BR112020001601A2

BR112020001601A2 - métodos e composições para preparar células geneticamente manipuladas

Info

Publication number: BR112020001601A2
Application number: BR112020001601-2A
Authority: BR
Inventors: Mark L. Bonyhadi
Original assignee: Juno Therapeutics Inc
Priority date: 2017-08-09
Filing date: 2018-08-09
Publication date: 2020-08-11
Also published as: JP2020530294A; KR20200046045A; WO2019032929A1; EP3664835A1; MX2020001491A; US20200239910A1; JP2023055888A; CA3070575A1; CN111263641A; AU2018313952A1; RU2020109867A; RU2020109867A3; MA49981A

Abstract

A presente invenção refere-se a métodos para a preparação de células T para terapia celular, composições produzidas pelos métodos e métodos de administração das células aos indivíduos. Em particular, a descrição se refere à preparação de células T manipuladas, tais como aquelas que expressam receptores geneticamente modificados, tal como receptores de antígenos geneticamente modificados, como TCRs (recombinantes) manipulados e receptores de antígeno quiméricos (CARs) ou outros receptores quiméricos recombinantes. As características dos métodos incluem a produção de um produto de célula T mais consistente e/ou previsível e/ou menor toxicidade em comparação com outros métodos. Os métodos fornecidos incluem incubar células sob condições estimulantes para induzir a expansão ou proliferação de células T semelhantes às células T naives em comparação com células T semelhantes às células T não naives na composição estimulada, que por sua vez pode resultar na transdução preferencial de células derivadas de células T semelhantes às células T naives. As características dos métodos também podem incluir redução de custos, número de etapas e gasto de recursos em comparação com outros métodos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA PREPARAR CÉLULAS GENETICAMENTE MANIPULADAS". Referência Cruzada com Pedidos Relacionados

[001] Esse pedido reivindica prioridade para o pedido provisório U.S. No. 62/543.359, depositado em 9 de agosto de 2017, intitulado “METHODS AND COMPOSITIONS FOR PREPARING GENETICALLY ENGINEERED CELLS”, cujos conteúdos estão incorporados por referência em sua totalidade. Incorporação por Referência da Listagem de Sequências

[002] O presente pedido está sendo depositado juntamente com uma Listagem de Sequências em formato eletrônico. A Listagem de sequência é fornecida como um arquivo intitulado 735042010540SEQLIST.txt, criado em 11 de julho de 2018, com tamanho de 35.434 kilobytes. As informações no formato eletrônico da Listagem de sequências são incorporadas por referência em sua totalidade. Campo

[003] A presente invenção refere-se a métodos para a preparação de células T para terapia celular, composições produzidas pelos métodos e métodos de administração das células a indivíduos. Em particular, a descrição se refere à preparação de células T manipuladas, tais como aquelas que expressam receptores geneticamente manipulados, como receptores de antígenos geneticamente manipulados, como TCRs (recombinantes) manipulados e receptores de antígeno quiméricos (CARs) ou outros receptores quiméricos recombinantes. As características dos métodos incluem a produção de um produto de célula T mais consistente e/ou previsível e/ou menor toxicidade em comparação com outros métodos. Os métodos fornecidos incluem a incubação de células sob condições estimulantes para induzir a expansão ou proliferação de células T semelhantes às células T naives em comparação com células T semelhantes às células T não naives na composição estimulada, que por sua vez pode resultar na transdução preferencial de células derivadas células T semelhantes às células T naives. Os aspectos dos métodos também podem incluir redução de custos, número de etapas e gasto de recursos em comparação com outros métodos. Antecedentes

[004] Estão disponíveis vários métodos para preparar células para uso terapêutico e a administração das células. Por exemplo, estão disponíveis métodos para a preparação de células, incluindo células T, para manipulação e terapia celular, incluindo métodos que envolvem depleção ou enriquecimento para determinadas subpopulações. São necessários métodos aprimorados, por exemplo, para reduzir a toxicidade associada a certas administrações de terapia celular adotadas, para melhorar o processo de fabricação, para permitir uma administração aperfeiçoada e/ou para reduzir custos ou outros recursos. São fornecidos métodos, células, composições, kits e sistemas que atendem a tais necessidades. Sumário

[005] São fornecidos aqui métodos para manipulação genética de células T, incluindo o método de incubação de uma composição de entrada, em condições de estimulação, por 2 a 6 dias, a dita composição de entrada que compreende uma população de células T que compreende células T do naive e células T semelhantes às células T não naives, em que as condições de estimulação compreendem um reagente estimulador capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR e/ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimuladoras, gerando dessa maneira uma composição estimulada; e introduzindo um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente manipulado na composição estimulada de células T, em que a introdução é realizada durante pelo menos uma porção da incubação.

[006] São fornecidos aqui métodos para manipulação genética de células T, o método que compreende a incubação de uma composição de entrada, sob condições estimulantes, por 2 a 6 dias, a dita composição de entrada que compreende uma população de células T que compreende células T semelhantes às células T naives e células T semelhantes às células T não naives, em que as condições estimulantes compreendem a presença de um reagente estimulador capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR e/ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimuladoras, gerando dessa maneira uma composição estimulada; e a incubação da composição de entrada sob condições estimulantes é realizada antes, durante e/ou subsequente à introdução de um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente manipulado. Em algumas modalidades, a incubação é realizada por pelo menos 3 dias. Em alguns casos, a incubação é realizada por pelo menos 4 dias. Em algumas modalidades, a incubação é realizada por pelo menos 5 dias. Em algumas modalidades, a incubação é realizada por pelo menos 6 dias.

[007] São aqui fornecidos métodos para estimular células T, que incluem (a) incubar, sob condições estimulantes, uma composição de entrada que contém células T que contém uma quantidade inicial de cultura de células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+ dessas, produzindo assim uma composição estimulada; e (b) introduzir na composição celular estimulada um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente manipulado, em que o método gera assim uma composição de saída que contém células T que expressam o receptor recombinante geneticamente manipulado. Em algumas modalidades, as células T contêm células T semelhantes às células T naives e células T semelhantes às células T não naives, em que as condições estimulantes induzem preferivelmente a expansão ou proliferação das células T semelhantes às células T naives em comparação com as células T não naives na composição estimulada. Em algumas modalidades, a introdução é realizada durante pelo menos uma porção da incubação ou é realizada subsequentemente à incubação.

[008] Em algumas modalidades, a quantidade inicial de cultura de células T semelhantes às células T naives ou de um subgrupo de células T CD8+ está entre ou entre cerca de 0,1 x 108 a 5 x 108, entre ou entre cerca de 0,1 x 108 a 4 x 108, entre ou entre cerca de 0,1 x 108 a 2 x 108, entre ou entre cerca de 0,1 x 108 a 1 x 108, entre ou entre cerca de 1 x 108 a 5 x 108, entre ou entre cerca de 1 x 1108 a 4 x 108, entre ou entre cerca de 1 x 108 a 2 x 108, entre ou entre cerca de 2 x 108 a 5 x 108, entre ou entre cerca de 2 x 108 a 4 x 108 das células T semelhantes células T naives ou um subgrupo de células T CD8+ dessas. Em alguns casos, a quantidade inicial de cultura de células T naives ou de um subgrupo de células T CD8+ é pelo menos ou pelo menos cerca de ou é ou é cerca de 0,5 x 108, 0,75 x 108, 1 x 108, 1,5 x 108, 2 x 108 ou 4 x 108 das células T semelhantes às células T naives ou de um subgrupo de células T CD8+ dessas. Em alguns casos, a quantidade inicial de cultura de células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+ é pelo menos ou pelo menos cerca de ou é ou é cerca de 2 x 108 células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+ dessas.

[009] São fornecidos métodos para estimular células T, incluindo o método de incubação, sob condições estimulantes, uma composição de entrada que inclui células T que contêm uma quantidade inicial de cultura de células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+ entre ou entre cerca de 1 x 108 a 4 x 108 células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+, produzindo assim uma composição estimulada. Em alguns aspectos, as células T contêm células T semelhantes às células T naives e células T semelhantes às células T não naives, em que as condições de estimulação induzem preferivelmente a expansão ou proliferação das células T naive em comparação com as células T não naives na composição estimulada.

[0010] Em algumas modalidades, a quantidade inicial de cultura de células T semelhantes às células T naives ou de um subgrupo de células T CD8+ dessas é pelo menos ou pelo menos cerca de ou é ou é cerca de 2 x 108 de células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+ dessas. Em alguns aspectos, a quantidade inicial de cultura é uma quantidade de células T CD8+ semelhantes às células naives.

[0011] Em algumas de tais modalidades, as células T semelhantes às células T naives ou as células T CD8+ do tipo naive são positivas na superfície para um marcador de ativação de célula T selecionado do grupo que consiste em CD45RA, CD27, CD28 e CCR7; e/ou são negativas na superfície para um marcador selecionado do grupo que consiste em CD25, CD45RO, CD56, CD62L, KLRG1; e/ou têm baixa expressão de CD95; e/ou são negativas para a expressão intracelular de uma citocina selecionada do grupo que consiste em IL-2, IFN-γ, IL- 4, IL-10. Em algumas modalidades, as células do tipo naive ou as células CD8+ do tipo naive têm superfície positiva para um marcador de ativação de célula T selecionado do grupo que consiste em CD45RA, CD27, CD28 e CCR7; e/ou são negativas na superfície para um marcador selecionado do grupo que consiste em CD45RO, CD56,

KLRG1; e/ou tem baixa expressão de CD95. Em algumas modalidades, as células T semelhantes às células T naives ou as células CD8+ do tipo naive são CD45RA+, CD27+, CCR7+, CD62- e/ou CD45RO-.

[0012] Em algumas de tais modalidades, as células T semelhantes às células T não naives têm a superfície negativa para um marcador de ativação de célula T selecionado do grupo que consiste em CD45RA, CD27, CD28 e CCR7; e/ou são positivas na superfície para um marcador selecionado do grupo que consiste em CD25, CD45RO, CD56, CD62L, KLRG1 e perforina; e/ou são positivas para a expressão intracelular de uma citocina selecionada do grupo que consiste em IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10; e/ou tem alta expressão de CD95. Em alguns aspectos, as células T semelhantes às células T não naives são CD45RA-, CD27-, CCR7-, CD62 + e/ou CD45RO+.

[0013] Em algumas modalidades, as células da composição de entrada não foram e não são, antes da incubação, submetidas a uma etapa de seleção com base em um marcador endógeno de superfície de célula T que diferencia as células T semelhantes às células T naives e do tipo não naive.

[0014] Em algumas modalidades, o método inclui ainda a introdução de um receptor recombinante geneticamente manipulado nas células estimuladas, em que o método gera assim uma composição de saída que inclui células T que expressam o receptor recombinante geneticamente manipulado. Em alguns casos, a incubação da composição sob condições de estimulação é realizada antes, durante e/ou subsequente à introdução de um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente manipulado.

[0015] Em algumas modalidades, o receptor recombinante é capaz de se ligar a um antígeno alvo que está associado com, específico para e/ou expresso em uma célula ou tecido de uma doença, distúrbio ou condição. Em alguns exemplos, a doença, distúrbio ou condição é uma doença ou distúrbio infeccioso, uma doença autoimune, uma doença inflamatória ou um tumor ou um câncer.

Em alguns casos, o antígeno alvo é um antígeno tumoral.

