CN111133295A - 拉曼成像技术测定抗生素敏感性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种通过受激拉曼散射显微镜测定抗生素敏感性的方法。该方法通过成像设备采集细菌样本的激光信号并对细菌样本的新陈代谢活动进行成像。为了确定细菌对某些抗生素的敏感性，可以用抗生素对样本处理后进行成像。
Description
技术领域
本发明涉及一种活细菌代谢活性的检测方法，具体涉及一种通过超光谱受激拉曼散射显微镜检测抗生素敏感性的方法。
背景技术
广泛使用和滥用抗生素来对抗各种细菌感染已经引起耐药菌数量的增加。因此，对于特定的传染病而言，通过抗生素敏感性检测(AST)分析特定细菌的抗生素反应显得尤为重要。根据细菌种类的不同，常规的AST通常利用琼脂平板和肉汤稀释法进行细菌培养，一般最少需要16-24小时。正在开发的新技术虽然能进行快速检测，但仅适用于特定细菌或需要耗时的样品富集，具有一定的限制性。
拉曼光谱法，是一种用于测量分子振动的非标定量技术，已经应用于细菌AST的快速检测。拉曼峰在指纹领域或重水D2O代谢吸收中已经作为一种生物标记，以表征细菌对对抗生素治疗的反应。然而，由于横截面积较小，拉曼光谱产生的信号较弱，因此需要大量的样本或者每个细胞需要较长的整合时间。利用金属胶体或粗糙金属表面，拉曼信号可以通过表面增强拉曼光谱(SERS)进行增强，随着抗生素治疗的改变，SERS已经被应用于以拉曼峰为依据的AST快速检测，但SERS需要底物且信号变化较大，无法实际应用。
相干拉曼散射显微镜包括相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)和受激拉曼散射(SRS)显微镜，与自发拉曼散射相比，信号得到显著改善。与CARS不同，SRS显微镜不具有非共振背景，已应用于细胞，组织和模型生物的代谢成像方面。但SRS并非完全没有背景。超光谱受激拉曼散射(SRS)可以在每一个像素处记录光谱，用以区别来自于背景的SRS信号，包括由于非线性吸收和交叉相位调制。
对单一细菌的代谢活动成像技术仍然具有很高的挑战性。细菌的大小(直径约为1μm)比哺乳动物细胞(约10μm)小的多，接近CARS或SRS显微镜的空间分辨率。此外，C-D拉曼信号比C-H信号弱很多，因此需要一种改进的AST方法。优选地，这种方法不需要延长样品富集时间，并且在单各细胞水平上适用于各种细菌。
发明内容
一方面，本发明涉及一种适用于所有细菌的快速的抗生素敏感性检测(AST)方法。
另一方面，本发明涉及一种利用超光谱受激拉曼散射(SRS)成像技术在单一细胞水平上监测细菌中葡萄糖-d7代谢活性的方法。
另一方面，本发明涉及一种适用于所有细菌的快速的(AST)方法，利用超光谱受激拉曼散射(SRS)成像技术在单个细胞水平上监测活细菌中葡萄糖-d7代谢活性。这种方法可以使用类似地其他的营养源，例如D2O。万古霉素敏感性(VSE)和耐药性(VRE)肠球菌可以作为模型，利用SRS成像在单个细胞水平上可以检测到细菌以及定量监测到它们的代谢活性，也可以检测到对抗生素治疗的代谢反应，从而在30分钟内确定细菌敏感性和最低抑菌浓度(MIC)。同样，成像方法还可以应用到具有不同抑菌或杀菌机制的其他抗生素上。由于葡萄糖是细菌生产的常见碳源，因此我们可以合理预测这种方法可以适用于多种细菌。
另一方面，本发明涉及一种样品制备方法，适用于改良的细菌培养以及使信噪比最大化的成像设置，以获得更加一致的图像处理过程。
另一方面，本申请涉及一种用于快速AST检测的拉曼成像系统，其中拉曼成像系统包括双输出飞秒脉冲激光器，所述双输出飞秒脉冲激光器包括泵浦光束和斯托克斯光束，其中斯托克斯光束的路径通过声光调制器调制，泵浦光束路径包括一个平移台，用以调谐泵浦光束和斯托克斯光束间的延迟。组合器，所述组合器用于组合泵浦光束和斯托克斯光束。啁啾装置，所述啁啾装置用于在泵浦光束和斯托克斯光束之间形成不同的脉冲持续时间。激光扫描显微镜还包括一个可以将泵浦光束和斯托克斯光束聚焦在样品上的物镜。此外，该系统可以包括用于从样本收集激光的油冷凝器。该系统可以使用一个或多个位于聚光器之后并适于滤除斯托克斯束的滤光器。用于检测泵浦光束的光电二极管可以位于滤光器之后。锁定放大器用于提取泵浦光束信号损耗。
附图说明
为了便于理解本申请的特征，有益效果和实施方式，请参考以下公布的对系统和过程的描述，其中：
图1A为本申请的一个示例性超光谱受激拉曼散射(SRS)建立过程示意图；
图1B为本申请啁啾后泵浦光束和斯托克斯光束间的延迟示意图；
图2A为本申请抗生素敏感性检测(AST)过程示意图；
图2B为本申请对万古霉素敏感性和耐药性肠球菌是否应用20μg/ml万古霉素治疗的情况下在C-D振动区(2178cm-1)的超光谱受激拉曼散射(SRS)成像数据；
图2C为本申请易感细菌的超光谱受激拉曼散射(SRS)光谱数据；
图2D为本申请耐药细菌的超光谱受激拉曼散射(SRS)光谱数据；
