CN102362877A - 一种雾水葛提取物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种雾水葛提取物及其制备方法和应用。本发明首次从雾水葛消肿拔脓的有效部位中分离鉴定了四个化合物。采用雾水葛制备得到的水提取液以及其氯仿或正丁醇萃取部位具有消炎拔脓作用。在所述氯仿萃取部位含有木栓酮；在所述正丁醇萃取部位含有山柰酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、槲皮素-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、槲皮素-3，7-O-α-L-2-吡喃鼠李糖苷。本发明所述提取物具有良好的消肿拔脓、抗炎镇痛的作用，可用于制备消炎拔脓方面的药物。

Description

一种雾水葛提取物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种雾水葛提取物的制备方法和应用。

技术背景

《新华本草纲要》中记载，荨麻科雾水葛属Pouzolzia的药用植物共有四种，包括雅致雾水葛Pouzolzia elegans Wedd.，雾水葛Pouzolzia zeylanica(L.)Benn.，红雾水葛Pouzolzia sanguinea(Bl.)Merr.以及多枝雾水葛Pouzolziazeylanica(L.)Benn.Var.microphylla(Wedd.)W.T.Wang.，皆有除湿，消肿，解毒的功效。雾水葛植物资源丰富，在民间有广泛的应用，别名地消散、脓见消、啜脓膏、石珠子等，其主要功效为解毒消肿、接骨，用于痈肿、梅毒、肺结核、尿路感染等。古籍《闽南民间草药》记载：雾水葛，拔脓效力甚强，无脓者勿用之，以免增痛；《广西中草药》记载雾水葛叶配伍旱莲花外敷能治疗恶毒大疮。广东佛山市中医院用雾水葛、白鹤藤等制成的医院制剂“拔脓膏”，有清热消炎，化腐排脓，拔毒生肌的功效，用于骨髓炎，痈疮肿毒等症。

国内外对雾水葛属植物的研究报道不多，主要是关于药材的抗菌、驱虫、抗肿瘤和降血糖应用的零星报道，但对民间俗称雾水葛为“拔脓草”的相关药理及药效成分未见报道，也未见与其拔脓消炎相关的提取物制备和应用的报道，雾水葛的药用价值还没有得到充分的开发利用。

发明内容

本发明的一个目的在于克服现有雾水葛应用粗制剂和化学成分研究方面的不足，提供一种具有消炎拔脓作用的雾水葛提取物。

本发明的另一个目的是提供所述雾水葛提取物的制备方法。

本发明还有一个目的是提供所述雾水葛提取物的应用。

本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

提供一种雾水葛提取物的制备方法，是采用水回流提取雾水葛得到的水提取物；或者将所述水提取物浓缩得到的浸膏经氯仿、正丁醇萃取得到的提取物。

基于上述提取物制备得到的雾水葛粗制剂。

本发明同时提供了4种新的化合物，从雾水葛提取物制备得到。所述化合物为木栓酮(产物Ⅰ)、山柰酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(产物Ⅱ)、槲皮素-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(产物Ⅲ)、槲皮素-3，7-O-α-L-2-吡喃鼠李糖苷(产物Ⅳ)。

所述木栓酮(产物Ⅰ)的结构式为：

所述产物Ⅰ的制备方法包括以下步骤：

(1)采用蒸馏水回流提取雾水葛，将提取液浓缩得到浸膏；

(2)将步骤(1)所得浸膏经氯仿萃取得到氯仿萃取部位；

(3)将步骤(2)所得氯仿萃取部位进行硅胶柱色谱分离、氯仿-甲醇梯度洗脱，得到7个部位；取第二个部位继续用氯仿-甲醇梯度洗脱，经薄层色谱法检识，合并相同流份，用葡聚糖凝胶柱色谱纯化，氯仿-甲醇洗脱即得产物Ⅰ。

所述山柰酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、槲皮素-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷、槲皮素-3，7-O-α-L-2-吡喃鼠李糖苷的结构式分别为：

本发明提供了产物Ⅱ、产物Ⅲ、产物Ⅳ的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用蒸馏水回流提取雾水葛，将提取液浓缩得到浸膏；

(2)将步骤(1)所得浸膏经氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，减压浓缩得到正丁醇萃取部位；

(3)将步骤(2)所得正丁醇萃取部位通过AB-8大孔吸附树脂柱，依次用水、体积比浓度为30％、60％、85％的乙醇洗脱；

(4)取步骤(3)60％乙醇洗脱液，减压浓缩后进行硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇溶剂系统梯度洗脱，经薄层色谱法检识，流份26～45合并，流份50～72合并；