Em algumas modalidades, o antígeno alvo é selecionado dentre a ανβ6 integrina (avb6 integrina), antígeno de maturação de células B (BCMA), anidrase carbônica 9 (CAIX), Her2/neu (receptor tirosina quinase erbB2), L1-CAM, B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX ou G250), um antígeno de câncer de testículo, antígeno de câncer/testículo 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA) e antígeno de superfície da hepatite B, receptor anti-folato, ciclina, ciclina A2, Ligante 1 do Motivo C-C da Quimiocina (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44 , CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteoglicano 4 do sulfato de condroitina (CSPG4), proteína do fator de crescimento epidérmico (EGFR), glicoproteína epitelial 2 (EPG- 2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40 ), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), erb-B2, erb-B3, erb-B4, dímeros de erbB, mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico do tipo III (EGFR vIII), proteína de ligação ao folato (FBP), receptor Fc semelhante a 5 ( FCRL5; também conhecido como homólogo 5 do receptor Fc ou FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), uma proteína de ligação ao folato (FBP), receptor alfa de folato, gangliosídeo GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glipicano-3 (GPC3), Receptor 5D Acoplado à Proteína G (GPRC5D), Her2/neu (receptor tirosina quinase erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros erbB, antígeno humano de alto peso molecular associado ao melanoma (HMW-MAA), Antígeno de superfície da hepatite B, antígeno A1 leucocitário humano (HLA-A1), antígeno A2 leucocitário humano (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL- 22R-alfa), IL-13R-alfa2 (IL-13Rα2), de quinase receptor de domínio do inserto de quinase (kdr), cadeia leve kappa, Lewis Y, molécula L1 de adesão celular (L1-CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, Membro A da Família 8 que contém repetição rica em leucina (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado ao Melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomegalovírus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes do Membro D do grupo 2 de natural killer (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adesão de células neurais (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno do melanoma expresso preferivelmente (PRAME), receptor de progesterona, antígeno específico da próstata, antígeno de células-tronco da próstata (PSCA), antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), receptor tirosina quinase semelhante ao receptor órfão 1 (ROR1), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG também conhecida como 5T4), glicoproteína 72 associada ao tumor (TAG72), proteína 1 relacionada à tirosinase (TRP1, também conhecida como TYRP1 ou gp75), proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP2, também conhecida como dopacromo tautomerase, dopacromo delta-isomerase ou DCT), receptor α de folato, 8H9, antígeno duplo, glicoproteína 100 (gp100), receptor de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor de fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGF-R2), receptor de estrogênio, receptor de progesterona, Tumor de Wilms 1 (WT-1), um antígeno específico de patógeno ou expresso por patógeno e um antígeno associado a um marcador universal.

[0016] Em algumas modalidades, o receptor recombinante é ou contém um receptor de antígeno não TCR funcional ou um TCR ou seu fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o receptor recombinante é um receptor de antígeno quimérico (CAR).

[0017] Em algumas dessas modalidades, o receptor recombinante contém um domínio extracelular que contém um domínio de ligação ao antígeno, opcionalmente em que o domínio de ligação ao antígeno se liga especificamente ao antígeno alvo. Em alguns casos, o domínio de ligação ao antígeno é ou contém um anticorpo ou seu fragmento de anticorpo, que opcionalmente é um fragmento de cadeia simples. Em alguns aspectos, o fragmento contém regiões variáveis de anticorpo unidas por um ligante flexível. Em alguns casos, o fragmento contém um scFv.

[0018] Em algumas modalidades, o receptor recombinante contém ainda um espaçador e/ou uma região de dobradiça. Em alguns aspectos, o receptor recombinante contém uma região de sinalização intracelular. Em alguns exemplos, a região de sinalização intracelular contém um domínio de sinalização intracelular. Em alguns aspectos, o domínio de sinalização intracelular é ou contém um domínio de sinalização primário, um domínio de sinalização que é capaz de induzir um sinal de ativação primária em uma célula T, um domínio de sinalização de um componente do receptor de célula T (TCR) e/ou um domínio de sinalização que contém um motivo de ativação de imunorreceptor baseado em tirosina (ITAM). Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular é ou contém um domínio de sinalização intracelular de uma cadeia de CD3, opcionalmente uma cadeia CD3-zeta (CD3ζ), ou uma porção de sinalização da mesma.

[0019] Em algumas modalidades, o receptor recombinante contém ainda um domínio transmembrana disposto entre o domínio extracelular e a região de sinalização intracelular. Em alguns aspectos, a região de sinalização intracelular contém ainda uma região de sinalização coestimulatória. Em algumas modalidades, a região de sinalização coestimulatória contém um domínio de sinalização intracelular de uma molécula coestimuladora de células T ou uma porção de sinalização da mesma. Em alguns casos, a região de sinalização coestimulatória contém um domínio de sinalização intracelular de um CD28, um 4-1BB ou um ICOS ou uma porção de sinalização dos mesmos. Em algumas modalidades, o CAR compreende um scFv específico para o antígeno,

um domínio transmembrana, um domínio de sinalização citoplasmático derivado de uma molécula coestimulatória, que é opcionalmente ou compreende um 4-1BB e um domínio de sinalização citoplasmático derivado de uma molécula que contém a sinalização primária de ITAM, que opcionalmente é ou compreende um domínio de sinalização CD3zeta e, opcionalmente, compreende ainda um espaçador entre o domínio transmembrana e o scFv; o CAR compreende, em ordem, um scFv específico para o antígeno, um domínio transmembrana, um domínio de sinalização citoplasmático derivado de uma molécula coestimulatória, que opcionalmente é ou compreende um domínio de sinalização de 4-1BB e um domínio de sinalização citoplasmático derivado molécula que contém a sinalização primária de ITAM, que opcionalmente é um domínio de sinalização de CD3zeta; ou o CAR compreende, em ordem, um scFv específico para o antígeno, um espaçador, um domínio transmembrana, um domínio de sinalização citoplasmático derivado de uma molécula coestimulatória, que opcionalmente é um domínio de sinalização de 4- 1BB e um domínio de sinalização citoplasmático derivado de uma molécula que contém a sinalização primária de ITAM, que opcionalmente é ou compreende um domínio de sinalização de CD3zeta.

[0020] Em algumas modalidades, a região de sinalização coestimulatória está entre os domínios transmembrana e a região de sinalização intracelular.

[0021] Em algumas dessas modalidades, a condição estimulante inclui a incubação com um reagente estimulador capaz de ativar células T, células T CD4+ e/ou células T CD8+; é capaz de induzir um sinal através de um complexo TCR; e/ou é capaz de induzir a proliferação de células T, células T CD4+ e/ou células T CD8+. Em algumas modalidades, a condição estimulante inclui a incubação com um reagente estimulador capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR e/ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimuladoras. Em alguns casos, o reagente estimulador contém um agente primário que se liga especificamente a um membro de um complexo de TCR, opcionalmente que se liga especificamente a CD3. Em algumas modalidades, o agente primário é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno.

[0022] Em alguns exemplos, o agente estimulador inclui ainda um agente secundário que se liga especificamente a uma molécula coestimuladora de célula T, opcionalmente em que a molécula coestimuladora é selecionada do grupo que consiste em CD28, CD137 (4-1-BB), OX40 ou ICOS. Em algumas modalidades, o agente primário é um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, os agentes primário e secundário incluem anticorpos, opcionalmente em que o um ou mais agentes estimulantes incluem incubação com um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28.

[0023] Em algumas modalidades, o agente primário e/ou secundário está presente na superfície de um suporte sólido. Em alguns casos, o suporte sólido é ou contém uma esfera. Em algumas modalidades, a esfera contém um diâmetro maior ou maior que cerca de 3,5 μm, mas não mais que cerca de 9 μm ou não mais que cerca de 8 μm ou não mais que cerca de 7 μm ou não mais que cerca de 7 μm ou não mais que cerca de 6 μm ou não mais que cerca de 5 μm. Em alguns exemplos, a esfera contém um diâmetro de cerca de 4,5 μm. Em alguns aspectos, a esfera contém um diâmetro que é ou tem aproximadamente o mesmo tamanho que um linfócito ou de uma célula que apresenta o antígeno.

[0024] Em algumas modalidades, a esfera é inerte. Em alguns casos, a esfera é ou contém uma superfície de poliestireno e, opcionalmente, contém um núcleo magnético ou superparamagnético.

[0025] Em algumas modalidades, a condição estimulante inclui incubar as células com uma proporção de esferas para células que é de ou de cerca de 1:1 a 10:1, de ou de cerca de 1:1 a 8:1, de ou de cerca de 1:1 a 6:1, de ou de cerca de 1:1 a 4:1, de ou de cerca de 1:1 a 3:1, de ou de cerca de 2:1 a 4:1, de ou de cerca de 2:1 a 3:1, de ou de cerca de 1:1 a 2:1, de ou de cerca de 4:1 a 10:1, de ou de cerca de 4:1 a 8:1, de ou de cerca de 4:1 a 6:1, de ou de cerca de 6:1 a 10:1, de ou de cerca de 6:1 a 8:1, de ou de cerca de 8:1 a 10:1, de ou de cerca de 1:1 a 1:10, de ou de cerca de 1:1 a 1: 8, de ou de cerca de 1:1 a 1: 6, de ou de cerca de 1:1 a 1: 4, de ou de cerca de 1: 2 a 1: 3. Em alguns exemplos, a proporção de esferas para células é de ou de cerca de 3:1. Em algumas modalidades, a proporção de esferas para células é de ou de cerca de 1:1.

[0026] São aqui fornecidos métodos para manipular geneticamente células T, incluindo a incubação de uma composição de entrada, sob condições estimulantes, por entre 2 e 6 dias, a dita composição de entrada que compreende uma população de células T que compreende células T semelhantes às células T naives e células T semelhantes às células T não naives, em que as condições estimulantes compreendem um reagente estimulador que compreende um anticorpo anti-CD3 e um agente secundário que é um anticorpo anti-CD28 que está ligado a uma esfera, em que a proporção de esferas para células durante a incubação é de ou de cerca de 1:1 a 4:1; e introdução de um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente manipulado na composição estimulada de células T, em que a introdução é realizada durante pelo menos uma porção da incubação.

[0027] São fornecidos aqui métodos para manipular geneticamente células T, o método que compreende a incubação de uma composição de entrada, em condições estimulantes, por 2 a 6 dias, a dita composição de entrada que compreende uma população de células T que compreende células T semelhantes às células T naives e células T semelhantes às células T não naives, em que as condições estimulantes compreendem um reagente estimulador que compreende um anticorpo anti-CD3 e um agente secundário que é um anticorpo anti-CD28 que está ligado a uma esfera, em que a proporção de esferas para células durante a incubação é de ou de cerca de 1:1 a 4:1; e a incubação da composição de entrada sob condições estimulantes é realizada antes, durante e/ou subsequente à introdução de um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente manipulado.

[0028] Em algumas de tais modalidades, as células T são de uma amostra biológica, opcionalmente em que a amostra biológica é de um indivíduo humano. Em alguns casos, a amostra biológica é ou contém uma amostra de sangue total, uma amostra de buffy coat, uma amostra de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), uma amostra de células T não fracionada, uma amostra de linfócitos, uma amostra de células sanguíneas brancas, um produto de aférese ou um produto de leucaférese.

[0029] Em algumas modalidades, as células T, contêm células T CD4+ e/ou células T CD8+; Em algumas modalidades, as células T, contêm células T CD4+ e/ou células T CD8+ a e proporção de células T CD4+ para CD8+ está entre ou é de cerca de 2:1 e é de ou cerca de 1:5. Em alguns casos, a proporção de células T CD4+ para CD8+ é de ou cerca de 1:1, 1:2, 2:1, 1:3 ou 3:1. Em algumas modalidades, as células T semelhantes às células T naives incluem células T CD4+ do tipo naive e/ou células T CD8+ do tipo naive.

[0030] Em algumas dessas modalidades, as células T semelhantes às células T naives são policlonais. Em alguns casos, a clonalidade das células T semelhantes às células T naives é determinada pelo sequenciamento clonal, opcionalmente por sequenciamento da próxima geração ou análise por tipo espectral.

[0031] Em algumas modalidades, a presença, quantidade, número ou percentual de células T semelhantes às células T naives é detectada por citometria de fluxo.

[0032] Em algumas dessas modalidades, a condição estimulante não inclui N-acetilcisteína (NAC). Em algumas modalidades, a condição estimulante não contém IL-15 e/ou IL-7. Em algumas modalidades, a condição estimulante resulta ou induz a morte ou as células T não naives ou uma subpopulação das mesmas. Em alguns aspectos, a condição de estimulação resulta em morte celular induzida por ativação (AICD) de células T semelhantes às células T não naives ou uma subpopulação das mesmas.

[0033] Em algumas modalidades, o método inclui ainda a adição de DNAase durante a incubação e/ou à composição estimulada.

[0034] Em algumas modalidades, a incubação é realizada por mais do que ou cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 dias. Em algumas modalidades, o percentual de células, na composição estimulada, derivada das células T semelhantes às células T naives é aumentado em mais do que ou é maior que cerca de 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes em comparação com o percentual de células do tipo naive na composição de entrada. Em algumas modalidades, a proporção, na composição estimulada, de células derivadas das células T semelhantes às células T naives em comparação com células derivadas das células T semelhantes às células T não naives é aumentada em mais do que ou é maior que cerca de 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes em comparação com a proporção de células T semelhantes às células T naives em comparação com células T semelhantes às células T não naives na composição de entrada.