图3A-D为本申请用超光谱SRS成像数据以将细菌的C-D成分和凝胶背景分离的多元曲线分辨率(MCR)分析数据，图3A为细菌沉积在琼脂糖凝胶上的C-D振动区的SRS图像；图3B为葡萄糖-d7和凝胶成分的MRC输出光谱；图3C为多元曲线分辨率(MCR)分析后的凝胶成分；图3D为多元曲线分辨率(MCR)分析后的葡萄糖-d7成分；
图4A-B为本申请SRS成像的交叉相位调制噪声结果；
图5A-C为本申请利用SRS代谢成像方法测定MIC的结果；
图6A-D为本申请是否应用20μg/ml万古霉素的条件下，用包含葡萄糖-d7的培养基培养细菌时，细菌在C-D振动区随时间变化的结果；
图7A为本申请超光谱SRS在2150cm-1处的成像结果；
图7B为本申请1M葡萄糖-d7溶液在C-D区域对应光谱的图示结果；
图8为本申请中万古霉素敏感性肠球菌(VSE)分别在正常培养基和包含2％葡萄糖-d7培养基中的自发拉曼光谱结果；
图9A-B为本申请葡萄糖-d7对粪肠球菌的细菌生长检测的图示结果；
图10A-F为本申请对粪肠球菌31970应用不同抗生素后的抗生素敏感性检测的SRS代谢成像结果；
图11A-D描述了在0.5h内对奥沙西林敏感和耐药的金黄色葡萄球菌的分化结果；
图12为本申请在包含葡萄糖-d7的培养基中培养1h后的SRS成像结果和对应的光谱数据；
图13A-C为本申请在包含葡萄糖-d7的培养基中培养3h后的SRS成像结果和对应的光谱数据；
图14为本申请中抗生素敏感性检测(AST)的过程；
图15A为本申请中铜绿假单胞菌分别在正常培养基和包含70％D2O的LB培养基中培养2h后的自发拉曼光谱结果；
图15B为本申请中铜绿假单胞菌分别在正常培养基和包含70％D2O的LB培养基中培养2h在2162cm-1处的C-D区SRS的成像结果以及对应的透射成像结果；
图15C为本申请图15B中单个细菌对应的SRS光谱结果；
图16A为本申请中铜绿假单胞菌在包含70％D2O的LB培养基中培养30min后用2根SF57玻璃棒啁啾后用皮秒SRS在2162cm-1处的SRS的成像结果；
图16B为本申请图16A中虚线在细菌上的强度图；
图16C为本申请中铜绿假单胞菌在包含70％D2O的LB培养基中培养30min后不做啁啾处理在2162cm-1处的SRS的成像结果；
图16D为本申请图16C中虚线在细菌上的强度图；
图17A为本申请中铜绿假单胞菌在包含70％D2O的LB培养基中培养0-3h内的C-D区SRS的成像结果；
图17B为本申请图17A的放大图像；
图17C为本申请图17A中的单一铜绿假单胞菌的平均SRS强度动态变化示意图，其中误差线表示标准偏差(N>10)；
图17D为本申请图17B中作用10min时虚线在细菌上的强度图；
图17E为本申请图17B中作用30min时虚线在细菌上的强度图；
图18A为本申请中铜绿假单胞菌在包含70％D2O的LB培养基中培养0-3h内，D2O在铜绿假单胞菌内的生物合成过程中，C-D区SRS的成像结果；
图18B为本申请中图18B的矩形框中铜绿假单胞菌的放大图像；
图18C为本申请图18A中的单一铜绿假单胞菌的平均SRS强度动态变化示意图，其中误差线表示标准偏差(N>10)；
图18D为本申请图18B中作用10min时细菌上虚线的强度图；
图18E为本申请图18B中作用30min时细菌上虚线的强度图；
图19A为本申请中铜绿假单胞菌在包含70％D2O的LB培养基中加入20ug/ml庆大霉素后在2162cm-1处的C-D区SRS的成像结果以及对应的透射成像结果；
图19B为本申请中铜绿假单胞菌在包含70％D2O的LB培养基中加入20ug/ml头孢噻肟后在2162cm-1处的C-D区SRS的成像结果以及透射成像结果；
图19C-H为本申请中铜绿假单胞菌在包含70％D2O的LB培养基后不用抗生素处理(对照组)以及用庆大霉素或头孢噻肟处理不同时间的平均C-D区SRS强度图；
图20A为本申请中铜绿假单胞菌在正常LB培养基中(对照组)或包含70％D2O的LB培养基添加不同浓度庆大霉素后在2162cm-1处的C-D区SRS的成像结果以及透射成像结果；
图20B为本申请图20A中单一铜绿假单胞菌平均C-D区SRS强度图。
具体实施方式
本发明中对各种实施例的详细描述请参考附图，附图以示例和最佳方式解释了各种实施例及其实施方式，但并不限于这些方式。本申请详细描述了这些实施例以使本领域技术人员能够实施，但应当理解为在不脱离本申请公开的精神和范围的前提下，可以实现其他实施例，并且可以进行机械的或其他方面的改变。此外，此外，对单数的任何引用都包括多个实施例，并且对不止一个组件的任何引用都可以包括单数实施例。同样，对一个设备或组份进行排序或对设备的一部分进行排序，例如“第一”和“第二”是为了使本申请更加清晰和便于理解，而不应被解释为限制或表示除任意区分之外的含义。此外，对具有所述特征的多个实施例的列举并不旨在排除具有附加特征的其他实施例，或结合了所述特征的不同组合的其他实施例。
本申请公开的各种实施例中提供了系统，方法和计算机程序产品。对“各种实施例”、“一个实施例”、“一项实施例”和“一个示例实施例”等的引用，表示对实施例的描述可能包括某个特定的特征，结构或特性，但并非每个实施例都包括，并且这些短语不一定是指相同的实施例。此外，当结合实施例描述某个特定的特征，结构或特性时，在与其他实施例结合时，无论是否明确描述，都应认为是在本领域技术人员的知识范围内。阅读说明书后，对于相关领域的技术人员来说如何在替代的实施例中实现本发明应该是显而易见的。
