CN108904507A

CN108904507A - P2x3受体调节剂苯并咪唑化合物在制备抗呼吸疾病药物中的应用

Info

Publication number: CN108904507A
Application number: CN201810430604.8A
Authority: CN
Inventors: 赖英杰
Original assignee: 赖英杰
Current assignee: CHEN-STONE (GUANGZHOU) Co.,Ltd.
Priority date: 2018-02-11
Filing date: 2018-05-08
Publication date: 2018-11-30

Abstract

本发明公开了P2X3受体调节剂苯并咪唑化合物在制备抗呼吸疾病药物中的应用。所述的苯并咪唑化合物其通式为：

Description

P2X3受体调节剂苯并咪唑化合物在制备抗呼吸疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及P2X3受体调节剂苯并咪唑化合物在制备抗呼吸疾病药物中的应用。

背景技术

呼吸系统疾病是一种常见病、多发病，主要病变在气管、支气管、肺部及胸腔。更应重视的是，由于大气污染及其他因素，使国内外的慢性阻塞性肺疾病(chronicobstructive pulmonary disease，COPD)、慢性咳嗽(chronic cough)、肺癌(lungcancer)、肺纤维化(lung fibrosis)、肺动脉高压(pulmonary artery hypertension)、哮喘(asthma)的发病率、死亡率有增无减。

慢性阻塞性肺病是一种不完全可逆气流受限的气道慢性炎症性疾病。长期有害颗粒(如香烟烟雾、粉尘等)吸入与其发病密切相关，其发病机制尚不明确，主要认为是气道慢性炎症。COPD的发病率逐年上升，WHO预测COPD将在2030年上升为第三大致死性疾病，因此预防COPD并研究其发病机制、病理生理过程，找到有效的能够干预其发生及发展的方法及药物就显得尤为重要。

慢性咳嗽是呼吸内科门诊常见的就诊症状，严重影响患者生活质量。慢性咳嗽的病因比较复杂，除可由呼吸系统疾病引起外，还可与肺外疾病有关，所以许多患者常无法及时获得正确诊治。

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位。

慢性阻塞性肺疾病是一种具有气流阻塞特征的慢性支气管炎和(或)肺气肿，可进一步发展为肺心病和呼吸衰竭的常见慢性疾病。其与有害气体及有害颗粒的异常炎症反应有关，致残率和病死率很高，全球40岁以上发病率已高达9％～10％。

肺动脉高压是常见的心血管病症，通常因肺小动脉的血管痉挛、内膜增生及重构导致肺血管阻力进行性加重，最终引起右心室功能衰竭和死亡，故防治肺动脉高压及右心室重构具有重要的临床意义。目前对右心室重构的研究相当有限，且临床无针对性抗右心室重构药物。

具有以下结构的化合物2-((2-(2,6-二氟-4-(甲基氨甲酰基))苯基)-5-甲基-1H-苯并[d]咪唑-1-基)甲基)吗啉-4-羧酸甲酯(2-[2-(2,6-Difluoro-4-methylcarbamoyl-phenyl)-5-methyl-benzoimidazol-1-ylmethyl]-morpholine-4-carboxylic acidmethyl ester)化合物是一种P2X3受体调节剂，已有报道用于各种疼痛的治疗(见CN102741245A)，CN101903359A、CN102803245A、CN103153968A和CN103140221A等文献也有类似的报道。

目前，已有用于治疗急性、亚急性或慢性咳嗽的二氨基吡啶P2X3和P2X2/3受体调节剂的文献报道(CN105682659A及WO2015027212A1)，也有用于治疗高血压与偏头痛的报道(WO2016004358A1)，但是关于P2X3受体调节剂用于治疗COPD或PAH等呼吸疾病的报道还没有出现。

发明内容

本发明的目的在于公开P2X3受体调节剂苯并咪唑化合物在制备抗呼吸疾病药物中的应用。

本发明所采取的技术方案是：

P2X3受体调节剂苯并咪唑化合物或其组合物在制备抗呼吸疾病药物中的应用，所述的苯并咪唑化合物如通式(1)所示：

应用所述的抗呼吸疾病药物为治疗和/或预防和/或延缓和/或辅助治疗呼吸疾病的药物。

应用所述的呼吸疾病为慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化、肺动脉高压、哮喘中的至少一种。

应用中，P2X3受体调节剂苯并咪唑化合物的组合物包括下列物质中的至少一种：a)化合物，b)该化合物在药学上可接受的盐，c)该化合物的水合物，d)该化合物的溶剂化物，e)该化合物的多晶型物，f)该化合物的互变异构体，g)该化合物的前药；其中，所述的化合物如通式(1)所示。

应用中，P2X3受体调节剂苯并咪唑化合物的组合物还包括药学上可接受的辅料。

本发明的P2X3受体调节剂苯并咪唑化合物可用于制备治疗和/或预防和/或延缓和/或辅助治疗呼吸疾病的药物，尤其是能明显改善COPD受损的肺功能，也能明显降低肺动脉高压，改善肺组织纤维化沉积，具有十分良好的治疗效果，其临床应用价值高，使用前景广阔。

具体而言：

1)本发明的苯并咪唑化合物CS5024在慢性阻塞性肺病试验中，对于减小呼吸道吸气和呼气阻力，增大肺顺应性方面效果非常好。在减少肺部炎性细胞数量方面也起到了良好的效果。可见该化合物能明显改善COPD大鼠受损的肺功能，具有良好的治疗效果。

2)本发明的苯并咪唑化合物CS5024在肺动脉高压试验中，显示出明显降低肺动脉血压及右心室功能的药效。右心室收缩压在给药后，显著低于造模组，右心室肥大的状况也得到明显改善，证明该化合物具有十分良好的治疗效果。

3)本发明的苯并咪唑化合物CS5024在肺纤维化试验中，对BLM诱导的肺纤维化小鼠的肺间质组织中的纤维化沉积有明显的降低作用，并且能够抑制小鼠肺组织中炎症细胞如白细胞，碱性粒细胞和淋巴细胞的浸润，证明该化合物对改善肺纤维化沉积具有良好的治疗效果。

