Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von gereinigtem RNA-Proteolipid und/oder einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon, gemäss dem Oberbegriff des Anspruchs 1, ein Verfahren zur Herstellung eines markierten Derivats eines RNA-Proteolipidkomplexes, ein Verfahren zur Gewinnung eines monoklonalen Antikörpers gegen ein von humanen malignen Zellen gebildetes RNA-Proteolipid und/oder gegen eine immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktion davon, ein Verfahren zur Herstellung eines markierten Derivats eines monoklonalen Antikörpers, ein Verfahren zur Gewinnung von einer zu von humanen malignen Zellen gebildeten RNA-Proteolipid komplementären Desoxyribonucleinsäure (cDNA), ein Verfahren zur Herstellung einer einsträngigen cDNA, sowie die nach diesen Verfahren gewonnenen Substanzen und Verwendungen davon.
Ein Verfahren gemäss dem Oberbegriff des Anspruchs 1 zur Gewinnung des RNA-Proteolipids und/oder einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon aus Seren von Patienten mit neoplastischen Erkrankungen und aus Zellkulturüberständen maligner Zellinien wurde von A. Wieczorek, C. Rhyner und L. Block in "Proc. Natl. Acad. Sci. USA" 82:3455-3459 (5/1985) und von A. Wieczorek, V. Sitaramam, W. Machleidt, K. Rhyner, A. Perruchoud und L. Block in Cancer Research 47:6407-6412 (1 Dec. 1987) veröffentlicht.
Ein gereinigter polyklonaler Antikörper gegen das genannte RNA-Proteolipid und/oder einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon und dessen Gewinnung auf an sich bekannte Weise sind in diesen Veröffentlichungen erwähnt worden.
Generell ist die Technik zur Gewinnung grosser Mengen eines monoklonalen Antikörpers bekannt, doch ist ein als Mit tel zum Nachweis von humanen malignen Zellen oder zur Herstellung von solchen Mitteln brauchbarer monoklonaler Antikörper gegen das genannte RNA-Proteolipid und/oder die immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktionen davon noch nicht bekannt.
Aufgabe der Erfindung ist es, mit Hilfe des genannten RNA-Proteolipids, einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon, eines Antikörpers dagegen, deren markierten Derivate oder einer dazu komplementären cDNA Mittel bereitzustellen, die in grossem Umfang für diagnostische Zwecke einsetzbar sind und insbesondere einen brauchbaren Test zur Diagnose von Krebs ermöglichen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäss gelöst durch die Bereitstellung von gereinigtem, von Zellen von Human-Neoplasien oder deren Abkömmlingen gebildetem RNA-Proteolipid und/oder einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon. Eine Körperflüssigkeit von neoplastisch erkrankten Patienten, vorzugsweise Blutserum, Pleura- oder Peritonealflüssigkeit, oder ein Extrakt von kultivierten humanen malignen Zellen epithelialen oder mesenchymalen Ursprungs, oder noch ein Überstand einer Kultur solcher Zellen, wird dabei mindestens einer Kaliumbromid-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation unterzogen.
Aus der zentrifugierten Flüssigkeit entnimmt man den Dichtebereich bei ca. 1,080, der an der Grenze zwischen den Dichtebereichen für alpha -Lipoproteine (HDL) und für beta -Lipoproteine (LDL) liegt und unterhalb 11 DEG C als opaleszente Bande erkennbar ist, um eine das RNA-Proteolipid und/oder eine immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktion davon enthaltende Suspension zu gewinnen. Im Falle der Verwendung von Körperflüssigkeit verwendet man erfindungsgemäss diejenige von solchen Patienten, deren Serum kein immunochemisch nachweisbares Lipoprotein a enthält, und man unterzieht erfindungsgemäss die gewonnene Suspension einer Dekontamination durch Säulenchromatographie über Agarose, um sie von alpha -Lipoproteinen (HDL) zu befreien.
Vorzugsweise reinigt man die dekontaminierte Suspension weiter, in dem man sie über eine Affinitätssäule führt, die durch Kopplung von anti-Humanserumglobulinen an mit Cyanogenbromid aktivierter Agarose bereitgestellt worden ist, mit dem Zweck, weitere Anteile zumindest von Lipoproteinen und Serumalbuminen daraus zu beseitigen. Das RNA-Proteolipid und/oder eine immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktion davon sind erfindungsgemäss verwendbar als Mittel oder zur Herstellung von Mitteln zum Nachweis von in Lebewesen gebildeten Antikörpern gegen das RNA-Proteolipid oder eine immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktion davon.
Man kann auch ein markiertes Derivat des RNA-Proteolipids und/oder einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon bereitstellen, indem man das RNA-Proteolipid oder eine immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktion davon kovalent an einen Liganden bindet. Vorzugsweise ist der Ligand ein Chelator, ein Enzym, eine radioaktive Verbindung, eine fluoreszierende Verbindung oder eine lumineszierende Verbindung. Das markierte Derivat ist erfindungsgemäss verwendbar als Mittel und/oder zur Herstellung von Mitteln zum Nachweis von in Lebewesen gebildeten Antikörpern gegen das RNA-Proteolipid oder eine immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktion davon.
In einer weiteren Alternative wird die Aufgabe gelöst durch die Bereitstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen ein von Zellen von Human-Neoplasien oder deren Abkömmlingen gebildetes RNA-Proteolipid und/oder gegen immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktionen davon. Erfindungsgemäss verwendet man dabei Klone von solchen Hybridomzellen, die einen monoklonalen Antikörper gegen das RNA-Proteolipid oder eine immunologisch äquivalente lipophile Peptidfraktion davon, und keinen mit Normalserum reagierenden Antikörper produzieren, wobei man die Hybridomzellen in vivo vermehren lassen kann. Der monoklonale Antikörper ist erfindungsgemäss verwendbar als Mittel und/oder zur Herstellung von Mitteln zum Nachweis des von humanen malignen Zellen gebildeten RNA-Proteolipids oder einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon.
Man kann auch ein markiertes Derivat des monoklonalen Antikörpers bereitstellen, indem man diesen kovalent an einen Liganden bindet. Vorzugsweise ist der Ligand ein Chelator, ein Enzym, eine radioaktive Verbindung, eine fluoreszierende Verbindung oder eine lumineszierende Verbindung. Das markierte Derivat ist erfindungsgemäss verwendbar als Mittel und/oder zur Herstellung von Mitteln zum Nachweis des von humanen malignen Zellen gebildeten RNA-Proteolipids oder einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon.
In einer weiteren Alternative wird die Aufgabe gelöst durch die Bereitstellung von einem von humanen malignen Zellen gebildeten RNA-Proteolipid komplementärer Desoxyribonucleinsäure (cDNA). Diese cDNA wird erfindungsgemäss gewonnen, indem man solche cDNA bildet, die der RNA aus dem RNA-Proteolipid komplementär ist, diese cDNA in einen Bakteriophagen bringt, Escherichia coli mit dem Bakteriophagen transformiert, die cDNA kloniert und isoliert. Vorzugsweise wandelt man diese cDNA in einsträngige cDNA um. Diese einsträngige cDNA ist erfindungsgemäss verwendbar als Mittel und/oder zur Herstellung von Mitteln zum Nachweis von humanen malignen Zellen gebildeten RNA-Proteolipids oder einer immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktion davon.
Das genannte RNA-Proteolipid und/oder die immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktionen davon stellen einen makromolekularen Komplex dar, der zusammengesetzt ist aus hochmolekularer Ribonukleinsäure, Cholesterin, Phospholipiden, lipidgebundenen Zuckern und lipophilen Oligopeptiden mit einem Molekulargewicht von etwa 1000 bis etwa 2200. Zur Vereinfachung der Beschreibung wird dieser Komplex, d.h. insbesondere das RNA-Proteolipid und/oder die immunologisch äquivalenten lipophilen Peptidfraktionen davon, im nachfolgenden unter der Bezeichnung "RNA-Proteolipidkomplex" subsummiert.
Es wird angenommen, dass der Ursprung des RNA-Proteolipidkomplexes bei den malignen Zellen liegt. Dies ist begründet durch Versuche mit in vitro etablierten malignen Zel len, die das Proteolipid in den Kulturüberstand sezernieren. Experimentelle Untersuchungen an nackten Mäusen, denen verschiedene menschliche Tumoren als Xenografts implantiert wurden, haben gezeigt, dass der RNA-Proteolipidkomplex schon bei sehr kleinen Tumoren im Serum nachzuweisen ist. Die Bildung des RNA-Proteolipidkomplexes scheint hauptsächlich von der malignen Transformation der Zellen abhängig zu sein, da der RNA-Proteolipidkomplex bei Tieren mit normalen menschlichen Implantaten wie z.B. fetalen Lungenfragmenten nicht nachweisbar ist, obwohl diese Transplantate in den Empfängertieren wachsen.
Bei Tumorpatienten nimmt die Konzentration des RNA-Proteolipidkomplexes im Serum mit dem Wachstum des Tumors zu. Nach chirurgischer Entfernung des Tumors geht die Konzentration des RNA-Proteolipidkomplexes mit einer Halbwertszeit von zwei Tagen auf nicht messbare Werte zurück. Bestrahlung oder Chemotherapie führen ebenfalls zu einer mit der Abnahme der Tumormasse einhergehenden Reduktion des RNA-Proteolipidkomplexes. Bei Auftreten von Rezidiven nach zunächst erfolgreicher Therapie kommt es zu einem Wiederanstieg des RNA-Proteolipidkomplexes im Serum. Demnach ist der RNA-Proteolipidkomplex als Verlaufsparameter für maligne Tumoren geeignet. Zusätzlich scheint der RNA-Proteolipidkomplex auch als Klinikparameter für maligne Erkrankungen verwendbar zu sein. Er zeigt eine hohe Sensitivität.
Von 96 Fällen mit malignen Erkrankungen wurden 94 durch einfache Ultrazentrifugation des Patientenserums über den Kaliumbromid-Dichtegradienten als positiv befunden. Schon so zeigte sich also eine hohe Spezifizität. In 58 Fällen von nicht neoplastischen Erkrankungen und auch bei 46 gesunden Probanden konnte kein RNA-Proteolipidkomplex nachgewiesen werden.
In einem Blindtest wurde bei 102 Patienten mittels Auftrennung des Patientenserums durch Natriumdodecylsulfat-Gelchromatographie (Natriumdodecylsulfat = SDS) an Polyacrylamidgelen mit anschliessendem Elektro-Blot auf Nitrozellulose und dem erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper nach dem RNA-Proteolipidkomplex gesucht. Unter den 102 Patientenseren befanden sich 30 Malignompatienten und 72 Patienten ohne maligne Erkrankung. Die Malignompatienten umfassten das ganze Spektrum maligner Erkrankungen, von der akuten Leukämie über maligne Lymphome bis zu allen Arten von soliden Tumoren wie Bronchuskarzinome, Mammakarzinome, Teratokarzinome, Hypernephrome oder Prostatakarzinom. 28 der 32 Malignome wurde mittels des Tests erkannt, was eine Sensitivität von 93% ergibt. Korrekt negativ waren 68 Patienten, was einer Spezifizität von 97% gleichkommt.