参考图1A-1B，通过拉曼代谢成像确定抗生素敏感性。成像系统包括任何类型的拉曼成像，包括但不限于受激拉曼散射成像，相干反斯托克斯拉曼散射成像或相干拉曼诱导的克尔效应成像。在一个示例实施例中，本发明公开了一种超光谱受激拉曼散射(SRS)成像装置。本发明公开的成像系统可以包括光源101。在一个示例实施例中，光源可以是双输出飞秒脉冲激光器(InSight DeepSee，Spectra-Physics)，重复率约为80MHz，但是可以使用任何合适的速率。所述光源101可用于超光谱SRS成像。类似地，成像系统可以使用单色SRS成像。可以使用光源101(例如可调激光器103)在C-D振动区域成像。在一个示例实施例中，可调激光器可以是被调谐到约847nm的120-fs可调激光器。另外，可以合并滤光器以清除激光束。光束103可以用作泵浦光束。第二光束105，例如大约以1040nm为中心的220-fs激光器。所述第二光束105可以用作斯托克斯光束，可以由声光调制器107(AOM，1205-C，Isomet)调制到2.35MHz。每个光束都可以穿过一个或多个滤镜或透镜。类似地，每个光束都可以穿过偏振分束器(PBS)133。在一个示例实施例中，可以在泵浦路径中安装一个电动平移台109(T-LS28E，Zaber)来调谐泵浦光束103和斯托克斯光束105之间的延迟。两个光束可以使用一个组合器111，然后可以用一个或多个玻璃棒113对两个光束进行啁啾。在一个示例实施例中，可以使用2个长度约为15cm的玻璃棒。同样，玻璃棒可以是SF57玻璃棒。
在一些示例实施例中，泵浦光束和斯托克斯光束啁啾后的脉冲持续时间大约在1-2ps之间，或在1.3ps与1.9ps之间。在一个示例实施例中，泵浦光束和斯托克斯光束可以分别约在1.9ps和1.3ps。在其他实施例中，成像系统可以不用对光束啁啾。泵浦光束103和斯托克斯光束105引入具有扫描单元115和一个或多个透镜117的激光扫描显微镜中。在一个示例实施例中，透镜117可以是一个大约60倍水物镜(NA＝1.2,UPlanApo/IR，奥林巴斯)，用于将激光聚焦到样品119上。可以使用油冷凝器121(NA＝1.4,U-AAC，奥林巴斯)，用于从样品123上收集合并的激光光束120。一个或多个滤镜125(HQ825/150m，Chroma)可用于滤除斯托克斯光束。泵浦光束由光电二极管127(S3994-01，Hamamatsu)检测，其损耗信号可以通过锁定放大器(HF2LI,Zurich Instrument)提取。该系统可以包括一个或多个反射镜，以将每个光束引导通过该设备的各个组件。在一些示例实施例中，一个或多个反射镜129可以是双色镜131。如图1B所示，ΔW1和ΔW2表明本申请公开的示例成像系统可以检测到可能的拉曼峰。啁啾后泵浦光束和斯托克斯光束之间的每一个延迟都可以对应一个成像系统检测到的分子振动模式。
本申请还涉及一种用于示例成像系统的样品制备方法，包括但不限于SRS成像系统。样品制备可以利用细菌培养板。在一个示例实施例中，培养板可以包括琼脂糖凝胶板，用于将溶液中的细菌放在凝胶板中进行实时成像。在一些示例实施例中，可根据以下步骤制备琼脂糖凝胶板：(1)将1％琼脂糖粉加入约装有2ml纯净水的塑料管中；(2)微波加热20s直至琼脂糖粉完全溶解；(3)用移液器取10ul加热的琼脂糖凝胶溶液加到盖玻片上；(4)另取一个盖玻片将凝胶琼脂糖凝胶溶液弄平，将凝胶夹于两盖玻片之间；(5)2min后通过滑动两个盖玻片将其中一个取下；(6)残留在其中一个盖玻片上的琼脂糖凝胶凝固后即成琼脂糖凝胶板。
本申请公开的细菌AST程序在一个细胞周期内(约30min)通过拉曼成像检测细菌的代谢活性，例如受激拉曼散射(SRS)。成像系统可以利用啁啾皮秒SRS在C-D振动频率下监测氘化的葡萄糖(例如葡萄糖-d7)的代谢活性，并且使用C-D信号作为标识物进行AST。
同样，水也可以用于细菌体内的生物分子合成，并且可以使用拉曼光谱法在C-D频率下使用重水(D20)监测其代谢。与葡萄糖-d7不同，D20本身不具有C-D键，因此与葡萄糖-d7相比，D20的代谢活性可能为快速AST提供更好的对照。利用自发拉曼光谱，D20的代谢活性已经应用于对代谢活性细菌进行成像。SRS成像具有数量级的信号增强功能，从而可以实现高速成像。此外，D20代谢活性SRS成像一种非侵入性的、准确方法，可以实现对哺乳动物细胞和动物代谢动态的可视化。本申请公开的基于SRS成像方法可以在约10min内确定细菌对抗生素的敏感性。放置于琼脂糖凝胶板上的细菌溶液可以通过SRS成像检测，细菌溶液在可以在肉汤中培养，例如溶菌肉汤(LB)(LB Broth,Sigma Aldrich)，大约2h即可达到对数生长期。然后按照约0.1:100-10:100的比例将细菌加入到2ml各种类型的培养基中。在一个示例实施例中，可以按照约1:100的比例加入到2ml培养基中，例如专用培养基。在一些示例实施例中，可以使用D20培养基或其他专用培养基，如本文中约有2％葡萄糖-d7被用作碳源的M9培养基。选择M9培养基是因为它能使C-D振动区域内的信号最大化。为了检测特定细菌对一种抗生素的耐药性，将抗生素加入到特定培养基中，浓度为20ug/ml。孵育至少30min后，将约500ul样品离心，用纯净水洗涤两次，然后加入琼脂糖凝胶板上进行成像。图1A展示了处理样品的过程。
