BR112021003757A2 - receptores de antígenos quiméricos contra múltiplas isoformas de hla-g - Google Patents

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Abstract

RECEPTORES DE ANTÍGENOSQUIMÉRICOSCONTRA MÚLTIPLAS ISOFORMAS DE HLA-G. A presente invenção refere-se a receptores de antígenos quiméricos (CAR) contra múltiplas, mas não todas as isoformas de antígenos leucocitários humanos (HLA-G). Mais especificamente, a presente invenção diz respeito a CARs que são específicos para isoformas imunossupressoras de HLA-G livres de ß2M ou associadas a ß2M, respectivamente.

Description

RECEPTORES DE ANTÍGENOS QUIMÉRICOS CONTRA MÚLTIPLAS ISOFORMAS DE HLA-G CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção refere-se ao campo da imunologia, biologia celular e biologia molecular. Em certos aspectos, o campo da invenção diz respeito à imunoterapia. Mais particularmente, a invenção refere-se a receptores de antígenos quiméricos (CAR) contra múltiplas isoformas de antígenos leucocitários humanos (HLA-G).
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[002] Durante anos, as bases do tratamento do câncer foram cirurgia, quimioterapia e radioterapia. No entanto, nos últimos anos, a imunoterapia surgiu como uma ferramenta eficaz no tratamento do câncer.
[003] Os avanços na engenharia genética levaram ao projeto de receptores de direcionamento de tumor sintéticos, denominados receptores de antígenos quiméricos (CARs), que podem ser introduzidos em células imune humanas, tais como células T, para redirecionar a especificidade do antígeno e aumentar as funções das células imunes efetoras. Os CARs foram desenvolvidos primeiramente em meados da década de 1980 e o interesse por esses receptores está crescendo desde então. Eles foram gerados primeiramente para contornar a especificidade intrínseca de TCR de expressão de células T, ao fornecer reconhecimento de antígeno específico independentemente dos complexos HLA-peptídeos- peptídeos. Os CARs prototípicos de cadeia única foram primeiramente descritos em um estudo de Eshhar e colegas em 1993, no qual a ativação específica e o direcionamento de células T foram mediados por moléculas que consistem em um domínio de anticorpo específico do antígeno alvo e as subunidades de sinalização γ ou ζ do receptor Fc epsilon ou complexo CD3 de receptor de células T, respectivamente (Eshhar et al., 1993, Proc Natl
Acad Sci USA., 90, 720-4). Desde então, muitos grupos desenvolveram moléculas CAR com especificidades direcionadas a tumor único e endodomínios de sinalização aprimorados. Hoje em dia, o domínio de ligação de um CAR consiste tipicamente em um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia única (scFv) ou fragmento de ligação ao anticorpo (Fab) selecionado a partir de uma biblioteca e compreendendo os fragmentos variáveis de cadeia leve e pesada de um anticorpo monoclonal (Mabs) unido por um ligante flexível. O scFv retém a mesma especificidade e uma afinidade semelhante ao anticorpo completo a partir do qual foi derivado e é capaz de se ligar especificamente ao alvo de interesse. Os CARs, portanto, combinam especificidade de antígeno e propriedades de ativação de células T em uma única molécula de fusão. De fato, o scFv está ligado a um módulo de sinalização intracelular que inclui CD3ζ para induzir a ativação de células T após a ligação ao antígeno. A estrutura modular foi estendida a partir de CARs de primeira geração com apenas um domínio de sinalização CD3ζ para CARs de segunda e terceira geração que ligam os endodomínios de sinalização, tais como CD28, 4-1BB ou OX40 a CD3ζ, em uma tentativa de imitar a coestimulação. Geralmente, um espaçador ou domínio de dobradiça serve como um ligante entre os endodomínios e o scFV. A incorporação de tal domínio de dobradiça melhora a flexibilidade, organização espacial e/ou proximidade, mas também a expansão das células CAR (Qin et al, Journal of Hematology & Oncology. 2017; 10:68) ou localização de tumor (Watanabe et al, Oncoimmunology. 2016; 5(12): e1253656). Portanto, é fundamental desenvolver o CAR compreendendo um domínio de dobradiça otimizado.
[004] Os CARs permitiram que as células T tenham como alvo os cânceres em um mecanismo independente do MHC. A ligação do ligante de um CAR difere da ligação de um TCR ao peptídeo/MHC (pMHC) na afinidade do receptor,
densidade do antígeno e propriedades espaciais; e abordagens experimentais para projetar um CAR ideal para uma molécula alvo específica se basearam em ensaios funcionais de células T transduzidas in vitro ou em modelos de xenoenxerto de tumor humano. Por ser improvável que os CARs se engajem em série em moléculas alvo e se agrupem em sinapses organizadas como é observado com o reconhecimento de TCR/pMHC, presume-se que uma densidade de ligante maior seja necessária para o reconhecimento de CAR do que para TCRs. A configuração e a aplicação ideais desses receptores, além de afinidade e especificidade, dependem do projeto do constructo, domínios de sinalização, sistemas de entrega de vetores, populações de células imunes receptoras e fabricação.
[005] Embora muitas tentativas de alcançar o sucesso de células CAR-T para tumores sólidos tenham sido realizadas, os resultados às vezes têm sido decepcionantes. Os três principais obstáculos encontrados para a aplicação de terapias com células CAR T em tumores sólidos são (1) a identificação de Antígenos Associados a Tumores (TAA) adequados, (2) o tráfego limitado de células transferidas de forma adotiva para sítios de tumor (3) o efeito imunossupressor do microambiente tumoral e (4) o potencial problema de segurança de células indesejadas ou não transformadas.
[006] Quanto à escolha do alvo, o antígeno G leucocitário humano (HLA-G) é retratado como uma molécula capaz de conferir proteção ao feto do sistema imunológico de reconhecimento e destruição de sua mãe, proporcionando tolerância fetal-materna. Além de suas funções fisiológicas, HLA-G foi recentemente identificado como uma molécula de ponto de checagem imune (ICP), que inibe as funções efetoras de subconjuntos de células imunes infiltrantes através da interação com seus receptores específicos. O HLA-G é expresso em numerosas efusões tumorais de diversas origens com uma expressão tecidual altamente restrita. Em diversas transformações malignas, a expressão de HLA-G pelas células tumorais aumenta dramaticamente, tornando- as fortemente imunossupressoras. Modelos pré-clínicos mostraram que a expressão de HLA-G em células cancerosas as torna mais metastáticas e diminui significativamente a sobrevida do paciente (Lin A et al. Int J Cancer. 1 de julho de 2012; 131 (1): 150-7. dois: 10.1002/ijc.26375; Lin A et al. Hum Immunol. Abril de 2013; 74 (4): 439-46. dois: 10.1016/j.humimm.2012.11.021).
[007] HLA-G é uma molécula de HLA não clássica de classe I que foi identificada pela primeira vez em células de coriocarcinoma. Ao contrário das moléculas de HLA clássicas de classe I, o HLA-G é caracterizado por um polimorfismo limitado e difere também por sua expressão, estrutura e funções. O transcrito primário de HLAG é alternativamente submetido ao splicing resultando na expressão de sete isoformas, em que quatro são ligadas à membrana (HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3 e HLA-G4) enquanto as outras três são solúveis (HLA-G5, HLA-G6 e HLA-G7). HLA-G1 e HLA-G5 são as isoformas mais estudadas e apresentam a estrutura típica de uma molécula de HLA de classe I clássica: uma cadeia pesada constituída por três domínios globulares ligados de forma não covalente a β2-microglobulina (β2M) e um peptídeo, enquanto as outras isoformas são mais curtas, faltando um ou dois domínios da cadeia pesada e não devem se ligar a β2M.
[008] Considerando que os critérios básicos para desenvolver imunoterapias de CAR são a identificação do TAA adequado, a acessibilidade das células efetoras transgênicas e a reversibilidade do microambiente tumoral imunossupressor, e também levando em consideração a neoexpressão de HLA- G pelas células tumorais e sua contribuição para o efeito imunossupressor do microambiente tumoral e seu papel como um ICP e nos mecanismos imunológicos de escape, HLA-G é um candidato excepcional para o desenvolvimento de novas imunoterapias capazes de bloquear essa molécula. Além disso, dado que nenhuma função estimulatória ou resposta celular direcionada contra o HLA-G alogênico foi relatada, e que a expressão de HLA-G é restrita ao tecido, a geração de células CAR citolíticas direcionadas contra o HLA-G abriria novas possibilidades no campo de imunoterapia do câncer.
[009] WO2016/160622 revela anticorpos direcionados contra o HLA-G e seus usos em células CAR. No entanto, como o mRNA de HLA-G é submetido ao splicing em diferentes isoformas de proteínas, há uma necessidade de desenvolver CARs capazes de reconhecer especificamente as diferentes isoformas de HLA-G (isoformas de HLA associadas a β2M e isoformas livres de β2M menores) e/ou as mais abundantes isoformas, para eliminar a maioria das células que expressam as isoformas imunossupressoras, mas também constructos CAR que compreendem um domínio espaçador otimizado e um marcador selecionável para melhorar a expansão e seleção de células CAR.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[010] Visando o maior número de isoformas de HLA-G, os inventores desenvolveram diversos receptores de antígenos quiméricos dirigidos contra o HLA-G usando derivados de scFv de novos anticorpos monoclonais específicos anti-HLA-G (Mabs). Esses Mabs apresentam alta afinidade para o HLA-G e são direcionados a diferentes epítopos da molécula, considerando a heterogenicidade de expressão desta molécula [Alegre et al, Eur. J. Immunol.
2013. 43: 1933–1939; Alegre E et al, 2014, Journal of Immunology Research, 2014: 657625]. Os inventores também otimizaram o domínio espaçador entre o domínio de ligação ao antígeno e o endodomínio para melhorar a eficácia das células CAR anti-HLA-G. Os inventores finalmente projetaram um constructo CAR compreendendo um ligante clivável e um repórter que permite a seleção de células CAR transduzidas.
[011] A presente invenção fornece um receptor de antígeno quimérico (CAR) que compreende um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo anti- HLA-G, um domínio transmembrana e um domínio intracelular, em que o referido CAR se liga especificamente a uma a seis isoforma(s) de HLA-G, preferencialmente duas a cinco isoformas de HLA-G, preferencialmente tal CAR permite a discriminação das isoformas de HLA-G, ou seja, o CAR não reconhece ou se liga a todas as sete isoformas de HLA-G.
[012] Em um aspecto, o CAR se liga especificamente ao HLA-G livre de β2M ou às isoformas de HLA-G associadas a β2M. Alternativamente, o CAR se liga especificamente à isoforma de HLA-G selecionada a partir do grupo que consiste em HLA-G1, HLA-G2, HLA-G5 e HLA-G6. Em outro aspecto, o CAR se liga especificamente à ambos HLA-G1 e HLA-G5, ou a ambos HLA-G2 e HLA-G6 e/ou à ambas isoformas de HLA-G1/livre de β2M e HLA-G5/livre deβ2M.
[013] A presente invenção fornece, particularmente, um receptor de antígeno quimérico anti HLA-G (CAR) compreendendo sequencialmente do N- ao C-terminal: (a) uma sequência de peptídeo sinal, b) um anticorpo anti-HLA-G ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, c) opcionalmente, um domínio espaçador, d) um domínio transmembrana, e) um domínio intracelular, e opcionalmente f) um ligante clivável e opcionalmente g) um domínio CD19 humano truncado.
[014] Em um aspecto, o domínio espaçador compreende ou consiste em (i) um domínio de dobradiça de IgG4 humana, (ii) um domínio de dobradiça de IgG4 humana e um domínio CH3 de IgG4 humana ou (iii) um domínio CH2 mutado de lgG4 humana, um domínio de dobradiça de IgG4 humana e um domínio CH3 de IgG4 humana. Preferencialmente, o domínio espaçador compreende ou consiste na sequência apresentada em (i) SEQ ID NO: 25, (ii) SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 27, ou (iii) SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27, ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais de 95% de identidade com ela.
[015] Em outro aspecto, o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em um peptídeo sinal de CD8a, um peptídeo sinal de Ig Kappa de camundongo, um peptídeo sinal de IgG4 humana, um peptídeo sinal de IL2, um peptídeo sinal de IgG2 humana e um peptídeo sinal de Gaussia luc.
[016] Em um aspecto particular, o domínio transmembrana é selecionado a partir de domínios transmembrana CD28, CD3 e CD8, preferencialmente, o domínio transmembrana é um domínio transmembrana CD28.
[017] Preferencialmente, o anti HLA-G CAR da presente invenção compreende um domínio intracelular que compreende um domínio de sinalização zeta de CD3 e pelo menos um domínio coestimulatório selecionado a partir de domínios coestimulatórios CD28, 41BB, CD28, CD134, ICOS, OX40, CD149, DAP10, CD30, IL2-R, IL7r6, IL21-R, NKp30, NKp44, CD27, CD137 e DNAM- 1, preferencialmente os dois domínios coestimulatórios são domínios coestimulatórios 41BB e CD28.
[018] Em um aspecto, o ligante clivável é selecionado a partir do grupo que consiste em P2A, T2A, E2A, B2A e F2A.
[019] Em outro aspecto, o domínio CD19 humano truncado consiste na sequência apresentada na SEQ ID NO: 29.
[020] Particularmente, o CAR, o anticorpo anti-HLA-G ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, preferencialmente um scFV, se liga seletivamente ao HLA-G livre de β2M ou às isoformas de HLA-G associadas a β2M, mas não se liga a todas as isoformas de HLA-G.
[021] Em outro aspecto, o CAR, o anticorpo anti-HLA-G ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, preferencialmente um scFV, ou a célula que expressa o CAR não se liga ao domínio alfa1 de HLA-G.
[022] Preferencialmente, o anticorpo anti-HLA-G ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um scFv anti-HLA-G que compreende: (a) (i) a região variável de cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 1 ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais que 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1; e (ii) a região variável de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 2 ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais que 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2; ou (b) (i) a região variável de cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 3 ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais que 95% de identidade com a SEQ ID NO: 3; e (ii) a região variável de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 4 ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais que 95% de identidade com a SEQ ID NO: 4.
[023] Preferencialmente, o domínio de ligação ao antígeno do CAR é um scFv que se liga especificamente ao HLA-G associado a β2M; preferencialmente a ambos HLA-G1 e HLA-G5, e o scFv compreende: (a) (i) a região variável da cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 1 ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais que 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1; e (ii) a região variável de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 2 ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais que 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2; ou (b) (i) a CDR (Região Determinante de Complementaridade) 1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 1; e a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 2.
[024] Alternativamente, o domínio de ligação ao antígeno do CAR é um scFv que se liga especificamente ao HLA-G livre de β2M, preferencialmente ao HLA- G2 e HLA-G6 e/ou a ambos HLA-G1/livre de β2M e às isoformas HLA-G5/livres de β2M e o scFv compreende: (a) (i) a região variável de cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 3 ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais que 95% de identidade com a SEQ ID NO: 3; e (ii) a região variável de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 4 ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais que 95% de identidade com a SEQ ID NO: 4; ou (b) (i) a CDR (Região Determinante de Complementaridade) 1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 3; e a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 4.
[025] Preferencialmente, o domínio intracelular do CAR compreende um domínio de sinalização zeta de CD3 e, opcionalmente, pelo menos um domínio coestimulatório selecionado a partir de CD28, 41BB, CD28, CD134, ICOS, OX40, CD149, DAP10, CD30, IL2-R, IL7r6, domínios coestimulatórios IL21-R, NKp30, NKp44, CD27, CD137 e DNAM-1, preferencialmente os dois domínios coestimulatórios são domínios coestimulatórios 41BB e CD28.
[026] Preferencialmente, o domínio transmembrana do CAR é selecionado a partir de domínios transmembrana CD28, CD3 e CD8, preferencialmente o domínio transmembrana é um domínio transmembrana CD28.
[027] Preferencialmente, o CAR compreende, adicionalmente, uma região de dobradiça conectando o domínio de ligação ao antígeno ao domínio transmembrana, preferencialmente selecionado no grupo que consiste em (i)
dobradiça de CD28, (ii) dobradiça de CD8 alfa, (iii) um domínio de dobradiça de IgG4 humana, (iv ) um domínio de dobradiça de lgG4 humana e um domínio CH3 de lgG4 humana e (v) um domínio CH2 mutado de lgG4 humana, um domínio de dobradiça de IgG4 humana e um domínio de dobradiça CH3 de lgG4 humana.
[028] A presente invenção também se refere a um constructo de CAR multiespecífico que compreende pelo menos dois domínios de ligação ao antígeno diferentes, um domínio transmembrana e um domínio intracelular, em que pelo menos um dos domínios de ligação ao antígeno se liga especificamente às isoformas de HLA-G associadas a um domínio β2M de HLA- G; e pelo menos outro dos domínios de ligação ao antígeno liga-se especificamente às isoformas de HLA-G que não estão associadas a um domínio β2M de HLA-G.
[029] Preferencialmente, o constructo de CAR multiespecífico é um constructo de CAR biespecífico que compreende (i) um domínio compreendendo CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 11, 12 e 13, respectivamente, (ii) um domínio compreendendo CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 14, 15 e 16, respectivamente, (iii) um domínio compreendendo CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 5, 6 e 7, respectivamente, e (iv) um domínio compreendendo CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 8, 9 e 10, respectivamente, opcionalmente em que cada CDR pode opcionalmente compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições, deleções ou inserções de aminoácidos.
[030] A presente invenção também prevê uma molécula de ácido nucleico que codifica o CAR da presente invenção, para um vetor de expressão, compreendendo a molécula de ácido nucleico e para uma célula que compreende o CAR da presente invenção ou a molécula de ácido nucleico da presente invenção, ou o vetor de expressão da presente invenção,
preferencialmente em que a célula é selecionada a partir de um grupo que consiste em uma célula T, Célula T CD4+, Célula T CD8+, célula B, célula NK, célula NKT, monócito e célula dendrítica, preferencialmente a célula sendo uma célula T, uma célula B ou uma célula NK.
[031] A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica compreendendo uma molécula de ácido nucleico, um vetor de expressão ou uma célula de acordo com a presente invenção e, opcionalmente, um carreador farmaceuticamente aceitável. Preferencialmente, a célula da presente invenção ou a composição farmacêutica da presente invenção é para uso no tratamento de câncer ou para uso no tratamento de uma infecção viral. A célula ou composição farmacêutica para tais usos podem ser administradas em combinação com uma terapia CAR que não é direcionada ao HLA-G.
[032] Em um aspecto, a composição farmacêutica compreende (i) uma célula compreendendo um CAR que se liga especificamente ao HLA-G associado a β2M; preferencialmente a ambos HLA-G1 e HLA-G5, e uma célula compreendendo um CAR que se liga especificamente ao HLA-G livre de β2M, preferencialmente à ambos HLA-G2 e HLA-G6 e/ou a ambos HLA-G1/livre de β2M e i às isorfomas de HLA-G5/livre de β2M; ou (ii) uma célula compreendendo um CAR que se liga especificamente a ambos HLA-G1 e HLA-G5 ou às isoformas de HLA-G livres de β2M e um CAR que se liga especificamente a ambos HLA-G2 e HLA-G6 ou às isoformas de HLA-G associadas a β2M.
[033] A presente invenção finalmente diz respeito a um anticorpo anti-HLA- G que se liga especificamente às isoformas de HLA-G associadas a β2M, preferencialmente a ambos HLA-G1 e HLA-G5. Tal anticorpo compreende: (a) (i) a região variável da cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 1 ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais que 95% de identidade com a SEQ ID
NO: 1; e (ii) a região variável de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 2 ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais que 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2; ou (b) (i) o CDR (Região Determinante de Complementaridade) 1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada compreende a SEQ ID NO: 1; e a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável de cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 2.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[034] Figura 1: (A) Receptores HLA-G (B) Splicing alternativo do transcrito primário de HLA-G gera sete isoformas de HLA-G, 4 ligações de membrana e 3 isoformas solúveis (C) Funções imunossupressoras de HLA-G.
[035] Figura 2: Especificidade do anticorpo monoclonal analisada por citometria de fluxo. (A) O anticorpo monoclonal 15E7 é específico para as isoformas de HLA-G livres de β2M. (B) Linhagens celulares que expressam HLA- G1 de superfície celular marcadas pelo anticorpo 15E7. (C) Linhagens celulares que expressam HLA-G1 de superfície celular marcadas pelo anticorpo LFTT-1.
[036] Figura 3: (A) 15E7 3a estrutura de geração de CAR. (B) LFTT-1 3a estrutura de geração de CAR.
[037] Figura 4: Representações esquemáticas de (A) as 3 cadeias de HLA-G CAR dependendo de sua dobradiça e (B) as proteínas HLA-G CAR resultantes.
[038] Figura 5: (A) As expressões anti-HLA-G CAR 15E7 e LFTT-1 em Jurkat e as linhagens celulares NKT 1.2 murinas foram analisadas por citometria de fluxo. (B) A expressão da superfície celular de HLA-G CAR 15E7 e LFTT-1 foi determinada por imunofluorescência.
[039] Figura 6: (A) Princípio dos ensaios de ativação. (B) Ligação de HLA-G1 por anticorpos 15E7 (painel esquerdo) e LFTT-1 (painel direito). (C) Figura representativa da ativação das células HLA-G CAR efetoras. (D) As células efetoras CAR HLA-G foram fortemente ativadas na presença de células alvo que expressam HLA-G.
[040] Figura 7: Especificidade do CAR analisada por citometria de fluxo. (A) 15E7 CAR HLA-G Jurkat foram fortemente ativados na presença de células expressando HLA-G/β2Mneg. (B) NKT 1.2 HLA-G CAR LFTT-1 foram fortemente ativados na presença da linhagem celular Jeg-3.
[041] Figura 8: A função citolítica de células HLA-G CAR T foi investigada em células tumorais K562, K562-HLA-G1 e JEG-3 por meio de (A) lise de células tumorais e (B) expressão de CD107a em células CARs efetoras.
[042] Figura 9: A secreção de IFN- de células HLA-G CARs foi investigada após coincubação com células tumorais K562, K562-HLA-G1 e JEG-3.
[043] Figura 10: Funções anti-tumorais in vivo de células HLA-G CAR T (A) Esquema de experimento in vivo em camundongos com células HLA-G CAR T (B) Citotoxicidade das células CAR T contra células tumorais HLA-G in vivo em camundongos NGS.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA PRESENTE INVENÇÃO Introdução
[044] A presente invenção se refere a um receptor de antígeno quimérico (CAR) compreendendo um domínio extracelular, principalmente constituído pelo domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo específico anti-HLA-G, opcionalmente um domínio de dobradiça compreendendo ou consistindo em (i) um domínio de dobradiça de IgG4 humana, (ii) um domínio de dobradiça de IgG4 humana e um domínio de lgG4 humano de CH3 ou (iii) um domínio CH2 mutado de lgG4 humana, um domínio de dobradiça de IgG4 humana e um domínio de dobradiça CH3 de IgG4 humana, um domínio transmembrana, um domínio intracelular que compreende uma, duas ou três estruturas coestimulatórias, dependendo da geração do projeto do CAR, opcionalmente um ligante clivável e, opcionalmente, um repórter.
[045] Particularmente, o CAR, de acordo com a presente invenção se liga especificamente a uma a seis, preferencialmente duas a cinco isoforma(s) de HLA-G, mais preferencialmente selecionadas a partir de HLA-G1, HLA-G2, HLA- G5 e HLA-G6.
[046] A presente invenção também se refere a um CAR que se liga especificamente a ambos HLA-G1 e HLA-G5 ou à ambas isoformas de HLA-G2 e HLA-G6.
[047] É fornecido, adicionalmente, um constructo de CAR multiespecífico, preferencialmente um constructo de CAR biespecífico que compreende um domínio que reconhece as isoformas de HLA-G que são livres de β2M, preferencialmente ambos HLA-G2 e HLA-G6 e/ou ambas isoformas de HLA-G1 /livre de β2M e HLA-G5/livre de β2M; e um domínio que reconhece as isoformas de HLA-G associadas a β2M, preferencialmente as isoformas de HLA-G1 e HLA- G5.
[048] Em um aspecto, a presente invenção está adicionalmente relacionada a um CAR que se liga especificamente às isoformas de HLA-G que são livres de β2M (beta-2-microglobulina). Em outro aspecto, a presente invenção está adicionalmente relacionada a um CAR que se liga especificamente às isoformas de HLA-G associadas a β2M.
[049] Refere-se particularmente a um anticorpo monoclonal ou uma molécula de fragmento variável de cadeia única (scFv) que se liga especificamente a ambos HLA-G1 e HLA-G5 ou ambas isoformas de HLA-G2 e HLA-G6. Também refere-se a um anticorpo monoclonal ou uma molécula de fragmento variável de cadeia única (scFv) que se liga especificamente às isoformas de HLA-G que são livres de β2M, preferencialmente a ambos HLA-G2 e HLA-G6 e/ou a ambos HLA-G1/livre de β2M e isoformas de HLA-G5/livre de β2M. Refere-se, adicionalmente,a um anticorpo monoclonal ou a uma molécula de fragmento variável de cadeia única (scFv) que se liga especificamente às isoformas de HLA-G associadas a β2M, preferencialmente isoformas HLA-G1 e HLA-G5.
[050] A presente invenção também se refere a constructos de ácido nucleico ou vetores contendo o constructo de ácido nucleico que pode ser transduzido em uma célula, preferencialmente uma célula imune, tal como uma célula T, criando assim uma célula imune recombinante manipulada para expressar o CAR codificado. Também são fornecidas células que são transduzidas para expressar o CAR da presente invenção, populações de células e composições farmacêuticas contendo as células que expressam CAR.
[051] A presente invenção pode estar particularmente relacionada a uma célula imune que expressa dois CAR diferentes, particularmente um CAR que se liga especificamente às isoformas de HLA-G que são livres de β2M, preferencialmente a ambos HLA-G2 e HLA-G6 e/ou ambos HLA-G1/livre de β2M e isoformas de HLA-G5 /livre de β2M; e um CAR que se liga especificamente às isoformas de HLA-G associadas a β2M, preferencialmente isoformas HLA-G1 e HLA-G5.
[052] Dentre as composições estão composições farmacêuticas e formulações para administração, tal como para terapia celular adotiva. Também são fornecidos métodos para preparar células que expressam CAR e administrar as células e composições a indivíduos, por exemplo, pacientes. Abreviações APC: Célula Apresentadora de MFI: Intensidade de Antígeno Fluorescência do Meio β2M: β-2-Microglobulina MOI: Multiplicidade de Infecção
CAR: Receptor de Antígeno NK: Natural Killer Quimérico CTL: Linfócito T Citotóxico MHC: Complexo Principal de Histocompatibilidade DC: Células Dendríticas PBS: Tampão Fosfato-salino HLA-G: Antígeno Leucocitário PBMC: Células Humano G Mononucleares de Sangue Periférico ICP: Ponto de Checagem scFv: Fragmento variável de Imunológico cadeia única ITAM: Motivos de Ativação Baseados SD: Desvio Padrão em Tirosina do Imunorreceptor Mab(s): Anticorpo(s) monoclonal(is) TAA: Antígeno Associado a Tumor WT: tipo selvagem Definições
[053] Para facilitar a compreensão da presente invenção, vários termos são definidos abaixo.
[054] Os termos "Receptor de antígeno quimérico" (CAR), "receptor de célula manipulada", "receptor de célula quimérica" ou "receptor imune quimérico" (ICR), como usados na presente invenção, referem-se a receptores manipulados, que enxertam uma especificidade de ligação de antígeno em células imunes (por exemplo, células T ou células NK), combinando assim as propriedades de ligação ao antígeno do domínio de ligação ao antígeno com a atividade imunogênica da célula imune, tal como a capacidade lítica e a autorrenovação das células T. Particularmente, um CAR refere-se a uma proteína fundida que compreende um domínio extracelular capaz de se ligar a um antígeno, um domínio transmembrana, opcionalmente um domínio de dobradiça e pelo menos um domínio intracelular.
Os termos "domínio extracelular capaz de se ligar a um antígeno", "domínio externo", "ectodomínio" e "domínio de ligação ao antígeno" são usados indistintamente na presente invenção e significam qualquer oligopeptídeo ou polipeptídeo que pode se ligar a um antígeno alvo (por exemplo, isoforma(s) de HLA-G). Particularmente, o termo "domínio de ligação ao antígeno" ou "domínio de direcionamento específico de antígeno", como usado na presente invenção, refere-se à região do CAR que direciona e se liga a antígenos específicos, por exemplo, antígeno de HLA-G.
Quando um CAR é expresso em uma célula hospedeira, este domínio forma o domínio extracelular (ectodomínio) do receptor.
O domínio de ligação ao antígeno de um CAR tipicamente deriva de um anticorpo e pode consistir em um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo de cadeia única (scFv) ou fragmentos de ligação ao antígeno (Fab). Os termos "domínio intracelular", "domínio interno", "domínio citoplasmático" e "domínio de sinalização intracelular" são usados indistintamente na presente invenção e significam qualquer oligopeptídeo ou polipeptídeo conhecido por funcionar como um domínio que transmite um sinal que causa ativação ou inibição de um processo em uma célula.
O domínio de sinalização intracelular pode gerar um sinal que promove uma função efetora imune da célula transduzida com uma sequência de ácido nucleico que compreende um CAR, por exemplo, atividade citolítica e atividade auxiliar, incluindo a secreção de citocinas.
O termo "domínio transmembrana" significa qualquer oligopeptídeo ou polipeptídeo conhecido por abranger a membrana celular e que pode funcionar para ligar os domínios extracelulares e de sinalização.
Pode ser uma única hélice alfa, um barril beta transmembrana, uma hélice beta de gramicidina A ou qualquer outra estrutura.
Normalmente, o domínio transmembrana denota uma única hélice alfa transmembrana de uma proteína transmembrana, também conhecida como proteína integral.
[055] Um receptor de antígeno quimérico pode opcionalmente compreender um "domínio de dobradiça" que serve como um ligante entre os domínios extracelular e transmembrana. Como usados na presente invenção, os termos "dobradiça", "espaçador" ou "ligante" referem-se a uma sequência de aminoácidos de comprimento variável tipicamente codificada entre dois ou mais domínios de um constructo polipeptídico para conferir, por exemplo, flexibilidade, organização espacial melhorada e/ou proximidade. Como usado na presente invenção, o termo "ligante clivável" refere-se a uma cadeia peptídica de comprimento variável que pode ser proteoliticamente clivada ou digerida por proteases ou enzimas ou que se autoclivam. Após a clivagem do ligante peptídico, sua integridade é geralmente comprometida e resulta na separação dos domínios localizados em ambos os lados do ligante clivável (C-terminal e N- terminal). Um "ligante clivável" geralmente compreende um sítio de clivagem. Como usado na presente invenção, o termo "sítio de clivagem" refere-se a uma sequência específica de aminoácidos que pode ser clivada especificamente por um agente de clivagem, tal como uma protease, ou que se autocliva. O termo "ligante", como usado no contexto de um scFv, refere-se a um ligante peptídico que consiste em aminoácidos, tais como glicina e/ou resíduos de serina usados isoladamente ou em combinação, para ligar regiões de cadeia pesada variável e leve variável juntas.
[056] Um receptor de antígeno quimérico pode opcionalmente compreender um peptídeo sinal. Os termos "peptídeo sinal", "sinal de direcionamento", "sinal de localização", "peptídeo de trânsito" ou "sequência líder" referem-se a um peptídeo curto presente no N-terminal da maioria das proteínas recentemente sintetizadas que são destinadas à via secretória. O núcleo do peptídeo sinal pode conter uma longa extensão de aminoácidos hidrofóbicos. O peptídeo sinal pode ou não ser clivado a partir do polipeptídeo maduro.
[057] Como usado na presente invenção, os termos "anticorpo" e "anticorpos" referem-se a anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, anticorpos de camelo, anticorpos quiméricos, fragmentos de ligação ao antígeno, tais como fragmento variável de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única, anticorpos de domínio único, fragmentos de ligação ao antígeno (Fab), fragmentos F(ab'), fragmento variável ligado por dissulfeto (sdFv), intracorpos, nanocorpos e fragmentos de ligação ao epítopo de qualquer um dos acima. Em particular, os anticorpos incluem moléculas de imunoglobulina e fragmentos imunologicamente ativos de moléculas de imunoglobulina, ou seja, moléculas que contêm um sítio de ligação ao antígeno. As moléculas de imunoglobulina podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) ou subclasse. A menos que especificamente indicado de outra forma, o termo "anticorpo" inclui imunoglobulinas intactas e "fragmentos de anticorpo" ou "fragmentos de ligação a antígeno" que se ligam especificamente a uma molécula de interesse (ou um grupo de moléculas de interesse semelhantes, tais como isoformas de HLA-G) à exclusão substancial de ligação a outras moléculas. O termo "anticorpo" também inclui formas geneticamente manipuladas, tais como anticorpos quiméricos (por exemplo, anticorpos murinos humanizados), anticorpos heteroconjugados (tais como anticorpos biespecíficos). Preferencialmente, o termo anticorpo refere-se a um anticorpo monoclonal, ainda mais preferencialmente a um scFv derivado de um anticorpo monoclonal.
[058] Em termos de estrutura, um anticorpo pode ter cadeias pesadas (H)
e cadeias leves (L) interconectadas por ligações dissulfeto. Existem dois tipos de cadeia leve, lambda (λ) e kappa (κ). Cada cadeia pesada e leve contém uma região constante e uma região variável (ou "domínio"). As regiões variáveis da cadeia leve e pesada contêm uma região "estrutural" interrompida por três regiões hipervariáveis, também chamadas de "regiões determinantes de complementaridade" ou "CDRs". A extensão da região estrutural e das CDRs é definida (ver, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Departamento de Saúde e Serviços Humanos dos EUA, 1991, que é incorporado na presente invenção por referência). As regiões estruturais atuam para formar um andaime que fornece o posicionamento das CDRs na orientação correta por interações não covalentes entre cadeias. Os CDRs são os principais responsáveis pela ligação a um epítopo de um antígeno. As CDRs de cada cadeia são normalmente referidas como CDR1, CDR2 e CDR3, numeradas sequencialmente a partir do N-terminal. Os domínios VL e VH do anticorpo de acordo com a presente invenção podem compreender quatro regiões estruturais ou "FRs", que são referidas no estado da técnica e na presente invenção como “Região de Estrutura 1" ou "FR1"; como “Região de Estrutura 2" ou "FR2"; como "Região de Estrutura 3" ou "FR3"; e como "Região de Estrutura 4" ou "FR4", respectivamente. Estas regiões estruturais são interrompidas por três regiões determinantes complementares ou "CDRs", que são referidas no estado da técnica como "Região Determinante de Complementaridade 1" ou "CDR1"; como "Região 2 Determinante de Complementaridade" ou "CDR2"; e como "Região 3 Determinante de Complementaridade" ou "CDR3", respectivamente. Estas regiões estruturais e regiões determinantes de complementaridade são preferencialmente operativamente ligadas na seguinte ordem: FR1-CDR1-FR2- CDR2-FR3-CDR3-FR4 (do amino-terminal ao carbóxi-terminal).
[059] Uma "cadeia pesada de anticorpo", como usada na presente invenção, refere-se ao maior dos dois tipos de cadeias polipeptídicas presentes nas conformações de anticorpos.
[060] Uma "cadeia leve de anticorpo", como usada na presente invenção, refere-se ao menor dos dois tipos de cadeias polipeptídicas presentes nas conformações do anticorpo, as cadeias leves κ e λ referem-se aos dois principais isótipos da cadeia leve do anticorpo.
[061] O termo "scFv" refere-se a uma proteína compreendendo pelo menos um fragmento de anticorpo compreendendo uma região variável de uma cadeia leve e pelo menos um fragmento de anticorpo compreendendo uma região variável de uma cadeia pesada, em que as regiões variáveis da cadeia leve e pesada estão ligadas de forma contígua, por exemplo, via um ligante sintético, por exemplo, um ligante polipeptídico curto e flexível, e capaz de ser expresso como um polipeptídeo de cadeia única, e em que o scFv retém a especificidade do anticorpo intacto do qual é derivado. A menos que especificado, tal como usado na presente invenção, um scFv pode ter as regiões variáveis VL e VH em qualquer ordem, por exemplo, em relação às extremidades N-terminal e C- terminal do polipeptídeo, o scFv pode compreender VL-ligante-VH ou pode compreender VH-ligante-VL. O ligante pode compreender porções das sequências estruturais.
[062] O termo "deriva de" ou "derivado de", como usado na presente invenção, refere-se a um composto tendo uma estrutura derivada da estrutura de um composto ou proteína parental e cuja estrutura é suficientemente similar àquelas reveladas na presente invenção e com base nessa similaridade, seria esperado por um técnico no assunto exibir as mesmas ou semelhantes propriedades, atividades e utilidades que os compostos reivindicados. Por exemplo, um scFv derivado de um anticorpo monoclonal refere-se a um fragmento de anticorpo que compartilha as mesmas propriedades que o anticorpo monoclonal, por exemplo, compartilha VH e VL idênticos ou similares e/ou reconhece o mesmo epítopo.
[063] Como usado na presente invenção, o termo "antígeno" refere-se a um composto, composição ou substância que pode ser especificamente ligada pelos produtos de imunidade humoral ou celular específica, tal como uma molécula de anticorpo, um receptor de células T ou um CAR. É prontamente aparente que a presente invenção inclui antígeno intacto e fragmento de antígeno do mesmo. É prontamente aparente que um antígeno pode ser gerado, sintetizado ou pode ser derivado de uma amostra biológica. Tal amostra biológica pode incluir, mas não está limitada a uma amostra de tecido, uma amostra de tumor, uma célula ou um fluido biológico. Preferencialmente, o termo "antígeno" refere-se na presente invenção ao HLA-G, particularmente às isoformas de HLA-G.
[064] Como usado na presente invenção, os termos "HLA-G" e "Antígeno leucocitário humano G" se refere a uma molécula específica associada a este nome e a quaisquer outras moléculas que tenham uma função biológica análoga que compartilhe pelo menos 80% de identidade de sequência de aminoácidos, preferencialmente 90% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade de sequência com HLA-G, incluindo, mas não limitado a qualquer uma de suas diversas isoformas, incluindo, mas não limitado, às isoformas ligadas à membrana (por exemplo, HLA-G1, HLA-G2, HLA- G3, HLA- G4), isoformas solúveis (por exemplo, HLA-G5, HLA-G6, HLA-G7) e formas solúveis geradas por clivagem proteolítica de isoformas ligadas à membrana (por exemplo, sHLA-G1). Exemplos das sequências HLA-G são fornecidos na presente invenção abaixo.
[065] Como usado na presente invenção, "ligar" ou "ligação" refere-se a peptídeos, polipeptídeos, proteínas, proteínas de fusão e anticorpos (incluindo fragmentos de anticorpos) que reconhecem e contactam um antígeno. Preferencialmente, refere-se a uma interação do tipo antígeno-anticorpo. Por "ligar-se especificamente" ou "ligar-se imunoespecificamente" significa que o anticorpo reconhece um antígeno específico, mas não reconhece ou se liga substancialmente a outras moléculas em uma amostra. Em alguns casos, os termos "ligação específica" ou "ligando especificamente" podem ser usados em referência à interação de um anticorpo, uma proteína ou um peptídeo com uma segunda espécie química, para significar que a interação é dependente da presença de uma estrutura particular (por exemplo, um determinante antigênico ou epítopo). Como usado na presente invenção, o termo "ligação específica" significa o contato entre um anticorpo e um antígeno com uma afinidade de ligação de pelo menos 10-6 M. Em certos aspectos, os anticorpos se ligam com afinidades de pelo menos cerca de 10-7 M, e preferencialmente 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M.
[066] O termo "anticorpo que se liga especificamente a uma isoforma de HLA-G" ou “CAR que se liga especificamente a uma isoforma de HLA-G" e termos análogos, como usados na presente invenção, referem-se a anticorpos ou fragmentos de anticorpos que reconhecem especificamente um ou diversas isoforma(s) de HLA-G e não reconhecem ou reconhecem fracamente outros antígenos (incluindo outras isoformas de HLA-G). Preferencialmente, os anticorpos ou fragmentos de anticorpos que se ligam especificamente a uma ou diversas isoforma(s) de HLA-G têm uma maior afinidade para esta ou essas isoforma(s) de HLA-G ou um fragmento das mesmas quando comparados com a afinidade para outros antígenos ou fragmentos dos mesmos, incluindo outras isoformas de HLA-G.
