CN102146371B - 高抗草甘膦突变基因及其改良方法和应用 - Google Patents

高抗草甘膦突变基因及其改良方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过人工特变获得高抗草甘膦G1174基因特变体的方法：在基因G1174编码的蛋白质的第95到114位的氨基酸序列中引入2个或者2个以上的氨基酸特变，然后选择高抗草甘膦的突变体。本发明还公开了一种高抗草甘膦特变基因，其核苷酸序列为SEQIDNO：26~SEQIDNO：30中的任意一种。上述高抗草甘膦特变基因的用途是：通过转基因在植物中表达，从而使植物获得抗草甘膦能力。

Description

高抗草甘膦突变基因及其改良方法和应用
技术领域
本发明属于植物基因工程领域，具体的说，本发明涉及一种改良抗草甘膦基因的方法、抗草甘膦基因及其编码的蛋白质，以及利用这些改良的抗草甘膦基因获得转基因抗草甘膦植物的方法。本发明可以运用在作物的育种、也可以运用在植物细胞培养的筛选。 
背景技术
草甘膦是一种非常重要的除草剂，它是抑制植物中芳香族氨基酸生物合成中的一种重要的酶，即5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）。草甘膦是一种极广谱的除草剂，对农作物也同样具备杀伤力。因此为了能够在农作物生长时选择性地除草，农作物需要获得具有抗草甘膦的能力。 
草甘膦能够抑制大部分细菌中芳香族氨基酸生物合成中的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）。但部分细菌的EPSPS已发现对草甘膦具有抗性，并且被分离获得。植物可以通过转基因表达细菌的抗性EPSPS而获得抗草甘膦的能力。农杆菌(Agrobacterium tumefaciens sp CP4)和 Salmonella typhimurium CT7的EPSPS在植物中表达而获得的抗性已在生产中应用（ 美国专利453590，4769061，5094945）。但是为了提高转基因农作物的抗性水平和增加抗性基因的多样性，生产应用中仍然需要新的抗草甘膦基因和以此为基础的转基因抗草甘膦植物。 
从Deinococcus radiodurans R1获得的EPSPS基因具有相当的抗草甘膦能力（中国专利200910098129.X）。2009年申请的申请号200910098129.X的发明专利《一种抗草甘膦基因及其应用》提供了抗草甘膦基因，其中基因G1174所编码的蛋白质的氨基酸序列如该专利的SEQ ID NO：2所示。尽管D. radiodurans R1的EPSPS的抗草甘膦能力比较高，但是获得抗性更高的EPSPS改良基因仍然十分必要。提供转基因植物的抗性水平能够提高草甘膦的使用剂量，从而可以减缓抗性杂草的发生，避免使用过程中由于剂量问题而造成药害。 
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种改良抗草甘膦EPSPS基因的方法和提供一种抗草甘膦基因。这种抗性基因具有比D. radiodurans R1天然的EPSPS基因更高的抗草甘膦能力。利用这种基因可以用来产生转基因抗草甘膦植物，也可作为植物细胞培育中的筛选标记。 
为了解决上述技术问题，本发明是通过这样的技术方案来实现的：本发明提供一种通过特变获得高抗草甘膦的G1174特变基因（高抗草甘膦特变基因）的方法，在第95到114位的氨基酸序列 (Pro Gly Asn Ala Gly Ala Val Ala Arg Phe Leu Met Gly Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly)中引入2个或者2个以上的氨基酸特变，然后选择高抗草甘膦的突变体。特别是引入2个或者2个以上如下位点的特变：1）第99号甘氨酸；2)第100号丙氨酸；3）第104号苯丙氨酸；4）第106号甲硫氨酸；5）第107号甘氨酸。 
本发明同时也提供一种G1174抗草甘膦特变基因（高抗草甘膦特变基因），其编码的蛋白质包括至少2个以下位点的特变：1）第99号氨基酸从甘氨酸特变成为丙氨酸；2)第100号氨基酸从丙氨酸特变成为苯丙氨酸，或者苏氨酸，或者甲硫氨酸，或者丝氨酸；3）第104号氨基酸从苯丙氨酸特变成为亮氨酸或者丝氨酸；4）第106号氨基酸从甲硫氨酸特变成为亮氨酸或者丝氨酸；5）第107号氨基酸从甘氨酸特变成为丙氨酸。 
本发明进一步提供一种抗草甘膦G1174的特变基因（高抗草甘膦特变基因），其编码的蛋白质的第95到114位的氨基酸序列特变成为如下的任何一种： 1）SEQ ID NO：4； 2）SEQ ID NO：5； 3）SEQ ID NO：6； 4）SEQ ID NO：7； 5）SEQ ID NO：8； 6）SEQ ID NO：9； 7）SEQ ID NO:10; 8）SEQ ID NO：11; 9）SEQ ID NO：12; 10）SEQ ID NO：13; 11）SEQ ID NO：14; 12）SEQ ID NO：15; 13）SEQ ID NO：16,  14）SEQ ID NO：17， 15）SEQ ID NO：18，16）SEQ ID NO：19， 17)SEQ ID NO：20， 18)SEQ ID NO：21， 19)SEQ ID NO：22， 20)SEQ ID NO：23， 21) SEQ ID NO：24。 
本发明还提供了一种高抗草甘膦特变基因，该基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：26~ SEQ ID NO：30中的任意一种。 
本发明还提供了一种载体，其包含上述高抗草甘膦特变基因。 
本发明还提供了上述高抗草甘膦特变基因的用途：通过转基因在植物中表达，从而使植物获得抗草甘膦能力。植物为水稻、玉米、棉花、小麦、大麦、高粱、油菜、大豆、草坪草或牧草等。 
来自Deinococcus deserti VCD115和Deinococcus geothermalis的EPSPS基因(基因库：YP_002785524 和YP_604470, 专利申请200910098129.X 中提供的多肽SEQ ID NO：4；SEQ ID NO：5）和本发明所用的G1174同源性比较高，它们所编码的蛋白质和G1174相比，在相应于G1174的第95到114位的氨基酸序列是完全相同的。 本发明同时也提供一种改良这些同源基因以及其他与G1174氨基酸序列相同性至少有75%的抗草甘膦多肽的方法。这些多肽中相对应于G1174 中如下位点可以引入至少如下2个位点的特变从而筛选获得抗草甘膦能力更高的蛋白质：1）第99号氨基酸从甘氨酸特变成为丙氨酸；2)第100号氨基酸从丙氨酸特变成为苯丙氨酸或者苏氨酸或者甲硫氨酸或者丝氨酸；3）第104号氨基酸从苯丙氨酸特变成为亮氨酸或者丝氨酸；4）第106号氨基酸从甲硫氨酸特变成为亮氨酸或者丝氨酸；5）第107号氨基酸从甘氨酸特变成为丙氨酸。 
本发明进一步提供了编码高抗性的EPSPS蛋白质突变体的代表性核苷酸序列：SEQ ID NO：26， 或者SEQ ID NO：27，或者SEQ ID NO：28，或者SEQ ID NO：29，或者SEQ ID NO：30。这些基因在5’端包含了编码叶绿体信号肽的DNA片段。 
