CN1935215A - 洋金花总甾体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种洋金花总甾提取物及其制备方法，本发明以洋金花为原料，采用含水或不含水的有机溶剂为提取溶媒，常规方法提取，通过大孔树脂或溶剂萃取方法分离得到洋金花总甾提取物；该提取物是以魏察曼陀罗素B、G等甾体类化合物为主的有效部位，甾体类成分含量10％－80％，特别是50－75％。该提取物能显著抑制肿瘤生长，可用于抗肿瘤药物的制备。

Description

洋金花总甾体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于中药技术领域。具体涉及一种洋金花总甾提取物，该提取物的制备方法以及在制备治疗肿瘤药物中的应用。

背景技术

肿瘤是严重威胁人类生命健康的疾病，据世界卫生组织调查表明，全球肿瘤患者比例约占6.89‰，而每年新增肿瘤患者为1.78‰，生存数近4000万人。国家卫生部统计资料表明，目前中国恶性肿瘤患病率达到1.15～1.27‰，因恶性肿瘤死亡居全部死因的第二位。恶性肿瘤的治疗虽然取得很大进展，但目前还缺乏理想的治疗药物，无法满足临床需要，恶性肿瘤仍被人们视为难治疾病，仍在不断寻找安全有效的抗肿瘤药物。

洋金花为传统中药，系茄科植物白曼陀罗Datura metel L.或毛曼陀罗Daturainnoxia Mill.的干燥花。亦名曼陀罗花(《御药院方》)、大闹杨花(《生草药性备要》)等。中医药认为其味辛，性温，有毒。入肺、心、脾经。功能：定喘、祛风、麻醉止痛。主治：哮喘、惊痫、风湿痹痛、脚气、疮疡疼痛。并作外科手术麻醉剂。

含洋金花的中药复方制剂有用于肿瘤治疗(癌痛)专利申请见CN96118736.0、CN95119652.9。但单味药及有效部位没有抗肿瘤方面的文献报道。本发明人通过深入研究筛选，首次发现洋金花中所含总甾体部位对治疗恶性肿瘤非常有效。本发明人研究了该有效部位(总甾提取物)的制备方法，并进一步研究了该总甾提取物的化学组分，该总甾提取物可用于制备抗肿瘤药物。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于研究具有抗肿瘤活性的洋金花总甾提取物及其制备方法，提供其在制备抗肿瘤药物中的应用。

洋金花含有生物碱、黄酮、甾体类等化学成分，通过本发明人的筛选研究，发现甾体类组分具有显著抗肿瘤活性，因此对洋金花总甾体的制备工艺进行了系统研究，得到洋金花总甾体提取物。

本发明提供了一种洋金花总甾提取物。

本发明涉及的洋金花总甾提取物，用植物化学方法分析鉴定发现其中包含：豆甾-4-烯-3，6-二醇，豆甾-5，28-二烯-3，24-二醇，麦角甾-5，25-二烯-3，24-二醇，魏察曼陀罗素B，魏察曼陀罗素G，枸杞物质B，12-去氧魏察曼陀罗内酯，withatatulin(化合物分离及结构鉴定见实施例4)。

该提取物的总甾体含量通过分光光度法测定见东战国等，分析化学。1996，24(2)：227-229，以β-谷甾醇或魏察曼陀罗素B或魏察曼陀罗素G为对照品，洋金花总甾提取物中总甾体含量为10-80％，优选范围为50-75％。

本发明的另一目的是提供了洋金花总甾提取物的制备方法：

洋金花以单一溶剂或混合溶剂提取，溶剂包括水、乙醇、丙酮、乙酸乙酯，所选提取溶剂包括并不限于以上种类(例如50％7醇)。提取方法可采用冷浸、超声波提取、渗漉、加温提取(例如回流提取)。可单次提取，也可多次提取后(例如提取3次)，合并提取液，蒸发挥去溶剂得到洋金花提取物，将提取物按以下方法分离可以得到洋金花总甾提取物：

1、向洋金花提取物中加入含水醇，最终调节成含醇量为0％-30％的溶液(如15％)，用石油醚萃取此溶液0-6次(如3次)，将非石油醚层溶液通过吸附性树脂(如D101大孔吸附树脂)，以水洗脱水溶性物质，以5-35％的乙醇(如25％)洗脱非甾类物质，再以30-95％的乙醇洗脱(如95％)，便得到含有甾类物质的馏分，挥去乙醇得浓缩液，以正丁醇或乙酸乙酯(如乙酸乙酯)萃取浓缩液1-6次(如3次)，合并有机相，以PH8-14的碱水(如PH11)洗涤有机相1-6次(如3次)，以水洗涤有机相1-6次(如3次)，以PH1-6的酸水(如PHi)洗涤有机相1-6次(如3次)，以水洗涤有机相至中性，回收有机溶剂后得到洋金花总甾提取物。