[067] A afinidade de um anticorpo pode ser uma medida de sua ligação com um antígeno específico em um único sítio de antígeno-anticorpo e é, em essência, a soma de todas as forças atrativas e repulsivas presentes na interação entre o sítio de ligação ao antígeno de um anticorpo e um epítopo particular. A afinidade de um anticorpo por um antígeno particular (por exemplo, isoforma(s) de HLA-G) pode ser expressa pela constante de equilíbrio K de dissociação, definida pela equação Kd = [Ag] [Ab]/[Ag Ab], que representa a afinidade do sítio de combinação do anticorpo; onde [Ag] é a concentração de antígeno livre (M), [Ab] é a concentração de anticorpo livre (M) e [Ag Ab] é a concentração (M) do complexo antígeno-anticorpo. Onde o antígeno e o anticorpo reagem fortemente em conjunto, haverá muito pouco antígeno livre ou anticorpo livre e, portanto, a constante de equilíbrio ou afinidade do anticorpo será baixa. A afinidade média para anticorpos é de pelo menos 10-6 M. Em certos aspectos, o domínio de ligação ao antígeno do CAR liga um a seis, preferencialmente dois a cinco, isoforma(s) de HLA-G com afinidades de pelo menos cerca de 10-6 M, e preferencialmente pelo menos 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M ou 10-10 M. A afinidade de ligação pode ser medida por qualquer método disponível para o técnico no assunto, em particular por ressonância plasmônica de superfície (SPR).
[068] Um "ligante estimulador", como usado na presente invenção, significa um ligante que, quando presente em uma célula que apresenta antígeno (por exemplo, uma APC, uma célula dendrítica, uma célula B e semelhantes) pode se ligar especificamente a um parceiro de ligação cognato (referido na presente invenção como uma "molécula estimulatória") em uma célula T, mediando assim uma resposta primária pela célula T, incluindo, mas não limitado a, ativação, iniciação de uma resposta imune, proliferação e semelhantes.
[069] O termo "ligante coestimulatório", como usado na presente invenção, inclui uma molécula em uma célula de apresentação de antígeno (por exemplo, uma APC, célula dendrítica, célula B e semelhantes) que se liga especificamente a um parceiro de ligação cognato (referido na presente invenção como uma "molécula estimulatória") em uma célula T, fornecendo assim um sinal que, além do sinal primário fornecido por, por exemplo, ligação de um complexo TCR/CD3 com uma molécula MHC carregada com peptídeo, media uma resposta de célula T, incluindo, mas não limitado a, proliferação, ativação, diferenciação e semelhantes.
[070] Como usado na presente invenção, uma "molécula coestimulatória" refere-se a uma molécula expressa por uma célula imune (por exemplo, célula T, célula NK, célula B) que fornece a(s) sequência(s) de sinalização citoplasmática(s) que regulam a ativação da célula imune em uma forma estimulatória para pelo menos algum aspecto da via de sinalização de células imunes. Em um aspecto, o sinal é um sinal primário que é iniciado, por exemplo, pela ligação de um complexo TCR/CD3 com uma molécula MHC carregada com peptídeo e que leva à mediação de uma resposta de células T, incluindo, mas não limitada a, proliferação, ativação, diferenciação e semelhantes. Uma sequência sinalização citoplasmática primária (também referida como um "domínio de sinalização primário") que atua de uma maneira estimulatória pode conter um motivo de sinalização que é conhecido como um motivo de ativação baseado em tirosina do imunorreceptor ou ITAM. Particularmente, este termo refere-se ao parceiro de ligação cognato em uma célula T que se liga especificamente a um ligante coestimulatório presente em uma célula apresentadora de antígeno, mediando assim uma resposta coestimulatória pela célula T, tal como, mas não limitado a, proliferação ativação, diferenciação e semelhantes.
[071] Uma "molécula estimulatória", como usado na presente invenção, significa uma molécula em uma célula T que se liga especificamente a um ligante estimulador cognato presente em uma célula apresentadora de antígeno.
[072] Um "sinal coestimulatório", como usado na presente invenção,
refere-se a um sinal, que em combinação com um sinal primário, tal como ligação de TCR/CD3, leva à ativação da proliferação de células T, diferenciação e semelhantes, e/ou regulação positiva ou regulação negativa de moléculas- chave.
[073] Pelo termo "estimulação" ou "estimulador" entende-se uma resposta primária induzida pela ligação de uma molécula estimulatória (por exemplo, um complexo TCR/CD3) com seu ligante cognato, mediando assim um evento de transdução de sinal, tal como, mas não limitado a, transdução de sinal via complexo TCR/CD3. A estimulação pode mediar a expressão alterada de certas moléculas, tal como a regulação negativa de TGF-β e/ou reorganização de estruturas do citoesqueleto e semelhantes.
[074] Um "repórter" ou "marcador selecionável", como usado na presente invenção, refere-se a um polinucleotídeo ou polipeptídeo que permite a detecção e/ou a seleção de células de expressão da população de células que se pretende transfectar, particularmente uma célula transfectada com um constructo CAR. Quando ligada a um constructo particular, permite estabelecer a presença e/ou a quantificação de tal constructo em uma célula.
[075] "Células imunes", como usado na presente invenção, refere-se a células envolvidas na imunidade inata e adaptativa, por exemplo, tais como glóbulos brancos (leucócitos) que são derivados de células-tronco hematopoiéticas (HSC) produzidas na medula óssea, linfócitos (células T, células B, células natural killer (NK) e células T natural killer (NKT)) e células derivadas de mieloides (neutrófilos, eosinófilos, basófilos, monócitos, macrófagos, células dendríticas). Em particular, a célula imune pode ser selecionada na lista não exaustiva que compreende células B, células T, em particular células T CD4+ e células T CD8+, células NK, células NKT, células APC, células dendríticas e monócitos.
[076] De acordo com a presente invenção, o doador e o receptor das células imunes, preferencialmente células T, podem ser um único indivíduo ou indivíduos diferentes, por exemplo, indivíduos autólogos, alogênicos ou xenogênicos. Como usado na presente invenção, o termo "autólogo" refere-se a células ou tecidos obtidos de um indivíduo e posteriormente transplantados de volta para o mesmo indivíduo. Como usado na presente invenção, o termo "alogênico" refere-se a células ou tecidos obtidos de diferentes indivíduos da mesma espécie, onde o doador e o receptor não são geneticamente idênticos. No que diz respeito à presente invenção, um transplante de células alogênico ou enxerto de tecido envolve o transplante de células ou tecidos em que o doador e o receptor são indivíduos diferentes da mesma espécie. O termo “xenogênico” significa aquele que é derivado ou obtido de um organismo de uma espécie diferente. No que diz respeito à presente invenção, um transplante de células xenogênicas ou enxerto de tecido envolve o transplante de células ou tecidos em que o doador e o receptor são indivíduos diferentes de espécies diferentes.
[077] O termo "tratamento" refere-se a qualquer ato destinado a melhorar o estado de saúde dos pacientes, tais como terapia, prevenção, profilaxia e retardo da doença ou dos sintomas da doença. Designa um tratamento curativo e/ou profilático de uma doença. Um tratamento curativo é definido como um tratamento que resulta na cura ou um tratamento que alivia, melhora e/ou elimina, reduz e/ou estabiliza uma doença ou os sintomas de uma doença ou o sofrimento que ela causa direta ou indiretamente. Um tratamento profilático compreende um tratamento que resulta na prevenção de uma doença e um tratamento que reduz e/ou atrasa a progressão e/ou a incidência de uma doença ou o risco de sua ocorrência. Em certas modalidades, tal termo refere-se à melhoria ou erradicação de uma doença, um distúrbio, uma infecção ou sintomas associados a ela. Em outras modalidades, este termo refere-se a minimizar a propagação ou o agravamento dos cânceres. Os tratamentos de acordo com a presente invenção não implicam necessariamente 100% ou tratamento completo. Em vez disso, existem vários graus de tratamento, dos quais um técnico no assunto reconhece como tendo um benefício potencial ou efeito terapêutico.
[078] Como usado na presente invenção, os termos "distúrbio" ou "doença" referem-se ao funcionamento incorreto do órgão, parte, estrutura ou sistema do corpo resultante do efeito de erros genéticos ou de desenvolvimento, infecção, venenos, deficiência nutricional ou desequilíbrio, toxicidade, ou fatores ambientais desfavoráveis. Preferencialmente, estes termos referem-se a um distúrbio de saúde ou doença, por exemplo, uma doença que perturba as funções físicas ou mentais normais. Mais preferencialmente, o termo distúrbio refere-se a doenças imunes e/ou inflamatórias que afetam animais e/ou humanos, tal como câncer.
[079] O termo "doença imune", como usado na presente invenção, refere- se a uma condição em um indivíduo caracterizado por lesão celular, de tecido e/ou órgão causada por uma reação imunológica do indivíduo às suas próprias células, tecidos e/ou órgãos. O termo "doença inflamatória" refere-se a uma condição em um indivíduo caracterizado por inflamação, por exemplo, inflamação crônica. Os distúrbios autoimunes podem ou não estar associados à inflamação. Além disso, a inflamação pode ou não ser causada por um distúrbio autoimune.
[080] O termo "câncer", como usado na presente invenção, é definido como doença caracterizada pelo crescimento rápido e descontrolado de células aberrantes. As células cancerosas podem se espalhar localmente ou através da corrente sanguínea e do sistema linfático para outras partes do corpo.
[081] O termo "terapia celular adotiva" ou "terapia de células T adotivas"
ou "ACT", como usado na presente invenção, significa a transferência de células para um paciente, em que as células foram manipuladas ou de outra forma alteradas antes da transferência para o indivíduo. Um exemplo de ACT é a colheita de sangue ou tumor de um indivíduo, uma célula imune, tal como uma célula T. Essas células imunes são então estimuladas ex vivo, em cultura e expandidas. As células são então transduzidas com um ou mais constructos de ácido nucleico que permitem que a célula expresse novas moléculas, tal como um CAR, fornecendo às células imunes manipuladas um novo mecanismo para combater uma doença, por exemplo, um câncer. Em alguns casos, o CAR compreende um domínio de ligação ao antígeno que reconhece especificamente um antígeno expresso por um tumor ou câncer, tal como HLA-G. As células imunes típicas utilizadas em procedimentos ACT incluem linfócitos infiltrantes de tumor (TILs) ou células T. As células imunes usadas na ACT podem ser derivadas do próprio paciente/indivíduo ou de um doador universal. A ACT também pode ser acompanhada pela etapa opcional de linfodepleção dos próprios linfócitos do indivíduo que podem competir com as células recombinantes infundidas de volta no indivíduo.
[082] Os termos "terapia de CAR" ou "terapia celular de CAR" são usados indistintamente na presente invenção e se referem a um tipo de tratamento no qual as células imunes são modificadas para expressar um CAR para prevenir ou tratar uma doença, por exemplo, tais como infecção viral ou câncer. Tal célula imune pode ser autóloga ou alogênica. As células imunes podem ser, por exemplo, linfócitos B, linfócitos T, células natural killer ou células T natural killer e semelhantes. Por exemplo, a terapia celular CAR é fornecida pela aquisição de células imunes de um paciente, transfectando as células imunes com genes CAR que permitem a expressão de um CAR, tal CAR sendo direcionado contra um antígeno envolvido na doença do paciente, expandindo a população de células imunes modificadas e reinfundindo as células de volta no paciente. O termo "efeito antitumoral", como usado na presente invenção, refere-se a um efeito biológico que pode ser manifestado por uma diminuição no volume do tumor, uma diminuição no número de células tumorais, uma diminuição no número de metástases, um aumento na expectativa de vida, ou melhora de vários sintomas fisiológicos associados à condição cancerosa. Um "efeito antitumoral" também pode ser manifestado pela capacidade das células e CARs da presente invenção na prevenção da ocorrência de tumor em primeiro lugar ou para limitar a formação de metástases.
[083] Os termos "citolítico" ou "citotóxico", como usados na presente invenção, referem-se ao resultado da resposta imune mediada por células citotóxicas, tais como células T ou células NK e células NKT que levam à morte (por exemplo, por apoptose) de uma célula alvo.
[084] Como usado na presente invenção, o termo "indivíduo", "hospedeiro", "indivíduo" ou "paciente" refere-se a indivíduos humanos e veterinários, particularmente a um animal, preferencialmente a um mamífero, ainda mais preferencialmente a um humano, incluindo adulto e criança. No entanto, o termo "indivíduo" também abrange animais não humanos, em particular mamíferos, tais como cães, gatos, cavalos, vacas, porcos, ovelhas e primatas não humanos, entre outros.
[085] Conforme usado na presente invenção, a frase "efeitos colaterais" abrange efeitos indesejáveis e adversos de um agente profilático ou terapêutico. Os efeitos colaterais são sempre indesejados, mas os efeitos indesejados não são necessariamente adversos. Um efeito adverso de uma terapia (por exemplo, um agente profilático ou terapêutico) pode ser prejudicial, desconfortável ou arriscado. Os efeitos indesejáveis tipicamente experimentados pelos pacientes são numerosos e conhecidos no estado da técnica.
[086] O termo "em combinação", como usado na presente invenção, refere-se ao uso de mais que uma terapia (por exemplo, agentes profiláticos e/ou terapêuticos). O uso do termo "em combinação" não restringe a ordem em que as terapias (por exemplo, agentes profiláticos e/ou terapêuticos) são administradas a um indivíduo com uma doença ou distúrbio.
[087] Pelo termo "modulação", como usado na presente invenção, significa mediar um aumento ou diminuição detectável no nível de uma resposta em um indivíduo em comparação com o nível de uma resposta no indivíduo na ausência de um tratamento ou composto, e/ou em comparação com o nível de resposta em um indivíduo de outra forma idêntico, mas não tratado. O termo abrange perturbar e/ou afetar um sinal ou resposta nativa, mediando assim uma resposta terapêutica benéfica em um indivíduo, preferencialmente, um humano.
[088] Como usado na presente invenção, uma "composição farmacêutica ou veterinária" refere-se a uma preparação de um ou mais dos agentes ativos, tal como compreendendo um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo anti-HLA-G de acordo com a presente invenção, com outros componentes químicos opcionais, tais como carreadores e excipientes fisiologicamente adequados. A finalidade de uma composição farmacêutica ou veterinária é facilitar a administração do agente ativo a um organismo. As composições da presente invenção podem estar em uma forma adequada para qualquer via convencional de administração ou uso. Em uma modalidade, uma "composição" normalmente pretende uma combinação do agente ativo, por exemplo, composto ou composição, e um carreador de ocorrência natural ou não natural, inerte (por exemplo, um agente ou marcador detectável) ou ativo, tal como um adjuvante, diluente, aglutinante, estabilizante, tampões, sais, solventes lipofílicos, conservante, adjuvante ou semelhantes e incluem carreadores farmaceuticamente aceitáveis.
[089] Um "veículo aceitável" ou "carreador aceitável", como referido na presente invenção, é qualquer composto conhecido ou combinação de compostos que são conhecidos pelos técnicos no assunto como sendo úteis na formulação de composições farmacêuticas ou veterinárias.
[090] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" é uma quantidade que, quando administrada a um indivíduo, é a quantidade de agente ativo que é necessária para tratar a doença ou distúrbio direcionado, ou para produzir o efeito desejado. A “quantidade eficaz” irá variar dependendo do(s) agente(s), da doença e sua gravidade e da idade, peso e características do indivíduo a ser tratado.
[091] Como usado na presente invenção, o termo "medicamento" refere- se a qualquer substância ou composição com propriedades curativas ou preventivas contra distúrbios ou doenças.
[092] O termo "transfectado" ou "transformado" ou "transduzido" é usado indistintamente na presente invenção e é aplicado à produção de células receptoras de antígeno quiméricas e refere-se particularmente ao processo pelo qual uma sequência de nucleotídeos estranha ou exógena é introduzida em uma célula. O ácido nucleico exógeno pode ser introduzido de forma estável ou transitória na célula hospedeira. Uma célula "transfectada" ou "transformada" ou "transduzida" é aquela que foi transfectada, transformada ou transduzida com ácido nucleico exógeno. Em algumas modalidades, esta transdução é realizada por meio de um vetor, preferencialmente um vetor lentiviral.
[093] Como usado na presente invenção, os termos "constructo de ácido nucleico" e "vetor" são equivalentes e se referem a uma molécula de ácido nucleico que serve para transferir uma sequência de ácido nucleico passageira, tais como DNA ou RNA, para uma célula hospedeira. Um vetor pode compreender uma origem de replicação, um marcador selecionável e,
opcionalmente, um sítio adequado para a inserção de uma sequência ou gene. Um vetor pode ser um vetor extracromossômico autorreplicante ou um vetor que se integra em um genoma hospedeiro. Também pode compreender elementos de expressão incluindo, por exemplo, um promotor, a sequência de iniciação da tradução correta, tal como um sítio de ligação ao ribossoma e um códon de iniciação, um códon de terminação e uma sequência de terminação da transcrição. Um constructo de ácido nucleico também pode compreender outras regiões regulatórias, tais como intensificadores, silenciadores e elementos de fronteira/isolantes para direcionar o nível de transcrição de um dado gene. Vetores capazes de direcionar a expressão de genes e/ou sequência de ácido nucleico aos quais estão operativamente ligados também podem ser referidos na presente invenção como "vetores de expressão". Existem diversos tipos comuns de vetores, incluindo constructos de ácido nucleico, fagemídeos, genomas de vírus, cosmídeos e cromossomos artificiais. O constructo de ácido nucleico pode ser um vetor para a expressão estável ou transitória de um gene ou sequência. O constructo de ácido nucleico pode compreender uma origem de replicação do constructo de ácido nucleico (ori). Particularmente, o constructo de ácido nucleico pode ser projetado para transferência genética entre diferentes hospedeiros, incluindo, mas não limitado a, um plasmídeo, um vírus, um cosmídeo, um fago, um BAC, um YAC. Tais vetores podem ser preparados a partir de vetores comercialmente disponíveis ou produzidos, por exemplo, a partir de baculovírus, retrovírus, adenovírus ou AAVs de acordo com técnicas conhecidas no estado da técnica. Preferencialmente, esses termos refere-sem a um vetor lentiviral.
[094] Como usado na presente invenção, o termo "expressão" refere-se ao processo pelo qual os polinucleotídeos são transcritos em mRNA e/ou o processo pelo qual o mRNA transcrito é subsequentemente traduzido em peptídeos,
polipeptídeos ou proteínas. O nível de expressão de um gene pode ser determinado medindo a quantidade de mRNA ou proteína em uma amostra de célula ou tecido. Em um aspecto, o nível de expressão de um gene de uma amostra pode ser diretamente comparado ao nível de expressão desse gene de uma amostra de controle ou de referência. Em outro aspecto, o nível de expressão de um gene de uma amostra pode ser diretamente comparado ao nível de expressão desse gene da mesma amostra após a administração de um composto.
[095] O termo "variante funcional" ou "equivalente biológico" é usado indistintamente como usado na presente invenção e refere-se a um polipeptídeo (CAR ou proteína) tendo identidade de sequência substancial ou significativa ou similaridade com um polipeptídeo parental, cuja variante funcional retém a atividade biológica do polipeptídeo do qual é uma variante. A menos que especificamente recitado na presente invenção, é contemplado que qualquer polinucleotídeo, polipeptídeo ou proteína mencionada na presente invenção também inclui equivalentes dos mesmos. Por exemplo, um equivalente pretende pelo menos cerca de 70% de homologia ou identidade, ou pelo menos 80% de homologia ou identidade e, alternativamente, ou pelo menos cerca de 85%, ou alternativamente, pelo menos cerca de 90%, ou alternativamente pelo menos cerca de 95%, ou alternativamente, 98% de homologia ou identidade e exibe atividade biológica substancialmente equivalente à proteína, polipeptídeo ou ácido nucleico de referência. Alternativamente, quando se refere a polinucleotídeos, um equivalente dos mesmos é um polinucleotídeo que hibridiza sob condições rigorosas com o polinucleotídeo de referência ou seu complemento. Quando relacionado a anticorpos, o termo "equivalente" ou "equivalente biológico" significa que a capacidade do anticorpo de se ligar especificamente à sua proteína epítopo ou fragmento da mesma, como medido por ELISA ou outros métodos adequados, é semelhante ou conservada. Anticorpos biologicamente equivalentes incluem, mas não são limitados a, esses anticorpos, peptídeos, fragmentos de anticorpos, variantes de anticorpos, derivados de anticorpos e miméticos de anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que o anticorpo de referência. Quando relacionadas aos CARs, as variantes funcionais abrangem, por exemplo, aquelas variantes dos CARs descritos na presente invenção (o CAR parental) que retêm a capacidade de reconhecer células alvo em uma extensão similar, na mesma extensão ou em maior extensão, como o CAR parental. Em referência ao CAR parental, a variante funcional pode, por exemplo, ser pelo menos cerca de 50%, 75%, 80%, 90%, 98% ou mais idêntica na sequência de aminoácidos ao CAR parental.
[096] Por "variante" ou "equivalente", também se entende uma sequência polipeptídica que difere daquela de uma sequência polipeptídica parental em virtude de pelo menos uma modificação de aminoácido. Por exemplo, no contexto da presente invenção, uma variante pode ser uma variante de um anticorpo monoclonal ou fragmento do mesmo ou uma variante de um CAR. Tipicamente, uma variante compreende de 1 a 50 modificações de aminoácidos, preferencialmente de 1 a 40 modificações de aminoácidos. Em particular, a variante pode ter de 1 a 30 alterações de aminoácidos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 alterações de aminoácidos em comparação com seu parental. As variantes podem compreender uma ou diversas substituições de aminoácidos e/ou, uma ou diversas inserções de aminoácidos e/ou uma ou diversas deleções de aminoácidos. Em algumas modalidades, a variante pode compreender uma ou diversas substituições conservativas, por exemplo, como mostrado acima. Em algumas modalidades adicionais, a variante de um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, particularmente um scFv, pode compreender uma ou diversas modificações de aminoácidos nos domínios CDR do Mab parental. Em algumas outras modalidades, a variante do Mab parental pode compreender uma ou diversas modificações de aminoácidos em pelo menos um domínio estrutural.
[097] Por "polipeptídeo parental" como usado na presente invenção, entende-se um polipeptídeo não modificado que é subsequentemente modificado para gerar uma variante. No contexto da presente invenção, o polipeptídeo parental pode ser um anticorpo, preferencialmente um anticorpo monoclonal, ainda mais preferencialmente um scFv.
[098] Como usado na presente invenção, "homologia", "identidade" ou "similaridade", quando usado no contexto de dois ou mais ácidos nucleicos ou sequências polipeptídicas, refere-se a duas ou mais sequências ou subsequências que são iguais ou têm uma porcentagem especificada de nucleotídeos ou resíduos de aminoácidos que são iguais, por exemplo, pelo menos 60% de identidade, preferencialmente pelo menos 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou identidade superior sobre uma região especificada (por exemplo, sequência de nucleotídeos que codifica um anticorpo descrito na presente invenção ou sequência de aminoácidos de um anticorpo descrito na presente invenção). A homologia pode ser determinada comparando uma posição em cada sequência que pode ser alinhada para fins de comparação. Quando uma posição na sequência comparada é ocupada pela mesma base ou aminoácido, então as moléculas são homólogas naquela posição. Um grau de homologia entre as sequências é uma função do número de posições correspondentes ou homólogas compartilhadas pelas sequências. O termo "porcentagem de identidade" em relação às sequências designa o nível de identidade ou homologia entre as referidas sequências e pode ser determinado por técnicas conhecidas per se no estado da técnica.
Normalmente, a porcentagem de identidade entre duas sequências de ácido nucleico é determinada por meio de programas de computador, tal como GAP fornecido no pacote de programa GCG (Manual do Programa para o Pacote de Wisconsin, Versão 8, agosto de 1996, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, SB e Wunsch, CD, (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453). Com as configurações ajustadas para, por exemplo, sequências de DNA (particularmente: Penalidade de criação de GAP de 5,0 e penalidade de extensão de GAP de 0,3), as moléculas de ácido nucleico podem ser alinhadas umas às outras usando o software de alinhamento Pileup disponível como parte do pacote de programa GCG.
A determinação do percentual de identidade entre duas sequências também pode ser realizada usando um algoritmo matemático.
Um exemplo não limitativo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de duas sequências são aqueles descritos em Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., Eds. 1987) Suplemento 30, seção 7.7.18, Tabela 7.7.1. ou o algoritmo de Karlin e Altschul, 1990, Proc.
Natl.
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EUA. 87: 2264-2268, modificado como em Karlin e Altschul, 1993, Proc.
Natl.
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EUA 90:5873-5877. Tal algoritmo é incorporado nos programas NBLAST e XBLAST de Altschul et al, 1990, J.
MoI.
Biol. 215: 403. As pesquisas de nucleotídeos do BLAST podem ser realizadas com os parâmetros do programa de nucleotídeos NBLAST definidos, por exemplo, para pontuação = 100, comprimento de palavra = 12 para obter sequências de nucleotídeos homólogas a uma molécula de ácido nucleico da presente invenção.
As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com os parâmetros do programa XBLAST definidos, por exemplo, para pontuação-50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácidos homólogas a uma molécula de proteína da presente invenção.
Para obter alinhamentos com lacunas para fins de comparação, Gapped BLAST pode ser utilizado como descrito em Altschul et al, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Alternativamente, PSI-BLAST pode ser usado para desempenhar uma pesquisa iterada que detecta relações distantes entre moléculas (Id). Quando utilizar os programas BLAST, Gapped BLAST e PSI-Blast, os parâmetros padrão dos respectivos programas (por exemplo, de XBLAST e NBLAST) podem ser usados (ver, por exemplo, o site do NCBI). Outro exemplo preferido não limitativo de um algoritmo matemático utilizado para a comparação de sequências é o algoritmo de Myers e Miller, 1988, CABIOS 4: 11-17. Tal algoritmo é incorporado no programa ALIGN (versão 2.0) que faz parte do pacote de software de alinhamento de sequência GCG.
Ao utilizar o programa ALIGN para comparar sequências de aminoácidos, uma tabela de resíduos de peso PAM 120, uma penalidade de comprimento de lacuna de 12 e uma penalidade de lacuna de 4 podem ser usadas.
O alinhamento e o percentual de homologia ou identidade de sequência podem ser determinados usando programas de software conhecidos no estado da técnica, por exemplo.
Preferencialmente, os parâmetros padrão são usados para alinhamento.
Um programa de alinhamento preferido é o BLAST, usando parâmetros padrão.
Em particular, os programas preferidos são BLASTN e BLASTP, usando os seguintes parâmetros padrão: Código genético = padrão; filtro = nenhum; fita = ambos; corte = 60; espera = 10; Matriz = BLOSUM62; Descrições = 50 sequências; classificar por = HIGH SCORE; Bancos de dados = não redundante, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + traduções de GenBank CDS + SwissProtein + SPupdate + PIR.
Os detalhes desses programas podem ser encontrados no seguinte endereço da Internet: ncbi.nlm.nih.gov/cgi- bin/BLAST.
Para comparar duas sequências de aminoácidos, pode-se usar, por exemplo, a ferramenta "Agulha de gravação" para alinhamento de sequência em pares de proteínas fornecidas por EMBL-EBI e disponíveis em: www.ebi.ac.uk/Tools/services/web/toolform.ebi?tool=emboss_needle&contex t=protein, usando as configurações padrão: (I) Matriz: BLOSUM62, (ii) Lacuna aberta: 10, (iii) extensão da lacuna: 0,5, (iv) formato de saída: par, (v) penalidade de lacuna final: falso, (vi) lacuna final aberta: 10, (vii) extensão da lacuna final: 0,5.
[099] A identidade de sequência entre as sequências de nucleotídeos ou de aminoácidos pode ser determinada comparando um alinhamento das sequências. Quando uma posição equivalente nas sequências comparadas é ocupada pela mesma base ou aminoácido, então as moléculas são idênticas naquela posição. A pontuação de um alinhamento como uma porcentagem de identidade é uma função do número de aminoácidos ou bases idênticas nas posições compartilhadas pelas sequências comparadas. Ao comparar as sequências, os alinhamentos ideais podem exigir que os intervalos sejam introduzidos em uma ou mais das sequências para levar em consideração possíveis inserções e deleções nas sequências. Os métodos de comparação de sequência podem empregar penalidades de lacuna de modo que, para o mesmo número de moléculas idênticas nas sequências sendo comparadas, um alinhamento de sequência com o menor número de lacunas possível, refletindo maior relacionamento entre as duas sequências comparadas, alcançará uma pontuação maior do que um com muitas lacunas. O cálculo do percentual de identidade máxima envolve a produção de um alinhamento ideal, levando em consideração as penalidades de lacuna.
[100] Os termos também incluem sequências que têm deleções e/ou adições, bem como aquelas que têm substituições, particularmente substituição conservativa. Preferencialmente, a identidade existe sobre uma região que tem pelo menos cerca de 25 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento, ou mais preferencialmente sobre uma região que tem pelo menos 50-100 aminoácidos ou nucleotídeos de comprimento. Uma sequência "não relacionada" ou "não homóloga" compartilha menos de 50% de identidade ou, alternativamente, menos de 40% de identidade, preferencialmente menos de 30% com uma das sequências reveladas na presente invenção. Antígeno HLA-G
[101] “HLA-G” designa o antígeno leucocitário humano G, que inclui pelo menos sete isoformas. Sua expressão é principalmente restrita à interface feto- maternal no citotrofoblasto extraviloso; para a placenta, âmnio; a alguns tecidos adultos saudáveis, tais como timo, córnea, células epiteliais brônquicas e pâncreas; e a diferentes tipos de células, tais como células-tronco mesenquimais, alguns monócitos ativados e precursores eritróides e endoteliais. O HLA-G solúvel também é encontrado em fluidos corporais, tais como plasma, líquido cefalorraquidiano, ascite maligna, derrame pleural e esperma. Embora o gene HLA-G não seja ativo em alguns tecidos, sua expressão pode ser induzida por certas moléculas, tais como a progesterona ou fármacos anticâncer. Além disso, essa molécula também pode ser neo-expressa também em condições patológicas, tais como câncer, esclerose múltipla, doenças inflamatórias e infecções virais ou após aloenxerto. O HLA-G solúvel (sHLA-G) pode ser detectado no soro/plasma de indivíduos.
[102] O HLA-G difere das moléculas HLA clássicas de classe I por sua baixa diversidade genética, expressão restrita a tecidos, existência de sete isoformas e funções imuno-inibitórias. Esta molécula exerce uma função imuno-inibitória por meio da ligação direta a três receptores inibitórios: receptor tipo imunoglobulina leucocitária B1 (LILRB1/ILT2/CD85j), LILRB2 (ILT4/CD85d) e KIR2DL4 (ou CD158d), esquematizado na Figura 1A. Para receptores LILRB, o sítio de reconhecimento ocorre através do domínio α3 de HLA-G e é improvável que seja afetado pelo peptídeo. LILRB1 é expresso por células B, algumas células T, algumas células NK e todos os monócitos/células dendríticas, enquanto LILRB2 é específico para mieloides e sua expressão é restrita a monócitos/células dendríticas. KIR2DL4 é um receptor específico para o HLA-G, expresso apenas pelo subconjunto CD56bright de células NK. LILRB1 e LILRB2 mostraram se ligar a uma ampla faixa de moléculas HLA clássicas pelo domínio α3 e o B2M, para o qual HLA-G é o ligante de maior afinidade, enquanto para KIR2DL4, HLA-G é o único ligante conhecido. Em adição, foi demonstrado que LILRB1 e LILRB2 apresentam maior afinidade para multímeros HLA-G do que estruturas monoméricas. É importante trazer à tona a diferença entre a forma como LILRB1 e LILRB2 se ligam a seus ligantes: LILRB1 mostra maior afinidade para a cadeia pesadao HLA-G associada a β2M, enquanto LILRB2 mostra reconhecimento de ligação a MHCI notavelmente distinto por se ligar mais ao domínio α3 do que β2M, envolvendo os aminoácidos aromáticos Phe-195 e Tyr-197. Isto explica a ligação HLA-G independente de β2M do último receptor e sua maior afinidade para as isoformas livres β2M.
[103] Ao ligar esses receptores, o HLA-G atua como um regulador negativo do sistema imunológico para o qual algumas das funções foram descritas: inibição da função citolítica das células NK do sangue uterino e periférico, a função citolítica específica do antígeno de linfócitos T citotóxicos, a resposta aloproliferativa de células T CD4, a proliferação de células T e células NK do sangue periférico e a maturação e função das células dendríticas, mostradas na Figura 1C. Além disso, o HLA-G pode induzir a geração de células supressoras. Mas, ao contrário das moléculas clássicas de HLA de classe I, nenhuma função estimulatória foi relatada até agora para o HLA-G, nem respostas dirigidas contra o HLA-G alogênico.
[104] O HLA-G pode inibir todos os subconjuntos de células imunes; assim, pode bloquear todos os estágios da resposta antitumoral. Esta molécula é expressa em muitos tipos de tumores primários, metástases e efusões malignas,
e também pode ser encontrada em células tumorais e células infiltrantes de tumor. Foi demonstrado que a expressão de HLA-G por linhagens celulares tumorais as protege da destruição por linfócitos T citotóxicos e células NK. Assim, a expressão de HLA-G por células malignas pode prevenir a eliminação imune do tumor ao inibir a atividade de NK infiltrantes de tumor, linfócitos T citotóxicos (CTL) e células apresentadoras de antígeno (APCs).
[105] A expressão de HLA-G é controlada principalmente no nível transcricional por um promotor de gene único e no nível pós-transcricional por splicing alternativo, estabilidade do mRNA, tradução e transporte de proteínas para a superfície celular.
[106] O transcrito primário de HLA-G é alternativamente submetido ao spliced resultando na expressão de sete isoformas, onde quatro são ligadas à membrana (HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3 e HLA-G4) e três são solúveis (HLA-G5, HLA-G6 e HLA-G7). HLA-G1 e HLA-G5 apresentam a estrutura típica de uma molécula HLA clássica de classe I: uma cadeia pesada constituída por três domínios globulares ligados de forma não covalente a β2-microglobulina (β2M) e um peptídeo, enquanto as outras isoformas são mais curtas, sem um ou dois domínios da cadeia pesada, e não deve ligar a β2M (Figura 1A).
[107] HLA-G1 e o HLA-G5 são considerados as isoformas mais abundantes, provavelmente devido à falta de diversidade de anticorpos contra outras isoformas, particularmente a falta de anticorpos contra as isoformas livres de β2M.
[108] A isoforma HLA-G1 é a isoforma completa com os domínios α1, α2 e α3 associados à β2-microglobulina. A isoforma HLA-G2 não possui domínio α2, enquanto HLA-G3 não possui domínios α2 e α3, e HLA-G4 não possui domínio α3. Nenhuma das isoformas de HLA-G2, HLA-G3 e HLA-G4 se liga a β2M. As isoformas de HLA-G5 e HLA-G6 solúveis contêm os mesmos domínios globulares extra que HLA-G1 e HLA-G2, respectivamente. A isoforma HLA-G7 possui apenas o domínio α1 ligado a dois aminoácidos codificados pelo íntron 2. A isoforma HLA-G5 se liga a β2M, enquanto as isoformas de HLA-G6 e HLA-G7 não se ligam a β2M.
[109] Em adição, as moléculas HLA-G podem formar dímeros através da criação de ligações dissulfeto entre dois resíduos de cisteína exclusivos nas posições 42 (ligações Cys42-Cys42) e 147 (ligações Cys42-Cys147) da cadeia pesada HLA-G. A dimerização tem uma orientação oblíqua que expõe os sítios de ligação do receptor HLA-G do domínio α3 para cima, tornando-os mais acessíveis aos receptores. Consequentemente, os dímeros HLA-G ligam-se aos receptores com maior afinidade e taxas de dissociação mais lentas do que os monômeros, e sinalizam com mais eficiência do que os monômeros.
[110] Nomes alternativos são Antígeno de histocompatibilidade HLA-G classe I ou G ou MHC-G. HLA-G é descrito em bancos de dados sob os seguintes números de acesso: ID do gene: 3135, UniGene Hs.512152. Esta proteína é revelada no UniProt sob o número de acesso: P17693. A entrada GenBank da sequência da proteína e do mRNA são respectivamente NP_002118.1. e NM_002127.5.
[111] Ao comparar sequências de isoformas de HLA-G, HLA-G1 é geralmente escolhido como a sequência canônica, ou seja, a sequência de DNA, RNA ou aminoácidos que reflete o ácido nucleico ou base ou aminoácido mais frequente em cada posição, razão pela qual o banco de dados geralmente refere- se a sequência desta isoforma com o nome “HLA-G”. HLA-G2 a G7 difere de HLA- G1 por deleção(ões) e/ou substituição(ões) de aminoácidos. As isoformas humanas HLA-G são descritas sob o número de acesso Uniprot P17693-1 para o HLA-G1, P17693-2 para o HLA-G2, P17693-3 para o HLA-G3, P17693-4 para o HLA-G4, P17693-5 para HLA- G5, P17693-6 para o HLA-G6, P17693-7 para o HLA-
G7. Anticorpos contra às isoformas de HLA-G
[112] A presente invenção fornece um anticorpo que se liga especificamente a uma a seis, preferencialmente duas a cinco isoforma(s) de HLA-G entre as sete isoformas de HLA-G, mas não se liga ou reconhece especificamente todas as isoformas de HLA-G. Por exemplo, o anticorpo pode ligar-se especificamente a uma, duas, três, quatro, cinco ou seis isoformas de HLA-G. As isoformas de HLA-G podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste em HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6 e HLA-G7, preferencialmente de HLA-G1, HLA-G2, HLA-G5 e HLA-G6.
[113] Por exemplo, o anticorpo ou o domínio de ligação ao antígeno do CAR de acordo com a presente invenção pode reconhecer: - HLA-G1, HLA-G4 e HLA-G5, se o epítopo reconhecido pelo anticorpo ou domínio de ligação ao antígeno estiver no domínio α2 de HLA-G, - HLA-G1, HLA-G2, HLA-G5 e HLA-G6, se o epítopo reconhecido pelo anticorpo ou domínio de ligação ao antígeno estiver no domínio α3 de HLA-G, - HLA-G1 e HLA-G5, se o epítopo reconhecido pelo anticorpo ou domínio de ligação ao antígeno estiver no domínio β2M de HLA-G ou em um domínio que é específico do HLA-G associado ao domínio β2M.
[114] Em uma modalidade particular, o anticorpo ou seu fragmento não reconhece todas as isoformas de HLA-G, ou seja, o anticorpo ou o domínio de ligação ao antígeno do CAR de acordo com a presente invenção não reconhece um epítopo do domínio α1 de HLA-G.
[115] Em um aspecto, o anticorpo pode ligar-se especificamente às isoformas de HLA-G1 e HLA-G5. Então, o anticorpo não se liga substancialmente às outras isoformas de HLA-G, especialmente HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G6 e HLA-G7. Mais especificamente, o anticorpo é específico das isoformas de HLA-
G associadas a β2M. Neste contexto, o anticorpo não se liga substancialmente às isoformas de HLA-G1 e HLA-G5 desprovidas de β2M.
[116] É fornecido na presente invenção um anticorpo 15E7. Em particular, 15E7 é um anticorpo scFv tendo uma sequência de cadeia pesada como revelado em SEQ ID NO: 3 e uma sequência de cadeia leve, como revelado em SEQ ID NO:
4. Os CDRs do anticorpo 15E7 possuem as seguintes sequências, de acordo com Kabat: - CDR1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 11; - CDR2 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 12, - CDR3 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 13, - CDR1 da cadeia leve de SEQ ID NO: 14, - CDR2 da cadeia leve de SEQ ID NO: 15, e - CDR3 da cadeia leve de SEQ ID NO: 16.