附图说明

图1是待测化合物对COPD试验中大鼠体重的影响图；

图2是待测化合物对COPD试验中大鼠Penh的影响图；

图3是待测化合物对COPD试验中大鼠肺功能FEV0.1/FVC的影响图；

图4是待测化合物对COPD试验中大鼠肺功能FEV0.3/FVC的影响图；

图5是待测化合物对COPD试验中大鼠肺功能RL area的影响图；

图6是待测化合物对COPD试验中大鼠肺功能RE area的影响图；

图7是待测化合物对COPD试验中大鼠肺功能Cydn的影响图；

图8是待测化合物对COPD试验中大鼠BALF中免疫细胞数量的影响图；

图9是待测化合物对COPD试验中大鼠BALF中免疫细胞数量占白细胞总数的影响图；

图10是受试化合物对肺动脉高压试验中大鼠体重的影响图；

图11是受试化合物对肺动脉高压试验中大鼠右心室压力的影响图；

图12是受试化合物对肺动脉高压试验中大鼠右心室肥大指数的影响图；

图13是受试化合物对肺纤维化试验中小鼠体重的影响图；

图14是受试化合物对肺纤维化试验中小鼠死亡率指标的影响图；

图15是受试化合物对肺泡灌洗液中小鼠白细胞数目计数图；

图16是受试化合物对肺泡灌洗液中小鼠淋巴细胞数目计数图；

图17是受试化合物对肺泡灌洗液中小鼠碱性粒细胞数目计数图；

图18是受试化合物对Masson染色病理切片的Ashcroft score评分图。

具体实施方式

进一步的，应用中，所述的抗呼吸疾病药物为治疗和/或预防和/或延缓和/或辅助治疗呼吸疾病的药物。

进一步的，应用中，所述的呼吸疾病为慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化、肺动脉高压、哮喘中的至少一种。

进一步的，应用中，P2X3受体调节剂苯并咪唑化合物的组合物包括下列物质中的至少一种：a)化合物，b)该化合物在药学上可接受的盐，c)该化合物的水合物，d)该化合物的溶剂化物，e)该化合物的多晶型物，f)该化合物的互变异构体，g)该化合物的前药；其中，所述的化合物如通式(1)所示。

进一步的，应用中，P2X3受体调节剂苯并咪唑化合物的组合物还包括药学上可接受的辅料；优选的，所述的辅料包括下列物质中的至少一种：溶剂、抛射剂、增溶剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂与反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂。

药学上可接受的盐是指把母体化合物中的碱性基团转换成盐的形式。药学上可接受的盐包括，但不仅限于，碱性基团例如胺(氨)基的无机或有机酸盐类。本发明药学上可接受的盐可以由母体化合物合成，即母体化合物中的碱性基团与1-4当量的酸在一个溶剂系统中反应。合适的盐列举在Remington’s Pharmaceutical Sciences,17th ed.,MackPublishing Company,Easton,Pa.,1985,1418和Journal of Pharmaceutical Science,66,2,1977中。

药学上可接受的酸加成盐可以由无机和有机酸制备。由衍生酸加成盐的无机酸包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等。由衍生酸加成盐的有机酸包括乙酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、丙二酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、苯磺酸等。衍生酸加成盐的无机酸和有机酸尤其选自盐酸、磷酸、硫酸、硝酸、高氯酸、氢溴酸、乙酸、苯甲酸和对甲苯磺酸。

为了制备固体组合物如片剂，将主要的活性组分与药物赋形剂(或载体)进行混合以形成固体预配制组合物，其包含本发明的化合物的均匀混合物。当称这些预配制组合物为均匀的时候，它是指活性组分被均匀分散在整个组合物中，以致组合物可以容易地被细分成相同有效的单位剂型如片剂、丸剂以及胶囊剂。

本发明的片剂或丸剂可以被涂布或用其它方式被复合以提供一种具有延长作用优点的剂型，或保护片剂或丸剂免受胃中酸性条件的作用。例如，片剂或丸剂可以包括内剂量和外剂量成分，后者具有在前者之上的外皮的形式。可以用肠溶层来分隔两种成分，其中肠溶层用来阻止在胃中的崩解以及允许内成分完整进入十二指肠或被延迟释放。各种材料可以用于这样的肠溶层或涂层，上述材料包括许多高分子酸以及高分子酸与这样的材料如虫胶、十六烷醇、以及醋酸纤维素的混合物。

用于吸入法或吹入法的组合物包括在药学上可接受的含水溶剂或有机溶剂、或其混合物中的溶液和悬浮液，以及散剂。液体或固体组合物可以包含如上文所述的适宜的药用赋形剂。优选的，通过口服或鼻呼吸途径给予这些组合物以获得局部或全身效应。可以通过使用惰性气体来雾化在优选的药学可接受的溶剂中的组合物。可以直接从雾化装置吸入雾化溶液，或雾化装置可以连接于面罩帐状物、或间歇正压呼吸机。可以由以适当方式递送剂型的装置，优选口服或鼻途径，给予溶液、混悬剂、或散剂组合物。

本发明的化合物和药学上可接受的盐还包括溶剂化物或水合物的形式。一般来说，溶剂化物或水合物的形式与非溶剂化的或非水合的形式等同，并涵盖在本发明的范围内。本发明中的某些化合物有可能存在多晶体或无定形的形式。总的来说，所有的物理形式具有同等的用途，并且涵盖在本发明的范围内。

本发明的化合物还包括互变异构体形式。互变异构体形式来源于一个单键与相邻的双键交换并一起伴随一个质子的迁移。

本发明还包括所述化合物的前药。前药是一个药理物质(药物)，由母体药物衍生而来。一旦进入体内，前药就被代谢转变成母体药物。前药可通过对母体药物的一个或多个官能团进行取代而制备，其取代基团在体内将被降解而释放出母体化合物来。前药的制备和使用可在T.Higuchi and V.Stella,“Pro-drugs as Novel Delivery Systems,”Vol.14of the A.C.S.Symposium Series和Bioreversible Carriers in Drug Design,ed.Edward B.Roche,American Pharmaceutical Association and Pergamon Press,1987中找到。

本发明还提供包括通式化合物或其药学可接受的盐或其前药以及至少一种药学上可接受的载体的药物组合物。本发明的药物组合物可口服，针剂注射，喷雾吸入，皮外用，直肠用，鼻腔用，阴道用，腹腔用，或通过植入储液囊或透皮贴剂等途径而使用。