利用本发明提供的抗草甘膦基因氨基酸序列可以设计并且合成有利于在植物中表达的核苷酸序列（Campbell 和 Gowri ，Plant Physiol. 92:1-11），并进一步构建能够在植物中表达的人工基因表达框。 能够在植物中表达的人工基因表达框包括启动子、带有叶绿体信号肽的抗草甘膦基因和终止子。在植物中表达和产生抗草甘膦能力所需要的启动子、叶绿体信号肽和终止子是已经有的技术。例如，在转化单子叶植物时启动子可以是玉米Ubiqutin-1启动子，或者水稻Actin启动子；而终止子可以是来自根癌农杆菌终止子（Nos）或者其他终止子；引导抗草甘膦蛋白质进入叶绿体的信号肽可以是Rubisco的亚基的信号肽(de Castro Silva Filho 1996 Plant Mol. Biol. 30:767-780)、植物EPSPS基因信号肽（Archer 1990 J. Bioenerg. Biomemb. 22(b):789-810）等。 编码叶绿体信号肽的DNA片段连接在一个抗草甘膦基因在5’端，并且在一个表达阅读框内。这个表达构件可以通过农杆菌（如Agrobacterium菌株LAB4404）、基因枪方法或则其他方法整合到植物的基因组中并且获得表达，从而获得抗草甘膦转基因植株。植物转化的技术和方法是已知和成熟的。不同植物的转化的方法和步骤有所不同。但是，通常通过农杆菌或基因枪导入植物的未成熟胚、成熟胚、未分化的愈伤组织或原生质体。然后用1到5 mM的草甘膦培养基进行筛选培养。再进行分化而获得转化芽，经过生根培养基培养就可以获得可以种植的转基因苗。进一步，抗草甘膦转基因植物可以通过喷施草甘膦筛选。 
本发明还提供了一种质粒，这种质粒包含上述抗草甘膦的核苷酸序列分子，并且功能性地与控制植物中表达的核苷酸序列连接而构成表达框。 
本发明还提供了一种对植物进行改造的方法：包括利用植物基因转化技术将上述抗草甘膦基因表达框导入植物细胞，再将其分化培育成相应的转基因植株。所获得的植株具有抗草甘膦能力。植物可以是水稻、玉米、棉花、小麦、大豆、油菜、高粱、大麦、草坪草或牧草。这些植物的转化技术是已经现有的技术。 
本发明还提供了利用上述抗草甘膦基因的核苷酸序列分子，在植物转基因细胞培养中作筛选标记。 
本发明的又一个方面是提供抗草甘膦基因用来作为植物转基因的筛选标志。上述能够在植物细胞中表达的抗草甘膦人工基因可以与目的基因表达框构建在同一个植物转化质粒的同一个DNA转化片段上。目的基因可以是任何有价值的基因。这个植物转化质粒可以通过基因枪、农杆菌方法或则其他方法导入植物组织，而含有合适浓度的草甘膦(如1-5 mM) 培养基则可以选择性地杀死没有导入DNA转化片段的植物细胞，从而选择了含有目的基因的植物细胞。 
本发明的抗草甘膦基因的核苷酸序列可以有多种不同的变异，包括但不限于：1）利用同一个氨基酸的不同密码子而获得的不同的核苷酸序列，这些序列编码相同活性的蛋白质多肽； 2）通过导入核苷酸序列的其他变异但是仍然编码具有抗草甘膦能力的蛋白质的核苷酸序列。这种变异可以是随机的变异，也可以是针对性的点变异，还可以是插入或者缺失变异。本领域的一般技术人员就能够通过分子生物学的方法产生上述变异。     
本发明适用于所有植物，包括双子叶和单子叶植物。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。 
本发明的以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在Ausubel编写的John Wiley and Sons 公司出版的Current Protocols in Molecular Biology， 和J. Sambrook等编写Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001) 出版的Molecular Cloning: A Labortory Manual, 3rd ED.等文献均有详细的说明。 
实施例1、EPSPS基因的表达 
Deinococcus radiodurans的EPSPS基因（核苷酸序列SEQ ID NO：1）通过上海生工（上海）人工合成获得，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2.。 这个基因被称为G1174基因， 其核苷酸序列编码第95到114氨基酸的核苷酸片段的二端分别设计了XmaI和 KpnI酶切位点。
PMD19载体（购于TAKARA公司）被用来表达G1174，以测定其抗草甘膦能力。 通过一般的分子生物学方法将G1174克隆到PMD19，获得了PMD19-M-1174质粒载体， SEQ ID NO：3是其全部序列，其中插入的G1174基因序列为2218-3531。转化了PMD19和PMD19-M-1174的大肠杆菌TG-1细胞分别在LB培养液（酵母提取物 5.0g, 蛋白胨 10.0g, NaCl 10.0g, 琼脂 15.0g, 蒸馏水定容至1.0L, pH7.0）中37°C振荡培养16小时以后，离心收集获得大肠杆菌细胞，经过SDS-PAGE分离，利用G1174的抗体进行Western检测，结果发现PMD19样品没有信号而PMD19-M-1174检测到了明显的信号，说明这个载体能够表达G1174蛋白质。 
实施例2、EPSPS突变体文库的获得 
为了筛选抗性水平更高的EPSPS突变体，对G1174编码的95-114氨基酸的核苷酸片段进行突变。合成如下2个核苷酸简并引物：
94-114F：Ggg aac gcg  NNg NNg gtg gcc cgc NNc ctg NNg gNc gtg gcg gcg ctg acg agc ggt ac （N代表A\t\g\c）。
94-114R: C GCT CGT CAG CGC CGC CAC GNC CNN CAG GNN GCG GGC CAC CNN CGC GTT CCC（N代表A\t\g\c）。 
混合以上2个核苷酸简并引物的Tris-HCl 溶液，用T4 多聚核苷酸激酶进行5‘端磷酸化，然后65°C 20分钟，然后冷却到22°C， 获得能够和SmaI 和KpnI酶切的载体连接的双链DNA片段。这个DNA片段进一步和经过了SmaI 和KpnI酶切的载体PMD19-M-1174混合，利用了DNA连接酶连接， 导入大肠杆菌TG-1，从而获得包含不同G1174突变体的突变体表达文库。 
实施例3、EPSPS突变体的抗性筛选 
配置含60mM或者100mM草甘膦的M 63培养基。M63的配方如下：每升M63: 13.6g KH2PO4 , 2 g (NH4) 2SO4 , 0.5 mg FeSO4-7H2O , 2.4 mg MgCl2, 10 g glucose, 10 mg Thiamine-HCl 和 25 mg L-Proline，40ｇ琼脂糖，其余为蒸馏水，pH7.0。M63培养基在完成高温高压杀菌以后，在温度下降到55°C时，添加草甘膦到最后浓度60mM或者100mM。