[0035] Em alguns casos, a composição estimulada contém mais do que 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de células derivadas de células T semelhantes às células T naives da composição de entrada. Em algumas modalidades, a composição estimulada contém menos do que 10% de células derivadas de células T não naives. Em alguns exemplos, a composição estimulada contém menos do que 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% de células derivadas de células T não naives.

[0036] Em algumas modalidades, das células na composição de entrada, um percentual maior de células T semelhantes às células T naives, em comparação com as células T semelhantes às células T não naives, é induzido a proliferar e/ou ser ativada. Em alguns aspectos, um percentual maior de células T que eram naives na composição de entrada, em comparação com o percentual de células T que não eram naives na composição de entrada, estão se dividindo no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 após o início da dita incubação. Em alguns casos, as condições estimulantes são capazes de induzir a proliferação de um percentual maior de células de uma população de células T humanas do tipo naive, em comparação com células T humanas do tipo humano não naive, no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 após o início da incubação sob as condições.

[0037] Em algumas de tais modalidades, as células T não naives são selecionadas do grupo que consiste em células T efetoras (TEFF), células T de memória, células T de memória central (TCM), , células T de memória efetiva (TEM) e suas combinações; ou as células T não naives são uma pluralidade de células T, incluindo ou consistindo em células T efetoras (TEFF) e/ou células T de memória, as células T de memória que contêm opcionalmente células T de memória central (TCM) e/ou células efetoras de memória T (TEM).

[0038] Em algumas modalidades, o percentual de células T semelhantes às células T naives na composição de entrada é menor que o percentual de células manipuladas na composição estimulada derivadas de células T semelhantes às células T naives na composição de entrada. Em algumas modalidades, um percentual maior de células introduzidas com o ácido nucleico é ou é derivada da proliferação de células T semelhantes às células T naives na composição de entrada, em comparação com células T semelhantes às células T não naives na composição de entrada.

[0039] Em algumas dessas modalidades, a introdução é por transdução. Em algumas modalidades, o ácido nucleico contém um vetor viral. Em alguns casos, o vetor viral é um vetor retroviral. Em alguns aspectos, o vetor viral é um vetor lentiviral ou um vetor gama retroviral. Em algumas modalidades, a introdução é pela transposição de um transposon que contém a molécula de ácido nucleico. Em algumas modalidades, a proporção de células T semelhantes às células T naives em comparação com células T semelhantes às células T não naives na composição estimulada está aumentada em mais do que ou é maior que cerca de 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes em comparação com a proporção de células T semelhantes às células T naives em comparação com as células T não naives na composição de entrada. Em algumas modalidades, a composição estimulada é mais policlonal ou multiclonal em comparação com a composição de entrada. Em algumas modalidades, o método é realizado in vitro ou ex vivo.

[0040] São fornecidas composições de saída produzidas por qualquer um dos métodos aqui fornecidos. Também são fornecidas composições farmacêuticas que contêm as composições de saída descritas. Em algumas modalidades, a composição farmacêutica contém ainda um veículo farmacêutico.

[0041] São fornecidos métodos de tratamento, incluindo a administração a um indivíduo mamífero de uma composição de saída produzida por qualquer um dos métodos descritos ou qualquer uma composições descritas. Em algumas modalidades, as células são derivadas do indivíduo no qual as células são administradas. Descrição Detalhada

[0042] São aqui fornecidos métodos para incubar (por exemplo, estimular) células no processo de preparação de células para terapia celular adotiva e composições e células produzidas pelos métodos. Em algumas modalidades, as células incluem células T, que em alguns aspectos expressam receptores de antígeno geneticamente manipulados. Em algumas modalidades, os receptores de antígeno geneticamente manipulados incluem receptores de células T geneticamente manipulados ou recombinantes (TCRs) e receptores funcionais de antígeno não TCR, tais como receptores quiméricos de antígeno (CARs).

[0043] Em algumas modalidades, são fornecidos métodos para incubar (por exemplo, estimular) células T. Os métodos disponíveis têm feito uso de anti-CD3 e anti-CD28 para a estimulação de células T. No entanto, os métodos atualmente disponíveis não se concentraram na obtenção de populações-alvo específicas de células através do processo de incubação e na produção de uma população mais desejável de células T e nos resultados benéficos das mesmas. Os métodos disponíveis também não resultam na eliminação de uma população de células T específica e indesejada de uma população de células T de entrada no processo de incubação, nem nos resultados benéficos da mesma. Além disso, os métodos disponíveis não são projetados para eliminar, de uma população de células T durante o processo de incubação, uma subpopulação que será usada para gerar uma composição de saída que compreende células T que expressam um receptor recombinante geneticamente manipulado. Os métodos disponíveis também não descrevem benefícios, que incluem a produção de uma população mais consistente e/ou previsível de células T que é benéfica para manipulação genética, dosagem e/ou resposta clínica.

[0044] Em alguns aspectos, as modalidades fornecidas fornecem métodos para gerar um número aumentado de composição mais uniforme e/ou previsível de células T em comparação com outros métodos de estimulação e, em alguns aspectos, proporciona ainda a diminuição ou eliminação de populações indesejadas de células T, por exemplo, células cuja presença pode dar ao produto final uma heterogeneidade que é difícil de prever a potência, eficácia e segurança. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos abordam problemas relacionados à geração de células T geneticamente modificadas, nas quais um grande número ou a maioria dessas células geneticamente modificadas são derivadas de células T não naives. Em alguns aspectos, a falta de persistência, exaustão e/ou problemas relacionados à toxicidade podem estar associados à terapia adotiva de células T que envolve uma composição que contém células geneticamente modificadas derivadas de células T não naives e/ou nas quais o percentual ou número de células geneticamente modificadas derivadas de células T não naives está acima de um certo limite. Em algumas modalidades, os métodos que resultam em uma composição de célula T geneticamente modificada que é enriquecida com células derivadas de células do tipo naive podem exibir características relacionadas a um aumento geral no percentual de células saudáveis e/ou em células na composição que exibem persistência aumentada em comparação com outros métodos nos quais essas células do tipo naive não são tão enriquecidas.

[0045] Consequentemente, entre os métodos para a preparação de células T manipuladas para terapia adotiva aqui fornecidos estão aqueles que usam condições que resultam em expansão ou proliferação preferencial ou manipulação genética de células derivadas de células T semelhantes às células T naives (ou derivadas de células CD27+, CD45RA+, CCR7+, CD62L- ou CD45RO-) em comparação com aquelas derivadas de células T semelhantes células T não naives (ou derivadas de células T CD27-, CD45RA-, CCR7-, CD62L + ou CD45RO +). Em algumas modalidades, os métodos envolvem a incubação de células T em uma composição de entrada que contém células T semelhantes às células T naives sob condições estimulantes que produzem preferivelmente uma composição estimulada que contém células derivadas de células T semelhantes às células T naives da composição de entrada. Em alguns aspectos, a população de células T contém uma mistura de células T semelhantes às células T naives e células T semelhantes às células T não naives. Em algumas modalidades, as condições estimulantes induzem preferivelmente uma resposta em células T não naives em comparação com células T naives. Em alguns casos, a resposta inclui a ativação preferencial das células T não naives, o que, em algumas modalidades, pode levar à morte celular.

[0046] Em algumas modalidades, o método inclui incubar células sob condições estimulantes, incluindo a incubação com um agente estimulador capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo de TCR e/ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimulatórias. Em alguns casos, o agente primário se liga especificamente ao CD3 e/ou a molécula coestimulatória é selecionada do grupo que consiste em CD28, CD137 (4-1-BB), OX40 ou ICOS. Por exemplo, em algumas modalidades, o agente primário é ou compreende anti-CD3 e o agente secundário é ou compreende anti-CD28. Em alguns casos, os agentes primário e secundário compreendem anticorpos e/ou estão presentes na superfície de um suporte sólido. Em alguns exemplos, o suporte sólido é uma esfera.

[0047] Em algumas modalidades, a condição estimulante inclui incubar as células da composição de entrada com tal reagente de estimulação, por exemplo, esferas anti-CD3/anti-CD28, nas quais a proporção de esferas para células é de ou de cerca de 1:1 a 10:1, de ou de cerca de 1:1 a 8:1, de ou de cerca de 1:1 para 6:1, de ou de cerca de 1:1 a 4:1, de ou de cerca de 1:1 a 3:1, de ou de cerca de 4:1 a 10:1, de ou de cerca de 4:1 a 8 :1, de ou de cerca de 4:1 a 6:1, de ou de cerca de 6:1 a 10:1, de ou de cerca de 6:1 a 8:1, de ou de cerca de 8:1 a 10:1 , de ou de cerca de 1:1 a 1:10, de ou de cerca de 1:1 a 1: 8, de ou de cerca de 1:1 a 1: 6, de ou de cerca de 1:1 a 1: 4, de ou de cerca de 1: 2 a 1: 3. Em alguns exemplos específicos, a proporção de esferas para células é de ou de cerca de 3:1. Em alguns casos, a proporção de esferas para células é de aproximadamente 1:3.

[0048] Os métodos geralmente incluem ainda etapas para a manipulação genética da composição estimulada de células T. A manipulação genética pode ser realizada ou iniciada na composição estimulada, após ou a qualquer momento após o início da incubação inicial e/ou simultaneamente com a incubação. Em algumas modalidades, as células são incubadas com ácidos nucleicos que codificam essas moléculas geneticamente modificadas, de modo que os ácidos nucleicos são introduzidos e as moléculas geneticamente modificadas expressas nas células da composição, gerando assim uma composição de saída. Entre as moléculas geneticamente modificadas estão proteínas, tais como receptores de antígeno geneticamente manipulados, incluindo receptores de antígeno quiméricos (CARs) e outros receptores recombinantes, tais como receptores quiméricos com porções extracelulares de ligação ao ligante e porções de sinalização intracelular.

[0049] Também são fornecidas composições iniciadoras de cultura, composições estimuladas e composições de saída, usadas ou geradas pelos métodos descritos. Também são fornecidos métodos que envolvem a administração de tais composições e células a indivíduos necessitados, incluindo pacientes com câncer. São ainda fornecidos kits, incluindo as composições e/ou células produzidas por qualquer um dos métodos aqui descritos.

[0050] Os métodos podem ser vantajosos e produzem um produto mais desejável. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos permitem um processo de fabricação mais consistente. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos produzem células que resultam em transdução e/ou expansão mais uniforme nas etapas posteriores da manipulação das células. Em algumas modalidades, a transdução e/ou expansão mais uniformes podem levar a um produto de célula T que é mais previsível ao longo do processo de fabricação. Em alguns casos, o produto de célula T pode ser dosado de forma mais consistente para administração a um indivíduo. Tais características podem, em alguns contextos, reduzir ou impedir a potencial toxicidade e/ou resultados e sintomas associados em indivíduos após terapia celular adotiva.

[0051] Todas as publicações, incluindo documentos de patentes, artigos científicos e bancos de dados, referidos neste pedido, estão incorporados por referência em sua totalidade para todos os fins, na mesma extensão como se cada publicação individual fosse incorporada individualmente por referência. Se uma definição estabelecida aqui for contrária ou inconsistente com uma definição estabelecida nas patentes, pedidos, pedidos publicados e outras publicações que estão aqui incorporadas por referência, a definição aqui estabelecida prevalecerá sobre a definição que está aqui incorporada por referência.

[0052] Os títulos das seções usados aqui têm propósitos de organização apenas e não devem ser considerados como limitantes do assunto em questão descrito. Breve Descrição das Figuras

[0053] As FIGs. 1A-1D ilustram os resultados de composições de células T CAR+ geradas a partir de processos expandidos e não expandidos que envolvem um reagente estimulador à base de esferas (Esfera), um reagente estimulante à base de esferas e incubação em meios basais (Esfera-Meio Basal) ou um reagente estimulador oligomérico (Oligômero). FIG. 1A representa o percentual de células T CD4+ e CD8+ positivas para CCR7 e CD27. FIG. 1B representa o percentual de células CCR7+ CD27+ para células T CD4+ CAR+. FIG. 1C representa o percentual de células CCR7+ CD27+ para células T CD8+ CAR+. FIG. 1D exibe o percentual de células CCR7+ CD27+ geradas a partir de um doador representativo de um processo expandido em vários dias durante o processo de fabricação, incluindo ativação no dia 1 (d1 AMAT), transdução no dia 2 (d2 XMAT) e em várias temporizações após início do cultivo (d4 INOC+2, d6 INOC+4, d7 INOC+5).