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。

一、通式(1)化合物(化合物CS5024)的制备

1、化合物2的合成

将化合物1(10g，53.7mmol)加入到250mL反应瓶中，加入100mL二氯甲烷和三滴N,N-二甲基甲酰胺，氮气置换后，于冰水浴下搅拌。滴加入草酰氯(10.2g，80.6mmol)，控制内温<40℃，保温搅拌0.5小时。冷却至0℃，滴加入甲氨溶液(40％，13g)，控温<7℃，搅拌0.5小时。

通过TLC监控反应，原料反应完，加入1M盐酸溶液(60mL)淬灭反应，升至室温，静置分相，得到有机相，减压浓缩得到浓缩物A，水相浓缩得到浓缩物B，将所有浓缩物混合后，柱层析分离(PE/EA＝10/1to 3/1)，得到黄色固体(9.9g)。

¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:3.03-3.04(d,J＝4Hz,3H),6.48(br,1H),7.41-7.43(J＝8,2H),10.37(br,1H)；MS(ESI)m/z:200.1[M+H]⁺.

2、化合物5的合成

室温下，于250mL单口瓶中加入二甲亚砜(70mL)，搅拌下加入化合物3(14g，64.7mmol)，加入2,5-二甲基硝基苯(10.0g，64.7mmol)，加入碳酸钙(6.48g，64.7mmol)。设置外温115℃，加热搅拌16小时。

通过TLC监控反应，确认反应完全后，过滤，滤液加入甲基叔丁基醚(200mL)和水(200mL)，进行洗涤，水相用甲基叔丁基醚(100mL x4)萃取，合并有机相，减压浓缩，得到油状物(26g)。将其用于下一步骤而没有进一步纯化。MS(ESI)m/z:374.1[M+Na]⁺.

3、化合物6的合成

室温下，将化合物5(26g，74mmol)粗品加入到500mL单口瓶中，加入甲醇(300mL)，搅拌使其溶解，加入冰乙酸(44.5g，740mmol)，分批加入Zn粉(48.4g，740mmol)，控制温度<50℃。撤掉冰水浴，室温搅拌1小时。

通过TLC监控反应，确认反应完全后，过滤，滤液于60℃下减压浓缩，得到浓缩物。浓缩物加入水和二氯甲烷，萃取，有机相浓缩后得到23g粗品。柱层析分离(PE/EA＝10/1to4/1)，得到13.9g产品。乙酸乙酯冲洗柱子，得到4.6g。将其用于下一步骤而没有进一步纯化。MS(ESI)m/z:322.2[M+H]⁺.

4、化合物7的合成

室温下，在500mL单口瓶加入化合物3(16.48g，51.34mmol)，加入甲醇(300mL)，加入冰乙酸(15.4g，256.2mmol)，加入化合物5(10.21g，51.34mmol)，室温下搅拌16小时。

TLC监控反应，原料反应完，减压浓缩除掉甲醇，加入二氯甲烷(200mL)和水(200mL)进行萃取，水相再用二氯甲烷(200mL x2)反萃。合并有机相，干燥，浓缩得到浓缩物，柱层析分离(PE/EA＝3/1to 1/1)，得到化合物6(12.3g)。

¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ:1.39(s,9H),2.38(t,J-11.59Hz,1H),2.50-2.57(m,3H),2.72(d,J＝10.0Hz,1H),3.00(d,J＝4.65Hz,3H),3.23(br.s.,1H),3.49-3.82(m,4H),3.82-4.15(m,2H),7.23(d,J＝8.20Hz,1H),7.36-7.49(m,3H),7.63(s,1H),8.96-9.06(m,1H)。MS(ESI)m/z:501.2[M+H]+.

5、化合物8的合成

室温下，在250mL单口瓶加入化合物6(12.3g，24.50mmol)，冰水浴下加入盐酸乙醇溶液(37mL，245.00mL，6.7mol/L)，室温搅拌3小时。

LC-MS监控反应，原料反应完，减压浓缩得到固体(12g)。粗品加入乙醇(25mL，2vol)，60℃下加热搅拌使其完全溶解后，滴加入异丙醚(25mL)，析出晶体后，开始降温至室温，搅拌12小时，过滤，滤饼用乙醇/异丙醚(1:1)洗涤，再用异丙醚洗涤，得到白色固体(7g)，纯度为96％；母液得到5g。白色固体再次结晶，加入乙醇(28mL)，60℃下加热搅拌使其完全溶解后，滴加入异丙醚(5mL)，析出晶体后，开始降温并缓慢滴加异丙醚(25mL)，搅拌12小时，过滤，滤饼用乙醇/异丙醚(1:2)洗涤，再用异丙醚洗涤，得到白色固体(6.5g)，纯度为99％。

¹H NMR(DMSO,400MHz)δ:2.51(s,3H),2.68-2.76(m,2H),2.83(s,3H),3.01-3.04(d,J＝12,1H),3.36-3.39(d,J＝12,1H),3.50-3.56(m,1H),3.65-3.66(m,1H),3.96-4.02(m,1H),4.32-4.36(m,1H),4.65-4.68(m,1H),7.39-7.41(d,J＝8,1H),7.66(s,1H),7.87-7.89(d,J＝8,2H),7.91-7.93(d,J＝8,1H),9.10(br,1H),9.63(br,2H).m/z:401.2[M+H]⁺.