[117] Consequentemente, a presente invenção refere-se a um anticorpo tendo (a) (i) uma cadeia pesada compreendendo CDR 1, 2 e 3 da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 e (ii) uma cadeia leve compreendendo CDR 1, 2 e 3 da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 4; (b) (i) uma cadeia pesada compreendendo CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 11, 12 e 13, respectivamente, e (ii) uma cadeia leve compreendendo CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 14, 15 e 16, respectivamente, opcionalmente em que cada CDR pode opcionalmente compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições, deleções ou inserções de aminoácidos; ou (c) uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve de SEQ ID NOS: 3 e 4 ou uma região variável da cadeia pesada tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a SEQ ID NOS: 3 e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a SEQ ID NO: 4.
[118] O referido anticorpo pode ser quimérico, humano ou humanizado. O referido anticorpo pode ser um fragmento de anticorpo selecionado a partir de Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab') 2, Fv, um diacorpo, um fragmento de anticorpo de cadeia única ou um anticorpo multiespecífico compreendendo vários fragmentos de anticorpo diferentes. O referido anticorpo pode ser conjugado ou covalentemente ligado a um agente tóxico ou a um marcador detectável.
[119] Em outro aspecto, o anticorpo pode ligar-se especificamente às isoformas de HLA-G2 e HLA-G6. Então, o anticorpo não se liga substancialmente às outras isoformas de HLA-G, especialmente isoformas associadas à subunidade β2M, tais como HLA-G1, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5 e HLA-G7. Mais especificamente, o anticorpo é específico das isoformas de HLA-G livres de β2M e se liga especificamente a ambas as isoformas HLA-G2 e HLA-G6 e/ou ambas as isoformas livres de HLA-G1-β2M e HLA-G5-β2M.
[120] É fornecido na presente invenção um anticorpo LFTT-1. Em particular, LFTT-1 é um anticorpo scFv tendo uma sequência de cadeia pesada como revelado em SEQ ID NO: 1 e uma sequência de cadeia leve, como revelado em SEQ ID NO: 2. Os CDRs do anticorpo LFTT-1 possuem as seguintes sequências, de acordo com Kabat: - CDR1 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 5; - CDR2 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 6, - CDR3 da cadeia pesada de SEQ ID NO: 7, - CDR1 da cadeia leve de SEQ ID NO: 8, - CDR2 da cadeia leve de SEQ ID NO: 9, e - CDR3 da cadeia leve de SEQ ID NO: 10.
[121] Consequentemente, a presente invenção refere-se a um anticorpo tendo (a) (i) uma cadeia pesada compreendendo CDR 1, 2 e 3 da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 1 e (ii) uma cadeia leve compreendendo CDR 1, 2 e 3 da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 2; (b) (i) uma cadeia pesada compreendendo CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 5, 6 e 7, respectivamente, e (ii) uma cadeia leve compreendendo CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 8, 9 e 10, respectivamente, opcionalmente em que cada CDR pode opcionalmente compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições, deleções ou inserções de aminoácidos; ou (c) uma região variável da cadeia pesada e uma região variável da cadeia leve de SEQ ID NOS: 1 e 2 ou uma região variável da cadeia pesada tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a SEQ ID NOS: 1 e uma região variável de cadeia leve tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2.
[122] O referido anticorpo pode ser quimérico, humano ou humanizado. O referido anticorpo pode ser um fragmento de anticorpo selecionado a partir de Fab, Fab', Fab'-SH, F (ab') 2, Fv, um diacorpo, um fragmento de anticorpo de cadeia única ou um anticorpo multiespecífico compreendendo vários fragmentos de anticorpo diferentes. O referido anticorpo pode ser conjugado ou covalentemente ligado a um agente tóxico ou a um marcador detectável.
[123] Em uma modalidade particular, o anticorpo é um anticorpo multiespecífico, preferencialmente um anticorpo biespecífico. Os anticorpos biespecíficos compreendem dois fragmentos F(ab) diferentes que reconhecem dois epítopos diferentes no mesmo ou em antígenos diferentes.
Particularmente, o anticorpo biespecífico de acordo com a presente invenção liga diferentes epítopos na(s) mesma(s) isoforma(s) de HLA-G ou diferentes isoformas de HLA-G. Preferencialmente, o anticorpo biespecífico liga-se especificamente a diferentes isoformas de HLA-G e compreende um F(ab) que reconhece as isoformas HLA-G/livres de β2M e um segundo F(ab) que reconhece as isoformas de HLA-G associadas ao domínio β2M.
[124] Em uma modalidade, o anticorpo biespecífico compreende um F(ab) que se liga especificamente às isoformas de HLA-G que são livres de β2M, preferencialmente a ambos HLA-G2 e HLA-G6 e/ou a ambos HLA-G1/livres de β2M e isoformas HLA -G5/livres de β2M, e um outro F(ab) que se liga especificamente às isoformas de HLA-G associadas com isoformas β2M, preferencialmente isoformas HLA-G1 e HLA-G5. Nesta modalidade particular, o anticorpo biespecífico compreende um F(ab) do anticorpo LFTT-1 com os CDRs descritos acima (SEQ ID NO. 5-10) e um F(ab) do anticorpo 15E7 com os CDRs descritos acima (SEQ ID NO. 11-16).
[125] Em outra modalidade, o anticorpo anti-HLA-G biespecífico compreende uma cadeia pesada contínua construída de um Fc (Hinge-CH2-CH3) seguido por uma cadeia pesada Fab (CH1-VH) do primeiro anticorpo (anticorpo 1) e a sucessiva cadeia pesada Fab (CH1-VH) de um segundo anticorpo (anticorpo 2), o último unido por uma sequência ligante polipeptídica. Durante a expressão da proteína, a cadeia pesada resultante se monta em dímeros enquanto as cadeias leves do anticorpo 1 e 2 (VL-CL) coexpressas se associam com suas cadeias pesadas cognatas para formar a molécula F(ab) '2-Fc final em tandem. Preferencialmente, o anticorpo 1 e o anticorpo 2 são diferentes, preferencialmente são o anticorpo LFTT-1 e o anticorpo 15E7, respectivamente.
[126] Em uma modalidade, o anticorpo ou fragmento do mesmo não se liga ou reconhece todas as isoformas de HLA-G. Particularmente, o anticorpo ou fragmento do mesmo que se liga especificamente a uma ou diversas, mas não a todas as isoforma(s) de HLA-G, tem uma constante de afinidade Kd de pelo menos 10-6 M. Em certos aspectos, o anticorpo ou fragmento do mesmo liga uma ou diversas, mas não todas as isoforma(s) de HLA-G com altas afinidades de pelo menos cerca de 10-7 M, e preferencialmente pelo menos cerca de 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M.
[127] Em uma modalidade particular, o anticorpo ou fragmento do mesmo não se liga ou reconhece o domínio alfa1 de isoformas de HLA-G. Isso significa que tal anticorpo ou fragmento do mesmo pode se ligar ou reconhecer isoformas de HLA-G sem domínio alfa-1, por exemplo isoformas de HLA-G, tal como descrito em Tronik-Le Roux et al., Molecular Oncology 11 (2017) 1561-1578, que contêm os domínios alfa2 e alfa3 ou apenas o domínio alfa3. Por exemplo, tal anticorpo ou fragmento do mesmo pode ligar o domínio alfa2, alfa3 ou β2M.
[128] A sequência do anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser usada em um método para preparar um CAR ou para preparar uma composição farmacêutica. Alternativamente, o anticorpo ou fragmento de anticorpo de acordo com a presente invenção pode ser usado para detectar isoforma(s) de HLA-G em testes de diagnóstico, tais como imunoensaios.
[129] Os anticorpos ou fragmentos de anticorpos podem ser identificados, por exemplo, por imunoensaios, tais como radioimunoensaios (RIAs), ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISAs) e ensaios de Ressonância Plasmática De Superfície (SPR) ou outras técnicas conhecidas pelos técnicos no assunto.
[130] Preferencialmente, os anticorpos (incluindo fragmentos de anticorpo do mesmo) que se ligam especificamente a uma ou diversas isoforma(s) de HLA- G não apresentam reação cruzada significativa com outros antígenos (ou seja, não são detectáveis em ensaios imunológicos de rotina). Um anticorpo se liga especificamente a um antígeno quando se liga ao antígeno com maior afinidade do que a qualquer antígeno de reação cruzada, como determinado usando técnicas experimentais, tal como Western blot (WB), radioimunoensaios (RIAs) e ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISAs), particularmente ELISA competitivo. Receptores de Antígenos Quiméricos (CARs) contra às isoformas de HLA-
G
[131] Um CAR tipicamente compreende um ectodomínio (domínio extracelular) e um endodomínio (domínio citoplasmático), preferencialmente unidos por um domínio de dobradiça e um domínio transmembrana. Particularmente, o CAR de acordo com a presente invenção compreende opcionalmente um ligante clivável e um repórter. O ectodomínio, expresso na superfície da célula, compreende um domínio de ligação ao antígeno ou domínio do receptor, opcionalmente um peptídeo sinal que direciona o domínio de ligação ao antígeno para o retículo endoplasmático para processamento. O domínio extracelular compreende um domínio de ligação ao antígeno que reconhece especificamente um antígeno alvo. Como um exemplo não limitativo, o domínio de ligação ao antígeno pode ser um anticorpo, preferencialmente um anticorpo de cadeia única, tal como um scFv. A região espaçadora liga o domínio de ligação ao antígeno ao domínio transmembrana e é projetada para ser suficientemente flexível para permitir que o domínio de ligação ao antígeno se oriente de uma maneira que permita o reconhecimento do antígeno. O domínio transmembrana é tipicamente uma hélice alfa hidrofóbica, tipicamente, que se estende através da bicamada lipídica da membrana celular. O endodomínio do CAR é composto por um peptídeo transmissor de sinal que espalha um sinal de ativação intracelularmente para o citoplasma da célula, estimulando assim a célula que expressa o CAR. O endodomínio pode incluir diversos domínios de sinalização, como explicado vide infra.
[132] Em algumas modalidades, um CAR compreende pelo menos um domínio de ligação ao antígeno extracelular, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização citoplasmático compreendendo um domínio de sinalização funcional derivado de uma molécula estimulatória e/ou coestimulatória como definido abaixo. Em algumas modalidades, o conjunto de polipeptídeos inclui um interruptor de dimerização que, mediante a presença de uma molécula de dimerização, pode acoplar os polipeptídeos uns aos outros, por exemplo, pode acoplar um domínio de ligação ao antígeno a um domínio de sinalização intracelular. Em um aspecto, o domínio de sinalização citoplasmática compreende adicionalmente um ou mais domínios de sinalização funcionais derivados de pelo menos uma molécula coestimulatória como definido abaixo.
[133] Em um aspecto, o CAR compreende uma proteína de fusão quimérica compreendendo um domínio de ligação ao antígeno extracelular, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização intracelular que compreende um domínio de sinalização funcional derivado de uma molécula estimulatória. Em um aspecto, o CAR compreende uma proteína de fusão quimérica compreendendo um domínio de ligação ao antígeno extracelular, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização intracelular compreendendo um domínio de sinalização funcional derivado de uma molécula coestimulatória e um domínio de sinalização funcional derivado de uma molécula estimulatória.
[134] Preferencialmente, o CAR compreende uma proteína de fusão quimérica compreendendo um domínio de ligação ao antígeno extracelular, opcionalmente um domínio de dobradiça, um domínio transmembrana e um domínio de sinalização intracelular compreendendo dois domínios de sinalização funcionais derivados de uma ou mais molécula(s) coestimulatório(es) e um domínio de sinalização funcional derivado de uma molécula estimulatória. Em um aspecto, o CAR compreende uma sequência líder opcional ou sequência de peptídeo sinal no terminal amino (N-ter) da proteína de fusão do CAR.
[135] Em uma modalidade particular, o CAR compreende ainda um ligante clivável e um repórter, para facilitar a identificação e seleção de células de expressão a partir da população de células buscadas para serem transfectadas com o CAR de acordo com a presente invenção, preferencialmente sequencialmente no terminal carbóxi (C-ter) da proteína de fusão CAR. De acordo com a presente invenção, o CAR manipulado tem um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito ou mais componentes e, em algumas modalidades, pelo menos um componente facilita o direcionamento ou a ligação da célula imune a isoform(a) HLA-G específica(s). Preferencialmente, este pelo menos um componente é derivado de um anticorpo monoclonal como definido na seção anterior. Preferencialmente, este componente é um scFv.
[136] Preferencialmente, o CAR anti-HLA-G sequencialmente compreende ou consiste em, do N ao C-terminal: opcionalmente, uma sequência de peptídeo sinal, um anticorpo anti-HLA-G ou fragmento do mesmo, preferencialmente um scFv anti-HLA-G, um domínio espaçador, um domínio transmembrana, pelo menos um domínio intracelular, um ligante clivável e um repórter CD19 humano truncado. Todos esses componentes serão descritos mais especificamente logo abaixo.
[137] Particularmente, o CAR de acordo com a presente invenção, particularmente o domínio de ligação ao antígeno, o anticorpo ou o scFv de acordo com a presente invenção, pode ligar especificamente uma a seis, preferencialmente duas a cinco, isoforma(s) de HLA-G, mais preferencialmente a uma ou duas isoforma(s) de HLA-G ou duas ou três isoformas de HLA-G, mas não se liga a todas as isoformas de HLA-G. Por exemplo, o CAR pode ligar especificamente uma, duas, três, quatro, cinco ou seis isoformas de HLA-G. As isoformas de HLA-G podem ser selecionadas a partir do grupo que consiste em HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6 e HLA-G7, preferencialmente de HLA-G1, HLA-G2, HLA-G5 e HLA-G6.
[138] Em um aspecto, o CAR pode ligar especificamente à isoformas de HLA-G associadas a β2M, tais como isoformas de HLA-G1 e HLA-G5. Então, o CAR não se liga substancialmente às outras isoformas de HLA-G, especialmente HLA- G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G6 e HLA-G7. Mais especificamente, o CAR é específico das isoformas de HLA-G associadas a β2M. Neste contexto, o CAR não se liga substancialmente às isoformas de HLA-G1 e HLA-G5 desprovidas de β2M.
[139] Em outro aspecto, o CAR pode ligar-se especificamente às isoformas de HLA-G2 e HLA-G6. Então, o CAR não se liga substancialmente às outras isoformas de HLA-G, especialmente HLA-G1, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5 e HLA-G7. Mais especificamente, o CAR é específico das isoformas de HLA-G livres de β2M e pode ligar-se especificamente a ambos HLA-G2 e HLA-G6 e/ou HLA-G1/livre de β2M e isoformas de HLA-G5/livres de β2M. Domínio de ligação ao antígeno
[140] O domínio externo do CAR de acordo com a presente invenção é um domínio de ligação ao antígeno. Particularmente, este domínio de ligação ao antígeno é derivado do anticorpo como definido na seção acima.
[141] O direcionamento de antígeno ou reconhecimento de antígeno por moléculas de CAR envolve mais comumente o uso de um fragmento variável de cadeia única (scFv) que foi montado a partir de um anticorpo monoclonal. No entanto, porções de direcionamento alternativas incluem ligantes (Altenschmidt et al. (1996) Clin. Cancer Res. 2: 1001-8; Muniappan, et al. (2000) Cancer Gene Ther. 7: 128-134), peptídeos (Pameijer et al. (2007) Cancer Gene Ther. 14:91-97), chimeric ligands (Davies et al. (2012) Mol. Med. 18:565-576), receptor derivatives (Zhang et al. (2012) J Immunol. 189:2290-9), and single domain antibodies
(Sharifzadeh et al. (2012) Cancer Res. 72: 1844-52). Qualquer anticorpo desejado ou fragmento de anticorpo do mesmo que especificamente reconhece e se liga a um antígeno alvo, em particular isoformas de HLA-G como definido acima, pode ser incorporado em um CAR de acordo com a presente invenção.
[142] Em uma modalidade, esse domínio de ligação ao antígeno é um anticorpo, preferencialmente um anticorpo de cadeia única. Preferencialmente, o anticorpo é um anticorpo humanizado ou um anticorpo murino não humanizado. Particularmente, tal domínio de ligação ao antígeno é um fragmento de anticorpo selecionado a partir de fragmentos de ligação a antígeno de fragmento (Fab), fragmentos F(ab') 2, fragmentos Fab', fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante (rlgG), fragmentos de anticorpo de cadeia única, variável de cadeia única fragmentos (scFv), anticorpos de domínio único (por exemplo, sdAb, sdFv, nanocorpo), fragmentos, diacorpos e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpos. Em modalidades particulares, os anticorpos são fragmentos de anticorpos de cadeia única compreendendo uma região variável da cadeia pesada e/ou uma região variável da cadeia leve, tal como scFv. Particularmente, tal domínio de ligação ao antígeno é selecionado a partir de um Fab e um scFv.
[143] Os fragmentos de anticorpos podem ser feitos por várias técnicas, incluindo, mas não limitado a, digestão proteolítica de um anticorpo intacto, assim como a produção por células hospedeiras recombinantes. Em algumas modalidades, os anticorpos são fragmentos produzidos de forma recombinante, tais como fragmentos compreendendo arranjos que não ocorrem naturalmente, tais como aqueles com duas ou mais regiões ou cadeias de anticorpos unidas por ligantes sintéticos, por exemplo, ligantes de peptídeo, e/ou que não podem ser produzidas por digestão enzimática de um anticorpo intacto de ocorrência natural. Em alguns aspectos, os fragmentos de anticorpo são scFvs.
[144] Em modalidades em que o domínio de direcionamento ao antígeno é um scFv, o scFv pode ser derivado das regiões da cadeia pesada variável (VH) e da cadeia leve variável (VL) de um mAb específico do antígeno ligado por um ligante flexível. O scFv retém a mesma especificidade e uma afinidade similar ao anticorpo completo a partir do qual foi derivado (Muniappan et al. (2000) Cancer Gene Ther. 7: 128-134). Vários métodos para preparar um scFv podem ser usados, incluindo métodos descritos em US 4.694.778; Bird et al. (1988) Science 242: 423-442; Ward et al. (1989) Nature 334: 54454; e Skerra et al. (1988) Science 242: 1038-1041. Em certas modalidades, o scFv pode ser um scFv humanizado ou totalmente humano.
[145] O domínio de ligação ao antígeno que se liga especificamente a uma isoforma particular de HLA-G pode apresentar reação cruzada com antígenos relacionados, por exemplo, com um a cinco, preferencialmente duas a quatro outras isoforma(s) diferentes de HLA-G.
[146] Em alguns aspectos, o domínio de ligação ao antígeno pode ser derivado de um anticorpo ou fragmento do mesmo que tem uma ou mais características funcionais especificadas, tais como propriedades de ligação, incluindo ligação a epítopos particulares, tais como epítopos que são similares ou se sobrepõem aos de outros anticorpos, a capacidade de competir pela ligação com outros anticorpos e/ou afinidades de ligação particulares. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno, os CARs que os compreendem e as células que compreendem esses CARs exibem uma preferência de ligação para as células que expressam o antígeno alvo em comparação com as células negativas para o antígeno alvo. Em algumas modalidades, a preferência de ligação é observada onde um grau significativamente maior de ligação é medido para a expressão do antígeno, em comparação com as células que não expressam. Em alguns casos, o grau total de ligação observada ao antígeno alvo ou às células que expressam o antígeno é aproximadamente o mesmo, pelo menos tão grande ou maior do que aquele observado para domínios específicos não antígenos, CARs ou células. Em qualquer uma das modalidades fornecidas, a comparação de propriedades de ligação, tal como afinidades ou competição, pode ser por meio de medição por ensaios conhecidos no estado da técnica, tal como mencionado acima.
[147] Em outra modalidade, o domínio de ligação ao antígeno do CAR se liga especificamente a uma ou diversas isoforma(s) de HLA-G com uma constante de afinidade Kd de pelo menos 10-6 M. Em certos aspectos, o domínio de ligação ao antígeno do CAR liga uma ou diversas isoforma(s) de HLA-G com altas afinidades de pelo menos cerca de 10-7 M, e preferencialmente pelo menos cerca de 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M. preferencialmente, o domínio de ligação ao antígeno do CAR liga uma ou diversas isoforma(s) de HLA-G com uma afinidade de cerca de 10-9 M.
[148] Em um aspecto, o fragmento de ligação ao antígeno do CAR pode se ligar especificamente a ambas HLA-G2 e HLA-G6 e/ou a ambas isoformas de HLA- G1/ livres de β2M e de HLA-G5/livres de β2M. Então, o fragmento de ligação ao antígeno do CAR não se liga substancialmente às outras isoformas de HLA-G, especialmente HLA-G1 e HLA-G5 isoformas associadas a β2M, HLA-G3, HLA-G4 e HLA-G7. Mais especificamente, o fragmento de ligação ao antígeno do CAR é específico das isoformas de HLA-G livres de β2M e não se liga substancialmente às isoformas de HLA-G associadas a β2M.
[149] Em uma modalidade particular, o fragmento de ligação ao antígeno do CAR compreende i) uma região variável da cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 1 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1; e/ou (ii) a região variável da cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 2 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a SEQ ID NO:
2.
[150] Em uma modalidade particular adicional, o fragmento de ligação ao antígeno do CAR compreende (i) uma cadeia pesada compreendendo CDR 1, 2 e 3 da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 1 e (ii) uma cadeia leve compreendendo CDR 1, 2 e 3 da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 2.
[151] Em uma modalidade particular, adicionalmente, o fragmento de ligação ao antígeno do CAR compreende (i) uma cadeia pesada compreendendo CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 5, 6 e 7, respectivamente, e (ii) uma cadeia leve compreendendo CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 8, 9 e 10, respectivamente, opcionalmente em que cada CDR pode opcionalmente compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições, deleções ou inserções de aminoácidos.
[152] Em outro aspecto, o fragmento de ligação ao antígeno do CAR pode ligar especificamente as isoformas de HLA-G associadas a β2M, tais como as isoformas HLA-G1 e HLA-G5. Então, o fragmento de ligação ao antígeno do CAR não se liga substancialmente às outras isoformas de HLA-G, especialmente isoformas livres β2M, tais como HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G6 e HLA-G7. Neste contexto, o fragmento de ligação ao antígeno do CAR não se liga substancialmente às isoformas HLA-G1 e HLA-G5 desprovidas de β2M.
[153] Em uma modalidade particular, o fragmento de ligação ao antígeno do CAR compreende i) uma região variável da cadeia pesada que compreende a SEQ ID NO: 3 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a SEQ ID NO: 3; e/ou (ii) a região variável da cadeia leve compreende a SEQ ID NO: 4 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a SEQ ID NO:
4.
[154] Em uma modalidade particular adicional, o fragmento de ligação ao antígeno do CAR compreende (i) uma cadeia pesada compreendendo CDR 1, 2 e 3 da região variável da cadeia pesada de SEQ ID NO: 3 e (ii) uma cadeia leve compreendendo CDR 1, 2 e 3 da região variável da cadeia leve de SEQ ID NO: 4.
[155] Em uma modalidade particular, adicionalmente, o fragmento de ligação ao antígeno do CAR compreende (i) uma cadeia pesada compreendendo CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 11, 12 e 13, respectivamente, e (ii) uma cadeia leve compreendendo CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 14, 15 e 16, respectivamente, opcionalmente em que cada CDR pode opcionalmente compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições, deleções ou inserções de aminoácidos.
[156] Particularmente, o fragmento de ligação ao antígeno do CAR não se liga ou reconhece todas as isoformas de HLA-G.
[157] Em uma modalidade, o fragmento de ligação ao antígeno do CAR não se liga ou reconhece o domínio alfa1 das isoformas de HLA-G. Isso significa que tal fragmento de ligação ao antígeno pode reconhecer isoformas de HLA-G sem domínio alfa-1, por exemplo isoformas de HLA-G, tal como descrito em Tronik- Le Roux et al., Molecular Oncology 11 (2017) 1561-1578 que contêm os domínios alfa2 e alfa3 ou apenas o domínio alfa3. Por exemplo, tal fragmento de ligação ao antígeno pode ligar o domínio alfa2, alfa3 ou β2M.
[158] Em uma modalidade particular, o domínio de ligação ao antígeno é um domínio de ligação ao antígeno multiespecífico, preferencialmente um domínio de ligação ao antígeno biespecífico. Por exemplo, o fragmento biespecífico de ligação ao antígeno compreende um domínio que reconhece as isoformas de HLA-G/livres de β2M e um segundo domínio que reconhece as isoformas de HLA-G associadas ao domínio β2M. Ainda mais preferencialmente, o domínio de ligação ao antígeno biespecífico compreende um domínio que se liga especificamente a ambos HLA-G2 e HLA-G6 e/ou a ambas isoformas de HLA- G1/livres de β2M e HLA-G5/livre de β2M e outro domínio que se liga especificamente às isoformas HLA-G1 e HLA-G5 associadas à subunidade β2M. Preferencialmente, o fragmento de ligação ao antígeno biespecífico é derivado do anticorpo LFTT-1 com as CDRs descritas acima (SEQ ID NO. 5-10) e do anticorpo 15E7 com as CDRs descritas acima (SEQ ID NO. 11-16).
[159] Em uma modalidade particular, o fragmento de ligação ao antígeno do CAR é um domínio de ligação ao antígeno biespecífico que compreende (i) um domínio compreendendo CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 11, 12 e 13, respectivamente, (ii) um domínio compreendendo CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 14, 15 e 16, respectivamente, (iii) um domínio compreendendo CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 5, 6 e 7, respectivamente, e (iv) um domínio compreendendo CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 8, 9 e 10, respectivamente, opcionalmente em que cada CDR pode, opcionalmente, compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições, deleções ou inserções de aminoácidos.
[160] Tal domínio de ligação ao antígeno biespecífico adequado para um CAR pode ser, por exemplo, scFv-tandem ou nanocorpos (De Munter et al., Molecular sciences 2018).
[161] Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno compreende um scFv que compreende as sequências CDR de um anticorpo monoclonal anti-HLA-G. Os CDRs podem ser determinados usando métodos convencionais. Os limites precisos da sequência de aminoácidos de uma dada CDR ou FR podem ser facilmente determinados usando qualquer um de inúmeros esquemas bem conhecidos, incluindo aqueles descritos por Kabat et al. (1991), "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. ("Kabat" numbering scheme), Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948 ("Chothia" numbering scheme), MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996), "Antibody-antigen transactions: Contact analysis and binding site topography," J. Mol. Biol. 262, 732-745." ("Contact" numbering scheme), Lefranc MP et al, "IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains”, Dev Comp Immunol, 2003 January; 27 (l): 55-77 ("IMGT" numbering scheme), e Honegger A e Pluckthun A, "Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool", J Mol Biol, Jun. 8 de 2001; 309 (3): 657-70, ("Aho" numbering scheme).
[162] Em modalidades específicas, o domínio de ligação ao antígeno é um fragmento variável de cadeia única (scFv). O scFv também pode compreender um ligante peptídico. O ligante de peptídeo conectando domínios de scFv VH e VL une o terminal carboxila de um domínio da região variável ao terminal amino do outro domínio variável sem comprometer a fidelidade dos sítios de VH–Veu de pareamento e de ligação do antígeno. Os ligantes peptídicos podem variar de 10 a 30 aminoácidos de comprimento. Em uma modalidade, o ligante peptídico scFv é um ligante Gly/Ser e compreende uma ou mais repetições da sequência de aminoácidos Gly-Gly-Gly-Ser ou Gly-Gly-Gly-Gly-Ser. Em uma modalidade, o ligante polipeptídico flexível inclui, mas não está limitado a (Gly 3Ser)3 e (Gly4Ser)3. Domínio transmembrana e de dobradiça Domínio de dobradiça
[163] Quando uma célula T interage com uma célula apresentadora de antígeno, uma sinapse imunológica com uma distância intermembranar de cerca de 15 nm é formada. Essa distância é ditada pela arquitetura do TCR e do complexo peptídeo-MHC. Esta separação espacial é importante para o desencadeamento eficaz da cascata de fosforilação e ativação de células T. Quando encurtada artificialmente, essa proteína tem a chance de permanecer dentro da sinapse, resultando na supressão dos sinais de ativação.
[164] Dado que a posição do epítopo reconhecido por um scFv específico na superfície da célula alvo é geralmente fixa, o comprimento e a rigidez do espaçador extracelular (o módulo de dobradiça) no CAR precisam ser ajustados para garantir compatibilidade estérica máxima com o scFv e a formação de uma sinapse compacta. Em alguns aspectos, uma porção da região constante de imunoglobulina serve como uma região espaçadora entre o domínio de ligação ao antígeno, por exemplo, scFv e domínio transmembrana. O espaçador pode ter um comprimento que proporcione maior responsividade da célula após a ligação ao antígeno, em comparação com a ausência do espaçador. O domínio espaçador preferencialmente tem uma sequência que promove a ligação de um CAR com um antígeno e aumenta a sinalização em uma célula. Exemplos de um aminoácido que se espera que promova a ligação incluem cisteína, um aminoácido carregado e serina e treonina em um sítio de glicosilação potencial, e esses aminoácidos podem ser usados como um aminoácido que constitui o domínio espaçador.
[165] Em algumas modalidades, o CAR compreende uma sequência de dobradiça entre o domínio de ligação ao antígeno e o domínio transmembrana e/ou entre o domínio transmembrana e o domínio citoplasmático. O domínio de dobradiça pode ter até 150 aminoácidos, preferencialmente 10 a 100 aminoácidos, ainda mais preferencialmente 50 a 100 aminoácidos de comprimento. Um técnico no assunto apreciará que uma sequência de dobradiça é uma sequência curta de aminoácidos que facilita a flexibilidade (ver,
por exemplo, Woof et al, Nat. Rev. Immunol, 4 (2): 89-99 (2004)). A sequência de dobradiça pode ser qualquer sequência adequada derivada ou obtida a partir de qualquer molécula adequada. Em algumas modalidades, o comprimento da sequência de dobradiça pode ser otimizado com base na distância entre o CAR e o epítopo de ligação, por exemplo, dobradiças mais longas podem ser ideais para epítopos proximais da membrana.
[166] A dobradiça pode ser derivada de ou incluir pelo menos uma porção de uma região Fc de imunoglobulina, por exemplo, uma região Fc de IgG1, uma região Fc de IgG2, uma região Fc de IgG3, uma região Fc de IgG4, uma região Fc de IgE, uma região Fc de IgM, ou uma região Fc de IgA. Em certas modalidades, o domínio de dobradiça inclui pelo menos uma porção de uma região Fc de imunoglobulina IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgE, IgM ou IgA que cai dentro de seus domínios CH2 e CH3. Em algumas modalidades, o domínio espaçador também pode incluir pelo menos uma porção de uma região de dobradiça de imunoglobulina correspondente. Em algumas modalidades, a dobradiça é derivada de ou inclui pelo menos uma porção de uma região Fc de imunoglobulina modificada, por exemplo, uma região Fc de IgG1 modificada, uma região Fc de IgG2 modificada, uma região Fc de IgG3 modificada, uma região Fc de IgG4 modificada, uma região Fc de IgE modificada, região Fc de IgM modificada ou região Fc de IgA modificada. A região Fc de imunoglobulina modificada pode ter uma ou mais mutações (por exemplo, mutações pontuais, inserções, deleções, duplicações), resultando em uma ou mais substituições, modificações ou deleções de aminoácidos que causam ligação prejudicada do domínio espaçador a um receptor Fc (FcR). Em alguns aspectos, a região Fc de imunoglobulina modificada pode ser projetada com uma ou mais mutações que resultam em uma ou mais substituições, modificações ou deleções de aminoácidos que causam ligação prejudicada do domínio espaçador a um ou mais FcR incluindo, mas não limitado a, FcyRI, FcyR2A, FcyR2Bl, FcyR2B2, FcyR3A, FcyR3B, FcsRI, FcsR2, FcaRI, Fca/μΚ ou FcRn.
[167] Dobradiças exemplificativas incluem, mas não estão limitadas a, uma dobradiça de CD8a, uma dobradiça de CD28, sequências de IgG1/IgG4 (parte da dobradiça-Fc) (em estudos únicos, CD4, CD7 e IgD) dobradiça IgG4 sozinha, dobradiça IgG4 ligada a domínios CH2 e CH3, ou dobradiça de IgG4 ligada ao domínio CH3, aqueles descritos em Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19: 3153, publicação do pedido de patente internacional número WO2014031687, Pat. No. 8.822.647 ou pedido publicado No. US2014/0271635. Como domínio de dobradiça, a presente invenção refere-se a todos ou parte dos resíduos 118 a 178 de CD8a (GenBank No. de acesso NP_001759.3), resíduos 135 a 195 de CD8 (GenBank No. de acesso AAA35664), resíduos 315 a 396 de CD4 (GenBank No. de acesso NP_000607.1), ou os resíduos 137 a 152 de CD28 (GenBank No. de acesso NP_006130.1). Também, como o domínio espaçador, uma parte de uma região constante de uma cadeia H ou cadeia L do anticorpo (região CHI ou região CL) pode ser usada. Adicionalmente, o domínio espaçador pode ser uma sequência sintetizada artificialmente. Particularmente, o CAR de acordo com a presente invenção compreende uma dobradiça selecionada a partir de sequências de CD8a, CD28 e IgG1/IgG4 (parte da dobradiça-Fc) (em estudos únicos, CD4, CD7 e IgD). Essa escolha é baseada no fato de que essas sequências são relativamente neutras, flexíveis e foram bem caracterizadas estruturalmente.
[168] Preferencialmente, o domínio de dobradiça compreende ou consiste em (i) dobradiça de CD28, (ii) dobradiça de CD8 alfa, (iii) um domínio de dobradiça de IgG4 humana, (iv) um domínio de dobradiça de IgG4 humana e um domínio CH3 de IgG4 humana ou (v) a domínio CH2 mutado de lgG4 humana, um domínio de dobradiça de IgG4 humana e um domínio de dobradiça CH3 de
IgG4 humana. Ainda mais preferencialmente, o domínio de dobradiça compreende ou consiste em (a) SEQ ID NO: 18, (b) SEQ ID 19, (c) SEQ ID NO: 25, (d) SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 27, ou (e) SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27, ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a mesma.
[169] Em uma modalidade, o domínio de dobradiça compreende ou consiste em (i) um domínio de dobradiça de IgG4 humana, (ii) um domínio de dobradiça de IgG4 humana e um domínio CH3 de IgG4 humana ou (iii) um domínio CH2 mutado de IgG4 humana, um domínio de dobradiça de IgG4 humana e um domínio de dobradiça CH3 de IgG4 humana. Particularmente, o domínio de dobradiça sequencialmente compreende ou consiste no N-terminal ao C-terminal de (i) um domínio de dobradiça de IgG4 humana e um domínio CH3 de IgG4 humana ou (ii) um domínio CH2 mutado de IgG4 humana, um domínio de dobradiça de IgG4 humana e um domínio de dobradiça CH3 de IgG4 humana.
[170] Em uma modalidade, o CAR de acordo com a presente invenção compreende um domínio espaçador que compreende ou consiste em um domínio de dobradiça de IgG4 humana que compreende ou consiste na sequência apresentada em SEQ ID NO: 25 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade com ela.
[171] Em outra modalidade, o CAR de acordo com a presente invenção compreende um domínio espaçador que compreende ou consiste em (i) um domínio CH3 de lgG4 humana que compreende ou consiste na sequência apresentada em SEQ ID NO: 27 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade com ela e (ii) um domínio de dobradiça de IgG4 humana que compreende ou consiste na sequência apresentada em SEQ ID NO: 25 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90, 95%, 96%, 97%, 98%,
99% de identidade com ela.
[172] Em uma modalidade, o CAR de acordo com a presente invenção compreende ainda o domínio CH2 mutado de IgG4 humana, em que a mutação no domínio CH2 de IgG4 humana consiste na mutação dos aminoácidos EFLG (113-116) PVA e N177Q, por exemplo, como revelado em Watanabe et al. Oncoimmunology. 2016; 5 (12): e1253656. Preferencialmente, o domínio CH2 mutado de IgG4 humana compreende ou consiste na sequência apresentada em SEQ ID NO: 26 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade com ela.
[173] Em uma modalidade preferida, o CAR de acordo com a presente invenção compreende um domínio de dobradiça que sequencialmente compreende ou consiste em (i) um domínio CH2 mutado de IgG4 humana compreende ou consiste na sequência apresentada em SEQ ID NO: 26 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade com ela, (ii) um domínio CH3 de lgG4 humana que compreende ou consiste na sequência apresentada em SEQ ID NO: 27 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade com ela e (iii) um domínio de dobradiça de IgG4 humana que compreende ou consiste na sequência apresentada em SEQ ID NO: 25 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de identidade com ela.
[174] Particularmente, o CAR de acordo com a presente invenção compreende um domínio de dobradiça de CD8a, preferencialmente compreendendo ou consistindo na sequência de SEQ ID NO: 18 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com ela.
[175] Outro CAR particular de acordo com a presente invenção compreende um domínio de dobradiça de CD28, preferencialmente compreendendo ou consistindo na sequência de SEQ ID NO: 19 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com ela. Domínio transmembrana
[176] O módulo transmembrana funciona para ancorar o receptor na superfície da célula. Com relação ao domínio transmembrana, o CAR pode ser projetado para compreender um domínio transmembrana que é fundido ao domínio de ligação ao antígeno do CAR. Particularmente, o CAR pode ser projetado para compreender um domínio transmembrana que é fundido tanto ao domínio de ligação ao antígeno quanto ao endodomínio do CAR.
[177] Em uma modalidade, o domínio transmembrana que naturalmente está associado a um dos domínios no CAR é usado. Em alguns casos, o domínio transmembrana pode ser selecionado ou modificado por substituição de aminoácidos para evitar a ligação de tais domínios aos domínios transmembrana das mesmas ou diferentes proteínas de superfície de membrana para minimizar as interações com outros membros do complexo receptor. O domínio transmembrana pode ser derivado de uma fonte natural ou sintética. Quando a fonte é natural, o domínio pode ser derivado de qualquer proteína ligada à membrana ou transmembrana. Normalmente, o domínio transmembrana denota uma única hélice transmembrana de uma proteína transmembrana, também conhecida como uma proteína integral. Este domínio geralmente inclui as sequências transmembrana de CD3ζ, CD28, CD8, FcRIγ e, menos frequentemente, de CD4, CD7, OX40 e MHC (H2-Kb), a escolha dependendo do espaçador vizinho e das sequências intracelulares. Os módulos transmembrana baseados em CD3ζ e FcRIγ garantem a incorporação eficiente do CAR no TCR endógeno. Por exemplo, o CAR de WO 2008/045437 descreve uma porção transmembrana derivada de CD8 alfa ou CD28 humano, e particularmente proteínas receptoras de células T quiméricas com uma região de dobradiça CD8 não modificada com posições de aminoácidos 135 a 205, 135 a 203 ou 135 a 182
(de acordo com a numeração de aminoácidos de UniProtKB/Swiss-Prot P01732), cada um compreendendo resíduos de cisteína nas posições 164 e 181. WO 95/30014 usa a região de dobradiça de CD8 de murino não modificada com as posições de aminoácidos 132 a 191 (de acordo com a numeração de aminoácidos de UniProtKB/Swiss-Prot P01731), compreendendo um resíduo de cisteína na posição 178. Em particular, US 2008/0260738 usa regiões de dobradiça CD8 modificadas com posições de aminoácidos 131 a 170 ou 136 a 169 (de acordo com a numeração de aminoácidos de UniProtKB/Swiss-Prot P01732), em que a cisteína na posição 164 é substituída por serina. Portanto, seria conhecido pelo técnico no assunto, qual domínio transmembrana escolher de acordo com as características dos domínios CAR.
[178] As regiões transmembrana de uso particular nesta presente invenção podem ser derivadas de (ou seja, compreende pelo menos a(s) região(ões) transmembrana de) CD28, CD3ε, CD4, CD5, CD8, CD9, CD 16, CD22, CD33, CD37, CD45, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154, TCR , TCRβ, H2-Kb, FcsRIy, GITR ou CD3ζ e/ou regiões transmembrana contendo variantes funcionais das mesmas, tais como aquelas que retêm uma porção substancial da estrutura, por exemplo, transmembrana, propriedades dos mesmo podem ser usadas. Ver, por exemplo, Kahlon et al. (2004) Cancer Res. 64: 9160-9166; Schambach et al. (2009) Methods Mol. Biol. 506: 191-205; Jensen et al. (1998) Biol. Blood Marrow Transplant 4:75-83; Patel et al. (1999) Gene Ther. 6: 412; Song et al. (2012) Blood 119: 696-706; Carpenito et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106: 3360-5; Hombach et al. (2012) Oncoimmunology 1: 458-66) e Geiger et al. (2001) Blood 98: 2364-71.