Mit Elektro-Blot und Sandwich-ELISA parallel geführte Tests ergaben bei über 100 Patienten eine Übereinstimmung von ca. 90%.
Im nachfolgenden wird die Erfindung anhand von Durchführungsbeispielen für die verschiedenen Verfahrensschritte näher erläutert.
Isolierung des RNA-Proteolipidkomplexes
Der RNA-Proteolipidkomplex kann auf bekannte Weise (vgl. Wieczorek et al., 1985, loc. cit.) aus dem Blutserum von Patienten mit neoplastischen Erkrankungen gewonnen werden. Es sollen aber nur Seren verwendet werden, die kein Lipoprotein a enthalten. Dieses kann mittels eines von der Firma Pharmacia vertriebenen immunchemischen Tests nachgewiesen werden.
Der RNA-Proteolipidkomplex kann auch aus Überständen etablierter, maligner Zellinien gewonnen werden. Es wurden von malignen humanen Zellen konditionierte Kulturmedien untersucht. Die aus menschlichen Tumoren angezüchteten und als permanente Linien etablierten Zellen wurden von Flow (Glasgow), Gibco (Bethesda) und Seromed (München) beschafft: HEp-2, Larynxkarzinom; KB, Mundbodenkarzinom; EB-2, Burkitt-Lymphom; HeLa, Zervixkarzinom; Jlll, Monozytenleukämie, Ht-1080, Fibrosarkom; RD, Rhabdomyosarkom; ohne Code, malignes Melanom der Haut. Als Kontrollen wurden verwendet: Hautfibroblasten zweier gesunder Erwachsener, Lymphozyten und Monozyten eines gesunden Erwachsenen sowie fetale menschliche Lungenzellen und Leberzellen von Flow (Glasgow).
Die im Monolayer wachsenden Zellen (HEp-2, KB, HeLa, HT-1080, RD, malignes Melanom, Hautfibroblasten, fetale Lungen- und Leberzellen) wurden im Eagle's Minimal Essential Medium, angereichert mit 1% nicht-essentieller Aminosäuren und 10%igem fetalem Rinderserum (Gibco) inkubiert. Einzelne Versuche wurden im serumfreien Medium von Neuman und Tytell (Gibco) mit und ohne Zusatz von LDL und HDL (100 mu g/ml) durchgeführt, um den Einfluss von Lipoproteinen auf die Zusammensetzung des RNA-Proteolipidkomplexes zu prüfen.
In konfluenten Monolayer (3. Tag nach dem Aussäen, 75 cm) wurden die Zellen mit 10 ml Medium 6, 12 und 24 h versetzt. Danach wurde der Überstand der Zellkultur abgesaugt und über Filter (Amicon XM50) 3fach konzentriert.
Isolierung der opaleszenten Fraktion
Nüchternserumproben wurden bei 4 DEG C aufbewahrt und innerhalb von drei Tagen untersucht. Zu 3 ml Serum wurden 1,05 g Kaliumbromid p.a. (Merck) zugewogen. Nach Lösung des Salzes unter leichtem Schwenken wurden die Proben in Ultraclear-Röhrchen eines Beckman SW41 Ausschwingrotors gefüllt. Darüber wurden 2 ml ein 20%igen Kaliumbromidlösung, 4 ml einer 8,5%igen Kaliumbromidlösung und 3,7 ml destillierten Wassers geschichtet.
Die Proben wurden 16 h bei 4 DEG C mit 38 000 rpm in einer Beckman Ultrazentrifuge zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurden die Röhrchen unter einer im Abstand von 30 cm vom oberen Rand angeordneten Lichtquelle (Wolframglühbirne) gegen einen Metallschirm beobachtet und photographiert. Der RNA-Proteolipidkomplex flotiert im Kaliumbromid-Gradienten zwischen alpha -Lipoprotein (HDL2 = "high-density lipoprotein 2") und beta -Lipoprotein (LDL = "low-density lipoprotein"). Er stellt sich in diesem Gradienten dar als eine scharfe opaleszente Bande die zwischen der orangefarbenen LDL-Bande und der gelben HDL2-Bande lokalisiert ist, wobei die Opaleszenz nur bei tiefen Temperaturen (4-11 DEG C) zu beobachten ist. In einigen Fällen erschien die opaleszente Fraktion als Doppelbande, wobei die beiden Banden ca. 1 mm voneinander entfernt waren.
VLDL, LDL und die opaleszente Bande wurden nacheinander von oben abgesaugt. Die HDL-Banden und der lipoproteinfreie Unterstand wurden ebenfalls gesammelt. In Serumproben, die keine opaleszenten Bande zeigten, wurde die äquivalente Fraktion des Gradienten abgesaugt. Unter Verwendung eines metallischen Hintergrundes war die opaleszente Fraktion am deutlichsten sichtbar. Das Opaleszenzphänomen ist temperaturabhängig. Nach Aufwärmen der Röhrchen auf Zimmertemperatur nimmt die Erkennbarkeit der Bande deutlich ab. Die Proben wurden deshalb innerhalb von 10 min betrachtet und die Banden markiert. Im elektronenmikroskopischen Bild erscheinen die Partikel (20-28 nm) grösser als LDL (19-21 nm).
Im Falle vom Überstand von Zellkulturen wurden 3 ml-Proben davon der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation unterzogen (vgl. Redgrave et al., Anal. Biochem. 65:42-49, 1975), wie es im vorangehenden für die Serumproben angegeben wurde.
Schwimmende Zellen (EB-2, Jlll, Lymphzyten, Monozyten) wurden im RPMI 1640 Medium, angereichert mit 10%igem fetalen Rinderserumalbumin in Konzentrationen von 10<6>, 10<7> und 10<8> Zellen/ml in 10 ml-Kulturen 6, 12 und 24 h inkubiert. Danach wurden die Zellen abzentrifugiert und der Überstand wie oben behandelt.
Die opaleszente Bande enthält nach einer ersten Ultrazentrifugation noch kontaminierende Serumproteine, die ca. 10% der Gesamtmenge darstellen. Deshalb wird zumindest eine zweite Ultrazentrifugation auf einem Kaliumbromid-Dichtegradienten durchgeführt, denn um den RNA-Proteolipidkomplex in der opaleszenten Bande möglichst gut von kontaminierenden Serumproteinen zu befreien.
Eine weitere Reinigung durch Säulenchromatographie über 4%ige Agarose erlaubt eine Abtrennung von kontaminierenden HDL2, die wegen ihres geringeren Molekulargewichtes längere Retentionszeiten zeigen als der RNA-Proteolipidkomplex.
Eine noch weitere Reinigung gelingt durch Passage des RNA-Proteolipidkomplexes über eine Affinitätssäule, die durch Kopplung von anti-Humanserumglobulinen an cyanogenbromidaktivierte Agarose hergestellt wird.
Gewinnung von Oligopeptiden aus dem RNA-Proteolipidkomplex
Zur lyophilisierten opaleszenten Bande wurden 2 ml Chloroform/Methanol/Wasser (50:50:10) zugegeben und die gelöste Fraktion wurde mit 6 ml Diethylether gefällt. Die einzelnen Peptide wurden auf Celluloseplatten in 70%igem n-Propanol aufgetrennt, nach Anfärben der Banden mit Ninhydrin ausgekratzt und dann mit Chloroform/Methanol/ Wasser (50:50:10) eluiert.
Gewinnung von monospezifischen Antikörpern
gegen den RNA-Proteolipidkomplex
Der RNA-Proteolipidkomplex als Antigen wurde in mit Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) auf eine Konzentration von 150 mu g/ml Peptid verdünnt. Kaninchen wurden dreimal mit je 50 mu l dieser Lösung in Abständen von je einer Woche unter Zusatz von komplettem Freundschen Adjuvans (1:1) immunisiert. Die Injektionen erfolgten in die Innenseiten der Oberschenkel. Nach sechs Wochen wurden die Tiere entblutet. Die Antikörper wurden gereinigt (vgl. Wieczorek et al., 1985, loc. cit.).
Gewinnung von monoklonalen Antikörpern
gegen den RNA-Proteolipidkomplex
BALB/C-Mäuse wurden durch drei Injektionen von je 0,5 ml mit je 50 mu g der Peptidfraktion in PBS unter Zugabe von je 0,5 ml kompletten Freundschen Adjuvans immunisiert. Die Injektionen wurden an den Tagen 0, 7 und 14 subkutan durchgeführt. Eine weitere Booster-Injektion wurde am 28. Tag durchgeführt.
Die Milz der Tiere wurde eine Woche nach der letzten Injektion entnommen, um Milzzellen mit Maus-Myelomzellen zu fusionieren, wobei solche Myelomzellen verwendet wurden, die das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (HGPRT) nicht haben und deshalb in einem selektiven Kulturmedium (HAT-Medium) nicht überleben.
Nach dem Verfahren von Köhler und Milstein, 1975, wurden 10<8> Milzzellen mit 3 x 10<7> Maus-Myelomzellen P3-X63-Ag8.653 (Kearney, 1979) in 1,5 ml einer Lösung von 50 Gew.-% Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht von 4000 (Merck, Darmstadt) und 9,7% Dimethylsulfoxid in Eagle's Minimal Essential Medium vermischt. Nach der Fusion wurden die Zellen auf 960 Vertiefungen von Mikrotiterplatten verteilt und im selektiven Medium Littlefields HAT-Medium (Littlefield, 1964) zusammen mit je 10<4> Mäuseperitonealmakrophagen als Feeder-Zellen gezüchtet, wobei die Hybridomzellen überleben. Nach zehn Tagen im HAT-Medium wurde im RPMI 1640 HT-Medium weiter kultiviert.
Die Zellkulturüberstände der Hybridomzellen wurden darauf untersucht, ob sie die gewünschten monoklonalen Antikörper enthalten. Dabei wurde ein Dot-Blot-ELISA verwendet.
Alle ELISA wurden in paralellen Reihen an in Mikrotiterplatten plazierten Nitrozellulosescheibchen (Bio-Rad, Richmond, CA) durchgeführt. 0,5 mu l der RNA-Proteolipidkomplex-Lösung (10 mu g/ml Peptid) wurden auf jedes Scheibchen getropft, mit 100 mu l 3%igem Rinderserumalbumin blockiert und mit 100 mu l der Zellkulturüberstände zwei h bei 37 DEG C inkubiert. Nach Waschen mit PBS wurden die Scheibchen mit 100 mu l mit einem auf 1:10 000 verdünnten, mit Peroxidase markierten Zweitantikörper (Bio-Rad, Ziegenantikörper gegen Mäuseimmunglobuline) inkubiert. Nach 1 h wurde erneut gewaschen und mit 0,1% 4-Chloronaphtol in 20%igem Methanol in PBS mit 0,01% Wasserstoffperoxid entwickelt.
