CH627079A5 - Process for preparing a protein concentrate containing immunological factors of milk origin - Google Patents
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C07K—PEPTIDES
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- C07K16/04—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from milk
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
- A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
Description
La présente invention concerne un procédé de fabrication d'un concentré protéique contenant des facteurs immunologiques d'origine lactique, notamment des immunoglobulines actives. The present invention relates to a method for manufacturing a protein concentrate containing immunological factors of lactic origin, in particular active immunoglobulins.
On a déjà proposé d'introduire des facteurs immunologiques d'origine lactique dans des produits diététiques pour nouveau-nés et nourrissons par incorporation au lait de ces facteurs, l'ingestion orale It has already been proposed to introduce immunological factors of lactic origin into dietetic products for newborns and infants by incorporating these factors into oral milk, oral ingestion
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de ces produits devant permettre le transfert dans le sang du nourrisson de ces facteurs, sans toutefois indiquer les modalités ni les résultats d'une telle immunisation passive généralisée. of these products should allow the transfer of these factors into the infant's blood, without however indicating the methods or the results of such a generalized passive immunization.
On a également proposé d'isoler des lactoglobulines immunes à 5 partir de lait de vaches vaccinées, par coagulation du lait, récupération du lactosérum et précipitation sélective des lactoglobulines par le sulfate d'ammonium suivie de dialyse contre l'eau pure, filtration et séchage. Des tests de séroprotection chez la souris en liaison avec ces travaux ont montré que l'injection parentérale de ces principes io immunisants procurait une protection passive généralisée contre certaines bactéries et virus entéropathogènes, lorsque ces parasites étaient injectés aux animaux par la même voie. It has also been proposed to isolate immune lactoglobulins from the milk of vaccinated cows, by coagulation of milk, recovery of whey and selective precipitation of lactoglobulins by ammonium sulfate followed by dialysis against pure water, filtration and drying. . Seroprotection tests in mice in conjunction with this work have shown that parenteral injection of these immunizing principles provides generalized passive protection against certain enteropathogenic bacteria and viruses, when these parasites are injected into animals by the same route.
On a maintenant trouvé une méthode de fabrication, à l'échelle industrielle, d'un concentré protéique contenant des immunoglobuli-15 nés sans dénaturation de celles-ci au cours du processus technologique. Ce produit procure une immunisation passive locale au niveau de la paroi intestinale sans résorption et sans destruction notable de son activité dans le tractus. We have now found a method of manufacturing, on an industrial scale, a protein concentrate containing immunoglobulins born without denaturing them during the technological process. This product provides local passive immunization in the intestinal wall without absorption and without significant destruction of its activity in the tract.
Le procédé selon l'invention est caractérisé par les étapes 20 suivantes: The method according to the invention is characterized by the following steps:
On hyperimmunise des femelles laitières en les vaccinant avec un antigène d'origine virale ou bactérienne, on recueille leur lait contenant les anticorps qu'elles ont produits, on sépare la crème et les impuretés, on coagule le lait clarifié et écrémé, on sépare la 25 caséine, on filtre, ultrafiltre et stérilise les protéines du petit-lait par filtration, on évapore et on sèche le produit dans des conditions ne dénaturant pas les immunoglobulines et conservant la stérilité. Dairy females are hyperimmunized by vaccinating them with an antigen of viral or bacterial origin, their milk is collected containing the antibodies that they have produced, the cream and the impurities are separated, the clarified and skimmed milk are coagulated, the 25 casein, the whey proteins are filtered, ultrafilter and sterilized by filtration, the product is evaporated and dried under conditions which do not denature the immunoglobulins and which maintain sterility.
Le dessin annexé est une représentation schématique des différentes étapes du procédé. The appended drawing is a schematic representation of the different stages of the process.
30 Les femelles laitières utilisées sont des bovidés, en particulier des vaches. 30 The dairy females used are bovines, in particular cows.
Le lait à traiter peut être de différents types plus ou moins riches en anticorps: Colostrum, lait de transition (lait des 8 jours suivant le vêlage) ou lait de fin de lactation (des 2 derniers mois de sécrétion 35 lactée). The milk to be treated can be of different types more or less rich in antibodies: Colostrum, transition milk (milk of the 8 days following calving) or milk at the end of lactation (of the last 2 months of milk secretion).
On préfère traiter un mélange de ces laits pour obtenir un taux d'anticorps élevé pendant la période la plus longue possible. It is preferred to treat a mixture of these milks to obtain a high level of antibodies for the longest possible period.
L'hyperimmunisation de la vache s'effectue par vaccination ou injection. Par exemple par injection dans la glande mammaire, 40 parentérale (sous-cutanée, intraveineuse), dans le système ganglionnaire rétromammaire, par scarification, par ingestion orale ou par combinaison de plusieurs de ces modes. The hyperimmunization of the cow is carried out by vaccination or injection. For example, by injection into the mammary gland, 40 parenterally (subcutaneously, intravenously), into the retromammary ganglion system, by scarification, by oral ingestion or by a combination of several of these modes.
On préfère utiliser une combinaison de ces modes suivant un schéma d'immunisation soigneusement établi afin d'obtenir un titre 45 d'anticorps satisfaisant dans chaque type de lait utilisé. Ainsi, pour le Colostrum et le lait de transition, la vaccination est parentérale dans les 8-2 semaines avant le vêlage et orale pendant la semaine précédant le vêlage. It is preferred to use a combination of these modes according to a carefully established immunization scheme in order to obtain a satisfactory antibody titer in each type of milk used. Thus, for Colostrum and transitional milk, vaccination is parenteral in the 8-2 weeks before calving and oral during the week before calving.
Pour le lait de fin de lactation, on procède à une alternance de so vaccination parentérale et orale à partir de 2 Vi mois avant le tarissement présumé de la sécrétion lactée. For end-of-lactation milk, parenteral and oral vaccination are alternated from 2 Vi months before the presumed drying up of the milk secretion.
Le vaccin utilisé est avantageusement un mélange de l'antigène choisi et d'un adjuvant à base de sérum sanguin homologue de celui de vaches immunisées, permettant ainsi une détoxication du vaccin. 55 La vache servant comme animal de production, les Ig contenues dans le concentré protéique sont principalement des IgG (spécialement des IgGi), à la différence du lait maternel qui contient des IgA. The vaccine used is advantageously a mixture of the selected antigen and an adjuvant based on blood serum homologous to that of immunized cows, thus allowing detoxification of the vaccine. 55 As the cow is used as a production animal, the Ig contained in the protein concentrate are mainly IgG (especially IgGi), unlike breast milk which contains IgA.
Le titre en Ig dans le concentré protéique dans lequel les protéines représentent 70 à 80% en poids est de 25 à 35% en poids. Certains 60 avantages sont liés au fait que, dans la mise en œuvre du procédé, les Ig ne sont pas séparées des autres protéines du lactosérum, lesquelles sont donc également présentes dans le concentré obtenu. On évite ainsi les opérations de précipitation sélective par le sulfate d'ammonium et dialyse. The Ig titer in the protein concentrate in which the proteins represent 70 to 80% by weight is 25 to 35% by weight. Some advantages are linked to the fact that, in the implementation of the process, the Ig are not separated from the other proteins of the whey, which are therefore also present in the concentrate obtained. This avoids selective precipitation operations with ammonium sulfate and dialysis.
65 De plus, certains facteurs bactériostatiques ou antiviraux, par exemple la lactoferrine ou les systèmes enzymatiques tels que lactoperoxydase, ribonucléase qui sont présents dans le lactosérum se retrouvent dans lé concentré protéique. 65 In addition, certain bacteriostatic or antiviral factors, for example lactoferrin or enzymatic systems such as lactoperoxidase, ribonuclease which are present in whey are found in the protein concentrate.
3 3
627079 627079
Toutes sortes d'antigènes d'origine virale ou bactérienne peuvent être utilisés et les anticorps obtenus sont fonction de la nature des antigènes administrés à la vache. On peut, par exemple, obtenir une protection contre les bactéries et virus entéropathogènes responsables de gastro-entérites accompagnées de fortes diarrhées avec déshydratation, par incorporation du concentré protéique contenant les Ig dans tout support convenant à une administration orale. Ce support peut être un excipient quelconque ou de préférence un produit diététique tel qu'un lait ou une farine lactée pour petit enfant, un lait dit humanisé ou adapté pour nourrisson, un lait spécialement adapté à un groupe particulier de nouveau-nés, comme par exemple un lait pour prématuré ou enfant de faible poids de naissance, etc. All kinds of antigens of viral or bacterial origin can be used and the antibodies obtained depend on the nature of the antigens administered to the cow. It is possible, for example, to obtain protection against the enteropathogenic bacteria and viruses responsible for gastroenteritis accompanied by severe diarrhea with dehydration, by incorporation of the protein concentrate containing the Ig in any support suitable for oral administration. This support can be any excipient or preferably a dietetic product such as milk or milk flour for small children, so-called humanized or adapted milk for infants, milk specially adapted for a particular group of newborns, such as example a milk for premature or low birth weight babies, etc.