[0054] As FIGs. 2A-2D mostram as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier para indivíduos aos quais foram administradas composições de células T CAR+, divididas em grupos aos quais foram administradas composições que contêm um percentual de células T CCR7+ CD27+ CAR+ entre células T CD4+ CAR+ (FIG. 2A para sobrevida livre de progressão, FIG. 2C para duração da resposta) e entre células T CD8+ CAR+ (FIG. 2B para sobrevida livre de progressão, FIG. 2D para duração da resposta) que está acima ou abaixo de um certo nível limiar.

[0055] FIG. 3 mostra a clonalidade das células T das composições de células T CD4+ e CD8+ isoladas antes da manipulação (CMAT) e das composições terapêuticas de células T CD4+ e CD8+ terapêuticas CAR+ após a manipulação (índice de Shannon aplicado). I. MÉTODO PARA A INCUBAÇÃO (POR EXEMPLO, ESTIMULAÇÃO)

DE CÉLULAS T

[0056] São aqui fornecidos métodos para incubar (por exemplo,

estimular) células no processo de preparação de células para terapia celular adotiva e composições e células produzidas pelos métodos. Em algumas modalidades, as células incluem tipicamente células T, que em algumas modalidades expressam receptores de antígeno geneticamente manipulados, tais como receptores de células T geneticamente manipulados ou recombinantes (TCRs) e receptores de antígeno não TCR funcionais, tais como receptores de antígeno quimérico (CARs).

[0057] Em algumas modalidades, é fornecido um método para incubar (por exemplo, estimular) células T, incluindo a incubação, sob condições estimulantes, de uma composição de entrada que contém uma população de células T que compreende células T semelhantes às células T naives e células T semelhantes às células T não naives, a dita composição de entrada que contém uma quantidade da cultura inicial das células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+, produzindo assim uma composição estimulada. Em alguns aspectos, as condições estimulantes induzem preferivelmente a expansão ou proliferação das células T semelhantes às células T naives em comparação com as células T semelhantes às células T não naives na composição estimulada. Em algumas modalidades, o método inclui ainda a introdução na composição celular estimulada de um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente manipulado, em que o método gera assim uma composição de saída que compreende células T que expressam o receptor recombinante geneticamente manipulado. Em alguns aspectos, a introdução é realizada durante pelo menos uma porção da incubação ou é realizada subsequentemente à incubação. Em algumas modalidades, as células da composição de entrada não foram e não são, antes da incubação, submetidas a uma etapa de seleção com base em um marcador endógeno de superfície de células T que diferencia entre células T semelhantes às células T naives e não naive.

[0058] Em algumas modalidades dos métodos fornecidos, a introdução de um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente manipulado é realizada antes, durante e/ou subsequente à introdução de um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente manipulado. Em algumas modalidades, o método inclui incubar a composição sob condições estimulantes antes da introdução de um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente manipulado. Em alguns casos, o método inclui incubar a composição sob condições estimulantes durante a introdução de um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente manipulado. Em algumas modalidades, o método inclui incubar a composição sob condições estimulantes subsequentes à introdução de um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente manipulado.

[0059] Em certas modalidades, a condição estimulante compreende uma superfície, tal como uma esfera magnética, que tem acoplado a ela um ou mais agentes que se ligam a uma porção da superfície celular. Em uma modalidade, a superfície tem acoplado a ela pelo menos anticorpos anti-CD3. Em outra modalidade, a superfície tem acoplado a ela anticorpos anti-CD3 e/ou anti-CD28. Em algumas modalidades, pelo menos uma porção substancial de pelo menos uma população de células T na composição de entrada é excluída logo após a incubação. Em uma modalidade, a proporção de células para esferas nas condições estimulantes é de cerca de 50:1 a cerca de 5:1. Em certas modalidades, a proporção é de cerca de 100:1 a cerca de 1:1. Em algumas modalidades, a proporção é de cerca de 1:1 a 1:50. Em certas modalidades, a proporção é de pelo menos cerca de 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1: 2, 1: 3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1: 8, 1:9 ou 1:10. Em uma modalidade particular, a razão é de cerca de 3:1. Em uma modalidade específica, a proporção é de cerca de 1:3.

[0060] Em algumas modalidades dos métodos aqui fornecidos, as condições de cultura induzem preferivelmente a proliferação, estimulação e/ou ativação de células T semelhantes às células T não naives em comparação com células T semelhantes às células T naives. Em algumas modalidades, os métodos de incubação (por exemplo, estimulante) geram uma composição de saída desejada composta por um número desejado de células derivadas de células T semelhantes às células T naives da composição de entrada. Em algumas modalidades de uso do método de estimulação células T aqui descritas, das células na composição de entrada, um percentual maior de células T semelhantes às células T naives, em comparação com as células T semelhantes às células T não naives, são induzida a proliferar e/ou são expandidas. Em alguns aspectos, a composição estimulada resultante dos métodos de estimulação descritos aqui contém menos de 10% de células derivadas de células T do tipo. Em alguns exemplos, a composição estimulada contém menos de 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% de células derivadas de células T não naives. Em algumas modalidades, um percentual maior de células T que eram do tipo naive na composição de entrada, em comparação com o percentual de células T que eram do tipo não naive na composição de entrada, estão se dividindo no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 após o início da dita incubação. Em alguns casos, as condições estimulantes do método para estimular células T induzem a morte celular em subpopulações particulares de células. Em exemplos particulares, as condições estimulantes do método induzem a ativação de células T semelhantes às células T não naives, induzindo assim a morte celular induzida pela ativação (AICD).

[0061] Em um aspecto, o método ativa preferivelmente células T não naives da composição de entrada, induzindo assim a morte celular de células T não naives da composição de entrada, eliminando assim as células T derivado de células do tipo não naive da composição de entrada a partir da composição estimulada. Ao mesmo tempo, as células desejadas que permanecem, por exemplo, aquelas que são derivadas das células T semelhantes às células T naives da composição de entrada, são ativadas, sobrevivem e estimuladas a se expandir, resultando em uma população de células ativadas a partir das quais pelo menos uma porção substancial de subpopulações indesejadas de células T foi eliminada. Além disso, as condições de incubação (por exemplo, estimulação) fornecidas pelos métodos aqui descritos restauram a policlonalidade para a população de células T em relação aos genes de TCR expressos, conforme indicado pela análise espectral ou outros métodos de quantificação da clonalidade. Em algumas modalidades, a assinatura das células na composição de saída derivada de células T semelhantes às células T naives da composição de entrada é indicada pela expressão de marcadores específicos. A. Composição de Entrada

[0062] Nos métodos fornecidos para incubar (por exemplo, estimular) as células T, o método inclui incubar, sob condições estimulantes, uma composição de entrada que compreende uma população de células T. A composição de entrada, em alguns aspectos, compreende uma população de células T tal como, por exemplo, células T semelhantes às células T naives e células T semelhantes às células T naives. Em algumas modalidades, a população de células T compreende células CD4+ e/ou CD8+. Em algumas modalidades, a composição de entrada compreende uma quantidade de células que inicia a cultura. Em alguns casos, a quantidade de células que inicia a cultura é baseada na quantidade de células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+ na composição de entrada.

Em alguns aspectos, subgrupos específicos de células T, tais como células T semelhantes às células T naives e/ou células T semelhantes às células T não naives, podem ser identificados usando marcadores ou assinaturas específicas. Em alguns exemplos específicos, a expressão de marcadores da superfície celular é usada para avaliar e/ou identificar subgrupos de células T. Em alguns aspectos, a clonalidade da composição de entrada pode ser caracterizada.

[0063] Em alguns aspectos, a composição das células que estão sendo incubadas e/ou manipuladas, tal como a composição de entrada, não foi e não está sujeita a seleção prévia de células T semelhantes às células T naives. Em algumas modalidades, o método não compreende seleção positiva ou negativa ou enriquecimento das células do tipo naive da composição de entrada. Em alguns aspectos, a composição de células que são estimuladas e/ou manipuladas, tal como a composição de entrada e/ou a composição estimulada, não foi e não está sujeita a essa seleção antes da incubação (por exemplo, estimulação). Em algumas modalidades, as células não foram e/ou não são, antes da incubação, submetidas a uma etapa de seleção com base no nível ou na presença de um marcador de superfície de célula T que diferencia entre células T semelhantes às células T naives e do tipo não naive, tal como CD27, CD28, CD45RA, CD45RO, CD56, CD62L, CD95, KLRG1 ou CCR7. Por exemplo, em alguns aspectos, as células na composição de entrada não foram submetidas a seleção com base na expressão ou com base na expressão da superfície de tal marcador, antes da incubação sob as condições estimulantes. Em alguns aspectos, as células na composição estimulada não são submetidas a seleção com base na expressão ou com base na expressão na superfície de tal marcador, antes da manipulação genética, por exemplo, incubação com o ácido nucleico. Em alguns aspectos, a incubação da composição de entrada é realizada sem seleção com base na expressão da superfície de um marcador para enriquecer para células T semelhantes às células T naives.

[0064] Em algumas modalidades, os métodos compreendem menos etapas de seleção em comparação com outros métodos, por exemplo, não envolvem a seleção de subgrupos de células T e, portanto, são mais simples e associados a vantagens de economia de custos e/ou recursos em comparação com métodos de seleção de múltiplas etapas. Em algumas modalidades, os métodos não incluem enriquecimento com base na expressão de marcadores característicos das células T de memória ou um subgrupo delas e/ou células T semelhantes às células T naives. Em alguns aspectos, a composição de células que está sendo incubada (por exemplo, estimulada), tal como a composição de entrada e/ou a composição estimulada, não foi e não está sujeita a tal seleção.

[0065] Em alguns exemplos, os métodos não compreendem a seleção positiva com base em um marcador que é característico de células T não naives ou que distingue subgrupos específicas de células T, tais como CD62L, CCR7, CD27, CD28, CD56, CD3, CD122, CD95, CD25, IL7-Rα e/ou CD 127. Em alguns exemplos, os métodos não compreendem seleção positiva ou enriquecimento com base na expressão de CD62L, CCR7, CD27, CD28, CD56, CD3, CD122, CD95, CD25, IL7-Rα e/ou CD127. Em algumas modalidades, os métodos não usam amostras ou composições que tenham sido enriquecidas ou selecionadas positivamente com base em tais marcadores ou para enriquecer subtipos específicos.

[0066] Em algumas modalidades, os métodos não compreendem etapas de seleção baseadas em afinidade projetadas para separar ou distinguir entre células T semelhantes às células T naives e não naive. Em alguns exemplos, os métodos não compreendem a seleção positiva com base em um marcador que é característico de células do tipo naive ou não naive, ou distingue uma da outra, tais como CD27, CD28, CD45RO, CD45RA, CD56, CCR7, CD95, KLRG1 e/ou CD62L. Em alguns exemplos, os métodos não compreendem seleção positiva ou enriquecimento com base na expressão de tais marcadores. Em algumas modalidades, os métodos não usam amostras ou composições que tenham sido enriquecidas ou selecionadas positivamente com base em tais marcadores ou para enriquecer tais subtipos. Células

[0067] Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos incluem uma ou mais etapas para preparar uma composição de entrada de células na qual está contida uma quantidade inicial de cultura de células T semelhantes às células T naives, tal como em conexão com um método que inclui uma ou mais etapas de estimulação, expansão, proliferação e/ou manipulação genética, por exemplo, transdução de células. As células geralmente são células eucarióticas, como células de mamíferos, e tipicamente são células humanas. A composição de entrada pode ser produzida ou gerada por vários métodos que envolvem o isolamento ou seleção de células a partir de uma amostra biológica. Em algumas modalidades, a composição de entrada contém células CD4+ e/ou CD8+ derivadas de uma amostra biológica, como obtidas ou derivadas de uma ou mais etapas de isolamento, seleção ou enriquecimento. Em alguns exemplos específicos, uma proporção das células CD4+ para CD8+ da cultura de entrada é ou é de cerca de 1:1, 1: 2, 2:1, 1:3 ou 3:1. Em algumas modalidades, a composição de entrada que contém células T CD4+ e/ou CD8+ isoladas contém uma mistura de células T semelhantes às células T naives e células T semelhantes às células T não naives.