[179] Alternativamente, o domínio transmembrana pode ser sintético, caso em que compreenderá predominantemente resíduos hidrofóbicos, tais como leucina e valina. Preferencialmente, um tripleto de fenilalanina, triptofano e valina será encontrado em cada extremidade de um domínio transmembrana sintético. Um domínio transmembrana da presente invenção é termodinamicamente estável em uma membrana. Pode ser uma única alfa hélice, um barril beta transmembrana, uma beta hélice de gramicidina A ou qualquer outra estrutura.
[180] Opcionalmente, um ligante oligo- ou polipeptídico curto, preferencialmente entre 2 e 10 aminoácidos de comprimento, pode formar a ligação entre o domínio transmembrana e o(s) domínio(s) de sinalização intracelular(es) do CAR. Um dupleto de glicina-serina pode fornecer um ligante adequado.
[181] Em uma modalidade, o domínio transmembrana do CAR é selecionado a partir do domínio transmembrana CD3ζ, CD28, CD8, FcRIγ CD4, CD, OX40 e MHC (H2-Kb). Preferencialmente, o domínio transmembrana do CAR de acordo com a presente invenção é selecionado a partir do domínio transmembrana CD8 e CD28. Ainda mais preferencialmente, o domínio transmembrana do CAR de acordo com a presente invenção é um domínio transmembrana CD28, preferencialmente compreendendo ou consistindo na sequência de SEQ ID NO: 20 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com ela. Domínio intracelular
[182] Em certas modalidades, um domínio de sinalização citoplasmático ou intracelular, tal como aqueles derivados da cadeia ζ do receptor de células T, é empregado como pelo menos parte do receptor quimérico a fim de produzir sinais estimuladores para a proliferação de linfócitos T e função efetora após o engajamento de o receptor quimérico com o antígeno alvo.
[183] O papel do módulo de sinalização dos CARs é transduzir o sinal de ativação para uma célula imune assim que o domínio extracelular tiver reconhecido o antígeno. Em células T, a ativação começa com a fosforilação do motivo de ativação do imunorreceptor basedo em tirosina (ITAMs) na porção citoplasmática da subunidade CD3ζ do complexo TCR. Assim, na maioria dos projetos de CAR implementados até o momento, as sequências de sinalização de CD3ζ são usadas como um módulo que dispara a atividade lítica celular.
[184] CARs de primeira geração, que continham apenas a cadeia CD3ζ, enviavam exclusivamente o sinal de ativação para a célula. Isso levou a uma reação citotóxica contra as células tumorais, mas não forneceu uma proliferação aumentada de células CAR T ativadas. Em princípio, o sinal de proliferação poderia ser potencialmente fornecido pelos correceptores nativos presentes nas células CAR T; no entanto, muitos tumores não expressam os ligantes correspondentes. Assim, os CARs de segunda geração compreendem um domínio citoplasmático contendo adicionalmente o domínio CD28 coestimulatório, fundido junto com CD3ζ, para superar esta dificuldade. Este projeto CAR fornece sinal de ativação e proliferação para a célula T; como resultado, a célula é ativada, destrói a célula alvo e se prolifera. Além de CD28, sequências de sinalização de receptores coestimulatórios, tais como CD134 (TNFRSF4, OX40), CD154 (CD40L), CD137 (4-1BB), ICOS (CD278), CD27, CD244 (2B4), foram testadas com sucesso em CARs.
[185] A terceira geração de CARs é baseada na combinação de duas ou mais sequências coestimulatórias (tal como 4-1BB-CD28-CD3ζ). Esses receptores secretam uma faixa mais ampla de citocinas (incluindo TNFα, GM-CSF e IFNγ), são menos suscetíveis à morte celular induzida por ativação e mostram maior eficácia na eliminação de tumor em modelos de camundongo. Um ou vários endodomínios podem ser empregados, já que os chamados CARs de terceira geração têm pelo menos 2 ou 3 domínios de sinalização fundidos para efeito aditivo ou sinérgico, por exemplo.
[186] O CAR da presente invenção pode ser um CAR de primeira geração, uma segunda geração ou um CAR de terceira geração, como descrito acima. Preferencialmente, o CAR é um CAR de segunda ou terceira geração. Ainda mais preferencialmente, o CAR é um CAR de terceira geração quando expresso por uma célula T e um CAR de primeira geração quando expresso por uma célula NK ou NKT.
[187] Em algumas modalidades, o endodomínio de sinalização intracelular transmite um sinal para uma célula quando o domínio de direcionamento de antígeno extracelular presente dentro da mesma molécula se liga a um antígeno.
[188] A ativação de células T é transmitida por dois tipos diferentes de endodomínios de sinalização citoplasmática, ou seja, uma sequência para iniciar a ativação primária dependente de antígeno por meio de um complexo TCR (endodomínio de sinalização citoplasmática primário) e uma sequência para atuar antígeno independentemente para fornecer um sinal secundário ou coestimulatório (endodomínio de sinalização citoplasmática secundária ou endodomínio coestimulatório). Portanto, enquanto algumas modalidades abrangem um CAR com apenas um endodomínio de sinalização citoplasmática primário, em outras modalidades, um CAR da presente invenção inclui um endodomínio de sinalização primário e um endodomínio de sinalização citoplasmático secundário.
[189] O domínio de sinalização intracelular do CAR da presente invenção desencadeia ou induz a ativação de pelo menos uma das funções efetoras normais da célula imune na qual o CAR foi colocado. O termo "função efetora" refere-se a uma função especializada de uma célula. A função efetora de uma célula T pode ser, por exemplo, atividade citolítica ou atividade auxiliar, incluindo a secreção de citocinas. Embora normalmente todo o domínio de sinalização intracelular possa ser empregado, em muitos casos não é necessário usar toda a cadeia. Na medida em que uma porção truncada do domínio de sinalização intracelular é usada, tal porção truncada pode ser usada no lugar da cadeia intacta, desde que transduza o sinal da função efetora. O termo domínio de sinalização intracelular pretende, portanto, incluir qualquer porção truncada do domínio de sinalização intracelular suficiente para transduzir o sinal da função efetora.
[190] Exemplos de sequências de domínio intracelular que são de uso particular na presente invenção incluem aquelas derivadas de um domínio de sinalização intracelular de uma cadeia de receptor de linfócitos, um complexo proteico TCR/CD3, uma subunidade de receptor Fc, uma subunidade de receptor de IL-2, CD3ζ, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d, CD278 (ICOS), FcsRI, DAP10 e DAP12. É particularmente preferido que o domínio de sinalização intracelular no CAR da presente invenção compreenda uma sequência sinalização citoplasmática derivada de CD3ζ. Especificamente, os exemplos do ITAM incluem resíduos 51 a 164 de CD3 (GenBank No. de acesso NP_932170), resíduos 45 a 86 de FcsRIy (GenBank No. de acesso NP_004097), resíduos 201 a 244 de FcsRi (GenBank No. de acesso NP_000130), resíduos 139 a 182 de CD3y (No. de Acesso do GenBank NP_000064), resíduos 128 a 171 de CD35 (No. de Acesso do GenBank NP_000723), resíduos 153 a 207 de CD3s (No. de Acesso do GenBank NP_000724), resíduos 402 a 495 de CD5 (Acesso do GenBank No. NP_055022), resíduos 707 a 847 de CD22 (No. de acesso GenBank NP_001762), resíduos 166 a 226 de CD79a (No. de acesso GenBank NP_001774), resíduos 182 a 229 de CD79b (No. de acesso GenBank NP_000611) e resíduos 177 a 252 de CD66d (GenBank No. de Acesso NP_001806), e suas variantes. Os resíduos referenciados são baseados nas informações da sequência de aminoácidos do GenBank e no comprimento total do precursor (incluindo uma sequência de peptídeo sinal, etc.) de cada proteína. Exemplos preferidos de domínios de sinalização intracelular para uso no CAR da presente invenção incluem as sequências citoplasmáticas do receptor de células T (TCR) e co- receptores que atuam em conjunto para iniciar a transdução de sinal após o envolvimento do receptor de antígeno, bem como qualquer derivado ou variante dessas sequências e qualquer sequência sintética que tenha a mesma capacidade funcional.
[191] Em uma modalidade preferida, o domínio citoplasmático do CAR pode ser projetado para compreender o domínio de sinalização de CD3ζ por si só ou combinado com qualquer outro domínio citoplasmático desejado(s) útil no contexto do CAR da presente invenção. Em um aspecto particular, o CAR da presente invenção compreende o domínio de sinalização de CD3ζ, preferencialmente compreendendo ou consistindo na sequência de SEQ ID NO: 22 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com ela.
[192] O domínio citoplasmático do CAR pode compreender uma porção da cadeia CD3ζ e uma região de sinalização coestimulatória. A região de sinalização coestimulatória refere-se a uma porção do CAR que compreende o domínio intracelular de uma molécula coestimulatória.
[193] Exemplos de moléculas coestimulatórias que podem ser usadas na presente invenção incluem uma molécula MHC de classe I, proteínas receptoras de TNF, proteínas semelhantes a imunoglobulinas, receptores de citocinas, integrina, moléculas de sinalização de ativação linfocítica (proteínas SLAM), ativadores de receptores de células NK, um ligante do receptor Toll, B7-H3, BAFFR, BTLA, BLAME (SLAMF8), CD2, CD4, CD5, CD7, CD8a, CD8, CDl la, LFA-1 (CDl la/CD18), CDl lb, CDl lc, CDl ld, CD18, CD19, CD19a, CD27, CD28, CD29, CD30, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD84, CD96 (Tátil), CD100 (SEMA4D), CD103, CRTAM, OX40 (CD134), 4-1BB ( CD137), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), CD160
(BY55), SELPLG (CD162), DNAM1 (CD226), Ly9 (CD229), SLAMF4 (CD244, 2B4), ICOS (CD278), CEACAM1, CDS, CRTAM, DAP10, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1, IL2Rβ, IL2Rγ, IL7Ra, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB1, ITGB2, ITGB7, KIRDSFA2, LAT -1, LIGHT, LTBR, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), PAG/Cbp, PD-1, PSGLI, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAM F7, SLP-76, TNFR2, TRANCE/RANKL, VLA-I, VLA-6, um ligante que se liga especificamente a CD83 e semelhantes.
[194] Ligantes estimuladores são bem conhecidos no estado da técnica e abrangem, inter alia, uma molécula MHC de Classe I carregada com um peptídeo, um anticorpo anti-CD3, um anticorpo superagonista anti-CD28 e um anticorpo superagonista anti-CD2.
[195] Em uma modalidade, os domínios de sinalização intracelular compreendem pelo menos um domínio intracelular selecionado a partir de um domínio de sinalização intracelular de uma cadeia de receptor de linfócitos, um complexo proteico TCR/CD3, uma subunidade de receptor Fc, uma subunidade de receptor de IL-2, CD3, FcRγ, FcRβ, CD3γ, CD3δ, CD3ε, CD5, CD22, CD79a, CD79b, CD66d, CD278 (ICOS), FcsRI, DAP10 e DAP 12.
[196] Em uma modalidade, o domínio coestimulatório do CAR de acordo com a presente invenção é selecionado a partir de CD28, CD134 (TNFRSF4, OX40), CD154 (CD40L), CD137 (4-1BB), ICOS (CD278), CD27, CD244 (2B4), CD149, DAP10, CD30, IL2-R, IL7r6, IL21-R, NKp30, NKp44, CD27 e DNAM-1. Esses diferentes domínios coestimulatórios produzem diferentes perfis de citocinas que, por sua vez, podem produzir efeitos na citotoxicidade mediada por células alvo e no microambiente tumoral. Particularmente, o domínio coestimulatório é fundido junto com CD3ζ. Em uma modalidade, o domínio coestimulatório do CAR de acordo com a presente invenção é selecionado a partir de CD28, 4-1BB e OX40.
[197] Embora qualquer endodomínio adequado possa ser usado no CAR da presente invenção, em certas modalidades, a presente invenção contempla especificamente o uso de todos ou parte dos endodomínios de 4-1BB e CD3ζ como o domínio intracelular. As sequências de sinalização citoplasmática dentro do domínio de sinalização intracelular do CAR da presente invenção podem ser ligadas umas às outras em uma ordem aleatória ou especificada. Em um CAR contendo mais que um endodomínio intracelular, um ligante oligopeptídico, como descrito acima, ou um ligante polipeptídico pode ser inserido entre os endodomínios intracelulares para ligar os domínios. Opcionalmente, um ligante oligo- ou polipeptídico curto, preferencialmente entre 2 e 10 aminoácidos de comprimento, pode formar a ligação. Um dupleto de glicina-serina ou sequência contínua fornece um ligante particularmente adequado. Particularmente, o ligante de peptídeo pode ser um ligante (Gly)3-Ser ou qualquer repetição do mesmo, tal como dupletos ou tripletos dos mesmos.
[198] Como usado na presente invenção, o termo "região de sinalização coestimulatória 4-1BB" refere-se a um fragmento de proteína específico associado a este nome e quaisquer outras moléculas que têm função biológica análoga que compartilham pelo menos 70% ou, alternativamente, pelo menos 80% da identidade de sequência de aminoácidos, preferencialmente 90% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 95% de identidade de sequência com a sequência da região de sinalização coestimulatória 4-1BB como mostrado em SEQ ID NO: 21. As sequências de exemplo da região de sinalização coestimulatória 4-1BB são fornecidas em US 20130266551A1.
[199] Exemplos de sequências de domínio de sinalização coestimulatória de CD28 são fornecidos na Pat. No. 5.686.281; Geiger, TL et al., Blood 98: 2364-2371 (2001); Hombach A. et al., J Immunol 167: 6123-6131 (2001); Maher J. et al. Nat Biotechnol 20: 70-75 (2002); Haynes NM et al., J Immunol 169: 5780-5786
(2002); Haynes NM et al., Blood 100: 3155-3163 (2002).
[200] Sequências de exemplo não limitantes da região de sinalização coestimulatória OX40 são reveladas em US 2012/20148552 A1.
[201] Em uma modalidade particular, o CAR da presente invenção compreende uma região de sinalização coestimulatória 4-1BB, preferencialmente compreendendo ou consistindo na sequência de SEQ ID NO: 21 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com ela. Peptídeo Sinal
[202] Além do domínio de direcionamento do antígeno, domínio de dobradiça, domínio transmembrana e endodomínio de sinalização, o CAR da presente invenção pode compreender, adicionalmente, uma sequência de peptídeo sinal ligada ao N-terminal do CAR. As sequências de peptídeos sinal existem no N-terminal de muitas proteínas secretoras e proteínas de membrana e têm tipicamente um comprimento de 15 a 30 aminoácidos. Uma vez que muitas das moléculas de proteína mencionadas acima têm sequências de peptídeos sinal, esses peptídeos sinal podem ser usados como um peptídeo sinal para o CAR da presente invenção.
[203] Em uma modalidade, a sequência que compreende o domínio de ligação ao antígeno compreende, adicionalmente, um peptídeo sinal. Em modalidades em que o domínio de ligação ao antígeno compreende um fragmento de ligação ao antígeno, preferencialmente um scFv, o peptídeo sinal pode ser posicionado no terminal amino do fragmento de ligação ao antígeno ou scFv. Em algumas modalidades, quando a região variável da cadeia pesada é N- terminal, o peptídeo sinal pode ser posicionado no terminal amino da região variável da cadeia pesada. Em algumas modalidades, quando a região variável da cadeia leve é N-terminal, a sequência líder pode ser posicionada no terminal amino da região variável da cadeia leve. A sequência líder pode compreender qualquer sequência sinal adequada. Em uma modalidade, o CAR da presente invenção, preferencialmente o anticorpo ou o fragmento de ligação ao antígeno, ainda mais preferencialmente o scFv, compreende um peptídeo sinal selecionado a partir do grupo que consiste em CD8a, um peptídeo sinal de Ig Kappa de camundongo, um peptídeo sinal de IgG4 humana, um peptídeo sinal de IL2, um peptídeo sinal de IgG2 humana e um peptídeo sinal Gaussia luc. Em uma modalidade, o CAR da presente invenção, preferencialmente o scFv, compreende um peptídeo sinal selecionado a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 17, 24, 75, 76, 77 e 78.
[204] Em uma modalidade particular, o CAR da presente invenção compreende um peptídeo sinal CD8a, preferencialmente compreendendo ou consistindo na sequência de SEQ ID NO: 17 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com ela. Ligante clivável
[205] Em uma modalidade particular, o CAR de acordo com a presente invenção compreende ainda um ligante clivável. O ligante clivável pode ser um peptídeo, um polipeptídeo ou uma parte de um polipeptídeo, que é clivado após a geração da proteína ou polipeptídeo, particularmente, após a tradução do CAR de acordo com a presente invenção.
[206] Particularmente, o ligante clivável é um peptídeo ou ligante autoclivável, de autoclivagem, sendo estes termos usados indistintamente na presente invenção.
[207] Em uma modalidade, o ligante clivável compreende um peptídeo 2A. Sequências "2A" ou "semelhantes a 2A" são parte de uma grande família de peptídeos que podem causar salto de ligação peptídica. Particularmente, o mecanismo de "autoclivagem" mediada por 2A foi recentemente descoberto como sendo o ribossomo que pula a formação de uma ligação de peptídeo glicil- prolil no C-terminal do peptídeo 2A. A clivagem mediada pelo peptídeo 2A começa após a tradução. O salto bem-sucedido e o reinício da tradução resultam em duas proteínas "clivadas": a proteína a montante de 2A é fixada ao peptídeo 2A completo, exceto para a prolina C-terminal, e a proteína a jusante de 2A é fixada a uma prolina no N -terminal. O salto bem-sucedido, mas a queda do ribossomo e a tradução descontinuada resultam apenas na proteína a montante de 2A. Vários peptídeos 2A foram identificados em picornavírus, vírus de inseto e rotavírus do tipo C.
[208] Exemplos de ligante clivável de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitados a, teschovírus suíno-1 2A (P2A), FMDV 2A (F2A); vírus da rinite A equina (ERAV) 2A (E2A); e vírus Thosea asigna 2A (T2A), vírus da poliedrose citoplasmática 2A (BmCPV2A) e vírus flacherie 2A (BmIFV2A), ou uma combinação dos mesmos, por exemplo, tal como descrito em Kim et al. (2011) PLoS ONE 6 (4): el8556 e em Liu et al (2017) Sci Rep. 2017; 7: 2193.
[209] Preferencialmente, o ligante clivável é P2A, que compreende ou consiste na sequência apresentada em SEQ ID NO: 28 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com ela.
[210] Em uma modalidade, o N-terminal do ligante clivável está operacionalmente ligado ao C-terminal do endodomínio CAR e/ou o C-terminal do ligante clivável está operacionalmente ligado ao N-terminal de um repórter. Repórter
[211] Por razões de segurança, para fins de rastreamento ou para eliminação de células expressando CAR modificadas indesejadas, o constructo de CAR de acordo com a presente invenção pode compreender ainda um marcador selecionável ou repórter. Particularmente, as células CAR podem ser manipuladas com ligante de autoclavagem para coexpressar CARs com um repórter, para fornecer a possibilidade de selecionar ou eliminar as células CAR, por exemplo, por anticorpos.
[212] Em uma modalidade particular, o N-terminal do repórter é conectado ao CAR anti-HLA-G por um ligante clivável, tal como um ligante 2A como descrito acima, para permitir a liberação da molécula repórter. O repórter pode então ser usado para confirmar a entrega ou expressão bem-sucedida do constructo CAR para células de interesse.
[213] Particularmente, o repórter é selecionado no grupo consistindo em um marcador c-myc, CD20, CD52 (Campath), EGFR truncado (EGFRt), CD19 truncado (CD19t), ou qualquer parte ou combinação dos mesmos, ou qualquer outra molécula marcadora que pode ser expressa e/ou detectada em uma célula.
[214] Em uma modalidade preferida, o repórter é um repórter CD19, preferencialmente um repórter CD19 truncado humano (hCD19t) no qual o aminoácido da posição 314-556 foi removido (ou seja, aminoácido 313 removido). Em uma modalidade particular, o CD19 humano truncado é aquele sintetizado por GeneArt contendo as porções extracelulares e transmembrana de CD19 humano (aminoácidos 1-313) conhecidas sob o número de acesso NP_001171569.1.
[215] Preferencialmente, o repórter é um repórter CD19 truncado humano que compreende ou consiste na sequência apresentada em SEQ ID NO: 28 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com ela. CARs particulares da presente invenção
[216] Em uma modalidade particular, o CAR da presente invenção compreende um peptídeo sinal, preferencialmente um peptídeo sinal CD8a; um domínio de ligação ao antígeno específico de uma ou diversas isoforma(s) de HLA-G, em particular como um scFv, preferencialmente como detalhado acima;
opcionalmente uma dobradiça, preferencialmente compreendendo ou consistindo em (i) um domínio de dobradiça de IgG4 humana, (ii) um domínio de dobradiça de IgG4 humana e um domínio CH3 de IgG4 humana ou (iii) um domínio CH2 mutado de lgG4 humana, um domínio de dobradiça de IgG4 humana e um domínio de dobradiça CH3 de IgG4 humana ou (iv) uma dobradiça de CD28 ou (v) uma dobradiça de CD8a; um domínio transmembrana, preferencialmente um domínio transmembrana de CD28; uma região de sinalização coestimulatória, preferencialmente selecionada a partir da região de sinalização coestimulatória de CD28, 4-1BB e OX40, mais preferencialmente uma região de sinalização coestimulatória 4-1BB; e um domínio de sinalização de CD3ζ e, opcionalmente, um ligante clivável, preferencialmente um ligante 2A, e um repórter, preferencialmente um repórter hCD19t.
[217] Em uma modalidade, o constructo CAR é um constructo CAR biespecífico que compreende (i) um domínio compreendendo CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 11, 12 e 13, respectivamente, (ii) um domínio compreendendo CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 14, 15 e 16, respectivamente, (iii) um domínio compreendendo CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 5, 6 e 7, respectivamente, e (iv) um domínio compreendendo CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 8, 9 e 10, respectivamente, opcionalmente em que cada CDR pode opcionalmente compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições, deleções ou inserções de aminoácidos.
[218] Mais especificamente, o CAR da presente invenção pode compreender ou consistir na sequência polipeptídica de SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 83 ou 85 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a sequência de SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 83 ou 85 e tendo as mesmas funções. Variações de CAR
[219] Incluídas no escopo da presente invenção estão as partes funcionais dos CARs inventivos descritos na presente invenção. O termo "parte funcional", quando usado em referência a um CAR, refere-se a qualquer parte ou fragmento do CAR da presente invenção, cuja parte ou fragmento retém a atividade biológica do CAR do qual faz parte (o CAR parental). As porções funcionais abrangem, por exemplo, aquelas partes de um CAR que retêm a capacidade de reconhecer o antígeno ou células-alvo, ou detectar, tratar ou prevenir uma doença, em uma extensão similar, na mesma ou em maior extensão, como o CAR parental. Em referência ao CAR parental, a porção funcional pode compreender, por exemplo, cerca de 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% ou mais, do CAR parental.
[220] A porção funcional pode compreender aminoácidos adicionais no terminal amino ou carboxi da porção, ou em ambos os terminais, cujos aminoácidos adicionais não são encontrados na sequência de aminoácidos do CAR parental. Desejavelmente, os aminoácidos adicionais não interferem na função biológica, por exemplo, reconhecer células alvo, detectar câncer, tratar ou prevenir câncer etc. Mais desejavelmente, os aminoácidos adicionais aumentam a atividade biológica, em comparação com a atividade biológica do CAR parental.
[221] Incluídos no escopo da presente invenção estão variantes funcionais ou equivalentes biológicos dos CARs ou anticorpos inventivos descritos na presente invenção. Uma variante funcional pode, por exemplo, compreender a sequência de aminoácidos do polipeptídeo parental com pelo menos uma substituição conservativa de aminoácidos. Alternativamente ou adicionalmente, as variantes funcionais podem compreender a sequência de aminoácidos do polipeptídeo parental com pelo menos uma substituição de aminoácido não conservativa. Neste caso, é preferível que a substituição não conservativa de aminoácidos não interfira ou iniba a atividade biológica da variante funcional. A substituição não conservativa de aminoácidos pode aumentar a atividade biológica da variante funcional, de modo que a atividade biológica da variante funcional seja aumentada em comparação com o polipeptídeo parental.
[222] Tal variante biológica (incluindo porções funcionais da mesma) pode compreender aminoácidos sintéticos no lugar de um ou mais aminoácidos de ocorrência natural.
[223] Tal variante biológica (incluindo porções funcionais da mesma) pode ser glicosilada, amidada, carboxilada, fosforilada, esterificada, N-acilada, ciclizada via, por exemplo, uma ponte dissulfeto, ou convertida em um sal de adição de ácido e/ou opcionalmente dimerizada ou polimerizada, ou conjugado.
[224] Tal variante biológica (incluindo suas porções funcionais) pode ser obtida por métodos conhecidos no estado da técnica. Os polipeptídeos podem ser produzidos por qualquer método adequado de produção de polipeptídeos ou proteínas. Métodos adequados de síntese de polipeptídeos e proteínas de novo são descritos em referências, tais como Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2000; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2001 e US Pat. Nº 5,449,752. Também, polipeptídeos e proteínas podem ser produzidos de forma recombinante usando os ácidos nucleicos descritos na presente invenção usando métodos recombinantes padrão. Ver, por exemplo, Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 2001; e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley &
Sons, NY, 1994. Constructo de ácido nucleico e vetores para expressão de CAR
[225] A presente invenção também se refere a um ácido nucleico que codifica um anticorpo como descrito acima ou um ácido nucleico que codifica um CAR de acordo com a presente invenção. Tal ácido nucleico pode ser transduzido em uma célula, em particular uma célula imune, para criar uma célula que expressa o CAR. Particularmente, o constructo de ácido nucleico compreende sequências que codificam um domínio externo, um domínio intracelular, uma transmembrana, opcionalmente um domínio de dobradiça e, opcionalmente, um ligante clivável, um repórter e/ou um peptídeo sinal como descrito acima.
[226] Em uma modalidade, o constructo de ácido nucleico sequencialmente compreende ou consiste em, do N ao C-terminal: opcionalmente, uma sequência de peptídeo sinal, um anticorpo anti-HLA-G ou fragmento do mesmo, preferencialmente um scFv anti-HLA-G, um domínio espaçador, um domínio transmembrana, pelo menos um domínio intracelular e, opcionalmente, um ligante clivável e um repórter.
[227] Em ainda outra modalidade, o constructo de ácido nucleico compreende, adicionalmente, uma etiqueta , preferencialmente uma etiqueta Flag (Flag-Tag). Por exemplo, a etiqueta Flag (Flag-Tag) compreende ou consiste em SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 60 ou SEQ ID NO: 79.
[228] Em algumas modalidades, o constructo de ácido nucleico compreende: (i) uma sequência de ácido nucleico que codifica um scFv anti-HLA-G como descrito acima; (ii) opcionalmente, uma sequência de ácido nucleico que codifica uma dobradiça, preferencialmente selecionada a partir do grupo que consiste em (i)
dobradiça de CD28, (ii) dobradiça de CD8 alfa, (iii) um domínio de dobradiça de IgG4 humana, (iv) um domínio de dobradiça de IgG4 humana e um domínio CH3 de lgG4 humana ou (v) um domínio CH2 mutado de lgG4 humana, um domínio de dobradiça de lgG4 humano e um domínio de dobradiça CH3 de lgG4 humana (iii) uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio transmembrana, preferencialmente um domínio transmembrana CD28; (iii) uma sequência de ácido nucleico que codifica um endodomínio, preferencialmente um domínio 4-1BB e/ou um domínio CD3 ζ ; (iv) opcionalmente, um ligante clivável, preferencialmente um ligante clivável P2A; (v) opcionalmente um repórter, preferencialmente um repórter hCD19t; e/ou (vi) opcionalmente, um peptídeo sinal, preferencialmente selecionado a partir do grupo que consiste em CD8a, um peptídeo sinal de Ig Kappa de camundongo, um peptídeo sinal de IgG4 humana e um peptídeo sinal de IL2.
[229] Em algumas modalidades, o constructo de ácido nucleico compreende: (i) uma sequência de ácido nucleico que codifica o HCDR1, HCDR2 e HCDR 3 da SEQ ID NO: 5, 6 e 7, respectivamente, por exemplo SEQ ID NO: 42, 43 e 44, respectivamente; e (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica o LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da SEQ ID NO: 8, 9 e 10, respectivamente, por exemplo SEQ ID NO: 45, 46 e 47 respectivamente.
[230] Alternativamente, o constructo de ácido nucleico compreende: (i) uma sequência de ácido nucleico que codifica o HCDR1, HCDR2 e HCDR 3 da SEQ ID NO: 11, 12 e 13, respectivamente, por exemplo SEQ ID NO: 48, 49 e 50, respectivamente, e
(ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica o LCDR1, LCDR2 e LCDR3 da SEQ ID NO: 14, 15 e 16, respectivamente, por exemplo SEQ ID NO: 51, 52 e 53, respectivamente.
[231] Em uma modalidade particular, o constructo de ácido nucleico compreende ou consiste essencialmente em: (i) uma sequência de ácido nucleico codificando SEQ ID NO: 1 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1, por exemplo SEQ ID NO: 38; (ii) uma sequência de ácido nucleico codificando SEQ ID NO: 2 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2, por exemplo SEQ ID NO: 39; (iii) opcionalmente, uma sequência de ácido nucleico que codifica (a) SEQ ID NO: 18, (b) SEQ ID 19, (c) SEQ ID NO: 25, (d) SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 27, ou (e) SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27, ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a mesma, por exemplo (a) SEQ ID NO: 55, (b) SEQ ID NO: 56, (c) SEQ ID NO: 62, (d) SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 64, ou (e) SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 64, respectivamente; (iv) uma sequência de ácido nucleico que codifica um domínio transmembrana, preferencialmente um domínio transmembrana CD28, ainda mais preferencialmente SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 80; (v) uma sequência de ácido nucleico que codifica um endodomínio, preferencialmente um domínio 4-1BB, por exemplo SEQ ID NO: 58 ou 81, e/ou um endodomínio CD3ζ, por exemplo SEQ ID NO: 59 ou 82, preferencialmente um domínio 4-1BB e um endodomínio CD3ζ; (vi) opcionalmente, uma sequência de ácido nucleico que codifica um ligante clivável, preferencialmente um ligante clivável P2A, ainda mais preferencialmente codificando SEQ ID NO: 28 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a SEQ ID NO: 28, por exemplo SEQ ID NO: 65; (vii) opcionalmente, uma sequência de ácido nucleico que codifica um repórter, preferencialmente um repórter hCD19t, ainda mais preferencialmente que codifica a SEQ ID NO: 29 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a SEQ ID NO: 29, por exemplo SEQ ID NO: 66; (viii) opcionalmente, uma sequência de ácido nucleico que codifica um peptídeo sinal, preferencialmente um peptídeo sinal de CD8 , ainda mais preferencialmente SEQ ID NO. 54 ou 61.
[232] Em uma ainda modalidade adicional, o constructo de ácido nucleico compreende, adicionalmente, uma sequência de ácido nucleico codificando uma etiqueta, preferencialmente uma etiqueta Flag, por exemplo de SEQ ID NO: 23 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a mesma.
[233] Em outra modalidade particular, o constructo de ácido nucleico compreende ou consiste essencialmente em: (i) uma sequência de ácido nucleico codificando SEQ ID NO: 3 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a SEQ ID NO: 3; por exemplo, SEQ ID NO: 40; e/ou (ii) uma sequência de ácido nucleico codificando SEQ ID NO: 4 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a SEQ ID NO: 4; por exemplo, SEQ ID NO: 41; (iii) opcionalmente, uma sequência de ácido nucleico codificando (a) SEQ ID NO: 18, (b) SEQ ID 19, (c) SEQ ID NO: 25, (d) SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 27, ou (e) SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27, ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a mesma, por exemplo (a) SEQ ID NO: 55, (b) SEQ ID NO: 56, (c) SEQ ID NO: 62, (d) SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 64,
ou (e) SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 64, respectivamente; (iv) uma sequência de ácido nucleico codificando um domínio transmembrana, preferencialmente um domínio transmembrana CD28, ainda mais preferencialmente SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 80; (v) uma sequência de ácido nucleico codificando um endodomínio, preferencialmente um domínio 4-1BB, por exemplo SEQ ID NO: 58 ou 81, e/ou um endodomínio CD3ζ, por exemplo SEQ ID NO: 59 ou 82, preferencialmente um domínio 4-1BB e um endodomínio CD3ζ; (vi) opcionalmente, uma sequência de ácido nucleico codificando um ligante clivável, preferencialmente um ligante clivável P2A, ainda mais preferencialmente codificando SEQ ID NO: 28 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a SEQ ID NO: 28, por exemplo SEQ ID NO: 65; (vii) opcionalmente, uma sequência de ácido nucleico codificando um repórter, preferencialmente um repórter hCD19t, ainda mais preferencialmente codificando SEQ ID NO: 29 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a SEQ ID NO: 29, por exemplo SEQ ID NO: 66; (viii) opcionalmente, uma sequência de ácido nucleico codificando um peptídeo sinal, preferencialmente um peptídeo sinal de CD8 , ainda mais preferencialmente SEQ ID NO. 54 ou 61.
[234] Em uma ainda modalidade adicional, o constructo de ácido nucleico compreende ainda uma sequência de ácido nucleico codificando um marcador, preferencialmente uma etiqueta Flag, por exemplo de SEQ ID NO: 23 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a mesma.
[235] Em outra modalidade particular, o constructo de ácido nucleico sequencialmente compreende ou consiste no N ao C-terminal: (i) opcionalmente, um peptídeo sinal, preferencialmente um peptídeo sinal de CD8α, ainda mais preferencialmente SEQ ID NO: 54 ou 61, (ii) uma sequência de ácido nucleico codificando SEQ ID NO: 30 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a SEQ ID NO: 30; por exemplo SEQ ID NO: 67; ou uma sequência de ácido nucleico codificando SEQ ID NO: 31 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a SEQ ID NO: 31; por exemplo SEQ ID NO: 68; (iii) opcionalmente, uma sequência de ácido nucleico codificando (a) SEQ ID NO: 18, (b) SEQ ID 19, (c) SEQ ID NO: 25, (d) SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 27, ou (e) SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27, ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a mesma, por exemplo (a) SEQ ID NO: 55, (b) SEQ ID NO: 56, (c) SEQ ID NO: 62, (d) SEQ ID NO: 62 e SEQ ID NO: 64, ou (e) SEQ ID NO: 62, SEQ ID NO: 63 e SEQ ID NO: 64, respectivamente; (iv) uma sequência de ácido nucleico codificando um domínio transmembrana, mais preferencialmente um domínio transmembrana CD28, ainda mais preferencialmente SEQ ID NO: 57 ou SEQ ID NO: 80; (v) uma sequência de ácido nucleico codificando um endodomínio, preferencialmente um domínio 4-1BB, por exemplo SEQ ID NO: 58 ou 81, e/ou um endodomínio CD3ζ, por exemplo SEQ ID NO: 59 ou 82, preferencialmente um domínio 4-1BB e um endodomínio CD3ζ; (vi) opcionalmente, uma sequência de ácido nucleico codificando um ligante clivável, preferencialmente um ligante clivável P2A, ainda mais preferencialmente codificando SEQ ID NO: 28 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a SEQ ID NO: 28, por exemplo SEQ ID NO: 65; (vii) opcionalmente, uma sequência de ácido nucleico codificando um repórter, preferencialmente um repórter hCD19t, ainda mais preferencialmente codificando SEQ ID NO: 29 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou
95% de identidade com a SEQ ID NO: 29, por exemplo SEQ ID NO: 66.
[236] Em uma modalidade particular, a presente invenção fornece uma sequência de ácido nucleico codificando um CAR particular da presente invenção, preferencialmente um CAR descrito na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 32, 33, 34, 35, 36, 37, 83 ou 85, mais preferencialmente, uma sequência de ácido nucleico ou constructo compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 69, 70, 71, 72, 73, 74, 84 ou 86 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com a mesma.
[237] A sequência da fase de leitura aberta codificando o receptor quimérico pode ser obtida a partir de uma fonte de DNA genômico, uma fonte de cDNA, gerada por PCR a partir de uma fonte de cDNA ou outra. Caso contrário, pode ser sintetizado quimicamente ou combinações dos mesmos. Dependendo do tamanho do DNA genômico e do número de íntrons, pode ser desejável usar cDNA ou uma combinação dos mesmos, visto que os íntrons estabilizam o mRNA ou fornecem células imunes, particularmente expressão específica de células T (Barthel e Goldfeld, 2003). Além disso, pode ser adicionalmente vantajoso usar regiões não codificantes endógenas ou exógenas para estabilizar o mRNA.
[238] Para expressão de um receptor de antígeno quimérico da presente invenção, a região de iniciação transcricional de ocorrência natural ou endógena da sequência de ácido nucleico codificando os componentes N-terminais do receptor quimérico pode ser usada para gerar o receptor quimérico na célula hospedeira alvo. Alternativamente, uma região de iniciação da transcrição exógena pode ser usada, o que permite a expressão constitutiva ou induzível, em que a expressão pode ser controlada dependendo do hospedeiro alvo, do nível de expressão desejado, da natureza do hospedeiro alvo e semelhantes.
[239] Da mesma forma, uma sequência sinal direcionando o receptor quimérico para a membrana de superfície pode ser a sequência sinal endógena do componente N-terminal do receptor quimérico. Opcionalmente, em alguns casos, pode ser desejável trocar esta sequência por uma sequência sinal diferente. No entanto, a sequência sinal selecionada deve ser compatível com o percurso secretor da célula imune que expressará o CAR para que o receptor quimérico seja apresentado na superfície da célula.
[240] De acordo com a presente invenção, o constructo de ácido nucleico é transformado ou introduzido em uma célula e é transcrito e traduzido para produzir um produto (ou seja, um receptor quimérico). Assim, o constructo de ácido nucleico pode incluir, adicionalmente, pelo menos um promotor para direcionar a transcrição do CAR.
[241] Em uma modalidade, o promotor está operacionalmente ligado à sequência de ácido nucleico codificando o receptor quimérico da presente invenção, ou seja, eles são posicionados de modo a promover a transcrição do RNA mensageiro do DNA codificando o receptor quimérico. O promotor pode ser de origem genômica ou gerado sinteticamente. Uma variedade de promotores para uso em células imunes e particularmente em células T são bem conhecidos no estado da técnica (por exemplo, o promotor CD4 revelado por Marodon et al. (2003)). O promotor pode ser constitutivo ou indutível, onde a indução está associada ao tipo de célula específico ou um nível específico de maturação, ou fármaco (por exemplo, tetraciclina ou doxorrubicina) por exemplo. Exemplos de promotores indutíveis incluem, mas não estão limitados a, um promotor de metalotioneína, um promotor de glicocorticoide, um promotor de progesterona e um promotor de tetraciclina. Alternativamente, vários promotores virais bem conhecidos também são adequados. Os promotores de interesse incluem o promotor β-actina, promotores iniciais e tardios de SV40, promotor de imunoglobulina, promotor de citomegalovírus humano, promotor de retrovírus e o promotor de Friend vírus formador de foco de baço, vírus de tumor mamário de camundongo (MMTV), vírus da imunodeficiência humana (HIV) promotor de repetição de terminal longo (LTR), promotor MoMuLV, promotor de vírus da leucemia aviária, promotor inicial imediato do Citomegalovírus, promotor de vírus do sarcoma de Rous, bem como promotores do gene humano, tais como, mas não limitado a, o promotor da actina, o promotor da miosina, o promotor de hemoglobina e o promotor de creatina quinase. Os promotores podem ou não estar associados a intensificadores, em que os intensificadores podem estar naturalmente associados ao promotor particular ou associados a um promotor diferente.
