CN116731173A - 抗a-syn/igf1r的双特异性抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及与α‑突触核蛋白和IGF1R特异性结合的双特异性抗体，以及该双特异性抗体在预防、治疗和/或诊断α‑突触核蛋白病中的用途，α‑突触核蛋白病是与α‑突触核蛋白或α‑突触核蛋白聚集体相关的疾病。本发明中，允许α‑syn抗体或其抗原结合片段穿透血脑屏障以在脑中发挥其作用，并延长半衰期使得可以长时间维持药学功效。

Description

抗A-SYN/IGF1R的双特异性抗体及其用途
本申请是申请号为201880089354.4的中国专利申请(申请日：2018年12月14日，发明名称：抗A-SYN/IGF1R的双特异性抗体及其用途)的分案申请。
技术领域
本发明涉及抗α-突触核蛋白和IGFR的双特异性抗体、包含该双特异性抗体的用于预防和/或治疗突触核蛋白病(α-突触核蛋白病)的药物组合物、以及包含该双特异性抗体的检测α-突触核蛋白聚集体或提供用于诊断α-突触核蛋白病的信息的方法。
背景技术
α-突触核蛋白(α-突触核蛋白，α-syn)主要在神经元的突触前末端表达，在正常情况下是天然未折叠的单体。α-突触核蛋白有助于调节作为控制随意或非随意运动的神经递质的多巴胺的释放。特别地，α-突触核蛋白的功能对于增加的突触活性和衰老是重要的，并且是神经退变的重要因素。
然而，在病理状态下，α-突触核蛋白通过与液滴、磷脂双层或脂质膜的结合和相互作用而经历结构变化，以形成折叠的或折叠的α-螺旋二级结构，从而分散含量。形成包括二聚物、寡聚物和/或纤维形式的分子的聚集体。
已知这些α-突触核蛋白聚集体诱导对细胞的毒性，并且是发现于帕金森病(PD)、帕金森病痴呆症(PDD)、多系统萎缩症(PD MSA)、路易体痴呆(DLB)和各种疾病的神经元中的路易体的异常蛋白聚集体主要成分。还已知α-突触核蛋白的翻译后修饰(例如磷酸化或泛素化)也与α-突触核蛋白的聚集和神经毒性有关。已知α-突触核蛋白在动物实验和细胞实验中杀死多巴胺神经元并引起炎性反应，并在实验动物中引起类似于帕金森病的运动症状。此外，已知α-突触核蛋白聚集与一组称为α-突触核蛋白病的神经退行性疾病的病因有关，α-突触核蛋白病包括帕金森病、帕金森病痴呆、路易体痴呆、多系统萎缩症和许多其他神经轴突疾病。
已经提出了抗α-突触核蛋白的抗体或诱导这样的抗体的α-突触核蛋白的片段作为针对突触核蛋白疾病的免疫疗法的方法。但是，抗体的脑部穿透可能受到血脑屏障(BBB)的限制。
此外，高度特异性的BBB载体的缺乏也延迟了针对脑源性疾病(包括脑肿瘤和神经退行性疾病)的新疗法和诊断方法的开发。显然需要一种以药学有效剂量将治疗性和诊断性分子递送至脑部而不破坏BBB的生理和体内平衡的方法。
发明内容
技术问题
本发明的一种实施方式提供了蛋白质复合物或制备该蛋白质复合物的方法，所述蛋白质复合物包含抗α-突触核蛋白(α-Syn)的抗原结合区和抗IGF1R的抗原结合区。
另一种实施方式提供了编码该蛋白质复合物的多核苷酸，包含该多核苷酸的重组载体和包含该重组载体的重组细胞。
进一步的实施方式提供了获得自所述蛋白质复合物的抗α-Syn和IGF1R的双特异性抗体及其制备方法。
进一步的实施方式提供了用于预防和/或治疗α-突触核蛋白病的药物组合物，其包含抗α-Syn和IGF1R的双特异性抗体和药学上可接受的赋形剂。
提供了一种使用本发明的抗体或抗原结合片段将用于诊断、治疗或预防α-突触核蛋白病的药物递送至脑的方法。
技术方案
在下文中，将更详细地描述本发明。
本发明的一种实施方式是包含α-突触核蛋白(α-Syn)的抗原结合区和IGF1R的抗原结合区的蛋白质复合物，以及获得自所述蛋白质复合物的抗α-突触核蛋白和IGF1R的双特异性抗体(以下称为抗α-Syn/抗-IGF1R双特异性抗体)。因此，本发明的双特异性抗体可以识别并结合至作为抗原的α-突触核蛋白和IGF1R两者。
本发明的抗α-Syn/抗IGF1R双特异性抗体包括抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段，并且特异性地识别并结合α-突触核蛋白，特别是α-突触核蛋白的C末端区域，从而用于预防、治疗和/或诊断与α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体相关的疾病，即α-突触核蛋白病。
根据本发明，术语“α-突触核蛋白病”包括所有以病理性突触核蛋白聚集体为特征的神经退行性疾病。帕金森病、帕金森病痴呆症(PDD)、路易体痴呆症(DLB)、路易体病、路易体痴呆症、帕金森症伴痴呆症、多系统萎缩症(MSA)、多发性神经系统萎缩和I型神经退行性疾病脑铁积聚(I型NBIA)被归类为突触核蛋白病。另外，还发现了在阿尔茨海默病中继发α-突触核蛋白聚集(Kim等人，阿尔茨海默病研究与治疗(Alzheimer's Research&Therapy)2014，6：73)。
突触核蛋白病是多组神经退行性疾病，它们具有共同的病理特性：在神经病方面，可以将特定的病变检测为神经元和少突胶质细胞的选择的群体中的α-突触核蛋白的异常聚集。α-突触核蛋白(以前称为PARK1和PARK4)是一种由140个氨基酸组成的蛋白质，在新皮层、海马体、齿状回、后神经球、纹状体、丘脑和小脑中广泛表达。α-突触核蛋白也在造血细胞中高表达，所述造血细胞包括单核细胞，例如B细胞、T细胞和NK细胞以及血小板。在这些细胞中的确切作用尚不清楚，但与巨核细胞(血小板前体)的分化有关。
在本文中，“与α-突触核蛋白聚集体有关的疾病”是被称为突触核蛋白病的一组神经退行性疾病，其中在包括神经元和胶质的损伤中发现α-突触核蛋白聚集体，并且α-突触核蛋白聚集体具有诸如多巴胺系统退变、迁移率变化、认知障碍以及路易体和/或路易神经突形成的特征(Kim等人，阿尔茨海默病研究与治疗2014，6:73；McKeith等人，神经学(Neurology)(1996)47：1113-24)。这些疾病包括帕金森病、帕金森病痴呆症、路易体痴呆症、阿尔茨海默病路易体变异型、阿尔茨海默病和帕金森病合并症、多系统萎缩症和许多其他神经轴索疾病，但不限于此。在一种实施方式中，根据本发明的抗体有效地用于治疗帕金森病。
另外，本发明的抗α-Syn/抗IGF1R双特异性抗体包括抗IGF1R抗体或其抗原结合片段，使得抗α-Syn抗体或其抗原结合片段能够穿透血脑屏障以发挥作用，并延长半衰期以长时间保持疗效。
此外，本发明的抗α-Syn/抗IGF1R双特异性抗体在不影响配体的结合的情况下结合至细胞表面上的IGF1R，并且具有对通过IGF1R的信号传导途径没有影响的特性。因为它不抑制IGF1R与其配体的结合以及通过IGF1R的信号传导，所以它可以作为穿梭工具用于穿透血脑屏障。
特别地，本发明的抗IGF1R抗体或其抗原结合片段特异性识别IGF1R(胰岛素样生长因子1受体)并结合至IGF1R，特别是人IGF1R、小鼠IGF1R、大鼠IGF1R和猴IGF1R。但是，它不干扰IGF1R配体(例如IGF-1、IGF-2和/或胰岛素)与IGF1R的结合，并且不抑制通过IGF1R的信号转导，可用于穿过BBB的转胞吞作用(transcytosis)。它不具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，因此即使重复施用于动物也不会降低脑中IGF1R的水平，因此没有毒性。
特别地，本发明的抗IGF1R抗体结合至位于构成BBB的脑内皮细胞表面上的IGF1R并内化到细胞的内部。例如，可以通过使用表达IGF1R的细胞系(例如MCF-7)来鉴定本发明的抗IGF1R抗体是否被内化到细胞中。本发明的抗IGF1R抗体，例如1564、48G5、54H4、60H6、B11以及1564的亲和变体(例如C04、F06、VH2、VH5、VH7、VH9、VH16、VH32和VH35)，与阴性对照相比，具有更高的内化程度。结果表明，所测试的抗IGF1R抗体的内在化程度对细胞表面上的IGF1R具有特异性。另外，本发明的抗IGF1R抗体为scFv形式，并且可以以各种方式与治疗性抗体连接而产生。例如，抗IGF1R抗体的scFv可以以双特异性抗体制备，例如以双特异性抗体的二价形式制备，其中两个scFv结合至治疗性抗体(例如α-syn抗体)的C末端，或以双特异性抗体的单价形式制备，其中一个scFv结合至治疗性抗体的C末端。这两种双特异性抗体都可以内化到表达IGF1R的细胞中。IGF1R抗体对细胞表面上的抗原具有高结合亲和力，从而增强内化作用并导致BBB穿过能力。但是，如果抗体具有通过BBB并干扰IGF1R信号传导的能力，则可能引起副作用。本发明的抗体的特征为适合于BBB穿梭的结合能力和针对IGF1R信号传导的非阻断性质两者。
抗IGF1R抗体或其抗原结合片段具有易于开发的优异性质。在这方面，在抗IGF1R抗体的CDR区域中发生并降低抗体的稳定性和功效的翻译后修饰(例如脱酰胺化)要被去除。通过取代发生脱酰胺化的氨基酸，与亲本抗体相比，可以增加抗体的稳定性和功效，而不会改变对抗原IGF1R与ECD的结合能力。通过将脱氨基作用位点的Asn依次替换为包括Q、H和K的其他残基来制备突变体，并通过ELISA分析突变体与IGF1R的结合亲和力，证实了突变体的结合亲和力与亲本抗体相似。
另外，当与作用于脑中的生物活性物质连接时，与单独的生物活性物质相比，本发明的抗IGF1R抗体可以诱导改善的BBB穿透能力和功效。
根据本发明的一方面，抗IGF1R抗体可以用作包括各种第二治疗性抗体的双特异性抗体。在使用源自人IPSC的体外BBB系统进行的穿透实验中，显示BBB穿透性是仅由治疗性抗体组成的单一抗体的15倍(图16a)。抗IGF1R抗体可以以单价或二价形式结合至双特异性抗体中的第二抗体。例如，当将具有单价形式或二价形式抗IGF1R抗体的双特异性抗体单次施用至正常大鼠后，分析血液和CSF中抗体的量时，与亲本抗IGF1R抗体(克隆1564)相比，单价形式和二价形式的抗IGF1R抗体显示在血液中的量增加高达5倍，在CSF中的量增加高达5倍。与亲本抗IGF1R抗体(克隆1564)相比，它们显示在CSF中的量增加了约3倍，脑穿透性质的量增加了约4.5倍(图16c)。因此，与由单独的治疗性第二抗体组成的单一抗体相比，包括通过上述方法改良的抗IGF1R抗体的双特异性抗体预期显示出在CSF中的量高达约15倍和约23倍的抗体穿透脑的能力。
已经鉴定出本发明的抗IGF1R抗体结合至IGF1R，特别是包括人、猴、大鼠和小鼠在内的哺乳动物的IGF1R，因此可用于药物开发筛选、临床试验等。
本发明的抗IGF1R抗体或其抗原结合片段是特异性识别IGF1R(胰岛素样生长因子1受体)的抗体或其抗原结合片段。
本发明的抗IGF1R抗体或抗原结合片段是指，当它以≦10-6M的解离常数(KD)结合时，“特异性结合”至其靶标，例如抗原。当KD≦1×10-8M时，或当有效浓度50(EC50)为2nM或更低时，抗体以高亲和力特异性结合至靶标。在一种实施方式中，抗体或其抗原结合片段能够以KD≦1×10-8M结合至IGF1R或人IGF1R。已经发现本文公开的抗体结合至IGF1R，特别是人IGF1R、小鼠IGF1R、大鼠IGF1R和猴IGF1R。
如本文所用，术语“表位”是抗原决定簇，其被解释为表示抗原的被抗体识别的部分。根据一种实施方式，本发明的抗IGF1R抗体的结合位点可以是IGF1R蛋白(例如人IGF1R蛋白(SEQ ID NO:99))的胞外域。更具体地，本发明的抗IGF1R抗体(例如针对人IGF1R蛋白的1564克隆抗体)的结合位点为在由SEQ ID NO:99的氨基酸序列组成的蛋白质中的：结合位点1，包括Y775、P776、F778、R650、S791、L798和Glu779；结合位点2，包括L641、H808、E809和L813；和结合位点3，包括V397、D435、W434、Y460和C488。因此，本发明的IGF1R抗体的表位可以是包括三个结合位点的全部或部分的构象表位。
如本文所用，术语“抗体”是指通过在免疫系统中抗原的刺激而产生的物质，并且可以在体内产生、重组产生或人工合成，但没有特别限制。本发明中的抗体包括动物抗体、嵌合抗体、人源化抗体和人抗体。另外，在本发明中，抗体还包括抗体的具有抗原结合能力的抗原结合片段。
抗体还包括单克隆抗体和多克隆抗体，并且单克隆抗体可以是作为特异性结合至IGF1R的分离的抗体的人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。单克隆抗体是特异性结合至IGF1R的类型为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的分离抗体。
本发明的抗体包括但不限于双特异性抗体、小抗体、域抗体、抗体模拟物(或合成抗体)、抗体融合物(或抗体缀合物)及其片段。各种抗体的结构在下文进一步公开。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指对抗原具有特异性结合亲和力的抗体的部分或包括该部分的多肽。例如，抗体的部分包括通过与抗原相互作用而与抗原具有特异性和亲和力的氨基酸残基。该抗原结合区通常包含一个或多个“互补决定区(CDR)”。特异性抗原结合区也包含一个或多个“框架(FR)”区。CDR是有助于抗原结合的特异性和亲和力的氨基酸序列。框架区有助于维持这些CDR的适当构象，从而促进抗原结合区与抗原之间的结合。
在本发明中，“互补决定区(CDR)”是指在抗体的可变区中赋予对抗原的结合特异性的区域。
该抗体可以选自免疫球蛋白的所有亚型(例如，IgA、IgD、IgE、IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM等)。抗体的IgG形式可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，例如IgG1或IgG2亚型。IgG型抗体包含两条重链和两条轻链，每条重链和轻链通过二硫键结合形成两个重链-轻链二聚体，形成的两条重链-轻链通过二硫键在重链的Fc区连接。IgG形式的抗体包括：靶向一种抗原的单一靶标抗体，其包含两个重链-轻链构建体中的针对相同抗原的抗原结合位点；或靶向两种抗原的双特异性抗体，其包含重链-轻链构建体中的针对不同抗原的抗原结合位点。
术语抗体或免疫球蛋白的链(重链或轻链)的“抗原结合片段”包括抗体的与全长链相比缺少一些氨基酸但可以特异性结合抗原的部分。在可以特异性结合至靶抗原或可以与其他抗体或抗原结合片段竞争结合特异性表位的方面，该片段可以被认为具有生物学活性。具体而言，抗原结合片段选自由包括一个或多个互补决定区的抗体片段组成的组，所述抗体片段例如scFv、(scFv)2、scFv-Fc、Fab、Fab'和F(ab')2，但不限于此。这样的生物活性片段可以通过重组DNA技术产生，或者可以通过酶促或化学切割完整抗体来产生。免疫功能性免疫球蛋白片段不限于此。
在本发明中，例如，多肽(例如抗原结合片段、蛋白质或抗体)的“变体”是与其他多肽序列相比在一个或多个氨基酸残基处发生插入、缺失、添加和/或取代的多肽，并包括融合多肽。例如，一些抗体在重链或轻链、可变区或CDR序列的一个或多个残基中包括保守氨基酸取代。
本发明中的术语多肽的“衍生物”是指通过与其他化学部分缀合而被化学修饰的多肽，该多肽不同于插入、缺失、添加或取代变体。
本发明的抗IGF1R抗体或抗原结合片段不会阻止IGF1R配体(例如IGF-1、IGF-2和/或胰岛素)与IGF1R的结合。具体而言，抗IGF1R抗体或抗原结合片段不干扰IGF1R配体与位于表达IGF1R的细胞膜上的IGF1R的结合，有利地既不抑制通过IGF1R的信号转导也不影响IGF1R在细胞表面上的表达。因此，本发明的抗IGF1R抗体或抗原结合片段可以有效地用于通过砖胞吞作用穿透血脑屏障。
人IGF1R可以被胰岛素样生长因子IGF-1和IGF-2以及胰岛素(INS)激活。通过IGF1R的信号传导通过依赖于PI3激酶/Akt途径的活化的IRS衔接子蛋白促进细胞生长和存活。IGF1R向IRS-1、IRS-2、IRS-3和IRS-4的主要底物以及Shc蛋白发出信号，从而激活Ras/Raf/MAP激酶和PI3激酶/Akt信号传导途径。与目前已经使用并且已知在脑的内皮细胞中表达以改善穿透BBB能力的其他转胞吞靶标相比，IGF1R已显示在脑中具有相对较高的表达水平。
本发明的抗IGF1R抗体不干扰IGF1、IGF2和/或胰岛素与IGF1R的结合，也不干扰如上所述的通过IGF1R的信号传导途径。另外，在本发明的一种实施方式中，当将IGF1R与当前正在开发的用于改善治疗性抗体的BBB穿透能力的其他靶标(例如转铁蛋白受体或胰岛素受体)进行比较时，IGF1R显示出在正常的脑和外围组织(例如肝、肺或大肠)中具有较低的表达水平。
IGF1R是受体介导的转胞吞作用(Receptor Mediated Transcytosis，RTM)的靶标，受体介导的胞吞作用可以通过血脑屏障(BBB)将有用的物质输送到脑中。然而，为了作为穿透血脑屏障的药物递送靶标而使用，期望具有结合至细胞表面上的IGF1R，而不影响配体的结合和通过IGF1R的信号传导途径的性质。因此，本发明的抗IGF1R抗体及其抗原结合片段不抑制IGF1R与其配体的结合以及通过IGF1R的信号传导，因此可以用作穿梭工具来穿透血脑屏障。
本发明的抗IGF1R抗体或抗原结合片段能够进行转胞吞作用并且可以穿过脑的内皮细胞。另外，当将本发明的抗体注射到小鼠的血管中时，本发明的抗体位于与小鼠的脑血管相同的位置。这些结果表明，本发明的抗体或抗原结合片段可以有效地用作穿过血脑屏障的药物载体。
因此，本发明的抗IGF1R抗体或抗原结合片段允许在脑中起作用的生物活性物质穿过血脑屏障。在本发明中，生物屏障是指阻止生物分子有效通过、扩散或转移的细胞、组织、膜或细胞、膜或结构。这些生物屏障包括神经细胞/组织、结缔组织、肌肉、膜或上皮(例如粘膜或血管)细胞。典型的实例是血脑屏障。
在本发明中，术语“血脑屏障”或BBB是由在脑和脊柱及其周围的循环系统之间存在的脑的毛细血管内皮膜中的紧密连接形成的屏障。这种屏障非常坚固，以至于它也限制了约60Da的低分子量分子进入脑。脑的血脑屏障、脊柱的血管脊髓屏障和视网膜的血管视网膜屏障是中枢神经系统中的连续毛细血管屏障，通常称为BBB。
在本发明中，术语“血脑屏障转运蛋白”可以穿过血脑屏障并递送根据本发明的抗体或其抗原结合片段，并且例如包括包含肽和多肽的蛋白质、核酸、抗体或小分子化合物。
可以从转基因小鼠中产生并选择本发明的抗体，例如上述的那些，其中使用杂交瘤技术通过编码具有所需特异性的抗原特异性人mAb的基因引入小鼠。可以使用适当的载体和宿主细胞克隆和表达这样的抗体，或者可以从培养的杂交瘤细胞中收获抗体。另外，抗体可以衍生自噬菌体展示文库。噬菌体展示技术是通过选择丝状噬菌体表面上的抗体库并从中选择与所需抗原结合的噬菌体来模仿一种免疫选择的方法。这样的技术可以参考本发明的实施方式或PCT公开号WO1999/010494。在一种实施方式中，本发明的人源化IGF1R抗体通过噬菌体展示方法进行选择。
本发明涉及特异性结合IGF1R的分离的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段可以是包括重链互补决定区和轻链互补决定区的特异性结合于IGF1R的多肽、蛋白质、抗体或其抗原结合片段。
具体地，在下文针对特异性结合至IGF1R的抗体进行描述。
本发明的抗IGF1R抗体或抗原结合片段特异性识别IGF1R(胰岛素样生长因子1受体)，识别并结合IGF1R，特别是人IGF1R、小鼠IGF1R、大鼠IGF1R和猴IGF1R，不干扰IGF1R、IGF-1R、IGF-2和/或胰岛素与IGF1R的结合并抑制通过IGF1R的信号转导，并且可用于转胞吞作用以穿过血液中的屏障。它不具有抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)，即使重复施用于动物，也不会降低大脑中IGF1R的水平。
特别地，本发明的抗IGF1R抗体结合至位于构成BBB的脑内皮细胞表面上的IGF1R并内化到细胞的内部。例如，可以通过使用表达IGF1R的细胞系(例如MCF-7)来鉴定本发明的抗IGF1R抗体是否被内化到细胞中。本发明的抗IGF1R抗体，例如1564、48G5、54H4、60H6、B11以及1564的亲和变体(例如C04、F06、VH2、VH5、VH7、VH9、VH16、VH32和VH35)与阴性对照相比，具有更高的内化程度。结果表明，所测试的抗IGF1R抗体的内化程度对细胞表面的IGF1R具有特异性。另外，本发明的抗IGF1R抗体为scFv形式，并且可以以各种方式与治疗性抗体连接而产生。例如，抗IGF1R抗体的scFv可以以双特异性抗体制备，例如以双特异性抗体的二价形式制备，其中两个scFv结合至治疗性抗体(例如α-syn抗体)的C末端；或以双特异性抗体的单价形式制备，其中一个scFv结合至治疗性抗体的C末端。双特异性抗体可以内化到表达IGF1R的细胞中。IGF1R抗体对细胞表面上的抗原具有高结合能力，从而增强了内化作用并导致了BBB穿过能力。但是，如果抗体具有通过BBB并干扰IGF1R信号传导的能力，则可能引起副作用。本发明的抗体的特征为适合于BBB穿梭的结合能力和针对IGF1R信号传导的非阻断性质。
本发明涉及特异性结合IGF1R的分离抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段可以是包括重链互补决定区和轻链互补决定区的特异性结合IGF1R的多肽、蛋白质或抗体。
在特定的例子中，抗IGF1R抗体或其抗原结合片段可包括：
(i)一个或多个重链互补决定区或包含一个或多个重链互补决定区的重链可变区，所述一个或多个重链互补决定区选自由表1中所述的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3组成的组；
(ii)一个或多个轻链互补决定区或包含一个或多个轻链互补决定区的轻链可变区，所述一个或多个轻链互补决定区选自由表1中所述的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3组成的组；
一个或多个重链互补决定区(CDR)和一个或多个轻链互补决定区(CDR)的组合；或
重链可变区和轻链可变区的组合。
另外，在重链可变区、轻链可变区或重链可变区和轻链可变区的组合中，重链可变区可包括选自由H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4组成的组中的一个或多个重链框架，轻链可变区可包括选自由L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4组成的组中的一个或多个轻链框架。
(i)本发明的重链CDR的H-CDR1、H-CDR2或H-CDR3选自表1中列出的氨基酸序列，或包含至少一个与所选氨基酸序列具有实质序列同一性的氨基酸序列。另外，(ii)轻链CDR的L-CDR1、L-CDR2或L-CDR3选自表2中列出的氨基酸序列，或包含至少一个与所选氨基酸序列具有实质序列同一性的氨基酸序列。
实质序列同一性是指该序列包括变异但保持本发明公开的效果。该序列与一种实施方式中公开的重链可变区具有约90％、95％或99％的同一性。该序列与其他实施方式中公开的轻链可变区具有约90％、95％或99％的同一性。例如，在变体显示与本发明公开的抗体或抗原结合片段的序列具有约90％、95％或99％同一性的情况下，任何序列变异都发生在可变区的框架而不是CDR中。
[表1]本发明的抗体克隆中的重链可变区的CDR序列。
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[表2]本发明的抗体克隆中的轻链可变区的CDR序列