Hybridomüberstände, die ein Signal mit gereinigtem RNA Proteolipidkomplex ergaben, jedoch kein Signal mit gepooltem Normalserum ergaben, wurden ausgewählt und die zugehörigen Hybridomlinien weiter kultiviert. Beim ersten Test erwiesen sich 37 Klone als positiv. Diese Klone wurden erneut getestet, und zwar bezüglich der Reaktivität gegen gepooltes Normalserum (20 Probanden), das 1:10 verdünnt aufgetropft wurde (je 0,5 mu l). Es verblieben acht Klone, die gegen den RNA-Proteolipidkomplex, jedoch nicht gegen gepooltes Normalserum reagierten. Diese Klone wurden auf ihre Fähigkeit getestet, zwischen 20 normalen Seren und 10 Tumorseren zu unterscheiden (Karzinome der Bronchien, der Mamma, des Magens, des Colons, des Rektums, des Pankreas, der Niere, Knochensarkom, Hodgkin- und Non-Hodgkin-Lymphom). Es verblieben drei Klone, die mit allen Tumorseren, nicht aber mit Normalseren reagierten.
Diese Klone, bezeichnet als AK33 (IgM), AK37 (IgG3) und AK52 (IgG3), befinden sich beim Institut für Anatomie (Prof. Dr. P. Groscurth), Universität Zürich-Irchel (Schweiz).
Grosse Mengen der gewünschten monoklonalen Antikörper können durch Vermehrung der Hybridomzellen in vivo gewonnen werden. BALB/C-Mäuse wurden intraperitoneal mit 0,4 ml Pristan (Carl Roth) gespritzt. Nach einer Woche wurden 2 bis 5 x 10<4> klonierte Hybridomzellen intraperitoneal gespritzt. Aszites wurde nach 8 bis 10 Tagen entnommen und 30 min bei 4 DEG C mit 6000 rpm zentrifugiert (Sorvall, G4-Rotor). Zur Isolierung der gewünschten Antikörper wurde flottierendes Fett und Pristan abgesaugt und gesättigte Ammoniumsulfatlösung dem debrisfreien Überstand unter Rühren bis zur Halbsättigung zugetropft.
Die derart ausgefällte rohe Immunglobulinfraktion wurde mit 0,1 M Tris-HCl (pH 8,2) über DEAE Affi-Gel Blue (Bio-Rad) nach Angaben des Herstellers chromatographiert, die Immunglobulinfraktionen wurden gereinigt und über Filter (Amicon XM50) konzentriert.
Markierung des monoklonalen Antikörpers
mit Peroxidase
Es wurde die Methode von Nakane, 1974, angewandt. 10 mg Peroxidase (Serva, Heidelberg) wurden in 1,25 ml destilliertem Wasser gelöst und 250 mu l Natriumperjodat (43 mg/ml) zugefügt. Nach 20 min Rühren bei Raumtemperatur wurden 30 mu l Ethylenglykol zugefügt. Nach weiteren 10 min bei Raumtemperatur wurde die Probe mit 1 mM Natriumacetat (pH 4,4) auf 10 ml verdünnt und über Filter (Amicon PM10) auf 1 ml konzentriert. Parallel dazu wurden 8 mg Antikörper in 1,18 ml 0,2 M Carbonatpuffer (pH 9,0) gelöst und 0,82 ml davon der Peroxidaselösung zugefügt. Nach 2 h bei Raumtemperatur wurde die Probe im Eisbad abgekühlt und 500 mu l Natriumborhydrid in Wasser (3,8 mg/ml) zugefügt. Das Konjugat wurde über eine Sephadex-300-Säule (Pharmacia) unter Elution mit 0,1 M Tris-HCl (pH 7,4) gereinigt.
Die Markierung mit <1><2><5>I wurde mit der Chloramin-T-Methode nach Shepard, 1976 durchgeführt.
Nachweis des RNA-Proteolipidkomplexes
mittels ELISA
Für einen direkten ELISA wurden die Seren mit 0,5% Natrium-Deoxycholat in PBS in Proportionen 1:10, 1:100, 1:1000 und 1:10 000 verdünnt und 100 mu l-Proben in Polystyrol-Mikrotiterplatten (Linbro) pipettiert. Die Inkubation wurde bei 37 DEG C durchgeführt, weil bei der hohen Deoxycholatkonzentration ein Teil der Seren bei Raumtemperatur geliert. Nach 2 h wurden zur Blockierung 20 mu l 3%igem Rinderserumalbumin in PBS zugegeben. Nach 1 h wurde mit PBS gewaschen und 100 mu l des mit Peroxidase markierten monoklonalen Antikörpers (1:1000 der Stammlösung) in 1%igem Rinderserumalbumin zugefügt, dann wurde 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Nach erneutem Waschen mit PBS wurde ein Farbentwicklungspuffer zugegeben, bestehend aus 1 mg/ml Azino-bis-3-ethyl-benzthiazolin-sulfonsäure (ABTS, Serva) in TBS mit 0,015% Wasserstoffperoxid. Die Extinktionen wurden nach 15 min bei 405 nm gemessen.
Zur Standardisierung wurde eine Lösung von 1 mu g Proteolipidpeptid in 1 ml TBS verwendet.
Für ein Sandwich-ELISA wurden die monoklonalen Antikörper auf 10 ng/ml mit PBS verdünnt. Davon wurden Aliquote von 200 mu l in Vertiefungen von Mikrotiterplatten pipettiert. Die Inkubation wurde 2 h bei Raumtemperatur durchgeführt. Danach wurde nacheinander mit PBS und mit 0,05%igem Tween 20 in PBS gewaschen und 2 h 10%igem Rinderserumalbumin unter Zusatz von 10%iger Sucrose in PBS inkubiert. Nach erneutem Waschen mit PBS wurden die Platten mit Parafilm abgedeckt und bis zur Verwendung bei 4 DEG C aufbewahrt. Die mit dem Fängerantikörper beschichteten Platten wurden wie beim direkten ELISA mit verdünnten Seren inkubiert. Nach 2 h bei 37 DEG C wurde mit PBS gewaschen und 50 mu l des konjugierten Antikörpers zugegeben. Inkubation, Waschen und Entwicklung erfolgten wie beim direkten ELISA.
Für einen indirekten ELISA wurden die mit Antikörper beschichteten Platten 2 h mit je 5 ng RNA-Proteolipidkomplex und 50 mu l des 1:10 mit PBS verdünnten Testserums inkubiert.
Der Nachweis erfolgte mit Antikörper, der mit Peroxidase oder alkalischer Phosphatase markiert worden war. Es wurde auch mit Biotin markierter Antikörper verwendet, in diesem Fall wurde das Biotin mit einem Streptavidin-Peroxidase-Konjugat nachgewiesen.
Markierung des monoklonalen Antikörpers
mit Jod 125
In einer ersten Reihe von Experimenten wurden, zur Markierung des RNA-Proteolipidkomplexes über die Hydroxylgruppen der Tyrosinreste, zu 1 mCi <2><2><5>I (in einer Konzentration von 17 Ci/Mol vorliegend) 10 mu g RNA-Proteolipidkomplex und 88 mu g Chloramin-T in je 25 mu l 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) zugegeben. Nach 1 min wurden 100 mu l einer Lösung von 2,4 g/l Natriummetabisulfit im gleichen Puffer und anschliessend 200 mu l einer Lösung von 10 g/l Kaliumjodid im gleichen Puffer zugegeben. Der Reaktionsansatz wurde auf eine 1 cm x 10 cm Sephadex-G15-Säule appliziert und mit 50 mM Phosphatpuffer (pH 8,0) eluiert.
In einer zweiten Reihe von Experimenten wurden, zur Markierung des gereinigten Peptids über die Hydroxylgruppen der Tyrosinreste, zu 1 mCi <1><2><5>I (in einer Konzentration von 17 Ci/Mol vorliegend) 5 mu g gereinigtes Peptid und 88 mu g Chloramin-T in je 25 mu l 50 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,5) zugegeben. Nach 1 min wurden 100 mu l einer Lösung von 2,4 g/l Natriummetabisulfit im gleichen Puffer und anschliessend 200 mu l einer Lösung von 10 g/l Kaliumjodid im gleichen Puffer zugegeben. Der Reaktionsansatz wurde auf eine 1 cm x 10 cm Sephadex-615-Säule appliziert und mit 50 mM eines zusätzlich 0,05% Tween 80 enthaltenden Phosphatpuffers (pH 8,0) eluiert.
In beiden Reihen von Experimenten betrugen die erzielten Aktivitäten 7000 bis 12 000 cpm/ng.
Nachweis des RNA-Proteolipidkomplexes
mittels Radio-Immuno-Assay
Polyvinylplatten (Costar) wurden mit dem Antikörper wie beim vorangehend beschriebenen Nachweis mittels ELISA beschichtet (20 ng Immunglobulin pro Vertiefung), die Blockierung und Aufbewahrung der Platten erfolgte ebenfalls wie dort beschrieben. Je 1 ng des wie vorangehend beschrieben radioaktiv markierten Antigens (ca. 10 000 cpm in 50 mu l) wurden pro Vertiefung mit je 50 mu l des mit PBS auf 1:10 bis 1:1000 verdünnten Serums inkubiert. Nach 4 Stunden bei Zimmertemperatur wurde sechsmal mit PBS gewaschen. Die einzelnen Vertiefungen wurden ausgeschnitten und im Szintillationsverfahren gezählt. Die Resultate wurden in pg des verdrängten <1><2><5>I ausgedrückt.
Nachweis des RNA-Proteolipidkomplexes
mittels Elektro-Immuno-Blot und Western-Blot
Serumaliquote von 3 mu l wurden mit 3 mu l 1%igem SDS in 0,1 N Tris-Acetatpuffer (pH 8,0) vermischt und 6 h bei 37 DEG C inkubiert. Dann wurden die Proben auf Polyacrylamidgradientengelen (2-16%, Pharmacia) aufgetrennt (70 mA, 8 h). Danach wurden die Gele mit Nitrozellulose bedeckt und die aufgetrennten Moleküle mit Hilfe von 50 mM Tris-Glycinpuffer (pH 8,3) entweder elektrophoretisch (beim Elektro-Immuno-Blot) oder durch Diffusion (beim Western-Blot) auf die Nitrozellulose übertragen. Die Nitrozelluloseblätter wurden mit 3%igem Rinderserumalbumin blockiert. Die Blätter wurden 2 h mit den monoklonalen Antikörpern in 1%igem Rinderserumalbumin und nach Waschen mit PBS 1 h in mit Peroxidase markierten Antikörpern gegen Mäuse-IgG inkubiert.
Nach erneutem Waschen erfolgte die Farbentwicklung mit 0,1% 4-Chloronaphtol in 20%igem Methanol in PBS mit 0,01% Wasserstoffperoxid.
Nachweis des RNA-Proteolipidkomplexes in Zellen und Gewebeschnitten mittels Immuno-Fluoreszenz, Immuno-Histochemie oder Immuno-Goldmarkierung
Für den morphologischen Nachweis des RNA-Proteolipidkomplexes wurden unfixierte oder mit 2%igem Paraformaldehyd vorfixierte Zellen und Gewebeschnitte (Gefrier-, Paraffin- oder Plastik-Schnitte), mit verschiedenen Verdünnungen der vorstehend aufgeführten monoklonalen Antikörper mit 1%igem Rinderalbumin in PBS, bei Raumtemperatur inkubiert. Nach einer Inkubation von 12 h bei 4 DEG C wurden die Proben dreimal in PBS gewaschen.