将包含不同G1174突变体的突变体表达文库涂在含60mM草甘膦的M 63培养基上培养。72小时以后观察生长情况。 原始基因G1174在60mM草甘膦的M63培养基上生长非常缓慢， 72小时以后不能看到明显的菌落。但是，部分G1174突变体能够在培养72小时以后长出可以看到的菌落。 
将抗草甘膦的突变体克隆进一步在草甘膦含量为100 mM的 M 63培养基上培育。 如下克隆能够在72小时长出菌落，它们分别是： G1174-A， G1174-B， G1174-C， G1174-D, G1174-E，G1174-F; G1174-G, G1174-H, G1174-I, G1174-J, G1174-K, G1174-L， G1174-M, G1174-N, G1174-O, G1174-P, G1174-Q, G1174-R, G1174-S, G1174-T, G1174-U, G1174-V, G1174-W。 
实施例4、高抗草甘膦G1174特变位点的分析 
在100mM草甘膦上能够正常生长的克隆可能包含一个抗草甘膦性能比原始基因G1174更加高的突变体。因此测定了实施例3获得的抗草甘膦克隆的特变区域的核苷酸序列。结果发现这些基因的特变结果如下 (从第95到114号氨基酸)：
G1174:    PGNAGAVARFLMGVAALTSGT
G1174-A： PGNAGAVARLLMAVAALTSGT  （SEQ ID NO：4）
G1174-B： PGNAGMVARSLLGVAALTSGT   （SEQ ID NO：5）
G1174-C:　 PGNAAAVARLLMAVAALTSGT    （SEQ ID NO：6）
G1174-D： PGNAAMVARSLMAVAALTSGT   （SEQ ID NO：7）
G1174-E： PGNAGLVARSLLGVAALTSGT     （SEQ ID NO：8）
G1174-F:　PGNAAFVARSLMGVAALTSGT     （SEQ ID NO：9）
G1174-G:  PGNAASVARFLMGVAALTSGT    （SEQ ID NO：10）
G1174-I:   PGNAATVARLLMGVAALTSGT    （SEQ ID NO：11）
G1174-J:   PGNAAMVARSLMGVAALTSGT    （SEQ ID NO：12）
G1174-K:  PGNAGFVARSLMGVAALTSGT    （SEQ ID NO：13）
G1174-L:   PGNAATVARFLMGVAALTSGT     （SEQ ID NO：14）
G1174-M:  PGNAAMVARLLMGVAALTSGT    （SEQ ID NO：15）
G1174-N:   PGNAGAVARLLLGVAALTSGT    （SEQ ID NO：16）
G1174-O:   PGNAGTVARFLLAVAALTSGT    （SEQ ID NO：17）
G1174-P:   PGNAGAVARLLLAVAALTSGT    （SEQ ID NO：18）
G1174-R:   PGNAGTVARFLTGVAALTSGT    （SEQ ID NO：19）
G1174-S:   PGNAGTVARLLSGVAALTSGT    （SEQ ID NO：20）
G1174-T:   PGNAGTVARLLLGVAALTSGT    （SEQ ID NO：21）
G1174-U:   PGNAAMVARSLLAVAALTSGT    （SEQ ID NO：22）
G1174-V：  PGNAAAVARLLMGVAALTSGT    （SEQ ID NO：23）
G1174-W:   PGNAAFVARSLMAVAALTSGT    （SEQ ID NO：24）
这些高抗草甘膦的突变体的特变主要包括：1）第99号氨基酸从甘氨酸特变成为丙氨酸；2)第100号氨基酸从丙氨酸特变成为苯丙氨酸或者苏氨酸或者甲硫氨酸或者丝氨酸；3）104号氨基酸从苯丙氨酸特变成为亮氨酸或者丝氨酸；4）106号氨基酸从甲硫氨酸特变成为亮氨酸或者丝氨酸；5）107号氨基酸从甘氨酸特变成为丙氨酸。特别是这些突变体普遍具有2个或者以上的氨基酸特变。
以前的研究已经发现在大肠杆菌EPSPS的第96号氨基酸（相应于本发明中G1174的第99号氨基酸）从甘氨酸特变成为丙氨酸能够提高抗草甘膦能力，但是这个突变体酶的活性降低了（GenBank accession no. X00557; Kishore et al. 1986; Padgette et al. 1991)。 为了研究能否仅仅将基因G1174的第99号氨基酸从甘氨酸特变成为丙氨酸而获得高的抗草甘膦能力，本发明通过点特变的方法获得了99号氨基酸从甘氨酸特变成为丙氨酸的G1174特变基因G1174-G99A。 
为了比较G1174-G99A和本发明的G1174-A、G1174-F 和G1174-V等突变体的抗草甘膦能力，能够表达以上这些突变体的PMD19载体导入了大肠杆菌TG-1，在LB培养基上37°C培养16小时，获得单个克隆。然后将每个突变体的5个克隆转接到含100mM草甘膦的M63培养基上，37°C培养48小时, 观察生长情况。结果发现，表达G1174-G99A的克隆生长明显比表达G1174-A、G1174-F 和G1174-V的克隆慢。同时这些表达克隆转接到含100mM草甘膦的M63培养液（不包含琼脂糖， 其他成分和M63培养基相同），37°C振荡培养48小时。测定OD600，结果发现，G1174-G99A是0.24，G1174-A是0.73，G1174-F是0.65，G1174-V是0.53。因此本发明提供的抗草甘膦突变体比仅仅第99号的甘氨酸到丙氨酸特变体表现更高的抗性。 
实施例5、G1174-A基因，G1174-C基因， G1174-L基因， G1174-O基因 和G1174-V基因在植物中表达的表达框的构建 
     通过人工合成获得了适于在单子叶植物中表达的密码子优化的G1174的人工基因 （SEQ ID NO：25, 其包括了5’ 端编码叶绿体信号肽的核苷酸序列）。这个人工基因的DNA片段的5’ 端带有一个BamHI位点，3’ 端带有一个XhoI位点。利用现有的特变方法分别引进了相应的特变，获得了具有G1174-A，G1174-C，G1174-L， G1174-O 和G1174-V的突变位点的G1174特变基因 （核苷酸序列分别SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, 和SEQ ID NO: 30）。
启动G1174特变基因的启动子是玉米的ubiquitin-1启动子。 这个启动子是通过PCR从玉米基因组中获得。PCR引物分别是 ZmUbiF (GCGAAGCTTGCATGCCTACAGTGC AGCGTGACCCGGTCGTGC, 加了HindIII 位点，下划线表示)，和 ZmUbiR (GTGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCA GAAGTAACACCAAACAACAG, 加了BamHI 位点，下划线表示)。 