Si on veut utiliser par exemple un concentré contenant des Ig anti-.E. coli en dose prophylactique avec un lait comme support, on incorporera de 0,8 à 3 g de concentré à 100 g de matière sèche et jusqu'à 6 g en dose thérapeutique. If you want to use for example a concentrate containing anti-.E. coli in prophylactic dose with milk as a support, 0.8 to 3 g of concentrate will be incorporated in 100 g of dry matter and up to 6 g in therapeutic dose.
Pour mettre en œuvre le procédé, il est nécessaire de veiller à ce que les opérations d'écrémage et de clarification soient très poussées pour éviter une obturation subséquente des filtres et ultrafiltres. To implement the process, it is necessary to ensure that the skimming and clarification operations are very thorough to avoid a subsequent blockage of the filters and ultrafilters.
La coagulation se fait avantageusement au pH isoélectrique de la caséine sans chauffage, de préférence en présence de présure. Coagulation is advantageously carried out at the isoelectric pH of casein without heating, preferably in the presence of rennet.
Ainsi, l'écrémage s'effectue de préférence en deux étapes, d'abord à froid pour éliminer la majeure partie des matières grasses et des impuretés (comme par exemple le sang souvent contenu dans le Colostrum), et ensuite à chaud pour séparer complètement celles-ci. De même, la séparation de la caséine s'accompagne d'un débourbage du sérum permettant de séparer les fines. Thus, creaming is preferably carried out in two stages, first cold to remove most of the fat and impurities (such as for example the blood often contained in Colostrum), and then hot to completely separate these. Likewise, the separation of the casein is accompanied by a settling of the serum making it possible to separate the fines.
D'autre part, il est essentiel de conduire les opérations nécessitant un traitement thermique (évaporation et séchage) dans des conditions ménagées pour éviter d'inactiver les Ig. On the other hand, it is essential to conduct operations requiring heat treatment (evaporation and drying) under gentle conditions to avoid inactivating the Ig.
Pour diminuer les pertes en Ig, dont une partie est éliminée dans l'écrémage avec la crème et une autre avec la caséine lors de la séparation de celle-ci, il est indiqué d'extraire à l'eau et la crème et le caillé, et de traiter les eaux de lavage contenant les Ig pour les récupérer. To reduce the loss of Ig, part of which is eliminated in creaming with the cream and another with casein when it is separated, it is advisable to extract the cream and the curd with water , and to treat the wash water containing the Ig to recover them.
Les exemples suivants, dans lesquels les quantités et proportions sont en poids sauf indication contraire, illustrent la façon dont l'invention peut être mise en œuvre. The following examples, in which the quantities and proportions are by weight unless otherwise indicated, illustrate the manner in which the invention can be implemented.
Exemple 1: Example 1:
5 Des vaches de différentes races ont été hyperimmunisées suivant le schéma ci-dessous avec un vaccin dont la préparation est indiquée ci-après, et on a recueilli le lait des 2 derniers mois de sécrétion lactée et des 8 premiers jours après vêlage. 5 Cows of different breeds were hyperimmunized according to the scheme below with a vaccine, the preparation of which is indicated below, and the milk was collected for the last 2 months of milk secretion and the first 8 days after calving.
]0 Préparation du vaccin ] 0 Vaccine preparation
On a utilisé les sérotypes E. coli entéropathogènes suivants: The following enteropathogenic E. coli serotypes were used:
20 20
0 0
18 18
K76 K76
(B20) (B20)
0 0
111 111
K58 K58
(B4) (B4)
0 0
20 20
K17 K17
(L) (L)
0 0
112 112
K68 K68
(B 11) (B 11)
0 0
26 26
K60 K60
(B6) (B6)
0 0
119 119
K69 K69
(B 14) (B 14)
0 0
44 44
K74 K74
(L) (L)
0 0
124 124
K72 K72
(B 17) (B 17)
0 0
55 55
K59 K59
(B 5) (B 5)
0 0
125 125
K70 K70
(B 15) (B 15)
0 0
78 78
K.80 K.80
(-) (-)
0 0
126 126
K71 K71
(B 16) (B 16)
0 0
86 86
K61 K61
(B 7) (B 7)
0 0
127 127
K63 K63
(BS) (BS)
0 0
128 128
K68 K68
(B 12) (B 12)
Les différentes souches provenaient de cas de gastro-entérites chez des enfants hospitalisés. Le sérotypage a été fait avec des antisérums multi- et monovalents (Difco). Les bactéries ont été 25 cultivées en milieu liquide minimal contenant 2% d'acides casaminés (Difco) et 2% de glucose pendant 24 h à + 37° C sans agitation des flacons. Pour inactiver les germes, on a séparé les cultures par centrifugation entre cellules sédimentées et surnageant. Les cellules ont été remises en suspension et incubées à -I- 37°C pendant 24 h en 30 présence de 0,5% de formaldéhyde, cependant que le surnageant a été inactivé comme indiqué ci-dessus, mais avec 0,05% de formaldéhyde. Après ime nouvelle centrifugation et élimination du surnageant, les bactéries ont été remises en suspension dans le surnageant inactivé d'origine. Cette procédure permet de conserver le 35 surnageant contenant des exotoxines bactériennes pour le vaccin. On a obtenu un vaccin à 1-2 x 10® bactéries/ml, qu'on a ensuite dilué par mélange avec une solution à 2% d'Al(OH)3 et du sérum sanguin homologue de celui de vaches immunisées. The different strains came from cases of gastroenteritis in hospitalized children. Serotyping was done with multi- and monovalent antisera (Difco). The bacteria were cultivated in a minimal liquid medium containing 2% casaminic acids (Difco) and 2% glucose for 24 h at + 37 ° C. without shaking the flasks. To inactivate the germs, the cultures were separated by centrifugation between sedimented cells and supernatant. The cells were resuspended and incubated at -I- 37 ° C for 24 h in the presence of 0.5% formaldehyde, while the supernatant was inactivated as indicated above, but with 0.05% of formaldehyde. After further centrifugation and removal of the supernatant, the bacteria were resuspended in the original inactivated supernatant. This procedure keeps the supernatant containing bacterial exotoxins for the vaccine. A 1-2 x 10® bacteria / ml vaccine was obtained, which was then diluted by mixing with a 2% solution of Al (OH) 3 and blood serum homologous to that of immunized cows.
Procédure d'immunisation Immunization procedure
A. Schéma d'immunisation pour l'obtention de lait colostral et de transition contenant des Ig anti-£. coli A. Immunization scheme for obtaining colostral and transition milk containing anti-Ig. coli
Jour de vêlage présumé = X Presumed calving day = X
Moment du traitement Time of treatment
Vaccin + adjuvant éventuel Vaccine + possible adjuvant
Mode d'administration Administration mode
X — 8 semaines X - 8 weeks
5 ml vaccin (5 x 107 bactéries/ml) + 5 ml sérum* 5 ml vaccine (5 x 107 bacteria / ml) + 5 ml serum *
injection sous-cutanée subcutaneous injection
X — 7 semaines X - 7 weeks
5 ml vaccin (5 x 107 bactéries/ml) + 5 ml 2% AI(OH)3 + 5 ml sérum* 5 ml vaccine (5 x 107 bacteria / ml) + 5 ml 2% AI (OH) 3 + 5 ml serum *
injection intraveineuse intravenous injection
X — 6 semaines X - 6 weeks
10 ml vaccin (5 x 107 bactéries/ml) 10 ml vaccine (5 x 107 bacteria / ml)
injection sous-cutanée subcutaneous injection
X — 5 Vi semaines X - 5 Vi weeks
20 ml vaccin (5 x 107 bactéries/ml) + 10 ml 2% Al(OH)3 20 ml vaccine (5 x 107 bacteria / ml) + 10 ml 2% Al (OH) 3
injection dans le système ganglionnaire rétromammaire injection into the retromammary ganglion system
X — 5 semaines X - 5 weeks
40 ml vaccin (5 x 107 bactéries/ml) + 20 ml sérum instillation de 4 x 15 ml dans le pis par les canaux des trayons 40 ml vaccine (5 x 107 bacteria / ml) + 20 ml instillation serum 4 x 15 ml into the udder through the teat ducts
X — 4'A semaines X - 4'A weeks
24 ml vaccin (5 x 108 bactéries/ml) + 8 ml sérum* 24 ml vaccine (5 x 108 bacteria / ml) + 8 ml serum *
injection sous-cutanée** subcutaneous injection **
X — 4 semaines X - 4 weeks
40 ml vaccin (5 x 107 bactéries/ml) + 20 ml sérum instillation de 4 x 15 ml dans le pis par les canaux des trayons 40 ml vaccine (5 x 107 bacteria / ml) + 20 ml instillation serum 4 x 15 ml into the udder through the teat ducts
X — 3 semaines X - 3 weeks
10 ml vaccin (5 x 108 bactéries/ml) 10 ml vaccine (5 x 108 bacteria / ml)
injection sous-cutanée subcutaneous injection
X — 2 semaines X - 2 weeks
5 ml vaccin (5 x 10® bactéries/ml) + 5 ml 2% Al(OH)3 5 ml vaccine (5 x 10® bacteria / ml) + 5 ml 2% Al (OH) 3
injection intraveineuse intravenous injection
X — 1 semaine X - 1 week
100 ml vaccin 100 ml vaccine
(1 x 109 bactéries/ml) (1 x 109 bacteria / ml)
ingestion orale pendant le ruminement oral ingestion during rumination
627079 627079
4 4
Jour de vêlage présumé = X Presumed calving day = X
Moment du traitement Time of treatment
Vaccin + adjuvant éventuel Vaccine + possible adjuvant
Mode d'administration Administration mode
X — Zi semaine X - Zi week
100 ml vaccin 100 ml vaccine
(1 x 109 bactéries/ml) (1 x 109 bacteria / ml)
ingestion orale pendant le ruminement oral ingestion during rumination
* Ces additions de sérum sont faites uniquement dans le cas où une vache est immunisée pour la première fois. * These serum additions are made only if a cow is immunized for the first time.