6、目标化合物9(化合物CS5024)的合成

室温下，在250mL单口瓶加入化合物7(6.5g，14.9mmol)，加入二氯甲烷(100mL)，冰水浴下搅拌下，加入氢氧化钠溶液(3g in 100mL H₂O)，搅拌2小时。分相得到有机相，水相再用二氯甲烷反萃，合并有机相，干燥，浓缩，得到白色泡沫固体6g。

室温下，在250mL三口瓶加入白色泡沫固体(6g，15.0mmol)，加入二氯甲烷(50mL)，0℃下滴加入N，N-二异丙基乙胺(2.7g，22.0mmol)，-2℃下滴加入氯甲酸甲酯(2.1g，22.0mmol)，滴加完毕后，维持0℃下搅拌0.5小时。

LC-MS监控反应，原料反应完，加入水(50mL)淬灭反应，分相，得到的水相再用二氯甲烷反萃(100mL x2)，合并有机相，干燥，浓缩，得到白色泡沫状固体化合物8(6.5g，purity＝98.4％)。

再次采用PE/EA体系，经快速硅胶柱纯化，可以得到6g合格产品(HPLC>99％)。

¹H NMR(CDCl₃,400MHz):δ:2.46-2.52(t,J＝12,1H),2.56(s,3H),2.78-2.84(t,J＝12,1H),3.03-3.04(d,J＝4,3H),3.27(br,1H),3.59-3.77(m,6H),3.86-4.12(m,3H),7.24-7.26(d,J＝8,1H),7.40-7.42(d,J＝8,1H),7.66(s,1H),8.58(br,1H).MS(ESI)m/z:459.2[M+H]⁺.

二、化合物CS5024在大鼠COPD动物模型中的药效研究

生物活性测定

由于吸烟是COPD发病的主要原因，因此用熏烟的方法建立COPD模型符合COPD发病的病理生理过程，是研究COPD的最理想建模方法。本发明即采用被动熏吸香烟的方法建立大鼠的COPD模型，并采用阳性药Roflumilast(Rof)作为对比(可参看CN1126468A相关的报道)，探讨待测化合物CS5024在大鼠COPD模型中药效及可能机制。

1.实验动物

1.1采购SPF级SD大鼠，雄性，180-220g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

1.2动物实验适应：动物到达药明康德设施后，将其饲养于严格控制环境条件的动物饲养间中，饲养间的温度维持在20～24℃，湿度30～70％。通过温湿度计对饲养间的温度和湿度进行实时监控，并且每天对温度和湿度记录两次(上午和下午各1次)。动物饲养间的采光由一个电子定时开灯系统来控制，每天开灯12小时关灯12小时(7:00AM点开灯，19:00PM关灯)。

1.3本实验所用大鼠是用于评估临床前药效实验的最常用的标准啮齿类动物。本实验是在没有合适的非动物替代情况下进行的，而且在最低限度使用动物数量条件下完成的。

2.待测化合物及主要试剂的配置

2.1待测化合物

化合物	纯度	分子量	保存温度
				CS5024	>99％	458.18	4℃

2.2主要试剂及待测化合物的配备

2.2.1 20％羟丙基环糊精(sigma 332593)：

精确称取适量10g溶于50mL生理盐水，4℃保存，有效期为7天。

2.2.2待测化合物的配制

称取定量的待测化合物溶解于20％羟丙基环糊精中，4℃保存，有效期为7天。

3.实验仪器

3.1被动吸烟染毒系统：PAB-S200，北京贝兰博科技有限公司

3.2无创Penh测定系统：500654，Buxco

3.3动物肺功能分析系统：AniRes2005，北京贝兰博科技有限公司

3.4全自动血液分析仪：ADVIA 2120，SIEMENS

3.5离心机：5810R，Eppendorf

4.实验过程

4.1实验方案

4.1.1 SD大鼠按体重随机分组，每组10只；

4.1.2烟熏造模：经香烟烟雾发生器一次性点燃15支香烟，产生的香烟注入特制烟熏箱(体积为600*800*800cm)，烟熏大鼠60min，一天两次，两次的时间间隔为4h。连续烟熏16周；

4.1.3给药：在烟熏的第5周，每天连续口服给予待测化合物，口服给药体积为2mL/kg，待测化合物的给药剂量为15mg/kg，给药时间为每天第一次烟熏前1h，一直至第16周；

4.1.4数据采集：①烟熏16周后，用Buxco无创Penh测定系统测定各实验组大鼠自然状态下的呼吸道阻力。②用70mg/kg戊巴比妥钠麻醉后，测定肺功能参数；

4.1.5取材：取肺泡灌洗液(BALF)再通过全自动血液分析仪测定BALF中各炎性细胞的数量百分比及白细胞总数量。

4.1.6时间安排表

4.2实验分组

自动物抵达设施起，实验人员及兽医进行每日笼边观察，健康状况和体重每周至少监测一次。

各实验分组情况如下表：

组别	给药	给药方式/体积	给药周期	给药剂量	烟熏周期
						Control	-	-	-	-	0
COPD	20％羟丙基环糊精	灌胃/2mL/kg	12weeks	-	16weeks
						Rof	Rof	灌胃/2mLkg	12weeks	0.4mg/kg	16weeks
CS5024	CS5024	灌胃/2mL/kg	12weeks	15mg/kg	16weeks

4.3终点检测指标

4.3.1烟熏16周各实验组大鼠的呼吸道阻力Penh。

4.3.2烟熏16周后的肺功能参数，包括：FEV0.1/FVC，FEV0.3/FVC，呼吸道吸气阻力RL area，呼吸道呼气阻力RE area，肺动态顺应性Cydn。

4.3.3BALF中的白细胞总数量及各类白细胞数量百分比。

5.实验方法

5.1 Buxco测定Penh和TV

①校准仪器；

②将待测大鼠放入对应的容器中适应5分钟；

③设置并开启程序。程序设置为：5min适应，2min给PBS，3min反应，5min恢复。

④倒出和分析数据。

5.2肺功能参数的测定

大鼠经戊巴比妥钠麻醉(70mg/kg)后，仪器测定FEV0.1/FVC，FEV0.3/FVC。

颈静脉依次给予0.0125、0.025及0.05mg/kg Mch，测定RL area，RE area，Cydn。

5.3 BALF中免疫细胞计数

①用3mL的生理盐水分三次冲洗肺，每次反复抽吸3次，置于冰上预冷的试管中，收集BALF；

②1000rpm×10min，4℃离心，沉淀用于重悬计数；

③400μl生理盐水重悬后，全自动血液分析仪进行白细胞计数。

6.数据处理

所有的数据被录入到Excel文档中，并以平均值±标准误的方式表示。实验数据统计采用非配对双尾t-test将各组数据进行两两分析比较。统计分析结果P<0.05认为有显著差异，用*表示；P<0.01，为非常显著性差异，用**表示。P<0.001，为极显著性差异，用***表示。