合并的流份26～45经硅胶柱分离、葡聚糖凝胶柱色谱纯化即得产物Ⅱ；

合并的流份50～72经硅胶柱分离、葡聚糖凝胶柱色谱纯化即得产物Ⅲ；

(5)取步骤(3)30％乙醇洗脱液，减压浓缩后进行硅胶柱色谱分离，经氯仿-甲醇(5∶1，体积比)溶剂系统梯度洗脱，经薄层色谱法检识，合并流份10～21，所得流份再经过反相硅胶柱色谱分离、葡聚糖凝胶柱色谱纯化即得产物Ⅳ。

所述的具有消炎拔脓作用的雾水葛提取物，包括粗制剂、4种化合物，优选由荨麻科雾水葛属植物多枝雾水葛Pouzolzia zeylanica(L.)Benn.Var.microphylla(Wedd.)W.T.Wang的干燥全草(地上部分)和带根全草中提取制备得到。

本发明所述雾水葛提取物具有良好的拔脓消肿、抗炎镇痛的药理作用，可应用于制备消炎拔脓方面的药物。

本发明的有益效果是：本发明首次提供了雾水葛提取物对小鼠皮下脓肿和大鼠溃疡模型具有治愈作用的技术研究成果，确定了雾水葛提取物中抗炎镇痛、消肿拔脓的有效部位是氯仿萃取部位和正丁醇萃取部位，从而提供了一种新的具有良好消炎拔脓作用的中药提取物作为制药新资源。

(1)本发明首次从雾水葛消肿拔脓的有效部位中分离鉴定了四个化合物的结构(包括一个三萜和三个黄酮苷)，这四个化合物均为首次从该属植物分离得到。研究成果表明雾水葛氯仿部位含三萜类成分，正丁醇部位含黄酮苷类成分，该成果补充了雾水葛化学成分库内容，为提取物的质量标准提供对照品。

(2)本发明采用荨麻科雾水葛属Pouzolzia植物多枝雾水葛Pouzolziazeylanica(L.)Benn.Var.microphylla(Wedd.)W.T.Wang的干燥全草和带根全草作为原料，原料资源丰富，有效部位提取物制备方法简单，去除了亲脂性杂质和水溶性杂质，为应用于制备消炎拔脓方面的药物制剂提供制备方法，具有良好的应用前景和工业实用价值。

(3)在应用方面，本发明基于雾水葛提取物的应用成功建立动物皮肤脓肿不同药理模型(小鼠皮下脓肿和大鼠细菌性外伤性溃疡模型)，该模型重复性高(成模率97.5％)，可操作性强。首次说明了雾水葛提取物对外伤感染引起的皮肤脓肿具有解毒排脓以及促进皮肤愈合的功效，其作用机制是通过抑制炎症因子的释放和调节脾脏免疫功能，为其临床应用提供实验依据。

(4)本发明提供了所述雾水葛提取物的应用，具有较强的抗炎镇痛作用，并初步研究总结出雾水葛提取物镇痛作用不是中枢镇痛作用，而在外周。

附图说明

图1产物Ⅰ的¹³C-NMR谱；

图2产物Ⅰ的¹H-NMR谱；

图3产物Ⅱ的¹³C-NMR谱；

图4产物Ⅱ的¹H-NMR谱；

图5产物Ⅲ的¹H-NMR谱；

图6产物Ⅲ的¹³C-NMR谱；

图7产物Ⅳ的¹³C-NMR谱；

图8产物Ⅳ的¹H-NMR谱；

图9雾水葛各萃取物对皮下脓肿模型小鼠皮肤病理切片(10×10)；

图10雾水葛粗提物口服剂对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀率结果图；

图11雾水葛粗提物外搽剂对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀率结果图；

图12雾水葛水提物各萃取部位对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀率结果图；

图13雾水葛粗提物口服剂醋酸致小鼠扭体结果图；

图14雾水葛粗提物外搽剂对醋酸致小鼠扭体结果图；

图15雾水葛水提物各萃取部位对醋酸致小鼠扭体结果图；

图16造模后次日大鼠皮肤溃疡伤口情况图；

图17用药后第6天大鼠皮肤溃疡伤口愈合情况图，A为模型组，B为百多邦组，C为拔脓膏组，D为雾水葛组；

图18用药后第9天雾水葛组大鼠皮肤溃疡伤口愈合情况图；

图19各用药组对大鼠皮肤溃疡处肿胀体积的影响；

图20各用药组对皮肤溃疡模型大鼠胸腺指数与脾脏指数的影响；

图21各用药组对皮肤溃疡模型大鼠血清TNF-α和IL-1含量的影响。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。除非特别说明，本发明实施例采用的试剂和材料均为常规市购。