** Cette injection sous-cutanée est répartie dans le système lymphatique comme suit: ** This subcutaneous injection is distributed in the lymphatic system as follows:
2 x 4 ml dans les ganglions lymphatiques préscapulaires 2 x 4 ml dans les ganglions lymphatiques postscapulaires 2 x 4 ml in the prescapular lymph nodes 2 x 4 ml in the postscapular lymph nodes
Exemple 2: Example 2:
Le lait recueilli à partir de vaches vaccinées selon l'exemple 1 a été traité comme suit: The milk collected from cows vaccinated according to Example 1 was treated as follows:
— l'écrémage s'effectue en deux étapes: étape A à froid, et étape B à chaud. - skimming is carried out in two stages: stage A cold, and stage B hot.
A) 1100 kg de lait passent à froid dans une écrémeuse centrifuge et sont dirigés vers une cuve tampon de 25001, puis pompés dans une débourbeuse centrifuge à accélérations élevées (environ 11000 g) afin d'éliminer sang et impuretés (boues). A) 1100 kg of milk are cold passed through a centrifugal cream separator and are directed to a 25001 buffer tank, then pumped into a centrifugal carboy at high accelerations (approximately 11000 g) in order to remove blood and impurities (sludge).
B) Le lait débourbé froid est stocké dans un réservoir de 25001 et pompé à travers un réchauffeur tempéré à 40°C dans l'écrémeuse centrifuge qui a déjà servi précédemment, séparant ainsi 110 kg de crème qu'on récupère et 5 kg de boues qui sont détruites. En variante, on peut utiliser une écrémeuse autodébourbeuse dans les opérations d'écrémage à froid et à chaud, et une débourbeuse entre ces opérations, réduisant ainsi la durée de l'écrémage. B) The cold settled milk is stored in a 25001 tank and pumped through a tempered heater to 40 ° C in the centrifugal cream separator which has already served previously, thus separating 110 kg of cream that is recovered and 5 kg of sludge which are destroyed. Alternatively, a self-cleaning cream separator can be used in cold and hot skimming operations, and a settler between these operations, thereby reducing the duration of skimming.
— On procède alors à la filtration, suivie de l'ultrafiltration du sérum. La filtration doit être très soignée, afin d'éliminer toute difficulté à l'ultrafiltration, en séparant les particules très fines de caséine. Elle s'opère par filtre Seitz KOth7 à 7 plaques d'amiante de 20 x 20 cm. Le filtrat est stocké dans un réservoir de 30001 puis pompé vers l'ultrafiltre. L'ultrafiltration s'opère en 2 ou 3 étapes avec recyclage du rétentat dans le réservoir. Deux pompes centrifuges en série fournissent le débit contre une pression d'entrée d'environ - We then proceed to filtration, followed by ultrafiltration of the serum. Filtration must be very careful, in order to eliminate any difficulty with ultrafiltration, by separating the very fine particles of casein. It is operated by a Seitz KOth7 filter with 7 asbestos plates of 20 x 20 cm. The filtrate is stored in a 30001 tank and then pumped to the ultrafilter. Ultrafiltration takes place in 2 or 3 stages with recycling of the retentate in the tank. Two centrifugal pumps in series provide flow against an inlet pressure of approximately
7 bars dans le compartiment d'entrée de l'ultrafiltre, à la sortie duquel la pression est maintenue à environ 4,5 bars. Pour éviter le réchauffement du rétentat par l'énergie fournie aux pompes, celui-ci est refroidi à environ 10-12°C. 7 bars in the inlet compartment of the ultrafilter, at the outlet of which the pressure is maintained at around 4.5 bars. To avoid heating of the retentate by the energy supplied to the pumps, it is cooled to around 10-12 ° C.
io 2 x 4 ml dans les ganglions lymphatiques inguinals 2 x 4 ml dans les ganglions lymphatiques poplités B. Schéma d'immunisation pour l'obtention de lait de fin de lactation (2 derniers mois de lactation) contenant des Ig anti-if. coli. Cette immunisation s'applique uniquement aux vaches ayant déjà 15 été immunisées pour la période colostrale et de transition. io 2 x 4 ml in the inguinal lymph nodes 2 x 4 ml in the popliteal lymph nodes B. Immunization scheme for obtaining late lactation milk (last 2 months of lactation) containing anti-if Ig. coli. This immunization only applies to cows which have already been immunized for the colostral and transitional period.
La première étape ou ultrafïltration propre permet de séparer les solutés à haut poids moléculaire, les protéines, retenues sur la membrane (qui se trouvent dans le rétentat), tandis qu'une partie du lactose, des vitamines, des sels minéraux et de l'eau sont évacués dans 45 le perméat, En utilisant un module DDS avec membrane 800 (surface membrane = 7 m2), le rapport rétentat/perméat étant d'environ 1 à 3,1, on obtient 580 kg de perméat I et 274,7 kg de rétentat avec un débit moyen de 14,17 kgperméat/m2 h. The first stage or clean ultrafiltration makes it possible to separate the high molecular weight solutes, the proteins retained on the membrane (which are found in the retentate), while part of the lactose, vitamins, mineral salts and water are evacuated in 45 permeate, Using a DDS module with membrane 800 (membrane surface = 7 m2), the retentate / permeate ratio being approximately 1 to 3.1, we obtain 580 kg of permeate I and 274.7 kg of retentate with an average flow rate of 14.17 kg permeate / m2 h.
La seconde étape est une diafiltration, au cours de laquelle on ajoute continuellement au rétentat 825 kg d'eau, et on fait circuler la solution dans les mêmes conditions que dans la première étape. La diafiltration est arrêtée lorsque la conductibilité électrique du perméat atteint la valeur désirée, le rapport rétentat/eau ajoutée étant d'environ 1 à 3. On sépare ainsi 825 kg de perméat II et 274,7 kg de 55 rétentat avec un débit moyen de 11,77 kg perméat/m2 h. The second stage is a diafiltration, during which 825 kg of water are continuously added to the retentate, and the solution is circulated under the same conditions as in the first stage. The diafiltration is stopped when the electrical conductivity of the permeate reaches the desired value, the retentate / added water ratio being approximately 1 to 3. This separates 825 kg of permeate II and 274.7 kg of 55 retentate with an average flow rate of 11.77 kg permeate / m2 h.
La troisième est une concentration qu'on opère facultativement par recyclage du rétentat sur la membrane jusqu'à un taux de matières sèches d'environ 10%, par élimination de 82,5 kg de perméat III. On obtient ainsi 192,2 kg de solution préconcentrée. En 60 variante, on supprime cette troisième étape et on procède directement à la filtration stérile. The third is a concentration which is optionally operated by recycling the retentate on the membrane to a dry matter content of approximately 10%, by elimination of 82.5 kg of permeate III. 192.2 kg of preconcentrated solution are thus obtained. Alternatively, this third step is omitted and sterile filtration is carried out directly.