G1174特变基因经过XhoI和BamHI酶切，PCR获得的玉米ubiquitin-1启动子经过HindIII和BamHI酶切，同时连接到经过了HindIII和XhoI酶切的pCambia1300载体， 分别获得T-DNA载体pCAM1300-1174A， pCAM1300-1174C， pCAM1300-1174L，pCAM1300-1174O 和 pCAM1300-1174V。这个载体中G1174特变基因的终止子是来自载体本身的CaMV的35S基因的终止子。 
实施例6、水稻的转化 
         转基因植物的获得方法是采用现有技术（卢雄斌 龚祖埙 1998 生命科学 10：125-131；刘凡等，2003 分子植物育种 1：108-115）。选取成熟饱满的“秀水110”种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。分别取含载体pCAM1300-1174A， pCAM1300-1174C， pCAM1300-1174L，pCAM1300-1174O 和 pCAM1300-1174V的农杆菌划板，挑单菌落接种准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入适当浓度的农杆菌液中（含乙酰丁香酮），让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养基中，共培养2～3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到含适当抗生素的筛选培养基上，筛选培养（2 mM草甘膦）两个月（中间继代一次）。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基上培养20天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基，14小时光照分化发芽。2－3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，作为鉴定材料。
实施例7、玉米的转化 
玉米的转化方法已经比较成熟，例如Frame等描述了利用农杆菌转化玉米的方法 （Plant Physiol, 2002, 129：13-22 ）。分别取含载体pCAM1300-1174A， pCAM1300-1174C， pCAM1300-1174L，pCAM1300-1174O 和 pCAM1300-1174V的农杆菌划板，挑单菌落接种准备转化用农杆菌。 取授粉后8－10天的Hi-II玉米穗。收集所有的未成熟胚（大小为1.0－1.5mm）。将含有T-DNA载体的农杆菌与未成熟胚共培育共培养2－3天（22℃）。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上（200mg/L的Timentin杀农杆菌），28℃暗培养10－14天。将所有的愈伤转到带有2 mM草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2－3周。
转移所有的组织到新鲜草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2－3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基上，28℃暗培养10－14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10－14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基上，26℃光照培养直到根发育完全,然后移植到温室中单株培养，检测转基因玉米的抗除草剂能力。 
实施例8、转基因水稻的抗草甘膦能力测定 
    从pCAM1300-1174A， pCAM1300-1174C， pCAM1300-1174L，pCAM1300-1174O 和 pCAM1300-1174V以及pCAM1300-G1174（对应原始的基因G1174）获得的转基因水稻中分别选择12个不同的转基因水稻株和同品种“秀水110”的非转基因株种植在温室中培育（温度15-25oC）。在苗高大约10 cm时，喷浓度为0.4%（W/V）的草甘膦，40 mL/平方米。8天后检查，结果如表1。结果表明这些本发明特变基因的抗草甘膦能力良好，优于原始基因G1174。
          表1：转基因水稻喷施草甘膦以后的成活率。 
转化载体 死亡率 其中生长受到抑制比例
pCAM1300-1174A 0% 20%
pCAM1300-1174C 0% 40%
pCAM1300-1174L 0% 50%
pCAM1300-1174O 0% 40%
pCAM1300-1174V 0% 20%
pCAM1300-G1174 0% 70%
亲本对照 100%  --
实施例9、转基因玉米的抗草甘膦能力测定 
从pCAM1300-1174A， pCAM1300-1174C， pCAM1300-1174L，pCAM1300-1174O 和 pCAM1300-1174V以及pCAM1300-G1174（对应原始的基因G1174）获得的转基因玉米中分别选择12个不同的转基因水稻株和同品种“秀水110”的非转基因株种植在温室中培育（温度15-25oC）。在苗期大约是5-6叶期间，喷浓度为0.4%（W/V）的草甘膦，40 mL/平方米。8天后检查，结果如表2。结果表明利用这些特变基因获得的转基因玉米的部分转化系的抗草甘膦能力已经达到了生产应用水平。
表2：转基因玉米喷施草甘膦以后的成活率。 
转化载体 死亡率 生长受到抑制比例
pCAM1300-1174A 0% 40%
pCAM1300-1174C 0% 40%
pCAM1300-1174L 0% 60%
pCAM1300-1174O 0% 50%
pCAM1300-1174V 0% 50%
pCAM1300-G1174 0% 80%
亲本对照 100% --
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。 
SEQ ID NO：1 
    1    atgtccgacg ccctccctgc tacattcgac gtgatcgtgc atccagctcg cgaactccgc
   61   ggcgagcttc gcgctcagcc atccaagaac tacaccactc gctacctcct cgccgctgcc
  121   ctcgctgagg gcgagacccg cgtggtgggc gtggctacct ctgaggacgc cgaggccatg
  181   ctccgctgcc tccgcgactg gggcgctggc gtggagcttg tgggcgatga cgccgtgatc
  241   cgcggtttcg gcgctcgccc acaggccggt gtgaccctca acccaggcaa cgctggcgca
  301   gtggcccgct tcctcatggg cgtggccgct ctcacctctg gcaccacttt cgtgaccgac