[0068] Em algumas modalidades, as células da composição de entrada são derivadas do sangue, medula óssea, linfa ou órgãos linfoides, são células do sistema imunológico, como células da imunidade inata ou adaptativa, incluindo amostras que contém células mieloides ou linfoides, incluindo linfócitos, tipicamente células T. As células são tipicamente células primárias, tais como aquelas isoladas diretamente de um sujeito e/ou isoladas de um indivíduo e congeladas. Em algumas modalidades, as células incluem um ou mais subgrupos de células T ou outros tipos de células, como populações inteiras de células T, células CD4+, células CD8+ e suas subpopulações, como aquelas definidas por função, estado de ativação, maturidade, potencial de diferenciação, capacidade de expansão, recirculação, localização e/ou persistência, especificidade de antígeno, tipo de receptor de antígeno, presença em um órgão ou compartimento específico, perfil de secreção de marcador ou citocina e/ou grau de diferenciação. Com referência ao indivíduo a ser tratado, as células podem ser alogênicas e/ou autólogas. Entre os métodos incluem métodos prontos para uso. Em algumas modalidades, os métodos incluem isolar células do indivíduo, preparar, processar, cultivar e/ou manipular, conforme descrito aqui, e reintroduzi- las no mesmo paciente, antes ou depois da criopreservação.

[0069] Entre os subtipos e subpopulações de células T e/ou células T CD4+ e/ou CD8+, estão as células T naives (TN), as células T efetoras (TEFF), as células T de memória e seus subtipos, tais como células T tronco de memória (TSCM), T de memória central T (TCM), T efetora de memória (TEM) ou células T efetoras de memória terminalmente diferenciadas, linfócitos que infiltram tumores (TIL), células T imaturas, células T maduras, células T auxiliares, células T citotóxicas, células T invariantes associadas à mucosa, células T reguladoras adaptativas que ocorrem naturalmente (Treg), células T auxiliares, tais como células TH1, células TH2, células TH3, células TH17, células TH17, células TH9, células TH22, T auxiliar folicular , células T alfa/beta e células T delta/gama. Em algumas modalidades, a célula é uma célula T reguladora (Treg). Em algumas modalidades, a célula compreende ainda um FOXP3 recombinante ou uma variante do mesmo.

[0070] Em algumas modalidades, a preparação das células manipuladas inclui uma ou mais etapas de cultura e/ou preparação. As células para manipulação podem ser isoladas de uma amostra, tal como uma amostra biológica, por exemplo, aquela obtida ou derivada de um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo do qual a célula é isolada é aquele que tem a doença ou condição ou precisa de uma terapia celular ou no qual a terapia celular será administrada. O indivíduo em algumas modalidades é um humano que precisa de uma intervenção terapêutica específica, tal como a terapia celular adotiva para a qual as células estão sendo isoladas, processadas e/ou manipuladas.

[0071] Consequentemente, as células em algumas modalidades são células primárias, por exemplo, células humanas primárias. As amostras incluem tecido, fluido e outras amostras colhidas diretamente do indivíduo, assim como amostras resultantes de uma ou mais etapas de processamento, tais como separação, centrifugação, manipulação genética (por exemplo, transdução com vetor viral), lavagem e/ou incubação. A amostra biológica pode ser uma amostra obtida diretamente de uma fonte biológica ou de uma amostra que é processada. As amostras biológicas incluem, entre outras, fluidos corporais, tais como sangue, plasma, soro, líquido cefalorraquidiano, líquido sinovial, urina e suor, amostras de tecidos e órgãos, incluindo amostras processadas derivadas destas.

[0072] Em alguns aspectos, a amostra da qual as células são derivadas ou isoladas é sangue ou uma amostra derivada de sangue, ou é ou é derivada de um produto de aférese ou leucaférese. Exemplos de amostras incluem sangue total, células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), leucócitos, medula óssea, timo, biópsia de tecido, tumor, leucemia, linfoma, linfonodo, tecido linfoide associado ao intestino, tecido linfoide associado à mucosa, baço, outros tecidos linfoides, fígado pulmão, estômago, intestino, cólon, rim, pâncreas, mama, osso, próstata, colo do útero, testículos, ovários, amígdalas ou outro órgão e/ou células deles derivadas. As amostras incluem, no contexto da terapia celular, por exemplo, terapia celular adotiva, amostras de fontes autólogas e alogênicas.

[0073] Em algumas modalidades, as células são derivadas de linhagens celulares, por exemplo, linhagens de células T. As células em algumas modalidades são obtidas a partir de uma fonte xenogênica, por exemplo, de camundongo, rato, primata não humano ou porco.

[0074] Em algumas modalidades, o isolamento das células inclui uma ou mais etapas de preparação e/ou separação baseada em células sem afinidade. Em alguns exemplos, as células são lavadas, centrifugadas e/ou incubadas na presença de um ou mais reagentes, por exemplo, para remover componentes indesejados, enriquecer os componentes desejados, lisar ou remover células sensíveis a reagentes particulares. Em alguns exemplos, as células são separadas com base em uma ou mais propriedades, tais como densidade, propriedades aderentes, tamanho, sensibilidade e/ou resistência a componentes específicos.

[0075] Em algumas modalidades, as células do sangue circulante de um indivíduo são obtidas, por exemplo, por exemplo, por aférese ou leucaférese. As amostras, em alguns aspectos, contêm linfócitos, incluindo células T, monócitos, granulócitos, células B, outras células sanguíneas brancas nucleadas, células sanguíneas vermelhas e/ou plaquetas e em alguns aspectos contêm células diferentes das células sanguíneas vermelhas e plaquetas.

[0076] Em algumas modalidades, as células sanguíneas coletadas do indivíduo são lavadas, por exemplo, para remover a fração plasmática e colocar as células em um tampão ou meio apropriado para as etapas de processamento subsequentes. Em algumas modalidades, as células são lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Em algumas modalidades, a solução de lavagem carece de cálcio e/ou magnésio e/ou vários ou todos os cátions divalentes. Em alguns aspectos, uma etapa de lavagem é realizada por uma centrífuga semi-automática "flow-through" (por exemplo, o processador de células Cobe 2991, Baxter) de acordo com as instruções do fabricante. Em alguns aspectos, uma etapa de lavagem é realizada por filtração de fluxo tangencial (TFF) de acordo com as instruções do fabricante. Em algumas modalidades, as células são ressuspensas em uma variedade de tampões biocompatíveis após a lavagem, tais como, por exemplo, PBS sem de Ca++/Mg++. Em certas modalidades, os componentes de uma amostra de células sanguíneas são removidos e as células ressuspensas diretamente nos meios de cultura.

[0077] Em algumas modalidades, os métodos incluem métodos de separação de células com base na densidade, tal como a preparação de células sanguíneas brancas a partir de sangue periférico, pela análise das células sanguíneas vermelhas e centrifugando através de um gradiente de Percoll ou Ficoll.

[0078] Em algumas modalidades, os métodos de isolamento incluem a separação de diferentes tipos de células com base na expressão ou presença na célula de uma ou mais moléculas específicas, tais como marcadores de superfície, por exemplo, proteínas de superfície, marcadores intracelulares ou ácido nucleico. Em algumas modalidades, qualquer método conhecido para separação com base em tais marcadores pode ser usado. Em algumas modalidades, a separação é uma separação baseada em afinidade ou imunoafinidade. Por exemplo, o isolamento em alguns aspectos inclui a separação de células e populações de células com base na expressão ou nível de expressão das células de um ou mais marcadores,

tipicamente marcadores de superfície celular, por exemplo, por incubação com um anticorpo ou parceiro de ligação que se liga especificamente a tais marcadores, seguida geralmente por etapas de lavagem e separação de células que se ligaram ao anticorpo ou parceiro de ligação, daquelas células que não se ligaram ao anticorpo ou parceiro de ligação.

[0079] Tais etapas de separação podem ser baseadas na seleção positiva, na qual as células que se ligaram aos reagentes são retidas para uso posterior e/ou na seleção negativa, na qual as células que não se ligam ao anticorpo ou parceiro de ligação são retidas. Em alguns exemplos, ambas as frações são retidas para uso posterior. Em alguns aspectos, a seleção negativa pode ser particularmente útil quando não houver anticorpo disponível que identifique especificamente um tipo de célula em uma população heterogênea, de modo que a separação seja melhor realizada com base em marcadores expressos por células diferentes da população desejada.

[0080] A separação não precisa resultar em 100% de enriquecimento ou remoção de uma determinada população de células ou células que expressam um determinado marcador. Por exemplo, seleção positiva de ou enriquecimento para células de um tipo específico, como aquelas que expressam um marcador, se referem ao aumento do número ou percentual dessas células, mas não precisa resultar em uma ausência completa de células que não expressam o marcador. Da mesma forma, seleção negativa, remoção ou depleção de células de um tipo específico, como aquelas que expressam um marcador, se refere à diminuição do número ou percentual dessas células, mas não precisa resultar na remoção completa de todas essas células.

[0081] Em alguns exemplos, várias rodadas de etapas de separação são realizadas, onde a fração selecionada positivamente ou negativamente de uma etapa é submetida a outra etapa de separação, tal como uma seleção positiva ou negativa subsequente. Em alguns exemplos, uma única etapa de separação pode depletar as células que expressam vários marcadores simultaneamente, tal como pela incubação de células com uma pluralidade de anticorpos ou parceiros de ligação, cada um específico para um marcador direcionado para seleção negativa. Da mesma forma, vários tipos de células podem ser simultaneamente selecionados positivamente através da incubação de células com uma pluralidade de anticorpos ou parceiros de ligação expressos nos vários tipos de células.

[0082] Por exemplo, em alguns aspectos, subpopulações específicas de células T, tais como células positivas ou que expressam altos níveis de um ou mais marcadores de superfície, por exemplo, células T CD28+, CD62L+, CCR7+, CD27+, CD127+, CD4+, CD8+, CD56+, CD45RA+, CD95hi e/ou CD45RO+ são isoladas por técnicas de seleção positiva ou negativa.

[0083] Por exemplo, as células T CD3+, CD28+ podem ser selecionadas positivamente usando esferas magnéticas conjugadas com anti-CD3/anti-CD28 (por exemplo, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T Cell Expander).

[0084] Em algumas modalidades, o isolamento é realizado por enriquecimento de uma população celular específica por seleção positiva, ou depleção de uma população celular específica, por seleção negativa. Em algumas modalidades, a seleção positiva ou negativa é realizada pela incubação das células com um ou mais anticorpos ou outro agente de ligação que se ligam especificamente a um ou mais marcadores de superfície expressos ou expressos (marcador+) em um nível relativamente mais alto (marcadorhigh) nas células selecionadas positivamente ou negativamente, respectivamente.

[0085] Em algumas modalidades, as células T são separadas de uma amostra de PBMC por seleção negativa de marcadores expressos em células não T, tais como células B, monócitos ou outras células sanguíneas brancas, tais como CD14. Em alguns aspectos, uma etapa de seleção de CD4+ ou CD8+ é usada para separar células T CD4+ auxiliares células T CD8+ citotóxicas. Tais populações de CD4+ e CD8+ podem ser ainda classificadas em subpopulações por seleção positiva ou negativa para marcadores expressos ou expressos em um grau relativamente mais alto em uma ou mais subpopulações de células T naives, de memória e/ou efetoras.

[0086] Em algumas modalidades, as células CD8+ são ainda enriquecidas com ou depletadas de células naives, de memória central, de memória efetora e/ou de células-tronco de memória central, tal como por seleção positiva ou negativa com base em antígenos de superfície associados com à respectiva subpopulação. Em algumas modalidades, o enriquecimento das células T de memória central (T CM) é realizado para aumentar a eficácia, tal como para melhorar a sobrevivência a longo prazo, a expansão e/ou o enxerto após a administração, o que em alguns aspectos é particularmente robusto nessas subpopulações. Veja Terakura et al. ( 2012) Blood.1: 72-82; Wang et al. ( 2012) J Immunother. 35(9):689-701. Em algumas modalidades, a combinação de células T CD8+ enriquecidas com TCM e células T CD4+ aperfeiçoa ainda mais a eficácia.

[0087] Nas modalidades, as células T de memória estão presentes em ambos os subgrupos CD62L+ e CD62L- de linfócitos CD8+ do sangue periférico. PBMC pode ser enriquecida por ou depletada das frações CD8+CD62L- e/ou CD8+CD62L+, tal como pelo uso de anticorpos anti- CD8 e anti-CD62L.