参考图2A-D，为了确定利用抗生素的有效性，本申请可以以示例的方法公开，例如使用万古霉素。因此，该方法可用于检测抗生素对细菌代谢葡萄糖-d7的影响。万古霉素敏感性(VSE)和万古霉素耐药性(VRE)肠球菌可以先在LB培养基中培养，大约2h生长到对数期，然后VSE和VRE肠球菌可以在含有2％葡萄糖-d7作为唯一碳源的M9培养基中进一步培养，分别添加万古霉素至终浓度为20ug/ml(图2A)。其他实施方案可以包括各种类型的碳源作为唯一碳源使用，或者与其他碳源或营养源组合。在一个示例实施例中，可以使用0-100％的二氧化氘作为营养源。同样，碳源可以包括二氧化氘和葡萄糖-d7的组合。需要选择浓度是因为这个浓度在万古霉素对VSE(MIC是1ug/ml)和对VRE(MIC>100ug/ml)的最小抑菌浓度(MICs)之间。为了进行对照，将VSE和VRE在包含葡萄糖-d7的培养基中培养时不添加万古霉素(图2A)。孵育30min(0.5小时)至3小时后，将每个样品离心并在水中洗涤两次，然后加入到在琼脂糖凝胶板上以进行SRS成像。
图2B显示了VSE和VRE在含有葡萄糖-d7的培养基中培养30min后在C-D振动区域(～2160cm-1)的SRS成像结果。在对照组(No antibiotics)中，VSE和VRE均具有很强的C-D信号，表明细菌对葡萄糖-d7的代谢吸收活性较高，并且可以清楚地观察到单个细菌。在万古霉素治疗组(20ug/mlvancomycin)中，单个VSE的C-D信号强度已降至对照组中单个VSE的C-D信号强度的约1/3。由于葡萄糖-d7的SRS信号强度与其浓度成正比，因此降低的信号表示葡萄糖-d7的吸收较少。相反，单个VRE的C-D信号强度与对照组相似，其中Susceptible表示敏感性，Resistant表示耐药性。
图2C和2D显示了图2A中所示的VSE和VRE的相应的标准化的SRS光谱。所有光谱均在CD振动区域显示一个峰值，但对照组相比，万古霉素治疗降低了VSE的信号强度(Intensity)，而在有和没有万古霉素治疗的情况下，VRE的信号强度均保持不变，这与图2B所示的SRS成像结果一致，其中Raman shift(cm-1)表示拉曼位移。这些结果表明VSE和VRE的代谢活性对万古霉素治疗的反应不同，因此可以在30min内确定VSE和VRE的敏感性，这与粪肠球菌的一个细胞周期的时间接近。应用万古霉素治疗1小时和3小时观察到相似的效果，因此，通过目前公开的成像方法说明粪肠球菌对万古霉素的AST检测结果不敏感。
为了量化粪肠球菌细胞的C-D含量和细菌对抗生素治疗的反应，应用多元曲线分辨率(MCR)分析图3A-D中超光谱SRS成像数据的C-D含量。MCR是一个双线性模型，它将包含每个像素光谱的实验数据矩阵分解为浓度图和主成分光谱。以每个组件的初始估计光谱作为输入，使用交替最小二乘算法迭代计算和优化MCR，直到达到收敛为止。MCR的输出包含每个成分的浓度图和光谱。如图3A-D所示，代表C-D成分的葡萄糖-d 7的光谱和代表背景的凝胶的光谱被用作输入成分，其中Intensity表示信号强度，Raman shift(cm-1)表示拉曼位移。经过MCR分析后，可以将C-D成分与背景清楚地分开，并用于量化收集的SRS成像数据的内容。
尽管本方法总体上公开了用于基于代谢成像的AST的超光谱SRS显微镜，但在另一个示例实施例中可以将改进方法制备的样品使用单频SRS显微镜检测。改进之前单频SRS显微镜是对干燥在玻璃上的细菌进行检测，以避免细菌在测量过程中移动，这在SRS信号中引起了强烈的噪声。制备琼脂糖凝胶样品，将溶液中的细菌沉积在琼脂糖凝胶板上不会是细菌死亡，这样就去除了噪声。这样，细菌在C-D振动频率下的SRS信号主要来自C-D成。因此通过监测细菌C-D成分变化而进行的基于代谢成像的AST方法，可以通过单频SRS成像检测，该方法比超光谱SRS成像花费的时间要少得多，因为只拍摄了一张图像而不是一堆图像。
此外，另一示例实施例可以使用附加步骤来制备样品。在一个示例实施例中，通过将细菌干燥在玻璃上制备用于SRS成像的样品。如图4a-b所示，细菌沉积在琼脂糖凝胶上能显著降低SRS成像的交叉相位调制噪声。图4a是在正常培养基中培养并在玻璃上干燥的细菌(Dried bacteria)在2178cm-1处的SRS成像结果，图4b是在正常培养基中培养并沉积在琼脂糖凝胶板上的细菌(Bacteria on agarose gel)在2178cm-1处的SRS成像结果。在玻璃上使用干燥细菌进行成像时发现很强的背景，这可能是由于交叉相位调制所致。使用琼脂糖凝胶板，细菌沉积在该凝胶板的溶液中可以进行活菌成像。如图4B所示，这种样品制备大大降低了SRS成像的背景。为了最大化CD信号水平，将培养基从包含正常葡萄糖的LB培养基替换为定制的M9培养基，其中葡萄糖-d7是唯一的碳源，并将葡萄糖-d7的浓度提高到2％。为确保信号和光谱分辨率，使用两根15厘米长的SF57玻璃棒对超光谱SRS成像的泵浦光束和斯托克斯光束进行啁啾，并在C-D振动区域使单个细菌的信噪比达到约5，光谱分辨率约为20cm-1。