  361   tacccggact ccctcggcaa gcgccctcag ggcgacctcc ttgaggccct cgaacgcctc
  421   ggtgcctggg tgtcctccaa cgacggtcgc ctcccgatct ccgtgtccgg cccagtgcgc
  481   ggtggcaccg tggaggtgtc cgccgagcgc tcctcccagt acgcctccgc cctcatgttc
  541   ctcggccctc tcctcccgga cggactcgaa ctccgcctca ccggcgacat caagtcccac
  601   gctccgctcc gccagacact cgacaccctc tctgacttcg gcgtgcgcgc cactgcctcc
  661   gacgacctcc gccgcatctc catcccgggt ggccagaagt accgcccagg ccgcgtgctc
  721   gtgccgggcg actacccggg ctccgctgcc atcctcaccg ccgctgccct cctcccaggc
  781   gaggtgcgcc tctctaacct ccgcgagcac gacctccagg gcgagaagga ggccgtgaac
  841   gtgctccgcg agatgggcgc tgacatcgtg cgcgagggcg ataccctcac cgtgcgcggt
  901   ggccgccctc tccacgccgt gactcgcgac ggcgattcct tcaccgacgc cgtgcaagcc
  961   ctcaccgccg ctgctgcctt cgccgagggc gacaccacct gggagaacgt ggccactctc
1021    cgcctcaagg agtgcgaccg catctctgac acccgcgctg agcttgagcg cctcggcctc
1081    cgcgcacgcg agaccgccga ctctctctcc gtgactggct ctgctcacct cgctggtggc
1141    atcaccgccg acggccacgg cgaccaccgc atgatcatgc tcctcaccct cctcggcctc
1201    cgcgcagacg ctccactccg catcaccggc gcacaccaca tccgcaagtc ctaccctcag
1261    ttcttcgctc acctcgaagc cctcggcgct cgcttcgagt acgctgaggc caccgcctaa
1321    taggagctcg ag
SEQ ID No： 2
1    Met Ser Asp Ala Leu Pro Ala Thr Phe Asp Val Ile Val His Pro Ala Arg Glu Leu Arg
21    Gly Glu Leu Arg Ala Gln Pro Ser Lys Asn Tyr Thr Thr Arg Tyr Leu Leu Ala Ala Ala
41    Leu Ala Glu Gly Glu Thr Arg Val Val Gly Val Ala Thr Ser Glu Asp Ala Glu Ala Met
61    Leu Arg Cys Leu Arg Asp Trp Gly Ala Gly Val Glu Leu Val Gly Asp Asp Ala Val Ile
81    Arg Gly Phe Gly Ala Arg Pro Gln Ala Gly Val Thr Leu Asn Pro Gly Asn Ala Gly Ala
101    Val Ala Arg Phe Leu Met Gly Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly Thr Thr Phe Val Thr Asp
121    Tyr Pro Asp Ser Leu Gly Lys Arg Pro Gln Gly Asp Leu Leu Glu Ala Leu Glu Arg Leu
141    Gly Ala Trp Val Ser Ser Asn Asp Gly Arg Leu Pro Ile Ser Val Ser Gly Pro Val Arg
161    Gly Gly Thr Val Glu Val Ser Ala Glu Arg Ser Ser Gln Tyr Ala Ser Ala Leu Met Phe
181    Leu Gly Pro Leu Leu Pro Asp Gly Leu Glu Leu Arg Leu Thr Gly Asp Ile Lys Ser His
201    Ala Pro Leu Arg Gln Thr Leu Asp Thr Leu Ser Asp Phe Gly Val Arg Ala Thr Ala Ser
221    Asp Asp Leu Arg Arg Ile Ser Ile Pro Gly Gly Gln Lys Tyr Arg Pro Gly Arg Val Leu
241    Val Pro Gly Asp Tyr Pro Gly Ser Ala Ala Ile Leu Thr Ala Ala Ala Leu Leu Pro Gly
261    Glu Val Arg Leu Ser Asn Leu Arg Glu His Asp Leu Gln Gly Glu Lys Glu Ala Val Asn
281    Val Leu Arg Glu Met Gly Ala Asp Ile Val Arg Glu Gly Asp Thr Leu Thr Val Arg Gly
301    Gly Arg Pro Leu His Ala Val Thr Arg Asp Gly Asp Ser Phe Thr Asp Ala Val Gln Ala
321    Leu Thr Ala Ala Ala Ala Phe Ala Glu Gly Asp Thr Thr Trp Glu Asn Val Ala Thr Leu
341    Arg Leu Lys Glu Cys Asp Arg Ile Ser Asp Thr Arg Ala Glu Leu Glu Arg Leu Gly Leu
361    Arg Ala Arg Glu Thr Ala Asp Ser Leu Ser Val Thr Gly Ser Ala His Leu Ala Gly Gly
381    Ile Thr Ala Asp Gly His Gly Asp His Arg Met Ile Met Leu Leu Thr Leu Leu Gly Leu
401    Arg Ala Asp Ala Pro Leu Arg Ile Thr Gly Ala His His Ile Arg Lys Ser Tyr Pro Gln