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本发明的选自由H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4组成的组中的重链框架可以选自表3的氨基酸序列。本发明的选自由L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4组成的组中的轻链框架可以选自表4的氨基酸序列。
具体而言，本发明的抗IGF1R抗体的重链可变区包含表1中所描述的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3，或者另外包含表3中所示的H-FR1、H-FR2，H-FR3和H-FR4。本发明的抗IGF1R抗体的轻链可变区包含表1中所描述的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3，或者另外包含表4中所示的L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4。在本发明的一种实施方式中，抗IGF1R抗体或其抗原结合片段可包含：重链可变区，包含选自由表1所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3的氨基酸序列组成的组中的每个克隆的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3；以及轻链可变区，包含选自由表2所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3的氨基酸序列组成的组中的每个克隆的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。
在本发明的一种实施方式中，氨基酸修饰，例如抗IGF1R抗体的Fc区域中的氨基酸的脱氨作用的去除，可以由于血液清除率的降低而增加抗体的pK，而不改变抗原IGF1R与ECD结合的能力，并导致半衰期的延长。在一个实例中，抗IGF1R抗体中脱酰胺化被去除的氨基酸位置可以是克隆1564中的轻链LCDR2的N51D，或轻链LCDR3的N95aK、N95aH、N95aR或N95aD，或重链HCDR2的N54D或N54Q。
[表3]本发明的抗体克隆中的重链可变区的框架序列。
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[表4]本发明的抗体克隆中的轻链可变区的框架序列
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本发明的抗IGF1R抗体可以是包含轻链可变区和重链可变区的抗体，并且本文公开的各种重链和轻链可变区示于表5和表6中，每个克隆的CDR1至CDR3和框架1至4以SEQ IDNO描述。
表5和表6中所述的重链可变区和轻链可变区可自由组合以产生各种类型的抗体。表5和表6示出了重链可变区和轻链可变区的组合的实例。
[表5]本发明的抗体的重链可变区
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[表6]本发明的抗体的轻链可变区
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表5和表6列出了本文公开的各种重链和轻链可变区。每个可变区可以与重链和轻链恒定区结合以形成完整抗体的相应重链和轻链。构成本发明的抗IGF1R抗体的重链可变区和轻链可变区的组合的实例可以是与表5和6中所述相同的克隆名称的重链可变区和轻链可变区的组合。
在本发明的具体实例中，抗IGF1R抗体或其抗原结合片段包含选自由以下组成的组中的至少一种：
重链CDR1(H-CDR1)，其包含选自SEQ ID NO:1至9的氨基酸序列，
重链CDR2(H-CDR2)，其包含选自SEQ ID NO:10至49的氨基酸序列，
重链CDR3(H-CDR3)，其包含选自SEQ ID NO:50至80的氨基酸序列，
轻链CDR1(L-CDR1)，其包含选自SEQ ID NO:96至113的氨基酸序列，
轻链CDR2(L-CDR2)，其包含选自SEQ ID NO:114至132的氨基酸序列，和
轻链CDR3(L-CDR3)，其包含选自SEQ ID NO:133至161的氨基酸序列。
具体而言，本发明的抗体或抗原结合片段可以包含：
重链可变区，该重链可变区包括：重链CDR1(H-CDR1)，包含选自SEQ ID NO:1至9的氨基酸序列；重链CDR2(H-CDR2)，包含选自SEQ ID NO:10至49的氨基酸序列；和重链CDR3(H-CDR3)，包含选自SEQ ID NO:50至80的氨基酸序列；以及
轻链可变区，该轻链可变区包括：轻链CDR1(L-CDR1)，包含选自SEQ ID NO:96至113的氨基酸序列；轻链CDR2(L-CDR2)，包含选自SEQ ID NO:114-132的氨基酸序列；和轻链CDR3(L-CDR3)，包含选自SEQ ID NO:133-161的氨基酸序列。
特异性识别并结合选自由SEQ ID NO:410的氨基酸序列中的Y775、P776、F778、R650、S791、L798、Glu779、L641、H808、E809、L813、V397、D435、W434、Y460和C488组成的组中的至少一种氨基酸。具体而言，本发明的抗IGF1R抗体或其抗原结合片段可以结合至选自包含氨基酸序列SEQ ID NO:410的蛋白质的结合位点1至结合位点3中的至少一个。结合位点1包含选自由Y775、P776、F778、R650、S791、L798和Glu779组成的组中的至少一种氨基酸，结合位点2包含选自由L641、H808、E809和L813组成的组中的至少一种氨基酸，结合位点3包含选自由V397、D435、W434、Y460和C488组成的组中的至少一种氨基酸。
本发明的抗体或抗原结合片段的重链可变区可以包括：
位于H-CDR1的N末端的重链框架1(H-FR1)，其包含选自SEQ ID NO:81至84的氨基酸序列，
位于H-CDR1和H-CDR2之间的重链框架(H-FR2)，其包含选自SEQ ID NO:85至86的氨基酸序列，
位于H-CDR2和H-CDR3之间的重链框架(H-FR3)，其包含选自SEQ ID NO:87至91的氨基酸序列，和
位于H-CDR3 C末端的重链框架(H-FR4)，其包含选自SEQ ID NO:92至95的氨基酸序列。
本发明的抗体或抗原结合片段的轻链可变区可包括：
位于L-CDR1的N末端的轻链框架1(L-FR1)，其包含选自SEQ ID NO:162至164的氨基酸序列，
位于L-CDR1和L-CDR2之间的轻链框架(L-FR2)，其包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列，
位于L-CDR2和L-CDR3之间的轻链框架(L-FR3)，其包含选自SEQ ID NO:166至168的氨基酸序列，和
位于L-CDR3的C末端的轻链框架(L-FR4)，其包含选自SEQ ID NO:169至171的氨基酸序列。
表5和6中公开的重链可变区和轻链可变区中的每一个可以用作单独的域抗体，可以彼此自由结合以形成各种抗体，并且以单链形式连接以获得单链抗体，例如scFv。
在本文中，“域抗体”是仅包含重链可变区或轻链可变区的免疫功能性免疫球蛋白片段。在一种实施方式中，两个或更多个VH区通过肽接头通过共价键连接，以形成二价域抗体。该二价域抗体的两个VH区可以靶向相同或不同的抗原。
本发明的抗IGF1R抗体的抗原结合片段可以是选自由scFv、(scFv)2、scFv-Fc、Fab、Fab′、F(ab′)2、小抗体和双抗体组成的组中的一种，包括包含一种或多种互补决定区的抗体片段。
在抗原结合片段中，Fab包括轻链可变区、重链可变区、轻链恒定区和重链的第一恒定区(CH1)，并具有一个抗原结合位点。Fab'在Fab中具有铰链区，该铰链区在重链CH1结构域的C末端包含一个或多个半胱氨酸残基。F(ab')2抗体是通过连接两个Fab'而产生的，它们在Fab'铰链区的半胱氨酸残基之间形成二硫键。
Fv是仅具有重链可变区和轻链可变区的最小抗体片段，并且包括单链可变片段(scFv)和双链可变片段(Fv)。在双链Fv中，重链可变区和轻链可变区可以通过非共价键连接。在单链Fv中，重链可变区和轻链可变区直接或通过肽接头共价连接，或直接在C末端连接形成scFv二聚体样结构(di-scFv)，例如双链Fv。在本发明中，单链Fv是抗原结合区的单条多肽链，其中重链和轻链可变区直接或通过接头连接，并且可以是选自由具有与重链可变区和轻链可变区连接的单链的scFv、scFv二聚体样结构(双scFv)形式以及重链可变区、轻链可变区和Fc连接成单链形式的skFv-Fc等组成的组中的至少一种。
肽接头可以如上所述，并且可以是例如1至100个氨基酸长度，例如2至50个氨基酸长度或5至25个氨基酸长度，并且该肽接头的长度可以在不影响抗体的功能的限制范围内。肽接头中包含的氨基酸的种类可以由选自由例如Gly、Ser和Leu组成的组中的一种或多种氨基酸组成，并且具体实例包括Gly和Ser残基或Leu和Ser残基。在具体实例中，肽接头可以是(G4S)n，其中n是由1至10的整数表示的(G4S)的重复数，例如2至5，特别是3或4。接头的实例可以是由SEQ ID NO:172或173的氨基酸组成的肽。
SEQ ID NO:411：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO:412：GGGGSGGGGSGGGGS
单链Fv(scFv)可以通过将编码肽接头的DNA融合在编码两个可变域多肽(VL和VH)的DNA之间来产生。根据两个可变域之间的柔性接头的长度，所制备的多肽可以通过折叠形成抗原结合单体或多聚体(例如二聚体、三聚体或四聚体)。通过将含有不同VL和VH的多肽组合，可以形成结合不同表位的多聚scFv。
抗原结合片段可以使用蛋白水解酶获得(例如，用木瓜蛋白酶对整个抗体进行限制性酶切消化以获得Fab，以及用胃蛋白酶消化以获得F(ab')2片段)，或使用遗传重组技术获得。
本文公开的单链抗体包括但不限于包含重链和轻链可变区的域组合或包含CDR的轻链可变域和重链可变域的组合的scFv。
另外，抗IGF1R抗体及其抗原结合片段可以包括包含重链可变区的重链和包含轻链可变区的轻链。具体地，重链可变区和轻链可变区可以与重链恒定区和轻链恒定区结合，并且重链和轻链序列也可以结合以形成完整的抗体结构。
提供可以与本发明的可变区结合的恒定区序列作为实例，所述恒定区序列可以适当地选自免疫球蛋白(例如人免疫球蛋白)的重链和轻链恒定区。例如，重链恒定区可以是IgG1重链恒定区、IgG3重链恒定区或IgG4重链恒定区，而轻链恒定区可以是κ恒定区或λ轻链恒定区，但不限于此。
例如，本发明的可变区可以结合至恒定区以形成下述重链和轻链序列。表7示出了重链和轻链的组合的实例。另外，示例性完整抗体在表16中列出。恒定区可以适当地选自免疫球蛋白(例如人免疫球蛋白)的重链恒定区和轻链恒定区。
[表7]示例性抗体
本发明中描述的抗体还包括双特异性抗体和双官能抗体，其包含如上所述的一个或多个CDR或一个或多个可变区。双特异性或双官能抗体是识别具有或没有相互关系的两个不同靶标的人工杂合抗体。可以使用多种方法来制备双特异性抗体，例如杂交瘤融合或Fab'片段的连接。
在本文中，“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”靶向两个或更多个抗原或表位。在本文中，“双特异性”或“双重特异性”抗原结合蛋白或抗体是具有两个不同的抗原结合位点的杂交抗原结合蛋白或杂交抗体。该双特异性抗体是一种多特异性抗原结合蛋白或多特异性抗体，并且可以通过各种已知方法来产生，例如，诸如杂交瘤融合或Fab'片段连接的方法。
多特异性抗体，例如能够产生双特异性抗体的抗IGF1R抗体及其抗原结合片段，可以包括抗IGF1R抗体及其抗原结合片段，例如整个抗体。抗原结合片段可以选自由域抗体、scFv、(scFv)2、scFvFc、Fab、Fab'和F(ab')2组成的组。
抗IGF1R抗体的抗原结合片段可以与或不与接头(例如肽接头)连接。另外，抗原结合片段中的重链和轻链部分(例如scFv片段中的重链可变区和轻链可变区)也可以与或不与肽接头连接。肽接头可以如上所述。
在双特异性抗体中，抗IGF1R抗体及其抗原结合片段可以执行将靶向与之结合的不同抗原或表位的第二抗体或抗原结合片段通过血脑屏障递送至脑的功能。第二抗体可以是在脑中发挥功效的抗体，但没有特别限制。
本发明的抗IGF1R抗体或其抗原结合片段可以与不同的第二抗体共有特定区域或序列。例如，抗IGF1R抗体可以共有抗体或第二抗体的抗原结合片段的恒定区或Fc区。
另外，本发明中的双特异性抗体的结构包括：二价形式的双特异性抗体，其中抗IFG1R抗体的scFv直接或通过接头，例如在重链末端处，连接至完整免疫球蛋白的两条重链的每个Fc；单价形式的双特异性抗体，其中抗IGF1R抗体的scFv直接或通过接头连接至完整免疫球蛋白的两条重链的仅一个末端，但单价双抗体是优选的。
具体地，在本发明的一种实施方式中，存在一种情况，其中单价形式克隆具有比二价形式克隆改善的半衰期，并且单价形式克隆的结构是抗IGF1R的域抗体(scFv)仅通过接头与完整免疫球蛋白中的一条重链的末端结合的形式。具体地，该抗体是通过杵臼(Knob-In-Hole)法应用的异二聚体，该异二聚体包括完整免疫球蛋白的两条不同的重链，其中一条重链具有结合至其C末端的抗IGF1R的域抗体(scFv)，而另一条重链在其C末端不具有任何抗体。
在双特异性抗体中，结合至抗IGF1R抗体或其抗原结合片段的第二抗体可以是特异性结合至IGF1R的人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或分离的抗体。第二抗体包括但不限于完整抗体、双特异性抗体、小抗体、域抗体，抗体模拟物(或合成抗体)，抗体融合物(或抗体缀合物)及其片段。
下文中，本发明涉及抗-syn抗体及其抗原结合片段。
可以被本文提供的抗体识别的α-突触核蛋白可以选自人α-突触核蛋白、猴α-突触核蛋白(例如恒河猴α-突触核蛋白)、小鼠α-突触核蛋白、大鼠α突触核蛋白等的哺乳动物α突触核蛋白。例如，人α-突触核蛋白可以是α-突触核蛋白(NCBI ID:NP_000336)，但不限于此。除非本文另有说明，否则α-突触核蛋白可以指人α-突触核蛋白，并且本文提供的抗体或抗原结合片段不仅具有对人α-突触核蛋白的特异性结合特性，而且还具有对猴子(例如恒河猴)α-突触核蛋白、大鼠α-突触核蛋白和/或小鼠α-突触核蛋白的特异性结合特性。
抗体或其抗原结合片段可以结合至α-突触核蛋白的C末端区域，特别是包括以下的C末端区域：由人α-突触核蛋白的SEQ ID NO:559中的第110至120个残基或第111至122个残基的至少11或12个连续氨基酸组成的肽。已经证实本发明的抗体或抗原结合片段可以识别抗原识别区域并以高结合亲和力结合至α-突触核蛋白聚集体。
在本文中，“亲和力”或“亲和性”是抗体或其抗原结合片段与抗原之间的相互作用的强度，并且可以通过抗原的性质(例如抗原的大小、形状和/或电荷)以及抗体或抗原结合片段的CDR序列和/或理化性质(亲水/疏水性质、静电性质等)来确定。确定亲和力的方法是本领域已知的，并且通常表示为解离常数(KD)，但不限于此。
在本文中，“特异性结合至α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体”是指与其他抗原相比，对α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体的结合亲和力相对较高，并且如Octet分析或SPR分析所测量的，对α-突触核蛋白聚集体，具体是淀粉样原纤维、初原纤维和寡聚体，特别是淀粉样原纤维的解离常数(KD)可以为0.1×10-10M至2×10-10M或0.05×10-10M至0.3×10- 9M，但不限于此。
根据本发明的实施方式的人源化α-突触核蛋白抗体包括轻链和重链，例如Hu11F11_(ver.1)、Hu11F11(ver.2)和Hu11F11_ABL2-4，并且与嵌合α-突触核蛋白抗体相比，表现出促进吞噬细胞摄取的高活性。与嵌合α-突触核蛋白抗体相比，Hu11F11(ver.1)、Hu11F11(ver.2)、Hu11F11(ver.3)、Hu11F11(ver.4)和ABL2-4显示出高的抑制原纤维与神经细胞膜结合的活性。与嵌合α-突触核蛋白抗体相比，Hu11F11(ver.2)、Hu11F11(ver.4)和ABL2-4具有高的抑制由过表达α-突触核蛋白的细胞分泌的α-突触核蛋白向其他神经细胞传播的活性，并显示出对α-突触核蛋白聚集体的结合亲和力，例如，其在基于细胞的测定中具有与嵌合α-突触核蛋白抗体相似或更好的活性。
根据本发明的α-突触核蛋白抗体可以抑制从受试者的神经系统中的神经细胞分泌出的α-突触核蛋白聚集体转移到胞外空间中的其他正常细胞并感染神经细胞(抑制聚集体的细胞间传递)的功能，并具有促进小胶质细胞对胞外空间中的α-突触核蛋白聚集体的吞噬作用的能力。α-突触核蛋白聚集体像朊病毒一样从一个细胞传播到另一细胞，并且α-突触核蛋白，尤其是α-突触核蛋白聚集体遍布整个脑，导致正常细胞中的突触核蛋白病。因此，α-突触核蛋白聚集体对脑神经元有毒性，众所周知会导致脑神经元死亡(神经退变)和神经炎症。因此，随着α-突触核蛋白聚集体扩散到脑的各个部分，脑细胞死亡和神经炎症反应增加，并导致脑细胞死亡的发生以及产生伴随突触核蛋白病(例如帕金森病)的进展而发现的行为和认知障碍。
因此，本发明的α-突触核蛋白抗体可以通过抑制α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体在神经细胞之间的传播来防止α-突触核蛋白聚集体向脑的各个区域传播的现象，以及通过减少或清除受试者神经系统的神经细胞的胞外区域中的α-突触核蛋白聚集体本身以及促进小胶质细胞的吞噬作用来减少作为突触核蛋白病的重要原因的α-突触核蛋白聚集体的水平，从而导致脑神经细胞死亡和神经炎症反应减少，并有望进一步改善、减轻或预防突触核蛋白病(例如帕金森病)的症状和进展。
另外，根据本发明的α-突触核蛋白抗体具有执行以下两种功能的优异活性：(i)抑制α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体在神经细胞之间的传递(参见本文公开的基于细胞的测定的结果)，以及(ii)通过促进小胶质细胞的吞噬作用降低脑神经系统中α-突触核蛋白聚集体的水平。特别地，由于目前已经在临床试验中或在科学论文中出版的α-突触核蛋白抗体具有两种活性(i)和(ii)之一，这表明本发明的α-突触核蛋白抗体与已知的α-突触核蛋白抗体相比在突触核蛋白病的优越的预防或治疗方面具有优势。因此，根据本发明的α-突触核蛋白抗体在病因学上具有减少和消除α-突触核蛋白聚集体以及抑制α-突触核蛋白聚集体的作用的更优异的功效，因此对于突触核蛋白病或与之相关的症状性疾病(例如认知障碍疾病)更有效。
对α-突触核蛋白聚集体具有高亲和力的根据本发明的抗体或抗原结合片段可以减少α-突触核蛋白聚集体的形成，从而降低脑中聚集体的浓度。另外，对α-突触核蛋白聚集体具有高亲和力的根据本发明的抗体或抗原结合片段可以减少中枢神经系统外部的α-突触核蛋白聚集体的形成，并最终改变被BBB(血脑屏障)限制的α-突触核蛋白形式之间的平衡，从而带来降低中枢神经系统内部α-突触核蛋白聚集体的浓度的作用。
这在临床实践中具有很大的优势，因为即使通过较方便的途径施用(例如皮下注射)，也可以充分获得功效，但不限于此。另外，根据本申请的抗体或抗原结合片段可通过除去单体来抑制聚集体的形成，或消除单体和聚集体两者，但不限于该理论。
特异性结合至α-突触核蛋白或α-突触核蛋白聚集体的本发明的抗体或其抗原结合片段可以不是天然存在的产物(它可以是非天然存在的产物，例如通过化学合成或重组方法)。重组技术是本领域熟知的。
在本文中，“抗体”是指任何同种型的完整免疫球蛋白，或可以与完整抗体竞争结合靶抗原的抗原结合片段。例如，它包括嵌合的、人源化的、完整的人或双重特异性抗体或其抗原结合片段。抗体本身就是一种抗原结合蛋白。通常，完整抗体包含至少2个全长重链和2个全长轻链，但是在某些情况下，抗体可以仅包含重链。
抗体或其抗原结合片段可以仅来源自一种来源，也可以是嵌合抗体。嵌合抗体包含来源自两种不同抗体的部分，并且在下文更详细地描述。抗体或其抗原结合片段可以通过杂交瘤、重组DNA技术或完整抗体的酶促或化学切割来产生。除非本文另有说明，否则抗体的术语包括含有2条全长重链和2条全长轻链的抗体，以及它们的衍生物、变体、片段和突变体，其实例如下所述。
在一种实施方式中，该抗体包括单克隆抗体、双特异性抗体、微抗体、域抗体、抗体模拟物(或合成抗体)、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体，抗体融合物(或抗体缀合物)及其片段，本文公开的各种类型的抗体不限于此。在一种实施方式中，本文公开的抗体的片段可以是Fab片段、Fab'片段、F(ab')2片段、Fv片段、单链片段(scFv)、双抗体或通过间隔区连接重链可变区和轻链可变区而制备的单链的单链抗体分子。
在本文中，“轻链”包括全长轻链及其片段，该片段具有充分提供与抗原或表位的结合特异性的可变区序列。全长轻链包含可变区结构域VL和恒定区结构域CL。轻链的可变区结构域存在于轻链多肽的N末端。轻链的种类包括κ链和λ链。
在本文中，“重链”包括全长重链及其片段，该片段具有充分提供与抗原或表位的结合特异性的可变区序列。全长重链包含可变区结构域VH和3种恒定区结构域CH1、CH2和CH3。VH结构域存在于重链多肽的N末端，CH结构域存在于羧基末端，而CH3的位置最接近C末端。重链包括IgG(包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4亚型)、IgA(包括IgA1和IgA2亚型)以及IgM和IgE的同种型。
在本文中，“抗原结合片段”是指抗体的与抗原具有特异性结合亲和力的部分，或包括该部分的多肽。例如，抗原结合片段可以是抗体的包括通过与抗原(例如表位)相互作用而赋予抗体对抗原的特异性和/或亲和力的氨基酸残基的部分，或包括该部分的多肽。该抗原结合片段通常包含一个或多个“互补决定区(CDR)”，以及另外一个或多个“框架(FR)”区。CDR是有助于抗体与抗原结合的特异性和亲和力的氨基酸序列，而框架区是有助于维持这些CDR的适当构象并促进抗原结合区与抗原之间结合的氨基酸序列。
如本文所用，抗体或免疫球蛋白的链(重链或轻链)的“抗原结合片段”包括抗体的与全长链相比缺少一些氨基酸但可特异性结合至抗原的部分。在可以特异性结合至靶抗原或可以与其他抗体或抗原结合片段竞争结合特异性表位的方面，该片段可以被认为具有生物学活性。一方面，该片段包含存在于全长轻链或重链中的至少一个CDR，并且在一些实施方式中，该片段包含重链和/或轻链的单链或其部分。该生物活性片段可以通过重组DNA技术产生，或者可以例如通过酶促或化学方法切割完整的抗体来产生。具有免疫功能的免疫球蛋白片段包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、域抗体和单链抗抗体(例如scFv、scFv-Fc等)，但不限于此，并且可以来源自任何哺乳动物，包括人、小鼠、大鼠、骆驼科动物或兔子，但不限于此。抗体的功能性部分，例如本文所述的一个或多个CDR，可以通过共价键与二级蛋白质或小分子化合物连接，并用作针对特定靶标的靶标治疗剂。