7.实验结果

7.1 COPD大鼠一般状态的观察

动物在烟熏后期毛色发黄，轻度掉毛，伴有偶尔的咳嗽，并且出现暴躁，攻击性增强的现象。烟熏16周期间未发现其他明显的不良症状。

7.2 COPD大鼠体重的变化

烟熏大鼠的体重从烟熏第6周开始即出现体重增幅降低，较未烟熏的正常对照组大鼠体重减轻，而阳性化合物Roflumilast及待测化合物CS5024处理大鼠的体重并不能恢复，相比正常对照组仍然减轻。待测化合物对COPD试验中大鼠体重的影响见附图1。

7.3待测化合物对COPD大鼠Penh的影响

烟熏16周后的大鼠，自然状态下的呼吸道阻力Penh相比正常大鼠已明显增大，Rof和CS5024给药干预组的Penh相比烟熏大鼠均减小，且与正常大鼠已无显著性的差异。待测化合物对COPD试验中大鼠Penh的影响见附图2。

7.4待测化合物对COPD大鼠肺功能变化的影响

肺功能是作为气流受限的重要客观指标，被认为是评定COPD的金标准，此次研究从FEV0.1/FVC(0.1s用力呼气容积与用力肺活量的比值)、FEV0.3/FVC(0.3s用力呼气容积与用力肺活量的比值)、RL area(呼吸道吸气阻力)、RE area(呼吸道呼气阻力)、Cydn(肺动态顺应性)等指标展开研究。

COPD组大鼠FEV0.1/FVC，FEV0.3/FVC较未烟熏大鼠极显著性降低，阳性药Rof及CS5024，给药12周后，FEV0.1/FVC，FEV0.3/FVC较COPD模型组非常显著性的增大，而均与正常组相比无显著性差异。这表明Rof和CS5024均能明显改善COPD大鼠气流受限的状况。待测化合物对COPD试验中大鼠肺功能FEV0.1/FVC和FEV0.3/FVC的影响分别见附图3和附图4。

本发明采用了0.025、0.05、0.1mg/mL Mch三个不同浓度来诱导测定RL area、REarea、Cydn。COPD组大鼠RL area在三个浓度Mch刺激下，较正常组均有所增大，其中在0.1mg/mL Mch刺激下增大的最为明显，但尚未与正常组形成显著性差异。在阳性药Rof，及CS5024给药后，RL area均下降，且与正常组相比无明显差别，但相比COPD组分别显著和非常显著的减小。COPD组大鼠RE area均较未烟熏的大鼠增大，但三个浓度下的RE area，都未达到显著性差异。其中CS5024给药组，在0.1mg/mL Mch诱导下，RE area较COPD大鼠具有显著性降低。Cydn在0.025、0.05、0.1mg/mL Mch诱导下，分别显著，极显著，非常显著的降低，在分别给予阳性药Rof，CS5024后，Cydn均升高，其中Rof给药后，在0.025和0.1mg/mL Mch刺激下均与正常大鼠无显著性差别，且0.1mg/mL Mch诱导下，Rof给药组大鼠Cydn相比COPD大鼠有显著性的增大。CS5024给药组在三个浓度Mch诱导下的Cydn分别非常、非常显著、显著的升高。待测化合物对COPD试验中大鼠肺功能RL area、RE area和Cydn变化的影响分别见附图5、6和7。

7.5待测化合物对COPD大鼠BALF中免疫细胞数量的影响

烟熏16周后，COPD组大鼠白细胞总数极显著性的增多，Rof和CS5024给药组白细胞总数降低，且均与正常组相比，无显著性差异，相比COPD大鼠Rof给药组白细胞总数具有显著性降低。COPD大鼠的Neut的数量较未烟熏大鼠极其显著的增大，Neut占白细胞总数的比例也是非常显著性升高，Rof和CS5024给药组Neut的数量都有所降低，但都未能恢复到正常水平。Rof给药组相比COPD组，能显著性的降低Baso数量。Luc的数量在COPD组中亦显著性升高，Rof及CS5024给药组相比COPD组，都显著性的降低了Luc的数量，也显著，非常显著性的降低了Luc占白细胞总数的比例。待测化合物对COPD试验中大鼠BALF中免疫细胞数量的影响见附图8；待测化合物对COPD试验中大鼠BALF中免疫细胞数量占白细胞总数的影响见附图9。

生物实验结论

通过本发明研究发现：

1、随着烟熏的时间延长，烟熏大鼠的体重相比未烟熏大鼠体重增长幅度下降，在烟熏后期，COPD大鼠的体重比正常对照大鼠偏轻。给予阳性药Rof和待测化合物后，体重未能恢复到正常大鼠的水平。

2、烟熏16周后的大鼠，自然状态下的呼吸道阻力Penh相比正常大鼠明显增大，Rof和CS5024给药干预组，呼吸道阻力相比烟熏大鼠均减小，且与正常大鼠无显著性的差异。

3、烟熏大鼠FEV0.1/FVC，FEV0.3/FVC相比正常对照组大鼠极显著降低，阳性药Rof及CS5024，给药12周后，FEV0.1/FVC，FEV0.3/FVC较COPD模型组具有非常显著性的增大，而均与正常组相比无显著性差异。

4、在不同浓度的Mch诱导下，COPD组大鼠呼吸道吸气阻力RL area较正常组均有所增大，其中在0.1mg/mL Mch刺激下最为明显，但尚未与正常组形成显著性差异。阳性药Rof，及CS5024给药12weeks后，RL area均下降，且与正常组相比无显著性差异，而相比COPD组分别显著和非常显著的减小。

5、与此同时，呼吸道呼气阻力RE area的情况类似于RL area，亦是COPD组大鼠在三个浓度梯度的Mch刺激下，均显示了较正常组偏大的RE area，但仍未达到显著性差异。其中CS5024给药组，在0.1mg/mL Mch诱导下，RE area较COPD大鼠具有显著性降低。

6、烟熏大鼠，肺动态顺应性Cydn在0.025，0.05，0.1mg/mL Mch诱导下，分别显著，极显著，非常显著的降低，在分别给予阳性药Rof，CS5024后，Cydn均升高，其中Rof给药后，在0.025和0.1mg/mL Mch刺激下均与正常大鼠无显著性差异，且0.1mg/mL Mch诱导下，Rof给药组大鼠Cydn相比COPD大鼠已有显著性的增大。CS5024给药组在三个浓度Mch诱导下的Cydn分别非常、非常显著、显著的升高。

