CN115768443A - Cd19定向嵌合抗原受体t细胞组合物和方法及其用途 - Google Patents

Abstract

在一些方面提供了用于治疗患有疾病和病症如非霍奇金淋巴瘤(NHL)的受试者的细胞组合物，以及相关方法、组合物、用途和制品。在一些实施方案中，所述疾病或病症是B细胞非霍奇金淋巴瘤(B细胞NHL)。所述细胞通常表达用于靶向所述淋巴瘤的细胞上的抗原如CD19的重组受体如嵌合抗原受体(CAR)。

Description

CD19定向嵌合抗原受体T细胞组合物和方法及其用途

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年2月12日提交的标题为“CD19定向嵌合抗原受体T细胞组合物和方法及其使用(CD19-DIRECTED CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR T CELL COMPOSITIONSAND METHODS AND USES THEREOF)”的美国临时申请号62/975,724，将其内容通过引用以其整体并入。

通过引用并入序列表

本申请是与电子格式的序列表一起提交申请的。序列表以2021年2月6日创建、大小为56.9千字节的名为735042022740SEQLIST.txt的文件提供。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其整体并入。

技术领域

本公开文本在一些方面涉及过继细胞疗法，所述过继细胞疗法涉及施用细胞的组合物以用于治疗患有诸如非霍奇金淋巴瘤(NHL)的疾病和病症的受试者；以及相关方法、组合物、用途和制品。

背景技术

多种免疫疗法和/或细胞疗法可用于治疗疾病和病症。例如，过继细胞疗法(包括涉及施用表达对目的疾病或障碍具有特异性的嵌合受体(如嵌合抗原受体(CAR))和/或其他重组抗原受体的细胞的那些过继细胞疗法，以及其他过继免疫细胞和过继T细胞疗法)在癌症或者其他疾病或障碍的治疗中可以是有益的。需要改进的方法。提供满足此类需求的方法、用途和制品。

发明内容

在一个方面，本文提供了一种治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(B细胞NHL)的方法，其中所述方法包括向患有或怀疑患有B细胞NHL的受试者施用包含表达靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中所述组合物包含表达所述CAR的CD4⁺ T细胞和表达所述CAR的CD8⁺ T细胞，并且所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约25×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；并且所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞。

在一个方面，本文提供了一种治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(B细胞NHL)的方法，其中所述方法包括向患有或怀疑患有B细胞NHL的受试者施用包含表达靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中所述组合物包含在约1:2.5与约2.5:1之间的比率下的表达所述CAR的CD4⁺ T细胞和表达所述CAR的CD8⁺ T细胞，并且所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约100×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值，并且所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD3⁺细胞。

在一个方面，本文提供了一种治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(B细胞NHL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有B细胞NHL的受试者施用包含表达靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中所述组合物包含在约1:1与约2.5:1之间的比率下的表达所述CAR的CD4+ T细胞和表达所述CAR的CD8⁺ T细胞，并且所述组合物包含在为或约5×106个与为或约50×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值，并且所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞。

在一个方面，本文提供了一种治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(r/r B细胞NHL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有B细胞NHL的受试者施用包含表达靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中所述组合物包含表达所述CAR的CD4+ T细胞和表达所述CAR的CD8⁺ T细胞，并且所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约100×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值，并且所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞，并且所述组合物中至少或至少约80％的CAR⁺ T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。

在一个方面，本文提供了一种治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-细胞NHL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有B细胞NHL的受试者施用包含表达靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中所述组合物包含表达所述CAR的CD4⁺ T细胞和表达所述CAR的CD8⁺ T细胞，并且所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约100×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值，并且所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺ T细胞是CD27⁺CCR7⁺和/或所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺ T细胞是CD27⁺CCR7⁺。

在一个方面，本文提供了一种治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(B-细胞NHL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有B细胞NHL的受试者施用包含表达靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中所述组合物包含表达所述CAR的CD4+ T细胞和表达所述CAR的CD8⁺ T细胞，并且所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约50×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值，并且所述组合物中至少或至少约96％的细胞是CD3⁺细胞，并且所述组合物中至少或至少约80％的CAR⁺ T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。

在一个方面，本文提供了一种治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(r/r B细胞NHL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有B细胞NHL的受试者施用包含表达靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中所述组合物包含表达所述CAR的CD4+ T细胞和表达所述CAR的CD8⁺ T细胞，并且所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约100×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值，并且所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均为少于或少于约0.9。

在一个方面，本文提供了一种治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(r/r B细胞NHL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有B细胞NHL的受试者施用包含表达靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中所述组合物包含表达所述CAR的CD4+ T细胞和表达所述CAR的CD8⁺ T细胞，并且所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约100×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值，并且所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)平均在或在约0.4个拷贝/二倍体基因组与3.0个拷贝/二倍体基因组之间，包含端值。

在本文的任何实施方案中，所述组合物包含在约1:2.5与约2.5:1之间的比率下的表达所述CAR的CD4⁺ T细胞和表达所述CAR的CD8⁺ T细胞。

在本文的任何实施方案中，所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约50×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。在本文的任何实施方案中，所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约25×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。

在本文的任何实施方案中，所述组合物可以包含在约1:2与约2:1之间、在约1:1.5与约1.5:1之间或者为或为约1:1的比率下的表达所述CAR的CD4⁺ T细胞和表达所述CAR的CD8⁺ T细胞。在本文的任何实施方案中，所述组合物可以包含在约1:1与约2.5:1之间、在约1.5:1与约2:1之间、为或为约1.5:1或者为或为约2:1的比率下的表达所述CAR的CD4⁺ T细胞和表达所述CAR的CD8⁺ T细胞。在本文的任何实施方案中，所述组合物可以包含在为或约5×10⁶个与为或约10×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。在本文的任何实施方案中，所述组合物可以包含在为或约10×10⁶个与为或约25×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。在本文的任何实施方案中，所述组合物可以包含为或约5×10⁶个CAR表达T细胞。在本文的任何实施方案中，所述组合物可以包含为或约10×10⁶个CAR表达T细胞。在本文的任何实施方案中，所述组合物可以包含为或约25×10⁶个CAR表达T细胞。在本文的任何实施方案中，所述组合物可以包含为或约50×10⁶个CAR表达T细胞。在本文的任何实施方案中，所述组合物可以包含为或约100×10⁶个CAR表达T细胞。

在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD3⁺细胞。

在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CAR⁺ T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。

在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％或者至少或至少约96％的细胞是CD3⁺细胞。在本文的任何实施方案中，所述组合物中在为或约5％与为或约30％之间、任选在为或约5％与为或约30％之间的CAR⁺ T细胞表达凋亡的标记物、任选膜联蛋白V或活性胱天蛋白酶3。在本文的任何实施方案中，所述组合物中在为或约10％与为或约15％之间的CAR⁺ T细胞表达凋亡的标记物、任选膜联蛋白V或活性胱天蛋白酶3。在本文的任何实施方案中，所述组合物中在为或约15％与为或约20％之间的CAR⁺ T细胞表达凋亡的标记物、任选膜联蛋白V或活性胱天蛋白酶3。在本文的任何实施方案中，所述组合物中在为或约20％与为或约25％之间的CAR⁺ T细胞表达凋亡的标记物、任选膜联蛋白V或活性胱天蛋白酶3。在本文的任何实施方案中，所述组合物中在为或约25％与为或约30％之间的CAR⁺ T细胞表达凋亡的标记物、任选膜联蛋白V或活性胱天蛋白酶3。在本文的任何实施方案中，所述组合物中为或约5％、为或约10％、为或约15％、为或约20％、为或约25％或者为或约30％的CAR⁺T细胞表达凋亡的标记物、任选膜联蛋白V或活性胱天蛋白酶3。在本文的任何实施方案中，所述组合物中在为或约80％与为或约85％之间的CAR⁺ T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。在本文的任何实施方案中，所述组合物中在为或约85％与为或约90％之间的CAR⁺ T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。在本文的任何实施方案中，所述组合物中在为或约90％与为或约95％之间的CAR⁺ T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。在本文的任何实施方案中，所述组合物中在为或约95％与为或约99％之间的CAR⁺ T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。在本文的任何实施方案中，所述组合物中为或约85％、为或约90％、为或约95％或者为或约99％的CAR⁺ T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。

在本文的任何实施方案中，凋亡的所述标记物是膜联蛋白V。在一些任何本文的实施方案中，凋亡的所述标记物是活性胱天蛋白酶3。

在本文的任何实施方案中，所述组合物中属于幼稚样表型或中央记忆表型的所述至少或至少约80％的CAR⁺ T细胞对在幼稚样或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性。在一些实施方案中，在幼稚样或中央记忆T细胞上表达的所述标记物选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7。

在一些任何实施方案中，所述组合物中属于幼稚样或中央记忆表型的所述至少或至少约80％的CAR⁺ T细胞具有选自CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺或CD62L^-CCR7⁺的表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中在为或约80％与为或约85％之间、在为或约85％与为或约90％之间、在为或约90％与为或约95％之间、在为或约95％与为或约99％之间的CAR⁺ T细胞属于选自CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺或CD62L^-CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中为或约80％、为或约85％、为或约90％、为或约95％或者为或约99％的CAR⁺ T细胞属于选自CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺或CD62L^-CCR7⁺幼稚样表型或中央记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中为或约80％、为或约85％、为或约90％、为或约95％或者为或约99％的CAR⁺ T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。

在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺ T细胞属于呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样表型或中央记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的CD4⁺CAR⁺ T细胞属于呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样表型或中央记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的CD4⁺CAR⁺ T细胞属于呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样表型或中央记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CD4⁺CAR⁺ T细胞属于呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样表型或中央记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约85％的CD4⁺CAR⁺ T细胞属于呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样表型或中央记忆表型。

在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺ T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的CD4⁺CAR⁺ T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的CD4⁺CAR⁺ T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CD4⁺CAR⁺ T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约85％的CD4⁺CAR⁺ T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。

在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺ T细胞属于呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样表型或中央记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的CD8⁺CAR⁺ T细胞属于呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样表型或中央记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的CD8⁺CAR⁺ T细胞属于呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样表型或中央记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CD8⁺CAR⁺ T细胞属于呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样表型或中央记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约85％的CD8⁺CAR⁺ T细胞属于呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样表型或中央记忆表型。

在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺ T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的CD8⁺CAR⁺ T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的CD8⁺CAR⁺ T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CD8⁺CAR⁺ T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。在一些任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约85％的CD8⁺CAR⁺ T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。

在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CAR⁺ T细胞对在幼稚样或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性。在本文的任何实施方案中，在幼稚样或中央记忆T细胞上表达的标记物选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7。在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺和/或CD62L^-CCR7⁺。在本文的任何实施方案中，所述组合物中在为或约80％与为或约85％之间、在为或约85％与为或约90％之间、在为或约90％与为或约95％之间、在为或约95％与为或约99％之间的CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺和/或CD62L^-CCR7⁺。在本文的任何实施方案中，所述组合物中为或约80％、为或约85％、为或约90％、为或约95％或者为或约99％的CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺和/或CD62L^-CCR7⁺。在本文的任何实施方案中，所述组合物中为或约80％、为或约85％、为或约90％、为或约95％或者为或约99％的CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-。在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的CD4⁺CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-。在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的CD4⁺CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-。在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CD4⁺CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-。在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约85％的CD4⁺CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-。在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的CD4⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的CD4⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CD4⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约85％的CD4⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。

在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-。在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的CD8⁺CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-。在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的CD8⁺CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-。在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CD8⁺CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-。在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约85％的CD8⁺CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-。在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约60％的CD8⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约70％的CD8⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％的CD8⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。在本文的任何实施方案中，所述组合物中至少或至少约85％的CD8⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。

在本文的任何实施方案中，所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均为小于或小于约0.9。

在本文的任何实施方案中，所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均在为或约0.9与为或约0.8之间。在本文的任何实施方案中，所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均为小于或小于约0.8。在本文的任何实施方案中，所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均在为或约0.8与为或约0.7之间。在本文的任何实施方案中，所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均在为或约0.7与为或约0.6之间。在本文的任何实施方案中，所述组合物中CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均在为或约0.6与为或约0.5之间。在本文的任何实施方案中，所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均在为或约0.5与为或约0.4之间。

在本文的任何实施方案中，所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)平均为在或在约0.4个拷贝/二倍体基因组与3.0个拷贝/二倍体基因组之间，包含端值。

在本文的任何实施方案中，所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)平均为在或在约0.8个拷贝/二倍体基因组与2.0个拷贝/二倍体基因组之间，包含端值。在本文的任何实施方案中，所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)平均为在或在约0.8个拷贝/二倍体基因组与1.0个拷贝/二倍体基因组之间，包含端值。在本文的任何实施方案中，所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)平均为在或在约1.0个拷贝/二倍体基因组与1.5个拷贝/二倍体基因组之间，包含端值。在本文的任何实施方案中，所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)平均为在或在约1.5个拷贝/二倍体基因组与2.0个拷贝/二倍体基因组之间，包含端值。

在本文的任何实施方案中，所述r/r B细胞NHL选自弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、任选DLBCL非特指型(DLBCL NOS；包括从头或转化的DLBCL，例如从滤泡性淋巴瘤或边缘区淋巴瘤转化的)；高级别B细胞淋巴瘤(HGBCL)、任选DLBCL组织学为携带MYC和BCL2和/或BCL6重排的HGBCL；原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)；以及滤泡性淋巴瘤(FL)、任选滤泡性淋巴瘤3b级别(FL3B)。

在本文的任何实施方案中，所述B细胞NHL选自：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、任选DLBCL非特指型；转化的DLBCL、任选从滤泡性淋巴瘤或边缘区淋巴瘤转化的DLBCL；高级别B细胞淋巴瘤(HGBCL)、任选DLBCL组织学为携带MYC和BCL2和/或BCL6重排的HGBCL；原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)；以及滤泡性淋巴瘤(FL)、任选滤泡性淋巴瘤3b级别(FL3B)。

在本文的任何实施方案中，所述B细胞NHL是弥漫性大B细胞淋巴瘤。在本文的任何实施方案中，所述B细胞NHL是弥漫性大B细胞淋巴瘤非特指型。在本文的任何实施方案中，所述B细胞NHL是从头弥漫性大B细胞淋巴瘤。在本文的任何实施方案中，所述B细胞NHL是从滤泡性淋巴瘤转化的弥漫性大B细胞淋巴瘤。在本文的任何实施方案中，所述B细胞NHL是从边缘区淋巴瘤转化的弥漫性大B细胞淋巴瘤。在本文的任何实施方案中，所述B细胞NHL是高级别B细胞淋巴瘤(HGBCL)。在本文的任何实施方案中，所述B细胞NHL是具有MYC和BCL2和/或BCL6重排的高级别B细胞淋巴瘤。在本文的任何实施方案中，所述B细胞NHL是具有DLBCL组织学的高级别B细胞淋巴瘤。在本文的任何实施方案中，所述B细胞NHL是双打击淋巴瘤或三打击淋巴瘤。在本文的任何实施方案中，所述B细胞NHL是原发性纵隔大B细胞淋巴瘤。在本文的任何实施方案中，所述B细胞NHL是滤泡性淋巴瘤。在本文的任何实施方案中，所述B细胞NHL是滤泡性淋巴瘤3b。在本文的任何实施方案中，所述B细胞NHL是经组织学证实的。

在本文的任何实施方案中，在施用包含工程化T细胞的所述组合物时或紧接在施用包含工程化T细胞的所述组合物之前，所述受试者在用以下疗法治疗之后在缓解后复发，或者变得用以下疗法难以治疗：(i)针对所述B细胞NHL的两种或更多种先前疗法和/或(ii)自体干细胞移植(ASCT)疗法。

在本文的任何实施方案中，在施用包含工程化T细胞的所述组合物时或紧接在施用包含工程化T细胞的所述组合物之前，所述受试者在用以下疗法治疗之后在缓解后复发，或者变得用以下疗法难以治疗：针对所述B细胞NHL的两种或更多种先前疗法。在本文的任何实施方案中，在施用包含工程化T细胞的所述组合物时或紧接在施用包含工程化T细胞的所述组合物之前，所述受试者在用以下疗法治疗之后在缓解后复发，或者变得用以下疗法难以治疗：针对所述B细胞NHL的三种或更多种先前疗法。在本文的任何实施方案中，针对所述r/r B细胞NHL的所述两种或更多种先前疗法不包括另一个剂量的表达所述CAR的细胞。

在本文的任何实施方案中，针对所述B细胞NHL的所述两种或更多种先前疗法包括蒽环类药物和CD20靶向剂。在本文的任何实施方案中，针对所述B细胞NHL的所述两种或更多种先前疗法不包括针对先前惰性淋巴瘤给予的疗法。在本文的任何实施方案中，针对所述B细胞NHL的所述两种或更多种先前疗法不包括针对惰性DLBCL给予的蒽环类药物。在本文的任何实施方案中，针对所述B细胞NHL的所述两种或更多种先前疗法包括CD20靶向剂，并且针对所述B细胞NHL的所述两种或更多种先前疗法不包括针对先前惰性淋巴瘤给予的蒽环类药物。在本文的任何实施方案中，所述CD20靶向剂包括抗CD20单克隆抗体。在本文的任何实施方案中，所述CD20靶向剂包括利妥昔单抗。

在本文的任何实施方案中，在施用包含工程化T细胞的所述组合物时或紧接在施用包含工程化T细胞的所述组合物之前，所述受试者在用以下疗法治疗之后在缓解后复发，或者变得用以下疗法难以治疗：自体干细胞移植(ASCT)疗法。在一些实施方案中，所述受试者患有复发性和/或难治性DLBCL。在一些实施方案中，所述ASCT无法实现客观反应(部分反应(PR)或更好)。在本文的任何实施方案中，在所述ASCT之后，所述受试者的疾病已经进展。

在一些任何实施方案中，在施用包含工程化T细胞的所述组合物时或之前，所述受试者已经被鉴定为患有侵袭性疾病或高风险疾病或者被鉴定为具有不良预后。在本文的任何实施方案中，在施用包含工程化T细胞的所述组合物时或之前，所述受试者已经在化学疗法后被鉴定为患有化学疗法难治性疾病或患有持续性或复发性疾病。在本文的任何实施方案中，所述受试者具有经病理证实的由恶性肿瘤导致的继发性中枢神经系统(CNS)受累。在本文的任何实施方案中，所述受试者没有仅由恶性肿瘤导致的中枢神经系统(CNS)受累。

在本文的任何实施方案中，所述受试者未接受过先前的CAR T细胞或基因修饰的T细胞疗法。在本文的任何实施方案中，所述受试者未接受过先前的CD19靶向疗法，如抗CD19单克隆抗体或双特异性抗体。

在本文的任何实施方案中，所述方法进一步包括从所述受试者获得白细胞单采术样品，以用于制造包含工程化T细胞的组合物。在一些实施方案中，所述受试者在白细胞术的时间之前为或约14天内未接受过治疗剂量的皮质类固醇。在一些实施方案中，所述受试者在白细胞单采术的时间之前为或约7天内未接受过细胞毒性化学治疗剂，其不是淋巴毒性化学治疗剂或鞘内疗法。在本文的任何实施方案中，所述受试者在白细胞单采术的时间之前为或约4周内未接受过淋巴毒性化学治疗剂。在本文的任何实施方案中，所述受试者在白细胞单采术的时间之前为或约4周内未接受过免疫抑制疗法。在本文的任何实施方案中，所述受试者在白细胞单采术的时间之前为或约6周内未接收过辐射。在本文的任何实施方案中，所述受试者在白细胞单采术的时间之前为或约3个月内未接受自体干细胞移植。

在本文的任何实施方案中，所述受试者未实现响应于先前疗法的完全缓解(CR)。在本文的任何实施方案中，所述受试者未实现响应于先前疗法的客观反应(部分反应(PR)或更好)。

在本文的任何实施方案中，在施用包含工程化T细胞的所述组合物时或之前，评价所述受试者中与中枢神经系统(CNS)受累或继发性CNS淋巴瘤相关的或者涉及中枢神经系统(CNS)受累或继发性CNS淋巴瘤的淋巴瘤。在本文的任何实施方案中，在施用包含工程化T细胞的所述组合物时或之前，所述受试者被鉴定为或已经被鉴定为具有：足够的心脏功能，任选地具有为或约40％、大于40％或大于约40％的左心室射血分数(LVEF)；和/或足够的肾功能，任选地具有为或约45mL/min、大于45mL/min或大于约45mL/min的肌酐清除率；和/或足够的肝功能，任选地具有为或小于2.5倍的正常上限值(ULN)的天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)以及小于1.5倍的ULN的总胆红素；和/或足够的肺功能，任选地在室内空气下具有≤CTCAE 1级呼吸困难和饱和氧(例如，SaO₂≥92％)。在本文的任何实施方案中，在施用包含工程化T细胞的所述组合物时或之前，所述受试者被鉴定为或已被鉴定为在没有生长因子支持的情况下具有为或约1.0×10⁹个细胞/L、大于1.0×10⁹个细胞/L或大于约1.0×10⁹个细胞/L的绝对中性粒细胞计数(ANC)。在本文的任何实施方案中，在施用包含工程化T细胞的所述组合物时或之前，所述受试者被鉴定为或已被鉴定为在没有输液支持的情况下具有为或约50×10⁹个细胞/L、大于50×10⁹个细胞/L或大于约50×10⁹个细胞/L的血小板。

在本文的任何实施方案中，在施用包含工程化T细胞的所述组合物时或之前，所述受试者已在用于产生包含工程化T细胞的组合物的白细胞单采术的时间与施用包含工程化T细胞的所述组合物之间接受了桥接化学疗法。在本文的任何实施方案中，在施用包含工程化T细胞的所述组合物时或之前，所述受试者已在先前疗法之后接受了桥接化学疗法以用于疾病控制。

在本文的任何实施方案中，所述受试者被鉴定为或已经被鉴定为具有0或1的东部肿瘤协作组体能状态(ECOG PS)。在本文的任何实施方案中，在施用包含工程化T细胞的所述组合物之前，所述受试者被鉴定为或已经被鉴定为具有高基线肿瘤负担，如通过垂直直径乘积之和(SPD)或高血清乳酸脱氢酶(LDH)如LDH≥500u/L所测量。在本文的任何实施方案中，在施用包含工程化T细胞的所述组合物时或之前，所述受试者患有正电子发射断层扫描(PET)-阳性疾病。

在本文的任何实施方案中，所述方法进一步包括在施用包含工程化T细胞的所述组合物之前鉴定或选择所述受试者以施用包含工程化T细胞的所述组合物。

在本文的任何实施方案中，在所述施用之前，所述受试者已用淋巴细胞清除疗法进行了预调理。在本文的任何实施方案中，所述方法进一步包括紧接在施用包含工程化T细胞的所述组合物之前向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法，其中所述淋巴细胞清除疗法包括施用氟达拉滨和/或环磷酰胺。

在本文的任何实施方案中，包含工程化T细胞的所述组合物和/或所述淋巴细胞清除疗法的施用是经由门诊递送进行的。在一些任何实施方案中，所述组合物的施用是在门诊基础上进行的，任选地除非如下情况或直到如下情况为止：所述受试者展现出持续发热或者展现出在用退热药治疗后未降低或一直未降低过超过1℃的发热。在一些任何实施方案中，所述组合物的施用无需使所述受试者住院和/或无需在医院过夜停留，任选地除非如下情况或直到如下情况为止：所述受试者展现出持续发热或展现出在用退热药治疗后未降低或一直未降低过超过1℃的发热。在一些任何实施方案中，所述组合物的施用不需要住院或在医院过夜停留，任选地除非如下情况或直到如下情况为止：所述受试者展现出持续发热或展现出在用退热药治疗后未降低或一直未降低过超过1℃的发热。

在本文的任何实施方案中，所述淋巴细胞清除疗法包括以30mg/m²受试者身体表面积每天施用氟达拉滨以及以300mg/m²受试者身体表面积每天施用环磷酰胺，每一种持续3天。在本文的任何实施方案中，包含工程化T细胞的所述组合物是在完成所述淋巴细胞清除疗法之后为或约48小时与为或约9天之间施用，包含端值。在本文的任何实施方案中，所述受试者在接受所述淋巴细胞清除疗法时具有至少或至少约30mL/min的肌酐清除率。

在本文的任何实施方案中，在开始施用包含工程化T细胞的所述组合物之前，所述受试者未被施用过用于治疗、预防、减轻或减弱神经毒性和/或细胞因子释放综合征或其风险的药剂或治疗方法。在本文的任何实施方案中，所述方法进一步包括向所述受试者施用用于治疗、预防、减轻或减弱神经毒性和/或细胞因子释放综合征或其风险的药剂或治疗方法。在本文的任何实施方案中，所述药剂是或包含抗IL-6抗体、抗IL-6受体抗体或类固醇。在本文的任何实施方案中，所述药剂是或包含托珠单抗或甲基泼尼松龙。

在本文的任何实施方案中，所述T细胞是从受试者获得的原代T细胞。

在本文的任何实施方案中，所述T细胞对于所述受试者是自体的。

在本文的任何实施方案中，至少35％、至少40％或至少50％的根据所述方法治疗的受试者实现完全反应(CR)；至少60％、70％、80％、90％或95％的实现CR的受试者展现出持续大于或等于3个月或者大于或等于6个月的CR；和/或至少60％、70％、80％、90％或95％的截至1个月和/或截至3个月实现CR的受试者在实现所述CR之后保持反应、保持CR和/或存活或无进展存活，持续大于或等于3个月和/或大于或等于6个月和/或大于或等于9个月；和/或至少50％、至少60％或至少70％的根据所述方法治疗的受试者实现客观反应(OR)；至少60％、70％、80％、90％或95％的实现OR的受试者展现出持续大于或等于3个月或大于或等于6个月的OR；和/或至少35％、至少40％或至少50％的实现OR的受试者在实现所述OR之后保持反应或存活，持续大于或等于3个月和/或大于或等于6个月。

在本文的任何实施方案中，至少50％的根据所述方法治疗的受试者实现完全反应(CR)；至少60％的实现CR的受试者展现出持续大于或等于6个月的CR；和/或至少60％的截至1个月和/或截至3个月实现CR的受试者在实现所述CR之后保持反应，保持CR和/或存活或无进展存活，持续大于或等于6个月；和/或根据所述方法治疗的受试者的至少70％实现客观反应(OR)；至少60％的实现OR的受试者展现出持续大于或等于6个月的OR；和/或至少50％的实现OR的受试者在实现所述OR之后保持反应或存活，持续大于或等于6个月。

在本文的任何实施方案中，所述CR或所述OR持续大于3个月或大于6个月；和/或至少20％、至少25％、至少35％、至少40％或至少50％的根据所述方法治疗的受试者实现持续大于3个月或大于6个月的CR；和/或至少60％、70％、80％、90％或95％的用所述方法治疗并实现CR的受试者保持CR或保持反应或保持存活，持续大于或等于3个月或大于或等于6个月或大于或等于9个月；和/或至少60％、70％、80％、90％或95％的用所述方法治疗并截至一个月和/或截至3个月实现CR的受试者保持反应，保持CR和/或存活或无进展存活，持续大于或等于3个月和/或大于或等于6个月和/或大于或等于9个月；和/或至少50％、至少60％或至少70％的根据所述方法治疗的受试者实现客观反应(OR)；至少60％、70％、80％、90％或95％的受试者实现持续大于或等于3个月或大于或等于6个月的OR；和/或至少35％、至少40％或至少50％的用所述方法治疗并实现OR的受试者保持反应或存活，持续大于或等于3个月和/或大于或等于6个月。

在本文的任何实施方案中，所述细胞对于所述受试者是自体的，并且对于所述疗法的产生，不要求和/或指定单采术的绝对淋巴细胞计数(ALC)；和/或所述细胞通过如下过程产生，所述过程对于至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的患有所述B细胞NHL的受试者能够生成用于根据所述方法施用的细胞产物。

在本文的任何实施方案中，至少35％、至少40％或至少50％的根据所述方法治疗的受试者实现CNS疾病的完全反应(CR)或缓解；至少60％、70％、80％、90％或95％的实现CR的受试者保持CR，持续大于或等于3个月或大于或等于6个月；和/或至少60％、70％、80％、90％或95％的截至一个月和/或截至3个月实现CNS疾病的CR或缓解的受试者保持反应，保持CR和/或存活或无进展存活，持续大于或等于3个月和/或大于或等于6个月和/或大于或等于9个月；和/或至少50％、至少60％或至少70％的根据所述方法治疗的受试者实现CNS疾病的客观反应(OR)或缓解；至少60％、70％、80％、90％或95％的受试者实现OR，持续大于或等于3个月或大于或等于6个月；和/或至少60％、70％、80％、90％或95％的实现CNS疾病的OR或缓解的受试者保持反应或存活，持续大于或等于3个月和/或大于或等于6个月；和/或脑病灶的大小或体积减小大于或大于约25％、50％、75％或更多；和/或在至少35％、至少40％或至少50％的根据所述方法治疗的受试者中实现CNS疾病的减轻或缓解或清除。

在本文的任何实施方案中，大于或大于约50％、约60％、约70％或约80％的根据所述方法治疗的受试者不展现3级或更高级别的细胞因子释放综合征(CRS)，和/或不展现3级或更高级别的神经毒性，和/或大于40％或50％或55％的根据所述方法治疗的受试者不展现任何神经毒性或CRS。在本文的任何实施方案中，大于或大于约80％的根据所述方法治疗的受试者不展现3级或更高级别的细胞因子释放综合征(CRS)，和/或不展现3级或更高级别的神经毒性。在本文的任何实施方案中，大于95％的根据所述方法治疗的受试者不展现3级或更高级别的CRS。在本文的任何实施方案中，大于85％的根据所述方法治疗的受试者不展现3级或更高级别的神经毒性。

在本文的任何实施方案中，大于或大于约30％、35％、40％或50％的根据所述方法治疗的受试者不展现任何级别的细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性；和/或至少或至少约45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的根据所述方法治疗的受试者不展现开始施用后早于3天的CRS发作，和/或不展现开始施用后早于5天的神经毒性发作；和/或根据所述方法治疗的受试者中神经毒性的中值发作位于根据所述方法治疗的受试者的CRS的中值峰处或之后，或者所述CRS的消退的中值时间之时或之后，和/或根据所述方法治疗的受试者中神经毒性的中值发作大于或大于约8、9、10或11天。

在本文的任何实施方案中，大于或大于约50％的根据所述方法治疗的受试者不展现任何级别的细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性；和/或至少或至少约45％的根据所述方法治疗的受试者不展现开始施用后早于3天的CRS发作，和/或不展现开始施用后早于5天的神经毒性发作；和/或根据所述方法治疗的受试者中神经毒性的中值发作位于根据所述方法治疗的受试者的CRS的中值峰处或之后，或者所述CRS的消退的中值时间之时或之后，和/或根据所述方法治疗的受试者中神经毒性的中值发作大于或大于约8天。

在本文的任何实施方案中，至少50％的根据所述方法治疗的受试者实现完全反应(CR)；至少70％的根据所述方法治疗的受试者实现客观反应(OR)；并且大于或大于约50％的根据所述方法治疗的受试者不展现任何级别的细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性；并且大于或大于约80％的根据所述方法治疗的受试者不展现3级或更高级别的细胞因子释放综合征(CRS)和/或不展现3级或更高级别的神经毒性。

在本文的任何实施方案中，所述CAR可以包含对所述抗原具有特异性的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、源自共刺激分子、任选4-1BB的胞质信号传导结构域和源自含有ITAM的初级信号传导分子、任选CD3ζ的胞质信号传导结构域；在一些任何实施方案中，所述CAR可以按顺序包含对所述抗原具有特异性的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、源自共刺激分子的胞质信号传导结构域和源自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域；或者所述CAR可以包含与所述抗原特异性结合的胞外抗原识别结构域和细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含CD3-zeta(CD3ζ)链和作为4-1BB的信号传导结构域的共刺激信号传导区。在本文的任何实施方案中，所述CAR可以包含对CD19具有特异性的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、源自4-1BB的胞质信号传导结构域和源自CD3ζ的胞质信号传导结构域。

在本文的任何实施方案中，所述CAR包含对CD19具有特异性的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、源自共刺激分子、任选4-1BB的胞质信号传导结构域和源自含有ITAM的初级信号传导分子、任选CD3ζ的胞质信号传导结构域；所述CAR按顺序包含对CD19具有特异性的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、源自共刺激分子的胞质信号传导结构域和源自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域；或者所述CAR包含与CD19特异性结合的胞外抗原识别结构域和细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含CD3-zeta(CD3ζ)链和作为4-1BB的信号传导结构域的共刺激信号传导区。

在本文的任何实施方案中，所述CAR包含对CD19具有特异性的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、源自作为4-1BB的共刺激分子的胞质信号传导结构域以及源自作为CD3ζ的含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域。

在本文的任何实施方案中，所述胞外抗原结合结构域是scFv。在本文的任何实施方案中，所述scFv可以包含RASQDISKYLN(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列、SRLHSGV(SEQ IDNO:36)的氨基酸序列和/或GNTLPYTFG(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列和/或DYGVS(SEQ IDNO:38)的氨基酸序列、VIWGSETTYYNSALKS(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列和/或YAMDYWG(SEQID NO:40)的氨基酸序列。在本文的任何实施方案中，所述scFv的六个CDR序列(CDRL1-L3和CDRH1-H3)可以包含氨基酸序列RASQDISKYLN(SEQ ID NO:35)、SRLHSGV(SEQ ID NO:36)、GNTLPYTFG(SEQ ID NO:37)、DYGVS(SEQ ID NO:38)、VIWGSETTYYNSALKS(SEQ ID NO:39)和YAMDYWG(SEQ ID NO:40)。在一些实施方案中，所述scFv包含FMC63的可变重链区和FMC63的可变轻链区。在一些实施方案中，所述scFv的六个CDR序列(CDRL1-L3和CDRH1-H3)可以包含FMC63的CDRL1序列、FMC63的CDRL2序列、FMC63的CDRL3序列、FMC63的CDRH1序列、FMC63的CDRH2序列和FMC63的CDRH3序列。在一些实施方案中，所述scFv可以是这样的scFv，其与前述任一项结合相同的表位或者与前述任一项竞争结合。在一些实施方案中，所述scFv按顺序包含VH、任选地包括SEQ ID NO:24所示的接头在内的接头以及VL。在本文的任何实施方案中，所述scFv按顺序包含VL、任选地包括SEQ ID NO:24所示的接头在内的接头以及VH。在一些实施方案中，所述scFv包含柔性接头。在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列。在本文的任何实施方案中，所述scFv如SEQ ID NO:43所示。

在本文的任何实施方案中，所述scFv可以包含RASQDISKYLN(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列、SRLHSGV(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列和/或GNTLPYTFG(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列和/或DYGVS(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列、VIWGSETTYYNSALKS(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列和/或YAMDYWG(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scFv包含FMC63的可变重链区和FMC63的可变轻链区。在一些实施方案中，所述scFv包含FMC63的CDRL1序列、FMC63的CDRL2序列、FMC63的CDRL3序列、FMC63的CDRH1序列、FMC63的CDRH2序列和FMC63的CDRH3序列。在一些实施方案中，所述scFv按顺序包含VH、接头SEQ ID NO:24和VL。在一些实施方案中，所述scFv包含柔性接头。在一些实施方案中，所述scFv包含SEQ IDNO:43所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，CD19定向scFv与前述任一项结合相同的表位或者与前述任一项竞争结合。

在本文的任何实施方案中，所述scFv可以包含FMC63的可变重链区和FMC63的可变轻链区。

在一些实施方案中，所述跨膜结构域是如下跨膜结构域，所述跨膜结构域包含SEQID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述跨膜结构域是如下跨膜结构域，所述跨膜结构域包含SEQID NO:9所示的氨基酸序列，或与其具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。

在本文的任何实施方案中，所述共刺激信号传导区是4-1BB的信号传导结构域。在本文的任何实施方案中，所述共刺激结构域可以包含SEQ ID NO:12或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的其变体。在本文的任何实施方案中，所述初级信号传导结构域是CD3ζ信号传导结构域。在本文的任何实施方案中，所述初级信号传导结构域可以包含与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的SEQ ID NO:13、14或15。

在本文的任何实施方案中，源自共刺激分子的所述胞质信号传导结构域是4-1BB的信号传导结构域。在本文的任何实施方案中，源自共刺激分子的所述胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:12或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的其变体。

在本文的任何实施方案中，源自含有ITAM的初级信号传导分子的所述胞质信号传导结构域是CD3ζ信号传导结构域。在本文的任何实施方案中，源自含有ITAM的初级信号传导分子的所述胞质信号传导结构域包含与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的SEQ ID NO:13、14或15。

在本文的任何实施方案中，所述CAR进一步包含所述跨膜结构域与所述胞外抗原结合结构域之间的间隔子。在一些实施方案中，所述间隔子包含以下项或由以下项组成：SEQ ID NO:1的序列、由SEQ ID NO:2编码的序列、SEQ ID NO:30的序列、SEQ ID NO:31的序列、SEQ ID NO:32的序列、SEQ ID NO:33的序列、SEQ ID NO:34的序列，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的前述任一项的变体。在一些实施方案中，所述间隔子包含式X₁PPX₂P或由其组成，其中X₁是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸，并且X₂是半胱氨酸或苏氨酸。

在本文的任何实施方案中，所述CAR可以进一步包含所述跨膜结构域与所述scFv之间的间隔子。在本文的任何实施方案中，所述间隔子是多肽间隔子，所述多肽间隔子包含全部或部分免疫球蛋白铰链或其修饰形式或者由全部或部分免疫球蛋白铰链或其修饰形式组成。在一些实施方案中，所述间隔子是IgG4铰链或其修饰形式。在本文的任何实施方案中，所述间隔子的长度是为或约12个氨基酸。在本文的任何实施方案中，所述间隔子具有以下项或由以下项组成：SEQ ID NO:1的序列、由SEQ ID NO:2编码的序列、SEQ ID NO:30、SEQID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的前述任一项的变体。在一些实施方案中，所述间隔子可以包含式X₁PPX₂P或由其组成，其中X₁是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸，并且X₂是半胱氨酸或苏氨酸。在本文的任何实施方案中，所述间隔子是多肽间隔子，所述多肽间隔子可以包含全部或部分免疫球蛋白铰链或其修饰形式或者由全部或部分免疫球蛋白铰链或其修饰形式组成，或者包含约15个或更少的氨基酸。在一些实施方案中，所述间隔子不包含CD28胞外区或CD8胞外区，并且可以包含全部或部分免疫球蛋白铰链、任选IgG4铰链或其修饰形式或者由全部或部分免疫球蛋白铰链、任选IgG4铰链或其修饰形式组成，和/或包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28胞外区或CD8胞外区。

在一些实施方案中，所述间隔子的长度是为或约12个氨基酸和/或包含全部或部分免疫球蛋白铰链、任选IgG4或其修饰形式，或者由全部或部分免疫球蛋白铰链、任选IgG4或其修饰形式组成。在一些实施方案中，所述间隔子具有以下项或可以由以下项组成：SEQID NO:1的序列、由SEQ ID NO:2编码的序列、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的前述任一项的变体。在一些实施方案中，所述间隔子可以包含式X₁PPX₂P或由其组成，其中X₁是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸，并且X₂是半胱氨酸或苏氨酸。在一些任何实施方案中，所述共刺激结构域可以包含SEQ ID NO:12或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的其变体。在一些任何所提供的实施方案中，所述初级信号传导结构域可以包含与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的SEQ ID NO:13、14或15。在一些任何实施方案中，所述scFv可以包含RASQDISKYLN(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列、SRLHSGV(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列、GNTLPYTFG(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列、DYGVS(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列、VIWGSETTYYNSALKS(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列和YAMDYWG(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述scFv包含FMC63的可变重链区和FMC63的可变轻链区。在一些实施方案中，所述scFv包含六个CDR，其包含FMC63的CDRL1序列、FMC63的CDRL2序列、FMC63的CDRL3序列、FMC63的CDRH1序列、FMC63的CDRH2序列和FMC63的CDRH3序列。在一些实施方案中，所述scFv是这样的scFv，其与前述任一项结合相同的表位或者与前述任一项竞争结合。在一些实施方案中，所述scFv按顺序包含VH、接头、任选包括SEQ ID NO:24的接头以及VL。在一些实施方案中，所述scFv按顺序包含VL、接头、任选包括SEQ ID NO:24的接头和VH。在一些实施方案中，所述scFv包含柔性接头。在一些实施方案中，所述scFv氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示。

在本文的任何实施方案中，(i)所述scFv可以包含RASQDISKYLN(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列、SRLHSGV(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列、GNTLPYTFG(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列、DYGVS(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列、VIWGSETTYYNSALKS(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列和YAMDYWG(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列，例如所述scFv可以包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列；(ii)所述间隔子可以是多肽间隔子，所述多肽间隔子(a)包含作为约15个或更少的氨基酸的全部或部分免疫球蛋白铰链或其修饰形式或者由作为约15个或更少的氨基酸的全部或部分免疫球蛋白铰链或其修饰形式组成，并且包含全部或部分免疫球蛋白铰链、任选IgG4铰链或其修饰形式或者由全部或部分免疫球蛋白铰链、任选IgG4铰链或其修饰形式组成，任选地例如其中所述间隔子可以包含SEQ ID NO:1的序列或由SEQ ID NO:2编码的序列或者由SEQ ID NO:1的序列或由SEQ ID NO:2编码的序列组成；(iii)所述共刺激结构域可以包含SEQ ID NO:12或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的其变体；并且(iv)所述初级信号传导结构域可以包含与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的SEQ ID NO:13、14或15。

在本文的任何实施方案中，所述CAR是如下CAR，其中(i)所述scFv包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列；(ii)所述间隔子是多肽间隔子，所述多肽间隔子包含SEQ ID NO:1的序列或由SEQ ID NO:2编码的序列或者由SEQ ID NO:1的序列或由SEQ ID NO:2编码的序列组成；(iii)源自共刺激分子的所述胞质信号传导结构域是共刺激结构域，所述共刺激结构域包含SEQ ID NO:12或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的其变体；并且(iv)源自含有ITAM的初级信号传导分子的所述胞质信号传导结构域是如下胞质信号传导结构域，所述胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:13、14或15或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的其变体。

在本文的任何实施方案中，所述CAR是如下CAR，其中(i)所述胞外抗原结合结构域包含scFv，其包含FMC63的可变重链区和FMC63的可变轻链区；所述间隔子是多肽间隔子，其包含SEQ ID NO:1的序列；源自共刺激分子的所述胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:12；并且源自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:13、14或15。

在本文的任何实施方案中，所述间隔子是多肽间隔子，其可以包含SEQ ID NO:1的序列；所述共刺激结构域可以包含SEQ ID NO:12；所述初级信号传导结构域可以包含SEQID NO:13、14或15；所述抗原结合结构域可以包含scFv，其含有FMC63的可变重链区和FMC63的可变轻链区。在本文的任何实施方案中，将所述细胞组合物肠胃外施用、任选静脉内施用。在本文的任何实施方案中，所述受试者是人受试者。

在任何所提供的方法的特定实施方案中，所述CAR按顺序从N末端至C末端含有：作为SEQ ID NO:43所示的scFv的胞外抗原结合结构域、SEQ ID NO:1所示的间隔子、SEQ IDNO:8所示的跨膜结构域、SEQ ID NO:12所示的4-1BB共刺激信号传导结构域以及SEQ IDNO:13所示的CD3-zeta(CD3ζ)链的信号传导结构域。

在一些任何实施方案中，包含工程化T细胞的所述组合物是通过如下制造过程产生的，所述制造过程包括：(i)将包含原代T细胞的输入组合物与包含含有多种链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的刺激试剂暴露于用于刺激T细胞的条件下，从而生成刺激的群体，其中：所述寡聚颗粒试剂包含含有抗CD3抗体或其抗原结合片段的第一药剂和含有抗CD28抗体或其抗原结合片段的第二药剂；(ii)将编码靶向CD19的CAR的异源多核苷酸引入所述刺激的群体的T细胞中；(iii)将所述转化细胞的群体孵育长达96小时；以及(iv)收获所述转化细胞的群体的T细胞，从而产生工程化细胞的组合物，其中所述收获在开始暴露于所述刺激试剂之后24小时与120小时之间的时间进行，包含端值。在一些实施方案中，所述输入组合物包含从所述受试者选择的自体T细胞，如基于免疫亲和力从来自所述受试者的血液或单采术(例如白细胞单采术)样品选择CD3 T细胞或CD4和CD8 T细胞而富集的。

在本文的任何实施方案中，包含工程化T细胞的所述组合物是通过如下制造过程产生的，所述制造过程包括将包含原代T细胞的输入组合物与包含含有多种亲和素、链霉亲和素、亲和素突变蛋白或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的刺激试剂暴露于用于刺激T细胞的条件下，从而生成刺激的群体，其中所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域；在本文的任何实施方案中，所述制造过程可以进一步包括将编码靶向CD19的CAR的异源多核苷酸引入所述刺激的群体的细胞中，从而生成转化细胞的群体。

在一些任何实施方案中，所述寡聚颗粒试剂包含含有抗CD3抗体或其抗原结合片段的第一试剂以及含有抗CD28抗体或其抗原结合片段的第二药剂。在一些任何实施方案中，所述抗CD3抗体或抗原结合片段是Fab，并且所述抗CD28抗体或抗原结合片段是Fab。在一些任何实施方案中，所述第一药剂和所述第二药剂各自包含链霉亲和素结合肽，所述链霉亲和素结合肽使所述第一药剂和所述第二药剂可逆地结合至寡聚颗粒试剂，任选地其中所述链霉亲和素结合肽包含SEQ ID NO:78-82中任一项所示的氨基酸序列。在一些任何实施方案中，所述链霉亲和素突变蛋白分子是链霉亲和素突变蛋白的四聚体，其包含氨基酸残基Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47，任选地其中所述链霉亲和素突变蛋白包含SEQ ID NO:69、84、87、88、90、85或59中任一项所示的序列。在一些任何实施方案中，所述寡聚颗粒试剂包含在1,000个与5,000个之间的链霉亲和素突变蛋白四聚体，包含端值。在一些任何实施方案中，所述方法进一步包括在收获所述细胞之前在所述孵育之后或期间添加生物素或生物素类似物。

在本文的任何实施方案中，所述制造过程可以进一步包括将所述转化细胞的群体孵育长达96小时。在本文的任何实施方案中，所述孵育是在缺乏一种或多种重组细胞因子的基础培养基中进行。在本文的任何实施方案中，所述制造过程可以进一步包括收获所述转化细胞的群体的T细胞，从而产生工程化细胞的组合物。在本文的任何实施方案中，所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后24小时与120小时之间进行。在本文的任何实施方案中，所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间进行。在本文的任何实施方案中，所述收获是在基因组中检测到整合的载体时但在达到每个二倍体基因组的稳定的整合载体拷贝数(iVCN)之前的时间进行。在本文的任何实施方案中，所述收获是在所述收获时活细胞总数大于或大于约三倍的所述刺激的群体的总活细胞数之前的时间进行。在本文的任何实施方案中，所述收获是在所述收获时活细胞总数等于或等于约三倍、等于或等于约两倍的所述刺激的群体的总活细胞数或者等于或大约等于所述刺激的群体的总活细胞数时进行。在本文的任何实施方案中，所述收获是在CD27⁺CCR7⁺的百分比是在所述转化细胞的群体中总T细胞、所述群体中总CD3⁺ T细胞、所述转化细胞的群体中总CD4⁺ T细胞或所述转化细胞的群体中总CD8⁺ T细胞或所述转化细胞的群体中其CAR表达细胞的大于或大于约50％时进行。在本文的任何实施方案中，所述收获是在CD45RA⁺CCR7⁺和CD45RA^-CCR7⁺细胞的百分比是在所述转化细胞的群体中总T细胞、所述转化细胞的群体中总CD3⁺ T细胞、所述转化细胞的群体中总CD4⁺ T细胞或所述转化细胞的群体中总CD8⁺ T细胞或所述转化细胞的群体中其CAR表达细胞的大于或大于约60％时进行。

在本文的任何实施方案中，所施用的组合物中的细胞是通过用于产生输出组合物的制造过程产生的，所述输出组合物(i)包含工程化CD4+ T细胞和工程化CD8+ T细胞并且(ii)展现出预先确定的特征，其中当在多名不同的单独受试者之间进行时，所述制造过程的迭代任选地从人生物样品产生多种所述输出组合物，其中在所述多种输出组合物之间所述输出组合物的预先确定的特征选自：在所述多种输出组合物中的具有记忆表型的细胞的平均百分比为在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；在所述多种输出组合物中的具有中央记忆表型的细胞的平均百分比为在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；在所述多种输出组合物中的为CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-、和/或CD127+的细胞的平均百分比为在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；在所述多种输出组合物中的为CCR7+/CD45RA-或CCR7+/CD45RO+的细胞的平均百分比为在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；在所述多种输出组合物的工程化CD4+ T细胞(任选地CAR+CD4+ T细胞)中的中央记忆CD4+ T细胞的平均百分比为在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；在所述多种输出组合物的工程化CD8+ T细胞(任选地CAR+CD8+ T细胞)中的中央记忆CD8+ T细胞的平均百分比为在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；和/或在所述多种输出组合物的工程化T细胞(任选地CAR+ T细胞)中的中央记忆T细胞(任选地CD4+中央记忆T细胞和CD8+中央记忆T细胞)的平均百分比为在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间。在一些实施方案中，所述多种输出组合物是从人生物样品产生的。

在本文的任何实施方案中，所施用的组合物是通过用于产生输出组合物的制造过程产生的，所述输出组合物在至少约80％、约90％、约95％、约97％、约99％、约100％或100％的人生物样品中展现出预先确定的特征、任选在所述输出组合物中的阈值数量的表达CAR的细胞，其中所述制造过程是在多名不同的单独受试者之中进行的。在本文的任何实施方案中，包含基因工程化细胞的组合物不含有来自所述制造过程的残留珠。在本文的任何实施方案中，所述B细胞NHL是复发性和/或难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤(B细胞NHL)。在本文的任何实施方案中，所述预先确定的特征是在所述输出组合物中表达所述CAR的细胞的阈值数量。

本文还提供了一种制品，所述制品包含含有表达靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化细胞的组合物，以及用于根据本文提供的任何方法施用所述细胞组合物的说明书。

附图说明

图1显示了通过流式细胞术确定的对使用不同的供体类型(参考，患者)从非扩增工程化过程产生的T细胞组合物的细胞纯度的示例性定量。将细胞工程化以表达抗CD19CAR(CD19)或进行模拟转导(模拟物)。测定了活性CD45+细胞中的CD3+细胞百分比(左图)，活性CD45+细胞中NK细胞百分比(中间图)以及活性CD45+细胞中的CD19+细胞百分比(右图)。

图2-图3显示了对于使用不同供体类型(参考、患者)的扩增和非扩增工程化过程，通过流式细胞术确定的细胞表型的示例性定量。将细胞工程化以表达抗CD19 CAR(CD19)或进行模拟转导(模拟物)。图2显示了活性CD45+细胞中CD3+CD8+和CD3+CD4+细胞的百分比(左图)，以及活性CD45+细胞中CD8+CAR+和CD4+CAR+细胞的百分比(右图)。图3显示了CD4+细胞与CD8+细胞的比率以及CD4+CAR+细胞与CD8+CAR+细胞的比率。

图4显示了通过流式细胞术确定的对使用不同的供体类型(参考、患者)从非扩增工程化过程产生的T细胞组合物的细胞活力的示例性定量。将细胞工程化以表达抗CD19CAR(CD19)或进行模拟转导(模拟物)。测定了CD3+细胞中aCas3+细胞的百分比。

图5A显示了在从来自不同人供体的原代T细胞产生的细胞组合物中，在如通过标准VCN(未进行脉冲场凝胶电泳或PFGE)与iVCN(进行PFGE)所评估的总细胞中每个细胞的拷贝数之间的示例性关系，所述原代T细胞已经使用扩增过程(○)或非扩增过程(●)工程化以表达CAR。图5B-图5C显示了如通过标准VCN(图5B)或iVCN(图5C)所评估的细胞组合物中每个细胞中的拷贝数与如通过流式细胞术评估的活CD45+细胞中表达CAR的CD3+细胞的百分比(CD3+CAR+％)所指示的CAR表面表达之间的关系。

图6A-图6B显示了使用不同供体类型(参考、患者)从扩增和非扩增工程化过程得到的细胞表型的示例性百分比。将细胞工程化以表达抗CD19 CAR(CD19)或进行模拟转导(模拟物)。图6A显示了aCas-CD8+CAR+和aCas-CD4+CAR+细胞中CD45RA+CCR7+细胞的百分比(左上图)、aCas-CD8+CAR+和aCas-CD4+CAR+细胞中CD45RA-CCR7+细胞的百分比(右上图)、aCas-CD8+CAR+和aCas-CD4+CAR+细胞中CD45RA-CCR7-细胞的百分比(左下图)以及aCas-CD8+CAR+和aCas-CD4+CAR+细胞中CD45RA+CCR7-细胞的百分比(右下图)。图6B显示了aCas-CD8+CAR+和aCas-CD4+CAR+细胞中CD27+CCR7+细胞的示例性百分比。

图7A-图7D显示了在长期CAR依赖性刺激(初级)之前和在长期CAR依赖性刺激之后(在用激动性抗独特型抗体长期刺激9天至14天之后)(次级)，对于其中细胞被工程化为表达抗CD19 CAR的供体匹配的扩增和非扩增工程化过程，如通过流式细胞术所测定的对细胞表型的示例性定量。DP1＝弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)患者1；DP2＝DLBCL患者2；HD1＝健康供体1；MP1＝套细胞淋巴瘤患者1。

图8A-图8F显示了在用抗ID抗体进行长期抗CD19 CAR依赖性刺激后，从非扩增和扩增过程生成的细胞的示例性体外增殖能力。测量了活力(图8A)和细胞大小(图8B)。扩增的倍数变化计算为每日计数除以起始细胞数量(图8C)，然后转换成曲线下面积(AUC)以对于单独组进行比较(图8D)或依据制造过程进行比较(图8E，使用曼-惠特尼检验的统计显著性；*p<0.05)。也可以通过获取从非扩增过程生成的组合物的每日倍数扩增，并将其除以从扩增过程生成的组合物的供体匹配的对照值来直接测量制造平台之间的单独供体倍数扩增(图8F)。

图9A-图9B显示了在以不同效应子与靶标的比率进行长期刺激之前(图9A)和之后(图9B)，通过非扩增或扩增过程工程化的抗CD19 CAR T细胞的示例性细胞裂解潜力。针对单独组比较曲线下面积(AUC)值(图9A和图9B的左图)或依据制造过程来比较曲线下面积值(图9A和图9B的右图，使用曼-惠特尼检验的统计显著性；*p<0.05)。

图10显示了在长期抗原刺激的第0天和第10天由通过非扩增或扩增过程工程化的细胞导致的示例性细胞因子产生，如通过多功能得分使用流式细胞术测量。通过曼-惠特尼评估统计显著性，*p<0.05。

图11A-图11B显示了在用从非扩增和扩增的匹配的供体工程化过程生成的抗CD19CAR-T细胞组合物治疗后随时间而变的在Nalm6白血病模型中的示例性肿瘤负担和循环CAR-T细胞。图11A显示了对于每组从生物发光(BLI)的曲线下面积(AUC)计算的从第-1天(治疗之前)至治疗后大约第25天的肿瘤生长。图11B显示了对于每组在治疗后大约第5天与大约第20天之间每1μl血液中的循环抗CD19 CAR-T细胞计数。

图12A-图12B显示了在用从非扩增和扩增的匹配的供体工程化过程生成的抗CD19CAR-T细胞组合物治疗后随时间而变的在Raji淋巴瘤模型中的示例性肿瘤负担和循环CAR-T细胞。图12A显示了对于每组从BLI的曲线下面积(AUC)计算的从第-1天(治疗之前)至治疗后大约第80天的肿瘤生长，其中较高(左图)和较低(右图)剂量的抗CD19 CAR-T细胞组合物是从非扩增和扩增的匹配供体工程化过程生成的。显示了所有组的BLI辐射(光子/秒；y轴)的变化(肿瘤负担)。图12B显示了对于每组在治疗后指定的时间点处每1μl血液中循环抗CD19 CAR-T细胞计数(非扩增，NE；扩增，E)。每个时间点的绝对计数显示为组平均值。使用曼-惠特尼U检验比较差异；*p<0.05。

具体实施方式

本文提供了工程化细胞(例如，T细胞)和/或其组合物用于治疗患有疾病或病症的受试者的方法和用途，所述疾病或病症通常是或包括癌症或肿瘤，如淋巴瘤，最特定地作为包括NHL的侵袭性亚型在内的非霍奇金淋巴瘤(NHL)的B细胞恶性肿瘤。在特定方面，所述受试者患有侵袭性或高风险NHL。在所提供的方法的实施方案中，将含有工程化细胞的治疗性T细胞组合物例如经由过继细胞疗法(如过继T细胞疗法)施用至患有NHL的受试者。在任何所提供的方法的特定实施方案中，将T细胞用针对分化簇19(CD19)的嵌合抗原受体(CAR)工程化。在一些方面，疾病或病症是B细胞淋巴瘤。在一些方面，疾病或病症是大B细胞淋巴瘤。在一些方面，疾病或病症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)或其亚型。在一些方面，如与某些替代性方法相比，例如，在所治疗受试者的特定组中，所述方法和用途提供或实现改善的反应和/或更持久的反应或功效和/或降低的毒性或其他副作用的风险。在一些实施方案中，所述方法由于以下而是有利的：施用指定数量或相对数量的工程化细胞、施用限定比率的特定类型的细胞、施用特定高百分比的分化程度较低的细胞(例如，幼稚样或中央记忆细胞或早期分化状态的细胞，如CCR7+CD27+细胞)、治疗特定患者群体(如具有特定风险状况、分期和/或先前治疗史的那些)和/或其组合。

在一些实施方案中，所述方法和用途包括在过继细胞疗法中向所述受试者施用表达基因工程化(重组)细胞表面受体的细胞，所述基因工程化(重组)细胞表面受体通常是嵌合受体(如嵌合抗原受体(CAR))，其识别由白血病或淋巴瘤和/或其衍生细胞类型表达、与白血病或淋巴瘤和/或其衍生细胞类型相关和/或对NHL和/或其衍生细胞类型具有特异性的CD19。所述细胞通常在配制用于施用的组合物中施用；所述方法通常涉及将一个或多个剂量的所述细胞施用于所述受试者，所述一个或多个剂量可以包括特定数量或相对数量的细胞或所述工程化细胞。在一些情况下，所述组合物中的CD19定向CAR+工程化细胞包括所述组合物内两种或更多种亚型(如CD4与CD8 T细胞)的限定比率或组成。在特定实施方案中，用于在所提供的方法中使用或施用的细胞组合物包含被工程化为表达CD19定向CAR的原代T细胞，其(i)含有低百分比(例如少于40％、少于30％、少于20％或少于10％)的耗竭细胞和/或展示与耗竭相关的标记物或表型的细胞；和/或(ii)含有相对较高百分比(例如大于50％、大于60％、大于70％、大于80％或大于90％)的记忆样T细胞，如幼稚样T细胞、中央记忆T细胞或长寿记忆T细胞。在所提供的实施方案中，与涉及施用含有较高百分比的耗竭细胞和/或较高数量的展示与耗竭相关的表型的细胞和/或含有较低百分比的某些T细胞(如幼稚样T细胞、中央记忆T细胞或长寿记忆T细胞)的其他CD19定向CAR T细胞疗法相比，所述组合物和所提供的方法的特征导致改善或增强的存活、扩增、持久性和/或抗肿瘤活性。在所提供的实施方案中，与涉及施用含有较高百分比的耗竭细胞和/或较高数量的展示与耗竭相关的表型的细胞和/或含有较低百分比的某些T细胞(如幼稚样T细胞、中央记忆T细胞或长寿记忆T细胞)的其他CD19定向CAR T细胞疗法相比，所述组合物和所提供的方法的特征导致改善的治疗功效，例如实现完全反应(CR)的患者的增加的百分比。在所提供的方法中，与涉及施用含有较高百分比的耗竭细胞和/或较高数量的展示与耗竭相关的表型的细胞和/或含有较低百分比的记忆样T细胞(如幼稚样T细胞、中央记忆T细胞或长寿记忆T细胞)的其他CD19定向CAR T细胞疗法相比，所述组合物和所提供的方法的特征导致改善的治疗反应如CR(例如在自开始疗法的一段时间之后持续存在的反应)的临床持久性。在特定实施方案中，可以以如下细胞剂量实现在所提供的方法中使用或施用所提供的CD19定向CAR T细胞组合物，所述细胞剂量比参考CD19定向CAR T细胞组合物(例如用相同或相似的CAR工程化，如具有相同的抗原结合结构域)的剂量低超过2倍，如低5倍或10倍，只是其中所述参考CD19定向CAR T细胞组合物含有较高百分比的耗竭细胞和/或较高数量的展示与耗竭相关的表型的细胞和/或含有较低百分比的记忆样T细胞，如幼稚样T细胞、中央记忆T细胞或长寿记忆T细胞。在一些实施方案中，参考CD19定向CAR T细胞组合物是通过如下过程离体产生的组合物，所述过程涉及在用于扩增的条件下培育细胞的步骤，如在用于产生细胞的过程期间导致细胞的增殖或细胞的群体倍增(例如相比于过程开始，群体中细胞2、3、4、5、6、7、8、9、10个倍增或更多倍增)。

在一些实施方案中，用于在所提供的方法和用途中使用的CD19定向CAR T细胞组合物是通过相对较短的过程产生的，所述过程不包括在被设计用于扩增或增殖所述细胞的扩增条件下培育所述细胞的步骤。不同的过程可用于生成含有基因工程化T细胞群体的组合物，包括用于生成表达CAR的工程化T细胞，其通常包括被设计用于或用于培育所述细胞以扩增或增加细胞增殖的目的的步骤。然而，在特定方面，这些过程中的一些可能需要长时间或相对长时间来产生所述工程化细胞。另外，在各个方面，一些现有过程成功产生适合于细胞疗法的工程化T细胞所需的时间量可能变化，从而使得难以协调细胞疗法的该施用。在某些方面，这些过程中的一些所产生的细胞群可能包括相对高百分比或量的消耗的细胞、分化细胞或具有低效力的细胞。用于在所提供的方法中使用的所提供的CD19定向CAR T细胞组合物解决这些问题中的一个或多个。

在特定实施方案中，所提供的方法与有效地产生或生成适用于细胞疗法的工程化细胞的过程结合使用。在一些实施方案中，所提供的含有CD19定向CAR工程化T细胞的组合物是通过如下过程产生的，所述过程无需用于扩增细胞的任何另外的步骤，例如无需扩增单元操作和/或无需旨在引起细胞扩增的步骤。在用于产生CD19定向CAR T细胞组合物的过程的方面，所述过程包括用于刺激和基因工程化(例如，转化、转导或转染)T细胞以产生工程化T细胞的群体的一个或多个步骤，所述工程化T细胞的群体可以被收集或配制用作用于细胞疗法的组合物。在特定实施方案中，所述过程包括用含有编码CD19定向CAR的核酸的病毒载体(例如慢病毒载体)转导细胞的步骤。在一些方面，所提供的过程导致异源核酸(从病毒载体表达的)稳定地整合到细胞的基因组中。在一些方面，所提供的过程产生的工程化CD19定向CAR T细胞具有如与从替代性过程，如涉及扩增细胞的那些过程产生的工程化T细胞组合物相比增强的效力。

在特定方面，用于产生所提供的组合物的过程的持续时间可以从输入细胞群体或输入组合物的细胞(例如，T细胞)首次接触或暴露于刺激条件(例如，如本文例如在章节II-C中所述)时起测量，此时在本文中称为刺激(stimulation)或刺激(stimulating)的开始，并且本文中也称为暴露于刺激试剂，例如，如在开始暴露于刺激试剂时。在一些实施方案中，收获或收集含有工程化细胞的输出群体(本文中也称为输出组合物或称为工程化细胞例如工程化T细胞的组合物)所需时间的持续时间是从刺激开始时起测量。在特定实施方案中，所述过程的持续时间为、为约或小于120小时、108小时、96小时、84小时、72小时、60小时、48小时、36小时或30小时。在特定实施方案中，所述过程的持续时间为、为约或小于5天、4天、3天、2天或一天。在特定实施方案中，所述工程化细胞，例如，输出组合物或群体的细胞比通过需要更长时间的过程工程化的细胞更强效、持久或幼稚样。在一些方面，所提供的过程的持续时间，例如，生成或产生T细胞的工程化群体所需的时间量比一些现有过程的持续时间短、短约或短至少2天、3天、4天、5天、6天、7天或超过7天。在一些实施方案中，所提供过程的持续时间是替代性或现有过程的为、为约或小于75％、60％、50％、40％、30％、25％、15％或10％。

在某些实施方案中，对从生物样品分离、富集或选择的细胞(例如，CD3+、CD4+和/或CD8+ T细胞)的群体进行所提供的过程。在一些方面，所提供的方法可以从自受试者收集生物样品时起，在如与其他方法或过程相比缩短的时间量内，产生或生成工程化T细胞的组合物。在一些实施方案中，所提供的方法可以从自受试者收集生物样品时至收集、收获或配制工程化T细胞(例如，用于低温保存或施用)时，在或在约10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天或2天内，或者在或在约120小时、96小时、72小时或48小时内，产生或生成工程化T细胞，包括对生物样品或者富集、分离或选择的细胞进行低温保存和储存的任何或所有时间。

在特定实施方案中，用于产生或工程化T细胞群体的过程包括刺激细胞的步骤，如在用病毒载体转导之前。在所提供的过程的方面，用寡聚刺激试剂(如链霉亲和素突变蛋白寡聚体)进行刺激，在所述寡聚刺激试剂上固定或附接有一种或多种刺激结合剂(例如抗CD3/抗CD28)。用于在体外(如在外源生长因子不存在或外源生长因子量低的情况下)刺激T细胞的现有试剂是已知的(参见例如美国专利6,352,694 B1和欧洲专利EP 0 700 430B1)。通常，此类试剂可以采用直径大于1μm的珠，例如，磁珠，将各种结合剂(例如抗CD3抗体和/或抗CD28抗体)固定在所述珠上。然而，在一些情况下，此类磁珠例如难以整合至用于在临床试验或治疗目的所需的条件下刺激细胞的方法中，因为必须确保在将所扩增的T细胞施用至受试者之前完全去除这些磁珠。在一些方面，例如通过将细胞暴露于磁场进行的这种去除可能降低可用于细胞疗法的活细胞的产率。在某些情况下，必须将此类试剂(例如，含有磁珠的刺激试剂)与细胞一起孵育最短时间量，以允许T细胞从刺激试剂充分脱离。

利用寡聚刺激试剂(例如链霉亲和素突变蛋白聚合物)的所提供的过程克服了此类潜在限制。例如，在一些实施方案中，所提供的过程避免或降低在通过所述过程生成或产生的输出细胞中残留刺激试剂(例如，含有磁珠的试剂)的风险。在一些实施方案中，这也意味着，符合GMP标准的过程与其他方法(如其中必须进行另外的措施以确保最终工程化T细胞群体不含珠的那些方法)相比更易于建立。在一些实施方案中，这在当前实施方案中可以通过以下方式容易地实现：添加物质，例如，竞争试剂，所述物质例如通过简单冲洗或洗涤细胞(例如通过离心)将寡聚刺激试剂从细胞解离。因此，在一些方面，如与基于珠的刺激试剂的去除或分离相比，如通过添加物质或竞争试剂将寡聚刺激试剂从细胞去除或分离几乎不导致或不导致细胞损失。在一些方面，寡聚刺激试剂去除或分离的时间安排不受限制或者所受限制小于基于珠的刺激试剂的去除或分离。因此，在一些方面，可以在所提供的过程期间的任何时间或阶段从细胞去除或分离寡聚刺激试剂。

在一些方面，与替代性刺激试剂(如抗CD3/抗CD28顺磁珠)相比，使用寡聚刺激试剂(例如抗CD3/抗CD28链霉亲和素突变蛋白寡聚体)可以导致总体降低的刺激信号。可能涉及较弱或降低的刺激的所提供的过程可以生成这样的工程化CAR+ T细胞，其与通过如下过程生成的CAR+ T细胞一样强效、持久或有效或甚至更强效、更持久或更有效，所述过程涉及更强的刺激条件或更高量或更高浓度的刺激试剂，如可以在用抗CD3/抗CD28顺磁珠刺激后发生。此外，在一些实施方案中，如与使用更大量的寡聚刺激试剂的过程相比，用较低量或相对低量的寡聚刺激试剂刺激细胞可以增加所得工程化细胞群体的效力、功效或持久性。此类实施方案考虑，即使在足够低至足以在所述过程期间和之后降低激活标记物的表达或对激活标记物呈阳性的细胞的份额的剂量下，此类作用也可以持续存在。

在某些实施方案中，通过所提供的过程产生或生成的工程化T细胞，例如，含有表达重组受体如嵌合抗原受体的T细胞的T细胞的输出组合物或群体，在用作用于细胞疗法的细胞时特别有效或强效。例如，在一些方面，从所提供的过程产生的含有工程化T细胞(例如，CAR+ T细胞)的输出组合物具有比通过替代性现有过程生成或产生的工程化T细胞显著更高程度的效力和/或增殖能力。在一些方面，通过所提供的过程产生的含有工程化T细胞(例如，CAR+ T细胞)的输出组合物具有比通过替代性或现有过程产生的工程化T细胞(例如，CAR+ T细胞)增强的抗肿瘤或抗癌细胞活性。

在特定实施方案中，用于产生所提供的CD19定向T细胞组合物的过程具有进一步的优势，所述过程不包括将细胞扩增至阈值量或浓度的步骤。在一些方面，不依赖于扩增细胞以增加来自起始细胞群体(例如，输入群体)的细胞的数量或浓度的方案不需要在细胞群体之间可能变化的孵育或培育。例如，一些实施方案考虑从不同受试者(如具有不同疾病或疾病类型的受试者，特别是对于患有NHL(包括高风险、侵袭性和/或R/R NHL)的患者尤其如此)获得的细胞群体可能以不同速率分裂或扩增。在某些方面，消除需要细胞扩增的可能多变的步骤允许严格控制整个过程的持续时间。在某些实施方案中，过程持续时间的可变性被降低或消除，这在一些方面可能允许改进对医生、患者与技术人员之间的安排和治疗的协调，以有利于自体细胞疗法。

在一些实施方案中，所提供的方法涉及治疗受试者的特定组或子集，例如，被鉴定为患有高风险疾病(例如，高风险NHL或高风险大B细胞淋巴瘤)的受试者。在一些方面，所述方法治疗患有某种形式的侵袭性和/或不良预后B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)(如对于标准疗法已经复发或是难治性(R/R)和/或具有不良预后的NHL)的受试者。在一些方面，所述方法治疗患有对于标准疗法是复发性或是难治性(R/R)的大B细胞淋巴瘤的受试者。在特定方面，所述工程化细胞对于受试者是自体的，并且在通过与现有方法相比缩短的离体过程生成后进行施用，所述离体过程不包括或不涉及在产生工程化细胞的方法期间用于扩增细胞的培育步骤，和/或能够产生分化程度较低的且允许施用较低剂量的CAR工程化T细胞组合物。作为结果，与现有方法相比，所提供的方法是有利的，因为它们可以缩短直到患者可使用工程化T细胞疗法的时间，特别是在需要治疗的患者中，如在用于治疗所述疾病或病症的一种或多种其他先前疗法后复发或对于治疗而言是难治性的受试者。在一些方面，所提供的方法、组合物、用途和制品实现改进的且更好的对可用疗法的反应。在一些实施方案中，改进的或优越的反应是针对当前护理标准(SOC)。

非霍奇金淋巴瘤(NHL)是一组具有不同生物和临床行为的淋巴恶性肿瘤。据估计，2019年美国(US)将有大约74,200例新诊断出NHL的病例和19,970例死于NHL的病例(Siegel等人,CA Cancer J Clin.2019；69(1):7-34)。非霍奇金淋巴瘤可以分为2种预后组：惰性淋巴瘤(随着淋巴结病的消长而缓慢生长多年)和侵袭性淋巴瘤(如果没有治疗，则在几周之内迅速生长并导致死亡)。最常见的侵袭性淋巴瘤是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)，占所有NHL的30％至40％(Li等人,Pathology 2018；50(1):74-87)。其他侵袭性淋巴瘤包括但不限于称为双打击(DHL)或三打击淋巴瘤(THL)的高级别B细胞淋巴瘤(HGBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)和滤泡性淋巴瘤3b(FL3B)。其他侵袭性淋巴瘤亚型的预后和疗法类似于DLBCL。大约50％的新诊断为DLBCL的患者可以用一线R-CHOP免疫化学疗法(利妥昔单抗、环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松)治愈。然而，大约一半用R-CHOP治疗的患者将复发，大部分是在疗法后的前2年内复发(Coiffier等人,Blood 2010；116(12):2040-5；Vitolo等人,J Clin Oncol.2017；35(31):3529-37)。拯救高剂量免疫化学疗法接着进行自体干细胞移植(ASCT)是复发性或难治性(R/R)DLBCL的标准二线疗法。由于对拯救疗法没有反应或有医疗状况，因此大约一半的R/R患者将不符合移植的条件，并且很大一部分患者甚至在ASCT之后复发。在难治性DLBCL中的多群组回顾性NHL研究(SCHOLAR-1；n＝636)表明该患者群体中的结局非常差，其中对下一个疗法线的总反应率(ORR)为26％(ORR)，并且中值总存活期(OS)为6.3个月(Crump等人,Blood 2017；130(16):1800-8；Gisselbrecht等人,Br J Haematol.2018；182(5):633-43)。