La filtration stérile représente une étape importante dans l'ensemble du procédé, les traitements thermiques n'étant pas applicables pour la stérilisation, car ils conduisent à une dénaturation des Ig. La 65 filtration stérile débarrasse le rétentat des micro-organismes qui pourraient encore s'y trouver (la majeure partie de ceux-ci ont déjà été éliminés lors de la séparation de la crème, de la caséine et des boues). Afin d'éviter le blocage des filtres stérilisants, un dêbourbage Sterile filtration represents an important stage in the whole process, thermal treatments not being applicable for sterilization, because they lead to denaturation of the Ig. The sterile filtration rids the retentate of microorganisms which could still be there (most of these have already been eliminated during the separation of the cream, the casein and the sludge). In order to avoid blockage of the sterilizing filters, a settling
Jour présumé de tarissement de la sécrétion lactée = X Presumed day of drying up of the milk secretion = X
Moment du traitement Time of treatment
Vaccin + adjuvant éventuel Vaccine + possible adjuvant
Mode d'administration Administration mode
X — 70 jours X - 70 days
5 ml vaccin (5 x 107 bactéries/ml) 5 ml vaccine (5 x 107 bacteria / ml)
injection intraveineuse intravenous injection
+ 5 ml 2% Al(OH)3 + 5 ml 2% Al (OH) 3
X — 65 jours X - 65 days
20 ml vaccin (5 x 108 bactéries/ml) 20 ml vaccine (5 x 108 bacteria / ml)
injection dans le système ganglionnaire injection into the lymph node system
rétromammaire retromammary
X — 60 jours X - 60 days
24 ml vaccin (5 x 108 bactéries/ml) 24 ml vaccine (5 x 108 bacteria / ml)
injection sous-cutanée** subcutaneous injection **
(comme ci-dessus, sous A) (as above, under A)
X — 55 jours X - 55 days
100 ml vaccin (1 x 109 bactéries/ml) 100 ml vaccine (1 x 109 bacteria / ml)
ingestion orale pendant ruminement oral ingestion during rumination
X — 50 jours X - 50 days
40 ml vaccin (5 x 107 bactéries/ml) 40 ml vaccine (5 x 107 bacteria / ml)
instillation dans le pis udder instillation
+ 20 ml sérum + 20 ml serum
(comme ci-dessus, sous A) (as above, under A)
X — 40 jours X - 40 days
100 ml vaccin (1 x 109 bactéries/ml) 100 ml vaccine (1 x 109 bacteria / ml)
ingestion orale pendant ruminement oral ingestion during rumination
X — 30 jours X - 30 days
20 ml vaccin (5 x 108 bactéries/ml) 20 ml vaccine (5 x 108 bacteria / ml)
injection dans le système ganglionnaire injection into the lymph node system
rétromammaire retromammary
X — 25 jours X - 25 days
40 ml vaccin (5 x 107 bactéries/ml) 40 ml vaccine (5 x 107 bacteria / ml)
instillation dans le pis udder instillation
+ 20 ml sérum + 20 ml serum
(comme ci-dessus, sous A) (as above, under A)
X — lOjoiirs X - lOjoiirs
100 ml vaccin (1 x 109 bactéries/ml) 100 ml vaccine (1 x 109 bacteria / ml)
ingestion orale pendant ruminement oral ingestion during rumination
50 50
5 5
627079 627079
par centrifugation et une triple filtration du rétentat sont nécessaires. Après débourbage, le rétentat est stocké dans un réservoir et passé par une ligne de filtration comprenant une préfiltration sur trois filtres Seitz KOth7, EK, EKS montés en série, puis filtration stérile sur filtres Seitz Supra 20 et Millipore HA 0,45p., montés en série et préalablement stérilisés à l'eau surchauffée. Le rétentat stérile est stocké dans un réservoir stérile de 5001. by centrifugation and triple filtration of the retentate are necessary. After settling, the retentate is stored in a tank and passed through a filtration line comprising a prefiltration on three Seitz KOth7, EK, EKS filters assembled in series, then sterile filtration on Seitz Supra 20 and Millipore HA 0.45p. Filters, assembled in series and previously sterilized with superheated water. The sterile retentate is stored in a sterile tank of 5001.
Toutes les opérations ultérieures se feront sous conditions stériles. A l'aide d'azote comprimé et filtré stérile, par exemple, on peut transférer à l'opération suivante d'évaporation. All subsequent operations will be carried out under sterile conditions. Using sterile compressed and filtered nitrogen, for example, it can be transferred to the next evaporation operation.
L'évaporation est effectuée avec un évaporateur à couche mince (à flot tombant de surface 1 m2) à température de chauffage de 75°C, celle du produit étant d'environ 30°C, jusqu'à un taux de matières sèches d'au moins 20%. Pour éviter toute infection, le transfert se fait par pompe péristaltique du réservoir de rétentat au réservoir de concentrât, lequel est relié à une boucle comprenant l'évaporateur, l'opération de concentration se faisant en circuit fermé. Cette opération n'affecte pas l'activité des Ig. The evaporation is carried out with a thin-layer evaporator (with a falling surface area of 1 m2) at a heating temperature of 75 ° C., that of the product being approximately 30 ° C., up to a dry matter content of at least 20%. To avoid any infection, the transfer is made by peristaltic pump from the retentate reservoir to the concentrate reservoir, which is connected to a loop comprising the evaporator, the concentration operation being carried out in a closed circuit. This does not affect the activity of the Ig.
— On procède alors au séchage du concentrât (96 kg) par tout moyen convenable, par exemple par congélation suivie d'une lyophilisation. La congélation peut s'effectuer sur plateaux à —40°C. Les Ig peuvent être stockées à — 30° C sans perte d'activité pendant environ 45 j. Le produit à — 30°C est lyophilisé dans des plateaux dans une enceinte à 0,5 torr, avec une température du condenseur de —50°C et granulés chauffés à 30-35°C. Le mode de séchage n'affecte pas l'activité des Ig. On obtient ainsi 19,1 kg de produit sec contenant 25-35% d'Ig que l'on conditionne stérilement. - The concentrate is then dried (96 kg) by any suitable means, for example by freezing followed by lyophilization. Freezing can be carried out on trays at -40 ° C. The Ig can be stored at -30 ° C without loss of activity for about 45 days. The product at -30 ° C is lyophilized in trays in an enclosure at 0.5 torr, with a condenser temperature of -50 ° C and granules heated to 30-35 ° C. The drying mode does not affect the activity of the Ig. 19.1 kg of dry product are thus obtained containing 25-35% of Ig which are sterile packaged.
La composition moyenne du concentré protéique obtenu est The average composition of the protein concentrate obtained is
Protéines Protein
75 ± 5% 75 ± 5%
30 ± 5% 30 ± 5%
immunoglobulines immunoglobulins
15 ± 5% 15 ± 5%
a-lactalbumines a-lactalbumin
35 ± 5%" 35 ± 5% "
ß-lactoglobulines ß-lactoglobulins
5 + 2% 5 + 2%
sérum albumines albumin serum
5 ± 2% 5 ± 2%
autres protéines mineures other minor proteins
4 ± 0,5% 4 ± 0.5%
humidité résiduelle residual moisture
10 ± 2% 10 ± 2%
lactose lactose
5 ± 2% 5 ± 2%
sels minéraux mineral salts
5 ± 2% 5 ± 2%
substances azotées non protéiques non-protein nitrogenous substances
Exemple 3: Example 3:
On procède comme à l'exemple 2, à la différence que la crème et la caséine sont extraites à l'eau pour récupérer une partie des Ig perdues, les eaux de lavage étant recyclées dans la ligne de fabrication. The procedure is as in Example 2, with the difference that the cream and the casein are extracted with water to recover part of the lost Ig, the washing water being recycled in the production line.
— L'écrémage à froid (étape A) s'effectue avec une ligne parallèle d'extraction à l'eau de la fraction de protéines contenant les Ig entraînée avec la crème. La crème provenant de la première centrifugation (115 kg) est stockée dans un réservoir de 10001 avec brasseur et mélangée à 150 kg d'eau tiède à 40° C, le tout brassé pendant 30 min et centrifugé dans une écrémeuse. On sépare ainsi - Cold skimming (step A) is carried out with a parallel line of water extraction of the protein fraction containing the Ig entrained with the cream. The cream from the first centrifugation (115 kg) is stored in a 10001 tank with stirrer and mixed with 150 kg of warm water at 40 ° C, all stirred for 30 min and centrifuged in a cream separator. So we separate
115 kg de crème et 150 kg de solution qui est réunie au lait écrémé et débourbé. On obtient ainsi 1130 kg de liquide qui est conduit vers l'écrémage à chaud (étape B) et la coagulation. 115 kg of cream and 150 kg of solution which is combined with skimmed milk and racked. 1130 kg of liquid are thus obtained which is led to hot skimming (step B) and coagulation.