实施例1提取物的制备

取雾水葛全草100g，去杂，剪碎，加1500mL蒸馏水加热回流提取3次，每次2h，合并3次提取液，浓缩成浸膏，加水定容100mL，制成浓度为1g生药/mL的药液；取其中50mL药液作为雾水葛水总提物(P)，另50mL用少量水分散，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取至各萃取液色浅，合并各萃取液(依次为氯仿萃取液PC、乙酸乙酯萃取液PE、正丁醇萃取液PB)及最后水部位(PW)，减压浓缩至流浸膏。

实施例2提取物的制备

取雾水葛全草10kg，去杂，剪碎，加150L蒸馏水加热回流3次，每次2h，合并3次提取液，浓缩成浸膏，用少量水分散，依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取至各萃取液色浅，各萃取液减压浓缩至流浸膏。

取氯仿萃取部位浸膏进行硅胶(100～200目)柱色谱分离，经氯仿∶甲醇(300∶1～1∶1，体积比)梯度洗脱，薄层色谱法检识后合并相似流份，得7个组分Fra.A-G。取组分Fra.B继续进行硅胶(300～400目)柱色谱分离(样品和硅胶质量比为1∶50)，经氯仿-甲醇(200∶1～20∶1，体积比)梯度洗脱，得到34个流份，经薄层色谱法检识，合并流份7～28，再用葡聚糖凝胶柱色谱纯化，氯仿-甲醇(1∶1，体积比)洗脱，得到产物Ⅰ。

取正丁醇萃取部位浸膏充分溶解于水中，加至已纯化好的AB-8大孔吸附树脂柱中，依次用水、30％、60％、85％(体积比浓度)的乙醇洗脱，得到不同浓度乙醇洗脱液，各洗脱液减压回收溶剂，得到各个洗脱部位浸膏。取60％乙醇洗脱部位浸膏进行硅胶(200～300目)柱色谱分离，以氯仿-甲醇溶剂(10∶1～1∶1，体积比)系统梯度洗脱，经薄层色谱法检识，流份26～45合并，流份50～72合并。合并的流份26～45经硅胶柱色谱分离、葡聚糖凝胶柱色谱纯化，得到产物Ⅱ。合并的流份50～72经硅胶柱色谱分离、葡聚糖凝胶柱色谱纯化，得到产物Ⅲ。取30％乙醇洗脱部位浸膏进行硅胶(200～300目)柱色谱分离，经氯仿-甲醇溶剂(5∶1～0∶1，体积比)系统梯度洗脱，薄层色谱法检识，合并流份10～21，再经过反相硅胶柱色谱分离、葡聚糖凝胶柱色谱纯化，得到产物Ⅳ。附图1～8分别为产物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的¹³C-NMR谱图和¹H-NMR谱图，产物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的结构如下：

产物Ⅰ：

木栓酮(friedelin)：白色晶体。¹³CNMR(CDCl₃，125Hz)δ：213.3(C＝O)，59.5(C-10)，58.2(C-4)，53.1(C-8)，42.8(C-18)，42.1(C-5)，41.5(C-2)，41.3(C-6)，39.7(C-13)，39.2(C-22)，38.3(C-14)，37.4(C-9)，36.0(C-16)，35.8(C-29)，35.6(C-11)，35.0(C-19)，32.8(C-30)，32.4(C-21)，32.0(C-15)，31.7(C-12)，30.5(C-17)，29.9(C-28)，28.1(C-20)，22.2(C-1)，20.6(C-26)，18.6(C-27)，18.2(C-7)，17.9(C-25)，14.7(C-24)，7.1(C-23)。