CD19是免疫球蛋白超家族的成员以及B细胞表面信号转导复合物的组分，其积极调节通过B细胞受体的信号转导。从早期发育到分化为浆细胞的大多数B细胞恶性肿瘤表达CD19(Stamenkovic等人,J Exp Med.1988；168(3):1205-10)。CD19是有吸引力的治疗靶标，因为它由包括B细胞NHL在内的大多数B细胞恶性肿瘤表达(Davila等人,Oncoimmunology.2012；(9):1577-83)。重要的是，除了B细胞谱系的那些外，CD19抗原不在造血干细胞或任何正常组织上表达。此外，CD19在循环中不脱落，这限制了脱靶不良反应(Shank等人,Pharmacotherapy.2017；37(3):334-45)。

在特定实施方案中，本文提供的方法是基于施用针对CD19的CAR T细胞疗法，其中CAR含有针对CD19的scFv抗原结合结构域(例如来自FMC63)。CAR还含有包含来自CD3ζ的信号传导结构域的细胞内信号传导结构域，并且还掺入4-1BB共刺激结构域，所述4-1BB共刺激结构域与相比于含有CD28的构建体，较低的细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性(NE)发生率相关(Lu等人J Clin Oncol.2018；36:3041)。

CAR T细胞开发的挑战是生成在输注后始终扩增、持续存在以及介导持久的抗肿瘤反应的产物。某些CD19定向CAR-T细胞疗法可用于治疗B细胞淋巴瘤，其包括Kymriah^TM(tisagenlecleucel)(Kymriah PI)和

(axicabtagene ciloleucel)(YescartaPI)。两种CAR T细胞疗法在该难以治疗的患者群体中具有初始50％至60％的完全反应率(CRR)；然而，在6个月时反应率降至40％至50％范围，且反应者更有可能具有持续的持久反应(Locke等人,Mol Ther.2017；25(1):285-95；Schuster等人,N Engl J Med.2017；377(26):2545-54)。因此，接受这些疗法的患者中多于一半不具有持续的持久反应，并且总存活期(OS)的预后非常差。

所提供的方法是基于以下发现，即过继转移的T细胞的较低分化率可以影响这些细胞持续存在和促进持久抗肿瘤免疫的能力。在一些实施方案中，所提供的CD19定向CAR+工程化T细胞组合物是通过如下方法产生的，在所述方法中细胞未在扩增条件下培育，从而限制或降低最终工程化输出组合物的群体倍增数量并导致分化程度较低的产物。然而，所提供的组合物也经由如下过程产生，所述过程导致稳定整合载体拷贝数(iVCN)以确保CAR的一致且可靠的表达，从而导致一致的细胞产物以用于施用至受试者以及在所施用的剂量中CAR表达细胞之间的低可变性。相比之下，大多数T细胞工程化方案通常将T细胞离体扩增9至14天或更长时间。本文举例说明的所提供的数据支持如下模型，在所述模型中具有增加的分化程度较低的记忆T细胞的组合物的CAR T细胞产物可以展现出增强的持久抗肿瘤活性。这些发现表明，旨在最大程度地减少CAR T细胞产物中的效应子分化的策略可以导致改善的临床功效。本文提供了可以满足此类目的的实施方案。

本文中的观察支持根据所提供的方法用针对CD19的CAR T细胞疗法治疗患有高风险疾病的受试者。例如，患有NHL的受试者(包括患有侵袭性NHL或具有某些高风险特征的患者，例如患有复发性/难治性(R/R)NHL的患者)可以根据所提供的方法进行治疗。在一些实施方案中，所提供的方法可以用于治疗已经被深度预治疗(例如用一种、两种、三种、四种或更多种先前疗法用于治疗疾病)的受试者。

本申请中提及的所有出版物(包括专利文献、科学文章和数据库)出于所有目的通过引用以其整体并入，在程度上如同每个单独的出版物通过引用单独并入。如果本文所述的定义与通过引用并入本文的专利、申请、公开的申请和其他出版物中所述的定义相反或在其他方面不一致，则本文所述的定义优先于通过引用并入本文的定义。

本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应解释为限制所描述的主题。

I.CD19靶向细胞疗法在B细胞非霍奇金淋巴瘤中的方法和用途

本文提供治疗方法，其涉及施用工程化细胞(如工程化T细胞)或含有工程化细胞的组合物。还提供了所提供的CD19定向CAR工程化细胞(例如，T细胞)和/或其组合物的方法和用途，包括用于治疗患有包括侵袭性或高风险NHL(如R/R NHL)在内的B细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)的受试者的方法，所述方法涉及施用所述工程化细胞和/或其组合物。在一些实施方案中，所提供的CD19定向CAR工程化细胞(例如，T细胞)和/或其组合物的方法和用途，包括用于治疗患有R/R NHL的受试者的方法，所述受试者已经在至少两种或更多种先前疗法下失败。在特定实施方案中，所述方法包括向受试者施用一定剂量的包含CD4+和CD8+ T细胞的T细胞，其中所述T细胞包含与CD19特异性结合的嵌合抗原受体(CAR)。

在一些实施方案中，所述方法和用途包括在过继细胞疗法中向所述受试者施用表达基因工程化(重组)细胞表面受体的细胞，所述基因工程化(重组)细胞表面受体通常是嵌合受体(如嵌合抗原受体(CAR))，其识别由白血病或淋巴瘤和/或其衍生细胞类型表达、与白血病或淋巴瘤和/或其衍生细胞类型相关和/或对淋巴瘤和/或其衍生细胞类型具有特异性的CD19。所述细胞通常以配制用于施用的组合物施用。在一些实施方案中，在治疗前从受试者收集细胞以用于用CD19定向重组受体(例如CAR)使所述细胞工程化。在一些实施方案中，所述细胞是通过白细胞单采术收集的。在一些方面，所述细胞是通过不涉及培育细胞以供扩增的离体方法(以下也成为非扩增过程)进行工程化。章节II-C中描述了用于使所提供的表达CAR的治疗性组合物工程化的示例性非扩增过程。

在一些实施方案中，所述疾病或病症是侵袭性NHL。在一些实施方案中，所述疾病或病症是先前惰性的侵袭性NHL。在一些实施方案中，NHL是非惰性的，这是一种快速移动的侵袭性淋巴瘤。最常见的侵袭性NHL亚型包括弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。

在一些实施方案中，使用正电子发射断层扫描(PET)证实所述疾病或病症。在一些实施方案中，使用PET证实所述疾病或病症，并基于卢加诺分类进行分期(例如参见Cheson等人,(2014)JCO 32(27):3059-3067；Cheson,B.D.(2015)Chin Clin Oncol4(1):5)。在一些实施方案中，所述疾病或病症是经组织学证实的。在本文公开的任何实施方案中，可以在关于获得T细胞以用于自体T细胞疗法的白细胞单采术之前确定所述疾病或病症或亚型或状态。

在一些实施方案中，所述疾病或病症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，所述疾病或病症是DLBCL非特指型(NOS)。在一些实施方案中，所述疾病或病症是DLBCL组织学为携带MYC和BCL2和/或BCL6重排的高级别B细胞淋巴瘤(HGBCL)。在一些实施方案中，所述疾病或病症是从滤泡性淋巴瘤(tFL)转化的DLBCL。在一些实施方案中，所述疾病或病症是从边缘区淋巴瘤(tMZL)转化的DLBCL。在一些实施方案中，所述疾病或病症是原发性纵隔B细胞淋巴瘤(PMBCL)。在一些实施方案中，所述疾病或病症是滤泡性淋巴瘤(FL)。在一些实施方案中，所述疾病或病症是3B级滤泡性淋巴瘤(FL3B)。

在一些实施方案中，受试者在白细胞单采术之前具有0或1的东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态(参见例如，Oken等人,(1982)Am J Clin Oncol.5:649-655)。在一些实施方案中，东部肿瘤协作组(ECOG)体能状态指示物可以用于评估或选择用于治疗的受试者，例如，因先前疗法而具有较差体能的受试者(参见例如，Oken等人(1982)Am J ClinOncol.5:649-655)。ECOG体能状态量表描述患者在其自理能力、日常活动和体能(例如，步行、工作等)方面的机能水平。在一些实施方案中，ECOG体能状态为0指示，受试者可以进行正常活动。在一些方面，ECOG体能状态为1的受试者展现体力活动中的一些限制，但是所述受试者能完全走动。在一些方面，ECOG体能状态为2的患者能大于50％走动。在一些情况下，ECOG体能状态为2的受试者也可能能够自理；参见例如

等人,(1993)Br J Cancer67(4)773-775。反映ECOG体能状态的标准描述于下表1中：

在一些实施方案中，在施用所提供的CD19定向CAR T细胞组合物之前如在施用时，受试者在用针对NHL的一种或多种先前疗法线治疗之后缓解后复发或变得难治。在一些实施方案中，在关于使CD19定向CAR T细胞组合物工程化的白细胞单采术之前的时间，受试者在用治疗NHL的一种或多种先前疗法线治疗之后缓解后复发或变得难治。因此，在特定实施方案中，在治疗的时间之前，如在白细胞单采术之前，受试者患有R/R NHL。在一些实施方案中，在施用表达所述重组受体的细胞之前，所述受试者先前已用靶向所述疾病或病症(例如，NHL)的疗法或治疗剂来治疗。在一些实施方案中，所述受试者先前已用造血干细胞移植(HSCT)(例如，同种异体HSCT或自体HSCT)来治疗。在一些实施方案中，所述受试者在用标准疗法治疗后具有较差预后和/或一个或多个先前治疗线已失败。在一些实施方案中，受试者已经进行治疗或者先前已经接受用于治疗疾病或障碍的至少或至少约或约1、2、3、4或更多种用于治疗NHL(如侵袭性或高风险NHL，如DLBCL或其亚型)的其他疗法。在一些实施方案中，所述受试者已经进行治疗或者先前已经接受包括CD20靶向剂(例如抗CD20抗体)和烷基化剂在内的疗法。在一些方面，受试者在对先前疗法的完全反应(CR)或部分反应(PR)的初始反应之后复发。在一些实施方案中，受试者是用所述至少一种或多种先前疗法的治疗难治性的，并且难治性治疗是先前疗法之后疾病稳定(SD)或疾病进展(PD)的最佳反应。

在一些实施方案中，受试者在用针对所述疾病或病症的至少两种先前全身性疗法线治疗之后缓解后复发或变得难治。在一些实施方案中，至少一种所述先前全身性疗法线包括蒽环类药物和抗CD20单克隆抗体治疗。示例性抗CD20抗体包括但不限于利妥昔单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗(也称为GA101或RO5072759)、维妥珠单抗、奥比妥珠单抗、TRU-015(Trubion Pharmaceuticals)、奥卡妥珠单抗(也称为AME-133v或奥卡妥珠单抗)和Pro131921(Genentech)。参见例如Lim等人Haematologica.(2010)95(1):135-43。利妥昔单抗是嵌合小鼠/人单克隆抗体IgG1κ，其与CD20结合并引起CD20表达细胞的细胞裂解。在一些实施方案中，至少一种所述先前全身性疗法线包括蒽环类药物和利妥昔单抗治疗。

在一些实施方案中，受试者在用自体干细胞移植(ASCT)治疗之后缓解后复发或变得难治。在一些实施方案中，在用ASCT治疗之后缓解后复发或变得难治无法实现ASCT之后的客观反应。在一些实施方案中，在用ASCT治疗之后缓解后复发或变得难治无法实现ASCT之后的部分反应(PR)或更好反应。在一些实施方案中，在用ASCT治疗之后缓解后复发或变得难治无法包括在ASCT之后的疾病进展。

在一些实施方案中，受试者在用针对所述疾病或病症的至少两种先前全身性疗法线和ASCT治疗之后缓解后复发或变得难治。在一些实施方案中，至少一种所述先前全身性疗法线包括蒽环类药物和抗CD20单克隆抗体治疗。在一些实施方案中，至少一种所述先前全身性疗法线包括蒽环类药物和利妥昔单抗治疗。

在一些实施方案中，在白细胞单采术之前，受试者未显示出仅由所述疾病或病症导致的中枢神经系统(CNS)受累。在一些实施方案中，受试者具有经病理证实的由所述疾病或病症导致的继发性CNS受累。

在一些实施方案中，受试者在根据所提供的方法施用CD19定向工程化CAR T细胞之前先前未接受过CAR T细胞疗法。在一些实施方案中，受试者未接受过基因修饰的T细胞疗法。在一些实施方案中，受试者未接受过CD19靶向疗法。示例性CD19靶向疗法包括但不限于抗CD19单克隆抗体或抗CD19双特异性抗体。在一些实施方案中，受试者对氟达拉滨和/或环磷酰胺没有超敏性。在一些实施方案中，受试者不患有需要免疫抑制疗法的活动性自身免疫性疾病。

在一些实施方案中，受试者在白细胞单采术之前少于14天未接受过治疗剂量的皮质类固醇。在一些实施方案中，治疗剂量的皮质类固醇被定义为大于20mg/天的泼尼松或等效物。在一些实施方案中，受试者在白细胞单采术之前少于7天未接受过不被视为具有淋巴毒性的细胞毒性化学治疗剂。在一些实施方案中，受试者在白细胞单采术之前少于7天未接受过鞘内疗法(IT)。示例性细胞毒性化学治疗剂包括但不限于多柔比星、长春新碱、吉西他滨、奥沙利铂、卡铂和依托泊苷。在一些实施方案中，受试者在白细胞单采术之前少于5个半衰期未接受过口服化学治疗剂。示例性口服化学治疗剂包括但不限于来那度胺和依鲁替尼。在一些实施方案中，受试者在白细胞单采术之前少于4周未接受过淋巴毒性化学治疗剂。示例性淋巴毒性化学治疗剂包括但不限于环磷酰胺、异环磷酰胺和苯达莫司汀。在一些实施方案中，受试者在白细胞单采术处理之前少于8周(对于生物制剂)或5个半衰期(对于小分子)未接受过任何实验疗法。在一些实施方案中，受试者在白细胞单采术之前少于4周未接受过免疫抑制疗法。示例性免疫抑制疗法包括但不限于钙调磷酸酶抑制剂、甲氨蝶呤或其他化学治疗剂、霉酚酸酯、雷帕霉素、免疫抑制抗体，如抗TNF、抗IL6或抗IL6R。在一些实施方案中，受试者在白细胞单采术之前少于6周未接受过供体淋巴细胞输注。在一些实施方案中，受试者在白细胞单采术的少于6周未接受过针对多种病灶的放射疗法。在一些实施方案中，如果存在另外的未辐照PET阳性病灶，则受试者在白细胞单采术之前少于14天未接受过针对单一病灶的放射疗法。在一些实施方案中，受试者在白细胞单采术之前少于3个月未接受过自体干细胞移植(SCT)。在一些实施方案中，受试者在白细胞单采术之前少于6个月未接受过同种异体SCT。

在一些实施方案中，在白细胞单采术之前确定受试者对于涉及施用工程化细胞的治疗的资格。在一些实施方案中，受试者在白细胞单采术之前具有足够的血管通路以供白细胞单采术。在一些实施方案中，受试者在白细胞单采术之前具有足够的器官功能。

在一些实施方案中，除其他因素外，足够的器官功能通过以下项来指示：在确定资格的7天内在没有生长因子支持的情况下绝对中性粒细胞计数(ANC)大于1.0×10⁹个细胞/L；在确定资格的7天内在没有输液支持的情况下血小板计数大于50×10⁹个细胞/L；计算的肌酐清除率(CrCl，Cockcroft-Gault式)大于45mL/min；天冬氨酸氨基转移酶(AST)水平少于或等于2.5倍正常上限值(ULN)；丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平少于或等于2.5倍ULN；总胆红素水平少于1.5倍ULN；在吉尔伯特综合征或肝的淋巴瘤浸润的情况下，直接胆红素水平少于1.5倍ULN；足够的肺功能，例如在室内空气下少于或等于CTCAE 1级呼吸困难和饱和氧(SaO2大于92％)；足够的心脏功能，例如左心室射血分数(LVEF)大于或等于40％，如通过在确定资格的30天内进行的超声心动图(ECHO)或多次吸收门控采集(MUGA)扫描所评估；用于接受淋巴细胞清除(LD)化学疗法的足够的器官功能；或前述任一项的组合。

在特定实施方案中，在施用CD19定向工程化CAR T细胞的剂量之前，受试者被施用或已接受淋巴细胞清除化学疗法。淋巴细胞清除可以通过自我平衡细胞因子、降低CD4+CD25+调节T细胞、增加骨髓微环境内的SDF-1以及对抗原呈递细胞的刺激作用改善CAR T细胞的移植和活性(Grossman等人,Nat Rev Immunol.2004；4(5):387-395；Stachel等人,Pediatr Blood Cancer 2004；43(6):644-50；Pinthus等人,J Clin Invest 2004；114(12):1774-81；Turk等人,J Exp Med 2004；200(6):771-82)。此外，LD化学疗法可以进一步减轻受试者的肿瘤负担，并可能降低细胞因子释放综合征(CRS)的风险和严重程度。

因此，在一些实施方案中，所述方法包括在施用工程化细胞之前将预调理剂施用于受试者，所述预调理剂如淋巴细胞清除剂或化学治疗剂，如环磷酰胺、氟达拉滨或其组合。例如，可以在施用工程化细胞之前至少2天(如至少3、4、5、6、7、8或9天)向所述受试者施用预调理剂。在一些实施方案中，在施用工程化细胞之前不超过9天(如不超过8、7、6、5、4、3或2天)向所述受试者施用预调理剂。

在一些实施方案中，将受试者用环磷酰胺以在或在约20mg/kg与100mg/kg受试者体重之间，如在或在约40mg/kg与80mg/kg之间的剂量进行预调理。在一些方面，用或用约60mg/kg的环磷酰胺对受试者进行预调理或施用。在一些实施方案中，可以将环磷酰胺按单剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每日给予、每隔一天给予或每三天给予。在一些实施方案中，将环磷酰胺每日施用一次，持续一天或两天。在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含环磷酰胺的情况下，以在或在约100mg/m²与500mg/m²受试者体表面积之间，如在或在约200mg/m²与400mg/m²之间，或250mg/m²与350mg/m²之间(包含端值)的剂量向受试者施用环磷酰胺。在一些情形中，向受试者施用约100mg/m²的环磷酰胺。在一些情形中，向受试者施用约150mg/m²的环磷酰胺。在一些情形中，向受试者施用约200mg/m²的环磷酰胺。在一些情形中，向受试者施用约250mg/m²的环磷酰胺。在一些情形中，向受试者施用约300mg/m²的环磷酰胺。在一些实施方案中，可以将环磷酰胺按单剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每日给予、每隔一天给予或每三天给予。在一些实施方案中，每天施用环磷酰胺，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情况下，在开始细胞疗法之前，向受试者每天施用约300mg/m²受试者体表面积的环磷酰胺，持续3天。在一些实施方案中，在开始细胞疗法之前，向受试者施用总计为或约300mg/m²、400mg/m²、500mg/m²、600mg/m²、700mg/m²、800mg/m²、900mg/m²、1000mg/m²、1200mg/m²、1500mg/m²、1800mg/m²、2000mg/m²、2500mg/m²、2700mg/m²、3000mg/m²、3300mg/m²、3600mg/m²、4000mg/m²或5000mg/m²的环磷酰胺，或任何前述值限定的范围内的环磷酰胺。

在一些实施方案中，在淋巴细胞清除剂包含氟达拉滨的情况下，以在为或约1mg/m²与为或100mg/m²之间，如在为或约10mg/m²与为或约75mg/m²之间、为或约15mg/m²与为或约50mg/m²之间、为或约20mg/m²与为或约40mg/m²之间、为或约或24mg/m²与为或约35mg/m²之间(包含端值)的剂量向受试者施用氟达拉滨。在一些情况下，向受试者施用为或为或约10mg/m²的氟达拉滨。在一些情况下，向受试者施用为或约15mg/m²的氟达拉滨。在一些情况下，向受试者施用为或约20mg/m²的氟达拉滨。在一些情况下，向受试者施用为或约25mg/m²的氟达拉滨。在一些情况下，向受试者施用为或约30mg/m²的氟达拉滨。在一些实施方案中，可以将氟达拉滨按单一剂量施用或者可以按多个剂量施用，如每日给予、每隔一天给予或每三天给予。在一些实施方案中，每天施用氟达拉滨，如持续1-5天，例如持续3至5天。在一些情况下，在开始细胞疗法之前，向受试者每天施用为或约30mg/m²受试者体表面积的氟达拉滨，持续3天。在一些实施方案中，在开始细胞疗法之前，向受试者施用总计为或约10mg/m²、20mg/m²、25mg/m²、30mg/m²、40mg/m²、50mg/m²、60mg/m²、70mg/m²、80mg/m²、90mg/m²、100mg/m²、120mg/m²、150mg/m²、180mg/m²、200mg/m²、250mg/m²、270mg/m²、300mg/m²、330mg/m²、360mg/m²、400mg/m²或500mg/m²的环磷酰胺，或由任何前述值限定的范围内的环磷酰胺。

在一些实施方案中，淋巴细胞清除剂包含单一药剂，如环磷酰胺或氟达拉滨。在一些实施方案中，向受试者仅施用环磷酰胺，而不施用氟达拉滨或其他淋巴细胞清除剂。在一些实施方案中，在施用之前，受试者已经接受淋巴细胞清除疗法，包括每天施用为或约200-400mg/m²受试者体表面积、任选地为或约300mg/m²的环磷酰胺，持续2-4天。在一些实施方案中，向受试者仅施用氟达拉滨，例如不施用环磷酰胺或其他淋巴细胞清除剂。在一些实施方案中，在施用之前，受试者已经接受淋巴细胞清除疗法，包括每天施用为或约20-40mg/m²受试者体表面积、任选地为或约30mg/m²的氟达拉滨，持续2-4天。

在一些实施方案中，淋巴细胞清除剂包含药剂的组合，如环磷酰胺和氟达拉滨的组合。因此，药剂的组合可包括任何剂量或给药时间表(如上述那些剂量或给药时间表)下的环磷酰胺以及任何剂量或给药时间表(如上述那些剂量或给药时间表)下的氟达拉滨。例如，在一些方面，在第一剂量或后续剂量之前，向受试者施用为或约60mg/kg(约2g/m²)的环磷酰胺和3至5个剂量的25mg/m²氟达拉滨。在一些中，在施用细胞之前，向受试者同时静脉内施用氟达拉滨(30mg/m²/天，持续3天)和环磷酰胺(300mg/m²/天，持续3天)(flu/cy)。在一些实施方案中，向受试者施用减少的、延迟的或消除的剂量的一个或多个剂量的一种或多种淋巴细胞清除剂。

在一些实施方案中，在从受试者收集细胞之后以及在施用淋巴细胞清除(LD)化学疗法之前，受试者可以接受桥接疗法以控制疾病。可以基于熟练开业医生对于治疗特定疾病或病症的判断，包括基于多种因素来施用多种疗法中的任一种作为桥接疗法的一部分，所述因素如患者年龄、疾病的严重程度或程度、副作用的可能性、在LD化学疗法之前的施用的时间安排、先前疗法和其他因素。可以在淋巴细胞清除疗法之前作为桥接给予的示例性疗法包括但不限于皮质类固醇、长春新碱、环磷酰胺、利妥昔单抗、地塞米松、泼尼松、来那度胺、吉西他滨、奥沙利铂、维汀-本妥昔单抗、依鲁替尼、甲氨蝶呤、胞嘧啶阿拉伯糖苷、阿糖胞苷、苯达莫司汀或前述任一种的任何组合。

在一些实施方案中，对受试者进行前驱用药，例如以使输注反应的风险降至最低。在一些方面，前驱用药包括施用镇痛药和/或抗组胺药。在一些实施方案中，前驱用药包括施用对乙酰氨基酚和/或苯海拉明或另一种H1-抗组胺药。在一些实施方案中，在用细胞疗法治疗之前为或约30至60分钟，患者使用对乙酰氨基酚(例如，650mg口服)和苯海拉明(例如，25-50mg，IV或口服)或另一种H1-抗组胺药。

在一些实施方案中，受试者至少18岁。在任何所提供方法的实施方案中，所述受试者是人受试者。

A.给药

在一些实施方案中，根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物将一定剂量的工程化细胞施用于受试者。在一些实施方案中，剂量的大小或时间安排根据受试者的特定疾病或病症确定。在一些情况下，可以根据所提供的描述凭经验确定用于特定疾病的剂量的大小或时间安排。

在一些任何所提供的实施方案中，T细胞(如表达重组受体的工程化T细胞)的剂量包括、富集或包含富集CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或者CD4+ T细胞和CD8+ T细胞的细胞组合物或细胞群体。在一些任何此类实施方案中，T细胞的剂量中大于或大于约70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的细胞是CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞或者CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。在一些任何此类实施方案中，T细胞的剂量中大于或大于约70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的细胞是CD3+ T细胞。在一些任何所提供的实施方案中，T细胞的剂量包含CD4+细胞和CD8+细胞。在一些任何此类实施方案中，T细胞的剂量中大于或大于约70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。

在一些实施方案中，细胞的剂量包含在为或约0.1x10⁵个CD19定向CAR工程化细胞/公斤受试者体重(细胞/kg)与为或约2x10⁶个细胞/kg之间，如在为或约0.1x10⁵个细胞/kg与为或约0.5x10⁵个细胞/kg之间、在为或约0.5x10⁵个细胞/kg与为或约1x10⁵个细胞/kg之间、在为或约1x10⁵个细胞/kg与为或约1.5x10⁵个细胞/kg之间、在为或约1.5x10⁵个细胞/kg与为或约2x10⁵个细胞/kg之间、在为或约2x10⁵个细胞/kg与为或约2.5x10⁵个细胞/kg之间、在为或约2.5x10⁵个细胞/kg与为或约3x10⁵个细胞/kg之间、在为或约3x10⁵个细胞/kg与为或约3.5x10⁵个细胞/kg之间、在为或约3.5x10⁵个细胞/kg与为或约4x10⁵个细胞/kg之间、在为或约4x10⁵个细胞/kg与为或约4.5x10⁵个细胞/kg之间、在为或约4.5x10⁵个细胞/kg与为或约5x10⁵个细胞/kg之间、在为或约5x10⁵个细胞/kg与为或约5.5x10⁵个细胞/kg之间、在为或约5.5x10⁵个细胞/kg与为或约6x10⁵个细胞/kg之间、在为或约6x10⁵个细胞/kg与为或约6.5x10⁵个细胞/kg之间、在为或约6.5x10⁵个细胞/kg与为或约7x10⁵个细胞/kg之间、在为或约7x10⁵个细胞/kg与为或约7.5x10⁵个细胞/kg之间、在为或约7.5x10⁵个细胞/kg与为或约8x10⁵个细胞/kg之间、或在为或约8x10⁵个细胞/kg与为或约10x10⁵个细胞/kg之间。在一些实施方案中，细胞的所述剂量包含不超过2x10⁵个CD19定向CAR工程化细胞/公斤所述受试者的体重(细胞/kg)，如不超过或不超过约3x10⁵个细胞/kg、不超过或不超过约4x10⁵个细胞/kg、不超过或不超过约5x10⁵个细胞/kg、不超过或不超过约6x10⁵个细胞/kg、不超过或不超过约7x10⁵个细胞/kg、不超过或不超过约8x10⁵个细胞/kg、不超过或不超过约9x10⁵个细胞/kg、不超过或不超过约1x10⁶个细胞/kg、或不超过或不超过约2x10⁶个细胞/kg。在一些实施方案中，细胞的所述剂量包含至少或至少约或为或约0.1x10⁵个CD19定向CAR工程化细胞/公斤受试者体重(细胞/kg)，如至少或至少约或为或约0.2x10⁵个细胞/kg、至少或至少约或为或约0.3x10⁵个细胞/kg、至少或至少约或为或约0.4x10⁵个细胞/kg、至少或至少约或为或约0.5x10⁵个细胞/kg、至少或至少约或为或约0.6x10⁵个细胞/kg、至少或至少约或为或约0.7x10⁵个细胞/kg、至少或至少约或为或约0.8x10⁵个细胞/kg、至少或至少约或为或约0.9x10⁵个细胞/kg、至少或至少约或为或约0.1x10⁶个细胞/kg、或至少或至少约或为或约0.2x10⁶个细胞/kg。在一些实施方案中，细胞的数量是作为活细胞(例如活T细胞，如表达CD19定向CAR的活CD3+细胞)的此类细胞的数量。

在某些实施方案中，将细胞或细胞亚型的单独群体按以下施用至受试者：在为或约10万至为或约1000亿个细胞的范围和/或每公斤受试者体重该量的细胞，如例如为或约10万至为或约500亿个细胞(例如，为或约500万个细胞、为或约2500万个细胞、为或约5亿个细胞、为或约10亿个细胞、为或约50亿个细胞、为或约200亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约400亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)、为或约100万至为或约500亿个细胞(例如，为或约500万个细胞、为或约2500万个细胞、为或约5亿个细胞、为或约10亿个细胞、为或约50亿个细胞、为或约200亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约400亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，如为或约1000万至为或约1000亿个细胞(例如，为或约2000万个细胞、为或约3000万个细胞、为或约4000万个细胞、为或约6000万个细胞、为或约7000万个细胞、为或约8000万个细胞、为或约9000万个细胞、为或约100亿个细胞、为或约250亿个细胞、为或约500亿个细胞、为或约750亿个细胞、为或约900亿个细胞或由任两个前述值限定的范围)，并且在一些情况下，为或约1亿个细胞至为或约500亿个细胞(例如，为或约1.2亿个细胞、为或约2.5亿个细胞、为或约3.5亿个细胞、为或约6.5亿个细胞、为或约8亿个细胞、为或约9亿个细胞、为或约30亿个细胞、为或约300亿个细胞、为或约450亿个细胞)或在这些范围和/或每公斤受试者体重的这些范围之间的任何值。剂量可以根据疾病或障碍和/或患者和/或其他治疗特有的属性而变化。在一些实施方案中，这些值是指表达重组受体的细胞的数量；在其他实施方案中，它们是指施用的组合物中T细胞或总细胞的数量。在一些实施方案中，细胞数量是作为活细胞的此类细胞的数量。

在一些实施方案中，细胞剂量是细胞的平剂量或细胞的固定剂量，使得细胞剂量不依赖于或基于受试者的体表面积或体重。

在一些实施方案中，基因工程化细胞的所述剂量包含从为或约1x10⁵至为或约1x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵至为或约0.8x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵至为或约0.6x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵至为或约0.4x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵至为或约0.2x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵至为或约1.0x10⁷个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵至为或约0.8x10⁷个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵至为或约0.6x10⁷个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵至为或约0.4x10⁷个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵至为或约0.2x10⁷个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约1x10⁵至为或约1.0x10⁶个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶至为或约1.0x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶至为或约0.8x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶至为或约0.6x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶至为或约0.4x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶至为或约0.2x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶至为或约1.0x10⁷个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶至为或约0.8x10⁷个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶至为或约0.6x10⁷个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶至为或约0.4x10⁷个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约1x10⁶至为或约0.2x10⁷个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶至为或约1.0x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶至为或约0.8x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶至为或约0.6x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶至为或约0.4x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶至为或约0.2x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶至为或约1.0x10⁷个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶至为或约0.8x10⁷个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约5x10⁶至为或约0.6x10⁷个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约10x10⁶至为或约1.0x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约10x10⁶至为或约0.9x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约10x10⁶至为或约0.8x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约10x10⁶至为或约0.7x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约10x10⁶至为或约0.6x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约10x10⁶至为或约0.5x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约10x10⁶至为或约0.4x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约10x10⁶至为或约0.3x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约10x10⁶至为或约0.2x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约10x10⁶至为或约15x10⁶个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约15x10⁶至为或约1.0x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约15x10⁶至为或约0.9x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约15x10⁶至为或约0.8x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约15x10⁶至为或约0.7x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约15x10⁶至为或约0.6x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约15x10⁶至为或约0.5x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约15x10⁶至为或约0.4x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约15x10⁶至为或约0.3x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约15x10⁶至为或约0.2x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约20x10⁶至为或约1.0x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约20x10⁶至为或约0.9x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约20x10⁶至为或约0.8x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约20x10⁶至为或约0.7x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约20x10⁶至为或约0.6x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约20x10⁶至为或约0.5x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约20x10⁶至为或约0.4x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约20x10⁶至为或约0.3x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约20x10⁶至为或约25x10⁶个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约25x10⁶至为或约1.0x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约25x10⁶至为或约0.9x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约25x10⁶至为或约0.8x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约25x10⁶至为或约0.7x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约25x10⁶至为或约0.6x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约25x10⁶至为或约0.5x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约25x10⁶至为或约0.4x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约25x10⁶至为或约0.3x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约30x10⁶至为或约1.0x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约30x10⁶至为或约0.9x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约30x10⁶至为或约0.8x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约30x10⁶至为或约0.7x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约30x10⁶至为或约0.6x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约30x10⁶至为或约0.5x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约30x10⁶至为或约0.4x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约30x10⁶至为或约35x10⁶个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约35x10⁶至为或约1.0x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约35x10⁶至为或约0.9x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约35x10⁶至为或约0.8x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约35x10⁶至为或约0.7x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约35x10⁶至为或约0.6x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约35x10⁶至为或约0.5x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约35x10⁶至为或约0.4x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约40x10⁶至为或约1.0x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约40x10⁶至为或约0.9x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约40x10⁶至为或约0.8x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约40x10⁶至为或约0.7x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约40x10⁶至为或约0.6x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、从为或约40x10⁶至为或约0.5x10⁸个表达所述CD19定向CAR的总T细胞、或从为或约40x10⁶至为或约45x10⁶个表达所述CD19定向CAR的总T细胞。在一些实施方案中，细胞的数量是作为活细胞(如活T细胞)的此类细胞的数量。

在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含至少或至少约1x10⁵个表达CD19定向CAR的T细胞、至少或至少约2.5x10⁵个表达CD19定向CAR的T细胞、至少或至少约5x10⁵个表达CD19定向CAR的T细胞、至少或至少约1x10⁶个表达CD19定向CAR的T细胞、至少或至少约2.5x10⁶个表达CD19定向CAR的T细胞、至少或至少约5x10⁶个表达CD19定向CAR的T细胞、至少或至少约1x10⁷个表达CD19定向CAR的T细胞、至少或至少约2.5x10⁷个表达CD19定向CAR的T细胞、或至少或至少约5x10⁷个表达CD19定向CAR的T细胞。在一些实施方案中，细胞的数量是作为活细胞(如活T细胞)的此类细胞的数量。

在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含少于或少于约1x10⁵个表达CD19定向CAR的T细胞、少于或少于约2.5x10⁵个表达CD19定向CAR的T细胞、少于或少于约5x10⁵个表达CD19定向CAR的T细胞、少于或少于约1x10⁶个表达CD19定向CAR的T细胞、少于或少于约2.5x10⁶个表达CD19定向CAR的T细胞、少于或少于约5x10⁶个表达CD19定向CAR的T细胞、少于或少于约1x10⁷个表达CD19定向CAR的T细胞、少于或少于约1.5x10⁷个表达CD19定向CAR的T细胞、少于或少于约2x10⁷个表达CD19定向CAR的T细胞、少于或少于约2.5x10⁷个表达CD19定向CAR的T细胞、少于或少于约3x10⁷个表达CD19定向CAR的T细胞、少于或少于约3.5x10⁷个表达CD19定向CAR的T细胞、少于或少于约4x10⁷个表达CD19定向CAR的T细胞、少于或少于约4.5x10⁷个表达CD19定向CAR的T细胞、或少于或少于约5x10⁷个表达CD19定向CAR的T细胞。在一些实施方案中，细胞的数量是作为活细胞(如活T细胞)的此类细胞的数量。

在一些实施方案中，细胞疗法包括施用包含如下细胞数量的剂量：包含从或从约1x10⁵至或至约5x10⁸个总重组受体表达细胞或总T细胞、5x10⁵至或至约1x10⁷个总重组受体表达细胞或总T细胞、或1x10⁶至或至约1x10⁷个总重组受体表达细胞或总T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用包含如下细胞数量的剂量：从或从约1x10⁵至或至约1x10⁸个总重组受体表达细胞或总T细胞、从或从约5x10⁵至或至约1x10⁸个总重组受体表达细胞或总T细胞、从或从约1x10⁶至或至约50x10⁶个总重组受体表达细胞或总T细胞、从或从约5x10⁶至或至约45x10⁶个总重组受体表达细胞或总T细胞、或从或从约10x10⁶至或至约25x10⁶个总重组受体表达细胞或总T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用包含如下细胞数量的细胞剂量：至少或至少约1x10⁵个总重组受体表达细胞或总T细胞，如至少或至少约1x10⁶、至少或至少约1x10⁷、至少或至少约1x10⁸个此类细胞。在一些实施方案中，细胞的数量是作为活细胞(如活T细胞)的此类细胞的数量。

在一些实施方案中，所述数量是关于CD3⁺、CD8⁺或CD4+和CD8+，在一些情况下以及重组受体表达(例如CAR+)细胞的总数量。在一些实施方案中，细胞数量是作为活细胞的此类细胞的数量。

在一些实施方案中，细胞疗法包括施用包含如下细胞数量的剂量：从或从约1x10⁵至或至约1x10⁸个CD3⁺、CD8⁺、或CD4⁺和CD8⁺总T细胞或CD3⁺、CD8⁺、或CD4⁺和CD8⁺重组受体(例如CAR)表达细胞，从或从约5x10⁵至或至约5x10⁷个CD3⁺、CD8⁺、或CD4⁺和CD8⁺总T细胞或CD3⁺、CD8⁺、或CD4⁺和CD8⁺重组受体(例如CAR)表达细胞，或从或从约1x10⁶至或至约2.5x10⁷个CD3⁺、CD8⁺、或CD4⁺和CD8⁺总T细胞或CD3⁺、CD8⁺、或CD4⁺和CD8⁺重组受体(例如CAR)表达细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞疗法包括施用包含如下细胞数量的剂量：从或从约1x10⁵至或至约1x10⁸个总CD3⁺/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺细胞，从或从约5x10⁵至或至约5x10⁷个总CD3⁺/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺、或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺细胞，或从或从约1x10⁶至或至约2.5x10⁷个总CD3⁺/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺、或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞数量是作为活细胞的此类细胞的数量。

在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含至少或至少约0.1x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺、或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺ T细胞、至少或至少约0.5x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺ T细胞、至少或至少约1.0x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺ T细胞、至少或至少约2.5x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺ T细胞、或至少或至少约5x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺ T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含少于或少于约0.1x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺ T细胞、少于或少于约0.5x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺ T细胞、少于或少于约1.0x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺ T细胞、少于或少于约2.5x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺ T细胞、少于或少于约5x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺ T细胞、少于或少于约7.5x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺ T细胞或少于或少于约10x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺ T细胞。在一些实施方案中，基因工程化细胞的剂量包含为或约0.5x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺ T细胞、为或约1.0x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺ T细胞、为或约1.5x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺ T细胞、为或约2.0x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺ T细胞、为或约2.5x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺ T细胞、为或约3.0x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺T细胞、为或约3.5x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺ T细胞、为或约4.0x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺ T细胞、为或约4.5x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺ T细胞、为或约5x10⁷个CD3+/CAR⁺、CD8⁺/CAR⁺或CD4⁺/CD8⁺/CAR⁺ T细胞。在一些实施方案中，细胞数量是作为活细胞的此类细胞的数量。

在一些实施方案中，T细胞的剂量包含：为或约0.5x10⁷个重组受体(例如CAR)表达T细胞、为或约1.0x10⁷个重组受体(例如CAR)表达T细胞、为或约1.5x10⁷个重组受体(例如CAR)表达T细胞、为或约2.0x10⁷个重组受体(例如CAR)表达T细胞、为或约2.5x10⁷个重组受体(例如CAR)表达CD8⁺ T细胞、为或约3.0x10⁷个重组受体(例如CAR)表达T细胞、为或约3.5x10⁷个重组受体(例如CAR)表达T细胞、为或约4.0x10⁷个重组受体(例如CAR)表达T细胞、或为或约4.5x10⁷个重组受体(例如CAR)表达T细胞。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包含：为或约1x10⁸个重组受体(例如CAR)表达T细胞或为或约5x10⁷个重组受体(例如CAR)表达CD8⁺ T细胞。在一些实施方案中，T细胞的所述剂量包含：为或约1.5x10⁸个重组受体(例如CAR)表达T细胞或为或约0.75x10⁸个重组受体(例如CAR)表达CD8⁺ T细胞。在一些实施方案中，细胞数量是作为活细胞的此类细胞的数量。

在一些实施方案中，所述剂量的所述T细胞包括CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞或CD4⁺和CD8⁺ T细胞。

在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，CD8+ T细胞的剂量(包括在包括CD4+和CD8+ T细胞的剂量中)包括在为或约1x10⁶个与为或约1x10⁸个之间的总重组受体(例如CAR)表达CD8+细胞，例如，在以下范围内：从为或约1x10⁶至为或约1x10⁸个此类细胞，如1x10⁶、2.5x10⁶、5x10⁶、7.5x10⁶、1x10⁷、2.5x10⁷、5x10⁷或7.5x10⁷个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，向患者施用多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞的剂量包括施用从或约1x10⁶至或至约5x10⁷个总重组受体表达CD8+ T细胞、从或约5x10⁶至或至约2.5x10⁷个总重组受体表达CD8+ T细胞、从或从约10x10⁶至或至约2.5x10⁷个总重组受体表达CD8+ T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞数量是作为活细胞的此类细胞的数量。

在一些实施方案中，例如，在受试者是人的情况下，CD4+ T细胞的剂量(包括在包括CD4+和CD8+ T细胞的剂量中)包括在为或约1x10⁶个与为或约1x10⁸个之间的总重组受体(例如CAR)表达CD4+细胞，例如，在以下范围内：从为或约1x10⁶至为或约1x10⁸个此类细胞，如1x10⁶、2.5x10⁶、5x10⁶、7.5x10⁶、1x10⁷、2.5x10⁷、5x10⁷或7.5x10⁷个总此类细胞，或任两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，向患者施用多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞的剂量包括施用从或约1x10⁶至或至约5x10⁷个总重组受体表达CD4+ T细胞、从或约5x10⁶至或至约2.5x10⁷个总重组受体表达CD4+ T细胞、从或从约10x10⁶至或至约2.5x10⁷个总重组受体表达CD4+ T细胞，每个都包含端值。在一些实施方案中，细胞数量是作为活细胞的此类细胞的数量。

在一些实施方案中，例如在受试者是人的情况下，所述剂量包含少于约5x10⁸个总重组受体(例如，CAR)表达细胞或T细胞，例如在为或为约1x10⁶至或至约1x10⁸个此类细胞的范围内(如为或为约2x10⁶、5x10⁶、1x10⁷、5x10⁷或1x10⁸个总此类细胞)，或任何两个前述值之间的范围内。在一些实施方案中，细胞数量是作为活细胞的此类细胞的数量。

在一些实施方案中，向患者施用多个剂量，并且每个剂量或总剂量可以在任何前述值内。在一些实施方案中，细胞的所述剂量包括施用从或从约1x10⁵至或至约1x10⁸个总重组受体(例如CAR)表达T细胞或总T细胞、从或从约1x10⁵至或至约0.5x10⁸个总重组受体(例如CAR)表达T细胞或总T细胞、从或从约1x10⁵至或至约0.5x10⁸个总重组受体(例如CAR)表达T细胞或总T细胞、从或从约5x10⁵至或至约5x10⁷个总重组受体(例如CAR)表达T细胞或总T细胞、或从或从约1x10⁶至或至约1x10⁷个总重组受体(例如CAR)表达T细胞或总T细胞，每个都包含端值。

在一些实施方案中，所述剂量的所述T细胞包括CD4⁺ T细胞、CD8⁺ T细胞或CD4⁺和CD8⁺ T细胞。

在一些实施方案中，细胞(例如，重组受体表达T细胞)的剂量是作为单一剂量施用至受试者，或者在两周、一个月、3个月、六个月、1年或更长的时间段内仅施用一次。

在过继细胞疗法的情况下，施用给定“剂量”涵盖施用作为单一组合物和/或单次不间断施用(例如，作为单次注射或连续输注)的给定量或数量的细胞，并且还涵盖在指定时间段中(如在不超过3天中)施用在多种单独组合物或输注中提供的作为分割剂量或作为多种组合物的给定量或数量的细胞。因此，在一些情况下，剂量是指定数量的细胞的单次或连续施用，在单个时间点给予或开始。然而，在一些情况下，剂量在不超过三天的时间段内以多次注射或输注的方式施用，例如每天一次持续三天或两天或者通过在一天的时间内多次输注。

在特定实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指重组受体(例如，CAR)表达细胞的数量。在其他实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指所施用的T细胞的数量或浓度。

在一些实施方案中，受试者接受细胞的多个剂量，例如，两个或更多个剂量或多个连续剂量。在一些实施方案中，向受试者施用两个剂量。在一些实施方案中，受试者接受连续剂量，例如，第二剂量是在第一剂量后约4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天、16天、17天、18天、19天、20天或21天施用。在一些实施方案中，在第一剂量后施用多个连续剂量，使得在施用所述连续剂量后施用另外一个或多个剂量。在一些方面，在另外的剂量中施用至受试者的细胞数量与第一剂量和/或连续剂量相同或相似。在一些实施方案中，另外一个或多个剂量大于先前剂量。

在一些方面，剂量的大小基于一个或多个标准来确定，如受试者对先前治疗(例如化学疗法)的反应、受试者的疾病负担(如肿瘤负荷、体积、尺寸或程度)、转移的程度或类型、分期和/或受试者发生毒性结局(例如，CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所施用的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。

在一些方面，第一剂量的施用与连续剂量的施用之间的时间为约9至约35天、约14至约28天或15至27天。在一些实施方案中，施用所述连续剂量是在施用所述第一剂量后大于约14天且在施用所述第一剂量后小于约28天的某个时间点进行。在一些方面，所述第一剂量与所述连续剂量之间的时间为约21天。在一些实施方案中，在施用连续剂量后施用另外一个或多个剂量(例如连续剂量)。在一些方面，在施用先前剂量后至少约14天且小于约28天施用另外一个或多个连续剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后小于约14天(例如，在先前剂量后4、5、6、7、8、9、10、11、12或13天)施用所述另外的剂量。在一些实施方案中，在先前剂量后小于约14天不施用剂量，和/或在先前剂量后超过约28天不施用剂量。

在一些实施方案中，细胞的所述剂量通常足够大以有效减少疾病负担。

在特定实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指重组受体(例如，CAR)表达细胞的数量。在其他实施方案中，细胞的数量和/或浓度是指施用的所有细胞、T细胞或外周血单个核细胞(PBMC)的数量或浓度。

在一些实施方案中，所述方法还包括施用一个或多个另外的剂量的表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞和/或淋巴细胞清除疗法，和/或重复所述方法的一个或多个步骤。在一些实施方案中，所述一个或多个另外的剂量与初始剂量相同。在一些实施方案中，一个或多个另外的剂量与初始剂量不同，例如，更高，如比初始剂量高为或约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多；或者更低，如例如更高，如比初始剂量低2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍或更多。在一些实施方案中，基于以下确定一个或多个另外的剂量的施用：受试者对初试治疗或任何先前治疗的反应、受试者的疾病负担(如肿瘤负荷、体积、尺寸或程度)、转移的程度或类型、分期和/或受试者发生毒性结局(例如，CRS、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、神经毒性和/或针对所施用的细胞和/或重组受体的宿主免疫应答)的可能性或发生率。

B.反应、功效和存活

在一些实施方案中，尽管受试者已经对另一种疗法产生耐药性，但根据所提供的方法的施用有效治疗了所述受试者。在一些实施方案中，至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％或至少80％的根据所述方法治疗的受试者实现完全缓解(CR)。在一些实施方案中，至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少80％、或至少90％的根据所述方法治疗的受试者实现客观反应(OR)。在一些实施方案中，至少或至少约50％的根据所述方法治疗的受试者、至少或至少约60％的受试者、至少或至少约70％的受试者、至少或至少约80％的受试者或者至少或至少约90％的受试者实现CR和/或实现客观反应(OR)。在一些实施方案中，评估有效治疗的标准包括总体反应率(ORR；在一些情况下也称为客观反应率)、完全反应(CR；在一些情况下也称为完全缓解)、反应持续时间(DOR)、无进展存活期(PFS)和/或总体存活期(OS)。

在一些实施方案中，至少40％或至少50％的根据本文所提供的方法治疗的受试者实现完全缓解(CR；在一些情况下也称为完全反应)，展现大于或大于约3个月、6个月或12个月或大于13个月或大约14个月的无进展存活期(PFS)和/或总体存活期(OS)；平均而言，根据所述方法治疗的受试者展现大于或大于约6个月、12个月或18个月的中值PFS或OS；和/或所述受试者在疗法后展现至少或至少约6、12、18或更多个月或更久的PFS或OS。

在一些实施方案中，至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％的根据所提供的方法治疗的受试者展现出CRR。在一些实施方案中，完全反应率(CRR)计算为具有长达12个月、长达18个月、长达24个月、长达36个月或更长时间的最佳总体反应(BOR)的受试者的百分比。

在一些方面，受试者(例如患有NHL的受试者)的反应率是基于卢加诺标准。(Cheson等人,(2014)JCO 32(27):3059-3067；Johnson等人,(2015)Radiology 2:323–338；Cheson,B.D.(2015)Chin Clin Oncol 4(1):5)。在一些方面，反应评估利用临床、血液学和/或分子方法中的任何一种。在一些方面，使用卢加诺标准评估的反应涉及视情况使用正电子发射断层摄影术(PET)-计算机断层成像(CT)和/或CT。PET-CT评价还可以包括使用氟脱氧葡萄糖(FDG)用于嗜FDG淋巴瘤。在一些方面，如果将使用PET-CT来评估嗜FDG组织学中的反应，则可以使用5分量表。在一些方面，5分量表包含以下标准：1，没有高于背景的摄取；2，摄取≤纵隔；3，摄取>纵隔但≤肝脏；4，摄取中度>肝脏；5，摄取显著高于肝脏和/或新病灶；X，新的摄取区域不可能与淋巴瘤有关。

在一些方面，如使用卢加诺标准描述的完全反应涉及在不同可测量部位的完全代谢反应和完全放射学反应。在一些方面，这些部位包括淋巴结和淋巴外部位，其中当使用PET-CT时，在5分量表上CR被描述为得分为1、2或3，其具有或不具有残留肿块。在一些方面，在脾或骨髓内具有高生理摄取或激活的韦氏环(Waldeyer's ring)或结节外部位中(例如，对于化学疗法或骨髓集落刺激因子)，摄取可以大于正常纵隔和/或肝脏。在这种情况下，如果在初始受累部位的摄取不大于周围的正常组织，即使所述组织具有高生理摄取，也可以推断为完全代谢反应。在一些方面，使用CT在淋巴结中评估反应，其中CR被描述为没有患病的淋巴外部位，并且靶淋巴结/淋巴结肿块的病灶的最长横径(LDi)必须复原至≤1.5cm。其他评估部位包括骨髓，其中基于PET-CT的评估应指示在骨髓中缺乏嗜FDG疾病的证据，并且基于CT的评估应指示正常形态，如果不确定则应是IHC阴性。其他部位可以包括对器官肿大的评估，其应复原至正常。在一些方面，评估未测量的病灶和新病灶，其在CR的情况下应不存在(Cheson等人,(2014)JCO32(27):3059-3067；Johnson等人,(2015)Radiology 2:323-338；Cheson,B.D.(2015)Chin Clin Oncol 4(1):5)。

在一些方面，如使用卢加诺标准描述的部分反应(PR；在一些情况下也称为部分缓解)涉及在不同可测量部位的部分代谢和/或放射学反应。在一些方面，这些部位包括淋巴结和淋巴外部位，其中在使用PET-CT时，PR被描述为得分为4分或5分，具有与基线相比降低的摄取和任何大小的一个或多个残留肿块。在中间时期，此类发现可以指示反应中的疾病。在治疗结束时，此类发现可以指示残留疾病。在一些方面，使用CT评估淋巴结中的反应，其中PR被描述为多达6个可测量的靶结节和结节外部位的SPD减小≥50％。如果病灶太小而无法在CT上测量，则将5mm×5mm指定为默认值；如果病灶不再可见，则所述值为0mm×0mm；对于>5mm×5mm但小于正常的结节，使用实际测量值进行计算。其他评估部位包括骨髓，其中基于PET-CT的评价应指示残留摄取，所述残留摄取高于正常骨髓中的摄取但与基线相比有所降低(弥漫性摄取与来自所允许化学疗法的反应性变化相容)。在一些方面，如果在结节反应的情况下在骨髓中存在持续的局灶性变化，则应考虑用MRI或活检或间隔扫描进一步评价。在一些方面，其他部位可以包括对器官肿大的评估，其中脾脏的超过正常的长度必须已经复原>50％。在一些方面，评估未测量病灶和新病灶，其在PR的情况下应不存在/正常，已复原但没有增加。也可以使用基于PET-CT和/或CT的评估来测量无反应/疾病稳定(SD)或疾病进展(PD)。(Cheson等人,(2014)JCO 32(27):3059-3067；Johnson等人,(2015)Radiology 2:323-338；Cheson,B.D.(2015)Chin Clin Oncol 4(1):5)。

在一些方面，无进展存活期(PFS)被描述为在疾病(如癌症)治疗期间和之后，受试者带病生存但所述疾病不恶化的时间长度。在一些方面，客观反应(OR)被描述为可测量的反应。在一些方面，客观反应率(ORR；在一些情况下也称为总体反应率)被描述为实现CR或PR的患者的比例。在一些方面，总体存活期(OS)被描述为从诊断日期或疾病(如癌症)治疗开始日期起，被诊断患有所述疾病的受试者仍然存活的时间长度。在一些方面，无事件存活期(EFS)被描述为在癌症治疗结束后，受试者保持没有所述治疗意图预防或延迟的某些并发症或事件的时间长度。这些事件可以包括癌症的复发或某些症状的发作，如已经扩散到骨骼的癌症引起的骨痛，或死亡。

在一些实施方案中，反应持续时间(DOR)的量度包括从记录到肿瘤反应至疾病进展的时间。在一些实施方案中，用于评估反应的参数可以包括持久反应，例如，从开始疗法起一段时间之后持续存在的反应。在一些实施方案中，持久反应是由在开始疗法之后大约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24个月的反应率来指示。在一些实施方案中，所述反应是持久的，持续超过3个月或超过6个月。

在一些方面，使用RECIST标准确定客观肿瘤反应；在一些方面，在实体瘤中确定。(Eisenhauer等人,European Journal of Cancer 45(2009)228-247。)在一些方面，使用RECIST标准确定对于靶病灶的客观肿瘤反应。在一些方面，如使用RECIST标准确定的完全反应被描述为所有靶病灶的消失，并且任何病理性淋巴结(无论是靶标还是非靶标)必须在短轴上减小至<10mm。在其他方面，如使用RECIST标准确定的部分反应被描述为以基线直径总和为参考，靶病灶的直径总和减小至少30％。在其他方面中，疾病进展(PD)被描述为以研究中的最小总和(如果基线总和在研究中最小，则这个最小总和包括基线总和)作为参考，靶病灶直径总和增加至少20％。除了20％的相对增加外，总和还必须显示至少5mm的绝对增加(在一些方面，出现一个或多个新病灶也被视为进展)。在其他方面中，疾病稳定(SD)被描述为以研究时的最小总直径作为参考，既没有足够缩小以符合PR，也没有足够增加以符合PD。

在一些实施方案中，患有滤泡性淋巴瘤(FL)的受试者的存活率是基于意大利淋巴瘤协作组(ILI)和/或国际滤泡性淋巴瘤预后因子项目(IFLPFP)开发的评分系统，大体上如上文所述(Luminari等人,(2012)Rev.Brad.Hematol.Hemoter.,34:54-59)。在一些实施方案中，疾病(如FL)的程度可以通过Ann Arbor分期系统、肿瘤负担、巨块病、疾病的结节或结节外部位的数量和/或骨髓受累来评估，大体上如上所述。

在一些方面，根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物的施用通常降低或预防所述受试者中所述疾病或病症的扩大或负担。例如，在疾病或病症是肿瘤的情况下，所述方法通常降低肿瘤大小、体积、转移、骨髓中原始细胞的百分比或可分子检测的癌症，和/或改善预后或存活或与肿瘤负担相关的其他症状。

疾病负担可以涵盖受试者体内或受试者的器官、组织或体液(如肿瘤的器官或组织或例如可指示转移的另一位置)中疾病细胞的总数。例如，可以在某些血液恶性肿瘤环境中在血液或骨髓中检测和/或定量肿瘤细胞。在一些实施方案中，疾病负担可包括肿瘤的质量、转移的数量或程度和/或骨髓中存在的原始细胞的百分比。

在一些方面，通过流式细胞术检测最小残留病(MRD)。可以使用流式细胞术监测骨髓和外周血样品中的癌细胞。在特定方面，使用流式细胞术检测或监测骨髓中癌细胞的存在。在一些方面，使用通过流式细胞术进行的多参数免疫学检测来检测癌细胞(参见例如，Coustan-Smith等人,(1998)Lancet 351:550-554)。在一些方面，使用通过质谱流式细胞技术进行的多参数免疫学检测来检测癌细胞。在一些例子中，可以使用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45或50个参数来检测癌细胞。用于检测的抗原是基于所检测的癌症选择的(Foon和Todd(1986)Blood 68:1-31)。

在一些例子中，通过骨髓抽吸物或骨髓活检收获骨髓，并分离淋巴细胞用于分析。可以使用与荧光染料(例如，异硫氰酸荧光素(FITC)、藻红蛋白、多甲藻素叶绿素蛋白或生物素)缀合的单克隆和/或多克隆抗体检测分离的淋巴细胞上的表位，如末端脱氧核苷酸基转移酶(TdT)、CD3、CD10、CD11c、CD13、CD14、CD33、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD34、CD45、CD56、CD79b、IgM和/或KORSA3544。然后可以使用流式细胞术(如多参数流式细胞术或质谱流式细胞术)来检测标记的细胞，以检测多个表位。

可以基于光散射点图鉴定和门控淋巴细胞，然后进行二次门控以鉴定表达目的免疫表型特征的细胞群体。示例性表位显示于下表2中。白血病和淋巴瘤的其他免疫学分类提供于Foon和Todd(Blood(1986)68(1):1-31)中。在一些方面，MRD的流式细胞术评估可以通过对带有一种或多种CLL免疫表型(例如，低前向/侧向散射；CD3^-；CD5⁺；CD14^-；CD19⁺；CD23⁺；CD45⁺；CD56^-)的活性淋巴细胞进行定量来实现。

在一些方面，可以使用所收获的B细胞免疫球蛋白重链(IGH)基因座的深度测序来检测微小残留病(MRD)。特定IgG重排的克隆存在可以提供标记物以检测B细胞恶性肿瘤(如CLL或NHL)的存在和/或其恶性细胞的残留存在。在一些方面，从血液收获并分离细胞，如含有或怀疑含有B细胞的群体。在一些方面，从骨髓(例如从骨髓抽吸物或骨髓活检)和/或从其他生物样品收获并分离细胞。在一些方面，使用针对基因座的V区和J区内的高度保守序列的引物实现互补决定区3(CDR3)的聚合酶链式反应(PCR)扩增，其可用于鉴定细胞的克隆群体，用于评估微小残留病的目的。可以使用用于检测克隆群体的其他方法，如单细胞测序法，包括提供关于特定谱系的和/或表达特定可变链(如可变重链或其结合位点)的细胞(如克隆群体)的数量信息的那些方法。在一些方面，使用简并引物或识别不同细胞克隆之间共有的可变链区的引物(如识别IGH序列的共有V区和简并共有J区的那些引物)扩增IGH DNA。V区的示例性序列是ACACGGCCTCGTGTATTACTGT(SEQ ID NO:57)。J区的示例性简并共有序列是ACCTGAGGAGACGGTGACC(SEQ ID NO:58)。

在一些方面，PCR产物或测序结果是重排的等位基因特有的，并且用作MRD检测的克隆标记物。在CDR3区域的PCR扩增之后，可以对PCR产物进行测序以产生患者特异性寡核苷酸，所述患者特异性寡核苷酸被构建为等位基因特异性PCR的探针，用于灵敏地检测在用CAR-T细胞疗法(例如CD19 CAR-T细胞疗法)治疗B细胞恶性肿瘤后的MRD。在不使用共有引物产生PCR产物的例子中，可以替代地使用框架区1的V区家族特异性引物。

在一些方面，在治疗后可PCR检测的肿瘤细胞(如B细胞恶性肿瘤(如NHL或CLL)的细胞，如对应于恶性或克隆IGH序列的可检测IGH序列)的持久性与增加的复发风险相关。在一些方面，与具有持续恶性IGH序列的患者相比，治疗后恶性IGH序列呈阴性的患者(在一些方面，即使在其他标准指示疾病进展或仅部分反应(如淋巴结增大的持久性)的情况下或在一些情况下其他标准可能与疾病或缺乏完全反应相关)可能被认为具有增加的PFS可能性或进入CR或持久CR或延长的存活。在一些实施方案中，例如与其他临床症状(如淋巴结大小)或其他分期标准的消退相比，这种预后和分期确定与在施用所述疗法后的短时间段内观察到恶性细胞清除的治疗特别相关。例如，在一些此类方面，如与其他可用分期或预后方法相比，样品(如骨髓)中可检测IGH或微小残留病的不存在可以是反应或反应可能性或其持久性的优选读数。在一些方面，来自MRD的结果，例如IGH深度测序信息，可以告知进一步干预或其缺乏。例如，所述方法和其他所提供的实施方案在一些背景下提供，被认为恶性IGH呈阴性的受试者在一些方面可以不进行进一步治疗或不被进一步施用所提供疗法的剂量，或者向所述受试者施用较低的或减少的剂量。相反，可以提供或指定经由IGH深度测序展现出MRD的受试者被进一步治疗，例如采用最初以相似或更高剂量施用的疗法或采用进一步治疗。在一些方面，疾病或病症在施用第一剂量后持续存在，和/或施用第一剂量不足以根除受试者中的疾病或病症。

在一些实施方案中，如与通过可比较方法使用替代性给药方案(如其中所述受试者接受一种或多种替代性治疗剂的方法和/或其中所述受试者不根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物接受细胞剂量和/或淋巴细胞清除剂的方法)会观察到的降低相比，所述方法降低疾病或病症的负担(例如，肿瘤细胞数、肿瘤大小、患者存活或无事件存活的持续时间)至更大程度和/或持续更长时间段。在一些实施方案中，检测、评估或测量受试者中疾病或病症的负担。在一些方面，可以通过检测受试者中或受试者的器官、组织或体液(如血液或血清)中的疾病细胞或疾病相关细胞(例如肿瘤细胞)的总数来检测疾病负担。在一些方面，评估受试者的存活、特定时间段内的存活、存活程度、无事件或无症状存活的存在或持续时间或无复发存活。在一些实施方案中，评估疾病或病症的任何症状。在一些实施方案中，规定疾病或病症负担的量度。

在一些实施方案中，如与其他方法(例如，其中受试者接受一种或多种替代性治疗剂的方法，和/或其中受试者不根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物接受细胞的剂量和/或淋巴细胞清除剂的方法)相比，所述方法改进所述受试者的无事件存活率或总体存活率。例如，在一些实施方案中，通过所述方法治疗的受试者在所述剂量后6个月时的无事件存活率或概率大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％或大于约95％。在一些方面，总体存活率大于约40％、大于约50％、大于约60％、大于约70％、大于约80％、大于约90％或大于约95％。在一些实施方案中，用所述方法治疗的受试者表现出无事件存活、无复发存活或存活到至少6个月，或至少1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年或10年。在一些实施方案中，至进展时间得以改进，如至进展时间大于或大于约6个月，或至少1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年或10年。

在一些实施方案中，如与其他方法(例如，其中所述受试者接受一种或多种替代性治疗剂的方法和/或其中所述受试者不根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物接受细胞和/或淋巴细胞清除剂的剂量的方法)相比，在通过所述方法治疗后，复发的概率降低。例如，在一些实施方案中，在第一剂量后6个月时复发的概率小于约80％、小于约70％、小于约60％、小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％或小于约10％。

在一些情况下，确定所施用细胞(例如，过继转移细胞)的药代动力学，以评估利用度，例如，所施用细胞的生物利用度。用于确定过继转移细胞的药代动力学的方法可以包括从已经被施用工程化细胞的受试者中抽取外周血，并确定所述外周血中所述工程化细胞的数量或比率。用于选择和/或分离细胞的方法可以包括使用嵌合抗原受体(CAR)特异性抗体(例如，Brentjens等人,Sci.Transl.Med.2013Mar；5(177):177ra38)蛋白L(Zheng等人,J.Transl.Med.2012Feb；10:29)，直接引入CAR中特异性位点中的表位标签如Strep-标签序列，其中Strep-标签的结合试剂用于直接评估CAR(Liu等人(2016)Nature Biotechnology,34:430；国际专利申请公开号WO 2015095895)以及与CAR多肽特异性地结合的单克隆抗体(参见国际专利申请公开号WO 2014190273)。在一些情况下，外在标记基因可以与工程化细胞疗法结合使用，以允许检测或选择细胞，并且在一些情况下也促进细胞自杀。在一些情况下，截短的表皮生长因子受体(EGFRt)可以与所转导细胞中目的转基因(CAR)共表达(参见例如，美国专利号8,802,374)。EGFRt可以含有抗体西妥昔单抗

或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以用于鉴定或选择已用EGFRt构建体和另一种重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达所述受体的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,Nature Biotech.2016年4月；34(4):430-434)。

在一些实施方案中，可以在施用所述细胞疗法后的时间段确定从患者获得的生物样品(例如，血液)中CAR⁺ T细胞的数量，例如，以确定所述细胞的药代动力学。在一些实施方案中，在所述受试者的血液中或在通过所述方法如此治疗的大多数受试者中可检测的CAR⁺ T细胞(任选地CAR⁺CD8⁺ T细胞和/或CAR⁺CD4⁺ T细胞)的数量是大于1个细胞/μL、大于5个细胞/μL或大于10个细胞/μL。

C.毒性

在一些实施方案中，例如，与施用替代性细胞疗法(如替代性CAR⁺ T细胞组合物)和/或细胞的替代性给药(例如，不以限定比率施用的细胞给药)相比，所提供方法被设计为或包括多个特征，所述特征导致较低比率和/或较低程度的毒性、毒性结果或症状、促进毒性的概况、因子或特性，如与细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性(NT)相关或指示细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性(NT)的症状或结果。可以根据美国移植和细胞治疗学会(American Society for Transplantation and Cellular Therapy，ASTCT)一致分级系统(参见例如，Lee等人Biol Blood Marrow Transplant.2019年4月；25(4):625-38)对细胞因子释放综合征(CRS)和神经毒性进行分级。

在一些方面，尽管作为本文所提供的方法的一部分施用的较低分化状态的工程化T细胞(例如，较高比例的具有幼稚样或中央记忆表型(如选自CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺或CD62L^-CCR7⁺的表型)的工程化T细胞)预计比分化程度更高的细胞更具活性，这些发现表明可以成功地管理细胞疗法的安全性。在一些方面，例如与通过其中细胞较多分化的过程(如包括细胞的扩增的过程)产生的细胞组合物相比，提供较低剂量的所述组合物实现稳健的功效和高安全性。在一些方面，发现可以施用甚至更高剂量的所提供的抗BCMA CAR组合物的细胞，同时维持较低程度的毒性(如严重的细胞因子释放综合征(CRS)或严重的神经毒性)。因此，与包括施用替代性细胞疗法(如具有比本文所施用的那些分化程度更高的工程化T细胞的替代性CAR⁺ T细胞组合物)的方法相比，所提供的方法在一些实施方案中包括施用更高剂量的工程化T细胞(例如，大于50×10⁶个CAR表达T细胞，如为或约100×10⁶个CAR表达T细胞)。

在一些实施方案中，如与某些其他细胞疗法相比，所提供的方法不导致高比率或可能性的毒性或毒性结局，或者降低毒性或毒性结局(如神经毒性(NT)、细胞因子释放综合征(CRS))的比率或可能性。在一些实施方案中，所述方法不导致以下事件或不增加以下事件的风险：重度NT(sNT)、重度CRS(sCRS)、巨噬细胞激活综合征、肿瘤溶解综合征、至少或至少约38摄氏度发热三天或更多天、以及至少或至少约20mg/dL的CRP血浆水平。在一些实施方案中，大于或大于约30％、35％、40％、50％、55％、60％或更多的根据所提供方法治疗的受试者不展现任何级别的CRS或任何级别的神经毒性。在一些实施方案中，不超过50％的所治疗受试者(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的所治疗受试者)展现高于2级的细胞因子释放综合征(CRS)和/或高于2级的神经毒性。在一些实施方案中，至少50％的根据所述方法治疗的受试者(例如至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更多的所治疗受试者)未展现出重度毒性结局(例如重度CRS或重度神经毒性)，如未展现出3级或更高分级的神经毒性和/或未展现出重度CRS，或者在治疗后某一时间段内(如在施用所述细胞的一周、两周或一个月内)未展现出上述情况。在一些实施方案中，被评估以确定某些毒性的参数包括不良事件(AE)、剂量限制性毒性(DLT)、CRS和NT。

施用过继T细胞疗法如用表达嵌合抗原受体的T细胞进行的治疗可以诱导毒性作用或结局，如细胞因子释放综合征和神经毒性。在一些例子中，此类效果或结局与高水平的循环细胞因子并行，高水平的循环细胞因子可能是观察到的毒性的基础。

在一些方面，毒性结局是细胞因子释放综合征(CRS)或重度CRS(sCRS)，或与细胞因子释放综合征(CRS)或重度CRS(sCRS)相关，或指示细胞因子释放综合征(CRS)或重度CRS(sCRS)。在一些情况下，在过继T细胞疗法和向受试者施用其他生物制品后可发生CRS，例如sCRS。参见Davila等人,Sci Transl Med 6,224ra25(2014)；Brentjens等人,Sci.Transl.Med.5,177ra38(2013)；Grupp等人,N.Engl.J.Med.368,1509-1518(2013)；和Kochenderfer等人,Blood 119,2709-2720(2012)；Xu等人,Cancer Letters 343(2014)172-78。

通常，CRS由例如通过T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和/或巨噬细胞介导的过度的全身免疫应答引起。此类细胞可以释放大量炎性介质，如细胞因子和趋化因子。细胞因子可能引发急性炎症应答和/或诱导内皮器官损伤，所述内皮器官损伤可能导致微血管渗漏、心力衰竭或死亡。重度的危及生命的CRS可能导致肺浸润和肺损伤、肾衰竭或弥散性血管内凝血。其他重度的危及生命的毒性可以包括心脏毒性、呼吸窘迫、神经毒性和/或肝衰竭。在一些方面，发热、特别是高热(≥38.5℃或≥101.3°F)与CRS或其风险相关。在一些情况下，CRS的特征或症状类似于感染。在一些实施方案中，在呈现CRS症状的受试者中也考虑感染，并且可以施用通过培养监测和经验性抗生素疗法。与CRS相关的其他症状可以包括心功能障碍、成人呼吸窘迫综合征、肾和/或肝衰竭、凝血障碍、弥散性血管内凝血和毛细血管渗漏综合征。

可以使用抗炎疗法(如抗IL-6疗法，例如，抗IL-6抗体，例如，托珠单抗)或抗生素或如所述的其他药剂治疗CRS。CRS的结局、体征和症状是已知的，并且包括本文所述的那些。在一些实施方案中，在特定剂量方案或施用实现或不实现给定的CRS相关结局、体征或症状的情况下，可以指定特定结局、体征和症状和/或其量或程度。

在施用CAR表达细胞的情况下，CRS通常在输注表达CAR的细胞后6-20天时发生。参见Xu等人,Cancer Letters 343(2014)172-78。在一些情况下，CRS在CAR T细胞输注后少于6天或超过20天时发生。CRS的发生率和时机可能与在输注时的基线细胞因子水平或肿瘤负担有关。通常，CRS包括干扰素(IFN)-γ、肿瘤坏死因子(TNF)-α和/或白介素(IL)-2的血清水平升高。可在CRS中快速诱导的其他细胞因子是IL-1β、IL-6、IL-8和IL-10。

