CN1133063A

CN1133063A - 编码结核分枝杆菌细胞吸收的dna分子

Info

Publication number: CN1133063A
Application number: CN94193768.2A
Authority: CN
Inventors: L·W·莱利
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1993-09-02
Filing date: 1994-09-01
Publication date: 1996-10-09
Also published as: WO1995006726A3; EP0724635A1; WO1995006726A2; BR9407527A; CA2170148A1; JPH09502095A

Abstract

本发明涉及赋予结核分枝杆菌进入哺乳动物细胞和在巨噬细胞内存活之能力的一种DNA分子。由该基因片段编码的蛋白质在防止结核分枝杆菌感染的疫苗中有用，而所产生的抗该蛋白质的抗体可用于被动免疫那些已被该微生物感染的生物体。这些蛋白质和抗体都可用于在组织或体液中检测结核分枝杆菌的诊断试验中。本发明的蛋白质可与各种其它的治疗物质相联，用于哺乳动物，特别是人类，使这些物质得以被细胞吸收。

Description

编码结核分枝杆菌细胞吸收的DNA分子

本发明的领域

本发明涉及编码结核分枝杆菌吸收的DNA分子及其在药品、疫苗和诊断试验中的用途。

发明背景

结核病是世界上死亡的首要原因，估计每年有九百万新的结核病例，有二百九十万死于该疾病。美国，从1985年起，结核病的稳定下降趋势出现逆转。这一问题是由结核分枝杆菌的抗药性菌株的增长趋势引起的。

最近结核病的突然蔓延与环境有关，在该环境中，大量感染HIV的病人密集居住(例如医院的AIDS病房、教养机构和招待所)。在这些蔓延中出现结核病传染给保健人员；18到50％的这类人员在其皮肤试验中显示出转化。见F.Laraque等“Tuberculosis in HIV-Infected Patients，”The AIDS Reader(September/October1992)，本文引用以供参考。

结核分枝杆菌感染后有两种基本的临床类型式。

在大多数情况下，被吞噬泡状巨噬细胞摄入的所吸入的结核杆菌直接被杀死或在称为结核的局部病灶进行有限度的细胞内生长。在儿童和免疫受损的个体中，很少发生形成小粟粒状(粟样)病灶或威胁生命的脑膜炎的早期血原性传播。更普遍的是，在感染后2到6周内，细胞介导的免疫形成，免疫淋巴细胞和激活的巨噬细胞浸入病灶，引起杀死大多数杆菌并消除该原始感染，通常感染的个体注意不到症状。对结核菌素纯化的蛋白质衍生物(“PPD”)的皮肤试验反应性和在某些病例中愈后的钙化病灶的X射线证据提供了感染的唯一证据。尽管如此，在一定的未知程度上，有潜伏的活结核分枝杆菌存留。

第二种类型是感染的进展或蔓延引起活动性疾病。被结核分枝杆菌感染的个体在10％的寿命中会有形成疾病的危险。在每种情况下，杆菌在肺内通过淋巴或血液从最初感染的部位扩散到身体的其它部位，肺的顶端和区域性淋巴结是好发部位。胸膜、淋巴、骨骼、生殖-泌尿系统、脑膜、腹膜或皮肤的肺外结核病占结核病人的大约15％。尽管许多杆菌被杀死，大部分浸入的吞噬细胞和肺实质细胞也死亡，产生特征性固态干酪样(类似干酪)坏死，其中杆菌可能存活但不活跃。如果保护性免疫反应占优势，病灶可能受抑制，尽管对肺或其它组织有一些残余的损伤。如果坏死反应扩展，进入到支气管、在肺内产生空腔，使大量杆菌随咳嗽扩散到体外。在最坏的情况下，也许是炎性细胞释放水解酶的结果，固态坏死可能液化产生供杆菌增殖的富裕培养基，也许每毫升达10⁹细胞。病理和发炎过程产生特征性虚弱，发热、胸疼、咳嗽、当血管受侵蚀时，出现血痰。

对致病力和发病机理的分子基础所知甚少。有建议建立认为无致病力的菌株的分子证据，鉴定和克隆针对病原体所推断的致病性基因，证实致病力可经那些必须的基因传递给无致病力的菌株。尽管存在结核分枝杆菌无致病力的菌株，但其突变特征是未知的，在现有技术中没有定义涉及结核病发病机理的单个基因。宿主细胞发病，细胞内存活、生长、扩散或组织趋向性的分子基础仍是未知的。在分子水平上没有鉴定一个现存药物的目标药，没有定义对任一药物产生抗性机制，在20年里没有鉴定用于药品开发的新分枝杆菌目标。

对于结核病有许多建议的治疗方案。由美国公共卫生服务社和美国胸科协会推荐的方案是用异烟肼、利福平和吡嗪酰胺组合治疗2个月，接着用异烟肼和利福平再治疗4个月。在HIV感染的病人中，异烟肼和利福平治疗再持续7个月。在完成这种称为短程化学疗法的治疗的病人中产生超过90％的治愈率。对存在多种药物抗性的结核病的治疗在起始方案中需要加入乙胺丁醇和/或链霉素，或者第二线药，如卡那霉素、氨基羟丁基卡那霉素A、缠霉素、乙硫异烟胺、环丝氨酸、PAS和氯苯吩嗪。也可使用新药，如ciprofloxacin和吡啶羧酸。对于被普通结核分枝杆菌感染并显示PPD阳性结果的病人，用异烟肼进行药物预防有大约90％能有效防止该疾病。结核病和这些治疗已在B.Bloom等的文章中进行了更详细的讨论(“Tuberculosis：Commentary on a Reemergent Killer”，Science，257：1055-64(1992)；“Control of Tuberculosis in the UnitedStates”，American Thoracic Society，146：1623-33(1992)；City Health Information，vol，11(1992)，本文引用以供参考)。

尽管对结核病的现用疗法具有相当高的成功水平，但仍然存在提高治疗该疾病的成功率的需要。而且考虑到对常规治疗方案具有抗性的结核分枝杆菌的水平逐渐增加，必须发展新的治疗类型。在美国和国外的结核病高发的地区，这类抗性菌株目前正逐渐增加。

本发明概述

本发明涉及赋予结核分枝杆菌进入哺乳动物细胞和在巨噬细胞内存活之能力的分离的DNA分子以及由该分离的DNA分子编码的一种分离的蛋白质或多肽。该分子可作为异源DNA插入表达载体中形成产生该蛋白质或多肽的重组DNA表达系统。同样地，通常插入表达载体中形成重组DNA表达系统的该异源性DNA可掺入细胞以达到这一目的。

本发明被分离的蛋白质或多肽可与可药用的载体结合以形成疫苗或单独使用，用于哺乳动物，特别是人类，以阻止被结核分枝杆菌感染。作为选择，本发明的蛋白质或多肽可用于诱生抗体或其结合部分。该抗体或其结合部分可单独使用或与一种可药用的载体结合来治疗已被结核分枝杆菌感染的哺乳动物，特别是人类，以诱导防止疾病发生的被动免疫。