— La séparation de la caséine donne, à partir de 114,5 kg de lait écrémé emprésuré et acidifié, 991 kg de sérum et 154 kg de caséine. Une ligne parallèle permet d'extraire la fraction de protéines contenant les Ig du caillé à l'eau. Le caillé est stocké à la sortie de la clarifieuse-autodébourbeuse dans un réservoir muni d'un brasseur et brassé avec 300 kg d'eau tiède à 40° C pendant 30 min et dirigé vers un moulin colloïdal. La suspension de caillé broyé est alors séparée dans une clarifieuse-autodébourbeuse. On récupère 154 kg de caséine lavée et 300 kg de liquide de lavage qu'on réunit au sérum pour les opérations ultérieures. 1291 kg de sérum sont filtrés et ultrafiltrés, conduisant à 2010 kg de perméats (I, II et III) et 216 kg de préconcentrat. L'évaporation fournit 108 kg de concentrât qui donne • 21,6 kg de produit sec par séchage. On gagne ainsi environ 14% d'Ig par rapport au procédé selon l'exemple 2. - The separation of casein gives, from 114.5 kg of renneted skimmed and acidified milk, 991 kg of serum and 154 kg of casein. A parallel line makes it possible to extract the fraction of proteins containing the Ig from the curd with water. The curd is stored at the outlet of the self-cleaning clarifier in a tank fitted with a stirrer and stirred with 300 kg of lukewarm water at 40 ° C for 30 min and directed to a colloid mill. The suspension of ground curd is then separated in a clarifier-self-cleaning. 154 kg of washed casein and 300 kg of washing liquid are recovered, which are combined with serum for the subsequent operations. 1291 kg of serum are filtered and ultrafiltered, leading to 2010 kg of permeates (I, II and III) and 216 kg of preconcentrate. Evaporation provides 108 kg of concentrate which gives • 21.6 kg of dry product upon drying. This saves about 14% of Ig compared to the method according to Example 2.
Exemple 4: Example 4:
1 kg de la poudre préparée selon les exemples 2 ou 3 est mélangée à 99 kg de poudre de lait de façon homogène, et celle-ci est conditionnée stérilement pour fournir un produit contenant une dose prophylactique d'Ig, pour une alimentation isocalorique de 120 cal/kg/jour, correspondant à 250 mg de concentré Ig/kg/jour. 1 kg of the powder prepared according to examples 2 or 3 is mixed with 99 kg of milk powder in a homogeneous manner, and this is sterile packaged to provide a product containing a prophylactic dose of Ig, for an isocaloric diet of 120 cal / kg / day, corresponding to 250 mg of Ig concentrate / kg / day.
Exemple 5: Example 5:
Différents tests in vitro et in vivo ont été effectués avec le concentré protéique selon les exemples 2 ou 3 et désignés ci-après par concentré Ig pour montrer: Various in vitro and in vivo tests were carried out with the protein concentrate according to Examples 2 or 3 and designated below by Ig concentrate to show:
— que les Ig lactiques ont une spécificité anticorps que l'on trouve normalement chez les Ig humaines, et que celle-ci est préservée au cours du processus de fabrication; - that lactic Ig have an antibody specificity that is normally found in human Ig, and that this is preserved during the manufacturing process;
— que les Ig lactiques spécifiques montrent une activité protectrice en interférant dans les mécanismes pathogènes des microorganismes entéropathogènes. - that specific lactic Ig show a protective activity by interfering in the pathogenic mechanisms of enteropathogenic microorganisms.
Hémagglutination passive Passive hemagglutination
Des globules rouges de mouton ont été sensibilisés avec un extrait à l'urée d'un sérotype d'E. coli spécifique. Cet extrait a été obtenu selon Brodhage (Brodhage H., «J. Hyg.», 1961,148,94). Les bactéries ont été cultivées sur agar nutritif (Difco) à 37°C pendant 30 h dans des flacons de Roux. On a récolté la culture par 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (8,8 g NaCl + 1,86 g Na2HP04 • 2H20 + 0,43 g KH2P04/1000 ml H20) à pH 7,2. Après addition de 10 g d'urée (Merk), la suspension a été laissée au repos pendant 90 h à 37°C avec agitation lente. Après centrifugation, le surnageant a été totalement dialysé contre la solution saline tamponnée au phosphate à pH 7,2, dilué jusqu'à un volume final de 50 ml avec la solution saline tamponnée au phosphate à pH 7,2 et congelé en petites portions à — 20° C. La sensibilisation des globules rouges de mouton avec cet antigène a été effectuée par une combinaison des méthodes selon Avrameas et coll. (Avrameas S., Taudou B., Chuilon S., «Immunochemistry», 1969, 6, 67) et selon Otto et coll. (Otto H., Takamiya H., Vogt A., «J. Immunol. Methods», 1973,3,137). Les globules rouges de mouton ont été prétraités avec le glutaraldéhyde (concentration finale 5% de globules rouges de mouton et 0,5% de glutaraldéhyde) puis lavés et mis en suspension à 20% dans la solution saline tamponnée au phosphate à pH 7,2 et mélangés avec le même volume d'extrait à l'urée. Après 16 h d'incubation à 20° C sous agitation douce, les globules rouges de mouton sensibilisés ont été lavés plusieurs fois et mis en suspension à 1 % pour usage immédiat. Les globules rouges de mouton peuvent être stockés en suspension à 10% à 4°C pendant plusieurs semaines. Sheep red blood cells were sensitized with an urea extract of an E. serotype. specific coli. This extract was obtained according to Brodhage (Brodhage H., "J. Hyg.", 1961,148,94). The bacteria were cultivated on nutritious agar (Difco) at 37 ° C. for 30 h in vials of Roux. The culture was harvested with 10 ml of phosphate-buffered saline (8.8 g NaCl + 1.86 g Na2HP04 • 2H20 + 0.43 g KH2P04 / 1000 ml H2O) at pH 7.2. After addition of 10 g of urea (Merk), the suspension was left to stand for 90 h at 37 ° C with slow stirring. After centrifugation, the supernatant was completely dialyzed against phosphate buffered saline at pH 7.2, diluted to a final volume of 50 ml with phosphate buffered saline at pH 7.2 and frozen in small portions to - 20 ° C. The sensitization of the red blood cells of sheep with this antigen was carried out by a combination of the methods according to Avrameas et al. (Avrameas S., Taudou B., Chuilon S., “Immunochemistry”, 1969, 6, 67) and according to Otto et al. (Otto H., Takamiya H., Vogt A., "J. Immunol. Methods", 1973,3,137). The sheep red blood cells were pretreated with glutaraldehyde (final concentration 5% sheep red blood cells and 0.5% glutaraldehyde) then washed and suspended at 20% in phosphate buffered saline at pH 7.2 and mixed with the same volume of urea extract. After 16 h of incubation at 20 ° C with gentle shaking, the sensitized sheep red blood cells were washed several times and suspended in 1% for immediate use. Sheep's red blood cells can be stored in 10% suspension at 4 ° C for several weeks.
Avant filtration, chaque échantillon à examiner doit être absorbé sur globules rouges de mouton prétraités au glutaraldéhyde (0,1 ml globules rouges de mouton sédimentés pour 1 ml de concentré Ig, 37°C, 60 min). Before filtration, each sample to be examined must be absorbed on glutaraldehyde pretreated sheep red blood cells (0.1 ml sedimented sheep red blood cells for 1 ml of Ig concentrate, 37 ° C, 60 min).
Les titrages ont été effectués avec un appareil Microtiter (Sever J.L., «J. Immunol.», 1962,88,320, et Conrath T.B., «Handbook of Microtiter Procédures», 1972) en utilisant des plaques de polystyrène avec cavités en forme de V. On a effectué une série de dilutions de 50 [il chacune dans le sérum normal de lapin dilué à 1/200 et on a ajouté 25 [il de globules rouges de mouton sensibilisés à 1% à chaque dilution. Une série a été préparée avec des globules rouges de mouton non sensibilisés comme contrôle d'agglutination non spécifique. On a lu les résultats après 2 h, le titre d'hémagglutination étant donné par la dernière dilution conduisant à une réaction positive nette. The titrations were carried out with a Microtiter apparatus (Sever JL, “J. Immunol.”, 1962, 88, 320, and Conrath TB, “Handbook of Microtiter Procedures”, 1972) using polystyrene plates with V-shaped cavities. A series of dilutions of 50 µl each in normal rabbit serum diluted 1/200 was made and 25 µl of sensitized sheep red blood cells 1% were added to each dilution. A series was prepared with non-sensitized sheep red blood cells as a non-specific agglutination control. The results were read after 2 h, the titer of hemagglutination being given by the last dilution leading to a clear positive reaction.