与CRS相关的示例性结局包括发热、僵直、寒战、低血压、呼吸困难、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑病、ALT/AST升高、肾衰竭、心脏病、缺氧、神经紊乱和死亡。神经系统并发症包括谵妄、癫痫发作样活动、意识错乱、找词困难、失语和/或变得迟钝。与CRS相关的其他结局包括疲劳、恶心、头痛、癫痫发作、心动过速、肌痛、皮疹、急性血管渗漏综合征、肝功能损害和肾衰竭。在一些方面，CRS与一种或多种因子(如血清铁蛋白、d-二聚体、氨基转移酶、乳酸脱氢酶和甘油三酯)的增加相关，或与低纤维蛋白原血或肝脾肿大相关。与CRS相关的其他示例性体征或症状包括血流动力学不稳定、发热型嗜中性粒细胞减少症、血清C反应蛋白(CRP)增加、凝血参数(例如，国际标准化比率(INR)、凝血酶原时间(PTI)和/或纤维蛋白原)变化、心脏和其他器官功能的变化、和/或绝对嗜中性粒细胞计数(ANC)。

在一些实施方案中，与CRS相关的结局包括以下中的一种或多种：持续发热，例如指定温度(例如大于或大于约38摄氏度)的发热持续两天或更多天，例如三天或更多天，例如四天或更多天或持续至少连续三天；大于或大于约38摄氏度的发热；细胞因子的升高，如至少两种细胞因子(例如，由以下组成的组中的至少两种：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子(fracktalkine)和IL-5和/或肿瘤坏死因子α(TNFα))与治疗前水平相比例如至少或至少约75倍的最大倍数变化，或此类细胞因子中至少一种的例如至少或至少约250倍的最大倍数变化；和/或至少一种毒性临床体征，如低血压(例如，如通过至少一种静脉内血管活性加压药所测量)；缺氧(例如，血浆氧(PO₂)水平低于或低于约90％)；和/或一种或多种神经病学障碍(包括精神状态变化、迟钝和癫痫发作)。在一些实施方案中，可以与CRS同时观察到神经毒性(NT)。

示例性CRS相关结局包括增加的或高的一种或多种因子(包括细胞因子和趋化因子和与CRS相关的其他因子)的血清水平。示例性结局进一步包括一种或多种此类因子的合成或分泌的增加。这种合成或分泌可以由T细胞或与T细胞相互作用的细胞(如先天免疫细胞或B细胞)进行。

在一些实施方案中，CRS相关的血清因子或CRS相关的结局包括炎性细胞因子和/或趋化因子，包括干扰素γ(IFN-γ)、TNF-a、IL-1β、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、sIL-2Ra、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1、肿瘤坏死因子α(TNFα)、IL-6和IL-10、IL-1β、IL-8、IL-2、MIP-1、Flt-3L、分形趋化因子和/或IL-5。在一些实施方案中，所述因子或结局包括C反应蛋白(CRP)。除了作为CRS的早期且易于测量的风险因子外，CRP也是细胞扩增的标记物。在一些实施方案中，被测量为具有高CRP水平(如≥15mg/dL)的受试者患有CRS。在一些实施方案中，被测量为具有高CRP水平的受试者未患CRS。在一些实施方案中，CRS的量度包括CRP的量度和指示CRS的另一因子。

在一些实施方案中，在CAR治疗之前、期间或之后监测一种或多种炎性细胞因子或趋化因子。在一些方面中，一种或多种细胞因子或趋化因子包括IFN-γ、TNF-α、IL-2、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、sIL-2Rα、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或巨噬细胞炎性蛋白(MIP)。在一些实施方案中，监测IFN-γ、TNF-α和IL-6。

已经研发出CRS标准，其显现出与CRS的发作相关联，以预测哪些患者更可能有发生sCRS的风险(参见Davilla等人Science translational medicine.2014；6(224):224ra25)。因素包括发热、缺氧、低血压、神经系统改变、升高的炎性细胞因子的血清水平，所述炎性细胞因子如一组七种细胞因子(IFNγ、IL-5、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和GM-CSF)，它们的治疗诱导的升高可能与治疗前肿瘤负担和sCRS症状二者密切相关。关于CRS的诊断和管理的其他指南是已知的(参见例如，Lee等人,Blood.2014；124(2):188-95；Lee等人,Biol Blood Marrow Transplant 2019；25(4):625-38)。在一些实施方案中，反映CRS级别的标准是下表3中详述的那些。

在一些实施方案中，反映CRS级别的标准是下表4中详述的那些。

在一些实施方案中，高剂量血管加压药疗法包括下表5中所述的那些。

在一些实施方案中，毒性结果是严重CRS。在一些实施方案中，毒性结果是严重CRS的不存在(例如中度或轻度CRS)。在一些实施方案中，如果在施用后受试者展示以下各项，则认为所述受试者响应于或继发于细胞疗法或其细胞剂量的施用而发生“严重CRS”(“sCRS”)：(1)至少38摄氏度发热持续至少三天；(2)细胞因子升高，其包括(a)与刚刚施用后的水平相比，以下七种细胞因子的组中至少两种的至少75倍的最大倍数变化：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和IL-5，和/或(b)与刚刚施用后的水平相比，以下七种细胞因子的组中至少一种的至少250倍的最大倍数变化：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和IL-5；和(c)至少一种毒性临床体征，如低血压(需要至少一种静脉内血管作用加压药)或缺氧(PO₂<90％)或一种或多种神经病学障碍(包括精神状态变化、迟钝和/或癫痫发作)。在一些实施方案中，严重CRS包括3级或更高级CRS，如表3和表4中所示。

在一些实施方案中，毒性结果(例如，CRS相关结果)的水平(例如CRS指示物的血清水平)是通过ELISA测量。在一些实施方案中，可以测量发热和/或C反应蛋白(CRP)的水平。在一些实施方案中，患有发热且CRP≥15mg/dL的受试者可以被认为具有发生严重CRS的高风险。在一些实施方案中，CRS相关血清因子或CRS相关结果包括炎性细胞因子和/或趋化因子的水平和/或浓度的增加，所述炎性细胞因子和/或趋化因子包括Flt-3L、分形趋化因子、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素-1β(IL-1β)、IL-2、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、干扰素γ(IFN-γ)、巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1、MIP-1、sIL-2Rα或肿瘤坏死因子α(TNFα)。在一些实施方案中，所述因子或结局包括C反应蛋白(CRP)。除了作为CRS的早期且易于测量的风险因子外，CRP也是细胞扩增的标记物。在一些实施方案中，被测量为具有高CRP水平(如≥15mg/dL)的受试者患有CRS。在一些实施方案中，被测量为具有高CRP水平的受试者未患CRS。在一些实施方案中，CRS的量度包括CRP的量度和指示CRS的另一因子。

在一些实施方案中，与严重CRS或3级CRS或更高级CRS(如4级或更高级)相关的结果包括以下中的一种或多种：持续发热，例如指定温度(例如，高于或高于约38摄氏度)的发热持续两天或更多天，例如三天或更多天，例如四天或更多天或持续至少连续三天；高于或高于约38摄氏度的发热；细胞因子的升高，如至少两种细胞因子(例如，由以下组成的组中的至少两种：干扰素γ(IFNγ)、GM-CSF、IL-6、IL-10、Flt-3L、分形趋化因子和IL-5和/或肿瘤坏死因子α(TNFα))与治疗前水平相比的最大倍数变化(例如至少或至少约75倍)，或此类细胞因子中至少一种的最大倍数变化(例如至少或至少约250倍)；和/或至少一种毒性临床体征，如低血压(例如，如通过至少一种静脉内血管作用加压药所测量)；缺氧(例如，血浆氧(PO₂)水平低于或低于约90％)；和/或一种或多种神经病学障碍(包括精神状态变化、迟钝和癫痫发作)。在一些实施方案中，重度CRS包括需要在重症监护病房(ICU)中进行管理或护理的CRS。

在一些实施方案中，CRS(如重度CRS)包括以下的组合：(1)持续发热(至少38摄氏度的发热至少三天)和(2)CRP的血清水平为至少或至少约20mg/dL。在一些实施方案中，所述CRS涵盖需要使用两种或更多种血管加压药的低血压或需要机械通气的呼吸衰竭。在一些实施方案中，在第二次或后续施用中增加血管加压药的剂量。

在一些实施方案中，重度CRS或3级CRS涵盖丙氨酸氨基转移酶的增加、天冬氨酸氨基转移酶的增加、寒战、发热性嗜中性粒细胞减少症、头痛、左心室功能不全、脑病、脑积水和/或震颤。

可以指定测量或检测各种结局的方法。

在一些方面，毒性结局是神经毒性或与神经毒性相关。在一些实施方案中，与神经毒性的临床风险相关的症状包括意识错乱、谵妄、失语、表达性失语、迟钝、肌阵挛、嗜睡、精神状态改变、惊厥、癫痫样活动、癫痫发作(任选地如通过脑电图(EEG)证实)、升高的β淀粉样蛋白(Aβ)水平，升高的谷氨酸水平和升高的氧自由基水平。在一些实施方案中，基于严重程度对神经毒性进行分级(例如，使用1-5级量表(参见例如，Guido Cavaletti和PaolaMarmiroli Nature Reviews Neurology 6,657-666(2010年12月)；美国国家癌症研究所—常见毒性标准第4.03版(NCI-CTCAE v4.03))。

在一些情形中，神经症状可能是sCRS的最早症状。在一些实施方案中，观察到神经病学症状在细胞疗法输注后5至7天开始。在一些实施方案中，神经病学变化的持续时间可能在3至19天的范围内。在一些情况下，神经病学变化的恢复是在sCRS的其他症状消退后发生。在一些实施方案中，用抗IL-6和/或一种或多种类固醇治疗不会加速神经病学变化消退的时间或程度。

在一些实施方案中，认为受试者响应于或继发于细胞疗法或其细胞剂量的施用而发生“重度神经毒性”，条件是在施用后所述受试者展示以下中的限制自理(例如洗澡、穿衣和脱衣、进食、如厕、服药)的症状：1)外周运动神经病的症状，包括外周运动神经的炎症或退化；2)外周感觉神经病的症状，包括外周感觉神经的炎症或退化、感觉迟钝(如感官知觉失真，导致异常和不适感)、神经痛(如沿神经或神经组的剧烈疼痛感)，和/或感觉异常(如感觉神经元的功能紊乱，导致在没有刺激物的情况下刺痛、麻木、压迫、冷和温的异常皮肤感觉)。在一些实施方案中，重度神经毒性包括3级或更高分级神经毒性，如表6所示。

在一些实施方案中，与其他方法相比，所述方法减轻与CRS或神经毒性相关的症状。在一些方面，与其他方法相比，所提供的方法减轻与CRS相关的症状、结局或因素，包括与重度CRS或3级或更高分级的CRS相关的症状、结局或因素。例如，根据本方法治疗的受试者可能缺少可检测的CRS(例如，严重CRS或3级或更高级别的CRS)的症状、结果或因素和/或具有减少的所述症状、结果或因素，如所述的(例如表3和表4中所示的)任何症状、结果或因素。在一些实施方案中，与通过其他方法治疗的受试者相比，根据本方法治疗的受试者可能具有减轻的神经毒性症状，如四肢无力或麻木、记忆、视力和/或智力受损、无法控制的强迫性和/或强制性行为、妄想、头痛、认知和行为问题(包括丧失运动控制、认知退化和自主神经系统功能障碍)以及性功能障碍。在一些实施方案中，根据本方法治疗的受试者可具有减轻的与外周运动神经病、外周感觉神经病、感觉迟钝、神经痛或感觉异常相关的症状。

在一些实施方案中，所述方法减轻与神经毒性相关的结局，包括对神经系统和/或脑的损伤，如神经元的死亡。在一些方面，所述方法降低与神经毒性相关的因子(如β淀粉样蛋白(Aβ)、谷氨酸和氧自由基)的水平。

在一些实施方案中，所述毒性结局是剂量限制性毒性(DLT)。在一些实施方案中，所述毒性结局是剂量限制性毒性。在一些实施方案中，毒性结局是剂量限制性毒性的不存在。在一些实施方案中，剂量限制性毒性(DLT)被定义为任何3级或更高分级的毒性，如通过任何已知或公开的用于评估特定毒性的指南所评估，如上述任何指南并且包括国家癌症研究所(NCI)的不良事件通用术语标准(Common Terminology Criteria for AdverseEvents，CTCAE)4.0版。

在一些实施方案中，通过根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物施用一定剂量的T细胞观察到的发生毒性(例如，CRS或神经毒性或重度CRS或神经毒性，例如，3级或更高分级的CRS或神经毒性)的低比率、风险或可能性允许在门诊基础上施用所述细胞疗法。在一些实施方案中，根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物施用所述细胞疗法(例如，T细胞(例如，CAR+ T细胞)的剂量)是在门诊基础上进行，或者不需要使受试者入院，如需要过夜停留的入院。

在一些方面，被根据所提供方法和/或用所提供制品或组合物施用所述细胞疗法(例如，T细胞(例如，CAR+ T细胞)的剂量)的受试者(包括在门诊基础上治疗的受试者)没有在施用所述细胞剂量之前或与其同时被施用用于治疗任何毒性的干预，除非或直到所述受试者展现毒性(如神经毒性或CRS)的体征或症状。用于治疗、延迟、减弱或改善毒性的示例性药剂描述于章节I-C中。

在一些实施方案中，如果被给予所述细胞疗法(例如，T细胞(例如，CAR⁺ T细胞)的剂量)的受试者(包括在门诊基础上治疗的受试者)展现发热，则给予所述受试者治疗或指示所述受试者接受或给予治疗，以减轻发热。在一些实施方案中，将所述受试者的发热表征为所述受试者的体温等于或高于某一阈值温度或水平(或在所述阈值温度或水平下测量)。在一些方面，所述阈值温度是与至少低度发热、与至少中度发热和/或与至少高度发热相关的温度。在一些实施方案中，所述阈值温度是特定的温度或范围。例如，所述阈值温度可以是为或约或至少或至少约38、39、40、41或42摄氏度，和/或可以是为或约38摄氏度至为或约39摄氏度的范围、为或约39摄氏度至为或约40摄氏度的范围、为或约40摄氏度至为或约41度的范围、或为或约41摄氏度至为或约42摄氏度的范围。

在一些实施方案中，被设计为减轻发热的治疗包括用退热药治疗。退热药可以包括减轻发热的任何药剂，例如，化合物、组合物或成分，如已知具有退热作用的任何数量的药剂中的一种，如NSAID(如布洛芬、萘普生、酮洛芬和尼美舒利)、水杨酸盐(如阿司匹林、水杨酸胆碱、水杨酸镁和水杨酸钠)、扑热息痛、醋氨酚、安替比林甲胺甲烷、萘丁美酮、非那宗(Phenaxone)、安替比林、退烧药。在一些实施方案中，所述退热药是对乙酰氨基酚。在一些实施方案中，可以长达每四小时以12.5mg/kg的剂量口服或静脉内施用对乙酰氨基酚。在一些实施方案中，所述退热药是或包含布洛芬或阿司匹林。

在一些实施方案中，如果发热是持续发热，则向受试者施用替代性治疗以治疗毒性，如章节I-C中所述的任一种。对于在门诊基础上治疗的受试者，如果受试者患有持续发热和/或被确定为患有持续发热或将要持续发热，则指示受试者返回医院。在一些实施方案中，如果受试者展现等于或高于相关阈值温度的发热，并且在指定治疗(如被设计为减轻发热的治疗，如使用退热药(例如，NSAID或水杨酸盐，例如，布洛芬、对乙酰氨基酚或阿司匹林)的治疗)后，受试者的发热或体温不下降，或者不下降指定量或超过指定量(例如，超过1℃，并且通常不会变动约或超过约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃)的情况下，所述受试者已经和/或被确定为或认为患有持续发热。例如，如果所述受试者展现或被确定为展现至少或至少约38或39摄氏度的发热，所述发热即使在用诸如对乙酰氨基酚的退热药治疗后，在6小时时间段中、在8小时时间段中、或在12小时时间段中、或在24小时时间段中，没有降低或没有降低超过或超过约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃，或降低或降低约1％、2％、3％、4％或5％，则受试者被认为患有持续发热。在一些实施方案中，所述退热药的剂量是通常在这种受试者中有效减轻发热或特定类型的发热的剂量，所述特定类型的发热如与细菌或病毒感染(例如，局部或全身感染)相关的发热。

在一些实施方案中，如果受试者展现等于或高于相关阈值温度的发热，并且在受试者的发热或体温没有变动约或超过约1℃，并且通常没有变动约或超过约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃的情况下，所述受试者已经患有和/或被确定为或认为患有持续发热。通常，高于或等于某一量的变动的这种不存在是在给定的时间段内测量(如，在24小时、12小时、8小时、6小时、3小时或1小时的时间段内，其可以从发烧的最初体征或最初高于所指示阈值的温度起测量)。例如，在一些实施方案中，如果受试者展现至少或至少约38或39摄氏度的发热，所述发热的温度在6小时时间段内、8小时时间段内、或12小时时间段内、或24小时时间段内没有变动超过或超约0.5℃、0.4℃、0.3℃或0.2℃，则所述受试者被认为或被确定为展现持续发热。

在一些实施方案中，所述发热是持续发热；在一些方面，有可能诱导所述毒性的初始疗法(如所述细胞疗法，如T细胞(例如CAR+ T细胞)的剂量)后，在已经确定受试者患有持续发热时，如在这种确定或首次这种确定的1、2、3、4、5、6小时或更短时间内，治疗所述受试者。

在一些实施方案中，在例如，如根据任何前述实施方案所测量，在确定或确认(如首次确定或确认)所述受试者展现出持续发热时或此前不久的时间，施用用于治疗所述毒性的一种或多种干预或药剂(如靶向毒性的疗法)。在一些实施方案中，在这种确认或确定的某一时间段内，如在这种确认或确定的30分钟、1小时、2小时、3小时、4小时、6小时或8小时内，施用所述一种或多种靶向毒性的疗法。

II.细胞疗法和工程化细胞

在一些实施方案中，本文所公开的细胞疗法(例如，T细胞疗法)方法包括施用表达重组受体(例如CAR)的工程化的细胞，所述重组受体设计为识别和/或特异性结合至与疾病或病症(如r/r/B细胞NHL)相关的抗原。在特定实施方案中，由重组受体(例如CAR)结合或识别的抗原是CD19。在一些实施方案中，与所述抗原的结合导致反应，如针对这样的抗原的免疫应答。在一些实施方案中，所述细胞含有或被工程化为含有重组受体，如嵌合抗原受体(CAR)。重组受体如CAR通常包含与一个或多个细胞内信号传导组分连接(在一些方面经由接头和/或一个或多个跨膜结构域)的对所述抗原具有特异性的胞外抗原(或配体)结合结构域。在一些方面，工程化的细胞作为适合于施用至受试者、如适合于过继细胞疗法的药物组合物和配制品来提供。还提供用于将细胞和组合物施用至受试者例如患者的治疗方法。

在一些实施方案中，所述细胞包括经由基因工程引入的一种或多种核酸，从而表达此类核酸的重组或基因工程化产物。在一些实施方案中，通过以下方式完成基因转移：首先刺激细胞，如通过将其与诱导反应(如增殖、存活和/或激活)的刺激物进行组合，例如如通过细胞因子或激活标记物的表达测量的，然后转导激活的细胞，并且在培养中扩增至足以用于临床应用的数量。

A.嵌合抗原受体

在所提供的方法和用途的一些实施方案中，所述工程化细胞(如T细胞)表达嵌合受体(如嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合受体含有一个或多个结构域，所述一个或多个结构域使提供针对所期望抗原(例如肿瘤抗原)的特异性的配体结合结构域(例如抗体或抗体片段)与细胞内信号传导结构域组合。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域是激活性细胞内结构域部分，如T细胞激活结构域，从而提供初级激活信号。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域含有或另外含有共刺激信号传导结构域以促进效应子功能。在与分子例如抗原特异性结合后，受体通常将免疫刺激信号(如ITAM转导的信号)递送到细胞中，从而促进靶向所述疾病或病症的免疫应答。在一些实施方案中，嵌合受体在被基因工程化至免疫细胞中时，可以调节T细胞活性，并且在一些情况下可以调节T细胞分化或稳态，由此产生在体内具有改善的寿命、存活和/或持久性的基因工程化细胞，如用于过继细胞治疗方法。

示例性抗原受体(包括CAR)以及将此类抗原受体工程化并引入细胞中的方法包括例如以下文献中所述的那些：国际专利申请公开号WO 200014257、WO 2013126726、WO2012/129514、WO 2014031687、WO 2013/166321、WO 2013/071154、WO 2013/123061，美国专利申请公开号US 2002131960、US 2013287748、US 20130149337，美国专利号6,451,995、7,446,190、8,252,592、8,339,645、8,398,282、7,446,179、6,410,319、7,070,995、7,265,209、7,354,762、7,446,191、8,324,353和8,479,118，以及欧洲专利申请号EP2537416；和/或以下文献中所述的那些：Sadelain等人,Cancer Discov.2013年4月；3(4):388-398；Davila等人(2013)PLoS ONE 8(4):e61338；Turtle等人,Curr.Opin.Immunol.,2012年10月；24(5):633-39；Wu等人,Cancer,2012年3月18(2):160-75。在一些方面，抗原受体包括如美国专利号7,446,190中描述的CAR，以及国际专利申请公开号WO/2014055668A1中描述的那些。CAR的例子包括如在任何上述出版物中披露的CAR，所述出版物例如WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190、美国专利号8,389,282；Kochenderfer等人,2013,Nature Reviews Clinical Oncology,10,267-276(2013)；Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；和Brentjens等人,Sci TranslMed.2013 5(177)。还参见WO 2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、美国专利号7,446,190和美国专利号8,389,282。

在一些实施方案中，工程化的细胞(如T细胞)表达对特定抗原(或标记物或配体)(如在特定细胞类型的表面上表达的抗原)具有特异性的重组受体(如嵌合抗原受体(CAR))。在一些实施方案中，受体所靶向的抗原是多肽。在一些实施方案中，其是碳水化合物或其他分子。在一些实施方案中，与正常或非靶标细胞或组织相比，抗原在疾病或病症的细胞(例如，肿瘤或病原细胞)上选择性表达或过表达。在其他实施方案中，抗原在正常细胞上表达和/或在工程化细胞上表达。

在一些实施方案中，受体靶向的抗原包括与B细胞恶性肿瘤相关的抗原，如许多已知B细胞标记物中的任何一种。在一些实施方案中，受体靶向的抗原是CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b或CD30。在特定方面，所述抗原是CD19。在一些实施方案中，任何这样的抗原是在人B细胞上表达的抗原。

嵌合受体(如CAR)通常包括胞外抗原结合结构域，其是抗体分子的一个或多个抗原结合部分。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是抗体分子的一部分，通常是所述抗体的可变重(V_H)链区和/或可变轻(V_L)链区，例如，scFv抗体片段。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域是单结构域抗体(sdAb)，如sdFv、纳米抗体、V_HH和V_NAR。在一些实施方案中，抗原结合片段包含通过柔性接头连接的抗体可变区。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段(例如scFv或V_H结构域)特异性识别抗原如CD19。在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段源自与CD19特异性结合的抗体或抗原结合片段或者是其变体。在一些实施方案中，所述抗原是CD19。在一些实施方案中，scFv含有源自对CD19具有特异性的抗体或抗体片段的V_H和V_L。在一些实施方案中，结合CD19的抗体或抗体片段是小鼠来源的抗体，如FMC63和SJ25C1。在一些实施方案中，抗体或抗体片段是人抗体，例如如美国专利公开号US 2016/0152723中所述。

在一些实施方案中，所述抗原结合结构域包括源自FMC63的V_H和/或V_L，其在一些方面可以是scFv。FMC63通常是指针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987).Leucocyte typing III.302)。在一些实施方案中，FMC63抗体包含SEQ ID NO:38和39分别所示的CDR-H1和CDR-H2，和SEQ ID NO:40或54所示的CDR-H3；以及SEQ ID NO:35所示的CDR-L1、SEQ ID NO:36或55所示的CDR-L2和SEQ IDNO:37或56所示的CDR-L3序列。在一些实施方案中，FMC63抗体包含含有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的重链可变区(V_H)和含有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的轻链可变区(V_L)。

在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:35的CDR-L1序列、SEQ ID NO:36的CDR-L2序列和SEQ ID NO:37的CDR-L3序列的可变轻链和/或含有SEQ ID NO:38的CDR-H1序列、SEQ ID NO:39的CDR-H2序列和SEQ ID NO:40的CDR-H3序列的可变重链，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的前述任一项的变体。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:41所示的FMC63可变重链区和SEQ ID NO:42所示的FMC63可变轻链区，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如SEQ ID NO:24所示。在一些实施方案中，scFv依次包含V_H、接头和V_L。在一些实施方案中，scFv依次包含V_L、接头和V_H。在一些实施方案中，scFv由SEQ ID NO:25所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:25展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列编码。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:43展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。

在一些实施方案中，所述抗原结合结构域包括源自SJ25C1的V_H和/或V_L，其在一些方面可以是scFv。SJ25C1是针对人来源的表达CD19的Nalm-1和Nalm-16细胞产生的小鼠单克隆IgG1抗体(Ling,N.R.等人(1987).Leucocyte typing III.302)。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含分别在SEQ ID NO:47-49所示的CDR-H1、CDR-H2和CDR-H3，以及分别在SEQID NO:44-46所示的CDR-L1、CDR-L2和CDR-L3。在一些实施方案中，SJ25C1抗体包含含有SEQID NO:50的氨基酸序列的重链可变区(V_H)和含有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的轻链可变区(V_L)。在一些实施方案中，scFv包含含有SEQ ID NO:44的CDR-L1序列、SEQ ID NO:45的CDR-L2序列和SEQ ID NO:46的CDR-L3序列的可变轻链和/或含有SEQ ID NO:47的CDR-H1序列、SEQ ID NO:48的CDR-H2序列和SEQ ID NO:49的CDR-H3序列的可变重链，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体。在一些实施方案中，scFv包含SEQ ID NO:50所示的SJ25C1可变重链区和SEQ ID NO:51所示的SJ25C1可变轻链区，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的任何前述项的变体。在一些实施方案中，可变重链和可变轻链通过接头连接。在一些实施方案中，接头如SEQ ID NO:52所示。在一些实施方案中，scFv依次包含V_H、接头和V_L。在一些实施方案中，scFv依次包含V_L、接头和V_H。在一些实施方案中，scFv包含SEQ IDNO:53所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:53展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的序列。

本文中的术语“抗体”在最广泛的意义上使用，并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab')₂片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、能够特异性结合抗原的可变重链(V_H)区、单链抗体片段(包括单链可变片段(scFv))以及单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体、V_HH或V_NAR)或片段。所述术语涵盖免疫球蛋白的基因工程化的和/或以其他方式修饰的形式，如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体、多特异性(例如，双特异性)抗体、双抗体、三抗体和四抗体、串联二-scFv、串联三-scFv。除非另有说明，否则术语“抗体”应当理解为涵盖其功能性抗体片段。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类(包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD)的抗体。在一些方面，CAR是双特异性CAR，例如含有两个具有不同特异性的抗原结合结构域。

在一些实施方案中，抗原结合蛋白、抗体及其抗原结合片段特异性地识别全长抗体的抗原。在一些实施方案中，抗体的重链和轻链可以是全长的或者可以是抗原结合部分(Fab、F(ab')2、Fv或单链Fv片段(scFv))。在其他实施方案中，所述抗体重链恒定区选自例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE，特别是选自例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，更特别是IgG1(例如，人IgG1)。在另一个实施方案中，所述抗体轻链恒定区选自例如κ或λ，特别是κ。

术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，在一些情况下是已知的，是指抗体可变区内的非连续氨基酸序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，在每个重链可变区中有三个CDR(CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)，并且在每个轻链可变区中有三个CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3)。“框架区”和“FR”是已知的，在一些情况下是指重链和轻链的可变区的非CDR部分。通常，在每个全长重链可变区中有四个FR(FR-H1、FR-H2、FR-H3和FR-H4)，并且在每个全长轻链可变区中有四个FR(FR-L1、FR-L2、FR-L3和FR-L4)。

给定CDR或FR的精确氨基酸序列边界可以使用许多熟知的方案中的任一种容易地确定，包括以下文献中所述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD(“Kabat”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“Chothia”编号方案)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.262:732-745(1996),“Antibody-antigen interactions:Contact analysis and binding site topography,”J.Mol.Biol.262,732-745”。(“Contact”编号方案)；Lefranc MP等人,“IMGT uniquenumbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Igsuperfamily V-like domains,”Dev Comp Immunol,2003年1月；27(1):55-77(“IMGT”编号方案)；Honegger A and Plückthun A,“Yet another numbering scheme forimmunoglobulin variable domains:an automatic modeling and analysis tool,”JMol Biol,2001年6月8号；309(3):657-70(“Aho”编号方案)；以及Martin等人,“Modelingantibody hypervariable loops:a combined algorithm,”PNAS,1989,86(23):9268-9272(“AbM”编号方案)。

给定CDR或FR的边界可能根据用于鉴定的方案而变化。例如，Kabat方案是基于结构比对，而Chothia方案是基于结构信息。Kabat和Chothia方案的编号都是基于最常见的抗体区域序列长度，其中通过插入字母(例如“30a”)提供插入，并且在一些抗体中出现缺失。这两种方案将某些插入和缺失(“插入缺失(indel)”)放置在不同的位置，从而产生不同的编号。Contact方案是基于对复杂晶体结构的分析，并且在许多方面与Chothia编号方案相似。AbM方案是Kabat与Chothia定义之间的折衷，是基于Oxford Molecular's AbM抗体建模软件使用的方案。

下表7列出了如分别通过Kabat、Chothia、AbM和Contact方案鉴定的CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3以及CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3的示例性位置边界。对于CDR-H1，使用Kabat和Chothia两种编号方案列出残基编号。FR位于CDR之间，例如，FR-L1位于CDR-L1之前，FR-L2位于CDR-L1与CDR-L2之间，FR-L3位于CDR-L2与CDR-L3之间，等等。应注意，因为所示的Kabat编号方案在H35A和H35B处放置插入，所以当使用所示的Kabat编号惯例进行编号时，Chothia CDR-H1环的末端根据环的长度在H32与H34之间变化。

表7.根据各种编号方案的CDR边界。

1-Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins of Immunological Interest,”第5版Public Health Service,National Institutes of Health,马里兰州贝塞斯达

2-Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948

因此，除非另有规定，否则应当理解给定抗体或其区域(如其可变区)的“CDR”或“互补决定区”或单独指定的CDR(例如，CDR-H1、CDR-H2、CDR-H3)涵盖如由任何前述方案或其他已知方案所定义的一个(或特定的)互补决定区。例如，在声明特定的CDR(例如，CDR-H3)含有给定V_H或V_L区氨基酸序列中的相应CDR的氨基酸序列的情况下，应理解，这种CDR具有在可变区内的相应CDR(例如，CDR-H3)的序列，如由任何前述方案或其他已知方案所定义的。在一些实施方案中，指定了特定的CDR序列。使用各种编号方案描述所提供抗体的示例性CDR序列，但应当理解，所提供抗体可以包括如根据任何其他上述编号方案或熟练技术人员已知的其他编号方案所描述的CDR。

同样，除非另有规定，否则给定抗体或其区域如其可变区的FR或单独指定的一个或多个FR(例如，FR-H1、FR-H2、FR-H3、FR-H4)应理解为涵盖如任何已知方案所定义的一个(或特定)框架区。在一些情形中，指定用于鉴定特定CDR、FR或多个特定FR或CDR的鉴定方案，如通过Kabat、Chothia、AbM或Contact方法或其他已知方案定义的CDR。在其他情况下，给出了CDR或FR的特定氨基酸序列。

术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变区(分别为V_H和V_L)通常具有相似的结构，其中每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单一V_H或V_L结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的V_H或V_L结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以分别筛选互补的V_L或V_H结构域的文库。参见例如Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。

所提供的抗体包括抗体片段。“抗体片段”是指不同于完整抗体的分子，其包含完整抗体中结合完整抗体所结合抗原的一部分。抗体片段的例子包括但不限于Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')₂；双抗体；线性抗体；可变重链(V_H)区、单链抗体分子(如scFv)和单结构域V_H单一抗体；和由抗体片段形成的多特异性抗体。在特定实施方案中，抗体是包含可变重链区和/或可变轻链区的单链抗体片段，诸如scFv。

术语“可变区”或“可变结构域”是指抗体重链或轻链中参与抗体与抗原的结合的结构域。天然抗体的重链和轻链的可变结构域(分别为V_H和V_L)通常具有相似的结构，每个结构域包含四个保守的框架区(FR)和三个CDR。(参见例如Kindt等人Kuby Immunology,第6版,W.H.Freeman and Co.,第91页(2007)。单一V_H或V_L结构域可能足以赋予抗原结合特异性。此外，可以使用来自结合抗原的抗体的V_H或V_L结构域分离结合所述特定抗原的抗体，以分别筛选互补的V_L或V_H结构域的文库。参见例如Portolano等人,J.Immunol.150:880-887(1993)；Clarkson等人,Nature 352:624-628(1991)。

单结构域抗体(sdAb)是包含抗体的重链可变结构域的全部或一部分或轻链可变结构域的全部或一部分的抗体片段。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体。在一些实施方案中，CAR包含特异性地结合抗原的抗体重链结构域，所述抗原例如癌症标记物或待靶向的细胞或疾病(例如肿瘤细胞或癌细胞)的细胞表面抗原，例如本文所述或已知的任何靶抗原。示例性的单结构域抗体包括sdFv、纳米抗体、V_HH或V_NAR。

抗体片段可以通过各种技术制备，包括但不限于完整抗体的蛋白水解消化以及通过重组宿主细胞产生。在一些实施方案中，所述抗体是重组产生的片段，如包含天然不存在的排列的片段(如具有通过合成接头(例如，肽接头)连接的两个或更多个抗体区或链的那些)，和/或可不通过酶消化天然存在的完整抗体产生的片段。在一些实施方案中，所述抗体片段是scFv。

“人源化”抗体是如下抗体，其中所有或基本上所有CDR氨基酸残基都衍生自非人CDR并且所有或基本上所有FR氨基酸残基都衍生自人FR。人源化抗体任选地可以包括源自人抗体的抗体恒定区的至少一部分。非人抗体的“人源化形式”是指非人抗体的变体，其已经经历人源化以通常降低对人的免疫原性，同时保留亲代非人抗体的特异性和亲和力。在一些实施方案中，人源化抗体中的一些FR残基被来自非人抗体(例如，CDR残基所来源的抗体)的相应残基取代，例如以恢复或改善抗体特异性或亲和力。

在一些方面，重组受体(例如嵌合抗原受体)包括胞外部分，其含有一个或多个配体(例如抗原)结合结构域(如抗体或其片段)；和一个或多个细胞内信号传导区域或结构域(也可互换地称为胞质信号传导结构域或区域)。在一些方面，重组受体(例如CAR)还包括间隔子和/或跨膜结构域或部分。在一些方面，间隔子和/或跨膜结构域可以连接含有配体(例如，抗原)结合结构域的胞外部分和一个或多个细胞内信号传导区或结构域。

在一些实施方案中，重组受体(例如CAR)还包括间隔子，所述间隔子可以是或包括免疫球蛋白恒定区的至少一部分或其变体或经修饰形式，例如铰链区(例如，IgG4铰链区)和/或C_H1/C_L和/或Fc区。在一些实施方案中，重组受体还包含间隔子和/或铰链区。在一些实施方案中，恒定区或部分是人IgG如IgG4或IgG1的。在一些方面，恒定区的所述部分用作抗原识别组分(例如，scFv)与跨膜结构域之间的间隔子区。与不存在间隔子的情况下相比，间隔子的长度可以提供抗原结合后增强的细胞反应性。在一些例子中，间隔子具有为或约12个氨基酸的长度或者具有不超过12个氨基酸的长度。示例性间隔子包括具有以下氨基酸的那些：至少约10至229个氨基酸、约10至200个氨基酸、约10至175个氨基酸、约10至150个氨基酸、约10至125个氨基酸、约10至100个氨基酸、约10至75个氨基酸、约10至50个氨基酸、约10至40个氨基酸、约10至30个氨基酸、约10至20个氨基酸或约10至15个氨基酸，并且包括任何列出的范围的端点之间的任何整数。在一些实施方案中，间隔子区具有约12个或更少的氨基酸、约119个或更少的氨基酸、或约229个或更少的氨基酸。示例性间隔子包括仅IgG4铰链、与CH2和CH3结构域连接的IgG4铰链或与CH3结构域连接的IgG4铰链。示例性间隔子包括但不限于以下文献中所述的那些：Hudecek等人(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153；Hudecek等人(2015)Cancer Immunol Res.3(2):125-135或国际专利申请公开号WO2014031687。

在一些实施方案中，间隔子仅含有IgG的铰链区，如仅IgG4或IgG1的铰链，如SEQID NO:1所示且由SEQ ID NO:2所示的序列编码的仅铰链间隔子。在一些实施方案中，间隔子是与C_H2和/或C_H3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链。在一些实施方案中，所述间隔子是与C_H2和C_H3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:4所示。在一些实施方案中，所述间隔子是仅与C_H3结构域连接的Ig铰链，例如IgG4铰链，如SEQ ID NO:3所示。在一些实施方案中，间隔子是或包含富甘氨酸-丝氨酸的序列或其他柔性接头，如已知的柔性接头。在一些实施方案中，恒定区或部分是IgD的。在一些实施方案中，间隔子具有SEQ ID NO:5中所示的序列。在一些实施方案中，所述间隔子具有与SEQ ID NO:1、3、4和5中的任何一个展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

在一些方面，所述间隔子是多肽间隔子，所述多肽间隔子：(a)包含全部或部分免疫球蛋白铰链或其修饰形式或者由全部或部分免疫球蛋白铰链或其修饰形式组成，或包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28胞外区或CD8胞外区，(b)包含全部或部分免疫球蛋白铰链、任选IgG4铰链或其修饰形式或者由全部或部分免疫球蛋白铰链、任选IgG4铰链或其修饰形式组成，和/或包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28胞外区或CD8胞外区，或(c)长度为或约12个氨基酸和/或包含全部或部分免疫球蛋白铰链、任选IgG4铰链或其修饰形式或者由全部或部分免疫球蛋白铰链、任选IgG4铰链或其修饰形式组成；或(d)由以下项组成或包含以下项：SEQ ID NO:1、3-5、27-34或24所示的氨基酸序列或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的前述任一项的变体，或(e)包含式X₁PPX₂P或由其组成，其中X₁是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸并且X₂是半胱氨酸或苏氨酸。

在一些实施方案中，所述抗原受体包含与胞外结构域直接或间接连接的细胞内结构域。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括连接胞外结构域和细胞内信号传导结构域的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导结构域包含ITAM。例如，在一些方面，所述抗原识别结构域(例如胞外结构域)通常与一种或多种细胞内信号传导组分(如模拟通过抗原受体复合物(如TCR复合物)(在CAR的情况下)进行激活和/或经由另一种细胞表面受体传导信号的信号传导组分)连接。在一些实施方案中，所述嵌合受体包含在胞外结构域(例如scFv)与细胞内信号传导结构域之间连接或融合的跨膜结构域。因此，在一些实施方案中，所述抗原结合组分(例如，抗体)与一种或多种跨膜结构域和细胞内信号传导结构域连接。

在一个实施方案中，使用与受体(例如，CAR)中的一个结构域天然地缔合的跨膜结构域。在一些情形中，通过氨基酸取代选择或修饰所述跨膜结构域以避免此类结构域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，以最小化与所述受体复合物的其他成员的相互作用。

在一些实施方案中，跨膜结构域源自天然或合成来源。当来源是天然的时，在一些方面，所述结构域可以源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。跨膜区包括源自以下(即包含其至少一个或多个跨膜区)的那些：T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137(4-1BB)或CD154。可替代地，在一些实施方案中，跨膜结构域是合成的。在一些方面，合成跨膜结构域主要包含疏水性残基，例如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，将在合成跨膜结构域的每个末端发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。在一些实施方案中，所述连接是通过接头、间隔子和/或一个或多个跨膜结构域来实现。在一些方面，所述跨膜结构域含有CD28的跨膜部分或其变体。所述胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，所述胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文描述的任何间隔子)连接。

在一些实施方案中，所述受体(例如，CAR)的跨膜结构域是人CD28的跨膜结构域(例如人CD28(登录号：P10747.1)的27个氨基酸的跨膜结构域)或其变体，或是包含SEQ IDNO:8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列的跨膜结构域。在一些实施方案中，所述重组受体的含有跨膜结构域的部分包含SEQID NO:9所示的氨基酸序列或与其具有至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述重组受体(例如CAR)包括至少一种或多种细胞内信号传导组分，如细胞内信号传导区或结构域。在一些方面，将T细胞激活描述为由两个类别的胞质信号传导序列来介导：通过TCR起始抗原依赖性初级激活的那些(初级胞质信号传导序列)，以及以非抗原依赖性方式作用以提供次级或共刺激信号的那些(次级胞质信号传导序列)。在一些方面，CAR包括此类信号传导组分中的一种或两种。细胞内信号传导区包括模拟或类似以下的那些：经由天然抗原受体的信号、经由这种受体与共刺激受体的组合的信号和/或仅经由共刺激受体的信号。在一些实施方案中，存在短的寡肽或多肽接头，例如长度在2与10个氨基酸之间的接头，如含有甘氨酸和丝氨酸的接头，例如甘氨酸-丝氨酸双联体，并且所述接头在CAR的跨膜结构域与胞质信号传导结构域之间形成连接。

在一些实施方案中，在连接CAR后，CAR的胞质结构域或细胞内信号传导区激活免疫细胞(例如，工程化以表达CAR的T细胞)的正常效应子功能或反应中的至少一种。例如，在一些情境下，CAR诱导T细胞的功能,如细胞裂解活性或T辅助活性，如细胞因子或其他因子的分泌。在一些实施方案中，使用抗原受体组分或共刺激分子的细胞内信号传导区的截短部分(例如，如果其转导效应子功能信号)代替完整的免疫刺激链。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区(例如包含一个或多个细胞内信号传导结构域)包括T细胞受体(TCR)的胞质序列，并且在一些方面还包括共受体(其在天然背景下与这种受体协同起作用以在抗原受体接合后启动信号转导)和/或此类分子的任何衍生物或变体的那些，和/或具有相同功能能力的任何合成序列。在一些实施方案中，例如包含一个或多个细胞内结构域的细胞内信号传导区包括参与提供共刺激信号的区域或结构域的胞质序列。

在一些方面，CAR包括调节TCR复合物的初级激活的初级胞质信号传导序列。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列可以含有信号传导基序(其称为免疫受体酪氨酸激活基序或ITAM)。含有ITAM的初级胞质信号传导序列的例子包括源自CD3ζ链、FcRγ、CD3γ、CD3δ和CD3ε的那些。在一些实施方案中，CAR中的一种或多种胞质信号传导分子含有源自CD3ζ的胞质信号传导结构域、其部分或序列。

在一些实施方案中，所述受体包括TCR复合物的细胞内组分，如介导T细胞激活和细胞毒性的TCR CD3链，例如CD3ζ链。因此，在一些方面，所述抗原结合部分连接至一个或多个细胞信号传导模块。在一些实施方案中，细胞信号传导模块包括CD3跨膜结构域、CD3细胞内信号传导结构域和/或其他CD跨膜结构域。在一些实施方案中，受体(例如，CAR)还包括一种或多种另外的分子(如Fc受体γ、CD8α、CD8β、CD4、CD25或CD16)的一部分。例如，在一些方面，CAR或其他嵌合受体包括CD3-zeta(CD3-ζ)或Fc受体γ与CD8α、CD8β、CD4、CD25或CD16之间的嵌合分子。

在一些实施方案中，所述细胞内(或胞质)信号传导区包含人CD3链、任选地CD3ζ刺激信号传导结构域或其功能变体，如人CD3ζ(登录号：P20963.2)的亚型3的112个AA的胞质结构域或如美国专利号7,446,190或美国专利号8,911,993中所述的CD3ζ信号传导结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域包含SEQ ID NO:13、14或15所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13、14或15展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

在天然TCR的情况下，完全激活通常不仅需要通过TCR进行信号传导，还需要共刺激信号。因此，在一些实施方案中，为了促进完全激活，用于生成次级或共刺激信号的组分也被包括在所述CAR中。在其他实施方案中，所述CAR不包括用于生成共刺激信号的组分。在一些方面，另外的CAR在同一细胞中表达，并且提供用于生成次级或共刺激信号的组分。

在一些实施方案中，嵌合抗原受体含有T细胞共刺激分子的细胞内结构域。在一些实施方案中，CAR包括共刺激受体(例如CD28、4-1BB、OX40(CD134)、CD27、DAP10、DAP12、ICOS和/或其他共刺激受体)的信号传导结构域和/或跨膜部分。在一些实施方案中，CAR包括CD28或4-1BB(如人CD28或人4-1BB)的共刺激区域或结构域。

在一些实施方案中，细胞内信号传导区或结构域包含人CD28的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如其41个氨基酸的结构域和/或在天然CD28蛋白的位置186-187处具有LL至GG取代的结构域。在一些实施方案中，所述细胞内信号传导区域和/或结构域可以包含SEQ ID NO:10或11所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:10或11展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述细胞内区域包含4-1BB的细胞内共刺激信号传导结构域或其功能变体或部分，如人4-1BB(登录号Q07011.1)的42个氨基酸的胞质结构域或其功能变体或部分，如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

在一些方面，同一CAR包括初级(或激活)胞质信号传导区和共刺激信号传导组分二者。

在一些实施方案中，激活结构域包括于一个CAR内，而共刺激组分是由识别另一种抗原的另一种CAR提供。在一些实施方案中，CAR包括均在同一细胞上表达的激活或刺激CAR、共刺激CAR(参见WO 2014/055668)。在一些方面，细胞包括一种或多种刺激或激活性CAR和/或共刺激CAR。在一些实施方案中，细胞进一步包括抑制性CAR(iCAR，参见Fedorov等人,Sci.Transl.Medicine,5(215)(2013年12月)，如识别除了与疾病或病症相关和/或对所述疾病或病症具有特异性的抗原以外的抗原的CAR，其中通过靶向疾病的CAR递送的激活信号由于抑制性CAR与其配体的结合而有所减小或被抑制，例如以减小脱靶效应。

在一些实施方案中，这两种受体分别将激活和抑制信号诱导至细胞，使得一种受体与其抗原的连接激活细胞或诱导反应，但是第二抑制性受体与其抗原的连接诱导抑制或减弱该反应的信号。例子是激活CAR与抑制性CAR(iCAR)的组合。例如，这种策略可以用于例如降低在如下背景中的脱靶效应的可能性，在所述背景中激活CAR结合在疾病或病症中表达但也在正常细胞上表达的抗原，并且抑制性受体结合在正常细胞上表达但不在所述疾病或病症的细胞上表达的单独抗原。

在一些方面，嵌合受体是或包括抑制性CAR(例如iCAR)，并且包括减弱或抑制免疫反应(如细胞中ITAM和/或共刺激促进的反应)的细胞内组分。这样的细胞内信号传导组分的示例是在免疫检查点分子(包括PD-1、CTLA4、LAG3、BTLA、OX2R、TIM-3、TIGIT、LAIR-1、PGE2受体、EP2/4腺苷受体(包括A2AR))上发现的那些。在一些方面，工程化细胞包含抑制性CAR，所述抑制性CAR包含这种抑制性分子的信号传导结构域或源自这种抑制性分子的信号传导结构域，使得其用于减弱例如由激活和/或共刺激CAR诱导的细胞应答。

在一些情况下，CAR被称为第一代、第二代和/或第三代CAR。在一些方面，第一代CAR是在抗原结合时仅提供CD3链诱导的信号的CAR；在一些方面，第二代CAR是提供这种信号和共刺激信号的CAR，如包括来自共刺激受体(如CD28或CD137)的细胞内信号传导结构域的CAR；在一些方面，第三代CAR是包括不同共刺激受体的多个共刺激结构域的CAR。

在一些实施方案中，CAR涵盖在胞质部分中的一个或多个(例如，两个或更多个)共刺激结构域和激活结构域(例如初级激活结构域)。示例性CAR包括CD3ζ、CD28和4-1BB的细胞内组分。

在一些实施方案中，抗原受体进一步包含标记物，和/或表达CAR或其他抗原受体的细胞还包括替代标记物，诸如细胞表面标记物，所述替代标记物可以用于确认细胞被转导或工程化以表达受体。在一些方面，所述标记物包括全部或部分(例如，截短形式)的CD34、NGFR或表皮生长因子受体，诸如此类细胞表面受体的截短形式(例如，tEGFR)。在一些实施方案中，编码标记物的核酸可操作地连接至编码接头序列(诸如可切割接头序列，例如T2A)的多核苷酸。例如，标记物以及任选地接头序列可以是如公开的专利申请号WO2014031687中所披露的任一种。例如，标记物可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。

截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:7或16所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7或16展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。示例性T2A接头序列包含SEQ ID NO:6或17所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:6或17展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，所述标记物是并非在T细胞上天然发现的或并非在T细胞表面上天然发现的分子(例如，细胞表面蛋白)或其部分。在一些实施方案中，所述分子是非自身分子(例如，非自身蛋白)，即没有被细胞过继转移到其中的宿主的免疫系统识别为“自身”的分子。

在一些实施方案中，所述标记物不提供任何治疗功能和/或不产生除了用作基因工程化标记物(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，所述标记物可以是治疗性分子或以其他方式发挥一些所需作用的分子，如在体内会遇到的细胞的配体，如用于在过继转移和遇到配体时增强和/或减弱细胞应答的共刺激或免疫检查点分子。

在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括含有本文所述的抗体或片段的胞外部分。在一些方面，嵌合抗原受体包括含有本文所述的抗体或片段的胞外部分和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，抗体或片段包括scFv或单结构域V_H抗体，并且细胞内结构域含有ITAM。在一些方面，细胞内信号传导结构域包括CD3-zeta(CD3ζ)链的ζ链的信号传导结构域。在一些实施方案中，CD3-ζ链是人CD3-ζ链。在一些实施方案中，细胞内信号传导区域还包含与CD3ζ细胞内结构域连接的CD28和CD137(4-1BB，TNFRSF9)共刺激结构域。在一些实施方案中，CD28是人CD28。在一些实施方案中，所述4-1BB是人4-1BB。在一些实施方案中，嵌合抗原受体包括设置在胞外结构域与细胞内信号传导区域之间的跨膜结构域。在一些方面，跨膜结构域含有CD28的跨膜部分。所述胞外结构域和跨膜可以直接或间接连接。在一些实施方案中，所述胞外结构域和跨膜通过间隔子(如本文描述的任何间隔子)连接。

在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如，抗体片段)、跨膜结构域(其是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体)以及含有CD28的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。例如，在一些实施方案中，CAR包括抗体(如抗体片段，包括scFv，例如对CD19具有特异性，如以上所述的任何一种)、间隔子(如含有免疫球蛋白分子的一部分(如铰链区和/或重链分子的一个或多个恒定区)的间隔子，如含有Ig铰链的间隔子)、含有CD28来源的跨膜结构域的全部或一部分的跨膜结构域、CD28来源的细胞内信号传导结构域和CD3ζ信号传导结构域。

在一些实施方案中，CAR含有抗体(例如抗体片段)、是或含有CD28的跨膜部分或其功能变体的跨膜结构域、以及含有4-1BB的信号传导部分或其功能变体和CD3ζ的信号传导部分或其功能变体的细胞内信号传导结构域。在一些此类实施方案中，所述受体还包括含有Ig分子(如人Ig分子)的一部分(如Ig铰链，例如IgG4铰链)的间隔子，如仅铰链间隔子。在一些实施方案中，CAR包括抗体或片段(如scFv，例如对CD19具有特异性，如以上所述的任何一种)、间隔子(如任何含Ig铰链的间隔子)、CD28来源的跨膜结构域、4-1BB来源的细胞内信号传导结构域和CD3ζ来源的信号传导结构域。

在任何所提供的方法的特定实施方案中，所述CAR按顺序从N末端至C末端含有：作为SEQ ID NO:43所示的scFv的胞外抗原结合结构域、SEQ ID NO:8所示的跨膜结构域、SEQID NO:12所示的4-1BB共刺激信号传导结构域以及SEQ ID NO:13所示的CD3-zeta(CD3ζ)链的信号传导结构域。

B.用于基因工程化的核酸、载体和方法

在一些实施方案中，将细胞(例如T细胞)基因工程化以表达重组受体。在一些实施方案中，通过引入编码重组受体的多核苷酸来进行工程化。还提供了编码重组受体的多核苷酸，以及含有此类核酸和/或多核苷酸的载体或构建体。

在一些情况下，编码所述重组受体的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。在一些方面，信号序列可以编码源自天然多肽的信号肽。在其他方面，所述信号序列可以编码异源或非天然信号肽，如SEQ ID NO:65所示并且由SEQ ID NO:66所示核苷酸序列编码的GMCSFRα链的示例性信号肽。在一些情况下，编码重组受体(例如，嵌合抗原受体(CAR))的核酸序列含有编码信号肽的信号序列。信号肽的非限制性示例性例子包括例如SEQ ID NO:65所示并且由SEQ ID NO:66所示核苷酸序列编码的GMCSFRα链信号肽，或SEQ ID NO:67所示的CD8α信号肽。

在一些实施方案中，编码重组受体的多核苷酸含有至少一个启动子，所述启动子可操作地连接以控制所述重组受体的表达。在一些例子中，多核苷酸含有两个、三个或更多个启动子，所述启动子可操作地连接以控制所述重组受体的表达。

在核酸分子编码两种或更多种不同多肽链(例如重组受体和标记物)的某些情况下，每条多肽链可以由单独的核酸分子编码。例如，提供了两种单独的核酸，并且每一种可以单独转移到或引入细胞中以在细胞中表达。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸和编码标记物的核酸与相同的启动子可操作地连接，并且任选地通过内部核糖体进入位点(IRES)或编码自切割肽或导致核糖体跳跃的肽(其任选地是T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸分开。在一些实施方案中，编码标记物的核酸和编码重组受体的核酸可操作地连接至两个不同的启动子。在一些实施方案中，编码标记物的核酸和编码所述重组受体的核酸存在或插入于细胞基因组内的不同位置。在一些实施方案中，例如通过逆转录病毒转导、转染或转化将编码重组受体的多核苷酸引入含有培养细胞的组合物中。

在一些实施方案中，如多核苷酸含有第一和第二核酸序列的那些实施方案中，编码不同多肽链中的每一种的编码序列可以与相同或不同的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，核酸分子可以含有驱动两条或更多条不同多肽链表达的启动子。在一些实施方案中，此类核酸分子可以是多顺反子的(双顺反子的或三顺反子的，参见例如，美国专利号6,060,273)。在一些实施方案中，可以将转录单位工程化为含有IRES(内部核糖体进入位点)的双顺反子单元，其允许通过来自单一启动子的信息共表达基因产物(例如编码标记物和编码重组受体)。可替代地，在一些情况下，单一启动子可引导RNA的表达，所述RNA在单一开放阅读框(ORF)中含有两个或三个基因(例如编码标记物和编码重组受体)，所述基因通过编码自切割肽(例如2A序列)的序列或蛋白酶识别位点(例如弗林蛋白酶(furin))彼此分开。因此，ORF编码单一多肽，其在翻译期间(在2A的情况下)或翻译后被处理成单独蛋白质。在一些情况下，肽(如T2A)可引起核糖体跳过2A元件C末端处肽键的合成(核糖体跳跃)，导致2A序列末端与下游的下一个肽之间分开(参见例如，de Felipe,Genetic Vaccines andTher.2:13(2004)和de Felipe等人Traffic 5:616-626(2004))。已知各种2A元件。可以用于本文公开的方法和系统中的2A序列的例子包括但不限于来自以下病毒的2A序列：口蹄疫病毒(F2A，例如SEQ ID NO:21)、马鼻炎A病毒(E2A，例如SEQ ID NO:20)、明脉扁刺蛾β四体病毒(T2A，例如SEQ ID NO:6或17)和猪捷申病毒-1(P2A，例如SEQ ID NO:18或19)，如美国专利公开号20070116690中所述。

本文所述的任何重组受体可以由呈任何组合或排列的含有编码重组受体的一种或多种核酸序列的多核苷酸编码。例如，一种、两种、三种或更多种多核苷酸可以编码一种、两种、三种或更多种不同的多肽，例如重组受体。在一些实施方案中，一种载体或构建体含有编码标记物的核酸序列，并且单独的载体或构建体含有编码重组受体(例如CAR)的核酸序列。在一些实施方案中，编码标记物的核酸和编码重组受体的核酸与两种不同的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸存在于编码标记物的核酸的下游。

在一些实施方案中，所述载体骨架含有编码一种或多种标记物的核酸序列。在一些实施方案中，所述一种或多种标记物是转导标记物、替代标记物和/或选择标记物。

在一些实施方案中，标记物是转导标记物或替代标记物。转导标记物或替代标记物可以用于检测已经引入多核苷酸(例如，编码重组受体的多核苷酸)的细胞。在一些实施方案中，转导标记物可以指示或确认对细胞的修饰。在一些实施方案中，替代标记物是经制备在细胞表面上与重组受体(例如，CAR)共表达的蛋白质。在特定实施方案中，这种替代标记物是已经修饰以具有极少或无活性的表面蛋白。在一些实施方案中，替代标记物是由编码重组受体的相同多核苷酸编码。在一些实施方案中，编码重组受体的核酸序列与编码标记物的核酸序列可操作地连接，任选地由内部核糖体进入位点(IRES)或编码自我切割肽或引起核糖体跳跃的肽(如2A序列，如T2A、P2A、E2A或F2A)的核酸隔开。在一些情况下，外在标记基因可以结合工程化细胞用于允许检测或选择细胞，并且在一些情况下还可以用于促进细胞自杀。

示例性替代标记物可以包括截短形式的细胞表面多肽，如是非功能性的并且不转导或不能转导信号或通常被细胞表面多肽的全长形式转导的信号、和/或不内化或不能内化的截短形式。示例性截短的细胞表面多肽包括截短形式的生长因子或其他受体，如截短的人表皮生长因子受体2(tHER2)、截短的表皮生长因子受体(tEGFR，在SEQ ID NO:7或16中列出的示例性tEGFR序列)或前列腺特异性膜抗原(PSMA)或其修饰形式。tEGFR可以含有被抗体西妥昔单抗

或其他治疗性抗EGFR抗体或结合分子识别的表位，其可以被用于鉴定或选择已经用tEGFR构建体和编码的外源蛋白质工程化的细胞，和/或用于消除或分离表达所编码的外源蛋白质的细胞。参见美国专利号8,802,374和Liu等人,NatureBiotech.2016年4月；34(4):430-434)。在一些方面，标记物(例如替代标记物)包括全部或部分(例如截短形式)的CD34、NGFR、CD19或截短的CD19(例如截短的非人CD19)或表皮生长因子受体(例如tEGFR)。

在一些实施方案中，标记物是或包含荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(例如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP)(例如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体和密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，标记物是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)或其变体。

在一些实施方案中，标记物是选择标记物。在一些实施方案中，选择标记物是或包含赋予对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，选择标记物是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记物是向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记物是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博莱霉素抗性基因或其修饰形式。

在一些实施方案中，所述分子是非自身分子(例如，非自身蛋白)，即没有被细胞过继转移到其中的宿主的免疫系统识别为“自身”的分子。

在一些实施方案中，所述标记物不提供任何治疗功能和/或不产生除了用作基因工程化标记物(例如，用于选择成功工程化的细胞)以外的作用。在其他实施方案中，所述标记物可以是治疗性分子或以其他方式发挥一些所需作用的分子，如在体内会遇到的细胞的配体，如用于在过继转移和遇到配体时增强和/或减弱细胞应答的共刺激或免疫检查点分子。

在一些实施方案中，编码标记物的核酸与编码接头序列(如可切割接头序列，例如T2A)的多核苷酸可操作地连接。例如，标记物和任选地接头序列可以是如PCT公开号WO2014031687。例如，标记物可以是截短的EGFR(tEGFR)，其任选地连接至接头序列，如T2A可切割接头序列。截短的EGFR(例如tEGFR)的示例性多肽包含SEQ ID NO:7或16所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:7或16展现出至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高序列同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，标记物是或包含荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)(例如超折叠GFP(sfGFP))、红色荧光蛋白(RFP)(例如tdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed或DsRed2)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝绿色荧光蛋白(BFP)、增强型蓝色荧光蛋白(EBFP)和黄色荧光蛋白(YFP)及其变体，包括荧光蛋白的物种变体、单体变体和密码子优化的和/或增强的变体。在一些实施方案中，标记物是或包含酶(如萤光素酶)、来自大肠杆菌的lacZ基因、碱性磷酸酶、分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)。示例性发光报告基因包括萤光素酶(luc)、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、β-葡萄糖醛酸酶(GUS)或其变体。

在一些实施方案中，标记物是选择标记物。在一些实施方案中，选择标记物是或包含赋予对外源药剂或药物的抗性的多肽。在一些实施方案中，选择标记物是抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记物是向哺乳动物细胞赋予抗生素抗性的抗生素抗性基因。在一些实施方案中，选择标记物是或包含嘌呤霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、杀稻瘟菌素抗性基因、新霉素抗性基因、遗传霉素抗性基因或博莱霉素抗性基因或其修饰形式。

在一些实施方案中，使用重组感染性病毒颗粒(例如源自猿猴病毒40(SV40)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)的载体)将重组核酸转移到细胞中。在一些实施方案中，使用重组慢病毒载体或逆转录病毒载体(如γ-逆转录病毒载体)将重组核酸转移到T细胞中(参见例如Koste等人(2014)Gene Therapy 2014年4月3日.doi:10.1038/gt.2014.25；Carlens等人(2000)Exp.Hematol.,28(10):1137-46；Alonso-Camino等人(2013)Mol.Ther.Nucl.Acids.,2,e93；Park等人,Trends Biotechnol.,2011年11月29(11):550–557。

在一些实施方案中，所述病毒载体是腺相关病毒(AAV)。

在一些实施方案中，所述逆转录病毒载体具有长末端重复序列(LTR)，例如源自莫洛尼鼠白血病病毒(MoMLV)、骨髓增生性肉瘤病毒(MPSV)、鼠胚胎干细胞病毒(MESV)、鼠干细胞病毒(MSCV)或脾病灶形成病毒(SFFV)的逆转录病毒载体。大多数逆转录病毒载体源自鼠逆转录病毒。在一些实施方案中，所述逆转录病毒包括源自任何禽类或哺乳动物细胞来源的那些。所述逆转录病毒通常是双嗜性的，这意味着它们能够感染包括人在内的若干种物种的宿主细胞。在一个实施方案中，待表达的基因替代逆转录病毒gag、pol和/或env序列。已经描述了许多例示性逆转录病毒系统(例如，美国专利号5,219,740；6,207,453；5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7:980-990；Miller,A.D.(1990)HumanGene Therapy 1:5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180:849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:8033-8037；以及Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3:102-109。

慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如以下文献中：Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。

在一些实施方案中，通过电穿孔将重组核酸转移到T细胞中(参见例如Chicaybam等人,(2013)PLoS ONE 8(3):e60298；和Van Tedeloo等人(2000)Gene Therapy7(16):1431-1437)。在一些实施方案中，通过转座将重组核酸转移到T细胞中(参见例如Manuri等人(2010)Hum Gene Ther 21(4):427-437；Sharma等人(2013)Molec Ther Nucl Acids 2,e74；以及Huang等人(2009)Methods Mol Biol 506:115-126)。在免疫细胞中引入和表达遗传物质的其他方法包括磷酸钙转染(例如，如在Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,New York.N.Y.中所述)、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染；钨粒子促进的微粒轰击(Johnston,Nature,346:776-777(1990))；以及磷酸锶DNA共沉淀(Brash等人,Mol.Cell Biol.,7:2031-2034(1987))。

用于转移编码重组产物的核酸的其他方法和载体是例如国际专利申请公开号WO2014055668和美国专利号7,446,190中所述的那些。

在一些实施方案中，可以在扩增期间或之后例如用嵌合抗原受体(CAR)对细胞(例如T细胞)进行转染。例如，这种用于引入所需受体的基因的转染可以用任何合适的逆转录病毒载体进行。然后可以使基因修饰的细胞群体摆脱初始刺激物(例如抗CD3/抗CD28刺激物)，随后用第二类型的刺激物例如通过从头引入的受体进行刺激。该第二类型的刺激物可以包括呈肽/MHC分子形式的抗原刺激物、遗传引入的受体的同源(交联)配体(例如CAR的天然配体)或在新受体的框架内直接结合(例如通过识别受体内的恒定区)的任何配体(如抗体)。参见例如，Cheadle等人,“Chimeric antigen receptors for T-cell basedtherapy”Methods Mol Biol.2012；907:645-66或Barrett等人,Chimeric AntigenReceptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine第65卷:333-347(2014)。

在一些情况下，可以使用不需要激活细胞(例如，T细胞)的载体。在一些此类情形中，可以在激活之前选择和/或转导细胞。因此，可以在培养细胞之前或之后将细胞工程化，并且在一些情况下在培养的同一时间或至少一部分期间将细胞工程化。

另外的核酸(例如，用于引入的基因)包括用于改善治疗功效的那些，例如通过促进转移细胞的活力和/或功能；提供用于选择和/或评价细胞的遗传标记物的基因，例如以评估体内存活或定位；改善安全性的基因，例如通过使细胞在体内对阴性选择易感，如Lupton S.D.等人,Mol.and Cell Biol.,11:6(1991)；和Riddell等人,Human GeneTherapy 3:319-338(1992)所述；还参见Lupton等人的PCT/US91/08442和PCT/US94/05601的公开，其描述了使用源自将显性阳性选择性标记物与阴性选择性标记物融合的双功能选择性融合基因。参见例如，Riddell等人,美国专利号6,040,177，第14-17栏。

用于基因工程化的细胞和细胞制备在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或衍生这种细胞的生物中发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的如自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。

细胞通常是真核细胞，例如哺乳动物细胞，并且通常是人细胞。在一些实施方案中，所述细胞源自血液、骨髓、淋巴或淋巴器官，是免疫系统的细胞，如先天或适应性免疫的细胞，例如骨髓或淋巴细胞，包括淋巴细胞，通常为T细胞和/或NK细胞。其他示例性细胞包括干细胞，如多潜能干细胞和多能干细胞，包括诱导多能干细胞(iPSC)。细胞通常是原代细胞如直接从受试者分离和/或从受试者分离并冷冻的那些原代细胞。在一些实施方案中，所述细胞包括T细胞或其他细胞类型的一个或多个亚组，如整个T细胞群体、CD4+ T细胞、CD8+T细胞及其亚群，如由以下各项所定义的那些亚群：功能、激活状态、成熟度、分化的可能性、扩增、再循环、定位和/或持久能力、抗原特异性、抗原受体类型、在特定器官或区室中的存在、标记物或细胞因子分泌特征和/或分化程度。关于待治疗的受试者，细胞可以是同种异体的和/或自体的。所述方法包括现成的方法。在一些方面，如对于现有技术，所述细胞是多能的和/或多潜能的，如干细胞，如诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述方法包括从受试者分离细胞、制备、加工、培养和/或将它们工程化，并在低温保存之前或之后将它们重新引入同一受试者中。

T细胞和/或CD4+和/或CD8+ T细胞的亚型和亚群包括幼稚T(T_N)细胞、效应T细胞(T_EFF)、记忆T细胞及其亚型(诸如干细胞记忆T(T_SCM)、中央记忆T(T_CM)、效应记忆T(T_EM)或终末分化效应记忆T细胞)、肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)、未成熟T细胞、成熟T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、粘膜相关恒定T(MAIT)细胞、天然存在和适应性调节T(Treg)细胞、辅助T细胞(诸如TH1细胞、TH2细胞、TH3细胞、TH17细胞、TH9细胞、TH22细胞、滤泡辅助T细胞)、α/βT细胞和δ/γT细胞。

在一些实施方案中，所述细胞是天然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，所述细胞是单核细胞或粒细胞，例如骨髓细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和/或嗜碱性粒细胞。

在一些实施方案中，所述细胞包括经由基因工程引入的一种或多种核酸，从而表达此类核酸的重组或基因工程化产物。在一些实施方案中，核酸是异源的，即通常不存在于细胞或从细胞获得的样品中，如从另一种生物或细胞获得的核酸，例如，所述核酸通常不在被工程化的细胞和/或衍生这种细胞的生物中发现。在一些实施方案中，核酸不是天然存在的如自然界中未发现的核酸，包括包含编码来自多种不同细胞类型的各种结构域的核酸的嵌合组合的核酸。

在一些实施方案中，工程化细胞的制备包括一个或多个培养和/或制备步骤。用于引入编码转基因受体(如CAR)的核酸的细胞可以从样品(如生物样品，例如从受试者获得或源自受试者的生物样品)分离。在一些实施方案中，分离出细胞的受试者是患有疾病或病症或需要细胞疗法或将对其施用细胞疗法的受试者。在一些实施方案中，所述受试者是需要特定治疗性干预(如过继细胞疗法，其中细胞被分离、加工和/或工程化)的人。

因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、体液和其他样品，以及来自一个或多个加工步骤(如分离、离心、基因工程化(例如用病毒载体转导)、洗涤和/或孵育)的样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过加工的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其衍生的加工样品。

在一些方面，细胞从其中衍生或分离的样品是血液或血液衍生的样品，或者是或源自单采术或白细胞单采术产物。示例性样品包括全血、外周血单个核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、黏膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的背景下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。

在一些实施方案中，细胞源自细胞系，例如T细胞系。在一些实施方案中，细胞获得自异种来源，例如获得自小鼠、大鼠、非人灵长类动物和猪。

在一些实施方案中，细胞的分离包括一个或多个制备和/或基于非亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞在一种或多种试剂的存在下洗涤、离心和/或孵育，例如以去除不需要的组分、针对所需组分进行富集、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、尺寸、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。

在一些例子中，例如通过单采术或白细胞单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，样品含有淋巴细胞(包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞)、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。

在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如以去除血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或介质中以用于随后的加工步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤所述细胞。在一些实施方案中，所述洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面，根据制造商的说明书，通过半自动“流通”离心机(例如，Cobe2991细胞加工器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，根据制造商的说明书，通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如像不含Ca⁺⁺/Mg⁺⁺的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将所述细胞直接重悬于培养基中。

在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。

在一些实施方案中，分离方法包括基于细胞中一种或多种特定分子(如表面标记物，例如表面蛋白、细胞内标记物或核酸)的表达或存在来分离不同细胞类型。在一些实施方案中，可以使用任何已知的基于此类标记物的用于分离的方法。在一些实施方案中，分开是基于亲和力或基于免疫亲和力的分开。例如，在一些方面，所述分离包括基于所述细胞的一种或多种标记物(通常为细胞表面标记物)的表达或表达水平来分离细胞和细胞群体，例如通过和与此类标记物特异性结合的抗体或结合配偶体一起孵育，然后通常是洗涤步骤和从那些未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞中分离已结合所述抗体或结合配偶体的细胞。

此类分离步骤可以基于阳性选择(其中保留已经结合所述试剂的细胞以供进一步使用)和/或阴性选择(其中保留未与所述抗体或结合配偶体结合的细胞)。在一些例子中，保留两种级分以供进一步使用。在一些方面，在没有可用于特异性鉴定异质群体中的细胞类型的抗体的情况下，阴性选择可能特别有用，使得最好基于由除所需群体之外的细胞表达的标记物进行分离。

所述分离不需要导致100％富集或去除特定细胞群体或表达特定标记物的细胞。例如，针对特定类型的细胞(如表达标记物的那些)的阳性选择或富集是指增加此类细胞的数量或百分比，但不需要导致不表达所述标记物的细胞的完全不存在。同样地，特定类型的细胞(如表达标记物的那些)的阴性选择、去除或耗尽是指减少此类细胞的数量或百分比，但不需要导致所有此类细胞的完全去除。

在一些例子中，进行多轮分离步骤，其中来自一个步骤的阳性或阴性选择的级分经受另一个分离步骤，如随后的阳性或阴性选择。在一些例子中，单个分离步骤可以同时耗尽表达多种标记物的细胞，如通过将细胞与多种抗体或结合配偶体(每种抗体或结合配偶体对被靶向用于阴性选择的标记物具特异性)一起孵育。同样地，通过将细胞与在各种细胞类型上表达的多种抗体或结合配偶体一起孵育，可以同时阳性选择多种细胞类型。

例如，在一些方面，T细胞的特定亚群，如对一种或多种表面标记物呈阳性或高水平表达的细胞(例如CD28⁺、CD62L⁺、CCR7⁺、CD27⁺、CD127⁺、CD4⁺、CD8⁺、CD45RA⁺和/或CD45RO⁺ T细胞)通过阳性或阴性选择技术来分离。

例如，可以使用抗CD3/抗CD28缀合的磁珠(例如，

M-450CD3/CD28T细胞扩增器)阳性选择CD3⁺、CD28⁺ T细胞。

在一些实施方案中，通过经由阳性选择富集特定细胞群体，或经由阴性选择耗尽特定细胞群体来进行分离。在一些实施方案中，通过将细胞与一种或多种抗体或其他结合剂一起孵育来完成阳性或阴性选择，所述一种或多种抗体或其他结合剂与分别在阳性或阴性选择的细胞上表达或以相对较高水平(标记物^高)(标记物⁺)的一种或多种表面标记物特异性结合。