[0088] Em algumas modalidades, o enriquecimento das células T de memória central (TCM) é baseado na expressão positiva ou alta na superfície de CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3 e/ou CD127; em alguns aspectos, ele é baseado na seleção negativa para células que expressam ou que expressam altamente CD45RA e/ou granzima B. Em alguns aspectos, o isolamento de uma população de CD8+ enriquecida com células TCM é realizada pela depleção de células que expressam CD4, CD14, CD45RA e seleção positiva ou enriquecimento com células que expressam CD62L. Em um aspecto, o enriquecimento das células T de memória central (TCM) é realizado começando com uma fração negativa de células selecionadas com base na expressão de CD4, que é submetida a uma seleção negativa com base na expressão de CD14 e CD45RA e uma seleção positiva baseada em CD62L. Tais seleções em alguns aspectos são realizadas simultaneamente e em outros aspectos são realizadas sequencialmente, em qualquer ordem. Em alguns aspectos, a mesma etapa de seleção baseada na expressão de CD4 usada na preparação da população ou subpopulação de células CD8+ também é usada para gerar a população ou subpopulação de células CD4+, tal que as frações positivas e negativas da separação baseada em CD4 são retidas e usadas nas etapas subsequentes dos métodos, seguindo opcionalmente uma ou mais etapas de seleção positiva ou negativa.

[0089] Em um exemplo particular, uma amostra de PBMCs ou outra amostra de células sanguíneas brancas é submetida à seleção de células CD4+, onde ambas as frações positiva e negativa são retidas. A fração negativa é então submetida à seleção negativa com base na expressão de CD14 e CD45RA ou ROR1, e seleção positiva com base em um marcador característico das células T de memória central, tal como CD62L ou CCR7, onde as seleções positiva e negativa são realizadas qualquer em ordem.

[0090] As células T CD4+ auxiliares são classificadas em células naives, de memória central e efetoras, pela identificação das populações de células que possuem antígenos de superfície celular. Os linfócitos CD4+ podem ser obtidos por métodos padronizados. Em algumas modalidades, os linfócitos T CD4+ naives são células T CD45RO-, CD45RA+, CD62L- e CD4+. Em algumas modalidades, as células CD4+ de memória central são CD62L+ e CD45RO+. Em algumas modalidades, as células CD4+ efetoras são CD62L- e CD45RO-.

[0091] Em um exemplo, para enriquecer as células CD4+ pela seleção negativa, um coquetel de anticorpos monoclonais normalmente inclui anticorpos para CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR e CD8. Em algumas modalidades, o anticorpo ou parceiro de ligação está ligado a um suporte sólido ou matriz, tal como uma esfera magnética ou esfera paramagnética, para permitir a separação de células para seleção positiva e/ou negativa. Por exemplo, em algumas modalidades, as células e as populações de células são separadas ou isoladas usando técnicas de separação imuno-magnética (ou afinidade magnética) (revisadas em Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In vitro and In vivo, p 17-25 Editado por: S. A. Brooks e U. Schumacher © Humana Press Inc., Totowa, NJ).

[0092] Em alguns aspectos, a amostra ou composição de células a serem separadas é incubada com material pequeno, magnetizável ou responsivo magneticamente, tal como partículas ou micropartículas responsivas magneticamente, tal como esferas paramagnéticas (por exemplo, como esferas Dynalbeads ou MACS). O material responsivo magneticamente, por exemplo, partícula, geralmente é diretamente ou indiretamente ligado a um parceiro de ligação, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a uma molécula, por exemplo, marcador de superfície, presente na célula, células ou população de células que se desejar separar, por exemplo, que é desejado selecionar negativa ou positivamente.

[0093] Em algumas modalidades, a partícula ou esfera magnética compreende um material responsivo magneticamente ligado a um membro de ligação específico, tal como um anticorpo ou outro parceiro de ligação. Em alguns aspectos, materiais magneticamente responsivos usados em métodos de separação magnética podem ser usados. Partículas magnéticas adequadas incluem aquelas descritas em Molday, Pat. U.S. No. 4.452.773, e no Pedido de Patente Europeu EP 452342 B, que estão aqui incorporados por referência. Partículas de tamanho coloidal, como as descritas em Owen, Pat. U.S. No. 4.795.698, e Liberti et al., Pat. U.S. No. 5.200.084 são outros exemplos.

[0094] A incubação geralmente é realizada sob condições nas quais os anticorpos ou parceiros de ligação ou moléculas, tais como anticorpos secundários ou outros reagentes, que se ligam especificamente a tais anticorpos ou parceiros de ligação, que estão ligados à partícula ou esfera magnética, ligam-se especificamente às moléculas da superfície celular, se presentes nas células da amostra.

[0095] Em alguns aspectos, a amostra é colocada em um campo magnético e as células que possuem partículas magneticamente responsivas ou magnetizáveis ligadas a elas serão atraídas para o ímã e separadas das células não marcadas. Para seleção positiva, as células atraídas pelo ímã são retidas; para seleção negativa, as células que não são atraídas (células não marcadas) são retidas. Em alguns aspectos, uma combinação de seleção positiva e negativa é realizada durante a mesma etapa de seleção, onde as frações positivas e negativas são retidas e posteriormente processadas ou submetidas a etapas de separação adicionais.

[0096] Em certas modalidades, as partículas magneticamente responsivas são revestidas em anticorpos primários ou outros parceiros de ligação, anticorpos secundários, lectinas, enzimas ou estreptavidina. Em certas modalidades, as partículas magnéticas são acopladas às células através de um revestimento de anticorpos primários específicos para um ou mais marcadores. Em certas modalidades, as células, ao invés das esferas, são marcadas com um anticorpo primário ou parceiro de ligação e, em seguida, são adicionadas partículas magnéticas revestidas com anticorpo secundário específico do tipo de célula ou outro parceiro de ligação (por exemplo, estreptavidina). Em certas modalidades, partículas magnéticas revestidas com estreptavidina são usadas em conjunto com anticorpos primários ou secundários biotinilados.

[0097] Em algumas modalidades, as partículas magneticamente responsivas são deixadas acopladas às células que são subsequentemente incubadas, cultivadas e/ou manipuladas; em alguns aspectos, as partículas são deixadas acopladas às células para administração a um paciente. Em algumas modalidades, as partículas magnetizáveis ou magneticamente responsivas são removidas das células. Os métodos para remover partículas magnetizáveis das células podem incluir, por exemplo, o uso de anticorpos não marcados competitivos, partículas magnetizáveis ou anticorpos conjugados com ligantes cliváveis, etc. Em algumas modalidades, as partículas magnetizáveis são biodegradáveis.

[0098] Em algumas modalidades, a seleção baseada em afinidade se faz através da classificação celular ativada magneticamente (MACS) (Miltenyi Biotec, Auburn, CA). Os sistemas de Classificação Magnética de Células Ativadas (MACS) são capazes de seleção de alta pureza de células que possuem partículas magnetizadas ligadas a elas. Em certas modalidades, MACS opera em um modo em que as espécies não alvo e alvo são sequencialmente eluídas após a aplicação do campo magnético externo. Ou seja, as células ligadas às partículas magnetizadas são mantidas no lugar enquanto as espécies não acopladas são eluídas. Então, após a conclusão desta primeira etapa de eluição, as espécies que foram capturadas no campo magnético e impedidas de serem eluídas são liberadas de alguma maneira, de forma que possam ser eluídas e recuperadas. Em certos aspectos, as células não alvo são marcadas e depletadas da população heterogênea de células.

[0099] Em certas modalidades, o isolamento ou separação é realizado usando um sistema, dispositivo ou aparelho que realiza uma ou mais das etapas de isolamento, preparação celular, separação, processamento, incubação, cultura e/ou formulação dos métodos. Em alguns aspectos, o sistema é usado para executar cada uma dessas etapas em um ambiente fechado ou estéril, por exemplo, para minimizar erros, manipulação do usuário e/ou contaminação. Em um exemplo, o sistema é um sistema conforme descrito na Publicação Internacional PCT Nº WO2009/072003 ou US 20110003380 Al.

[00100] Em algumas modalidades, o sistema ou aparelho executa uma ou mais, por exemplo, todas as etapas de isolamento, processamento, manipulação e formulação em um sistema integrado ou independente, e/ou de maneira automatizada ou programável. Em alguns aspectos, o sistema ou aparelho inclui um computador e/ou programa de computador em comunicação com o sistema ou aparelho, o que permite ao usuário programar, controlar, avaliar o resultado e/ou ajustar vários aspectos do processamento, isolamento, etapas de manipulação e formulação.

[00101] Em alguns aspectos, a separação e/ou outras etapas são realizadas usando o sistema CliniMACS (Miltenyi Biotec), por exemplo, para separação automatizada de células em nível de escala clínica em um sistema fechado e estéril. Os componentes podem incluir um microcomputador integrado, unidade de separação magnética, bomba peristáltica e várias válvulas de manga flexível. O computador integrado em alguns aspectos controla todos os componentes do instrumento e direciona o sistema para executar procedimentos repetidos em uma sequência padronizada. A unidade de separação magnética em alguns aspectos inclui um ímã permanente móvel e um suporte para a coluna de seleção. A bomba peristáltica controla a taxa de fluxo através do conjunto de tubos e, juntamente com as válvulas de manga flexível, garante o fluxo controlado de tampão através do sistema e a suspensão contínua das células.

[00102] O sistema CliniMACS, em alguns aspectos, usa partículas magnetizáveis acopladas a anticorpos que são fornecidas em uma solução estéril e não pirogênica. Em algumas modalidades, após a marcação das células com partículas magnéticas, as células são lavadas para remover o excesso de partículas. Uma bolsa de preparação de células é então conectada ao conjunto de tubos, que por sua vez é conectado a uma bolsa contendo tampão e uma bolsa de coleta de células. O conjunto de tubos consiste em tubos estéreis pré- montados, incluindo uma pré-coluna e uma coluna de separação, e são apenas para uso único. Após o início do programa de separação, o sistema aplica automaticamente a amostra de células na coluna de separação. As células marcadas são retidas na coluna, enquanto as células não marcadas são removidas por uma série de etapas de lavagem. Em algumas modalidades, as populações de células para uso com os métodos aqui descritos não são marcadas e não são retidas na coluna. Em algumas modalidades, as populações de células para uso com os métodos aqui descritos são marcadas e retidas na coluna. Em algumas modalidades, as populações de células para uso com os métodos aqui descritos são eluídas da coluna após a remoção do campo magnético e são coletadas dentro da bolsa de coleta de células.

[00103] Em certas modalidades, a separação e/ou outras etapas são realizadas usando o sistema CliniMACS Prodigy (Miltenyi Biotec). O sistema CliniMACS Prodigy, em alguns aspectos, é equipado com uma unidade de processamento celular que permite a lavagem e o fracionamento automatizados de células por centrifugação. O sistema CliniMACS Prodigy também pode incluir uma câmera integrada e um programa de reconhecimento de imagem que determina o ponto final ótimo de fracionamento da célula pelo discernimento das camadas macroscópicas do produto da célula de origem. Por exemplo, o sangue periférico pode ser automaticamente separado em camadas de eritrócitos, leucócitos e plasma. O sistema CliniMACS Prodigy também pode incluir uma câmara de cultura celular integrada que realiza protocolos de cultura de células tais como, por exemplo, diferenciação e expansão celular, carregamento de antígeno e cultura celular de longo prazo. As portas de entrada podem permitir a remoção estéril e a reposição de meio e as células podem ser monitoradas usando um microscópio integrado. Veja, por exemplo, Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. ( 2012) Blood.1: 72-82, e Wang et al. ( 2012) J Immunother. 35(9):689-701.

[00104] Em algumas modalidades, uma população de células aqui descrita é coletada e enriquecida (ou depletada) por citometria de fluxo, na qual as células coradas para vários marcadores de superfície celular são transportadas em uma corrente fluidizada. Em algumas modalidades, uma população de células aqui descrita é coletada e enriquecida (ou depletada) por meio de classificação em escala preparativa (FACS). Em certas modalidades, uma população de células aqui descrita é coletada e enriquecida (ou depletada) pelo uso de chips de sistemas microeletromecânicos (MEMS) em combinação com um sistema de detecção baseado em FACS (ver, por exemplo, WO 2010/033140, Cho et al. (2010) Lab Chip 10:1567-1573; e Godin et al. ( 2008) J. Biophoton. 1(5):355— 376. Em ambos os casos, as células podem ser marcadas com vários marcadores, permitindo o isolamento de subgrupos de células T bem definidos com alta pureza.