Les résultats obtenus pour cinq sérotypes d'E. coli sont donnés dans le tableau ci-dessous: The results obtained for five serotypes of E. coli are given in the table below:
5 5
10 10
15 15
20 20
25 25
30 30
35 35
40 40
45 45
50 50
55 55
60 60
65 65
627079 627079
6 6
Sérotype E. coli E. coli serotype
Titre en agglutinines Agglutinin title
0 55 0 55
1/256 1/256
0 111 0 111
1/ 64 1/64
0 119 0 119
1/128 1/128
0 127 0 127
1/128 1/128
0 128 0 128
1/ 64 1/64
contrôle control
— -
Activité bactériostatique in vitro In vitro bacteriostatic activity
On a étudié l'activité bactériostatique sur la croissance de différents sérotypes E. coli par addition de concentré Ig au milieu de culture. On a utilisé le système Microtiter adapté pour la culture, permettant ainsi d'utiliser des quantités minimales d'échantillon à tester et d'examiner simultanément un nombre maximal d'échantillons. The bacteriostatic activity on the growth of different E. coli serotypes was studied by the addition of concentrated Ig to the culture medium. The appropriate Microtiter system was used for the culture, thus allowing the use of minimum quantities of the test sample and the simultaneous examination of a maximum number of samples.
Chaque culture avait un volume final de 0,25 ml soit dans un milieu minimal contenant 1 % de glucose, soit dans un milieu de culture riche. Pour chaque valeur du temps d'incubation étudiée, on a effectué deux prises d'échantillons pour diminuer les risques d'erreurs dues à des variations de volume. L'évaluation a été faite pai double comptage d'aliquots de 10 (il sur plaques d'agar nutritif. L'inoculum bactérien consistait en une dilution d'une culture de 16 h en milieu minimal contenant 1 à 2 x 103 bactéries/ml. L'incubation a été effectuée en atmosphère humide à 37° C. Le concentré Ig aux concentrations finales de 1 |xg/ml, 10 [ig/ml, 100 [ig/ml et 1 mg/ ml a été ajouté au milieu de culture avant inoculation avec 2 x 103 E. colijml. On a constaté une nette inhibition de la croissance de E. coli 0 111 : B4 pendant les 4 premières heures d'incubation à la concentration de concentré Ig de 10 (ig/ml. Par comparaison au contrôle constitué par le milieu de culture seul, on a observé une croissance supérieure en présence de 1 mg/ml de protéines de petit-lait normales obtenues à partir de vaches non immunisées. Each culture had a final volume of 0.25 ml either in a minimal medium containing 1% glucose, or in a rich culture medium. For each value of the incubation time studied, two samples were taken to reduce the risk of errors due to variations in volume. The evaluation was made by double counting of aliquots of 10 (it on nutrient agar plates. The bacterial inoculum consisted of a dilution of a culture of 16 h in minimal medium containing 1 to 2 x 103 bacteria / ml The incubation was carried out in a humid atmosphere at 37 ° C. The Ig concentrate at the final concentrations of 1 μg / ml, 10 μg / ml, 100 μg / ml and 1 mg / ml was added to the medium. culture before inoculation with 2 × 10 3 E. colijml. A marked inhibition of the growth of E. coli 0 111: B4 was observed during the first 4 hours of incubation at the concentration of concentrated Ig of 10 (μg / ml. compared to the control constituted by the culture medium alone, higher growth was observed in the presence of 1 mg / ml of normal whey proteins obtained from non-immunized cows.
Clearance de E. coli 0 111 : B4 chez la souris Clearance of E. coli 0 111: B4 in mice
Pour chaque test, on a utilisé 8 souris (souris blanches mâles suisses, de 20 à 24 g), soit 2 comme contrôle et 6 pour 3 tests effectués chacun deux fois. Toutes les souris ont reçu une injection sous-5 cutanée de 0,1 ml d'héparine (500 Ul/ml). Un bouillon de culture de 116 h deE. coli 0 111 :B4 a été dilué au 1/10 avec une solution saline stérile puis dilué au 1/100 par addition de sérum de veau fœtal (Difco) dilué au 1/10 pour les contrôles et contenant trois concentrations choisies de concentré Ig. On a injecté par voie intraveineuse io 0,2 ml de la solution obtenue dans la veine caudale, chaque souris (2 souris pour le contrôle et 2 x 3 pour les tests) recevant environ 2 x 106 bactéries, la suspension bactérienne d'origine contenant 109 bactéries/ml. Immédiatement après l'injection (au temps tO), et après 20,40 et 60 min, on a effectué une ponction sanguine de 50 [il à îs partir du plexus veineux ophtalmique, au moyen de tubes capillaires calibrés héparinisés, et on a transféré immédiatement les échantillons dans 5 ml de solution saline stérile (dilution sanguine 10-2) qu'on a ensuite dilué à IO-3 et 10-4 en solution saline. On a effectué le comptage sur plaques d'agar (Difco) avec 1 ml de chaque dilution et 20 déterminé l'indice de phagocytose K selon Biozzi et coll. (Biozzi G., Stiffel C., Halpern B.N., Le Minor L., Mauton D., «J. Immunol.», 1961,57,296): For each test, 8 mice (white Swiss mice, 20 to 24 g) were used, ie 2 as a control and 6 for 3 tests each carried out twice. All mice received a subcutaneous injection of 0.1 ml heparin (500 IU / ml). A 116 h E.E. culture broth. coli 0 111: B4 was diluted 1/10 with sterile saline then diluted 1/100 by addition of fetal calf serum (Difco) diluted 1/10 for the controls and containing three selected concentrations of Ig concentrate. 0.2 ml of the solution obtained was injected intravenously into the tail vein, each mouse (2 mice for the control and 2 x 3 for the tests) receiving approximately 2 x 10 6 bacteria, the original bacterial suspension containing 109 bacteria / ml. Immediately after the injection (at time t0), and after 20.40 and 60 min, a blood puncture of 50 μl was carried out from the ophthalmic venous plexus, using calibrated heparinized capillary tubes, and transfer was carried out. immediately the samples in 5 ml of sterile saline solution (blood dilution 10-2) which was then diluted to IO-3 and 10-4 in saline solution. Agar plate counting (Difco) was performed with 1 ml of each dilution and the phagocytosis K index was determined according to Biozzi et al. (Biozzi G., Stiffel C., Halpern B.N., Le Minor L., Mauton D., "J. Immunol.", 1961,57,296):
log Ci - log C2 log Ci - log C2
25 T2 — Ti 25 T2 - Ti
Cj et C2 correspondent aux comptages aux temps Tt etT2. Cj and C2 correspond to the counts at times Tt and T2.
On a ainsi observé une diminution normale du nombre des 30 bactéries par élimination dans le système réticulo-endothélial en présence de sérum de veau fœtal, tandis que l'addition de 10 [ig de concentré Ig à la solution d'injection a provoqué la disparition de 99,6% des bactéries du flot sanguin en 20 min. There was thus observed a normal decrease in the number of bacteria by elimination in the reticuloendothelial system in the presence of fetal calf serum, while the addition of 10 μg of concentrated Ig to the injection solution caused the disappearance 99.6% of bacteria in the blood stream in 20 min.
35 Les résultats sont résumés dans le tableau ci-dessous : 35 The results are summarized in the table below:
Temps Time
(minutes après l'injection E. coli) (minutes after E. coli injection)
Bactéries en % du nombre initial au temps 0 après injection intraveineuse de 2 x 10® E.coli 0 111 :B4 Bacteria in% of the initial number at time 0 after intravenous injection of 2 x 10® E.coli 0 111: B4
Contrôle 1:10 sérum fœtal de veau Control 1:10 fetal calf serum
Tests, concentré Ig Tests, Ig concentrate
1000 (ig 1000 (ig
100 (ig 100 (ig
10 (ig 10 (ig
0 0
100 100
100 100
100 100
100 100
20 20
27,8 27.8
0,14 0.14
0,22 0.22
0,4 0.4
40 40
15,5 15.5
0,02 0.02
0,02 0.02
0,12 0.12
60 60
10,0 10.0
0,02 0.02
0,02 0.02
0,06 0.06
On a contrôlé la spécificité de l'opsonisation par absorption exhaustive de concentré Ig avec le sérotype 0 111 : B4 d'E. coli et ón a constaté que cette absorption annihile pratiquement toute l'activité d'augmentation de la phagocytose, même avec une quantité de 1 mg de concentré Ig. The specificity of opsonization was checked by exhaustive absorption of Ig concentrate with serotype 0 111: B4 from E. coli et ón has found that this absorption annihilates practically all the activity of increasing phagocytosis, even with an amount of 1 mg of concentrated Ig.
