CN112359123A - 转g10evo-epsps基因大豆实时荧光定量检测方法及其试剂盒 - Google Patents

转g10evo-epsps基因大豆实时荧光定量检测方法及其试剂盒 Download PDF

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Abstract

本申请涉及生物检测技术领域，尤其涉及转g10evo‑epsps基因大豆实时荧光定量检测方法及其试剂盒。一种用于转基因大豆g10evo‑epsps基因检测的特异性引物对及探针，所述引物对包括上游引物和下游引物，其中上游引物序列为TTACCGTGAGAGGTGGTAGACCT，下游引物序列为GTGGTATCACCCTCAGCGAAG；所述探针序列为5′FAM‑ttccttcaccgacgcc‑MGB3′。通过该引物对和探针建立的实时荧光定量PCR方法，具有特异性好、准确度高和检测速度快等优势，可以很好的应用于转基因大豆g10evo‑epsps基因的定量检测。

Description

转g10evo-epsps基因大豆实时荧光定量检测方法及其试剂盒
技术领域
本申请涉及生物检测技术领域，尤其涉及转g10evo-epsps基因大豆实时荧光定量检测方法及其试剂盒。
背景技术
大豆是人类生产领域中最重要的农作物之一，也是植物蛋白和植物油的重要来源之一。大豆起源于我国，已有5000多年的栽培历史。大豆在农业、工业、医学等方面都有极为重要的用途。大豆营养丰富，种子含有40％蛋白质和20％脂肪，还有丰富的异黄酮、卵磷脂、维生素E、皂素等生理活性物质。转基因技术作为一项新兴的生物技术，为生物新品种的培育提供了新的技术手段。转基因技术被广泛应用于大豆育种中，培育出了有重要经济价值的大豆新品种。转基因大豆也成为世界上商品化时间最早、推广应用速度最快的转基因作物。
草甘膦是一种优秀的广谱灭生性除草剂，具有除草性能优异、成本低廉、容易降解等优点，栽培抗草甘膦作物可大幅度降低杂草防治成本，因此培育抗草甘膦转基因作物成为转基因作物研发的重点。如中国发明专利申请(申请号：CN201110009329.0)公开了高抗草甘膦的g10evo-epsps基因是由杭州瑞丰生物科技有限公司研发、拥有自主知识产权的功能基因，目前已成功导入到玉米、大豆、棉花和水稻等作物中，并在其中稳定地整合和表达。但是，仍需要对转基因大豆草甘膦抗性外源基因表达量和外源基因插入拷贝数等进行定量检测分析，才能进一步满足我国转基因生物安全监管需求，为转基因生物新品种培育重大专项的顺利实施提供保障和支撑，推动我国农业转基因研究与应用健康发展。实时荧光PCR是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过扩增曲线对结果进行分析。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本申请的目的是提供一种用于转基因大豆g10evo-epsps基因检测的特异性引物对及探针，通过该引物对和探针建立的实时荧光定量PCR方法，具有特异性好、准确度高和检测速度快等优势，可以很好的应用于转基因大豆g10evo-epsps基因的定量检测。
为了实现上述的目的，本申请采用了以下的技术方案：
一种用于转基因大豆g10evo-epsps基因检测的特异性引物对及探针，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中正向引物序列为TTACCGTGAGAGGTGGTAGACCT，反向引物序列为GTGGTATCACCCTCAGCGAAG；所述探针序列为5′FAM-ttccttcaccgacgcc-MGB3′。
进一步，本申请提供了一种用于转基因大豆g10evo-epsps基因检测的实时荧光定量PCR方法，该方法包括如下的步骤：
1)提取含量为100％的转基因大豆基因组DNA，基因组DNA浓度稀释成为30.0ng/uL，依次按5倍梯度稀释配制成了6个含量的标准样品；每个PCR反应设置3个平行，重复3次实验；
2)采用所述的引物对及探针进行实时荧光定量PCR扩增检测，根据标准DNA溶液PCR反应的Ct值和初始模板拷贝数的对数分别绘制g10evo-epsps基因和Lectin基因的标准曲线；
3)待测样品在相同引物、体系及反应条件下进行实时荧光定量PCR反应，获得Ct值根据标准曲线可计算得样品g10evo-epsps基因拷贝数。
优选，该方法采用的实时荧光定量PCR反应程序为：95℃变性5min；95℃变性15s，58℃退火1min，共进行40次循环；
PCR反应体系如下：
Figure BDA0002717991050000021
进一步，本申请提供了一种包括所述的引物对及探针的试剂盒。
进一步，本申请提供了所述的引物对及探针和所述的试剂盒在转基因大豆g10evo-epsps基因检测中的应用。
进一步，本申请提供了所述的方法在转基因大豆g10evo-epsps基因检测中的应用。
本申请由于采用了以上的技术方案，提供了一种用于检测转基因大豆植物中的g10evo-epsps基因的引物对和探针，还提供了一种基于该引物对和探针建立的实时荧光定量PCR方法和试剂盒，由于所述引物对和探针具备很高的特异性和灵敏度，并且仅针对转基因大豆植物中的g10evo-epsps基因能够进行检测，因此本发明在转基因大豆g10evo-epsps基因检测应用中具有良好的发展前景。
附图说明
图1五种引物荧光定量PCR标准曲线。
图2 g10evo-epsps-4荧光定量PCR结果。
图3(a)g10evo-epsps和(b)Lectin引物探针浓度筛选。
图4(a)g10evo-epsps和(b)Lectin退火温度梯度筛选。
图5(a)g10evo-epsps和(b)Lectin引物扩增曲线和标准曲线。
图6 g10evo-epsps荧光定量PCR特异性检测。
图7实时荧光PCR方法(a)g10evo-epsps和(b)Lectin检出限测试。
图8(a)g10evo-epsps和(b)Lectin引物重复性实验。
具体实施方式
实施例1实验设计引物探针序列
针对g10evo-epsps基因导入大豆后，设计了五组该基因的特异性引物/探针序列，如表1。
表1 g10evo-epsps基因引物及探针序列
Figure BDA0002717991050000031
F:正向引物，R:反向引物，P：探针