[00105] Em algumas modalidades, os anticorpos ou parceiros de ligação são marcados com um ou mais marcadores detectáveis, para facilitar a separação para seleção positiva e/ou negativa. Por exemplo, a separação pode ser baseada na ligação a anticorpos marcados com fluorescência. Em alguns exemplos, a separação de células com base na ligação de anticorpos ou outros parceiros de ligação específicos para um ou mais marcadores de superfície celular é realizada em uma corrente fluídica, como por classificação celular ativada por fluorescência (FACS), incluindo escala preparativa (FACS) e /ou chips de sistemas microeletromecânicos (MEMS), por exemplo, em combinação com um sistema de detecção citométrica de fluxo. Tais métodos permitem a seleção positiva e negativa com base em vários marcadores simultaneamente.

[00106] Em algumas modalidades, os métodos de preparação incluem etapas de congelamento, por exemplo, criopreservação, das células, antes ou depois do isolamento, incubação e/ou manipulação. Em algumas modalidades, a etapa de congelamento e descongelamento subsequente remove granulócitos e, até certo ponto, monócitos na população celular. Em algumas modalidades, as células são suspensas em uma solução de congelamento, por exemplo, após uma etapa de lavagem para remover o plasma e as plaquetas. Qualquer uma de uma variedade de soluções e parâmetros de congelamento conhecidos em alguns aspectos pode ser usada. Um exemplo envolve o uso de PBS contendo DMSO 20% e albumina sérica humana 8% (HSA) ou outro meio de congelamento celular adequado. Este é então diluído 1:1 com meio, de modo que a concentração final de DMSO e HSA seja 10% e 4%, respectivamente. As células são então congeladas a -80°C a uma taxa de 1° por minuto e armazenadas na fase de vapor de um tanque de armazenamento de nitrogênio líquido. a. Células T semelhantes às células T naives

[00107] Em algumas modalidades, o método compreende incubar uma composição de entrada que compreende células T semelhantes às células T naives ou uma certa quantidade limite de células T semelhantes às células T naives. Um aspecto dos presentes métodos fornece uma composição de entrada que foi avaliada para subpopulações de células com base na expressão de uma variedade de marcadores, como CD27, CD28, CD56, CD62L, CD95, KLRG1, CD45RA ou CD45RO, citocinas (por exemplo, IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10), receptores de citocinas (por exemplo, CD25), perforina, moléculas de adesão (por exemplo, VLA-1, VLA-2, VLA-4, LPAM-1, LFA-1 ) e/ou moléculas de retorno (por exemplo, L-Selectina), antes da incubação (por exemplo, estimulantes). Para identificar células T semelhantes às células T naives, em algumas modalidades, várias assinaturas de células T semelhantes às células T naives podem ser utilizadas. Em algumas modalidades, a expressão de marcadores particulares de células T semelhantes às células T naives pode ser avaliada. Por exemplo, em alguns casos, as células T semelhantes às células T naives têm a superfície positiva para um marcador, incluindo marcadores de ativação de células T, selecionados do grupo que consiste em CD27, CD28, CD45RA, CD62L e CCR7. Em alguns aspectos, as células T semelhantes às células T naives têm superfície negativa para CD56 e/ou CD45RO. Em alguns aspectos, as células T semelhantes às células T naives têm superfície negativa para CD45RO e superfície celular positiva para CD27, CD45RA e CCR7. Em alguns casos, as células T semelhantes às células T naives são negativas para a expressão intracelular de uma citocina tal como IL-2, IFN-γ, IL-4 e/ou IL-10. Em alguns exemplos adicionais, as células T semelhantes às células T naives são negativas para a expressão dos marcadores CD25 e/ou perforina. Em alguns casos, as células T semelhantes às células T naives são CD95lo.

[00108] Para avaliar a expressão dos marcadores de células T semelhantes às células T naives, o método em algumas modalidades inclui a detecção dos marcadores através da realização de um ensaio in vitro. Em alguns exemplos, o ensaio in vitro é um imunoensaio, um ensaio baseado em aptâmero, um ensaio histológico ou citológico ou um ensaio de nível de expressão de mRNA. Em alguns casos, o ensaio in vitro usado pode ser um ensaio imunossorbente ligado a enzima (ELISA), immunoblotting, imunofenotipagem, imunoprecipitação, radioimunoensaio (RIA), imunocoloração, ensaio por citometria de fluxo, ressonância de plasma de superfície (SPR), ensaio por quimioluminescência, imunoensaio por fluxo lateral, ensaio de inibição ou ensaio de avidez. Em algumas modalidades, a expressão de marcadores de células T semelhantes às células T naives é determinada por RNA-seq.

[00109] As células T semelhantes às células T naives da composição de entrada também podem ser avaliadas pela clonalidade das células T. Em algumas modalidades, avaliar a clonalidade da população de células T é uma avaliação da diversidade clonal da população de células T. Em algumas modalidades, as células T semelhantes às células T naives são policlonais ou multiclonais. A policlonalidade da dita composição de entrada das células T é medida pela amplitude da resposta da população a um determinado antígeno. Em alguns aspectos, a composição de entrada pode ser avaliada medindo o número de diferentes epítopos reconhecidos por células específicas para o antígeno. Isto pode ser realizado utilizando técnicas padronizadas para gerar e clonar células T específicas para o antígeno in vitro. Em algumas modalidades, as células T semelhantes às células T naives são policlonais (ou multiclonais) com nenhuma população clonotípica única predominando na população de células T semelhantes às células T naives.

[00110] No contexto de uma população de células T, tal como da composição de entrada, em alguns aspectos, a assinatura da policlonalidade se refere a uma população de células T que possui especificidade múltipla e ampla de antígeno. Em algumas modalidades, a policlonalidade se refere a uma população de células T que exibe alta diversidade no repertório de TCR. Em alguns casos, a diversidade do repertório de TCR é devida a eventos de recombinação V(D)J que, em alguns aspectos, são desencadeados por eventos de seleção de autoantígenos e antígenos estranhos. Em algumas modalidades, uma população de células T que é diversa ou policlonal é uma população de células T na qual a análise indica a presença de uma pluralidade de transcritos de TCR variados ou diferentes ou produtos presentes na população. Em algumas modalidades, uma população de células T que exibe clonalidade alta ou relativamente alta é uma população de células T na qual o repertório de TCR é menos diversificado. Em algumas modalidades, as células T são oligoclonais se a análise indicar a presença de vários, tal como dois ou três, transcritos ou produtos de TCR em uma população de células T. Em algumas modalidades, as células T são monoclonais se a análise indicar a presença de um único transcrito ou produto de TCR em uma população de células T.

[00111] A clonalidade das células na composição de entrada, tal como as células T semelhantes às células T naives, é, em alguns exemplos, determinada pelo sequenciamento clonal, opcionalmente o sequenciamento da próxima geração ou análise espectral. Em alguns aspectos, métodos de sequenciamento de próxima geração podem ser empregados, usando DNA genômico ou cDNA de células T, para avaliar o repertório de TCR, incluindo sequências que codificam a região 3 de determinação de complementaridade (CDR3). Em algumas modalidades, o sequenciamento do transcriptoma completo por RNA- seq pode ser empregado. Em algumas modalidades, métodos de sequenciamento de célula única podem ser usados.

[00112] Em algumas modalidades, a policlonalidade pode ser avaliada ou determinada por análise espectral (uma medida do repertório da região hipervariável de cadeia Vβ, Vα, Vy ou Vδ). Uma população de células T é considerada policlonal quando o perfil espectral de Vβ para uma dada família de Vβ, Vα, Vy ou Vδ de TCR possui múltiplos picos, tipicamente 5 ou mais picos predominantes e na maioria dos casos com distribuição Gaussiana. A policlonalidade também pode ser definida pela geração e caracterização de clones específicos para o antígeno para um antígeno de interesse.

[00113] Em algumas modalidades, os métodos para avaliar a clonalidade podem incluir várias características dos métodos, conforme descrito nas Publicações Internacionais Nos. WO2012/048341, WO2014/ 144495, WO2017/053902, WO2016044227, WO2016176322 e WO2012048340 cada uma incorporada por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, tais métodos podem ser utilizados para obter informações de sequência sobre um polinucleotídeo alvo de interesse dentro de uma célula, tal como um TCR. Os genes alvo podem ser obtidos a partir do DNA genômico ou mRNA de uma célula a partir de uma amostra ou população de células. A amostra ou população de células pode incluir células imunes. Por exemplo, para moléculas alvo de TCR, os genes que codificam as cadeias de um TCR podem ser obtidos a partir de DNA genômico ou mRNA de células imunes ou células T. Em algumas modalidades, o material de partida é o RNA das células T composto por genes que codificam uma cadeia de um TCR.

[00114] Em algumas modalidades, o índice de Shannon é aplicado à clonalidade como um limiar para filtrar clones ("clonalidade ajustada por Shannon"), veja Chaara et al. ( 2018) Front Immunol 9:1038).

[00115] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos promovem ou resultam em um aumento na policlonalidade da população de células T ou em um subgrupo da composição de entrada. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos promovem ou resultam em um aumento na diversidade da população de células T ou em um subgrupo das mesmas da composição de entrada. Em algumas modalidades, as células T ou seu subgrupo de CD4 ou CD8, de uma composição incubada ou estimulada exibem clonalidade reduzida ou diminuída em comparação com as células T ou seu subgrupo de CD4 ou CD8, na composição de entrada antes da realização dos métodos. Em algumas modalidades, o grau de clonalidade está reduzido em mais do que ou mais do que cerca de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 ou mais.

[00116] Em um aspecto dos métodos fornecidos, uma população de células T na composição de entrada é ativada ou estimulada para induzir apoptose, como descrito abaixo na seção intitulada "Incubação de Células", eliminando assim a subpopulação da população de células. Ao mesmo tempo, as células desejadas que permanecem, por exemplo, as células do tipo naive, são ativadas e estimuladas a se expandir, resultando em uma população de células ativadas a partir da qual pelo menos uma porção substancial de subpopulações indesejadas de células T (como células T não naives) foram eliminadas. Como mencionado anteriormente, a estimulação/ativação, conforme descrito aqui, pode ser realizada em células remanescentes após a exposição de uma população de células diretamente às composições pro- apoptóticas. Além disso, a estimulação e ativação subsequentes fornecidas pela presente invenção restauram a policlonalidade para a população de células T em relação aos genes de TCR expressos, conforme indicado por métodos de análise espectral ou sequenciamento. Quantidade para iniciar a Cultura

[00117] Em aspectos dos métodos fornecidos, a composição de entrada inclui uma quantidade inicial de cultura para a ativação ou expansão preferencial de células T semelhantes às células T naives. Em alguns casos, a quantidade para a iniciação da cultura inclui ou é determinada ou é baseada no número de células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+ na composição. Assim, em aspectos do método fornecido, a incubação (por exemplo, estimulação) é realizada sem levar em consideração o número total ou o percentual de células T não naives, desde que exista um limiar presente ou quantidade para iniciar de cultura de células T semelhantes às células T naives na composição de entrada.

[00118] Em algumas modalidades dos métodos aqui fornecidos para incubar (por exemplo, estimular) as células, a quantidade para iniciar a cultura das células T semelhantes às células T naives ou de um subgrupo de células T CD8+ é de aproximadamente 0,1 x 108 a 5 x 108, entre ou entre cerca de 0,1 x 108 a 4 x 108, entre ou entre cerca de 0,1 x 108 a 2 x 108, entre ou entre cerca de 0,1 x 108 a 1 x 108, entre ou entre cerca de 1 x 108 a 5 x 108, entre ou entre cerca de 1 x 1108 a 4 x 108, entre ou entre cerca de 1 x 108 a 2 x 108, entre ou entre cerca de 2 x 108 a 5 x 108, entre ou entre cerca de 2 x 108 a 4 x 108 de células T naives. Em alguns casos, a quantidade inicial de cultura das células T naive ou de um subgrupo de células T CD8+ é pelo menos ou pelo menos cerca de ou é ou é cerca de 0,5 x 108, 0,75 x 108, 1 x 108, 1,5 x 108, 2 x 108 ou 4 x 108 das células T naive. Em alguns exemplos, a quantidade para o início da cultura das células T semelhantes às células T naives ou de um subgrupo de células T CD8+ é pelo menos ou pelo menos aproximadamente ou é ou é cerca de 2 x 108 células.