产物Ⅱ：

山柰酚-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(Kaempferol-7-O-α-L-rhamnopyranoside)：黄色针晶(甲醇)，盐酸-镁粉反应呈阳性，AlCl₃反应显黄色。ESI-MS(m/z)：431[M-H]。¹H-NMR(DMSO-d₆，500Hz)δ(ppm)：8.09(2H，d，J＝7Hz，H-2′，6′)；6.93(2H，d，J＝7Hz，H-3′，H-5′)；6.82(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)；6.42(1H，d，J＝2.5Hz，H-6)；5.54(1H，d，J＝1.5Hz，H-1″)，3.16～5.14(糖上质子)，1.23(3H，d，J＝7.0Hz，H-6″)；¹³CNMR(DMSO-d₆，125Hz)δ：148.40(C-2)，137.47(C-3)，177.36(C-4)，161.70(C-5)，99.77(C-6)，162.79(C-7)，95.72(C-8)，157.11(C-9)，106.05(C-10)，123.00(C-1′)，131.03(C-2′)，116.84(C-3′)，160.74(C-4′)，116.84(C-5′)，131.03(C-6′)，100.20(C-1″)，71.44(C-2″)，71.65(C-3″)，72.97(C-4″)，71.22(C-5″)，19.30(C-6″)。

产物Ⅲ：

槲皮素-7-O-α-L-吡喃鼠李糖苷(quercetin-7-O-α-L-rhamnopyranoside)：黄色针晶(甲醇)，AlCl₃反应显黄色。ESI-MS(m/z)：447.1[M-H]。¹H-NMR(DMSO-d₆，500Hz)δ(ppm)：7.72(H，d，J＝2Hz，H-2′)；7.58(2H，dd，J＝2Hz，J＝8Hz，H-6′)；6.89(H，d，J＝8Hz，H-5′)；6.79(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)；6.42(1H，d，J＝2.5Hz，H-6)；5.54(1H，d，J＝1.5Hz，H-1″)，3.16～5.14(糖上质子)，1.23(3H，d，J＝7.0Hz，H-6″)。¹³CNMR(DMSO-d₆，125Hz)δ：148.86(C-2)，137.47(C-3)，177.36(C-4)，161.73(C-5)，99.80(C-6)，162.78(C-7)，95.54(C-8)，157.06(C-9)，106.01(C-10)，123.16(C-1′)，116.57(C-2′)，146.46(C-3′)，149.28(C-4′)，116.97(C-5′)，121.49(C-6′)，100.20(C-1″)，71.44(C-2″)，71.62(C-3″)，72.97(C-4″)，71.22(C-5″)，19.30(C-6″)。

产物Ⅳ：

槲皮素-3，7-O-α-L-2-吡喃鼠李糖苷(quercetin-3，7-O-α-L-2-rhamnopyranoside)：黄色针晶(甲醇)，AlCl₃反应显黄色。ESI-MS(m/z)：593.1[M-H]，¹H-NMR(DMSO-d₆，500Hz)δ(ppm)：7.72(H，d，J＝2Hz，H-2′)；7.58(2H，dd，J＝2Hz，J＝8Hz，H-6′)；6.89(H，d，J＝8Hz，H-5′)；6.79(1H，d，J＝2.0Hz，H-8)；6.42(1H，d，J＝2.5Hz，H-6)；5.54(1H，d，J＝1.5Hz，H-1″)，3.16～5.14(糖上质子)，1.23(3H，d，J＝7.0Hz，H-6″)。¹³CNMR(DMSO-d₆，125Hz)δ：156.11(C-2)，134.60(C-3)，178.00(C-4)，160.98(C-5)，98.47(C-6)，161.72(C-7)，94.50(C-8)，157.92(C-9)，105.80(C-10)，121.30(C-1′)，115.54(C-2′)，145.29(C-3′)，148.67(C-4′)，115.78(C-5′)，120.62(C-6′)，99.51(C-1″)，70.28(C-2″)，70.69(C-3″)，71.65(C-4″)，70.10(C-5″)，17.96(C-6″)，101.95(C-1″′)，70.14(C-2″′)，70.40(C-3″′)，71.23(C-4″′)，69.86(C-5″′)，17.56(C-6″′)。

实施例4提取物对小鼠皮下脓肿作用的实验

(1)实验材料：红霉素软膏(广州何济公制药厂，批号：S1019)；拔脓膏(佛山中医院医院制剂，批号：100921)；10％甲醛固定液(山东拓博塑料有限公司，批号100226)；雾水葛提取物，自制。