[242] Similarmente, uma região de terminação pode ser fornecida pela região de terminação da transcrição endógena ou de ocorrência natural da sequência de ácido nucleico codificando o componente C-terminal do receptor quimérico. Alternativamente, a região de terminação pode ser derivada de uma fonte diferente. Para a maior parte, a fonte da região de terminação geralmente não é considerada crítica para a expressão de uma proteína recombinante e uma ampla variedade de regiões de terminação pode ser empregada sem afetar adversamente a expressão. Como será apreciado por um técnico no assunto que, em alguns casos, alguns aminoácidos nas extremidades do domínio de ligação ao antígeno no CAR podem ser deletados, geralmente não mais do que 10, mais geralmente não mais do que 5 resíduos, por exemplo. Além disso, pode ser desejável introduzir um pequeno número de aminoácidos nas bordas, geralmente não mais do que 10, mais geralmente não mais do que 5 resíduos. A deleção ou inserção de aminoácidos pode ser como resultado das necessidades da construção, fornecendo sítios de restrição convenientes, facilidade de manipulação, melhoria nos níveis de expressão ou semelhantes. Além disso, a substituição de um ou mais aminoácidos por um aminoácido diferente pode ocorrer por razões semelhantes, geralmente não substituindo mais do que cerca de cinco aminoácidos em qualquer domínio.
[243] Em outra modalidade, o constructo de ácido nucleico compreende, adicionalmente, um promotor, a sequência de iniciação da tradução correta, tal como um sítio de ligação ao ribossomo e um códon de iniciação, um códon de terminação e uma sequência de terminação da transcrição.
[244] O constructo de ácido nucleico de acordo com a presente invenção também pode compreender outras regiões regulatórias, tais como intensificadores, silenciadores e elementos de fronteira/isolantes para direcionar o nível de transcrição de um dado gene.
[245] O constructo de ácido nucleico que codifica o receptor quimérico de acordo com a presente invenção pode ser preparado de maneiras convencionais. Porque, na maior parte das vezes, podem ser empregues sequências naturais, os genes naturais podem ser isolados e manipulados, como apropriado, de modo a permitir a união adequada dos vários componentes. Assim, as sequências de ácido nucleico codificando para as proteínas N-terminal e C-terminal do receptor quimérico podem ser isoladas empregando a reação em cadeia da polimerase (PCR), usando iniciadores apropriados que resultam na deleção das porções indesejadas do gene. Alternativamente, a digestão de restrição de genes clonados pode ser usada para gerar o constructo quimérico. Em qualquer um dos casos, as sequências podem ser selecionadas para fornecer para sítios de restrição com extremidades cegas ou com sobreposições complementares.
[246] As várias manipulações para preparar o constructo quimérico podem ser realizadas in vitro e em modalidades particulares, o constructo quimérico é introduzido em vetores para clonagem e expressão em um hospedeiro apropriado usando métodos de transformação ou transfecção padrão. Assim, após cada manipulação, o constructo resultante da união das sequências de DNA é clonado, o vetor isolado e a sequência rastreada para garantir que a sequência codifica o receptor quimérico desejado. A sequência pode ser rastreada por análise de restrição, sequenciamento ou semelhantes.
[247] CARs podem ser preparados usando vetores de expressão. Aspectos da presente invenção refere-sem a uma sequência de ácido nucleico codificando um HLA-G CAR e vetores compreendendo uma sequência de ácido nucleico codificando o CAR, como descrito acima.
[248] Por exemplo, o constructo de ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser clonado em um vetor incluindo, mas não limitado a, um plasmídeo, um fagemídeo, um derivado de fago, um vírus e um cosmídeo. Os vetores de interesse particular incluem vetores de expressão, vetores de replicação, vetores de geração de sondas e vetores de sequenciamento. De acordo com o constructo de ácido nucleico e a célula hospedeira, o vetor de acordo com a presente invenção pode compreender: um promotor, um terminador, origem de replicação, marcadores selecionáveis, sítios de clonagem múltipla, sítios de empacotamento e semelhantes. Em algumas outras modalidades, o vetor compreende, ou alternativamente consiste essencialmente do mesmo, ou consiste adicionalmente em, uma sequência de consenso Kozak a montante da sequência codificando o CAR. Em algumas modalidades, o vetor compreende um polinucleotídeo conferindo resistência a antibióticos.
[249] Particularmente, o vetor de acordo com a presente invenção pode ser fornecido a uma célula na forma de um vetor viral. Um número de sistemas baseados em vírus foi desenvolvido para a transferência de genes para células de mamíferos. A tecnologia de vetor viral é bem conhecida no estado da técnica e é descrita, por exemplo, em Sambrook, et al. ((2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), e em outros manuais de virologia e biologia molecular. Vírus, que são úteis como vetores incluem, mas não estão limitados a, retrovírus, adenovírus, vírus adeno- associados, herpesvírus e lentivírus. Preferencialmente, o vetor é um Vetor Lentiviral Integrativo. Os vetores lentivirais têm a vantagem adicional sobre os vetores derivados de onco-retrovírus, pois podem transduzir células não proliferantes e apresentar baixa imunogenicidade. Em geral, um vetor adequado contém uma origem de replicação funcional em pelo menos um organismo, uma sequência promotora, sítios de endonuclease de restrição convenientes e um ou mais marcadores selecionáveis, tal como descrito em WO 01/96584; WO 01/29058; e US 6.326.193.
[250] Particularmente, a fim de avaliar a expressão de um CAR, o vetor de expressão a ser introduzido em uma célula também pode conter um gene marcador selecionável ou um gene repórter ou ambos para facilitar a identificação e seleção de células que expressam a população de células procuradas para ser transfectado ou infectado através de vetores virais, em outros aspectos, o marcador selecionável pode ser realizado em um pedaço separado de DNA e usado em um procedimento de co-transfecção. Ambos os marcadores selecionáveis e os genes repórter podem ser flanqueados com sequências regulatórias apropriadas para permitir expressão nas células hospedeiras. Marcadores selecionáveis úteis incluem, por exemplo, genes de resistência a antibióticos e semelhantes.
[251] Em um aspecto, o termo "vetor" significa um vetor recombinante que retém a capacidade de infectar e transduzir células que não se dividem e/ou se dividem lentamente e se integram ao genoma da célula alvo. Em diversos aspectos, o vetor é derivado de ou baseado em um vírus de tipo selvagem. Em aspectos adicionais, o vetor é derivado de ou baseado em um retrovírus de tipo selvagem. Particularmente, o retrovírus pode ser selecionado a partir de um vírus da leucemia, tal como o Vírus da Leucemia Murina de Moloney (MMLV), o
Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) ou o Vírus da Leucemia do Macaco Gibão (GALV). O intensificador e promotor estrangeiro pode ser o intensificador e promotor precoce imediato (IE) do citomegalovírus humano (HCMV), o intensificador e promotor (região U3) do Vírus do Sarcoma Murino de Moloney (MMSV), a região U3 do Vírus do Sarcoma de Rous (RSV), a região U3 do vírus formador de foco do baço (SFFV), ou o HCMV intensificador de IE unido ao promotor nativo do vírus da leucemia murina de Moloney (MMLV). Os vetores virais, e especialmente os vetores retrovirais, tornaram-se o método mais amplamente usado para inserir genes em mamíferos, por exemplo, células humanas. Os vetores virais também podem ser derivados de lentivírus, poxvírus, vírus do herpes simplex I (HSV), vírus Epstein Barr (EBV), papilomavírus, adenovírus e vírus adeno-associados e semelhantes. Ver, por exemplo, US Pat. Nos. 5,350,674 e 5,585,362.
[252] Preferencialmente, o vetor de acordo com a presente invenção é um vetor lentiviral. Particularmente, o vetor é derivado de lentivírus primatas e não primatas. Exemplos de lentivírus primatas incluem o vírus da imunodeficiência humana (HIV), o agente causador da síndrome da imunodeficiência adquirida humana (AIDS) e o vírus da imunodeficiência símia (SIV). O grupo lentiviral não primata inclui o protótipo "vírus lento" do vírus visna/maedi (VMV), bem como o vírus relacionado da artrite-encefalite caprina (CAEV), vírus da anemia infecciosa equina (EIAV) e os mais recentemente descritos vírus da imunodeficiência felina (FIV) recentemente e vírus da imunodeficiência bovina (BIV). Os vetores lentivirais recombinantes do estado da técnica são conhecidos no estado da técnica, por exemplo, ver Patentes US N°. 7.056.699; 7.07.993;
7.419.829 e 7.442.551, incorporados na presente invenção por referência.
[253] Os vetores retrovirais comerciais para uso nesta presente invenção incluem, mas não estão limitados a, vetores pFB-neo (STRATAGENE®), as versões
4, 6 e 6.2 do sistema "ViraPower" da série pLenti da Invitrogen. Fabricado pela Lentigen Corp.; pHIV-7-GFP, laboratório gerado e usado pelo City of Hope Research Institute; Vetor lentiviral “Lenti-X”, pLVX, fabricado por Clontech; pLKO.1-puro, fabricado por Sigma-Aldrich; pLemiR, fabricado pela Open Biosystems; e pLV, laboratório gerado e usado pela Charité Medical School, Institute of Virology (CBF), Berlin, Alemanha.
[254] Será evidente que um vetor viral de acordo com a presente invenção não precisa ser confinado aos componentes de um vírus particular. O vetor viral pode compreender componentes derivados de dois ou mais vírus diferentes e também pode compreender componentes sintéticos. Os componentes do vetor podem ser manipulados para obter as características desejadas, tal como a especificidade da célula alvo.
[255] US 6.924.123 revela que certa sequência retroviral facilita a integração no genoma da célula alvo. Esta patente ensina que cada genoma retroviral compreende genes chamados gag, pol e env que codificam proteínas e enzimas de vírion. Esses genes são flanqueados em ambas as extremidades por regiões chamadas de repetições terminais longas (LTRs). Os LTRs são responsáveis pela integração proviral e transcrição. Eles também servem como sequências estimulatórias-promotoras. Consequentemente, o vetor de acordo com a presente invenção pode compreender uma ou mais das características de integração.
[256] Em algumas modalidades, os componentes das partículas não codificadas pelo genoma do vetor são fornecidos em trans por sequências de ácido nucleico adicionais (o "sistema de empacotamento", que geralmente inclui um ou ambos os genes gag/pol e env) expressos na célula hospedeira, por exemplo, usando uma estratégia de vírus auxiliar. O conjunto de sequências necessárias para a produção das partículas do vetor viral pode ser introduzido na célula hospedeira por transfecção transitória, ou podem ser integradas no genoma da célula hospedeira, ou podem ser fornecidas em uma mistura de maneiras, tal como sequências auxiliares. As técnicas envolvidas são conhecidas dos técnicos no assunto. Por exemplo, os constructos retrovirais são plasmídeos de empacotamento compreendendo pelo menos uma sequência de DNA retroviral auxiliar derivada de um genoma retroviral incompetente para replicação codificando em trans todas as proteínas de vírion necessárias para empacotar um vetor retroviral incompetente para replicação e para produzir proteínas de vírion capazes de empacotar o vetor retroviral incompetente para replicação em alto título, sem a produção de vírus auxiliar competente para replicação.
[257] No processo de empacotamento, os plasmídeos de empacotamento e vetores retrovirais expressando o CAR de acordo com a presente invenção são transitoriamente co-transfectados em uma primeira população de células de mamíferos que são capazes de produzir vírus, tal como células de rim embrionário humano, por exemplo células 293 (ATCC No. CRL1573, ATCC, Rockville, Md.) para produzir sobrenadantes contendo retrovírus recombinantes de alto título. Em outro método da presente invenção, esta primeira população de células transfectada transitoriamente é então co-cultivada com células alvo de mamífero, por exemplo, linfócitos humanos, para transduzir as células alvo com o gene estranho em altas eficiências. Em ainda outro método da presente invenção, os sobrenadantes da primeira população de células transfectadas transitoriamente descritas acima são incubados com células alvo de mamífero, por exemplo, linfócitos humanos ou células-tronco hematopoiéticas, para transduzir as células alvo com o gene estranho em altas eficiências.
[258] O constructo de ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser inserido em um vetor e embalado em partículas retrovirais ou lentivirais usando técnicas conhecidas no estado da técnica. O vírus recombinante pode então ser isolado e entregue às células do indivíduo in vivo ou ex vivo. Em um aspecto particular, os plasmídeos de empacotamento são expressos de forma estável em uma primeira população de células de mamíferos que são capazes de produzir vírus, tal como células de rim embrionário humano, por exemplo, células 293. Os vetores retrovirais ou lentivirais são introduzidos nas células por co-transfecção com um marcador selecionável ou infecção com vírus pseudotipado. Em ambos os casos, os vetores se integram. Alternativamente, os vetores podem ser introduzidos em um plasmídeo mantido epissomal. Células que expressam CAR anti-HLA-G
[259] A presente invenção refere-se a uma célula expressando um CAR como descrito na presente invenção. A célula pode ser de qualquer tipo, incluindo uma célula imune capaz de expressar o CAR ou uma célula, tal como uma célula bacteriana, que abriga um vetor de expressão que codifica o CAR.
[260] No contexto de expressão de uma sequência de ácido nucleico heteróloga codificando o CAR da presente invenção, "célula hospedeira" refere- se a uma célula que é capaz de replicar um vetor e/ou expressar um gene heterólogo codificado por um vetor. O termo "célula" também inclui sua progênie, que é toda e qualquer geração subsequente. Entende-se que toda a progênie pode não ser idêntica devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. Uma célula hospedeira pode ser transfectada pelo constructo de ácido nucleico ou vetor de acordo com a presente invenção. Uma célula transformada inclui a célula principal e sua progênie. Como usado na presente invenção, os termos células "manipuladas" e "recombinantes" ou células hospedeiras se destinam a se referir a uma célula na qual uma sequência de ácido nucleico exógena, tal como, por exemplo, um vetor, mais particularmente um CAR, foi introduzida.
Portanto, as células recombinantes são distinguíveis das células de ocorrência natural que não contêm um ácido nucleico introduzido de forma recombinante.
[261] Após a transdução de uma célula com um constructo de ácido nucleico codificando um CAR, a célula reconhecerá a isoforma HLA-G especificada pelo CAR. Assim, a presente invenção também se refere a células expressando os CARs de acordo com a presente invenção. Particularmente, as células que expressam CAR anti-HLA-G de acordo com a presente invenção são células imunes capazes de expressar um CAR de acordo com a presente invenção. Em certas modalidades, as células imunes são transfectadas para compreender pelo menos um CAR da presente invenção.
[262] A célula pode compreender um CAR que se liga especificamente às isoformas de HLA-G associadas a β2M, preferencialmente a ambas isoformas HLA-G1 e HLA-G5. Alternativamente, a célula pode compreender um CAR que se liga especificamente às isoformas de HLA-G livres de β2M, preferencialmente ambas isoformas HLA-G2 e HLA-G6 e/ou isoformas HLA-G1/livres de β2M e/ou isoformas HLA-G5/livres de β2M.
[263] Em uma modalidade, a célula expressa pelo menos dois CARs diferentes. Por exemplo, a célula pode compreender um CAR que se liga especificamente às isoformas de HLA-G associadas a β2M, preferencialmente a ambas HLA-G1 e HLA-G5, e outro CAR que se liga especificamente a um antígeno diferente. A célula pode, alternativamente, compreender um CAR que se liga especificamente às isoformas de HLA-G livres de β2M, preferencialmente para HLA-G2 e HLA-G6, e/ou HLA-G1/livres de β2M e/ou isoformas HLA-G5/livres de β2M e outra CAR que se liga especificamente a um antígeno diferente. Em particular, a célula pode compreender ambos um CAR que se liga especificamente às isoformas de HLA-G associadas a β2M, preferencialmente à ambas o HLA-G1 e HLA-G5, e um CAR que se liga especificamente às isoformas de HLA-G livres de β2M, preferencialmente para o HLA-G2 e HLA-G6, e/ou HLA- G1/livres de β2M e/ou isoformas HLA-G5/livres de β2M.
[264] Preferencialmente, a célula compreende um CAR compreendendo um fragmento de ligação ao antígeno derivado do anticorpo LFTT-1 como descrito acima e um CAR compreendendo um fragmento de ligação ao antígeno derivado do anticorpo 15E7 como descrito acima.
[265] Preferencialmente, tal célula compreende, portanto, um primeiro CAR compreendendo (i) uma cadeia pesada compreendendo CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 11, 12 e 13, respectivamente, e (ii) uma cadeia leve compreendendo CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 14, 15 e 16, respectivamente, e um segundo CAR que compreende (i) uma cadeia pesada compreendendo CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 5, 6 e 7, respectivamente, e (ii) uma cadeia leve compreendendo CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 8, 9 e 10, respectivamente, opcionalmente em que cada CDR pode, opcionalmente, compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições, deleções ou inserções de aminoácidos. Ainda mais preferencialmente, tal célula compreende, assim, um primeiro CAR compreendendo ou consistindo na sequência estabelecida em SEQ ID NO: 32, 33, 34 ou 85 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com ela e um segundo CAR compreendendo ou consistindo em SEQ ID NO: 35, 36, 37 ou 83 ou uma sequência tendo pelo menos 80, 85, 90 ou 95% de identidade com ela.
[266] Alternativamente, a célula pode expressar um CAR biespecífico compreendendo um domínio de ligação ao antígeno biespecífico, como descrito acima, que compreende um domínio que reconhece isoformas de HLA-G/livres de β2M, preferencialmente ambas HLA-G2 e HLA-G6 e/ou ambas isoformas HLA-
G1/livre de β2M e HLA-G5/livre de β2M, e um segundo domínio que reconhece as isoformas de HLA-G associadas ao domínio β2M, preferencialmente HLA-G1 e HLA-G5.
[267] Opcionalmente, a célula expressando um CAR anti-HLA-G de acordo com a presente invenção expressa adicionalmente um CAR que tem como alvo um antígeno envolvido em uma doença, preferencialmente tal como câncer ou infecção viral, preferencialmente um antígeno direcionado em terapias contra o câncer ou em terapias virais. Será entendido que tal antígeno não é HLA-G.
[268] A célula de acordo com a presente invenção pode ser uma célula procariótica ou eucariótica. Preferencialmente, as células são células eucarióticas, tais como células de mamíferos, e tipicamente são células humanas, felinas ou caninas, mais tipicamente células humanas, preferencialmente células humanas primárias.
[269] Preferencialmente, as células são células imunes. As células podem ser selecionadas a partir de um grupo que consiste em uma célula T, incluindo Célula T CD4+ e Célula T CD8+, célula B, célula NK, célula NKT, monócito e célula dendrítica, preferencialmente a célula sendo uma célula T, uma célula B e uma célula NK.
[270] As células podem ser células autólogas, células singênicas, células alogênicas e até mesmo, em alguns casos, células xenogênicas. Por exemplo, células imunes adequadas que podem ser usadas na presente invenção incluem células de linfócitos T autólogos, células T alogênicas, células T xenogênicas, progenitores de qualquer um dos anteriores, tumor transformado ou células efetoras imunológicas xenogênicas, linfócitos infiltrantes de tumor (TILs), linfócitos citotóxicos ou outras células que são capazes de matar células-alvo quando ativadas.
[271] As células imunes podem ser isoladas de indivíduos humanos ou não humanos ou podem ser derivadas de células-tronco, por exemplo, células-tronco embrionárias, células-tronco multipotentes, células-tronco pluripotentes, células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), células-tronco adultas ou outras células reprogramadas. As células para introdução dos constructos de ácido nucleico descritos na presente invenção podem ser isoladas de uma amostra, tal como uma amostra biológica, por exemplo, uma obtida ou derivada de um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo do qual a célula é isolada é aquele que tem a doença ou condição ou precisa de uma terapia celular ou ao qual a terapia celular será administrada. O indivíduo em algumas modalidades é um ser humano que necessita de uma intervenção terapêutica particular, tal como a terapia celular adotiva para a qual as células estão sendo isoladas, processadas e/ou manipuladas. Em algumas modalidades, as células são derivadas do sangue, medula óssea, linfa ou órgãos linfoides, são células do sistema imunológico, tais como células do sistema imunológico inato ou adaptativo, por exemplo, células mieloides ou linfoides, incluindo linfócitos, tipicamente Células T e/ou células NK.
[272] Em algumas modalidades, as células incluem um ou mais subconjuntos de células T ou outros tipos de células, tal como populações de células T inteiras, células CD4+, células CD8+ e subpopulações das mesmas, tais como aquelas definidas pela função, estado de ativação, maturidade, potencial para diferenciação, expansão, recirculação, localização e/ou capacidade de persistência, especificidade do antígeno, tipo de receptor de antígeno, presença em um órgão ou compartimento particular, perfil de secreção de marcador ou citocina e/ou grau de diferenciação.
[273] Em certas modalidades, a célula imune é uma célula T, por exemplo, uma célula T animal, uma célula T de mamífero, uma célula T felina, uma célula T canina ou uma célula T humana. Entre os subtipos e subpopulações de células
T e/ou de células T CD4+ e/ou CD8+ estão as células T (TN) naive, células T efetoras (TEFF), células T de memória e subtipos da mesma, tal como células- tronco T de memória (TSCM), T de memória central (TCM), T de memória efetora (TEM) ou células T de memória efetoras diferenciadas terminalmente, linfócitos infiltrantes de tumor (TIL), células T imaturas, células T maduras, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T invariantes associadas à mucosa (MAIT), células T reguladoras adaptativas e de ocorrência natural (Treg), células T auxiliares, tal como células TH1, células TH2, células TH3, células TH17, células TH9, células TH22, células T auxiliares foliculares, células T α/β e células T δ/γ.
Exemplos não limitativos de linhagens celulares-T comercialmente disponíveis incluem as linhagens BCL2 (AAA) Jurkat (ATCC® CRL-2902™), BCL2 (S70A) Jurkat (ATCC® CRL-2900™), BCL2 (S87A) Jurkat (ATCC® CRL -2901™), BCL2 Jurkat (ATCC® CRL-2899™), Neo Jurkat (ATCC® CRL-2898 ™), linhagem de células T humanas citotóxicas TALL-104 (ATCC # CRL-11386). Exemplos adicionais incluem, mas não estão limitados a, linhagens de células T maduras, por exemplo, tais como Deglis, EBT-8, HPB-MLp-W, HUT 78, HUT 102, Karpas 384, Ki 225, My-La, Se-Ax, SKW-3, SMZ-1 e T34; e linhagens de células T imaturas, por exemplo, ALL-SIL, Be13, CCRF-CEM, CML-T1, DND-41, DU.528, EU-9, HD-Mar, HPB-ALL, H-SB2, HT-1, JK- T1, Jurkat, Karpas 45, KE-37, KOPT-K1, K-T1, L-KAW, Loucy, MAT, MOLT-1, MOLT 3, MOLT-4, MOLT 13, MOLT-16, MT- 1, MT-ALL, P12/Ichikawa, Peer, PER0117, PER-255, PF-382, PFI-285, RPMI-8402, ST-4, SUP-T1 a T14, TALL-1, TALL-101, TALL- 103/2, TALL-104, TALL-105, TALL-106, TALL-107, TALL-197, TK-6, TLBR-1, - 2, -3 e -4, CCRF-HSB-2 (CCL- 120.1), J.RT3-T3.5 (ATCC TIB-153), J45.01 (ATCC CRL- 1990), J.CaM1.6 (ATCC CRL-2063), RS4; 11 (ATCC CRL-1873), CCRF -CEM (ATCC CRM-CCL-119); e linhagens de células T de linfoma cutâneo, por exemplo, HuT78 (ATCC CRM-TIB-161), MJ [G11] (ATCC CRL-8294), HuT102 (ATCC TIB-162). Fontes exemplificativas não limitativas para tais linhagens celulares comercialmente disponíveis incluem a American Type Culture Collection, ou ATCC, (http://www.atcc.org/) e a German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/)
[274] Em algumas modalidades, as células são células natural killer (NK), células T Natural Killer (NKT), células killer induzidas por citocinas (CIK), linfócitos infiltrantes de tumor (TILs), células killer ativadas por linfocina (LAK) ou semelhantes. As células NK podem ser isoladas ou obtidas de uma fonte comercialmente disponível. Exemplos não limitativos de linhagens celulares NK comerciais incluem as linhagens NK-92 (ATCC® CRL-2407™), NK-92MI (ATCC® CRL-2408™). Exemplos adicionais incluem, mas não estão limitados às linhagens NK HANK1, KHYG-1, NKL, NK-YS, NOI-90 e YT. Fontes exemplificativas não limitativas para tais linhagens celulares comercialmente disponíveis incluem a American Type Culture Collection, ou ATCC, (http://www.atcc.org/) e a German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/)
[275] Em uma modalidade particular, a célula hospedeira apresentando o CAR de acordo com a presente invenção é selecionada a partir de células T citotóxicas (também conhecidas como TC, linfócito T citotóxico, CTL, célula T Killer, uma célula T lítica, células T CD8+ ou célula T killer) e células NK.
[276] Em algumas modalidades, as células são células B, monócitos ou granulócitos, por exemplo, células mieloides, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, mastócitos, eosinófilos e/ou basófilos. Método para Preparar células expressando CAR
[277] Os métodos de introdução de genes em uma célula e expressão de genes em uma célula são conhecidos no estado da técnica.
[278] Particularmente, os métodos para a produção de células compreendendo vetores e/ou ácidos nucleicos exógenos são bem conhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al. (2001, Molecular Cloning:
A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York). No contexto de um vetor de expressão, o vetor pode ser facilmente introduzido em uma célula hospedeira, por exemplo, célula de mamífero, bactéria, levedura ou inseto por qualquer método no estado da técnica. Por exemplo, o vetor de expressão pode ser transferido para uma célula hospedeira por meios físicos, químicos ou biológicos que são mais particularmente descritos abaixo na presente invenção.
[279] Em algumas modalidades, os métodos incluem isolar células do indivíduo, preparar, processar, cultivar e/ou manipulá-las, como descrito na presente invenção, e reintroduzi-las no mesmo paciente, antes ou após a criopreservação.
[280] Na presente invenção é fornecido, particularmente, um método de produção de células expressando CAR anti-HLA-G compreendendo, ou alternativamente consistindo essencialmente em, ou adicionalmente consistindo nas etapas: (i) transduzir uma população de células isoladas com uma sequência de ácido nucleico codificando o CAR como descrito na presente invenção; e (ii) selecionar uma subpopulação das referidas células isoladas que foram transduzidas com sucesso com a referida sequência de ácido nucleico da etapa (i), produzindo assim células expressando CAR anti-HLA-G. Em um aspecto, as células isoladas são selecionadas a partir de um grupo que consiste em células T e células NK.
[281] Na presente invenção é ainda mais particularmente fornecido um método de produção de células expressando CAR anti-HLA-G compreendendo, ou alternativamente consistindo essencialmente em, ou adicionalmente consistindo nas etapas: (i) aquisição de uma população de células imunes (por exemplo, células sanguíneas) (ii) isolamento de uma população particular de células (por exemplo, células T e/ou células NK) (iii) transdução de uma população de células isoladas com uma sequência de ácido nucleico codificando o CAR como descrito na presente invenção; e (ii) selecionar uma subpopulação das referidas células isoladas que foram transduzidas com sucesso com a referida sequência de ácido nucleico da etapa (iii) produzindo assim células que expressam CAR anti HLA-G. Essas diferentes etapas são descritas mais particularmente abaixo. Aquisição de células
[282] Antes da expansão e modificação genética das células reveladas na presente invenção, as células podem ser obtidas de um indivíduo- por exemplo, em modalidades envolvendo terapia autóloga - ou de uma cultura comercialmente disponível.
[283] A célula pode ser adquirida de amostras que incluem tecido, fluido corporal (por exemplo, sangue, plasma, soro, líquido cefalorraquidiano, líquido sinovial, urina e suor) e outras amostras retiradas diretamente do indivíduo, bem como amostras resultantes de uma ou mais etapas de processamento, tais como separação, centrifugação, engenharia genética (por exemplo, transdução com vetor viral), lavagem e/ou incubação.
[284] As células podem ser obtidas de inúmeros fontes não limitantes, incluindo sangue total, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), leucócitos, medula óssea, tecido do timo, tecido do linfonodo, sangue do cordão umbilical, tecido de um sítio de infecção, ascite, derrame pleural, biópsia de tecido, tumor, leucemia, linfoma, tecido linfóide associado ao intestino, tecido linfóide associado à mucosa, baço, outros tecidos linfoides, fígado, pulmão, estômago, intestino, cólon, rim, pâncreas, mama, osso, próstata, colo do útero, testículos, ovários, amígdalas ou outro órgão e/ou células deles derivadas. As amostras incluem, no contexto da terapia celular, por exemplo, terapia celular adotiva, amostras de fontes autólogas e alogênicas.
[285] Em alguns exemplos, as células do sangue circulante de um indivíduo são obtidas, por exemplo, por aférese ou leucaferese. As amostras, em alguns aspectos, contêm linfócitos, incluindo células T, monócitos, granulócitos, células B, outros glóbulos brancos nucleados, glóbulos vermelhos e/ou plaquetas e, em alguns aspectos, contêm células diferentes de glóbulos vermelhos e plaquetas.
[286] Em algumas modalidades, qualquer número de células T ok linhagens celulares de NK disponíveis e conhecidas dos técnicos no assunto, tal como descrito acima, pode ser usado. Em algumas modalidades, as células podem ser derivadas de um doador saudável, de um paciente diagnosticado com câncer, de um paciente diagnosticado com um distúrbio autoimune ou inflamatório ou de um paciente diagnosticado com uma infecção. Em algumas modalidades, as células podem fazer parte de uma população mista de células que apresentam diferentes características fenotípicas. Isolamento celular
[287] Como é conhecido por um técnico no assunto, vários métodos estão prontamente disponíveis para isolar células imunes de um indivíduo ou podem ser adaptados ao presente pedido, por exemplo, usando o sistema Life Technologies Dynabeads®; STEMcell Technologies EasySep™, RoboSep™, RosetteSep™, SepMate™; Kits de separação de células Miltenyi Biotec MACS™, expressão de marcador de superfície celular e outros kits de separação e isolamento de células disponíveis comercialmente (por exemplo, ISOCELL de Pierce, Rockford, IL). Subpopulações particulares de células imunes podem ser isoladas através do uso de grânulos ou outros agentes de ligação disponíveis em tais kits específicos para marcadores de superfície celular únicos. Por exemplo, MicroBeads MACS™ CD4+ e CD8+ podem ser usados para isolar células T CD4+ e CD8+. A estratégia de isolar e expandir células T específicas para antígenos como uma intervenção terapêutica para doenças humanas também foi validada em ensaios clínicos (Riddell et al., 1992; Walter et al., 1995; Heslop et al., 1996).
[288] Em algumas modalidades, o isolamento das células inclui uma ou mais etapas de preparação e/ou separação de células com base em não afinidade. Em alguns exemplos, as células são lavadas, centrifugadas e/ou incubadas na presença de um ou mais reagentes, por exemplo, para remover componentes indesejados, enriquecer para componentes desejados, lisar ou remover células sensíveis a reagentes particulares. Em alguns exemplos, as células são separadas baseado em uma ou mais propriedades, tal como densidade, propriedades aderentes, tamanho, sensibilidade e/ou resistência a componentes particulares.
[289] Em algumas modalidades, as células sanguíneas coletadas do indivíduo são lavadas, por exemplo, para remover a fração de plasma e posicionar as células em um tampão ou meio apropriado para as etapas de processamento subsequentes. Em algumas modalidades, as células são lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em algumas modalidades, a solução de lavagem carece de cálcio e/ou magnésio e/ou muitos ou todos os cátions divalentes. Em alguns aspectos, uma etapa de lavagem é alcançada por uma centrífuga de "fluxo direto" semiautomática (por exemplo, o processador de células Cobe 2991, Baxter) de acordo com as instruções do fabricante. Em alguns aspectos, uma etapa de lavagem é alcançada por filtração de fluxo tangencial (TFF) de acordo com as instruções do fabricante. Em algumas modalidades, as células são ressuspensas em uma variedade de tampões biocompatíveis após a lavagem, tal como, por exemplo, Ca2/Mg2 livre de PBS. Em certas modalidades, os componentes de uma amostra de células sanguíneas são removidos e as células diretamente ressuspensas no meio de cultura.
[290] Em algumas modalidades, os métodos de isolamento incluem a separação de diferentes tipos de células com base na expressão ou presença na célula de uma ou mais moléculas específicas, tais como marcadores de superfície, por exemplo, proteínas de superfície, marcadores intracelulares ou ácido nucleico. Em algumas modalidades, qualquer método conhecido para separação com base em tais marcadores pode ser usado. Em algumas modalidades, a separação é uma separação baseada em afinidade ou imunoafinidade. Por exemplo, o isolamento em alguns aspectos inclui a separação de células e populações de células baseado na expressão das células ou nível de expressão de um ou mais marcadores, tipicamente marcadores de superfície celular, por exemplo, por incubação com um anticorpo ou parceiro de ligação que se liga especificamente a tais marcadores, seguidos geralmente por etapas de lavagem e separação de células que se ligaram ao anticorpo ou parceiro de ligação, daquelas células que não se ligaram ao anticorpo ou parceiro de ligação. Tais etapas de separação podem ser baseadas na seleção positiva, na qual as células que se ligaram aos reagentes são retidas para uso adicional e/ou seleção negativa, na qual as células que não se ligaram ao anticorpo ou parceiro de ligação são retidas. Em alguns exemplos, ambas as frações são retidas para uso adicional. Em alguns aspectos, a seleção negativa pode ser particularmente útil onde nenhum anticorpo que identifique especificamente um tipo de célula em uma população heterogênea está disponível, tal que a separação seja melhor realizada baseado em marcadores expressos por células diferentes da população desejada.
[291] Em algumas modalidades, várias rodadas de etapas de separação são realizadas, onde a fração selecionada positiva ou negativamente de uma etapa é submetida a outra etapa de separação, tal como uma seleção positiva ou negativa subsequente. Em alguns exemplos, uma única etapa de separação pode depletar células expressando vários marcadores simultaneamente, tal como pela incubação de células com uma pluralidade de anticorpos ou parceiros de ligação, cada um específico para um marcador direcionado para seleção negativa. Da mesma forma, vários tipos de células podem ser simultaneamente selecionados positivamente incubando células com uma pluralidade de anticorpos ou parceiros de ligação expressos nos vários tipos de células.
[292] Por exemplo, em alguns aspectos, subpopulações específicas de células T, tais como células positivas ou expressando altos níveis de um ou mais marcadores de superfície, por exemplo, células T CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD45RA+ e/ou CD45RO+ são isoladas por técnicas de seleção positiva ou negativa. Por exemplo, as células T CD3+ podem ser expandidas usando grânulos magnéticos conjugados com CD3/CD28 (por exemplo, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander).
[293] Em algumas modalidades, o isolamento é realizado por enriquecimento para uma população de células particular por seleção positiva ou depleção de uma população de células particular por seleção negativa. Em algumas modalidades, a seleção positiva ou negativa é alcançada ao incubar células com um ou mais anticorpos ou outro agente de ligação que se ligam especificamente a um ou mais marcadores de superfície expressos ou expressos (marcador+) em um nível relativamente mais alto nas células selecionadas positiva ou negativamente, respectivamente.
[294] Em algumas modalidades, as células T são separadas de uma amostra por seleção negativa de marcadores expressos em células não T, tal como células B, monócitos ou outras células brancas do sangue, tais como CD14. Em alguns aspectos, uma etapa de seleção de CD4 ou CD8 é usada para separar células T auxiliares CD4+ e CD8+ citotóxicas. Tais populações CD4+ e CD8+ podem ser adicionalmente classificadas em subpopulações por seleção positiva ou negativa para marcadores expressos ou expressos em um grau relativamente mais alto em uma ou mais subpopulações de células T naive, de memória e/ou efetoras.
[295] Em algumas modalidades, as células CD8+ são adicionalmente enriquecidas ou depletadas de células-tronco naive, de memória central, de memória efetora e/ou de memória central, tal como por seleção positiva ou negativa com base em antígenos de superfície associados à respectiva subpopulação. Em algumas modalidades, o enriquecimento para células T de memória central (TCM) é realizado para aumentar a eficácia, tal como para melhorar a sobrevivência de longo prazo, expansão e/ou enxerto após a administração, o que em alguns aspectos é particularmente robusto em tais subpopulações. Ver Terakura et al. (2012) Blood. 1:72-82; Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701. Em algumas modalidades, a combinação de células T CD8 +enriquecidas com TCM e células T CD4+ adicionalmente aumenta a eficácia.
[296] Em algumas modalidades, as células T de memória estão presentes em ambos os subconjuntos CD62L+ e CD62L- de linfócitos de sangue periférico CD8+. PBMC pode ser enriquecido ou esgotado de frações CD62L-CD8 e/ou CD62L CD8, tal como o uso de anticorpos anti-CD8 e anti-CD62L.
[297] Em algumas modalidades, o enriquecimento para células T de memória central (TCM) é baseado na expressão de superfície positiva ou alta de CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 e/ou CD127; em alguns aspectos, é baseado na seleção negativa para células expressando ou expressando altamente CD45RA e/ou granzima B. Em alguns aspectos, o isolamento de uma população enriquecida CD8+ para células TCM é realizado pela depleção de células expressando CD4, CD14, CD45RA, e seleção positiva ou enriquecimento para células expressando CD62L. Em um aspecto, o enriquecimento para células T de memória central (TCM) é realizado começando com uma fração negativa de células selecionadas baseado na expressão de CD4, que é submetida a uma seleção negativa baseada na expressão de CD14 e CD45RA, e uma seleção positiva baseada em CD62L. Tais seleções em alguns aspectos são realizadas simultaneamente e em outros aspectos são realizadas sequencialmente, em qualquer ordem. Em alguns aspectos, a mesma etapa de seleção baseada na expressão de CD4 usada na preparação da população ou subpopulação de células CD8+ também é usada para gerar a população ou subpopulação de células CD4+, tais que ambas as frações positivas e negativas da separação baseada em CD4 sejam retidas e usadas em etapas subsequentes dos métodos, opcionalmente seguindo uma ou mais etapas adicionais de seleção positiva ou negativa.
[298] Em algumas modalidades, o enriquecimento para células NK é baseado na expressão de superfície positiva ou alta de CD56 e CD16 e na expressão negativa de CD3 e/ou opcionalmente na presença de receptores NKp46 ou NKp30.
[299] Em alguns aspectos, a amostra ou composição de células a serem separadas é incubada com material pequeno, magnetizável ou magneticamente responsivo, tal como partículas magneticamente responsivas ou micropartículas, tal como grânulos paramagnéticos (por exemplo, tal como Dynabeads ou grânulos MACS). O material magneticamente responsivo, por exemplo, partícula, geralmente é direta ou indiretamente fixada a um parceiro de ligação, por exemplo, um anticorpo, que se liga especificamente a uma molécula, por exemplo, marcador de superfície, presente na célula, células ou população de células que é desejado separar, por exemplo, que é desejado selecionar negativamente ou positivamente. Em algumas modalidades, a partícula magnética ou grânulo compreende um material magneticamente responsivo ligado a um membro de ligação específico, tal como um anticorpo ou outro parceiro de ligação. Existem muitos materiais responsivos magneticamente bem conhecidos usados em métodos de separação magnética. Partículas magnéticas adequadas incluem aquelas descritas em Molday, Pat. No. 4.452.773, e na
Especificação de Patente Europeia EP 452342 B, que são incorporadas na presente invenção por referência. Partículas de tamanho coloidal, tais como aquelas descritas em Owen US Pat. Não. 4,795,698 e Liberti et al., Patente US Nº
5.200.084 são outros exemplos.
[300] A incubação geralmente é realizada sob condições em que os anticorpos ou parceiros de ligação ou moléculas, tais como anticorpos secundários ou outros reagentes, que se ligam especificamente a tais anticorpos ou parceiros de ligação, que estão fixados à partícula magnética ou grânulo, se ligam especificamente à superfície celular moléculas se presentes nas células dentro da amostra.