本发明的蛋白质或多肽或产生的针对它们的抗体或其结合部分也可用于在组织或体液样品中检测结核分枝杆菌的方法中。当使用该蛋白质或多肽时，它们作为一种抗原来提供。使用显示样品中结核分枝杆菌存在的试验系统来检测与该抗原或该抗体的任何反应。作为选择可经过提供赋予结核分枝杆菌进入哺乳动物细胞和在巨噬细胞内存活之能力的基因的核苷酸序列或其片段作为核酸杂交试验或基因扩增检测程序(例如，使用聚合酶链式反应程序)中的探针在该样品中检测结核分枝杆菌。检测与探针发生的任何反应以便显示样品中结核分枝杆菌的存在。

本发明的蛋白质或多肽也可用于与治疗或检测结核分枝杆菌无关的目的。更确切地说，该蛋白质或多肽赋予结核分枝杆菌进入哺乳动物细胞之能力的特性可用于使该细胞吸收其它物质。可用一种包括用于被哺乳动物细胞吸收的物质和与该物质相联的本发明的蛋白质或多肽的产品来达到这一目的。

本发明的DNA分子的分离构成了这种细菌治疗和检测方面的明显进展。它还为防止结核分枝杆菌感染的疫苗和用于感染了结核分枝杆菌的患者被动免疫的药用试剂提供了基础。用于疫苗或用来产生药用试剂的蛋白质可使用重组DNA技术进行高水平的生产。

在诊断应用中，本发明的蛋白质或多肽以及针对它们的抗体和其结合部分使特定个体是否感染结核分枝杆菌的快速检测得以实现。而且该检测不需检查被试验的个体的抗体反应就能实现。

除了发展结核分枝杆菌的治疗和诊断工具外，本发明赋予该微生物进入哺乳动物细胞的能力在需要将物质导入细胞，特别是巨噬细胞的治疗处理中具有明显的用处。经过将本发明的蛋白质或多肽与药用试剂相联，可迅速将该试剂导入细胞中以进行治疗。细胞对这些产品吸收的增强可减少药物剂量，从而降低毒性和花费。例如，在常规癌症治疗中，由于需要施用较大剂量，药物的毒性是主要问题。本发明对降低这类高剂量水平具有潜力且能将相当或更高剂量的药物传递到细胞内。

而且，本发明的蛋白质或多肽与DNA片段的结合可用于与基因治疗方法结合。特别是本发明DNA分子编码的产物增加巨噬细胞吸收的能力提供了特异性地将基因传递给巨噬细胞的机会。这一系统不仅可用于诱导体液免疫而且诱导细胞介导的免疫。

附图的简要描述

图1A、1B和1C是用结核分技杆菌菌株感染的Hela细胞薄层切片电子显微照片，这些菌株包括H37Ra(ATCC25177)(图1A)和感染性重组菌株E.coli XL1-Blue(pZ×7)(图1B和1C)。围绕结核分枝杆菌生物体有一条电子透明圈(图1A中的箭头所示)。在图1A中细胞与结核分枝杆菌培养72小时，在图1B和1C中与XL1-Blue(pZX7)培养7.5小时。在图1C中可见多个生物体，表明细菌在吞噬小体内增殖。标示出的线段代表0.5μm。

图2显示了来自原始载体pZX7的单向缺失亚克隆(pZX7.3、pZX7.4、pZX7.5和pZX7.6)和Bam HI-Pst I(pZX7.1)、Pst I-HinD III(pZX7.2)和Bam HI-Eco RI(pZX7.7)亚克隆的构建黑色线段代表结核分枝杆菌DNA序列，白色线段代表pBluescript序列。将亚克隆载体转移进E.coli XL1-Blue，然后将这些转化的菌株与Hela细胞的单层细胞培养6小时。

图3A、3B和3C是人巨噬细胞与感染性重组E.coli克隆XL1-Blue(pZX7)接触3小时(图3A)和24小时(图3B)及细胞与非致病性E.coli XL1-Blue(pBluescript)接触24小时(图3C)的薄层切片电子显微照片的比较。细菌在巨噬细胞内区室化并被膜层包围(图3B)。巨噬细胞与XL1-Blue(pBluescript)接触24小时后用电子显微镜观察不到细菌。图中标示出的线段代表1μm。

图4显示了用丙酮沉淀的细菌细胞声处理物的可溶部分的SDS-聚丙爆酰胺凝胶电泳。在9％的凝胶(左)中分析多肽：分子大小标准品(泳道1)，具有在Bam HI-Eco RI pBluescript克隆位点之间含有无关的结核分较杆菌DNA片段的载体(pZN7)的E.coli XL1-Blue(泳道2)和XL1-Blue(pZX7)(泳道3)。在8％凝胶中分析(右侧)：含有将2碱基移码导入pZX7中Bam HI克隆位点上游12个碱基处的载体(pZX7.8)的和KL1-Blue(泳道1)和KL1-Blue(pZX7)(泳道2)。分子大小在最右侧显示。在XL1-Blue(pZX7)的可溶性蛋白质片段中我们检测到了52kD的多肽(如箭头所示)。含pZX7.8的XL1-Blue表达了大约50kD的蛋白质。52-kD蛋白质的表达常与Hela细胞与重组E.coli克隆的相互作用相联系。

本发明的详细描述

本发明涉及赋予结核分枝杆菌进入哺乳动物细胞和在巨噬细胞内存活之能力的分离的DNA分子。该DNA分子包含与如下SEQ ID NO：1相对应的核苷酸序列：GGATCGAATT GCTGGCCTTT GGCGGGCGAT TCGTGGAGAT CGCCCGTAGA AAGGTTCGCG

60GACGCCAAGG CCGCCGCAGA CCGCCATAAA CGTAGTTGAC CAGGTGGTCT TGACTGGGGC120CGGACACCGA CGTGAACGAG GCGACCCGAT CCGCGTTACA TCCACCTGAT TCCGGCAAAT180GTGAACGCCG ACATCAAGGC GACCACGGTG TTCGGCGGTA AGTATGTGTC GTTGACCACG240CCGAAAAACC CGACAAAGAG GCGGATAACG CCAAAAGACG TCATCGACGT ACGGTCGGTG300ACCACCGAGA TCAACACGTT GTTCCAGACG CTCACCTCGA TCGCCGAGAA GGTGGATCCG360GTCAAGCTGA ACCTGACCCT GAGCGCGGCC GCGGAGGCGT TGACCGGGCT GGGCGATAAG420TTCGGCGAGT CGATCGTCAA CGCCAACACC GTTCTGGATG ACCTCAATTC GCGGATGCCG480CAGTCGCGCC ACGACATTCA GCAATTGGCG GCTCTGGGCG ACGTCTACGC CGACGCGGCG540CCGGACCTGT TCGACTTTCT CGACAGTTCG GTGACCACCG CCCGCACCAT CAATGCCCAG600CAAGCGGAAC TGGATTCGGC GCTGTTGGCG GCGGCCGGGT TCGGCAACAC CACAGCCGAT660GTCTTCGACC GCGGCGGGCC GTATCTGCAG CGGGGGGTCG CCGACCTGGT CCCCACCGCC720ACCCTGCTCG ACACTTATAG CCCGGAACTG TTCTGCACGA TCCGCAACTT CTACGATGCC780GATCGACCTG ACCGCGGGGC TGCCGCATAG GCCCGGAGTG GTTCGCGATC GGCGAGGCGC840ACGTCAAAGT GATTCGCGCC CTTTTTCGCC CACCTGCCCG CCGCGGTGGA TGTGTCCACC900CGCCAGGCCG CCGAAGCCGA CCTGGCCGGC AAAGCCGCTC AATATCGTCC CGACGAGCTG960GCCCGCTACG CCCAGCGGGT CATGGACTGG CTACACCCCG ACGGCGACCT CACCGACACC1020GAACGCGCCC GCAAACGCGG CATCACCCTG AGCAACCAGC AATACGACGG CATGTCACGG1080CTAAGTGGCT ACCTGACCCC CCAAGCGCGG GCCACCTTTG AAGCCGTGCT AGCCAAACTG1140GCCGCCCCCG GCGCGACCAA CCCCGACGAC CACACCCCGG TCATCGACAC CACCCCCGAT1200GCGGCCGCCA TCGACCGCGA CACCCGCAGC CAAGCCCAAC GCAACCACGA CGGGCTGCTG1260GCCGGGCTGC GCGCGCTGAT CCGTCATCCT GCCATCTCGG CCCTCGGCGC CGCCAACTCC1320AGGTGCTGTG CGGTCCACGC CGAACGCATG CACGCGATCT CGAATTGGTT GGCACCGTAT1380TCGGGATGGA ACTGCTCGAT AGCGATGCCT GCTGCCGTTG CCGCGGCGTT GACATCGCGG1440ACGAACGCCT CGTGCTCGAG CACCCCGGCG ACACCGTACT GCGCCCACAG CGTCGAAGGC1500AGCCGCTGGC CGTCCGCGTC GACCAAGAGG AATTC1535