在本文中，“Fab片段”由一条轻链和仅包含可变区和CH1的一条重链组成。Fab分子的重链不能与其他重链形成二硫键。
在本文中，“Fc”区域包含两个重链片段，所述重链片段包含抗体的CH2和CH3结构域。这两个重链片段通过两个或更多个二硫键以及CH3结构域的疏水相互作用相互结合。
在本文中，“Fab'片段”除了Fab片段之外还包含重链的CH1和CH2结构域之间的区域，并且可以由两个Fab'片段的两个重链之间的二硫键形成。
在本文中，“F(ab')2片段”包含两条轻链以及两条重链，所述重链包含可变区、CH1和CH1与CH2结构域之间的恒定区的一部分，如上所述，在两条重链之间形成了链间二硫键。因此，F(ab')2片段由两个Fab'片段组成，并且两个Fab'片段通过它们之间形成的二硫键彼此结合。
在本文中，“Fv区”是抗体的片段，该片段包含重链和轻链的每个可变区，但不包含恒定区。
在本文中，“单链抗体”是通过经柔性接头连接重链可变区和轻链可变区而形成的抗原结合区的单条多肽链。例如，单链抗体可以是选自由重链可变区和轻链可变区以单链形式连接的scFv，以及重链可变区、轻链可变区和Fc以单链形式连接的scFv-Fc等组成的组中的至少一种。单链抗体可以参考例如美国专利第5,260,203号。
在此，“二价抗原结合蛋白”或“二价抗体”包含两个抗原结合位点。该二价抗体中所包含的两个抗原结合位点可以具有相同的抗原特异性，或者可以分别是结合至不同抗原的双重特异性抗体。在本文中，“多特异性抗原结合蛋白”或“多特异性抗体”靶向两个或更多个抗原或表位。
在本文中，“双特异性”或“双重特异性”抗原结合蛋白或抗体是具有两个不同抗原结合位点的杂种抗原结合蛋白或抗体。这样的双特异性抗体是一种多特异性抗原结合蛋白或多特异性抗体，并且可以通过各种已知方法来产生，例如杂交瘤融合或Fab'片段融合。
在本文中，“双特异性”、“双重特异性”抗原结合蛋白或抗体是具有两个不同抗原结合位点的杂种抗原结合蛋白或抗体。该双特异性抗体是一种多特异性抗原结合蛋白或多特异性抗体，可以通过已知的各种方法来产生，例如，杂交瘤融合或Fab'片段连接等方法。例如，可参考Songsivilai和Lachmann,Clin.Exp.Immunol.1990,79:315-321；并且可以参考Kostelny等人,J.Immunol.1992,148:1547-1553等。双特异性抗原结合蛋白或抗体的两个抗原结合位点所结合的彼此不同的两个表位可以位于相同或不同的靶蛋白上。在一种实施方式中，本发明的抗体可以是另外包含与用于通过血脑屏障递送抗体的递送载体结合的双特异性抗体的形式。通过血脑屏障递送药物的一种方法包括使用递送系统，例如受体介导的胞吞作用，例如细胞中的葡萄糖转运蛋白、氨基酸转运蛋白、胰岛素受体或转铁蛋白受体。
在本文中，“缀合物”是指本文公开的抗体或其抗原结合片段与其他分子的嵌合分子，所述其他分子特别是下述血脑屏障转运蛋白或治疗剂。在缀合物中，本发明的抗体或其抗原结合片段通过共价键或物理力(例如范德华力或疏水相互作用)、包囊、包埋或其组合方法与其他分子结合。在一种实施方式的缀合物中，本发明的抗体或其抗原结合片段可以通过肽接头连接。
本发明还包括与本文公开的一种或多种氨基酸序列具有较高序列同一性的一种或多种氨基酸序列。较高序列同一性是指具有变异的序列维持了本发明公开的效果。在一种实施方式中，该序列与所公开的重链可变区具有约90％、95％或99％的序列同一性。在一种实施方式中，该序列与所公开的轻链可变区具有约90％、95％或99％的序列同一性。例如，在变体显示与本发明公开的抗体或抗原结合片段的序列具有90％、95％或99％的序列同一性的情况下，任何序列变异都发生在可变区的框架内而不是CDR。
根据本发明的特异性结合至α-突触核蛋白或其聚集体的抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，包含CDRH1、CDRH2和CDRH3的互补决定区；以及轻链可变区，包含CDRL1、CDRL2和CDRL3的互补决定区。
在一种实施方式中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段可包含以下CDR序列：
选自SEQ ID NO:434和SEQ ID NO:439的氨基酸序列的重链CDR1(H-CDR1)，
选自SEQ ID NO:435至437和SEQ ID NO:440至441的氨基酸序列的重链CDR2(H-CDR2)，
选自SEQ ID NO:438和SEQ ID NO:442的氨基酸序列的重链CDR3(H-CDR3)，
选自SEQ ID NO:443和SEQ ID NO:446的氨基酸序列的轻链CDR1(L-CDR1)，
选自SEQ ID NO:444和SEQ ID NO:447的氨基酸序列的轻链CDR2(L-CDR2)，和
选自SEQ ID NO:445和SEQ ID NO:448的氨基酸序列的轻链CDR3(L-CDR3)。
表8和表9总结了重链CDR1至CDR3的氨基酸序列和轻链CDR1至CDR3的氨基酸序列。
[表8]重链CDR1至CDR3的氨基酸序列
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[表9]轻链CDR1至CDR3的氨基酸序列
在一种实施方式中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段可包含：重链可变区，其包含：含有SEQ ID NO:434的氨基酸序列的重链CDR1(H-CDR1)、含有选自SEQ ID NO:435至437的氨基酸序列的重链CDR2(H-CDR2)和含有SEQ ID NO:438的氨基酸序列的重链CDR3(H-CDR3)；以及轻链可变区，其包含：含有SEQ ID NO:443的氨基酸序列的轻链CDR1(L-CDR1)、含有SEQ ID NO:444的氨基酸序列的轻链CDR2(L-CDR2)和含有SEQ ID NO:445的氨基酸序列的轻链CDR3(L-CDR3)。
另外，在一种实施方式中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段可包含：重链可变区，其包含：含有SEQ ID NO:439的氨基酸序列的重链CDR1(H-CDR1)、含有选自SEQ IDNO:440至441的氨基酸序列的重链CDR2(H-CDR2)和含有SEQ ID NO:442的氨基酸序列的重链CDR3(H-CDR3)；以及轻链可变区，其包含：含有SEQ ID NO:446的氨基酸序列的轻链CDR1(L-CDR1)、含有SEQ ID NO:447的氨基酸序列的轻链CDR2(L-CDR2)和含有SEQ ID NO:448的氨基酸序列的轻链CDR3(L-CDR3)。
在其他实施方式中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段可包含：
位于H-CDR1的N末端的重链框架(H-FR1)，其包含含有选自SEQ ID NO:449至450和SEQ ID NO:468至473的氨基酸序列的多肽片段，
位于H-CDR1与H-CDR2之间的重链框架(H-FR2)，其包含含有选自SEQ ID NO:451至452和SEQ ID NO:474至477的氨基酸序列的多肽片段，
位于H-CDR2与H-CDR3之间的重链框架(H-FR3)，其包含含有选自SEQ ID NO:453至461和SEQ ID NO:478至483的氨基酸序列的多肽片段，
位于H-CDR3的C末端的重链框架(H-FR4)，其包含含有选自SEQ ID NO:465至467和SEQ ID NO:484至485的氨基酸序列的多肽片段，
位于L-CDR1的N末端的轻链框架(L-FR1)，其包含含有选自SEQ ID NO:486至491和SEQ ID NO:504至510的氨基酸序列的多肽片段，
位于L-CDR1和L-CDR2之间的轻链框架(L-FR2)，其包含含有选自SEQ ID NO:492至494和SEQ ID NO:511至514的氨基酸序列的多肽片段，
位于L-CDR2和L-CDR3之间的轻链框架(L-FR3)，其包含含有选自SEQ ID NO:495至500和SEQ ID NO:515至521的氨基酸序列的多肽片段，和/或
位于L-CDR3的C末端的轻链框架(L-FR4)，其包含含有选自SEQ ID NO:501至503和SEQ ID NO:522的氨基酸序列的多肽片段。
作为可用作本文的框架的氨基酸序列，重链框架序列在表3和4中例示，而轻链框架序列在表10和11中例示。
[表10]重链框架1至2的氨基酸序列
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[表11]重链框架3至4的氨基酸序列
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[表12]轻链框架1至2的氨基酸序列
/>
[表13]轻链框架3至4的氨基酸序列
/>
在其他实施方式中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段可包含重链可变区，所述重链可变区包含：含有选自SEQ ID NO:434和SEQ ID NO:439的氨基酸序列的重链CDR1(H-CDR1)、含有选自SEQ ID NO:435至437和SEQ ID NO:440至441的氨基酸序列的重链CDR2(H-CDR2)和含有选自SEQ ID NO:438和SEQ ID NO:442的氨基酸序列的重链CDR3(H-CDR3)，
其中，重链可变区还包含：含有选自SEQ ID NO:449至450和SEQ ID NO:468至473的氨基酸序列的重链框架(H-FR1)、含有选自SEQ ID NO:451至452和SEQ ID NO:474至477的氨基酸序列的重链框架(H-FR2)、含有选自SEQ ID NO:453至464和SEQ ID NO:478至483的氨基酸序列的重链框架(H-FR3)以及含有选自SEQ ID NO:465至467和SEQ ID NO:484至458的氨基酸序列的重链框架(H-FR4)。更具体地，重链可变区包含：含有SEQ ID NO:450的氨基酸序列的重链框架(H-FR1)、含有SEQ ID NO:451的氨基酸序列的重链框架(H-FR2)、含有选自SEQ ID NO:462至464的氨基酸序列的重链框架(H-FR3)和含有SEQ ID NO:467的氨基酸序列的重链框架(H-FR4)。
另外，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段可包含轻链可变区，所述轻链可变区包含：含有选自SEQ ID NO:443和SEQ ID NO:446的氨基酸序列的轻链CDR1(L-CDR1)、含有选自SEQ ID NO:444和SEQ ID NO:447的氨基酸序列的轻链CDR2(L-CDR2)和含有选自SEQID NO:445和SEQ ID NO:448的氨基酸序列的轻链CDR3(L-CDR3)，
其中，轻链可变区还包含：含有选自SEQ ID NO:486至491和SEQ ID NO:504至510的氨基酸序列的轻链框架(L-FR1)、含有选自SEQ ID NO:492至494和SEQ ID NO:511至514的氨基酸序列的轻链框架(L-FR2)、含有选自SEQ ID NO:495至500和SEQ ID NO:515至521的氨基酸序列的轻链框架(L-FR3)和含有选自SEQ ID NO:501至503和SEQ ID NO:522的氨基酸序列的轻链框架(L-FR4)。更具体地，轻链可变区包含：含有具有SEQ ID NO:491的氨基酸序列的多肽片段的轻链框架(L-FR1)；含有具有SEQ ID NO:492的氨基酸序列的多肽片段的轻链框架(L-FR2)；含有具有SEQ ID NO:500的氨基酸序列的多肽片段的轻链框架(L-FR3)；和含有具有SEQ ID NO:467的氨基酸序列的多肽片段的轻链框架(L-FR4)。
根据本发明的实施方式的抗体或其抗原结合片段可包含：重链可变区，所述重链可变区包含：含有SEQ ID NO:434的氨基酸序列的重链CDR1(H-CDR1)、含有SEQ ID NO:435至437的氨基酸序列的重链CDR2(H-CDR2)和含有SEQ ID NO:438的氨基酸序列的重链CDR3(H-CDR3)；以及轻链可变区，所示轻链可变区包含：含有SEQ ID NO:443的氨基酸序列的轻链CDR1(L-CDR1)、含有SEQ ID NO:444的氨基酸序列的轻链CDR2(L-CDR2)和含有SEQ IDNO:445的氨基酸序列的轻链CDR3(L-CDR3)，
其中，重链可变区包含：含有选自SEQ ID NO:449至450的氨基酸序列的重链框架(H-FR1)、含有选自SEQ ID NO:451至452的氨基酸序列的重链框架(H-FR2)、含有选自SEQID NO:453至464的氨基酸序列的重链框架(H-FR3)和含有选自SEQ ID NO:465至467的氨基酸序列的重链框架(H-FR4)，以及
其中，轻链可变区包含：含有选自SEQ ID NO:486至491的氨基酸序列的轻链框架(L-FR1)、含有选自SEQ ID NO:492至494的氨基酸序列的轻链框架(L-FR2)、含有选自SEQID NO:495至500的氨基酸序列的轻链框架(L-FR3)和含有选自SEQ ID NO:501至503的氨基酸序列的轻链框架(L-FR4)。
优选地，根据本发明的实施方式的抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，所述重链可变区包含含有SEQ ID NO:434、435和438的氨基酸序列的重链CDR1至CDR3；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含含有SEQ ID NO:443、444和445的氨基酸序列的轻链CDR1至CDR3，其中所述重链可变区包含：含有SEQ ID NO:450的氨基酸序列的重链框架(H-FR1)、含有SEQ ID NO:451的氨基酸序列的重链框架(H-FR2)、含有SEQ ID NO:462至464的氨基酸序列的重链框架(H-FR3)和含有SEQ ID NO:467的氨基酸序列的重链框架(H-FR4)；所述轻链可变区包含：含有SEQ ID NO:491的氨基酸序列的轻链框架(L-FR1)；含有SEQ ID NO:492的氨基酸序列的轻链框架(L-FR2)；含有SEQ ID NO:500的氨基酸序列的轻链框架(L-FR3)；含有SEQ ID NO:467的氨基酸序列的轻链框架(L-FR4)，
根据本发明的实施方式的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，所述重链可变区包含含有SEQ ID NO:439的氨基酸序列的重链CDR1(H-CDR1)、含有SEQID NO:440至441的氨基酸序列的重链CDR2(H-CDR2)和含有SEQ ID NO:442的氨基酸序列的重链CDR3(H-CDR3)；以及轻链可变区，所述轻链可变区包含含有SEQ ID NO:446的氨基酸序列的轻链CDR1(L-CDR1)、含有SEQ ID NO:447的氨基酸序列的轻链CDR2(L-CDR2)和含有SEQID NO:448的氨基酸序列的轻链CDR3(L-CDR3)，
其中，重链可变区包含：含有选自SEQ ID NO:468至473的氨基酸序列的重链框架(H-FR1)、含有选自SEQ ID NO:474至477的氨基酸序列的重链框架(H-FR2)、含有选自SEQID NO:478至483的氨基酸序列的重链框架(H-FR3)和含有选自SEQ ID NO:484至485的氨基酸序列的重链框架(H-FR4)，以及
其中，轻链可变区包含：含有选自SEQ ID NO:504至510的氨基酸序列的轻链框架1(L-FR1)、含有选自SEQ ID NO:511至514的氨基酸序列的轻链框架(L-FR2)、含有选自SEQID NO:515至521的氨基酸序列的轻链框架(L-FR3)和含有SEQ ID NO:522的氨基酸序列的轻链框架(L-FR4)。
在全长形式的轻链和重链中，可变区和恒定区通过约12个或更多个氨基酸长度的“J”区相连，并且重链还包含约10个或更多个氨基酸长度的“D”区。例如，可以参考基础免疫学，第二版，第7章(Paul,W.编)1989，纽约：Raven出版社。通常，抗体中轻链和重链对的可变区可以形成抗原结合区。
免疫球蛋白链的可变区通常具有相同的整体结构，并包含由三个称为“互补决定区或结构域”或CDR的高变区连接的相对保守的框架区(FR)。来自构成重链/轻链对的每条链的可变区的CDR通常通过框架区对齐，以便形成与靶蛋白(α-突触核蛋白)的特定表位特异性结合的结构。天然存在的轻链可变区和重链可变区的这些元件通常从N末端到C末端按以下顺序包括：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。根据1987和1991年,NIH,Bethesda,MD))或Chothia&Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人.,1989,自然(Nature)342:878-883中的公开内容，根据Kabat编号系统(免疫学感兴趣的蛋白质的Kabat序列)，指定与可变区中这些元件中的每一个相对应的氨基酸序列的位置。
表14和15中显示了本文公开的各种重链可变区和轻链可变区。这些可变区中的每一个可以与重链恒定区和轻链恒定区偶联以形成完整抗体的重链和轻链。另外，获得的重链序列和轻链序列也可以组合以形成完整的抗体结构。例如，根据本发明的抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段可包含：重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:523至534或SEQ ID NO:535至541的氨基酸序列，和轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ IDNO:542至548或SEQ ID NO:549至556的氨基酸序列；更具体地，所述抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段可包含：重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:523至534的氨基酸序列，和轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:542至548的氨基酸序列，或包含：重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:535至541的氨基酸序列，和轻链可变区，所述轻链可变区包含选自SEQ ID NO:549至556的氨基酸序列。
在本发明的特定实施方式中，抗α-突触核蛋白抗体或其抗原结合片段可包含：重链可变区，所述重链可变区包含选自SEQ ID NO:531至534的氨基酸序列，和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:548的氨基酸序列(例如Hu11F11_(ver.1)、Hu11F11_(ver.2)、Hu11F11_(ver.3)、和Hu11F11_(ver.4)等)，或可包含：重链可变区，所述重链可变区包含SEQ ID NO:525的氨基酸序列，和轻链可变区，所述轻链可变区包含SEQ ID NO:546的氨基酸序列(例如，Hu11F11_(ABL2-4)抗体)。
表14和表15例示了根据一种实施方式的抗体或抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列。
[表14]重链可变区
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[表15]轻链可变区
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另外，表16中描述了示例抗体，其包含根据一种实施方式的抗体或抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区的组合以及恒定区。
[表16]本发明的示例抗体
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为了使本文所述的重链可变区和轻链可变区形成完整抗体的重链和轻链，每个重链可变区和轻链可变区可以与重链恒定区和轻链恒定区结合。如上所述产生的重链和轻链中的每一个可以适当地结合以构成重链-轻链的组合，并且重链-轻链的组合可以形成多聚体(例如IgG型抗体的二聚体)，从而构建完整抗体结构。
恒定区可以适当地选自免疫球蛋白(例如人免疫球蛋白)的重链恒定区和轻链恒定区。例如，重链恒定区可以是IgG1重链恒定区、IgG3重链恒定区或IgG4重链恒定区，而轻链恒定区可以是κ恒定区或λ恒定区，但不限于此。可以适当地选择其他类型的恒定区或修饰的恒定区，并将其用于抗体稳定性、可制造性、抗原亲和力和/或其他期望的特征，这是本领域技术人员清楚理解的。
在其他实施方式中，表14和15中公开的重链可变区和轻链可变区中的每一个可彼此自由结合以形成各种抗体，以及以单链形式连接以产生单链抗体，例如scFv。
本文描述的抗体可以与本文公开的不同抗体共享特定区域或序列。在一种实施方式中，抗体可以共享另一抗体或其抗原结合片段的恒定区。在另一种实施方式中，抗体可以共享Fc区。
在一种实施方式中，本发明的抗α-突触核蛋白抗体还包括单克隆抗体和多克隆抗体。在另一种实施方式中，抗α-突触核蛋白抗体可以是人抗体、人源化抗体、嵌合抗体或来源自动物的抗体。在其他实施方式中，可以重组或化学合成抗α-突触核蛋白抗体。
本文所述的抗体的抗原结合片段或抗体片段可以是选自由scFv、(scFv)2、scFv-Fc、Fab、Fab'、F(ab')2、微抗体、双抗体、scFv等单链抗体分子组成的组中的至少一种。
在其他实施方式中，本文提供的抗体可以是人源化抗体或人抗体，并且可以是各种同种型(例如，IgA、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgE或IgD)，特别是IgG1型、IgG2型、IgG3型或IgG4型，例如IgG1型或IgG2型。
在另一种实施方式中，抗α-突触核蛋白抗体可以仅包含上述重链或轻链。在其他实施方式中，抗α-突触核蛋白抗体仅具有重链可变区或仅具有轻链可变区。
本领域技术人员将理解，当抗体包含本文公开的一个或多个CDR时，公开的CDR中的每一个可以彼此独立地选择并组合。因此，可以制备抗体以包含1、2、3、4、5或6个独立选择的CDR。本领域技术人员还将理解，当选择CDR进行组合时，不会重复使用相同种类的CDR，并且例如，通常不产生包含两个CDR-H2区的抗体。
在一种实施方式中，该抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体。本文公开的抗体包括结合至α-突触核蛋白的单克隆抗体。单克隆抗体可以通过使用本领域已知的任何技术来产生。例如，它可以通过使从免疫的转基因动物中收获的脾细胞永生化来产生。杂交瘤细胞系分泌的单克隆抗体可以使用本领域已知的技术纯化。