为了检测葡萄糖-d7对细菌的毒性，在定制的M9培养基中培养粪肠球菌31970和31972，其中一种用正常葡萄糖作为对照，另一种用葡萄糖-d7。通过测量600nm处的光密度(OD，optical density)监测细菌的生长直到22小时(图9)。在粪肠球菌31970和31972培养在正常培养基(Glucose)和包含葡萄糖-d7(Glucose-d7)的培养基中观察到两种相似的生长曲线，表明葡萄糖-d7对细菌生长没有任何毒性。图9A显示了万古霉素敏感性肠球菌在包含2％正常葡萄糖或包含2％葡萄糖-d7的M9培养基中的OD值，图9B显示了万古霉素耐药性性肠球菌在包含2％正常葡萄糖或包含2％葡萄糖-d7的M9培养基中的OD值。
MIC可以定义为能够在体外抑制可见细菌生长的最低抗生素浓度，可以通过我们的代谢成像方法确定。VSE在含有葡萄糖-d7，加布不同浓度万古霉素的M9培养基中培养。培养1h后，将每个样品离心，用PBS洗涤两次，并沉积在琼脂糖凝胶板上用于SRS成像。图5A显示了进行MCR分析后每个样品的C-D成分。为了定量比较用万古霉素处理细菌中的葡萄糖-d7的吸收情况，并对视野中单个细菌的CD成分强度进行统计分析和绘图(图5B)，其中E.faecalis 31970表示肠球菌31970，Intensity表示信号强度。与未使用万古霉素治疗的对照组相比，2ug/ml或更高浓度的万古霉素治疗显着降低了C-D成分的强度。相反，1ug/ml万古霉素并未降低这种强度。因此，通过我们的代谢成像方法测定的VSE的MIC值为2ug/ml，是基于传统培养方法测定的MIC值的2倍。这种差异是可以接受且在精度范围内的，这在很大程度上是由于常规AST中是用手动连续稀释抗生素。图5A显示了在不同的万古霉素浓度下在含有葡萄糖-d7的培养基中培养1小时的细菌的C-D成分浓度图的结果。图5B为CD成分强度的定量图。与未使用万古霉素处理的对照组相比，使用2ug/ml和更高浓度万古霉素处理的细菌的C-D成分强度显示出明显的降低。如图5C所示，对基于传统培养的方法和我们的代谢成像方法确定的MIC值进行了比较。
为了评估细菌的代谢活性，将粪肠球菌在含有正常葡萄糖801和葡萄糖-d7803的培养基中培养后，用PBS洗掉痕量培养基，然后沉积于琼脂糖凝胶板上进行SRS成像。如图7B所示，1M葡萄糖-d7(Glucose-d7)溶液的超光谱SRS成像结果显示了在C-D振动模式中2130cm-1附近的峰。该峰位于拉曼光谱的细胞沉默区域，为氘标记的代谢物的代谢吸收成像提供了良好的对照。在含有葡萄糖-d7的培养基中培养的细菌的SRS成像在C-D振动区域显示出很强的信号，表明细菌成功吸收和利用了葡萄糖-d7。作为对照，在正常葡萄糖培养基(normal medium)中培养的细菌未观察到信号。如图8所示，通过自发拉曼测量进一步证实了这些结论，其中仅在含葡萄糖-d7 803的培养基(glucose-d7 medium)中培养的细菌在C-D区域中观察到一个峰。这些数据共同表明，细菌对葡萄糖-d7吸收代谢活动可以在单个细胞水平上通过超光谱SRS成像来监测。灰色条805表示2150cm-1附近的C-D区域。
图6A-D描绘了存在和不存在(No antibiotics)20ug/ml万古霉素(vancomycin)的情况下，用含有葡萄糖-d7的培养基培养的细菌中C-D成分变化的结果，其中Intensity表示信号强度。图6A和6B分别显示了对VSE和VRE进行MCR分析之后的C-D成分的时间动态。定量分析单个细菌中C-D成分的平均强度，并分别绘制在代表VSE和VRE的图6C和6D中。对于未经万古霉素处理的VSE对照组，在葡萄糖-d 7培养基中培养约0.5h和1h的细菌具有相似的C-D成分强度，而培养3h的细菌C-D成分的强度较高(图6C)，表明随着时间的推移葡萄糖-d 7的吸收略有增加。对于VSE对照组来说，培养约0.5h至3h的单一细菌具有相似的C-D成分强度(图6D)。万古霉素治疗显著降低VSE的C-D成分强度，t检验来分析VSE对照组和治疗组之间的显着性，0.5h、1h和3h的p值分别为2.2×10-13，2.0×10-11和3.9×10-15。VRE组中万古霉素处理并未显着降低C-D成分强度。有趣的是，VRE经过万古霉素处理3h的C-D成分强度高于对照组(p值为5x10-4)，这很可能归因于VRE对万古霉素处理的代谢反应，从而细胞增加了对葡萄糖的吸收以减轻抗生素压力。结果表明，在3小时内，万古霉素处理可显著降低VSE对葡萄糖-d7的吸收，而不会降低VRE对葡萄糖-d7的吸收。因此，可以快速确定VSE和VRE对万古霉素的敏感性。图12A-C描绘了在含葡萄糖-d7的培养基中培养1h的细菌的相应数据和成像数据。图12A显示了在含有葡萄糖-d7的培养基中培养的万古霉素敏感性和耐药性肠球菌在是否使用20ug/ml万古霉素处理的情况下，在C-D振动区的SRS成像结果。如图12B所示，万古霉素敏感性肠球菌在使用万古霉素处理1203和不使用万古霉素处理1201(Control)的情况下相应的光谱。另外，图12C显示万古霉素敏感性肠球菌在使用万古霉素处理和不使用万古霉素处理的情况下相应的光谱，结果表明成像数据没有偏移。同样的，图13A-C分别表示在含有葡萄糖-d7的培养基中培养3h的细菌的相应数据和成像数据。图13B显示了万古霉素敏感性肠球菌在使用万古霉素处理1303和不使用万古霉素处理1301的情况下相应的光谱。图13C显示万古霉素敏感性肠球菌在使用万古霉素处理和不使用万古霉素处理的情况下相应的光谱，结果表明成像数据没有偏移。