Le tableau ci-après donne les indices de phagocytose K obtenus en 20 min: The table below gives the indices of phagocytosis K obtained in 20 min:
55 Test de protection chez la souris 55 Protection test in mice
On a préparé des dilutions logarithmiques (log10) d'une culture de E. coli 0 111 : B4 en bouillon nutritif (Difco) contenant 109 bactéries/ml pour donner des dilutions à IO-5,10-6 et 10~7 dans la mucine à 5% (mucine granulaire, type 1701-W pour la potentiation 60 de la virulence des bactéries de Wilson Laboratories, Chicago, Illinois). Logarithmic dilutions (log10) of a culture of E. coli 0 111: B4 in nutritive broth (Difco) containing 109 bacteria / ml were prepared to give dilutions at IO-5,10-6 and 10 ~ 7 in the 5% mucin (granular mucin, type 1701-W for potentiation 60 of the virulence of bacteria from Wilson Laboratories, Chicago, Illinois).
On a ensuite mélangé 3 ml de chaque dilution à 0,6 ml de solution à tester, soit respectivement de solution saline, de concentré Ig, de protéines de petit-lait normal (vaches non immunisées). En utilisant 65 5 souris pour chaque dilution, on a injecté 0,6 ml du mélange obtenu à chaque souris par voie intrapéritonéale. Les résultats de l'évaluation du nombre de souris mortes sur 5 souris traitées après 48 h sont indiqués dans le tableau ci-après. 3 ml of each dilution were then mixed with 0.6 ml of test solution, that is to say saline, Ig concentrate, normal whey protein (non-immunized cows), respectively. Using 655 mice for each dilution, 0.6 ml of the resulting mixture was injected into each mouse intraperitoneally. The results of the evaluation of the number of dead mice out of 5 mice treated after 48 h are indicated in the table below.
Contrôle Control
1000 g 1000 g
1000 g 1000 g
1:10 sérum concentré Ig concentré Ig 1:10 concentrated serum Ig concentrated Ig
de veau fœtal non absorbé unabsorbed fetal calf
absorbé absorbed
K K
0,015 0.015
0,128 0.128
0,039 0.039
7 7
627079 627079
Matériau testé Material tested
Nombre de souris mortes / 5 souris traitées Number of dead mice / 5 treated mice
Concentration en bactéries du traitement Concentration of bacteria in the treatment
5 x 104 5 x 104
5 x 103 5 x 103
5 x 102 5 x 102
5 x 101 5 x 101
Solution saline Saline solution
5 5
5 5
5 5
5 5
10 fi concentré Ig * 10 fi concentrated Ig *
5 5
5 5
5 5
3 3
25 fi concentré Ig * 25 fi concentrated Ig *
5 5
4 4
0 0
0 0
100 [x concentré Ig * 100 [x Ig concentrate *
0 0
0 0
0 0
0 0
10 (a protéines de petit-lait normal 10 (a normal whey protein
5 5
5 5
5 5
5 5
(vaches non immunisées) (non-immune cows)
25 (j. protéines de petit-lait normal 25 (j. Normal whey protein
5 5
5 5
5 5
5 5
100 (a protéines de petit-lait normal 100 (a normal whey protein
5 5
5 5
5 5
5 5
* Calculé en protéines totales contenant 35-45% d'Ig lactiques. * Calculated as total protein containing 35-45% lactic Ig.
On a constaté que 100 |xg de concentré Ig conféraient une La présence d'Ig actives dans les extraits de selles a été confirmée protection totale pour toutes les concentrations en bactéries testées, 20 par double immuriodiffusion (test d'Ouchterlony) et par îmmuno- The presence of active Ig in the stool extracts was confirmed to be 100 µg of concentrated Ig for total protection for all concentrations of bacteria tested, by double immuriodiffusion (Ouchterlony test) and by immunoassay.
tandis que 100 f*g de protéines de petit-lait isolées à partir du lait de électrophorèse. Les antisérums utilisés dans ces tests ont été préparés vaches non immunisées ne donnaient aucune protection. par injections sous-cutanées et intraveineuses répétées de 1 mg d'anticorps lactiques ou 0,1 mg d'Ig G^ Pour le test d'Ouchterlony, . while 100 f * g of whey protein isolated from electrophoresis milk. The antisera used in these tests were prepared unimmunized cows gave no protection. by repeated subcutaneous and intravenous injections of 1 mg of lactic antibodies or 0.1 mg of IgG ^ For the Ouchterlony test,.
Exemple 6: des plaques de verre (94 x 84 mm) ont été recouvertes d'une couche Example 6: glass plates (94 x 84 mm) were covered with a layer
I. Une première série d'essais cliniques montrent que les Ig 25 de 1 % de gel d'agar dans une solution saline tamponnée au lactiques résistent à la dégradation protéolytique en fragments phosphate à pH 7,2, dans laquelle on a creusé des cavités de 4 mm inactifs dans le tractus intestinal. distantes de 9,5 mm à l'emporte-pièce (LKB-Producteur AB), en I. A first series of clinical trials show that the Ig 25 of 1% agar gel in a lactic buffered saline solution resist proteolytic degradation into phosphate fragments at pH 7.2, in which cavities have been dug 4 mm inactive in the intestinal tract. 9.5 mm apart with the punch (LKB-Producer AB),
„ „ . utilisant un antisérum antiprotéines de petit-lait colostral bovin et un „„. using a bovine colostral whey anti-protein antiserum and a
Onze enfants (neuf garçons deux filles) hospitalises pour diverses antisérum monovalent spécifique anti-IgG, de lait de vache. Eleven children (nine boys two girls) hospitalized for various monovalent anti-IgG antiserum, from cow's milk.
raisons, mais ne souffrant pas de gastro-ententes et dont 1 âge allait 30 pour nmmun0électrOphorèse> des plaques de verre (100 x de 2 semaines a l an, ont ete nourris avec un lait contenant un 85 ^ ont été rec0uvertes de 12 ml de gel d'agar à 1 % dans le concentre Ig prepare selon les exemples 2 ou 3 en dose 1Socalorique barbiturate 0,o5 M tamponné à pH 8,3 (10,3 g barbiturate de sodium correspondant a 2 g/kg de poids corporel distnbuee également sur ^ ^ g ^ oxalique l j d-eau) et la reasons, but not suffering from gastro-intestinal and whose age was 30 for nmmun0électrOphorèse> glass plates (100 x 2 weeks a year, were fed with a milk containing an 85 ^ were recovered with 12 ml of gel 1% agar in the Ig concentrate prepared according to Examples 2 or 3 in dose 1 Caloric barbiturate 0, o5 M buffered at pH 8.3 (10.3 g sodium barbiturate corresponding to 2 g / kg of body weight also distributed on ^ ^ g ^ oxalic lj of water) and the
24 h. Les premier et dernier repas avec incorporation de concentre Ig sé aration électrophorèse conduite à température ambiante ont ete marques par 0,2 g de rouge carmin. On a recueilli au moins 35 dant 90 min à 4 v/cm Après diffusion des antisérums (24 h), les une selle avant 1 administration de concentre Ig et systématiquement ^ lavées ayec ,a solution ^ séchées et réyélées ayec toutes les selles suivantes pendant 72 h. les selles étant conservees a f, • r» 24h. The first and last meals with incorporation of Ig electrophoresis separation conducted at room temperature were marked with 0.2 g of carmine red. At least 35 were collected in 90 min at 4 v / cm. After diffusion of the antisera (24 h), one stool before 1 administration of concentrated Ig and systematically ^ washed with, solution ^ dried and reyelated with all the following stools during 72 h. the stools being stored at f, • r "
F lazocarmineB. F lazocarmineB.
—20 C * —20 C *
On a constaté la présence d'Ig lactiques dans les selles malgré des Lactic Ig has been found in the stool despite
On a préparé des extraits de selles par addition de deux parties de variations considérables du moment de leur apparition et de la durée selle pour une partie de solution saline tamponnée au phosphate à 40 de la sécrétion Ig ainsi qu'une bonne correspondance entre l'appari-pH 7,2 et dispersé les selles à 0°C avec une tige de verre. On a ensuite tion et la disparition du marqueur rouge carmin et des Ig. Stool extracts were prepared by adding two parts of considerable variations in the time of their appearance and in the duration of the saddle for a part of phosphate buffered saline at 40 of the secretion Ig as well as a good match between the pair. -pH 7.2 and dispersed the stool at 0 ° C with a glass rod. Then we have the disappearance of the carmine red marker and the Ig
agité la suspension pendant 20 min avec mini-agitateur (400 tr/min) à Pour confirmer l'activité de ces Ig lactiques, on a effectué le test in température ambiante. La suspension a alors été refroidie rapide- vivo de séroprotection chez la souris (comme décrit à l'exemple 5), en ment à 0°C et centrifugée à cette température à 3500 x g pendant utilisant 6 extraits de selles dans chaque série et dont les résultats sont 15 min. On a ensuite soigneusement prélevé les surnageants. 45 résumés dans le tableau suivant: stirred the suspension for 20 min with mini-agitator (400 rpm) at To confirm the activity of these lactic Ig, the test was carried out at room temperature. The suspension was then rapidly cooled-vivo for seroprotection in mice (as described in Example 5), by lying at 0 ° C. and centrifuged at this temperature at 3500 xg for 6 using stool extracts in each series and the results are 15 min. The supernatants were then carefully removed. 45 summaries in the following table:
Extraits de selles Stool extracts
Intensité des Ig dans l'extrait de selles après examen immunoélectrophorétique Intensity of Ig in stool extract after immunoelectrophoretic examination
Nombre de souris mortes / 5 souris traitées Number of dead mice / 5 treated mice
Nombre de bactéries utilisées dans le traitement Number of bacteria used in treatment
5 x 104 5 x 104
5 x 103 5 x 103
5 x 102 5 x 102
5 x 101 5 x 101
Enfant M.D. Child M.D.