[301] Em alguns aspectos, a amostra é colocada em um campo magnético e as células com partículas magneticamente responsivas ou magnetizáveis fixados a mesma serão atraídas para o ímã e separadas das células não marcadas. Para a seleção positiva, as células que são fixadas pelo ímã são retidas; para a seleção negativa, as células que não são atraídas (células não marcadas) são retidas. Em alguns aspectos, uma combinação de seleção positiva e negativa é realizada durante a mesma etapa de seleção, onde as frações positivas e negativas são retidas e adicionalmente processadas ou sujeitas a etapas adicionais de separação.
[302] Em certas modalidades, as partículas responsivas magneticamente são revestidas com anticorpos primários ou outros parceiros de ligação, anticorpos secundários, lectinas, enzimas ou estreptavidina. Em certas modalidades, as partículas magnéticas são fixadas às células por meio de um revestimento de anticorpos primários específicos para um ou mais marcadores. Em certas modalidades, as células, em vez dos grânulos, são marcadas com um anticorpo primário ou parceiro de ligação e, em seguida, partículas magnéticas revestidas de anticorpo secundário específico do tipo de célula ou outro parceiro de ligação (por exemplo, estreptavidina) são adicionadas. Em certas modalidades, partículas magnéticas revestidas com estreptavidina são usadas em conjunto com anticorpos primários ou secundários biotinilados.
[303] Em algumas modalidades, as partículas responsivas magneticamente são deixadas fixadas às células que serão subsequentemente incubadas, cultivadas e/ou manipuladas; em alguns aspectos, as partículas são fixadas às células para administração a um paciente. Em algumas modalidades, as partículas magnetizáveis ou responsivas magneticamente são removidas das células. Métodos para remover partículas magnetizáveis de células são conhecidos e incluem, por exemplo, o uso de anticorpos não marcados concorrentes, partículas magnetizáveis ou anticorpos conjugados a ligantes cliváveis, etc. Em algumas modalidades, as partículas magnetizáveis são biodegradáveis.
[304] Em certas modalidades, o isolamento ou separação é realizado usando um sistema, dispositivo ou aparelho que realiza uma ou mais das etapas de isolamento, preparação de células, separação, processamento, incubação, cultura e/ou formulação dos métodos. Em alguns aspectos, o sistema é usado para executar cada uma dessas etapas em um ambiente fechado ou estéril, por exemplo, para minimizar o erro, manuseio do usuário e/ou contaminação. Em um exemplo, o sistema é um sistema como descrito no Pedido de Patente Internacional, Publicação Número WO2009/072003 ou US 20110003380.
[305] Em algumas modalidades, uma população de células descrita na presente invenção é coletada e enriquecida (ou depletada) por meio de citometria de fluxo, na qual as células coradas para múltiplos marcadores de superfície celular são realizadas em uma corrente fluídica. Em algumas modalidades, uma população de células descrita na presente invenção é coletada e enriquecida (ou depletada) por meio de classificação em escala preparativa (FACS). Em certas modalidades, uma população de células descrita na presente invenção é coletada e enriquecida (ou depletada) pelo uso de chips de sistemas microeletromecânicos (MEMS) em combinação com um sistema de detecção baseado em FACS (ver, por exemplo, WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10, 1567-1573; e Godin et al. (2008) J Biophoton. l (5): 355-376. Em ambos os casos, as células podem ser marcadas com múltiplos marcadores, permitindo o isolamento de subconjuntos de células T bem definidas em alta pureza. Em algumas modalidades, os anticorpos ou parceiros de ligação são marcados com um ou mais marcadores detectáveis, para facilitar a separação para seleção positiva e/ou negativa. Por exemplo, a separação pode ser baseada na ligação a anticorpos marcados com fluorescência. Em alguns exemplos, a separação de células baseado na ligação de anticorpos ou outros parceiros de ligação específicos para um ou mais marcadores de superfície celular são realizados em uma corrente fluídica, tal como por classificação de células ativadas por fluorescência (FACS), incluindo escala preparativa (FACS) e/ou chips de sistemas microeletromecânicos (MEMS), por exemplo, em combinação com um sistema de detecção de citometria de fluxo. Tais métodos permitem, simultaneamente, a seleção positiva e negativa com base em vários marcadores.
[306] Em algumas modalidades, os métodos incluem métodos de separação de células com base na densidade, tal como a preparação de glóbulos brancos a partir do sangue periférico por lise dos glóbulos vermelhos e centrifugação através de um gradiente de Percoll ou Ficoll.
[307] Em qualquer uma das etapas de separação acima mencionadas, a separação não resulta em 100% de enriquecimento ou remoção de uma população de células particular ou células expressando um marcador particular. Por exemplo, seleção positiva de ou enriquecimento para células de um tipo particular, tais como aquelas expressando um marcador, refere-se ao aumento do número ou porcentagem de tais células, mas não resulta em uma ausência completa de células não expressando o marcador. Da mesma forma, a seleção negativa, remoção ou depleção de células de um tipo particular, tais como aquelas que expressam um marcador, refere-se à diminuição do número ou porcentagem de tais células, mas não resulta em uma remoção completa de todas essas células.
[308] Alternativamente, as células podem ser obtidas através de culturas de células comercialmente disponíveis para células T, incluindo, mas não limitado a, linhagens BCL2 (AAA) Jurkat (ATCC® CRL-2902™), BCL2 (S70A) Jurkat (ATCC® CRL-2900™), BCL2 (S87A) Jurkat (ATCC® CRL-2901™), BCL2 Jurkat (ATCC® CRL-2899™), Neo Jurkat (ATCC® CRL-2898™), TALL-104 (ATTC® CRL-11386); e, para células NK, as linhagens NK-92 (ATCC® CRL-2407™), NK-92MI (ATCC® CRL- 2408™).
[309] Fontes exemplificativas não limitativas para tais linhagens celulares comercialmente disponíveis incluem a American Type Culture Collection, ou ATCC, (http://www.atcc.org/) e a German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (https://www.dsmz.de/) Preparação e expansão de células
[310] Se antes ou depois da modificação genética das células imunes para expressar um CAR desejável, as células podem ser ativadas e expandidas usando métodos geralmente conhecidos ou a partir de métodos prontamente adaptados para o presente pedido, tais como aqueles descritos nas Patentes US Nº. 6,352,694; 6.534.055; 6.905.680; 6.692.964; 5.858.358; 6.887.466;
6.905.681; 7.144.575; 7.067.318; 7, 172.869; 7.232.566; 7, 175.843; 5.883.223;
6.905.874; 6.797.514; 6.867.041 e a Publicação do Pedido de Patente US Nº 20060121005, kits de ativação e expansão do sistema Life Technologies Dynabeads®; Kits de ativação BD Biosciences Phosflow™, kits de ativação/expansão Miltenyi Biotec MACS™ e outros kits de células disponíveis comercialmente específicos para frações de ativação da célula relevante. Estimulação com o antígeno HLA-G ex vivo pode ativar e expandir a subpopulação celular de expressão de CAR selecionada. Alternativamente, as células podem ser ativadas in vivo por interação com o antígeno HLA-G.
[311] A incubação e/ou manipulação pode ser realizada em um recipiente de cultura, tal como uma unidade, câmara, poço, coluna, tubo, conjunto de tubos, válvula, frasco, prato de cultura, saco ou outro recipiente para cultura ou células cultivadas.
[312] Em algumas modalidades, as células são incubadas e/ou cultivadas antes ou em conexão com a engenharia genética. As etapas de incubação podem incluir cultura, cultivo, estimulação, ativação e/ou propagação. Em algumas modalidades, as composições ou células são incubadas na presença de condições estimulantes ou um agente estimulador. Tais condições incluem aquelas projetados para induzir a proliferação, expansão, ativação e/ou sobrevivência de células na população, para imitar a exposição ao antígeno e/ou para preparar as células para engenharia genética, tal como para a introdução de um receptor de antígeno recombinante. As condições podem incluir um ou mais dos meios particulares, temperatura, teor de oxigênio, teor de dióxido de carbono, tempo, agentes, por exemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, íons e/ou fatores estimuladores, tais como citocinas, quimiocinas, antígenos, ligação de parceiros, proteínas de fusão, receptores solúveis recombinantes e quaisquer outros agentes projetados para ativar as células.
[313] Em algumas modalidades, as células imunes da presente invenção podem ser expandidas in vitro por cocultura com tecido ou células. As células também podem ser expandidas in vivo, por exemplo, no sangue do indivíduo após a administração da célula no indivíduo.
[314] Geralmente, as células T da presente invenção podem ser expandidas, por exemplo, por contato com um agente que estimula um complexo CD3 TCR e uma molécula coestimulatória na superfície das células T para criar um sinal de ativação para a célula T. Por exemplo, produtos químicos tal como ionóforo de cálcio A23187, forbol 12-miristato-13-acetato (PMA) ou lectinas mitogênicas como fitohemaglutinina (PHA) podem ser usados para criar um sinal de ativação para a célula T.
[315] Em algumas modalidades, as populações de células T podem ser estimuladas in vitro por contato com, por exemplo, um anticorpo anti-CD3, ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou um anticorpo anti-CD2 imobilizado em uma superfície, ou por contato com um ativador de proteína quinase C (por exemplo, briostatina) em conjunto com um ionóforo de cálcio. Em algumas modalidades, as populações de células T podem ser estimuladas in vitro por contato com Muromonab-CD3 (OKT3). Para a coestimulação de uma molécula acessória na superfície das células T, um ligante que se liga à molécula acessória é usado. Por exemplo, uma população de células T pode ser incubada com um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28 sob condições que estimulam a proliferação das células T.
[316] Em algumas modalidades, as células T são expandidas ao adicionar à composição de iniciação de cultura de células alimentadoras, tal como PBMC sem divisão, (por exemplo, tal que a população de células resultante contenha pelo menos cerca de 5, 10, 20 ou 40 ou mais células alimentadoras de PBMC para cada linfócito T na população inicial a ser expandida); e incubar a cultura (por exemplo, por um tempo suficiente para expandir o número de células T). Em alguns aspectos, as células alimentadoras sem divisão podem compreender células alimentadoras de PBMC com radiação gama. Em algumas modalidades, as PBMC são irradiadas com raios gama na faixa de cerca de 3000 a 3600 rads para prevenir a divisão celular. Em alguns aspectos, as células alimentadoras são adicionadas ao meio de cultura antes da adição das populações de células T.
[317] Em modalidades particulares, moléculas coestimulatórias são empregadas para intensificar a ativação, proliferação e citotoxicidade de células T produzidas pelo CAR após o acoplamento do antígeno. Um ligante coestimulatório pode incluir, mas não está limitado a, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), B7-H3, BAFFR, BTLA, BLAME (SLAMF8), CD2, CD4, CD5, CD7, CD8a, CD8β, CD1a, LFA-1 (CD11a/CD18), CD1b, CD1c, CD1d, CD18, CD19, CD19a, CD27, CD28, CD29, CD30, CD30L, CD40, CD40MICA, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD70, CD83, CD84, CD96 (Tátil), CD 100 (SEMA4D), CD 103, OX40 (CD134), 4-1BB (CD137), SLAM (SLAMF1, CD150, IPO-3), CD160 (BY55), SELPLG (CD 162), DNAM1 (CD226), Ly9 (CD229), SLAMF4 (CD244, 2B4), ICOS (CD278), CEACAM1, CDS, CRTAM, DAP10, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), HLA-G, IA4, ICAM- 1, IL2R β, IL2R γ, IL7Ra, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB1, ITGB2, ITGB7, KIRDS2, LAT, LFA-1, LIGHT, LTBR, MICB, NKG2C, NKG2D, NKP30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), PAG/Cbp, PD-1, PD-L1, PD-L2, PSGL1, SLAMF6 (NTB-A, Lyl08), SLAMF7, SLP-76, TNFR2, TRANCE/RANKL, VLA1, VLA-6, ligante coestimulatório induzível (ICOS-L), molécula de adesão intercelular (rCAM), receptor beta de linfotoxina, 3 TR6, ILT3 e ILT4. Um ligante coestimulatório também abrange, inter alia, um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula coestimulatória presente em uma célula T, tal como, mas não limitado a, CD27, CD28, 4- 1BB, OX40, CD30, CD40 PD-1, ICOS, antígeno associado à função linfocitária-1 (LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3 e um ligante que se liga especificamente ao CD83.
[318] Em algumas modalidades, as populações de células NK podem ser expandidas in vitro usando interleucina-2 (IL-2) IL-15, complexo IL-15/IL-15RA, IL-18 e IL-12.
[319] As condições apropriadas para células T e cultura de células NK incluem um meio apropriado (por exemplo, Minimal Essential Media ou RPMI Media 1640 ou, X-Vivo 10, X-Vivo 15 e X-Vivo 20 (Lonza)) que podem conter fatores necessários para a proliferação e viabilidade, incluindo soro (por exemplo, soro fetal bovino ou humano), interleucina-2 (IL-2), insulina, IFN-γ, IL- 4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-2, IL-15, IL-18, IL-21, TGF e TNF, ou quaisquer outros aditivos para o crescimento de células conhecido pelo técnico no assunto. Em uma modalidade preferida, as células T são estimuladas in vitro por exposição a OKT3 e IL-2. Outros aditivos para o crescimento de células incluem, mas não estão limitados a, tensoativo, Plasmanato e agentes redutores, tais como N-acetil-cisteína e 2-mercaptoetanol. Os meios podem incluir RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, a-MEM, F-12, X-Vivo 10, X-Vivo 15 e X-Vivo 20, Otimizador, com aminoácidos adicionados, piruvato de sódio e vitaminas, livre de soro ou suplementado com uma quantidade apropriada de soro (ou plasma) ou um conjunto definido de hormônios e/ou uma quantidade de citocina(s) suficiente para o crescimento e expansão de células T.
[320] Antibióticos, por exemplo, penicilina e estreptomicina, são incluídos apenas em culturas experimentais, não em culturas de células que serão infundidas em um indivíduo. As células alvo são mantidas sob condições necessárias para suportar o crescimento, por exemplo, uma temperatura apropriada (por exemplo, 37 graus Celsius) e atmosfera (por exemplo, ar mais 5% de CO2) As células T que foram expostas a tempos de estimulação variados podem apresentar características diferentes.
[321] Em algumas modalidades, os métodos de preparação incluem etapas para congelamento, por exemplo, criopreservação das células, antes ou depois do isolamento, incubação e/ou manipulação. Em algumas modalidades, a etapa de congelamento e descongelamento subsequente remove granulócitos e, até certo ponto, monócitos na população de células. Em algumas modalidades, as células são suspensas em uma solução de congelamento, por exemplo, após uma etapa de lavagem para remover o plasma e as plaquetas. Qualquer uma de uma variedade de soluções e parâmetros de congelamento conhecidos em alguns aspectos podem ser usados. Um exemplo envolve o uso de PBS contendo 20% de DMSO e 8% de albumina de soro humano (HSA) ou outro meio de congelamento de células adequado. Este é então diluído 1: 1 com meio de modo que a concentração final de DMSO e HSA sejam 10% e 4%, respectivamente. As células são então congeladas a -80°C a uma taxa de 1 grau por minuto e armazenadas na fase de vapor de um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido.
[322] No método inventivo, as células NK ou células T são preferencialmente ex vivo expandido por pelo menos cerca de 5 dias, preferencialmente não menos do que cerca de 10 dias, mais preferencialmente não menos do que cerca de 15 dias e mais preferencialmente não menos do que cerca de 20 dias antes da administração ao paciente.
[323] Em outra modalidade, as células NK ou células T foram expandidas pelo menos cerca de 100 vezes, preferencialmente pelo menos cerca de 200 vezes, e mais preferencialmente pelo menos cerca de 400 vezes, preferencialmente pelo menos cerca de 600 vezes, mais preferencialmente pelo menos cerca de 1000 vezes e ainda mais preferencialmente pelo menos cerca de 1500 vezes em comparação com o dia 0 de expansão, antes da administração a um paciente. Transdução e seleção de células
[324] O constructo de ácido nucleico de acordo com a presente invenção pode ser transduzido em células imunes para criar uma célula imune que expressam o CAR anti-HLA-G de acordo com a presente invenção. Em certas modalidades, as células são transduzidas para compreender pelo menos um CAR da presente invenção.
[325] É contemplado que o constructo de ácido nucleico quimérico pode ser introduzido nas próprias células imunes do indivíduo como DNA nu ou em um vetor adequado. Métodos de transfecção estável de células imunes, particularmente células T, por eletroporação usando DNA nu são conhecidos no estado da técnica. Ver, por exemplo, Patente US Nº 6,410,319. DNA nu geralmente refere-se ao DNA codificando um receptor quimérico da presente invenção contido em um vetor de expressão de plasmídeo na orientação apropriada para expressão. Vantajosamente, a utilização de DNA nu reduz o tempo necessário para produzir células T que expressam o receptor quimérico da presente invenção. Os métodos físicos para introduzir um constructo de ácido nucleico em uma célula hospedeira incluem precipitação de fosfato de cálcio, lipofecção, bombardeio de partículas, microinjeção, eletroporação e semelhantes.
[326] Alternativamente, os métodos biológicos para introduzir um polinucleotídeo de interesse em uma célula hospedeira incluem o uso de vetores de DNA e RNA. Uma variedade de vetores virais, tal como o vetor descrito acima, pode ser usada para introduzir o constructo de ácido nucleico da presente invenção em células imunes. Os vetores adequados para uso de acordo com o método da presente invenção não se replicam nas células imunes do indivíduo.
[327] Em uma modalidade, o constructo de ácido nucleico codificando o CAR de acordo com a presente invenção é introduzido em uma célula imune por um vetor viral, particularmente um vetor lentiviral como descrito acima.
[328] Alternativamente, os meios químicos para introduzir um polinucleotídeo em uma célula hospedeira incluem sistemas de dispersão coloidal, tais como complexos de macromoléculas, nanocápsulas, microesferas, grânulos e sistemas à base de lipídios, incluindo emulsões de óleo em água,
micelas, micelas mistas e lipossomas. Um sistema coloidal exemplar para uso como um veículo de entrega in vitro e in vivo é um lipossoma (por exemplo, uma vesícula de membrana artificial).
[329] Independentemente do método usado para introduzir ácidos nucleicos exógenos em uma célula hospedeira ou de outra forma expor uma célula ao inibidor da presente invenção, a fim de confirmar a presença da sequência de DNA recombinante na célula hospedeira, uma variedade de ensaios pode ser realizada. Tais ensaios incluem, por exemplo, ensaios de “biologia molecular” bem conhecidos pelos técnicos no assunto, tais como Southern e Northern blotting, RT-PCR e PCR; Ensaios "bioquímicos", tais como a detecção da presença ou ausência de um peptídeo particular, por exemplo, por meios imunológicos (ELISAs e Western blots) ou por ensaios descritos na presente invenção para identificar os agentes que se enquadram no escopo da presente invenção. Métodos de teste de um CAR para a capacidade de reconhecer células alvo e quanto à especificidade do antígeno são conhecidos no estado da técnica. Por exemplo, Clay et al, J. Immunol., 163: 507-513 (1999), ensina métodos de medir a lieração de citocinas (por exemplo, interferon-γ, fator estimulador de colônia de granulócitos/monócitos (GM-CSF), fator de necrose tumoral a (TNF-α) ou interleucina 2 (IL-2)). Além disso, a função CAR pode ser avaliada por medição da citotoxicidade celular, como descrito em Zhao et al, J. Immunol., 174: 4415-4423 (2005).
[330] Uma vez que seja estabelecido que a célula imune transfectada ou transduzida é capaz de expressar o receptor quimérico como uma proteína de membrana de superfície com a regulação desejada e em um nível desejado, pode ser determinado se o receptor quimérico é funcional na célula hospedeira para fornecer a indução de sinal desejada. Subsequentemente, as células imunes transduzidas podem ser adicionalmente reintroduzidas ou administradas ao indivíduo para ativar respostas antitumorais no indivíduo. Para facilitar administração, as células T transduzidas de acordo com a presente invenção podem ser feitas em uma composição farmacêutica ou em um implante apropriado para administração in vivo, com diluentes ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis.
[331] Uma vez que as células expressando o CAR de acordo com a presente invenção são administradas a um indivíduo, a atividade biológica das populações de células manipuladas e/ou anticorpos em alguns aspectos é medida por qualquer um de inúmeros métodos conhecidos. Os parâmetros para avaliar incluem a ligação específica de uma célula T natural ou manipulada ou outra célula imune ao antígeno, in vivo, por exemplo, por imageamento, ou ex vivo, por exemplo, por ELISA ou citometria de fluxo. Em certas modalidades, a capacidade das células manipuladas de destruir células alvo pode ser medida usando qualquer método adequado conhecido no estado da técnica, tal como ensaios de citotoxicidade descritos em, por exemplo, Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32 (7): 689-702 (2009) e Herman et al. J. Immunological Methods, 285 (1): 25-40 (2004). Em certas modalidades, a atividade biológica das células também pode ser medida pelo ensaio de expressão e/ou secreção de certas citocinas, tais como GM-CSF, IL-3, MIP-1α, TNF-α, IL-10, IL-13, IFN-γ ou IL-
2.
[332] Em alguns aspectos, a atividade biológica é medida avaliando o resultado clínico, tal como redução na carga ou carga tumoral, estabilização do tumor, sobrevida livre de progressão ou sobrevida global. Composição farmacêutica ou veterinária
[333] A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica ou veterinária compreendendo o anticorpo anti-HLA-G ou fragmento de anticorpo, o CAR, o constructo de ácido nucleico, o vetor e/ou a célula como descrito acima.
[334] Em um aspecto particular, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica ou veterinária compreendendo células, preferencialmente células imunes, compreendendo um CAR como descrito na presente invenção acima e/ou compreendendo o constructo de ácido nucleico codificando como descrito acima. Em um aspecto, a composição farmacêutica ou veterinária pode compreender pelo menos duas populações diferentes de células, uma primeira com células compreendendo um CAR que se liga especificamente ao HLA-G associado a β2M, preferencialmente ao HLA-G1 e HLA-G5 e um segundo com células compreendendo um CAR que se liga especificamente ao HLA-G livres de β2M, preferencialmente para ambos HLA-G2 e HLA-G6 e/ou ambos HLA-G1/livres de β2M e isoformas de HLA-G5/livres de β2M. Em outro aspecto, a composição farmacêutica ou veterinária pode compreender uma população de células compreendendo pelo menos dois CARs, um primeiro CAR que se liga especificamente ao HLA-G associado a β2M, preferencialmente ambos HLA-G1 e HLA-G5 e um segundo CAR que se liga especificamente para o HLA-G livres de β2M, preferencialmente para ambos HLA-G2 e HLA-G6 e/ou HLA-G1/livres de β2M e/ou isoformas HLA-G5/livres de β2M. Em outro aspecto, a composição farmacêutica ou veterinária pode compreender uma população de células compreendendo um CAR biespecífico que permite a ligação específica ao HLA-G associado a β2M, preferencialmente ao HLA-G1 e HLA-G5 e ao HLA-G livre de β2M preferencialmente para ambos HLA-G2 e HLA-G6 e ainda mais preferencialmente para ambos HLA-G2 e HLA-G6 e/ou para ambos HLA-G1/livres β2M e isoformas de HLA-G5/livres de β2M.
[335] Em um aspecto adicional, a composição farmacêutica ou veterinária pode compreender uma primeira população de células que expressam um CAR ou pelo menos dois CAR ou um CAR biespecífico, como descrito acima,
direcionando HLA-G associado a β2M e/ou isoformas de HLA-G livres de β2M, e uma segunda população de células expressando um CAR que não reconhece HLA-G, mas reconheceu um antígeno conhecido por ser um alvo de interesse em terapias de CAR, tais como terapias antitumorais e/ou antivirais. Será entendido que essa segunda população de células expressando CAR não tem HLA-G como alvo.
[336] A presente invenção também se refere a uma composição farmacêutica ou veterinária contendo uma pluralidade de células expressando CAR da presente invenção, tais como células T e/ou células NK. A composição farmacêutica pode compreender adicionalmente um carreador, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável. A composição farmacêutica pode compreender opcionalmente um ou mais polipeptídeos e/ou compostos farmaceuticamente ativos adicionais.
[337] Em uma modalidade, a concentração da célula expressando CAR de acordo com a presente invenção que está incluída na composição farmacêutica ou veterinária é de pelo menos 0,001 mg/mL, pelo menos 0,1 mg/mL, pelo menos 0,5 mg/mL, pelo menos 1 mg/mL, pelo menos 5 mg/mL, pelo menos 10 mg/mL, pelo menos 15 mg/mL, pelo menos 20 mg/mL, pelo menos 25 mg/mL, pelo menos 30 mg/mL, pelo menos 35 mg/mL, pelo menos 40 mg/mL, pelo menos 45 mg/mL, pelo menos 50 mg/mL, pelo menos 55 mg/mL, pelo menos 60 mg/mL, pelo menos 65 mg/mL, pelo menos 70 mg/mL, pelo menos 75 mg/mL, pelo menos 80 mg/mL, pelo menos 85 mg/mL, pelo menos 90 mg/mL, pelo menos 95 mg/mL, pelo menos 100 mg/mL, pelo menos 105 mg/mL, pelo menos 110 mg/mL, pelo menos 115 mg/mL, pelo menos 120 mg/mL, pelo menos 125 mg/mL, pelo menos 130 mg/mL, pelo menos 135 mg/mL, pelo menos 140 mg/mL, a pelo menos 150 mg/mL, pelo menos 175 mg/mL, pelo menos 200 mg/mL, pelo menos 250 mg/mL, pelo menos 275 mg/mL ou pelo menos 300 mg/mL.
[338] Em outra modalidade, a concentração da célula expressando CAR de acordo com a presente invenção que está incluída na composição farmacêutica ou veterinária está entre 0,001-0,01 mg/mL entre 0,01-0,1 mg/mL, entre 0,1-1 mg/mL, entre 1-10 mg/mL, entre 10-50 mg/mL, entre 50-100 mg/mL, entre 50- 150 mg/mL, entre 50-200 mg/mL, entre 50-250 mg/mL, entre 50- 300 mg/mL, entre 100-200 mg/mL, entre 100-300 mg/mL ou entre 200-300 mg/mL.
[339] Em outra modalidade, a composição farmacêutica ou veterinária compreende células expressando o CAR de acordo com a presente invenção, particularmente pelo menos 100 células, pelo menos 200 células, pelo menos 400 células, pelo menos 500 células, pelo menos 700 células, pelo menos 1000 células, pelo menos 1.500 células, pelo menos 2.000 células, pelo menos 3.000 células, pelo menos 5.000 células, pelo menos 10.000 células, pelo menos
100.000 células, pelo menos 1 milhão de células, pelo menos 10 milhões de células ou pelo menos 100 milhões de células expressando o CAR de acordo com a presente invenção.
[340] A composição farmacêutica ou veterinária de acordo com a presente invenção pode ser formulada para qualquer via de administração convencional incluindo uma administração tópica, enteral, oral, parenteral, intranasal, intravenosa, intramuscular, subcutânea ou intraocular e semelhantes.
[341] Preferencialmente, a composição farmacêutica ou veterinária de acordo com a presente invenção pode ser administrada por via de administração enteral ou parenteral. Quando administrada parenteralmente, a composição farmacêutica ou veterinária de acordo com a presente invenção é preferencialmente administrada por via de administração intravenosa. Quando administrada enteralmente, a composição farmacêutica ou veterinária de acordo com a presente invenção é preferencialmente administrada por via oral de administração.
[342] Será entendido por um técnico no assunto que as formulações da presente invenção podem ser isotônicas com sangue humano que as formulações da presente invenção têm essencialmente a mesma pressão osmótica que o sangue humano. Tais formulações isotônicas geralmente têm uma pressão osmótica de cerca de 250 mOSm a cerca de 350 mOSm. A isotonicidade pode ser medida por, por exemplo, uma pressão de vapor ou osmômetro do tipo de congelamento de gelo. A tonicidade de uma formulação é ajustada pelo uso de modificadores de tonicidade. "Modificadores de tonicidade" são aquelas substâncias inertes farmaceuticamente aceitáveis que podem ser adicionadas à formulação para fornecer uma isotonicidade da formulação. Os modificadores de tonicidade adequados para esta presente invenção incluem, mas não estão limitados a, sacarídeos, sais e aminoácidos.
[343] As composições e formulações para administração parenteral, intratecal ou intraventricular podem incluir soluções aquosas estéreis que também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados, tais como, mas não limitado a, intensificadores de penetração, compostos carder e outros carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.
[344] A composição farmacêutica ou veterinária de acordo com a presente invenção pode adicionalmente compreender um veículo farmaceuticamente aceitável. Assim, aspectos adicionais da presente invenção referem-se a composições compreendendo um carreador e um ou mais dos produtos - por exemplo, uma célula compreendendo um CAR anti-HLA-G, um ácido nucleico, um vetor, um anticorpo anti-HLA-G ou fragmento de anticorpo - descrito nas modalidades reveladas na presente invenção. As formulações podem ser esterilizadas e, se desejado, misturadas com agentes auxiliares, tais como carreadores e excipientes que não interagem deleteriamente com os produtos -
por exemplo, uma célula compreendendo um CAR anti-HLA-G, um ácido nucleico, um vetor, um anticorpo anti-HLA-G ou fragmento de anticorpo– da formulação.
[345] Preferencialmente, as composições farmacêuticas ou veterinárias da presente invenção incluindo, mas não limitada a qualquer uma das composições reivindicadas, podem compreender células que expressam CAR, como descrito na presente invenção, em combinação com um ou mais carreadores, diluentes ou excipientes farmaceuticamente ou fisiologicamente aceitáveis, como descrito a seguir. Desejavelmente, é empregada uma forma farmaceuticamente aceitável que não afeta adversamente os efeitos de potenciação imunológica de células recombinantes desejados de acordo com a presente invenção.
[346] Para facilitar a administração, as células imunes transduzidas, preferencialmente células T e/ou células NK transduzidas com o constructo de ácido nucleico codificando o CAR de acordo com a presente invenção, podem ser feitas em uma composição farmacêutica para administração in vivo, com carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis apropriados. Os meios de fazer tal composição foram descritos no estado da técnica (ver, por exemplo, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins, 21ª edição (2005).
[347] Particularmente, as formulações compreendendo populações de células expressando CAR podem incluir excipiente(s) farmaceuticamente aceitável(s). Os excipientes incluídos nas formulações terão diferentes finalidades dependendo, por exemplo, do constructo CAR, da subpopulação de células usada e do modo de administração. As formulações compreendendo populações de células expressando CAR serão tipicamente preparadas e cultivadas na ausência de quaisquer componentes não humanos, tal como soro animal (por exemplo, albumina sérica bovina).
[348] A formulação ou composição também pode conter mais que um ingrediente ativo útil para a indicação, doença ou condição particular sendo tratada com as moléculas ou células de ligação, preferencialmente aquelas com atividades complementares à molécula ou célula de ligação, onde as respectivas atividades não afetam adversamente um ao outro. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para o propósito pretendido.
[349] A composição farmacêutica ou veterinária em alguns aspectos pode empregar sistemas de entrega de liberação prolongada, liberação retardada e liberação sustentada, tal que a entrega da composição ocorra antes e com tempo suficiente para causar a sensibilização do sítio a ser tratado. Meios conhecidos no estado da técnica podem ser usados para minimizar ou prevenir a liberação e absorção da composição até que ela alcance o tecido ou órgão alvo, ou para assegurar a liberação prolongada da composição. Tais sistemas podem evitar administrações repetidas da composição, aumentando assim a conveniência para o indivíduo e o médico. Indivíduo, regime e administração
[350] A presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica da presente invenção ou a células expressando CAR da presente invenção para uso como um medicamento ou para uso no tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo. Também se refere ao uso de uma composição farmacêutica da presente invenção ou de células expressando CAR da presente invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo. Finalmente, refere-se a um método para o tratamento de uma doença ou distúrbio em um indivíduo, compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz de uma composição farmacêutica da presente invenção ou células expressando CAR da presente invenção ao indivíduo.
[351] O indivíduo humano de acordo com a presente invenção pode ser um ser humano na fase pré-natal, um recém-nascido, uma criança, um bebê, um adolescente ou um adulto, em particular um adulto de pelo menos 40 anos de idade, preferencialmente um adulto de pelo menos 50 anos, ainda mais preferencialmente um adulto de pelo menos 60 anos, ainda mais preferencialmente um adulto de pelo menos 70 anos.
[352] Em algumas modalidades, o indivíduo é um modelo animal validado para doença, terapia celular adotivas e/ou para avaliar resultados tóxicos, tal como síndrome de liberação de citocinas (CRS).
[353] Em algumas modalidades, o indivíduo tem doença persistente ou recidivante, por exemplo, após o tratamento com outra imunoterapia e/ou outra terapia, incluindo quimioterapia, radiação e/ou transplante de células-tronco hematopoiéticas (HSCT), por exemplo, HSCT alogênico. Em algumas modalidades, a administração trata efetivamente o indivíduo, apesar de o indivíduo ter se tornado resistente a outra terapia. Em algumas modalidades, o indivíduo não teve uma recidiva, mas está determinado a estar em risco de recidiva, tal como um alto risco de recidiva e, assim, o composto ou composição é administrado profilaticamente, por exemplo, para reduzir a probabilidade de ou prevenir a recidiva.
[354] Em algumas modalidades, a presente invenção inclui a administração de células expressando o CAR da presente invenção ou uma composição contendo células expressando o CAR a um indivíduo, tal como aquele que tem, está em risco ou é suspeito de ter uma doença, condição ou distúrbio. Em algumas modalidades, as células e composições são administradas a um indivíduo com uma doença ou condição particular a ser tratada, por exemplo, via terapia celular adotiva, tal como terapia de células T adotivas. Em algumas modalidades, as células ou composições são administradas ao indivíduo, tal como um indivíduo com ou em risco de uma doença ou condição. Em alguns aspectos, os métodos tratam assim, por exemplo, melhoram um ou mais sintomas da doença ou condição. Em uma modalidade preferida, o indivíduo foi diagnosticado com uma doença imune, preferencialmente um câncer. Os métodos de diagnóstico de doenças autoimunes ou câncer são bem conhecidos pelos técnicos no assunto.
[355] Em uma modalidade particular, o indivíduo já recebeu pelo menos uma linha de tratamento, preferencialmente várias linhas de tratamento, antes da administração de células imunes de acordo com a presente invenção ou de uma composição farmacêutica ou veterinária de acordo com a presente invenção.
[356] Preferencialmente, o tratamento é administrado regularmente, preferencialmente entre todos os dias e todos os meses, mais preferencialmente entre todos os dias e a cada duas semanas, mais preferencialmente entre todos os dias e todas as semanas, ainda mais preferencialmente o tratamento é administrado todos os dias. Em uma modalidade particular, o tratamento é administrado várias vezes ao dia, preferencialmente 2 ou 3 vezes ao dia, ainda mais preferencialmente 3 vezes ao dia.
[357] A duração do tratamento com o vetor de acordo com a presente invenção, com as células imunes de acordo com a presente invenção ou com uma composição farmacêutica ou veterinária de acordo com a presente invenção é preferencialmente compreendida entre 1 dia e 20 semanas, mais preferencialmente entre 1 dia e 10 semanas, ainda mais preferencialmente entre 1 dia e 4 semanas, ainda mais preferencialmente entre 1 dia e 2 semanas. Em uma modalidade particular, a duração do tratamento é de cerca de 1 semana. Alternativamente, o tratamento pode durar enquanto a doença persistir.
[358] A forma das composições farmacêuticas ou veterinárias, a via de administração e a dose de administração de células imunes de acordo com a presente invenção ou de uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção podem ser ajustadas pelo técnico no assunto de acordo com o tipo e gravidade da infecção, e para o paciente, em particular sua idade, peso, sexo e condição física geral. As composições da presente invenção podem ser administradas de várias maneiras dependendo se o tratamento local ou sistêmico é desejado.
[359] No caso de terapia celular adotiva, os métodos para administração de células para terapia celular adotiva são conhecidos e podem ser usados em conexão com os métodos e composições fornecidos. Por exemplo, métodos de terapia de células T adotivas são descritos, por exemplo, na Publicação do Pedido de Patente US Nº 2003/0170238 para Gruenberg et al; Patente US No. 4.690.915 de Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85). Ver, por exemplo, Themeli et al. (2013) Nat Biotechnol. 31 (10): 928-933; Tsukahara et al. (2013) Biochem Biophys Res Commun 438 (1): 84-9; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8 (4): e61338.
[360] Um técnico no assunto reconhecerá que, embora mais que uma via possa ser usada para administração, uma via particular pode fornecer uma reação mais imediata e mais eficaz do que outra via. Por exemplo, a liberação intradérmica pode ser vantajosamente usada em vez da inalação para o tratamento de melanoma. A liberação local ou sistêmica pode ser alcançada por administração compreendendo a aplicação ou instilação da formulação nas cavidades corporais, inalação ou insuflação de um aerossol, ou por introdução parenteral, compreendendo administração intramuscular, intravenosa, intraportal, intra-hepática, peritoneal, subcutânea ou intradérmica.
[361] Embora a injeção sistêmica (intravenosa, IV) seja favorecida em aplicações clínicas devido à sua facilidade de administração, vários estudos pré- clínicos (Carpenito, et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106: 3360-3365; Song, et al. (2011) Cancer Res. 71: 4617-4627; Parente-Pereira, et al. (2011) J. Clin. Immunol. 31: 710-718) sugerem que a administração local (intratumoral, IT ou intraperitoneal, IP) de células T pode fornecer efeitos terapêuticos ideais, que podem ser, em parte, devido ao aumento do tráfego de células T para o tumor. Por exemplo, foi demonstrado que as células CAR T permanecem no sítio da inoculação com absorção sistêmica mínima quando distribuídas por vias IP ou IT (Parente-Pereira, et al. (2011) J. Clin. Immunol. 31:710-718). Em contraste, após a administração intravenosa, as células CAR T atingem inicialmente os pulmões e, em seguida, são redistribuídas para o baço, fígado e linfonodo. Além disso, as células CAR T eletroporadas com RNA podem ser particularmente adequadas para administração local, devido à natureza transitória da expressão de CAR nas células T (Zhao, et al. (2010) Cancer Res. 70:9053-9061). Além disso, estudos clínicos demonstraram a viabilidade e segurança de ambas as injeções intratumoral e intraperitoneal de células T (Canevari, et al. (1995) J. Natl. Cancer Inst. 87: 1463-1469; Duval, et al. (2006) Clin. Cancer Res. 12:1229-1236). No geral, uma via local de administração das células T recombinantes pode fornecer o efeito terapêutico ideal e diminuir o potencial para a toxicidade "no alvo, fora do órgão". Consequentemente, em uma modalidade, as células expressando CAR de acordo com a presente invenção são administradas localmente, preferencialmente por injeção intratumoral e intraperitoneal.
[362] A composição farmacêutica em algumas modalidades contém as células CAR em quantidades eficazes para tratar ou prevenir a doença ou condição, tal como uma quantidade terapeuticamente eficaz ou profilaticamente eficaz. A eficácia terapêutica ou profilática em algumas modalidades é monitorada por avaliação periódica dos indivíduos tratados. Para administrações repetidas durante vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é repetido até que ocorra a supressão desejada dos sintomas da doença. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis e podem ser determinados. A dosagem desejada pode ser liberada por uma única administração em bolus da composição, por múltiplas administrações em bolus da composição ou por administração por infusão contínua da composição. A quantidade de células imunes de acordo com a presente invenção ou de uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção a ser administrada pode ser determinada por procedimento padrão bem conhecido pelos técnicos no assunto. Os dados fisiológicos do paciente (por exemplo, idade, tamanho, peso e saúde e peso do receptor, tipo de tratamento simultâneo, se houver, frequência do tratamento e a natureza do efeito desejado) e as vias de administração devem ser levados em consideração para determinar a dosagem apropriada, de modo que uma quantidade terapeuticamente eficaz será administrada ao paciente. Particularmente, as dosagens apropriadas e o cronograma de dosagem podem ser baseados em ensaios clínicos ou terapias baseadas em células bem estabelecidas (ver, por exemplo, Topalian & Rosenberg (1987) Acta Haematol. 78 Suplemento 1: 75-6; US 4.690.915) ou uma estratégia alternativa de infusão contínua pode ser empregada.
[363] Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz ou número de células ou composição farmacêutica compreendendo essas células são administrados por parenteralmente. Em algumas modalidades, a administração pode ser uma administração intravenosa. Em algumas modalidades, a administração pode ser feita diretamente por injeção dentro de um tumor.