7、烟熏16周后，COPD组大鼠白细胞总数较正常大鼠极显著性的增多，Rof和CS5024给药后，白细胞总数降低，且均与正常组无显著性差异，Rof给药组相比COPD组，形成显著性降低。

8、COPD大鼠的中性粒细胞(Neut)的数量较未烟熏大鼠极其显著的增大，给药Rof和CS5024能降低Neut的数量，但未能恢复到正常水平。

9、Rof给药组相比COPD组，能显著性的降低嗜碱性细胞(Baso)数量。

10、COPD组大鼠未染色大细胞(Luc)亦显著性升高，Rof及CS5024均显著性的降低了Luc的数量。

11、COPD大鼠相比正常大鼠，Neut占总白细胞的比例非常显著增加，其他类型细胞无明显影响。Rof给药及CS5024给药均能明显降低Luc占白细胞总数的比例，且相比COPD都有显著性降低。

结论：

本发明通过长期烟熏制备经典的大鼠COPD模型，来观察待测化合物CS5024对COPD动物模型相关指标的影响，从而探索待测化合物CS5024在COPD治疗中可能具有的潜在意义。此大鼠COPD模型建立方法通过长期烟雾颗粒的吸入，导致动物的肺功能受损并伴随着许多细胞因子和炎性细胞的参与，故常通过检测呼吸道阻力、肺功能参数及支气管肺泡灌洗液中多种炎性细胞的计数来考察COPD大鼠病理学的变化。

通过观察肺功能、BALF中炎性细胞数量等指标，发现待测化合物CS5024能明显改善COPD大鼠肺功能，与此同时还减轻COPD大鼠肺部炎性程度。其效果甚至优于阳性药Roflumilast。

三、化合物CS5024在MCT诱导的SD大鼠肺动脉高压中的药效研究

生物活性测定

1.实验目的

通过使用受试化合物对野百合碱(MCT)诱导的大鼠肺动脉高压进行干预，观察受试化合物对大鼠肺动脉压力及右心室功能的影响，并探讨其可能的机制。

2.实验规范

本应用研究在上海药明康德新药开发有限公司实施，实施过程中所涉及到的所有动物实验操作，均按照药明康德IACUC规定的标准的实验动物操作规程、IACUC实验动物饲养与使用准则以及实验动物福利办公室所规定的动物福利要求来开展，此准则符合AAALAC原则。

本应用所有实验操作均严格遵守药明康德标准实验操作规程(SOP)，并按照本研究方案中所描述的实验方案来进行。

3.实验仪器及其他材料

3.1实验仪器及材料

多通道生理信号采集处理系统：型号，RM6280C；生产厂商，成都仪器厂。

精密电子天平：型号，ML203/02；生产厂商，Mettler Toledo。

电子天平：型号，JA20002；生产厂商，常州科源电子仪器有限公司。

电子天平：型号，CP225D；生产厂商，Sartorius。

移液枪：型号，F0203305A、E0204019A、D0200826A；生产厂商，RAININ。

移液枪：型号，US-patent；生产厂商，eppendorf。

药品保存箱：型号，HY-360；生产厂商，海尔。

PE导管：外径0.9mm，内径0.5mm，长度25cm。

3.2受试药和试剂：

受试化合物：CS5024；纯度：>98.5％；物理状态：白色粉末；存储条件，常温。

野百合碱(MCT)：批号，C2401-1G；厂家，sigma；储存条件，2-8℃。

0.9％氯化钠注射液：厂家，浙江都邦药业有限公司；批号，1609180111；储存条件，阴凉干燥处密闭存放。

3.3溶剂的配制及药物

1mol/L HCl：浓盐酸3mL加入ddH₂O至终体积30mL。

10mol/L NaOH：取4g NaOH溶于10mL dd H₂O。

MCT：先用少量1mol/L HCl充分溶解溶解MCT，再用10mol/L NaOH调节pH至7～7.5，最后用生理盐水调节到使用浓度30mg/mL。

溶剂：10％HP-β-CD，用ddH₂O配制。

2.5％戊巴比妥钠：用生理盐水配制。

4.实验动物

4.1动物的使用

雄性Sprague-Dawley大鼠(上海斯莱克实验动物有限公司提供)30只，清洁级，体重200g左右。

4.2动物的饲养

大鼠到达药明康德设施后，将其饲养于AAALAC认证的、严格控制环境条件的动物饲养间中，饲养间的温度维持在20～24℃，湿度维持在30～70％。通过温湿度计对饲养间的温度和湿度进行实时监控，并且每天对温度和湿度记录两次(上午10:00～10:30和下午16:00～16:30各1次)。动物饲养间的采光由电子定时开灯系统来控制，每天采用开灯12小时/关灯12小时循环(06:00AM开，18:00PM关)。实验过程中，自由饮水，自由采食。

5.实验设计

5.1大鼠肺动脉高压模型的建立

按2mL/kg的给药体积，皮下注射MCT(60mg/kg)，诱导肺动脉高压模型。并于MCT皮下注射当天开始灌胃给药，灌胃4周后测量各项指标。

5.2动物的分组

动物适应1周后，根据体重和动物状态将动物随机分为3组：Sham(阴性对照组)，Vehicle(造模组)，CS5024-20mpk。

5.3分组及给药信息表和分批给药及数据采集时间表

5.4监测指标

1)每天监测动物的一般状态及体重；

2)右心室收缩压(RVSP)；

3)测定右室肥大指数(RVHI)：右室重量/(左室重量+室间隔重量)。

5.5实验方法

5.5.1右心导管法测量大鼠RVSP

2.5％戊巴比妥钠(2mL/kg,ip)麻醉大鼠，仰位固定动物于手术板上，去掉颈部皮毛，切开颈部皮肤，钝性分离皮下组织及肌层，剥离左颈动脉及右颈静脉。将与压力换能器相连接并充满0.3％肝素钠溶液的大鼠专用右心导管(PE管，外径约1.5mm，前端为小弧形)插入右颈外静脉。操作中保持肺动脉导管的弧向下方，并将肺动脉导管向右心房方向延伸，根据压力波形判断是否到达心脏部位，将插管左旋并向前推入右心室。