Für die Immuno-Fluoreszenz wurden die Präparate dann mit einem gegen Maus-Immunglobuline gerichteten und mit Fluorescein-Isothiocyanat oder mit Rhodamin markierten Zweitantikörper (Bio-Rad, Ziegenantikörper gegen Mäuseimmunglobuline) (Verdünnung 1:50) 2 h bei Raumtemperatur behandelt. Danach wurden die Proben mehrmals gewaschen und, wenn sie noch nicht vorfixiert waren, mit 2%igem Formaldehyd in PBS nachfixiert. Die mit Polyvinylalkohol eingedeckten Präparate wurden in einem mit einer Auflichtfluoreszenzeinheit versehenen Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung von spezifischen Filtern untersucht.
Für die Immuno-Histochemie wurden die Präparate mit einem gegen Maus-Immunglobuline gerichteten und mit Peroxydase markierten sekundären Antikörper (Verdünnung 1:50) für 2 h bei Raumtemperatur behandelt. Nach mehrmaligem Waschen wurden die Präparate mit 0,02%igem Wasserstoffperoxid als Substrat und mit 3'-3-Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid oder auch mit 3-Amino-9-ethyl-carbazol als Chromogen inkubiert. Der positive Nachweis des RNA-Proteolipidkomplexes äusserte sich in einer durch das Reaktionsprodukt bestimmten Farbänderung der Zellen bzw. der Gewebe.
Für die Immuno-Goldmarkierung wurden mit kolloidalem Gold (5 nm) gekoppelte und gegen Maus-Immunglobuline gerich tete Antiseren als sekundäre Antikörper verwendet. Die Goldmarkierung wird anschliessend durch Silberlösungen (intense-LM, Jannssen) verstärkt.
Zur Kontrolle der verschiedenen Immunozytologischen Verfahren wurden die Präparate anstelle des primären Antikörpers entweder mit PBS oder mit durch den RNA-Proteolipidkomplex absorbierten Antikörper behandelt.
Herstellung der cDNA
Die mRNA aus dem Komplex wurde durch Entfernung der Lipide und lipophilen Peptide mit Chloroform/Methanol, mit 70%igem Ethanol und schliesslich mit Phenol-SDS gereinigt und zur reversen Transkription verwendet.
2 mu g-Proben der gereinigten mRNA wurden in 4 mu l Wasser gelöst und dann einem Reaktionsansatz beigegeben, der wie folgt zusammengestellt worden war: 18,5 mu l Wasser, 2 mu l Oligodeoxythymidin-Primer (12-18, Sigma), 2 mu l 1 M KCl, 4 mu l 10 mM Deoxythymidintriphosphat (Pharmacia), 4 mu l 0,5 M Tris-HCl (pH 8,1), 40 mM MgCl, 20 mM Dithiothreitol, 4 mu l Ribonukleaseinhibitor (250 mu g/ml), 2 mu l Reverse Transcriptase (avian myeloblastosis virus, 4 E/ml, Pharmacia).
Die Inkubation wurde in einem Polypropylen-Eppendorf-Röhrchen (1,5 ml) 2 h bei 42 DEG C durchgeführt. Danach wurden die Proben 3 min bei 100 DEG C erhitzt, im Eisbad gekühlt und während 2 s bei 10 000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde mit dem folgenden Reaktionsansatz versetzt: 20,5 mu l Wasser, 8 mu l 1 M HEPES-KOH (pH 6,9), 6,5 mu l M KCl, 2,5, mu l 0,1 M MgCl, 1,6 mu l 0,1 M Dithiothreitol, 0,8 mu l 10 mM Deoxythymidintriphosphat, 16 Einheiten Klenow Polymerase (Boehringer).
Der Ansatz wurde 1 h bei 15 DEG C inkubiert. Nach einer weiteren Inkubation bei 65 DEG C während 5 min wurden die Proben auf Eis gekühlt und während 2 s mit 10 000 g zentrifugiert. Zum Überstand wurde der folgende Ansatz zugegeben: 400 mu l 30 mM Natriumacetat (pH 4,5), 250 mM NaCl, 1 mM Zinksulfat, 5% Glycerin, 20 mu l S1 Nuklease (1 E/ul, Sigma). Die Proben wurden 1 h bei 37 DEG C inkubiert. Danach wurden 60 mu l 100 mM Tris/100 mM EDTA zugegeben. Schliesslich wurden 500 mu l Phenol/Chloroform/ Isoamylalkohol (49,5:49,5:1) zugegeben. Die Proben wurden geschüttelt und während 1 min bei 12 000 g zentrifugiert. Die obere Phase wurde in ein neues Propylenröhrchen (4,5 ml) überführt und das Phenol durch 4faches Ausschütteln mit Diethylether (je 2 ml) entfernt. Schliesslich wurden 3 ml Ethanol zugegeben.
Die Proben wurden geschüttelt, 2 h bei -70 DEG C inkubiert und 20 min bei 12 000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die cDNA-Proben bei -20 DEG C aufbewahrt.
Ligation der cDNA mit M13-Phagen
Als Phagenvektor wurde M13 mp8 (Messing, 1983, Amersham, Wirt E. Coli JM 101) verwendet. Diese erprobten und leicht zu handhabenden Phagen erwiesen sich dafür geeignet, grosse Mengen von cDNA für Hybridisierungstests herzustellen.
Die Vektor-DNA wurde in parallelen Ansätzen mit den Restriktionsendonukleasen Bam HI und Pst I geschnitten. 50 ng des Vektors in 1 mu l Wasser wurden mit 10 mu l des Reaktionspuffers (Bam HI: 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM Merkaptoethanol, 100 mu g/ml Rinderserumalbumin; Pst I: wie oben mit 50 mM NaCl) versetzt und 3 h bei 37 DEG C inkubiert. Danach wurden 50 mu l 10 mM Tris-HCl (pH 9,2), 0,2 mM MgCl, 2 E alkalische Phosphatase (Kälberdarm, Sigma) in 10 mu l zugegeben. Die Inkubation wurde 1 h bei 37 DEG C durchgeführt, dann wurden 50 mu l 50 mM EDTA/50 mM Tris-HCl (pH 8,0) und schliesslich mit 100 mu l Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (49,5:49,5:1) zugegeben. Die obere Phase wurde in ein neues Propylenröhrchen (4,5 ml) überführt und das Phenol durch 4faches Ausschütteln mit Diethylether (je 2 ml) entfernt. Schliesslich wurden 3 ml Ethanol zugegeben.
Die Proben wurden geschüttelt, 2 h bei -70 DEG C inkubiert und 20 min bei 12 000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und die Vektor-DNA bei -20 DEG C aufbewahrt.
Die cDNA wurde mit Linkern der genannten Endonukleasen ligiert. Verwendet wurden der Bam HI-Linker 5 min pd(CGGATCCG), und der Pst I-Linker 5 min pd(GCTGCAGC) von Pharmacia.
20 ng des Linkers wurden in 5 mu l Wasser gelöst und mit dem folgenden Ansatz versetzt: 1 mu l 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 1 mu l 10 mM EDTA, 2 mu l 0,5 M NaCl, 50 ng cDNA in 1 mu l Wasser. Die Inkubation wurde zuerst 2 min bei 65 DEG C, dann 30 min bei 42 DEG C durchgeführt. Nach Kühlung auf Eis wurden 70 mu l Wasser, 20 mu l 150 mM Tris-HCl, 20 mM MgCl, 6 mM EDTA, 5 mu l Dithiothreitol, 10 mM ATP, 1 mu l E. Coli DNA-Ligase (5 E/ mu l, Sigma) beigegeben. Die Inkubation wurde 3 h bei 14 DEG C durchgeführt. Danach wurden 50 mu l Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Lösung (49,5:49,5:1) zugegeben und die Extraktion der cDNA mit Diethylether sowie die Fällung der cDNA mit Ethanol wie oben beschrieben durchgeführt.
Die mit Linkern flankierte cDNA wurde in den genannten Puffern 30 min bei 37 DEG C mit den Endonukleasen Bam HI und Pst I hydrolysiert. Danach wurden 50 mu l Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol-Lösung (49,5:49,5:1) zugegeben und die Extraktion der cDNA mit Diethylether sowie die Fällung der cDNA mit Ethanol wie oben beschrieben durchgeführt.
40 mu g der geschittenen Vektor-DNA und 40 mu g der flankierten cDNA wurden in je 5 mu l Wasser gelöst, kombiniert und mit dem folgenden Ansatz versetzt: 2 mu l 150 mM Tris-HCl (pH 8,0), 20 mM MgCl2, 6 mM EDTA, 5 mM Dithiothreitol, 10 mM ATP, 2 E DNA-Polymerase vom Escherichia Coli (2 mu l). Die Inkubation wurde 6 h bei 14 DEG C durchgeführt. Der gesamte Ansatz wurde für die Transformation der Zellen vom Escherichia Coli verwendet.
Klonen und Isolierung der rekombinanten DNA
Die Wirtszellen (Escherichia Coli JM 101) wurden auf Glukose-Minimalmedium-Agar ausgestrichen, das pro Liter 15 g Agar (Gibco), 6 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 1 g NH4Cl, 0,5 g NaCl, 1 ml 1M MgSO4, 1 ml 0,1 M CaCl2, 1 ml 1 M Thiamin und 10 ml 20%ige Glukose enthielt. Nach 24 h Inkubation wurde eine der Kolonien in 10 ml Kulturmedium, enthaltend pro Liter 16 g Baktotrypton (Gibco), 10 g Hefeextrakt (Sigma) und 5 g NaCl, gegeben und über Nacht inkubiert. 2 ml dieser Kultur wurden zu 30 ml des angegebenen Flüssigmediums zugegeben. Zu einer weiteren Kultur (20 ml) wurde ein Tropfen der Übernachtkultur zugegeben. Die Kulturen wurden bei 37 DEG C inkubiert. Nach 6 h wurden die Zellen der 30 ml-Kultur abzentrifugiert (5000 g, 5 min). Die Zellen wurden in kaltem 50 mM CaCl2 suspendiert und 3 h bei 0 DEG C gehalten, dann 5 min bei 5000 g abzentrifugiert und in 2 ml 50 mM CaCl2 suspendiert.
Zu 0,2-ml Aliquoten dieser Zellsuspension wurden die vorangehend beschriebenen Ligationsmixturen zugegeben und die Proben 3 h bei 0 DEG C inkubiert. Daraufhin wurden die Zellen 3 min bei 42 DEG C inkubiert und wieder ins Eisbad befördert. Inzwischen wurden 0,3 mu l-Aliquote der 20-ml-Kultur mit 30 mu l Isopropylthiogalaktosid (100 mM) und 30 mu l 2%igem Bromochlorindoylgalaktosid in Dimethylformamid versetzt. Dieser Ansatz wurde mit den transformierten Zellen (0,2 ml) kombiniert und mit einer bei 42 DEG C gehaltenen Agarlösung versetzt, die pro Liter 10 g Baktotrypton, 8 g NaCl und 8 g Agar enthielt. Diese Lösung wurde sofort auf Agarplatten gegossen (pro Liter 10 g Baktotrypton, 8 g NaCl, 12 g Agar).