我们进行了其他测试以确定基于AST方法的代谢成像是否适用于其他抗生素。在含有葡萄糖-d7的M9培养基中培养VSE肠球菌31970，加入万古霉(vancomycin)，利奈唑胺(linezolid)，达托霉素(daptomycin)，庆大霉素(gentamycin)和红霉素(erythromycin)5中不同的抗生素。这些抗生素在临床上通常被用于细菌感染的处方治疗，并且具有不同的作用机理。图10A-F显示了在含有葡萄糖-d7的培养基中培养1h后，不用抗生素处理(对照组)和用终浓度为20ug/ml的各种抗生素处理后VSE的SRS成像结果。仅在万古霉素和利奈唑胺处理的细菌中观察到C-D信号显著降低。因此，根据我们的代谢成像方法，可以得出结论：粪肠球菌31970对万古霉素和利奈唑胺敏感，但对达托霉素，庆大霉素和红霉素具有抗性。通过常规的培养方法确定这些抗生素对VSE的MIC值，结果如下表1所示。VSE对这5种抗生素的敏感性与我们的代谢成像方法确定的结果一致。
表1各种抗体对粪肠球菌31970的MIC(ug/ml)值
| 抗生素 | 庆大霉素 | 利奈唑胺 | 红霉素 | 万古霉素 | 达托霉素 |
| MIC(ug/ml) | >256 | 2 | >256 | 1 | 32 |
为了验证该方法适用于其他细菌，使用对奥沙西林具有抗性的敏感菌株(MIC0.0625ug/ml)，金黄色葡萄球菌进行测试。通过SRS成像，可以在含有葡萄糖-d7的培养基中培养0.5h的单个细菌中观察到葡萄糖-d7的代谢活性(图11B)。当用1.3ug/ml的奥沙西林(oxacillin)处理细菌0.5h时，与未使用奥沙西林处理的对照1101相比，易感菌株1103的CD峰减少(图11C)，抗性菌株未观察到显著变化(图11D)。因此，敏感和耐药的金黄色葡萄球菌可以在大约0.5小时内确定。
本申请进一步提供了一种代谢成像方法，其可以在约30分钟内通过在单细胞水平上监测细菌的代谢活性来确定活菌对抗生素的敏感性和MIC值。此方法可将AST所需的时间从基于传统培养的方法的至少16h到24h减少到0.5h。基于代谢成像的单个细菌水平的AST尤其适用于不可培养或难养的细菌，因为代谢活动比表型生长快，细菌可能不需要复制以检测代谢活性对抗生素处理的反应。
对D2O的SRS成像是利用铜绿假单胞菌展示重水的代谢活性来说明的。对于广谱C-D振动光谱来说，与啁啾SRS相比，细菌的信号可以通过约5倍以上飞秒SRS改进而不用啁啾。细菌中的D2O代谢可能对不同的抗生素产生不同的反应，最快约10分钟，这取决于使用SRS显微镜进行代谢活性研究的单个细菌的敏感性，以及对通常对不同细菌能起作用的快速AST的敏感性。
首先通过在含有D2O的培养基中细菌的生长情况来测试D2O对细菌的毒性。将三种类型的细菌(大肠杆菌，金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌)在含有不同浓度D2O含的LB培养基中培养，并通过测量在约600nm处的光密度(OD)监测其生长。浓度高达100％的D2O也没有对大肠杆菌(E.coli)和金黄色葡萄球菌(S.aureus)的生长表现出明显的毒性，如各种浓度的D2O培养基中的生长曲线所示(图15A-B)。铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)的生长最初在D2O浓度为70％以上的LB培养基中减慢，但在D2O浓度为70％和80％的培养基中培养约18小时、D2O浓度为100％的培养基中培养约22小时后，最终恢复到正常生长(图15c)。因此，培养基中的D2O不会对细菌产生明显的毒性。
用D2O浓度为70％的LB培养基培养细菌，并使用铜绿假单胞菌作为模型来测试单一细菌中D2O的代谢活性是否可以通过SRS显微镜监测。将铜绿假单胞菌分别在正常LB培养基(Normal LB)和含70％D2O的LB培养基中培养约2小时，然后离心并用水洗涤除去培养基。参照图16A，在含有D2O的培养基中培养的细菌，C-D振动区域的高密度细菌的自发拉曼光谱显示在约2070cm-1至约2250cm-1之间有一个宽峰1601，这就表明D2O已经成功用于生物分子合成。而对照组，在正常培养基中培养的细菌1603在该区域没有出现该峰(图16A)。为了使单个细菌成像，将细菌进一步稀释并沉积在琼脂糖凝胶板上。通过将SRS频率调整到大约2162cm-1的CD区域，可以观察到在含有D20的培养基中培养的单个细菌的强信号(图16B，右)。作为对照，在正常培养基中培养的细菌未观察到CD信号(图16B，左)。这一结果也在通过啁啾泵浦和斯托克斯飞秒脉冲的时间调节获得的SRS光谱中(图16C)得到了证实。