在一些实施方案中，通过阴性选择在非T细胞(如B细胞、单核细胞或其他白细胞，如CD14)上表达的标记物，将T细胞与PBMC样品分离。在一些方面，CD4⁺或CD8⁺选择步骤用于分离CD4⁺辅助T细胞和CD8⁺细胞毒性T细胞。通过对在一种或多种幼稚、记忆和/或效应T细胞亚群上表达或以相对较高程度表达的标记物的阳性或阴性选择，可以将此类CD4⁺和CD8⁺群体还分类成亚群。

在一些实施方案中，如通过基于与相应子群体相关的表面抗原进行阳性或阴性选择，将CD8⁺细胞针对幼稚、中央记忆、效应子记忆和/或中央记忆干细胞进一步富集或耗尽。在一些实施方案中，针对中央记忆T(T_CM)细胞进行富集以增加功效，如以改善施用后的长期存活、扩增和/或植入，这在一些方面在此类亚群中特别稳健。参见Terakura等人(2012)Blood,1:72–82；Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。在一些实施方案中，组合富含T_CM的CD8⁺ T细胞与CD4⁺ T细胞进一步增强功效。

在实施方案中，记忆T细胞存在于CD8⁺外周血淋巴细胞的CD62L⁺和CD62L^-两个子集中。可以将PBMC针对CD62L^-CD8⁺和/或CD62L⁺CD8⁺级分进行富集或耗尽，诸如使用抗CD8和抗CD62L抗体。

在一些实施方案中，对中央记忆T(T_CM)细胞的富集是基于CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127的阳性或高表面表达；在一些方面，它是基于表达或高度表达CD45RA和/或颗粒酶B的细胞的阴性选择。在一些方面，富含T_CM细胞的CD8⁺群体的分离是通过耗尽表达CD4、CD14、CD45RA的细胞以及对表达CD62L的细胞的阳性选择或富集来进行的。在一个方面，中央记忆T(T_CM)细胞的富集从基于CD4表达所选择的阴性细胞级分开始进行，所述阴性细胞级分基于CD14和CD45RA的表达进行阴性选择且基于CD62L进行阳性选择。在一些方面这种选择是同时进行的，而在其他方面以任何顺序依序进行。在一些方面，用于制备CD8⁺细胞群体或亚群的相同的基于CD4表达的选择步骤也用于生成CD4⁺细胞群体或亚群，使得来自基于CD4的分离的阳性和阴性级分被保留并用于所述方法的后续步骤中，任选地在一个或多个其他阳性或阴性选择步骤之后。

在特定例子中，PBMC样品或其他白细胞样品进行CD4+细胞的选择，其中保留了阴性和阳性级分。然后所述阴性级分基于CD14和CD45RA或CD19的表达进行阴性选择，并基于中央记忆T细胞(如CD62L或CCR7)的标记物特征进行阳性选择，其中以任何顺序进行所述阳性和阴性选择。

通过鉴定具有细胞表面抗原的细胞群体，将CD4+ T辅助细胞分类为幼稚、中央记忆和效应细胞。CD4⁺淋巴细胞可以通过标准方法获得。在一些实施方案中，原初CD4⁺T淋巴细胞是CD45RO^-,CD45RA⁺,CD62L⁺,CD4⁺ T细胞。在一些实施方案中，中央记忆CD4⁺细胞是CD62L⁺且CD45RO⁺。在一些实施方案中，效应CD4⁺细胞是CD62L^-且CD45RO^-。

在一个例子中，为了通过阴性选择富集CD4⁺细胞，单克隆抗体混合剂通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在一些实施方案中，所述抗体或结合配偶体与固体支持物或基质(如磁珠或顺磁珠)结合，以允许细胞分离以用于阳性和/或阴性选择。例如，在一些实施方案中，使用免疫磁性(或亲和磁性)分离技术来分开或分离细胞和细胞群体(综述于以下文献中：Methods in Molecular Medicine,第58卷:MetastasisResearch Protocols,第2卷:Cell Behavior In Vitro and In Vivo,第17-25页S.A.Brooks和U.Schumacher编辑

Humana Press Inc.,新泽西州托托瓦)。

在一些方面，将要分离的细胞的样品或组合物与小的可磁化或磁响应材料(如磁响应颗粒或微粒，如顺磁珠(例如，如Dynalbeads或MACS珠))一起孵育。磁响应材料(例如，颗粒)通常直接或间接地附着于结合配偶体(例如，抗体)，所述结合配偶体与希望分离(例如，希望阴性地或阳性地选择)的一个细胞、多个细胞或细胞群体上存在的分子(例如，表面标记物)特异性结合。

在一些实施方案中，所述磁性颗粒或珠包含与特异性结合成员(如抗体或其他结合配偶体)结合的磁响应材料。有许多在磁分离方法中使用的熟知的磁响应材料。合适的磁性颗粒包括在Molday,美国专利号4,452,773和欧洲专利说明书EP 452342B中所述的那些，将所述专利通过引用特此并入。胶体大小的颗粒(例如在Owen美国专利号4,795,698和Liberti等人,美国专利号5,200,084中所述的那些)是其他的例子。

孵育通常在这样的条件下进行，由此抗体或结合配偶体或者与附着于磁性颗粒或珠的此类抗体或结合配偶体特异性结合的分子(如二抗或其他试剂)与细胞表面分子(如果存在于所述样品内的细胞上的话)特异性结合。

在一些方面，将样品置于磁场中，并且具有附着于其上的磁响应或可磁化颗粒的那些细胞将被吸引到磁体并与未标记的细胞分离。对于阳性选择，保留被磁铁吸引的细胞；对于阴性选择，保留未被吸引的细胞(未标记的细胞)。在一些方面，在同一选择步骤期间进行阳性和阴性选择的组合，其中保留阳性和阴性级分并进一步处理或经受另外的分离步骤。

在某些实施方案中，磁响应颗粒被包被在一抗或其他结合伴侣、二抗、凝集素、酶或链霉亲和素中。在某些实施方案中，所述磁性颗粒通过对一种或多种标记物具特异性的一抗的包被而附着于细胞。在某些实施方案中，用一抗或结合配偶体标记所述细胞而不是珠，并且然后添加细胞类型特异性二抗或其他结合配偶体(例如链霉亲和素)包被的磁性颗粒。在某些实施方案中，将链霉亲和素包被的磁性颗粒与生物素化的一抗或二抗结合使用。

在一些实施方案中，磁响应颗粒保持附着于所述细胞，所述细胞随后被孵育，培养和/或工程化；在一些方面，所述颗粒保持附着于所述细胞以用于施用于患者。在一些实施方案中，从所述细胞中去除可磁化或磁响应颗粒。从细胞中去除可磁化颗粒的方法是已知的，并且包括例如使用竞争的非标记抗体和与可切割接头缀合的可磁化颗粒或抗体。在一些实施方案中，所述可磁化颗粒是可生物降解的。

在一些实施方案中，基于亲和力的选择是经由磁激活细胞分选(MACS)(MiltenyiBiotec，加利福尼亚州奥本)。磁激活细胞分选(MACS)系统能够高纯度选择附着有磁化颗粒的细胞。在某些实施方案中，MACS以这样的模式操作，其中在施加外部磁场之后依序洗脱非靶标和靶标种类。也就是说，附着于磁化颗粒的细胞保持在适当的位置，而未附着的种类被洗脱。然后，在完成第一次洗脱步骤之后，以某种方式释放被捕获在磁场中并被阻止洗脱的种类，使得它们可以被洗脱和回收。在某些实施方案中，所述非靶细胞被标记并从异质细胞群体中耗尽。

在某些实施方案中，使用这样的系统、装置或设备进行分离或分开，所述系统、装置或设备进行所述方法的分离、细胞制备、分开、加工、孵育、培养和/或制备步骤中的一种或多种。在一些方面，所述系统用于在封闭或无菌环境中进行这些步骤中的每一个，例如以最小化错误、用户操作和/或污染。在一个例子中，该系统是如国际专利申请公开号WO2009/072003或US 20110003380 A1中所述的系统。

在一些实施方案中，所述系统或设备在集成或独立系统中和/或以自动化或可编程方式进行分离、处理、工程化和配制步骤中的一个或多个(例如，全部)。在一些方面，所述系统或设备包括与所述系统或设备通信的计算机和/或计算机程序，其允许用户对加工、分离、工程化和配制步骤的各个方面进行编程、控制、评估其结果和/或调整。

在一些方面，使用CliniMACS系统(Miltenyi Biotec)进行所述分离和/或其他步骤，例如以用于在封闭和无菌系统中在临床规模水平上自动分离细胞。部件可以包括集成微计算机、磁分离单元、蠕动泵和各种夹管阀。在一些方面，所述集成计算机控制所述仪器的所有部件并指示所述系统以标准化顺序执行重复程序。在一些方面，所述磁分离单元包括可移动的永磁体和用于选择柱的支架。所述蠕动泵控制整个管组的流速，并与夹管阀一起确保缓冲液通过所述系统的受控流动和细胞的连续悬浮。

在一些方面，所述CliniMACS系统使用抗体偶联的可磁化颗粒，其在无菌，无热原的溶液中提供。在一些实施方案中，在用磁性颗粒标记细胞后，洗涤所述细胞以去除过量的颗粒。然后将细胞制备袋连接到管组，所述管组又连接到含有缓冲液的袋和细胞收集袋。所述管组由预装配的无菌管(包括预柱和分离柱)组成，并且仅供一次性使用。在启动分离程序后，所述系统自动将细胞样品施加到分离柱。标记的细胞保留在柱内，而未标记的细胞通过一系列洗涤步骤去除。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群体是未标记的并且不保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文描述的方法一起使用的细胞群体被标记并保留在柱中。在一些实施方案中，用于与本文所述的方法一起使用的细胞群体在去除磁场后从柱中洗脱，并且收集在细胞收集袋内。

在某些实施方案中，使用CliniMACS Prodigy系统(Miltenyi Biotec)进行分离和/或其他步骤。在一些方面，CliniMACS Prodigy系统配备有细胞加工联合体，其允许通过离心自动化洗涤和分级分离细胞。CliniMACS Prodigy系统还可以包括机载相机和图像识别软件，其通过辨别源细胞产物的宏观层来确定最佳的细胞分级分离终点。例如，外周血自动分离成红细胞、白细胞和血浆层。CliniMACS Prodigy系统还可以包括集成细胞室，其实现细胞培养方案例如细胞分化和扩增、抗原加载和长期细胞培养。输入端口可允许无菌移除和补充培养基，并且可以使用集成显微镜监测细胞。参见，例如，Klebanoff等人(2012)JImmunother.35(9):651-660，Terakura等人(2012)Blood.1:72-82；和Wang等人(2012)JImmunother.35(9):689-701。

在一些实施方案中，通过流式细胞术收集和富集(或耗尽)本文描述的细胞群体，其中针对多种细胞表面标记物染色的细胞在流体流中载携。在一些实施方案中，经由制备规模(荧光激活细胞分选，FACS)分选来收集并富集(或耗尽)本文所述的细胞群体。在某些实施方案中，通过使用微机电系统(MEMS)芯片结合基于FACS的检测系统来收集和富集(或耗尽)本文所述的细胞群体(参见例如WO 2010/033140，Cho等人(2010)Lab Chip 10,1567-1573；和Godin等人(2008)J Biophoton.1(5):355-376)。在两种情况下，细胞可以用多种标记物来标记，允许以高纯度分离明确定义的T细胞子集。

在一些实施方案中，用一种或多种可检测标记物来标记抗体或结合配偶体，以促进分离供阳性和/或阴性选择。例如，分离可以基于与荧光标记的抗体的结合。在一些例子中，基于对一种或多种细胞表面标记物具有特异性的抗体或其他结合配偶体的结合来分离细胞携载于流体流中，如通过荧光激活细胞分选(FACS)(包括制备规模(FACS))和/或微机电系统(MEMS)芯片，例如与流式细胞检测系统组合。此类方法允许基于多种标记物同时进行阳性和阴性选择。

在一些实施方案中，制备方法包括在分离、孵育和/或工程化之前或之后冷冻(例如，低温保存)细胞的步骤。在一些实施方案中，所述冷冻和后续解冻步骤去除所述细胞群体中的粒细胞，并且在一定程度上去除单核细胞。在一些实施方案中，例如在洗涤步骤之后将细胞悬浮在冷冻溶液中以去除血浆和血小板。在一些方面，可以使用多种已知的冷冻溶液和参数中的任何一种。一个例子包括使用含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS，或其他合适的细胞冷冻培养基。然后用培养基将其1:1稀释，使得DMSO和HSA的最终浓度分别为10％和4％。然后通常将细胞以1℃/分钟的速率冷冻至-80℃并且储存在液氮储罐的气相中。

在一些实施方案中，在基因工程化之前或与其相连地孵育和/或培养细胞。所述孵育步骤可以包括培养、培育、刺激、激活和/或繁殖。孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器是如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或其他用于培养或培育细胞的容器。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂的存在下孵育所述组合物或细胞。这些条件包括针对以下而设计的那些条件：用于诱导群体中细胞的增殖、扩增、激活和/或存活的条件，用于模拟抗原暴露和/或用于引发细胞进行基因工程化，如以引入重组抗原受体。

所述条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶受体和设计为激活细胞的任何其他药剂))。

在一些实施方案中，刺激条件或刺激剂包括能够激活或刺激TCR复合物的细胞内信号传导结构域的一种或多种药剂(例如，配体)。在一些方面，所述药剂在T细胞中开启或启动TCR/CD3细胞内信号传导级联。此类药剂可包括抗体如对于TCR具有特异性的抗体，例如抗CD3。在一些实施方案中，刺激条件包括一种或多种药剂例如配体，其能够刺激共刺激受体，例如抗CD28。在一些实施方案中，这种药剂和/或配体可结合至固体支撑物如珠和/或一种或多种细胞因子。任选地，扩增方法可以还包括向培养基中添加抗CD3和/或抗CD28抗体(例如，以至少约0.5ng/mL的浓度)的步骤。在一些实施方案中，所述刺激剂包括IL-2、IL-15和/或IL-7。在一些方面，IL-2浓度为至少约10单位/mL。

在一些方面，孵育是根据多种技术来进行，例如以下文献中所述的那些技术：授予Riddell等人的美国专利号6,040,177；Klebanoff等人(2012)J Immunother.35(9):651-660，Terakura等人(2012)Blood.1:72-82，和/或Wang等人(2012)J Immunother.35(9):689-701。

在一些实施方案中，通过以下方法扩增T细胞：向培养起始组合物中加入饲养细胞，如非分裂外周血单个核细胞(PBMC)(例如，使得对于要扩增的初始群体中的每个T淋巴细胞，所得细胞群体含有至少约5、10、20或40个或更多个PBMC饲养细胞)；以及孵育培养物(例如，持续足以扩增T细胞数量的时间)。在一些方面，非分裂饲养细胞可以包含γ辐射的PBMC饲养细胞。在一些实施方案中，用约3000至3600拉德范围内的γ射线辐射PBMC以防止细胞分裂。在一些方面，在添加T细胞群体之前将饲养细胞加入到培养基中。

在一些实施方案中，刺激条件包括适合于人T淋巴细胞生长的温度，例如至少约25摄氏度，通常为至少约30摄氏度，并且通常在或在约37摄氏度。任选地，孵育还可以包括加入非分裂的EBV转化的类淋巴母细胞(LCL)作为饲养细胞。可以用约6000至10,000拉德范围内的γ射线照射LCL。在一些方面，所述LCL饲养细胞以任何合适的量(如LCL饲养细胞与初始T淋巴细胞的比率为至少约10:1)提供。

在实施方案中，通过用抗原刺激幼稚或抗原特异性T淋巴细胞获得抗原特异性T细胞，如抗原特异性CD4+和/或CD8+ T细胞。例如，可以通过从受感染的受试者中分离T细胞并用相同的抗原在体外刺激细胞，针对巨细胞病毒抗原产生抗原特异性T细胞系或克隆。

C.制造工程化细胞的方法

在特定实施方案中，所述工程化细胞通过如下过程来产生，所述过程从一种或多种输入组合物和/或从单个生物样品产生经富集T细胞的输出组合物。在某些实施方案中，所述输出组合物含有表达重组受体(例如CAR，如抗CD19 CAR)的细胞。在特定实施方案中，所述输出组合物的细胞适合于作为疗法(例如自体细胞疗法)施用于受试者。在一些实施方案中，所述输出组合物是富集的CD3+ T细胞或富集的CD4+和CD8+ T细胞的组合物。T细胞是通过如下方法工程化的，所述方法涉及在将核酸整合到细胞基因组中的条件下将编码CAR(例如，抗CD19 CAR)的核酸引入细胞中。在一些实施方案中，工程化方法包括用病毒载体(如慢病毒载体)转导。在特定实施方案中，通过使细胞与寡聚试剂(例如链霉亲和素突变蛋白寡聚体)接触来激活或刺激T细胞。在一些实施方案中，所述细胞是通过在96小时或更短的时间内完成的用寡聚试剂(例如链霉亲和素突变蛋白寡聚体)刺激细胞的过程工程化的。在一些实施方案中，所提供的方法不包括在过程期间扩增或增加细胞数量的步骤。PCT/US2019/046062披露了由此类方法产生的工程化细胞的制造的示例性方法，将其通过引用以其整体并入。

在特定实施方案中，所提供的方法与用于生成或产生工程化T细胞的输出细胞和/或输出群体的完整过程结合使用，所述完整过程如包括以下步骤中的一些或所有的过程：刺激来自输入群体的细胞；工程化、转化、转导或转染刺激的细胞以表达或含有异源或重组多核苷酸，例如，编码重组受体的多核苷酸，如CAR；孵育所述细胞，从所述细胞去除或分离刺激试剂，并且收获和收集所述细胞，在一些方面由此产生工程化T细胞的输出群体。

在一些实施方案中，所提供的方法与用于生成或产生富集的T细胞的输出细胞和/或输出组合物的完整过程结合使用，所述完整过程如包括以下步骤中的一些或所有的过程：收集或获得生物样品；从生物样品分离、选择或富集输入细胞；低温冷冻并储存输入细胞，然后解冻；刺激所述细胞；基因工程化刺激的细胞以表达或含有重组多核苷酸，例如，编码重组受体的多核苷酸，如CAR；配制输出组合物中的工程化细胞；以及低温冷冻并储存配制的输出细胞，直至释放所述细胞用于输注和/或施用至受试者。在一些实施方案中，所提供的方法不包括在所述过程期间扩增细胞或增加细胞数量的步骤，所述步骤如通过在生物反应器中在一定条件下培育细胞来进行，其中如与输入群体相比细胞扩增，如扩增至细胞的量、水平或浓度为至少3倍、4倍、5倍或更多倍的阈值量。在一些实施方案中，将细胞基因工程化是或包括用病毒载体转导细胞的步骤，所述步骤如通过以下方式来进行：在病毒颗粒的存在下旋转接种细胞，然后在静态条件下在病毒颗粒的存在下孵育所述细胞。

在某些实施方案中，用于产生工程化细胞的所提供过程从起始刺激到收集、收获或配制细胞的总持续时间为、为约或小于36小时、42小时、48小时、54小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时或120小时。在某些实施方案中，用于产生工程化细胞的所提供过程从起始刺激到收集、收获或配制细胞的总持续时间为、为约或小于1.5天、2天、3天、4天或5天。在一些实施方案中，用于产生工程化细胞的所提供过程从起始刺激到收集、收获或配制细胞的总持续时间在或在约36小时与120小时之间、48小时与96小时之间或48小时与72小时之间，包含端值，或者在或在约1.5天与5天之间、2天与4天之间或2天与3天之间，包含端值。在特定实施方案中，如从起始孵育到收获、收集或配制细胞所测量的完成所提供过程的时间量为、为约或小于48小时、72小时或96小时，或者为、为约或小于2天、3天或4天。在特定实施方案中，如从起始孵育到收获、收集或配制细胞所测量的完成所提供过程的时间量为48小时±6小时、72小时±6小时或96小时±6小时。

在一些实施方案中，例如如章节II-C-5中所公开的孵育在以下时间完成：在开始刺激之后，在或在约24小时与120小时之间、36小时与108小时之间、48小时与96小时之间、或48小时与72小时之间，包含端值。在一些实施方案中，所述孵育在以下时间、约以下时间或以下时间内完成：从刺激开始120小时、108小时、96小时、72小时、48小时、或36小时。在特定实施方案中，所述孵育在24小时±6小时、48小时±6小时或72小时±6小时之后完成。在一些实施方案中，所述孵育在在起始刺激后的以下时间完成：在或在约一天与5天之间、1.5天与4.5天之间、2天与4天之间或2天与3天之间，包含端值。在一些实施方案中，所述孵育在从起始刺激起的以下时间、约以下时间或以下时间内完成：5天、4天、3天、2天或1.5天。

在一些实施方案中，整个过程用富集的T细胞(例如，CD4+和CD8+ T细胞)的单一群体来进行。在某些实施方案中，所述过程用富集的T细胞(例如，CD4和CD8细胞)的两种或更多种输入群体进行，所述两种或更多种输入群体在生成或产生富集的T细胞的单一输出群体的过程之前和/或期间进行组合。在一些实施方案中，经富集T细胞是或包含工程化的T细胞，例如，转导以表达重组受体的T细胞。

在一些实施方案中，输出群体(例如，工程化T细胞的群体)通过以下方式产生：(i)将T细胞的输入群体或含有T细胞的输入群体在刺激条件下孵育在或在约18小时与30小时之间，包含端值，(ii)将编码重组受体的异源或重组多核苷酸引入刺激的群体的T细胞中，(iii)孵育所述细胞，然后(iv)收集或收获孵育的细胞。

在一些实施方案中，在起始于刺激条件下孵育之后36小时与108小时之间或1.5天与4.5天之间内，收集或收获细胞。在特定实施方案中，在转化的(例如，基因工程化、转导或转染的)T细胞达到稳定的每个基因组的整合载体拷贝数(iVCN)(其在24-48小时或一天至两天的跨度内增加或减少不超过20％)之后48小时或两天内，收集或收获细胞。在一些实施方案中，当所测量的细胞群体的iVCN在所述群体中测量的总载体拷贝数(VCN)的为或为约20％、15％、10％或5％内时，认为整合是稳定的。特定实施方案考虑，为了实现稳定整合，在将病毒载体接触或引入细胞之后，必须将细胞孵育为、为约或为至少48小时、60小时或72小时或者一天、2天或3天。在一些实施方案中，稳定整合发生在孵育的为或为约72小时内。在一些实施方案中，在转化的T细胞的总数量为或小于输入群体中细胞的总数量时的时间，收集或收获细胞。在各种实施方案中，在输入群体的细胞已经倍增超过三次、两次或一次之前的时间，收集或收获细胞。PCT/US2019/046048中披露了VCN和iVCN测定的示例性方法和组合物，将其通过引用以其整体并入本文。

在某些实施方案中，输出群体(例如，工程化T细胞的群体)通过以下方式产生：(i)将包含T细胞的输入群体在刺激试剂(例如，本文如在章节II-C-2中所述的刺激试剂)的存在下在刺激条件下孵育18小时与30小时之间，包含端值，(ii)用编码重组受体的病毒载体转导刺激的T细胞，如通过在所述病毒载体的存在下旋转接种刺激的T细胞来进行，(iii)将转导的T细胞在静态条件下孵育在或在18小时与96小时之间，包含端值，以及(iv)在开始于刺激条件下孵育之后在或在约36小时与108小时内，收获转化的群体的T细胞。

在一些实施方案中，将与所提供方法相关的过程与替代性过程进行比较。例如，在一些实施方案中，将本文所提供的方法与含有用于扩增细胞的步骤的替代性过程相比较。在特定实施方案中，替代性过程可以在一个或多个特定方面不同，但在其他方面含有与所提供方法相关的过程相似或相同的特征、方面、步骤、阶段、试剂和/或条件。在一些实施方案中，替代性过程类似于与所提供的方法相关的过程，例如，缺少或不包括扩增，但是不同之处包括但不限于以下中的一种或多种：不同的试剂和/或培养基配制品；在孵育、转导、转染和/或孵育工程化细胞期间血清的存在；输入群体的不同的细胞组成，例如，CD4+与CD8+T细胞的比率；不同的刺激条件和/或不同的刺激试剂；不同的刺激试剂与细胞的比率；不同的转导载体和/或方法；不同的孵育、转导和/或转染细胞的时间安排或顺序；在孵育或转导期间存在的一种或多种重组细胞因子的不存在或差异(例如，不同的细胞因子或不同浓度)；或者不同的收获或收集细胞的时间安排。

在一些实施方案中，如从分离、富集和/或选择来自生物样品的输入细胞(例如，CD4+或CD8+ T细胞)至收集、配制和/或低温保护输出细胞的时间所测量，完成所提供过程所需的持续时间或时间量是为、为约或小于48小时、72小时、96小时、120小时、2天、3天、4天、5天、7天或10天。在一些实施方案中，分离、选择或富集的细胞在刺激之前未进行低温保护，并且如从分离、富集和/或选择输入细胞(至收集、配制和/或低温保护输出细胞的时间)所测量，完成所提供过程所需的持续时间或时间量是为、为约或小于48小时、72小时、96小时、或120小时、或2天、3天、4天、或5天。

在某些实施方案中，对从生物样品分离、富集或选择的细胞(例如，CD4+和CD8+ T细胞)的群体进行所提供的过程。在一些方面，所提供的方法可以从自受试者收集生物样品时起，在如与其他方法或过程相比缩短的时间量内，产生或生成工程化T细胞的组合物。在一些实施方案中，所提供的方法可以从自受试者收集生物样品时至收集、收获或配制工程化T细胞(例如，用于低温保存或施用)时，在或在约10天、9天、8天、7天、6天、5天、4天、3天、2天内，或者在或在约120小时、96小时、72小时或48小时内，产生或生成工程化T细胞，包括在用于刺激或转导的步骤之前对生物样品或者富集、分离或选择的细胞进行低温保存和储存的任何或所有时间。在特定实施方案中，所提供的方法可以从自受试者收集生物样品时至收集、收获或配制工程化T细胞时，在或在约6天与8天之间(包含端值)内，产生或生成工程化T细胞，包括在用于刺激或转导的步骤之前对生物样品或者富集、分离或选择的细胞进行低温保存和储存的任何或所有时间。

在某些实施方案中，所提供的方法与生成或产生富集的T细胞的输出细胞和/或输出群体的过程结合使用。在特定实施方案中，富集的T细胞的输出细胞和/或输出群体是或包括如下细胞：从生物样品(如血液样品或白细胞单采术样品)收集、获得、分离、选择和/或富集；在刺激条件下孵育；工程化(例如，转导)以表达或含有重组多核苷酸，例如，编码重组受体的多核苷酸，如CAR；孵育至阈值细胞量、密度；和/或进行配制。在一些实施方案中，例如，在所述过程的一个或多个步骤期间、之前和/或之后，输出群体的先前已经进行低温保护并解冻。在一些实施方案中，输出群体含有表达重组受体(例如，CAR)的T细胞，例如，CD4+T细胞和CD8+ T细胞。

在一些实施方案中，输出群体中至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、或至少90％、至少95％的细胞表达重组受体。在某些实施方案中，输出组合物中至少50％的细胞表达重组受体。在某些实施方案中，输出组合物中至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的CD3+ T细胞表达重组受体。在一些实施方案中，输出组合物中至少50％的CD3+ T细胞表达重组受体。在特定实施方案中，输出组合物中至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或超过99％的CD4+ T细胞表达重组受体。在特定实施方案中，输出组合物中至少50％的CD4+ T细胞表达重组受体。在一些实施方案中，输出组合物中至少30％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或超过99％的CD8+ T细胞表达重组受体。在某些实施方案中，输出组合物中至少50％的CD8+ T细胞表达重组受体。

在特定实施方案中，如与通过替代性过程(例如，包括扩增细胞的一个或多个步骤的过程)产生的输出细胞相比，所述输出组合物的细胞具有改进的针对表达由重组受体结合和/或识别的抗原的细胞(例如，靶细胞)的细胞裂解活性。在一些实施方案中，当所述输出组合物的所述细胞暴露于表达所述抗原的细胞(例如，靶细胞)时，所述输出组合物的所述细胞杀伤、杀伤约或杀伤至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的表达所述抗原的细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞比相似或相同条件下通过替代性过程产生的输出细胞多杀伤至少25％、50％、75％、100％、150％或者1倍、2倍、3倍、4倍或5倍的量的表达抗原的细胞(例如，靶细胞)。

在特定实施方案中，如与通过替代性过程(例如，包括扩增细胞的一个或多个步骤的过程)产生的输出细胞相比，输出群体的细胞具有改进的体内抗肿瘤活性。在一些实施方案中，在将输出组合物的细胞施用至受试者(例如，患有肿瘤或癌症的受试者)时，输出群体的细胞杀伤、杀伤约或杀伤至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％的受试者体内的肿瘤细胞(例如，表达抗原的癌细胞或肿瘤细胞)。在某些实施方案中，输出组合物的细胞比相似或相同条件下通过替代性过程产生的输出细胞多杀伤至少25％、50％、75％、100％、150％或者1倍、2倍、3倍、4倍或5倍的量的体内肿瘤细胞。

在特定实施方案中，输出群体的大多数细胞是幼稚样、中央记忆和/或效应记忆细胞。在特定实施方案中，输出群体的大多数细胞是幼稚样或中央记忆细胞。在一些实施方案中，输出群体的大多数细胞对CCR7或CD27表达中的一种或多种呈阳性。在某些实施方案中，输出群体的细胞具有比从替代性过程(如涉及扩增的过程)产生的输出群体更大份额的幼稚样或中央记忆细胞。

在某些实施方案中，输出群体的细胞具有低份额和/或频率的被消耗的和/或衰老的细胞。在特定实施方案中，输出群体的细胞具有低份额和/或频率的被消耗的和/或衰老的细胞。在一些实施方案中，输出群体中小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或小于1％的细胞是被消耗的和/或衰老的。在某些实施方案中，输出群体中小于25％的细胞是被消耗的和/或衰老的。在某些实施方案中，输出群体中小于10％的细胞是被消耗的和/或衰老的。在特定实施方案中，所述细胞具有低份额

在一些实施方案中，输出群体的细胞具有低份额和/或频率的对CD27和CCR7表达(例如，表面表达)呈阴性的细胞。在特定实施方案中，输出群体的细胞具有低份额和/或频率的CD27-CCR7-细胞。在一些实施方案中，输出群体中小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或小于1％的细胞是CD27-CCR7-细胞。在某些实施方案中，输出群体中小于25％的细胞是CD27-CCR7-细胞。在某些实施方案中，输出群体中小于10％的细胞是CD27-CCR7-细胞。在实施方案中，输出群体中小于5％的细胞是CD27-CCR7-细胞。

在一些实施方案中，输出群体的细胞具有高份额和/或频率的对CD27和CCR7表达(例如，表面表达)中的一种或两种呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出群体的细胞具有高份额和/或频率的对CD27和CCR7中的一种或两种呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出群体中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的细胞对CD27和CCR7中的一种或两种呈阳性。在各种实施方案中，输出群体中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的CD4+CAR+细胞对CD27和CCR7中的一种或两种呈阳性。在一些实施方案中，输出群体中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的CD8+CAR+细胞对CD27和CCR7中的一种或两种呈阳性。

在某些实施方案中，输出群体的细胞具有高份额和/或频率的对CD27和CCR7表达(例如，表面表达)呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出群体的细胞具有高份额和/或频率的CD27+CCR7+细胞。在一些实施方案中，输出群体中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的细胞是CD27+CCR7+细胞。在各种实施方案中，输出群体中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的CD4+CAR+细胞是CD27+CCR7+细胞。在一些实施方案中，输出群体中至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或大于95％的CD8+CAR+细胞是CD27+CCR7+细胞。

在某些实施方案中，输出群体的细胞具有低份额和/或频率的对CCR7表达(例如，表面表达)呈阴性并且对CD45RA表达(例如，表面表达)呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出群体的细胞具有低份额和/或频率的CCR7-CD45RA+细胞。在特定实施方案中，输出群体中小于40％、小于35％、小于30％、小于25％、小于20％、小于15％、小于10％、小于5％或小于1％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。在一些实施方案中，输出群体中小于25％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。在特定实施方案中，输出群体中小于10％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。在某些实施方案中，输出群体中小于5％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。

在特定实施方案中，在细胞群体的为、为约或至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、八次、十次、二十次或更多次细胞倍增(例如，在孵育期间发生的倍增)之前，收获细胞。在某些实施方案中，在群体的任何倍增(例如，在孵育期间发生的倍增)之前，收获细胞。在一些方面，减少在工程化过程期间可能发生的倍增将在一些实施方案中增加幼稚样的工程化T细胞的份额。在一些实施方案中，增加工程化过程期间的倍增增加在工程化过程期间可能发生的T细胞分化。

在一些方面，考虑到，对于生成或产生工程化细胞组合物的过程，减少在过程期间(例如，在孵育期间)发生的扩增或细胞倍增增加所得工程化细胞组合物中幼稚样T细胞的量或份额。在特定方面，增加在过程期间发生的扩增或细胞倍增增加所得工程化细胞组合物中分化的T细胞的量或份额。在一些方面，考虑到，增加或增大所得工程化细胞组合物中幼稚样细胞的份额的过程(如本文所提供的过程)可以增加施用后工程化细胞组合物例如在体内的效力、功效和持久性。

1.用于基因工程化的细胞和细胞的制备

在一些实施方案中，与所提供的方法、用途、制品或组合物结合使用的细胞(如T细胞)是已经进行基因工程化以表达本文所述的重组受体(例如，CAR)的细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的情况下使用。在一些实施方案中，工程化细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，工程化细胞是T细胞，如CD4+或CD8+ T细胞。

在特定实施方案中，所提供的方法与从生物样品分离、选择或富集细胞以产生所富集细胞(例如，T细胞)的一个或多个输入群体结合使用。在一些实施方案中，所提供的方法包括从生物样品分离细胞或其群体，所述生物样品如获自或源自受试者的那些，所述受试者如患有特定疾病或病症或者需要细胞疗法或者将被施用细胞疗法的受试者。在一些方面，所述受试者是人，如作为需要特定治疗性干预(如过继细胞疗法，其中分离、处理和/或工程化细胞以用于所述过继细胞疗法)的患者的受试者。因此，在一些实施方案中，细胞是原代细胞，例如原代人细胞。样品包括直接取自受试者的组织、流体和其他样品。生物样品可以是直接从生物来源获得的样品或经过加工的样品。生物样品包括但不限于体液(如血液、血浆、血清、脑脊液、滑液、尿液和汗液)、组织和器官样品，包括由其衍生的加工样品。

在一些方面，样品是血液或源自血液的样品，或者源自单采术或白细胞单采术产物。示例性样品包括全血、外周血单个核细胞(PBMC)、白细胞、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、白血病、淋巴瘤、淋巴结、肠相关淋巴组织、黏膜相关淋巴组织、脾、其他淋巴组织、肝、肺、胃、肠、结肠、肾、胰腺、乳房、骨、前列腺、子宫颈、睾丸、卵巢、扁桃体或其他器官和/或由其衍生的细胞。在细胞疗法(例如，过继细胞疗法)的背景下，样品包括来自自体和同种异体来源的样品。

在一些例子中，例如通过单采术或白细胞单采术获得来自受试者的循环血液的细胞。在一些方面，样品含有淋巴细胞(包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞)、其他有核白细胞、红细胞和/或血小板，并且在一些方面含有除红细胞和血小板之外的细胞。

在一些实施方案中，洗涤从受试者收集的血细胞，例如以去除血浆级分并将细胞置于适当的缓冲液或介质中以用于随后的加工步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤所述细胞。在一些实施方案中，所述洗涤溶液缺乏钙和/或镁和/或许多或所有二价阳离子。在一些方面中，根据制造商的说明书，通过半自动“流通”离心机(例如，Cobe2991细胞加工器，Baxter)完成洗涤步骤。在一些方面，根据制造商的说明书，通过切向流过滤(TFF)完成洗涤步骤。在一些实施方案中，洗涤后将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液(例如像不含Ca⁺⁺/Mg⁺⁺的PBS)中。在某些实施方案中，去除血细胞样品的组分并将所述细胞直接重悬于培养基中。

在一些实施方案中，洗涤含有细胞的样品(例如，单采术产物或白细胞单采术产物)，以去除在单采术或白细胞单采术期间添加的一种或多种抗凝剂，如肝素。

在一些实施方案中，将含有细胞的样品(例如，全血样品、血沉棕黄层样品、外周血单个核细胞(PBMC)样品、未分级T细胞样品、淋巴细胞样品、白细胞样品、单采术产物或白细胞单采术产物)低温保存和/或低温保护(例如，冷冻)，然后在用于分离、选择、激活、刺激、工程化、转导、转染、孵育、培养、收获、配制细胞群体和/或将配制的细胞群体施用至受试者的任何步骤之前，将其解冻并任选地洗涤。

在一些实施方案中，在适于确保用于制造的适当质量的方法中从受试者收集含有自体外周血单个核细胞(PBMC)的样品。在一方面，含有PBMC的样品源自分级分离的全血。在一些实施方案中，将来自受试者的全血通过白细胞单采术使用离心力并利用细胞表型之间的密度差异进行分级分离，此时优先富集自体单个核细胞(MNC)，同时在所收集细胞组合物中减少其他细胞表型(如红细胞)。在一些实施方案中，在MNC收集期间并行收集自体血浆，这在一些方面可以允许延长白细胞单采术产物稳定性。在一方面，将自体血浆添加至白细胞单采术产物以改进白细胞单采术产物基质的缓冲能力。在一些方面，进行处理以生成白细胞单采术产物的全血的总体积为或为约2L、4L、6L、8L、10L、12L、14L、16L、18L或20L，或者是任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，收集的自体血浆的体积为或为约10mL、50mL、100mL、150mL、200mL、250mL或300mL或更多，或者是任何前述值之间的体积。在一些实施方案中，在白细胞单采术收集完成的约48小时内，使白细胞单采术产物经历一种程序，例如，洗涤和配制用于过程中低温保存。在一些实施方案中，例如，在白细胞单采术收集完成的约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、36小时或48小时内，使白细胞单采术产物经历一个或多个洗涤步骤。在一些方面，所述一个或多个洗涤步骤去除白细胞单采术收集期间的抗凝剂、白细胞单采术产物中可能积累的细胞废物、残余血小板和/或细胞碎片。在一些实施方案中，在所述一个或多个洗涤步骤期间进行一次或多次缓冲液交换。

在特定实施方案中，将单采术产物或白细胞单采术产物低温保存和/或低温保护(例如冷冻)，然后在进行如下所述的细胞选择或分离步骤(例如，T细胞选择或分离步骤)之前进行解冻。在一些实施方案中，在使低温保存的和/或低温保护的单采术产物或白细胞单采术产物经历T细胞选择或分离步骤之后，在任何随后步骤(如激活、刺激、工程化、转导、转染、孵育、培养、收获、配制细胞群体和/或将所配制的细胞群体施用至受试者的步骤)期间或之间，不再进行低温保存和/或低温保护步骤。例如，在解冻并任选地洗涤用于下游过程(如T细胞激活/刺激或转导)之前，不再对选自解冻的低温保存的和/或低温保护的单采术产物或白细胞单采术产物的T细胞进行低温保存和/或低温保护。

在特定实施方案中，将单采术产物或白细胞单采术产物以以下密度在低温保存溶液或缓冲液中进行低温保存和/或低温保护(例如，冷冻)：为、为约或至少5x10⁶个细胞/mL、10x10⁶个细胞/mL、20x10⁶个细胞/mL、30x10⁶个细胞/mL、40x10⁶个细胞/mL、50x10⁶个细胞/mL、60x10⁶个细胞/mL、70x10⁶个细胞/mL、80x10⁶个细胞/mL、90x10⁶个细胞/mL、100x10⁶个细胞/mL、110x10⁶个细胞/mL、120x10⁶个细胞/mL、130x10⁶个细胞/mL、140x10⁶个细胞/mL、或150x10⁶个细胞/mL，或者任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，所述低温保存溶液或缓冲液是或含有例如任选地包含人血清白蛋白(HSA)的DMSO溶液，或其他合适的细胞冷冻介质。

在特定实施方案中，将低温保存的和/或低温保护的单采术产物或白细胞单采术产物存放(例如，在冷冻样品之前不进行T细胞选择)，这在一些方面可以允许更灵活地进行后续制造步骤。在一些方面，将低温保存的和/或低温保护的单采术产物或白细胞单采术产物等分至多个低温保存容器(如袋子)中，所述容器可以各自单独地或组合地用于产物处理中。例如，在单采术产物或白细胞单采术产物中活细胞的总数量小于15x10⁹个细胞时，将低温保存的和/或低温保护的单采术产物或白细胞单采术产物等分至四个低温保存容器(如袋子)中。在一些实施方案中，在单采术产物或白细胞单采术产物中活细胞的总数量是15-30x10⁹个细胞时，将低温保存的和/或低温保护的单采术产物或白细胞单采术产物等分至八个低温保存容器(如袋子)中。

在一个方面，在选择前存放细胞增加用于下游过程的细胞产量，并且较早存放细胞可能意味着，所述细胞更健康并且可能更易于符合制造成功的标准。在另一个方面，一旦解冻，就可以使低温保存的和/或低温保护的单采术产物或白细胞单采术产物经历一种或多种不同的选择方法。这种方法的优点尤其在于，增强了用于治疗受试者的疾病或病症的细胞疗法的细胞的可用性、功效和/或其他方面，如在所述样品的供体和/或另一接受者中。

在一些实施方案中，在供体被诊断为患有疾病或病症之后的时间，在细胞选择之前或在不进行在先细胞选择的情况下(例如，不进行在先T细胞选择，如通过色谱进行选择)，收集样品(例如单采术或白细胞单采术样品)并进行低温保存和/或低温保护。在一些方面，低温保存的时间也在供体已经接受以下中的一种或多种之前：用于所述疾病或病症的任何初始治疗、用于所述疾病或病症的任何靶向治疗或针对治疗进行标记的任何治疗、或者除了辐射和/或化学疗法以外的任何治疗。在一些实施方案中，在疾病的初始治疗后的首次疾病复发之后，以及在供体或受试者接受用于疾病的后续治疗之前，收集样品。初始和/或后续治疗可以是除了细胞疗法以外的疗法。在一些实施方案中，所收集的细胞可以用于初始和/或后续治疗后的细胞疗法中。在一个方面，在不进行在先细胞选择的情况下，低温保存的和/或低温保护的样品可以有助于降低前期费用，如与随机化临床试验中的非治疗患者相关的那些费用，所述患者可能发生交叉并且以后需要治疗。

在一些实施方案中，在疾病的二线治疗后疾病第二次复发后，以及在供体或受试者接受用于所述疾病的后续治疗之前的时间，在细胞选择前或在不进行在先细胞选择的情况下(例如，不进行在先T细胞选择，如通过色谱进行的选择)，收集样品(例如单采术或白细胞单采术样品)并进行低温保存和/或低温保护。在一些实施方案中，例如通过评估某些风险因子，将患者鉴定为可能在二线治疗后复发。在一些实施方案中，所述风险因子是基于疾病类型和/或遗传学，如双打击淋巴瘤、原发性难治性癌症或激活的B细胞淋巴瘤。在一些实施方案中，所述风险因子是基于临床表现，如一线治疗后的早期复发，或者治疗后的其他不良预后指数(例如，IPI(国际预后指数)>2)。

在一些实施方案中，在供体或受试者被诊断为患有疾病之前的时间，在细胞选择前或在不进行在先细胞选择的情况下(例如，不进行在先T细胞选择，如通过色谱进行的选择)，收集样品(例如单采术或白细胞单采术样品)并进行低温保存和/或低温保护。在一些方面，可以确定供体或受试者具有患上疾病的风险。在一些方面，供体或受试者可以是健康受试者。在某些情形中，在被认为没有患上疾病的风险或被诊断为未患疾病的情况下，供体或受试者可以选择存放或储存细胞，以免在生命的后期需要细胞疗法。在一些实施方案中，可以基于诸如以下等因素，认为供体或受试者具有患上疾病的风险：基因突变、基因异常、基因破坏、家族病史、蛋白质异常(如蛋白质产生和/或加工的缺陷)，以及可能增加患病风险的生活方式的选择。在一些实施方案中，收集细胞作为预防药。

在一些实施方案中，将低温保存的和/或低温保护的细胞样品(例如单采术或白细胞单采术样品)，如尚未经历在先细胞选择(例如，不进行在先T细胞选择，如通过色谱进行的选择)的细胞样品储存或存放如下时间段：大于或等于12小时、24小时、36小时或48小时，或者大于或等于0.5天、一天、1.5天或两天。在一些实施方案中，将样品储存或存放如下时间段：大于或等于1周、2周、3周或4周。在一些实施方案中，将样品放置于长期储存或长期存放中。在一些方面，将样品储存如下时间段：大于或等于1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、1 1年、12年、13年、14年、15年、16年、17年、18年、19年、20年、25年、30年、35年、40年或更久。

在一些实施方案中，将从供体获取的单采术或白细胞单采术样品在冷却的环境中运输到储存或处理设施，和/或在储存设施中低温储存，或者在处理设施中进行处理。在一些实施方案中，在运输前处理样品，例如，通过选择T细胞，如CD3+ T细胞、CD4+T细胞和/或CD8+ T细胞进行处理。在一些实施方案中，在运输之后且在低温储存样品之前进行这种处理。在一些实施方案中，在低温储存后解冻样品之后进行所述处理。

通过允许供体在所述供体及因此其细胞尚未经历疾病的广泛治疗时和/或在患上疾病或病症或其诊断之前的阶段储存其细胞，与在一轮或多轮治疗后收获的细胞相比，这样的细胞可能具有用于细胞疗法的某些优点。例如，与已经历几轮治疗的细胞相比，在一轮或多轮治疗之前收获的细胞可能更健康，可能展现更高水平的某些细胞活性，可能生长更快，和/或可能更易接受基因操作。根据本文所述的实施方案的优点的另一个例子可以包括便利性。例如，通过在细胞疗法需要供体细胞之前收集(任选地处理)和储存所述供体细胞，如果接受者后来需要所述细胞以及在接受者后来需要所述细胞时，将容易获得所述细胞。这可以增加单采术实验室容量，从而为技术人员安排单采术收集过程的时间提供更高灵活性。

用于来自样品(如单采术样品)的细胞的低温储存和处理的示例性方法和系统可以包括WO 2018170188中所述的那些。在一些实施方案中，所述方法和系统涉及在患者需要细胞疗法之前收集单采术，然后使所述单采术样品经历低温保存，以供以后用于用重组受体(例如CAR)工程化细胞(例如T细胞)的过程中。在一些情况下，此类过程可以包括本文所述的那些。在一些实施方案中，从受试者收集单采术样品，并且在细胞群体的后续T细胞选择、激活、刺激、工程化、转导、转染、孵育、培养、收获、配制和/或将所配制的细胞群体施用至受试者之前进行低温保存。在这样的例子中，在使样品经历一个或多个选择步骤(如本文所述的任何步骤)之前，将低温保存的单采术样品解冻。

在一些实施方案中，将低温保存的和/或低温保护的细胞样品(例如单采术或白细胞单采术样品)，如尚未经历在先细胞选择(例如，不进行在先T细胞选择，如通过色谱进行的选择)的细胞样品解冻，之后将其用于制造用于细胞疗法的细胞群体(例如，含有CAR+ T细胞的T细胞群体)的下游过程中。在一些实施方案中，这种低温保存的和/或低温保护的细胞样品(例如单采术或白细胞单采术样品)与本文所提供的用于工程化T细胞疗法(如CAR+T细胞疗法)的过程结合使用。在特定例子中，在收获/配制步骤之前或期间不再进行低温保存步骤。

在一些实施方案中，细胞或群体的选择、分离或富集包括一个或多个制备步骤和/或非基于亲和力的细胞分离步骤。在一些例子中，将细胞在一种或多种试剂的存在下洗涤、离心和/或孵育，例如以去除不需要的组分、针对所需组分进行富集、裂解或去除对特定试剂敏感的细胞。在一些例子中，基于一种或多种特性(如密度、粘附特性、尺寸、对特定组分的敏感性和/或抗性)分离细胞。在一些实施方案中，所述方法包括基于密度的细胞分离方法，如通过裂解红细胞并通过Percoll或Ficoll梯度离心而从外周血制备白细胞。在一些实施方案中，细胞例如T细胞是通过色谱分离来分离、选择或富集，如通过柱色谱(包括亲和色谱或凝胶渗透色谱)进行。在一些实施方案中，所述方法采用与位于靶细胞(例如，要分离、选择或富集的细胞)表面上的受体分子结合的受体结合试剂。此类方法可以描述为(无踪迹)细胞亲和色谱技术(CATCH)。在某些实施方案中，用于选择、分离和富集的方法、技术和试剂描述于例如WO 2013124474和WO 2015164675中，所述申请通过引用以其整体特此并入。

细胞选择可以使用一个或多个色谱柱来进行。在一些实施方案中，一个或多个色谱柱包括在封闭系统中。在一些实施方案中，所述封闭系统是自动化封闭系统，例如需要最少或不需要用户(例如，人)输入。在一些实施方案中，细胞选择是依序进行(例如，顺序选择技术)。在一些实施方案中，一个或多个色谱柱是顺序排列。例如，第一柱的定向可以使得可以将所述柱的输出(例如，洗脱液)例如经由连接管道进给至第二色谱柱。在一些实施方案中，多个色谱柱可以依序排列。在一些实施方案中，细胞选择可以通过进行连续阳性和阴性选择步骤来实现，后一步骤使来自前一步骤的阴性和/或阳性级分经受进一步选择，其中整个过程在同一管或管道组中进行。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经受顺序选择，其中实现第一选择以富集CD4+或CD8+群体中的一种，并且使用来自第一选择的未选择细胞作为第二选择的细胞来源，用于富集CD4+或CD8+群体中的另一种。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD4+或CD8+群体中的一种或两种的亚群，例如，中央记忆T(T_CM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记物(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)呈阳性或高水平表达的细胞。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经历顺序选择，其中实现第一选择以富集CD3+群体，并且使用所选细胞作为第二选择的细胞来源，用于富集CD3+群体。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经受顺序选择，其中在第一固定相上(例如，在第一色谱柱中)实现第一选择以富集CD3+群体，并且使用含有未结合细胞的流出物作为第二选择的细胞来源，用于在第二固定相上(例如，在第二色谱柱中)富集CD3+群体，其中所述第一和第二固定相依序排列。在一些实施方案中，所述选择是针对CD3+ T细胞的阳性选择(例如，通过使用与细胞表面CD3特异性结合的抗体或其抗原结合片段)。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD3+群体的亚群，例如，中央记忆T(T_CM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记物(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)呈阳性或高水平表达的细胞。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经受顺序选择，其中实现第一选择以富集CD3+群体，并且使用所选细胞作为第二选择的细胞来源，用于富集CD4+群体。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD3+CD4+群体的亚群，例如，中央记忆T(T_CM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记物(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)呈阳性或高水平表达的细胞。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经受顺序选择，其中实现第一选择以富集CD3+群体，并且使用所选细胞作为第二选择的细胞来源，用于富集CD8+群体。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD3+CD8+群体的亚群，例如，中央记忆T(T_CM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记物(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)呈阳性或高水平表达的细胞。考虑到在一些方面，T细胞的特定亚群(例如，CD3+细胞)，如对一种或多种表面标记物呈阳性或高水平表达的细胞(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+ T细胞)，是通过阳性或阴性顺序选择技术来选择。在一些实施方案中，细胞选择是平行进行(例如，平行选择技术)。在一些实施方案中，一个或多个色谱柱是平行排列。例如，两个或更多个柱的排列可以使得将样品经由管道同时加载至两个或更多个柱上，所述管道允许将样品施加至每个柱，而无需样品穿过第一柱。例如，使用平行选择技术，细胞选择可以通过例如在封闭系统中同时进行阳性和/或阴性选择步骤来实现，其中整个过程在同一管或管道组中进行。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经历平行选择，其中将样品加载至两个或更多个色谱柱上，其中每个柱实现细胞群体的选择。在一些实施方案中，两个或更多个色谱柱单独实现CD3+、CD4+或CD8+群体的选择。在一些实施方案中，两个或更多个色谱柱(包括亲和色谱或凝胶渗透色谱)独立实现相同细胞群体的选择。例如，两个或更多个色谱柱可以实现CD3+细胞的选择。在一些实施方案中，两个或更多个色谱柱(包括亲和色谱或凝胶渗透色谱)独立实现不同细胞群体的选择。例如，两个或更多个色谱柱可以独立地实现CD3+细胞、CD4+细胞和CD8+细胞的选择。在一些实施方案中，可以例如使用顺序选择技术实现一次或多次进一步选择，以富集经由平行选择而选择的一个或所有细胞群体的亚群。例如，可以针对中央记忆T(T_CM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记物呈阳性或高水平表达的细胞(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)进一步选择选择的细胞。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经受平行选择，其中在两个或更多个柱上实现平行选择以富集CD3+群体。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD3+群体的亚群，例如，中央记忆T(T_CM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记物(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)呈阳性或高水平表达的细胞。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经历平行选择，其中在两个或更多个柱上独立地实现选择以富集CD3+群体和CD4+群体。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD3+和CD4+群体的亚群，例如，中央记忆T(T_CM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记物呈阳性或高水平表达的细胞(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经历平行选择，其中实现平行选择以富集CD3+群体和CD8+群体。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD3+和CD8+群体的亚群，例如，中央记忆T(T_CM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记物呈阳性或高水平表达的细胞(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)。在一些实施方案中，使含有靶细胞的样品经历平行选择，其中实现平行选择以富集CD4+群体和CD8+群体。在一些实施方案中，可以实现一次或多次进一步选择以富集CD4+和CD8+群体的亚群，例如，中央记忆T(T_CM)细胞、幼稚T细胞和/或对一种或多种表面标记物呈阳性或高水平表达的细胞(例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+)。考虑到在一些方面，通过阳性或阴性平行选择技术来选择T细胞的特定亚群(例如，CD3+、CD4+、CD8+ T细胞)，如对一种或多种表面标记物呈阳性或高水平表达的细胞，例如，CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+和/或CD45RO+T细胞。在一些实施方案中，顺序和平行选择技术可以组合使用。

2.激活/刺激

在一些实施方案中，在基因工程化之前或与其相连地孵育和/或培养细胞。孵育步骤可以包括培养、刺激、激活和/或繁殖。孵育和/或工程化可以在培养容器中进行，所述培养容器是如单元、室、孔、柱、管、管组、阀、小瓶、培养皿、袋或其他用于培养细胞的容器。在一些实施方案中，在刺激条件或刺激剂的存在下孵育所述组合物或细胞。这些条件包括针对以下而设计的那些条件：用于诱导群体中细胞的增殖、扩增、激活和/或存活的条件，用于模拟抗原暴露和/或用于引发细胞进行基因工程化，如以引入重组抗原受体。

在特定实施方案中，所述刺激试剂含有寡聚试剂(例如链霉亲和素突变蛋白试剂)，其被缀合、连接或附着至一种或多种能够激活TCR复合物的细胞内信号传导结构域的药剂(例如配体)。在一些实施方案中，所述一种或多种药剂具有能够在特定的结合位点(例如结合位点Z)上结合寡聚试剂的附着的结合结构域或结合配偶体(例如，结合配偶体C)。在一些实施方案中，多种药剂可逆地结合寡聚试剂。在各种实施方案中，寡聚试剂具有多个特定结合位点，所述多个特定结合位点在某些实施方案中在结合结构域(例如，结合配偶体C)处可逆地结合多种药剂。在一些实施方案中，在竞争试剂(例如还能够结合特定结合位点(例如结合位点Z)的试剂)的存在下结合药剂的量被降低或减少。

在一些实施方案中，所述刺激试剂是或包括其中至少一种药剂(例如，能够在细胞(如T细胞)中产生信号的药剂)与寡聚试剂相关(例如可逆地相关)的可逆系统。在一些实施方案中，所述试剂含有能够与试剂结合(例如可逆地结合)的多个结合位点。在一些情况下，所述试剂是具有能够在细胞(如T细胞)中产生信号的至少一种附着的药剂的寡聚颗粒试剂。在一些实施方案中，所述药剂含有可以特异性结合分子的表位或区域的至少一个结合位点(例如结合位点B)并且还含有与试剂的至少一个结合位点(例如，试剂的结合位点Z)结合的结合配偶体(在本文中也称为结合配偶体C)。在一些实施方案中，结合配偶体C与至少一个结合位点Z之间的结合相互作用是非共价相互作用。在一些情形中，结合配偶体C与至少一个结合位点Z之间的结合相互作用是共价相互作用。在一些实施方案中，结合配偶体C与至少一个结合位点Z之间的结合相互作用(如非共价相互作用)是可逆的。

在此类可逆系统中可用作寡聚试剂的物质是已知的，参见例如美国专利号5,168,049；5,506,121；6,103,493；7,776,562；7,981,632；8,298,782；8,735,540；9,023,604；和国际公开PCT申请号WO2013/124474和WO2014/076277。下文描述了能够形成可逆相互作用的试剂和结合配偶体以及能够逆转这种结合的物质(例如竞争试剂)的非限制性例子。

在一些实施方案中，寡聚试剂是链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白突变蛋白或类似物(如中性抗生物素蛋白)或其混合物的寡聚体，其中这种寡聚试剂含有用于与药剂的结合结构域(例如，结合配偶体C)可逆地缔合的一个或多个结合位点。在一些实施方案中，所述药剂的结合结构域可以是生物素、生物素衍生物或类似物、或链霉亲和素结合肽或能够特异性结合链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白或类似物的其他分子。

在某些实施方案中，一种或多种药剂(例如，能够在细胞如T细胞中产生信号的药剂)例如经由寡聚试剂上存在的多个特定结合位点(例如，结合位点Z)与寡聚试剂缔合(如可逆地结合)。在一些情况下，这导致所述药剂彼此紧密地排列，使得如果使具有由所述药剂结合或识别的(至少两个拷贝的)细胞表面分子的靶细胞与所述药剂接触，则可以发生亲合力效应。

在一些实施方案中，寡聚试剂是链霉亲和素寡聚体、链霉亲和素突变蛋白寡聚体、链霉亲和素类似物寡聚体、抗生物素蛋白寡聚体、由抗生物素蛋白突变蛋白或抗生物素蛋白类似物(如中性抗生物素蛋白)构成的寡聚体或其混合物。在特定实施方案中，寡聚试剂含有能够与药剂的结合结构域(例如，结合配偶体C)结合的特定结合位点。在一些实施方案中，结合结构域可以是生物素、生物素衍生物或类似物、或链霉亲和素结合肽或能够与链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物、抗生物素蛋白或抗生物素蛋白突变蛋白或类似物特异性结合的其他分子。在一些实施方案中，链霉亲和素可以是野生型链霉亲和素、链霉亲和素突变蛋白或类似物(如链霉亲和素样多肽)。同样，在一些方面，抗生物素蛋白包括野生型抗生物素蛋白、或者抗生物素蛋白的突变蛋白或类似物(如中性抗生物素蛋白，所述中性抗生物素蛋白是具有修饰的精氨酸的去糖基化抗生物素蛋白，其通常展现更中性的pi并且可用作天然抗生物素蛋白的替代物)。通常，抗生物素蛋白的去糖基化的中性形式包括例如那些可商购获得的形式，如可通过Sigma Aldrich公司获得的“Extravidin”、或可从ThermoScientific或Invitrogen公司获得的“NeutrAvidin”。

在一些实施方案中，所述试剂是链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白或类似物。在一些实施方案中，野生型链霉亲和素(wt-链霉亲和素)具有Argarana等人,Nucleic AcidsRes.14(1986)1871-1882中披露的氨基酸序列(SEQ ID NO:68)。通常，链霉亲和素在自然界中作为四个相同亚基的四聚体存在，即它是同四聚体，其中每个亚基含有针对生物素、生物素衍生物或类似物或生物素模拟物的单一结合位点。链霉亲和素亚基的示例性序列是SEQID NO:68所示的氨基酸序列，但是这个序列还可以包括在来自其他链霉菌属(Streptomyces)物种的同源物中存在的序列。特别地，链霉亲和素的每个亚基可以对生物素展现出强大的结合亲和力，其中解离常数(K_d)在约10^-14M的数量级上。在一些情况下，链霉亲和素可以作为单价四聚体存在，其中仅有四个结合位点中的一个具有功能性(Howarth等人(2006)Nat.Methods,3:267-73；Zhang等人(2015)Biochem.Biophys.Res.Commun.,463:1059-63)；可以作为二价四聚体存在，其中四个结合位点中的两个具有功能性(Fairhead等人(2013)J.Mol.Biol.,426:199-214)；或者可以以单体或二聚体形式存在(Wu等人(2005)J.Biol.Chem.,280:23225-31；Lim等人(2010)Biochemistry,50:8682-91)。

在一些实施方案中，链霉亲和素可以是任何形式，如野生型或未经修饰的链霉亲和素，如来自链霉菌属物种的链霉亲和素或其功能活性片段，所述功能活性片段包括含有针对生物素、生物素衍生物或类似物或生物素模拟物的结合位点的至少一个功能性亚基，如通常含有SEQ ID NO:68所示的来自阿维丁链霉菌(Streptomyces avidinii)的野生型链霉亲和素的至少一个功能性亚基或其功能活性片段。例如，在一些实施方案中，链霉亲和素可以包括野生型链霉亲和素的片段，所述片段在N末端和/或C末端被缩短。这种最小链霉亲和素包括任何如下链霉亲和素：在SEQ ID NO:68的氨基酸位置10至16的区域中的N末端开始，并且在SEQ ID NO:68的氨基酸位置133至142的区域中的C末端终止。在一些实施方案中，链霉亲和素的功能活性片段含有SEQ ID NO:69所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，如SEQ ID NO:69所示的链霉亲和素可以在对应于Ala13(其编号示于SEQ ID NO:68中)的位置进一步含有N末端甲硫氨酸。提及链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白中残基的位置是参考在SEQ ID NO:68中残基的编号。

链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的例子在例如WO 86/02077、DE 19641876Al、US 6,022,951、WO 98/40396或WO 96/24606中有提及。链霉亲和素突变蛋白的例子是本领域已知的，参见例如美国专利号5,168,049；5,506,121；6,022,951；6,156,493；6,165,750；6,103,493；或6,368,813；或国际公开PCT申请号WO2014/076277。

在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白可以含有不是未经修饰的或野生型链霉亲和素的一部分的氨基酸，或者可以仅包括野生型或未经修饰的链霉亲和素的一部分。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有至少一个亚基，所述至少一个亚基与未经修饰的或野生型链霉亲和素的亚基相比(例如与在SEQ ID NO:68所示的野生型链霉亲和素亚基或例如在SEQ ID NO:69所示的其功能活性片段相比)可以具有一个或多个氨基酸取代(替代)。

在一些实施方案中，链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白对结合结构域的结合亲和力(如解离常数(K_d))小于1x10^-4M、5x10^-4M、1x10^-5M、5x10^-5M、1x10^-6M、5x10^-6M或1x10^-7M，但通常大于1x10^-13M、1x10^-12M或1x10^-11M。例如，美国专利号5,506,121中披露的肽序列(例如，Strep-tags)可以用作生物素模拟物并显示对链霉亲和素的结合亲和力，例如，K_d大约在10^-4M与10^-5M之间。在一些情况下，可以通过在链霉亲和素分子内进行突变来进一步改进结合亲和力，参见例如，美国专利号6,103,493或WO 2014/076277。在一些实施方案中，结合亲和力可以通过本领域已知的方法(例如本文所述的任何方法)来确定。

在一些实施方案中，所述试剂(如链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白)展现出对肽配体结合配偶体的结合亲和力，所述肽配体结合配偶体可以是药剂(例如受体结合剂或选择剂)中存在的结合配偶体C。在一些实施方案中，肽序列含有具有通式His-Pro-Xaa的序列，其中Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或甲硫氨酸，如含有SEQ ID NO:71所示的序列。在一些实施方案中，肽序列含有SEQ ID NO:70所示的序列。在一些实施方案中，肽序列具有SEQ IDNO:72所示的通式，如SEQ ID NO:73所示。在一个例子中，肽序列是Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly(也称为

示于SEQ ID NO:74中)。在一个例子中，肽序列是Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys(也称为

II，如SEQ ID NO:75所示)。在一些实施方案中，肽配体含有至少两个链霉亲和素结合模块的顺序排列，其中在所述两个模块之间的距离为至少0个且不大于50个氨基酸，其中一个结合模块具有3个至8个氨基酸并且含有至少序列His-Pro-Xaa，其中Xaa是谷氨酰胺、天冬酰胺或甲硫氨酸，并且其中另一个结合模块具有相同或不同的链霉亲和素肽配体，如SEQ ID NO:72所示(参见例如国际公开的PCT申请号WO 02/077018；美国专利号7,981,632)。在一些实施方案中，肽配体含有具有SEQ ID NO:76或77中任一项所示的式的序列。在一些实施方案中，肽配体具有SEQ ID NO:78-80和81-82中任一个所示的氨基酸序列。在大多数情况下，所有这些链霉亲和素结合肽结合相同的结合位点，即链霉亲和素的生物素结合位点。如果将一种或多种此类链霉亲和素结合肽用作结合配偶体C(例如C1和C2)，经由结合配偶体C与所述一种或多种药剂结合的多聚化试剂和/或寡聚颗粒试剂通常由一种或多种链霉亲和素突变蛋白构成。

在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白是如美国专利号6,103,493中所述的突变体。在一些实施方案中，基于野生型链霉亲和素的氨基酸序列(如SEQ ID NO:68中所示)，链霉亲和素突变蛋白在氨基酸位置44至53的区域内含有至少一个突变。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白在一个或多个残基44、45、46和/或47处含有突变。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有疏水性脂肪族氨基酸(例如Val、Ala、Ile或Leu)对野生型链霉亲和素的位置44处的Glu的置换，位置45处的任何氨基酸，位置46处的脂肪族氨基酸(如疏水性脂肪族氨基酸)，和/或碱性氨基酸(例如Arg或Lys，如通常Arg)对位置47处的Val的置换。在一些实施方案中，Ala位于位置46和/或Arg位于位置47和/或Val或Ile位于位置44。在一些实施方案中，链霉亲和素突变体含有残基Val44-Thr45-Ala46-Arg47，如含有SEQ IDNO:83或SEQ ID NO:84或85所示氨基酸序列的示例性链霉亲和素突变蛋白中所示(也称为链霉亲和素突变体1，SAM1)。在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白含有残基Ile44-Gly45-Ala46-Arg47，如含有SEQ ID NO:86、87或59所示氨基酸序列的示例性链霉亲和素突变蛋白中所示(也称为SAM2)。在一些情况下，这种链霉亲和素突变蛋白描述于例如美国专利6,103,493中，并且可以在商标

下商业购得。在一些实施方案中，突变蛋白链霉亲和素含有SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:89所示的氨基酸序列。在特定实施方案中，所述分子是链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白的四聚体，其包含SEQ ID NO:69、84、87、88、90、85或59中任一项所示的序列，作为四聚体，其是含有20个伯胺(每个单体包括1个N末端胺和4个赖氨酸)的分子。

在一些实施方案中，链霉亲和素突变蛋白展现特征为如下解离常数(K_d)的结合亲和力：对于肽配体(Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly；也称为

示于SEQ IDNO:74中)，为或小于3.7x10^-5M；和/或对于肽配体(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys；也称为

II，示于SEQ ID NO:75中)，为或小于7.1x10^-5M；和/或对于SEQ ID NO:75、76-77、81-82、78-80、73、74、70、72中任一个所示的任何肽配体，为或小于7.0x10^-5M、5.0x10^-5M、1.0x10^-5M、5.0x10^-6M、1.0x10^-6M、5.0x10^-7M或1.0x10^-7M，但通常大于1x10^-13M、1x10^-12M或1x10^-11M。

在一些实施方案中，所得链霉亲和素突变蛋白展现特征为如下缔合常数(K_a)的结合亲和力：对于肽配体(Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly；也称为

示于SEQID NO:74中)，为或大于2.7x10⁴M^-1；和/或对于肽配体(Trp-Ser-His-Pro-Gln-Phe-Glu-Lys；也称为

II，示于SEQ ID NO:75中)，为或大于1.4x10⁴M^-1；和/或对于SEQ IDNO:75、76-77、81-82、78-80、73、74、70、72中任一个所示的任何肽配体，为或大于1.43x10⁴M^-1、1.67x10⁴M^-1、2x10⁴M^-1、3.33x10⁴M^-1、5x10⁴M^-1、1x10⁵M^-1、1.11x10⁵M^-1、1.25x10⁵M^-1、1.43x10⁵M^-1、1.67x10⁵M^-1、2x10⁵M^-1、3.33x10⁵M^-1、5x10⁵M^-1、1x10⁶M^-1、1.11x10⁶M^-1、1.25x10⁶M^-1、1.43x10⁶M^-1、1.67x10⁶M^-1、2x10⁶M^-1、3.33x10⁶M^-1、5x10⁶M^-1、1x10⁷M^-1，但通常小于1x10¹³M^-1、1x10¹²M^-1或1x10¹¹M^-1。

在特定实施方案中，本文提供了由多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体构成和/或含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体的寡聚颗粒试剂。在某些实施方案中，本文提供的寡聚颗粒试剂含有可逆地结合或能够可逆地结合一种或多种药剂(例如刺激剂和/或选择剂)的多个结合位点。在一些实施方案中，寡聚颗粒具有在70nm与125nm之间包含端值的半径(例如，平均半径)；在1x10⁷g/mol与1x10⁹g/mol之间包含端值的分子量；和/或在1,000与5,000之间的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体，包含端值。在一些实施方案中，寡聚颗粒试剂与一种或多种药剂结合(例如可逆地结合)，所述一种或多种药剂例如为与细胞表面上的分子(例如受体)结合的药剂。在某些实施方案中，一种或多种药剂是本文(例如，在第II-C-2部分中)所述的药剂。在一些实施方案中，所述药剂是抗CD3和/或抗CD28抗体或其抗原结合片段，如含有结合配偶体(例如，链霉亲和素结合肽，例如

II)的抗体或其抗原片段。在特定实施方案中，所述一种或多种药剂与细胞表面受体和/或辅助分子结合以刺激细胞，并且可以包括靶向TCR复合物或其组分的抗体、靶向共刺激分子的抗体、抗CD3抗体、抗CD28抗体或抗CD3和/或抗CD28 Fab，并且所述一种或多种药剂含有结合配偶体，例如链霉亲和素结合肽，例如

II。在特定实施方案中，一种或多种药剂包含基于链霉亲和素的寡聚体，如链霉亲和素突变蛋白寡聚体，其与带Strep-tag标签的抗CD3和带Strep-tag标签的抗CD28 Fab缀合。在一些实施方案中，寡聚颗粒试剂是如WO 2015/158868或WO2018/197949中所述的任一种。

在特定实施方案中，通过使称为

M2的示例性链霉亲和素突变蛋白聚合来制备寡聚试剂(参见例如美国专利号6,103,493和Voss和Skerra(1997)ProteinEng.,1:975-982以及Argarana等人(1986)Nucleic Acids Research,1871-1882)。在特定实施方案中，为了制备用于寡聚化的链霉亲和素突变蛋白，将含有一个或多个反应性硫醇基的链霉亲和素突变蛋白与马来酰亚胺激活的链霉亲和素突变蛋白一起孵育。在特定实施方案中，为了制备硫醇化的链霉亲和素突变蛋白，通过在总体积为2.6mL的100mM硼酸盐缓冲液中与2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐以1:100的摩尔比在约8.5的pH下在24℃下一起孵育1小时，将约100mg链霉亲和素突变蛋白硫醇化。对于激活反应，在总体积为约10.4mL的磷酸钠缓冲液中将约400mg链霉亲和素突变蛋白与琥珀酰亚胺基-6-[(β-马来酰亚胺基丙酰胺基)己酸酯(SMPH)以1:2的摩尔比在约7.2的pH下在24℃下一起孵育1小时。协调硫醇化和激活反应以在大致相同的时间开始，并控制所述反应的持续时间。在反应后，通过用PD-10脱盐柱(GE Healthcare)单独进行样品的凝胶过滤，从样品去除2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐和SMPH。对于每2.5mL体积的样品，平衡1mL PD-10柱并加载硫醇化突变蛋白链霉亲和素或马来酰亚胺突变蛋白链霉亲和素，并且通过添加3.5mL偶联缓冲液(100mM NaH₂PO₄、150mMNaCl、5mM EDTA，pH 7.2)进行洗脱。在4个柱上进行马来酰亚胺突变蛋白链霉亲和素的凝胶过滤以占据>10mL体积，并合并洗脱物。控制激活和硫醇化反应的时间安排以及激活和硫醇化反应的结束与寡聚化反应的开始之间的时间安排。通常，从凝胶过滤的开始(即，激活和硫醇化反应的结束)至开始寡聚化反应时，允许经过不超过十分钟。