在其他实施方式中，抗体可以是动物来源的抗体(例如小鼠抗体等)、嵌合抗体(例如小鼠-人嵌合抗体)、人源化抗体或人抗体。也可以出于各种目的以各种方式修饰抗体。还提供了嵌合抗体和人源化抗体。嵌合抗体是这样的抗体，其中来源自不同抗体的多肽片段共价连接以形成具有免疫功能的轻链、重链或其片段。
在这样的单克隆抗体中，通常构成抗体的非抗原识别部分的特定氨基酸残基被修饰为与对应于人抗体的同种型的对应残基同源。可以用各种已知的方法进行人源化，例如将至少一部分啮齿类动物可变区替换为人抗体的相应区域(美国专利第5,585,089号和第5,693,762号；Jones等人，自然1986，321：522-525；Riechmann等人，自然1988，332：323-27；Verhoeyen等人，科学(Science)1988，239：1534-1536)。
完整的人抗体可以通过免疫转基因动物(通常是小鼠)而产生，该转基因动物可以通过缺乏产生内源性免疫球蛋白而产生人抗体。完整的人抗体也可以来源自噬菌体展示文库。如果使用完整的人抗体，则可以最大程度地减少由对人施用小鼠或小鼠来源的mAb可能引起的免疫原性和过敏性反应。
在一种实施方式中，通过噬菌体展示方法选择本发明的人α-突触核蛋白抗体。通过噬菌体筛选方法选择的α-突触核蛋白特异性的单克隆噬菌体抗体通过使用重组方法转化为完整的IgG形式。获得每种单克隆噬菌体抗体的序列以重组产生抗α-突触核蛋白抗体。将获得的序列中的重链可变区序列与重链恒定区序列连接，并将轻链可变区序列与轻链恒定区序列连接后，用密码子优化方法将氨基酸序列转化为核苷酸序列。将获得的核苷酸序列克隆到用于动物细胞培养的载体中后，用载体转化用于蛋白质生产的宿主细胞(例如CHO细胞)，并进行培养。为了纯化培养基中包含的抗体，使用纯化技术(例如亲和色谱法)分离并纯化重组抗体。
在其他实施方式中，抗体可以具有天然存在的抗体的典型结构或修饰的结构。
具有典型结构的抗体可以具有多聚体结构，该多聚体结构包括包含两条不同多肽链(即重链和轻链)的结构单元。两条不同的多肽链包含一条全长轻链(约25kDa)和一条全长重链(约50至70kDa)。每条链显示出特征性的折叠模式，并且由几个由大约90至110个氨基酸组成的免疫球蛋白结构域组成。这些结构域是由抗体多肽组成的基本单元。每条链的氨基末端部分通常包含称为可变区或V区的部分，该部分是识别抗原的部分。羧基末端部分比氨基末端在进化上更保守，并且它包含称为恒定区或C区的部分。人轻链通常分为κ和λ轻链，它们包含一个可变区和一个恒定区。重链通常分为μ、δ、γ、α或ε链，它们分别定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE同种型。IgG包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，还有许多亚型而不限于此。重链恒定区通常包括一个或多个显示效应功能的结构域。重链恒定区中结构域的数目根据同种型而变化。IgG重链例如包含三个C区域，分别称为CH1、CH2和CH3。本文公开的抗体可以是这些同种型和亚型中的任一种。在一种实施方式中，本发明的抗体是IgG1、IgG2、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4亚型。
根据本申请的α-突触核蛋白抗体以高亲和力特异性识别α-突触核蛋白聚集体，表明α-突触核蛋白抗体可用于诊断或检测这样的疾病。此外，根据本申请的特异性识别α-突触核蛋白聚集体的α-突触核蛋白抗体抑制α-突触核蛋白聚集体的形成，降解聚集体或抑制聚集体的细胞间转移，从而有效地用于治疗突触核蛋白病，特别是帕金森病。
本发明的双特异性抗体的实例示于表17中。
[表17]
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发明效果
在本发明的一种实施方式中制备的抗体以适合于脑内皮转胞吞作用的优化的结合力特异性结合IGF1R，并且可用于递送针对脑退行性疾病和脑癌的治疗性抗体，所述治疗性抗体由于血脑屏障穿透能力低而具有有限的疗效。特别地，本发明中公开的单克隆抗体不影响其同源物的配体(例如IGF-1、IGF-2和胰岛素)与IGF1R的结合，并且在不抑制通过IGF1R的信号传导的情况下发挥作用。因此，它具有与血脑屏障渗透有关的有用性。
本文公开的抗体可以有效地去除或促进α-突触核蛋白聚集体的降解，并抑制α-突触核蛋白的细胞间递送，因此可以有效地用于治疗与α-突触核蛋白聚集体的积累有关的疾病。
附图说明
图1是斑点印迹结果，示出了在本发明的实施方式中制备的α-突触核蛋白抗体以聚集形式特异性结合至天然抗α-突触核蛋白。
图2是针对本发明的实施方式中制备的抗α-突触核蛋白抗体的亲和力进行ELISA分析的结果。
图3a是针对本发明的实施方式中制备的抗α-突触核蛋白抗体优先结合至α-突触核蛋白聚集体的特异性和亲和力进行BIAcore分析的结果。图3b是示出图3a的结果的表格。
图4a是针对本发明的实施方式中制备的抗α-突触核蛋白抗体优先结合至α-突触核蛋白聚集体的优先结合特异性的Octet分析的结果。图4b是示出图4a的结果的表格。
图5a和图5b示出了本发明的实施方式中的3A9和11F11的抗α-突触核蛋白抗体可以分别特异性地识别人脑组织中的路易体和路易神经突(Lewy neurites)的测量结果。结果表明，本发明的抗体结合至路易体(箭头)和路易神经突(左下部分的线状形状)。
图6是本发明实施方式的抗α-抗体的表位作图结果的示意图，其中本发明的抗体主要结合至C末端区域。
图7是在本发明的实施方式中制备的嵌合抗α-突触核蛋白抗体和人源化抗体11F11的亲和力的ELISA分析结果。
图8是针对本发明的实施方式中制备的嵌合抗α-突触核蛋白抗体和人源化抗体11F11优先结合至α-syn聚集体的特异性和亲和力进行BIAcore分析的结果。
图9a、图9b和图10是斑点印迹结果和ELISA分析结果，示出了在本发明的实施方式中制备的嵌合α-突触核蛋白抗体特异性结合至α-突触核蛋白，特别是α-突触核蛋白聚集体，但不结合至β-突触核蛋白、γ-突触核蛋白或淀粉样蛋白β1-42或tau驱使物的特异性。
图11a至图11b是在本发明的实施方式中制备的抗IGF1R抗体与IGF1R蛋白的结合数据。
图12是在本发明的实施方式中制备的抗IGF1R抗体与表达IGF1R的细胞系的结合数据。
图13是与在本发明的实施方式中制备的抗IGF1R抗体内化到表达IGF1R的细胞系内以及细胞系内命运相关的结果数据。
图14是显示在本发明的实施方式中制备的抗IGF1R抗体不影响通过IGF1R或胰岛素的IGF1R信号传导的结果数据。
图15a是显示在本发明的实施方式中制备的抗IGF1R抗体不具有ADCC。
图15b是显示在IGF1R中重复施用后，在本发明的实施方式中制备的抗IGF1R抗体对脑内IGF1R水平没有影响的结果数据。
图15c是显示在本发明的实施方式中制备的抗IGF1R抗体特异性结合至脑内皮细胞而不结合至脑内正常神经元的显微照片。
图16是显示包括抗IGF1R抗体和治疗性抗体的双特异性抗体可以比治疗性抗体更有效地穿透到BBB系统中的结果数据。
图17是显示抗IGF1R抗体以及包括抗IGF1R抗体和治疗性抗体的双特异性抗体一旦适用于大鼠，在脑和CSF中的分布高于单独的治疗性抗体。
图18是鉴定在本发明的实施方式中制备的抗IGF1R抗体中脱酰胺的残基的结果。
图18b是通过取代特异性氨基酸来阻止脱酰胺的变体。
图19是抗IGF1R抗体的表位作图结果。
图20a和图20b是测量本发明实施方式的双特异性抗体对每种抗原的亲和力的ELISA分析结果。
图20c和图20d是比较嵌合抗体和人源化抗体与每种抗原的结合的ELISA分析结果。
图20e是评估对本申请的实施方式中制备的双特异性抗体的小胶质细胞吞噬活性的结果。
图21a至21e是评估与单一抗体相比，本申请的实施方式中制备的双特异性抗体在小鼠动物模型中的功效的结果。
图22是显示通过对在本申请的实施方式中制备的双特异性抗体进行Fc工程化而增加的半衰期和改善的BBB渗透的结果。
具体实施方式
实施例1：小鼠α-突触核蛋白抗体的制备
1-1：免疫和杂交瘤生产
将具有全长(140个残基)或C末端21个残基被切割的(119个残基)的α-突触核蛋白单体放入37℃的热混合器中，以1050rpm的转速振荡下聚集14天，然后进行超声处理。将140个残基和119个残基的α-syn原纤维中的每种以1:1(体积:体积)的比例与佐剂混合。
智人α-突触核蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:559)：
MDVFMKGLSKAKEGVVAAAEKTKQGVAEAAGKTKEGVLYVGSKTKEGVVHGVATVAEKTKEQVTNVGGAVVTGVTAVAQKTVEGAGSIAAATGFVKKDQLGKNEEGAPQEGILEDMPVDPDNEAYEMPSEEGYQDYEPEA
然后，将200μL制备的混合物皮下注射到5至7周龄的BALB/c雌性小鼠中。2周后，进一步皮下注射200μL制备的混合物以进行抗体加强。加强免疫一周后，收集血液，并使用所施用的抗原通过ELISA方法进行免疫滴定。随后，通过仅皮下注射抗原进行第三次加强免疫。
除去免疫小鼠的脾脏，从脾脏中获得脾细胞。将脾细胞悬浮在补充有10％FBS的杂交瘤-SFM培养基(美国Thermo Fisher Scientific公司)中。为了制备杂交瘤，将脾细胞和鼠骨髓瘤细胞的SP2/0-Ag14在没有血清的杂交瘤-SFM培养基中混合，然后离心除去培养基。然后，将PEG添加到获得的细胞沉淀中，并在37℃下孵育1分钟以诱导细胞融合。
1-2：单细胞克隆和抗体纯化
融合2周后，使用施用至小鼠的抗原和细胞培养基，通过ELISA法确认与产生抗体的小鼠B细胞的融合。然后，使用杂交瘤进行单细胞克隆以选择16种产生单克隆抗体的杂交瘤。使用全长(140个残基)α-Syn的聚集体作为抗原来获得9B11克隆(IgG1κ)，并使用C末端的21个残基被切割的α-Syn聚集体作为抗原获得3A9和11F11的克隆(分别为IgG2bκ和IgG2bκ)。
为了纯化抗体，将每种杂交瘤在含有10％FBS的RPMI1640培养基中培养。为了产生抗体，用无血清的SFM培养基代替培养基并培养约4天。分离细胞培养上清液，离心，用0.22μm过滤器过滤，并用用于IgG1型的蛋白G柱和用于其余抗体的蛋白A柱纯化。
1-3：确定可变区序列
可变区和CDR序列通过参考Ahn等人，Mol.Cells 2004,18(2):237-241的公开内容确定。培养杂交瘤并离心以仅分离细胞。通过添加三唑从分离的杂交瘤中分离RNA，并将该RNA作为模板用于合成cDNA。通过测序确认可变区和CDR序列。
实施例2.抗α-突触核蛋白(嵌合)抗体的制备
2-1：抗体的克隆与表达
通过使用人源化后获得的重链可变区和轻链可变区抗体的核苷酸序列，合成了短核苷酸片段的gblock(m.biotech)，并将其克隆到动物细胞培养载体(pcDNA3.4)中。通过在可变区之前和之后包含约20bp的重叠序列来合成gblock，并且pcDNA3.4载体的除可变区之外的部分通过PCR扩增，并通过Gibson装配法克隆。
为了转染并表达克隆的抗体，使用制备的载体进行maxi-prep(Qiagen公司)以获得大量质粒DNA，然后如下引入细胞中。转染前一天，将ExpiCHOTM(Gibco公司，目录：A29127)细胞的浓度在ExpiCHOTM表达培养基(Gibco公司，目录：A29100-01)中调节至3×106至4×106个活细胞/mL的浓度，并在8％CO2，37℃和120rpm下培养1天。在DNA转染的当天，将生长至7×106至10×106个活细胞/mL并且存活率为95％或更高的细胞通过使用新鲜培养基稀释至6×106个活细胞/mL进行制备。
为了转染亲本细胞，通过使用ExpiFectamineTMCHO转染试剂盒(Gibco公司，目录号：A29129)制备ExpiFectamineTMCHO和质粒DNA复合物。通过分装冷的OptiPROTM (Gibco，Cat：12309019)培养基，以适当的浓度制备DNA和ExpiFectamineTMCHO试剂，分别接种，混合并在室温下静置5分钟。将产物接种到亲本细胞中，并在转染后培养。转染后的第二天，将ExpiFectamineTMCHO转染试剂盒中包含的增强剂和饲培剂(feed)接种到转染的细胞中，并在5天后再接种饲培剂，然后在8％CO2，37℃和120rpm下孵育10天，以产生转染的细胞。
为了获得培养液，将培养基转移到离心瓶中进行离心分离，在4℃和6500rpm下离心30分钟，然后用尺寸为0.2μm的过滤器过滤，获得除去悬浮固体的培养基，然后将该培养基用于随后的纯化。
2-2：抗体的纯化和测序
使用HiTrap MabSelectSure(GE Healthcare公司，11-0034-94)纯化培养物。用平衡缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.2，100mM NaCl)平衡后，将回收的培养物上样到柱上。上样完成后，将培养基用50mM柠檬酸钠(pH 5.0)洗涤，然后使用50mM柠檬酸钠(pH 3.4)洗脱。向洗脱液中添加1M Tris-HCl pH 9.0，以中和至pH 6.0。然后，将洗脱液进行缓冲液交换，并用PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4)浓缩，并保存在4℃下直至随后使用。
当需要进一步纯化时，第二次纯化根据洗脱样品的大小通过使第一纯化产物通过在HiLoad 26/600superdex 200柱上的1X PBS缓冲液而进行。通过质谱法分析纯化的抗体的氨基酸序列，并确认与小鼠来源的单克隆抗体的可变区一致。
用通过上述方法鉴定的3A9、9B11和11F11抗体的可变区替换IgG1同种型的骨架可变区部分以制备嵌合人IgG1抗体。在所获得的嵌合抗体中，特别地，Ch11F11抗体为IgG形式的抗体，并且包括SEQ ID NO:90的重链可变区序列(ch11F11-VH)和SEQ ID NO:109的轻链可变区序列(ch11F11-VL)的组合；Ch 3A9抗体为IgG形式的抗体，并且包括SEQ ID NO:102的重链可变区序列(ch11F11-VH)和SEQ ID NO:116的轻链可变区序列(ch11F11-VL)的组合。
实施例3：人源化抗体的产生
3-1：文库噬菌体的制备
构建将小鼠或人源序列引入每个CDR残基，同时将人框架与嵌合抗体的CDR1、CDR2和CDR3残基结合的微型文库。将产生的微型文库的感受态细胞接种在含34μg/ml氯霉素(Sigma，C0857)、2％葡萄糖(Sigma，G5400)和5mM MgCl2(Sigma，C0857)的2X YT培养基[17gTripton(CONDA公司，1612.00)、10g酵母提取物(CONDA公司，1702.00)和5g NaCl(Sigma公司，S7653)]中，在30℃下保持3小时以使得OD600为0.5至0.7。然后，用辅助噬菌体感染细胞，并在含有34μg/ml氯霉素、5mM MgCl2、70μg/ml卡那霉素(Sigma公司，K1876)和1mM IPTG(ELPISBIO公司，IPTG025)的2X YT培养基中在30℃下培养16小时以诱导噬菌体包装。将培养溶液在4℃下以4500rpm离心15分钟。向上清液中添加4％PEG 6000(Fluka公司，81253)和3％NaCl(Sigma公司，S7653)，并在冰上孵育1小时。将产物在4℃下以8000rpm离心20分钟，然后，将沉淀悬浮在PBS中，并在4℃和12,000rpm下再次离心10分钟，以获得包含噬菌体文库的上清液。将获得的上清液保存在4℃直到以后使用。
3-2：噬菌体展示淘选
将10μg/ml的重组α-突触核蛋白聚集体添加到免疫试管(maxisorp 444202)中的PBS中，4℃过夜使蛋白质吸附在试管表面上后，将牛血清白蛋白(BSA)以3％的浓度添加到试管中，从而保护未吸附α-突触核蛋白聚集体的表面。排空试管后，将分散在BSA 3％溶液中的1012CFU抗体噬菌体文库放入吸附有α-突触核蛋白单体的免疫试管，并反应1小时(阴性选择)。回收未结合至α-突触核蛋白单体的噬菌体，并在室温下在附着有α-突触核蛋白聚集体的免疫试管中2小时发生结合。然后，将非特异性结合的噬菌体用PBS-T(0.05％吐温20)溶液洗涤5至30次，并使用100mM三乙胺溶液回收剩余的抗原特异性噬菌体抗体。用1M Tris缓冲液(pH 7.4)中和回收的噬菌体后，在37℃下感染ER2537大肠杆菌1小时，然后将感染的大肠杆菌在含有羧苄青霉素的2X YT琼脂培养基上涂布在37℃下培养过夜。第二天，将培养的大肠杆菌悬浮在4ml的含有羧苄青霉素的2X YT培养液中，并添加15％甘油，一部分保存在-80℃，其余用于制备用于下次实验的噬菌体。通过总共重复3轮该过程，扩增并浓缩α-突触核蛋白抗原特异性噬菌体池。随着淘选过程的进行，使得使用PBS-T进行洗涤的次数增加，以扩增和浓缩抗原特异性噬菌体。
3-3：单克隆筛选
为了从通过淘选获得的噬菌体池中分选出特异性结合至α-突触核蛋白聚集体的单克隆抗体，进行如下实验。
为了从浓缩池中分离出单克隆，在LB-四环素/羧苄青霉素琼脂培养基上涂布噬菌体池并培养后，获得了单菌落。然后，将单克隆接种到96孔深孔板中，每孔分别放置400μl2X YT-四环素/羧苄青霉素培养基并过夜生长，然后将10μl培养液放入添加了390μl 2XYT-四环素/羧苄青霉素培养基的新的96孔深孔板中，在37℃下培养4小时。将1mM IPTG添加到培养液中，并在30℃下培养过夜。将过夜培养的培养液离心以得到上清液。
然后，通过使用如下ELISA方法，选择表达结合至α-突触核蛋白聚集体的单克隆可溶性scFv的克隆(Steinberger.Rader and Barbas III.2000.噬菌体展示载体(Phagedisplay vectors).在噬菌体展示实验手册(Phage Display Laboratory Manual)中.第一版.冷泉港出版社.NY.USA.pp.11.9-11.12)。具体地，将实施例1-1中选择的7B7抗体置于96孔板(Nunc-Immuno Plates，美国NUNC公司)上，并在4℃下包被过夜。将3％BSA以200μL的量添加到每个孔中，然后在37℃下封闭2小时。然后，将α-突触核蛋白聚集体和单体以100ng/孔的浓度上样，在37℃下反应2小时，并用300μL PBS-T洗涤五次。将制备的单克隆上清液与3％BSA以1:1(体积:体积)的体积比混合，并将100μL的溶液上样到与聚集体和单体结合的板上，然后在37℃下反应2个小时。将细胞用300μL的PBS-T洗涤五次，并在37℃下与抗HAHRP缀合的抗体一起孵育1小时，然后用PBS-T洗涤五次。添加100μL TMB(四甲基联苯胺，Sigma公司，T0440)后，通过添加50μL1 N H2SO4来终止反应，从而测量450nm处的吸光度。将吸光度为0.5或更大的克隆视为结合的阳性反应，并且排除非特异性结合BSA的克隆。
同时对文库中发现的克隆的CDR残基平行进行硅胶分析，选择了导致与框架结合的严重问题的克隆，或除CDR外框架部分中不具有T细胞表位、B细胞表位和MHCII表位的克隆。
随后，对于通过以下重链可变区和轻链可变区的组合制备的五种抗体，将人IgG1同种型的人源化抗体可变区替换为骨架可变区部分，以制备五种IgG1骨架人源化抗体。具体地，Hu11F11_(ABL2-4)是IgG型抗体，并且包括SEQ ID NO:92(Hu11F11-VH2)的重链可变区序列和SEQ ID NO:113(Hu11F11-VL4)的轻链可变区序列的组合。Hu11F11_(ver.1)是IgG型抗体，并且包括SEQ ID NO:98的重链可变区序列(Hu11F11-VH-v1)和SEQ ID NO:115的轻链可变区序列(Hu11F11-VLv3 4c)的组合。Hu11F11_(ver.2)是IgG型抗体，并且包括SEQ IDNO:99的重链可变区序列(Hu11F11-VH-v2)和SEQ ID NO:115的轻链可变区(Hu11F11-VLv34c)的组合。Hu11F11_(ver.3)是IgG型抗体，并且包括SEQ ID NO:100的重链可变区序列(Hu11F11-VH-v3)和SEQ ID NO:115的轻链可变区序列(Hu11F11-VLv3 4c)。
Hu11F11(ver.4)是SEQ ID NO:101的重链可变区序列(Hu11F11-VH-v4)和SEQ IDNO:115的轻链可变区序列(Hu11F11-VLv3 4c)的组合。
实施例4.通过使用α-突触核蛋白抗体分析抗原结合特异性和结合亲和力
4-1：使用抗α-突触核蛋白抗体进行斑点印迹分析
进行斑点印迹实验以分析本发明的抗体是否以天然状态结合单体或聚集体。对于该实验，将50ng或100ngα-syn单体或纤维蛋白(由国立首尔大学的Lee Seung-jae教授制备，Bae等人,J.Neurosci 32:13454,2012)在硝酸纤维素膜上点样。将两倍稀释的单体或原纤维蛋白从膜的右侧向左侧依次上样(12.5、25、50、100ng)。在室温下用5％TBST组合物的脱脂奶粉封闭膜1小时。将实施例1中制备的1mg/ml的α-syn抗体添加到含有1％牛血清白蛋白的TBST中，并在室温下孵育1小时。用TBST洗涤后，使用化学发光底物(NEN)作为底物，并根据制造商的手册对缀合有HRP(辣根过氧化物酶)的二抗进行信号分析。使用LAS-3000发光图像分析系统(FUJIFILM生命科学公司)对结果进行成像。结果示于图1中。
如图1所示，发现与α-突触核蛋白单体相比，本发明的α-突触核蛋白抗体优先结合聚集体。特别是9B11、3A9和11F11仅结合至聚合体。274抗体(Bae等人,J Neurosci.2012Sep26；32(39):13454-13469)用作同时与单体和聚集体结合的比较抗体。
4-2：使用小鼠单克隆抗α-Syn抗体的ELISA分析
进行ELISA分析以定量分析本发明的抗体与抗原的结合亲和力。为此，将实施例1中获得的α-突触核蛋白抗体以1ug/ml的浓度包被在96孔板上，并用α-突触核蛋白原纤维聚集体以10、100、1000和10,000ng/ml进行处理。用PBS洗涤后，处理缀合有HRP的链霉亲和素和缀合有生物素的二抗，然后与作为底物的TMB反应。测量吸光度，结果示于图2。
如图2所示，发现本发明的抗体优先以高结合亲和力结合至聚集体。ELISA结果表明，优先结合至聚集体的抗体具有0.1×10-9M至2×10-9M的亲和力，而同时结合至单体和聚集体的抗体与这些抗体相比具有约1×10-10M的更高亲和力。本发明的抗体优先以高亲和力结合至α-突触核蛋白聚集体，但是不能获得对单体的亲和力，因为它以比聚集体低的亲和力结合至单体上或不与单体结合。这些结果表明抗体可以有效地去除或抑制引起与α突触核蛋白病因有关的神经退行性疾病例如帕金森病的药物的作用。
4-3.使用抗α-突触核蛋白抗体的BIAcore分析
使用BIAcore分析对实施例1中制备的α-突触核蛋白抗体与单体和聚集抗原的结合进行定量分析。