Nach 24 h wurden durchschnittlich 240 Plaques beobachtet. Etwa 5% davon waren blau, d.h. sie enthielten den selbstligierten Vektor, der keine cDNA enthält. Die farblosen Plaques wurden mit sterilisierten Zahnstochern in je 2 ml des oben angegebenen Flüssigmediums überführt und über Nacht inkubiert. Das beschriebene Verfahren ist eine modifizierte Ausführungsweise bekannter Verfahren (Messing, 1983, Gray et al. 1983).
Die Kulturen der individuellen Plaques wurden zentrifugiert (5000 g, 5 min). Die Überstände (1,6 ml) wurden mit 0,3 ml 20%igem Polyethylenglykol (MG 6000-8000, Sigma) versetzt und 20 min bei 22 DEG C inkubiert. Nach Zentrifugation (10 000 g, 5 min) wurde der Überstand verworfen. Reste der Polyethylenglykollösung wurden mit Filterpapier entfernt. Die Phagen wurden in 100 mu l 10 mM Tris-HCl/1 mM EDTA suspendiert. Danach wurden 50 mu l Phenol/ Chloroform/Isoamylalkohol-Lösung (49,5:49,5:1) zugegeben. Die Proben wurden geschüttelt und 5 min bei 10 000 g zentrifugiert. Die oberen Phasen wurden in 1,5 ml-Eppendorf-Röhrchen überführt und die Extraktion der cDNA mit Diethylether sowie die Fällung der rekombinanten DNA mit Ethanol wie oben beschrieben durchgeführt.
Die DNA-Präzipitate wurden in 100 mM Tris-Acetat/1 mM EDTA gelöst und 10 mu l-Aliquote in 1%igen Agarose-Gelen im gleichen Puffer aufgetrennt (40 mA, 30 min). Die Gele wurden 15 min in 1 mu g/ml Ethidiumbromid inkubiert und im langwelligen UV-Licht betrachtet (300 nm).
Markierung der rekombinanten DNA
Mit dem Ziel, eine Routineanwendung zu ermöglichen, wurde eine Hybridisierungstechnik mit nichtradioaktiv markierter DNA verwendet. Es wurde das von Sigma entwickelte Verfahren (Technical Bulletin No. PROBE-2, 6-87) verwendet, bei dem die Hydroxylgruppe des Cytosins sulfoniert wird und danach immunchemisch nachweisbar ist. Zur Sulfonierung wurden die von Sigma in der genannten Veröffentlichung angegebenen Reagenzien A und B verwendet. Laut Angaben von Sigma unterliegen diese Reagentien einem Patentschutz.
Die DNA wird in einer Konzentration von 0,5 mu g/ml in destilliertem Wasser gelöst, 10 min bei 100 DEG C erhitzt und dann sofort im Eisbad gekühlt. Zu 100 mu l dieser Lösung werden 50 mu l Lösung A und 12,5 mu l Lösung B zugegeben. Nach 12 h Inkubation wurden 350 mu l Ethanol zugegeben. Nach Kühlung auf -20 DEG C über eine wurde die DNA abzentrifugiert (14 000 g, 20 min) und in einem 0,75 M physiologische Kochsalzlösung mit Natriumcitrat (SSC von Sigma), 0,75 M Denhards Lösung (Sigma) und 1 mu g/ml 50%iges Formamid enthaltenden Hybridisierungspuffer gelöst.
Der RNA-Proteolipidkomplex aus den Seren wurde durch Affinitätsabsorption vorgereinigt. 1 ml-Proben der unverdünnten Seren wurden versetzt mit 250 mu l 3 M SSC und 150 mu l 1%iges Nonidet P-40. In die Röhrchen wurden Stücke Polyuridinpapier gelegt (0,5 x 1 cm, Hybond-mAP, Amersham) und die Proben 12 h inkubiert. Der RNA-Proteoplipidkomplex wird dabei durch das Detergens labilisiert, so dass die Polyadenylkette der im RNA-Proteoplipidkomplex enthaltenen mRNA an die papiergebundene Polyuridinkette binden kann.
Das Serum wurde abpipettiert und die Papierstücke dreimal mit je 2 ml 0,5 M NaCl, danach mit 2 ml 70%igem Ethanol und dann mit 2 ml kaltem destiliertem Wasser gewaschen. Danach wurden 1,5 ml heisses Wasser (80 DEG C) zugegeben, das Papierstück herausgenommen, die Lösung gekühlt, mit 200 mu l 1 M Natriumacetat und 5 ml Ethanol versetzt und auf -20 DEG C gekühlt. Die auf solche Weise partiell gereinigte mRNA wurde abzentrifugiert (14 000 g, 20 min), in 50 mu l 50 mM Tris-HCl gelöst, 5 min auf 90 DEG C erhitzt und dann sofort im Eisbad gekühlt.
1 mu l-Aliquote der obigen mRNA wurden auf eine Nylonmembran (Hybond-N, Amersham) getropft. Nach Trocknung der Membran wurde diese invertiert auf einen UV-Transluminator (LKB) gelegt. Nach 20 min wurde die Membran 2 h mit beschallter Lachsspermien-DNA (1 mu g/ml im vorstehend angegebenen Hybridisierungspuffer) prähybridisiert. Für 1 cm Membran wurden bei allen Inkubationsschritten 100 mu l Lösung verwendet. Nach Waschen mit 0,5 M NaCl wurde die sulfonierte DNA zugegeben (1 mu g/ml Hybridisierungspuffer) und 20 h bei 42 DEG C inkubiert. Danach wurde erneut mit 0,5 M NaCl gewaschen und die Blockierlösung, enthaltend 20% Magermilchpulver, 0,05% Tween 20, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), zugegeben.
Nach 1 h wurde der monoklonale Antikörper gegen die sulfonierte DNA (Sigma) 1:300 im Blockierpuffer verdünnt. Nach 1 h wurde mit 100 mM Tris-HCl, (pH 7,5), 0,5 M NaCl gewaschen und dann mit Peroxidase markierter Zweitantikörper Bio-Rad, Ziegenantikörper gegen Mäuseimmunglobuline) 1:500 im Blockierpuffer verdünnt. Nach weiterer 1 h wurde erneut mit 100 mM Tris-HCl, (pH 7,5), 0,5 M NaCl gewaschen und die Membran in die Farbentwicklerlösung getaucht (0,1% 4-Chloronaphtol in 4%igem Methanol in PBS mit 0,01% Wasserstoffperoxid). Nach 10 min wurde die Membran mit PBS gewaschen und getrocknet. Die Intensität der Farbflecken wurde mit derjenigen von Farbflecken von gereinigtem und vorquantifiziertem RNA-Proteolipidkomplex verglichen.
The invention relates to a method for obtaining purified RNA proteolipid and / or an immunologically equivalent lipophilic peptide fraction thereof, according to the preamble of claim 1, a method for producing a labeled derivative of an RNA proteolipid complex, a method for obtaining a monoclonal antibody against RNA proteolipid formed by human malignant cells and / or against an immunologically equivalent lipophilic peptide fraction thereof, a method for producing a labeled derivative of a monoclonal antibody, a method for obtaining a deoxyribonucleic acid (cDNA) complementary to human malignant cell-formed RNA , a method for producing a single-stranded cDNA, and the substances obtained from these methods and uses thereof.
A method according to the preamble of claim 1 for obtaining the RNA proteolipid and / or an immunologically equivalent lipophilic peptide fraction thereof from sera from patients with neoplastic diseases and from cell culture supernatants of malignant cell lines was described by A. Wieczorek, C. Rhyner and L. Block in " Proc. Natl. Acad. Sci. USA "82: 3455-3459 (5/1985) and by A. Wieczorek, V. Sitaramam, W. Machleidt, K. Rhyner, A. Perruchoud and L. Block in Cancer Research 47: 6407-6412 (Dec. 1, 1987).
A purified polyclonal antibody against said RNA proteolipid and / or an immunologically equivalent lipophilic peptide fraction thereof and its recovery in a manner known per se have been mentioned in these publications.
In general, the technique for obtaining large amounts of a monoclonal antibody is known, but a monoclonal antibody which can be used as a means for the detection of human malignant cells or for the production of such agents is still available against the RNA proteolipid mentioned and / or the immunologically equivalent lipophilic peptide fractions thereof not known.
The object of the invention is to provide, with the help of the RNA proteolipid mentioned, an immunologically equivalent lipophilic peptide fraction thereof, an antibody, its labeled derivatives or a complementary cDNA means which can be used to a large extent for diagnostic purposes and in particular a useful test to diagnose cancer.
This object is achieved according to the invention by the provision of purified RNA proteolipid formed by cells of human neoplasms or their derivatives and / or an immunologically equivalent lipophilic peptide fraction thereof. A body fluid from neoplastic patients, preferably blood serum, pleural or peritoneal fluid, or an extract from cultured human malignant cells of epithelial or mesenchymal origin, or a supernatant from a culture of such cells, is subjected to at least one potassium bromide density gradient ultracentrifugation.
From the centrifuged liquid, the density range is taken at approx. 1.080, which lies on the border between the density ranges for alpha-lipoproteins (HDL) and for beta -lipoproteins (LDL) and is recognizable as an opalescent band below 11 ° C., by which the RNA proteolipid and / or a suspension containing an immunologically equivalent lipophilic peptide fraction thereof. In the case of the use of body fluid, those of those patients whose serum does not contain any immunochemically detectable lipoprotein a are used, and the suspension obtained is subjected to decontamination by column chromatography over agarose in order to free it from alpha-lipoproteins (HDL).
The decontaminated suspension is preferably further purified by passing it over an affinity column which has been provided by coupling anti-human serum globulins to agarose activated with cyanogen bromide with the purpose of removing further portions of at least lipoproteins and serum albumin therefrom. The RNA proteolipid and / or an immunologically equivalent lipophilic peptide fraction thereof can be used according to the invention as an agent or for the preparation of agents for the detection of antibodies raised against the RNA proteolipid or an immunologically equivalent lipophilic peptide fraction thereof.
A labeled derivative of the RNA proteolipid and / or an immunologically equivalent lipophilic peptide fraction thereof can also be provided by covalently binding the RNA proteolipid or an immunologically equivalent lipophilic peptide fraction thereof to a ligand. Preferably the ligand is a chelator, an enzyme, a radioactive compound, a fluorescent compound or a luminescent compound. The labeled derivative can be used according to the invention as an agent and / or for the preparation of agents for the detection of antibodies formed in living organisms against the RNA proteolipid or an immunologically equivalent lipophilic peptide fraction thereof.
In a further alternative, the object is achieved by providing a monoclonal antibody against an RNA proteolipid formed by cells of human neoplasms or their descendants and / or against immunologically equivalent lipophilic peptide fractions thereof. According to the invention, clones of such hybridoma cells are used which produce a monoclonal antibody against the RNA proteolipid or an immunologically equivalent lipophilic peptide fraction thereof and do not produce an antibody which reacts with normal serum, it being possible to have the hybridoma cells replicated in vivo. The monoclonal antibody can be used according to the invention as an agent and / or for the preparation of agents for the detection of the RNA proteolipid formed by human malignant cells or an immunologically equivalent lipophilic peptide fraction thereof.