为了进一步改进单个细菌的C-D信号，对非啁啾飞秒脉冲进行测试以改善啁啾皮秒脉冲的信噪比(SNR)。因为CD振动带相对较宽，约180cm-1的宽度(图16C)，所以没有啁啾的飞秒SRS可能会进一步增加SNR。为此，我们在含有70％D20的LB培养基中培养铜绿假单胞菌30min，然后通过啁啾皮秒脉冲和非啁啾飞秒脉冲在2162cm-1处成像，结果分别显示在图17A和图17C中，其中2rods表示使用2根SF57玻璃棒啁啾，No rods表示不作啁啾。调节泵浦和斯托克斯功率以确保在样品上使用相同的平均泵和斯托克斯功率。皮秒和飞秒SRS的单个细菌的信噪比(SNR)分别为1.43和7.81，表明飞秒SRS相对于皮秒SRS的SNR改善约5.44倍，结果如图17B和17D所示，其中pixels表示像素。这种改进可以归因于设置的两个不同方面，一个是CD振动带很宽，飞秒SRS可以检测到比啁啾皮秒SRS更宽的频带信号。第二，啁啾脉冲可以降低脉冲的峰值功率。尽管在样品上使用了相同的平均功率，但由于SRS的非线性效应，减少的峰值功率会明显降低SNR。
利用飞秒SRS成像可以检测到单个铜绿假单胞菌中D2 0代谢活性随使劲按的变化。首先在含有约70％D20的LB培养基中将铜绿假单胞菌培养达到约3小时，在不同时间点，取出约500ul细菌离心，洗涤并沉积在琼脂糖凝胶板上以进行成像。图18A显示了在2162cm-1处对单个铜绿假单胞菌进行SRS成像，在短短约10分钟后即可观察到单个铜绿假单胞菌的C-D信号。统计分析表明，单个细菌的平均C-D信号强度随时间增加，并在约1.5小时达到饱和，如图18C所示，这是因为在LB培养基中培养的铜绿假单胞菌的生成时间为24-27min，大约是三代。为了更清楚地观察单个细菌，图18A中的图像在图18B中被进一步放大。有趣的是，图18B显示了10分钟的结果，在细菌的细胞外围观察到了更强的信号，结果见图18D所示的细菌强度图。相反，在30min内和30min之后，图17B显示在细菌细胞中心的信号强度更强，结果见图18E所示的30min内细菌强度图。总体而言，这些结果表明，水最初用于合成铜绿假单胞菌的细胞膜和/或细胞壁。
将铜绿假单胞菌在含有70％D20的LB培养基中培养，并添加20ug/ml庆大霉素或头孢噻肟，以确定抗生素对细菌中D20代谢活性的影响，并且这种情况也适宜用于利用SRS成像的快速AST。使用传统的基于培养的微量稀释方法，预先确定铜绿假单胞菌的敏感性，对庆大霉素敏感并且在该浓度下对头孢噻肟耐药。如图19A所示，在2162cm-1处的SRS成像表明加入20ug/ml庆大霉素培养后C-D信号显著降低，表明庆大霉素抑制了铜绿假单胞菌D20的代谢活性。相反，在铜绿假单胞菌中加入头孢噻肟培养后，在所有时间点在约2162cm-1处的SRS成像中都可以观察到，表明在培养基中加入头孢噻肟，铜绿假单胞菌的D20具有活跃的代谢活性。我们观察到，在培养基中加入头孢噻肟时，铜绿假单胞菌倾向于形成长杆，如图19B所示，这可能是由于头孢噻肟是β-内酰胺抗生素，它能抑制细菌细胞壁的合成，因此铜绿假单胞菌在加入头孢噻肟培养时仍然可以生长但是不能分裂。当铜绿假单胞菌用其他β-内酰胺抗生素10处理时，也可以观察到这种丝状结构。
细菌的D20代谢活性可用于快速区分细菌的抗生素敏感性，并使用细菌的平均C-D信号强度进行检测，图19C-H对三组之间进行了比较，其中Ctrl代表对照组，Gen庆大霉素处理组，Cef代表头孢噻肟处理组。对照组未经抗生素处理(图18A)，庆大霉素处理组(图19A)和头孢噻肟处理组(图19B)。为了将敏感基团和抗性基团分开，我们确定了约65％的线性阈值，该阈值是在约10min至3h的对照组所有结果图中细菌的平均C-D强度的65％，结果如图19C-H所示。此阈值可以清楚地区分敏感组和耐药组，在所有时间点，用庆大霉素处理的组始终低于阈值，而使用头孢噻肟处理的组始终高于阈值。因此，可以在短短10min内确定铜绿假单胞菌对庆大霉素和头孢噻肟的敏感性。
SRS代谢成像方法可以确定抗生素对细菌的最低抑菌浓度(MIC)，这个检测通过在含有约70％D20的LB培养基中培养铜绿假单胞菌约1小时，并且加入连续稀释浓度的庆大霉素来完成。如图20A所示，在2162cm-1处的SRS成像表明铜绿假单胞菌的D20代谢活性在加入8ug/ml或更高浓度的庆大霉素时受到抑制。对照组，在正常LB培养基中培养的铜绿假单胞菌未观察到CD信号。将铜绿假单胞菌C-D信号的平均强度进行绘制并比较，如图20B所示。在强度阈值为65％的情况下，基于SRS的D20代谢成像方法确定的MIC约为8ug/ml，这与常规基于培养方法确定的结果一致。