使用的仪器是T200(GE Healthcare公司，S/N：1565888)。蛋白A用作芯片(GEHealthcare公司，目录号29-1275-56)。将10mM甘氨酸-HCl pH 1.5(GE Healthcare公司，目录号BR-1003-54)作为再生缓冲液。运行缓冲液、分析物稀释液和样品稀释液缓冲液为HBS-EP。将实施例1中制备的α-syn抗体(3A9、9B11和11F11)用1×HBS-EP(GE Healthcare公司，目录号BR-1006-69)稀释，一式两份连续稀释α-突触核蛋白单体(1mg/ml)和原纤维蛋白(3mg/ml)，并以包括0nM的总共6种浓度(0、0.39、1.56、6.25、25、100nM)进行分析。对于捕获，单体的RU为800(理论值)，原纤维的RU为100(理论值)。以60秒的接触时间、30μl/分钟的流速和180秒的稳定时间进行捕获阶段。缔合阶段以120秒的缔合时间和30μl/分钟的流速进行。解离阶段以360秒的解离时间和30μl/分钟的流速进行。再生阶段以240秒(第一次)和60秒(第二次)的再生时间和30μl/分钟的流速进行两次。使用1:1结合模型进行拟合，评估软件为BIACore T200评估软件(GE Healthcare公司)。结果示于图3a和3b中。
图3a是针对本发明实施例中制备的单克隆抗体优先结合至α-突触核蛋白聚集体的特异性和亲和力进行BIAcore分析的结果。其示出了本发明的抗体以高亲和力结合至聚集体。这些结果表明抗体可以有效地去除或抑制引起与α突触核蛋白病因有关的神经退行性疾病例如帕金森病的药物的作用。图3b是示出图3a的结果的表格。
如图3a和图3b所示，通过上述其他方法，在分析的四种α-突触核蛋白抗体中确认了优先结合至聚集体的3A9、9B11和11F11在BIAcore分析中以约1×10-9M至3×10-9M的高亲和力仅结合至聚集体上。
4-4.使用小鼠单克隆抗α-Syn抗体进行Octet分析
使用Octet对实施例1中制备的α-突触核蛋白抗体(3A9、9B11、11F11)与单体和聚集体抗原的结合进行定量分析。
具体地，运行缓冲液为在1000rpm下的1×KB缓冲液(目录号18-1092)或1×PBS缓冲液，固定缓冲液为pH 5的乙酸钠(10mM，目录号18-1068)。α-syn单体为固定化的α-syn抗原，原纤维为固定化的测试抗体。对于单体，目标浓度为20μg/ml，对于原纤维，目标浓度为0.4μg/ml。动力学浓度从50nM的单体和100nM的原纤维依次稀释两次，总共分别给出7个浓度点。单体的缔合时间/解离时间为5分钟/20分钟，原纤维的缔合时间/解离时间为5分钟/25分钟。生物传感器为ARG2，采用1:1拟合模型进行拟合。结果示于图4。图4a是针对本发明的实施方式的α-突触核蛋白抗体优先结合α-Syn聚集体的优先结合特异性进行Octet分析的结果。
如图4a所示，已显示3A9、9B11和11F11几乎不结合至单体(红色虚线框)，但是良好地结合至聚集体(红色虚线框中的上升线图)。这些结果与斑点印迹、Octet和ELISA分析中的结果相似或一致，表明通过上述其他方法确认了在所分析的四种α-突触核蛋白抗体中3A9、9B11和11F11优先结合至聚集体，在Octet分析中仅结合至聚集体。图4b是示出图4a的结果的表格。图4a和图4b显示了优先结合至α-突触核蛋白聚集体，并且与图1的结果一致。发现用作对照组的#274抗体与单体和聚集体均良好结合。
实施例5.通过抗α-突触核蛋白抗体检测人脑组织中的路易体
通过使用实施例5中使用的抗体，对从死于帕金森病的患者(悉尼大学Halliday博士)获得的约10微米厚的石蜡包埋脑切片中的路易体和路易神经突进行如下染色。组织切片用90％甲酸处理3分钟以进行抗原修复，然后通过1％H2O2(50％乙醇基)抑制组织本身的过氧化物酶活性。处理10％的正常马血清以防止组织的非特异性结合。随后，在用磷酸盐缓冲液洗涤后，将相邻的切片用本发明的3A9、11F11和11F11抗体在4℃下过夜处理。用磷酸盐缓冲液洗涤后，将缀合有生物素的抗人IgG抗体在37℃下处理30分钟，并将亲和素-生物素复合物在室温下反应30分钟(Vectastatin Elite试剂盒；Vector Laboratories)。
然后，用含有0.005％H2O2的DAB显色，并用0.5％甲酚紫对切片复染，以区分每个细胞。结果示于图5a和5b中。
图5a和图5b示出了根据本发明的实施方式的3A9和11F11的单克隆抗体可以分别特异性地识别人脑组织中的路易体和路易神经突的测量结果。结果表明，本发明的抗体结合至路易体(箭头)和路易神经突(左下部分的线状形状)。
如图5a和图5b所示，本发明的抗体显示出有效结合至路易体和路易神经突(箭头所示)。这些结果表明，它能够有效结合至人脑组织中路易体成分的α-突触核蛋白聚集体。这显示了递送至人脑的抗体可以有效且特异性地结合至α-突触核蛋白聚集体。这些结果表明，本发明的抗体实际上可以特异性地结合至人脑组织中的α-突触核蛋白聚集体，并且可以有效地用于预防和/或治疗与α-突触核蛋白病因有关的疾病。
实施例6.抗α-突触核蛋白抗体的表位分析
通过请求PEPSCAN(荷兰)进行肽等位基因分析来进行实施例2中获得的作为嵌合抗体的3A9和11F11抗体的表位作图。结果在图6中示出。图6是本发明的实施方式的抗体的表位作图结果的示意图。
如图6所示，已经证明本发明的大多数抗体结合至C末端区域。识别N末端的α-突触核蛋白抗体无法识别统称为α-突触核蛋白相关疾病的属于突触核蛋白病的其它疾病(例如多系统萎缩症)的聚集体。相反，识别C末端区域的α-突触核蛋白抗体在识别其他各种突触核蛋白病和帕金森病的聚集体方面具有优势。特别地，如上所述，识别110和122个残基之间的区域的抗体已经显示优先结合至聚集体。
实施例7.使用抗α-突触核蛋白抗体的ELISA分析
按照与实施例4-2基本相同的方法，进行夹心ELISA以定量分析实施例2中获得的嵌合抗体(Ch11F11)和实施例3中获得的人源化抗体(Hu11F11)的结合亲和力。
具体地，将每种抗体按1/10的比例以0.04至400nM的浓度稀释并在96孔板上包被，然后用突触核蛋白原纤维聚集体以2000ng/ml处理每个孔。用1×PBS洗涤后，处理缀合有HRP的链霉亲和素和缀合有生物素的二抗，然后与作为底物的TMB反应。测量吸光度。结果示于图7中。
如图7所示，证实了根据本发明的人源化抗体，尤其是来源自嵌合11F11抗体的人源化抗体(人源化11F11抗体)展示出与嵌合11F11克隆等效的结合亲和力。这证实了，人源化抗体，尤其是衍生自eh嵌合11F11的人源化抗体，例如hu11F11(ver.1)(包括Hu11F11-VH-v1和Hu11F11-VLv3 4c的组合)、hu11F11(ver.2)(包括Hu11F11-VH-v1和Hu11F11-VLv34c)、hu11F11(ver.3)(包括Hu11F11-VH-v3和Hu11F11-VLv3 4c)和hu11F11(ver.4)(包括Hu11F11-VH-v4和Hu11F11-VLv3 4c的组合)，展示了与嵌合11F11等效的结合亲和力，EC50值为11.5至15.1nM，显示类似于嵌合11F11抗体的EC50(为12.5nM)。
实施例8：使用抗α-突触核蛋白抗体的BIAcore分析
根据与实施例4-3基本相同的方法，进行BIAcore分析以定量分析实施例2中获得的嵌合抗体(Ch11F11)和实施例3中获得的人源化抗体(Hu11F11)的结合亲和力。分析结果示于图8和下表中。
[表18]
克隆名称 KD(nM)
Ch11F11 0.02472
Hu11F11(ver.2) 0.0596
Hu11F11(ver.3) 0.0316
Hu11F11(ver.4) 0.0204
结果，本发明的人源化抗体，尤其是克隆11F11的变体，即hu11F11(ver.2)(Hu11F11-VH-v2和Hu11F11-VLv3 4c的组合)、hu11F11(ver.3)(Hu11F11-VH-v3和Hu11F11-VLv3 4c的组合)或hu11F11(ver.4)(Hu11F11-VH-v4和Hu11F11-VLv3 4c的组合)，显示出与嵌合11F11克隆相似的KD值。至于结合亲和力，人源化克隆显示KD值为0.02至0.06×10-9M，而嵌合11F11克隆显示低KD值，为0.02×10-9M。也就是说，人源化克隆显示与聚集体高的结合亲和力。
实施例9.通过嵌合抗体评估与α-突触核蛋白的特异性结合
9-1：β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白的ELISA分析
在根据实施例2产生三种嵌合抗体3A9、9B11和11F11之后，将抗体对α-突触核蛋白的结合特异性与作为α-突触核蛋白的同源物的β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白的ELISA分析结果进行比较。
为了进行评估，将人β-突触核蛋白(Uniprot：Q16143)蛋白(CUSABIO公司，目录号：CSB-EP624090HU)和人γ-突触核蛋白(Uniprot：O76070)蛋白(CUSABIO公司，目录号：CSB-EP021915HU)以100ng/ml的浓度在96孔板上包被，洗涤，然后用5％BSA封闭2小时。此时，将结合所有α-突触核蛋白、β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白的泛-Syn抗体(santacruz公司，目录：FL-140，sc-10717，兔)用作阳性对照。洗涤后，将按1/10的比例以0.04至400nM的浓度稀释的嵌合抗体(3A9、9B11、11F11)处理2小时，用PBS洗涤，然后用作为检测抗体的HRP结合的山羊抗hFc抗体处理。之后，在与作为底物的TMB反应后，在450nm和650nm处测量吸光度。对于阳性对照，使用HRP结合的山羊抗兔抗体作为检测抗体。
实验结果示于图9a和图9b中。它们是ELISA分析结果，显示嵌合抗体(3A9、9B11、11F11)对人β-突触核蛋白和人γ-突触核蛋白具有非常低的结合亲和力。相反，作为阳性对照的泛-Syn抗体显示出对β-突触核蛋白和γ-突触核蛋白的高结合亲和力。图9a涉及人β-突触核蛋白，图9b涉及人γ-突触核蛋白。
9-2：β-淀粉样蛋白和tau聚集体的斑点印迹分析
实施例2中获得的三种类型的嵌合抗体3A9，9B11和11F11与淀粉样蛋白β1-42(Uniprot：P05067；CAS编号：107761-42-2)和Tau蛋白(UNIPORT：P10636-8)的聚集体进行反应。通过与斑点的反应分析了抗体与α-突触核蛋白聚集体的特异性结合能力。这样的原因如下。
淀粉样蛋白β1-42和tau蛋白形成聚集体，该聚集体被认为是神经退行性疾病，尤其是阿尔茨海默病的重要病因，并且该聚集体具有类似α-突触核蛋白聚集体的寡聚体、初原纤维和原纤维。因此，斑点印迹证实了嵌合抗体3A9、9B11和11F11识别α-突触核蛋白的特定序列，并且不识别来源自α-突触核蛋白、淀粉样蛋白β和tau的聚集体的共同结构。
以与实施例4-3基本相同的方式进行本实施例的斑点印迹法，重组淀粉样β1-42、tau蛋白及其聚集体由国立首尔大学的Seung-jae Lee教授(Professor Seung-jae Lee ofSeoul National University)制备。SYN-1、6E10和Tau5是已知分别结合至α-突触核蛋白、淀粉样蛋白β1-42和tau蛋白的抗体。分析结果如图10所示。
实验结果示于图10中，表明本发明的嵌合抗体3A9、9B11和11F11仅特异性结合至α-突触核蛋白衍生的聚集体，而不特异性结合至淀粉样蛋白β1-42和tau来源的聚集体。与此相反，6E10和Tau5抗体，已知分别结合淀粉样蛋白β1-42和Tau，在斑点印迹上显示出结合至相应的聚集体。
根据以上结果，嵌合抗体不结合至α-突触核蛋白的同源物和来源于不同蛋白质的聚集体，但是仅有效地与靶蛋白质结合。这说明可以具有比结合至同源物和来源于不同蛋白质的聚集体的抗体或药物更优异的功效。
实施例10.双特异性抗体的产生
10-1：二价双特异性抗体克隆
为了构建二价双特异性抗体表达载体，将包括信号序列的抗体核苷酸序列插入到pcDNA3.4载体(invitrogen)的多克隆位点(MCS)中。双特异性抗体表达载体是单顺反子载体，分别制备了重链表达载体和轻链表达载体。
随着重链序列插入重链表达载体，抗IGF1R scFv通过接头连接至免疫球蛋白的C末端，其中编码抗α-突触核蛋白抗体的重链可变区与人重链恒定区连接。作为插入轻链表达载体的轻链序列，将编码抗α-突触核蛋白抗体的轻链可变区与人轻链恒定区连接。
10-2：单价双特异性抗体克隆
单价双特异性抗体是一种异二聚体，其由抗IGF1R scFv在C末端连接的抗α-突触核蛋白免疫球蛋白的重链(臼)和未连接scFv的抗α-突触核蛋白免疫球蛋白的重链(杵)以及缀合至异二聚体的轻链组成。
为了提高重链异二聚体的缀合效率，使用了杵臼技术。即，将臼型重链的编码序列在CH3部分中替换为T366S、L368A和Y406V，并且将杵型重链的编码序列在CH3部分中替换为具有T366W的氨基酸。
10-3：瞬时表达
制备的载体进行maxi-prep(Qiagen)，获得大量质粒DNA。然后，将它们按如下方式引入细胞。为了产生单价BsAb，将重链的表达载体DNA和轻链的表达载体DNA以1:1的比例进行转染。为了产生单价的BsAb，臼型重链的表达载体DNA、杵型重链的表达载体DNA以及轻链的表达载体DNA分别以0.5:0.5:1的比例转染。
转染前一天，将ExpiCHOTM(Gibco公司，目录：A29127)细胞的浓度在ExpiCHOTM表达培养基(Gibco公司，目录：A29100-01)中调节至3×106至4×106个活细胞/mL的浓度，并然后在8％CO2，37℃和120rpm下培养1天。在DNA转染的当天，将生长至7×106至10×106个活细胞/mL且存活率为95％或更高的细胞通过使用新鲜培养基稀释至6×106个活细胞/mL。
为了转染亲本细胞，通过使用ExpiFectamineTMCHO转染试剂盒(Gibco公司，目录号：A29129)制备ExpiFectamineTMCHO和质粒DNA复合物。通过分装冷的OptiPROTM (Gibco，Cat：12309019)培养基，以适当的浓度制备DNA和ExpiFectamineTMCHO试剂，分别接种，混合并在室温下静置5分钟。将产物接种到亲本细胞中，并在转染后培养。转染后的第二天，将ExpiFectamineTMCHO转染试剂盒中包含的增强剂和饲培剂(feed)接种到转染的细胞中，并在5天后再接种饲培剂，然后在8％CO2，37℃和120rpm下孵育10天，以产生转染的细胞。/>
10-4：培养基收获
为了获得完全生产的培养液，将培养基转移到离心瓶中进行离心分离，在4℃和6500rpm下离心30分钟，然后用尺寸为0.2μm的过滤器过滤，获得除去悬浮固体的培养基，然后将该培养基用于随后的纯化。
实施例11.IGF1R抗体(scFV)的产生
11-1：IGF1R抗体(scFV)的制备
通过使用噬菌体展示/淘选技术来制备单克隆抗体。具体而言，将噬菌体展示淘选和其他分析中使用的抗原作为以下蛋白质使用。从人IGF1R胞外域中切除信号序列的由SEQID NO:99的氨基酸序列的31至932个残基组成的肽在C末端用组氨酸标记，并用于本实施例(美国R&D SYSTEMS公司，391-GR)。使用在C末端带有His标签的猴IGF1R(加拿大国家研究委员会)、小鼠IGF1R(R&D SYSTEMS公司，6630-GR/CF)和大鼠IGF1R(加拿大国家研究委员会)作为抗原来测试种间交叉反应性。
将具有多样性的来源于人的1×1010的ScFv(单链可变片段)文库细胞(由梨花女子大学的SHIM Hyunbo制备)接种在含34μg/ml氯霉素(Sigma，C0857)、2％葡萄糖(Sigma，G5400)和5mM MgCl2(Sigma，C0857)的2X YT培养基[17g Tripton(CONDA公司，1612.00)、10g酵母提取物(CONDA公司，1702.00)和5g NaCl(Sigma公司，S7653)]中，在30℃下培养3小时以使得OD600为0.5至0.7。然后，用辅助噬菌体感染细胞，并在含有34μg/ml氯霉素、5mMMgCl2、70μg/ml卡那霉素(Sigma公司，K1876)和1mM IPTG(ELPISBIO公司，IPTG025)的2X YT培养基中在30℃下培养16小时以诱导噬菌体包装。将培养溶液在4℃下以4500rpm离心15分钟。向上清液中添加4％PEG 6000(Fluka公司，81253)和3％NaCl(Sigma公司，S7653)，并在冰上孵育1小时。将产物在4℃下以8000rpm离心20分钟，然后，将沉淀在PBS中悬浮，并在4℃和12,000rpm下再次离心10分钟，以获得包含噬菌体文库的上清液。将获得的上清液保存在4℃直到以后使用。
11-2：噬菌体展示淘选
为了筛选人IGF1R抗体，按照以下方法进行三轮淘选。噬菌体文库是合成的人scFv文库，噬菌体展示淘选的过程和结果示于表19。
[表19]
具体而言，将1ml浓度为5ug/ml的重组人IGF1R蛋白(美国R&D Systems公司，391-GR或美国Sino Biological Life Technologies公司，10164-H08H-50R)添加到免疫试管(maxisorp 444202)，并在4℃下包被在免疫试管表面上16小时。然后，去除上清液，并在37℃下添加含3％BSA的PBS孵育1小时，以通过使BSA结合至未结合IGF1R的表面来阻断非特异性结合。去除上清液后，将实施例11-1中制备的与BSA 1.5％溶液混合的噬菌体文库放入免疫试管中，并在37℃下反应1小时，以使IGF1R特异性噬菌体结合至抗原。然后，将产物用PBS-T溶液(磷酸盐缓冲盐水-0.05％吐温20)洗涤以除去非特异性结合的噬菌体，并用100mM三乙胺溶液收集结合至IGF1R的噬菌体。
将收集的噬菌体用1M Tris缓冲液(pH 7.4)中和，并用大肠杆菌K12ER2738在37℃下转染1小时，然后将感染的大肠杆菌铺展在含有四环素和羧苄青霉素的LB琼脂培养基上，在37℃下培养过夜。第二天，将培养的大肠杆菌悬浮在含有四环素和羧苄青霉素的5ml SB(超级肉汤)培养基中，并以相同体积添加50％甘油。一部分储存在-80℃下，50μl的产物悬浮于40ml含有四环素和羧苄青霉素的SB(超级肉汤)培养基中，添加了1012PFU的VCSM13的PFU辅助噬菌体并在搅拌下在37℃下培养1小时。然后，将卡那霉素加入培养液并在30℃下培养约16小时，从而仅培养感染了辅助噬菌体的大肠杆菌。
第二天，离心培养液后，取上清液，并添加至含有4％PEG8000和3％氯化钠(NaCl)的缓冲液中，在4℃下反应约1小时，并将噬菌体沉淀并离心。去除上清液后，将沉淀的噬菌体池重新悬浮在含有1％BSA的PBS缓冲液中，并用于下一轮淘选。随着淘选过程的进行，使用PBS-T进行洗涤的次数增加，以扩增和浓缩抗原特异性噬菌体。
11-3：单克隆筛选
选择对人IGF1R和表达IFG1R的MCF-7的ECD(胞外域)具有结合亲和力的细胞克隆。
具体地，为了从实施例11-2中获得的噬菌体池中选择特异性结合至IGF1R的单克隆抗体，进行以下实验。
为了从浓缩池中分离出单克隆，在LB-四环素/羧苄青霉素琼脂培养基上涂布噬菌体池并培养后，以获得单菌落。将这些菌落接种在96孔深孔板中并孵育过夜后，将10μl培养液重新接种到96孔深孔板中，并以相同方式在37℃下孵育约4小时，获得合适的OD(0.5至0.7)。向培养液中加入20MOI的辅助噬菌体后，使混合物在37℃下反应1小时。之后，将卡那霉素添加到培养基中，并在30℃下培养过夜。第二天，将培养基离心，取上清液进行ELISA，以选择IGF1R特异性噬菌体(Steinberger.Rader and Barbas III.2000.噬菌体展示载体.在噬菌体展示实验手册中.第一版.冷泉港出版社.NY.USA.pp.11.9-11.12)。
将100ng重组IGF1R添加至ELISA板的每个孔中，并在4℃下反应约15小时以将抗原包被在板上。为防止非特异性结合，以每孔200μl添加含3％BSA的PBS缓冲液，然后在37℃下反应约1小时。弃去上清液。
将100μl含有制备的单克隆噬菌体的溶液放入每个孔中，在37℃下反应1小时，并用300μl PBS-T洗涤3次。为了检测结合至IGF1R抗原的噬菌体，将抗HAHRP在含有3％BSA的PBS缓冲液中以1:5000的比例稀释，并在37℃下反应1小时。用300μl PBS-T洗涤3次后，添加100ul的TMB(四甲基联苯胺，Sigma公司，T0440)显色，并添加50ul的1N H2SO4淬灭反应。通过测量450nm处的吸光度，选择与BSA对照组相比具有高吸光度的克隆作为抗原特异性抗体克隆。
通过筛选两次，选择了1564、48G5、49G11、54H4、60A11、60H6和B11七(7)种克隆。
实施例12：IGF1R抗体的亲和力变体的产生
通过评估配体结合能力和BBB穿透能力，对选择的克隆进行亲和力变异，从而优化抗体。在第一个试验中，基于1564scFv，制备了NNS手混引物，以对重链CDR2和轻链CDR3进行随机化，并使用PCR技术扩增包含随机序列的1564scFv基因。将扩增的基因产物插入pComb3x载体中，制成适合噬菌体展示的文库形式，并且可以通过文库淘选和ELISA筛选来选择多个结合至IGF1R的scFv克隆。对于选择的克隆，通过基因测序鉴定可变区的氨基酸序列。
在第二个试验中，针对分别在CDR1、CDR2和CDR3内引入种系回复突变的重链和轻链构建了两个小型文库。通过分析96个菌落，证实了31个VL克隆和39个VH克隆具有独特的序列。通过基于克隆的生产率和抗原结合亲和力选择亲和力变体，最终获得克隆。
实施例13.具有脱酰胺残基的抗体变体的制备
13-1：脱酰胺残基鉴定
当CDR中发生脱酰胺化时，抗体降解并且与抗原结合变弱，这可能导致功效降低和样品异质性。样品异质性由于在临床批准中的鉴定而导致复杂性。因此，旨在通过计算机分析和肽作图分析来确定发生脱酰胺化的位置。
如图8a所示，通过对亲本1564克隆进行计算机分析和肽作图，鉴定了实际脱酰胺化的发生。就这一点而言，在分析之前将样品在4℃或40℃下保存一周，并且确认了在L-CDR2、L-CDR3和H-CDR2中发生了脱酰胺化。还分析了实施例12中公开的亲和力变体以确认脱酰胺化的位置。
13-2：抗体变体的制备
在计算机分析中，亲本1564克隆的净电荷为-0.7。通常，当净电荷<0或>5.5时，它被认为在体内容易被快速清除。因此，如果用H、R、K等正电荷代替脱酰胺残基，则认为可以通过脱酰胺化去除和增加总电荷来防止快速清除。因此，如图18b所示，制备了脱酰胺位点被取代的突变体。
为了去除脱酰胺化残基，如下制备了具有残基取代的突变体：
1)在氨基酸序列中，Asn被类似于Asn的D或Q取代。如果突变体的结合亲和力没有变化，则所有残基均被Q取代。
2)因为亲本克隆的净电荷为-0.7，而引起快速清除的净电荷为<0或>5.5，所以当电荷变为正时是有利的。因此，用具有正电荷的H、R和K代替LCDR3的脱酰胺残基N95a。
实施例14.制备各种形式的抗IGF1R抗体
14-1：抗IGF1R微抗体的制备
通过将实施例11至13中获得的IGF1R特异性单克隆噬菌体抗体的整个scFv连接至Fc的C末端，制备微抗体。为此，制备了编码本发明中公开的scFV的氨基酸序列的核苷酸序列，并用限制酶切割该核苷酸序列，并将该核苷酸序列克隆到包含编码Fc的核苷酸序列的基于pcDNA的表达载体中。
14-2：抗IGF1R二价抗体的制备
制备在实施例11至13中获得的IGF1R特异性单克隆噬菌体抗体的完整scFv，并将两个完整的scFv以IgG形式连接至治疗性抗体的每个C末端。为此，制备编码本发明中公开的scFV的氨基酸序列的核苷酸序列，并用限制酶切割，并将该核苷酸序列克隆到包含编码治疗性抗体的核苷酸序列的基于pcDNA的表达载体中。
14-3：抗IGF1R IgG(全IgG)抗体的制备