[364] Em certas modalidades, no contexto de células geneticamente manipuladas expressando os CARs, um indivíduo é administrado na faixa de cerca de um milhão a cerca de 100 bilhões de células, tal como, por exemplo, 1 milhão a cerca de 50 bilhões de células (por exemplo, cerca de 5 milhões de células, cerca de 25 milhões de células, cerca de 500 milhões de células, cerca de 1 bilhão de células, cerca de 5 bilhões de células, cerca de 20 bilhões de células, cerca de 30 bilhões de células, cerca de 40 bilhões de células ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores anteriores), tal como cerca de 10 milhões a cerca de 100 bilhões de células (por exemplo, cerca de 20 milhões de células, cerca de 30 milhões de células, cerca de 40 milhões de células, cerca de 60 milhões de células, cerca de 70 milhões de células, cerca de 80 milhões de células, cerca de 90 milhões de células, cerca de 10 bilhões células, cerca de 25 bilhões de células, cerca de 50 bilhões de células, cerca de 75 bilhões de células, cerca de 90 bilhões de células ou uma faixa definida por quaisquer dois dos valores anteriores) e, em alguns casos, cerca de 100 milhões de células a cerca de 50 bilhões de células (por exemplo, cerca de 120 milhões de células, cerca de 250 milhões de células, cerca de 350 milhões de células, cerca de 450 milhões de células, cerca de 650 milhões de células, cerca de 800 milhões de células, cerca de 900 milhões de células, cerca de 3 bilhões de células, cerca de 30 bilhões de células, cerca de 45 bilhões de células) ou qualquer valor entre essas faixas, e/ou tal número de células por quilograma de peso corporal do indivíduo.
Por exemplo, em algumas modalidades, a administração das células ou população de células pode compreender a administração de cerca de 103 para cerca de 109 células por kg de peso corporal incluindo todos os valores inteiros de números de células dentro dessas faixas, por exemplo, as composições de células da presente invenção podem ser administradas em uma dose, ou dosagens, em que cada dose compreende pelo menos 10 células/kg de peso corporal, em pelo menos 100 células/kg de peso corporal; pelo menos 1000 células/kg de peso corporal; pelo menos 10.000 células; pelo menos 100.000 células; pelo menos 1 milhão de células; pelo menos 10 milhões de células; pelo menos 100 milhões de células; pelo menos 1 bilhão de células ou pelo menos 10 bilhões de células/kg de peso corporal.
[365] Particularmente, um número suficiente de células imunes transduzidas será introduzido de modo a atingir a resposta terapêutica desejada. Desejavelmente, uma quantidade eficaz ou número suficiente das células transduzidas isoladas está presente na composição e introduzida no indivíduo tal que respostas de agente antitumor ou anti-infecciosas específicas de longo prazo são estabelecidas para reduzir o tamanho ou recrescimento de um tumor ou crescimento de um agente infeccioso que de outra forma resultaria na ausência de tal tratamento. Desejavelmente, a quantidade de células imunes transduzidas, preferencialmente células T, reintroduzidas no indivíduo causa 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98 % ou 100% de diminuição no tamanho do tumor quando comparado às mesmas condições, em que as células imunes transduzidas não estão presentes.
[366] Uma composição da presente invenção pode ser fornecida na forma de dosagem unitária em que cada unidade de dosagem, por exemplo, uma injeção, contém uma quantidade predeterminada da composição, sozinha ou em combinação apropriada com outros agentes ativos. O termo forma de dosagem unitária, como usado na presente invenção, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para indivíduo animais e humanos, cada unidade contendo uma quantidade predeterminada da composição da presente invenção, sozinha ou em combinação com outros agentes ativos, calculada em uma quantidade suficiente para produzir o efeito desejado, em associação com um diluente, carreador ou veículo farmaceuticamente aceitável, quando apropriado. As especificações para as novas formas de dosagem unitária da presente invenção dependem da farmacodinâmica particular associada à composição farmacêutica no indivíduo particular.
[367] As células ou população de células podem ser administradas em uma ou mais doses. Em algumas modalidades, a referida quantidade eficaz ou número de células pode ser administrado como uma dose única. Em algumas modalidades, a referida quantidade eficaz ou número de células pode ser administrado como mais que uma dose ao longo de um período de tempo. O temporizador da administração está ao critério do médico responsável e depende da condição clínica do paciente. Embora as necessidades individuais variem, a determinação de faixas ideais de quantidades eficazes de um dado tipo de célula para uma doença ou condições particulares dentro das habilidades dos técnicos no assunto. Uma quantidade eficaz significa uma quantidade que fornece um benefício terapêutico ou profilático.
[368] Para as finalidades da presente invenção, a quantidade ou dose do material CAR inventivo administrado deve ser suficiente para gerar uma resposta terapêutica ou profilática no indivíduo ao longo de um período de tempo razoável. Por exemplo, a dose do material CAR inventivo deve ser suficiente para se ligar ao antígeno, por exemplo, isoforma(s) HLA-G, ou detectar, tratar ou prevenir doenças em um período de cerca de 2 horas ou mais, por exemplo, cerca de 12 a cerca de 24 ou mais horas, a partir do momento da administração. Em certas modalidades, o período de tempo pode ser ainda mais longo. A dose será determinada pela eficácia do material CAR particular da presente invenção e pela condição do indivíduo, bem como pelo peso corporal do indivíduo a ser tratado.
[369] Para as finalidades da presente invenção, um ensaio, que compreende, por exemplo, comparar a extensão em que as células alvo são lisadas ou IFN-γ é secretado por células T expressando o CAR, polipeptídeo ou proteína inventivos após a administração de uma determinada dose de tais células T para um mamífero, entre um conjunto de mamíferos dos quais cada um é dado uma dose diferente das células T, podem ser usadas para determinar uma dose inicial a ser administrada a um mamífero. A extensão em que as células alvo são lisadas ou IFN-γ é secretado após a administração de uma certa dose pode ser ensaiada por métodos conhecidos no estado da técnica. Usos Uso no tratamento de doenças ou distúrbios e em Terapia Combinada
[370] Em um aspecto, a doença ou distúrbio a ser tratado é uma condição selecionada a partir de uma doença ou distúrbio proliferativo, preferencialmente câncer; uma doença ou distúrbio infeccioso, preferencialmente uma infecção viral; uma doença ou distúrbio inflamatório; e uma doença ou distúrbio imune, preferencialmente doenças autoimunes ou de autoimunidade, alergias e rejeição de enxerto contra hospedeiro. Em algumas modalidades, a condição pode ser câncer.
[371] A presente invenção refere-se ao uso de um anticorpo, uma célula, um constructo de ácido nucleico, um vetor e/ou uma composição farmacêutica de acordo com a presente invenção para interferir ou neutralizar a regulação negativa imune devido às proteínas HLA-G em um hospedeiro em necessidade do mesmo.
[372] Em particular, a célula, o constructo de ácido nucleico, o vetor e/ou a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção são particularmente adequados para o tratamento de infecções virais, tais como por exemplo infecções por HIV-1, vírus da hepatite B e vírus da hepatite C.
[373] Em particular, a célula, o constructo de ácido nucleico, o vetor e/ou a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção são particularmente adequados para o tratamento de câncer, particularmente de tumores sólidos ou câncer hematopoiético, ainda mais preferencialmente quando a disponibilidade de bons alvos únicos seletivos é limitada.
[374] O sistema imunológico pode identificar e eliminar especificamente células tumorais com base em sua expressão de antígenos específicos de tumor ou moléculas induzidas durante a transformação de células malignas. Este processo é conhecido como vigilância imunológica tumoral. Apesar da vigilância imunológica tumoral, os tumores ainda podem se desenvolver na presença de um sistema imunológico em funcionamento. Isso ocorre por meio da imunoedição tumoral, um processo que compreende três fases principais: 1) a fase de eliminação em que a maioria das células tumorais imunogênicas são eliminadas pelas células T citotóxicas e NK; 2) a fase de equilíbrio na qual as células tumorais com imunogenicidade reduzida são selecionadas; e 3) a fase de escape em que as variantes que não respondem mais ao sistema imunológico do hospedeiro são mantidas (Urosevic and Dummer, 2008). O HLA-G está envolvido em todas as fases da imuno-edição tumoral, ao diminuir a eliminação das células tumorais, ao inibir a função citotóxica das células T e NK e por trogocitose (ou seja, a transferência intercelular de moléculas HLA-G viáveis), que torna as células citotóxicas competentes que não respondem aos antígenos tumorais (LeMaoult et al., 2007; Caumartin et al., 2007). Portanto, os constructos quiméricos da presente invenção encontram aplicação em indivíduos tendo ou suspeitos de ter uma doença, distúrbio ou uma condição particular, particularmente indivíduos tendo ou suspeitos de ter um câncer. Particularmente, os constructos quiméricos da presente invenção encontram aplicação em indivíduos tendo ou suspeitos de ter um câncer, reduzindo assim o tamanho de um tumor ou prevenindo o crescimento ou recrescimento de um tumor nestes indivíduos ou prevenindo a indução de um microambiente imunossupressor.
[375] Consequentemente, a presente invenção também se refere a métodos para inibir o crescimento de um tumor em um indivíduo em necessidade do mesmo e/ou para tratar um paciente com câncer que necessite do mesmo. O tumor pode ser um tumor sólido ou um tumor líquido. Em algumas modalidades, o tumor ou câncer expressa ou superexpressa HLA-G. Em certas modalidades, esses métodos compreendem, ou alternativamente consistem essencialmente em, ou consistem ainda, adicionalmente, em, administrar ao indivíduo ou paciente uma quantidade eficaz da célula isolada. Em ainda modalidades adicionais, a célula expressando um CAR de acordo com a presente invenção é uma célula T ou uma célula NK. A célula isolada pode ser alogênica ou autóloga para o indivíduo ou paciente a ser tratado. Em um aspecto adicional, o tumor expressa ou superexpressa o antígeno HLA-G e o indivíduo foi selecionado para a terapia por um diagnóstico.
[376] Em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método para reduzir o crescimento ou prevenir a formação de tumor em um indivíduo ao introduzir um constructo quimérico da presente invenção em uma célula imune, preferencialmente uma célula T ou uma célula NK, do indivíduo e reintroduzindo em o indivíduo a célula imune transformada, expressando assim o CAR de acordo com a presente invenção e efetuando respostas antitumorais para reduzir ou eliminar tumores no indivíduo. A etapa de liberação do constructo de ácido nucleico ao indivíduo geralmente envolve a introdução de um constructo de ácido nucleico da presente invenção em uma célula imune isolada (por exemplo, uma célula imune autóloga isolada de PBMC ou células imunes derivadas de um doador de células imunes derivadas de terceiros alogênicos) e introduzir no indivíduo a célula imune transformada, efetuando assim respostas antitumorais para reduzir ou eliminar tumores no indivíduo, como em um método de terapia de células T adotivas. Por exemplo, a célula imune pode compreender uma célula T e o indivíduo está sofrendo de, ou acredita-se que esteja sofrendo de, ou é diagnosticado como tendo tumor ou câncer, por exemplo, um câncer expressando HLA-G. Por exemplo, as moléculas anti-HLA-G CAR codificadas por constructos de ácido nucleico exemplificativas da presente invenção podem ser administradas ao indivíduo na forma de uma célula imune recombinante manipulada para expressar a molécula anti-HLA-G CAR.
[377] As células expressando CAR de acordo com a presente invenção e obtidas pelos métodos descritos acima, ou linhagens celulares derivadas de tais células, podem ser usadas como um medicamento no tratamento de uma doença, distúrbio ou condição em um indivíduo. Em algumas modalidades, tal medicamento pode ser usado para tratamento do câncer.
[378] Em algumas modalidades, administrar o tratamento ao indivíduo pode compreender terapia celular adotiva (ACT) usando células imunes colhidas do indivíduo ou de um ou mais doadores. Consequentemente, as células podem ser células que são xenogênicas, alogênicas ou autólogas para o indivíduo. Geralmente, as células são autólogas para o indivíduo.
[379] Em algumas modalidades, a terapia celular, por exemplo, terapia celular adotiva, por exemplo, terapia de células T adotivas, é realizada por transferência autóloga, em que as células são isoladas e/ou preparadas de outra forma a partir do indivíduo que vai receber a terapia celular, ou de uma amostra derivada de tal indivíduo. Assim, em alguns aspectos, as células são derivadas de um indivíduo, por exemplo, paciente, com necessidade de um tratamento e as células, após o isolamento e processamento, são administradas ao mesmo indivíduo.
[380] Em algumas modalidades, a terapia celular, por exemplo, terapia celular adotiva, por exemplo, terapia de células T adotivas, é realizada por transferência alogênica, na qual as células são isoladas e/ou preparadas de outra forma a partir de um indivíduo diferente que está para receber ou quem finalmente recebe a terapia celular, por exemplo, um primeiro indivíduo. Em tais modalidades, as células são administradas para um indivíduo diferente, por exemplo, um segundo indivíduo da mesma espécie. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo indivíduo são geneticamente idênticos. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo indivíduo são geneticamente semelhantes. Em algumas modalidades, o segundo indivíduo expressa a mesma classe HLA ou supertipo como o primeiro indivíduo. As células da presente invenção podem ser capazes de matar células alvo, tais como células cancerosas. A célula alvo pode ser reconhecível por um padrão definido de expressão do antígeno, por exemplo, a expressão do antígeno A ou do antígeno B.
[381] Em algumas modalidades, o ACT pode compreender isolamento de células imunes primárias do indivíduo ou de um ou mais doadores, transdução das células imunes primárias com o constructo ou constructos de ácido nucleico de qualquer uma das modalidades anteriores, expressando o CAR nas células imunes primárias transduzidas, e liberando as células imunes transduzidas ao indivíduo. ACT pode adicionalmente compreender estimular e/ou expandir as células imunes antes de liberar as células imunes transduzidas ao indivíduo.
[382] Por exemplo, em algumas modalidades, o ACT pode compreender a colheita de células T autólogas ou alogênicas e a transdução dessas células T com um ou mais constructos de ácido nucleico, de modo que as células T expressem um CAR que medeia a expressão de citocinas pró-inflamatórias e, em seguida, infundindo as células em um indivíduo com necessidade do mesmo.
[383] A presente invenção também fornece um método para o tratamento do câncer, compreendendo a liberação a um indivíduo em necessidade do mesmo de uma quantidade eficaz do constructo de ácido nucleico, um vetor ou vetores, ou uma célula imune transduzida ou composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores, tratando assim o câncer. Em algumas modalidades, o tratamento do câncer pode ser medido por uma diminuição na carga de células tumorais ou por um aumento na sobrevivência.
[384] A presente invenção fornece adicionalmente um método de terapia imunológica compreendendo a administração a um indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um constructo ou constructos de ácido nucleico, um vetor ou vetores, uma célula recombinante ou uma composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das modalidades anteriores. O tratamento com as células da presente invenção pode ajudar a prevenir o escape ou entrega de células tumorais, o que muitas vezes ocorre com abordagens padrão.
[385] Em certas modalidades, as células expressando CAR são modificadas de várias maneiras, tal que sua eficácia terapêutica ou profilática é aumentada. Por exemplo, o CAR pode ser conjugado direta ou indiretamente por meio de um ligante a uma fração de direcionamento. A prática de conjugação de compostos, por exemplo, o CAR, para direcionar frações é conhecido no estado da técnica. Ver, por exemplo, Wadhwa et al., J. Drug Targeting 1995; 3 (2): 111-127, e US Pat. Nº 5,087,616. Particularmente, a presente invenção inclui um tipo de terapia celular em que células isoladas são geneticamente modificadas para expressar CARs e a célula CAR é infundida em um indivíduo em necessidade do mesmo. Tal administração pode promover a ativação das células (por exemplo, ativação de células T) de uma maneira específica para o alvo, tal que as células da doença ou distúrbio sejam alvo de destruição. No caso em que a célula é uma célula T, as células CAR T, ao contrário das terapias de anticorpos, são capazes de se replicar in vivo resultando em persistência de longo prazo que pode levar ao controle sustentado de doenças, distúrbios ou condições específicas.
[386] As células expressando CAR, como reveladas na presente invenção, podem ser administradas sozinhas ou em combinação com diluentes, terapêuticas anticâncer conhecidas e/ou com outros componentes, tal como citocinas ou outras populações de células que são imunoestimulantes. Eles podem ser administrados como uma terapia de primeira linha, uma terapia de segunda linha, uma terapia de terceira linha ou terapia adicional.
[387] Em algumas modalidades, as células expressando CAR são administradas como parte de um tratamento de combinação, tal como simultaneamente com ou sequencialmente com, em qualquer ordem, outra intervenção terapêutica, tal como um anticorpo ou célula manipulada ou receptor ou agente, tal como um citotóxico ou agente terapêutico. As células ou anticorpos em algumas modalidades são coadministrados com um ou mais agentes terapêuticos adicionais ou em conexão com outra intervenção terapêutica, simultaneamente ou sequencialmente em qualquer ordem. Em alguns contextos, as células são coadministradas com outra terapia suficientemente próxima no tempo tal que as populações de células intensificam o efeito de um ou mais agentes terapêuticos adicionais, ou vice-versa. Em algumas modalidades, as células ou anticorpos são administrados antes de um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, as células ou anticorpos são administrados após um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tais como agentes anticâncer. Um agente "anticâncer" é capaz de afetar negativamente o câncer em um indivíduo, por exemplo, ao matar células cancerosas, induzindo apoptose em células cancerosas, reduzindo a taxa de crescimento de células cancerosas, reduzindo a incidência ou número de metástases, reduzindo o tamanho do tumor, inibindo o crescimento do tumor, reduzindo o fornecimento de sangue a um tumor ou células cancerosas, promovendo uma resposta imune contra células cancerosas ou um tumor,
prevenindo ou inibindo a progressão do câncer ou aumentando a vida útil de um indivíduo com câncer. De forma geral, essas outras composições seriam fornecidas em uma quantidade combinada eficaz para matar ou inibir a proliferação da célula. Este processo pode envolver o contato das células cancerosas com a célula expressando o CAR de acordo com a presente invenção e o(s) agente(s) ou múltiplos fatores ao mesmo tempo. Isso pode ser alcançado ao contatar a célula com uma única composição ou formulação farmacológica que inclui ambos os agentes, ou ao contatar a célula com duas composições ou formulações distintas, ao mesmo tempo, em que uma composição inclui o constructo de expressão e a outra inclui o(s) segundo(s) agente(s).
[388] Em uma modalidade particular, as células expressando um CAR contra às isoformas de HLA-G de acordo com a presente invenção são administradas como parte de um tratamento de combinação, tal como simultaneamente ou sequencialmente com, em qualquer ordem, com outras células expressando o CAR que não reconhecem HLA- G, mas são conhecidos por serem úteis em outras terapias de CAR, tal como terapias de CAR antitumorais e/ou antivirais. Tais células expressando CAR têm como alvo um antígeno envolvido em uma doença, preferencialmente tal como câncer ou infecção viral, preferencialmente um antígeno direcionado em terapias de câncer ou em terapias virais. Será entendido que tal antígeno não é HLA-G.
[389] No contexto da presente invenção, é contemplado que a terapia celular pode ser usada similarmente em conjunto com intervenção quimioterapêutica, radioterapêutica ou imunoterapêutica, bem como agentes pró-apoptóticos ou reguladores do ciclo celular, tal como o inibidor do ponto de checagem imune.
[390] Alternativamente, a terapia da presente invenção pode preceder ou seguir o tratamento com outro agente por intervalos que variam de minutos a semanas. Nas modalidades em que o outro agente e a presente invenção são aplicados separadamente ao indivíduo, um geralmente garantiria que um período de tempo significativo não expire entre os tempos de cada liberação, tal que o agente e a terapia inventiva ainda sejam capazes de exercer um efeito combinado vantajosamente na célula. Em tais casos, é contemplado que se pode entrar em contato com a célula com ambas as modalidades dentro de cerca de 12-24 h uma da outra e, mais preferencialmente, dentro de cerca de 6-12 h uma da outra. Em algumas situações, pode ser desejável estender o período de tempo para o tratamento significativamente, no entanto, onde vários dias (2, 3, 4, 5, 6 ou 7) a várias semanas (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8) prescreve entre as respectivas administrações.
[391] Espera-se que os ciclos de tratamento sejam repetidos como necessário. Também é contemplado que várias terapias padrão, bem como intervenção cirúrgica, podem ser aplicadas em combinação com a terapia celular inventiva. Cânceres direcionados
[392] O HLA-G é expresso de forma aberrante em muitos tumores malignos sólidos humanos in situ e doenças hematopoiéticas malignas incluindo cânceres de mama, ovário, células renais claras, colorretal, gástrico, esofágico, pulmonar e hepatocelular, bem como leucemia mieloide aguda e leucemia linfocítica crônica (B-CLL). A expressão aberrante de HLA-G na neoplasia maligna está significativamente correlacionada com o desfecho clínico insatisfatório de pacientes com câncer colorretal (CRC), câncer gástrico (GC), câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC), câncer de células escamosas de esôfago (ESCC), câncer de mama, cânceres hepatocelulares e B-CLL. Adicionalmente, o HLA-G solúvel no soro é aumentado em vários tipos de pacientes com câncer (incluindo pacientes com melanoma, leucemia aguda, mieloma múltiplo,
neuroblastoma, distúrbios linfoproliferativos, câncer de mama ou ovário, câncer de pulmão de células não pequenas, câncer de esôfago, câncer colorretal; câncer gástrico e carcinoma hepatocelular), quando comparados a controles saudáveis normais ou casos de doenças benignas.
[393] Os cânceres que podem ser tratados pela célula expressando o CAR, o constructo de ácido nucleico, o vetor ou a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção incluem tumores que não são vascularizados, ou ainda não substancialmente vascularizados, bem como tumores vascularizados.
[394] A célula expressando o CAR, o constructo de ácido nucleico, o vetor ou a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção podem ser usados para tratar cânceres da cavidade oral e faringe que incluem câncer de língua, boca e faringe; cânceres do sistema digestivo, que incluem cânceres esofágicos, gástricos e colorretais; cânceres do fígado e árvore biliar que inclui cacinomas hepatocelulares e colangiocarcinomas; cânceres do sistema respiratório, que incluem cânceres broncogênicos, cânceres do pulmão e cânceres da laringe; cânceres dos ossos e articulações que incluem osteossarcoma; cânceres da pele que incluem melanoma; câncer de mama; cânceres do trato genital, que incluem câncer de útero, endométrio, ovário e cervical em mulheres, câncer de próstata e de testículo em homens; cânceres do trato renal, que incluem carcinoma de células renais e carcinomas de células de transição de ureteres ou bexiga; tumor estromal gastrointestinal, cânceres do pâncreas, cânceres do rim, cânceres do cólon, cânceres do colo do útero, cânceres do cérebro incluindo gliomas, glioblastoma multiforme e medulobastomas; cânceres do sistema endócrino incluindo câncer da tireoide, carcinoma adrenal e cânceres associados a síndromes neoplásicas endócrinas múltiplas; linfomas incluindo linfoma de Hodgkin e linfoma não Hodgkin; linfoma de células B, linfoma monocítico, linfoma de zona marginal, linfoma de Burkitt,
linfomas T e B, Mieloma Múltiplo e plasmocitomas; leucemias agudas e crônicas, leucemia pró-hemocítica, leucemia não linfoblástica aguda (ANLL), leucemia linfoblástica aguda (ALL), eritroleucemia, leucemia mieloide ou linfóide; e cânceres de outros sítios não especificados, incluindo neuroblastoma. Preferencialmente, o câncer é selecionado a partir do grupo de carcinoma de células Renais (RCC), melanoma, câncer de rim e câncer de bexiga.
[395] Os cânceres podem compreender tumores não sólidos (tal como tumores hematológicos, por exemplo, leucemia e linfoma) ou podem compreender tumores sólidos. Como usado na presente invenção, "tumor sólido" é uma massa anormal de tecido que geralmente não contém cistos ou áreas líquidas. Os tumores sólidos podem ser benignos ou malignos. Diferentes tipos de tumores sólidos são nomeados de acordo com o tipo de células que os formam (tal como sarcomas, carcinomas e linfomas).
[396] Exemplos de tumores sólidos, tal como sarcomas e carcinomas, incluem fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, osteossarcoma e outros sarcomas, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma de colón, malignidade linfóide, câncer de pâncreas, câncer de mama, câncer de pulmão, câncer de ovário, câncer de próstata, carcinoma hepatocelular, carcinoma de células escamosas, carcinoma de células basais, adenocarcinoma, carcinoma de glândula sudorípara, carcinoma medular de tireoide, carcinoma papilífero de tireoide, feocromocitomas carcinoma de glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, carcinoma medular, carcinoma broncogênico, carcinoma de células renais, hepatoma, carcinoma do ducto biliar, coriocarcinoma, Tumor de Wilms, câncer cervical, tumor testicular, seminoma, carcinoma de bexiga, melanoma, e tumores do CNS (tais como um glioma (tal como o glioma do tronco encefálico e gliomas mistos), glioblastoma (também conhecido como glioblastoma multiforme) astrocitoma, linfoma do CNS, germinoma, meduloblastoma, Schwannoma craniofaringioma, ependimoma, pinealrogoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroma menangioma, neuroblastoma, retinoblastoma e metástases cerebrais).
[397] Os cânceres hematológicos são cânceres do sangue ou da medula óssea. Exemplos de cânceres hematológicos (ou hematogênicos) incluem leucemias, incluindo leucemias agudas (tais como leucemia linfocítica aguda, leucemia mielocítica aguda, leucemia mielogênica aguda e mieloblástica, promielocítica, mielomonocítica, monocítica e eritroleucemia), leucemias crônicas (tais como leucemia mielocítico crônico (granulocítico) leucemia mielóide crônica, e leucemia linfocítica crônica) policitemia vera, linfoma, doença de Hodgkin, linfoma não Hodgkin (formas indolentes e de alto grau) mieloma múltiplo, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença da cadeia pesada, síndrome mielodisplásica, leucemia de células pilosas e mielodisplasia.
[398] Em algumas modalidades, as células cancerosas expressam ou superexpressam HLA-G. Em uma modalidade particular, as células cancerosas expressam ou superexpressam uma a seis, preferencialmente duas a cinco isoformas de HLA-G selecionadas a partir de HLA-G1, HLA-G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA- G6 e HLA-G7, preferencialmente de HLA-G1, HLA-G2, HLA-G5 ou HLA-G6, e mais preferencialmente de HLA-G1 ou HLA-G2.
[399] Preferencialmente, as células cancerosas expressam ou superexpressam HLA-G1 e/ou HLA-G5; ou as células cancerosas expressam ou superexpressam HLA-G2 e/ou HLA-G6. Preferencialmente, quando tais células cancerosas expressam estas isoformas de HLA-G particulares, o CAR de acordo com a presente invenção liga-se especificamente ao HLA-G1 e HLA-G5 ou ao HLA-G2 e HLA-G6, respectivamente. Uso em diagnóstico e prognóstico
[400] Os anticorpos monoclonais anti-HLA-G ou scFv revelados na presente invenção também são úteis em métodos de diagnóstico e prognóstico. Como tal, a presente invenção refere-se ao uso dos anticorpos revelados na presente invenção no diagnóstico de condições médicas relacionadas ao HLA-G em um indivíduo.
[401] Os anticorpos monoclonais ou scFv revelados na presente invenção são úteis em métodos conhecidos no estado da técnica relacionados à localização e/ou quantificação de um polipeptídeo HLA-G (por exemplo, para uso na medição de níveis do polipeptídeo HLA-G em amostras fisiológicas apropriadas, para uso em métodos de diagnóstico, para uso no imageamento do polipeptídeo e semelhantes). Os anticorpos monoclonais ou scFv revelados na presente invenção são úteis no isolamento de um polipeptídeo HLA-G por técnicas padrão, tais como western blotting, métodos de cromatografia de afinidade para isolar células ou para análise celular baseada em citometria de fluxo ou classificação de células ou imunoprecipitação. Um anticorpo HLA-G revelado na presente invenção pode facilitar a purificação de polipeptídeos HLA- G naturais de amostras biológicas, por exemplo, soros ou células de mamíferos, bem como polipeptídeos HLA-G produzidos de forma recombinante expressos em um sistema hospedeiro. Além disso, os anticorpos monoclonais HLA-G ou scFv podem ser usados para detectar um polipeptídeo HLA-G (por exemplo, no plasma, um lisado celular ou sobrenadante celular) para avaliar a abundância e o padrão de expressão do polipeptídeo. Os anticorpos HLA-G revelados na presente invenção podem ser usados diagnosticamente para monitorar os níveis de HLA-G no tecido como parte de um procedimento de teste clínico, por exemplo, para determinar a eficácia de um determinado regime de tratamento. A detecção pode ser facilitada por acoplamento (ou seja, ligação física) dos anticorpos HLA-G revelados na presente invenção para uma substância detectável de modo que os anticorpos HLA-G ou fragmentos do mesmo sejam marcados detectavelmente. O termo "marcado", no que diz respeito ao anticorpo, é entendido para abranger a marcação direta do anticorpo por acoplamento (ou seja, ligação física) de uma substância detectável ao anticorpo, bem como marcação indireta do anticorpo por reatividade com outro composto que é marcado diretamente. Os exemplos não limitativos de marcação indireta incluem a detecção de um anticorpo primário usando um anticorpo secundário marcado com fluorescência e a marcação final de uma sonda de DNA com biotina de modo que possa ser detectada com estreptavidina marcada com fluorescência.
[402] O método de detecção da presente invenção pode ser usado para detectar níveis de expressão de polipeptídeos HLA-G em uma amostra biológica in vitro assim como in vivo. Técnicas In vitro para detecção de polipeptídeos de HLA-G incluem ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISAs), Western blots, citometria de fluxo, imunoprecipitações, radioimunoensaio e imunofluorescência (por exemplo, IHC). Adicionalmente, as técnicas in vivo para detecção de polipeptídeos HLA-G incluem introduzir em um indivíduo um anticorpo anti-HLA-G marcado. Apenas a título de exemplo, o anticorpo pode ser marcado com um marcador radioativo cuja presença e localização em um indivíduo podem ser detectadas por técnicas de imageamento padrão.
[403] Em alguns aspectos, os anticorpos HLA-G contendo modificações estruturais que facilitam a ligação rápida e absorção celular e/ou liberação lenta são úteis em métodos de detecção de imageamento in vivo. Em alguns aspectos, o anticorpo HLA-G contém uma deleção na região constante CH2 da cadeia pesada do anticorpo para facilitar a ligação rápida e a absorção celular e/ou liberação lenta. Em alguns aspectos, um fragmento Fab é usado para facilitar a ligação rápida e celular e/ou liberação lenta. Em alguns aspectos, um fragmento
F(ab) '2 é usado para facilitar a rápida ligação e absorção celular e/ou liberação lenta.
[404] Consequentemente, a presente invenção também fornece ensaios prognósticos (ou preditivos) para determinar se um indivíduo está em risco de desenvolver uma doença ou condição médica associada com o aumento da expressão ou atividade do polipeptídeo HLA-G (por exemplo, detecção de uma célula pré-cancerosa). Tais ensaios podem ser usados para fins prognósticos ou preditivos para assim tratar profilaticamente um indivíduo antes do início de uma doença ou condição médica caracterizada por ou associada à expressão do polipeptídeo HLA-G.
[405] Outro aspecto da presente invenção fornece métodos para determinar a expressão de HLA-G em um indivíduo para, assim, selecionar compostos terapêuticos ou profiláticos apropriados para esse indivíduo.
[406] Alternativamente, os ensaios de prognóstico podem ser utilizados para identificar um indivíduo tendo ou em risco de desenvolver câncer e/ou tumores sólidos. Assim, a presente invenção fornece um método para identificar uma doença ou condição associada a níveis aumentados de expressão de isoforma(s) HLA-G em que uma amostra de teste é obtida de um indivíduo e a(s) isoforma(s) HLA-G detectada(s), em que a presença de níveis aumentados de polipeptídeos HLA-G comparados com uma amostra de controle é preditivo para um indivíduo tendo ou em risco de desenvolver uma doença ou condição associada com níveis aumentados de expressão de isoforma(s) HLA-G. Em alguns aspectos, a doença ou condição associada com níveis aumentados de expressão de isoforma(s) de HLA-G é selecionada a partir do grupo consistindo em desenvolver câncer e/ou tumores sólidos.
[407] Em outra modalidade, a presente invenção fornece métodos para determinar se um indivíduo pode ser efetivamente tratado com um composto para um distúrbio ou condição associada com o aumento da expressão de HLA- G, em que uma amostra biológica é obtida do indivíduo e a(s) isoforma(s) de HLA-G) é/são detectados usando o anticorpo HLA-G ou ScFv como descrito acima. O nível de expressão do polipeptídeo HLA-G na amostra biológica obtida do indivíduo é determinado e comparado com os níveis de expressão de HLA-G encontrados em uma amostra biológica obtida de um indivíduo que está livre da doença. Níveis elevados de HLA-G na amostra obtida do indivíduo suspeito de ter a doença ou condição comparado com a amostra obtida do indivíduo saudável é indicativo da doença ou condição associada ao HLA-G no indivíduo sendo testado.
[408] Há inúmeros estados de doença em que o nível de expressão elevado da(s) isoforma(s) HLA-G é conhecido por ser um indicativo se um indivíduo com a doença é provável de responder a um tipo particular de terapia ou tratamento. Assim, o método de detectar isoformas(s) HLA-G em uma amostra biológica pode ser usado como um método de prognóstico, por exemplo, para avaliar a probabilidade de que o indivíduo irá responder à terapia ou tratamento.
[409] Aspectos adicionais da presente invenção se referem a métodos para determinar se um paciente é provável de responder ou não à terapia de HLA-G CAR Em modalidades específicas, este método compreende contatar uma amostra de tumor isolada do paciente com uma quantidade eficaz de um anticorpo HLA-G e detectar a presença de qualquer anticorpo ligado à amostra de tumor. Em modalidades adicionais, a presença de anticorpo ligado à amostra de tumor indica que o paciente é provável de responder à terapia de HLA-G CAR e a ausência de anticorpo ligado à amostra de tumor indica que o paciente não é provável de responder à terapia de HLA-G. Em algumas modalidades, o método compreende a etapa adicional de administrar uma quantidade eficaz da terapia de HLA-G CAR a um paciente que tem probabilidade de responder à terapia de
HLA-G CAR.
[410] Aspectos adicionais da presente invenção se referem a métodos para determinar se um paciente é provável de responder ou não é provável de responder à terapia de HLA-G CAR, dependendo da(s) isoforma(s) que é/são expressa(s) pelo tumor, particularmente selecionado(s) a partir de HLA-G1, HLA- G2, HLA-G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6 e HLA-G7, preferencialmente de HLA-G1, HLA-G2, HLA-G5 ou HLA-G6, e mais preferencialmente de HLA-G1 ou HLA-G2, ainda mais preferencialmente HLA-G1 e G5 ou HLAG-2 e G6. A identificação de isoforma(s) expressa(s) por HLA-G antes do tratamento permitiu a seleção do CAR mais adequado que se liga especificamente a uma a seis, preferencialmente duas a cinco isoformas de HLA-G selecionadas a partir de HLA-G1, HLA-G2, HLA- G3, HLA-G4, HLA-G5, HLA-G6 e HLA-G7, preferencialmente de HLA-G1, HLA-G2, HLA-G5 ou HLA-G6, e mais preferencialmente de HLA-G1 ou HLA-G2, ainda mais preferencialmente liga às isoformas HLA-G1 e HLA-G5 ou ambas as isoformas HLA-G2 e HLA-G6 para uso em um tratamento eficiente, tal como terapia celular. Kits
[411] Qualquer uma das composições descritas na presente invenção pode ser incluída em um kit fornecido pela presente invenção. Os kits irão, assim, incluir, em meios de recipiente adequados, células recombinantes/manipuladas da presente invenção e/ou vetores codificando os constructos de ácido nucleico da presente invenção e/ou constructo de ácido nucleico ou reagentes relacionados da presente invenção. Em algumas modalidades, o kit inclui adicionalmente um agente adicional para o tratamento de câncer ou uma doença infecciosa, e o agente adicional pode ser combinado com o(s) constructo(s) de ácido nucleico ou células, ou outros componentes do kit da presente invenção ou pode ser fornecido separadamente no kit. Em algumas modalidades, meios para tirar uma amostra de um indivíduo e/ou ensaiar a amostra podem ser fornecidos no kit. Em certas modalidades, o kit inclui células, tampões, meios celulares, vetores, iniciadores, enzimas de restrição, sais e assim por diante, por exemplo. Os kits também podem compreender meios para conter um tampão e/ou outro diluente estéril e farmaceuticamente aceitável.
[412] Os componentes dos kits podem ser embalados em meio aquoso ou na forma liofilizada. O recipiente dos kits incluirá geralmente pelo menos uma ampola (vial), tubo de ensaio, frasco, garrafa, seringa ou outro recipiente, no qual um componente pode ser colocado e, preferencialmente, aliquotado adequadamente. Onde houver mais que um componente no kit, o kit também conterá geralmente um segundo, terceiro ou outro recipiente adicional no qual os componentes adicionais podem ser colocados separadamente. No entanto, várias combinações de componentes podem ser compreendidas em uma ampola. Tais recipientes podem incluir recipientes de plástico moldado por injeção ou por sopro-, nos quais os tubos desejados são retidos. Os kits da presente invenção também incluirão tipicamente um meio para conter os componentes em confinamento fechado para venda comercial. Tais recipientes podem incluir recipientes de plástico moldado por injeção ou sopro, nos quais os tubos desejados são retidos.
[413] Quando os componentes do kit são fornecidos em uma e/ou mais soluções líquidas, a solução líquida é uma solução aquosa, com uma solução aquosa estéril sendo particularmente preferida. As composições também podem ser formuladas em uma composição compatível com seringa. Nesse caso, o recipiente pode ser ele próprio uma seringa, pipeta e/ou outro aparelho semelhante, do qual a formulação pode ser aplicada a uma área infectada do corpo, injetada em um animal e/ou mesmo aplicada a e/ou misturado com os outros componentes do kit. No entanto, os componentes do kit podem ser fornecidos como pó(s) seco(s). Quando os reagentes e/ou componentes são fornecidos como um pó seco, o pó pode ser reconstituído pela adição de um solvente adequado. Está previsto que o solvente também pode ser fornecido em outros meios de recipiente.
[414] Em modalidades particulares da presente invenção, as células que devem ser usadas para terapia celular são fornecidas em um kit e, em alguns casos, as células são essencialmente o único componente do kit. O kit pode compreender reagentes e materiais para preparar a célula desejada. Em modalidades específicas, os reagentes e materiais incluem iniciadores para amplificar sequências desejadas, nucleotídeos, tampões adequados ou reagentes de tampão, sal e assim por diante e, em alguns casos, os reagentes incluem vetores e/ou DNA que codifica um CAR como descrito na presente invenção e/ou elementos regulatórios do mesmo.
[415] Em modalidades particulares, há um ou mais aparelhos no kit adequados para extrair uma ou mais amostras de um indivíduo. O aparelho pode ser uma seringa, bisturi e assim por diante.
[416] Em alguns casos da presente invenção, o kit, além das modalidades de terapia celular, também inclui uma segunda terapia contra o câncer, tal como quimioterapia e/ou imunoterapia, por exemplo. O(s) kit(s) pode(m) ser adaptado(s) a um câncer particular para um indivíduo e compreende as respectivas segundas terapias de câncer para o indivíduo, como descrito acima.