该DNA分子编码具有分子量的大约50到55千道尔顿，优选52千道尔顿的多肽。从相应于SEQ ID NO：1的核苷酸序列推断的氨基酸序列代表一种在其羧基末端具有一疏水区的高度亲水蛋白质。它可以是一种分泌型蛋白质，一种细胞质蛋白质或其羧基末端附着于生物体外膜的表面蛋白质。据信这种蛋白质或多肽具有与如下SEQ ID NO：2相应的推断的氨基酸顺序：Gly Ser Asn Cys Trp Pro Leu Ala Gly Asp Ser Trp Arg Ser Pro Val1 5 10 15Glu Arg Phe Ala Asp Ala Lys Ala Ala Ala Asp Arg His Lys Arg Ser

20 25 30Xaa Pro Gly Gly Leu Asp Trp Gly Arg Thr Pro Thr Xaa Thr Arg Arg

35 40 45Pro Asp Pro Arg Tyr Ile His Leu Ile Pro Ala Asn Val Asn Ala Asp

50 55 60Ile Lys Ala Thr Thr Val Phe Gly Gly Lys Tyr Val Ser Leu Thr Thr65 70 75 80Pro Lys Asn Pro Thr Lys Arg Arg Ile Thr Pro Lys Asp Val Ile Asp

85 90 95Val Arg Ser Val Thr Thr Glu Ile Asn Thr Leu Phe Gln Thr Leu Thr

100 105 110Ser Ile Ala Glu Lys Val Asp Pro Val Lys Leu Asn Leu Thr Leu Ser

115 120 125Ala Ala Ala Glu Ala Leu Thr Gly Leu Gly Asp Lys Phe Gly Glu Ser

130 135 140Ile Val Asn Ala Asn Thr Val Leu Asp Asp Leu Asn Ser Arg Met Pro145 150 155 160Gln Ser Arg His Asp Ile Gln Gln Leu Ala Ala Leu Gly Asp Val Tyr

165 170 175Ala Asp Ala Ala Pro Asp Leu Phe Asp Phe Leu Asp Ser Ser Val Thr

180 185 190Thr Ala Arg Thr Ile Asn Ala Gln Gln Ala Glu Leu Asp Ser Ala Leu

195 200 205Leu Ala Ala Ala Gly Phe Gly Asn Thr Thr Ala Asp Val Phe Asp Arg

210 215 220Gly Gly Pro Tyr Leu Gln Arg Gly Val Ala Asp Leu Val Pro Thr Ala225 230 235 240Thr Leu Leu Asp Thr Tyr Ser Pro Glu Leu Phe Cys Thr Ile Arg Asn

245 250 255Phe Tyr Asp Ala Asp Arg Pro Asp Arg Gly Ala Ala Ala Xaa Ala Arg

260 265 270Ser Gly Ser Arg Ser Ala Arg Arg Thr Ser Lys Xaa Phe Ala Pro Phe

275 280 285Phe Ala His Leu Pro Ala Ala Val Asp Val Ser Thr Arg Gln Ala Ala

290 295 300Glu Ala Asp Leu Ala Gly Lys Ala Ala Gln Tyr Arg Pro Asp Glu Leu305 310 315 320Ala Arg Tyr Ala Gln Arg Val Met Asp Trp Leu His Pro Asp Gly Asp

325 330 335Leu Thr Asp Thr Glu Arg Ala Arg Lys Arg Gly Ile Thr Leu Ser Asn

340 345 350Gln Gln Tyr Asp Gly Met Ser Arg Leu Ser Gly Tyr Leu Thr Pro Gln

355 360 365Ala Arg Ala Thr Phe Glu Ala Val Leu Ala Lys Leu Ala Ala Pro Gly

370 375 380Ala Thr Asn Pro Asp Asp His Thr Pro Val Ile Asp Thr Thr Pro Asp385 390 395 400Ala Ala Ala Ile Asp Arg Asp Thr Arg Ser Gln Ala Gln Arg Ash His

405 410 415Asp Gly Leu Leu Ala Gly Leu Arg Ala Leu Ile Arg His Pro Ala Ile

420 425 430Ser Ala Leu Gly Ala Ala Asn Ser Arg Cys Cys Ala Val His Ala Glu

435 440 445Arg Met His Ala Ile Ser Asn Trp Leu Ala Pro Tyr Ser Gly Trp Asn

450 455 460Cys Ser Ile Ala Met Pro Ala Ala Val Ala Ala Ala Leu Thr Ser Arg465 470 475 480Thr Asn Ala Ser Cys Ser Ser Thr Pro Ala Thr Pro Tyr Cys Ala His

485 490 495Ser Val Glu Gly Ser Arg Trp Pro Ser Ala Ser Thr Lys Arg Asn

500 505 510

在更前面的序列中，由Xaa表示终止密码子。优选使用重组DNA技术进行这种分离的蛋白质或多肽的生产。认为该蛋白质或多肽具有一个或多个赋予结核分枝杆菌进入哺乳动物细胞和在巨噬细胞内存活之能力的抗原决定簇。

本发明的蛋白质或多肽优选用常规技术以纯化的形式生产。典型地是，本发明的蛋白质分泌进重组E.coli的生长培养基中。为了分离该蛋白质，将携带重组质粒的E.coli宿主细胞繁殖，匀浆、并离心匀浆产物以去掉细菌碎片。然后对上清液进行相继的硫酸铵沉淀。以合适大小的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱对含本发明蛋白质的部分进行凝胶过滤以分离该蛋白质。如果必要，可进一步以HPLC纯化蛋白质部分。

使用常规重组DNA技术可在细胞中掺入赋予结核分枝杆菌进入哺乳动物细胞和在巨噬细胞内存活之能力的DNA分子。一般来说，它包含将DNA分子插入与该DNA分子异源的(即，一般不存在的)表达系统中。异源DNA分子以合适的取向和正确的阅读框插入表达系统或载体中。载体含有插入的编码蛋白质的序列转录和翻译必须的元件。