具体包括下列步骤：

①提取：称取洋金花生药，加入3-50倍重量的溶剂，溶剂为：水、低级醇、丙酮或乙酸乙酯，或它们中的2种或2种以上混合溶剂；然后采用冷浸、超声波、渗漉或加温方法提取1-5次，合并提取液，除去有机溶剂，得到洋金花提取物；

②树脂分离：向洋金花提取物中加入含水醇，最终调节成含醇量为0％-30％的溶液，用石油醚萃取此溶液0-6次，将非石油醚层溶液通过吸附性树脂，以水洗脱水溶性物质，以5-35％的乙醇洗脱非甾类物质，再以35-95％的乙醇洗脱并收集洗脱液，得到含有甾类物质的馏分，挥去乙醇得浓缩；

③精制：以正丁醇或乙酸乙酯萃取浓缩液1-6次，合并有机相，以pH8-14的碱水洗涤有机相1-6次，以水洗涤有机相1-6次，以pH1-6的酸水洗涤有机相1-6次，以水洗涤有机相至中性，回收有机溶剂后得到洋金花总甾提取物。

2、洋金花提取物以PH8-14的碱水(如PH3)溶解，以石油醚萃取此碱水溶液0-6次(如3次)，弃去石油醚层，再以正丁醇或乙酸乙酯萃取碱水溶液1-6次(如3次)，合并有机相，以PH8-14的碱水(如PH13)洗涤有机相1-6次(如3次)，以水洗涤有机相1-6次(如3次)，以PH1-6的酸水(如PH3)洗涤有机相1-6次(如3次)，以水洗涤有机相至中性，将有机相浓缩后与氧化铝或活性炭(如活性炭)混合，静置10-100分钟(如30分钟)，过滤，用有机溶剂洗涤氧化铝或活性炭(如活性炭)，有机溶剂选自低级醇、含水低级醇、丙酮、乙酸乙酯(如乙酸乙酯)，而且包括并不限于以上种类，可以使用一种有机溶剂，也可以使用2种或2种以上有机溶剂混合物，挥去溶剂，得到洋金花总甾提取物。

具体包括下列步骤：

①提取：称取洋金花生药，加入3-50倍重量溶剂：水、低级醇、丙酮或乙酸乙酯或它们的多种混合溶剂，采用冷浸、超声波、渗漉或加温方法提取1-5次，合并提取液，除去溶剂，得到洋金花提取物；

②萃取：洋金花提取物以pH8-14的碱水溶解，以石油醚萃取此碱水溶液0-6次，弃去石油醚层，再以正丁醇或乙酸乙酯萃取碱水溶液1-6次，合并有机相，以pH8-14的碱水洗涤有机相1-6次，以水洗涤有机相1-6次，以pH1-6的酸水洗涤有机相1-6次，以水洗涤有机相至中性，挥去有机相得到洋金花总甾提取物。

本发明涉及的洋金花总甾提取物经动物实验活性评价显示具有强大抗肿瘤作用。

本发明的洋金花提取物的体内、体外药效试验结果如下：

(一)洋金花总甾提取物体内抑制S180肿瘤作用

实验材料

动物和瘤株：昆明种小鼠30只，雄性，体重20±1g，S180腹水瘤小鼠1只，由上海医药工业研究院动物房提供。洋金花总甾提取物：用时吐温助溶，0.5％CMC Na配制为所需浓度。阳性对照药：注射用环磷酰胺(CTX)，上海华联制药有限公司，批号：020806。配制时用生理盐水溶解。

方法与结果

小鼠30只，分为生理盐水组、环磷酰胺(CTX)组(30mg/kg，i.p)、洋金花总甾提取物大(0.1g/kg)、中(0.05g/kg)、小(0.025g/kg)剂量组，每组6只，接种次日开始按体重口服给药，连续给药10天后处死小鼠，测小鼠体重及瘤重并记录结果，计算洋金花总甾提取物的抑瘤率。抑瘤率＝(对照组瘤重-给药组瘤重)/对照组瘤重×100％。

结果见表1。

表1、洋金花总甾提取物对小鼠S180肉瘤的抑制作用

组别	剂量(g/kg)	动物数(只)(始/终)	瘤重(g)	抑瘤率(％)
					洋金花总甾提取物(p.o)	0.10.050.025	6/66/66/6	1.61±0.061.68±0.522.45±0.58	514926
环磷酰胺(i.p)空白对照	0.03-	6/66/6	0.78±0.433.32±0.31	76