EXEMPLOS
RESULTADOS Especificidade de paratopo de anticorpo anti-HLA-G
[417] Foi previamente descrito que diferentes isoformas de HLA-G podem ser expressas contendo de um a três domínios globulares, associados ou não a β2M e um peptídeo. Diferentes anticorpos anti-HLA-G específicos foram gerados anteriormente contra diferentes regiões ou "epítopos" de HLA-G. A especificidade dos anticorpos monoclonais anti-HLA-G foi anteriormente determinada contra diferentes isoformas de HLA-G. Resumidamente, como mostrado na Figura 2A, o anticorpo 15E7 apresenta uma alta afinidade para o HLA-G1/5 livres de β2M e HLA-G6, demonstrando que este Mab é específico para as isoformas de HLA-G que não estão associadas a β2M. Como mostrado na Figura 2B, K562 HLA-G1p apresenta uma proporção maior de HLA-G livres de β2M do que K562 HLA-G1Lv após a coloração com o anticorpo monoclonal 15E7 em comparação com o anticorpo monoclonal MEM-G/09, específico para isofromas HLA-G associadas a β2M (dados não mostrados). Similarmente, a especificidade do 15E7 foi avaliada contra as linhagens celulares Jurkat wt, Jurkat HLA-G1Lv e Jeg-3 que demonstraram que o anticorpo monoclonal 15E7 apresenta alta afinidade para as isoformas de HLA-G livres de β2M, como mostrado na Figura 2B.
[418] A especificidade do anticorpo monoclonal LFTT-1 foi determinada desempenhando os mesmas experimentos. Ao contrário do anticorpo 15E7, o anticorpo LFTT-1 é altamente específico para as isoformas de HLA-G associadas a β2M e linhagens celulares de K562 HLA-G1Lv, Jurkat HLA-G1Lv e Jeg-3 coradas, como mostrado na Figura 2C. Validação de constructos de CARs
[419] Dois receptores de antígenos quiméricos diferentes foram gerados contra o HLA-G baseado nos paratopos de anticorpos monoclonais 15E7 e LFTT-
1. O projeto dos CARs correspondeu a CARs de terceira geração já descritos (Pulè et al. Molecular Therapy, 2005) constituído de: um peptídeo sinal, o scFv de 15E7 ou LFTT-1, um domínio espaçador que compreende ou consiste em (i) uma dobradiça de CD8a ou CD28, (ii) um domínio de dobradiça de IgG4 humana, (iii) um domínio de dobradiça de IgG4 humana e um domínio CH3 de IgG4 humana ou (iv) um domínio CH2 mutado de IgG4 humana, um domínio de dobradiça de
IgG4 humana e um domínio de dobradiça CH3 de IgG4 humana, uma região transmembrana CD28 e dois segmentos de coativação: 4-1BB e CD3ζ. A Figura 3 resume o projeto esquemático das estruturas CAR baseado no 15E7 e LFTT-1 com domínio de dobradiça de CD8a ou de CD28 e a Figura 4 resume o projeto esquemático das estruturas CAR baseado em 15E7 e LFTT-1 com o ligante clivável P2A e o hCD19 truncado como repórter.
[420] Os constructos de CARs foram enxertadas em diferentes células hospedeiras efetoras: A linhagem celular Jurkat (células T CD4+ humanas) e NKT1.2 (iNKT murino) e a expressão de CAR de superfície foram avaliadas por citometria de fluxo e microscopia de imunofluorescência. 87,6% das células Jurkat HLA-G-15E7 e 83,2% das células CAR HLA-G-LFTT-1 transduzidas expressam os receptores quiméricos em sua superfície, detectados por um anticorpo anti-Flag demonstrando que as células efetoras expressam fortemente os constructos CARs (Figura 5A). Similarmente, NKT 1.2 HLA-G-15E7 e CAR HLA-G-LFTT-1 expressaram fortemente HLA-G CARs em sua superfície, uma vez que 85,2% e 85,1% foram respectivamente corados com o anticorpo anti-Flag. A expressão da superfície celular dos CARs também foi determinada por microscopia de imunofluorescência, como mostrado na Figura 5B. Ensaio de ativação: aquisição de membrana através da interação CAR/HLA-G1
[421] Foi demonstrado anteriormente que as células imunes adquirem placas de membrana da superfície celular de células-alvo, tais como APC ou células tumorais apresentadoras de antígenos. A aquisição de membrana de células alvo por células efetoras (i) requer contato célula a célula, (ii) é rápida, e (iii) é um processo ativo dependente do estado de ativação das células adquirentes que (iv) reflete a ativação específica do antígeno das células efetoras. Portanto, as transferências de membrana estão relacionadas à ativação de células imunes funcionalmente maduras.
[422] Baseado nesses princípios, um teste foi projetado para determinar o grau de ativação das células efetoras quando elas foram confrontadas com o indivíduo-alvo: Moléculas HLA-G. O experimento foi configurado ao usar a linhagem celular células T Jurkat como efetoras e células-alvo, nos permitindo evitar qualquer interação com proteínas espectadoras. Isso implica que o contato célula-a-célula seria apenas mediado pela interação CAR- antígeno. Espera-se que apenas as células transfectadas com o CAR anti-HLA-G sejam ativadas, portanto, apresentarão aquisição de membrana quando inoculadas com as células alvo e transferência de membrana muito baixa ou nenhuma para células controle (Jurkat wt), conforme representado na Figura 6A.
[423] Para caracterizar as isoformas expressas predominantemente em células alvo Jurkat transduzidas por HLA-G, a expressão das isoformas de HLA-G foi determinada por citometria de fluxo usando o anticorpo MEM-G/09 associado a β2M anti-HLA-G e o anticorpo 15E7 anti-HLA-G-α3 livre de β2M. A Figura 6B mostra que as células alvo Jurkat HLA-G1 expressam apenas isoformas HLA-G1 associadas a β2M, e nenhuma coloração é observada após a coloração de 15E7, implicando que nenhuma isoforma de HLA-G-α3 livres de β2M é expressa.
[424] Em seguida, o nível de transferência de membrana foi avaliado, referido de outra forma, o grau de ativação das células efetoras desafiadas com seus alvos. A aquisição da membrana foi de 5,91% e 5,38% para as células Jurkat HLA-G-15E7 e HLA-G-LFTT-1 CAR quando elas foram confrontadas para controlar Jurkat wt. No entanto, dada a natureza das isoformas de HLA-G expressas nas células alvo (HLA-G1 associado a B2M), apenas HLA-G-LFTT-1 CAR são esperadas que liguem e ativem especificamente as células efetoras. De fato, a aquisição de Jurkat CAR HLA-G-LFTT-1 aumentou para 21,7%, enquanto a ativação de Jurkat
CAR HLA-G-15E7 permaneceu em 5,6%. Esses resultados são mostrados na Figura 6C.
[425] Posteriormente, o grau de ativação das células CAR HLA-G-15E7 e CAR HLA-G-LFTT-1 desafiadas com células alvo específicas foi estudado, baseado na razão “Índice de Ativação" definindo a linha de base nas células controle não específicas: Linhagem celular Jurkat wt. Como mostrado na Figura 6D, Jurkat HLA-G-LFTT-1 CAR é ativado mais que 3 vezes quando inoculado com Jurkat HLA- G1Lv. No entanto, a ativação não aumenta quando são desafiadas com controles Jurkat, nem as células CAR HLA-G-15E7 são ativadas quando desafiadas com alvos não específicos (Jurkat wt e Jurkat HLA-G1Lv).
[426] Finalmente, o status de ativação de outros subconjuntos de células imunes foi avaliado a fim de confirmar a especificidade e a atividade biológica dos constructos CAR HLA-G-15E7 e CAR HLA-G-LFTT-1. Conforme mostrado na Figura 7A, Jurkat CAR HLA-G-15E7 foi desafiado com um alvo específico: K562 HLA-G1p (que expressa principalmente isoformas de HLA-G livres de β2M) usando células K562wt como controle. Novamente, um aumento de mais que 3 vezes de ativação foi observado. Também, as células NKT 1.2 HLA-G-15E7 e CAR HLA-G-LFTT-1 foram testadas, inoculadas com Jeg-3 (células de coriocarcinoma humano, expressando isoformas HLA-G1 associadas a β2M). Apenas as células HLA-G-LFTT-1 CAR foram significativamente ativadas em comparação com as células controle NKT 1.2 HLA-G-15E7 ou NKT 1.2, conforme mostrado na Figura 7B. Função citolítica e secreção de IFN-γ de células T HLA-G CAR
[427] A função citotóxica de 15E7 e células efetoras expressando LFTT-1 CAR foram avaliadas contra as linhagens celulares transfectadas JEG-3, K562 e K562-HLA-G1 (Figuras 8 e 9). Para fazer isso, as células alvo foram marcadas com CFSE antes de serem co-cultivadas 24 horas com células CAR-T nas razões de
Efetor: Razão alvo (E: T). 24h após a coincubação, o meio foi coletado para determinar o IFN- γ secreção e células recuperadas para investigar a lise das células alvo por citometria de fluxo.
[428] Independentemente da dobradiça usada, a linhagem celular K562 não foi lisada por células anti HLA-G LFTT-1 e CAR-T 15E7, desde que as células K562 não expressaram a proteína HLA-G em sua superfície (Figura 8A). A linhagem celular K562-HLA-G1P expressa ambas HLA-G1 associados a β2M e isoformas livres de β 2M em sua superfície (figuras 2B e 2C respectivamente) e foram quase completamente lisadas por células LFTT-1 e CAR-T 15E7 na razão E:T de 10:1 em comparação com células T ativadas, mas não transduzidas. As células IgG4 + CH3 de dobradiça CAR-T 15E7 e LFTT-1 exibiram uma eficiência ligeiramente menor em comparação com suas contrapartes IgG4 ou IgG4 + mCH2-CH3. A expressão de CD107a foi determinada em células CAR-T efetoras de acordo com sua função citotóxica (Figura 8B). A linhagem celular JEG-3 expressou apenas HLA-G1 associado a isoforma β 2M (figura 2C) e as células LFTT-1 CAR-T foram capazes de lisar células tumorais JEG-3 (Figura 8A). A expressão de CD107a foi determinada apenas em células LFTT-1 CAR-T (Figura 8B).
[429] Como mostrado na figura 9, contra a linhagem celular K562 negativas para o HLA-G, nenhuma secreção de IFN- γ foi determinada para células LFTT-1 e CAR-T 15E7, enquanto ambas as células CAR-T secretam fortemente IFN- γ após incubação com a linhagem celular K562-HLA-G1P. Contra a linhagem celular JEG-3, apenas células LFTT-1 CAR-T secretaram IFN- γ consistente com a lise das células JEG-3 e a expressão de CD107 da superfície celular nas células LFTT-1 CAR-T (Figura 8). Experimento in vivo em camundongos NGS
[430] Para investigar as funções das células HLA-G CAR-T in vivo, as células tumorais K562-HLA-G1P expressando a luciferase (K562-HLA-G1P-luc) foram implantadas em camundongos NGS seguidos por inoculação de células HLA-G CAR-T para monitorar citotoxicidade de células HLA-G CAR-T contra células HLA- G tumorais (Figura 10).
[431] Para fazer isso, células de controle ativadas e células T transduzidas por HLA-G CAR foram geradas como descrito anteriormente. Resumidamente, as células T humanas foram classificadas, ativadas e depois transduzidas ou não com os constructos 15E7-IgG4 dobradiça-CAR ou LFFT1-IgG4 dobradiça-CAR e mantidas em cultura até o dia 9 pós-transdução para retornar a um estado de repouso antes dos experimentos in vivo.
[432] Então, 18 camundongos NGS fêmeas foram irradiados 24 horas antes da inoculação intravenosa das células K562-HLA-G1P-luc.
[433] 3 dias após a inoculação das células K562-HLA-G1, 3 grupos de 6 camundongos foram estabelecidos correspondendo a: (i) 6 camundongos foram inoculados com 1.106 células T CD8 humanas ativadas, mas não transduzidas (grupo de controle), (ii) 6 camundongos foram inoculados com 1.106 células 15E7-IgG4-CAR-T e (iii) 6 camundongos foram inoculados com 1.106 Células LFTT1-IgG4-CAR-T. O crescimento do tumor K562-HLA-G1P-luc foi então monitorado para avaliar a citotoxicidade das células T de HLA-G CARs contra células T controle.
MATERIAIS E MÉTODOS Linhagens Celulares
[434] A linhagem celular Jurkat são células T CD4+ humanas adquiridas na ATCC (American Type Culture Collection TIB-152). A linhagem celular Jurkat foi transduzida com lentivírus HLA-G1, HLA-G-LFTT-1 ou HLA-G-15E7 CAR, respectivamente. As linhagens celulares Jurkat wt e Jurkat transduzidas foram cultivadas em RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado com 2mM de L-glutamina,
1 mg/mL de penicilina e estreptomicina (Gibco) e 10% de FCS inativado por calor (Invitrogen).
[435] NKT1.2 é uma linhagem celular murina de hibridoma que foi gentilmente fornecida pelo Dr. Kronenberg. Estes também foram transduzidos com lentivírus HLA-G-LFTT-1 ou CAR HLA-G-15E7 respectivamente e foram cultivados em X-Vivo 10 (Lonza) suplementado com 1 mg/mL de penicilina e estreptomicina (Gibco).
[436] As células K562 são células de leucemia humana compradas na ATCC (American Type Culture Collection CCL-243). As células K562-HLA-G1p foram obtidas por nucleofecção de células K562 wt com um vetor codificando HLA-G1 e as células K562-HLA-G1Lv foram obtidas por transdução de lentivírus codificando HLA-G1. Estas linhagens celulares foram cultivadas em RPMI 1640 (Invitrogen) suplementado com 2mM de L-glutamina, 1 mg/mL de penicilina e estreptomicina (Gibco) e 10% de FCS inativado pelo calor (Invitrogen).
[437] A linhagem celular Jeg-3 são células de coriocarcinoma humano adquiridas na ATCC (American Type Culture Collection HTB-36). Estes foram cultivados em MEM (X) suplementado com 1 mg/mL de penicilina e estreptomicina (X), e 10% de FCS inativado por calor (Invitrogen). Células HLA-G CAR Jurkat
[438] Os constructos HLA-G-LFTT-1 e CAR HLA-G-15E7 foram gerados como descrito anteriormente [Pulè et al. 2005 Molecular Therapy]. Resumidamente, o domínio de reconhecimento anti-HLA-G é um fragmento variável de cadeia única (scFv) derivado do anticorpo específico LFTT-1 associado a HLA-G1 / β2M ou do anticorpo 15E7 específico livre de HLA-G1/β2M. Um espaçador curto derivado da região de dobradiça de IgG1 foi usado para ligar este scFv ao domínio transmembrana. O endodomínio HLA-G CAR foi constituído pela fusão das moléculas de ativação CD28, OX40 e CD3ζ. O constructo CAR foi clonado em um vetor plasmídeo pTrip por digestão/ligação após extração por PCR com iniciadores específicos, sob o promotor precoce imediato de CMV. As sequências de aminoácidos codificando as cadeias leves e pesadas do scFv de Mabs são detalhadas em SEQ ID NOs: 1 (VH), 2 (VL) e 31 (scFV) para LFTT-1 e em SEQ ID NOs: 3 (VH), 4 (VL) e 30 (scFV) para 15E7. As sequências CAR são reveladas em SEQ ID NOs: 83 e 84 para o CAR 15E7 (sequência de aminoácidos e sequência de codificação de ácido nucleico, respectivamente) e em SEQ ID NOs: 85 e 86 para a sequência de aminoácidos de LFTT-1 CAR e a sequência de codificação de ácido nucleico, respectivamente). Células Jurkat HLA-G
[439] A linhagem celular Jurkat estável expressando HLA-G foi gerada por transdução e as partículas lentivirais foram geradas da seguinte forma: sequências específicas correspondentes ao cDNA de HLA-G1 nativo (NM_002127.5) K334A e K335A modificados de acordo com Zhao et al. foram clonados separadamente em um vetor de plasmídeo pTrip por digestão/ligação após extração por PCR com iniciadores específicos, sob o promotor precoce imediato de CMV. Vetores lentivirais
[440] As partículas de vetor derivadas de HIV-1 foram produzidas por cotransfecção de fosfato de cálcio de células HEK-293T (ATCC) com o plasmídeo recombinante pTRIP, um plasmídeo de expressão de envelope codificando a glicoproteína de VSV, glicoproteína de sorotipo Indiana e o plasmídeo de encapsidação p8.74. Os estoques virais foram titulados por PCR em tempo real em lisados celulares de células HEK-293T transduzidas e expressos como unidade de transdução (TU) por mL. Para gerar células Jurkat HLA-G-LFTT-1, CAR HLA-G- 15E7 e Jurkat HLA-G, 1x105 as células Jurkat foram semeadas em placas de 12 poços com 500 µl de meio cRPMI e 106 TU (293T) de vetores Trip CMV-HLA-G-
LFTT-1-CAR, Trip CMV-HLA-G-15E7-CAR ou Trip CMV-HLA-G, respectivamente. As células foram incubadas por 1 hora a 37°C e depois centrifugadas por 1 hora a 37°C 1200 g. Em seguida, 1 mL de meio cRPMI foi adicionado e incubado a 37°C. Duas semanas depois, as células positivas foram classificadas por citometria de fluxo usando anticorpos anti-HLA-G. A expressão de HLA-G foi avaliada por citometria de fluxo antes do ensaio de ativação Jurkat HLA-G-CAR. O mesmo procedimento foi realizado para obter células K562 HLA-G1Lv e NKT1.2 HLA-G- LFTT-1 CAR ou HLA-G-15E7 CAR. Citometria de fluxo
[441] IgG1 de camundongo conjugado-PE (Clone P.3.6.8.2.1. 12-4714) da eBiosciences (Paris; França), IgG2a de rato conjugado com FITC da BD Biosciences (clone: R35-95 553929, Le Pont de Claix; França) e MEM-G/09 (Exbio, Praha). A citometria de fluxo foi realizada incubando a linhagem celular correspondente com anticorpos monoclonais por 1h em RT, lavando duas vezes e incubando por 30 min em RT com anticorpo IgG de cabra anti-camundongo conjugado-PE (405307, Biolegend, EUA). As análises de citometria de fluxo foram realizadas usando LSR FORTESSA (Beckton Dickinson, Le Pont-de-Claix, França); os dados foram analisados com o software FlowJo X (Tree star, Ashland, EUA). A % de populações marcadas positivas foi definida como aquelas com intensidade de coloração maior do que aquelas exibidas por 99% do controle de isotipo. Ensaio de ativação
[442] As células efetoras Jurkat HLA-G CAR e as células tumorais Jurkat ou Jurkat HLA-G1 foram respectivamente marcadas com corantes fluorescentes PKH26 e PKH67 (Sigma) de acordo com as especificações do fabricante.
[443] Para ensaios de ativação com base no princípio de trogocitose, Jurkat HLA-G-LFTT-1 ou HLA-G-15E7 CAR (células "adquirentes") foram cocultivadas com células Jurkat ou Jurkat HLA-G1 (células "doadoras") por 1h a uma razão tumor-efetor de 1:1, em uma concentração total de 2x106 células/mL, e a 37°C em incubadora umidificada com 5% de CO2 como descrito anteriormente [Caumartin J et al, (2007) Trogocytosis-based generation of suppressive NK cells, EMBO J 26:1423-33]. No final da coincubação, as células foram colocadas em gelo e todas as etapas adicionais foram realizadas a menos de 4°C. A aquisição de membrana de células tumorais por células efetoras CAR foi investigada por citometria de fluxo. Produção vetorial
[444] As partículas de vetor derivadas de HIV-1 foram produzidas por cotransfecção transiente de fosfato de cálcio de células T HEK 293 (ATCC) com o plasmídeo de vetor pTRIP (codificando a glicoproteína de VSV, sorotipo Indiana (IND)) e o plasmídeo de encapsidação p8.74 para a produção de partículas de vetor lentiviral integrativo (ILV). A capacidade de transferência do gene vetorial foi determinada por PCR quantitativo após a transdução de células 293T, como descrito anteriormente (Coutant, F., et al., PLoS One, 2008. 3 (12): p. e3973) e foi expressa como unidade de transdução (TU)/mL de vetor. Isolamento e ativação de células T
[445] PBMCs foram extraídos de amostra de sangue de 3 dadores saudáveis diferentes (EFS, Rungis) após o isolamento de ficoll. As células T foram classificadas por purificação em coluna (Miltenyi), ativadas com microesferas revestidas com CD3 CD28 (Miltenyi) e depois cultivadas por 48 horas a 37°C, 5% CO2 em RPMI 1640 Glutamax (Gibco) suplementado com 10% FCS 1% penicilina- estreptomicina (Gibco), 50 uM de beta-mercaptoetanol (Gibco), aminoácido não essencial, 10 mM de Hepes (Gibco) e 1 mM de piruvato de sódio (Gibco). Em seguida, as células foram lavadas e transduzidas com vetores lentivirais em MOI 20 em 200 µl a 1 M/mL durante 4 horas sob agitação lenta. As células foram então transferidas para uma placa de 96 poços de fundo em U. Após 24h as células foram ajustadas em 1,106 células/mL e 50U/mL de IL2 humana foram adicionadas (Preprotech). A cada 2-3 dias, as células foram contadas e ajustadas em 1,106 células/mL em meio completo com IL2. Após 8 dias, as células foram utilizadas para ensaios de função. Ensaios de citotoxicidade e perfil de ativação
[446] Os ensaios citotóxicos foram desempenhados contra células alvo JEG- 3, K562 e K562-HLA-G1.
[447] Resumidamente, 24 horas antes do ensaio, 3.105 As células JEG-3 foram marcadas com CFSE (CellTrace, Thermofisher) a 1/10 000; 3,105 K562 ou
3.105 cs células K562-HLA-G1 foram marcadas com CFSE a uma diluição de 1/20
000. As células alvo foram então plaqueadas em uma placa de 96 poços de fundo em U. As células CAR T foram lavadas em PBS 1x (Gibco) antes de serem cocultivadas com células alvo com a razão Efetor:Alvo indicada (E: T).
[448] Após 24h de coincubação, o meio foi coletado e as células recuperadas (destacadas no caso de JEG-3) em PBS-EDTA 0,1%. Após a lavagem, as células foram marcadas com anticorpos contra: CD4 (clone SK3 Percp, BD Pharmingen), CD8 (clone SK1 PE-Cy7, Biolegend), CD19 (clone LT19 FITC ou PE, Miltenyi), CD25 (clone M-A251 BV421, BD Horizon), CD69 (clone FN50 BV711, BD Horizon), PD-1 (clone EH12.2H7 APC, Biolegend) e vivos/mortos (eFluor 780, Thermofisher) seguindo as recomendações do fabricante. A aquisição foi realizada com citômetro Attune (Thermofisher) e os resultados analisados com o software FlowJo. Ensaios de secreção de IFNγ
[449] A quantificação de IFNγ foi realizada diretamente no meio de cocultura usando um kit CBA (BD Biosciences) seguindo as instruções do fabricante. Ensaio de Degranulação
[450] As células cocultivadas foram preparadas como descrito anteriormente (razão E:T de 10) e o anti-CD107a (clone H4A3 PE, Biolegend) foi adicionado diretamente à cocultura. 1 hora após a co-incubação, foi adicionada Monensin (GolgiStop, BD Bioscience). As células foram recuperadas 5 horas após a experiência de co-incubação e marcadas com CD4, CD8, CD19 e anticorpos Live/died. A aquisição foi realizada com um citômetro Attune e os resultados foram analisados com o software FlowJo. Experimento in vivo
[451] Camundongos NOD/SCID/IL2Rγc (NSG) deficientes (6-8 semanas de idade, The Jackson Laboratory, Sacramento, CA, EUA) foram irradiados (2,5 Gy) e inoculados por intravenosamente com número apropriado de luciferase expressando células tumorais K562-HLA-G1P (1,106/camundongo). As células T (não transduzidas e transduzidas) foram injetadas na veia da cauda no dia 3 para o modelo K562-HLA-G1P-Luc. O enxerto foi monitorado a cada 3 a 4 dias até o dia 17 pós-implantação e então semanalmente por medições BLI: os camundongos receberam 3 mg de luciferina intraperitoneal (VivoGlo Luciferina, # P1043, Promega, Wisconsin, EUA) dentro de 10 minutos antes da imageamento (IVIS Lumina Series III, Perkin Elmer, Massachusetts, EUA). Análises estatísticas
[452] Os dados são apresentados como médias +/- desvio padrão (DP). O teste t de Student foi usado e um P valor inferior a 0,05 foi considerado significativo. Para figuras que mostram experiências representativas, as barras de erro representam SD de triplicatas.
CONCLUSÃO
[453] Considerando que os critérios básicos para desenvolver a imunoterapia de CARs são a identificação do Antígeno Associado a Tumor adequado, a acessibilidade das células efetoras transgênicas e a reversibilidade do microambiente tumoral imunossupressor, parece claro que o HLA-G representa um candidato muito interessante para esse fim. O HLA-G é considerado um ICP devido ao seu papel fundamental na modulação imunológica, também foi amplamente descrito que essa molécula é expressa em numerosas efusões tumorais de diversas origens, e nenhuma resposta celular ou humoral foi descrita contra ela. além disso, o HLA-G é uma molécula singular para a qual sua função foi caracterizada, mas sua estrutura proteica acaba sendo muito complexa e heterogênea. assim, apenas uma abordagem não seria suficiente para inibir a função do HLa-G.
[454] Aqui é proposto a geração de dois CARs direcionados contra o HLA-G utilizando o scFv de anticorpos monoclonais anti-HLA-G (Mabs), direcionados a diferentes epítopos da molécula visando a maioria das isoformas de HLA-G: isoformas clássicas de HLA e isoformas menores livres de β2M. Portanto, espera- se eliminar a maioria das células que expressam isoformas imunossupressoras de HLA-G. As células efetoras transduzidas com o constructo de ácido nucleico de acordo com a presente invenção foram geradas e essas moléculas de CAR são altamente expressas na superfície celular e são biologicamente funcionais. Além disso, foram geradas células CAR NKT anti-HLA-G NKT. Foi relatado anteriormente que as células NKT eram células imunes melhores para a terapia de CAR do que as contrapartes T ou NK. Além disso, foi demonstrado que as células CAR NKT se infiltram com um tumor sólido de maior eficiência. Uma vez que as células de tumor sólido expressam altamente HLA-G (Paul et al. 1999 Cancer Research, Rouas-Freiss et al. 2007 Semin Cancer Biol, Yaghi et al. 2016 Oncotarget), o anti-HLA-G NKT CAR pode ser uma forma inovadora de contornar o ambiente imunossupressor associado ao HLA-G.
[455] Para resumir, aqui é demonstrado que os CARs constructo recombinante de terceira geração de acordo com a presente invenção (i) são expressos corretamente na superfície das células transduzidas, (ii) que cada CAR: HLA-G-15E7 CAR e HLA-G-LFTT-1 CAR são específicos para as isoformas imunossupressoras de HLA-G livres de β2M ou associadas a β2M, respectivamente e (iii) que as células efetoras que expressam CAR contra o HLA- G estão devidamente ativadas.

Claims (24)

REIVINDICAÇÕES
1. Receptor de antígeno quimérico (CAR), caracterizado pelo fato de que compreende um domínio de ligação ao antígeno de um anticorpo anti-HLA-G, um domínio transmembrana e um domínio intracelular, em que o referido CAR se liga especificamente a uma a seis isoforma de HLA-G, preferencialmente duas a cinco isoformas de HLA -G.
2. Receptor de antígeno quimérico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido CAR se liga especificamente ao HLA-G livre de β2M ou às isoformas de HLA-G associadas a β2M.
3. Receptor de antígeno quimérico de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido CAR não se liga ao domínio alfa1 de HLA-G.
4. Receptor de antígeno quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o referido CAR se liga especificamente à isoforma de HLA-G selecionada a partir do grupo que consiste em HLA-G1, HLA-G2, HLA-G5 e HLA-G6; ou em que o referido CAR se liga especificamente a ambos HLA-G1 e HLA-G5 ou a ambos HLA-G2 e HLA-G6 e/ou a ambas isoformas de HLA-G1/livre de β2M e HLA-G5/livre de β2M.
5. Receptor de antígeno quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno é um scFv que se liga especificamente ao HLA-G associado a β2M; preferencialmente a ambos HLA-G1 e HLA-G5 e o scFv compreende: (a) (i) a região variável da cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 1 ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais que 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1; e (ii) a região variável da cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 2 ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais que 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2; ou (b) (i) a CDR (Região Determinante de Complementaridade) 1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 1; e a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 2; ou em que o domínio de ligação ao antígeno é um scFv que se liga especificamente ao HLA-G livre de β2M, preferencialmente a ambos HLA-G2 e HLA-G6 e/ou a ambas isoformas de HLA-G1/livre de β2M e HLA-G5/livre de β2M e o scFv compreende: (c) (i) a região variável da cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 3 ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais que 95% de identidade com a SEQ ID NO: 3; e (ii) a região variável da cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 4 ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais que 95% de identidade com a SEQ ID NO: 4; ou (d) (i) a CDR (Região Determinante de Complementaridade) 1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 3; e a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 4.
6. Receptor de antígeno quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-HLA-G é um scFv anti-HLA-G que compreende: (a) (i) a região variável da cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 1 ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais que 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1; e (ii) a região variável da cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 2 ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais que 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2; ou (b) (i) a região variável da cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 3 ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais que 95% de identidade com a SEQ ID NO: 3; e (ii) a região variável da cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 4 ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais que 95% de identidade com a SEQ ID NO: 4.
7. Receptor de antígeno quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o domínio intracelular compreende um domínio de sinalização zeta de CD3 e, opcionalmente, pelo menos um(ns) domínio(s) coestimulatório(s) selecionado(s) a partir de domínios coestimulatórios CD28, 41BB, CD28, CD134, ICOS, OX40, CD149, DAP10, CD30, IL2-R, IL7r6, IL21-R, NKp30, NKp44, CD27, CD137 e DNAM-1, preferencialmente os dois domínios coestimulatórios são domínios coestimulatórios 41BB e CD28.
8. Receptor de antígeno quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o domínio transmembrana é selecionado a partir de domínios transmembrana CD28, CD3 e CD8, preferencialmente o domínio transmembrana é um domínio transmembrana CD28.
9. Receptor de antígeno quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o CAR compreende, sequencialmente, a partir do terminal N ao C: uma sequência de peptídeo sinal, um anticorpo anti-HLA-G ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um domínio espaçador, um domínio transmembrana, um domínio intracelular, um ligante clivável e um domínio CD19 humano truncado.
10. Receptor de antígeno quimérico de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente uma região de dobradiça conectando o domínio de ligação ao antígeno ao domínio transmembrana, preferencialmente selecionado a partir do grupo que consiste em (i) um domínio de dobradiça de IgG4 humana, (ii) um domínio de dobradiça de IgG4 humana e um domínio CH3 de IgG4 humana, (iii) um domínio CH2 mutado de lgG4 humana, um domínio de dobradiça de IgG4 humana e um domínio de dobradiça CH3 de IgG4 humana, (iv) uma dobradiça de CD28 e (v) um domínio de dobradiça de CD8a.
11. Receptor de antígeno quimérico de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o domínio de dobradiça compreende ou consiste na sequência estabelecida em (i) SEQ ID NO: 25,(ii) SEQ ID NO: 25 e SEQ ID NO: 27,(iii) SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 e SEQ ID NO: 27,(iv) SEQ ID NO: 18 ou (v) SEQ ID NO: 19 ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais que 95% de identidade com a mesma.
12. Receptor de antígeno quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 11, caracterizado pelo fato de que o peptídeo sinal é selecionado a partir do grupo que consiste em um peptídeo sinal de CD8a, um peptídeo sinal de Ig Kappa de camundongo, um peptídeo sinal de IgG4 humana, um peptídeo sinal de IL2, um peptídeo sinal de IgG2 humana e um peptídeo sinal de Gaussia luc.
13. Receptor de antígeno quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 12, caracterizado pelo fato de que o ligante clivável é selecionado a partir do grupo que consiste em P2A, T2A, E2A, B2A e F2A.
14. Receptor de antígeno quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 13, caracterizado pelo fato de que o domínio de CD19 humano truncado consiste na sequência estabelecida em SEQ ID NO: 29.
15. Construto de CAR multiespecífico, caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos dois domínios de ligação ao antígeno diferentes, um domínio transmembrana e um domínio intracelular, em que pelo menos um dos domínios de ligação ao antígeno se liga especificamente às isoformas de HLA-G associadas a um domínio β2M de HLA-G; e pelo menos outro dos domínios de ligação ao antígeno se liga especificamente às isoformas de HLA-G que não são associadas a um domínio β2M de HLA-G, preferencialmente em que o construto de CAR multiespecífico é um construto de CAR biespecífico que compreende (i) um domínio compreendendo CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 11, 12 e 13, respectivamente, (ii) um domínio compreendendo CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 14, 15 e 16, respectivamente, (iii) um domínio compreendendo CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 5, 6 e 7, respectivamente, e (iv) um domínio compreendendo CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) compreendendo uma sequência de SEQ ID NO: 8, 9 e 10, respectivamente, opcionalmente em que cada CDR pode compreender opcionalmente 1, 2, 3 ou 4 substituições, deleções ou inserções de aminoácidos.
16. Molécula de ácido nucleico, caracterizada pelo fato de que codifica o CAR definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15.
17. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de que compreende a molécula de ácido nucleico definida na reivindicação 16.
18. Célula, caracterizada pelo fato de que compreende o CAR definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, ou a molécula de ácido nucleico definida na reivindicação 16 ou o vetor de expressão definido na reivindicação 17, preferencialmente em que a célula é selecionada a partir de um grupo que consiste em uma célula T, célula T CD4+, célula T CD8+, célula B, célula NK, célula NKT, monócito e célula dendrítica, preferencialmente a célula sendo uma célula T, uma célula B ou uma célula NK.
19. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de ácido nucleico definida na reivindicação 16, um vetor de expressão definido na reivindicação 17 ou uma célula definida na reivindicação 18 e, opcionalmente, um carreador farmaceuticamente aceitável.
20. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que compreende (i) uma célula compreendendo um CAR que se liga especificamente ao HLA-G associado a β2M; preferencialmente a ambos HLA-G1 e HLA-G5, preferencialmente definido na reivindicação 5, e uma célula compreendendo um CAR que se liga especificamente ao HLA-G livre de β2M, preferencialmente a ambos HLA-G2 e HLA-G6 e/ou a ambas isoformas de HLA-G1/ livres de β2M e HLA-G5/livres de β2M, preferencialmente definido na reivindicação 5; ou (ii) uma célula que compreende um CAR que se liga especificamente a ambos HLA-G1 e HLA-G5 ou às isoformas de HLA-G livres de β2M, preferencialmente definido na reivindicação 5, e um CAR que se liga especificamente a ambos HLA-G2 e HLA-G6 ou às isoformas de HLA-G associadas a β2M, preferencialmente definido na reivindicação 5.
21. Célula de acordo com a reivindicação 18 ou a composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 19 a 20, caracterizada pelo fato de que é para uso no tratamento de câncer ou para uso no tratamento de uma infecção viral, preferencialmente em que a célula ou composição deve ser administrada em combinação com uma terapia de CAR que não tem como alvo o HLA-G.
22. Anticorpo anti-HLA-G, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente às isoformas de HLA-G associadas a β2M, preferencialmente ambos HLA-G1 e HLA-G5, preferencialmente, em que o anticorpo compreende: (a) (i) a região variável da cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 1 ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais que 95% de identidade com a SEQ ID NO: 1; e (ii) a região variável da cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 2 ou uma sequência homóloga mostrando mais que 80%, preferencialmente mais que 90%, ainda preferencialmente mais que 95% de identidade com a SEQ ID NO: 2; ou (b) (i) a CDR (Região Determinante de Complementaridade) 1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 1; e a CDR1, CDR2 e CDR3 da região variável da cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 2.
23. Receptor de antígeno quimérico de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15 ou o anticorpo anti-HLA-G de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que o anticorpo anti-HLA-G ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, preferencialmente um scFv, liga-se seletivamente ao HLA-G livre de β2M ou às isoformas de HLA-G associadas a β2M, mas não se liga a todas as isoformas de HLA-G.
Petição 870210036827, de 22/04/2021, pág. 180/191 Receptores de Parada Transcrição primária de HLA-G HLA-G Indução de APCs tolerogênicas Domínios de Ig Isoformas de HLA-G Inibição de * proliferação Motivos * lise baseados * Secreção de IFNG em Tyr Indução de células regulatórias Célula Linfócito T
Ligado à membrana
Figura 1 1/12
Indução de * ativação Expressão * Produção de Ab
Linfócito B Inibição de * proliferação NK alguns + alguns Secretado * lise Células T CD8+ alguns alguns * Produção de IFNG Células T CD4+ alguns Células NK Células B Monócitos/MF
Multimérico
HLA-G5 livre de hB2m HLA-G6 Controle Controle % de ligação % de ligação Isotipo Normalizado para o modo Subconjunto Subconjunto PE-A PE-A 0.92 Subconjunto
1.35 PE-A 1.
24 Jurkat wt Jurkat HLA - G1Lv Normalizado para o modo Subconjunto GaM- Subconjunto PE-A Subconjunto PE-A PE-A 1,42 GAMPE 0,76 GAMPE 0,54 Figura 2
Isotipo Normalizado para o modo
Subconjunto PE-A Subconjunto PE-A GAMPE 0,60 GAMPE 1,54 Subconjunto GaM-PE-A 4,50
Jurkat wt Jurkat HLA - G1Lv Normalizado para o modo
Subconjunto GaM-PE-A 0 Subconjunto Subconjunto PE-A GaM-PE-A 3,42 GAMPE 1,43
Figura 2 (continuação)
CD28 Transmembrana Ectodomínio de 4-1BB
Dobradiça de CD8a Ectodomínio de CD3z Peptídeo Sinal de CD8a Etiqueta Flag
CD 28Transmembrana Ectodomínio de 4-1BB Dobradiça de CD28 Ectodomínio de CD3z Peptídeo Sinal de CD8a Etiqueta Flag
Figura 3
Dobradiça de hlgG4 +
Peptídeo Dobradiça CH2 mutado de hCD19 truncado Sinal de hIgG4 hlgG4
Dobradiça de hlgG4 + Peptídeo Dobradiça de hlgG4 hCD19 truncado Sinal
Dobradiça Peptídeo Dobradiça Sinal de hlgG4 hCD19 truncado hCD19 reporter truncado
Dobradiça de hlgG4-mCH2- Dobradiça de hlgG4-CH3 Dobradiça de hlgG4 CH3
Figura 4
Jurkat wt Jurkat 15E7 Jurkat LFTT-1
Anti-Flag Anti-Flag Anti-Flag
Anti-Flag Anti-Flag Anti-Flag
Figura 5
Células alvo Células efetoras Sem reconhecimento Sem ativação efetora Sem transferência de membrana
Reconhecimento de HLA-G Ativação efetora Células Efetoras Transferência de membrana CAR HLA-G
Jurkat HLA-G1Lv
Subconjunto GAMPE Isotipo PE-A 0,54 Normalizado para o modo
Figura 6
1 h de coincubação Jurkat Células
Jurkat CAR LFTT-1 alvo
Jurkat CAR 15E7 Jurkat HLA-G
Jurkat CAR 15E7 Jurkat CAR LFTT-1 Células efetoras
Figura 6 (continuação)
Índice de Ativação
Figura 6 (continuação)
p<0,05 Índice de Ativação Índice de Ativação
Figura 7
Células K562 Células K562-HLA-G1 Células JEG-3 % de lise celular
Razão E:T Razão E:T Razão E:T % de CD8 CD107a+
6 h de coincubação, n=3
Controle 15E7 CAR Dobradiça IgG4 LFTT-1 CAR Dobradiça IgG4 15E7 CAR Dobradiça IgG4 + CH3 LFTT-1 CAR Dobradiça IgG4 + CH3 LFTT-1 CAR Dobradiça IgG4 + mCH2-CH3 15E7 CAR Dobradiça IgG4 + mCH2-CH3
Figura 8
Células JEG-3 Células K562-HLA-G1 Células K562
Limite de detecção
Figura 9
Irradiação
Grupo controle Grupo tratado Grupo tratado 6 camundongos/grupo 6 camundongos/grupo 6 camundongos/grupo
Células T não transduzidas
Monitoramento de Tumor
Figura 10
Grupo controle Grupo tratado Grupo tratado Células T não transduzidas Células CAR-T 15E7 Células CAR-T LFTT1 Dia 3 Dia 7 Dia 10 Dia 14 Dia 17 Dia 24
Crescimento do tumor Crescimento do tumor Crescimento do tumor
Figura 10 (continuação)
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