Cohen和Boyer的美国专利号4237224(本文引用以供参考)描述了使用限制性酶裂解和以DNA连接酶的连接以重组质粒形式生产表达系统。然后以转化的方法导入这些重组质粒并在含有生长于组织培养基的原核生物和真核细胞的单细胞培养物中复制。

也可将重组基因导入病毒，如牛痘病毒，可经过将质粒转染入用病毒感染的细胞中来生产重组病毒。

合适的载体包括(但不限于)下列病毒载体，如λ载体系统gtll，gt WES.tB，Charon4和质粒载体例如pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC184、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、pR290、pKC37、pKC101、SV40、pBluescript II SK+/-或KS+/-(见“StratageneCloning Systems”Catalog(1993)from Stratagene，LaJolla，Calif，本文引用以供参考)、pQE、pIH821、pGEX、pET系列(见F.W.Studier et al.，“Use of T7 RNA Polymerase toDirect Expression of Cloned Genes，”Gene ExpressionTechnology Vol.185(1990)，本文引用以供参考)及其任意衍生物。重组分子导入细胞可经过转化，特别是转导，接合，转移或电穿孔。使用本领域的标准克隆技术将DNA序列克隆进载体中，如Maniatis等所述(Maniatis et al.，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Springs Laboratory，Cold Springs Harbor，NewYork(1982)，本文引用以供参考。

可以使用各种宿主载体系统表达编码蛋白质的序列。首先，载体系统必须与所用的宿主细胞是相容的。宿主载体系统包括但不限于下列系统：用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌；微生物，如含酵母载体的酵母；用病毒(例如牛痘病毒、腺病毒等)感染的哺乳动物细胞系统；用病毒(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统。这些载体的表达元件在其强度和特异性上有所不同。根据所用的宿主一载体系统，可使用许多合适的转录和翻译元件中的任意一种。

不同的遗传信号和加工过程控制基因表达的许多水平(例如，DNA的转录和信使RNA(mRNA)的翻译。

DNA的转录取决于启动子的存在，启动子是一段DNA序列，它指导RNA聚合酶的结合，从而启动mRNA的合成。真核启动子的DNA序列与原核启动子的不同。而且，真核启动子和伴随的遗传信号在原核系统中可能不被识别或不发挥功能，另外，原核启动子在真核细胞中也不被识别且不发挥功能。

同样，原核生物中mRNA的翻译取决于区别于真核生物的合适的原核信号的存在。在原核生物中mRNA的有效翻译需要mRNA上称为Shine-Dalgarno(SD)序列的核糖体结合位点。该序列是一段mRNA的短核苷酸序列，位于起始密码子前，该起始密码子通常是AUG编码蛋白质的氨基末端甲硫氨酸。SD序列与16srRNA(核糖体RNA)的3′端互补并很可能启动mRNA经过与rRNA形成双螺旋来与核糖体结合以使核糖体能正确定位。关于充分增强基因表达的描述，见Roberts andLauer，Methods in Enzymology，68：473(1979)，本文引用以供参考。

启动子的“强度”(即它们启动转录的能力)各有不同。为了表达克隆的基因，需要使用强启动子以获得高水平的转录，从而获得高水平的基因表达。根据使用的宿主细胞系统，可使用许多合适的启动子中的任意一个。例如，当在E.coli其噬菌体或质粒中克隆时，为了指导启动子相邻DNA片段的高水平转录，可使用的启动子(例如T7噬菌体启动子、lac启动子、trp启动子、recA启动子、核糖体RNA启动子、大肠杆菌噬菌体入的P_R和P_L启动子和其它启动子)包括但不限于lacUV5、ompF、bla、lpp和类似物。另外，可使用以重组DNA或其它合成的DNA技术生产的杂种trp-lacUV5(tac)启动子或其它E.coli启动子使插入的基因转录。

可选择的细菌宿主细胞菌株和表达载体抑制启动子的行为，除非它被特异性地诱导。在某些操纵子中，加入特异性诱导剂对插入DNA的有效转录是必须的。例如，lac操纵子经过加入乳糖或IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)来诱导。各种其它的操纵子，如trp、pro等受不同的控制。

在原核细胞中，有效的基因转录和翻译还需要特异性的起始信号。如分别对基因特异性mRNA和合成的蛋白质进行定量检测所示，这些转录和翻译起始信号的强度有所不同。含一个启动子的DNA表达载体也可含有各种“强”转录和/或翻译起始信号的任意组合。例如，在E.coli中的有效翻译需要一个距起始密码子(ATG)5′端大约7-9个碱基的Shine-Delgarno(SD)序列以提供核糖体结合位点。因此，可使用任意能被宿主细胞核糖体利用的SD-ATG组合。这类组合包括但不限于cro基因或大肠杆菌噬菌体λN基因或E.coli色氨酸E.D.C.B或A基因的SD-ATG组合。另外，可使用经过与合成核苷酸掺入有关的重组DNA或其它技术生产的任意SD-ATG组合。

一旦将赋予结核分枝杆菌进入哺乳动物细胞和在巨噬细胞内存活之能力的分离的DNA分子克隆进表达系统中，就可准备将它掺入宿主细胞中。根据载体/宿主细胞系统的不同，可用上面提到的各种转化形式完成这种掺入。合适的宿主细胞包括，但不限于细菌、病毒、酵母、哺乳动物细胞和类似物。

一般来说，人免疫系统经过产生与细菌表面特异性蛋白质或碳水化合物结合的抗体来对病原体细菌的感染作出应答。抗体刺激与巨噬细胞的结合，巨噬细胞具有与抗体Fc区域结合的受体。称为补体的其它血清蛋白质覆盖外源颗粒并经过结合到巨噬细胞的特异性表面受体上刺激其摄入。一旦颗粒结合到巨噬细胞的表面，经过质膜片段连续地对合到颗粒表面而开始随后的摄入过程。然后膜表面受体与均匀分布于颗粒表面的配体相互作用将两表面连接起来然后巨噬细胞包被的颗粒传递给溶酶体，颗粒被摄入溶酶体。

有些生物体被巨噬细胞摄入(即进行吸收)但不被杀死。其中有结核分枝杆菌。因此，这种生物体能在巨噬细胞内无限期存活，当它们脱离巨噬细胞时，引起结核病的发作。

由于本发明确定了赋予结核分枝杆菌进入哺乳动物细胞和在巨噬细胞内存活的能力的核苷酸序列，因而提出了将结核分枝杆菌吸收的分子基础。使用这一信息和上述重组DNA技术，可形成广泛的一系列分别用于治疗和检测结核分枝杆菌的治疗和/或预防试剂和诊断程序。

例如，有效量的本发明的蛋白质或多肽可单独或与可药用的载体结合作为一种疫苗用于人类以防止结核分枝杆菌的感染。作为选择，可给感染结核分枝杆菌的病人施用有效量的抗该蛋白质或多肽的抗体或其结合部分作为被动免疫。这种抗体或其结合部分单独或与可药用的载体结合使用以对最近感染结核分枝杆菌的病人产生短期的治疗效果。