为了将实施例11和12中获得的IGF1R特异性单克隆噬菌体抗体中的1564抗体和F06抗体的序列转换为完整IgG1(全IgG)形式，合成了重链和轻链区的核苷酸序列(Genotec公司)。
14-4：抗IGF1R scFv单价抗体的制备
实施例14-1是微抗体形式，其中scFv形式的抗IGF1R抗体结合至重链的两个Fc的每个C末端。在该实施例中，一个scFv结合至重链中仅一个Fc的C末端。以实施例11至13中获得的抗体的形式，构建了IGF1R特异性单克隆噬菌体抗体的1564、F06、C04、VH5、VH16、VH35、VH9、VH2、VH7和VH32与仅一个Fc的C末端结合的载体以及不具有与C末端结合的抗IGF1R抗体的载体。当在细胞中产生抗体时，将杵臼突变引入Fc区以产生异聚形式。当转染到CHO-S细胞用于抗体生产时，三种载体均被折射到CHO-S细胞，该三种载体包括：对应于重链的载体，其中抗IGF1R抗体结合至治疗性抗体的Fc的C末端；对应于重链的载体，其中抗IGF1R抗体不结合至治疗性抗体的Fc的C末端；以及对应于治疗性抗体的轻链的载体。
14-5：抗IGF1R各种抗体的表达和纯化
将实施例14-1至14-4中制备的载体如下引入细胞中。
具体地，将CHO-S细胞在CD-CHO(Gibco，10743)培养基中调节至1.5×106个细胞/ml的浓度，然后在8％CO2下于37℃下培养1天。在DNA转染的当天，使用含有1％DMSO的CD-CHO培养基以2.1×106个细胞/ml的浓度制备生长到2.5×106至3×106个细胞/ml的细胞，然后在8％CO2条件下于37℃下培养3小时。在3000rpm离心15分钟后，去除上清液，并在含2.5％FBS的RPMI 1640培养基中重悬。
随后，将载体的组合在Opti-MEM培养基中以1μg/ml培养基稀释，将PEI(Polysciences，23966，储备浓度：1mg/ml)稀释为8μg/ml培养基。混合DNA和PEI的混合物，并在常温下放置混合物10分钟后，将混合物倒入含有细胞的烧瓶中，并在5％CO2，37℃，100rpm下孵育4小时。然后，添加与培养体积相同体积的CD-CHO培养基，培养混合物，并在8％CO2，37℃，110rpm下孵育4天。
使获得的培养液通过平衡Mab selectsure(GE Healthcare，5mL)，以使表达的抗体与柱结合，所述平衡Mab selectsure通过用平衡缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 7.5，100mMNaCl)通过来平衡。之后，用50mM柠檬酸钠(pH3.4)和100mM NaCl溶液洗脱后，使用1M Tris-HCl(pH 9.0)进行中和，以使最终pH为7.2。之后，将缓冲液与PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH 7.4)交换，当纯度高时，配制后将其保存在-20℃，当需要进一步纯化时，将其保存在4℃直到进一步纯化。
当需要进行额外纯化时，可以使用Hiload superdex 200(GE Healthcare，目录号28-9893-36)进行纯化，并可以使用各种大小不同的排阻色谱进行纯化。用平衡缓冲液(1x磷酸盐缓冲盐水pH 7.4，Gibco公司，目录号10010-023)平衡后，将初步纯化的样品上样至柱。配制后，将完全纯化的样品在-20℃下以冷冻状态保存。
14-6：用抗α-突触核蛋白制备双特异性抗体
根据本发明的scFV形式的抗IGF1R抗体通过使用接头(SEQ ID NO:172)连接重链可变区和轻链可变区来制备，并通过使用接头(SEQ ID NO:173)连接至下表描述的抗α-突触核蛋白抗体的完整形式IGG的重链恒定区的C末端，从而制备双特异性抗体。在该实施例中，通过每个抗α-突触核蛋白抗体的IGG抗体分子连接一个scFv形式的抗IGF1R抗体分子来制备单价抗体，并且通过每个抗α-突触核蛋白抗体的IGG抗体分子分别连接两个scFv形式的抗IGF1R抗体分子来制备二价抗体。表17中示出了用于制备本实施例中的双特异性抗体的抗α-突触核蛋白抗体的序列，根据本发明制备的示例的双特异性抗体。表17中示例的双特异性抗体在随后的实施例中用于实验。
实施例15.通过使用抗IGF1R抗体分析IGF1R特异性结合亲和力
15-1：使用微抗体形式的抗IGF1R抗体分析IGF1R特异性结合亲和力(ELISA)
进行ELISA分析以测试实施例14-1中制备的微抗体形式的996、1226、1564和MKJP2克隆与重组IGF1R的结合亲和力和浓度依赖性结合。
具体而言，从R&D SYSTEMS公司(6630-GR/CF)购买了作为抗体结合靶标的人重组IGF1R，其为胞外域(ECD)。将人IGF1R在PBS缓冲液中以1μg/ml稀释，以每孔100μl的量添加到96孔ELISA板(Nunc-Immuno板，NUNC，罗切斯特，纽约)中，通过在4℃下反应16小时包被，然后去除上清液。将含3％BSA(牛血清白蛋白)的PBS缓冲液加至每孔200μl，并反应2小时，从而阻断非特异性结合。
将实施例14-1中制备的996、1226、1564和MKJP2克隆的微抗体以最高浓度20nM稀释3倍，制成12个点，然后转移100μl到每个孔中，然后在室温下处理1小时。处理后，用含0.05％吐温20的PBS缓冲液洗涤4次，并通过每孔添加100μl的以1:5000稀释于封闭缓冲液并识别微抗体的人Fc的抗人HRP在室温下反应1小时。用300μl PBS-T(吐温20 0.05％)洗涤4次后，使用TMB(四甲基联苯胺，Sigma，T0440)进行显色。酶促反应用0.5mol/L的硫酸淬灭，使用酶标仪在450nm处记录并分析吸光度。实验结果如图1a所示。
证实了这四个微抗体克隆以浓度依赖方式结合至人IGF1R重组蛋白，具体来说，MKJP2表现出最高的结合能力，然后，克隆996和1564表现出相似的结合强度，而1226克隆则表现出略低的结合强度。
15-2：IGF1R抗体的种间交叉反应性的ELISA分析
通过ELISA分析来分析根据实施例14-2的方法制备的1564抗IGF1R抗体与实施例11-3中获得的抗IGF1R抗体的种间交联活性。为此，首先，将人、猴、小鼠和大鼠的IGF1R抗原稀释至1μg/ml，添加100μl至每孔中，并在4℃下反应15小时，以在板的底部包被。去除上清液后，在每个孔中处理200μl含3％BSA的PBS缓冲液以阻断非特异性结合。将抗IGF1R抗体用最大浓度400nM的PBSB(BSA在PBS中的3％溶液)稀释5倍，在每个孔中处理，然后在37℃下反应1小时。然后，用PBS缓冲液洗涤5次后，将识别结合抗体的Fab部分的抗人Fab HRP以1:20000稀释，并以每孔100μl处理，并在37℃下反应1小时。用PBS缓冲液洗涤产物5次，并根据制造商的方法用TMB(四甲基联苯胺，Sigma，T0440)进行显色。酶促反应用0.5mol/L硫酸淬灭，并使用酶标仪(Molecular device公司)在450nm下测量吸光度。当在ELISA分析中使用许多样品时，将板分为两部分。实验结果示于下表12中。
具体地，在双特异性抗体针对人IGF1R的ELISA结果的表12中，1564IgG和双特异性抗体针对人IGF1R、小鼠IGF1R、大鼠IGF1R和猴IGF1R的ELISA结果示于表12中。
以下实验结果显示了使用各种物种的动物模型评估功效的优势，并且表明使用本发明的抗体，可以通过各种物种的疾病模型评估治疗剂的功效。
[表20]抗体与各种物种的IGF1R结合能力的ELISA分析结果
*：不可用
**201：scFv形式的赫赛汀生物仿制药
15-3：亲和变体与IGF1R(FACS)的结合亲和力分析
通过对IGF1R的ECD蛋白进行ELISA以测定实施例12中制备的亲和变体的结合亲和力，并且通过FACS分析对MCF-7的结合亲和力。
作为对初次克隆的分析，表21显示了相应初次选择克隆的双特异性抗体形式的IGF1R的ECD的ELISA分析结果，表22显示了通过FACS对MCF-7细胞系的结合亲和力的分析结果。
[表21]初次选择克隆的双特异性抗体形式与IGF1R ECD结合的ELISA结果
/>
[表22]与MCF-7细胞系结合的FACS分析结果
样品 几何平均值
仅第二抗体 2.92
1564亲本 4.09
F06 5.02
A07 5.06
B02 4.54
B09 4.29
D03 4.09
E06 4.24
F06 6.33
C04 3.88
结果，选择F06克隆作为与亲本克隆(1564克隆)(亲和力成熟)相比细胞结合中结合能力最高的克隆，选择C04克隆作为与亲本克隆(1564克隆)(亲和力降低)相比细胞结合中结合能力最低的克隆。
作为二次克隆的分析，表23显示了以二次生产方法制备的双特异性抗体形式的克隆与IGF1R的ECD结合的ELISA结果。
[表23]二次选择克隆针对IGF1R的ECD的ELISA结果
/>
如表16所示，在二次生产的克隆中排除生产率和物理特性显着降低的克隆后，选择通过FACS分析的克隆。
[表24]用FACS分析法分析的克隆
图12c是通过使用FACS分析克隆与MCF-7细胞系的结合的结果，并且与亲本克隆1564相比，所有分析的克隆对MCF-7都具有较低的结合亲和力。ELISA中结合能力降低的克隆在FACS中结合能力也降低。
所选的抗体克隆是F06、C04、VH2、VH5、VH7、VH9、VH16和VH32，这些抗体的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列示于上表5和6中。
15-4：人IGF1R的BIAcore分析
分析了根据本发明的抗体与人IGF1R的结合能力。
对于1564克隆的IgG形式，通过SPR分析来分析与人IGF1R的结合程度。将结合至作为抗原的人IGF1R ECD的抗His标签的抗his抗体在醋酸盐pH4.0缓冲液中稀释至20μg/ml，然后根据胺偶联法在CM4芯片的参考/分析通道中固定为10,000RU作为目标RU。在捕获过程中，将PBS用作运行缓冲液，流速保持在30μL/分钟。在缔合/解离过程中，流速为40μL/分钟，将PBS用作运行缓冲液。缔合/解离分别是5分钟和20分钟。按基线1、激活(EDC NHS)、人IGF1R上样、淬灭(1M乙醇胺)、基线2、缔合和解离的顺序进行分析。使用二价模型进行评估，并使用Biacore T200评估软件(1.0版，S/N：04Y15X11-0149)进行分析。
作为分析的结果，确认了1564IgG抗体的KD为2.5305×10-9nM，并且确认了F06 IgG抗体的KD为4.7802×10-7nM，均显示出与人IGF1R的高结合能力。分析结果示于图11b。特别是，当1564克隆以IgG形式产生时，1564克隆与人IGF1R的解离常数为2.5305×10-9nM，1564克隆证实，结合亲和力不根据抗体形式而发生显著变化。
实施例16.抗IGF1R抗体与表达人IGF1R的细胞系和脑内皮细胞的结合能力分析
16-1：MCF-7的FACS分析
为了确认实施例14-1中制备的克隆996、1226和1564的微抗体形式是否结合细胞表面上的内源性IGF1R，通过FACS对表达人IGF1R和脑内皮细胞的细胞系进行了结合亲和力分析。通过FACS测试了与MCF-7的结合程度，MCF-7已知是过表达IGF1R的乳腺癌细胞系。
具体地，将三种微抗体中的每一种稀释至20μg/ml，在每个样品的0.43×106个的MCF-7细胞系中进行处理，并在4℃下反应1小时。用PBS缓冲液洗涤两次后，将抗人FITC以1:500稀释，处理并在4℃下反应1小时。用PBS缓冲液洗涤两次后，使用FACS Calibur仪器测量抗IGF1R微抗体的结合程度。仅用二抗处理的MCF-7细胞用作对照。实验结果如图12a所示。
以与上述相同的方式分析在实施例12和实施例14-2中制备的A02、A06、A07、B01、B02、B09、B10、C04、D03、E06、F06、H04(Gly)、H04(Val)、VH2、VH5、VH7、VH9、VH16、VH32和VH35与MCF-7的结合亲和力。克隆1564通过实施例14-2的方法制备，并作为亲本克隆进行比较，仅用第二抗体处理的MCF-7细胞用作对照。分析结果示于表21和图12c。
根据上述实验的结果，它以样品的平均荧光强度(MFI)表示，三种微抗体中的scFV、双特异性抗体中的亲和力变体以及亲本克隆(1564个克隆)特异性结合至细胞表面上表达的内源性IGF1R。结果表明，在上述实施例中获得的克隆可以通过结合至实际存在于体内的形式的IGF1R而用于预期目的。
16-2：JIMT-1和BT474的FACS分析
实施例14-1中以基本上相同的方式制备的克隆996、1226和1564的微抗体，除了使用乳腺癌细胞系JIMT-1和BT474代替实施例16-1中使用的MCF-7细胞系。形态被证实结合至细胞表面的内源性IGF1R。实验结果如图12a所示。
根据上述实验结果，它以相应样品的平均荧光强度(MFI)表示，并且证实了测试的三种微抗体中的scFvs特异结合至表达IGF1R的各种细胞系表面上的内源性IGF1R。
16-3：小鼠脑内皮细胞的FACS分析
分析了通过实施例14-2的方法制备的双特异性抗体形式的1564克隆和通过实施例14-3的方法制备的IgG形式的1564克隆是否与脑内皮细胞bEND.3结合。就这一点而言，仅用二抗处理的组和仅用IgG形式的治疗性抗体(CH11F11)处理的组用作阴性对照。以与实施例16-1和16-2相同的方式进行FACS分析。分析结果如图12b所示。
除阴性对照外，所有测试的克隆均显示结合至bEND.3。结果证实，各种形式的克隆1564特异性结合至在脑内皮细胞表面上表达的IGF1R。
实施例17.抗IGF1R抗体的胞内内化分析
17-1：MCF-7内化分析-1564、996、1226、MKJP2(微抗体)
进行该实施例以测试在实施例14-1中制备的微抗体形式的996、1226、1564和MKJP2克隆是否在表达IGF1R的细胞系中胞内内化，以及引入该细胞的抗体是否通过RMT途径而不被降解。为了将抗IGF1R抗体用作改善BBB穿透能力的穿梭物，应将抗体内化到构成BBB的脑内皮细胞中。
通过使用表达IGF1R的MCF-7细胞系来测试根据本发明的抗体的胞内内化。具体地，在8孔载玻片室中铺板30,000个MCF-7细胞系后，将细胞培养1天。将培养的细胞系在4℃下在每个孔中用5μg/ml的实施例14-1中制备的996、1226、1564和MKJP2克隆的微抗体处理2小时，用冷的DMEM培养物洗涤3次，并且还用Alexa488缀合的抗人Fc抗体在4℃下处理1小时。
为了测试抗体复合物的内化，将板转移至CO2培养箱中并在37℃下孵育30分钟。通过添加100％甲醇固定培养物，同时终止反应。固定后，用PBS洗涤3次。在荧光显微镜上，在绿色滤光区域(Alexa488)中成像抗体的内化程度。在成像过程中，使用DAPI对胞内的细胞核染色以确认每个细胞的位置。实验结果如图13a所示。
从实验结果来看，使用MCF-7细胞系在实验中测试的所有四种抗体均被很好地内化。特别地，发现MKJP2和1564的内化比其他克隆发生得更多。
17-2：MCF-7内化分析-C04、F06、VH5、VH16、VH35、VH9、VH2、VH7、VH32
使用表达IGF1R的MCF-7细胞系，通过FACS分析，测试与IGF1R的结合能力变化的1564变体或细胞表面的IGF1R结合。用scFv抗IGF1R抗体制成的双特异性抗体以10ug/mL的浓度处理2×105个MCF7细胞30分钟。用含有1％BSA的PBS缓冲液洗涤后，处理用于检测人抗体的结合有FITC的二抗1小时。用PBS缓冲液洗涤后，FACS分析证实了具有改变的结合亲和力的各种变体的胞外结合和内化。
如表25所示，发现与冷藏条件相比，包括1564IGF1R抗体的双特异性抗体在37℃下具有增加的内化和增加的强度。这些结果表明1564变体与细胞结合良好并以结合依赖性方式内化到细胞中。
[表25]
/>
17-3：对人脑内皮细胞的内化分析
测试了实施例14-2和14-4中制备的二价形式和单价形式的克隆1564是否被内化到初级人微血管脑内皮细胞(HMBEC)中。将治疗性抗体IgG(11F11)用作阴性对照。
将HMBEC(细胞系统(Cell Systems)，目录号：ACBRI376)以90％的融合度铺在12孔板中，然后加入测试抗体。用4％多聚甲醛固定并在第二天用PBS冲洗后，通过使用含3％BSA和聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX)的溶液封闭和透化50分钟。用PBS冲洗后，将针对人Fc的抗体(山羊抗人抗体)孵育2小时30分钟，用PBS冲洗，并用抗相应的一抗的二抗处理1小时。用PBS冲洗后，将细胞用Hoechst以1:1000的浓度染色10分钟进行核染色。使用共聚焦显微镜在LSM 780 NLO EC Plan-Neofluar 100X/1.3油的条件下分析结果。实验结果如图13b所示。
与阴性对照治疗性抗体(11F11)相比，二价形式和单价形式的1564克隆显示出增加的内化。该结果表明，上述抗IGF1R抗体作为与包含与其连接的治疗性抗体的各种形式的双特异性抗体，可以有效地将治疗性抗体内化到构成BBB的脑内皮细胞中，从而提高了治疗性抗体的BBB穿透能力。
17-4：人脑内皮细胞的细胞命运分析
如果抗体被内化并与溶酶体相关标志物共定位于细胞中，则由于脑内皮细胞的降解，抗体无法通过BBB。相反，如果抗体与胞吐作用相关的早期内体或已知与BBB通过相关标志物共定位，则预期该抗体通过受体介导的转胞吞作用穿过BBB，内化到脑内皮细胞中，然后进入大脑。
以与实施例17-2中测试的抗体中的1564二价形式相同的方式处理HMBEC后，分析这些细胞中的哪些细胞成分与这些抗体共定位。但是，以下抗体中的每一种与检测封闭和透化后处理的抗体的山羊抗人抗体同时处理。
-抗组织蛋白酶D：溶酶体标志物
-抗小窝蛋白1：小窝蛋白介导的转胞吞作用标志物(它被认为是BBB通道的主要机制
-抗EEA1：早期内体标志物
该方法的其余部分与实施例17-2相同，但是分别处理了抗标志物的二抗。
分析结果如图13c所示。双特异性抗体形式的1564克隆在细胞膜和细胞内与组织蛋白酶D不共定位，但与小窝蛋白1和EEA1共定位。这些结果表明，在将1564克隆内化后，有可能通过RMT途径穿过BBB而没有经历胞内降解机制。
实施例18.抗IGF1R抗体对IGF1R信号传导的作用的分析
18-1：使用IGF1R进行MCF-7细胞系的增殖测定
使用IGF1的细胞增殖功效，证实了根据本发明的抗IGF1R抗体是否干扰IGF1R(IGF1受体)与其配体之间的结合。
将实施例14-1中制备的996、1226、1564和MKJP2克隆的微抗体分别从400nM稀释5倍，以制备稀释样品，然后用25μl的20ng/ml IGF1处理25μl稀释的样品。培养表达IGF1R的MCF-7细胞系，在实验当天去除培养基进行传代，并将每孔20,000个细胞系(对应于50μl)添加至分配有IGF1和测试抗体的96孔板。
在适当的温度和湿度下孵育3天后，处理10μl CCK-8试剂以测量细胞生长程度，并在CO2孵育箱中孵育4至5小时。然后取出，用分光光度计在450nm的波长下测定吸光度。
实验结果如图14A所示。
根据实验结果，证实了根据本发明的抗体不抑制由IGF1向IGF1R的信号传导引起的MCF-7的细胞增殖。作为对照组的抗IGF1R抗体(Imclone)以处理浓度依赖性的方式抑制IGF1向IGF1R的信号传导引起的MCF-7的细胞增殖。因此，本发明的抗体是具有结合至构成BBB的内皮细胞中表达的IGF1R并且穿透BBB的能力的抗体，但是不抑制体内IGF1的信号传导。因此，证实了根据本发明的抗体可以用作BBB穿梭物。
18-2：MCF-7细胞系中IGF1R对信号传导成分的抑制的分析
当结合至表达IGF1R的细胞的IGF1将信号传递到细胞中时，测试根据本发明的抗IGF1R抗体以确定IGF1是否参与信号传导的受体和下游信号传导成分。也就是说，用抗IGF1R抗体处理表达IGF1R的MCF-7细胞系，然后分析细胞中的总IGF1R、磷酸化IGF1R、作为IGF1R下游因子的总Akt和磷酸化Akt的量。
培养MCF-7细胞后，在用抗IGF1R抗体处理前20小时将培养基更换为无血清培养基。将实施例4-1中制备的996、1226、1564和MKJP2克隆的微抗体分别用100nM在MCF-7细胞系中处理，并在1小时后用200ng/ml的IGF1处理。20分钟后，将细胞用PBS洗涤，然后用添加有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的M-PER裂解。使用BCA测定试剂盒测量蛋白质浓度后，将12.5μg蛋白质上样至SDS-PAGE凝胶上进行电泳，然后转移至PVDF膜上。使用含有5％BSA的PBST(0.1％吐温20)在室温下轻轻摇动进行封闭1小时，然后用抗IGF1R或Akt的一抗在4℃下缓慢摇动处理过夜。β-肌动蛋白抗体用作上样对照。洗涤后，用二抗在室温下缓慢摇动处理1小时，然后洗涤。添加ECL溶液，并使用Image Quant Las 4000观察信号。实验结果如图14b所示。
根据实验结果，证实了根据本发明的抗体不影响细胞中的总IGF1R、磷酸化IGF1R、作为IGF1R的下游因子的总Akt和磷酸化Akt的量。
18-3：对IGF1R抑制小鼠脑内皮细胞中信号传导成分的分析
当结合至表达IGF1R的细胞的IGF1将信号传递到细胞中时，测试根据本发明的抗IGF1R抗体以确定IGF1是否参与信号传导的受体和下游信号传导成分。也就是说，用实施例14-2的方法制备的11F11-1564和3A9-1564(CH11F11和ch3A9，韩国专利公开第2018-0081465号中描述的抗α-突触核蛋白单一抗体)处理表达IGF1R的bEND3细胞系，然后分析细胞中的总IGF1R、磷酸化IGF1R、作为IGF1R下游因子的总Akt的量。
在孵育bEND3细胞时，在用抗IGF1R抗体处理前20小时将培养基更换为无血清培养基。实施例14-2的1564和MKJP2克隆的双特异性抗体分别用100nM在bEND细胞系中处理，并在1小时后用200ng/ml的IGF1处理。20分钟后，将细胞用PBS洗涤，然后用添加有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物的M-PER裂解。使用BCA测定试剂盒测量蛋白质浓度后，将12.5μg蛋白质上样至SDS-PAGE凝胶上进行电泳，然后转移至PVDF膜上。使用含有5％BSA的PBST(0.1％吐温20)在室温下轻轻摇动进行封闭1小时，然后用抗IGF1R或Akt的一抗在4℃下缓慢摇动处理过夜。β-肌动蛋白抗体用作上样对照。洗涤后，用二抗在室温下缓慢摇动处理1小时，然后洗涤。添加ECL溶液，并使用Image Quant Las 4000观察信号。实验结果如图14c所示。
根据实验结果，证实了根据本发明的抗体不影响细胞中的总IGF1R、磷酸化的IGF1R、作为IGF1R的下游因子的总Akt和磷酸化的Akt的量。
实施例19.抗IGF1R抗体的非毒性分析
19-1：IgG形式的IGF1R抗体的ADCC分析
测试根据实施例14-3的IgG形式的抗IGF1R抗体，以鉴定它是否确实通过IGF1R依赖性结合至表达IGF1R的细胞表面而影响细胞死亡。也就是说，当抗IGF1R抗体的1564克隆结合至表达IGF1R的细胞系时，使用ADCC报告物生物测定试剂盒分析自然杀伤细胞(NK细胞)的活化以及对表达IGF1R的细胞的不利影响。