在特定实施方案中，然后将马来酰亚胺链霉亲和素突变蛋白和硫醇化链霉亲和素突变蛋白样品组合为约17.5mL的总体积并在7.2的pH下在24℃下在约600rpm的搅拌条件下孵育1小时。因为与SMPH一起孵育的链霉亲和素突变蛋白是与2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐一起孵育的链霉亲和素突变蛋白的四倍，在寡聚化反应期间，硫醇化链霉亲和素突变蛋白与马来酰亚胺链霉亲和素突变蛋白的摩尔比为1:4。在反应后，寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂的其余SH基团通过以下方法来饱和：与N-乙基马来酰亚胺(NEM)在24℃且搅拌(约600rpm)下孵育15min，接着在4℃下另外孵育16-20小时。在与NEM一起孵育后，将含有寡聚链霉亲和素突变蛋白的样品离心，并通过0.45μm膜(来自Merck Millopore的Millex-HP0.45μm)过滤上清液。然后将过滤的溶液加载至柱(Sephacryl S-300HR HiPrep 26/60，GEHealthcare)中，用于使用AKTA Explorer色谱系统(GE Healthcare)进行尺寸排阻色谱(SEC)。合并毫吸光度单位(mAU)大于或等于1500mAU的级分。将含有寡聚链霉亲和素突变蛋白的合并样品用100mM羟胺在6.35的pH下在室温下处理15分钟。为了在处理后去除羟胺，将样品加载至PD10柱(每个柱2.5mL)上并用3.5mL含有100mM NaH₂PO₄、140mM NaCl、1mM EDTA的缓冲液(pH 7.2)洗脱。将PD10洗脱液合并，并用0.45μm过滤器之后用0.22μm过滤器进行无菌过滤，然后将样品冷冻并储存于-80℃下。在冷冻前，测量寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂的终浓度，并通过动态光散射(DLS)确定寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂的大小。

在一些实施方案中，将刺激剂(如抗CD3抗体和抗CD28 Fab抗体)通过与寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂的可逆结合进行多聚化。在一些实施方案中，刺激剂(例如抗CD3和抗CD28 Fab片段)经由融合至每个刺激剂(例如每个Fab片段)的链霉亲和素肽结合配偶体与链霉亲和素突变蛋白寡聚体可逆地结合。在一些实施方案中，抗CD3 Fab片段源自由杂交瘤细胞系OKT3(

CRL-8001^TM；还参见美国专利号4,361,549)产生的CD3结合单克隆抗体，并且含有Arakawa等人J.Biochem.120,657-662(1996)中所述的抗CD3抗体OKT3的重链可变结构域和轻链可变结构域。这些序列分别示于SEQ ID NO:60和61中。在一些实施方案中，抗CD28 Fab片段源自抗体CD28.3(作为合成单链Fv构建体以GenBank登录号AF451974.1存放；还参见Vanhove等人,BLOOD,2003年7月15日,第102卷,第2期,第564-570页)，并且含有分别示于SEQ ID NO:62和63中的抗CD28抗体CD28.3的重链和轻链可变结构域。例如，肽标记的Fab片段，参见国际专利申请公开号WO 2013/011011和WO 2013/124474。

在一些实施方案中，本文提供了由多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体构成和/或含有多个链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体的寡聚颗粒试剂。在某些实施方案中，本文提供的寡聚颗粒试剂含有可逆地结合或能够可逆地结合一种或多种药剂(例如刺激剂和/或选择剂)的多个结合位点。在一些实施方案中，寡聚颗粒具有在80nm与120nm之间且包含端值的半径(例如，平均半径)；在7.5x10⁶g/mol与2x10⁸g/mol之间且包含端值的分子量(例如，平均分子量)；和/或在500与10,000之间且包含端值的量(例如，平均量)的链霉亲和素或链霉亲和素突变蛋白四聚体。在一些实施方案中，寡聚颗粒试剂与一种或多种药剂结合(例如可逆地结合)，所述一种或多种药剂例如为与细胞表面上的分子(例如受体)结合的药剂。在一些实施方案中，所述药剂包含一种或多种药剂，其与细胞表面受体和/或辅助分子结合以刺激细胞(例如像靶向TCR复合物或其组分的抗体、靶向共刺激分子的抗体、抗CD3抗体、抗CD28抗体或抗CD3/抗CD28Fab)。在一些实施方案中，所述药剂是抗CD3和/或抗CD28 Fab，例如含有结合配偶体(例如，链霉亲和素结合肽，例如

II)的Fab。在特定实施方案中，一种或多种药剂是含有结合配偶体(例如，链霉亲和素结合肽，例如

II)的抗CD3和/或抗CD28 Fab。

在一些实施方案中，在以下的存在下对所述细胞进行刺激或使其经受刺激：每10⁶个细胞为、为约或为至少0.01μg、0.02μg、0.03μg、0.04μg、0.05μg、0.1μg、0.2μg、0.3μg、0.4μg、0.5μg、0.75μg、1μg、1.2μg、1.4μg、1.6μg、1.8μg、2μg、3μg、4μg、5μg、6μg、7μg、8μg、9μg、或10μg的寡聚刺激试剂(例如，基于链霉亲和素的寡聚体，如链霉亲和素突变蛋白寡聚体，其与带Strep-tag标签的抗CD3和带Strep-tag标签的抗CD28 Fab缀合)。在一些实施方案中，在以下的存在下对所述细胞进行刺激或使其经历刺激：每10⁶个细胞为或为约4μg的寡聚刺激试剂(例如，基于链霉亲和素的寡聚体，如链霉亲和素突变蛋白寡聚体，其与Strep标记的抗CD3和Strep标记的抗CD28 Fab缀合)。在特定实施方案中，在以下的存在下对所述细胞进行刺激或使其经历刺激：每10⁶个细胞为或为约1.2μg的寡聚刺激试剂(例如，基于链霉亲和素的寡聚体，如链霉亲和素突变蛋白寡聚体，其与Strep标记的抗CD3和Strep标记的抗CD28 Fab缀合)。在特定实施方案中，在以下的存在下对所述细胞进行刺激或使其经历刺激：每10⁶个细胞为或为约0.8μg的寡聚刺激试剂(例如，基于链霉亲和素的寡聚体，如链霉亲和素突变蛋白寡聚体，其与Strep标记的抗CD3和Strep标记的抗CD28 Fab缀合)。在特定实施方案中，在以下的存在下对所述细胞进行刺激或使其经历刺激：每10⁶个细胞为或为约1.8μg的寡聚刺激试剂(例如，基于链霉亲和素的寡聚体，如链霉亲和素突变蛋白寡聚体，其与Strep标记的抗CD3和Strep标记的抗CD28 Fab缀合)。在某些方面，在寡聚刺激试剂内，寡聚颗粒与附着药剂的质量比为约3:1。在某些方面，在寡聚刺激试剂内，寡聚颗粒、附着的抗CD3 Fab与附着的抗CD28 Fab之间的质量比为约3:0.5:0.5。在某些方面，4μg寡聚刺激试剂是或包括3μg寡聚颗粒和1μg附接药剂，例如，0.5μg抗CD3 Fab和0.5μg抗CD28 Fab。在其他例子中，每10⁶个细胞的1.2μg寡聚刺激试剂是或包括每10⁶个细胞的0.9μg寡聚颗粒和0.3μg附着药剂，例如，0.15μg抗CD3 Fab和0.15μg抗CD28 Fab。在一些实施方案中，将寡聚刺激试剂添加至无血清培养基，并且在无血清培养基中进行刺激，例如，如PCT/US2018/064627中所述。

在特定实施方案中，使为或为约900x10⁶个T细胞(例如，900x10⁶个CD3+ T细胞、或450x10⁶个CD4+ T细胞和450x10⁶个CD8+ T细胞)的量的输入群体在寡聚刺激试剂(例如，基于链霉亲和素的寡聚体，如链霉亲和素突变蛋白寡聚体，其与带Strep-tag标签的抗CD3和带Strep-tag标签的抗CD28 Fab缀合)的存在下经受刺激，例如，在刺激条件下培养。在某些实施方案中，以以下密度对所述细胞(例如，输入群体的细胞)进行刺激或使其经受刺激(例如，在刺激条件下如在刺激试剂的存在下培养)：为、为约或至少0.01x10⁶个细胞/mL、0.1x10⁶个细胞/mL、0.5x10⁶个细胞/mL、1.0x10⁶个细胞/mL、1.5x10⁶个细胞/mL、2.0x10⁶个细胞/mL、2.5x10⁶个细胞/mL、3.0x10⁶个细胞/mL、4.0x10⁶个细胞/mL、5.0x10⁶个细胞/mL、10x10⁶个细胞/mL、或50x10⁶个细胞/mL。在某些实施方案中，以为、为约或至少3.0x10⁶个细胞/mL的密度对所述细胞(例如，输入群体的细胞)进行刺激或使其经受刺激(例如，在刺激条件下如在刺激试剂的存在下培养)。

在一些实施方案中，输出群体(例如，工程化T细胞的群体)通过包括以下的步骤产生：将T细胞的输入群体或含有T细胞的输入群体与寡聚刺激性颗粒试剂(例如，本文所述的基于寡聚体的刺激试剂)一起孵育在或在约18小时与30小时之间，包含端值；将编码重组受体的异源或重组多核苷酸引入刺激的群体的T细胞中，(iii)在静态条件下孵育细胞，(iv)通过添加竞争试剂从细胞去除或分离刺激试剂，以及(v)收集或收获孵育的细胞。

在某些实施方案中，输出群体(例如，工程化T细胞的群体)通过包括以下的步骤产生：将包含T细胞的输入群体在可逆地附接至一种或多种药剂的链霉亲和素突变蛋白寡聚体的存在下在刺激条件下孵育18小时与30小时之间，包含端值，所述一种或多种药剂与细胞表面受体和/或辅助分子结合以刺激细胞(例如，靶向TCR复合物或其组分的抗体、靶向共刺激分子的抗体、抗CD3抗体、抗CD28抗体或抗CD3/抗CD28 Fab)；用编码重组受体的病毒载体转导刺激的T细胞，如通过在所述病毒载体的存在下旋转接种刺激的T细胞来进行，然后将转导的T细胞在静态条件下孵育在或在约42小时与84小时之间，包含端值；以及收获或收集T细胞。

在一些实施方案中，所提供的用于产生工程化细胞群体的方法包括以下中的一项或多项：在含有重组IL-2、IL-7和IL-15的无血清培养基中，在具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白(其量为对于每10⁶个细胞在或在约0.4μg与8μg之间，包含端值，例如，对于每10⁶个细胞1.2μg)的存在下，将T细胞的输入群体刺激18小时与30小时之间，包含端值；通过以下方式用编码重组受体的病毒载体转导细胞：首先将细胞在病毒载体的存在下以693g的力旋转接种30分钟，然后将旋转接种的细胞与病毒载体一起孵育24小时与96小时之间，包含端值；将生物素(例如，D-生物素)添加至细胞以从细胞去除或分离具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白；以及收集或收获细胞。

在一些实施方案中，从刺激开始在或在约36小时与96小时之间(包含端值)，收获或收集细胞。在各种实施方案中，在开始刺激之后36小时与108小时之间或48小时与96小时之间(包含端值)，收获或收集细胞。在特定实施方案中，在开始刺激之后36小时与96小时之间或48小时与72小时之间(包含端值)，将具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白从细胞去除或分离。

在一些实施方案中，在从刺激开始为或为约48小时(例如，48小时±6小时)之后，将具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白从细胞去除或分离(例如，如章节II-C-6所述)。在特定实施方案中，在从刺激开始为或为约72小时(例如，72小时±6小时)之后，将具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白从细胞去除或分离。在特定实施方案中，在从刺激开始为或为约96小时(例如，96小时±6小时)之后，将具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白从细胞去除或分离。在特定实施方案中，在孵育之后将具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白从细胞去除或分离，并且在添加生物素或生物素类似物之后收集或收获细胞。在某些实施方案中，在孵育期间将具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白从细胞去除或分离，使得在添加生物素或生物素类似物之后将细胞返回到孵育。

在一些实施方案中，孵育在重组细胞因子(例如IL-2、IL-7和IL-15)的存在下在无血清培养基中进行。在某些实施方案中，孵育在不存在重组细胞因子的情况下进行。在特定实施方案中，孵育在基础培养基的存在下进行。在某些实施方案中，如与其中将用寡聚刺激试剂刺激的细胞在含有重组细胞因子的无血清培养基的存在下孵育的过程相比，在基础培养基中的孵育促进整合(例如，异源或重组核苷酸的稳定整合)，增加表达重组受体的细胞的百分比，改进效力，或者降低细胞的分化。

在特定实施方案中，如通过添加生物素或生物素类似物去除寡聚刺激试剂(例如，具有可逆地附着的抗CD3/抗CD28 Fab的寡聚链霉亲和素突变蛋白)减少在从细胞分离或去除刺激试剂时可能发生的细胞损失的量。在一些实施方案中，在从细胞分离或去除寡聚刺激试剂时，从细胞群体损失、杀伤或分离小于或小于约30％、25％、20％、15％、10％或5％的细胞。在某些实施方案中，从使用寡聚刺激试剂进行刺激的过程产生的输出群体具有的总细胞比从利用替代性刺激试剂(如抗体缀合的顺磁珠)的过程产生的输出群体多为、为约或至少15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％。

3.用于基因工程化的载体和方法

在一些实施方案中，与所提供的方法、用途、制品或组合物结合使用的工程化细胞(如T细胞)是已经基因工程化以表达本文所述的重组受体(例如，CAR)的细胞。在一些实施方案中，所述细胞是通过引入、递送或转移编码所述重组受体和/或其他分子的核酸序列来工程化。

在一些实施方案中，用于产生工程化细胞的方法包括将编码重组受体(例如，抗CD19 CAR)的多核苷酸引入至细胞，例如像经刺激或激活的细胞中。在特定实施方案中，重组蛋白是重组受体，如任何所述的。将编码重组蛋白(如重组受体)的核酸分子引入细胞中可以使用许多已知载体中的任一种进行。此类载体包括病毒和非病毒系统，包括慢病毒和γ逆转录病毒系统，以及基于转座子的系统，如基于PiggyBac或Sleeping Beauty的基因转移系统。示例性方法包括用于转移编码受体的核酸的那些，包括通过病毒(如逆转录病毒或慢病毒)、转导、转座子和电穿孔来进行。在一些实施方案中，工程化产生经富集T细胞的一种或多种工程化组合物。

在一些实施方案中，所提供的方法包括将细胞基因工程化，例如，引入编码重组蛋白的异源或重组多核苷酸。此类重组蛋白可以包括重组受体，如章节II-A中所述的任一种。可以使用将导致编码重组受体的多核苷酸整合至细胞如T细胞的基因组中的引入异源或重组多核苷酸的任何方法，包括病毒和非病毒基因工程化过程。将编码重组蛋白的多核苷酸(例如，异源或重组多核苷酸)引入细胞中可以使用多种已知载体中的任一种来进行。这样的载体包括病毒系统，包括慢病毒和γ逆转录病毒系统。示例性方法包括用于转移编码受体的异源多核苷酸的那些方法，包括经由病毒(例如，逆转录病毒或慢病毒)转导。在一些实施方案中，将刺激细胞群体基因工程化，如以引入编码重组受体的异源或重组多核苷酸，从而产生转化细胞的群体(本文中也称为转化细胞群体)。

在一些实施方案中，所提供的方法包括使用非病毒方法将细胞基因工程化，例如，引入编码重组蛋白的异源或重组多核苷酸，所述非病毒方法如电穿孔、磷酸钙转染、原生质体融合、阳离子脂质体介导的转染、纳米颗粒如脂质纳米颗粒、钨颗粒促进的微粒轰击、磷酸锶DNA共沉淀以及在例如WO 2014055668和美国专利号7,446,190中所述的其他方法。还考虑基于转座子的系统。

在特定实施方案中，在将细胞在刺激条件下刺激、激活和/或孵育后，将细胞基因工程化、转化或转导，如通过本文例如在章节II中提供的任何方法来进行。在特定实施方案中，一个或多个刺激的群体先前已经进行低温保护和储存，并且在基因工程化、转化、转染或转导细胞之前解冻并任选地洗涤。

在特定实施方案中，在对细胞进行刺激或使其经受刺激或在刺激条件下培养之后，将细胞基因工程化、转化或转导。在特定实施方案中，在从刺激开始起的以下时间、约以下时间或以下时间内，将细胞基因工程化、转化或转导：72小时、60小时、48小时、36小时、24小时或12小时，包含端值。在特定实施方案中，在从刺激开始起的以下时间、约以下时间或以下时间内，将细胞基因工程化、转化或转导：3天、两天或一天，包含端值。在某些实施方案中，在开始刺激之后在或在约12小时与48小时之间、16小时与36小时之间或18小时与30小时之间，将细胞基因工程化、转化或转导。在特定实施方案中，在开始刺激之后在或在约18小时与30小时之间，将细胞基因工程化、转化或转导。在特定实施方案中，在开始刺激之后在或在约16小时、18小时、20小时、22小时或24小时，将细胞基因工程化、转化或转导。

在某些实施方案中，用于基因工程化的方法是通过以下方式来进行：使群体的一个或多个细胞与编码重组蛋白例如重组受体的核酸分子或多核苷酸接触，或向所述细胞中引入所述核酸分子或多核苷酸。在某些实施方案中，核酸分子或多核苷酸对于所述细胞是异源的。在特定实施方案中，异源核酸分子或异源多核苷酸对于所述细胞并非天然的。在某些实施方案中，异源核酸分子或异源多核苷酸编码并非所述细胞天然表达的蛋白质，例如，重组蛋白。在特定实施方案中，所述异源核酸分子或多核苷酸是或含有在所述接触或引入之前在所述细胞中未发现的核酸序列。

在一些实施方案中，在转导佐剂的存在下将所述细胞(例如，刺激的细胞)工程化(例如，转导)。示例性转导佐剂包括但不限于聚阳离子、纤连蛋白或纤连蛋白来源的片段或变体、以及RetroNectin。在某些实施方案中，在聚阳离子、纤连蛋白或纤连蛋白来源的片段或变体和/或RetroNectin的存在下将所述细胞工程化。在特定实施方案中，在聚阳离子的存在下将所述细胞工程化，所述聚阳离子是聚凝胺、DEAE-葡聚糖、硫酸鱼精蛋白、聚-L-赖氨酸或阳离子脂质体。在特定实施方案中，在硫酸鱼精蛋白的存在下将所述细胞工程化。在一些实施方案中，寡聚刺激试剂的存在(例如，如章节II-C-2中所述)可以用作转导佐剂，参见例如，WO/2017/068419，所述申请通过引用并入本文。

在一些实施方案中，基因工程化(例如，转导)是在无血清培养基中进行，例如如本文中或在PCT/US2018/064627中所述。在一些实施方案中，所述无血清培养基是定义的或明确定义的细胞培养基。在某些实施方案中，所述无血清培养基是受控培养基，其已经过处理，例如被过滤以去除抑制剂和/或生长因子。在一些实施方案中，所述无血清培养基含有蛋白质。在某些实施方案中，所述无血清培养基可以含有血清白蛋白、水解产物、生长因子、激素、载体蛋白和/或附着因子。

在特定实施方案中，在一种或多种细胞因子的存在下将细胞工程化。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员。在一些实施方案中，细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-15。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-7。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括重组IL-2。

在特定实施方案中，在刺激条件下在IL-2、IL-7和/或IL-15的存在下将细胞(例如，刺激的细胞)工程化。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是重组的。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是人的。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括人重组IL-2、IL-7和/或IL-15。在某些实施方案中，所述细胞被工程化(例如，转导)，或在刺激条件下，在重组IL-2、IL-7和IL-15(如重组人IL-2(例如，100IU/mL)、重组人IL-7(例如，600IU/mL)和/或重组人IL-15(例如，100IU/mL))的存在下。

在一些实施方案中，在与刺激期间存在的培养基相同或相似的培养基的存在下将细胞基因工程化、转化或转导。在一些实施方案中，在具有与刺激期间存在的培养基相同的细胞因子的培养基中将细胞基因工程化、转化或转导。在某些实施方案中，在以相同浓度具有与刺激期间存在的培养基相同的细胞因子的培养基中将细胞基因工程化、转化或转导。

在一些实施方案中，将细胞基因工程化是或包括将多核苷酸(例如，异源或重组多核苷酸)通过转导引入细胞中。在一些实施方案中，所述细胞用病毒载体进行转导或经受转导。在特定实施方案中，所述细胞用病毒载体进行转导或经受转导。在一些实施方案中，所述病毒是逆转录病毒载体，如γ逆转录病毒载体或慢病毒载体。慢病毒转导的方法是已知的。示例性方法描述于例如以下文献中：Wang等人(2012)J.Immunother.35(9):689-701；Cooper等人(2003)Blood.101:1637-1644；Verhoeyen等人(2009)Methods Mol Biol.506:97-114；以及Cavalieri等人(2003)Blood.102(2):497-505。

在一些实施方案中，转导通过使群体的一个或多个细胞与编码重组蛋白(例如重组受体)的核酸分子接触来进行。在一些实施方案中，所述接触可以通过离心如旋转接种(例如离心接种)来实现。此类方法包括如国际公开号WO 2016/073602中所述的那些方法中的任一种。示例性离心室包括由Biosafe SA生产和销售的那些，包括用于

和

2系统的那些，包括A-200/F和A-200离心室以及用于此类系统的各种试剂盒。示例性室、系统和处理仪器和机柜描述于例如以下文献中：美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和公开的美国专利申请公开号US 2008/0171951，以及公开的国际专利申请公开号WO00/38762，将其各自的内容通过引用以其全文并入本文。用于此类系统的示例性试剂盒包括但不限于由BioSafe SA以产品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1或CS-900.2销售的一次性试剂盒。

在特定实施方案中，使已经经受刺激(例如，在刺激条件下培养)的组合物中为、为约或为至少50x10⁶、100x10⁶、150x10⁶、200x10⁶、250x10⁶、300x10⁶、350x10⁶、400x10⁶、450x10⁶、500x10⁶、550x10⁶、600x10⁶、700x10⁶、800x10⁶、900x10⁶、或1,000x10⁶的量的细胞经受基因工程化，例如，转导。在特定实施方案中，已经经受刺激并且随后经受转导的细胞(例如，活T细胞，包括CD4+ T细胞和CD8+ T细胞两者)的总数量是为或约50x10⁶个细胞、为或约100x10⁶个细胞、为或约150x10⁶个细胞、为或约200x10⁶个细胞、为或约250x10⁶个细胞、为或约300x10⁶个细胞、为或约350x10⁶个细胞、为或约400x10⁶个细胞、为或约450x10⁶个细胞、为或约500x10⁶个细胞、为或约550x10⁶个细胞、为或约600x10⁶个细胞、为或约700x10⁶个细胞、为或约800x10⁶个细胞、为或约900x10⁶个细胞、或者为或约1,000x10⁶个细胞，或者任何前述值之间的任何值。在特定实施方案中，使输入群体中多达900x10⁶个细胞经受刺激，并且使为、为约或多达600x10⁶个细胞的量的已经经受刺激的细胞经受基因工程化，例如，转导。在特定实施方案中，经受基因工程化(例如，转导)的细胞组合物以如下比率包含活CD4+T细胞和活CD8+ T细胞：在1:10与10:1之间、在1:5与5:1之间、在4:1与1:4之间、在1:3与3:1之间、在2:1与1:2之间、在1.5:1与1:1.5之间、在1.25:1与1:1.25之间、在1.2:1与1:1.2之间、在1.1:1与1:1.1之间、或约1:1、或1:1的活CD4+ T细胞与活CD8+T细胞。

在一些实施方案中，所提供的方法与将含有编码重组受体的多核苷酸的病毒载体转导至为、为约或少于300x10⁶个细胞(例如，刺激的细胞群体的活T细胞)中结合使用。在某些实施方案中，对为或约100x10⁶个细胞(例如，刺激的细胞群体的活T细胞)进行转导或使其经历转导。

在一些实施方案中，所提供的方法与将含有编码重组受体的多核苷酸的病毒载体转导至为、为约或少于600x10⁶个细胞(例如，刺激的细胞群体的活T细胞)中结合使用。在某些实施方案中，对为或约600x10⁶个细胞(例如，刺激的细胞群体的活T细胞)进行转导或使其经历转导。在一些实施方案中，使多达900x10⁶个细胞(例如，活CD3+细胞或混合的活CD4+和活CD8+细胞(例如，以为或为约1:1比率混合))经受刺激，并且使为、为约或多达600x10⁶个细胞的量的已经经受刺激的细胞经受转导。

在一些实施方案中，转导在无血清培养基中进行。在一些实施方案中，转导在IL-2、IL-7和IL-15的存在下进行。在一些实施方案中，将用于转导的病毒载体在使用前冷冻并解冻，并用无血清培养基稀释解冻的病毒载体。在一些实施方案中，用于稀释病毒载体和用于转导的无血清培养基如本文中或PCT/US2018/064627中所述。

在一些实施方案中，无血清培养基包含补充有一种或多种补充剂的基础培养基(例如OpTmizer^TMT细胞扩增基础培养基(ThermoFisher))。在一些实施方案中，所述一种或多种补充剂不含血清。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含补充有一种或多种另外的组分的基础培养基，所述另外的组分用于细胞(例如，T细胞)的维持、扩增和/或激活，如由另外的补充剂(例如OpTmizer^TMT细胞扩增补充剂(ThermoFisher))来提供。在一些实施方案中，所述无血清培养基还包含血清替代物补充剂，例如，免疫细胞血清替代物，例如，ThermoFisher(#A2596101)、CTS^TM免疫细胞血清替代物、或Smith等人Clin TranslImmunology.2015年1月；4(1):e31中所述的免疫细胞血清替代物。在一些实施方案中，无血清培养基还包含游离形式的氨基酸，如L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，无血清培养基还包含二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)，如Glutamax^TM(ThermoFisher)中的二肽。在一些实施方案中，无血清培养基还包含一种或多种重组细胞因子，如重组人IL-2、重组人IL-7和/或重组人IL-15。

在特定实施方案中，所述细胞(例如，刺激的细胞群体的细胞)含有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的作为CD4+ T细胞或CD8+ T细胞的细胞。在一些实施方案中，转导(包括转导后孵育)进行24小时与48小时之间、36小时与12小时之间、18小时与30小时之间，或者进行或进行约24小时。在一些实施方案中，转导(包括转导后孵育)分别进行或进行约24小时、48小时或72小时，或者进行或进行约1天、2天或3天。在特定实施方案中，转导(包括转导后孵育)进行或进行约24小时±6小时、48小时±6小时或72小时±6小时。在特定实施方案中，转导(包括转导后孵育)进行或进行约72小时、72±4小时，或者进行或进行约3天。

在某些实施方案中，在起始或开始孵育(例如，在刺激条件下孵育)的两天内、36小时内、30小时内、24小时内、18小时内、16小时内、14小时内、或12小时内，开始转导步骤。在某些实施方案中，在起始或开始孵育(例如，在刺激条件下孵育)约20小时，开始转导步骤。在某些实施方案中，在起始或开始孵育(例如，在刺激条件下孵育)20±4小时，开始转导步骤。

在一些实施方案中，将系统与其他仪器一起包括和/或置于与其他仪器相关联，所述其他仪器包括用于操作、自动化、控制和/或监测转导步骤以及在系统中执行的一个或多个各种其他处理步骤(例如，可以使用或结合如本文或在国际公开号WO 2016/073602中所述的离心室系统进行的一个或多个处理步骤)的方面的仪器。在一些实施方案中，这种仪器容纳于机柜中。在一些实施方案中，所述仪器包括机柜，所述机柜包括外壳，所述外壳含有控制电路、离心机、罩、电机、泵、传感器、显示器和用户界面。示例性装置描述于美国专利号6,123,655、美国专利号6,733,433和US 2008/0171951中。

在一些实施方案中，所述系统包含一系列容器，例如袋、管路、旋塞、夹子、连接器和离心室。在一些实施方案中，所述容器(如袋子)包括一个或多个容器(例如袋子)，其在同一容器或单独容器(例如同一袋子或单独袋子)中含有待转导的细胞和病毒载体颗粒。在一些实施方案中，所述系统还包括一个或多个容器(例如袋)，所述容器含有介质，例如稀释剂和/或洗涤溶液，在所述方法期间将所述介质抽入室和/或其他部件中以稀释、重悬和/或洗涤组分和/或组合物。所述容器可以连接在系统中的一个或多个位置，例如连接在对应于输入管线、稀释剂管线、洗涤管线、废液管线和/或输出管线的位置。

在一些实施方案中，所述室与离心机相关联，离心机能够实现所述室的旋转，例如围绕其旋转轴旋转。结合细胞的转导和/或在一个或多个其他处理步骤中，旋转可以发生在孵育之前、期间和/或之后。因此，在一些实施方案中，各个处理步骤中的一个或多个在旋转下(例如在特定的力下)进行。所述室通常能够竖直或大致竖直地旋转，使得所述室在离心期间竖直放置，并且侧壁和轴是竖直或大致竖直的，且一个或多个端壁是水平或大致水平的。

在一些实施方案中，在将群体提供至空腔之前，可以将含有细胞的群体和含有病毒载体颗粒的群体和任选地空气组合或混合。在一些实施方案中，含有细胞的群体和含有病毒载体颗粒的群体和任选地空气是单独提供并且在空腔中组合并混合。在一些实施方案中，可以按任何顺序将含有细胞的群体、含有病毒载体颗粒的群体和任选地空气提供至内部空腔中。在这样的一些实施方案中的任一个中，含有细胞和病毒载体颗粒的群体在组合或混合在一起后就是输入群体，不论是在离心室内部还是外部组合或混合的，和/或不论细胞和病毒载体颗粒是一起还是单独(如同时或依序)提供至离心室中。

在一些实施方案中，在转导方法中，在孵育细胞和病毒载体颗粒(如旋转)之前，进行一定体积的气体(如空气)的摄入。在一些实施方案中，在转导方法中在细胞和病毒载体颗粒的孵育(如旋转)期间进行一定体积的气体(如空气)的摄入。

在一些实施方案中，构成转导群体的细胞或病毒载体颗粒的液体体积、以及任选地空气的体积可以是预先确定的体积。所述体积可以是被编程到系统中和/或由与所述系统相关联的电路控制的体积。

在一些实施方案中，手动、半自动和/或自动地控制转导群体和任选地气体(如空气)的摄入，直到已经将所需或预先确定的的体积摄入室的内部空腔中为止。在一些实施方案中，与系统相关的传感器可以例如经由其颜色、流速和/或密度来检测流入和流出离心室的液体和/或气体，并且可以与相关电路通信以按照需要停止或继续摄入，直到已经实现这种所需或预先确定的体积的摄入为止。在一些方面，可以使被编程或仅能够检测系统中的液体而非气体(例如空气)的传感器能够在不停止摄入的情况下允许气体(如空气)通过进入系统中。在一些此类实施方案中，当需要气体(如空气)摄入时，可以将一条不透明的管道放置在传感器附近的线中。在一些实施方案中，可以手动地控制气体(如空气)的摄入。

在所提供的方法的方面，使离心室的内部空腔经历高速旋转。在一些实施方案中，在摄入液体输入群体和任选地空气之前、同时、之后或间歇地实现旋转。在一些实施方案中，在摄入液体输入群体和任选地空气之后实现旋转。在一些实施方案中，旋转通过离心室的离心来进行，其在内部空腔的侧壁内表面处和/或在细胞的表面层处的相对离心力为或约或者至少或至少约200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、1000g、1100g、1500、1600g、1800g、2000g、2200g、2500g、3000g、3200g、3500g或4000g。在一些实施方案中，旋转通过离心进行，其力大于或大于约1100g，如大于或大于约1200g、大于或大于约1400g、大于或大于约1600g、大于或大于约1800g、大于或大于约2000g、大于或大于约2400g、大于或大于约2800g、大于或大于约3000g或者大于或大于约3200g。在特定实施方案中，通过离心进行的旋转的力在600g与800g之间。在特定实施方案中，通过离心进行的旋转的力为或为约693g。在一些实施方案中，旋转通过离心进行，其力为或为约1600g。

在一些实施方案中，将室的空腔中的气体(如空气)从室中排出。在一些实施方案中，将气体(如空气)排出到容器，所述容器作为封闭系统的一部分与离心室可操作地连接。在一些实施方案中，容器是自由或空的容器。在一些实施方案中，室的空腔中的空气(如气体)通过过滤器排出，所述过滤器经由无菌管组线与室的内部空腔可操作地连接。在一些实施方案中，使用手动、半自动或自动过程排出空气。在一些实施方案中，在从室的空腔中输送(express)含有孵育的细胞和病毒载体颗粒(如已经开始转导的细胞或已经用病毒载体转导的细胞)的输出群体之前、同时、间歇地或随后将空气从室中排出。

在一些实施方案中，转导和/或其他孵育作为连续或半连续过程或作为所述连续或半连续过程的一部分进行。在一些实施方案中，连续过程涉及连续摄入细胞和病毒载体颗粒，例如转导组合物(作为单一预先存在的组合物，或者通过连续抽入同一容器(例如空腔)中，从而混合其部分)，和/或在孵育的至少一部分期间(例如，在离心的同时)，从容器中连续输送或排出液体，以及任选地排出气体(例如空气)。在一些实施方案中，至少部分同时进行连续摄入和连续输送。在一些实施方案中，连续摄入发生在部分孵育期间，例如在部分离心期间，并且连续输送发生在孵育的单独部分期间。两者可以交替进行。因此，在进行孵育的同时，连续摄入和输送可以允许处理(例如转导)总体积更大的样品。

在一些实施方案中，孵育是连续过程的一部分，所述方法包括在孵育的至少一部分期间，实现在室旋转期间以及在孵育的一部分期间将所述转导组合物连续摄入空腔中，实现在室的旋转期间通过所述至少一个开口自空腔连续输送液体并任选地排出气体(例如空气)。

在一些实施方案中，通过在以下步骤之间交替来进行半连续孵育：实现将组合物摄入空腔中，孵育，自空腔输送液体和任选地自空腔排出气体(例如空气)，如到输出容器，然后摄入含有更多细胞和用于处理的其他试剂(例如，病毒载体颗粒)的随后的(例如第二、第三等)组合物，并重复所述过程。例如，在一些实施方案中，孵育是半连续过程的一部分，所述方法包括在孵育之前，实现通过所述至少一个开口将转导组合物摄入空腔中，并在孵育之后，实现从空腔中输送流体；实现将包含细胞和病毒载体颗粒的另一种转导组合物摄入所述内部空腔中；并且在所述内部空腔中在一定条件下孵育另一种转导组合物，借此将所述另一种转导组合物中的所述细胞用所述载体转导或经历转导。所述过程能以迭代的方式继续进行许多另外的回合。在此方面，半连续或连续方法可以允许产生甚至更大体积和/或数量的细胞。

在一些实施方案中，转导孵育的一部分在离心室中进行，其在包括旋转或离心的条件下进行。

在特定实施方案中，用病毒载体转导细胞是或包括旋转接种，例如，含有细胞和病毒颗粒的混合物的离心。在一些实施方案中，可以使含有细胞和病毒颗粒的组合物旋转，通常以相对较低的力或速度旋转，如速度低于用于沉淀细胞的速度，如从或从约600rpm至1700rpm(例如，为或约或至少600rpm、1000rpm、或1500rpm、或1700rpm)。在一些实施方案中，旋转以如下力(例如，相对离心力)进行：从或从约100g至4000g(例如为或约或者至少或至少约100g、200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、900g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g或3500g)，如例如在室或空腔的内壁或外壁处所测量。

在一些实施方案中，将所述细胞用病毒载体以如下力(例如，相对离心力)旋转接种：在或在约100g与4000g之间、200g与1,000g之间、500g与1200g之间、1000g与2000g之间、600g与800g之间、1200g与1800g之间、或1500g与1800g之间。在某些实施方案中，将所述细胞用病毒载体颗粒以如下力旋转接种：为、为至少或为约100g、200g、300g、400g、500g、600g、700g、800g、900g、1000g、1200g、1500g、1600g、2000g、2500g、3000g、3200g、或3500g。在一些实施方案中，将所述细胞用病毒载体以为或为约692g或693g的力进行转导或经受转导。在特定实施方案中，将所述细胞用病毒载体以为或为约1600g的力进行转导或经受转导。在一些实施方案中，所述力是在内部空腔的侧壁的内表面处和/或在细胞的表面层处的力。

在某些实施方案中，将细胞旋转接种，例如，使含有细胞和病毒载体的细胞组合物旋转，进行大于或大于约5分钟，如大于或大于约10分钟、大于或大于约15分钟、大于或大于约20分钟、大于或大于约30分钟、大于或大于约45分钟、大于或大于约60分钟、大于或大于约90分钟或者大于或大于约120分钟；或者在或在约5分钟与120分钟之间、30分钟与90分钟之间、15分钟与60分钟之间、15分钟与45分钟之间、30分钟与60分钟之间或45分钟与60分钟之间，每个都包含端值。在一些实施方案中，将细胞用病毒载体旋转接种，进行为或为约30分钟。在某些实施方案中，将细胞用病毒载体旋转接种，进行为或为约60分钟。

在一些实施方案中，转导方法包括转导组合物和任选地空气在离心室中的旋转接种(例如，旋转或离心)，持续大于或大于约5分钟，如大于或大于约10分钟、大于或大于约15分钟、大于或大于约20分钟、大于或大于约30分钟、大于或大于约45分钟、大于或大于约60分钟、大于或大于约90分钟或者大于或大于约120分钟。在一些实施方案中，将转导组合物和任选地空气在离心室中旋转或离心，持续大于5分钟，但持续不超过60分钟、不超过45分钟、不超过30分钟或不超过15分钟。在特定实施方案中，转导包括旋转或离心持续或持续约60分钟。

在一些实施方案中，转导方法包括转导组合物和任选地空气在离心室中旋转或离心，进行在或在约10分钟与60分钟之间、15分钟与60分钟之间、15分钟与45分钟之间、30分钟与60分钟之间或45分钟与60分钟之间，每个都包含端值，并且其在内部空腔的侧壁的内表面处和/或在细胞的表面层处的力为、为约或在1000g、1100g、1200g、1400g、1500g、1600g、1800g、2000g、2200g、2400g、2800g、3200g或3600g。在特定实施方案中，转导方法包括转导组合物(例如，细胞和病毒载体颗粒)以为或为约1600g旋转或离心，进行为或为约60分钟。

4.载体拷贝数(VCN)

在一些实施方案中，转基因序列(如编码重组受体例如CAR的转基因序列)的基因组整合可以在与用于工程化细胞的任何所提供过程结合产生的细胞中进行评估。在一些实施方案中，评估整合拷贝数，其是整合至细胞的染色体DNA或基因组DNA中的转基因序列的拷贝数。

在一些实施方案中，用于评估转基因序列的基因组整合的方法涉及从自一种或多种细胞分离的DNA分开脱氧核糖核酸(DNA)的高分子量级分，如大于或大于约10千碱基(kb)的DNA种类。在一些方面，这种分离可以通过诸如脉冲场凝胶电泳(PFGE)的方法进行。在一些方面，所述一个或多个细胞含有或被怀疑含有至少一个工程化细胞，所述至少一个工程化细胞包含编码重组蛋白的转基因序列。在一些方面，所述方法涉及确定整合到所述一个或多个细胞的基因组中的转基因序列的存在、不存在或量，例如通过定量方法(如定量聚合酶链式反应(qPCR)、数字PCR(dPCR)或微滴式数字PCR(ddPCR))来确定。

在一些实施方案中，所述高分子量级分主要含有大DNA分子如染色体或基因组DNA，并且含有低的或几乎不含大小小于阈值的分子，如质粒、非整合的DNA片段、线性互补DNA(cDNA)、自体整合体(autointegrant)、长末端重复序列(LTR)环或者尚非整合至基因组中的其他残余种类或分子。在一些实施方案中，通过确定所述高分子量级分中转基因序列的存在、不存在或量，所检测到的转基因序列表示已整合到工程化细胞的基因组中的那些，并且最小限度地检测到非整合转基因序列。

在一些实施方案中，所述高分子量级分包含大小大于或大于约10千碱基(kb)的DNA分子。在一些实施方案中，所述高分子量级分包含大小大于或大于约10、11、12、12.5、13、14、15、16、17、17.5、18、19、20、25或30千碱基(kb)或更大的DNA分子。在一些实施方案中，所述高分子量级分包含大小大于或大于约10、12.5、15、17.5或20千碱基(kb)或更大的DNA分子。在一些方面，所述高分子量级分含有基因组DNA或基因组DNA片段，并且排除或分离可能存在于DNA样品中的非整合或残留的核酸种类。在一些方面，所述高分子量级分例如高于阈值(如约10、11、12、12.5、13、14、15、16、17、17.5、18、19、20、25或30千碱基(kb)或更大)的DNA样品。在一些实施方案中，所述阈值大于或大于约10、12.5、15、17.5或20千碱基(kb)或更大。

在一些实施方案中，使用基于电泳的方法分开或分离所述高分子量级分。在一些方面，电泳依据电荷和/或大小经由在存在电场的情况下通过分离基质的迁移率分离生物分子。在一些实施方案中，电泳系统可以用于基于大小或分子量来分级分离、分析和收集特定分析物，包括核酸分子。在一些方面，级分是或包括所述多个分子的子集。在一些方面，可以通过大小或分子量来定义或确定级分，或者在一些方面通过任何如下物理特性来定义或确定级分，当由电场力驱动其迁移通过本发明的缓冲液组合物时，所述物理特性使其以比多个分子或级分中的其他分子或级分更快或更慢的速率(即，电泳迁移率)迁移。

在一些实施方案中，使用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分开或分离所述高分子量级分。在一些方面，PFGE涉及在电泳系统中引入交流电压梯度以提高较大核酸分子(如染色体或基因组DNA)的分辨率。在一些方面，所述电泳系统的电压在三个方向之间周期性地切换：一个沿着凝胶的中心轴，并且两个沿着两侧60度的角度。在一些方面，用于通过PFGE分开或分离核酸分子的示例性系统和方法包括在例如US 9599590、US 2017/0240882或US 2017/0254774中描述的那些。

在一些方面，所述电泳(如PFGE)可以使用设备或系统来进行。在一些方面，所述设备或系统是自动化系统或高通量系统。用于进行PFGE的示例性系统包括例如US 9599590、US 2017/0240882或US 2017/0254774中所述的那些，或可商购的设备或系统，如PippinPrep、Blue Pippin或Pippin HT(Sage Science)；CHEF

XA系统、

III变角度系统、CHEF-DR II系统(Bio-Rad)；和Biometra Rotaphor 8系统(Analytik Jena AG)。

在一些方面，用于评估的示例性样品包括核酸、寡核苷酸、DNA分子、RNA分子或其任何组合。在一些方面，所述样品可以包括氨基酸、肽、蛋白质或其任何组合。在一些方面，所述样品可以是全细胞裂解物或细胞裂解物(如工程化用于过继细胞疗法的细胞的裂解物)的DNA或蛋白质级分。

在一些实施方案中，来自样品的核酸可以包括基因组DNA、双链DNA(dsDNA)、单链DNA(ssDNA)、编码DNA(或cDNA)、信使RNA(mRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、单链RNA、双链RNA(dsRNA)、吗啉代、RNA干扰(RNAi)分子、线粒体核酸、叶绿体核酸、病毒DNA、病毒RNA和具有单独遗传物质的其他细胞器。在一些方面，来自样品的核酸还可以包括含有经修饰的、合成的或非天然存在的核苷酸或结构元件的核酸类似物或者其他替代/经修饰的核酸化学物质(如碱基类似物(如肌苷)、嵌入剂(美国专利号4,835,263)和小沟结合剂(美国专利号5,801,115)。

在一些实施方案中，在分离或分开高分子量或低分子量级分之前，可以将样品与如下试剂组合，所述试剂在电泳系统中评估之前赋予净负电荷、使肽或蛋白质变性或消化DNA或RNA分子。在一些方面，出于检测的目的，可以将样品与赋予样品或其级分荧光、磁性或放射性特性的药剂组合。在一些例子中，将dsDNA样品与溴化乙锭混合，施加至电泳盒，并且使用超亮绿色LED检测样品的级分。

在一些方面，用于分开或分离核酸样品的系统(如电泳系统)可以是自动化的和/或高通量的。在一些方面，所述电泳系统可以利用一次性消耗品或试剂，如电泳盒。

在一些方面，确定转基因序列的存在、不存在或量可以使用用于确定核酸序列的存在、不存在或量的方法来进行。特别地，用于定量核酸序列的方法(如定量聚合酶链式反应(qPCR)或相关方法)可以用于确定含有DNA的样品中或从含有DNA的样品分开或分离的特定级分(如高分子量级分)中的转基因序列的拷贝数。在一些实施方案中，确定转基因序列的存在、不存在或量包括例如使用下文用于对核酸分子进行定量的任一种示例性测定来确定拷贝数。

在一些方面，可以使用探针或引物检测特定序列的存在、不存在和/或量，所述探针或引物可以特异性结合或识别所述转基因序列的全部或一部分。在一些实施方案中，可以使用探针或引物序列来确定拷贝数，所述探针可以特异性检测所述转基因序列的一部分，所述引物序列可以特异性扩增所述转基因序列的一部分。在一些方面，所述探针或引物序列可以特异性检测、结合或识别所述转基因序列的一部分，如所述转基因序列中对细胞而言为异源的、外源的或转基因的部分。在一些实施方案中，用于qPCR或其他基于核酸的方法的引物或探针对结合、识别和/或扩增编码重组蛋白的核酸和/或所述质粒和/或载体的其他组分或元件具有特异性，所述其他组分或元件包括调节元件(例如启动子、转录和/或转录后调节元件或反应元件)或标记物(例如替代标记物)。在一些方面，所述探针或引物可以用于确定转基因序列的存在、不存在和/或量的示例性方法，如定量PCR(qPCR)、数字PCR(dPCR)或微滴式数字PCR(ddPCR)。

在一些方面，确定所述存在、不存在或量包括确定所述转基因序列的量，如确定在一个或多个细胞中或在含有一个或多个细胞的生物样品中所述转基因序列的质量、重量、浓度或拷贝数。在一些方面，确定核酸序列的存在、不存在或量或评估所述转基因序列的质量、重量、浓度或拷贝数可以在细胞群体的一部分或生物样品的一部分中进行，并且可以进行归一化、平均、和/或外推以确定整个样品或整个细胞群体中的存在、不存在或量。

在一些实施方案中，确定所述转基因序列的存在、不存在或量包括确定所述一个或多个细胞中的每个二倍体基因组或每个细胞中所述转基因序列的质量、重量、浓度或拷贝数。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞构成细胞群体，其中所述群体的多个细胞包含编码所述重组蛋白的转基因序列。在一些实施方案中，所述拷贝数是所述细胞群体中的每个二倍体基因组或每个细胞中的平均或均值拷贝数。

在一些方面，确定所述拷贝数包括确定存在于一个或多个细胞或生物样品中的转基因序列的拷贝数。在一些方面，所述拷贝数可以表示为平均或均值拷贝数。在一些方面，特定整合转基因的拷贝数包括每个细胞中的整合体(含有转基因序列)的数量。在一些方面，特定整合转基因的拷贝数包括每个二倍体基因组中的整合体(含有转基因序列)的数量。在一些方面，转基因序列的拷贝数表示为每个细胞中的整合转基因序列的数量。在一些方面，转基因序列的拷贝数表示为每个二倍体基因组中的整合转基因序列的数量。在一些方面，所述一个或多个细胞构成细胞群体，其中所述群体的多个细胞包含编码所述重组蛋白的转基因序列。在一些实施方案中，所述拷贝数是所述细胞群体中的每个二倍体基因组或每个细胞中的平均或均值拷贝数。

在一些实施方案中，确定所述转基因序列的量包括评估所述一个或多个细胞的每个细胞中、任选每个CD3+、CD4+和/或CD8+细胞中和/或每个表达所述重组蛋白的细胞中所述转基因序列的质量、重量、浓度或拷贝数。在一些方面，可以使用基于细胞的方法(如通过流式细胞术或免疫染色)来确定在细胞上表达的表面标记物或表型。在一些方面，表达重组蛋白的细胞可以使用基于细胞的方法来确定，如通过流式细胞术或免疫染色(例如使用抗独特型抗体或针对替代标记物染色)来进行。在一些方面，转基因序列的量可以针对特定细胞(如CD3+、CD4+和/或CD8+细胞)的数量来归一化，和/或按照表达重组蛋白的细胞或按照细胞总数(如按照样品中的细胞总数或按照正在经历工程化过程的细胞总数)来归一化。

在一些实施方案中，所确定的拷贝数表示为归一化值。在一些实施方案中，将所确定的拷贝数定量为每个基因组或每个细胞中的转基因序列的拷贝数。在一些方面，每个基因组的值表示为每个二倍体基因组中的转基因序列的拷贝，因为典型的体细胞(如T细胞)含有二倍体基因组。在一些方面，所确定的拷贝数可以针对细胞的基因组中已知参考基因的拷贝数归一化。在一些方面，参考基因是RRP30(编码核糖核酸酶P蛋白亚基p30)、或18SrRNA(编码18S核糖体RNA)、28S rRNA(编码28S核糖体RNA)、TUBA(编码α-微管蛋白)、ACTB(编码β-肌动蛋白)、β2M(编码β2-微球蛋白)、ALB(编码白蛋白)、RPL32(编码核糖体蛋白L32)、TBP(编码TATA序列结合蛋白)、CYCC(编码亲环蛋白C)、EF1A(编码延伸因子1α)、GAPDH(编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、HPRT(编码次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶)或RPII(编码RNA聚合酶II)。在一些实施方案中，将所确定的拷贝数定量为每微克DNA中的转基因序列的拷贝。

在一些方面，所述拷贝数是来自多个细胞或细胞群体(如多个工程化细胞或工程化细胞群体)的平均、均值或中值拷贝数。在一些方面，拷贝数是来自多个细胞或细胞群体(如多个工程化细胞或工程化细胞群体)的平均或均值拷贝数。在一些方面，所述平均或均值拷贝数是从多个细胞或细胞群体(如经受工程化或制造过程的一个或多个步骤的多个细胞或细胞群体)或在细胞组合物(如用于施用至受试者的细胞组合物)中确定。在一些方面，归一化的平均拷贝数被确定为例如针对参考基因(如在二倍体基因组中以两个拷贝存在的已知基因)归一化的转基因序列的平均或均值拷贝数。在一些方面，针对通常在每个二倍体基因组中以两个拷贝存在的参考基因的归一化可以对应于细胞(如二倍体细胞)中的拷贝数。因此，在一些方面，归一化的平均或均值拷贝数可以对应于多个细胞(例如，通常具有二倍体基因组的T细胞)或细胞群体中检测到的转基因序列的平均或均值拷贝数。

在一些实施方案中，确定所述转基因序列的存在、不存在或量是通过聚合酶链式反应(PCR)进行的。在一些实施方案中，所述PCR是定量聚合酶链式反应(qPCR)、数字PCR或微滴式数字PCR，如下文中描述的任一种。在一些实施方案中，所述转基因序列的存在、不存在或量通过微滴式数字PCR来确定。在一些实施方案中，所述PCR是使用与所述转基因序列的至少一部分互补或能够将其特异性扩增的一种或多种引物进行的，并且在一些情况下是使用与参考基因的至少一部分互补或能够将其特异性扩增的一种或多种引物进行的。

在一些方面，qPCR可以用于实时检测随着反应进展而测量的扩增产物的积累，并在每个循环后进行产物定量。因此，在一些方面，qPCR可以用于确定样品中特定核酸序列(如转基因序列)的拷贝数。在一些方面，qPCR在每个反应孔中使用荧光报告分子，所述荧光报告分子随着产物DNA的量增加而产生增加的荧光。在一些方面，使用的荧光化学物质包括DNA结合染料和荧光标记的序列特异性引物或探针。在一些方面，qPCR使用专门的热循环仪，所述热循环仪具有以指定波长照射每个样品并检测由激发的荧光团发射的荧光的能力。在一些方面，所测量的荧光与扩增子的总量成比例；荧光随时间的变化用于计算每个循环中产生的扩增子的量。

在一些实施方案中，dPCR是用于检测和定量核酸的方法，并且允许对靶核酸分子进行准确的定量分析和高度灵敏的检测。在一些方面，dPCR涉及将DNA有限稀释成一系列单独PCR反应物(或分区)。在一些方面，有限稀释可以基于待评估的模板核酸(例如，转基因序列)的随机分布和泊松统计，使用以纳米流体学和乳液化学物质划分的原理来测量对于给定比例的正分区存在的DNA的量。在一些方面，dPCR通常是线性的并且是灵敏的，能够检测或定量非常少量的DNA。在一些方面，dPCR允许使用无需标准曲线的单分子计数方法对DNA样品进行绝对定量，并且可以从每个孔的单个分区的PCR获得绝对定量(参见Pohl等人,(2004)Expert Rev.Mol.Diagn.4(1),41-47)。

用于dPCR的示例性可商购设备或系统包括Raindrop^TM数字PCR系统(Raindance^TMTechnologies)；QX200^TMDroplet Digital^TMPCR系统(Bio-Rad)；BioMark^TMHD系统和qdPCR 37K^TMIFC(Fluidigm Corporation)和QuantStudio^TM3D数字PCR系统(LifeTechnologies^TM)(参见例如，Huggett等人(2013)Clinical Chemistry 59:1691–1693；Shuga等人(2013)Nucleic Acids Research 41(16):e159；Whale等人(2013)PLoS One 3:e58177)。

在一些实施方案中，使用微滴式数字聚合酶链式反应(ddPCR)确定用于整合到工程化细胞的基因组中的转基因序列(如编码重组蛋白的转基因序列)的存在、不存在或量。ddPCR是一种类型的数字PCR，其中将所述PCR溶液通过水油乳液化学物质分成或划分为较小的反应物，以产生大量微滴。在一些方面，可以使用特定的表面活性剂产生油包水微滴。(参见例如，Hindson等人,(2011)Anal Chem 83(22):8604-8610；Pinheiro等人,(2012)Anal Chem 84,1003-1011)。在一些方面，每个单独微滴随后作为单独反应运行。在一些方面，将PCR样品划分为纳升大小的样品并封装进油性微滴中。在一些方面，所述油性微滴是使用微滴生成器制备的，所述微滴生成器向每个孔施加真空。在示例性的情况下，可以由20μL样品体积制备用于单独反应的大约20,000个油性微滴。

在一些方面，评估整合拷贝数的方法可以在不同时间点进行，以确定并比较基因工程化(如将引入的转基因序列整合至将所述转基因序列引入其中的细胞的基因组中)的时间安排、程度或进展。在一些方面，所述方法可以在用于工程化细胞组合物的工程化或制造过程(如所述的任何过程)的不同阶段进行。例如，所提供的方法可以在扩增工程化过程或非扩增工程化过程的各个阶段进行。

在一些方面，使用上述用于载体拷贝数的测定，针对如编码重组受体(例如CAR)的转基因序列的基因组整合来评估通过所提供的方法工程化的细胞。在一些实施方案中，所述方法涉及从自细胞分离的脱氧核糖核酸(DNA)分开大于或大于约10千碱基(kb)的高分子量级分，其中在所述分开之前，已经在用于将转基因序列整合至细胞基因组中的条件下，如通过病毒转导向细胞中引入包含转基因序列的多核苷酸；以及确定所述转基因序列在所述高分子量级分中的存在、不存在或量。

5.孵育

在一些实施方案中，用于产生例如用于根据所提供的方法、用途、制品或组合物中的任一种的细胞疗法的工程化细胞的方法包括用于孵育细胞(例如，在不促进增殖和/或扩增的条件下孵育细胞)的一个或多个步骤。在一些实施方案中，在基因工程化的步骤(例如通过转导或转染将重组多肽引入细胞)之后，在不促进增殖和/或扩增的条件下孵育细胞。在特定实施方案中，在刺激条件下孵育细胞并用重组多核苷酸(例如编码重组受体的多核苷酸)转导或转染细胞之后孵育细胞。因此，在一些实施方案中，将已通过用编码CAR的重组多核苷酸转导或转染工程化的CAR阳性T细胞的组合物在不促进增殖和/或扩增的条件下孵育。

在特定实施方案中，如通过用病毒载体转化(例如转导)细胞进行基因工程化还包括在向细胞引入病毒载体或使细胞与病毒载体接触之后孵育细胞的一个或多个步骤。在一些实施方案中，在用于基因工程化、转化、转导或转染细胞以将病毒载体引入细胞中的过程之后，孵育细胞(例如，转化细胞群体的细胞(也称为“转化细胞”)。在特定实施方案中，所述孵育得到孵育细胞的群体(本文中也称为孵育的细胞群体)。

在一些实施方案中，在不进一步处理细胞的情况下进行异源或重组多核苷酸(例如，病毒载体颗粒)的引入之后，孵育所述细胞(例如转化细胞)。在特定实施方案中，在孵育之前，洗涤细胞，如以去除或基本上去除编码异源或重组多核苷酸的外源或剩余多核苷酸(例如病毒载体颗粒)，如在旋转接种后在基因工程化过程之后培养基中剩余的那些。

在一些此类实施方案中，进一步孵育是在一定条件下实现，以使病毒载体整合到一个或多个细胞的宿主基因组中。例如，进一步孵育在例如经由旋转接种进行转导之后为可能结合至T细胞的病毒载体整合在细胞的基因组内以递送目标基因提供时间。在一些方面，进一步孵育在一定条件下进行，以允许细胞(例如转化细胞)休眠或恢复，其中在孵育期间对细胞的培养支持或维持细胞的健康。在特定实施方案中，在静态条件(如不涉及培养基的离心、振荡、旋转、摇摆或灌注(例如，连续或半连续灌注)的条件)下孵育细胞。

评估或确定孵育是否已经导致病毒载体颗粒整合到宿主基因组中，并且因此凭经验确定进一步孵育的条件是在技术人员的水平内。在一些实施方案中，可以通过测量在孵育后由病毒载体颗粒基因组中含有的核酸编码的重组蛋白(如异源蛋白)的表达水平来评估病毒载体在宿主基因组中的整合。可以使用多种熟知方法来评价重组分子的表达水平，例如在细胞表面蛋白的情况下，例如通过基于亲和力的方法(例如基于免疫亲和力的方法)来检测，例如通过流式细胞术进行。在一些例子中，通过检测转导标记物和/或报道基因构建体来测量表达。在一些实施方案中，编码截短的表面蛋白的核酸包括在载体内并用作其表达和/或增强的标记物。

在某些实施方案中，孵育是在静态条件(如不涉及培养基的离心、振荡、旋转、摇摆或灌注(例如，连续或半连续灌注)的条件)下进行。在一些实施方案中，在开始孵育之前或之后不久，例如，在5、15或30分钟内，将细胞转移(例如，在无菌条件下转移)至容器如袋或小瓶中，并置于孵育器中。

在一些实施方案中，孵育的至少一部分在离心室的内部空腔中进行，如国际公开号WO 2016/073602中所述。

在一些实施方案中，将已经引入编码异源或重组多肽的多核苷酸(例如，病毒载体)的细胞转移至用于孵育的容器中。在一些实施方案中，容器是小瓶。在特定实施方案中，容器是袋子。在一些实施方案中，将细胞和任选地异源或重组多肽在封闭或无菌条件下转移至容器中。在一些实施方案中，然后将容器(例如小瓶或袋)置入孵育器中进行孵育的全部或一部分。在特定实施方案中，将培养箱设定在为、为约或至少16℃、24℃或35℃。在一些实施方案中，将孵育器设定在37℃、约37℃或37℃±2℃、±1℃、±0.5℃或±0.1℃。

在一些方面，用于孵育的条件可以包括以下中的一种或多种：特定培养基、温度、氧含量、二氧化碳含量、时间、药剂(例如，营养素、氨基酸、抗生素、离子和/或刺激因子(如细胞因子、趋化因子、抗原、结合配偶体、融合蛋白、重组可溶性受体和任何其他旨在激活细胞的药剂))。

在一些实施方案中，在无血清培养基中进行孵育。在一些实施方案中，所述无血清培养基是定义的和/或明确定义的细胞培养基。在某些实施方案中，所述无血清培养基是受控培养基，其已经过处理，例如被过滤以去除抑制剂和/或生长因子。在一些实施方案中，所述无血清培养基含有蛋白质。在某些实施方案中，所述无血清培养基可以含有血清白蛋白、水解产物、生长因子、激素、载体蛋白和/或附着因子。

在特定实施方案中，在一种或多种细胞因子存在下孵育细胞。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是重组细胞因子。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是人重组细胞因子。在某些实施方案中，所述一种或多种细胞因子结合和/或能够结合由T细胞表达的和/或对T细胞而言内源的受体。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员。在一些实施方案中，细胞因子的4-α-螺旋束家族的成员包括但不限于白介素2(IL-2)、白介素4(IL-4)、白介素7(IL-7)、白介素9(IL-9)、白介素12(IL-12)、白介素15(IL-15)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)。在一些实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-15。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括IL-7。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括重组IL-2。

在特定实施方案中，在IL-2、IL-7和/或IL-15的存在下孵育细胞。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是重组的。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是人的。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括人重组IL-2、IL-7和/或IL-15。在某些实施方案中，在重组IL-2、IL-7和IL-15的存在下孵育细胞。

在一些实施方案中，将细胞(例如，转化细胞)与如下浓度的细胞因子(例如，重组人细胞因子)一起孵育：在1IU/mL与1,000IU/mL之间、在10IU/mL与50IU/mL之间、在50IU/mL与100IU/mL之间、在100IU/mL与200IU/mL之间、在100IU/mL与500IU/mL之间、在250IU/mL与500IU/mL之间、或在500IU/mL与1,000IU/mL之间。

在一些实施方案中，将细胞(例如，转化细胞)与如下浓度的IL-2(例如，人重组IL-2)一起孵育：在1IU/mL与500IU/mL之间、在10IU/mL与250IU/mL之间、在50IU/mL与200IU/mL之间、在50IU/mL与150IU/mL之间、在75IU/mL与125IU/mL之间、在100IU/mL与200IU/mL之间、或在10IU/mL与100IU/mL之间。在特定实施方案中，将细胞(例如，转化细胞)与如下浓度的重组IL-2一起孵育：为或为约50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL、150IU/mL、160IU/mL、170IU/mL、180IU/mL、190IU/mL、或100IU/mL。在一些实施方案中，在为或为约100IU/mL重组IL-2(例如，人重组IL-2)的存在下孵育细胞(例如，转化细胞)。

在一些实施方案中，将细胞(例如，转化细胞)与如下浓度的重组IL-7(例如，人重组IL-7)一起孵育：在100IU/mL与2,000IU/mL之间、在500IU/mL与1,000IU/mL之间、在100IU/mL与500IU/mL之间、在500IU/mL与750IU/mL之间、在750IU/mL与1,000IU/mL之间、或在550IU/mL与650IU/mL之间。在特定实施方案中，将细胞(例如，转化细胞)与如下浓度的IL-7一起孵育：为或为约50IU/mL、100IU/mL、150IU/mL、200IU/mL、250IU/mL、300IU/mL、350IU/mL、400IU/mL、450IU/mL、500IU/mL、550IU/mL、600IU/mL、650IU/mL、700IU/mL、750IU/mL、800IU/mL、750IU/mL、750IU/mL、750IU/mL、或1,000IU/mL。在特定实施方案中，在为或为约600IU/mL IL-7的存在下孵育细胞(例如，转化细胞)。

在一些实施方案中，将细胞(例如，转化细胞)与如下浓度的重组IL-15(例如，人重组IL-15)一起孵育：在1IU/mL与500IU/mL之间、在10IU/mL与250IU/mL之间、在50IU/mL与200IU/mL之间、在50IU/mL与150IU/mL之间、在75IU/mL与125IU/mL之间、在100IU/mL与200IU/mL之间、或在10IU/mL与100IU/mL之间。在特定实施方案中，将细胞(例如，转化细胞)与如下浓度的重组IL-15一起孵育：为或为约50IU/mL、60IU/mL、70IU/mL、80IU/mL、90IU/mL、100IU/mL、110IU/mL、120IU/mL、130IU/mL、140IU/mL、150IU/mL、160IU/mL、170IU/mL、180IU/mL、190IU/mL、或200IU/mL。在一些实施方案中，在为或为约100IU/mL重组IL-15(例如，人重组IL-2)的存在下孵育细胞(例如，转化细胞)。

在特定实施方案中，在IL-2、IL-7和/或IL-15的存在下孵育细胞(例如，转化细胞)。在一些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是重组的。在某些实施方案中，IL-2、IL-7和/或IL-15是人的。在特定实施方案中，所述一种或多种细胞因子是或包括人重组IL-2、IL-7和/或IL-15。在某些实施方案中，在重组IL-2、IL-7和IL-15的存在下孵育细胞。

在一些实施方案中，例如，非扩增过程的孵育的全部或一部分是在包含以下的培养基中进行：基础培养基(例如，CTS OpTmizer基础培养基(Thermofisher))、谷氨酰胺和一种或多种重组细胞因子，如重组IL-2、IL-7和/或IL-15。在一些实施方案中，所述培养基可以含有一种或多种另外的组分。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分可以包括二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，所述一种或多种另外的组分由另外的补充剂(例如

补充剂(Thermofisher))提供。在一些实施方案中，培养基是无血清培养基并且不含任何血清组分。在一些方面，培养基可以含有一种或多种血清取代蛋白，如白蛋白、胰岛素或转铁蛋白(例如CTS^TM免疫细胞血清替代物)中的一种或多种。

在一些实施方案中，在与细胞刺激期间存在的培养基相同或相似的培养基的存在下孵育细胞，如与上述刺激方法或过程结合进行。在一些实施方案中，在具有与细胞刺激期间存在的培养基相同的细胞因子的培养基中孵育细胞，如与上述刺激方法或过程结合进行。在某些实施方案中，在以相同浓度具有与细胞刺激期间存在的培养基相同的细胞因子的培养基中孵育细胞，如与上述刺激方法或过程结合进行。在一些实施方案中，在不存在重组细胞因子的情况下孵育细胞。在一些实施方案中，在不存在如本文所述的一种或多种细胞因子的情况下孵育细胞。在一些实施方案中，在不存在本文所述的所有细胞因子的情况下孵育细胞。

在一些方面，进一步孵育在一定条件下进行以允许细胞休眠或恢复，所述进一步孵育不包括刺激条件(例如，呈重组细胞因子或其他刺激剂的形式)的存在。例如，孵育在足以支持或维持孵育期间细胞的健康的培养的无脂培养基的存在下进行。

在一些实施方案中，孵育的全部或一部分在基础培养基(如不含一种或多种重组细胞因子或不含任何重组细胞因子的基础培养基)中进行。在一些实施方案中，培养基不包含一种或多种重组细胞因子，如重组人IL-2、重组人IL-7和/或重组人IL-15。在一些方面，孵育在没有任何重组细胞因子的情况下进行。在某些实施方案中，基础培养基补充有另外的添加剂。在一些实施方案中，基础培养基未补充任何另外的添加剂。细胞培养基的添加剂可以包括但不限于营养素、糖(例如，葡萄糖)、氨基酸、维生素或添加剂(如ATP和NADH)。还可以添加其他添加剂，但通常特定添加剂和量使得含有细胞的培养基的孵育有利于维持细胞，但在孵育期间最小化、限制和/或不诱导细胞的代谢活性。

在特定实施方案中，培养基是基础培养基，其不含一种或多种重组细胞因子并且不含血清组分，即是无血清培养基，但是可以含有一种或多种另外的组分。在特定实施方案中，在例如非扩增过程的孵育的全部或一部分中使用这种无血清培养基提供无脂培养基，所述无脂培养基提供细胞的维持，但不包括可以激活细胞或使细胞具有代谢活性的某些因子，从而培养所处状态是或可能是休眠或静息状态的细胞。在一些方面，在这种无血清培养基的存在下孵育允许细胞在刺激和基因工程化(例如转导)之后恢复或休眠。在一些方面，在这种无血清培养基的存在下孵育得到输出组合物，所述输出组合物含有对损伤或活力的损失不太敏感的细胞，例如在制造过程期间或之后，以及在将收获/配制的细胞低温保存，然后在即将使用前解冻时。在一些实施方案中，输出组合物中的细胞在解冻时具有的胱天蛋白酶或其他凋亡标记物的水平低于在类似培养基中孵育的细胞，但所述类似培养基含有一种或多种重组细胞因子、血清或可能使细胞的代谢活性在输出组合物的低温保存时更强的其他因子。

在一些实施方案中，基础培养基含有无机盐、糖、氨基酸和任选地维生素、有机酸和/或缓冲液或其他熟知的细胞培养营养素的混合物。除了营养素外，培养基还有助于维持pH和渗透压。在一些方面，基础培养基的试剂支持细胞生长、增殖和/或扩增。多种可商业购得的基础培养基对本领域技术人员而言是熟知的，并且包括达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM)、罗斯威尔公园纪念学院培养基(Roswell Park Memorial Institute Medium，RPMI)、伊斯科夫改良的达尔伯克培养基和哈氏(Hams)培养基。在一些实施方案中，基础培养基是伊斯科夫改良的达尔伯克培养基、RPMI-1640或α-MEM。

在一些实施方案中，基础培养基是平衡盐溶液(例如，PBS、DPBS、HBSS、EBSS)。在一些实施方案中，基础培养基选自达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM)、最小必需培养基(MEM)、伊格尔基础培养基(BME)、F-10、F-12、RPMI 1640、格拉斯哥最小必需培养基(GMEM)、α最小必需培养基(αMEM)、伊斯科夫改良的达尔伯克培养基和M199。在一些实施方案中，基础培养基是复合培养基(例如，RPMI-1640、IMDM)。在一些实施方案中，基础培养基是OpTmizer^TMCTS^TMT细胞扩增基础培养基(ThermoFisher)。

在一些实施方案中，基础培养基不含蛋白质。在一些实施方案中，基础培养基不含人蛋白(例如，人血清蛋白)。在一些实施方案中，基础培养基不含血清。在一些实施方案中，基础培养基不含源自人的血清。在一些实施方案中，基础培养基不含重组蛋白。在一些实施方案中，基础培养基不含人蛋白和重组蛋白。在一些实施方案中，基础培养基不含如本文所述的一种或多种或所有细胞因子。在一些实施方案中，例如非扩增过程的孵育的全部或一部分在不含任何另外的添加剂或重组细胞因子的基础培养基中进行。在一些实施方案中，基础培养基是不含任何另外的添加剂或重组细胞因子的CTS OpTmizer基础培养基(Thermofisher)。

在一些实施方案中，例如非扩增过程的孵育的全部或一部分在包含以下的培养基中进行：基础培养基和谷氨酰胺，例如，含有谷氨酰胺的CTS OpTmizer基础培养基(Thermofisher)。

在一些实施方案中，例如非扩增过程的全部或部分孵育是在包含以下的培养基中进行：不含一种或多种重组细胞因子(如重组人IL-2、重组人IL-7和/或重组人IL-15)的基础培养基(例如，CTS OpTmizer基础培养基(Thermofisher))。在一些实施方案中，培养基补充有一种或多种另外的非血清组分。在一些实施方案中，所述一种或多种补充剂不含血清。在一些实施方案中，无血清培养基还包含游离形式的氨基酸，如L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，无血清培养基不包含血清替代物补充剂。在一些实施方案中，无血清培养基不包含二肽形式的L-谷氨酰胺(例如，L-丙氨酰-L-谷氨酰胺)。在一些实施方案中，无血清培养基不包含任何重组细胞因子。在一些实施方案中，无血清培养基包含补充有T细胞补充剂和游离形式的L-谷氨酰胺的基础培养基，并且不含任何免疫细胞血清替代物、任何二肽形式的L-谷氨酰胺或任何重组细胞因子。在一些实施方案中，所述无血清培养基包含基础培养基(例如OpTmizer^TMT细胞扩增基础培养基)、L-谷氨酰胺和如由补充剂(例如OpTmizer^TMT细胞扩增补充剂)提供的一种或多种另外的组分。

在特定实施方案中，在如下浓度的无血清培养基中孵育细胞：为或为约0.25×10⁶个细胞/mL、0.5×10⁶个细胞/mL、0.75×10⁶个细胞/mL、1.0×10⁶个细胞/mL、1.25×10⁶个细胞/mL、1.5×10⁶个细胞/mL、1.75×10⁶个细胞/mL、或2.0×10⁶个细胞/mL。在特定实施方案中，在浓度为或为约0.75×10⁶个细胞/mL的无血清培养基中孵育细胞。在一些实施方案中，所述孵育进行或进行约18小时与30小时之间。在特定实施方案中，所述孵育进行或进行约24小时或者进行或进行约一天。在一些实施方案中，所述孵育分别进行或进行约48小时或72小时，或者进行或进行约2天或3天。在特定实施方案中，所述孵育进行或进行约24小时±6小时、48小时±6小时或72小时±6小时。在特定实施方案中，所述孵育进行或进行约72小时、72±4小时，或者进行或进行约3天，例如，在该时间期间在浓度为或为约0.75×10⁶个细胞/mL的无血清培养基中孵育细胞。在一些实施方案中，孵育的全部或一部分在包含以下的无血清培养基中进行：不含一种或多种重组细胞因子如重组人IL-2、重组人IL-7和/或重组人IL-15的基础培养基(例如，CTS OpTmizer基础培养基(Thermofisher))。在一些实施方案中，所述无血清培养基补充有L-谷氨酰胺和/或一种或多种细胞补充剂，例如OpTmizer^TMT细胞扩增补充剂，但是不含任何免疫细胞血清替代物、任何二肽形式的L-谷氨酰胺或任何重组细胞因子。