适用于诱导被动免疫的抗体可以是单克隆的或多克隆的。

单克隆抗体的生产可用本领域熟知的技术来实现。基本上，该过程涉及首先从用感兴趣的抗原(即：本发明的蛋白质或多肽)预先经体内或体外免疫的哺乳动物(例如，小鼠)脾中获得免疫细胞(淋巴细胞)。然后分泌抗体的淋巴细胞与能在细胞培养中无限繁殖的(小鼠)骨髓瘤细胞或转化的细胞融合以产生一种永生的分泌免疫球蛋白的细胞系。培养所得的融合细胞或杂交瘤，筛选所得的集落以进行所需的单克隆抗体的生产。克隆产生这种抗体的集落并在体内或体外生长以产生大量的抗体。融合这类细胞的理论基础和操作方法的描述在Kohler and Milstein，Nature256：495(1975)中阐述，本文引用以供参考。

经过用本发明的蛋白质或多肽免疫动物(例如，小鼠)来免疫哺乳动物淋巴细胞。如果必要以高达几周的时间间隔重复这种免疫以获得足够滴度的抗体。病毒用合适的溶液或佐剂作载体。在最后一次抗原加强免疫后，处死动物并取出脾细胞。

以标准和熟知的技术实现与哺乳动物骨髓瘤细胞或其它能在细胞培养基中无限繁殖的融合配偶体的融合，例如，使用聚乙二醇(PEG)或其它融合试剂(见Milstein and Kohler，Eur.J.Immunol.6：511(1976)，本文引用以供参考)。这种永生细胞系优选来自鼠类，但也可来自其他哺乳动物种类的细胞，包括但不限于来自大鼠和人类，该细胞系的选择应是利用某种营养成份所必须的酶的缺陷型，能迅速生长并具有较好的融合能力。许多这种细胞系是本领域的技术人员已知的，其它的细胞系已有系统的描述。

生产多克隆抗体的程序也是熟知的。典型的是，经过给首先抽血以获得免疫前血清的新西兰白兔皮下施用本发明的蛋白质或多肽来生产这类抗体。在6个不同的位点以每位点100μl的总体积注射该抗原。每次注射的物质中含有包含SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后的蛋白质或多肽的合成表面活性佐剂普鲁龙尼克多元醇类或粉碎的丙烯酰胺凝胶。然后在首次注射2周后给兔抽血并每隔6周用相同抗原周期性的加强免疫3次。然后收集每次加强免疫10天后的血清样品。使用捕捉抗体的相应的抗原经亲和色谱从血清中回收多克隆抗体。最后，兔用150mg/kgIV的戊巴比妥安乐死。生产多克隆抗体的这种和其它方法在E.Harlow，et al.，editors，Antibodies：A LaboratoryManual(1988)中公开，本文引用以供参考。

本发明的疫苗和被动免疫试剂的使用可经过口服、肠胃外途径、例如：皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、经鼻内滴入，或经粘膜施用如鼻、咽喉和支气管的施用。它们可单独施用或与合适的药用载体施用，也可以是固体或液体形式，例如：片剂、胶囊、粉末、溶液、悬液或乳剂。

固体单位剂量形式可以是常规类型。固体形式可以是胶囊，例如含本发明的蛋白质或多肽或本发明的抗体或其结合部分和一种载体(例如：润滑剂和情性填充剂(如乳糖、蔗糖、或玉米淀粉)。在另一实施方案中，这些化合物是用常规片剂基质(如乳糖、蔗糖、或玉米淀粉)与结合剂(如阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶)、分散剂(如玉米淀粉、土豆淀粉或藻酸)和一种润滑剂(如硬脂酸或硬脂酸镁)结合形成的片制。

本发明的蛋白质或多肽或本发明的抗体或其结合部分也可以是这些物质在含药用载体的生理可接受稀释剂中的溶液或悬液以可注射的剂量施用。这些载体包括无菌液体，如水和油，加入或不加表面活性剂和其它可药用的佐剂。油的例子是石油、动物油、植物油或合成来源的油，例如：花生油、大豆油或矿物油。一般来说，水、盐水、葡萄糖水溶液或有关糖溶液和乙二醇(如丙二醇聚乙二醇)是优选的液体载体，特别对可注射的溶液而言。

为用作喷雾剂，本发明的蛋白质或多肽或本发明的抗体或其结合部分的溶液或悬液可与合适的推进剂(例如：诸如丙烷、丁烷或异丁烷的碳氢化合物推进剂)和常规佐剂一起包装进增压喷雾剂容器中。本发明的物质也可以非增压形式(如在雾化器或喷雾器)中用药。

在本发明的另一方面中，本发明的蛋白质或多肽可在体液结核分枝杆菌检测的诊断试验中用作抗原。作为选择，该杆菌的检测可用使用以该抗原产生的抗体或其结合部分的诊断试验来实现。该技术可检测下列组织或体液中的结核分枝杆菌：血液、脊髓液、痰、胸膜液、尿、支气管肺泡灌洗液、淋巴结、骨髓、或其它活体组织检查物。

在一个实施方案中，测定系统有夹心式或竞争式。合适的测定例子包括酶联免疫吸附测定、放射免疫测定、凝胶扩散沉淀素反应测定、免疫扩散测定、凝集试验、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定、或免疫电泳测定。

在本发明作为选择的诊断实施例中，赋予结核分枝杆菌进入哺乳动物细胞和在巨噬细胞内存活之能力的分离的DNA分子的核苷酸序列可用作检测各种病人体液中结核分枝杆菌的核酸杂交试验中的探针。本发明的核苷酸序列可用于本领域已知的任一核酸杂交试验系统，包括但不限于Southern印迹(Southern，J.Mol.Biol.98：508(1975)；Northern印迹(Thomas et al.，Pro Nat′l Acad SciUSA77：5201-05(1980))；菌落印迹(Grunstein et al.，Proc Nat′l Acad Sci USA，72：3961-65(1975)，本文引用以供参考)。作为选择，本发明分离的DNA分子可用于基因扩增检测方法(例如，聚合酶链反应)。见H.A.Erlich et al.，“RecentAdvances in the Polymerase Chain Reaction”Science252：1643-51(1991)，本文引用以供参考。

总的说来用结核分枝杆菌获得的吸收现象的分子基础可用于影响哺乳动物细胞对其它物质的吸收。这经过使用本发明的蛋白质或多肽与该物质相联以被哺乳动物细胞吸收来实现。利用这种现象可将广泛的各种各样的物质导入该细胞，这些物质包括抗生素、DNA片段、抗肿瘤试剂和其混合物。

抗生素直接进入细胞的可能性构成了一种巨大的进步，因为它们可杀死细胞内的结核分枝杆菌。实现这种吸收的一种手段是经过用抗生素浸渗微球体，然后用本发明的蛋白质或多肽包裹微球体以实现这种吸收。作为选择，这种治疗可与本发明的蛋白质或多肽经化学连接以代替使用微球体来运输抗体。

这一技术可用于治疗由细胞内病原体引起的大范围的一系列疾病。为了治疗结核病，可将本身具有较弱的细胞穿透力但在体外试验中具有较高抗细胞外结核分枝杆菌活性的各种抗生素与本发明的蛋白质或多肽结合使用。在癌症治疗中，抗肿瘤试剂的细胞内传递可经过将该试剂与本发明的蛋白质或多肽连接来大幅度增强。这将可降低该试剂的剂量和其引起的毒性。

本发明的另一方面是将本发明的蛋白质或多肽用于基因治疗或遗传性疫苗，其中治疗上或预防上有用的DNA片段可经连接臂在其胸腺嘧啶残基上与本发明的蛋白质或多肽连接。因此，可将遗传物质导入细胞以校正遗传缺陷或产生所需特征或用作免疫原的产品。