孵育过表达IGF1R的MCF-7细胞和低水平表达IGF1R的SKBR3细胞后，在抗体处理前20小时将每孔5000个细胞分配到96孔板中。将培养的细胞换成含4％低IgG血清的RPMI/1640培养基，将IgG形式的克隆1564从133.3nM稀释8倍，并添加到每个孔中。将稳定的ADCC效应细胞添加至每个孔，孵育6小时，然后在室温下放置约10分钟。向每个孔中添加制备好的Bio-Glo荧光素酶测定试剂后，用PHERAster FS BMG LABTECH设备测量发光度，以分析ADCC的诱导程度。实验结果如图15a所示。
根据实验结果，证实了根据本发明的抗体，特别是1564克隆结合至作为过表达IGF1R的细胞系的MCF-7细胞以及以低水平表达IGF1R的SKBR3细胞，但是没有诱导由效应细胞导致的ADCC。
19-2：对重复施用抗IGF1R抗体后脑中IGF1R水平的分析
用作BBB穿梭物的抗体结合至脑内皮细胞的靶受体以增加治疗性抗体的穿透能力，但不应改变相应的受体水平。靶受体的下调会影响它们在靶标脑中的作用，从而引起副作用。
分析了即使重复施用后本发明的抗IGF1R抗体是否也影响脑中的IGF1R水平。根据实施例14-6，将1564克隆与帕金森病的治疗性抗体连接的二价形式的双特异性抗体、帕金森病的单一治疗性抗体和作为阴性对照组的IgG每周重复施用于帕金森病模型小鼠持续3个月，然后通过蛋白质印迹分析脑组织中的IGF1R水平。
每组三只小鼠的脑组织用PBS灌注并匀浆后，将10μg裂解物上样到4至12％Bis-Tris Gel中，电泳并转移到PVDF膜上。该方法的其余部分以与实施例19-1相同的方式进行。
实验结果如图15b所示。由克隆1564组成的双特异性抗体显示IGF1R水平与施用帕金森病的单一治疗性抗体和IgG的组的水平相似。该结果表明，即使在重复施用后，克隆1564也不会引起脑中IGF1R水平的严重变化，因此，预期该抗体用作BBB穿梭物时副作用低。
19-3：对施用抗IGF1R抗体后脑中抗体分布的分析
BBB穿梭物结合至脑内皮细胞表面的受体，并向脑内递送治疗性抗体，但与脑内正常细胞表面上的受体的结合应是少量的。如果BBB穿梭物结合至脑中大量表达抗原的正常细胞，则结合至该穿梭物的治疗性抗体将少量地到达疾病靶标。
为了分析本发明的抗IGF1R抗体在脑中的分布，通过对实施例21-2中进行的体内实验动物的脑中进行免疫染色来分析抗IGF1R抗体的分布。根据心内灌注，以生理盐水灌注施用二价形式的1564克隆的SD大鼠。将左半球在10％中性缓冲的福尔马林中固定24小时。用1×PBS漂洗脑，并在含有30％蔗糖的溶液中冷冻24小时。将脑在OCT中冷冻，并保存在-80℃下直至切片。在冠状方向上以25μm的厚度进行切片，并将切片收集在24孔培养皿中的含0.1％叠氮化钠的1×PBS中。通过与含有0.3％吐温-20的Dako无血清蛋白块(X0909，DAKO公司)在室温下以自由漂浮模式孵育1小时来封闭和透化组织。用生物素化的人Fc抗体(BA3080，Vector Labs)按1:50的比例处理一抗，并在4℃下孵育过夜。用TBS洗涤3次后，将抗内皮细胞的抗体与RECA-1(ab9774，AbCam公司)以1:2000的比例或与神经元抗体NeuN(MAB377，Millipore公司)以1:250的比例处理2小时。洗涤后，将Alexa488结合，每种抗体的二抗处理45分钟。洗涤后，将切片置于载玻片上，并通过添加含有Dapi的ProLong Gold或含有Hoechst 33258的Dako荧光固定介质来染色细胞核。在共聚焦显微镜下，以合适的荧光波长分析大脑皮层和海马体。分析结果示于图15c。
结果表明，与1564克隆结合的双特异性抗体不结合至正常神经元，而是特异性结合至脑内皮细胞。因此，预期本发明的抗IGF1R抗体通过仅增加治疗性抗体的BBB穿透能力而不结合至脑中的正常细胞而具有很少的副作用，并且为治疗性抗体的治疗功效带来改善。
实施例20.抗IGF1R抗体的体外BBB穿透能力的分析
20-1.二价抗体在来源于sv-ARBEC的BBB模型中的BBB穿透能力的分析
将实施例11和12的抗体用于制备实施例14-2中的双特异性抗体，然后在由Sv-ARBEC组成的BBB模型中测试双特异性抗体的体外BBB穿透能力。将Sv-ARBEC作为单层铺在渗透膜上，并基于BBB系统的阻力(TEER)和蔗糖通过程度预先评估BBB系统的完整性。这时，用已知有助于系统的完整性的大鼠星形胶质细胞培养基(RAS-CM)处理sv-ARBEC。在膜上处理测试抗体1564、48G5、54H4、60H6和B11的二价双特异性抗体后，在90分钟后用质谱仪分析底腔室中的抗体量。对于质谱，分析并使用来自每种抗体Fc和scFv的签名肽(signaturepeptide)。此时，单独的帕金森病的治疗性抗体(11F11)以及赫赛汀TM的scFv形式的生物相似药连接至治疗性抗体的双特异性抗体用作阴性对照。通过使已知不能穿过BBB的A20.1抗体(国家研究委员会生产)通过BBB，确定系统的校准极限。将质谱仪中获得的值输入到现有文献中已知的公式中，以产生Papp值，该值表示体外BBB穿透能力的程度。
分析结果示于图16a。除B11以外的测试抗体显示出比阴性对照更高的体外BBB穿透能力。特别地，克隆1564显示出比其他克隆更高的BBB穿透能力。这表明1564、48G5、54H4、60H6克隆和连接至1564、48G5、54H4、60H6克隆的双特异性抗体可以比单一抗体具有更高的体内BBB穿透能力。
20-2.单价抗体在来源于sv-ARBEC的BBB模型中的BBB穿透能力的分析
在与实施例20-1相同的模型中，分析了根据实施例14-4制备的单价抗体和根据实施例14-2制备的二价抗体的体外BBB穿透能力。使通过1564克隆制备的二价抗体和一价抗体以及作为阴性对照的帕金森病(3A9)治疗性抗体通过sv-ARBEC BBB系统，然后分析穿透的抗体的量。分析结果如图16b所示。
二价形式和单价形式的1564克隆显示出比3A9单一抗体更高的体外BBB穿透能力，尤其是，二价形式的BBB穿透能力高于单价形式。这表明1564克隆可以增强以各种形式与其相连的治疗性抗体的体外BBB穿透能力。
20-3.抗IGF1R抗体在来源于人IPSC的BBB模型中的BBB穿透能力的分析
来源于人干细胞的BBB模型显示出比来源于大鼠或小鼠细胞的BBB系统更高的阻力(TEER)，并表达在BBB中鉴定出的所有各种标志物。因此，人干细胞来源的模型的BBB紧密度高于动物细胞来源的BBB的紧密度，并且该模型很好地复制了人BBB。
将载体(例如编码OCT4、SOX2、c-Myc、KLF4、NANOG和LIN28的oriP/EBNA1游离型载体)导入来源于人羊水的细胞(AF-iPSC)中，并重新编程为iPSC。产生的菌落用KO DMEM/F12、KOSR、glutamax、NEAA和β-巯基乙醇处理以产生处于预分化状态的内皮细胞，然后用无血清内皮分化培养基、1％PDS和20ng/ml bFGF处理，分化为脑内皮细胞。羊水细胞的获取和使用这些细胞建立BBB系统是由国家研究委员会进行的。在通过阻力值和蔗糖通过值确认系统的完整性之后，分析将帕金森病的治疗性抗体与scFv形式的抗IGF1R抗体结合在一起的双特异性抗体形式中IGF1R抗体的BBB穿透能力。测试抗体是二价形式的1564克隆、单价形式的1564克隆、二价形式的F06克隆和二价形式的CO4克隆。将11F11作为帕金森病的治疗性抗体用作阴性对照。以与实施例20-1相同的方式分析了通过BBB系统的抗体。
分析结果示于图16c。与阴性对照组相比，所有测试克隆均显示出高的BBB穿透能力。特别是，F06二价和C04二价代表的BBB穿透能力是单一抗体的高达15倍。结果表明，与单一抗体相比，本发明的抗IGF1R抗体有效地通过了人源性BBB系统。
实施例21.抗IGF1R抗体的体内BBB穿透能力的分析(共定位测定)
21-1.微抗体与脑血管的共定位
进行以下实验以确认本发明的抗IGF1R抗体是否在体内沿脑脉管系统分布。
具体而言，将PBS缓冲液或10mg/kg的IgG对照，以及实施例14-1中制备的克隆996、1226和1564的微抗体抗体分别施用至6至8周龄BALB/c雄性小鼠的尾静脉。4小时后，对小鼠的脑进行足够量的0.9％NaCl溶液和4％多聚甲醛的心内灌注。提取固定的脑并切成20μm的切片，然后用作为血管标志物的抗小鼠CD31以及抗人Fc抗体进行共染色，以确认脑血管和被测试的IGF1R的共定位。使用缀合有Alexa 488的抗CD31的二抗和缀合有Alexa 594的抗人Fc的二抗，在荧光显微镜下对CD31和人Fc进行成像。
实验结果如图17a所示。
根据实验结果，证实了根据本发明的用于配体结合的非阻断抗体具有优异的BBB穿透能力。根据通过免疫染色分析抗体与大脑血管共定位程度的方法(神经元(Neuron)(2016)Yu-Zuchero等人)用血管标志物(抗CD31，绿色)和人抗体(抗人Fc，红色)对脑组织进行染色，结果，与IgG对照组相比，根据本发明的用于配体结合的非阻断抗体显示出更高的共定位程度。
21-2.分析双特异性抗体的体内BBB穿透能力
尝试证实本发明的抗IGF1R抗体在正常大鼠中的体内BBB穿透能力。将PBS缓冲液或10mg/kg的IgG对照、以及帕金森病的治疗性抗体(11F11)或含有连接至治疗性抗体的1564克隆的二价双特异性抗体(11F11-1564)分别施用至SD大鼠的尾静脉。在24小时时，通过质谱分析CSF和脑中抗体的量。以与实施例20-1相同的方法进行质谱分析。
与没有结合抗IGF1R抗体的治疗性抗体相比，结合有1564克隆的双特异性抗体显示出更高的CSF和脑穿透能力，并且在10mg/kg和30mg/kg剂量下均证实了功效。该双特异性抗体在30mg/kg剂量下显示出的脑穿透能力是单一抗体的高达约4.5倍。
根据实施例14-2和14-4，以二价形式和一价形式制备克隆1564，然后以与上述相同的方式分别以30mg/kg或60mg/kg施用，24小时后分析CSF和脑中的抗体的量。两类结合至1564克隆的双特异性抗体显示出比单一抗体更高的CSF和脑渗透能力。特别地，二价形式显示出比一价形式更高的BBB渗透能力，脑穿透能力提高了高达5倍。
图17b的结果显示了即使结合至各种形式的治疗性抗体，1564克隆也改善了体内治疗性抗体的BBB穿透能力。
与亲本克隆相比，预期根据实施例2制备的1564克隆的亲和力变体增加血清中的PK。因此，预期通过长时间保持在血清中并持续保持BBB流入来改善BBB穿透能力。将根据实施例14-2的二价形式或根据实施例4-4的单价形式中产生的亲和力变体以30mg/kg静脉内施用至SD大鼠后，于0、24和48小时从眼静脉丛中收集血液。根据治疗性抗体的骨架，将测试的抗体分为两个实验。实验中使用的相应变体的双特异性抗体在下表26中示出。
[表26]用于分析体内BBB穿透能力的双特异性抗体
嵌合骨架克隆 人源化骨架克隆
Ch11f11-1564二价 Hu11f11(ver.2)-1564二价
Ch11f11-1564单价 Hu11f11(ver.2)-VH5二价
Ch11f11-C04单价 Hu11f11(ver.2)-VH16二价
Ch11f11-F06二价 Hu11f11(ver.2)-VH35二价
Ch11f11-F0f单价 Hu11f11(ver.2)-VH9二价
** Hu11f11(ver.2)-VH2二价
** Hu11f11(ver.2)-VH7二价
** Hu11f11(ver.2)-VH32二价
通过ELISA分析抗体的血液水平。在将山羊抗人Fc抗体包被在96孔板上后，处理适当量的稀释样品，然后用缀合有抗人Fab HRP的抗体进行检测。分析结果如图17d所示。
结果，在第一测试组中，与亲本1564克隆的二价相比，1564的单价形式、F06的单价形式和C04的单价形式显示出更长的血清PK。在第二测试组中，与亲本1564二价相比，除了VH35之外的VH2、VH5、VH7、VH9、VH16和VH32的二价形式显示出增加的血清PK。
为了分析各组的BBB穿透能力，在48小时时从大鼠中提取CSF并通过相同的ELISA方法进行分析。分析结果如图17e所示。
在第一测试组中，与亲本1564二价相比，显示血清PK增加的1564单价、F06单价和C04单价形式显示CSF抗体增加。在第二测试组中，与亲本1564二价相比，也显示出血清PK增加的VH2、VH5、VH7、VH9、VH16和VH32的二价显示CSF抗体增加。与亲本1564二价抗体相比，VH35显示出较短的血清PK和低的CSF抗体水平。
图17d和17e的结果表明，由于抗体的持续BBB流入，血清中的PK是抗体的BBB穿透能力的重要因素，并且具有BBB穿梭且血清PK增加的双特异性抗体的BBB穿透能力增加。特别地，在具有最高CSF抗体水平的F06单价形式的情况下，它显示出是亲本1564二价的约5倍的CSF穿透能力。在实施例18-2和18-3中，由于1564二价抗体显示出CSF穿透能力是CSF中的单一抗体的约3倍，因此预期F06单价形式的穿透BBB的能力是单一抗体的约15倍。
实施例22.对IGF1R抗体的脱酰胺化
脱酰胺反应是指，例如，攻击天冬酰胺侧链之间的肽键以形成对称的琥珀酰亚胺中间体，琥珀酰亚胺中间体由于水解而转化为天冬氨酸或异天冬氨酸。因为这种脱氨基反应会影响蛋白质的连续活性，所以轻链和重链中的氨基酸被其他氨基酸取代，以防止脱氨基化并确保长期稳定性。
为了确认通过计算机分析鉴定出的脱氨基位点，将1564IGF1R抗体在40℃下放置并测量脱酰胺化程度。结果，如图18a所示，确认在轻链的CDR2和CDR3以及重链的CDR2中发生4.6至47.3％的脱酰胺反应。为了防止脱氨基化，如图18b所示，在每个位点上对氨基酸进行取代，根据每个氨基酸取代来分析IGF1R蛋白的结合能力的变化。选择显示出与WT 1564具有相同的结合亲和力的突变体，并且证实具有3或4个突变的突变体具有与WT 1564相同的IGF1R结合能力。这些突变的引入意味着制剂缓冲液的储存条件可以长期保持结合亲和力并保持稳定的形式。表27示出了分析结果。
[表27]
实施例23.抗IGF1R抗体的表位作图
23-1.抗IGF1R抗体、煮沸的IGF1R蛋白和天然IGF1R蛋白的ELISA分析
该实施例试图确认抗IGF1R抗体是识别线性表位还是构象表位。用1564、48G5、54H4、60H6和B11的二价双特异性抗体和天然人IGF1R的ECD蛋白或加热的蛋白(煮沸的IGF1R)进行ELISA。ELISA方法与实施例15同样地进行。分析结果示于表28。
[表28]
克隆名称 天然IGF1R的EC50(nM) 煮沸的IGF1R的EC50(nM)
ch11F11-1564 0.914 N/A*
ch11F11-48G5 1.21 N/A
ch11F11-54H4 2.88 N/A
ch11F11-60H6 10 N/A
ch11F11-B11 7.13 410
*N/A：不可用
该克隆显示出与实施例15相似地结合至天然人IGF1R的ECD蛋白合，但是不结合至三级结构通过加热而被破坏的煮沸的人IGF1的ECD蛋白。这意味着本发明的抗IGF1R抗体结合构象表位，但不结合线性表位。
23-2.抗IGF1R抗体的表位作图
为了分析1564克隆的构象表位，如下进行丙氨酸扫描。OGFAR3细胞是一种确认IGF1R表达水平低的卵巢癌细胞系，使OGFAR3细胞表达IGF1R文库，在该文库中，eGFP标签在N末端融合，并去除了C末端激酶结构域。IGF1R文库包含其中IGF1R表面上的残基被丙氨酸取代的突变。将制备的文库转染到OVCAR3细胞中。用1564抗体处理鉴定为表达IGF1R的细胞，然后通过用DyLight650标记的二抗进行荧光标记。根据是否存在IGF1R表达、IGF1R表达和1564结合是否存在来对标记的细胞进行分类，RNA深度测序通过使用Illumina HiSeq技术进行，以分析相应细胞组中每个丙氨酸突变的频率。对于表达野生型IGF1R的细胞的结果，相应的频率被标准化，然后计算相对频率以选择在1564标记的细胞组中数量减少的突变。基于该观察结果，发现1564克隆的表位位于FN2域中，并且属于FN2域的残基为Y775、P776、F778、R650、S791和L798。结果和1564克隆识别的序列显示在图19中。由于根据现有文献，不知晓这些残基参与IGF1的结合，因此结果如实地描述了实施例23-1中的1564克隆的性质。
实施例24.单一抗体和双特异性抗体的抗原结合亲和力的比较
24-1：单一抗体和双特异性抗体对α-突触核蛋白抗原的结合亲和力
当将scFv形式的IGF1R抗体与IgG型的α-突触核蛋白抗体连接时，分析了对α-突触核蛋白抗体的结合亲和力的影响。
将α-突触核蛋白聚集体以1μg/ml的浓度在96孔板上包被18小时，并且在洗涤之后，通过用每种抗体从400nM稀释5倍来处理。结合的抗体与抗人Fc-HRP结合，然后用TMB溶液显色，以测量抗体的结合程度。
如图20a所示，证实了在单一抗体和双特异性抗体中对α-突触核蛋白聚集体的结合亲和力相同。
24-2：单一抗体和双特异性抗体对IGF1R抗原的结合亲和力
为了比较单一α-突触核蛋白抗体和双特异性抗体与IGF1R抗原的结合程度，以与实施例22相同的方式进行实验。
如图20b所示，确认了具有scFv形式的IGF1R抗体的双特异性抗体以浓度依赖性方式良好结合，但是不具有IGF1R抗体区域的单一抗体不结合。
24-3：人源化α-突触核蛋白抗体的结合能力分析
通过以与实施例24-1相同的方式进行实验，分析了双特异性嵌合抗体和双特异性人源化抗体之间的结合亲和力的差异。
如图20c所示，双特异性人源化抗体对α-突触核蛋白聚集体的结合亲和力的水平与双特异性嵌合抗体相似，并且已证实具有一个scFv的IGF1R的单价双特异性抗体也表现出水平与嵌合抗体相似的结合亲和力。
通过以与实施例24-2相同的方式进行实验来分析双特异性嵌合抗体与双特异性人源化抗体之间对IGF1R的结合亲和力，结果所有双特异性抗体均表现出相同的结合亲和力，但是不具有IGF1R scFv的单一抗体不结合，如图20d所示。
这些结果表明，当抗体被人源化以取代在人体中充当免疫原的小鼠抗体区域时，抗体具有相同的活性，并且与α-突触核蛋白聚集体和IGF1R的结合亲和力没有变化。
24-4：单一抗体和双特异性抗体的吞噬作用比较
吞噬作用是指通过参与巨噬细胞的各种受体来去除细胞外物质的作用。各种蛋白质聚集体会诱发免疫应答或炎性反应，对人体产生不利影响。特别地，已知当施用抗体以去除α-突触核蛋白聚集体时，通过抗体的Fc区域与细胞表面上的FcrR之间的相互作用来促进。因此，比较了类似于IGF1R scFv的单一抗体和双特异性抗体对吞噬作用的活性。
使用来源于小鼠的BV-2小胶质细胞比较单一抗体和双特异性抗体之间的吞噬作用。BV-2细胞在RPMI1640培养基中培养，以浓度为2×106个细胞/ml制备，并以100μL分配在U型底96孔板中。10μg/ml的α-突触核蛋白聚集体和25ug/ml的抗体用RPMI1640培养基稀释，混合，并在室温下放置20分钟。用BV-2细胞处理α-突触核蛋白聚集体和抗体的混合物，并放置15分钟。通过以1200rpm离心除去上清液中的α-突触核蛋白聚集体，并用PBS缓冲液(pH2.5)洗涤3次以除去结合到细胞表面的聚集体或抗体。用4％多聚甲醛固定细胞，并用PBS缓冲液洗涤。为了确认聚集体和抗体被吞噬到细胞中的吞噬作用，添加0.5％聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)使细胞膜松弛，用PBS缓冲液洗涤，并用泛α-突触核蛋白抗体处理1小时。将结合的泛α-突触核蛋白抗体用抗兔-alexa-488抗体处理1小时，然后FACS分析证实了聚集体通过巨噬细胞进入细胞。
如图20e所示，证实了当用α-突触核蛋白抗体处理时，正常人IgG不影响巨噬细胞并且α-突触核蛋白聚集体的吞噬作用增加。当比较单一抗体和双特异性抗体时，证实了吞噬作用以相似的水平发生，并且结合至IgG C末端的scFv形式的IGF1R抗体不影响α-突触核蛋白抗体的作用。
实施例25.双特异性抗体的功效评估
根据实施例14-6，制备了由嵌合11F11抗体和1564克隆的scFv组成的二价双特异性抗体，并且测试了双特异性抗体和单一α-突触核蛋白抗体在过表达人α-突触核蛋白的转基因小鼠(mThy-1人α-突触核蛋白，加州大学圣地亚哥分校)中的体内功效。每周腹膜内施用2.5mg/kg的单一抗体或人IgG，或相同摩尔的二价双特异性抗体，持续3个月。每组使用五只小鼠，并且使用非转基因同窝仔作为对照。随后，如下进行灌注。
在最后一次施用完成后，根据人道主义法规将动物用水合氯醛麻醉，然后灌注0.9％的生理盐水，以分析脑部病理。随后，将灌注脑的一半(矢状切面)储存在磷酸盐缓冲液中的4％多聚甲醛(pH7.4，4℃)中直至分析时间，另一半则立即冷冻(-70℃)。
病理分析如下进行。通过使用振动计自由浮动，将固定在低聚甲醛上的半个脑切成40μm厚度的连续切片。为了确认每个施用组的大脑中α-突触核蛋白的表达水平，将含有皮质、海马体和纹状体的切片与α-突触核蛋白抗体(聚集体标志物的p129α-syn，abcam，ab59264或完整的α-突触核蛋白抗体)在4℃下过夜。可选择地，为了分析星形胶质细胞的活性程度，分析切片中的GFAP(胶质纤维酸性蛋白)(AB5804，millipore)，或者为了分析神经炎症程度，将切片与抗IL-1β的抗体(ab9722，abcam)分别孵育。可选择地，处理抗NeuN的抗体(Chemicon，#MAB377)以分析海马体中神经元细胞死亡的程度。与一抗孵育后，用生物素连接的山羊抗兔IgG(1:100，Vector Laboratories)和抗生物素蛋白D-辣根过氧化物酶(1:200，ABC Elite，Vector Laboratories)处理并用二氨基联苯胺(DAB)检测。用明场显微镜观察每个免疫染色的切片以测量光密度。结果在图21a至21e中公开。
25-1.通过嵌合抗体和双特异性抗体对α-突触核蛋白还原能力的分析
图21a示出了在向小鼠施用抗体后通过使用p-129α-Syn抗体在小鼠脑组织中的皮层和海马体进行染色和测量的结果，用于测试嵌合11F11抗体以及由1564克隆和嵌合11F11抗体组成的二价双特异性抗体是否可以去除过表达人α-突触核蛋白的小鼠动物模型(TG)中的α-突触核蛋白聚集体。p-129α-syn在第129位残基处被磷酸化，形成聚集体标志物，在染色组织中表现为深褐色斑点或聚集体。
根据图21a，IgG处理组显示p-129α-syn的染色程度高于非tg对照组(#：单因素ANOVA，p\u003c0.01)。相反，在用单一抗体或双特异性抗体处理的组中，p-129α-syn或聚集体的染色程度显著降低。特别是在海马体中，双特异性抗体处理组的降低程度高于嵌合11F11抗体的降低程度(*：单因素ANOVA，p\u003c0.05)。图21b以与图21a相同的方式示出了实验结果，除了用完整的α-突触核蛋白抗体作为标志物进行染色外。所有α-突触核蛋白的检测均表明本申请的抗体具有清除α-突触核蛋白本身并抑制细胞间传递的能力。在其他方面，它也可以解释为抑制由单体形成聚集体或去除所有单体。通过施用单一抗体和双特异性抗体，与IgG施用组相比，TG小鼠中增加的人α-突触核蛋白减少。特别是在海马体中，双特异性抗体比单一抗体更有效。
结果表明，即使在2.5mg/kg的低剂量下，嵌合11F11抗体和双特异性抗体也能有效降低帕金森病动物模型中的α-突触核蛋白及其聚集体水平。特别地，双特异性抗体优于单一抗体，这表明双特异性抗体比单一抗体可以更多地到达大脑，并基于改善的BBB穿透能力有效治疗疾病。
25-2.嵌合抗体和特异性抗体对星形胶质细胞增多(astroglosis)和炎性细胞因 子水平的降低能力的分析
胶质细胞增多是响应于中枢神经系统损害的发生在胶质细胞中的非特异性反应，是由BBB损害或诸如TGF-β和白介素的物质触发的。典型地，它包括星形胶质细胞增多和GFAP蛋白用作标志物。因此，通过施用嵌合11F11抗体和由1564克隆和嵌合抗体组成的双特异性抗体，分析了减少星形胶质细胞增多和引发星形胶质细胞增多的炎性细胞因子释放的效果。分析结果在图21c和图21d中公开。