(2)实验动物：SPF级NIH雄性小鼠(体重18～22g)，购于广州中医药大学医学实验动物中心，合格证号：SCXK(粤)2008-0020。

(3)实验方法：选择10％(质量百分比浓度)的淀粉水溶液作为外搽剂基质，将实施例1中的各流浸膏分别加入基质中，使总体积为50mL，制备得到雾水葛水提物各萃取部位外搽剂。选体重18～22g的健康小鼠117只(全为雄性)，背部用脱毛剂脱毛24h后，随机分为感染对照组、外搽基质对照组、拔脓膏阳性对照组、红霉素软膏阳性对照组、雾水葛水总提物组(P)、雾水葛氯仿部位组(PC)、雾水葛乙酸乙酯部位组(PE)、雾水葛正丁醇部位组(PB)、雾水葛水部位组(PW)共9组，每组13只。每只小鼠先皮下注射中浓度0.5mL/10g金黄色葡萄球菌菌液，随即外敷给药，每天两次。

(4)实验结果：

对小鼠皮下脓肿外观形态的影响：外观观察实验结果显示，在整个实验过程中雾水葛水总提物组(P)，雾水葛氯仿部位组(PC)，雾水葛水部位组(PW)与模型组相比，小鼠的脓肿体积都表现出一定的抑制作用，并在第7、8、9天与模型组比较有显著差别，同时这三种提取物的排脓作用和阳性对照组无明显差别，说明三者具有解毒排脓以及促进愈合的功效。对小鼠皮下脓肿体积影响的实验结果见表1、表2。

表1基质对照组、拔脓膏组、红霉素组随时间脓肿体积的变化表(单位mm³，n＝13)

与基质对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

表2雾水葛不同萃取部位随时间脓肿体积的变化表(单位mm³，n＝13)

与模型组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01

由结果可见，在整个实验过程中，大部分给药组的脓肿体积增长比模型组的程度轻些，尤其是红霉素组、P组、PC组、PW组小鼠第7、8、9天的脓肿体积与模型组比较具有显著性差异，表明雾水葛水总提取物组，雾水葛氯仿部位组，雾水葛水部位组对脓肿的发展过程有一定的影响，尤其是影响到后期的愈合。

对小鼠皮下脓肿病理形态的影响：对不同组别的小鼠的病理切片镜检发现，P组、PC组、PW组、红霉素组呈现一类相同的动态愈合趋势，而PE组、PB组和阳性对照拔脓膏组呈现出另一类趋势。其中P组、PC组、PW组小鼠的表皮层、真皮层以及肌肉的受损程度、炎性细胞浸润程度都比模型组轻，而肉芽生长、愈合速度比模型组快，说明氯仿萃取部位和水部位是排脓作用的有效部位。

实施例5提取物抗炎镇痛应用实验

(1)实验仪器与材料：Ay120托盘电子天平(岛津仪器(苏州)有限公司)；Elx-800型热板仪(BIOTEK)；跌打扭伤灵酊(广西邦琪药业有限公司，批号：080320)；罗通定(成都湔江制药厂，批号：070504)；吲哚美辛(临汾奇林药业，批号：0803301)；吐温-80(广州泰峰贸易有限公司)；乙醇、醋酸、二甲苯(天津博迪化学试剂分析纯)。

(2)实验动物：SPF级NIH小鼠，购于广东省医学实验动物中心(合格证号：SCXK(粤)2008-0002)，体重20～22g。

(3)实验方法：

二甲苯诱导小鼠耳肿胀实验：选择体重20±2g健康NIH小鼠80只，雌雄各半，适应性喂养48h之后，随机分为空白对照组、雾水葛水提口服组(1g生药/mL)、雾水葛醇提口服组(1g生药/mL)、水提物外搽组(1g生药/mL)、醇提物外搽组(1g生药/mL)、醇提物外搽剂赋形剂(70％乙醇)对照组、外搽阳性(跌打扭伤灵酊)组、吲哚美辛组共8组，每组10只。空白对照组按20mL/kg给予9％生理盐水灌胃，口服给药组按20g生药/kg剂量每日灌胃1次，连续3d。外搽给药组小鼠用硫化钠腹部脱毛24h后，按10g生药/kg(阳性组为10mL/kg)剂量，通过透皮吸收方式给药，每天2次，连续3天。吲哚美辛组于第2，3天灌胃给药0.1％吲哚美辛水溶液1次，给药量20mL/kg。于末次给药30min后，在小鼠右耳两面涂二甲苯50μL/只致肿，左耳不涂为正常耳。1h后脱颈椎处死，沿耳廓基线剪下双耳用直径6mm打孔器冲下左耳及右耳同一部位的圆片，于分析天平上称重，计算鼠耳肿胀度及抑制率。同时另选体重20±2g健康昆明种小鼠80只，雌雄各半，适应性喂养48h之后，随机分为空白组，雾水葛水提氯仿萃取部位高(1g生药/mL)、低(0.25g生药/mL)剂量组，水提乙酸乙酯萃取部位高(1g生药/mL)、低(0.25g生药/mL)剂量组，水提正丁醇萃取部位高(1g生药/mL)、低(0.25g生药/mL)剂量组，阳性对照(吲哚美辛)组共8组，每组10只，按上述相同方法实验和观察。