A labeled derivative of the monoclonal antibody can also be provided by covalently binding it to a ligand. Preferably the ligand is a chelator, an enzyme, a radioactive compound, a fluorescent compound or a luminescent compound. The labeled derivative can be used according to the invention as an agent and / or for the preparation of agents for the detection of the RNA proteolipid formed by human malignant cells or an immunologically equivalent lipophilic peptide fraction thereof.
In a further alternative, the object is achieved by the provision of an RNA proteolipid of complementary deoxyribonucleic acid (cDNA) formed by human malignant cells. This cDNA is obtained according to the invention by forming such cDNA which is complementary to the RNA from the RNA proteolipid, brings this cDNA into a bacteriophage, transforms Escherichia coli with the bacteriophage, clones and isolates the cDNA. This cDNA is preferably converted into single-stranded cDNA. This single-stranded cDNA can be used according to the invention as an agent and / or for the preparation of agents for the detection of RNA proteolipids formed from human malignant cells or an immunologically equivalent lipophilic peptide fraction thereof.
The RNA proteolipid mentioned and / or the immunologically equivalent lipophilic peptide fractions thereof represent a macromolecular complex which is composed of high molecular weight ribonucleic acid, cholesterol, phospholipids, lipid-bound sugars and lipophilic oligopeptides with a molecular weight of approximately 1000 to approximately 2200. To simplify the description, the description is as follows this complex, ie in particular the RNA proteolipid and / or the immunologically equivalent lipophilic peptide fractions thereof, subsumed below under the name "RNA proteolipid complex".
It is believed that the origin of the RNA-proteolipid complex lies in the malignant cells. This is due to experiments with in vitro established malignant cells that secrete the proteolipid into the culture supernatant. Experimental studies on nude mice to which various human tumors have been implanted as xenografts have shown that the RNA-proteolipid complex can be detected in very small tumors in the serum. The formation of the RNA-proteolipid complex appears to be mainly dependent on the malignant transformation of the cells, since the RNA-proteolipid complex in animals with normal human implants such as e.g. fetal lung fragments is undetectable, although these grafts grow in the recipient animals.
In tumor patients, the concentration of the RNA-proteolipid complex in the serum increases with the growth of the tumor. After the tumor has been surgically removed, the concentration of the RNA-proteolipid complex goes back to non-measurable values with a half-life of two days. Radiation or chemotherapy also lead to a reduction in the RNA-proteolipid complex associated with the decrease in tumor mass. If recurrences occur after initially successful therapy, the RNA-proteolipid complex in the serum rises again. Accordingly, the RNA-proteolipid complex is suitable as a progression parameter for malignant tumors. In addition, the RNA-proteolipid complex also appears to be useful as a clinical parameter for malignant diseases. It shows a high sensitivity.
Of 96 cases with malignant diseases, 94 were found to be positive by simple ultracentrifugation of the patient's serum via the potassium bromide density gradient. So already a high specificity was shown. No RNA-proteolipid complex could be detected in 58 cases of non-neoplastic diseases and also in 46 healthy volunteers.
In a blind test, 102 patients were searched for the RNA-proteolipid complex by separating the patient's serum by sodium dodecyl sulfate gel chromatography (sodium dodecyl sulfate = SDS) on polyacrylamide gels with subsequent electro-blot on nitrocellulose and the monoclonal antibody according to the invention. Among the 102 patient sera, there were 30 malignant patients and 72 patients without a malignant disease. The malignant patients covered the entire spectrum of malignant diseases, from acute leukemia to malignant lymphomas to all types of solid tumors such as bronchial carcinoma, breast carcinoma, teratocarcinoma, hypernephroma or prostate carcinoma. 28 of the 32 malignancies were identified by the test, which results in a sensitivity of 93%. 68 patients were correct negative, which corresponds to a specificity of 97%.
Tests conducted in parallel with electro-blot and sandwich-ELISA showed a match of approx. 90% in over 100 patients.
The invention is explained in more detail below with the aid of implementation examples for the various process steps.
Isolation of the RNA-proteolipid complex
The RNA-proteolipid complex can be obtained in a known manner (cf. Wieczorek et al., 1985, loc. Cit.) From the blood serum of patients with neoplastic diseases. However, only sera that do not contain lipoprotein a should be used. This can be demonstrated using an immunochemical test marketed by Pharmacia.
The RNA-proteolipid complex can also be obtained from supernatants from established malignant cell lines. Culture media conditioned by malignant human cells were examined. The cells grown from human tumors and established as permanent lines were obtained from Flow (Glasgow), Gibco (Bethesda) and Seromed (Munich): HEp-2, laryngeal carcinoma; KB, floor carcinoma; EB-2, Burkitt's lymphoma; HeLa, cervical cancer; Jlll, Monocyte Leukemia, Ht-1080, Fibrosarcoma; RD, rhabdomyosarcoma; without code, malignant melanoma of the skin. The following controls were used: skin fibroblasts from two healthy adults, lymphocytes and monocytes from a healthy adult, and fetal human lung cells and liver cells from Flow (Glasgow).
The cells growing in the monolayer (HEp-2, KB, HeLa, HT-1080, RD, malignant melanoma, skin fibroblasts, fetal lung and liver cells) were enriched in Eagle's Minimal Essential Medium, enriched with 1% non-essential amino acids and 10% fetal bovine serum (Gibco). Individual tests were carried out in the serum-free medium from Neuman and Tytell (Gibco) with and without the addition of LDL and HDL (100 mu g / ml) in order to test the influence of lipoproteins on the composition of the RNA-proteolipid complex.
In confluent monolayers (3rd day after sowing, 75 cm), the cells were mixed with 10 ml of medium for 6, 12 and 24 h. The supernatant of the cell culture was then suctioned off and concentrated three times over filters (Amicon XM50).
Isolation of the opalescent fraction
Fasting serum samples were kept at 4 ° C and examined within three days. 1.05 g of potassium bromide p.a. (Merck) weighed. After dissolving the salt with gentle swirling, the samples were filled into ultraclear tubes in a Beckman SW41 swing-out rotor. 2 ml of a 20% potassium bromide solution, 4 ml of an 8.5% potassium bromide solution and 3.7 ml of distilled water were layered on top.
The samples were centrifuged for 16 h at 4 ° C. at 38,000 rpm in a Beckman ultracentrifuge. After centrifugation, the tubes were observed against a metal screen and photographed under a light source (tungsten light bulb) at a distance of 30 cm from the upper edge. The RNA-proteolipid complex floats in a potassium bromide gradient between alpha-lipoprotein (HDL2 = "high-density lipoprotein 2") and beta -lipoprotein (LDL = "low-density lipoprotein"). In this gradient it appears as a sharp opalescent band which is located between the orange LDL band and the yellow HDL2 band, the opalescence being observable only at low temperatures (4-11 ° C.). In some cases the opalescent fraction appeared as a double band, the two bands being about 1 mm apart.
VLDL, LDL and the opalescent band were successively sucked off from above. The HDL bands and the lipoprotein-free shelter were also collected. The equivalent fraction of the gradient was aspirated in serum samples which showed no opalescent band. The opalescent fraction was most clearly visible using a metallic background. The opalescence phenomenon is temperature dependent. After the tubes are warmed up to room temperature, the visibility of the band decreases significantly. The samples were therefore observed within 10 min and the bands marked. In the electron microscopic image, the particles (20-28 nm) appear larger than LDL (19-21 nm).
In the case of the supernatant from cell cultures, 3 ml samples thereof were subjected to density gradient ultracentrifugation (cf. Redgrave et al., Anal. Biochem. 65: 42-49, 1975), as indicated above for the serum samples.
Floating cells (EB-2, Jlll, lymphocytes, monocytes) were in the RPMI 1640 medium, enriched with 10% fetal bovine serum albumin in concentrations of 10 <6>, 10 <7> and 10 <8> Cells / ml incubated in 10 ml cultures for 6, 12 and 24 h. The cells were then centrifuged off and the supernatant treated as above.
After an initial ultracentrifugation, the opalescent band still contains contaminating serum proteins, which represent approximately 10% of the total amount. Therefore, at least a second ultracentrifugation is carried out on a potassium bromide density gradient, because in order to free the RNA-proteolipid complex in the opalescent band as well as possible from contaminating serum proteins.
A further purification by column chromatography over 4% agarose allows the separation of contaminating HDL2, which show longer retention times than the RNA-proteolipid complex due to their lower molecular weight.
A further purification is achieved by passing the RNA-proteolipid complex through an affinity column, which is produced by coupling anti-human serum globulins to cyanogen bromide-activated agarose.
Extraction of oligopeptides from the RNA-proteolipid complex
2 ml of chloroform / methanol / water (50:50:10) were added to the lyophilized opalescent band and the dissolved fraction was precipitated with 6 ml of diethyl ether. The individual peptides were separated on cellulose plates in 70% n-propanol, scraped with ninhydrin after staining the bands and then eluted with chloroform / methanol / water (50:50:10).
Obtaining monospecific antibodies
against the RNA-proteolipid complex
The RNA-proteolipid complex as antigen was diluted in phosphate buffered saline (PBS) to a concentration of 150 μg / ml peptide. Rabbits were immunized three times with 50 ml of this solution at intervals of one week with the addition of complete Freund's adjuvant (1: 1). The injections were made on the inside of the thighs. The animals were bled after six weeks. The antibodies were purified (see Wieczorek et al., 1985, loc. Cit.).
Obtaining monoclonal antibodies
against the RNA-proteolipid complex
BALB / C mice were immunized by three injections of 0.5 ml each with 50 μg of the peptide fraction in PBS with the addition of 0.5 ml of complete Freund's adjuvant. The injections were made subcutaneously on days 0, 7 and 14. Another booster injection was performed on day 28.
The spleens of the animals were removed one week after the last injection in order to fuse spleen cells with mouse myeloma cells, using those myeloma cells which do not have the enzyme hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT) and therefore in a selective culture medium (HAT- Medium) does not survive.
According to the procedure by Köhler and Milstein, 1975, 10 <8> Spleen cells with 3 x 10 <7> Mouse myeloma cells P3-X63-Ag8.653 (Kearney, 1979) in 1.5 ml of a solution of 50% by weight polyethylene glycol with a molecular weight of 4000 (Merck, Darmstadt) and 9.7% dimethyl sulfoxide in Eagle's Minimal essential medium mixed. After the fusion, the cells were distributed to 960 wells of microtiter plates and in the selective medium Littlefields HAT medium (Littlefield, 1964) together with 10 each <4> Mouse peritoneal macrophages grown as feeder cells, the hybridoma cells surviving. After ten days in the HAT medium, cultivation was continued in the RPMI 1640 HT medium.
The cell culture supernatants of the hybridoma cells were examined to determine whether they contain the desired monoclonal antibodies. A dot blot ELISA was used.
All ELISA were carried out in parallel rows on nitrocellulose disks (Bio-Rad, Richmond, CA) placed in microtiter plates. 0.5 μl of the RNA-proteolipid complex solution (10 μg / ml peptide) was dropped onto each disk, blocked with 100 μl of 3% bovine serum albumin and incubated with 100 μl of the cell culture supernatants at 37 ° C. for two hours. After washing with PBS, the slices were incubated with 100 μl with a second antibody (Bio-Rad, goat antibody against mouse immunoglobulins) which had been diluted to 1:10 000 and labeled with peroxidase. After 1 h the mixture was washed again and developed with 0.1% 4-chloronaphtol in 20% methanol in PBS with 0.01% hydrogen peroxide.