以转基因大豆g10evo-epsps为样品，利用五组g10evo-epsps基因引物对及探针进行荧光定量PCR反应，同时利用内标引物对内标基因Lectin进行荧光定量PCR反应，分别得到五组g10evo-epsps标准曲线和一组Lectin标准曲线，如图1所示，Lectin、g10evo-epsps-1、g10evo-epsps-2、g10evo-epsps-3、g10evo-epsps-4和g10evo-epsps-5的扩增效率E分别为93.6％、92％、91.8％、94.9％、93.3％和99.9％。根据实验结果五种引物探针效果均较好，但和内标准基因Lectin引物探针相比较，第四对引物探针(g10evo-epsps-4)扩增效率和内标准基因引物探针更为接近，另外根据图2所示，g10evo-epsps-4引物的荧光定量PCR扩增曲线质量很好，因此选用g10evo-epsps第四对引物探针进行后续检测方法的建立以及均匀性稳定性等实验。
实施例2实时荧光定量PCR方法
2.1引物探针浓度筛选，反应条件的优化
转基因大豆g10evo-epsps作为检测样品，通过引物/探针几种浓度配比进行实时荧光定量PCR，优化反应体系中引物/探针的终浓度，设置了引物/探针浓度的不同组合如表2。如图3对反应效率进行考察后确定了本项目后续测试引物浓度为0.4μmol/L，探针浓度为0.2μmol/L。
表2引物探针浓度配比
Figure BDA0002717991050000041
如图4所示，转基因大豆作为检测样品，退火温度设置为54℃、56℃、58℃、60℃、64℃进行PCR反应的扩增。根据比较结果，以及为了方便检测实际需求，同时考虑大豆内标准基因的退火温度，最终确定g10evo-epsps在荧光定量PCR的退火温度为58℃。
2.2荧光定量PCR检测反应体系和程序
荧光定量PCR检测反应体系：
表3荧光定量PCR检测反应体系
Figure BDA0002717991050000042
Figure BDA0002717991050000051
根据仪器要求，可对反应体系做适当调整。
PCR检测反应程序：
95℃变性5min；95℃变性15s，58℃退火1min，共进行40次循环。
2.3标准曲线的建立(标准曲线的决定系数≥0.98，标准曲线斜率≥-3.6且≤-3.1)
取含量为100％的转基因大豆提取DNA，基因组DNA浓度稀释成为30.0ng/uL，依次按5倍梯度稀释配制成了6个含量的标准样品。每个PCR反应设置3个平行，重复3次实验。根据标准DNA溶液PCR反应的Ct值及初始模板拷贝数的对数分别绘制g10evo-epsps和Lectin的标准曲线。结果如图5显示，三次重复实验中检测反应标准曲线的回归系数R2、效率E、斜率、截距等所有指标全部满足了标准制定的要求范围，g10evo-epsps和Lectin检测体系的Ct值与模板拷贝数间均具有良好的线性关系。得到的标准DNA溶液g10evo-epsps和Lectin基因拷贝数如表4所示。
表4标准DNA溶液g10evo-epsps和Lectin基因拷贝数
Figure BDA0002717991050000052
实施例3实时荧光定量PCR方法特异性验证
以大豆阳性(含g10evo-epsps基因)、大豆阴性、转基因大豆混样(GTS40-3-2、MON89788、CV127、A5547-127、A2704-12、305423、356043、MON88302、73496、MON87769、MON87705、FG72、DAS68416-4、每种转化体含量为1％，以非转基因大豆为填充物)、转基因玉米混样(Bt11、Bt176、MON810、MON863、GA21、NK603、T25、TC1507、MON89034、MON88017、59122、MIR604、3272、MON87460、MIR162、DAS40278-9、双抗12-5、IE09S034、C0030.3.5、C0010.3.7、4114、MON87427、5307，每种转化体含量为1％，以非转基因玉米为填充物)、转基因水稻混样(TT51-1、科丰6号、克螟稻、M12、科丰8号、科丰2号、G6H1、T1C-19，每种转化体含量为1％，以非转基因水稻为填充物)、转基因油菜混样(Ms1、Ms8、RF1、RF2、RF3、T45、oxy235、Topas19/2、MON88302、73496，每种转化体含量为1％，以非转基因油菜为填充物)、转基因棉花混样(MON531、MON1445、MON15985、LLCOTTON25、MON88913、GHB614、COT102，每种转化体含量为1％，以非转基因棉花为填充物)和非转基因大豆混合样为测试样品，应用引物及体系对g10evo-epsps大豆特异性检测进行测试。利用优化好的PCR反应体系进行检测，每个样本做6次平行。检测结果如表5和图6，表明仅抗草甘膦大豆g10evo-epsps获得了典型的扩增曲线，表明建立的实时荧光PCR方法具有很好的特异性。(说明：转基因玉米混样中双抗12-5含有g10evo-epsps基因，但因为本专利设计引物探针只针对大豆中的g10evo-epsps基因，因此，此引物探针在双抗12-5中不能进行扩增。)
表5测试样品的Ct值
Figure BDA0002717991050000061
Figure BDA0002717991050000071
实施例4检测极限和定量极限(定量误差Bias、实验室内重复性RSDr、实验室间再现性RSDR)
检测极限：
设置了反应体系中含有8拷贝(相当于g10evo-epsps基因含量为0.032％)g10evo-epsps基因序列对方法的LOD进行测试了。结果如图7显示，当反应体系中含有8个拷贝的g10evo-epsps基因成分时，60个平行反应均有扩增信号，因此由实验室内的验证估测g10evo-epsps基因检测方法的检测极限(LOD)不高于8个拷贝，本方法的LOD设定为8拷贝。
定量极限：
LOQ测试结果见表6，当反应体系中含有16拷贝g10evo-epsps基因序列(相当于g10evo-epsps基因含量为0.07％)时，12次测试结果的偏差为4.16％，小于25％；RSD为18.86％，小于25％。因此由实验室内的验证估测本检测方法的LOQ不高于16拷贝，本方法LOQ设定为16拷贝。
表6 g10evo-epsps基因检测方法的LOQ测试
Figure BDA0002717991050000072
实施例5重复性测试
初始浓度的g10evo-epsps，含量4.5％、2％、0.5％、0.09％和0.045％的大豆基因组DNA样品，每次设置3个平行，重复3次实验，计算SD和RSD％，评价测试方法的正确度和精密度。结果如表7和图8，SD范围在0.01～0.11，RSD范围在2.30％～17.10％，说明该方法的正确度和精密度较好。
表7测试方法的正确度和精密度
Figure BDA0002717991050000081
以上为对本申请实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。