醋酸致小鼠扭体法：选择体重20±2g健康昆明种小鼠80只，雌雄各半，适应性喂养2d之后，挑选痛阈在5～30s内的小鼠80只，随机分为空白对照组、雾水葛水提口服组(1g生药/mL)、雾水葛醇提口服组(1g生药/mL)、水提物外搽组(1g生药/mL)、醇提物外搽组(1g生药/mL)、醇提物外搽剂赋形剂(70％乙醇)对照组、外搽阳性(跌打扭伤灵酊)组、罗通定组共8组，每组10只，空白对照组按20mL/kg给予9％生理盐水灌胃，口服给药组按20g生药/kg剂量每日灌胃1次，连续3d。外搽给药组小鼠用硫化钠腹部脱毛24h后，按10g生药/kg(阳性组为10mL/kg)剂量，通过透皮吸收方式给药，每天2次，连续3d。罗通定组每天灌胃给药0.8％罗通定水溶液1次，剂量为给药量20mL/kg。于末次给药1h后，在小鼠腹腔注射0.7％醋酸(10mL/kg)，记录各组小鼠给药后15min内扭体(腹部收缩内凹、伸展后肢、臀部抬高、蠕行)的次数。同时另选体重20±2g健康昆明种小鼠80只，雌雄各半，适应性喂养48h之后，随机分为空白组，雾水葛水提氯仿高(1g生药/mL)、低(0.25g生药/mL)剂量组，乙酸乙酯高(1g生药/mL)、低(0.25g生药/mL)剂量组，正丁醇高(1g生药/mL)、低(0.25g生药/mL)剂量组，阳性(罗通定)对照组，用上述相同方法实验和观察。

小鼠热板法：选择体重20±2g健康昆明种雌性小鼠80只，适应性喂养2d之后，挑选痛阈在5～30s内的小鼠80只，随机分为空白对照组、雾水葛水提口服组(1g生药/mL)、雾水葛醇提口服组(1g生药/mL)、水提物外搽组(1g生药/mL)、醇提物外搽组(1g生药/mL)、醇提物外搽剂赋形剂(体积比浓度为70％的乙醇)对照组、外搽阳性(跌打扭伤灵酊)组、罗通定组共8组，每组10只，空白对照组按20mL/kg给予9％生理盐水灌胃，口服给药组按20g生药/kg剂量每日灌胃1次，连续3d。外搽给药组小鼠用硫化钠腹部脱毛24h后，按10g生药/kg(阳性组为10mL/kg)剂量，通过透皮吸收方式给药，每天2次，连续3d。罗通定组每天灌胃给药0.8％罗通定水溶液1次，剂量为给药量20mL/kg。于末次给药1h后，取小鼠置于55.0±0.1℃热板仪中，加热后作为热刺激，用秒表记录小鼠自投入热板至出现舔后足的时间(s)作为该鼠的痛阈值(第一次舔足时间)。同时另选体重20±2g健康昆明种雌性小鼠80只，适应性喂养48h之后，挑选痛阈在5～30s内小鼠，随机分为空白组，雾水葛水提氯仿高(1g生药/mL)、低(0.25g生药/mL)剂量组，乙酸乙酯高(1g生药/mL)、低(0.25g生药/mL)剂量组，正丁醇高(1g生药/mL)、低(0.25g生药/mL)剂量组，阳性对照(罗通定)组。用上述相同方法实验和观察。

(4)实验结果：二甲苯诱导小鼠耳肿胀实验结果：见表3、表4所示。

表3二甲苯致小鼠耳廓肿胀率及抑制率比较(

n＝10)

与空白组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与70％乙醇组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01

表4雾水葛水提各萃取部位二甲苯致小鼠耳廓肿胀率及抑制率比较(

n＝10)