421    Phe Phe Ala His Leu Glu Ala Leu Gly Ala Arg Phe Glu Tyr Ala Glu Ala Thr Ala
SEQ ID NO：3 
    1    gacgaaaggg cctcgtgata cgcctatttt tataggttaa tgtcatgata ataatggttt
   61   cttagacgtc aggtggcact tttcggggaa atgtgcgcgg aacccctatt tgtttatttt
  121   tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata accctgataa atgcttcaat
  181   aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg tgtcgccctt attccctttt
  241   ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac gctggtgaaa gtaaaagatg
  301   ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact ggatctcaac agcggtaaga
  361   tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat gagcactttt aaagttctgc
  421   tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga gcaactcggt cgccgcatac
  481   actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac agaaaagcat cttacggatg
  541   gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat gagtgataac actgcggcca
  601   acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac cgcttttttg cacaacatgg
  661   gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct gaatgaagcc ataccaaacg
  721   acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac gttgcgcaaa ctattaactg
  781   gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga ctggatggag gcggataaag
  841   ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg gtttattgct gataaatctg
  901   gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact ggggccagat ggtaagccct
  961   cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac tatggatgaa cgaaatagac
 1021   agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta actgtcagac caagtttact
 1081   catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc taggtgaaga
 1141   tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc cactgagcgt
 1201   cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg cgcgtaatct
 1261   gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg gatcaagagc
 1321   taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca aatactgttc
 1381   ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg cctacatacc
 1441   tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg tgtcttaccg
 1501   ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga acggggggtt
 1561   cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac ctacagcgtg
 1621   agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat ccggtaagcg
 1681   gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt
 1741   atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag
 1801   gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt
 1861   gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta
 1921   ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt
 1981   cagtgagcga ggaagcggaa gagcgcccaa tacgcaaacc gcctctcccc gcgcgttggc
 2041   cgattcatta atgcagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca
 2101   acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc
 2161   cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg
 2221   gacgccctgc ccgccacctt cgacgtgatc gtgcatccag ctcgcgaact ccgcggcgag