实施例实施例1 Hela细胞感染克隆的制备和筛选

为了鉴定编码进入哺乳动物细胞的结核分枝杆菌DNA序列，重组的感染性克隆的构建如下：用限制性酶Sau3 A1和Eco RI消化结核分枝杆菌H37Ra菌株(ATCC25177)基因组，将该DNA片段连接进噬菌粒载体pBluescript II(Stratagene，La Jolla，CA)的Bam HI-Eco RI限制性位点。经电穿孔将重组载体导入E.coli EL1-Blue(Stratagene)。经过与R.R.Isberg和S.Falkow(Nature317，262(1987))，本文引用以供参考)所述相似的方法筛选重组菌株以得到Hela细胞感染性克隆。

经过与Hela细胞一致相关的筛选程序发现了一个E.coli转化子XL1-Blue(pZX7)，它含有质粒pZX7，该质粒在pBluescript载体的Bam HI-Eco RI限制性酶位点含一个1535碱基的插入片段。经过透射电子显微镜证实该克隆进入Hela细胞(图1)。图1A显示了结核分枝杆菌菌株H37Ra菌株(ATCC25177)感染的Hela细胞，而感染性重组菌株E.coli XL1-Blue(pZX7)如图1B和1C所示。在图1A中细胞与结核分枝杆菌菌株培养72小时，在图1B和图1C中与XL1-Blue(pZX7)培养7.5小时。该克隆被Hela细胞吸收的过程具有时间依赖性(图1B)，在感染后3.5小时就能看见细胞内的生物体。一些吞噬小体含多个生物体(图1C)，表明该细菌在细胞内繁殖。一些吞入的杆菌被一层明显的ETZ包围，与Hela细胞内包围结核分枝杆菌的透明环的外观相似(图1A，如箭头所示)。这一环是代表在其它病原体细胞内分枝杆菌生物体周围常见的ETZ(见P.Draperand R.J.W.Rees Nature228，860(1970)；N.Rastogi ResMicrobiol.141，217(1990)；T.Yamatoto，M.Nishimura N.Harada，T.Imaede，Int.J.Leper.26，111(1958)，本文引用以供参考)还是样品的一种假象尚不清楚。

含载体pBluescript或另一来自pBluescript重组载体(pZN7)的非病原性E.coli XL1-Blue菌株在7.5小时后显示与Hela细胞不相关。

为了证实感染性表型确实由克隆的结核分枝杆菌DNA片段编码，我们用pZX7转化了其它非病原性E.coli菌株，特别是HB101、HD5α和NM522。构建体HB101(pZX7)，DH5α(pZX7)和NM522(pZX7)对Hela细胞具有感染性。延长贮存期的XL1-Blue(pZX7)中pZX7)的自发丢失与感染性表型的丧失相关。

pZX7的4种核酸外切酶III单向缺失的亚克隆和亚克隆BamHI-PstI(pZX7.1)，Pst-I-HinD III(pZX7.2)和Bam HI-Eco RI(pZX7.7)用于与Hela细胞相联系。根据厂商说明书使用核酸外切酶IV(Erase-a-Base System，Promega，Madison，WI)生产pZX7的单向缺失亚克隆。用HinD III和KpnI限制性酶共同消化质粒pZX7，在Bam HI-EcoRI DNA插入片段的EcoRI位点下游产生一个相邻于插入片段的5′突出端和相邻于插入片段的4碱基3′突出端及另一链的4碱基3′突出以保护插入片段免受ExoIII消化。消化的质粒与300U的ExoIII在37℃混合，每隔30秒将2.5μlExoIII消化的等分试样转移入含S1核酸酶的管中以去掉残余的单链尾。经中和并在70℃加热10分钟灭活S1核酸酶。加入Klenow DNA聚合酶以产生平末端，该平端被连接以环化含有缺失的载体。然后经电穿孔将连接混合物用于转化感受态E.coli XL1-Blue菌株。这些转化的菌株与单层Hela细胞培养6小时。

该方法的结果如图2所示。黑色线段代表结核分枝杆菌DNA序列，白色线段代表pBluescript序列。如图所示，含pZX7.3、pZX7.4或pZX7.5的E.coli XL1-Blue菌株与Hela细胞的相关方式与E.coliZL1-Blue(pZX7)相似，而其它亚克隆不相关。实施例2 人巨噬细胞的感染

在聚苯乙烯孔底的盖玻片上形成用实施例1的E.coli重组克隆感染的巨噬细胞单层。每个巨噬细胞用大约10个生长过夜的细菌首先感染1或2小时，接着用磷酸盐缓冲液(pH7.4)洗涤并再培养1、6或22小时。在含2％AB的热灭活人血清及含庆大霉素(10μg/ml)的RP4I-1640培养基(Gibco)中于37℃进行培养。包含的庆大霉素杀死细胞外细菌。再次洗涤巨噬细胞单层，然后用灭菌的蒸馏水溶解。将溶胞产物涂布于胰蛋白大豆琼脂培养基上以获得菌落数。为进行显微镜检，用100％甲醇固定巨噬细胞单层，用10％Giemsa染液染色，以光学显微镜检查或加工以备电子显微镜检。

感染1小时的单层在洗涤、固定和染色后仅用光学显微镜立即进行了检查。巨噬细胞溶胞培养和光学显微镜检结果如下文表1所示。经过计数或以盖玻片单层上每100到200个巨噬细胞中感染的巨噬细胞数来计算感染的巨噬细胞百分数。驿于每个时间点，每个E.coli菌株试验4到6次，以学生T检验比较E.coli重组克隆和对照菌株XL1-Blue(pBluescript)和XL1-Blue(pZX7.3)感染的细胞百分数的平均值。

图3显示了被感染性重组E.coli克隆XL1-Blue(pZX7)感染3小时(图3A)和24小时(图3B)的人巨噬细胞薄切片，电子显微镜照片。图3C中，薄切片显微照片是非致病性E.coli XL1-Blue(pBluescript)感染24小时的人巨噬细胞照片。24小时后，细胞内的杆菌数目更大，且区室化，被很可能是宿主来源的多层膜包围(图3B)。用E.coli(pBluescript)感染24小时后的巨噬细胞内看不到细菌(图3C)。

表1显示了用Hela细胞感染性E.coli XL1-Blue(pZX7)、亚克隆XL1-Blue(pZX7.3)和非感染性XL1-Blue(p.Bluescript)感染的人巨噬细胞单层光学镜检和培养试验获得的结果。测定每毫升细胞培养溶胞产物中的菌落形成单位(CFU)。如表中所示，感染1小时后，重组克隆感染的细胞百分数(82±8％)比XL1-Blue(pBluescript)感染的细胞百分数多5倍(15±6％，p＜0.001)。

表1

感染的细胞百分数每毫升溶胞产物培养物

(平均值±SEM) 的CFU(平均值±SEM)感染(小时)pBluescript pZX7.3 pZX7 pBluescript pZX71 15±6 59±10^** 82±8^**** ND^***** ND3 9±4 ND 55±17 1800±500 3500±17008 4±2 ND 35±5 10±5 1600±40024 12±10 23±8^* 60±13^*** 3±1 1300±200^* p＞0.05，与pBluescript克隆比较。0.001，与pBluescript

或pZX7.3克隆比较。0.05，与pZX7.3比较。^** p＜0.001，与pBluescript克隆比较。^*** p＜0.001，与pBluescript或pZX7.3克隆比较。^**** p＜0.0001，与pBluescript克隆比较，p＜0.05与pZX7.3克