在特定实施方案中，在不存在细胞因子的情况下孵育细胞。在特定实施方案中，在不存在任何重组细胞因子的情况下孵育细胞。在特定实施方案中，在不存在一种或多种重组细胞因子如重组IL-2、IL-7和/或IL-15的情况下孵育细胞。

在一些实施方案中，所述基础培养基还包含谷氨酰胺，如L-谷氨酰胺。在一些方面，谷氨酰胺是游离形式的谷氨酰胺，如L-谷氨酰胺。在一些实施方案中，谷氨酰胺(如L-谷氨酰胺)在基础培养基中的浓度为约或小于约0.5mM-1mM、0.5mM-1.5mM、0.5mM-2mM、0.5mM-2.5mM、0.5mM-3mM、0.5mM-3.5mM、0.5mM-4mM、0.5mM-4.5mM、0.5mM-5mM、1mM-1.5mM、1mM-2mM、1mM-2.5mM、1mM-3mM、1mM-3.5mM、1mM-4mM、1mM-4.5mM、1mM-5mM、1.5mM-2mM、1.5mM-2.5mM、1.5mM-3mM、1.5mM-3.5mM、1.5mM-4mM、1.5mM-4.5mM、1.5mM-5mM、2mM-2.5mM、2mM-3mM、2mM-3.5mM、2mM-4mM、2mM-4.5mM、2mM-5mM、2.5mM-3mM、2.5mM-3.5mM、2.5mM-4mM、2.5mM-4.5mM、2.5mM-5mM、3mM-3.5mM、3mM-4mM、3mM-4.5mM、3mM-5mM、3.5mM-4mM、3.5mM-4.5mM、3.5mM-5mM、4mM-4.5mM、4mM-5mM、或4.5mM-5mM，每个都包含端值。在一些实施方案中，谷氨酰胺(如L-谷氨酰胺)在基础培养基中的浓度为至少约0.5mM、1mM、1.5mM、2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、或5mM。在一些实施方案中，谷氨酰胺(如L-谷氨酰胺)在基础培养基中的浓度为至多约2mM、2.5mM、3mM、3.5mM、4mM、4.5mM、5mM。在一些实施方案中，谷氨酰胺如L-谷氨酰胺在基础培养基中的浓度为约2mM。在一些实施方案中，基础培养基还可以包含蛋白质或肽。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质不是非哺乳动物来源的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是人蛋白质或源自人。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质是重组的。在一些实施方案中，所述至少一种蛋白质包括白蛋白、转铁蛋白、胰岛素、纤连蛋白、抑肽酶或胎球蛋白。在一些实施方案中，所述蛋白质包含白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种，任选人或重组白蛋白、胰岛素或转铁蛋白中的一种或多种。

在一些实施方案中，蛋白质是白蛋白或白蛋白取代物。在一些实施方案中，白蛋白是人源白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是重组白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是天然人血清白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是重组人血清白蛋白。在一些实施方案中，白蛋白是来自非人来源的重组白蛋白。白蛋白取代物可以是任何蛋白质或多肽来源。这样的蛋白质或多肽样品的例子包括但不限于牛垂体提取物、植物水解物(例如，大米水解物)、胎牛白蛋白(胎球蛋白)、卵白蛋白、人血清白蛋白(HSA)或另一种动物来源的白蛋白、鸡提取物、牛胚胎提取物、

I和

II。在一些实施方案中，蛋白质或肽包含转铁蛋白。在一些实施方案中，蛋白质或肽包括纤连蛋白。在一些实施方案中，蛋白质或肽包括抑肽酶。在一些实施方案中，蛋白质包括胎球蛋白。

在一些实施方案中，所述一种或多种另外的蛋白质是被添加至基础培养基中的血清替代物补充剂的一部分。血清替代物补充剂的例子包括例如免疫细胞血清替代物(ThermoFisher，#A2598101)或Smith等人Clin Transl Immunology.2015年1月；4(1):e31中所述的那些。

在某些实施方案中，在引入编码异源或重组蛋白的多核苷酸(例如，病毒载体)之后将细胞孵育为、为约或为至少18小时、24小时、30小时、36小时、40小时、48小时、54小时、60小时、72小时、84小时、96小时、或超过96小时。在某些实施方案中，在引入编码异源或重组蛋白的多核苷酸(例如，病毒载体)之后将细胞孵育为、为约或为至少一天、2天、3天、4天、或超过4天。在一些实施方案中，在基因工程化之前，孵育进行如下时间量：在30分钟与2小时之间、在1小时与8小时之间、在6小时与12小时之间、在12小时与18小时之间、在16小时与24小时之间、在18小时与30小时之间、在24小时与48小时之间、在24小时与72小时之间、在42小时与54小时之间、在60小时与120小时之间、在96小时与120小时之间、在90小时与在1天与7天之间、在3天与8天之间、在1天与3天之间、在4天与6天之间、或在4天与5天之间。在一些实施方案中，所述孵育进行或进行约18小时与30小时之间。在特定实施方案中，所述孵育进行或进行约24小时或者进行或进行约一天。

在某些实施方案中，孵育的总持续时间为、为约或为至少12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、54小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时、或120小时。在某些实施方案中，孵育的总持续时间为、为约或为至少一天、2天、3天、4天、或5天。在特定实施方案中，在以下时间、在约以下时间或在以下时间内完成孵育：120小时、108小时、96小时、84小时、72小时、60小时、54小时、48小时、42小时、36小时、30小时、24小时、18小时、或12小时。在特定实施方案中，在以下时间、在约以下时间或在以下时间内完成孵育：一天、2天、3天、4天、或5天。在一些实施方案中，孵育的总持续时间在或在约12小时与120小时之间、18小时与96小时之间、24小时与72小时之间、或24小时与48小时之间，包含端值。在一些实施方案中，孵育的总持续时间在或约在1小时与48小时之间、4小时与36小时之间、8小时与30小时之间或12小时与24小时之间，包含端值。在特定实施方案中，孵育分别进行为或为约24小时、48小时或72小时，或者进行为或为约1天、2天或3天。在特定实施方案中，孵育进行24小时±6小时、48小时±6小时或72小时±6小时。在特定实施方案中，孵育进行为或为约72小时或者进行为或为约3天。

在特定实施方案中，孵育在刺激开始之后在、在约或至少12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时开始。在特定实施方案中，在起始刺激后为、为约或为至少0.5天、一天、1.5天或2天，起始孵育。在特定实施方案中，在起始刺激的以下时间、在约以下时间或在以下时间内起始孵育：120小时、108小时、96小时、84小时、72小时、60小时、54小时、48小时、42小时、36小时、30小时、24小时、18小时、或12小时。在特定实施方案中，所述孵育在以下时间、在约以下时间或在以下时间内开始：刺激开始的5天、4天、3天、2天、一天、或0.5天。

在一些实施方案中，所述孵育在起始刺激后的以下时间完成：在或在约24小时与120小时之间、36小时与108小时之间、48小时与96小时之间或48小时与72小时之间，包含端值。在一些实施方案中，所述孵育在以下时间、约以下时间或以下时间内完成：从刺激开始120小时、108小时、96小时、72小时、48小时、或36小时。在一些实施方案中，孵育在从刺激开始的以下时间、约以下时间或以下时间内完成：5天、4.5天、4天、3天、2天、或1.5天。在特定实施方案中，孵育在刺激开始之后的以下小时后完成：24小时±6小时、48小时±6小时或72小时±6小时。在一些实施方案中，孵育在或在约72小时后或者在或在约3天后完成。

在一些实施方案中，所述孵育进行足以使异源或重组多核苷酸被整合至基因组中的时间量。在特定实施方案中，所述孵育进行足以使至少整合病毒拷贝数(iVCN)是每个二倍体基因组为、为约或为至少0.1、0.5、1、2、3、4、5或大于5的时间量。在特定实施方案中，所述孵育进行足以使至少iVCN为、为约或为至少0.5或1的时间量。在特定实施方案中，所述孵育进行足以使异源或重组多核苷酸被稳定整合至基因组中的时间量。在特定实施方案中，当每个二倍体基因组的iVCN在例如至少12、24或48小时的时间段内变化不超过20％、15％、10％、5％、1％或0.1％时，认为所述异源或重组多核苷酸被稳定整合。在特定实施方案中，所述孵育在稳定整合之前完成。

在某些实施方案中，至少直至在基因组中检测到整合载体为止，执行或进行所述孵育。在一些实施方案中，所述孵育在达到每个二倍体基因组的稳定的整合载体拷贝数(iVCN)之前完成。在特定实施方案中，至少直至在基因组中检测到整合载体为止，但在达到每个二倍体基因组的稳定iVCN之前，执行或进行所述孵育。在某些实施方案中，当所述iVCN达到峰值和/或保持不变或者在容许误差内不变持续一段时间时，达到每个二倍体基因组的稳定iVCN。在一些实施方案中，容许误差为以下值，在以下值内或为约以下值：±40％、±35％、±30％、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％、±2％、±1％或小于±1％。在某些实施方案中，所述时间段为、为约或为至少2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时、18小时、24小时、36小时、48小时、60小时或72小时。在某些实施方案中，所述时间段为、为约或为至少一天、2天或3天。在某些实施方案中，当所述iVCN达到峰值并保持不变或者在容许误差(例如，±25％)内不变持续为、为约或为至少24小时或一天的一段时间时，达到每个二倍体基因组的稳定iVCN。在一些实施方案中，当所述转化的细胞的群体的二倍体基因组中iVCN与总载体拷贝数(VCN)的分数平均为或为至少或为约0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4或1.5或者在其容许误差内(例如，±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±1％)时，达到每个二倍体基因组的稳定iVCN。在某些实施方案中，当所述转化细胞的群体的二倍体基因组中iVCN与总载体拷贝数(VCN)的分数平均为或为约0.8或在其容许误差内时，达到每个二倍体基因组的稳定iVCN。在一些实施方案中，当所述转化细胞的群体的二倍体基因组中iVCN与总载体拷贝数(VCN)的分数平均为或为约1.0或者在其容许误差内时，达到每个二倍体基因组的稳定iVCN。

在一些实施方案中，所述孵育在iVCN达到、达到约或达到至少5.0、4.0、3.0、2.5、2.0、1.75、1.5、1.25、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.75、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3或0.25个拷贝/二倍体基因组之前完成。在某些实施方案中，所述孵育在iVCN达到或达到约1.0个拷贝/二倍体基因组之前完成。在特定实施方案中，所述孵育在iVCN达到或达到约0.5个拷贝/二倍体基因组之前完成。

在某些实施方案中，在细胞群体的为、为约或至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、八次、十次、二十次或更多次细胞倍增(例如，在孵育期间发生的倍增)之前，收获细胞。在特定实施方案中，细胞倍增的量可以通过在不同时间点，如在工程化过程的不同时间或阶段测量群体中活细胞的数量来计算。在特定实施方案中，可以通过将在一个时间点的活细胞的总量与在较早时间点存在的活细胞的总数量进行比较来计算细胞倍增。在某些实施方案中，所述孵育在细胞群体的为、为约或至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、八次、十次、二十次或更多次细胞倍增(例如，在孵育期间发生的倍增)之前完成。在某些方面，细胞倍增是通过以下方式来计算：在开始孵育时和在完成孵育时确定总有核细胞数(TNC)，然后确定完成时的TNC除以开始时的TNC的乘积的自然对数，然后将乘积的所述自然对数除以2的自然对数。

在一些方面，在群体中(例如，在工程化过程期间)发生的倍增数是使用下式来确定：

1)

在一些方面，在群体中(例如，在工程化过程期间)发生的倍增数是使用下式来确定：

2)

在某些实施方案中，在群体中(例如，在工程化过程期间)发生的倍增数是使用下式来确定：

3)

在各种实施方案中，在群体中(例如，在工程化过程期间)发生的倍增数是使用下式来确定：

4)

在特定实施方案中，在群体中(例如，在工程化过程期间)发生的倍增数是使用下式来确定：

5)

在某些实施方案中，所述孵育在细胞的总数量(例如，孵育细胞或经历孵育的细胞的总数量)是输入群体的细胞数量(例如，与刺激试剂接触的细胞的总数量)的大于或大于约一倍、两倍、三倍、四倍、五倍、六倍、八倍、十倍、二十倍或超过二十倍之前完成。在各种实施方案中，所述孵育在孵育细胞的总数量是转化、转导或旋转接种的细胞的总数量(例如，与病毒载体接触的细胞的总数量)的大于或大于约一倍、两倍、三倍、四倍、五倍、六倍、八倍、十倍、二十倍或超过二十倍之前完成。在某些实施方案中，所述细胞是T细胞、活T细胞、CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、表达CAR的T细胞、或前述任一项的组合。在一些实施方案中，所述孵育在细胞总数大于输入群体中细胞的总数量之前完成。在一些实施方案中，所述孵育在活CD3+ T细胞的总数量大于输入群体中活CD3+细胞的总数量之前完成。在某些实施方案中，所述孵育在细胞总数大于转化、转导或旋转接种的细胞中细胞的总数量之前完成。在一些实施方案中，所述孵育在活CD3+ T细胞的总数量大于转化、转导或旋转接种的细胞中活CD3+的总数量之前完成。

在一些实施方案中，细胞群体的总细胞数或总活细胞数在孵育期间保持相似、相同或基本上相同。在特定实施方案中，细胞群体的总细胞数或总活细胞数在孵育期间不变。在一些方面，总细胞数或总活细胞数在孵育期间降低。在特定方面，在刺激开始之前(例如即将开始之前)或开始时，总活细胞数是输入群体的总细胞数或总活细胞数的为、为约或小于95％、90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％或50％。

6.刺激试剂的去除

在一些实施方案中，根据本文所提供的任何方法产生或生成孵育的T细胞的群体，其中将物质(如竞争剂)添加至T细胞以破坏(如减少和/或终止)一种或多种刺激剂的信号传导。在一些实施方案中，所孵育的T细胞群体含有物质(如竞争剂，例如生物素或生物素类似物，例如D-生物素)的存在。在一些实施方案中，所述物质(如竞争剂，例如生物素或生物素类似物，例如D-生物素)以如下量存在：是其中在孵育期间没有外源性添加所述物质的培养T细胞的参考群体或制剂中所述物质的量的至少1.5倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少10倍、至少100倍、至少1000倍或更多倍。在一些实施方案中，所述物质(如竞争剂，例如生物素或生物素类似物，例如D-生物素)在培养T细胞的群体中的量是从或从约10μΜ至100μΜ、100μΜ至1mM、100μΜ至500μΜ或10μΜ至100μΜ。在一些实施方案中，将10μm或约10μm的生物素或生物素类似物(例如D-生物素)添加至细胞或细胞群体，以从所述细胞或细胞群体分离或去除寡聚刺激试剂。

在某些实施方案中，一种或多种药剂(例如刺激或激活TCR和/或共受体的药剂)如经由寡聚试剂上存在的多个特定结合位点(例如，结合位点Z)与寡聚试剂缔合(如可逆地结合)。在一些情况下，这导致所述药剂彼此紧密地排列，使得如果使具有由所述药剂结合或识别的(至少两个拷贝的)细胞表面分子的靶细胞与所述药剂接触，则可以发生亲合力效应。在一些方面，受体结合试剂在结合位点B处对细胞的受体分子具有低亲和力，使得受体结合试剂在竞争试剂的存在下从细胞解离。因此，在一些实施方案中，在竞争试剂的存在下从细胞去除所述药剂。

在一些实施方案中，寡聚刺激试剂是具有可逆地附接的抗CD3和抗CD28 Fab的链霉亲和素突变蛋白寡聚体。在一些实施方案中，所附接的Fab含有链霉亲和素结合结构域，例如，其允许可逆地附接至链霉亲和素突变蛋白寡聚体。在一些情况下，抗CD3和抗CD28Fab相互紧密布置，使得如果使表达CD3和/或CD28的T细胞与具有可逆地附接的Fab的寡聚刺激试剂接触，则可能发生亲合力作用。在一些方面，Fab对CD3和CD28具有低亲和力，使得Fab在竞争试剂(例如生物素或生物素变体或类似物)的存在下从细胞中解离。因此，在一些实施方案中，在竞争试剂(例如D-生物素)的存在下将Fab从细胞去除或解离。

在一些实施方案中，在收集、收获或配制细胞前，从细胞或细胞群体去除或分离寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)。在一些实施方案中，在孵育(例如，本文如在章节II-C-5中所述的孵育)之后或期间，通过接触或暴露于竞争试剂(例如，生物素或生物素类似物，如D-生物素)从细胞或细胞群体去除或分离寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)。在某些实施方案中，在孵育之后但在用于收集、收获或配制细胞的步骤之前，将细胞或细胞群体接触或暴露于竞争试剂(例如，生物素或生物素类似物，如D-生物素)，以去除寡聚刺激试剂，例如寡聚刺激链霉亲和素突变蛋白试剂。在特定实施方案中，在孵育后，使细胞或细胞群体接触或暴露于竞争试剂(例如，生物素或生物素类似物，如D-生物素)，以去除寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)。在一些方面，当在孵育期间例如通过接触或暴露于竞争试剂(例如，生物素或生物素类似物，如D-生物素)将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞分离或去除时，使细胞返回到与分离或去除之前相同的孵育条件，持续孵育的剩余持续时间。

在一些实施方案中，使细胞与为、为约或为至少0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μM、100μM、500μM、0.01μM、1mM或10mM的竞争试剂接触，以从细胞去除或分离寡聚刺激试剂。在各种实施方案中，使细胞与为、为约或为至少0.01μM、0.05μM、0.1μM、0.5μM、1μM、2μM、3μM、4μM、5μM、10μM、100μM、500μM、0.01μM、1mM或10mM的生物素或生物素类似物如D-生物素接触，以将具有可逆地附接的抗CD3和抗CD28 Fab的刺激性链霉亲和素突变蛋白寡聚体从细胞去除或分离。在各种实施方案中，使细胞与在或在约100μM与10mM之间(例如，1mM)的生物素或生物素类似物如D-生物素接触，以将具有可逆地附着的抗CD3和抗CD28 Fab的寡聚刺激试剂(如链霉亲和素突变蛋白寡聚体)从细胞去除或分离。在各种实施方案中，在接触或暴露于D-生物素之后，使细胞与在或在约100μM与10mM之间(例如，1mM)的生物素或生物素类似物如D-生物素接触为或为约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时或48小时。

在特定实施方案中，在刺激开始的为或为约120小时、108小时、96小时、84小时、72小时、60小时、48小时、36小时、24小时或12小时(包含端值)内，将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞去除或分离。在特定实施方案中，在刺激开始的为或为约5天、4天、3天、2天、一天或0.5天(包含端值)内，将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞去除或分离。在特定实施方案中，在刺激开始后为或为约48小时或者为或为约2天，将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞去除或分离。在某些实施方案中，在刺激开始后为或为约72小时或者为或为约3天，将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞去除或分离。在一些实施方案中，在刺激开始后为或为约96小时或者为或为约4天，将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞去除或分离。

在某些实施方案中，在刺激开始后为或为约48小时或者为或为约2天，例如，在本文如在章节II-C-5中所述的孵育期间或之后，使细胞或细胞群体接触或暴露于竞争试剂(例如，生物素或生物素类似物，如D-生物素)，以去除寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)。在一些方面，当在孵育期间例如通过接触或暴露于竞争试剂(例如，生物素或生物素类似物，如D-生物素)将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞分离或去除时，使细胞返回到与分离或去除之前相同的孵育条件，持续孵育的剩余持续时间。在其他方面，当在孵育之后例如通过接触或暴露于竞争试剂(例如，生物素或生物素类似物，如D-生物素)将寡聚刺激试剂(例如，寡聚刺激性链霉亲和素突变蛋白试剂)从细胞分离或去除时，在接触或暴露于竞争试剂之后将细胞进一步孵育持续或持续约2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、42小时或48小时。在一些实施方案中，在D-生物素添加之后，将用D-生物素处理转导的细胞进一步孵育持续或持续约48小时。

7.收获、收集或配制细胞

在一些实施方案中，收获或收集细胞。在特定实施方案中，在孵育完成后收集或收获细胞。在某些实施方案中，收集或收获的细胞是输出群体的细胞。在一些实施方案中，输出群体包括如下细胞：是活的、CD3+、CD4+、CD8+和/或对重组受体呈阳性(例如，CAR+)。在特定实施方案中，收获的CD4+ T细胞和配制的CD8+ T细胞是输出CD4+和CD8+ T细胞。在特定实施方案中，配制的细胞群体(例如，富集的CD4+和CD8+细胞的配制群体)是输出细胞群体，例如，富集的CD4+和CD8+细胞的输出群体。

在一些实施方案中，收获、收集或配制的细胞或细胞群体尚未经历任何扩增，例如，如下任何条件：其中在一定条件下孵育或培育细胞，并在所述孵育或培育期间增加活细胞的量。例如，在一些方面，收获的细胞尚未经历任何孵育或培育，其中如与所述孵育或培育开始时总活细胞的数量相比，在所述孵育或培育结束时总活细胞的量增加。在一些实施方案中，收获的细胞尚未经历任何孵育或培育步骤，所述步骤明确用于与孵育或培育过程开始时相比，在所述孵育或培育过程结束时增加(例如，扩增)活细胞总数量的目的。在一些实施方案中，在可以导致扩增的条件下孵育细胞，但是孵育条件的进行并非出于扩增细胞群体的目的。在一些实施方案中，虽然是在不包括扩增步骤的过程中制造，但收获的细胞可能已经经历了扩增。在一些实施方案中，不包括扩增步骤的制造过程被称为非扩增或最小扩增的过程。“非扩增”过程也可以被称为“最小扩增”过程。在一些实施方案中，虽然过程不包括用于扩增的步骤，但非扩增或最小扩增过程可能得到已经经历扩增的细胞。在一些实施方案中，收获的细胞可能已经经历孵育或培育步骤，所述步骤包括设计用于降低、抑制、最小化或消除细胞群体作为群体的扩增的培养基组合物。在一些实施方案中，收集、收获或配制的细胞先前尚未经历在如下生物反应器中或在如下条件下进行的孵育或培育：其中在孵育或培育的全部或一部分中摇摆、旋转、振荡或灌注细胞。PCT/US2019/046062披露了由此类过程产生的工程化细胞的制造的示例性非扩增过程，将其通过引用以其整体并入。

在一些实施方案中，细胞选择、分离、分开、富集和/或纯化步骤在收获、收集或配制细胞或细胞群体之前进行。在一些实施方案中，细胞选择、分离、分开、富集和/或纯化步骤使用如本文所公开的色谱进行。在一些实施方案中，通过色谱进行的T细胞选择步骤在T细胞转导之后，但在收获之前、在收集之前和/或在配制细胞之前进行。在一些实施方案中，通过色谱进行的T细胞选择步骤在即将收获细胞之前进行。

在某些实施方案中，从起始刺激到收集、收获或配制细胞的时间量为、为约或小于36小时、42小时、48小时、54小时、60小时、72小时、84小时、96小时、108小时或120小时。在某些实施方案中，从起始刺激到收集、收获或配制细胞的时间量为、为约或小于1.5天、2天、3天、4天或5天。在一些实施方案中，从起始刺激到收集、收获或配制细胞用于生成工程化细胞的时间量，从起始刺激到收集、收获或配制细胞为在或在约36小时与120小时之间、48小时与96小时之间或48小时与72小时之间，包含端值，或者在或在约1.5天与5天之间、2天与4天之间或2天与3天之间，包含端值。在特定实施方案中，从起始孵育到收获、收集或配制细胞的时间量为、为约或小于48小时、72小时或96小时。在特定实施方案中，从起始孵育到收获、收集或配制细胞的时间量为、为约或小于2天、3天或4天。在特定实施方案中，从起始孵育到收获、收集或配制细胞的时间量为48小时±6小时、72小时±6小时或96小时±6小时。在特定实施方案中，从起始孵育到收获、收集或配制细胞的时间量为或为约96小时或四天。

在特定实施方案中，将细胞收获、收集或配制在无血清培养基中，如本文中或在PCT/US2018/064627中描述的无血清培养基，所述申请通过引用并入本文。在一些实施方案中，将细胞收获、收集或配制至如孵育期间所用的相同无血清培养基中。

在特定实施方案中，将细胞收获、收集或配制在基础培养基中，所述基础培养基不含一种或多种重组细胞因子并且不含血清组分，即，是无血清培养基，但可能含有一种或多种另外的组分。在特定实施方案中，使用这种无血清培养基提供无脂培养基，所述无脂培养基提供细胞的维持，但不包括可以激活细胞或使细胞具有代谢活性的某些因子，从而培养所处状态是或可能是休眠或静息状态的细胞。在一些方面，在这种无血清培养基的存在下孵育允许细胞在刺激和基因工程化(例如转导)之后恢复或休眠。在一些方面，在这种无血清培养基的存在下收获、收集或配制细胞得到输出组合物的配制品，所述组合物含有对损伤或活力的损失不太敏感的细胞，例如，在将收获/配制的细胞低温保存，然后在即将使用前解冻时。在一些实施方案中，输出组合物中的细胞在解冻时具有的胱天蛋白酶或其他凋亡标记物的水平低于在类似培养基中孵育的细胞，但所述类似培养基含有一种或多种重组细胞因子、血清或可能使细胞的代谢活性在输出组合物的低温保存时更强的其他因子。

在某些实施方案中，配制富集的T细胞的一个或多个群体。在特定实施方案中，在已经工程化和/或孵育一个或多个群体之后，配制富集的T细胞的一个或多个群体。在特定实施方案中，所述一个或多个群体是输入群体。在一些实施方案中，一个或多个输入群体先前已经进行低温保护和储存，并且在孵育之前解冻。

在某些实施方案中，至少在基因组中检测到整合载体时，收获或收集细胞。在一些实施方案中，在每个二倍体基因组的稳定的整合载体拷贝数(iVCN)之前，收获或收集细胞。在特定实施方案中，在基因组中检测到整合载体之后但在实现每个二倍体基因组的稳定iVCN时之前，收获或收集细胞。

在一些实施方案中，在iVCN达到、达到约或达到至少5.0、4.0、3.0、2.5、2.0、1.75、1.5、1.25、1.2、1.1、1.0、0.9、0.8、0.75、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3或0.25个拷贝/二倍体基因组之前，收获或收集细胞。在特定实施方案中，在iVCN达到或达到约1.0个拷贝/二倍体基因组之前，收获或收集细胞。在一些实施方案中，在iVCN达到或达到约0.5个拷贝/二倍体基因组之前，收集或收获细胞。

在某些实施方案中，在细胞群体的为、为约或为至少一次、两次、三次、四次、五次、六次、八次、十次、二十次或更多次细胞倍增(例如，在孵育期间发生的倍增)之前，收获细胞。

在特定实施方案中，在细胞的总数量(例如，孵育细胞或经历孵育的细胞的总数量)是输入群体的细胞数量(例如，与刺激试剂接触的细胞的总数量)的大于或大于约一倍、两倍、三倍、四倍、五倍、六倍、八倍、十倍、二十倍或超过二十倍之前的时间，收获或收集细胞。在一些实施方案中，在孵育细胞的总数量是转化、转导或旋转接种的细胞的总数量(例如，与病毒载体接触的细胞的总数量)的大于或大于约一倍、两倍、三倍、四倍、五倍、六倍、八倍、十倍、二十倍或超过二十倍之前的时间，收获或收集细胞。在某些实施方案中，所述细胞是T细胞、活T细胞、CD3+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、表达CAR的T细胞、或前述任一项的组合。在特定实施方案中，在细胞总数大于输入群体中细胞的总数量之前的时间，收获或收集细胞。在各种实施方案中，在活CD3+ T细胞的总数量大于输入群体中活CD3+细胞的总数量之前的时间，收获或收集细胞。在特定实施方案中，在细胞总数大于转化、转导或旋转接种的细胞中细胞的总数量之前的时间，收获或收集细胞。在各种实施方案中，在活CD3+T细胞的总数量大于转化、转导或旋转接种的细胞中活CD3+细胞的总数量之前的时间，收获或收集细胞。在各种实施方案中，在活CD4+细胞和CD8+细胞的总数量大于输入群体中活CD4+细胞和CD8+细胞的总数量之前的时间，收获或收集细胞。在特定实施方案中，在细胞总数大于转化、转导或旋转接种的细胞中细胞的总数量之前的时间，收获或收集细胞。在各种实施方案中，在活CD4+细胞和CD8+细胞的总数量大于转化、转导或旋转接种的细胞中活CD4+细胞和CD8+细胞的总数量之前的时间，收获或收集细胞。

在某些实施方案中，所述过程包括如下步骤：在收获或收集期间或之后例如使用过滤器(例如，40μm过滤器)过滤细胞组合物，例如，以去除大颗粒。在某些实施方案中，所述过滤步骤在正在收获或收集细胞的同时进行。例如，可以将过滤器串联在转导后被孵育的细胞与收获/收集装置(如

或Sepax

细胞处理系统)之间。在某些实施方案中，收获或收集细胞，然后过滤，之后任选地洗涤过滤的组合物。在某些实施方案中，收获或收集细胞，洗涤，并且过滤洗涤的细胞组合物。

在某些实施方案中，经配制细胞是输出细胞。在一些实施方案中，富集的T细胞的配制群体是富集的T细胞的输出群体。在特定实施方案中，配制的CD4+ T细胞和配制的CD8+T细胞是输出CD4+和CD8+ T细胞。在特定实施方案中，配制的细胞群体(例如，富集的CD4+和CD8+细胞的配制群体)是输出细胞群体，例如，富集的CD4+和CD8+细胞的输出群体。

在一些实施方案中，可以将细胞配制到容器如袋子或小瓶中。在一些实施方案中，小瓶可以是输注小瓶。在一些实施方案中，使小瓶配制为具有所述工程化细胞的单一单位剂量，所述单一单位剂量如包括用于以给定剂量或其部分施用的细胞数量。

在一些实施方案中，将细胞配制在药学上可接受的缓冲液中，所述药学上可接受的缓冲液在一些方面可以包括药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，处理包括将介质交换成药学上可接受的或施用于受试者所需的介质或配制缓冲液。在一些实施方案中，处理步骤可以涉及洗涤转导的和/或扩增的细胞以替代药学上可接受的缓冲液中的细胞，所述药学上可接受的缓冲液可以包括一种或多种任选的药学上可接受的载体或赋形剂。包括药学上可接受的载体或赋形剂的此类药物形式的例子可以是下文与将细胞和组合物施用于受试者可接受的形式结合描述的任何形式。在一些实施方案中，药物组合物以有效治疗或预防疾病或病症的量(如治疗有效量或预防有效量)含有细胞。

“药学上可接受的载体”是指药物配制品中除了活性成分之外对受试者无毒的成分。药学上可接受的载体包括但不限于缓冲液、赋形剂、稳定剂或防腐剂。

在一些方面，载体的选择部分取决于特定细胞和/或施用方法。因此，存在多种合适的配制品。例如，所述药物组合物可以含有防腐剂。合适的防腐剂可以包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。在一些方面中，使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.0001％至约2％的量存在。载体描述于例如Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版,Osol,A.编辑(1980).药学上可接受的载体在所用的剂量和浓度下通常对接受者无毒，并且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲氯铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苄醇；烷基对羟基苯甲酸酯，如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖类，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如锌-蛋白质络合物)；和/或非离子表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。

在一些方面，在所述组合物中包括缓冲剂。合适的缓冲剂包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。在一些方面中，使用两种或更多种缓冲剂的混合物。所述缓冲剂或其混合物通常以按总组合物的重量计约0.001％至约4％的量存在。用于制备可施用的药物组合物的方法是已知的。示例性方法更详细地描述于例如Remington:TheScience and Practice of Pharmacy,Lippincott Williams&Wilkins；21st ed.(2005年5月1日)中。

配制品可以包括水溶液。所述配制品或组合物还可含有可用于用细胞治疗的特定适应症、疾病或病症的多于一种活性成分，优选具有与所述细胞互补的活性的那些成分，其中各自的活性不会相互产生不利影响。此类活性成分以有效用于既定目的的量以合适的方式组合存在。因此，在一些实施方案中，药物组合物还包括其他药物活性药剂或药物，例如化学治疗剂，例如天冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、多柔比星、氟尿嘧啶、吉西他滨、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗、长春碱和/或长春新碱。在一些实施方案中，将药剂或细胞以盐(例如，药学上可接受的盐)的形式施用。合适的药学上可接受的酸加成盐包括源自无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、偏磷酸，硝酸和硫酸)和有机酸(如酒石酸、乙酸、柠檬酸、苹果酸、乳酸、富马酸、苯甲酸、乙醇酸、葡萄糖酸、琥珀酸和芳基磺酸，例如对甲苯磺酸)的那些盐。

在一些实施方案中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或病症的量(如治疗有效量或预防有效量)的药剂或细胞。在一些实施方案中，通过定期评估所治疗的受试者来监测治疗或预防功效。对于数天或更长时间的重复给予，取决于病症，重复所述治疗直至出现所需疾病症状的抑制。然而，其他剂量方案可能是有用的并且可以被确定。所需剂量可以通过单次推注给予所述组合物、通过多次推注给予所述组合物或通过连续输注给予所述组合物来递送。

所述药剂或细胞可以通过任何合适的方式施用，例如通过推注输注，通过注射例如静脉内或皮下注射、眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、经中隔注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房注射、结膜下(subconjectval)注射、结膜下(subconjuntival)注射、眼球筋膜囊下(sub-Tenon)注射、球后注射、球周注射或后近巩膜(posterior juxtascleral)递送。在一些实施方案中，将它们通过肠胃外、肺内和鼻内以及(如果需要用于局部治疗的话)病灶内施用来施用。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。在一些实施方案中，给定剂量通过细胞或药剂的单次推注给药来施用。在一些实施方案中，其是通过例如在不超过3天的时间段内对细胞或药剂的多次推注施用或通过细胞或药剂的连续输注施用来施用。

对于疾病的预防或治疗，适当的剂量可以取决于待治疗的疾病类型、一种或多种药剂的类型、细胞或重组受体的类型、疾病的严重程度和病程、施用药剂或细胞是用于预防目的还是治疗目的、先前疗法、受试者的临床病史和对药剂或细胞的反应以及主治医师的决断。在一些实施方案中，所述组合物适合一次或在一系列治疗中施用于受试者。

可以使用标准施用技术、配制品和/或设备施用细胞或药剂。提供了用于储存和施用所述组合物的配制品和装置(如注射器和小瓶)。关于细胞，施用可以是自体的或异源的。例如，免疫应答细胞或祖细胞可以获得自一名受试者，并且施用于同一受试者或不同的相容受试者。外周血衍生的免疫应答细胞或其后代(例如，体内、离体或体外衍生的)可以经由局部注射施用，包括导管施用、全身注射、局部注射、静脉内注射或肠胃外施用。当施用治疗性组合物(例如，含有基因修饰的免疫反应性细胞或治疗或改善神经毒性症状的药剂的药物组合物)时，通常将其配制成单位剂量可注射形式(溶液、悬浮液、乳液)。

配制品包括用于口服、静脉内、腹膜内、皮下、经肺、透皮、肌内、鼻内、经颊、舌下或栓剂施用的那些。在一些实施方案中，肠胃外施用药剂或细胞群体。如本文所用术语“肠胃外”包括静脉内、肌内、皮下、直肠、阴道和腹膜内施用。在一些实施方案中，使用通过静脉内、腹膜内或皮下注射的外周全身递送向受试者施用药剂或细胞群体。

在一些实施方案中，组合物作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体或粘性组合物，其在一些方面可以缓冲至选择的pH。液体制剂一般比凝胶、其他粘性组合物和固体组合物制备起来更容易。另外地，液体组合物稍微更方便给予，特别是通过注射。在另一方面，粘性组合物可以配制在适当的粘度范围内，以提供与特定组织的更长的接触时间。液体或粘性组合物可以包含载体，其可以是溶剂或分散介质，其含有例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。

无菌可注射溶液可以通过以下方式来制备：将所述药剂或细胞掺入溶剂中，如掺入与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)的混合物中。

用于体内施用的配制品通常是无菌的。可以例如通过经无菌滤膜过滤容易地实现无菌。

在一些实施方案中，所施用细胞的剂量在低温保存的组合物中。在一些方面，在将低温保存的组合物解冻后施用组合物。在一些实施方案中，在解冻后为或约30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟或180分钟内施用组合物。在一些实施方案中，在解冻后为或约120分钟内施用组合物。

在一些实施方案中，用注射器施用细胞的剂量。在一些实施方案中，注射器的体积是为或约0.5、1、2、2.5、3、4、5、7.5、10、20或25mL或由任何前述值限定的范围。

还提供了制品和试剂盒，其含有表达重组受体的工程化细胞或其组合物，以及任选地使用说明书，例如根据所提供的方法进行施用的说明书。在一些实施方案中，说明书指定选择或鉴定用于根据任何所提供的方法的疗法的受试者的标准。

在一些实施方案中，提供了制品和/或试剂盒，其包括包含治疗有效量的本文所述的任何工程化细胞的组合物，以及向受试者施用以治疗疾病或病症的说明书。在一些实施方案中，所述说明书可以指定本文所提供方法的一些或所有要素。在一些实施方案中，所述说明书指定施用用于细胞疗法的细胞的具体指导，例如，用于施用的剂量、时间安排、受试者的选择和/或鉴定以及用于施用的条件。在一些实施方案中，所述制品和/或试剂盒进一步包括用于疗法(例如，淋巴细胞清除疗法和/或组合疗法，如本文所述的任一种)的一种或多种另外的药剂，并且任选地进一步包括用于施用用于疗法的另外的药剂的说明书。在一些实施方案中，所述制品和/或试剂盒进一步包含用于淋巴细胞清除疗法的药剂，并且任选地进一步包括用于施用淋巴细胞清除疗法的说明书。在一些实施方案中，所述说明书可以作为伴随用于施用的组合物的标签或包装说明书而包含在内。

可以添加各种增强所述组合物的稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲液。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂(例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸)来确保防止微生物的作用。通过使用延迟吸收的药剂(例如单硬脂酸铝和明胶)可以实现可注射药物形式的延长吸收。

在一些实施方案中，配制缓冲液含有低温保存剂。在一些实施方案中，用低温保存剂溶液配制细胞，所述低温保存剂溶液含有1.0％至30％的DMSO溶液，如5％至20％的DMSO溶液或5％至10％的DMSO溶液。在一些实施方案中，低温保存剂溶液是或含有例如含有20％DMSO和8％人血清白蛋白(HSA)的PBS、或其他合适的细胞冷冻介质。在一些实施方案中，低温保存剂溶液是或含有例如至少或约7.5％DMSO。在一些实施方案中，加工步骤可以涉及洗涤经转导的和/或扩增的细胞以交换在低温保存剂溶液中的细胞。在一些实施方案中，将所述细胞在介质和/或溶液中冷冻(例如，低温保护或低温保存)，所述介质和/或溶液具有最终浓度为或为约12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％或5.0％的DMSO，或者在1％与15％之间、在6％与12％之间、在5％与10％之间、或在6％与8％之间的DMSO。在特定实施方案中，将所述细胞在介质和/或溶液中冷冻(例如，低温保护或低温保存)，所述介质和/或溶液具有最终浓度为或为约5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％、或0.25％的HSA，或者在0.1％与-5％之间、在0.25％与4％之间、在0.5％与2％之间、或在1％与2％之间的HSA。

在特定实施方案中，将富集的T细胞(例如已经进行刺激、工程化和/或孵育的T细胞)的组合物配制，低温保护，然后储存一定时间量。在某些实施方案中，储存配制的低温保护的细胞，直至释放细胞用于输注。在特定实施方案中，将配制的低温保护的细胞储存1天与6个月之间、1个月与3个月之间、1天与14天之间、1天与7天之间、3天与6天之间、6个月与12个月之间、或长于12个月。在一些实施方案中，将细胞低温保护并储存为、为约或为小于1天、2天、3天、4天、5天、6天或7天。在某些实施方案中，在储存之后，将细胞解冻并施用至受试者。在某些实施方案中，将细胞储存持续或持续约5天。在一些实施方案中，配制的细胞并未低温保存。

在一些实施方案中，使用一个或多个处理步骤进行配制，所述步骤包括洗涤、稀释或浓缩细胞。在一些实施方案中，处理可以包括将细胞稀释或浓缩至所需浓度或数量，如包括用于以给定剂量或其部分用的细胞数量的单位剂型组合物。在一些实施方案中，处理步骤可以包括减小体积，从而根据需要增加细胞的浓度。在一些实施方案中，处理步骤可以包括增加体积，从而根据需要减小细胞的浓度。在一些实施方案中，处理包括向转导的和/或孵育的细胞添加一定体积的配制缓冲液。在一些实施方案中，配制缓冲液的体积是从或从约10mL至1000mL，如至少或约至少或为约或为50mL、100mL、200mL、300mL、400mL、500mL、600mL、700mL、800mL、900mL或1000mL。

在一些实施方案中，用于配制细胞组合物的这样的处理步骤在封闭系统中进行。此类处理步骤的例子可以使用与跟细胞处理系统相关的一个或多个系统或套件结合的离心室(例如由Biosafe SA生产和出售的离心室，包括用于与

或Sepax

细胞处理系统一起使用的那些)来进行。在国际公开号WO 2016/073602中描述了示例性系统和过程。在一些实施方案中，所述方法包括实现自离心室的内部空腔输送经配制组合物，所述经配制组合物是在如所述的任何以上实施方案中，在配制缓冲液(如药学上可接受的缓冲液)中配制的所得细胞组合物。在一些实施方案中，将所配制的组合物输送到容器，如作为封闭系统的一部分与离心室可操作地连接的袋。在一些实施方案中，容器(如袋)在输出线或输出位置处与系统连接。

在一些实施方案中，如与离心室或细胞处理系统相关联的封闭系统包括多端口输出试剂盒，所述试剂盒含有在管线各末端与端口相关联的多路管歧管，所述端口可以连接至一个或多个容器以供经配制组合物输送。在一些方面，可以将所需数量或多个输出容器(例如，袋子)无菌地连接至多端口输出的一个或多个(通常两个或更多个，如至少3、4、5、6、7、8个或更多个)端口。例如，在一些实施方案中，可以将一个或多个容器(例如，袋子)附着到端口，或者附着到少于所有端口。因此，在一些实施方案中，所述系统可以实现将输出组合物输送到多个输出袋中。

在一些方面，可以将细胞以用于剂量施用(如用于单一单位剂量施用或多剂量施用)的量输送到多个输出袋中的一个或多个中。例如，在一些实施方案中，输出袋可以各自含有用于以给定剂量或其部分施用的细胞数量。因此，在一些方面，每个袋可以含有用于给予的单一单位剂量或可以含有所需剂量的分数，使得所述多个输出袋中的超过一个(如输出袋中的两个或输出袋中的三个)一起构成用于给予的剂量。

因此，容器(例如输出袋)通常含有要施用的细胞，例如，其一个或多个单位剂量。单位剂量可以是要施用于受试者的细胞的量或数量，或者是要施用的细胞的数量的两倍(或更多数量)。它可以是要施用于受试者的细胞的最低剂量或最低可能剂量。

在一些实施方案中，每个容器(例如，袋)单独包含单位剂量的细胞。因此，在一些实施方案中，每个容器包含相同或大致或基本相同数量的细胞。在一些实施方案中，每个单位剂量含有至少或约至少1x10⁶、2x10⁶、5x10⁶、1x10⁷、5x10⁷或1x10⁸个工程化细胞、总细胞、T细胞或PBMC。在一些实施方案中，每个袋子中配制的细胞组合物的体积是10mL至100mL，如至少或约至少20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL或100mL。

在一些实施方案中，将通过所述方法产生的此类细胞或包含此类细胞的组合物施用至受试者以治疗疾病或病症。

III.组合物和配制品

所提供的方法和用途涉及使用或施用一定剂量的如下组合物的工程化细胞，所述组合物包含表达嵌合抗原受体(CAR)(例如抗CD19 CAR如靶向人CD19的CAR)的工程化T细胞。在某些实施方案中，所述组合物是富集T细胞的治疗性组合物，例如，富集CD3+ T细胞的组合物或富集CD4+和CD8+ T细胞的组合物，其是使用本文(例如在章节II-C中)所公开的用于生成或产生输出工程化细胞和/或包含工程化T细胞的输出组合物的过程制造的。在一些实施方案中，工程化T细胞作为组合物、配制品或剂量(如药物组合物、配制品或剂量)提供。此类组合物、配制品或剂量可以根据所提供的方法或用途和/或用所提供制品或组合物来使用，如用于预防或治疗疾病、病症和障碍，或用于检测、诊断和预后方法。

在特定实施方案中，包含表达抗CD19 CAR的工程化T细胞的组合物富集CD3+T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少或约50％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约98％、至少或约98.5％、至少或约99％、至少或约99.5％、至少或约99.9％、100％或约100％的总细胞、总活细胞、总活性细胞、总T细胞、总活T细胞、总活性T细胞、总活性CD45+细胞或其CAR表达细胞是CD3+，例如CD3+ T细胞或CAR+CD3+ T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中在为或约75％与为或约80％之间、在为或约80％与为或约85％之间、在为或约85％与为或约90％之间、在为或约90％与为或约95％之间、在为或约95％与为或约99％之间的总细胞、总活细胞、总活性细胞、总T细胞、总活T细胞、总活性T细胞、总活性CD45+细胞或其CAR表达细胞是CD3+，例如CD3+T细胞或CAR+CD3+ T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中为或约80％、为或约81％、为或约82％、为或约83％、为或约84％、为或约85％、为或约86％、为或约87％、为或约88％、为或约89％、为或约90％、为或约91％、为或约92％、为或约93％、为或约94％、为或约95％、为或约96％、为或约97％、为或约98％、为或约99％的总活性CD45+细胞或其CAR表达细胞是CD3+，例如CD3+ T细胞或CAR+CD3+ T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中在约80％与约100％之间、在约85％与约99％之间、在约88％与约98％之间、在约96％与约99％之间、或在约97％与约99％之间的总活性CD45+细胞或CAR表达细胞是CD3+，例如CD3+ T细胞或CAR+CD3+ T细胞。在一些实施方案中，所述组合物由CD3+ T细胞组成或基本上由CD3+ T细胞组成。在一些实施方案中，所述组合物中至少或约80％的总细胞是CD3+ T细胞并且所述组合物中至少或约30％、至少或约40％、至少或约50％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约80％、至少或约90％、或至少或约95％的总细胞表达抗CD19 CAR。在一些实施方案中，所述组合物中至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、或至少或约99％的总活性CD45+细胞呈CD3+并且所述组合物中至少或约40％或至少或约50％的总细胞表达抗CD19 CAR。

在一些实施方案中，所述组合物中少于或少于约2.5％、少于或少于约2％、少于或少于约1.5％、少于或少于约1％、少于或少于约0.5％、少于或少于约0.4％、少于或少于约0.3％、少于或少于约0.2％、少于或少于约0.1％、少于或少于约0.05％、或为或约0％的总细胞、总活细胞、总活性细胞、总T细胞、总活T细胞、总活性T细胞、总活性CD45+细胞或其CAR表达细胞对于表达NK细胞标记物呈阳性。在一些实施方案中，所述组合物中在为或约2.5％与为或约2％之间、在为或约2％与为或约1.5％之间、在为或约1.5％与为或约1％之间、在为或约1％与为或约0.5％之间、在为或约0.5％与为或约0.4％之间、在为或约0.4％与为或约0.3％之间、在为或约0.3％与为或约0.2％之间、在为或约0.2％与为或约0.1％之间、在为或约0.1％与为或约0.05％之间、少于或少于约0.05％、或为或约0％的总细胞、总活细胞、总活性细胞、总T细胞、总活T细胞、总活性T细胞、总活性CD45+细胞或其CAR表达细胞是NK细胞。在一些实施方案中，所述组合物中在为或约1.5％与为或约0％之间、或在为或约0.5％与为或约0％之间的总活性CD45+细胞是NK细胞。在一些实施方案中，所述组合物不含或基本不含NK细胞或对表达NK细胞标记物呈阳性的细胞。

在一些实施方案中，所述组合物中少于或少于约0.2％、少于或少于约0.15％、少于或少于约0.1％、少于或少于约0.05％、少于或少于约0.01％、或为或约0％的总细胞、总活细胞、总活性细胞、总T细胞、总活T细胞、总活性T细胞、总活性CD45+细胞或其CAR表达细胞呈CD19+。在一些实施方案中，所述组合物中在为或约0.2％与为或约0.15％之间、在为或约0.15％与为或约0.1％之间、在为或约0.1％与为或约0.05％之间、在为或约0.05％与为或约0.01％之间、少于或少于约0.01％、或为或约0％的总细胞、总活细胞、总活性细胞、总T细胞、总活T细胞、总活性T细胞、总活性CD45+细胞或其CAR表达细胞呈CD19+。在一些实施方案中，所述组合物中在为或约0.1％与为或约0％之间、或在为或约0.05％与为或约0％之间的总活性CD45+细胞呈CD19+。在一些实施方案中，所述组合物不含或基本上不含CD19+细胞。

在一些实施方案中，所述组合物中至少或约80％的总活性CD45+细胞呈CD3+，所述组合物中至少或约40％的总细胞表达抗CD19 CAR，所述组合物中少于约1.5％的总活性CD45+细胞是NK细胞或对表达NK细胞标记物呈阳性的细胞，并且所述组合物中少于约0.1％的总活性CD45+细胞呈CD19+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或约96％的总活性CD45+细胞呈CD3+，所述组合物中至少或约50％的总细胞表达抗CD19 CAR，所述组合物中少于约0.5％的总活性CD45+细胞是NK细胞或对表达NK细胞标记物呈阳性的细胞，并且所述组合物中少于约0.05％的总活性CD45+细胞呈CD19+。

在特定实施方案中，包含表达抗CD19 CAR的工程化T细胞的组合物富集CD4+和CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少或约50％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约98％、至少或约98.5％、至少或约99％、至少或约99.5％、至少或约99.9％、100％、或约100％的总细胞、总活细胞、总活性细胞、总T细胞、总活T细胞、总活性T细胞、总活性CD45+细胞或其CAR表达细胞呈CD4+或CD8+。在一些实施方案中，所述组合物中在为或约75％与为或约80％之间、在为或约80％与为或约85％之间、在为或约85％与为或约90％之间、在为或约90％与为或约95％之间、在为或约95％与为或约99％之间的总细胞、总活细胞、总活性细胞、总T细胞、总活T细胞、总活性T细胞、总活性CD45+细胞或其CAR表达细胞呈CD4+或CD8+。在一些实施方案中，所述组合物中为或约80％、为或约81％、为或约82％、为或约83％、为或约84％、为或约85％、为或约86％、为或约87％、为或约88％、为或约89％、为或约90％、为或约91％、为或约92％、为或约93％、为或约94％、为或约95％、为或约96％、为或约97％、为或约98％、为或约99％的总活性CD45+细胞或其CAR表达细胞呈CD4+或CD8+。在一些实施方案中，所述组合物中在约80％与约100％之间、在约85％与约99％之间、在约88％与约98％之间、在约96％与约99％之间、或在约97％与约99％之间的总活性CD45+细胞或CAR表达细胞呈CD4+或CD8+。在一些实施方案中，所述组合物由CD4+ T细胞和CD8+ T细胞组成或基本上由CD4+ T细胞和CD8+ T细胞组成。在一些实施方案中，所述组合物中至少或约80％的总细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞并且所述组合物中至少或约30％、至少或约40％、至少或约50％、至少或约60％、至少或约70％、至少或约80％、至少或约90％、或至少或约95％的总细胞表达抗CD19 CAR。在一些实施方案中，所述组合物中至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约97％、至少或约98％、或至少或约99％的总活性CD45+细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞并且所述组合物中至少或约40％或至少或约50％的总细胞表达抗CD19 CAR。

在特定实施方案中，CD3+CD4+细胞在所述组合物中占总细胞、总活细胞、总活性细胞、总T细胞、总活T细胞、总活性T细胞、总活性CD45+细胞或其CAR表达细胞的至少或约50％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约98％、至少或约98.5％、至少或约99％、至少或约99.5％、至少或约99.9％、100％、或约100％。在特定实施方案中，CD3+CD4+细胞在所述组合物中占总活性CD45+细胞的在为或约50％与为或约70％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、在为或约60％与为或约65％之间、或在为或约65％与为或约70％之间。

在特定实施方案中，CD3+CD8+细胞占所述组合物中总细胞、总活细胞、总活性细胞、总T细胞、总活T细胞、总活性T细胞、总活性CD45+细胞或其CAR表达细胞的至少或约30％、至少或约35％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约98％、至少或约98.5％、至少或约99％、至少或约99.5％、至少或约99.9％、100％、或约100％。在特定实施方案中，CD3+CD8+细胞在所述组合物中占总活性CD45+细胞的在为或约30％与为或约50％之间、在为或约30％与为或约35％之间、在为或约35％与为或约40％之间、在为或约40％与为或约45％之间、或在为或约45％与为或约50％之间。

在特定实施方案中，CD3+CD4+细胞在所述组合物中占总活性CD45+细胞的在约55％与约65％之间，而CD3+CD8+细胞在所述组合物中占总活性CD45+细胞的在约35％与约45％之间。在特定实施方案中，CD3+CD4+细胞在所述组合物中占总活性CD45+细胞的约60％，而CD3+CD8+细胞占约40％。

在特定实施方案中，CAR+CD3+细胞(例如，表达抗CD19 CAR的CD3+细胞)占所述组合物中总细胞、总活细胞、总活性细胞、总T细胞、总活T细胞、总活性T细胞、总活性CD45+细胞或其CAR表达细胞的至少或约20％、至少或约30％、至少或约40％、至少或约50％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约98％、至少或约98.5％、至少或约99％、至少或约99.5％、至少或约99.9％、100％、或约100％。在特定实施方案中，CAR+CD3+细胞(例如，表达抗CD19 CAR的CD3+细胞)在所述组合物中占总活性CD45+细胞的在为或约40％与为或约100％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、在为或约60％与为或约65％之间、在为或约65％与为或约70％之间、在为或约70％与为或约75％之间、在为或约75％与为或约80％之间、在为或约80％与为或约85％之间、在为或约85％与为或约90％之间、在为或约90％与为或约95％之间、或在为或约95％与为或约99％之间。

在特定实施方案中，CAR+CD4+细胞(例如，表达抗CD19 CAR的CD4+细胞)占所述组合物中总细胞、总活细胞、总活性细胞、总T细胞、总活T细胞、总活性T细胞、总活性CD45+细胞或其CAR表达细胞的至少或约20％、至少或约30％、至少或约40％、至少或约50％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约98％、至少或约98.5％、至少或约99％、至少或约99.5％、至少或约99.9％、100％、或约100％。在特定实施方案中，CAR+CD4+细胞(例如，表达抗CD19 CAR的CD4+细胞)在所述组合物中占总活性CD45+细胞的在为或约20％与为或约60％之间、在为或约20％与为或约25％之间、在为或约25％与为或约30％之间、在为或约30％与为或约35％之间、在为或约35％与为或约40％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、或在为或约55％与为或约60％之间。

在特定实施方案中，CAR+CD8+细胞(例如，表达抗CD19 CAR的CD8+细胞)在所述组合物中占总细胞、总活细胞、总活性细胞、总T细胞、总活T细胞、总活性T细胞、总活性CD45+细胞或其CAR表达细胞的至少或约10％、至少或约20％、至少或约30％、至少或约35％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约96％、至少或约98％、至少或约98.5％、至少或约99％、至少或约99.5％、至少或约99.9％、100％、或约100％。在特定实施方案中，CAR+CD8+细胞(例如，表达抗CD19 CAR的CD8+细胞)在所述组合物中占总活性CD45+细胞的在为或约5％与为或约35％之间、在为或约5％与为或约10％之间、在为或约10％与为或约15％之间、在为或约15％与为或约20％之间、在为或约20％与为或约25％之间、在为或约25％与为或约30％之间、在为或约30％与为或约35％。

在特定实施方案中，CAR+CD3+细胞(例如，表达抗CD19 CAR的CD3+细胞)在所述组合物中占总活性CD45+细胞的在约35％与约65％之间。在特定实施方案中，CAR+CD4+细胞(例如，表达抗CD19 CAR的CD4+细胞)在所述组合物中占总活性CD45+细胞的在约25％与约55％之间，而CAR+CD8+细胞(例如表达抗CD19 CAR的CD8+细胞)在所述组合物中占总活性CD45+细胞的在约10％与约30％之间。在特定实施方案中，表达抗CD19 CAR的CD3+细胞在所述组合物中占总活性CD45+细胞的约50％。在特定实施方案中，CAR+CD4+细胞在所述组合物中占总活性CD45+细胞的约30％，而CAR+CD8+细胞占约20％。在特定实施方案中，表达抗CD19 CAR的CD3+细胞在所述组合物中占总活性CD45+细胞的约60％。在特定实施方案中，CAR+CD4+细胞在所述组合物中占总活性CD45+细胞的约40％，而CAR+CD8+细胞占约20％。

在特定实施方案中，组合物含有比率在3:1与1:3之间、在2.5:1与1:2.5之间、在2:1与1:2之间、在1.5:1与1:1.5之间、在1.4:1与1:1.4之间、在1.3:1与1:1.3之间、在1.2:1与1:1.2之间、或在1.1:1与1:1.1之间的CD4+ T细胞与CD8+ T细胞。在一些实施方案中，细胞组合物具有比率为或为约3:1、为或为约2.8:1、为或为约2.5:1、为或为约2.25:1、为或为约2:1、为或为约1.8:1、为或为约1.7:1、为或为约1.6:1、为或为约1.5:1、为或为约1.4:1、为或为约1.3:1、为或为约1.2:1、为或为约1.1:1、为或为约1:1、为或为约1:1.1、为或为约1:1.2、为或为约1:1.3、为或为约1:1.4、为或为约1:1.5、为或为约1:1.6、为或为约1:1.7、为或为约1:1.8、为或为约1:2、为或为约1:2.25、为或为约1:2.5、为或为约1:2.8或者为或为约1:3的CD4+ T细胞与CD8+ T细胞。

在一些实施方案中，输出组合物含有比率在3:1与1:3之间、在2.5:1与1:2.5之间、在2:1与1:2之间、在1.5:1与1:1.5之间、在1.4:1与1:1.4之间、在1.3:1与1:1.3之间、在1.2:1与1:1.2之间、或在1.1:1与1:1.1之间的表达重组受体(例如抗CD19 CAR)的CD4+ T细胞与表达重组受体(例如抗CD19 CAR)的CD8+ T细胞。在一些实施方案中，输出组合物中表达重组受体(例如，抗CD19 CAR)的CD4+ T细胞与表达重组受体(例如，抗CD19 CAR)的CD8+T细胞的比率为或为约3:1、为或为约2.8:1、为或为约2.5:1、为或为约2.25:1、为或为约2:1、为或为约1.8:1、为或为约1.7:1、为或为约1.6:1、为或为约1.5:1、为或为约1.4:1、为或为约1.3:1、为或为约1.2:1、为或为约1.1:1、为或为约1:1、为或为约1:1.1、为或为约1:1.2、为或为约1:1.3、为或为约1:1.4、为或为约1:1.5、为或为约1:1.6、为或为约1:1.7、为或为约1:1.8、为或为约1:2、为或为约1:2.25、为或为约1:2.5、为或为约1:2.8或者为或为约1:3。

在特定实施方案中，所述组合物含有在约2.5:1与约1:2之间或在约2:1与约1:1之间的比率的CD4+ T细胞与CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述细胞组合物具有比率为或为约1.5:1的CD4+ T细胞与CD8+ T细胞。在特定实施方案中，所述组合物含有在约3:1与约1:1之间的比率的CAR+CD4+细胞与CAR+CD8+细胞。在特定实施方案中，所述组合物含有在约2.5:1与约1.5:1之间的比率的CAR+CD4+细胞与CAR+CD8+细胞。在一些实施方案中，所述细胞组合物具有比率为或为约2:1的CAR+CD4+ T细胞与CAR+CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述细胞组合物具有比率为或为约1.5:1的CD4+T细胞与CD8+ T细胞，以及比率为或为约2:1的CAR+CD4+细胞与CAR+CD8+细胞。

在特定实施方案中，所述组合物含有至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约99％、或至少或至少约99.9％的活细胞。在一些实施方案中，所述组合物含有至少或至少约75％的活细胞。在某些实施方案中，所述组合物含有至少或至少约85％、至少或至少约90％、或至少或至少约95％的活细胞。在一些实施方案中，所述组合物含有至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约99％、或至少或至少约99.9％的活CD3+ T细胞。在特定实施方案中，所述组合物含有至少或至少约75％的活CD3+ T细胞。在某些实施方案中，所述组合物含有至少或至少约85％、至少或至少约90％、或至少或至少约95％的CD3+ T活细胞。在一些实施方案中，所述组合物含有至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约99％、或至少或至少约99.9％的活CD4+ T细胞。在某些实施方案中，所述组合物含有至少或至少约75％的活CD4+ T细胞。在特定实施方案中，所述组合物含有至少或至少约85％、至少或至少约90％、或至少或至少约95％的CD4+ T活细胞。在特定实施方案中，所述组合物含有至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约99％、或至少或至少约99.9％的CD8+T活细胞。在一些实施方案中，所述组合物含有至少或至少约75％的活CD8+ T细胞。在某些实施方案中，所述组合物含有至少或至少约85％、至少或至少约90％、或至少或至少约95％的CD8+ T活细胞。

在特定实施方案中，所述组合物具有低份额和/或频率的细胞正在经历和/或被准备、引发和/或进入凋亡。在特定实施方案中，所述组合物具有低份额和/或频率的对凋亡标记物呈阳性的细胞。在一些实施方案中，所述组合物中小于或小于约40％、小于或小于约35％、小于或小于约30％、小于或小于约25％、小于或小于约20％、小于或小于约15％、小于或小于约10％、小于或小于约5％或小于或小于约1％的细胞表达、含有凋亡标记物和/或对凋亡标记物呈阳性。在某些实施方案中，所述组合物中小于或小于约25％的细胞表达、含有凋亡标记物和/或对凋亡标记物呈阳性。在某些实施方案中，所述组合物中小于或小于约10％的细胞表达、含有凋亡标记物和/或对凋亡标记物呈阳性。

在特定实施方案中，所述组合组合物中至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约99％、或至少或至少约99.9％的抗CD19CAR表达细胞是活细胞，例如，对凋亡标记物如胱天蛋白酶(例如，激活的胱天蛋白酶-3)呈阴性的细胞。在某些实施方案中，所述组合物中至少或至少约85％、至少或至少约90％、或至少或至少约95％的抗CD19 CAR表达细胞对凋亡标记物如胱天蛋白酶(例如，激活的胱天蛋白酶-3)呈阴性。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约99％、或至少或至少约99.9％的CD3+ T细胞是活细胞，例如，对凋亡标记物如胱天蛋白酶(例如，激活的胱天蛋白酶-3)呈阴性的细胞。在某些实施方案中，所述组合物中至少或至少约85％、至少或至少约90％、或至少或至少约95％的CD3+ T细胞对凋亡标记物如胱天蛋白酶(例如，激活的胱天蛋白酶-3)呈阴性。在特定实施方案中，所述组合物中至少或至少约90％的CD3+T细胞是活细胞，例如，对凋亡标记物如胱天蛋白酶(例如，激活的胱天蛋白酶-3)呈阴性的细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约99％、或至少或至少约99.9％的CAR+CD3+ T细胞是活细胞，例如，对凋亡标记物如胱天蛋白酶(例如，激活的胱天蛋白酶-3)呈阴性的细胞。在特定实施方案中，所述组合物中至少或至少约85％、至少或至少约90％、或至少或至少约95％的抗CD19 CAR表达CD3+ T细胞是活细胞，例如，对凋亡标记物如胱天蛋白酶(例如，激活的胱天蛋白酶-3)呈阴性的细胞。

在一些实施方案中，所述组合物中少于或少于约30％、少于或少于约25％、少于或少于约20％、少于或少于约15％、少于或少于约10％、或少于或少于约5％的总细胞、总T细胞、总CD45+细胞、总CD3+细胞、总CD4+和CD8+细胞或其CAR表达细胞表达凋亡标记物、任选膜联蛋白V或活性胱天蛋白酶3。在一些实施方案中，所述组合物中在为或约30％与为或约25％之间、在为或约25％与为或约20％之间、在为或约20％与为或约15％之间、在为或约15％与为或约10％之间、在为或约10％与为或约5％之间的总细胞、总T细胞、总CD45+细胞、总CD3+细胞、总CD4+和CD8+细胞或其CAR表达细胞表达凋亡标记物、任选膜联蛋白V或活性胱天蛋白酶3。在一些实施方案中，所述组合物中为或约6％、为或约8％、为或约10％、为或约12％、为或约14％、为或约16％、为或约18％、为或约20％、为或约22％、为或约24％、为或约26％、为或约28％、为或约30％的CD3+细胞表达凋亡标记物、任选膜联蛋白V或活性胱天蛋白酶3。

在一些实施方案中，表达抗CD19 CAR可以包括但不限于具有定位于细胞膜和/或细胞表面的一种或多种重组受体蛋白，具有可检测量的重组受体蛋白，具有可检测量的编码重组受体的mRNA，具有或含有编码重组受体的重组多核苷酸，和/或具有或含有作为重组受体表达的替代标记物的mRNA或蛋白质。

在一些实施方案中，所述组合物中至少或约5％、至少或约10％、至少或约20％、至少或约30％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约97％、至少或约99％或多于99％的细胞表达表达重组受体，例如抗CD19 CAR。在某些实施方案中，所述组合物中至少或约50％的细胞表达抗CD19 CAR。在某些实施方案中，所述组合物中至少或约5％、至少或约10％、至少或约20％、至少或约30％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约97％、至少或约99％或多于99％的CD3+ T细胞表达抗CD19 CAR。在一些实施方案中，所述组合物中至少或约50％的CD3+ T细胞表达抗CD19 CAR。在某些实施方案中，所述组合物中至少或约5％、至少或约10％、至少或约20％、至少或约30％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约97％、至少或约99％或多于99％的细胞是表达抗CD19 CAR的CD3+ T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少或约50％的细胞是表达抗CD19 CAR的CD3+ T细胞。

在一些实施方案中，所述组合物包含至少或至少约0.2x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、0.3x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、0.4x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、0.5x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、0.6x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、0.7x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、0.8x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、0.9x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、1x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、1.1x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、1.2x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、1.3x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、1.4x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、1.5x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、1.6x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、1.7x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、1.8x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、1.9x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、2x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、2.1x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、2.2x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、2.3x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、2.4x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、2.5x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、2.6x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、2.7x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、2.8x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、2.9x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、3x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、3.1x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、3.2x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、3.3x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、3.4x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、3.5x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、3.6x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、3.7x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、3.8x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、3.9x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、4x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、4.1x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、4.2x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、4.3x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、4.4x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、4.5x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、4.6x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、4.7x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、4.8x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、4.9x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、5x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、5.1x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、5.2x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、5.3x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、5.4x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、5.5x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、5.6x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、5.7x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、5.8x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、5.9x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL、或6x10⁶个CD3+CAR+细胞/mL，每个都包含端值。在一些实施方案中，所述组合物包含至少或至少约0.2x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、0.3x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、0.4x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、0.5x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、0.6x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、0.7x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、0.8x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、0.9x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、1x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、1.1x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、1.2x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、1.3x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、1.4x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、1.5x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、1.6x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、1.7x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、1.8x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、1.9x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、2x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、2.1x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、2.2x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、2.3x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、2.4x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、2.5x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、2.6x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、2.7x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、2.8x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、2.9x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、3x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、3.1x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、3.2x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、3.3x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、3.4x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、3.5x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、3.6x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、3.7x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、3.8x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、3.9x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、4x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、4.1x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、4.2x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、4.3x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、4.4x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、4.5x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、4.6x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、4.7x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、4.8x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、4.9x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、5x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、5.1x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、5.2x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、5.3x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、5.4x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、5.5x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、5.6x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、5.7x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、5.8x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、5.9x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL、或6x10⁶个活CD3+CAR+细胞/mL，每个都包含端值。

在特定实施方案中，组合物中至少或约30％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约97％、至少或约99％或超过99％的CD4+ T细胞表达重组受体，例如抗CD19 CAR。在特定实施方案中，所述组合物中至少或约50％的CD4+ T细胞表达重组受体，例如抗CD19 CAR。在一些实施方案中，所述组合物中至少或约30％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约97％、至少或约99％或多于99％的CD8+ T细胞表达重组受体，例如抗CD19 CAR。在某些实施方案中，所述组合物中至少或约50％的CD8+ T细胞表达重组受体，例如抗CD19 CAR。

在一些实施方案中，所述组合物中至少或约5％、至少或约10％、至少或约20％、至少或约30％、至少或约40％、至少或约45％、至少或约50％、至少或约55％、至少或约60％、至少或约65％、至少或约70％、至少或约75％、至少或约80％、至少或约85％、至少或约90％、至少或约95％、至少或约97％、至少或约99％或多于99％的活性CD45+细胞呈CD3+CAR+(例如，表达抗CD19 CAR的CD3+ T细胞)、CD4+CAR+(例如，表达抗CD19 CAR的CD4+ T细胞)和/或CD8+CAR+(例如，表达抗CD19 CAR的CD8+ T细胞)。在某些实施方案中，所述组合物中至少或约50％的活性CD45+细胞是表达抗CD19 CAR的CD3+ T细胞。在某些实施方案中，所述组合物中在为或约60％与为或约65％之间的活性CD45+细胞是表达抗CD19 CAR的CD3+ T细胞。在某些实施方案中，所述组合物中在为或约35％与为或约45％之间、在为或约35％与为或约40％之间、或在为或约40％与为或约45％之间的活性CD45+细胞是表达抗CD19 CAR的CD4+ T细胞。在某些实施方案中，所述组合物中在为或约15％与为或约25％之间、在为或约15％与为或约20％之间、或在为或约20％与为或约25％之间的活性CD45+细胞是表达抗CD19 CAR的CD8+ T细胞。在某些实施方案中，在所述组合物中的活性CD45+细胞中，至少或约60％是表达抗CD19 CAR的CD3+ T细胞，至少或约40％是表达抗CD19 CAR的CD4+ T细胞，并且至少或约20％是表达抗CD19 CAR的CD8+ T细胞。

在任何进行的实施方案中，所述组合物可以在一个或多个容器如小瓶中包含约或至少约10x10⁶、约或至少约20x10⁶、约或至少约25x10⁶、约或至少约50x10⁶、约或至少约100x10⁶、约或至少约200x10⁶、约或至少约400x10⁶、约或至少约600x10⁶、约或至少约800x10⁶、约或至少约1000x10⁶、约或至少约1200x10⁶、约或至少约1400x10⁶、约或至少约1600x10⁶、约或至少约1800x10⁶、约或至少约2000x10⁶、约或至少约2500x10⁶、约或至少约3000x10⁶、或者约或至少约4000x10⁶个总细胞，例如，总活细胞。在任何进行的实施方案中，所述组合物的体积可以是在1.0mL与10mL之间，包含端值，任选地为或约2mL、为或约3mL、为或约4mL、为或约5mL、为或约6mL、为或约7mL、为或约8mL、为或约9mL、或者为或约10mL，或者任何前述值之间的任何值。在一些实施方案中，所述组合物含于多个容器中，如2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个小瓶中。在任何进行的实施方案中，所述组合物可以包含每个单元容器如每个小瓶约或至少约5x10⁶、约或至少约10x10⁶、约或至少约20x10⁶、约或至少约25x10⁶、约或至少约50x10⁶、约或至少约100x10⁶、约或至少约150x10⁶、约或至少约200x10⁶、约或至少约250x10⁶、约或至少约300x10⁶、约或至少约350x10⁶、约或至少约400x10⁶、约或至少约450x10⁶、约或至少约500x10⁶、约或至少约550x10⁶、或者约或至少约600x10⁶个总细胞，例如，总活细胞。在一些实施方案中，所述一个或多个容器中的组合物的细胞在溶液或缓冲液中(例如，在低温保存溶液或缓冲液中)的密度为、为约或至少5x10⁶个细胞/mL、10x10⁶个细胞/mL、20x10⁶个细胞/mL、30x10⁶个细胞/mL、40x10⁶个细胞/mL、50x10⁶个细胞/mL、60x10⁶个细胞/mL、70x10⁶个细胞/mL、80x10⁶个细胞/mL、90x10⁶个细胞/mL、100x10⁶个细胞/mL、110x10⁶个细胞/mL、120x10⁶个细胞/mL、130x10⁶个细胞/mL、140x10⁶个细胞/mL、或150x10⁶细胞/mL。在一些实施方案中，使约或多达约900x10⁶个细胞(例如，活CD4+ T细胞和活CD8+ T细胞或活CD3+ T细胞)经受刺激，其中使刺激的组合物中约或多达约600x10⁶个细胞(例如，活CD4+ T细胞和活CD8+T细胞或活CD3+ T细胞)经受如使用病毒载体(例如，通过转导)或非病毒基因工程化方法的基因工程化，之后在不含任何重组细胞因子的无血清基础培养基(例如，补充有一种或多种补充剂)中孵育约72小时或约三天。在一些实施方案中，所产生的输出组合物在一个或多个容器如小瓶中包含约100x10⁶与约1400x10⁶之间的总细胞，例如，总活细胞。