与空白组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

由表3可知，与空白对照组比较，雾水葛水提取物组耳廓肿胀度存在显著性差异，醇提取物口服组、外搽组与空白组比较均无显著性差异。由此说明雾水葛水溶性成分有更好的抗炎作用，抗炎效果口服比外搽更好。由表4可知，与空白组比较，雾水葛氯仿部位高、低剂量组、正丁醇部位高、低剂量组耳廓肿胀度存在显著性差异。而雾水葛乙酸乙酯部位、水部位各组别与空白组均无显著性差异，说明雾水葛水提取物的氯仿萃取部位和正丁醇萃取部位是其抗炎的有效部位。

醋酸致小鼠扭体法结果：雾水葛粗提物及外搽剂醋酸致小鼠扭体结果见表5所示，雾水葛水提各萃取部位醋酸致小鼠扭体结果见表6所示。

表5雾水葛粗提物及外搽剂醋酸致小鼠扭体次数比较(n＝10)

与空白组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与70％乙醇组比较，^△P＜0.05，^△△P＜0.01

表6雾水葛水提各萃取部位醋酸致小鼠扭体次数比较(

n＝10)

与空白组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

由实验结果可知，水提物口服组对醋酸致小鼠15min内扭体反应有明显抑制作用，而雾水葛醇提物组并没有显著差异，提示雾水葛水溶性成分有较好的镇痛效果。相对于空白组，雾水葛氯仿部位低剂量组、乙酸乙酯部位高剂量组、水部位高、低剂量组对醋酸致小鼠15min内扭体反应均有明显抑制作用，而雾水葛氯仿部位高剂量组、乙酸乙酯部位低剂量组、正丁醇部位组并没有显著差异，说明雾水葛的氯仿部位、乙酸乙酯部位和水部位都有较好的镇痛效果，不同剂量组之间的量效关系也很明显。

小鼠热板法结果：实验结果见表7、表8所示。

表7雾水葛粗提物及外搽剂热板法致小鼠舔足时间比较(

n＝10)

与用药前比较，^*P＜0.05

表8雾水葛水提各萃取部位热板法致小鼠舔足时间比较(n＝10)

与用药前比较，^*P＜0.05

由结果可知，各给药组对热板法均不敏感，并不随给药时间延长改变，说明雾水葛的镇痛作用不是中枢镇痛作用。

实施例6提取物对大鼠皮肤溃疡的作用及机制实验

(1)实验材料：一次性静脉采血针(湖南浏阳医用仪具厂，批号：100902)；一次性血样采集容器(湖南浏阳医用仪具厂，批号101223)；定量移液器(PROLONE)；莫正罗星软膏(百多邦，中美史克，批号1010513)。

(2)实验动物：SPF级SD雄性大鼠50只，购自广州中医药大学实验动物中心，合格证号：SCXK(粤)2008-0020。

(3)实验方法：取SD雄性大鼠50只(220±20g)，适应性喂养24h，背部脱毛，24h后每只大鼠按1mL/100g的剂量腹腔注射9％乌来糖生理盐水溶液使其麻醉，在背部脱毛区做一个直径为1cm的圆形印记，沿边缘剪下皮肤，深达肌筋膜。随即在伤口周缘注入1mL金黄色葡萄球菌液。造模次日将大鼠随机分为5组：空白组，模型组，百多邦组，拔脓膏组，雾水葛水提取物组(10g生药/mL)。模型组不做治疗处理，其他给药组创面分别用无菌纱布固定包扎伤口，每日换药2次。实验过程中定时用游标卡尺测定脓肿的长径与宽径，计算脓肿的体积。用药第9天参照文献评价标准进行疗效评定，并在当天给药后1h，腹腔注射20％乌来糖麻醉、开腹，经腹总动脉取血5mL，采集血清，用酶标仪测定OD值，计算各样品中肿瘤坏死因子(TNF-α)及白细胞介素(IL-1)的含量(pg/mL)。同时取胸腺及脾脏称重，计算胸腺指数与脾脏指数。

(4)实验结果：

伤口愈合情况：与模型组相比较，雾水葛组有显著性差异。说明雾水葛治疗脓肿溃疡外观愈合情况较好，结果见表9所示。

表9雾水葛对大鼠皮肤脓肿疗效结果(n＝10)

肿胀度：与模型组比较，拔脓膏组在第6天、第9天肿胀体积具有显著性差异(P＜0.05)；雾水葛组在第6天、第9天肿胀体积具有显著性差异(P＜0.01)。提示拔脓膏、雾水葛均具有消肿拔脓的功效，。结果见表10。