在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可以容易地设计出多种多样的其他布局。此外，本文中所叙述的本发明的原理，各个方面和实施例以及具体实施例旨在涵盖其结构和功能上的等同物。另外，预期这样的等同物包括当前已知的等同物以及将来开发的等同物，即，开发的执行相同功能的任何元件，而与结构无关。本文引用的所有参考文献通过引用并入。在附录A中找到其他公开内容，其全部内容通过引用合并于此。
Claims (20)
1.一种用于测定细菌对抗生素敏感性的方法，其特征在于，包括：
制备细菌固定化凝胶；在具有营养源的培养基中培养所述细菌；
将预选的抗生素添加到所述培养基中；
将所述抗生素和细菌在培养基中孵育一段预定的时间以形成样品；
离心所述样品；
洗涤所述样品；
将所述样品沉积在所述细菌固定化凝胶上；
通过相干拉曼显微镜在所述细菌固定化凝胶上收集样品的图像。
2.根据权利要求1所述的用于测定细菌对抗生素敏感性的方法，其特征在于，通过超光谱相干拉曼显微镜采集样品图像。
3.根据权利要求1所述的用于测定细菌对抗生素敏感性的方法，其特征在于，通过单频相干拉曼显微镜采集样品图像。
4.根据权利要求1所述的用于测定细菌对抗生素敏感性的方法，其特征在于，所述固定化凝胶由琼脂糖凝胶组成。
5.根据权利要求1所述的用于测定细菌对抗生素敏感性的方法，其特征在于，所述营养源具有单一的碳源，所述营养源仅由0.1-10％的葡萄糖-d7组成。
6.根据权利要求1所述的用于测定细菌对抗生素敏感性的方法，其特征在于，所述营养源由含有0-100％二氧化氘的培养基组成。
7.根据权利要求1所述的用于测定细菌对抗生素敏感性的方法，其特征在于，所述营养源由葡萄糖-d7和二氧化氘组成。
8.根据权利要求1所述的用于测定细菌对抗生素敏感性的方法，其特征在于，所述拉曼显微镜收集样品的图像为拉曼成像，所述拉曼成像可以是受激拉曼散射成像、相干反斯托克斯拉曼散射成像或相干拉曼诱导的克尔效应成像。
9.一种用于收集抗生素敏感性测试图像的超光谱受激拉曼散射成像设备，其特征在于，所述设备包括：
具有80MHz重复率的双输出飞秒脉冲激光器，所述双输出飞秒脉冲层包括：
泵浦光束；
斯托克斯光束；
所述斯托克斯光束路径由声光调制器调制；
所述泵浦光束路径具有平移台以调谐所述泵浦光束和所述斯托克斯光束之间的延迟；
组合器，所述组合器用于组合所述泵浦光束和所述斯托克斯光束；
激光扫描显微镜，所述激光扫描显微镜具有用于将泵浦光束和斯托克斯光束聚焦在样品上的物镜；
油冷凝器，所述油冷凝器用于从所述样品收集激光；
滤光器，所述滤光器位于所述聚光器之后，并且用于滤除所述斯托克斯光束；
光电二极管，所述光电二极管位于滤光器之后，用于检测泵浦光束；
锁定放大器，所述锁定放大器用于提取泵浦光束信号损耗。
10.根据权利要求9所述的用于收集抗生素敏感性测试图像的超光谱受激拉曼散射成像设备，其特征在于，还包括啁啾装置，所述啁啾装置用于在斯托克光束和泵浦光束之间形成不同的脉冲持续时间。
11.根据权利要求10所述的用于收集抗生素敏感性测试图像的超光谱受激拉曼散射成像设备，其特征在于，所述啁啾装置是两个15厘米长的SF57玻璃棒
12.根据权利要求9所述的用于收集抗生素敏感性测试图像的超光谱受激拉曼散射成像设备，其特征在于，使用一对滤光片。
13.根据权利要求9所述的用于收集抗生素敏感性测试图像的超光谱受激拉曼散射成像设备，其特征在于，所述激光扫描显微镜的物镜为60倍的水物镜。
14.根据权利要求9所述的用于收集抗生素敏感性测试图像的超光谱受激拉曼散射成像设备，其特征在于，所述泵浦光束的脉冲持续时间在1.5和2ps之间，所述斯托克斯光束的脉冲持续时间在1.0和1.4ps之间。
15.根据权利要求9所述的用于收集抗生素敏感性测试图像的超光谱受激拉曼散射成像设备，其特征在于，所述啁啾装置用于形成泵浦光束的1.9ps和斯托克斯光束的1.3ps的脉冲持续时间。
16.根据权利要求9所述的用于收集抗生素敏感性测试图像的超光谱受激拉曼散射成像设备，其特征在于，所述泵浦光束是具有泵浦光束路径的120-fs可调谐激光器，所述斯托克斯光束是以1040nm为中心的具有斯托克斯光束路径的220-fs激光器。
17.一种使用显微镜快速确定细菌对抗生素敏感性的方法，其特征在于，包括：在具有营养源的培养基中培养细菌；
将具有预选的浓度的抗生素添加到所述培养基中以形成样品；
将样品在培养基中孵育一段预定的时间；
离心样品；
洗涤样品；
将样品沉积在细菌固定化凝胶上；
使用相干拉曼显微镜对固定化凝胶上的细菌样品进行成像。
18.根据权利要求17所述的使用显微镜快速确定细菌对抗生素敏感性的方法，其特征在于，所述相干拉曼显微镜包括受激拉曼散射系统。
19.根据权利要求18所述的使用显微镜快速确定细菌对抗生素敏感性的方法，其特征在于，所述刺激拉曼散射系统使用泵浦光束和斯托克斯光束，所述泵浦光束和斯托克斯光束用一个或多个玻璃棒啁啾，从而为泵浦光束和斯托克斯光束之间产生l-2ps的脉冲持续时间。
20.根据权利要求19所述的使用显微镜快速确定细菌对抗生素敏感性的方法，其特征在于，所述显微镜系统还包括可以调谐所述泵浦光束和所述斯托克斯光束之间的延迟的平移台。
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