Hybridoma supernatants, which gave a signal with purified RNA proteolipid complex, but gave no signal with pooled normal serum, were selected and the associated hybridoma lines were further cultivated. In the first test, 37 clones proved positive. These clones were tested again with regard to the reactivity to pooled normal serum (20 test persons), which was dripped on 1:10 diluted (0.5 μl each). Eight clones remained, which reacted against the RNA-proteolipid complex, but not against pooled normal serum. These clones were tested for their ability to differentiate between 20 normal sera and 10 tumor sera (carcinomas of the bronchi, breast, stomach, colon, rectum, pancreas, kidney, bone sarcoma, Hodgkin and non-Hodgkin lymphoma ). Three clones remained, which reacted with all tumor sera but not with normal sera.
These clones, designated AK33 (IgM), AK37 (IgG3) and AK52 (IgG3), are located at the Institute of Anatomy (Prof. Dr. P. Groscurth), University of Zurich-Irchel (Switzerland).
Large quantities of the desired monoclonal antibodies can be obtained by multiplying the hybridoma cells in vivo. BALB / C mice were injected intraperitoneally with 0.4 ml Pristan (Carl Roth). After one week, 2 to 5 x 10 <4> cloned hybridoma cells injected intraperitoneally. Ascites was removed after 8 to 10 days and centrifuged for 30 min at 4 ° C. at 6000 rpm (Sorvall, G4 rotor). To isolate the desired antibodies, floating fat and pristan were suctioned off and saturated ammonium sulfate solution was added dropwise to the debris-free supernatant with stirring until it was half saturated.
The crude immunoglobulin fraction thus precipitated was chromatographed with 0.1 M Tris-HCl (pH 8.2) over DEAE Affi-Gel Blue (Bio-Rad) according to the manufacturer's instructions, the immunoglobulin fractions were purified and concentrated on filters (Amicon XM50).
Labeling of the monoclonal antibody
with peroxidase
The Nakane, 1974, method was used. 10 mg peroxidase (Serva, Heidelberg) were dissolved in 1.25 ml distilled water and 250 μl sodium periodate (43 mg / ml) was added. After stirring for 20 min at room temperature, 30 μl of ethylene glycol were added. After a further 10 min at room temperature, the sample was diluted to 10 ml with 1 mM sodium acetate (pH 4.4) and concentrated to 1 ml via filter (Amicon PM10). In parallel, 8 mg of antibody were dissolved in 1.18 ml of 0.2 M carbonate buffer (pH 9.0) and 0.82 ml of it was added to the peroxidase solution. After 2 h at room temperature, the sample was cooled in an ice bath and 500 μl sodium borohydride in water (3.8 mg / ml) was added. The conjugate was purified on a Sephadex 300 column (Pharmacia) eluting with 0.1 M Tris-HCl (pH 7.4).
The marking with <1> <2> <5> I was performed using the Shepard chloramine T method, 1976.
Detection of the RNA-proteolipid complex
by means of ELISA
For a direct ELISA, the sera were diluted with proportions 1:10, 1: 100, 1: 1000 and 1:10 000 with 0.5% sodium deoxycholate in PBS and 100 μl samples were pipetted into polystyrene microtiter plates (Linbro) . The incubation was carried out at 37 ° C. because at the high deoxycholate concentration part of the sera gelled at room temperature. After 2 h, 20 μl of 3% bovine serum albumin in PBS were added for blocking. After 1 h was washed with PBS and 100 μl of the peroxidase-labeled monoclonal antibody (1: 1000 of the stock solution) in 1% bovine serum albumin was added, then the mixture was incubated for 2 h at room temperature. After washing again with PBS, a color development buffer consisting of 1 mg / ml azino-bis-3-ethyl-benzothiazoline-sulfonic acid (ABTS, Serva) in TBS with 0.015% hydrogen peroxide was added. The absorbances were measured after 15 min at 405 nm.
A solution of 1 μg proteolipid peptide in 1 ml TBS was used for standardization.
For a sandwich ELISA, the monoclonal antibodies were diluted to 10 ng / ml with PBS. Aliquots of 200 μl were pipetted into wells of microtiter plates. The incubation was carried out for 2 hours at room temperature. The mixture was then washed successively with PBS and with 0.05% Tween 20 in PBS and incubated for 2 hours in 10% bovine serum albumin with the addition of 10% sucrose in PBS. After washing again with PBS, the plates were covered with parafilm and stored at 4 ° C. until used. The plates coated with the capture antibody were incubated with diluted sera as in the direct ELISA. After 2 h at 37 ° C., the mixture was washed with PBS and 50 μl of the conjugated antibody were added. Incubation, washing and development were carried out as in the direct ELISA.
For an indirect ELISA, the plates coated with antibody were incubated for 2 hours with 5 ng RNA-proteolipid complex and 50 μl of the test serum diluted 1:10 with PBS.
The detection was carried out with antibody which had been labeled with peroxidase or alkaline phosphatase. Antibody labeled with biotin was also used, in which case the biotin was detected with a streptavidin-peroxidase conjugate.
Labeling of the monoclonal antibody
with iodine 125
In a first series of experiments, 1 mCi were used to label the RNA-proteolipid complex via the hydroxyl groups of the tyrosine residues <2> <2> <5> I (in a concentration of 17 Ci / mol present) 10 μg of RNA proteolipid complex and 88 μg of chloramine-T in 25 μl each of 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) were added. After 1 min, 100 μl of a solution of 2.4 g / l sodium metabisulfite in the same buffer and then 200 μl of a solution of 10 g / l potassium iodide in the same buffer were added. The reaction mixture was applied to a 1 cm × 10 cm Sephadex G15 column and eluted with 50 mM phosphate buffer (pH 8.0).
In a second series of experiments, 1 mCi was used to label the purified peptide via the hydroxyl groups of the tyrosine residues <1> <2> <5> I (in a concentration of 17 Ci / mol present) 5 μg of purified peptide and 88 μg of chloramine-T in 25 μl each of 50 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) were added. After 1 min, 100 μl of a solution of 2.4 g / l sodium metabisulfite in the same buffer and then 200 μl of a solution of 10 g / l potassium iodide in the same buffer were added. The reaction mixture was applied to a 1 cm × 10 cm Sephadex 615 column and eluted with 50 mM of a phosphate buffer (pH 8.0) additionally containing 0.05% Tween 80.
In both series of experiments, the activities achieved were 7,000 to 12,000 cpm / ng.
Detection of the RNA-proteolipid complex
using radio immunoassay
Polyvinyl plates (Costar) were coated with the antibody by means of ELISA as in the detection described above (20 ng immunoglobulin per well), the plates were also blocked and stored as described there. 1 ng of the radioactively labeled antigen as described above (approx. 10,000 cpm in 50 ml) was incubated per well with 50 ml of the serum diluted with PBS to 1:10 to 1: 1000. After 4 hours at room temperature it was washed six times with PBS. The individual wells were cut out and counted using the scintillation method. The results were suppressed in pg's <1> <2> <5> I expressed.
Detection of the RNA-proteolipid complex
using electro-immuno-blot and western blot
Serum aliquots of 3 ml were mixed with 3 ml of 1% SDS in 0.1 N Tris acetate buffer (pH 8.0) and incubated at 37 ° C. for 6 hours. The samples were then separated on polyacrylamide gradient gels (2-16%, Pharmacia) (70 mA, 8 h). The gels were then covered with nitrocellulose and the separated molecules were transferred to the nitrocellulose either electrophoretically (with electro-immuno-blot) or by diffusion (with western blot) using 50 mM Tris-glycine buffer (pH 8.3). The nitrocellulose sheets were blocked with 3% bovine serum albumin. The leaves were incubated for 2 hours with the monoclonal antibodies in 1% bovine serum albumin and after washing with PBS for 1 hour in antibodies against mouse IgG labeled with peroxidase.
After washing again, the color was developed with 0.1% 4-chloronaphtol in 20% methanol in PBS with 0.01% hydrogen peroxide.
Detection of the RNA-proteolipid complex in cells and tissue sections using immunofluorescence, immunohistochemistry or immuno-gold labeling
For the morphological detection of the RNA-proteolipid complex, unfixed or pre-fixed with 2% paraformaldehyde and tissue sections (frozen, paraffin or plastic sections), with various dilutions of the above-mentioned monoclonal antibodies with 1% bovine albumin in PBS, at room temperature incubated. After an incubation of 12 h at 4 ° C., the samples were washed three times in PBS.
For immunofluorescence, the preparations were then treated with a second antibody directed against mouse immunoglobulins and labeled with fluorescein isothiocyanate or with rhodamine (Bio-Rad, goat antibodies against mouse immunoglobulins) (dilution 1:50) for 2 hours at room temperature. The samples were then washed several times and, if they had not been pre-fixed, fixed with 2% formaldehyde in PBS. The preparations covered with polyvinyl alcohol were examined in a fluorescence microscope provided with an incident light fluorescence unit using specific filters.
For immunohistochemistry, the preparations were treated with a secondary antibody directed against mouse immunoglobulins and labeled with peroxidase (dilution 1:50) for 2 h at room temperature. After washing several times, the preparations were incubated with 0.02% hydrogen peroxide as substrate and with 3'-3-diaminobenzidine tetrahydrochloride or with 3-amino-9-ethyl-carbazole as chromogen. The positive detection of the RNA-proteolipid complex was expressed in a change in the color of the cells or tissues determined by the reaction product.
For immuno-gold labeling, antisera coupled with colloidal gold (5 nm) and directed against mouse immunoglobulins were used as secondary antibodies. The gold marking is then strengthened by silver solutions (intense-LM, Jannssen).
To control the various immunocytological methods, the preparations were treated instead of the primary antibody either with PBS or with antibodies absorbed by the RNA-proteolipid complex.
Preparation of the cDNA
The mRNA from the complex was purified by removing the lipids and lipophilic peptides with chloroform / methanol, with 70% ethanol and finally with phenol SDS and used for reverse transcription.
2 μg samples of the purified mRNA were dissolved in 4 μl water and then added to a reaction mixture which was composed as follows: 18.5 μl water, 2 μl oligodeoxythymidine primer (12-18, Sigma), 2 mU 1 M KCl, 4 mu 10 mM deoxythymidine triphosphate (Pharmacia), 4 mu 0.5 M Tris-HCl (pH 8.1), 40 mM MgCl, 20 mM dithiothreitol, 4 mu ribonuclease inhibitor (250 mu g / ml), 2 ml reverse transcriptase (avian myeloblastosis virus, 4 U / ml, Pharmacia).
The incubation was carried out in a polypropylene-Eppendorf tube (1.5 ml) at 42 ° C. for 2 h. The samples were then heated at 100 ° C. for 3 minutes, cooled in an ice bath and centrifuged at 10,000 g for 2 s. The following reaction mixture was added to the supernatant: 20.5 ml of water, 8 ml of 1 M HEPES-KOH (pH 6.9), 6.5 ml of M KCl, 2.5 ml of 0.1 M MgCl , 1.6 μl 0.1 M dithiothreitol, 0.8 μl 10 mM deoxythymidine triphosphate, 16 units Klenow polymerase (Boehringer).