5.5.2 RVHI的测定

取出心脏，去除心房及大血管，用滤纸吸干水分，剥离右心室，并称重，计算RVHI＝RV/LV+SEP。

6.数据处理

所有的数据被录入到Excel文档中，并以平均值±标准误的方式表示。实验数据统计采用单因素方差分析方法(one-way ANOVA)加Dunnett’s t test将各组数据进行分析比较。统计分析结果P<0.05认为有显著差异，用*和#表示；P<0.01，为非常显著性差异，用**和##表示；P<0.001，为极显著性差异，用***和###表示。两两比较采用非配对双尾t-test方法比较差异性。

7.实验结果

7.1大鼠的一般情况

阴性对照组大鼠体毛光滑、反应敏捷、饮食正常。模型组和治疗组具有一定程度的饮食减少、体重减轻。附图10是受试化合物对肺动脉高压试验中大鼠体重的影响图。

7.2受试化合物对大鼠各项肺动脉高压相关指标的影响

CS5024对肺动脉高压大鼠的药效可见下表：

组别	Average RVSP(mmHg)	RVHI(％)
			Sham(阴性对照组)	18.64±0.97	24.24±0.73
Vehicle(造模组)	70.05±3.52***	61.62±2.42***
			CS5024-20mpk	61.71±1.77#	56.73±1.52

注：*P<0.05,**p<0.01,***p<0.001vs阴性对照组.#p<0.05,##p<0.01,###P<0.001vs造模组。

受试化合物对肺动脉高压试验中大鼠右心室压力和右心室肥大指数的影响分别见附图11和附图12。根据上表以及图11、图12的结果表明：

1、受试化合物对RVSP的影响：与阴性对照组相比，造模组的RVSP极显著升高(P<0.001)，而经受试化合物CS5024干预后，升高的RVSP降低了，且具有显著性差异(P<0.05)。

2、受试化合物对右心肥大指数(RVHI)的影响：造模组的RVHI较阴性对照组极显著性增大(P<0.001)。受试化合物CS5024相比于造模组，RVHI有明显的降低趋势。

生物实验结论

本发明意在通过使用受试化合物CS5024对MCT诱导的大鼠肺动脉高压进行干预，观察肺动脉高压模型相关指标的变化，从而对多种受试化合物进行初步筛选，进而探索受试化合物在肺动脉高压治疗中的作用。经过研究发现，受试化合物CS5024干预可显著降低大鼠右室收缩压，以及右心室壁厚(RVHI)的改善均表明，受试化合物CS5024对右心室功能也起到很大程度的改善。

本发明通过右心导管法监测RVSP，右心导管法对动物损伤最小，所以许多实验室用RVSP间接评价肺动脉压。从结果来看，CS5024能够显著抑制RVSP的升高，提示CS5024对MCT诱导的肺动脉压力升高有抑制作用。

右心室功能是影响肺动脉高压患者预后的重要因素，改善右心室功能的治疗会对肺动脉高压的整体治疗带来显著益处。RVHI是评价右心室结构的一个指标，MCT可诱导显著的RVHI增大，并且右心室壁厚度的增厚，提示大鼠单次注射MCT，即可导致右心室的重构，而CS5024能改善上述两个指标，意味着它具有对右心室重构的抑制作用。

在以上的研究中发现CS5024对MCT诱导的肺动脉高压大鼠的右心室收缩压有降低的作用，并且能够抑制右心室重构，同时又能改善右心室功能。因此为药物研发前期化合物的筛选提供了一定的理论依据。

四、化合物CS5024在BLM诱导的C57BL/6小鼠肺纤维化中的药效研究

1.实验目的

通过使用受试化合物对博莱霉素(BLM)诱导的小鼠肺纤维化模型进行干预，观察受试化合物对小鼠肺纤维化程度影响，并探讨其可能的机制。

2.实验规范

本项目在上海药明康德新药开发有限公司(简称“药明康德”)实施，实施过程中所涉及到的所有动物实验操作，均按照药明康德IACUC规定的标准的实验动物操作规程、IACUC实验动物饲养与使用准则以及实验动物福利办公室所规定的动物福利要求来开展，此准则符合AAALAC原则。本实验属于非GLP实验。

本项目所有实验操作均严格遵守药明康德标准实验操作规程(SOP)，并按照本研究方案中所描述的实验方案来进行。

3.实验仪器及其他材料

3.1实验仪器及材料

精密电子天平：型号，ML203/02；生产厂商，Mettler Toledo。

电子天平：型号，CP225D；生产厂商，Sartorius。

移液枪：型号，US-patent；生产厂商，eppendorf。

药品保存箱：型号，HY-360；生产厂商，海尔。

3.2受试药和试剂：

博莱霉素(BLM)：批号，271830；日本株式会社；储存条件，2-8℃。

尼达尼布(Nintedanib,NTD)：Sigma,CAS：656247-17-5；分子量539.62，纯度：98％；

吡非尼酮(Pirfenidone,PFD)：Sigma,CAS：53179-13-8；分子量185.22，纯度99％；

0.9％氯化钠注射液：安徽双鹤药业有限责任公司；批号，171226 9Q；

储存条件，阴凉干燥处密闭存放。

PEG-400：Sigma；批号：BCBS 1795V；储存条件，阴凉干燥处密闭存放。

Tween-80：Sigma；批号：BCBP0905V；储存条件，阴凉干燥处密闭存放。

3.3溶剂的配制及药物

CS5024:称取后溶解于溶剂，充分搅拌至溶解；

Vehicle:25％PEG400:5％Tween80:70％ddH₂O；

BLM(博莱霉素):Saline溶解，给药体积为每只动物为50μL，给药剂量3mg/kg；

Pirfenidone：0.5％Methocel/0.2％tween-80溶解于ddH₂O；

Nintedanib：0.5％Methocel/0.2％tween-80溶解于ddH₂O；

溶剂：25％PEG-400+5％Tween-80，用ddH₂O配制。

2.5％戊巴比妥钠：用生理盐水配制。

4.实验动物

4.1动物的使用

雄性，C57BL/6小鼠(上海斯莱克实验动物有限公司提供)48只，SPF级，体重20g左右。

4.2动物的饲养

小鼠到达药明康德设施后，将其饲养于AAALAC认证的、严格控制环境条件的动物饲养间中，饲养间的温度维持在20～24℃，湿度维持在30～70％。通过温湿度计对饲养间的温度和湿度进行实时监控，并且每天对温度和湿度记录两次(上午10:00～10:30和下午16:00～16:30各1次)。动物饲养间的采光由电子定时开灯系统来控制，每天采用开灯12小时/关灯12小时循环(06:00AM开，18:00PM关)。实验过程中，自由饮水，自由采食。