Claims (6)

1.一种用于转基因大豆g10evo-epsps基因检测的特异性引物对及探针，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，其中正向引物序列为TTACCGTGAGAGGTGGTAGACCT，反向引物序列为GTGGTATCACCCTCAGCGAAG；所述探针序列为5′FAM-ttccttcaccgacgcc-MGB3′。
2.一种用于转基因大豆g10evo-epsps基因检测的实时荧光定量PCR方法，其特征在于，该方法包括如下的步骤：
1)提取含量为100％的转基因大豆的基因组DNA，基因组DNA浓度稀释成为30.0ng/uL，依次按5倍梯度稀释配制成了6个含量的标准样品；每个PCR反应设置3个平行，重复3次实验；
2)采用权利要求1所述的引物对及探针进行实时荧光定量PCR扩增检测，根据标准DNA溶液PCR反应的Ct值和初始模板拷贝数的对数分别绘制g10evo-epsps基因和Lectin基因的标准曲线；
3)待测样品在相同引物、体系及反应条件下进行实时荧光定量PCR反应，获得Ct值根据标准曲线可计算得样品g10evo-epsps基因拷贝数。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，该方法采用的实时荧光定量PCR反应程序为：95℃变性5min；95℃变性15s，58℃退火1min，共进行40次循环；
PCR反应体系如下：
Figure FDA0002717991040000011
4.一种包括权利要求1所述的引物对及探针的试剂盒。
5.权利要求1所述的引物对及探针和权利要求4所述的试剂盒在转基因大豆g10evo-epsps基因检测中的应用。
6.权利要求2或3所述的方法在转基因大豆g10evo-epsps基因检测中的应用。
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