隆比较^**** ND指未检测。

这一观察表明：克隆的结核分枝杆菌DNA序列有利于以高于巨噬细胞背景吞噬活性的量进行细菌吸收。感染24小时后，接触XL1-Blue p Bluescript的巨噬细胞的12％(±10％)和接触XL1-Blue(pZX7)的细胞的60％(±13％)被感染(p＜0.001)。如表1所示，感染24小时的巨噬细胞溶胞产物的培养表明细胞内E.coli XL1-Blue(pZX7)菌株是活的。

比较表1中XL1-Blue(pZX7)，XL1-Blue(pBluescript)和一种Hela细胞感染性缺失衍生物E.coli XL1-Blue(pZX7.3)在1小时的感染中感染巨噬细胞的能力，E.coli XL1-Blue(pZX7.3)的感染能力是XL1-Blue(pBluescript)的4倍(p＜0.001)，但至24小时时区别不再明显。因此，与Hela细胞感染相关的DNA序列对巨噬细胞吸收的增强负责。使在巨噬细胞内存活的序列位于哺乳动物细胞进入所所需的序列下游。实施例3 同源性分析

以F.Sanger等(“DNA Seguencing with Chain-Terminating Inhibitors”，Proc Nat.Acad.Sci.，74：5463-67，本文引用以供参考)描述的链终止法测序Bam Hi-Eco Ri DNA片段，发现有1535个碱基对[欧洲分子生物学实验室(EMBL)保藏号×70901]。该序列与GenBank(R72.0)数据库或EMBL(R31.0)中的任意DNA序列无同源性。没有明显的原核启动子一致序列被识别。如果我们假定结核分枝杆菌使用普通原核终止密码子序列，可鉴定氨基酸序列的同源性。发现靠近一个潜在的开放阅读框推断序列NH₂末端的区域具有(i)与internalin(Listeria monocytogenes)编码的与哺乳动物细胞进入相关的一种蛋白质。A.B.Hartman，M.Venkatesan，E.V.Oaks，J.M.Buysse，J.Bacteriol，172，1905(1990)，本文引用以供参考)的80残基NH₂一端区域有27％的相同性；(ii)与Shigella感染性质粒IpaH基因产物的145残基区有20％的相同性(B.E.Anderson，G.A.McDonald，D.C.Jones，R.L.Regnery，Infect，Tmmun.58，2760(1990)，本文引用以供参考)；(iii)与人β-adaptin(一种质膜蛋白质、将clathrin连接到衣被小囊的受体上，引起受体介导的内吞作用，S.Ponnambalam，M.S.Robinson，A.P.Jackson，L.Peiper，P.Parham，J.Biol.Chem.265，4814(1990)和J.L.Goldstein，M.S.Brown，R.G.W.Anderson，D.W.Russell，W.J.Schneider，Annu.Rev.Cell Biol.1，1(1985)，本文引用以供参考)的176残基区具有18％的相同性。当与Yersinia pseudotuberculosis的侵入蛋白质进行序列对比时，细胞进入相关性区域与靠近侵入COOH端的100残基区(R.R.Isberg，D.L.Voorhis，S.Falkow，Cell50，769(1987)，本文引用以供参考)具有19％的相同性。这些序列排列的功能性意义尚不清楚。实施例4 52kD多肽的功能分析

以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析的蛋白质部分制备如下：离心收获在含氨苄青霉素(100μg/ml)的胰蛋白大豆培养基中生长过夜(调到在550nm处的光密度为600)的5ml细菌等分试样。然后在1.5ml含5mMMgCl₂的10mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)中声处理细菌沉淀。在微量离心机(Eppendorf model5415C)上以12,000rpm4℃离心声处理物25分钟。将丙酮加入新的微量离心管的600μl上清液中(60％v/v)，混合物在4℃下以14000rpm离心25分钟。将沉淀重悬于20μl蒸馏水和20μlLaemmli′s煮沸的缓冲液中，加热至水沸腾5分钟并以SDS-PAGE分析。首次离心后含外膜部分的细菌碎片重悬于100μl水和100μl含7.5mMMgCl₂和3％(v/v)Triton X-100的15mMTris-HCl缓冲液(pH8.0)中并以14000rpm离心25分钟。沉淀重悬于25μl水和25μl煮沸的缓冲液中并煮沸，以SDS-PAGE分析样品的20μl等分试样。

对丙酮沉淀的细菌细胞声处理物的可溶部分进行SDS-PAGE(即：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳)。在9％凝胶中分析多肽(左侧)：分子大小标准品(泳道1)，带有在Bam HI-EcoRI pBluescript克隆位点之间含无关结核分枝杆菌DNA片段的载体的E.coli XL1-BBlue(泳道2)和XL1-Blue(pZX7)(泳道3)。在8％凝胶中分析(右侧)：含有在pZX7)(泳道1)和XL1-Blue(pZX7)(泳道2)Bam HI克隆位点上游导入12碱基的2碱基读框移位的载体(pZX7.8)的XL1-Blue。分子大小在最右测显示。我们在XL1-Blue(pZX7)可溶蛋白部分中检测到一个52kD的多肽(箭头)。含pZX7.8的XL1-Blue表达大约50kD的蛋白质。52kD蛋白质的表达常与Hela细胞与重组E.coli克隆的相互作用相关。

从图4的SDS-PAGE结果可推断XL1-Blue(pZX7)细菌细胞声处理产物的可溶部分含有52kD的多肽，该多肽在带有含无关结核分枝杆菌DNA片段的pBluescript衍生载体(pZN7)的XLl-Blue可溶部分中检测不到。用Klenow DNA聚合酶在pZX7 Bam HI克隆位点上游12个碱基的XbaI位点补齐5′突出端(经测序证实)后以钝端连接导入的2碱基读框移位导致含该质粒(pZX7.8)的E.coli XL1-Blue与Hela细胞的联系丧失。该克隆不表达52kD蛋白质，但在可溶部分中检测到分子量较低的新多肽。XL1-Blue(pZX7)贮存期延长后与Hela细胞发生联系的能力的自发丧失伴随着52kD蛋白质的丧失。因此，该52kD蛋白质很可能是克隆的结核分枝杆菌DNA片段表达的产物。在细菌外膜多肽部分中没有可检测到的差异。

尚不清楚克隆的1535bp片段是否具有不止一个的开放阅读框或是否单个基因产物同时介导细胞感染和在巨噬细胞内的存活。将药物设计成瞄准结核分枝杆菌产物介导的巨噬细胞存活或抗编码进入哺乳动物细胞的产物之疫苗可对世界范围内的结核病控制战略作出巨大贡献。

尽管本发明为说明目的进行了详细的描述，应理解这种详情仅仅是为了达到该目的，据此，本领域的技术人员不背离本发明的实质和范围就能作出变化，下面权利要求限定了本发明的实质和范围。