图21c示出了在施用抗体之后使用GFAP(星形胶质细胞增多)作为标志物对小鼠脑组织进行染色和测量的结果，以测试嵌合11F11抗体和本发明的实施例中制备的由1564克隆和嵌合抗体组成的双特异性抗体是否可以减少体内星形胶质细胞增多。与IgG对照组相比，单一抗体和双特异性抗体抑制星形胶质细胞增多。特别地，证实了双特异性抗体在纹状体内的功效优于单一抗体。
图21d示出了在施用抗体之后使用IL-1β抗体作为标志物对小鼠脑组织进行染色和测量的结果，以测试嵌合11F11抗体和本发明的实施例中制备的由1564克隆和嵌合抗体组成的双特异性抗体是否可以减少体内炎性细胞因子。IL-1β引起炎症，导致各种神经元死亡和炎症反应。在施用根据本发明的抗体的大鼠的海马体中，与IgG对照组相比，在施用单一抗体和双特异性抗体的组中IL-1β降低，特别地，双特异性抗体的降低能力明显优于单一抗体(##：单因素ANOVA，p\u003c0.005；*：单因素ANOVA，p\u003c0.05)。
如图所示，与对照相比，已经显示出根据本发明的抗体减少星形胶质细胞增生(astrogliosis)并减少触发星形胶质细胞增生的IL-1β的炎性细胞因子的释放。
25-3.嵌合抗体和双特异性抗体的神经退变降低能力的分析
在现有文献中已经证实，脑细胞的死亡是由于α-突触核蛋白的神经毒性和炎性反应而发生的。分析了本发明的单一抗体和双特异性抗体是否可以在体内抑制由α-突触核蛋白引起的脑细胞死亡。
通过用皮层和海马体中神经元的标志物NeuN染色，发现与IgG对照组相比，单一抗体和双特异性抗体均降低了脑细胞死亡的程度。特别地，在皮层中，证实了双特异性抗体比单一抗体具有更好的脑细胞死亡抑制能力。结果在图21e中示出。
实施例26.通过Fc工程化增加半衰期并因此改善BBB穿透能力
FcRn是细胞膜上的重要受体，可通过将抗体吸入细胞并使之循环进入细胞来延长半衰期，从而在抗体在血管中循环时抑制抗体的降解。BBB穿透能力对于抗体的转胞吞活性也很重要，但是熟知的是，抗体的转胞吞活性在BBB穿透能力中很重要，但是抗体通过BBB的途径取决于抗体在血管中的浓度。因此，为了增加双特异性抗体的半衰期，通过在Fc区域的第428位氨基酸处将甲硫氨酸(Met)变为亮氨酸(Leu)来增加与FcRn的结合亲和力，从而制备双特异性抗体。通过比较以10mg/kg的浓度向表达人FcRn的tg小鼠施用WT双特异性抗体和M428L双特异性抗体的半衰期，结果证实增加的半衰期效果约为50％，如图22所示。为了再次确认半衰期延长，通过向猴子施用WT双特异性抗体、M428L二价双特异性抗体和M428L单价双特异性抗体来分析PK谱。在WT双特异性抗体的情况下，如图22a所示，在168小时后，血液浓度迅速降低，而与WT相比，对FcRn具有高结合亲和力的M428L双特异性抗体保持了改善的血液浓度。证实了与WT双特异性抗体相比，M428L双特异性抗体的半衰期增加了约1.5天。特别地，就清除率而言，M428L单价双特异性抗体显示最佳清除，而WT双特异性抗体则显示最快清除(图22b)。
为了验证由于增加的半衰期作用而改善的BBB传递，在施用抗体后24小时提取了CSF，并分析了CSF中的抗体量。将100ng/ml冷藏状态的IGF1R包被18小时后，添加CSF以检测与IGF1R结合的抗体。从图22c中可以看出，证实了在血液中具有大量抗体的M428L双特异性抗体通过BBB的量很大，并且M428L单价双特异性抗体表现出比M428L二价双特异性抗体改善的BBB穿透能力，以及优异的BBB穿透能力。
综上所述，本发明包括但不限于以下项：
1.一种抗IGF1R抗体或其抗原结合片段，
其中，所述抗IGF1R抗体包含重链可变区和轻链可变区，
所述重链可变区包含：重链CDR1(H-CDR1)，其包含选自SEQ ID NO:1至9的氨基酸序列；重链CDR2(H-CDR2)，其包含选自SEQ ID NO:10至49的氨基酸序列；和重链CDR3(H-CDR3)，其包含选自SEQ ID NO:50至80的氨基酸序列，以及
所述轻链可变区包含：轻链CDR1(L-CDR1)，其包含选自SEQ ID NO:96至113的氨基酸序列；轻链CDR2(L-CDR2)，其包含选自SEQ ID NO:114至132的氨基酸序列；和轻链CDR3(L-CDR3)，其包含选自SEQ ID NO:133至161的氨基酸序列。
2.根据项1所述的双特异性抗体，其中，所述抗α-Syn抗体或其抗原结合片段特异性结合至人α-突触核蛋白的C末端区域。
3.根据项1所述的双特异性抗体，其中，所述抗α-Syn抗体或其抗原结合片段特异性结合至来自SEQ ID NO:126的氨基酸序列的N末端的、至少包括第110至120个残基的连续11个氨基酸的肽或至少包括第111至122个残基的连续12个氨基酸的肽。
4.根据项1所述的双特异性抗体，其中，所述抗α-Syn抗体或其抗原结合片段包含：
重链CDR1(H-CDR1)，其包含选自SEQ ID NO:1至6的氨基酸序列；重链CDR2(H-CDR2)，其包含选自SEQ ID NO:2至4和SEQ ID NO:7至8的氨基酸序列；重链CDR3(H-CDR3)，其包含选自SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:9的氨基酸序列；轻链CDR1(L-CDR1)，其包含选自SEQID NO:10和SEQ ID NO:13中的一个氨基酸序列；轻链CDR2(L-CDR2)，其包含选自SEQ IDNO:11和SEQ ID NO:14中的一个氨基酸序列；以及轻链CDR3(L-CDR3)，其包含选自SEQ IDNO:12和SEQ ID NO:15中的一个氨基酸序列。
5.根据项4所述的双特异性抗体，其中，所述抗α-Syn抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，所述重链可变区包含：重链CDR1(H-CDR1)，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列；重链CDR2(H-CDR2)，其包含SEQ ID NO:2至4的氨基酸序列；和重链CDR3(H-CDR3)，其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包含：轻链CDR1(H-CDR1)，其包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列；轻链CDR2(H-CDR2)，其包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列；和轻链CDR3(H-CDR3)，其包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。
6.根据项4所述的双特异性抗体，其中，所述抗α-Syn抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，所述重链可变区包含：重链CDR1(H-CDR1)，其包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列；重链CDR2(H-CDR2)，其包含SEQ ID NO:7至8的氨基酸序列；和重链CDR3(H-CDR3)，其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包含：轻链CDR1(H-CDR1)，其包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列；轻链CDR2(H-CDR2)，其包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列；和轻链CDR3(H-CDR3)，其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列。
7.根据项1所述的双特异性抗体，其中，所述抗α-Syn抗体的重链可变区包含：
位于H-CDR1的N末端的重链可变区框架1(H-FR1)，其包含选自SEQ ID NO:16至17和SEQ ID NO:35至40的氨基酸序列，
位于H-CDR1和H-CDR2之间的重链可变区框架(H-FR2)，其包含选自SEQ ID NO:18至19和SEQ ID NO:41至44的氨基酸序列，
位于H-CDR2和H-CDR3之间的重链可变区框架(H-FR3)，其包含选自SEQ ID NO:20至31和SEQ ID NO:45至50的氨基酸序列，和
位于H-CDR3的C末端的重链可变区框架(H-FR4)，其包含选自SEQ ID NO:32至34和SEQ ID NO:51至52的氨基酸序列。
8.根据项4所述的双特异性抗体，其中，所述抗α-Syn抗体的轻链可变区包含：
位于L-CDR1的N末端的轻链可变区框架1(L-FR1)，其包含选自SEQ ID NO:53至58和SEQ ID NO:71至77的氨基酸序列，
位于L-CDR1和L-CDR2之间的轻链可变区框架(L-FR2)，其包含选自SEQ ID NO:59至61和SEQ ID NO:78至81的氨基酸序列，
位于L-CDR2和L-CDR3之间的轻链可变区框架(L-FR3)，其包含选自SEQ ID NO:62至67和SEQ ID NO:82至88的氨基酸序列，和
位于L-CDR3的C末端的轻链可变区框架(L-FR4)，其包含选自SEQ ID NO:68至70和SEQ ID NO:89的氨基酸序列。
9.根据项5所述的双特异性抗体，其中，所述抗α-Syn抗体的重链可变区包含：
位于H-CDR1的N末端的重链框架1(H-FR1)，其包含选自SEQ ID NO:16至的氨基酸序列，
位于H-CDR1和H-CDR2之间的重链框架(H-FR2)，其包含选自SEQ ID NO:18至19的氨基酸序列，
位于H-CDR2和H-CDR3之间的重链框架(H-FR3)，其包含选自SEQ ID NO:20至31的氨基酸序列，和
位于H-CDR3的C末端的重链框架(H-FR4)，其包含选自SEQ ID NO:32至34的氨基酸序列，
所述抗α-Syn抗体的轻链可变区包含：
位于L-CDR的N末端的轻链框架1(L-FR1)，其包含选自SEQ ID NO:53至58的氨基酸序列，
位于L-CDR1和L-CDR2之间的轻链框架(L-FR2)，其包含选自SEQ ID NO:59至61的氨基酸序列，
位于L-CDR2和L-CDR3之间的轻链框架(L-FR3)，其包含选自SEQ ID NO:62至67的氨基酸序列，和
位于L-CDR3的C末端的轻链框架(L-FR4)，其包含选自SEQ ID NO:68至70的氨基酸序列。
10.根据项6所述的双特异性抗体，其中，所述抗α-Syn抗体的重链可变区包含：
位于H-CDR1的N末端的重链框架1(H-FR1)，其包含选自SEQ ID NO:35至40的氨基酸序列，
位于H-CDR1和H-CDR2之间的重链框架(H-FR2)，其包含选自SEQ ID NO:41至44的氨基酸序列。
位于H-CDR2和H-CDR3之间的重链框架(H-FR3)，其包含选自SEQ ID NO:45至50的氨基酸序列，和
位于H-CDR3的C末端的重链框架(H-FR4)，其包含选自SEQ ID NO:51至52的氨基酸序列，
所述抗α-Syn抗体的轻链可变区包括，
位于L-CDR1的N末端的轻链框架1(L-FR1)，其包含选自SEQ ID NO:71至77的氨基酸序列，
位于L-CDR1和L-CDR2之间的轻链框架(L-FR2)，其包含选自SEQ ID NO:78至81的氨基酸序列，
位于L-CDR2和L-CDR3之间的轻链框架(L-FR3)，其包含选自SEQ ID NO:82至88的氨基酸序列，和
位于L-CDR3的C末端的轻链框架(L-FR4)，其包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列。
11.根据项4所述的双特异性抗体，其中，所述抗α-Syn抗体的重链可变区包含选自SEQ ID NO:90至101或SEQ ID NO:102至108的氨基酸序列；
与选自SEQ ID NO:90至101或SEQ ID NO:102至108的氨基酸序列具有至少90％或更高的序列同一性的氨基酸序列；或
与选自SEQ ID NO:90至101或SEQ ID NO:102至108的氨基酸序列具有至少95％或更高的序列同一性的氨基酸序列。
12.根据项4所述的双特异性抗体，其中，所述抗α-Syn抗体的轻链可变区包含：
选自SEQ ID NO:109至115或SEQ ID NO:116至123的氨基酸序列；
与选自SEQ ID NO:109至115或SEQ ID NO:116至123的氨基酸序列具有至少90％或更高的序列同一性的氨基酸序列；或
与选自SEQ ID NO:109至115或SEQ ID NO:116至123的氨基酸序列具有至少95％或更高的序列同一性的氨基酸序列。
13.根据项4所述的双特异性抗体，其中，所述抗α-Syn抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，其包含选自SEQ ID NO:90至101的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含选自SEQ ID NO:109至115的氨基酸序列。
14.根据项4所述的双特异性抗体，其中，所述抗α-Syn抗体或其抗原结合片段包含：重链可变区，其包含选自SEQ ID NO:102至108的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含选自SEQ ID NO:116至123的氨基酸序列。
15.根据项4所述的双特异性抗体，其中，所述抗α-Syn抗体或其抗原结合片段包含：
SEQ ID NO:127的重链可变区和SEQ ID NO:128的轻链可变区，
SEQ ID NO:129的重链可变区和SEQ ID NO:130的轻链可变区，
SEQ ID NO:131的重链可变区和SEQ ID NO:132的轻链可变区，
SEQ ID NO:133的重链可变区和SEQ ID NO:134的轻链可变区，
SEQ ID NO:135的重链可变区和SEQ ID NO:136的轻链可变区，或
SEQ ID NO:137的重链可变区和SEQ ID NO:138的轻链可变区。
16.根据项1所述的双特异性抗体，其中，所述抗IGF1R抗体或其抗原结合片段包含：
重链可变区，所述重链可变区包含：重链CDR1(H-CDR1)，其包含选自SEQ ID NO:1至9的氨基酸序列；重链CDR2(H-CDR2)，其包含选自SEQ ID NO:10至49的氨基酸序列；和重链CDR3(H-CDR3)，其包含选自SEQ ID NO:50至80的氨基酸序列，以及
轻链可变区，所述轻链可变区包含：轻链CDR1(L-CDR1)，其包含选自SEQ ID NO:96至113的氨基酸序列；轻链CDR2(L-CDR2)，其包含选自SEQ ID NO:114至132的氨基酸序列；和轻链CDR3(L-CDR3)，其包含选自SEQ ID NO:133至161的氨基酸序列。
17.根据项16所述的双特异性抗体，其中，所述抗IGF1R抗体或其抗原结合片段特异性识别并结合至选自由包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的蛋白质中的Y775、P776、F778、R650、S791、L798、Glu779、L641、H808、E809、L813、V397、D435、W434、Y460和C488组成的组中的至少一种氨基酸。
18.根据项17所述的双特异性抗体，其中，所述抗IGF1R抗体或其抗原结合片段识别并结合至选自由包含SEQ ID NO:174的氨基酸序列的蛋白质中的结合位点1至结合位点3组成的组中的至少一个结合位点，并且其中所述结合位点1包含选自由Y775、P776、F778、R650、S791、L798和Glu779组成的组中的至少一种，所述结合位点2包含选自由L641、H808、E809和L813组成的组中的至少一种，所述结合位点3包含选自由V397、D435、W434、Y460和C488组成的组中的至少一种。
19.根据项17所述的双特异性抗体，其中，所述重链可变区包含：
位于H-CDR1的N末端的重链框架1(H-FR1)，其包含选自SEQ ID NO:81至84的氨基酸序列，
位于H-CDR1和H-CDR2之间的重链框架(H-FR2)，其包含选自SEQ ID NO:85至86的氨基酸序列，
位于H-CDR2和H-CDR3之间的重链框架(H-FR3)，其包含选自SEQ ID NO:87至91的氨基酸序列，和
位于H-CDR3的C末端的重链框架(H-FR4)，其包含选自SEQ ID NO:92至95的氨基酸序列。
20.根据项17所述的双特异性抗体，其中，所述轻链可变区包含：
位于L-CDR1的N末端的轻链框架1(L-FR1)，其包含选自SEQ ID NO:162至164的氨基酸序列，
位于L-CDR1和L-CDR2之间的轻链框架(L-FR2)，其包含SEQ ID NO:165的氨基酸序列，
位于L-CDR2和L-CDR3之间的轻链框架(L-FR3)，其包含选自SEQ ID NO:166至168的氨基酸序列，和
位于L-CDR3的C末端的轻链框架(L-FR4)，其包含选自SEQ ID NO:169至171的氨基酸序列。
21.根据项16所述的双特异性抗体，其中，所述抗IGF1R抗体的抗原结合片段选自由scFv、(scFv)2、scFv-Fc、Fab、Fab'和F(ab')2组成的组。
22.根据项1所述的双特异性抗体，其中，所述抗α-Syn抗体是完全抗体，所述抗IGFR抗体是Fv片段。
23.根据项1所述的双特异性抗体，其中，所述抗α-Syn抗体是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4形式的竞争抗体。
24.根据项1所述的双特异性抗体，其中，所述抗IGFR抗体的抗原结合片段选自由scFv、(scFv)2、scFv-Fc、Fab、Fab'和F(ab')2组成的组。
25.一种用于预防或治疗α-突触核蛋白病的药物组合物，包含根据项1至24中任一项所述的双特异性抗体。
26.根据项25所述的药物组合物，其中，所述α-突触核蛋白病是帕金森病(PD)、帕金森病痴呆症(PDD)、路易体痴呆症(DLB)、阿尔茨海默病路易体变异型(LBV)、阿尔茨海默病和帕金森病合并症或多系统萎缩症(MSA)。
27.一种用于预防或治疗α-突触核蛋白病的药物组合物，包含提供根据项1至24中任一项所述的双特异性抗体的步骤。
28.一种治疗α-突触核蛋白病的方法，其包括将根据项1至24中任一项所述的双特异性抗体以药学有效量施用至需要治疗α-突触核蛋白病和/或调节α-syn聚集体浓度的受试者的步骤。
29.一种抑制α-突触核蛋白聚集体形成或降低α-突触核蛋白聚集体浓度的方法，包括将根据项1至24中任一项所述的双特异性抗体以药学有效量施用至需要治疗α-突触核蛋白病和/或调节α-syn聚集体浓度的受试者的步骤。

Claims (11)

1.一种抗IGF1R抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中
(a)所述VH包含：
重链CDR1(H-CDR1)，其包含选自SEQ ID NO:1至9的氨基酸序列；
H-CDR2，其包含选自SEQ ID NO:10至49的氨基酸序列；和
H-CDR3，其包含选自SEQ ID NO:50至80的氨基酸序列，以及
(b)所述VL包含：
轻链CDR1(L-CDR1)，其包含选自SEQ ID NO:96至113的氨基酸序列；
L-CDR2，其包含选自SEQ ID NO:114至132的氨基酸序列；和
L-CDR3，其包含选自SEQ ID NO:133至161的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗IGF1R抗体或其抗原结合片段，其中所述抗IGF1R抗体或其抗原结合片段特异性结合至选自人、猴、大鼠和小鼠的哺乳动物的IGF1R蛋白。
3.根据权利要求1或2所述的抗IGF1R抗体或其抗原结合片段，其中所述VH包含选自以下的一个或多个：
重链框架1(H-FR1)，其包含选自SEQ ID NO:81至84的氨基酸序列，
H-FR2，其包含SEQ ID NO:85或86，
H-FR3，其包含选自SEQ ID NO:87至91的氨基酸序列，和
H-FR4，其包含选自SEQ ID NO:92至95的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗IGF1R抗体或其抗原结合片段，其中所述VL包含选自以下的一个或多个：
轻链框架1(L-FR1)，其包含选自SEQ ID NO:162至164的氨基酸序列，
L-FR2，其包含SEQ ID NO:165，
L-FR3，其包含选自SEQ ID NO:166至168的氨基酸序列，和
L-FR4，其包含选自SEQ ID NO:169至171的氨基酸序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的抗IGF1R抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由包含SEQ ID NO:410的蛋白质中的Y775、P776、F778、R650、S791、L798、Glu779、L641、H808、E809、L813、V397、D435、W434、Y460和C488组成的组中的至少一种氨基酸。
6.根据权利要求5所述的抗IGF1R抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段结合至选自由包含SEQ ID NO:410的蛋白质中的结合位点1至结合位点3组成的组中的至少一个结合位点，并且其中
所述结合位点1包含Y775、P776、F778、R650、S791、L798和Glu779中的至少一种，
所述结合位点2包含L641、H808、E809和L813中的至少一种，并且
所述结合位点3包含V397、D435、W434、Y460和C488中的至少一种。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的抗IGF1R抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗IGF1R抗体的抗原结合片段选自由scFv、(scFv)2、scFv-Fc、Fab、Fab'和F(ab')2组成的组。
8.一种生物活性物质的血脑屏障转运蛋白，其包含根据权利要求1-7中任一项所述的抗IGF1R抗体或其抗原结合片段。
9.根据权利要求8所述的血脑屏障转运蛋白，其中，所述抗IGF1R抗体或其抗原结合片段与生物活性物质，以及将生物活性物质偶联至所述抗体或其抗原结合片段的接头结合。
10.根据权利要求9所述的血脑屏障转运蛋白，其中，所述生物活性物质选自由在脑中起作用的化合物、蛋白质、抗体、多肽和肽组成的组。
11.一种将生物活性物质递送至脑部的方法，该方法包括将所述生物活性物质连接至根据权利要求1-7中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
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