 2281   cttcgcgctc agccatccaa gaactacacc actcgctacc tcctcgccgc tgccctcgct
 2341   gagggcgaga cccgcgtggt gggcgtggct acctctgagg acgccgaggc catgctccgc
 2401   tgcctccgcg actggggcgc tggcgtggag cttgtgggcg atgacgccgt gatccgcggt
 2461   ttcggcgctc gcccacaggc cggtgtgagg gtcaaccccg ggaacgcggg ggcggtggcc
2521    cgcttcctga tgggcgtggc ggcgctgacg agcggtacca ctttcgtcac cgattacccc
 2581   gactcgctcg gcaagcggcc ccagggggat ttgctcgaag ccctggagcg gctgggggcg
 2641   tgggtgagca gcaacgacgg acgcctccct atctctgtct ccggcccggt gcgcggcggc
 2701   accgtcgaag tcagcgccga gcgcagcagc cagtacgcct ccgcgctgat gttcctgggg
 2761   ccactgctgc cggatggcct ggaactgcgg ctgaccggcg acatcaagag ccacgccccg
 2821   ctgcggcaaa cgctcgacac gctgtccgac ttcggcgtgc gggccacggc gagcgacgac
 2881   ctgcggcgca tttccattcc cggcgggcaa aagtatcggc ccggacgggt gctggtgccc
 2941   ggcgactacc ccggctcggc ggcgattctg acggcggcgg cccttttgcc cggcgaggtg
 3001   cggctctcca acctgcgcga acacgacctg caaggcgaaa aggaggcggt gaacgtgctg
 3061   cgcgagatgg gcgccgacat cgtgcgggag ggcgacaccc tgacggtgcg cgggggccgc
 3121   ccgctgcacg cggtgacgcg cgacggcgac agcttcaccg atgcggtgca ggccctcacc
 3181   gccgctgccg ccttcgcgga gggcgacacg acctgggaaa atgtcgccac cctgcgcctc
 3241   aaggagtgcg accgcatcag cgacacccgc gccgagctgg agcggctggg cctgcgcgcc
 3301   cgcgaaacgg cggacagcct cagcgtgacg ggtagcgccc accttgccgg gggcatcacc
 3361   gccgacgggc acggcgacca ccgcatgatc atgctgctga ccctgctggg gctgcgggcc
 3421   gacgcgccgc ttcgaattac cggggcgcac cacatccgca agagctatcc gcagtttttc
 3481   gcccatctgg aagcgctggg ggcgcggttc gagtacgcag aagcgacagc gtaactcgag
 3541   taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc
 3601   cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt
 3661   caccgtcatc accgaaacgc gcga
SEQ ID NO：4
Pro Gly Asn Ala Gly Ala Val Ala Arg Leu Leu Met Ala Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly
SEQ ID NO：5
Pro Gly Asn Ala Gly Met Val Ala Arg Ser Leu Leu Gly Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly
SEQ ID NO：6
    Pro Gly Asn Ala Ala Ala Val Ala Arg Leu Leu Met Ala Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly
SEQ ID NO：7
Pro Gly Asn Ala Ala Met Val Ala Arg Ser Leu Met Ala Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly
SEQ ID NO：8
    Pro Gly Asn Ala Gly Leu Val Ala Arg Ser Leu Leu Gly Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly
SEQ ID NO：9
Pro Gly Asn Ala Ala Phe Val Ala Arg Ser Leu Met Gly Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly
SEQ ID NO：10
   Pro Gly Asn Ala Ala Ser Val Ala Arg Phe Leu Met Gly Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly
SEQ ID NO：11
Pro Gly Asn Ala Ala The Val Ala Arg Leu Leu Met Gly Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly
SEQ ID NO：12
Pro Gly Asn Ala Ala Met Val Ala Arg Ser Leu Met Gly Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly
SEQ ID NO：13
Pro Gly Asn Ala Gly Phe Val Ala Arg Ser Leu Met Gly Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly
SEQ ID NO：14
Pro Gly Asn Ala Ala The Val Ala Arg Phe Leu Met Gly Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly
SEQ ID N O：15