Claims

1.一种赋予结核分枝杆菌进入哺乳动物细胞和在巨噬细胞内存活之能力的分离的DNA分子。

2.根据权利要求1的分离的DNA分子，其中所说的DNA分子包含与SEQ ID NO 1相对应的核苷酸序列。

3.根据权利要求1的分离的DNA分子，其中所说的DNA分子编码具有大约50-55千道尔顿分子量的多肽。

4.一种由赋予结核分枝杆菌进入哺乳动物细胞和在巨噬细胞内存活之能力的DNA分子编码的分离的蛋白质或多肽。

5.根据权利要求4的分离的蛋白质或多肽，其中所说的DNA分子包含与SEQ ID NO 1相对应的核苷酸序列。

6.根据权利要求5的分离的蛋白质或多肽，其中的蛋白质或多肽具有与SEQ ID NO 2相对应的氨基酸序列。

7.根据权利要求4的分离的蛋白质或多肽，其中所说的蛋白质或多肽是一种具有分子量为大约50-55千道尔顿的多肽。

8.根据权利要求4的分离的蛋白质或多肽，其中所说的蛋白质或多肽是重组体。

9.根据权利要求4的分离的蛋白质或多肽，其中所说的蛋白质或多肽是纯化的。

10.根据权利要求4的分离的蛋白质或多肽，其中所说的蛋白质或多肽具有一个或多个赋予结核分枝杆菌进入哺乳动物细胞和在巨噬细胞内存活之能力的抗原决定簇。

11.一种接种哺乳动物抗结核分枝杆菌感染的方法，包括给哺乳动物施用有效量的根据权利要求4的分离的蛋白质或多肽。

12.根据权利要求11的方法，其中所说的用药是经口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下或鼻内施药。

13.一种重组DNA表达系统，包含一种表达载体，在其中插入一种赋予结核分枝杆菌进入哺乳动物细胞和在巨噬细胞内存活之能力的异源性的DNA。

14.根据权利要求13的重组DNA表达系统，其中所说的异源DNA包含与SEQ ID NO 1相对应的核苷酸序列。

15.根据权利要求13的重组DNA表达系统，其中所说的异源DNA以合适的取向和正确的阅读框架插入所说的载体中。

16.一种宿主细胞，掺入了赋予结核分枝杆菌进入哺乳动物细胞和在巨噬细胞内存活之能力的异源性的DNA。

17.根据权利要求16的宿主细胞，其中所说的异源DNA包含与SEQ ID NO 1相对应的核苷酸序列。

18.根据权利要求16的宿主细胞，其中所说的异源DNA插入包含表达载体的重组DNA表达系统中。

19.一种预防哺乳动物被结核分枝杆菌感染和引起疾病的疫苗，包含根据权利要求4的一种分离的蛋白质或多肽和一种可药用的载体。

20.根据权利要求19的疫苗，其中所说的蛋白质或多肽是具有大约50-55千道尔顿分子量的多肽。

21.根据权利要求19的疫苗，其中所说的蛋白质或多肽是纯化的。

22.一种接种哺乳动物抗结核分枝杆菌感染的方法，包含给哺乳动物施用有效量的根据权利要求19的疫苗。

23.根据权利要求22的方法，其中所说的用药是经口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下或鼻内施药。

24.一种抗根据权利要求4的蛋白质或多肽的分离的抗体或其结合部分。

25.根据权利要求24的分离的抗体或其结合部分，其中所说的蛋白质或多肽是具有大约50-55千道尔顿分子量的多肽。

26.根据权利要求24的分离的抗体或其结合部分，其中所说的抗体是单克隆的或多克隆的。

27.根据权利要求24的分离的抗体或其结合部分，其中所说的抗体对由赋予结核分枝杆菌进入哺乳动物细胞和在巨噬细胞内存活之能力的基因片段编码的所说蛋白质或多肽的抗原决定簇具有特异性。

28.一种被动免疫受结核分枝杆菌感染的哺乳动物的方法，包含给感染结核分枝杆菌的哺乳动物施用有效量的根据权利要求24的所说的抗体或其结合部分。

29.根据权利要求28的方法，其中所说的用药是经口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下或鼻内施药。

30.一种被动免疫受结核分枝杆菌感染的哺乳动物的组合物，包含根据权利要求24的分离的抗体或其结合部分和一种可药用的载体。

31.根据权利要求30的组合物，其中所说的抗体是单克隆的或多克隆的。

32.根据权利要求30的组合物，其中所说的抗体对由赋予结核分枝杆菌进入哺乳动物细胞和在巨噬细胞内存活之能力的基因片段编码的所说的蛋白质或多肽的抗原决定簇具有特异性。

33.一种被动免疫感染结核分枝杆菌的哺乳动物的方法，包含给感染结核分枝杆菌的哺乳动物施用有效量的根据权利要求30所说的组合物。

34.根据权利要求33的方法，其中所说的用药是经口服、皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下或鼻内施药。

35.一种在组织或体液样品中检测结核分枝杆菌的方法，包括：

提供根据权利要求4的蛋白质或多肽作为抗原；

将样品与抗原接触；

使用一种检测系统检测表明样品中存在结核分枝杆菌的任一反应。

36.根据权利要求35的方法，其中所说的蛋白质或多肽是具有大约50-55千道尔顿分子量的多肽。

37.根据权利要求35的方法，其中的检测系统选自酶联免疫吸附测定，放射免疫测定、凝胶扩散沉淀素反应测定、免疫扩散测定、凝集试验、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定和免疫电泳测定。

38.一种检测组织或体液样品中结核分枝杆菌的方法，包含：

提供根据权利要求24的抗体或其结合部分；

将样品与抗体或其结合部分接触；

使用一种测定系统检测表明在样品中存在结核分枝杆菌的任一反应。

39.根据权利要求38的方法，其中所说的蛋白质或多肽是具有分子量为大约50-55千道尔顿的多肽。

40.根据权利要求38的方法，其中的测定系统选自酶联免疫吸附测定，放射免疫测定、凝胶扩散沉淀素反应测定、免疫扩散测定、凝集试验、荧光免疫测定、蛋白质A免疫测定和免疫电泳测定。

41.一种检测组织或体液样品中的结核分枝杆菌的方法，包含：

提供根据权利要求1的DNA分子的核苷酸序列作为核酸杂交测定中的探针；

将样品与探针接触：

检测在样品中表明结核分枝杆菌存在的任一反应。

42.一种检测组织或体液样品中结核分枝杆菌的方法，包含：

提供根据权利要求1的DNA分子的核苷酸序列作为基因扩增检测程序中的探针；

将样品与探针接触；

检测在样品中表明结核分枝杆菌存在的任一反应。

43.一种用于哺乳动物细胞吸收物质的产品，包含哺乳动物吸收的物质和根据权利要求4的蛋白质或多肽，其中所说的蛋白质与所说的物质相关联。

44.根据权利要求43的产品，其中所说的蛋白质或多肽是具有分子量为大约50-55千道尔顿的多肽。

45.根据权利要求43的产品，其中所说的蛋白质或多肽是纯化的。

46.根据权利要求43的产品，其中所说的物质选自抗生素、DNA片段、抗肿瘤药剂和其混合物。

47.一种细胞用的吸收方法，包含用根据权利要求4的蛋白质或多肽将物质导入哺乳动物细胞中。

48.根据权利要求47的方法，其中所说的蛋白质或多肽是具有分子量为大约50-55千道尔顿的多肽。

49.根据权利要求47的方法，其中所说的蛋白质或多肽是纯化的。

50.根据权利要求47的方法，其中所说的物质选自抗生素、DNA片段、抗肿瘤药剂和其混合物。

51.根据权利要求47的方法，其中的哺乳动物细胞是巨噬细胞。

52.根据权利要求51的方法，其中所说的方法诱导细胞介导的免疫。