在特定实施方案中，所述组合物的大多数细胞是幼稚或幼稚样细胞、中央记忆细胞和/或效应记忆细胞。在特定实施方案中，所述组合物的大多数细胞是幼稚样或中央记忆细胞。在一些实施方案中，输出组合物中的大多数细胞是中央记忆细胞。在一些方面，分化程度较低的细胞(例如，中央记忆细胞)不再存活，并且消耗较慢，从而增加持久性和耐久性。在一些方面，细胞疗法(如CAR-T细胞疗法)的反应者具有增加的中央记忆基因的表达。参见例如，Fraietta等人(2018)Nat Med.24(5):563-571。

在某些实施方案中，所述组合物的细胞具有高份额和/或频率的幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记物呈表面阳性的T细胞。在某些实施方案中，所述组合物的细胞中幼稚样细胞的份额和/或频率大于从替代性过程(如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的组合物。在某些实施方案中，幼稚样T细胞可以包括处于不同分化状态的细胞，并且特征可以是某些细胞标记物的阳性或高表达(例如，表面表达或细胞内表达)和/或其他细胞标记物的阴性或低表达(例如，表面表达或细胞内表达)。在一些方面，幼稚样T细胞的特征为CCR7、CD45RA、CD28和/或CD27的阳性或高表达。在一些方面，幼稚样T细胞的特征为CD25、CD45RO、CD56、CD62L和/或KLRG1的阴性表达。在一些方面，幼稚样T细胞的特征为CD95的低表达。在某些实施方案中，幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记物呈表面阳性的T细胞是CCR7+CD45RA+，其中所述细胞是CD27+或CD27-。在某些实施方案中，幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记物呈表面阳性的T细胞是CD27+CCR7+，其中所述细胞是CD45RA+或CD45RA-。在某些实施方案中，幼稚样T细胞或对幼稚样T细胞上表达的标记物呈表面阳性的T细胞是CD62L-CCR7+。

在特定实施方案中，所述组合物的细胞富含CCR7+细胞。CCR7是在T细胞进入淋巴结中涉及的趋化因子受体。在特定方面，CCR7由幼稚或幼稚样T细胞(例如CCR7+CD45RA+或CCR7+CD27+)和中央记忆T细胞(CCR7+CD45RA-)表达。在一些实施方案中，通过所提供的方法产生的所提供的工程化T细胞的组合物包括T细胞群体，其中所述群体中大于或大于约50％、大于或大于约55％、大于或者大于或大于约60％、大于或者大于或大于约65％、大于或者大于或大于约70％、大于或者大于或大于约75％、大于或者大于或大于约80％、大于或者大于或大于约85％、或大于或者大于或大于约90％的T细胞是中央记忆和幼稚样T细胞。在一些实施方案中，通过所提供的方法产生的所提供的工程化T细胞的组合物包括T细胞群体，其中所述群体中大于或大于约50％、大于或大于约55％、大于或者大于或大于约60％、大于或者大于或大于约65％、大于或者大于或大于约70％、大于或者大于或大于约75％、大于或者大于或大于约80％、大于或者大于或大于约85％、或大于或者大于或大于约90％的T细胞是CCR7+ T细胞。在一些实施方案中，通过所提供的方法产生的所提供的工程化T细胞的组合物包括T细胞群体，其中所述群体中大于或大于约50％、大于或大于约55％、大于或者大于或大于约60％、大于或者大于或大于约65％、大于或者大于或大于约70％、大于或者大于或大于约75％、大于或者大于或大于约80％、大于或者大于或大于约85％、或大于或者大于或大于约90％的T细胞是CCR7+CD27+。在一些实施方案中，通过所提供的方法产生的所提供的工程化T细胞的组合物包括T细胞群体，其中所述群体中大于或大于约50％、大于或大于约55％、大于或者大于或大于约60％、大于或者大于或大于约65％、大于或者大于或大于约70％、大于或者大于或大于约75％、大于或者大于或大于约80％、大于或者大于或大于约85％、或大于或者大于或大于约90％的T细胞是CCR7+CD45RA-。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有高份额和/或频率的中央记忆T细胞或对中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性的T细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中中央记忆细胞的份额和/或频率大于从替代性过程(如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物。在某些实施方案中，中央记忆T细胞可以包括处于不同分化状态的细胞，并且特征可以是某些细胞标记物的阳性或高表达(例如，表面表达)和/或其他细胞标记物的阴性或低表达(例如，表面表达)。在一些方面，中央记忆T细胞的特征为CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3和/或CD127的阳性或高表达。在一些方面，中央记忆T细胞的特征为CD45RA和/或颗粒酶B的阴性或低表达。在某些实施方案中，中央记忆T细胞或对中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性的T细胞是CCR7+CD45RA-。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞中幼稚样细胞和中央记忆细胞的份额和/或频率大于从替代性过程(如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的效应记忆和/或效应记忆RA T细胞或对效应记忆和/或效应记忆RA T细胞上表达的标记物呈表面阳性的T细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中效应记忆和/或效应记忆RA T细胞的份额和/或频率低于从替代性过程(如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物。在某些实施方案中，效应记忆和/或效应记忆RA T细胞可以包括处于不同分化状态的细胞，并且特征可以是某些细胞标记物的阳性或高表达(例如，表面表达或细胞内表达)和/或其他细胞标记物的阴性或低表达(例如，表面表达或细胞内表达)。在某些实施方案中，效应记忆T细胞或对效应记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性的T细胞是CCR7-CD45RA-。在某些实施方案中，效应记忆RA T细胞或对效应记忆RA T细胞上表达的标记物呈表面阳性的T细胞是CCR7-CD45RA+。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞中效应记忆T细胞的份额和/或频率低于从替代性过程(如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中效应记忆RA T细胞的份额和/或频率低于从替代性过程(如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中幼稚样细胞和中央记忆细胞的份额和/或频率大于从替代性过程(如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物，并且效应记忆和效应记忆RA T细胞的份额和/或频率低于所述从替代性过程产生的输出组合物。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有高份额和/或频率的幼稚样和/或中央记忆细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有高份额和/或频率的中央记忆细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的细胞具有记忆表型，具有幼稚样或中央记忆表型，或者是幼稚样或中央记忆T细胞，或者是中央记忆T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞是幼稚样或中央记忆T细胞，或是中央记忆T细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD4+ T细胞是幼稚样或中央记忆CD4+ T细胞，或是中央记忆CD4+ T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD4+ T细胞是幼稚样或中央记忆CD4+ T细胞，或是中央记忆CD4+ T细胞。在某些实施方案中，输出组合物的在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％、在为或约45％与为或约50％、在为或约50％与为或约55％、在为或约55％与为或约60％、或在为或约60％与为或约65％之间的CD4+ T细胞是幼稚样或中央记忆CD4+ T细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD4+CAR+ T细胞是幼稚样或中央记忆CD4+CAR+ T细胞，或是中央记忆CD4+CAR+ T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD4+CAR+ T细胞是幼稚样或中央记忆CD4+CAR+ T细胞，或是中央记忆CD4+CAR+ T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD4+CAR+ T细胞是幼稚样或中央记忆CD4+CAR+ T细胞，或是中央记忆CD4+CAR+ T细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD8+ T细胞是幼稚样或中央记忆CD8+ T细胞，或是中央记忆CD8+ T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD8+ T细胞是幼稚样或中央记忆CD8+ T细胞，或是中央记忆CD8+ T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD8+ T细胞是幼稚样或中央记忆CD8+ T细胞，或是中央记忆CD8+ T细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD8+CAR+ T细胞是幼稚样或中央记忆CD8+CAR+ T细胞，或是中央记忆CD8+CAR+ T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD8+CAR+ T细胞是幼稚样或中央记忆CD8+CAR+ T细胞，或是中央记忆CD8+CAR+ T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD8+CAR+ T细胞是幼稚样或中央记忆CD8+CAR+ T细胞，或是中央记忆CD8+CAR+ T细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CAR+ T细胞(例如，CD4+CAR+ T细胞和CD8+CAR+ T细胞)是幼稚样或中央记忆T细胞，或是中央记忆T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CAR+ T细胞(例如，CD4+CAR+ T细胞和CD8+CAR+ T细胞)是幼稚样或中央记忆T细胞，或是中央记忆T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CAR+ T细胞是CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CAR+ T细胞是CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+。

在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约85％的细胞具有幼稚样或中央记忆表型，或是幼稚样或中央记忆T细胞。在某些实施方案中，输出组合物中少于或为或约15％的细胞具有效应子或效应子RA表型或者是效应子或效应子RA T细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的被耗竭和/或是衰老的细胞。在特定实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的被消耗的和/或衰老的细胞。在一些实施方案中，输出组合物中的细胞的小于或小于约40％、小于或小于约35％、小于或小于约30％、小于或小于约25％、小于或小于约20％、小于或小于约15％、小于或小于约10％、小于或小于约5％、或小于或小于约1％被耗竭和/或是衰老的。在某些实施方案中，输出组合物中小于或小于约25％的细胞是被耗竭的和/或衰老的。在某些实施方案中，输出组合物中小于或小于约10％的细胞是被耗竭的和/或衰老的。

在一些实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的对CD27和CD28表达(例如表面表达)呈阴性的细胞。在特定实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的CD27-CD28-细胞。在一些实施方案中，输出组合物中的细胞的小于或小于约40％、小于或小于约35％、小于或小于约30％、小于或小于约25％、小于或小于约20％、小于或小于约15％、小于或小于约10％、小于或小于约5％、或小于或小于约1％是CD27-CD28-细胞。在某些实施方案中，输出组合物中小于或小于约25％的细胞是CD27-CD28-细胞。在某些实施方案中，输出组合物中小于或小于约10％的细胞是CD27-CD28-细胞。在实施方案中，输出组合物中小于或小于约5％的细胞是CD27-CD28-细胞。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有高份额和/或频率的对CD27和CD28表达(例如表面表达)呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出组合物中的细胞具有高份额和/或频率的CD27+CD28+细胞。在一些实施方案中，输出组合物中的细胞的至少或至少约50％、至少或至少约60％、至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、或大于或大于约95％是CD27+CD28+细胞。在某些实施方案中，输出组合物中小于或小于约25％的细胞是CD27-CD28-细胞。在某些实施方案中，输出组合物中至少或至少约50％的细胞是CD27+CD28+细胞。在实施方案中，输出组合物中至少或至少约75％的细胞是CD27+CD28+细胞。

在特定实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的作为T_EMRA细胞的细胞。在特定实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的T_EMRA细胞。在一些实施方案中，输出组合物中的细胞的小于或小于约40％、小于或小于约35％、小于或小于约30％、小于或小于约25％、小于或小于约20％、小于或小于约15％、小于或小于约10％、小于或小于约5％、或小于或小于约1％是T_EMRA细胞。在一些实施方案中，输出组合物中小于或小于约25％的细胞是T_EMRA细胞。在一些实施方案中，输出组合物中小于或小于约10％的细胞是T_EMRA细胞。在一些实施方案中，输出组合物中小于或小于约5％的细胞是T_EMRA细胞。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的对CCR7表达(例如表面表达)呈阴性并且对CD45RA表达(例如表面表达)呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的CCR7-CD45RA+细胞。在特定实施方案中，输出组合物中的细胞的小于或小于约40％、小于或小于约35％、小于或小于约30％、小于或小于约25％、小于或小于约20％、小于或小于约15％、小于或小于约10％、小于或小于约5％、或小于或小于约1％是CCR7-CD45RA+细胞。在一些实施方案中，输出组合物中小于或小于约25％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。在特定实施方案中，输出组合物中小于或小于约10％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。在某些实施方案中，输出组合物中小于或小于约5％的细胞是CCR7-CD45RA+细胞。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有高份额和/或频率的处于早期分化阶段中的T细胞，或对处于早期分化阶段中的T细胞上表达的标记物呈表面阳性的T细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中处于早期分化阶段中的T细胞的份额和/或频率大于从替代性过程(如涉及扩增的过程(例如包括扩增单元操作和/或包括旨在引起细胞扩增的步骤的过程))产生的输出组合物。在某些实施方案中，处于早期分化阶段中的T细胞的特征可以是某些细胞标记物的阳性或高表达(例如，表面表达或细胞内表达)和/或其他细胞标记物的阴性或低表达(例如，表面表达或细胞内表达)。在一些方面，处于早期分化阶段中的T细胞的特征为CCR7和/或CD27的阳性或高表达。在某些实施方案中，处于早期分化阶段中的T细胞或对处于早期分化阶段中的T细胞上表达的标记物呈表面阳性的T细胞是CCR7+CD27+。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的处于中期分化阶段中的T细胞，或对处于中期分化阶段中的T细胞上表达的标记物呈表面阳性的T细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中处于中期分化阶段中的T细胞的份额和/或频率低于从替代性过程(如涉及扩增的过程)产生的输出组合物。在某些实施方案中，处于中期分化阶段中的T细胞的特征可以是某些细胞标记物的阳性或高表达(例如，表面表达或细胞内表达)和/或其他细胞标记物的阴性或低表达(例如，表面表达或细胞内表达)。在某些实施方案中，处于中期分化阶段中的T细胞或对处于中期分化阶段中的T细胞上表达的标记物呈表面阳性的T细胞是CCR7+CD27-。在某些实施方案中，处于中期分化阶段中的T细胞或对处于中期分化阶段中的T细胞上表达的标记物呈表面阳性的T细胞是CCR7-CD27+。在某些实施方案中，处于中期分化阶段中的T细胞或对处于中期分化阶段中的T细胞上表达的标记物呈表面阳性的T细胞包括呈CCR7+CD27-的细胞和呈CCR7-CD27+的细胞。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有低份额和/或频率的高分化的T细胞，或对高分化的T细胞上表达的标记物呈表面阳性的T细胞。在某些实施方案中，输出组合物的细胞中高分化的T细胞的份额和/或频率低于从替代性过程(如涉及扩增的过程)产生的输出组合物。在某些实施方案中，高分化的T细胞的特征可以是某些细胞标记物的阳性或高表达(例如，表面表达或细胞内表达)和/或其他细胞标记物的阴性或低表达(例如，表面表达或细胞内表达)。在一些方面，高分化的T细胞的特征为CCR7和/或CD27的阴性或低表达。在某些实施方案中，高分化的T细胞或对高分化的T细胞上表达的标记物呈表面阳性的T细胞是CCR7-CD27-。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞中处于早期分化阶段中的T细胞(例如，呈CCR7+CD27+的细胞)的份额和/或频率大于从替代性过程(如涉及扩增的过程)产生的输出组合物，处于中期分化阶段中的T细胞(例如，呈CCR7+CD27-的细胞和/或呈CCR7-CD27+的细胞)的份额和/或频率低于所述从替代性过程产生的输出组合物，并且高分化的T细胞(例如，呈CCR7-CD27-的细胞)的份额和/或频率低于所述从替代性过程产生的输出组合物。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞中幼稚样细胞和中央记忆细胞的份额和/或频率大于从替代性过程(如涉及扩增的过程)产生的输出组合物。在某些实施方案中，幼稚样细胞和中央记忆细胞包括处于不同分化状态的细胞，包括处于早期分化阶段中的T细胞，例如，呈CCR7+CD27+的细胞。

在某些实施方案中，输出组合物的细胞具有高份额和/或频率的对CCR7和CD27表达(例如表面表达)呈阳性的细胞。在一些实施方案中，输出组合物中的细胞具有高份额和/或频率的CCR7+CD27+细胞。在某些实施方案中，输出组合物中小于或小于约5％、小于或小于约10％、小于或小于约15％、小于或小于约20％、小于或小于约25％或小于或小于约30％的细胞是CCR7-或CD27-细胞。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、至少或为或约98％、或大于98％的细胞是CCR7+CD27+。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞是CCR7+CD27+。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD4+ T细胞是CCR7+CD27+。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD4+ T细胞是CCR7+CD27+。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD4+ T细胞是CCR7+CD27+。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD4+CAR+ T细胞是CCR7+CD27+。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD4+CAR+ T细胞是CCR7+CD27+。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD4+CAR+ T细胞是CCR7+CD27+。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD8+ T细胞是CCR7+CD27+。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD8+ T细胞是CCR7+CD27+。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD8+ T细胞是CCR7+CD27+。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CD8+CAR+ T细胞是CCR7+CD27+。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CD8+CAR+ T细胞是CCR7+CD27+。在某些实施方案中，输出组合物中在为或约40％与为或约65％之间、在为或约40％与为或约45％之间、在为或约45％与为或约50％之间、在为或约50％与为或约55％之间、在为或约55％与为或约60％之间、或在为或约60％与为或约65％之间的CD8+CAR+ T细胞是CCR7+CD27+。在一些实施方案中，输出组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CAR+ T细胞(例如，CD4+CAR+ T细胞和CD8+CAR+ T细胞)是CCR7+CD27+。在某些实施方案中，输出组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CAR+ T细胞(例如，CD4+CAR+ T细胞和CD8+CAR+ T细胞)是CCR7+CD27+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或为或约30％、至少或为或约40％、至少或为或约50％、至少或为或约60％、至少或为或约70％、至少或为或约75％、至少或为或约80％、至少或为或约85％、至少或为或约90％、至少或为或约95％、或大于95％的CAR+ T细胞是CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或为或约50％、至少或为或约55％、至少或为或约60％、或至少或为或约65％的CAR+ T细胞是CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+。

在一些实施方案中，本文提供治疗性T细胞组合物，其包含和/或富含表达重组受体的CD3+ T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD3+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD3+ T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD3+ T细胞，并且所述组合物中至少或至少约40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD3+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约95％的细胞是CD3+ T细胞，并且所述组合物中至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD3+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD3+ T细胞，并且所述组合物中至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD3+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的细胞是CD3+ T细胞，并且所述组合物中至少50％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少50％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少90％的细胞是CD3+ T细胞，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+。

在一些实施方案中，本文提供治疗性T细胞组合物，其包含和/或富含表达重组受体的CD3+ T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD3+细胞是幼稚样T细胞或中央记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD3+ T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD3+ T细胞，并且所述组合物中至少或至少约40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD3+细胞是幼稚样T细胞或中央记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约95％的细胞是CD3+ T细胞，并且所述组合物中至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD3+细胞是幼稚样T细胞或中央记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD3+ T细胞，并且所述组合物中至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD3+细胞是幼稚样T细胞或中央记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的细胞是CD3+ T细胞，所述组合物中至少50％的总受体⁺/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中央记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性，并且所述组合物中至少50％的总受体⁺/CD4+细胞是幼稚样T细胞或中央记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少90％的细胞是CD3+ T细胞，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中央记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性，并且所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD4+细胞是幼稚样T细胞或中央记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性。

在一些实施方案中，本文提供治疗性T细胞组合物，其包含和/或富含表达重组受体的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD4⁺和受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD4+T细胞和CD8+ T细胞。

在一些实施方案中，本文提供治疗性T细胞组合物，其包含和/或富含表达重组受体的CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+和受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中央记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，并且所述组合物中至少或至少约40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+和受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中央记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约95％的细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，并且所述组合物中至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+和受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中央记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，并且所述组合物中至少或至少约50％、60％、70％、80％或90％的总受体+/CD4+和受体+/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中央记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，所述组合物中至少50％的总受体⁺/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中央记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性，并且所述组合物中至少50％的总受体⁺/CD4+细胞是幼稚样T细胞或中央记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性。在一些实施方案中，所述组合物中至少90％的细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD8+细胞是幼稚样T细胞或中央记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性，并且所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD4+细胞是幼稚样T细胞或中央记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性。

在某些实施方案中，本文公开治疗性T细胞组合物，其包含表达重组受体的CD4+ T细胞和表达重组受体的CD8+ T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+，其中所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD3+ T细胞。在某些实施方案中，本文公开治疗性T细胞组合物，其包含表达重组受体的CD4+ T细胞和表达重组受体的CD8+ T细胞，其中所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+，其中所述组合物中至少或至少约80％、至少或至少约85％、至少或至少约90％、至少或至少约95％、至少或至少约96％、至少或至少约97％、至少或至少约98％、至少或至少约99％、约100％、或100％的细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。在一些方面，所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，所述组合物中至少或至少约60％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且治疗性T细胞组合物中至少或至少约40％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少或至少约95％的细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，所述组合物中至少或至少约65％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且治疗性T细胞组合物中至少或至少约45％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，所述组合物中至少或至少约70％、至少或至少约75％、至少或至少约80％、或者至少或至少约85％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且治疗性T细胞组合物中至少或至少约50％、至少或至少约55％、至少或至少约60％、或者至少或至少约65％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，所述组合物中至少或至少约75％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且治疗性T细胞组合物中至少或至少约55％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，所述组合物中至少或至少约80％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少或至少约60％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，所述组合物中至少或至少约85％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少或至少约65％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少或至少约98％的细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，所述组合物中至少或至少约90％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少或至少约70％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少90％的细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，所述组合物中至少60％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少40％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少90％的细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，所述组合物中至少70％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少50％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少90％的细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，所述组合物中至少70％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少60％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少95％的细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，所述组合物中至少70％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少70％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+。在一些方面，所述组合物中至少95％的细胞是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞，所述组合物中至少80％的总受体⁺/CD8+细胞是CD27+CCR7+，并且所述组合物中至少80％的总受体⁺/CD4+细胞是CD27+CCR7+。

在任何前述实施方案中，细胞群体或组合物内对一种或多种标记物(例如，CD3、CD4、CD8、CD27、CD28、CCR7或CD45RA等)呈阳性/阴性的细胞的百分比可以是来自通过本文所公开方法产生的多种输出组合物的平均、均值或中值百分比。在一些实施方案中，细胞群体或组合物内对标记物呈阳性的细胞的百分比是来自通过本文所公开方法产生的多种输出组合物的此类百分比的平均值。在一些实施方案中，多种输出组合物是通过本文所公开方法从多种输入组合物产生，所述输入组合物可以源自例如来自同一供体或不同供体的相同生物样品或不同生物样品(例如，PBMC或单采术或白细胞单采术样品)。在一些方面，所述平均值是基于约或至少约5、约或至少约10、约或至少约15、约或至少约20、约或至少约25、约或至少约30、约或至少约35、约或至少约40、约或至少约45、约或至少约50、约或至少约55、约或至少约60、约或至少约100、或者超过约100种通过本文所公开方法产生的输出组合物的多个值。

在一些实施方案中，其中平均而言，在通过所述方法产生的多种输出组合物(例如，约或至少约5种)中，所述组合物中T细胞的总数量或所述组合物中表达重组蛋白的T细胞的总数量的至少或至少约或者为或约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％是CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。在一些实施方案中，平均而言，在通过所述方法产生的多种输出组合物(例如，约或至少约5种)中，所述组合物中至少50％、60％、70％、80％或90％的总受体⁺/CD4+和受体⁺/CD8+细胞是幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞上表达的标记物呈表面阳性(例如，CD27+CCR7+细胞)。在一些实施方案中，多种(例如，约或至少约5种)通过本文所公开方法产生的输出组合物在所述组合物的总受体⁺/CD4+和受体⁺/CD8+细胞中平均包含至少50％、60％、70％、80％或90％的幼稚样T细胞或中央记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性。在一些实施方案中，多种(例如，约或至少约5种)通过本文所公开方法产生的输出组合物在所述组合物的总受体⁺/CD4+和受体⁺/CD8+细胞中平均包含至少50％、60％、70％、80％或90％的CD27+CCR7+细胞。在一些实施方案中，多种(例如，约或至少约5种)通过本文所公开方法产生的输出组合物平均包含至少或至少约80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的CD3+ T细胞。在一些实施方案中，多种(例如，约或至少约5种)通过本文所公开方法产生的输出组合物在所述组合物的总受体⁺/CD3+细胞中平均包含至少50％、60％、70％、80％或90％的幼稚样T细胞或者对幼稚样T细胞(例如，CD27+CCR7+细胞)上表达的标记物呈表面阳性。在一些实施方案中，多种(例如，约或至少约5种)通过本文所公开方法产生的输出组合物在所述组合物的总受体⁺/CD3+细胞中平均包含至少50％、60％、70％、80％或90％的幼稚样T细胞或中央记忆T细胞或者对幼稚样T细胞或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性。在一些实施方案中，多种(例如，约或至少约5种)通过本文所公开方法产生的输出组合物在所述组合物的总受体⁺/CD3+细胞中平均包含至少50％、60％、70％、80％或90％的CD27+CCR7+细胞。

在一些实施方案中，所述组合物包含具有整合至T细胞基因组中的编码抗CD19CAR的异源或重组多核苷酸的T细胞。在特定实施方案中，所述组合物中细胞的整合载体拷贝数(iVCN)平均具有约或具有至少0.1、0.5、1、2、3、4、5个或大于5个/二倍体基因组。在特定实施方案中，所述组合物中CAR+细胞的iVCN平均为在或在约0.4个拷贝/二倍体基因组与3.0个拷贝/二倍体基因组之间，包含端值。在特定实施方案，所述组合物中CAR+细胞的iVCN平均为约约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9、约2.0、约2.1、约2.2、约2.3、约2.4、约2.5、约2.6、约2.7、约2.8、约2.9、或约3.0个拷贝/二倍体基因组，包含端值。

在某些实施方案中，所述转化细胞的群体的二倍体基因组中iVCN与总载体拷贝数(VCN)的分数平均为少于或少于约0.9，例如为至少或为约0.4、0.5、0.6、0.7、0.8或0.9或者在其容许误差内(例如，±25％、±20％、±15％、±10％、±5％或±1％)。在某些实施方案中，所述转化细胞的群体的二倍体基因组中iVCN与总载体拷贝数(VCN)的分数平均为或为约0.8或在其容许误差内。

在一些实施方案中，所述组合物中细胞的总载体拷贝数(VCN)平均少于或少于约20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2个拷贝，包含端值。在一些实施方案中，所述组合物中CD3+细胞的总载体拷贝数(VCN)平均少于或少于约20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2个拷贝，包含端值。在一些实施方案中，所述组合物中CD3+CAR+细胞的总载体拷贝数(VCN)平均少于或少于约20、18、16、14、12、10、9、8、7、6、5、4、3或2个拷贝，包含端值。

在一些实施方案中，所述组合物包含残留的刺激试剂，例如根据章节II-C-6中所述的任何方法未去除的刺激试剂。在一些实施方案中，残留的刺激试剂包括章节II-C-2中所述的任何寡聚刺激试剂。在一些实施方案中，残留的刺激试剂包括章节II-C-2中所述的任何寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂。在一些实施方案中，所述组合物含有在或在约50与2000ng/mL之间的残留刺激试剂，如在或在约50与1900ng/mL之间、50与1800ng/mL之间、50与1700ng/mL之间、50与1600ng/mL之间、50与1500ng/mL之间、50与1400ng/mL之间、50与1300ng/mL之间、50与1200ng/mL之间、50与1100ng/mL之间、50与1000ng/mL之间、50与900ng/mL之间、50与800ng/mL之间、50与700ng/mL之间、50与600ng/mL之间、50与500ng/mL之间、50与400ng/mL之间、50与300ng/mL之间、50与200ng/mL之间、50与100ng/mL之间、100与2000ng/mL之间、100与1900ng/mL之间、100与1800ng/mL之间、100与1700ng/mL之间、100与1600ng/mL之间、100与1500ng/mL之间、100与1400ng/mL之间、100与1300ng/mL之间、100与1200ng/mL之间、100与1100ng/mL之间、100与1000ng/mL之间、100与900ng/mL之间、100与800ng/mL之间、100与700ng/mL之间、100与600ng/mL之间、100与500ng/mL之间、100与400ng/mL之间、100与300ng/mL之间、100与200ng/mL之间、200与2000ng/mL之间、200与1900ng/mL之间、200与1800ng/mL之间、200与1700ng/mL之间、200与1600ng/mL之间、200与1500ng/mL之间、200与1400ng/mL之间、200与1300ng/mL之间、200与1200ng/mL之间、200与1100ng/mL之间、200与1000ng/mL之间、200与900ng/mL之间、200与800ng/mL之间、200与700ng/mL之间、200与600ng/mL之间、200与500ng/mL之间、200与400ng/mL之间、200与300ng/mL之间、300与2000ng/mL之间、300与1900ng/mL之间、300与1800ng/mL之间、300与1700ng/mL之间、300与1600ng/mL之间、300与1500ng/mL之间、300与1400ng/mL之间、300与1300ng/mL之间、300与1200ng/mL之间、300与1100ng/mL之间、300与1000ng/mL之间、300与900ng/mL之间、300与800ng/mL之间、300与700ng/mL之间、300与600ng/mL之间、300与500ng/mL之间、300与400ng/mL之间、400与2000ng/mL之间、400与1900ng/mL之间、400与1800ng/mL之间、400与1700ng/mL之间、400与1600ng/mL之间、400与1500ng/mL之间、400与1400ng/mL之间、400与1300ng/mL之间、400与1200ng/mL之间、400与1100ng/mL之间、400与1000ng/mL之间、400与900ng/mL之间、400与800ng/mL之间、400与700ng/mL之间、400与600ng/mL之间、400与500ng/mL之间、500与2000ng/mL之间、500与1900ng/mL之间、500与1800ng/mL之间、500与1700ng/mL之间、500与1600ng/mL之间、500与1500ng/mL之间、500与1400ng/mL之间、500与1300ng/mL之间、500与1200ng/mL之间、500与1100ng/mL之间、500与1000ng/mL之间、500与900ng/mL之间、500与800ng/mL之间、500与700ng/mL之间、500与600ng/mL之间、600与2000ng/mL之间、600与1900ng/mL之间、600与1800ng/mL之间、600与1700ng/mL之间、600与1600ng/mL之间、600与1500ng/mL之间、600与1400ng/mL之间、600与1300ng/mL之间、600与1200ng/mL之间、600与1100ng/mL之间、600与1000ng/mL之间、600与900ng/mL之间、600与800ng/mL之间、600与700ng/mL之间、700与2000ng/mL之间、700与1900ng/mL之间、700与1800ng/mL之间、700与1700ng/mL之间、700与1600ng/mL之间、700与1500ng/mL之间、700与1400ng/mL之间、700与1300ng/mL之间、700与1200ng/mL之间、700与1100ng/mL之间、700与1000ng/mL之间、700与900ng/mL之间、700与800ng/mL之间、800与2000ng/mL之间、800与1900ng/mL之间、800与1800ng/mL之间、800与1700ng/mL之间、800与1600ng/mL之间、800与1500ng/mL之间、800与1400ng/mL之间、800与1300ng/mL之间、800与1200ng/mL之间、800与1100ng/mL之间、800与1000ng/mL之间、800与900ng/mL之间、900与2000ng/mL之间、900与1900ng/mL之间、900与1800ng/mL之间、900与1700ng/mL之间、900与1600ng/mL之间、900与1500ng/mL之间、900与1400ng/mL之间、900与1300ng/mL之间、900与1200ng/mL之间、900与1100ng/mL之间、900与1000ng/mL之间、1000与2000ng/mL之间、1000与1900ng/mL之间、1000与1800ng/mL之间、1000与1700ng/mL之间、1000与1600ng/mL之间、1000与1500ng/mL之间、1000与1400ng/mL之间、1000与1300ng/mL之间、1000与1200ng/mL之间、1000与1100ng/mL之间、1100与2000ng/mL之间、1100与1900ng/mL之间、1100与1800ng/mL之间、1100与1700ng/mL之间、1100与1600ng/mL之间、1100与1500ng/mL之间、1100与1400ng/mL之间、1100与1300ng/mL之间、1100与1200ng/mL之间、1200与2000ng/mL之间、1200与1900ng/mL之间、1200与1800ng/mL之间、1200与1700ng/mL之间、1200与1600ng/mL之间、1200与1500ng/mL之间、1200与1400ng/mL之间、1200与1300ng/mL之间、1300与2000ng/mL之间、1300与1900ng/mL之间、1300与1800ng/mL之间、1300与1700ng/mL之间、1300与1600ng/mL之间、1300与1500ng/mL之间、1300与1400ng/mL之间、1400与2000ng/mL之间、1400与1900ng/mL之间、1400与1800ng/mL之间、1400与1700ng/mL之间、1400与1600ng/mL之间、1400与1500ng/mL之间、1500与2000ng/mL之间、1500与1900ng/mL之间、1500与1800ng/mL之间、1500与1700ng/mL之间、1500与1600ng/mL之间、1600与2000ng/mL之间、1600与1900ng/mL之间、1600与1800ng/mL之间、1600与1700ng/mL之间、1700与2000ng/mL之间、1700与1900ng/mL之间、1700与1800ng/mL之间、1800与2000ng/mL之间、1800与1900ng/mL之间、或1900与2000ng/mL之间的残留刺激试剂，每个都包含端值。

本文还公开了一种治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(B细胞NHL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有B细胞NHL的受试者施用包含表达靶向CD19的CAR的工程化T细胞的组合物，其中所施用的组合物是通过用于产生展现出预先确定的特征的输出组合物的制造过程产生的，其中所述制造过程的迭代当在多名不同的单独受试者之间进行时任选地从人生物样品产生多种输出组合物，其中在所述多种输出组合物之间输出组合物的预先确定的特征选自以任何组合的在章节III中公开的组合物的特征，包括CD3+细胞的百分比、CD4+/CD8+或CD4CAR+/CD8+CD8+细胞的比率、表达凋亡标记物的细胞的百分比、分化程度较低的细胞的百分比以及iVCN和iVCN/VCN值。

IV.定义

除非另外定义，否则本文使用的所有领域术语、符号和其他技术和科学术语或命名旨在具有与所要求保护的主题所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在一些情况下，为了清楚和/或为了便于参考而在本文中定义具有通常理解的含义的术语，并且本文中包含的此类定义不应被解释为表示与本领域通常理解的实质性差异。

术语“多肽”与“蛋白质”可互换使用以指代氨基酸残基的聚合物，并且不限于最小长度。多肽(包括所提供的受体和其他多肽，例如接头或肽)可以包括氨基酸残基，包括天然和/或非天然氨基酸残基。所述术语还包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、唾液酸化、乙酰化和磷酸化。在一些方面，多肽可以含有关于自然或天然序列的修饰，只要蛋白质维持所需活性即可。这些修饰可能是故意的(例如通过定点诱变)，或者可能是偶然的(例如通过产生所述蛋白质的宿主的突变或由于PCR扩增引起的错误)。

如本文所用，“受试者”是哺乳动物，如人或其他动物，并且通常是人。在一些实施方案中，被施用一种或多种药剂、细胞、细胞群体或组合物的受试者(例如，患者)是哺乳动物，通常是灵长类动物，如人。在一些实施方案中，所述灵长类动物是猴或猿。所述受试者可以是雄性或雌性，并且可以处于任何合适的年龄，包括婴儿、幼年、青春期、成年和老年受试者。在一些实施方案中，所述受试者是非灵长类哺乳动物，如啮齿动物。

如本文所用，“治疗(treatment)”(及其语法变体如“治疗”(“treat”或“treating”))是指疾病或病症或障碍、或者与之相关的症状、不良效果或结局或表型的完全或部分改善或减轻。理想的治疗效果包括但不限于预防疾病的发生或复发、症状的缓解、疾病的任何直接或间接病理后果的减少、预防转移、降低疾病进展的速度、改善或缓解疾病状态以及缓解或改善预后。所述术语并不暗示完全治愈疾病或完全消除任何症状或对所有症状或结局的影响。

如本文所用，“延迟疾病的发生”意指推迟、阻碍、减缓、延缓、稳定、抑制和/或延期疾病(如癌症)的发生。此延迟可以具有不同的时间长度，这取决于病史和/或所治疗的个体。在一些实施方案中，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不会患上疾病。例如，可能延迟晚期癌症，如转移的发展。

如本文所用，“预防”包括提供关于受试者的疾病的发生或复发的预防，所述受试者可能易患所述疾病但尚未被诊断患有所述疾病。在一些实施方案中，所提供的细胞和组合物用于延迟疾病的发展或延缓疾病的进展。

如本文所用的，“抑制”功能或活性是当与除了目标条件或参数之外在其他方面相同的条件相比时，或者可替代地，与另一种情况相比时，减少功能或活性。例如，与不存在所述细胞的情况下的肿瘤生长速率相比，抑制肿瘤生长的细胞降低了肿瘤的生长速率。

在施用的情况下，药剂(例如药物配制品、细胞或组合物)的“有效量”是指在必要的剂量/量下和必要的时间段内有效实现所需结果(例如治疗或预防结果)的量。

药剂(例如，药物配制品或细胞)的“治疗有效量”是指在所需剂量下和所需时间段中有效实现所需治疗结果(如针对疾病、病症或障碍的治疗)和/或治疗的药代动力学或药效学作用的量。治疗有效量可以根据诸如以下的因素而变化：疾病状态、受试者的年龄、性别和体重和所施用的细胞群体。在一些实施方案中，所提供的方法涉及以有效量(例如，治疗有效量)施用细胞和/或组合物。

“预防有效量”是指在必要的剂量和持续必要的时间段的情况下能有效实现所需预防结果的量。通常但不是必须的，因为预防剂量是在疾病之前或早期在受试者体内使用的，所以预防有效量将小于治疗有效量。在肿瘤负担较低的情况下，在一些方面，预防有效量将高于治疗有效量。

如本文所用的术语“约”是指本技术领域的技术人员容易知道的相应值的常用误差范围。本文对“约”某一值或参数的提及包括(并描述)针对所述值或参数本身的实施方案。

除非上下文明确指示其他含义，否则如本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数指示物。例如，“一种/个(a或an)”意指“至少一种/个”或“一种/个或多种/个”。

贯穿本公开文本，所要求保护的主题的各个方面以范围形式呈现。应理解的是，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，并且不应该被解释为对所要求保护的主题的范围的不能转变的限制。因此，应该认为范围的描述具体公开了所有可能的子范围以及该范围内的单个数值。例如，在提供了值的范围的情况下，应理解，在该范围的上限和下限之间的每个中间值以及在所陈述范围内的任何其他所述或中间值涵盖在所要求保护的主题内。这些较小范围的上限和下限可以独立地被包括在该较小范围内，并且也涵盖在所要求保护的主题内，受制于在所陈述范围内任何确切排除的限制。在所陈述范围包括限制中的一者或两者的情况下，排除了那些包括的限制中的任一者或两者的范围也包括在所要求保护的主题内。无论范围的广度如何，这都适用。

如本文所用，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。

如本文所用，当提及一种或多种特定细胞类型或细胞群体时，“富集”是指例如与所述组合物中的总细胞数或组合物体积相比，或者相对于其他细胞类型，如通过基于所述群体或细胞表达的标记物的阳性选择，或通过基于在要耗尽的所述细胞群体或细胞上不存在的标记物的阴性选择，增加所述细胞类型或群体的数量或百分比。所述术语不需要从组合物完全去除其他细胞、细胞类型或群体，并且不需要如此富集的细胞在被富集组合物中以等于或甚至接近100％存在。

如本文所用，细胞或细胞群体对特定标记物呈“阳性”的陈述是指特定标记物(通常为表面标记物)在细胞上或细胞中的可检测的存在。当提及表面标记物时，所述术语是指如通过流式细胞术(例如通过用特异性地结合至所述标记物的抗体染色并检测所述抗体)所检测的表面表达的存在，其中所述染色可通过流式细胞术以如下水平检测到：显著高于在其他都相同的条件下用同种型匹配的对照或荧光减一(FMO)门控对照通过实施相同程序检测到的染色的水平，和/或与已知对所述标记物呈阳性的细胞的水平基本上相似的水平，和/或显著高于已知对所述标记物呈阴性的细胞的水平的水平。

如本文所用，细胞或细胞群体对特定标记物呈“阴性”的陈述是指特定标记物(通常为表面标记物)在细胞上或细胞中不存在实质上可检测的存在。当提及表面标记物时，所述术语是指如通过流式细胞术(例如通过用特异性地结合至所述标记物的抗体染色并检测所述抗体)所检测的表面表达的不存在，其中所述染色未通过流式细胞术以如下水平检测到：显著高于在其他都相同的条件下用同种型匹配的对照或荧光减一(FMO)门控对照通过实施相同程序检测到的染色的水平，和/或显著低于已知对所述标记物呈阳性的细胞的水平的水平，和/或与已知对所述标记物呈阴性的细胞的水平基本上相似的水平。

如本文所用，术语“载体”是指能传播其所连接的另一核酸分子的核酸分子。所述术语包括作为自我复制核酸结构的载体以及掺入已引入其的宿主细胞基因组中的载体。某些载体能够指导它们可操作地连接的核酸的表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。

V.示例性实施方案

所提供的实施方案包括：

1.一种治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(B细胞NHL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有B细胞NHL的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物包含表达所述CAR的CD4⁺ T细胞和表达所述CAR的CD8⁺ T细胞；

所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约25×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；并且

所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞。

2.一种治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(B细胞NHL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有B细胞NHL的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物包含在约1:2.5与约2.5:1之间的比率下的表达所述CAR的CD4⁺ T细胞和表达所述CAR的CD8⁺ T细胞；

所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约100×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；

所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD3⁺细胞。

3.一种治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(B细胞NHL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有B细胞NHL的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物包含在约1:1与约2.5:1之间的比率下的表达所述CAR的CD4+ T细胞和表达所述CAR的CD8+ T细胞；

所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约50×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；并且

所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞。

4.一种治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(r/r B细胞NHL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有B细胞NHL的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物包含表达所述CAR的CD4+ T细胞和表达所述CAR的CD8+ T细胞；

所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约100×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；

所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且

所述组合物中至少或至少约80％的CAR⁺ T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。

5.一种治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(r/r B细胞NHL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有B细胞NHL的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物包含表达所述CAR的CD4+ T细胞和表达所述CAR的CD8+ T细胞；

所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约100×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；

所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且

所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺和/或所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。

6.一种治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(B细胞NHL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有B细胞NHL的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物包含表达所述CAR的CD4+ T细胞和表达所述CAR的CD8+ T细胞；

所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约50×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；

所述组合物中至少或至少约96％的细胞是CD3⁺细胞；

并且

所述组合物中至少或至少约80％的CAR⁺ T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。

7.一种治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(r/r B细胞NHL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有B细胞NHL的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物包含表达所述CAR的CD4+ T细胞和表达所述CAR的CD8+ T细胞；

所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约100×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；

所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且

所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均为小于或小于约0.9。

8.一种治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(r/r B细胞NHL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有B细胞NHL的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物包含表达所述CAR的CD4+ T细胞和表达所述CAR的CD8+ T细胞；

所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约100×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；

所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且

所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)平均为在或在约0.4个拷贝/二倍体基因组与3.0个拷贝/二倍体基因组之间，包含端值。

9.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在约1:2与约2:1之间、在约1:1.5与约1.5:1之间或者为或为约1:1的比率下的表达所述CAR的CD4⁺ T细胞和表达所述CAR的CD8⁺ T细胞。

10.根据实施方案1-8中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在约1:1与约2.5:1之间、在约1.5:1与约2:1之间、为或为约1.5:1或者为或为约2:1的比率下的表达所述CAR的CD4⁺ T细胞和表达所述CAR的CD8⁺ T细胞。

11.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约10×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。

12.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在为或约10×10⁶个与为或约25×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。

13.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述组合物包含为或约5×10⁶个CAR表达T细胞。

14.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述组合物包含为或约10×10⁶个CAR表达T细胞。

15.根据实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述组合物包含为或约25×10⁶个CAR表达T细胞。

16.根据实施方案1-15中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％或者至少或至少约96％的细胞是CD3⁺细胞。

17.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约5％与为或约30％之间、任选在为或约5％与为或约30％之间的CAR⁺ T细胞表达凋亡的标记物、任选膜联蛋白V或活性胱天蛋白酶3。

18.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约10％与为或约15％之间的CAR⁺ T细胞表达凋亡的标记物、任选膜联蛋白V或活性胱天蛋白酶3。

19.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约15％与为或约20％之间的CAR⁺ T细胞表达凋亡的标记物、任选膜联蛋白V或活性胱天蛋白酶3。

20.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约20％与为或约25％之间的CAR⁺ T细胞表达凋亡的标记物、任选膜联蛋白V或活性胱天蛋白酶3。

21.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约25％与为或约30％之间的CAR⁺ T细胞表达凋亡的标记物、任选膜联蛋白V或活性胱天蛋白酶3。

22.根据实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述组合物中为或约5％、为或约10％、为或约15％、为或约20％、为或约25％或者为或约30％的CAR⁺ T细胞表达凋亡的标记物、任选膜联蛋白V或活性胱天蛋白酶3。

23.根据实施方案1-22中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约80％与为或约85％之间的CAR⁺ T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。

24.根据实施方案1-22中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约85％与为或约90％之间的CAR⁺ T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。

25.根据实施方案1-22中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约90％与为或约95％之间的CAR⁺ T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。

26.根据实施方案1-22中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约95％与为或约99％之间的CAR⁺ T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。

27.根据实施方案1-22中任一项所述的方法，其中所述组合物中为或约85％、为或约90％、为或约95％或者为或约99％的CAR⁺ T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。

28.根据实施方案1-27中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CAR⁺ T细胞对在幼稚样或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性。

29.根据实施方案28所述的方法，其中在幼稚样或中央记忆T细胞上表达的标记物选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7。

30.根据实施方案1-29中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺和/或CD62L^-CCR7⁺。

31.根据实施方案1-30中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约80％与为或约85％之间、在为或约85％与为或约90％之间、在为或约90％与为或约95％之间、在为或约95％与为或约99％之间的CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺和/或CD62L^-CCR7⁺。

32.根据实施方案1-31中任一项所述的方法，其中所述组合物中为或约80％、为或约85％、为或约90％、为或约95％或者为或约99％的CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺和/或CD62L^-CCR7⁺。

33.根据实施方案1-32中任一项所述的方法，其中所述组合物中为或约80％、为或约85％、为或约90％、为或约95％或者为或约99％的CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。

34.根据实施方案1-33中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-。

35.根据实施方案1-33中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约60％的CD4⁺CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-。

36.根据实施方案1-33中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约70％的CD4⁺CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-。

37.根据实施方案1-33中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CD4⁺CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-。

38.根据实施方案1-33中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约85％的CD4⁺CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-。

39.根据实施方案1-38中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。

40.根据实施方案1-38中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约60％的CD4⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。

41.根据实施方案1-38中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约70％的CD4⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。

42.根据实施方案1-38中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CD4⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。

43.根据实施方案1-38中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约85％的CD4⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。

44.根据实施方案1-43中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-。

45.根据实施方案1-43中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约60％的CD8⁺CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-。

46.根据实施方案1-43中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约70％的CD8⁺CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-。

47.根据实施方案1-43中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CD8⁺CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-。

48.根据实施方案1-43中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约85％的CD8⁺CAR⁺ T细胞呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-。

49.根据实施方案1-48中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。

50.根据实施方案1-48中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约60％的CD8⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。

51.根据实施方案1-48中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约70％的CD8⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。

52.根据实施方案1-48中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CD8⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。

53.根据实施方案1-48中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约85％的CD8⁺CAR⁺ T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。

54.根据实施方案1-53中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均在为或约0.9与为或约0.8之间。

55.根据实施方案1-53中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均为小于或小于约0.8。

56.根据实施方案1-53中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均在为或约0.8与为或约0.7之间。

57.根据实施方案1-53中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均在为或约0.7与为或约0.6之间。

58.根据实施方案1-53中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均在为或约0.6与为或约0.5之间。

59.根据实施方案1-53中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均在为或约0.5与为或约0.4之间。

60.根据实施方案1-59中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)平均为在或在约0.8个拷贝/二倍体基因组与2.0个拷贝/二倍体基因组之间，包含端值。

61.根据实施方案1-59中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)平均为在或在约0.8个拷贝/二倍体基因组与1.0个拷贝/二倍体基因组之间，包含端值。

62.根据实施方案1-59中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)平均为在或在约1.0个拷贝/二倍体基因组与1.5个拷贝/二倍体基因组之间，包含端值。

63.根据实施方案1-59中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺ T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)平均为在或在约1.5个拷贝/二倍体基因组与2.0个拷贝/二倍体基因组之间，包含端值。

64.根据实施方案1-63中任一项所述的方法，其中所述r/r B细胞NHL选自弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、任选DLBCL非特指型(DLBCL NOS；包括从头或转化的DLBCL，例如从滤泡性淋巴瘤或边缘区淋巴瘤转化的)；高级别B细胞淋巴瘤(HGBCL)、任选DLBCL组织学为携带MYC和BCL2和/或BCL6重排的HGBCL；原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)；以及滤泡性淋巴瘤(FL)、任选滤泡性淋巴瘤3b级别(FL3B)。

65.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中所述r/r B细胞NHL是弥漫性大B细胞淋巴瘤。

66.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中所述r/r B细胞NHL是弥漫性大B细胞淋巴瘤非特指型。

67.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中所述r/r B细胞NHL是从头弥漫性大B细胞淋巴瘤。

68.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中所述r/r B细胞NHL是从滤泡性淋巴瘤转化的弥漫性大B细胞淋巴瘤。

69.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中所述r/r B细胞NHL是从边缘区淋巴瘤转化的弥漫性大B细胞淋巴瘤。

70.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中所述r/r B细胞NHL是高级别B细胞淋巴瘤(HGBCL)。

71.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中所述r/r B细胞NHL是具有MYC和BCL2和/或BCL6重排的高级别B细胞淋巴瘤。

72.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中所述r/r B细胞NHL是具有DLBCL组织学的高级别B细胞淋巴瘤。

73.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中所述r/r B细胞NHL是双打击淋巴瘤或三打击淋巴瘤。

74.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中所述r/r B细胞NHL是原发性纵隔大B细胞淋巴瘤。

75.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中所述r/r B细胞NHL是滤泡性淋巴瘤。

76.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中所述r/r B细胞NHL是滤泡性淋巴瘤3b。

77.根据实施方案1-64中任一项所述的方法，其中所述r/r B细胞NHL是经组织学证实的。

78.根据实施方案1-77中任一项所述的方法，其中在施用工程化T细胞的所述组合物时或紧接在施用包含工程化T细胞的所述组合物之前，所述受试者在用以下疗法治疗之后在缓解后复发，或者变得用以下疗法难以治疗：(i)针对所述r/r B细胞NHL的两种或更多种先前疗法和/或(ii)自体干细胞移植(ASCT)疗法。

79.根据实施方案78所述的方法，其中在施用工程化T细胞的所述组合物时或紧接在施用包含工程化T细胞的所述组合物之前，所述受试者在用以下疗法治疗之后在缓解后复发，或者变得用以下疗法难以治疗：针对所述r/r B细胞NHL的两种或更多种先前疗法。

80.根据实施方案78所述的方法，其中在施用工程化T细胞的所述组合物时或紧接在施用包含工程化T细胞的所述组合物之前，所述受试者在用以下疗法治疗之后在缓解后复发，或者变得用以下疗法难以治疗：针对所述r/r B细胞NHL的三种或更多种先前疗法。

81.根据实施方案78-80中任一项所述的方法，其中针对所述r/r B细胞NHL的所述两种或更多种先前疗法不包括另一个剂量的表达所述CAR的细胞。

82.根据实施方案78-81中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种先前疗法包括蒽环类药物和CD20靶向剂。

83.根据实施方案78-82中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种先前疗法不包括针对先前惰性淋巴瘤给予的疗法。

84.根据实施方案78-83中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种先前疗法不包括针对惰性DLBCL给予的蒽环类药物。

85.根据实施方案78-84中任一项所述的方法，其中所述两种或更多种先前疗法包括CD20靶向剂，并且所述两种或更多种先前疗法可以不包括针对先前惰性淋巴瘤给予的蒽环类药物。

86.根据实施方案82-85中任一项所述的方法，其中所述CD20靶向剂包括抗CD20单克隆抗体。

87.根据实施方案82-86中任一项所述的方法，其中所述CD20靶向剂包括利妥昔单抗。

88.根据实施方案1-77中任一项所述的方法，其中在施用工程化T细胞的所述组合物时或紧接在施用包含工程化T细胞的所述组合物之前，所述受试者在用以下疗法治疗之后在缓解后复发，或者变得用以下疗法难以治疗：自体干细胞移植(ASCT)疗法。

89.根据实施方案88所述的方法，其中所述受试者患有复发性和/或难治性DLBCL。

90.根据实施方案88或89所述的方法，其中所述ASCT无法实现客观反应(部分反应(PR)或更好)。

91.根据实施方案78-90中任一项所述的方法，其中在所述ASCT之后，所述受试者的疾病已经进展。

92.根据实施方案1-91中任一项所述的方法，其中在施用所述细胞组合物时或之前，所述受试者已经被鉴定为患有侵袭性疾病或高风险疾病或者被鉴定为具有不良预后。

93.根据实施方案1-92中任一项所述的方法，其中在施用所述细胞组合物时或之前，所述受试者已经在化学疗法后被鉴定为患有化学疗法难治性疾病或患有持续性或复发性疾病。

94.根据实施方案1-93中任一项所述的方法，其中所述受试者具有经病理证实的由恶性肿瘤导致的继发性中枢神经系统(CNS)受累。

95.根据实施方案1-94中任一项所述的方法，其中所述受试者没有仅由恶性肿瘤导致的中枢神经系统(CNS)受累。

96.根据实施方案1-95中任一项所述的方法，其中所述受试者未接受过先前的CART细胞或基因修饰的T细胞疗法。

97.根据实施方案1-96中任一项所述的方法，其中所述受试者未接受过先前的CD19靶向疗法，如抗CD19单克隆抗体或双特异性抗体。

98.根据实施方案1-97中任一项所述的方法，所述方法进一步包括从所述受试者获得白细胞单采术样品，以用于制造工程化T细胞的组合物。

99.根据实施方案98所述的方法，其中所述受试者在白细胞术的时间之前为或约14天内未接受过治疗剂量的皮质类固醇。

100.根据实施方案98或99所述的方法，其中所述受试者在白细胞单采术的时间之前为或约7天内未接受过细胞毒性化学治疗剂，其不是淋巴毒性化学治疗剂或鞘内疗法。

101.根据实施方案98-100中任一项所述的方法，其中所述受试者在白细胞单采术的时间之前为或约4周内未接受过淋巴毒性化学治疗剂。

102.根据实施方案98-101中任一项所述的方法，其中所述受试者在白细胞单采术的时间之前为或约4周内未接受过免疫抑制疗法。

103.根据实施方案98-102中任一项所述的方法，其中所述受试者在白细胞单采术的时间之前为或约6周内未接收过辐射。

104.根据实施方案98-103中任一项所述的方法，其中所述受试者在白细胞单采术的时间之前为或约3个月内未接受自体干细胞移植。

105.根据实施方案1-104中任一项所述的方法，其中所述受试者未实现响应于先前疗法的完全缓解(CR)。

106.根据实施方案1-105中任一项所述的方法，其中所述受试者未实现响应于先前疗法的客观反应(部分反应(PR)或更好)。

107.根据实施方案1-106中任一项所述的方法，其中在施用所述细胞组合物时或之前，评价所述受试者中与中枢神经系统(CNS)受累或继发性CNS淋巴瘤相关的或者涉及中枢神经系统(CNS)受累或继发性CNS淋巴瘤的淋巴瘤。

108.根据实施方案1-107中任一项所述的方法，其中在施用所述细胞组合物时或之前，所述受试者已经被鉴定为具有：

足够的心脏功能，任选地具有为或约40％、大于40％或大于约40％的左心室射血分数(LVEF)；和/或

足够的肾功能，任选地具有为或约45mL/min、大于45mL/min或大于约45mL/min的肌酐清除率；和/或

足够的肝功能，任选地具有为或小于2.5倍的正常上限值(ULN)的天冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)以及小于1.5倍的ULN的总胆红素；和/或

足够的肺功能，任选地在室内空气下具有≤CTCAE 1级呼吸困难和饱和氧(例如，SaO₂≥92％)。

109.根据实施方案1-108中任一项所述的方法，其中在施用所述细胞组合物时或之前，所述受试者被鉴定为或已被鉴定为在没有生长因子支持的情况下具有为或约1.0×10⁹个细胞/L、大于1.0×10⁹个细胞/L或大于约1.0×10⁹个细胞/L的绝对中性粒细胞计数(ANC)。

110.根据实施方案1-109中任一项所述的方法，其中在施用所述细胞组合物时或之前，所述受试者被鉴定为或已被鉴定为在没有输液支持的情况下具有为或约50×10⁹个细胞/L、大于50×10⁹个细胞/L或大于约50×10⁹个细胞/L的血小板。

111.根据实施方案1-110中任一项所述的方法，其中在施用所述细胞组合物时或之前，所述受试者已在用于产生工程化T细胞的所述组合物的白细胞单采术的时间与施用工程化细胞的所述组合物之间接受了桥接化学疗法。

112.根据实施方案1-111中任一项所述的方法，其中在施用所述细胞组合物时或之前，所述受试者已在先前疗法之后接受了桥接化学疗法以用于疾病控制。

113.根据实施方案1-112中任一项所述的方法，其中所述受试者被鉴定为或已经被鉴定为东部肿瘤协作组体能状态(ECOG PS)为0或1。

114.根据实施方案1-113中任一项所述的方法，其中在施用所述细胞组合物之前，所述受试者被鉴定为或已经被鉴定为具有高基线肿瘤负担，如通过垂直直径乘积之和(SPD)或高血清乳酸脱氢酶(LDH)如LDH≥500u/L所测量。

115.根据实施方案1-114中任一项所述的方法，其中在施用所述细胞组合物时或之前，所述受试者患有正电子发射断层扫描(PET)-阳性疾病。

116.根据实施方案1-115中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在施用所述细胞组合物之前鉴定或选择所述受试者以施用所述细胞组合物。

117.根据实施方案1-116中任一项所述的方法，其中在所述施用之前，所述受试者已用淋巴细胞清除疗法进行了预调理。

118.根据实施方案1-117中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括紧接在施用所述细胞的剂量之前向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法，其包括施用氟达拉滨和/或环磷酰胺。

119.根据实施方案117或118所述的方法，其中所述细胞组合物和/或所述淋巴细胞清除疗法的施用是经由门诊递送例如在非三级护理中心进行的。

120.根据实施方案117-119中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法包括以30mg/m²受试者身体表面积每天施用氟达拉滨以及以300mg/m²受试者身体表面积每天施用环磷酰胺，持续3天。

121.根据实施方案117-120中任一项所述的方法，其中工程化T细胞的所述组合物是在完成所述淋巴细胞清除疗法之后为或约48小时与为或约9天之间施用，包含端值。

122.根据实施方案117-121中任一项所述的方法，其中所述受试者在接受所述淋巴细胞清除疗法时具有至少或至少约30mL/min的肌酐清除率。

123.根据实施方案1-122中任一项所述的方法，其中在开始施用所述细胞组合物之前，所述受试者未被施用过用于治疗、或预防、或减轻或减弱神经毒性和/或细胞因子释放综合征或其风险的药剂或治疗方法。

124.根据实施方案1-123中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者施用用于治疗、或预防、或减轻或减弱神经毒性和/或细胞因子释放综合征或其风险的药剂或治疗方法。

125.根据实施方案123或124所述的方法，其中所述药剂是或包含抗IL-6抗体、抗IL-6受体抗体或类固醇。

126.根据实施方案123-125中任一项所述的方法，其中所述药剂是或包含托珠单抗或甲基泼尼松龙。

127.根据实施方案1-126中任一项所述的方法，其中所述T细胞是从受试者获得的原代T细胞。

128.根据实施方案1-127中任一项所述的方法，其中所述T细胞对于所述受试者是自体的。

129.根据实施方案1-128中任一项所述的方法，其中：

至少35％、至少40％或至少50％的根据所述方法治疗的受试者实现完全反应(CR)；

至少60％、70％、80％、90％或95％的实现CR的受试者展现出持续大于或等于3个月或大于或等于6个月的CR；和/或

至少60％、70％、80％、90％或95％的截至一个月和/或截至3个月实现CR的受试者在实现所述CR后保持反应，保持CR和/或存活或无进展存活，持续大于或等于3个月和/或大于或等于6个月和/或大于或等于9个月；和/或

至少50％、至少60％或至少70％的根据所述方法治疗的受试者实现客观反应(OR)；

至少60％、70％、80％、90％或95％的实现OR的受试者展现出持续大于或等于3个月或大于或等于6个月的OR；和/或

至少35％、至少40％或至少50％的实现OR的受试者在实现所述OR后保持反应或存活，持续大于或等于3个月和/或大于或等于6个月。

130.根据实施方案1-129中任一项所述的方法，其中：

至少50％的根据所述方法治疗的受试者实现完全反应(CR)；

至少60％的实现CR的受试者展现持续大于或等于6个月的CR；和/或

至少60％的截至1个月和/或截至3个月实现CR的受试者在实现所述CR后保持反应，保持CR，和/或存活或无进展存活，持续大于或等于6个月；和/或

至少70％的根据所述方法治疗的受试者实现客观反应(OR)；

至少60％的实现OR的受试者展现持续大于或等于6个月的OR；和/或

至少50％的实现OR的受试者在实现所述OR后保持反应或存活，持续大于或等于6个月。

131.根据实施方案129或130所述的方法，其中：

所述CR或所述OR持续超过3个月或超过6个月；和/或

至少20％、至少25％、至少35％、至少40％或至少50％的根据所述方法治疗的受试者实现持续大于3个月或大于6个月的CR；和/或

至少60％、70％、80％、90％或95％的用所述方法治疗并实现CR的受试者保持CR或保持反应或保持存活大于或等于3个月或大于或等于6个月或大于或等于9个月；和/或

至少60％、70％、80％、90％或95％的用所述方法治疗并截至一个月和/或截至3个月实现CR的受试者保持反应，保持CR，和/或存活或无进展存活，持续大于或等于3个月和/或大于或等于6个月和/或大于或等于9个月；和/或

至少50％、至少60％或至少70％的根据所述方法治疗的受试者实现客观反应(OR)；

至少60％、70％、80％、90％或95％的受试者实现持续大于或等于3个月或大于或等于6个月的OR；和/或

至少35％、至少40％或至少50％的用所述方法治疗并实现OR的受试者保持反应或存活，持续大于或等于3个月和/或大于或等于6个月。

132.根据实施方案1-131中任一项所述的方法，其中所述细胞对于所述受试者是自体的，并且

对于所述疗法的产生，不要求和/或指定单采术的最小绝对淋巴细胞计数(ALC)；和/或

所述细胞是通过如下过程产生，所述过程对于至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的患有所述疾病或病症的受试者或所选受试者群体，能够生成用于根据所述方法施用的细胞产物。

133.根据实施方案1-132中任一项所述的方法，其中：

至少35％、至少40％或至少50％的根据所述方法治疗的受试者实现CNS疾病的完全反应(CR)或缓解；

至少60％、70％、80％、90％或95％的实现CR的受试者保持CR大于或等于3个月或大于或等于6个月；和/或

至少60％、70％、80％、90％或95％的截至一个月和/或截至3个月实现CNS疾病的CR或缓解的受试者保持反应，保持CR和/或存活或无进展存活，持续大于或等于3个月和/或大于或等于6个月和/或大于或等于9个月；和/或

至少50％、至少60％或至少70％的根据所述方法治疗的受试者实现CNS疾病的客观反应(OR)或缓解；

至少60％、70％、80％、90％或95％的实现所述OR的受试者持续大于或等于3个月或大于或等于6个月；和/或

至少60％、70％、80％、90％或95％的实现CNS疾病的OR或缓解的受试者保持反应或存活大于或等于3个月和/或大于或等于6个月；和/或

所述脑病灶的大小或体积减小大于或大于约25％、50％、75％或更多；和/或CNS疾病的降低或缓解或清除在至少35％、至少40％或至少50％的根据所述方法治疗的受试者中得以实现。

134.根据实施方案1-133中任一项所述的方法，其中：

大于或大于约50％、约60％、约70％或约80％的根据所述方法治疗的受试者不展现3级或更高级别的细胞因子释放综合征(CRS)，和/或不展现3级或更高级别的神经毒性，和/或大于40％或50％或55％不展现任何神经毒性或CRS。

135.根据实施方案1-134中任一项所述的方法，其中大于或大于约80％的根据所述方法治疗的受试者不展现3级或更高级别的细胞因子释放综合征(CRS)，和/或不展现3级或更高级别的神经毒性。

136.根据实施方案1-135中任一项所述的方法，其中大于95％的根据所述方法治疗的受试者不展现3级或更高级别的CRS。

137.根据实施方案1-136中任一项所述的方法，其中大于85％的根据所述方法治疗的受试者不展现3级或更高级别的神经毒性。

138.根据实施方案1-137中任一项所述的方法，其中：

大于或大于约30％、35％、40％或50％的根据所述方法治疗的受试者不展现任何级别的细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性；和/或

至少或至少约45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的根据所述方法治疗的受试者不展现开始所述给予后早于3天的CRS发作，和/或不展现开始所述给予后早于5天的神经毒性发作；和/或

在根据所述方法治疗的受试者中神经毒性的中值发作是在根据所述方法治疗的受试者的CRS的中值峰处或之后、或者到消退的中值时间之时或之后，和/或在根据所述方法治疗的受试者中神经毒性的中值发作大于或大于约8、9、10或11天。

139.根据实施方案1-138中任一项所述的方法，其中：

大于或大于约50％的根据所述方法治疗的受试者不展现任何级别的细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性；和/或

至少或至少约45％的根据所述方法治疗的受试者不展现开始所述施用后早于3天的CRS发作，和/或不展现开始所述施用后早于5天的神经毒性发作；和/或

根据所述方法治疗的受试者中神经毒性的中值发作是在根据所述方法治疗的受试者的CRS的中值峰处或之后、或者到消退的中值时间之时或之后，和/或根据所述方法治疗的受试者中神经毒性的中值发作是大于或大于约8天。

140.根据实施方案1-139中任一项所述的方法，其中：

至少50％的根据所述方法治疗的受试者实现完全反应(CR)；

至少70％的根据所述方法治疗的受试者实现客观反应(OR)；并且

大于或大于约50％的根据所述方法治疗的受试者不展现任何级别的细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性；并且

大于或大于约80％的根据所述方法治疗的受试者不展现3级或更高级别的细胞因子释放综合征(CRS)，和/或不展现3级或更高级别的神经毒性。

141.根据实施方案1-140中任一项所述的方法，其中：

所述CAR包含对所述抗原具有特异性的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、源自共刺激分子任选4-1BB的胞质信号传导结构域以及源自含有ITAM的初级信号传导分子任选CD3ζ的胞质信号传导结构域；

所述CAR按顺序包含对所述抗原具有特异性的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、源自共刺激分子的胞质信号传导结构域和源自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域；或者

所述CAR包含胞外抗原识别结构域和细胞内信号传导结构域，所述胞外抗原识别结构域与抗原特异性结合，所述细胞内信号传导结构域包含CD3-zeta(CD3ζ)链和作为4-1BB的信号传导结构域的共刺激信号传导区。

142.根据实施方案1-141中任一项所述的方法，其中所述CAR包含对CD19具有特异性的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、源自4-1BB的胞质信号传导结构域和源自CD3ζ的胞质信号传导结构域。

143.根据实施方案142所述的方法，其中所述抗原结合结构域是scFv。

144.根据实施方案143所述的方法，其中所述scFv包含RASQDISKYLN(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列、SRLHSGV(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列和/或GNTLPYTFG(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列和/或DYGVS(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列、VIWGSETTYYNSALKS(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列和/或YAMDYWG(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列，或者其中所述scFv包含FMC63的可变重链区和FMC63的可变轻链区和/或FMC63的CDRL1序列、FMC63的CDRL2序列、FMC63的CDRL3序列、FMC63的CDRH1序列、FMC63的CDRH2序列和FMC63的CDRH3序列，或者与前述任一项结合相同的表位或与前述任一项竞争结合，并且任选地其中所述scFv按顺序包含VH、任选地包含SEQ ID NO:24的接头和VL，和/或所述scFv包含柔性接头和/或包含如SEQID NO:43所示的氨基酸序列。

145.根据实施方案143或144所述的方法，其中所述scFv包含FMC63的可变重链区和FMC63的可变轻链区。

146.根据实施方案141-145中任一项所述的方法，其中所述共刺激信号传导区是4-1BB的信号传导结构域。

147.根据实施方案141-146中任一项所述的方法，其中所述共刺激结构域包含SEQID NO:12或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的其变体。

148.根据实施方案141-147中任一项所述的方法，其中所述初级信号传导结构域是CD3ζ信号传导结构域。

149.根据实施方案141-148中任一项所述的方法，其中所述初级信号传导结构域包含与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的SEQ ID NO:13、14或15。

150.根据实施方案141-149中任一项所述的方法，其中所述CAR进一步包含在所述跨膜结构域与所述scFv之间的间隔子。

151.根据实施方案150所述的方法，其中所述间隔子是多肽间隔子，所述多肽间隔子包含以下项或由以下项组成：全部或部分免疫球蛋白铰链或其修饰形式、任选IgG4铰链或其修饰形式。

152.根据实施方案150或151所述的方法，其中所述间隔子的长度为或为约12个氨基酸。

153.根据实施方案150-152中任一项所述的方法，其中：

所述间隔子具有以下项或由以下项组成：SEQ ID NO:1的序列、由SEQ ID NO:2编码的序列、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的前述任一项的变体；和/或

所述间隔子包含式X₁PPX₂P或由其组成，其中X₁是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸，并且X₂是半胱氨酸或苏氨酸。

154.根据实施方案150-153中任一项所述的方法，其中：

所述间隔子是多肽间隔子，所述多肽间隔子(a)包含全部或部分免疫球蛋白铰链或所述免疫球蛋白铰链的修饰形式或由全部或部分免疫球蛋白铰链或所述免疫球蛋白铰链的修饰形式组成，或者包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28胞外区域或CD8胞外区域，(b)包含全部或部分免疫球蛋白铰链任选IgG4铰链或所述免疫球蛋白铰链的修饰形式或由全部或部分免疫球蛋白铰链任选IgG4铰链或所述免疫球蛋白铰链的修饰形式组成，和/或包含约15个或更少的氨基酸，并且不包含CD28胞外区域或CD8胞外区域，或者(c)长度是为或约12个氨基酸和/或包含全部或部分免疫球蛋白铰链任选IgG4或所述免疫球蛋白铰链的修饰形式或由全部或部分免疫球蛋白铰链任选IgG4或所述免疫球蛋白铰链的修饰形式组成；或者(d)具有以下项或由以下项组成：SEQ ID NO:1的序列、由SEQ ID NO:2编码的序列、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34，或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的前述任一项的变体，或者(e)包含式X₁PPX₂P或由其组成，其中X₁是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸，并且X₂是半胱氨酸或苏氨酸；和/或

所述共刺激结构域可以包含SEQ ID NO:12或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的其变体；和/或

所述初级信号传导结构域包含与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的SEQ ID NO:13、14或15；和/或

所述scFv包含RASQDISKYLN(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列、SRLHSGV(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列和/或GNTLPYTFG(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列和/或DYGVS(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列、VIWGSETTYYNSALKS(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列和/或YAMDYWG(SEQ IDNO:40)的氨基酸序列，或者其中所述scFv包含FMC63的可变重链区和FMC63的可变轻链区和/或FMC63的CDRL1序列、FMC63的CDRL2序列、FMC63的CDRL3序列、FMC63的CDRH1序列、FMC63的CDRH2序列和FMC63的CDRH3序列，或者与前述任一项结合相同的表位或与前述任一项竞争结合，并且任选地其中所述scFv依次包含VH、任选地包含SEQ ID NO:24的接头和VL，和/或所述scFv包含柔性接头和/或包含如SEQ ID NO:43所示的氨基酸序列；和/或

155.根据实施方案150-154中任一项所述的方法，其中：

所述间隔子是多肽间隔子，所述多肽间隔子包含SEQ ID NO:1的序列；

所述共刺激结构域包含SEQ ID NO:12；

所述初级信号传导结构域包含SEQ ID NO:13、14或15；

所述抗原结合结构域包含scFv，所述scFv包含FMC63的可变重链区和FMC63的可变轻链区。

156.根据实施方案1-155中任一项所述的方法，其中将所述细胞组合物肠胃外施用、任选静脉内施用。

157.根据实施方案1-156中任一项所述的方法，其中所述受试者是人受试者。

158.根据实施方案1-157中任一项所述的方法，其中包含工程化T细胞的所述组合物是通过如下制造过程产生的，所述制造过程包括将包含原代T细胞的输入组合物与包含含有多种亲和素、链霉亲和素、亲和素突变蛋白或链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的刺激试剂暴露于用于刺激T细胞的条件下，从而生成刺激的群体，其中所述刺激试剂能够激活TCR复合物的一种或多种组分的一个或多个细胞内信号传导结构域和一种或多种共刺激分子的一个或多个细胞内信号传导结构域。