Pro Gly Asn Ala Ala Met Val Ala Arg Leu Leu Met Gly Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly
SEQ ID NO：16
Pro Gly Asn Ala Gly Ala Val Ala Arg Leu Leu Leu Gly Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly
SEQ ID NO：17
Pro Gly Asn Ala Gly The Val Ala Arg Phe Leu Leu Ala Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly
SEQ ID NO：18
Pro Gly Asn Ala Gly Ala Val Ala Arg Leu Leu Leu Ala Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly
SEQ ID NO：19
Pro Gly Asn Ala Gly The Val Ala Arg Phe Leu The Gly Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly
SEQ ID NO：20
Pro Gly Asn Ala Gly The Val Ala Arg Leu Leu Ser Gly Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly
SEQ ID NO：21
Pro Gly Asn Ala Gly The Val Ala Arg Leu Leu Leu Gly Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly
SEQ ID NO：22
Pro Gly Asn Ala Ala Met Val Ala Arg Ser Leu Leu Ala Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly
SEQ ID NO：23
Pro Gly Asn Ala Ala Ala Val Ala Arg Leu Leu Met Gly Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly
SEQ ID NO：24
Pro Gly Asn Ala Ala Phe  Val Ala Arg Ser Leu Met Ala Val Ala Ala Leu Thr Ser Gly
SEQ ID NO： 25
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  241   atcgtgcatc cagctcgcga actccgcggc gagcttcgcg ctcagccatc caagaactac
  301   accactcgct acctcctcgc cgctgccctc gctgagggcg agacccgcgt ggtgggcgtg
  361   gctacctctg aggacgccga ggccatgctc cgctgcctcc gcgactgggg cgctggcgtg
  421   gagcttgtgg gcgatgacgc cgtgatccgc ggtttcggcg ctcgcccaca ggccggtgtg
  481   accctcaacc caggcaacgc tggcgcggtg gcccgcttcc tcatgggcgt ggccgctctc
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  601   gacctccttg aggccctcga acgcctcggt gcctgggtgt cctccaacga cggtcgcctc
  661   ccgatctccg tgtccggccc agtgcgcggt ggcaccgtgg aggtgtccgc cgagcgctcc
  721   tcccagtacg cctccgccct catgttcctc ggccctctcc tcccggacgg actcgaactc
  781   cgcctcaccg gcgacatcaa gtcccacgct ccgctccgcc agacactcga caccctctct
  841   gacttcggcg tgcgcgccac tgcctccgac gacctccgcc gcatctccat cccgggtggc
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SEQ ID NO： 29 
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  301   accactcgct acctcctcgc cgctgccctc gctgagggcg agacccgcgt ggtgggcgtg
  361   gctacctctg aggacgccga ggccatgctc cgctgcctcc gcgactgggg cgctggcgtg
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SEQ ID NO： 30
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1141    gattccttca ccgacgccgt gcaagccctc accgccgctg ctgccttcgc cgagggcgac
1201    accacctggg agaacgtggc cactctccgc ctcaaggagt gcgaccgcat ctctgacacc
1261    cgcgctgagc ttgagcgcct cggcctccgc gcacgcgaga ccgccgactc tctctccgtg
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1501    ttcgagtacg ctgaggccac cgcctaatag ctcgag
 

Claims (5)

1.高抗草甘膦突变基因编码的蛋白质，其特征是：所述蛋白质的第95到114位的氨基酸序列为SEQ ID NO：4~SEQ ID NO：24中的任意一种；
所述蛋白质野生型的氨基酸序列为SEQ ID NO：2。
2.一种高抗草甘膦突变基因，其特征是：所述基因的核苷酸序列为SEQID NO：26~ SEQ ID NO：30中的任意一种。
3.一种载体，其特征是：包含权利要求2所述的高抗草甘膦突变基因。
4.如权利要求2所述高抗草甘膦突变基因的用途，其特征是：通过转基因在植物中表达，从而使植物获得抗草甘膦能力。
5.根据权利要求4所述的高抗草甘膦突变基因的用途，其特征是：所述植物为水稻或玉米。
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