(2)洋金花总甾提取物体外抗肿瘤细胞作用

试验材料：

MCF-7、K111、K562、L1210细胞：单层或悬浮均可，制成细胞悬液的浓度为10-20×10⁴/ml。MTT液：浓度5mg/ml，溶解于生理盐水，溶液储存4℃，有效期为3周。溶解液：含10％十二烷基硫酸钠，5％异丁醇及0.02mol/L HCl液。RPMI1640细胞培养液：按常规配制(含灭活小牛血清及适量抗生素)。受试药物：洋金花总甾提取物(按

实施例一方法制备)。

方法及结果：

取细胞悬液(相当于1-2×105/孔的细胞)，取96孔微量培养板，加入一定密度的100μl/孔，每挡浓度设三复孔，阴性对照孔加入培养也来代替。另外，同时设无细胞无试剂100μl纯培养液/孔的空白对照1-2空作为调仪器的零点孔，然后振荡使混合，置于37℃，5％CO2培养箱(48hr)后再加入MTT液20μl/孔，继续培养4hr后，加入溶解液100μl/孔，在放置37℃培养箱中，次日，以A570波长测各孔的光密度。各档试液孔均值与阴性对照值比较得各档浓度的百分抑制率(同时设一定浓度的标准抗肿瘤药作为阳性对照)。计算公式为：IC％＝(C-T)/C×100％(T为试液组OD值C为阴性对照组OD值)。然后根据各个检测液各档浓度的IC％，以回归曲线求得IC50值。

表2：洋金花总甾提取物体外抗肿瘤活性

	IC50(μg/ml)
						MCF-7	K562	K111	L1210
洋金花总甾提取物	9.28	1.08	8.19	0.94

(3)洋金花总甾提取物口服抑制B16肿瘤作用

试验材料

洋金花总甾提取物(批号：050926)：使用时吐温助溶，0.5％CMC Na配制为所需浓度。对照品：注射用环磷酰胺(CTX)，上海华联制药有限公司，批号：020806。配制时用生理盐水溶解。C57BL/6J种小鼠24只，雄性，体重20±1g，由上海医药工业研究院动物房提供。

试验方法

C57BL/6J荷瘤小鼠2只，无菌条件下取瘤，磨碎，用生理盐水稀释为1-2×107个/ml，按0.2ml/只给小鼠腋下皮下接种。次日将小鼠随机分组，每组8只。对照品环磷酰胺采用腹腔注射途径给药，剂量为30mg/kg×7d。另设空白对照组。动物接种次日开始按体重给药，灌胃0.5ml/20g，连续9天，根据体重给药，接种后第10天处死，取瘤块称重，计算抑瘤率：

抑瘤率＝(对照组瘤重-给药组瘤重)/对照组瘤重×100％

试验结果

表3、洋金花总甾提取物对移植B16肿瘤小鼠的抑瘤作用

	剂量mg/kg	动物数(只)	体重0d(g)	体重17d(g)	瘤重(g)	抑瘤率(％)
							洋金花总甾提取物CTXcontrol	11630-	8/88/88/8	21.53±1.4518.25±0.2018.24±0.24	22.81±1.4019.9±1.5222.96±1.39	0.44±0.250.59±0.202.21±0.51	8073

以上实验表明，本发明的洋金花总甾提取物具有明显的抗肿瘤活性。

因此，本发明的洋金花总甾提取物可作为有效组分，通过与药用辅料按常规方法制成口服或非口服制剂，用于肿瘤的治疗。

具体实施方式

实施例1

取洋金花100克，每次加入1升95％乙醇回流提取1小时，提取4次，合并提取液，挥去溶剂，得到洋金花提取物，该提取物用50％的乙醇溶解，用石油醚萃取此溶液4次，将非石油醚层用水稀释1倍，混匀后通过D101大孔吸附性树脂，以水洗脱水溶性物质，以25％的乙醇洗脱非甾类物质，再以95％的乙醇洗脱，收集95％的乙醇洗脱液，挥去乙醇得浓缩液，以乙酸乙酯萃取浓缩液3次，合并乙酸乙酯层，以PH13的氢氧化钠水溶液洗涤乙酸乙酯层3次，以水洗涤有机相3次，以PH1的盐酸水溶液洗涤乙酸乙酯层3次，以水洗涤乙酸乙酯层至中性，将乙酸乙酯层蒸干后得到洋金花总甾提取物0.39克，含甾体51.69％。

实施例2

洋金花25克，每次加入200毫升50％乙醇回流提取0.5小时，提取3次，合并提取液，挥去乙醇，得到水溶液，再以乙酸乙酯萃取水溶液3次，合并乙酸乙酯层，以PH13的碱水洗涤乙酸乙酯层4次，以水洗涤有机相3次，以PH1的盐酸水溶液洗涤乙酸乙酯层3次，以水洗涤乙酸乙酯层至中性，将乙酸乙酯层浓缩至10毫升，与氧化铝混合，静置后过滤，用95乙醇洗涤活性炭至无色，收集乙醇洗脱液蒸干，得到洋金花总甾提取物0.09克，含甾体40.68％。