5.实验设计

5.1小鼠肺纤维化模型的建立

按3mg/kg，50μl/动物的给药剂量和体积，气道注射BLM，诱导肺纤维化模型。并于BLM造模后的第7天，灌胃给药3周后测量各项指标。

5.2动物的分组

动物适应1周后，根据体重和动物状态将动物随机分为3组：Vehicle(造模组)，Pirfenidone组(阳性药组)；Nintedanib组(阳性药组)；

CS-5024-20mpk组。

5.3分组及给药信息表和分批给药及数据采集时间表

5.4监测指标

1)第21天动物体重；

2)存活率；

3)BALF细胞计数；

4)Masson染色切片及Ashcroft score。

5.5实验方法

5.5.1终点取样

最后一次给药后24h，动物经CO₂吸入法处死。仰位固定动物于手术板上，去掉颈部皮毛，切开颈部皮肤，钝性分离皮下组织及肌层，剥离气管，在气管上端剪出十字口，插入注射器改造后的灌洗管，生理盐水分3次(0.3ml，0.4ml和0.5ml)依次灌洗小鼠肺组织，最终收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)约1.3ml，离心(3000rpm，4℃，15min)，后弃上清液，之后，生理盐水重悬细胞沉淀，用全自动血细胞计数仪(SIEMENS，ADVIA 2120i)进行细胞计数；肺泡灌洗结束后，取左肺组织固定于4％的多聚甲醛中，用于Masson染色切片制作。

6.数据处理

所有的数据被录入到Excel文档中，并以平均值±标准误的方式表示。实验数据统计采用单因素方差分析方法(one-way ANOVA)加Dunnett’s t test将各组数据进行分析比较。统计分析结果P<0.05认为有显著差异，用*和#表示；P<0.01，为非常显著性差异，用**和##表示；P<0.001，为极显著性差异，用***和###表示。

7.实验结果

7.1小鼠的一般情况

阴性对照组小鼠体毛光滑、反应敏捷、饮食正常。模型组，阳性对照组和治疗组具有一定程度的饮食减少，体重减轻。实验过程中动物体重变化如附图13所示。图13的数据表明，造模组小鼠的体重在第21天显著地降低(p<0.01)。

7.2受试化合物对各组小鼠死亡率指标的影响

受试化合物对各组小鼠死亡率指标的影响可见附图14。如图14变化所示，Vehicle组，阳性药Pirfenidone组，阳性药Nintedanib组和CS-5024组动物的存活率分别为64.1％，75％，83％和55％。

7.3受试化合物对肺泡灌洗液中炎症细胞计数

受试化合物对肺泡灌洗液中炎症细胞计数的结果如图15(BALF中白细胞数目)、图16(BALF中淋巴细胞数目)和图17(BALF中碱性粒细胞数目)所示。图15、16和17的数据显示造模组Vehicle组小鼠的BALF中白细胞，淋巴细胞和碱性粒细胞的数目显著增加(p<0.01)，Pirfenidone-90mpk，Nintedanib-30mpk和CS-5024-20mpk的处理能显著降低小鼠BALF中以上三种细胞的数目(p<0.05或p<0.01)。

7.4受试化合物对Masson染色病理切片的Ashcroft score评分

受试化合物对Masson染色病理切片的Ashcroft score评分的结果如图18所示。如图18所示，Nintedanib-30mpk和CS-5024-20mpk的处理组动物能显著降低小鼠肺组织Masson染色的病理评分。

8.结论与讨论

本研究意在通过使用受试化合物对BLM诱导的小鼠肺纤维化模型进行干预，观察肺纤维化模型相关指标的变化，从而对受试化合物进行初步筛选，进而探索受试化合物在肺纤维化治疗中的作用。BLM诱导的纤维化模型是纤维化治疗药物初步筛选的经典模型，吡非尼酮和尼达尼布也是以肺纤维化模型相关药效研究的常用阳性药物，能显著降低肺组织中的纤维化沉积和炎症细胞浸润，该项目中阳性药的结果与之前的研究一致。经研究发现，受试化合物CS5024干预能显著地减少小鼠BALF中白细胞，淋巴细胞和碱性粒细胞的数目。同时，受试化合物CS5024的治疗也显著降低小鼠肺组织中纤维化程度，显著地降低小鼠肺组织Masson染色病理切片的Ashcroft score评分，表明CS5024的处理能有效降低小鼠肺组织的结构变化，尤其是组织中纤维束的形成和纤维化沉积。从数据检测结果看，CS5024对BLM诱导的肺纤维化模型表现出明显的抑制作用。

在以上的研究中发现CS5024对BLM诱导的肺纤维化小鼠的肺间质组织中的纤维化沉积有明显的降低作用，并且能够抑制小鼠肺组织中炎症细胞如白细胞，碱性粒细胞和淋巴细胞的浸润。因此为药物研发前期化合物的筛选提供了一定的理论依据。

Claims

1.P2X3受体调节剂苯并咪唑化合物或其组合物在制备抗呼吸疾病药物中的应用，所述的苯并咪唑化合物如通式(1)所示：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的抗呼吸疾病药物为治疗和/或预防和/或延缓和/或辅助治疗呼吸疾病的药物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述的呼吸疾病为慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化、肺动脉高压、哮喘中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：P2X3受体调节剂苯并咪唑化合物的组合物包括下列物质中的至少一种：a)化合物，b)该化合物在药学上可接受的盐，c)该化合物的水合物，d)该化合物的溶剂化物，e)该化合物的多晶型物，f)该化合物的互变异构体，g)该化合物的前药；其中，所述的化合物如通式(1)所示。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：P2X3受体调节剂苯并咪唑化合物的组合物还包括药学上可接受的辅料。