表10各给药组对大鼠皮肤溃疡处肿胀体积的影响(

n＝10)

与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

胸腺指数与脾脏指数：感染后各大鼠的脾脏指数和胸腺指数均明显下降，与空白组对照有显著性差别。给药后，各给药组均可使大鼠脾脏指数增加，但仅雾水葛组与模型组相比具有显著性差异，百多邦组和拔脓膏组无统计学意义。而对胸腺指数的影响，各给药组与模型组比较均未见明显上升，结果见表11所示。

表11各给药组对皮肤溃疡大鼠胸腺指数与脾脏指数的影响(

n＝10)

与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

大鼠血清TNF-α和IL-1的含量：与空白组比较，模型组大鼠血清中IL-1和TNF-α的含量均显著上升。给药后，雾水葛组血清中IL-1含量降低，与模型组比较有显著性的差异；虽然雾水葛组、百多邦组和拔脓膏组也有降低大鼠血清中TNF-α水平的趋势，但与模型组比较，统计无显著差异，结果见表12所示。

表12各给药组对皮肤溃疡大鼠血清中TNF-α和IL-1的影响(n＝10)

与模型组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

实验证明，雾水葛提取物能使大鼠溃疡脓肿基本消除，创面愈合情况良好，具有拔脓消肿的治疗作用，分析其治疗细菌性外伤性溃疡的机制是通过调节脾脏免疫减轻溃疡的发展，通过降低血清中白细胞介素(IL-1)的含量以达到抗炎作用，实验结果得以证明。

Claims (9)

1.一种雾水葛提取物，其特征在于是采用水回流提取雾水葛得到的水提取物；或者将所述水提取物浓缩得到的浸膏经氯仿或正丁醇萃取得到的氯仿萃取部位或正丁醇萃取部位。

2.根据权利要求1所述雾水葛提取物，其特征在于所述雾水葛为荨麻科雾水葛属Pouzolzia植物多枝雾水葛Pouzolzia zeylanica(L.)Benn.Var.microphylla(Wedd.)W.T.Wang的干燥全草或带根全草。

3.权利要求1或2所述雾水葛提取物的应用，其特征在于应用于制备消炎、拔脓、镇痛或治疗脓肿溃疡方面的药物。

4.一种化合物，其特征在于具有式(Ⅰ)所示结构：

所述化合物通过以下制备步骤制备得到：

(1)将权利要求1所述氯仿萃取部位进行硅胶柱色谱分离、氯仿-甲醇梯度洗脱，得到7个部位；

(2)取第二个部位继续用氯仿-甲醇梯度洗脱，经薄层色谱法检识，合并相同流份，用葡聚糖凝胶柱色谱纯化，氯仿-甲醇洗脱即得。

5.含有权利要求4所述化合物的雾水葛提取物。

6.权利要求5所述雾水葛提取物的应用，其特征在于应用于制备消炎、拔脓或镇痛或者治疗脓肿溃疡方面的药物。

7.一种化合物，其特征在于具有式(Ⅱ)、式(Ⅲ)或式(Ⅳ)所示结构：

所述化合物通过以下制备步骤制备得到：

(1)将权利要求1所述正丁醇萃取部位通过AB-8大孔吸附树脂柱，依次用水、30％、60％、85％的乙醇洗脱；

(2)取步骤(1)60％乙醇洗脱液，减压浓缩后进行硅胶柱色谱分离，以氯仿-甲醇系统梯度洗脱，经薄层色谱法检识，流份26～45合并，流份50～72合并；

合并的流份26～45经硅胶柱色谱分离、葡聚糖凝胶柱色谱纯化即得化合物Ⅱ；

合并的流份50～72经硅胶柱色谱分离、葡聚糖凝胶柱色谱纯化即得化合物Ⅲ；

(3)取步骤(1)30％乙醇洗脱液，减压浓缩后进行硅胶柱色谱分离，经体积比为5∶1的氯仿-甲醇溶剂系统梯度洗脱，经薄层色谱法检识，合并流份10～21，所得流份再经过反相硅胶柱色谱分离、葡聚糖凝胶柱色谱纯化即得化合物Ⅳ。

8.含有权利要求7所述化合物的雾水葛提取物。

9.权利要求8所述雾水葛提取物的应用，其特征在于应用于制备消炎、拔脓或镇痛或者治疗脓肿溃疡方面的药物。

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