实施例3

取洋金花20克，每次加入200毫升85％乙醇回流提取2小时，提取3次，合并提取液，挥去溶剂，得到粗提物。该粗提物以200毫升PH11的碱水溶解，以乙酸乙酯萃取碱水溶液5次，合并乙酸乙酯层，以PH11的碱水洗涤乙酸乙酯层3次，以水洗涤有机相3次，以PH3的盐酸水溶液洗涤乙酸乙酯层3次，以水洗涤乙酸乙酯层至中性，将乙酸乙酯层蒸干，得到洋金花总甾提取物0.5克，含甾体48.86％。

实施例4

实施例1、2所得的总甾部位经，以石油醚-丙酮进行梯度洗脱，用HF₂₅₄硅胶板薄层层析检测，相同流出物合并后分别经低压硅胶柱(300-400目)层析纯化，得到以下8个化合物。经分析，这8个化合物分别为魏察曼陀罗素B、魏察曼陀罗素G、。化合物1至8的结构式如下：

Claims (7)

1、一种洋金花总甾提取物，其特征在于该提取物包括至少一种下列化合物：豆甾-4-烯-3，6-二醇、豆甾-5，28-二烯-3，24-二醇、麦角甾-5，25-二烯-3，24-二醇、魏察曼陀罗素B、魏察曼陀罗素G、枸杞物质B、12-去氧魏察曼陀罗内酯和withatatulin，并且该提取物中甾体类成分的含量为10-80％。

2、按权利要求1所述的洋金花总甾提取物，其特征在于该提取物中甾体类成分的含量为50-75％。

3、按权利要求1所述的洋金花总甾提取物，其特征在于该洋金花总甾提取物通过以下方法制备得到：

①提取：称取洋金花生药，加入3-50倍重量的溶剂，溶剂为：水、低级醇、丙酮或乙酸乙酯，或它们中的2种或2种以上混合溶剂；然后采用冷浸、超声波、渗漉或加温方法提取1-5次，合并提取液，除去有机溶剂，得到洋金花提取物；

②树脂分离：向洋金花提取物中加入含水醇，最终调节成含醇量为0％-30％的溶液，用石油醚萃取此溶液0-6次，将非石油醚层溶液通过吸附性树脂，以水洗脱水溶性物质，以5-35％的乙醇洗脱非甾类物质，再以35-95％的乙醇洗脱并收集洗脱液，得到含有甾类物质的馏分，挥去乙醇得浓缩；

③精制：以正丁醇或乙酸乙酯萃取浓缩液1-6次，合并有机相，以pH8-14的碱水洗涤有机相1-6次，以水洗涤有机相1-6次，以pH1-6的酸水洗涤有机相1-6次，以水洗涤有机相至中性，回收有机溶剂后得到洋金花总甾提取物。

4、按权利要求1所述的洋金花总甾提取物，其特征在于该提取物通过以下方法制备得到：

①提取：称取洋金花生药，加入3-50倍重量溶剂：水、低级醇、丙酮或乙酸乙酯或它们的多种混合溶剂，采用冷浸、超声波、渗漉或加温方法提取1-5次，合并提取液，除去溶剂，得到洋金花提取物；

②萃取：洋金花提取物以pH8-14的碱水溶解，以石油醚萃取此碱水溶液0-6次，弃去石油醚层，再以正丁醇或乙酸乙酯萃取碱水溶液1-6次，合并有机相，以pH8-14的碱水洗涤有机相1-6次，以水洗涤有机相1-6次，以pH1-6的酸水洗涤有机相1-6次，以水洗涤有机相至中性，挥去有机相得到洋金花总甾提取物。

5、按权利要求3所述的洋金花总甾提取物制备方法，其特征在于该提取物的制备方法步骤③的精制为，将洋金花总甾提取物用有机溶剂溶解并与氧化铝或活性炭混合，静置10-100分钟，过滤，用有机溶剂洗涤氧化铝或活性炭，该有机溶剂为低级醇、含水低级醇、丙酮或乙酸乙酯或它们的2种或2种以上混合溶剂，挥去溶剂，得到洋金花总甾提取物的精制品。

6、按权利要求3所述的洋金花总甾提取物制备方法，其特征在于该提取物的制备方法步骤②所用吸附树脂为非极性或弱极性大孔吸附树脂：D101、AB-8或HPD100。

7、一种按权利要求1所述的洋金花总甾提取物在制备抗肿瘤药中的应用。