159.根据实施方案158所述的方法，其中所述制造过程进一步包括将编码靶向CD19的CAR的异源多核苷酸引入所述刺激的群体的细胞中，从而生成转化细胞的群体。

160.根据实施方案159所述的方法，其中所述制造过程进一步包括将所述转化细胞的群体孵育长达96小时。

161.根据实施方案160所述的方法，其中所述孵育是在缺乏一种或多种重组细胞因子的基础培养基中进行。

162.根据实施方案159或161所述的方法，其中所述制造过程进一步包括收获所述转化的群体的T细胞，从而产生工程化细胞的组合物。

163.根据实施方案162所述的方法，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后24小时与120小时之间进行。

164.根据实施方案162或163所述的方法，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间进行。

165.根据实施方案162-164中任一项所述的方法，其中所述收获是在基因组中检测到整合的载体时但在达到每个二倍体基因组的稳定的整合载体拷贝数(iVCN)之前的时间进行。

166.根据实施方案162-165中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述收获时活细胞总数大于或大于约三倍的所述刺激的群体的总活细胞数之前的时间进行。

167.根据实施方案166所述的方法，其中所述收获是在所述收获时活细胞总数等于或等于约三倍、等于或等于约两倍的所述刺激的群体的总活细胞数或者等于或大约等于所述刺激的群体的总活细胞数时进行。

168.根据实施方案162-167中任一项所述的方法，其中所述收获是在CD27⁺CCR7⁺的百分比是在所述群体中总T细胞、所述群体中总CD3⁺ T细胞、所述群体中总CD4⁺ T细胞或所述群体中总CD8⁺ T细胞或所述群体中其CAR表达细胞的大于或大于约50％时进行。

169.根据实施方案162-168中任一项所述的方法，其中所述收获是在CD45RA⁺CCR7⁺和CD45RA^-CCR7⁺细胞的百分比是在所述群体中总T细胞、所述群体中总CD3⁺ T细胞、所述群体中总CD4⁺ T细胞或所述群体中总CD8⁺ T细胞或所述群体中其CAR表达细胞的大于或大于约60％时进行。

170.根据实施方案1-169中任一项所述的方法，其中所施用的组合物中的细胞是通过用于产生展现出预先确定的特征的输出组合物的制造过程产生的，其中当在多名不同的单独受试者之中进行时，所述制造过程的迭代任选地从人生物样品产生多种所述输出组合物，其中所述多种输出组合物之中的所述输出组合物的预先确定的特征选自：

在所述多种所述输出组合物中的具有记忆表型的细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；

在所述多种所述输出组合物中的具有中央记忆表型的细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；

在所述多种所述输出组合物中的为CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+的细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；

在所述多种输出组合物中的呈CCR7+/CD45RA-或CCR7+/CD45RO+的细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；

在所述多种输出组合物中的所述工程化CD4+ T细胞、任选地CAR+CD4+ T细胞中的中央记忆CD4+ T细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；

在所述多种输出组合物中的所述工程化CD8+ T细胞、任选地CAR+CD8+ T细胞中的中央记忆CD8+ T细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；和/或

在所述多种输出组合物中的所述工程化T细胞、任选地CAR+ T细胞中的中央记忆T细胞，任选地CD4+中央记忆T细胞和CD8+中央记忆T细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间。

171.根据实施方案170所述的方法，其中所施用的组合物是通过用于产生输出组合物的制造过程产生的，所述输出组合物在至少约80％、约90％、约95％、约97％、约99％、约100％或100％的人生物样品中展现出预先确定的特征、任选在所述输出组合物中的阈值数量的表达CAR的细胞，其中所述制造过程是在多名不同的单独受试者之中进行的。

172.根据实施方案158-171中任一项所述的方法，其中包含基因工程化细胞的组合物不含有来自所述制造过程的残留珠。

173.根据实施方案1-172中任一项所述的方法，其中所述B细胞NHL是复发性和/或难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤(B细胞NHL)。

174.一种制品，所述制品包含含有表达靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化细胞的组合物，以及用于按照根据实施方案1-173中任一项所述的方法施用所述细胞组合物的说明书。

VI.实施例

以下实施例被包括在内仅用于说明目的，并不旨在限制本发明的范围。

实施例1：使用非扩增过程生成含有CAR+ T细胞的T细胞组合物。

含有表达抗CD19嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的原代T细胞的工程化组合物是通过如下过程来产生的：所述过程在用病毒载体转导之前利用由抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚试剂构成的刺激试剂来激活T细胞，但是所述过程不涉及转化细胞的后续扩增步骤。使用称为非扩增过程A和非扩增过程B的两个类似的非扩增过程生成CAR+ T细胞组合物。所述非扩增过程不包括在转导之后的培育步骤，所述培育步骤的目的是与培育步骤开始相比，增加培育步骤结束时活细胞的总数。尽管孵育条件不是为了扩增细胞群体的目的而进行的，但与孵育开始相比，收获时的组合物可能经历扩增或展现出细胞数量的增加。为了进行比较，将来自同一供体的T细胞通过其中细胞在转导后培育以进行扩增的过程进行工程化。评估了生成的CD19靶向CAR治疗性T细胞组合物的表型和活性。

所有过程包括用相同CD19靶向CAR将T细胞工程化。所述CAR含有抗CD19scFv、免疫球蛋白来源的间隔子、源自CD28的跨膜结构域、源自4-1BB的共刺激区和CD3-ζ细胞内信号传导结构域。病毒载体还含有编码截短的受体的序列，所述截短的受体用作CAR表达的替代标记物；所述序列通过T2A核糖体跳跃序列与所述CAR序列隔开。

A.CD19靶向CAR T细胞组合物的生成。

在非扩增过程A中，从人供体收集白细胞单采术样品，将其洗涤并经受基于免疫亲和力的针对CD4+和CD8+ T细胞组合物的选择。选择后，将单独的CD4+和CD8+ T细胞组合物低温冷冻，然后解冻并以约1:1比率的活CD4+ T细胞与活CD8+ T细胞(约300×10⁶个CD4+和300×10⁶个CD8+细胞)混合，然后通过在含有重组IL-2(100IU/mL)、重组IL-7(600IU/mL)和重组IL-15(100IU/mL)的无血清的完全培养基中与抗CD3/抗CD28Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂一起孵育18-30小时进行刺激。刺激后，通过用编码抗CD19 CAR的慢病毒载体旋转接种来转导细胞。旋转接种后，将细胞洗涤并重悬于未添加重组细胞因子的基础无血清培养基中，并在培养箱中在约37.0℃下孵育。在开始刺激后约48小时后，添加D-生物素并与细胞混合以将抗CD3和抗CD28 Fab试剂与寡聚链霉亲和素试剂解离。将细胞进一步再孵育48小时(直到刺激开始后约4天)，然后将其用低温保护剂配制。

在非扩增过程B中，从人供体收集白细胞单采术样品，洗涤并低温保存。使低温保存的样品解冻，然后通过基于免疫亲和力的选择从每个样品选择CD4+和CD8+细胞的单独组合物。将选择的CD4+和CD8+ T细胞组合物混合达到900×10⁶个总活CD4+和CD8+ T细胞，并且通常以约1:1比率进行，然后通过在含有重组IL-2(100IU/mL)、重组IL-7(600IU/mL)和重组IL-15(100IU/mL)的无血清的完全培养基中与抗CD3/抗CD28Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂一起孵育16-24小时进行刺激。刺激后，通过用编码抗CD19 CAR的慢病毒载体旋转接种来转导细胞。旋转接种后，将细胞洗涤并重悬于未添加重组细胞因子的基础无血清培养基中，并在培养箱中在约37.0℃下孵育。在开始刺激后约48小时后，添加D-生物素并与细胞混合以将抗CD3和抗CD28 Fab试剂与寡聚链霉亲和素试剂解离。将细胞进一步再孵育48小时(直到刺激开始后约4天)，然后将其用低温保护剂配制。

在扩增过程中，各自表达相同抗CD19 CAR的工程化CD4+ T细胞和工程化CD8+ T细胞通过如下过程产生，所述过程涉及使富集的CD4+和富集的CD8+细胞群体单独经受过程步骤，包括单独选择、低温保存、刺激、转导、扩增和收获步骤。从人供体收集白细胞单采术样品，将其洗涤并经受基于免疫亲和力的针对CD4+和CD8+ T细胞组合物的选择。选择后，将单独的CD4+和CD8+ T细胞组合物在含有重组IL-2和重组IL-15(以及对于CD4+ T细胞组合物，另外的重组IL-7)的无血清完全培养基中用抗CD3/抗CD28顺磁珠激活，然后单独用编码抗CD19 CAR的载体进行慢病毒转导。去除顺磁珠，然后将转导的群体在重组IL-2和重组IL-14(以及对于CD4+ T细胞组合物，另外的重组IL-7)的存在下单独孵育，并且在用于细胞扩增的摇摆运动生物反应器中培育直至达到扩增的阈值，如在从开始扩增起9天与13天之间。然后单独收获细胞，对其进行配制和低温冷冻。

B.工程化T细胞组合物的纯度。

用识别表面标记物(包括CD3、NK细胞标记物、和CD19)的抗体对从非扩增工程化过程产生的T细胞组合物进行染色，并且如图1所示通过流式细胞术对其进行定量。生成模拟物转导的T细胞组合物并将其用作对照。使用非扩增过程产生的细胞组合物通常展现出高百分比(>96％)的CD3+ T细胞，其中NK细胞和CD19+细胞的百分比较低。

C.CD4/CD8频率和CD4/CD8比率。

用识别表面标记物(包括CD3、CD4和CD8)的抗体对从扩增和非扩增工程化过程产生的T细胞组合物进行染色，并且如图2和图3中所示通过流式细胞术对其进行定量。生成模拟物转导的T细胞组合物并将其用作对照。由于扩增过程产生了单独的CD4和CD8组合物，因此CD4+或CD8+ T细胞各自在通过该过程得到的相应生成的组合物中以约100％存在。

D.细胞活力。

将从非扩增工程化过程产生的T细胞组合物针对指示凋亡的因子的表达进行染色，如用作为细胞健康的量度的膜联蛋白V或激活的胱天蛋白酶3(aCas3)进行表面染色以及用识别包括CD3在内的表面标记物的抗体进行表面染色。图4显示了与模拟物转导的T细胞组合物相比，由非扩增工程化过程产生的细胞组合物的CD3+细胞中aCas3+细胞的百分比。

E.CAR的载体拷贝数和表面表达。

使用标准载体拷贝数(VCN)测定和整合载体拷贝数(iVCN)测定来测定从基本如本实施例中所述的非扩增和扩增工程化过程产生的T细胞组合物，所述测定包括通过脉冲场凝胶电泳(PFGE)分离高分子量和低分子量DNA种类。如通过VCN和iVCN测定确定的CAR的载体拷贝数也与CAR的表面表达相关。PCT/US2019/046048中披露了VCN和iVCN测定的示例性方法和组合物，将其通过引用以其整体并入本文。

具体地，从细胞制备基因组DNA，并通过如下方法对其进行转基因序列拷贝数的评估：(1)使用阈值的iVCN方法以分离>15kb(“iVCN”)的高分子量DNA种类与低于15kb阈值的低分子量、非染色体种类，其中分离是通过自动化PFGE(例如PippinHT(Sage Science，马萨诸塞州贝弗利市))进行的，或(2)标准VCN方法，其中基因组DNA未首先通过PFGE分离(“VCN”)。在两种测定中，转基因拷贝数通过ddPCR使用对转基因特有的序列具有特异性的引物(例如对重组蛋白的调节元件具有特异性的引物)来确定，并针对如使用对参考基因(例如，白蛋白(ALB)基因)具有特异性的引物确定的二倍体基因组进行归一化。

结果表明，使用VCN测定评估的转基因拷贝数大体上与通过iVCN评估的转基因拷贝数相关(图5A)。然而，对于使用非扩增过程制造的细胞，通过VCN获得的值高于通过iVCN获得的值，这与检测可能存在于含有使用非扩增过程产生的细胞的样品中的非整合转基因序列的VCN测定一致。相比之下，对于使用扩增过程制造的细胞，通过VCN和iVCN获得的值几乎相同(在VCN＝iVCN线附近)。这些差异可能是由于与扩增过程相比，在较短的非扩增过程中样品中存在更大量的游离的、非整合转基因序列拷贝所致。这些结果与以下观察结果一致：与iVCN测定相比，能够检测高分子量和低分子量DNA两者的标准VCN测定具有局限性，特别是当用于在转基因引入后的早期评估细胞时，如在将T细胞工程化的缩短过程(其中游离的、非整合转基因序列拷贝可能仍存在于样品中)中。

为了评估iVCN或VCN测定与CAR的表面表达的相关性程度，通过流式细胞术评估来自非扩增或扩增过程的细胞样品的CD3、CD45和CAR的表达，以确定在活CD45+细胞中CD3+CAR+细胞的百分比。如图5B所示，与通过非扩增过程工程化相比，VCN测定展现出与通过扩增过程工程化的样品的CAR+细胞的百分比更好的相关性，这可能是由于存在未促进表面CAR表达的非整合CAR DNA序列。如图5C所示，在已通过非扩增或扩增过程工程化的细胞中，iVCN显示相似的与CAR表达的相关性。对于所有样品，与通过VCN测定(R²＝0.5903)确定的每个细胞中的拷贝数相比，CAR表达与通过iVCN测定(R²＝0.8952)确定的每个细胞中的拷贝数的相关性更高。

F.T细胞组合物的记忆特征。

将从非扩增工程化过程产生的T细胞组合物针对激活的胱天蛋白酶3(aCas3)并用识别表面标记物(包括CD4、CD8、CCR7、CD27和CD45RA)的抗体进行染色。确定指示幼稚/幼稚样T细胞(CD45RA+CCR7+)、中央记忆(CD45RA-CCR7+)、效应记忆(CD45RA-CCR7-；T_E+_EM)和效应记忆CD45RA+细胞(CCR7-CD45RA+；T_EMRA)的T细胞的百分比。如图6A所示，工程化组合物富集了中央记忆/幼稚样T细胞。

在对CCR7和CD27染色两者呈阳性的aCas-T细胞中，CD4+CAR+和CD8+CAR+ T细胞的百分比显示于图6B中。如图所示，工程化组合物富集了CCR7+CD27+细胞。

这些结果支持从非扩增过程生成的工程化细胞组合物具有比从扩增过程生成的细胞组合物更高份额的具有幼稚样、分化程度较低的表型的细胞。

实施例2：使用非扩增过程生成的T细胞组合物的体外活性。

使用用于制造工程化T细胞的非扩增和扩增过程从匹配的供体产生含有表达抗CD19嵌合抗原受体(CAR)的T细胞的原代T细胞的工程化T细胞组合物，并且比较细胞组合物的属性。

从1名健康供体和患有非霍奇金淋巴瘤(NHL)的三名患者(两名患者患有弥漫性大B细胞淋巴瘤DLBCL；并且一名患者患有套细胞淋巴瘤MCL)收集白细胞单采术样品，并且进行制造运行以使用基本上如实施例1中的过程A所述的非扩增过程A以抗CD19 CAR将T细胞工程化。将所述工程化T细胞组合物与使用如实施例1中所述的扩增过程从供体匹配的过程运行产生的T细胞组合物进行比较。抗CD19 CAR含有源自鼠类抗体的抗CD19 scFv、源自免疫球蛋白的间隔子、源自CD28的跨膜结构域、源自4-1BB的共刺激区域和CD3-ζ细胞内信号传导结构域。病毒载体还含有编码截短的受体的序列，所述截短的受体用作CAR表达的替代标记物；所述序列通过T2A核糖体跳跃序列与所述CAR序列隔开。

1)记忆特征。

在长期刺激测定中分析了来自通过非扩增和扩增过程从匹配的供体生成的工程化T细胞组合物的细胞，所述长期刺激测定涉及在存在与针对抗CD19 CAR的激动性抗独特型抗体缀合的微珠以提供CAR依赖性刺激物的情况下连续孵育9至14天。该测定模拟细胞在长期暴露于抗原后的适应性和存活能力，如在施用后可能在体内发生的适应性和存活能力。具体地，在长期CAR依赖性刺激(初级)之前和在长期CAR依赖性刺激(次级)之后，通过流式细胞术评估细胞的表面标记物(包括CD4、CD8、CCR7、CD27、CD45RA)以及CAR(替代标记物+或抗独特型+)。将细胞在对CAR表达呈双阳性的活性CD3+细胞上门控。然后将CAR+细胞作为CD4+(图7A和图7C)或CD8+(图7B和图7D)细胞进行门控，之后进行记忆亚型化。

在CAR特异性刺激(初级)之前，与使用扩增过程产生的细胞组合物相比，使用非扩增过程生成的细胞组合物展现出较高比例的幼稚样和中央记忆T细胞以及较低比例的效应子记忆亚型(图7A和图7B)。与使用扩增过程产生的组合物相比，使用非扩增过程生成的组合物具有较高比例的早期分化程度较低的CD4+和CD8+CAR T细胞、较低比例的中等分化的CD4+和CD8+CAR T细胞以及较低比例的晚期分化程度较高的CD4+CAR T细胞(图7C和图7D)。

在长期CAR特异性刺激(刺激)之后，从非扩增和扩增过程生成的两种组合物分化程度更高，因为在扩增之后存在较少的分化程度较低的幼稚样(例如，CD45RA+CCR7+)、中央记忆(例如CD45RA-CCR7+)或早期(CD27+CCR7+)细胞(图7A-图7D)。与从扩增过程生成的组合物相比，从非扩增过程生成的组合物显示出在刺激之后分化程度较低的记忆亚型的保存，包括较好保留了趋化因子受体CCR7，其参与在体内运输至次级淋巴组织并且可以指示对于延长功能的潜力。

2)增殖能力。

在如上所述用对抗CD19 CAR具有特异性的抗ID抗体进行持续10天的长期CAR依赖性刺激后，评估增殖能力。长期刺激后，分析了组合物中的活性细胞。如图8A-图8F所示，与供体匹配的扩增细胞产物中的工程化细胞相比，来自抗CD19非扩增细胞产物的细胞展现显著增强的增殖能力(2倍至7.4倍)。这些结果与以下观察结果一致：非扩增细胞产物含有更高相对比例的分化程度较低的T细胞(包括维持与中央记忆和干细胞记忆T细胞类似的特征的细胞)，并且因此具有响应于经由CAR的信号传导经历另外多轮分裂的能力。

3)细胞裂解活性

为了进行细胞裂解潜力的评估，将如上所述在非扩增或扩增过程中工程化的抗CD19 CAR T细胞用对CAR具有特异性的抗ID抗体刺激10-14天，并且基于至第10天观察到的增殖总结扩增数据。将被转导以表达CD19的K562细胞(K562-CD19)用NucLight Red(NLR)标记，以允许通过显微镜检查对其进行追踪。将在长期刺激之前或之后来自非扩增或扩增过程的工程化CAR-T细胞组合物与K562-CD19以0.5:1的低效应子与靶细胞(E:T)比率一起共培养。通过测量在96小时时间段内活性靶细胞的损失来评估细胞裂解活性，如通过红色荧光信号(使用

活细胞分析系统，Essen Bioscience)所确定。将数据转化为曲线下面积(AUC)，用于针对单独供体/过程或依据制造过程进行比较。

在制造之后立即且在长期刺激之前(图9A)，与使用扩增过程生成的T细胞组合物相比，使用非扩增过程生成的工程化CAR-T细胞组合物展现出更好或相似的细胞裂解活性。然而，在长期刺激测定中扩增后(图9B)，与使用扩增过程生成的组合物相比，使用非扩增过程生成的组合物展现出在低效应子与靶标比率(0.5:1)下保持功能性细胞裂解活性(曼-惠特尼检验；*P<0.05)。

4)细胞因子产生。

为了进行细胞因子产生的评估，将如上所述在非扩增或扩增过程中工程化的抗CD19 CAR T细胞用对CAR具有特异性的抗ID抗体刺激9至14天。将在长期刺激之前或之后来自非扩增或扩增过程的工程化CAR-T细胞组合物在板结合的抗ID上孵育5小时，并通过流式细胞术测量细胞因子产生。在每个细胞的基础上，通过三重阳性细胞的布尔逻辑门(Boolean logic gating)确定基于CD4+CAR+和CD8+CAR+细胞中三种细胞因子(IL-2、IFNγ和TNFα)的同时产生的多功能得分。通过曼-惠特尼评估统计显著性，*p<0.05。在次级抗原刺激物之后，从非扩增过程生成的细胞显示比从扩增过程产生的细胞更高的多功能性(图10)。

实施例3：使用非扩增过程生成的T细胞组合物的体内抗肿瘤活性。

1)CD19+Nalm-6白血病模型。

在Nalm-6急性淋巴细胞白血病(ALL)肿瘤模型中评价从非扩增和扩增匹配供体工程化过程产生的抗CD19 CAR-T细胞组合物。向NOD.Cg-Prkdc^scidIL-2rg^tm1Wjl/SzJ小鼠静脉内注射5.0×10⁵个Nalm-6萤火虫萤光素酶-绿色荧光蛋白(FfLuc-GFP)淋巴细胞白血病细胞，并且在3天后，将小鼠随机化为多个组以平衡肿瘤负担。该模型是缓慢生长的肿瘤模型，其中在未施用CAR-T细胞的小鼠中，小鼠截至大约第24天至第26天达到末期疾病。在植入后第4天，将CAR-T细胞静脉内施用至小鼠。通过使Nalm-6 FfLuc阳性生物发光(BLI)成像来评估播散性肿瘤生长。

图11A显示在用扩增工程化过程生成的工程化CAR-T细胞治疗的小鼠中，在CAR-T细胞注射后大约第10天检测到肿瘤负担增加。相比之下，在用从每种非扩增工程化过程产生的CAR-T细胞治疗的小鼠中，肿瘤负担的降低持续到大约第15天。尽管如此，但在第5天与大约第20天之间，与从扩增过程生成的细胞相比，从非扩增过程产生的CD19CAR-T细胞展现出在小鼠中的循环CAR-T细胞的减少(图11B)。

2)CD19+Raji伯基特淋巴瘤模型。

在Raji伯基特淋巴瘤模型中评价从非扩增和扩增匹配供体工程化过程产生的抗CD19 CAR-T细胞组合物。向NOD.Cg-Prkdc^scidIL-2rg^tm1Wjl/SzJ小鼠静脉内注射5.0×10⁵个Raji萤火虫萤光素酶-绿色荧光蛋白(FfLuc-GFP)伯基特淋巴瘤细胞，并且在6天后，将小鼠随机化为多个组以平衡肿瘤负担(每组n＝8)。第二天(肿瘤植入后第7天)，以1.0×10⁶个细胞/小鼠(图12，左图)的高剂量或2.5×10⁵个细胞/小鼠(图12，右图)的低剂量用媒介物或抗CD19嵌合抗原受体(CAR)人CD4+和CD8+ T细胞静脉内治疗小鼠。使用来自一个健康供体(HD1)、两名患有弥漫性大B细胞淋巴瘤的患者(DP1、DP2)或一名患有套细胞淋巴瘤的患者(MP1)的T细胞利用非扩增过程和扩增过程产生抗CD19CAR T细胞。对照小鼠未接受治疗(仅肿瘤)。通过使Raji FfLuc阳性生物发光(BLI)成像来评估播散性肿瘤生长。

Raji伯基特淋巴瘤模型是快速生长的肿瘤，其末期疾病的特征在于在未施用CAR-T细胞的小鼠中在肿瘤植入后第18至20天发生后肢瘫痪。在肿瘤植入后第7天，在给予CAR-T治疗时小鼠具有中等肿瘤负担。用使用非扩增过程生成的组合物治疗的小鼠具有延迟反应，其中峰值肿瘤抑制发生在CAR-T细胞施用后大约40天(图12A，第1阶段)。相比之下，用使用扩增过程生成的组合物以在该模型中通常亚治愈性的剂量治疗导致早期抗肿瘤作用，这在50天后开始减弱(图12A，第2阶段)。在治疗后第5天，在用使用扩增过程生成的组合物治疗的小鼠中循环CAR-T细胞的数量较高。然而，在第5天之后，与扩增过程组合物相比，用使用非扩增过程生成的组合物治疗的小鼠显示出更大的CAR-T细胞扩增，其中平均具有10至15倍更高的扩增，且对于一些时间点倍数扩增达到高达30倍(图12B)。

具有效应子记忆表型的CAR-T细胞可以介导快速肿瘤清除，而分化程度较低的幼稚样和中央记忆T细胞很可能介导长期抗肿瘤活性和记忆形成(Gattinoni等人,NatMed.2017,23(1):18-27；Klebanoff等人,Trends Immunol.2005,26(2):111-117)。非扩增过程组合物的CAR-T细胞扩增的初始速率较慢可能是由于分化程度较低的表型和可能延迟的扩增动力学导致的，同时导致长期持久性。治疗时的较高肿瘤负担和Raji肿瘤模型的激进生长速率最初可能超过非扩增过程组合物的CAR-T细胞在体内分化为效应细胞的速度，从而导致抗肿瘤功能的滞后。相比之下，在治疗时具有较低肿瘤负担的较慢生长的Nalm-6肿瘤模型中，非扩增过程组合物的CAR-T细胞比扩增过程组合物的CAR-T细胞具有更大的抗肿瘤功效的趋势。综上所述，这些体内数据与非扩增过程组合物的CAR-T细胞的更大增殖能力和效力是一致的，这可能是人类抗肿瘤活性增强的指标。

实施例4：向患有复发性或难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤的受试者施用抗CD19 CAR 表达细胞。

将含有CD4+CAR表达T细胞组合物和CD8+CAR表达T细胞组合物的抗CD19CAR表达治疗性T细胞组合物施用至患有复发性或难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤(r/r B细胞NHL)的受试者。

招募患有r/r B细胞NHL的受试者，包括患有经组织学证实的DLBCL非特指型、DLBCL组织学为携带MYC和BCL2和/或BCL6重排的高级别B细胞淋巴瘤(HGBCL)、从滤泡性(tFL)或边缘区淋巴瘤(tMZL)转化的DLBCL、原发性纵膈B细胞淋巴瘤(PMBCL)或3b级FL(FL3B)的受试者。受试者在包括至少一种蒽环类药物和利妥昔单抗(或其他抗CD20单克隆抗体)的至少2种全身性疗法线之后患有复发性和/或难治性疾病，和/或受试者患有自体干细胞移植(ASCT)治疗已失败的复发性和/或难治性DLBCL。

所施用的抗CD19 CAR表达治疗性T细胞组合物是通过如下过程生成的，在所述过程中细胞未经受用于扩增(增殖)细胞的目的的培育步骤，所述过程产生具有如下表型特征的CAR T细胞产物，所述表型特征含有高比例的分化程度较低的细胞类型。所述过程包括基于免疫亲和力从来自待治疗的单独受试者的先前低温保存的白细胞单采术样品富集(例如，免疫磁性选择)CD4+和CD8+细胞。

将选择的CD4+和CD8+ T细胞组合物混合达到900×10⁶个总活CD4+和CD8+ T细胞，并且通常以约1:1比率进行，然后通过在含有重组IL-2(100IU/mL)、重组IL-7(600IU/mL)和重组IL-15(100IU/mL)的无血清的完全培养基中与抗CD3/抗CD28 Fab缀合的寡聚链霉亲和素突变蛋白试剂一起孵育16-24小时进行刺激。刺激后，通过用编码抗CD19 CAR的慢病毒载体旋转接种来转导细胞。所述CAR含有抗CD19 scFv、免疫球蛋白来源的间隔子、源自CD28的跨膜结构域、源自4-1BB的共刺激区和CD3-ζ细胞内信号传导结构域。病毒载体还含有编码截短的受体的序列，所述截短的受体用作CAR表达的替代标记物；所述序列通过T2A核糖体跳跃序列与所述CAR序列隔开。

旋转接种后，将细胞洗涤并重悬于未添加重组细胞因子的基础无血清培养基中，并在培养箱中在约37.0℃下孵育。在开始刺激后约48小时后，添加D-生物素并与细胞混合以将抗CD3和抗CD28 Fab试剂与寡聚链霉亲和素试剂解离。将细胞进一步再孵育48小时(直到刺激开始后约4天)，然后用低温保护剂配制。所述过程不涉及随后用于扩增转导细胞的步骤，并且通常比涉及扩增转导细胞的过程短。所述过程产生这样的细胞组合物，其中大于80％的细胞是这样的T细胞，其含有与起始样品相比以及与使用涉及旨在扩增转导细胞的培育步骤的制造过程生成的细胞组合物相比富集了中央记忆表型的CD4+CAR+和CD8+CAR+T细胞。

在静脉内施用之前，将含有CD4+CAR+和CD8+CAR+ T细胞的低温保存细胞组合物解冻。在CAR+ T细胞输注之前，受试者接受了使用静脉内氟达拉滨(flu，30mg/m²/d)和静脉内环磷酰胺(Cy，300mg/m²/d)的淋巴细胞清除化学疗法，持续三(3)天，并且对于具有降低的肾功能的受试者降低剂量。

受试者在完成淋巴细胞清除之后2-7天接受CAR表达T细胞。向每个受试者施用10×10⁶个总CAR表达T细胞的单剂量。可以设想，本研究中的受试者将被施用来自以下剂量水平的剂量：5×10⁶个总CAR+ T细胞、10×10⁶个总CAR+ T细胞、25×10⁶个总CAR+T细胞、50×10⁶个总CAR+ T细胞和100×10⁶个总CAR+ T细胞。每个剂量都含有CD3+CAR+ T细胞(≥80％CD3+细胞；≥10％CD3+CAR+细胞)。

在治疗之前的基线处和在治疗后的不同时间，基于通过正电子发射断层扫描(PET)和/或计算机断层扫描(CT)和/或磁共振成像(MRI)扫描的放射影像学肿瘤评估来评估对治疗的反应(例如基于卢加诺分类，参见例如Cheson等人,(2014)JCO32(27):3059-3067)。

本发明并不旨在限于具体公开的实施方案的范围，所提供的实施例例如是为了说明本发明的各个方面。根据本文的描述和传授，对组合物和方法的各种修改将变得清楚。可以在不脱离本公开文本的真实范围和精神的情况下实践这些变化，并且这些变化旨在落入本公开文本的范围内。

序列

序列表

<110> 朱诺治疗学股份有限公司

<120> CD19定向嵌合抗原受体T细胞组合物和方法及其用途

<130> 735042022740

<140> 尚未分配

<141> 同时随同提交

<150> US 62/975,724

<151> 2020-02-12

<160> 90

<170> 用于Windows的FastSEQ 4.0版

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 间隔子 (IgG4铰链)

<400> 1

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 间隔子 (IgG4铰链)

<400> 2

gaatctaagt acggaccgcc ctgcccccct tgccct 36

<210> 3

<211> 119

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 铰链-CH3 间隔子

<400> 3

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Gly Gln Pro Arg

1 5 10 15

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

20 25 30

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

35 40 45

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

50 55 60

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

65 70 75 80

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

85 90 95

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

100 105 110

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

115

<210> 4

<211> 229

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 铰链-CH2-CH3 间隔子

<400> 4

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 5

<211> 282

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> IgD-铰链-Fc

<400> 5

Arg Trp Pro Glu Ser Pro Lys Ala Gln Ala Ser Ser Val Pro Thr Ala

1 5 10 15

Gln Pro Gln Ala Glu Gly Ser Leu Ala Lys Ala Thr Thr Ala Pro Ala

20 25 30

Thr Thr Arg Asn Thr Gly Arg Gly Gly Glu Glu Lys Lys Lys Glu Lys

35 40 45

Glu Lys Glu Glu Gln Glu Glu Arg Glu Thr Lys Thr Pro Glu Cys Pro

50 55 60

Ser His Thr Gln Pro Leu Gly Val Tyr Leu Leu Thr Pro Ala Val Gln

65 70 75 80

Asp Leu Trp Leu Arg Asp Lys Ala Thr Phe Thr Cys Phe Val Val Gly

85 90 95

Ser Asp Leu Lys Asp Ala His Leu Thr Trp Glu Val Ala Gly Lys Val

100 105 110

Pro Thr Gly Gly Val Glu Glu Gly Leu Leu Glu Arg His Ser Asn Gly

115 120 125

Ser Gln Ser Gln His Ser Arg Leu Thr Leu Pro Arg Ser Leu Trp Asn

130 135 140

Ala Gly Thr Ser Val Thr Cys Thr Leu Asn His Pro Ser Leu Pro Pro

145 150 155 160

Gln Arg Leu Met Ala Leu Arg Glu Pro Ala Ala Gln Ala Pro Val Lys

165 170 175

Leu Ser Leu Asn Leu Leu Ala Ser Ser Asp Pro Pro Glu Ala Ala Ser

180 185 190

Trp Leu Leu Cys Glu Val Ser Gly Phe Ser Pro Pro Asn Ile Leu Leu

195 200 205

Met Trp Leu Glu Asp Gln Arg Glu Val Asn Thr Ser Gly Phe Ala Pro

210 215 220

Ala Arg Pro Pro Pro Gln Pro Gly Ser Thr Thr Phe Trp Ala Trp Ser

225 230 235 240

Val Leu Arg Val Pro Ala Pro Pro Ser Pro Gln Pro Ala Thr Tyr Thr

245 250 255

Cys Val Val Ser His Glu Asp Ser Arg Thr Leu Leu Asn Ala Ser Arg

260 265 270

Ser Leu Glu Val Ser Tyr Val Thr Asp His

275 280

<210> 6

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T2A

<400> 6

Leu Glu Gly Gly Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp

1 5 10 15

Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Arg

20

<210> 7

<211> 357

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> tEGFR

<400> 7

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly

20 25 30

Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe

35 40 45

Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala

50 55 60

Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu

65 70 75 80

Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile

85 90 95

Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu

100 105 110

Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala

115 120 125

Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu

130 135 140

Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr

145 150 155 160

Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys

165 170 175

Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly

180 185 190

Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu

195 200 205

Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys

210 215 220

Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu

225 230 235 240

Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met

245 250 255

Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala

260 265 270

His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val

275 280 285

Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His

290 295 300

Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro

305 310 315 320

Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala

325 330 335

Thr Gly Met Val Gly Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly

340 345 350

Ile Gly Leu Phe Met

355

<210> 8

<211> 27

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> CD28 (登录号P10747的氨基酸153-179)

<400> 8

Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu

1 5 10 15

Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val

20 25

<210> 9

<211> 66

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> CD28 (登录号P10747的氨基酸114-179)

<400> 9

Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu

20 25 30

Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly

35 40 45

Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe

50 55 60

Trp Val

65

<210> 10

<211> 41

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> CD28 (P10747的氨基酸180-220)

<400> 10

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 11

<211> 41

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> CD28 (LL至GG)

<400> 11

Arg Ser Lys Arg Ser Arg Gly Gly His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr

1 5 10 15

Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro

20 25 30

Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 12

<211> 42

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> 4-1BB (Q07011.1的氨基酸214-255)

<400> 12

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

1 5 10 15

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

20 25 30

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu

35 40

<210> 13

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> CD3 ζ

<400> 13

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 14

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> CD3 ζ

<400> 14

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 15

<211> 112

<212> PRT

<213> 智人 (Homo sapiens)

<220>

<223> CD3 ζ

<400> 15

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 16

<211> 335

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> tEGFR

<400> 16

Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu

1 5 10 15

Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile

20 25 30

Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe

35 40 45

Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr

50 55 60

Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn

65 70 75 80

Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg

85 90 95

Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile

100 105 110

Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val

115 120 125

Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp

130 135 140

Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn

145 150 155 160

Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu

165 170 175

Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser

180 185 190

Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu

195 200 205

Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln

210 215 220

Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly

225 230 235 240

Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro

245 250 255

His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr

260 265 270

Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His

275 280 285

Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro

290 295 300

Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly Ala

305 310 315 320

Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met

325 330 335

<210> 17

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> T2A

<400> 17

Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro

1 5 10 15

Gly Pro

<210> 18

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P2A

<400> 18

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 19

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> P2A

<400> 19

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 20

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> E2A

<400> 20

Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro

20

<210> 21

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> F2A

<400> 21

Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20

<210> 22

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<220>

<221> 重复序列

<222> (5)...(9)

<223> SGGGG重复5次

<400> 22

Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Pro

1 5 10

<210> 23

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 23

Gly Ser Ala Asp Asp Ala Lys Lys Asp Ala Ala Lys Lys Asp Gly Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 24

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 24

Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Lys Gly

<210> 25

<211> 735

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 编码scFv的序列

<400> 25

gacatccaga tgacccagac cacctccagc ctgagcgcca gcctgggcga ccgggtgacc 60

atcagctgcc gggccagcca ggacatcagc aagtacctga actggtatca gcagaagccc 120

gacggcaccg tcaagctgct gatctaccac accagccggc tgcacagcgg cgtgcccagc 180

cggtttagcg gcagcggctc cggcaccgac tacagcctga ccatctccaa cctggaacag 240

gaagatatcg ccacctactt ttgccagcag ggcaacacac tgccctacac ctttggcggc 300

ggaacaaagc tggaaatcac cggcagcacc tccggcagcg gcaagcctgg cagcggcgag 360

ggcagcacca agggcgaggt gaagctgcag gaaagcggcc ctggcctggt ggcccccagc 420

cagagcctga gcgtgacctg caccgtgagc ggcgtgagcc tgcccgacta cggcgtgagc 480

tggatccggc agccccccag gaagggcctg gaatggctgg gcgtgatctg gggcagcgag 540

accacctact acaacagcgc cctgaagagc cggctgacca tcatcaagga caacagcaag 600

agccaggtgt tcctgaagat gaacagcctg cagaccgacg acaccgccat ctactactgc 660

gccaagcact actactacgg cggcagctac gccatggact actggggcca gggcaccagc 720

gtgaccgtga gcagc 735

<210> 26

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<220>

<221> 变体

<222> (1)...(1)

<223> Xaa是甘氨酸、半胱氨酸或精氨酸

<220>

<221> 变体

<222> (4)...(4)

<223> Xaa是半胱氨酸或苏氨酸

<400> 26

Xaa Pro Pro Xaa Pro

1 5

<210> 27

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<400> 27

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 28

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<400> 28

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 29

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<400> 29

Glu Leu Lys Thr Pro Leu Gly Asp Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro

1 5 10 15

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu

20 25 30

Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro

35 40 45

Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

50 55 60

<210> 30

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<400> 30

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210> 31

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<400> 31

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 32

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<400> 32

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5

<210> 33

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<400> 33

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 34

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 铰链

<400> 34

Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 35

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR L1

<400> 35

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 36

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR L2

<400> 36

Ser Arg Leu His Ser Gly Val

1 5

<210> 37

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR L3

<400> 37

Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly

1 5

<210> 38

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR H1

<400> 38

Asp Tyr Gly Val Ser

1 5

<210> 39

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR H2

<400> 39

Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 40

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR H3

<400> 40

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly

1 5

<210> 41

<211> 120

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 41

Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr

20 25 30

Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys

50 55 60

Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 42

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL

<400> 42

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr

100 105

<210> 43

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv

<400> 43

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys

115 120 125

Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser

130 135 140

Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser

145 150 155 160

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile

165 170 175

Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn

195 200 205

Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr

210 215 220

Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 44

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR L1

<400> 44

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala

1 5 10

<210> 45

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR L2

<400> 45

Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser

1 5

<210> 46

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR L3

<400> 46

Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr

1 5

<210> 47

<211> 5

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR H1

<400> 47

Ser Tyr Trp Met Asn

1 5

<210> 48

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR H2

<400> 48

Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 49

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR H3

<400> 49

Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 50

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VH

<400> 50

Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 51

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VL

<400> 51

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser

65 70 75 80

Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 52

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 接头

<400> 52

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

<210> 53

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> scFv

<400> 53

Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Gln Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Lys Thr Ile Ser Ser Val Val Asp Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser

130 135 140

Pro Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Val Thr Cys

145 150 155 160

Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys

165 170 175

Pro Gly Gln Ser Pro Lys Pro Leu Ile Tyr Ser Ala Thr Tyr Arg Asn

180 185 190

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

195 200 205

Thr Leu Thr Ile Thr Asn Val Gln Ser Lys Asp Leu Ala Asp Tyr Phe

210 215 220

Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr Thr Ser Gly Gly Gly Thr Lys

225 230 235 240

Leu Glu Ile Lys Arg

245

<210> 54

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR H3

<400> 54

His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 55

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR L2

<400> 55

His Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 56

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CDR L3

<400> 56

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 57

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IGH 引物

<400> 57

acacggcctc gtgtattact gt 22

<210> 58

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> IGH 引物

<400> 58

acctgaggag acggtgacc 19

<210> 59

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变蛋白链霉亲和素 Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47

<400> 59

Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile

20 25 30

Gly Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

35 40 45

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

50 55 60

Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 60

<211> 119

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD3抗体OKT3的可变重链

<400> 60

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 61

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD3抗体OKT3的可变轻链

<400> 61

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn

100 105

<210> 62

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD28抗体CD28.3的可变重链

<400> 62

Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Arg

1 5 10 15

Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Ile Ile His

20 25 30

Trp Ile Lys Leu Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Phe

35 40 45

Tyr Pro Gly Ser Asn Asp Ile Gln Tyr Asn Ala Lys Phe Lys Gly Lys

50 55 60

Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr Met Glu Leu

65 70 75 80

Thr Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg

85 90 95

Asp Asp Phe Ser Gly Tyr Asp Ala Leu Pro Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Met Val Thr Val

115

<210> 63

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 抗CD28抗体CD28.3的可变轻链

<400> 63

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Asn Glu Asn Ile Tyr Ser Asn

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Thr His Leu Val Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Thr Ser Leu Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Gly Thr Pro Cys

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 64

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Twin-Strep-tag

<400> 64

Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25 30

<210> 65

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> GMCSFR α链信号序列

<400> 65

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 66

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> GMCSFR α链信号序列

<400> 66

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atccca 66

<210> 67

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> CD8 α链信号肽

<400> 67

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala

<210> 68

<211> 159

<212> PRT

<213> 阿维丁链霉菌 (Streptomyces avidinii)

<220>

<223> 阿维丁链霉菌 (UniProt No. P22629)

<400> 68

Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly

1 5 10 15

Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr

20 25 30

Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser Ala Val Gly

35 40 45

Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro

50 55 60

Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys

65 70 75 80

Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr

85 90 95

Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser

100 105 110

Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp

115 120 125

Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys

130 135 140

Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln

145 150 155

<210> 69

<211> 126

<212> PRT

<213> 阿维丁链霉菌 (Streptomyces avidinii)

<220>

<223> 最小链霉亲和素

<400> 69

Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe

1 5 10 15

Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu Ser

20 25 30

Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp

35 40 45

Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val

50 55 60

Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser

65 70 75 80

Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu

85 90 95

Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val

100 105 110

Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 70

<211> 4

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 链霉亲和素结合肽

<400> 70

His Pro Gln Phe

1

<210> 71

<211> 3

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 链霉亲和素结合肽

<220>

<221> 变体

<222> (3)...(3)

<223> Xaa选自Gln、Asp和Met

<400> 71

His Pro Xaa

1

<210> 72

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 链霉亲和素结合肽

<220>

<221> 变体

<222> (1)...(1)

<223> Xaa是Trp、Lys或Arg

<220>

<221> 变体

<222> (2)...(2)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (7)...(7)

<223> Xaa是Gly或Glu

<220>

<221> 变体

<222> (8)...(8)

<223> Xaa是Gly、Lys或Arg

<400> 72

Xaa Xaa His Pro Gln Phe Xaa Xaa

1 5

<210> 73

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 链霉亲和素结合肽

<220>

<221> 变体

<222> (2)...(2)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> 变体

<222> (7)...(7)

<223> Xaa是Gly或Glu

<220>

<221> 变体

<222> (8)...(8)

<223> Xaa是Gly、Lys或Arg

<400> 73

Trp Xaa His Pro Gln Phe Xaa Xaa

1 5

<210> 74

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 链霉亲和素结合肽, Strep-tag

<400> 74

Trp Arg His Pro Gln Phe Gly Gly

1 5

<210> 75

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 链霉亲和素结合肽, Strep-tag II

<400> 75

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

1 5

<210> 76

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 链霉亲和素结合肽的序列模块

<220>

<221> 变体

<222> (9)...(9)

<223> Xaa是任何氨基酸

<220>

<221> 重复序列

<222> (9)...(9)

<223> Xaa重复8或12次

<400> 76

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Xaa Trp Ser His Pro Gln Phe Glu

1 5 10 15

Lys

<210> 77

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 链霉亲和素结合肽的序列模块

<220>

<221> 重复序列

<222> (9)...(12)

<223> GlyGlyGlySer重复两次或三次

<400> 77

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro

1 5 10 15

Gln Phe Glu Lys

20

<210> 78

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Twin-Strep-tag

<400> 78

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25

<210> 79

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Twin-Strep-tag

<400> 79

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20

<210> 80

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Twin-Strep-tag

<400> 80

Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser

1 5 10 15

Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25

<210> 81

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Twin-Strep-tag

<400> 81

Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25 30

<210> 82

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Twin-Strep-tag

<400> 82

Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

20 25 30

<210> 83

<211> 159

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变蛋白链霉亲和素Val44-Thr45-Ala46-Arg47

<400> 83

Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly

1 5 10 15

Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr

20 25 30

Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr Ala Arg Gly

35 40 45

Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro

50 55 60

Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys

65 70 75 80

Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr

85 90 95

Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser

100 105 110

Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp

115 120 125

Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys

130 135 140

Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln

145 150 155

<210> 84

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变蛋白链霉亲和素Val44-Thr45-Ala46-Arg47

<400> 84

Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe

1 5 10 15

Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr

20 25 30

Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp

35 40 45

Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val

50 55 60

Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser

65 70 75 80

Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu

85 90 95

Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val

100 105 110

Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 85

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变蛋白链霉亲和素Val44-Thr45-Ala46-Arg47

<400> 85

Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val

20 25 30

Thr Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

35 40 45

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

50 55 60

Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 86

<211> 159

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变蛋白链霉亲和素Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47

<400> 86

Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly

1 5 10 15

Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr

20 25 30

Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile Gly Ala Arg Gly

35 40 45

Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro

50 55 60

Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys

65 70 75 80

Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr

85 90 95

Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser

100 105 110

Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val Gly His Asp

115 120 125

Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser Ile Asp Ala Ala Lys

130 135 140

Lys Ala Gly Val Asn Asn Gly Asn Pro Leu Asp Ala Val Gln Gln

145 150 155

<210> 87

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变蛋白链霉亲和素Ile44-Gly45-Ala-46-Arg47

<400> 87

Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe

1 5 10 15

Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Ile Gly

20 25 30

Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp

35 40 45

Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val

50 55 60

Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser

65 70 75 80

Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu

85 90 95

Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu Val

100 105 110

Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 88

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变蛋白链霉亲和素Val44-Thr45-Ala46-Arg47和

Glu117, Gly120, Try121 (突变蛋白m1-9)

<400> 88

Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe

1 5 10 15

Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr

20 25 30

Ala Arg Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp

35 40 45

Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val

50 55 60

Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser

65 70 75 80

Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu

85 90 95

Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Glu Asn Ala Gly Tyr Ser Thr Leu Val

100 105 110

Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

<210> 89

<211> 139

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 突变蛋白链霉亲和素Val44-Thr45-Ala46-Arg47和

Glu117, Gly120, Try121 (突变蛋白m1-9)

<400> 89

Asp Pro Ser Lys Asp Ser Lys Ala Gln Val Ser Ala Ala Glu Ala Gly

1 5 10 15

Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr Phe Ile Val Thr

20 25 30

Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Val Thr Ala Arg Gly

35 40 45

Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr Asp Ser Ala Pro

50 55 60

Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr Val Ala Trp Lys

65 70 75 80

Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp Ser Gly Gln Tyr

85 90 95

Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp Leu Leu Thr Ser

100 105 110

Gly Thr Thr Glu Glu Asn Ala Gly Tyr Ser Thr Leu Val Gly His Asp

115 120 125

Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

130 135

<210> 90

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 最小链霉亲和素

<400> 90

Met Glu Ala Gly Ile Thr Gly Thr Trp Tyr Asn Gln Leu Gly Ser Thr

1 5 10 15

Phe Ile Val Thr Ala Gly Ala Asp Gly Ala Leu Thr Gly Thr Tyr Glu

20 25 30

Ser Ala Val Gly Asn Ala Glu Ser Arg Tyr Val Leu Thr Gly Arg Tyr

35 40 45

Asp Ser Ala Pro Ala Thr Asp Gly Ser Gly Thr Ala Leu Gly Trp Thr

50 55 60

Val Ala Trp Lys Asn Asn Tyr Arg Asn Ala His Ser Ala Thr Thr Trp

65 70 75 80

Ser Gly Gln Tyr Val Gly Gly Ala Glu Ala Arg Ile Asn Thr Gln Trp

85 90 95

Leu Leu Thr Ser Gly Thr Thr Glu Ala Asn Ala Trp Lys Ser Thr Leu

100 105 110

Val Gly His Asp Thr Phe Thr Lys Val Lys Pro Ser Ala Ala Ser

115 120 125

Claims (118)

1.一种治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(r/r B细胞NHL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有B细胞NHL的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物包含表达所述CAR的CD4+T细胞和表达所述CAR的CD8+T细胞；

所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约100×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；

所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且

所述组合物中至少或至少约80％的CAR⁺T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。

2.一种治疗B细胞非霍奇金淋巴瘤(r/r B细胞NHL)的方法，所述方法包括向患有或怀疑患有B细胞NHL的受试者施用组合物，所述组合物包含表达靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的工程化T细胞，其中：

所述组合物包含表达所述CAR的CD4+T细胞和表达所述CAR的CD8+T细胞；

所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约100×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值；

所述组合物中至少或至少约80％的细胞是CD3⁺细胞；并且

所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺T细胞呈CD27⁺CCR7⁺和/或所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺T细胞呈CD27⁺CCR7⁺。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述组合物包含在约1:2.5与约2.5:1之间的比率下的表达所述CAR的CD4⁺T细胞和表达所述CAR的CD8⁺T细胞。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在约1:2与约2:1之间、在约1:1.5与约1.5:1之间或者为或为约1:1的比率下的表达所述CAR的CD4⁺T细胞和表达所述CAR的CD8⁺T细胞。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在约1:1与约2.5:1之间、在约1.5:1与约2:1之间、为或为约1.5:1或者为或为约2:1的比率下的表达所述CAR的CD4⁺T细胞和表达所述CAR的CD8⁺T细胞。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约50×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约25×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在为或约5×10⁶个与为或约10×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述组合物包含在为或约10×10⁶个与为或约25×10⁶个之间的CAR表达T细胞，包含端值。

10.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述组合物包含为或约5×10⁶个CAR表达T细胞。

11.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述组合物包含为或约10×10⁶个CAR表达T细胞。

12.根据权利要求1-7和9中任一项所述的方法，其中所述组合物包含为或约25×10⁶个CAR表达T细胞。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约90％的细胞是CD3⁺细胞。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约91％、至少或至少约92％、至少或至少约93％、至少或至少约94％、至少或至少约95％或者至少或至少约96％的细胞是CD3⁺细胞。

15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约5％与为或约30％之间的CAR⁺T细胞表达凋亡的标记物、任选膜联蛋白V或活性胱天蛋白酶3。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约10％与为或约15％之间的CAR⁺T细胞表达凋亡的标记物、任选膜联蛋白V或活性胱天蛋白酶3。

17.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约15％与为或约20％之间的CAR⁺T细胞表达凋亡的标记物、任选膜联蛋白V或活性胱天蛋白酶3。

18.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约20％与为或约25％之间的CAR⁺T细胞表达凋亡的标记物、任选膜联蛋白V或活性胱天蛋白酶3。

19.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约25％与为或约30％之间的CAR⁺T细胞表达凋亡的标记物、任选膜联蛋白V或活性胱天蛋白酶3。

20.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述组合物中为或约5％、为或约10％、为或约15％、为或约20％、为或约25％或者为或约30％的CAR⁺T细胞表达凋亡的标记物、任选膜联蛋白V或活性胱天蛋白酶3。

21.根据权利要求2-20中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CAR⁺T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约80％与为或约85％之间的CAR⁺T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。

23.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约85％与为或约90％之间的CAR⁺T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。

24.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约90％与为或约95％之间的CAR⁺T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。

25.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约95％与为或约99％之间的CAR⁺T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。

26.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述组合物中为或约85％、为或约90％、为或约95％或者为或约99％的CAR⁺T细胞属于幼稚样表型或中央记忆表型。

27.根据权利要求1和3-26中任一项所述的方法，其中所述组合物中属于幼稚样表型或中央记忆表型的所述至少或至少约80％的CAR⁺T细胞对在幼稚样或中央记忆T细胞上表达的标记物呈表面阳性。

28.根据权利要求27所述的方法，其中在幼稚样或中央记忆T细胞上表达的所述标记物选自CD45RA、CD27、CD28和CCR7。

29.根据权利要求1和3-28中任一项所述的方法，其中所述组合物中属于幼稚样或中央记忆表型的所述至少或至少约80％的CAR⁺T细胞具有选自CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺或CD62L^-CCR7⁺的表型。

30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述组合物中在为或约80％与为或约85％之间、在为或约85％与为或约90％之间、在为或约90％与为或约95％之间、在为或约95％与为或约99％之间的CAR⁺T细胞属于选自CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺或CD62L^-CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。

31.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述组合物中为或约80％、为或约85％、为或约90％、为或约95％或者为或约99％的CAR⁺T细胞属于选自CCR7⁺CD45RA⁺、CD27⁺CCR7⁺或CD62L^-CCR7⁺幼稚样表型或中央记忆表型。

32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述组合物中为或约80％、为或约85％、为或约90％、为或约95％或者为或约99％的CAR⁺T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。

33.根据权利要求1-32中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺T细胞属于呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样表型或中央记忆表型。

34.根据权利要求1-33中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约60％的CD4⁺CAR⁺T细胞属于呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样表型或中央记忆表型。

35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约70％的CD4⁺CAR⁺T细胞属于呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样表型或中央记忆表型。

36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CD4⁺CAR⁺T细胞属于呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样表型或中央记忆表型。

37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约85％的CD4⁺CAR⁺T细胞属于呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样表型或中央记忆表型。

38.根据权利要求1-37中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约50％的CD4⁺CAR⁺T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。

39.根据权利要求1-38中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约60％的CD4⁺CAR⁺T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。

40.根据权利要求1-39中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约70％的CD4⁺CAR⁺T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。

41.根据权利要求1-40中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CD4⁺CAR⁺T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。

42.根据权利要求1-41中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约85％的CD4⁺CAR⁺T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。

43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺T细胞属于呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样表型或中央记忆表型。

44.根据权利要求1-43中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约60％的CD8⁺CAR⁺T细胞属于呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样表型或中央记忆表型。

45.根据权利要求1-44中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约70％的CD8⁺CAR⁺T细胞属于呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样表型或中央记忆表型。

46.根据权利要求1-45中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CD8⁺CAR⁺T细胞属于呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样表型或中央记忆表型。

47.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约85％的CD8⁺CAR⁺T细胞属于呈CCR7⁺CD45RA⁺或CCR7⁺CD45RA^-的幼稚样表型或中央记忆表型。

48.根据权利要求1-47中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约50％的CD8⁺CAR⁺T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。

49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约60％的CD8⁺CAR⁺T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。

50.根据权利要求1-49中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约70％的CD8⁺CAR⁺T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。

51.根据权利要求1-50中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约80％的CD8⁺CAR⁺T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。

52.根据权利要求1-51中任一项所述的方法，其中所述组合物中至少或至少约85％的CD8⁺CAR⁺T细胞属于呈CD27⁺CCR7⁺的幼稚样表型或中央记忆表型。

53.根据权利要求1-52中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均为小于或小于约0.9。

54.根据权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均在为或约0.9与为或约0.8之间。

55.根据权利要求1-53中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均为小于或小于约0.8。

56.根据权利要求1-53和55中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均在为或约0.8与为或约0.7之间。

57.根据权利要求1-53和55中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均在为或约0.7与为或约0.6之间。

58.根据权利要求1-53和55中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均在为或约0.6与为或约0.5之间。

59.根据权利要求1-53和55中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)相比于总VCN的分数平均在为或约0.5与为或约0.4之间。

60.根据权利要求1-59中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)平均为在或在约0.4个拷贝/二倍体基因组与3.0个拷贝/二倍体基因组之间，包含端值。

61.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)平均为在或在约0.8个拷贝/二倍体基因组与2.0个拷贝/二倍体基因组之间，包含端值。

62.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)平均为在或在约0.8个拷贝/二倍体基因组与1.0个拷贝/二倍体基因组之间，包含端值。

63.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)平均为在或在约1.0个拷贝/二倍体基因组与1.5个拷贝/二倍体基因组之间，包含端值。

64.根据权利要求1-61中任一项所述的方法，其中所述组合物中CAR⁺T细胞中的整合载体拷贝数(iVCN)平均为在或在约1.5个拷贝/二倍体基因组与2.0个拷贝/二倍体基因组之间，包含端值。

65.根据权利要求1-64中任一项所述的方法，其中所述B细胞NHL选自：弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、任选DLBCL非特指型；转化的DLBCL、任选从滤泡性淋巴瘤或边缘区淋巴瘤转化的DLBCL；高级别B细胞淋巴瘤(HGBCL)、任选DLBCL组织学为携带MYC和BCL2和/或BCL6重排的HGBCL；原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)；以及滤泡性淋巴瘤(FL)、任选滤泡性淋巴瘤3b级别(FL3B)。

66.根据权利要求1-65中任一项所述的方法，其中在施用包含工程化T细胞的所述组合物时或紧接在施用包含工程化T细胞的所述组合物之前，所述受试者在用以下疗法治疗之后在缓解后复发，或者变得用以下疗法难以治疗：(i)针对所述B细胞NHL的两种或更多种先前疗法和/或(ii)自体干细胞移植(ASCT)疗法。

67.根据权利要求66所述的方法，其中针对所述B细胞NHL的两种或更多种先前疗法包括蒽环类药物和CD20靶向剂，任选地其中所述CD20靶向剂包括利妥昔单抗。

68.根据权利要求1-67中任一项所述的方法，其中所述受试者未接受过先前的CAR T细胞或基因修饰的T细胞疗法。

69.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，所述方法进一步包括从所述受试者获得白细胞单采术样品，以用于制造包含工程化T细胞的组合物。

70.根据权利要求1-69中任一项所述的方法，其中在所述施用之前，所述受试者已用淋巴细胞清除疗法进行了预调理。

71.根据权利要求1-69中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括紧接在施用包含工程化T细胞的所述组合物之前向所述受试者施用淋巴细胞清除疗法，其中所述淋巴细胞清除疗法包括施用氟达拉滨和/或环磷酰胺。

72.根据权利要求1-71中任一项所述的方法，其中包含工程化T细胞的所述组合物和/或所述淋巴细胞清除疗法的施用是经由门诊递送进行的。

73.根据权利要求70-72中任一项所述的方法，其中所述淋巴细胞清除疗法包括以30mg/m²受试者身体表面积每天施用氟达拉滨以及以300mg/m²受试者身体表面积每天施用环磷酰胺，每一种持续3天。

74.根据权利要求70-73中任一项所述的方法，其中包含工程化T细胞的所述组合物是在完成所述淋巴细胞清除疗法之后为或约48小时与为或约9天之间施用，包含端值。

75.根据权利要求1-74中任一项所述的方法，所述方法进一步包括向所述受试者施用用于治疗、预防、减轻或减弱神经毒性和/或细胞因子释放综合征或其风险的药剂或治疗方法。

76.根据权利要求75所述的方法，其中所述药剂是或包含抗IL-6抗体、抗IL-6受体抗体或类固醇。

77.根据权利要求75或权利要求76所述的方法，其中所述药剂是或包含托珠单抗或甲基泼尼松龙。

78.根据权利要求1-77中任一项所述的方法，其中所述T细胞对于所述受试者是自体的。

79.根据权利要求1-78中任一项所述的方法，其中：

至少35％、至少40％或至少50％的根据所述方法治疗的受试者实现完全反应(CR)；

至少60％、70％、80％、90％或95％的实现CR的受试者展现出持续大于或等于3个月或大于或等于6个月的CR；和/或

至少60％、70％、80％、90％或95％的截至一个月和/或截至3个月实现CR的受试者在实现所述CR后保持反应，保持CR和/或存活或无进展存活，持续大于或等于3个月和/或大于或等于6个月和/或大于或等于9个月；和/或

至少50％、至少60％或至少70％的根据所述方法治疗的受试者实现客观反应(OR)；

至少60％、70％、80％、90％或95％的实现OR的受试者展现出持续大于或等于3个月或大于或等于6个月的OR；和/或

至少35％、至少40％或至少50％的实现OR的受试者在实现所述OR后保持反应或存活，持续大于或等于3个月和/或大于或等于6个月。

80.根据权利要求1-79中任一项所述的方法，其中所述细胞对于所述受试者是自体的，并且

对于所述疗法的产生，不要求和/或指定单采术的最小绝对淋巴细胞计数(ALC)；和/或

所述细胞是通过如下过程产生，所述过程对于至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的患有所述B细胞NHL的受试者，能够生成用于根据所述方法施用的细胞产物。

81.根据权利要求1-80中任一项所述的方法，其中：

大于或大于约50％、约60％、约70％或约80％的根据所述方法治疗的受试者不展现3级或更高级别的细胞因子释放综合征(CRS)，和/或不展现3级或更高级别的神经毒性，和/或大于40％或50％或55％的根据所述方法治疗的受试者不展现任何神经毒性或CRS。

82.根据权利要求1-81中任一项所述的方法，其中：大于或大于约80％的根据所述方法治疗的受试者不展现3级或更高级别的细胞因子释放综合征(CRS)，和/或不展现3级或更高级别的神经毒性。

83.根据权利要求1-82中任一项所述的方法，其中大于95％的根据所述方法治疗的受试者不展现3级或更高级别的CRS。

84.根据权利要求1-83中任一项所述的方法，其中大于85％的根据所述方法治疗的受试者不展现3级或更高级别的神经毒性。

85.根据权利要求1-84中任一项所述的方法，其中：

大于或大于约30％、35％、40％或50％的根据所述方法治疗的受试者不展现任何级别的细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性；和/或

至少或至少约45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的根据所述方法治疗的受试者不展现开始所述给予后早于3天的CRS发作，和/或不展现开始所述给予后早于5天的神经毒性发作；和/或

在根据所述方法治疗的受试者中神经毒性的中值发作是在根据所述方法治疗的受试者的CRS的中值峰处或之后、或者到消退的中值时间之时或之后，和/或在根据所述方法治疗的受试者中神经毒性的中值发作大于或大于约8、9、10或11天。

86.根据权利要求1-85中任一项所述的方法，其中：

至少50％的根据所述方法治疗的受试者实现完全反应(CR)；

至少70％的根据所述方法治疗的受试者实现客观反应(OR)；并且

大于或大于约50％的根据所述方法治疗的受试者不展现任何级别的细胞因子释放综合征(CRS)或神经毒性；并且

大于或大于约80％的根据所述方法治疗的受试者不展现3级或更高级别的细胞因子释放综合征(CRS)，和/或不展现3级或更高级别的神经毒性。

87.根据权利要求1-86中任一项所述的方法，其中：

所述CAR包含对CD19具有特异性的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、源自共刺激分子任选4-1BB的胞质信号传导结构域以及源自含有ITAM的初级信号传导分子任选CD3ζ的胞质信号传导结构域；

所述CAR按顺序包含对CD19具有特异性的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、源自共刺激分子的胞质信号传导结构域、和源自含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域；或

所述CAR包含与CD19特异性结合的胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域，所述细胞内信号传导结构域包含CD3-zeta(CD3ζ)链和作为4-1BB的信号传导结构域的共刺激信号传导区。

88.根据权利要求1-87中任一项所述的方法，其中所述CAR包含对CD19具有特异性的胞外抗原结合结构域、跨膜结构域、源自作为4-1BB的共刺激分子的胞质信号传导结构域以及源自作为CD3ζ的含有ITAM的初级信号传导分子的胞质信号传导结构域。

89.根据权利要求87或权利要求88所述的方法，其中所述胞外抗原结合结构域是scFv。

90.根据权利要求89所述的方法，其中所述scFv包含RASQDISKYLN(SEQ ID NO:35)的氨基酸序列、SRLHSGV(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列、GNTLPYTFG(SEQ ID NO:37)的氨基酸序列、DYGVS(SEQ ID NO:38)的氨基酸序列、VIWGSETTYYNSALKS(SEQ ID NO:39)的氨基酸序列、YAMDYWG(SEQ ID NO:40)的氨基酸序列。

91.根据权利要求89或权利要求90所述的方法，其中所述scFv包含FMC63的可变重链区和FMC63的可变轻链区。

92.根据权利要求89-91中任一项所述的方法，其中所述scFv如SEQ ID NO:43所示。

93.根据权利要求87-92中任一项所述的方法，其中源自共刺激分子的所述胞质信号传导结构域是4-1BB的信号传导结构域，任选地其中源自共刺激分子的所述胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:12或与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的其变体。

94.根据权利要求87-93中任一项所述的方法，其中源自含有ITAM的初级信号传导分子的所述胞质信号传导结构域是CD3ζ信号传导结构域，任选地其中源自含有ITAM的初级信号传导分子的所述胞质信号传导结构域包含与其具有至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的SEQ ID NO:13、14或15。

95.根据权利要求87-94中任一项所述的方法，其中所述CAR进一步包含所述跨膜结构域与所述胞外抗原结合结构域之间的间隔子。

96.根据权利要求95所述的方法，其中所述间隔子是多肽间隔子，所述多肽间隔子包含以下或由以下组成：全部或部分免疫球蛋白铰链或其修饰形式，任选IgG4铰链或其修饰形式。

97.根据权利要求95或权利要求96所述的方法，其中所述间隔子的长度为或为约12个氨基酸。

98.根据权利要求96-97中任一项所述的方法，其中：

所述间隔子包含SEQ ID NO:1的序列或由SEQ ID NO:2编码的序列或者由SEQ ID NO:1的序列或由SEQ ID NO:2编码的序列组成。

99.根据权利要求95-98中任一项所述的方法，其中：

所述间隔子是多肽间隔子，所述多肽间隔子包含SEQ ID NO:1的序列；

源自共刺激分子的所述胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:12；

源自含有ITAM的初级信号传导分子的所述胞质信号传导结构域包含SEQ ID NO:13、14或15；并且

所述胞外抗原结合结构域包含scFv，所述scFv包含FMC63的可变重链区和FMC63的可变轻链区。

100.根据权利要求87-99中任一项所述的方法，其中所述跨膜结构域是来自CD28的跨膜结构域、任选如下跨膜结构域，其包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:8展现出至少或至少约85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多序列同一性的氨基酸序列。

101.根据权利要求96-100中任一项所述的方法，其中所述CAR按顺序从N末端至C末端含有：作为SEQ ID NO:43所示的scFv的胞外抗原结合结构域、SEQ ID NO:8所示的跨膜结构域、SEQ ID NO:12所示的4-1BB共刺激信号传导结构域以及SEQ ID NO:13所示的CD3-zeta(CD3ζ)链的信号传导结构域。

102.根据权利要求1-101中任一项所述的方法，其中包含工程化T细胞的所述组合物是通过制造过程产生的，所述制造过程包括：

(i)将包含原代T细胞的输入组合物、任选包含选自所述受试者的自体T细胞的输入组合物与包含含有多种链霉亲和素突变蛋白分子的寡聚颗粒试剂的刺激试剂暴露于用于刺激T细胞的条件下，从而生成刺激的群体，其中：

所述寡聚颗粒试剂包含含有抗CD3抗体或其抗原结合片段的第一药剂和含有抗CD28抗体或其抗原结合片段的第二药剂；

(ii)将编码靶向CD19的CAR的异源多核苷酸引入所述刺激的群体的T细胞中，从而生成转化细胞的群体；

(iii)将所述转化细胞的群体孵育长达96小时；以及

(iv)收获所述转化细胞的群体的T细胞，从而产生工程化细胞的组合物，其中所述收获在开始暴露于所述刺激试剂之后24小时与120小时之间的时间进行，包含端值。

103.根据权利要求102所述的方法，其中所述抗CD3抗体或抗原结合片段是Fab，并且所述抗CD28抗体或抗原结合片段是Fab。

104.根据权利要求102或权利要求103所述的方法，其中所述第一药剂和所述第二药剂各自包含链霉亲和素结合肽，所述链霉亲和素结合肽使所述第一药剂和所述第二药剂可逆地结合至寡聚颗粒试剂，任选地其中所述链霉亲和素结合肽包含SEQ ID NO:78-82中任一项所示的氨基酸序列。

105.根据权利要求102-104中任一项所述的方法，其中所述链霉亲和素突变蛋白分子是链霉亲和素突变蛋白的四聚体，其包含氨基酸残基Val44-Thr45-Ala46-Arg47或Ile44-Gly45-Ala46-Arg47，任选地其中所述链霉亲和素突变蛋白包含SEQ ID NO:69、84、87、88、90、85或59中任一项所示的序列。

106.根据权利要求102-105中任一项所述的方法，其中所述寡聚颗粒试剂包含在1,000个与5,000个之间的链霉亲和素突变蛋白四聚体，包含端值。

107.根据权利要求102-106中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括在收获所述细胞之前在所述孵育之后或期间添加生物素或生物素类似物。

108.根据权利要求102-107中任一项所述的方法，其中所述收获是在开始暴露于所述刺激试剂之后48小时与120小时之间进行。

109.根据权利要求102-108中任一项所述的方法，其中所述收获是在基因组中检测到整合的载体时但在达到每个二倍体基因组的稳定的整合载体拷贝数(iVCN)之前的时间进行。

110.根据权利要求102-109中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述收获时活细胞总数大于或大于约三倍的所述刺激的群体的总活细胞数之前的时间进行。

111.根据权利要求102-110中任一项所述的方法，其中所述收获是在所述收获时活细胞总数等于或等于约三倍、等于或等于约两倍的所述刺激的群体的总活细胞数或者等于或大约等于所述刺激的群体的总活细胞数时进行。

112.根据权利要求102-111中任一项所述的方法，其中所述收获是在CD27⁺CCR7⁺的百分比是在所述转化细胞的群体中总T细胞、所述转化细胞的群体中总CD3⁺T细胞、所述转化细胞的群体中总CD4⁺T细胞或所述转化细胞的群体中总CD8⁺T细胞或所述转化细胞的群体中其CAR表达细胞的大于或大于约50％时进行。

113.根据权利要求102-112中任一项所述的方法，其中所述收获是在CD45RA⁺CCR7⁺和CD45RA^-CCR7⁺细胞的百分比是在所述转化细胞的群体中总T细胞、所述转化细胞的群体中总CD3⁺T细胞、所述转化细胞的群体中总CD4⁺T细胞或所述转化细胞的群体中总CD8⁺T细胞或所述转化细胞的群体中其CAR表达细胞的大于或大于约60％时进行。

114.根据权利要求1-113中任一项所述的方法，其中所施用的组合物中的细胞是通过用于产生输出组合物的制造过程产生的，所述输出组合物(i)包含工程化CD4+T细胞和工程化CD8+T细胞并且(ii)展现出预先确定的特征的输出组合物的制造过程产生的，其中当在多名不同的单独受试者之中进行时，所述制造过程的迭代任选地从人生物样品产生多种所述输出组合物，其中所述多种输出组合物之中的所述输出组合物的预先确定的特征选自：

在所述多种所述输出组合物中的具有记忆表型的细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；

在所述多种所述输出组合物中的具有中央记忆表型的细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；

在所述多种所述输出组合物中的为CD27+、CD28+、CCR7+、CD45RA-、CD45RO+、CD62L+、CD3+、CD95+、颗粒酶B-和/或CD127+的细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；

在所述多种输出组合物中的呈CCR7+/CD45RA-或CCR7+/CD45RO+的细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；

在所述多种输出组合物中的所述工程化CD4+T细胞、任选地CAR+CD4+T细胞中的中央记忆CD4+T细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；

在所述多种输出组合物中的所述工程化CD8+T细胞、任选地CAR+CD8+T细胞中的中央记忆CD8+T细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间；和/或

在所述多种输出组合物中的所述工程化T细胞、任选地CAR+T细胞中的中央记忆T细胞，任选地CD4+中央记忆T细胞和CD8+中央记忆T细胞的平均百分比在约40％与约65％之间、在约40％与约45％之间、在约45％与约50％之间、在约50％与约55％之间、在约55％与约60％之间、或在约60％与约65％之间。

115.根据权利要求1-114中任一项所述的方法，其中所施用的组合物是通过用于产生输出组合物的制造过程产生的，所述输出组合物在至少约80％、约90％、约95％、约97％、约99％、约100％或100％的人生物样品中展现出预先确定的特征、任选在所述输出组合物中的阈值数量的表达CAR的细胞，其中所述制造过程是在多名不同的单独受试者之中进行的。

116.根据权利要求102-115中任一项所述的方法，其中包含基因工程化细胞的组合物不含有来自所述制造过程的残留珠。

117.根据权利要求1-116中任一项所述的方法，其中所述B细胞NHL是复发性和/或难治性B细胞非霍奇金淋巴瘤(B细胞NHL)。

118.一种制品，所述制品包含含有表达靶向CD19的嵌合抗原受体(CAR)的基因工程化细胞的组合物，以及用于按照根据权利要求1-117中任一项所述的方法施用所述细胞组合物的说明书。

Images