I I
5 5
5 5
5 5
5 5
(2 semaines) (2 weeks)
II II
5 5
5 5
5 5
5 5
IV IV
+ + + + + + + +
2 2
1 1
0 0
0 0
V V
+ + + + + + + +
0 0
0 0
0 0
0 0
VI VI
+ + + + + +
1 1
1 1
0 0
0 0
IX IX
5 5
5 5
3 3
4 4
Enfant S.G. Child S.G.
I I
5 5
5 5
5 5
5 5
(1 mois) (1 month)
III III
4 4
5 5
5 5
5 5
IV IV
+ + + + + + + +
0 0
0 0
0 0
0 0
VI VI
+ + + + + + + +
0 0
0 0
0 0
0 0
X X
+ + + +
3 3
0 0
1 1
0 0
XI XI
+ +
5 5
2 2
0 0
0 0
627079 627079
8 8
On constate clairement une corrélation entre les résultats positifs tures sont restées positives. Dans les cas où les coprocultures sont en immunoélectrophorèse et la capacité protectrice de la matière devenues négatives, la consistance des selles s'est améliorée plus contenue dans les extraits de selles. En particulier, on estime que les rapidement lorsque le concentré Ig a été administré dans une formule concentrations en Ig lactiques des extraits V (enfant M.D.) et IV et lactée pauvre en lactose. Clearly there is a correlation between the positive results and the positive ones. In cases where the co-cultures are in immunoelectrophoresis and the protective capacity of the material has become negative, the consistency of the stools has improved more contained in the stool extracts. In particular, it is estimated that these rapidly when the Ig concentrate has been administered in a formula containing lactic Ig concentrations of the extracts V (child M.D.) and IV and lactose poor in lactose.
VI (enfant S.G.) correspondaient au moins à 1 mg de concentré Ig. s VI (child S.G.) corresponded to at least 1 mg of Ig concentrate. s
II. Dans une seconde série d'essais cliniques on a étudié les Propriétés prophylactiques propriétés thérapeutiques et prophylactiques du concentré Ig. Les prématurés représentant un groupe extrêmement sensible aux gastro-entérites par E. coli, c'est ce groupe qui a été choisi pour les II. In a second series of clinical trials the prophylactic and therapeutic properties of concentrated Ig were studied. Premature babies representing a group extremely sensitive to gastroenteritis by E. coli, it is this group which was chosen for the
Propriétés thérapeutiques essais cliniques de prophylaxie. Therapeutic properties clinical prophylaxis trials.
On a effectué cette étude avec des enfants allant jusqu'à 5 mois io Cette étude a été effectuée pendant 6 mois dans 2 salles avec souffrant de gastro-entérites, de bénignes à aiguës, provoquées par E. 8 incubateurs dans chaque salle. On a procédé à la répartition des coli. Dans différentes séries de tests, on a administré à un total de 152 tests et des contrôles dans chaque salle pour que tous les patients patients soit 2 g de concentré Ig/kg/j pendant 5 j, soit 1 g/kg/j soient exposés aux mêmes conditions, 4 incubateurs servant au test et pendant 10 j dans leur nourriture. Les patients n'ont reçu aucun 4 au contrôle. Chaque cas est resté en moyenne 41 j, un enfant étant médicament tel que sulfamides ou antibiotiques, ni oralement ni 15 éloigné après guérison et remplacé par un autre, quelle que soit son parentéralement. On a fait des coprocultures chaque lendemain appartenance (test ou contrôle). 70 cas ont été suivis, 36 comme d'une administration, la dernière entre 36 et 48 h après la dernière contrôle et 34 pour le groupe test. This study was carried out with children up to 5 months old. This study was carried out for 6 months in 2 rooms with patients suffering from gastroenteritis, from mild to acute, caused by E. 8 incubators in each room. We distributed the coli. In different series of tests, a total of 152 tests and controls were administered in each room so that all patient patients were exposed to 2 g of Ig / kg / day concentrate for 5 days, or 1 g / kg / day to be exposed under the same conditions, 4 incubators used for the test and for 10 days in their food. The patients received no 4 at the control. Each case remained on average 41 days, one child being a drug such as sulfonamides or antibiotics, neither orally or distant after recovery and replaced by another, regardless of parenterally. We did co-cultures each day belonging (test or control). 70 cases were followed, 36 as for an administration, the last between 36 and 48 hours after the last control and 34 for the test group.
administration de concentré Ig. 43 patients ont été traités de la même Le groupe test à reçu le concentré Ig à chaque tétée réparti sur manière, mais en remplaçant le concentré Ig par des protéines de 24 h à raison de 0,25 g/kg/j. On a procédé à une coproculture dès le petit-lait provenant de vaches non immunisées. 20 commencement de l'essai et examiné les coprocultures tous les 5 j. administration of Ig concentrate. 43 patients were treated in the same way. The test group received the Ig concentrate at each feeding distributed in the same way, but replacing the Ig concentrate with proteins of 24 h at the rate of 0.25 g / kg / day. A co-culture was carried out from whey from non-immunized cows. 20 start of the trial and examine the co-cultures every 5 days.
On a obtenu des coprocultures négatives pour 90 enfants (57,7%) Sur un total de 666 coprocultures, 339 appartenaient au contrôle et au cours du traitement. Dans la série contrôle, seulement 14 enfants 327 au test. Parmi ces dernières, 33 ont montré la présence à'E. coli Negative co-cultures were obtained for 90 children (57.7%) Out of a total of 666 co-cultures, 339 were in control and during treatment. In the control series, only 14 children 327 tested. Among these, 33 showed the presence of E. coli
(27,7%) ont montré une disparition spontanée de E. coli dans les (10,1 %), tandis que 96 des 339 copro cultures de contrôle ont été (27.7%) showed spontaneous disappearance of E. coli in (10.1%), while 96 of 339 control co-cultures were
coprocultures. Il faut tenir compte du fait que les protéines natives de positives (28,3%). Si on examine seulement le sérotype E. coli petit-lait provenant de vaches non immunisées contiennent une faible 25 0 119 : B 14 qu'on trouve souvent associé à des formes aiguës de quantité d'Ig anti-Ê. coli. On a également constaté que l'absence de gastro-entérite, la fréquence des coprocultures positives a été 5,5% co-cultures. It should be taken into account that the native positive proteins (28.3%). If one examines only the serotype E. coli whey from unimmunized cows contain a low 25 0 119: B 14 which is often found associated with acute forms of amount of anti-EIg. coli. It was also found that the absence of gastroenteritis, the frequency of positive co-cultures was 5.5%
réussite du traitement a été observée plus fréquemment dans les cas dans le groupe test contre 23,3 % dans le groupe contrôle. treatment success was observed more frequently in cases in the test group compared to 23.3% in the control group.
ayant reçu la plus haute dose pendant un temps plus court. On peut conclure que l'incorporation de concentré protéique who received the highest dose for a shorter time. It can be concluded that the incorporation of protein concentrate
La consistance des selles a été examinée dans chaque cas. On a contenant des Ig lactiques spécifiques anti-£. coli au lait pour constaté une disparition de la diarrhée et une amélioration clinique 30 prématurés diminue nettement le degré d'infection par E. coli de ce sensible dans un grand nombre de cas et même lorsque les coprocul- groupe particulièrement sensible de nouveau-nés. The consistency of the stool was examined in each case. We have specific anti-L lactic Ig. coli in milk for evidence of disappearance of premature diarrhea and clinical improvement markedly decreases the degree of E. coli infection of this susceptible in a large number of cases and even when the coprocul- particularly sensitive group of newborns.
R 1 feuille dessins R 1 sheet drawings
Claims (12)
Priority Applications (20)
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