The mixture was incubated at 15 ° C. for 1 h. After a further incubation at 65 ° C. for 5 min, the samples were cooled on ice and centrifuged at 10,000 g for 2 s. The following mixture was added to the supernatant: 400 μl 30 mM sodium acetate (pH 4.5), 250 mM NaCl, 1 mM zinc sulfate, 5% glycerol, 20 μl S1 nuclease (1 U / ul, Sigma). The samples were incubated at 37 ° C. for 1 h. Then 60 μl 100 mM Tris / 100 mM EDTA were added. Finally 500 μl of phenol / chloroform / isoamyl alcohol (49.5: 49.5: 1) were added. The samples were shaken and centrifuged at 12,000 g for 1 min. The upper phase was transferred to a new propylene tube (4.5 ml) and the phenol was removed by shaking four times with diethyl ether (2 ml each). Finally 3 ml of ethanol were added.
The samples were shaken, incubated for 2 hours at -70 ° C. and centrifuged for 20 minutes at 12,000 g. The supernatant was discarded and the cDNA samples were stored at -20 ° C.
Ligation of the cDNA with M13 phages
M13 mp8 (brass, 1983, Amersham, host E. Coli JM 101) was used as the phage vector. These proven and easy-to-use phages have been shown to be suitable for producing large amounts of cDNA for hybridization tests.
The vector DNA was cut in parallel with the restriction endonucleases Bam HI and Pst I. 50 ng of the vector in 1 μl of water were mixed with 10 μl of the reaction buffer (Bam HI: 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 1 mM mercaptoethanol, 100 μg / ml bovine serum albumin ; Pst I: as above with 50 mM NaCl) and incubated at 37 ° C. for 3 h. Then 50 μl of 10 mM Tris-HCl (pH 9.2), 0.2 mM MgCl, 2 U alkaline phosphatase (calf intestine, Sigma) in 10 μl were added. The incubation was carried out at 37 ° C. for 1 h, then 50 μl 50 mM EDTA / 50 mM Tris-HCl (pH 8.0) and finally with 100 μl phenol / chloroform / isoamyl alcohol (49.5: 49.5 : 1) added. The upper phase was transferred to a new propylene tube (4.5 ml) and the phenol was removed by shaking four times with diethyl ether (2 ml each). Finally 3 ml of ethanol were added.
The samples were shaken, incubated for 2 hours at -70 ° C. and centrifuged for 20 minutes at 12,000 g. The supernatant was discarded and the vector DNA was stored at -20 ° C.
The cDNA was ligated with linkers of the endonucleases mentioned. The Bam HI linker 5 min pd (CGGATCCG) and the Pst I linker 5 min pd (GCTGCAGC) from Pharmacia were used.
20 ng of the linker was dissolved in 5 ml of water and the following mixture was added: 1 ml 0.1 M Tris-HCl (pH 7.5), 1 ml 10 mM EDTA, 2 ml 0.5 M NaCl , 50 ng cDNA in 1 ml water. Incubation was first carried out at 65 ° C. for 2 min, then at 42 ° C. for 30 min. After cooling on ice, 70 μl water, 20 μl 150 mM Tris-HCl, 20 mM MgCl, 6 mM EDTA, 5 μl dithiothreitol, 10 mM ATP, 1 μl E. coli DNA ligase (5 U / μl l, Sigma) added. The incubation was carried out at 14 ° C. for 3 h. 50 μl of phenol / chloroform / isoamyl alcohol solution (49.5: 49.5: 1) were then added and the extraction of the cDNA with diethyl ether and the precipitation of the cDNA with ethanol were carried out as described above.
The cDNA flanked with linkers was hydrolyzed in the buffers mentioned for 30 min at 37 ° C. with the endonucleases Bam HI and Pst I. 50 μl of phenol / chloroform / isoamyl alcohol solution (49.5: 49.5: 1) were then added and the extraction of the cDNA with diethyl ether and the precipitation of the cDNA with ethanol were carried out as described above.
40 μg of the cut vector DNA and 40 μg of the flanked cDNA were each dissolved in 5 μl water, combined and the following mixture was added: 2 μl 150 mM Tris-HCl (pH 8.0), 20 mM MgCl2 , 6 mM EDTA, 5 mM dithiothreitol, 10 mM ATP, 2 U DNA polymerase from Escherichia Coli (2 μl). The incubation was carried out at 14 ° C. for 6 h. The entire approach was used to transform the cells from Escherichia Coli.
Cloning and isolation of the recombinant DNA
The host cells (Escherichia Coli JM 101) were spread on glucose minimal medium agar containing 15 g agar (Gibco), 6 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 1 g NH4Cl, 0.5 g NaCl, 1 ml 1M MgSO4, per liter. 1 ml 0.1 M CaCl2, 1 ml 1 M thiamine and 10 ml 20% glucose contained. After 24 h of incubation, one of the colonies was placed in 10 ml of culture medium containing 16 g of baktotrypton (Gibco), 10 g of yeast extract (Sigma) and 5 g of NaCl per liter and incubated overnight. 2 ml of this culture was added to 30 ml of the specified liquid medium. A drop of the overnight culture was added to another culture (20 ml). The cultures were incubated at 37 ° C. After 6 h, the cells of the 30 ml culture were centrifuged off (5000 g, 5 min). The cells were suspended in cold 50 mM CaCl2 and kept at 0 ° C. for 3 h, then centrifuged for 5 min at 5000 g and suspended in 2 ml of 50 mM CaCl2.
The ligation mixtures described above were added to 0.2 ml aliquots of this cell suspension and the samples were incubated at 0 ° C. for 3 h. The cells were then incubated at 42 ° C. for 3 min and returned to the ice bath. In the meantime, 0.3 μl aliquots of the 20 ml culture were mixed with 30 μl isopropylthiogalactoside (100 mM) and 30 μl 2% bromochloroindoylgalactoside in dimethylformamide. This mixture was combined with the transformed cells (0.2 ml) and mixed with an agar solution kept at 42 ° C., which contained 10 g baktotrypton, 8 g NaCl and 8 g agar per liter. This solution was immediately poured onto agar plates (10 g of baktotrypton, 8 g of NaCl, 12 g of agar per liter).
An average of 240 plaques were observed after 24 hours. About 5% of them were blue, i.e. they contained the self-ligated vector, which contains no cDNA. The colorless plaques were transferred with sterilized toothpicks to 2 ml of the above-mentioned liquid medium and incubated overnight. The described method is a modified embodiment of known methods (Messing, 1983, Gray et al. 1983).
The cultures of the individual plaques were centrifuged (5000 g, 5 min). The supernatants (1.6 ml) were mixed with 0.3 ml of 20% polyethylene glycol (MG 6000-8000, Sigma) and incubated at 22 ° C. for 20 min. After centrifugation (10,000 g, 5 min) the supernatant was discarded. Residues of the polyethylene glycol solution were removed with filter paper. The phages were suspended in 100 μl 10 mM Tris-HCl / 1 mM EDTA. 50 μl of phenol / chloroform / isoamyl alcohol solution (49.5: 49.5: 1) were then added. The samples were shaken and centrifuged at 10,000 g for 5 min. The upper phases were transferred to 1.5 ml Eppendorf tubes and the extraction of the cDNA with diethyl ether and the precipitation of the recombinant DNA with ethanol were carried out as described above.
The DNA precipitates were dissolved in 100 mM Tris acetate / 1 mM EDTA and 10 μl aliquots in 1% agarose gels were separated in the same buffer (40 mA, 30 min). The gels were incubated for 15 min in 1 μg / ml ethidium bromide and viewed in long-wave UV light (300 nm).
Labeling of the recombinant DNA
A hybridization technique with non-radioactively labeled DNA was used with the aim of enabling routine application. The method developed by Sigma (Technical Bulletin No. PROBE-2, 6-87) was used, in which the hydroxyl group of the cytosine is sulfonated and can then be detected immunochemically. The reagents A and B specified by Sigma in the publication mentioned were used for the sulfonation. According to Sigma, these reagents are subject to patent protection.
The DNA is dissolved in a concentration of 0.5 μg / ml in distilled water, heated at 100 ° C. for 10 minutes and then immediately cooled in an ice bath. 50 μl of solution A and 12.5 μl of solution B are added to 100 μl of this solution. After 12 h of incubation, 350 μl of ethanol were added. After cooling to -20 ° C. over one, the DNA was centrifuged off (14,000 g, 20 min) and in a 0.75 M physiological saline solution with sodium citrate (SSC from Sigma), 0.75 M Denhard's solution (Sigma) and 1 mu Hybridization buffer containing 50% formamide dissolved in g / ml.
The RNA-proteolipid complex from the sera was pre-purified by affinity absorption. 1 ml samples of the undiluted sera were mixed with 250 ml 3 M SSC and 150 ml 1% Nonidet P-40. Pieces of polyurethane paper (0.5 x 1 cm, Hybond-mAP, Amersham) were placed in the tubes and the samples were incubated for 12 h. The RNA-proteoplipid complex is thereby stabilized by the detergent, so that the polyadenyl chain of the mRNA contained in the RNA-proteoplipid complex can bind to the paper-bound polyuridine chain.
The serum was pipetted off and the paper pieces were washed three times with 2 ml of 0.5 M NaCl, then with 2 ml of 70% ethanol and then with 2 ml of cold distilled water. Then 1.5 ml of hot water (80 ° C.) were added, the piece of paper was removed, the solution was cooled, 200 ml of 1 M sodium acetate and 5 ml of ethanol were added and the mixture was cooled to -20 ° C. The mRNA partially purified in this way was centrifuged off (14,000 g, 20 min), dissolved in 50 μl of 50 mM Tris-HCl, heated to 90 ° C. for 5 min and then immediately cooled in an ice bath.
1 µl aliquots of the above mRNA were dropped on a nylon membrane (Hybond-N, Amersham). After the membrane had dried, it was placed inverted on a UV transluminator (LKB). After 20 min, the membrane was prehybridized for 2 h with sonicated salmon sperm DNA (1 μg / ml in the hybridization buffer specified above). For 1 cm membrane, 100 μl of solution were used in all incubation steps. After washing with 0.5 M NaCl, the sulfonated DNA was added (1 μg / ml hybridization buffer) and incubated at 42 ° C. for 20 h. The mixture was then washed again with 0.5 M NaCl and the blocking solution, containing 20% skim milk powder, 0.05% Tween 20, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), was added.
After 1 h, the monoclonal antibody against the sulfonated DNA (Sigma) was diluted 1: 300 in the blocking buffer. After 1 h, the mixture was washed with 100 mM Tris-HCl, (pH 7.5), 0.5 M NaCl and then diluted 1: 500 in blocking buffer with peroxidase-labeled second antibody Bio-Rad, goat antibody against mouse immunoglobulins). After a further 1 h, the mixture was washed again with 100 mM Tris-HCl, (pH 7.5), 0.5 M NaCl and the membrane was immersed in the color developer solution (0.1% 4-chloronaphtol in 4% methanol in PBS with 0 , 01% hydrogen peroxide). After 10 min the membrane was washed with PBS and dried. The intensity of the color spots was compared to that of color spots from purified and pre-quantified RNA-proteolipid complex.