[00119] Em algumas modalidades dos métodos de incubação aqui fornecidos sob as condições estimulantes aqui descritas, uma composição de entrada que compreende uma população de células T que compreende células T semelhantes às células T naives e células T semelhantes às células T não naives contém uma quantidade para iniciar a cultura de ou de cerca de 1 x 108 a 8 x 108 células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+. Em algumas modalidades, os métodos produzem assim uma composição estimulada, em que as condições estimulantes induzem preferencialmente a expansão ou proliferação das células T semelhantes às células T naives em comparação com as células T semelhantes às células T não naives na composição estimulada. Em alguns aspectos, a quantidade para iniciar a cultura das células T semelhantes às células T naives ou de um subgrupo de células T CD8+ é pelo menos ou pelo menos cerca de ou é ou é cerca de 2 x 108 células. Em algumas modalidades, a quantidade de células T semelhantes às células T naives e células T semelhantes às células T não naives da composição de entrada são praticamente as mesmas. Em alguns casos, a quantidade inicial de cultura é uma quantidade de células T CD8+ naives. Em alguns casos, a quantidade para iniciar a cultura não leva em consideração a quantidade de células T não naives na composição de entrada. Em alguns aspectos, a quantidade para iniciar a cultura é determinada com base no número de células T não naives alvo na composição estimulada. b. Células T semelhantes às células T não naives

[00120] Em algumas modalidades, o método compreende incubar uma composição de entrada que compreende uma população de células T que compreende células T semelhantes às células T naives e células T semelhantes às células T não naives. Em algumas modalidades, as células T não naives incluem células T efetoras (TEFF), células T de memória, células T de memória central (T CM), células T de memória efetora (TEM) e combinações das mesmas. Um aspecto dos presentes métodos fornece uma composição de entrada que foi avaliada para populações de células que expressam uma variedade de marcadores, como CD27, CD28, CD56, CD62L, CD95, KLRG1,

CD45RA ou CD45RO, citocinas (por exemplo, IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10), receptores de citocinas (por exemplo, CD25), perforina, moléculas de adesão (por exemplo, VLA-1, VLA-2, VLA-4, LPAM-1, LFA-1) e/ou moléculas de retorno (por exemplo, L-Selectina), antes da incubação (por exemplo, estimulação). Para identificar células T não naives, em algumas modalidades, várias assinaturas de células T não naives podem ser utilizadas. Em algumas modalidades, a expressão de marcadores particulares de células T não naives pode ser avaliada. Por exemplo, em alguns casos, as células T não naives têm a superfície negativa para um marcador, incluindo marcadores de ativação de células T, tais como CD27, CD28, CD45RA e CCR7; e em alguns casos, as células T não naives são positivas para a superfície de um marcador, incluindo CD62L. Em alguns aspectos, as células T não naives são positivas na superfície para CD56 e/ou CD45RO. Em alguns aspectos, as células T não naives têm superfície positiva para CD45RO e superfície negativa para CD27, CD45RA e CCR7. Em alguns casos, as células T semelhantes às células T não naivess são positivas para a expressão intracelular de uma citocina tal como IL-2, IFN-γ, IL-4 e/ou IL-

10. Em alguns exemplos adicionais, as células T semelhantes às células T não naivess são positivas para a expressão dos marcadores CD25 e/ou perforina. Em alguns casos, as células T não naives são CD95hi.

[00121] Para avaliar a expressão dos marcadores de células T não naives, o método em algumas modalidades inclui a detecção dos marcadores através da realização de um ensaio in vitro. Em alguns exemplos, o ensaio in vitro é um imunoensaio, um ensaio baseado em aptâmero, um ensaio histológico ou citológico ou um ensaio de nível de expressão de mRNA. Em alguns casos, o ensaio in vitro usado pode ser um ensaio imunossorbente ligado a enzima (ELISA), immunoblotting, imunoprecipitação, radioimunoensaio (RIA), imunocoloração, teste de citometria de fluxo, ressonância de plasma de superfície (SPR), ensaio de quimioluminescência, imunoensaio de fluxo lateral, ensaio de inibição ou ensaio de avidez. Em algumas modalidades, a expressão de marcadores de células T não naives é determinada por RNA-seq.

[00122] As células T não naives da composição de entrada também podem ser avaliadas pela clonalidade das células T. Em algumas modalidades, as células T não naive são monoclonais. A clonalidade da dita composição de entrada das células T é medida pela amplitude da resposta da população a um determinado antígeno. Em algumas modalidades, monoclonalidade se refere a uma população de células T que é de baixa diversidade. Em alguns aspectos, a composição de entrada pode ser avaliada medindo o número de diferentes epítopos reconhecidos por células específicas para o antígeno. Isto pode ser realizado utilizando técnicas padronizadas para gerar e clonar células T específicas para o antígeno in vitro. Em algumas modalidades, as células T não naives exibem uma predominância de um único padrão de rearranjo do gene de TCR. A clonalidade das células na composição de entrada, tal como as células T não naives, é, em alguns exemplos, determinada por sequenciamento clonal, opcionalmente sequenciamento da próxima geração ou análise espectral.

[00123] Em algumas modalidades, avaliar a clonalidade da população de células T é uma avaliação da diversidade clonal da população de células T. Em algumas modalidades, uma população de células T que é monoclonal se refere a uma população de células T que exibe baixa diversidade. No contexto de uma população de células T, tal como na composição de entrada, a monoclonalidade se refere a uma população de células T que possui uma especificidade única, conforme definido pela análise espectral (uma medida do repertório da região hipervariável da cadeia Vβ, Vα, Vy ou Vδ de TCR). Uma população de células T é considerada monoclonal (ou monoespecífica) quando o perfil espectral de Vβ, Vα, Vy e/ou Vδ para uma determinada família Vβ, Vα,

Vy e/ou Vδ de TCR possui um único pico predominante. A análise do tipo de espectro distingue genes variáveis rearranjados de um tamanho específico, não sequência. Assim, é entendido que um único pico poderia representar uma população de células T que expressa qualquer um de um número limitado de genes variáveis de TCR rearranjados (Vβ, Vα, Vy ou Vδ) que compreende qualquer um dos 4 nucleotídeos potenciais (adenina (a), guanina (g), citosina (c) ou timina (t)) ou uma combinação dos 4 nucleotídeos na região da junção. Em certas modalidades, pode ser desejável clonar e sequenciar uma banda particular para determinar a sequência do(s) gene(s) variável (variáveis) rearranjado(s) presente(s) na banda que representa um comprimento específico.

[00124] Em algumas modalidades, os métodos para avaliar a clonalidade podem incluir várias características dos métodos, conforme descrito nas Publicações Internacionais Nos. WO2012/048341, WO2014/ 144495, WO2017/053902, WO2016044227, WO2016176322 e WO2012048340 cada uma incorporada por referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, tais métodos podem ser utilizados para obter informações de sequência sobre um polinucleotídeo alvo de interesse dentro de uma célula, como um TCR. Os genes alvo podem ser obtidos a partir de DNA genômico ou mRNA de uma célula a partir de uma amostra ou população de células. A amostra ou população de células podem incluir células imunes. Por exemplo, para moléculas alvo de TCR, os genes que codificam cadeias de um TCR podem ser obtidos a partir de DNA genômico ou mRNA de células imunes ou células T. Em algumas modalidades, o material de partida é o RNA das células T composto por genes que codificam uma cadeia de um TCR. Em algumas modalidades, o índice de Shannon é aplicado à clonalidade como um limiar para filtrar clones ("clonalidade ajustada por Shannon"), veja Chaara et al. ( 2018) Front Immunol 9:1038).

[00125] Consequentemente, entre os métodos para incubar (por exemplo, estimular) células T na preparação de células T manipuladas para terapia adotiva estão aqueles que usam condições que induzem preferencialmente a expansão e proliferação de células derivadas de células T semelhantes às células T naives (ou derivadas de células T CD45RA+ ou CD45RO-) em comparação com aquelas derivadas de células T não naives (ou derivadas de células T CD45RA- ou CD45RO+). Em algumas modalidades, as células T semelhantes às células T naives são CD45RA +, CD45RO, CD27+ e CCR7+. Em algumas modalidades, as células T semelhantes às células T não naives são CD45RA-, CD45RO+, CD27- e CCR7-. Em algumas modalidades, os métodos envolvem a incubação de células T em uma composição de cultura inicial sob condições estimulantes que induzem preferencialmente a expansão ou proliferação de células T semelhantes às células T naives em comparação com células T semelhantes às células T não naives, gerando assim uma composição estimulada. Ao usar os métodos fornecidos, a avaliação da composição de entrada usando os marcadores e assinaturas descritos acima pode ser utilizada como parte do método. B. Incubação Celular

[00126] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos incluem etapas de cultivo, incubação, cultura e/ou manipulação genética de células na composição de entrada, tal como uma composição de entrada que contém uma quantidade para iniciar a cultura de células T semelhantes às células T naives. Por exemplo, em algumas modalidades, são fornecidos métodos para incubar e/ou manipular uma quantidade inicial de cultura das composições de entrada fornecidas nas quais está contido um número limite de células T semelhantes às células T naives, conforme descrito. A incubação e/ou manipulação pode ser realizada em um vaso de cultura, tal como uma unidade, câmara, poço,

coluna, tubo, conjunto de tubos, válvula, frasco, disco de cultura, saco ou outro recipiente para cultura ou cultivo de células.

[00127] Em algumas modalidades, as células são incubadas e/ou cultivadas antes ou em conexão com a manipulação genética, tal como de acordo com qualquer um dos métodos descritos na Seção II. As etapas de incubação podem incluir cultura, cultivo, estimulação, ativação e/ou propagação. Em algumas modalidades, as composições ou células são incubadas na presença de condições estimulantes ou de um agente estimulador. Tais condições incluem aquelas designadas para induzir a proliferação, expansão, ativação e/ou sobrevivência de células na população, para mimetizar a exposição a antígenos e/ou para preparar as células para manipulação genética, tal como para a introdução de um receptor recombinante, por exemplo, CAR.

[00128] As condições podem incluir um ou mais meios particulares, temperatura, conteúdo de oxigênio, conteúdo de dióxido de carbono, tempo, agentes, por exemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, íons e/ou fatores estimuladores, tais como citocinas, quimiocinas, antígenos, parceiros de ligação, proteínas de fusão, receptores solúveis recombinantes e quaisquer outros agentes designados para ativar as células.

[00129] Em algumas modalidades, as condições ou agentes estimulantes incluem um ou mais agentes, por exemplo, ligante, que são capazes de ativar um domínio de sinalização intracelular de um complexo de TCR. Em alguns aspectos, o agente desencadeia ou inicia a cascata de sinalização intracelular de TCR/CD3 em uma célula T. Tais agentes podem incluir anticorpos, tais como aqueles específicos para um TCR, por exemplo, anti-CD3. Em algumas modalidades, as condições estimulantes incluem um ou mais agentes, por exemplo, ligantes, que são capazes de estimular um receptor coestimulatório, por exemplo, anti-CD28. Em algumas modalidades, tais agentes e/ou ligantes podem estar ligados a um suporte sólido, tal como uma esfera e/ou uma ou mais citocinas. Opcionalmente, o método de expansão pode ainda compreender a etapa de adição do anticorpo anti-CD3 e/ou anti-CD-28 ao meio de cultura (por exemplo, em uma concentração de pelo menos cerca de 0,5 ng/ml).

[00130] Os métodos fornecidos geralmente incluem a presença, projeto e/ou uso de condições estimulantes que induzem preferencialmente a expansão ou proliferação das células T semelhantes às células T naives versus células T semelhantes às células T não naives e/ou que não induzem preferencialmente a expansão ou proliferação em células do tipo não naive em comparação com células T semelhantes às células T naives. Em alguns aspectos, as condições incluem agentes que induzem um sinal de ativação, tal que apenas as células T não naives presentes na composição serão ativadas de uma maneira que induza a morte celular. Tais condições preferenciais são tipicamente utilizadas em uma fase anterior à introdução de ácidos nucleicos que codificam as moléculas manipuladas, tais como receptores de antígenos manipulados.

[00131] As condições incluem, mas não estão limitadas àquelas projetadas para induzir a proliferação, expansão, ativação e/ou sobrevivência de células na população. Em algumas modalidades, as condições induzem um sinal estimulador, por exemplo, de ativação, suficiente para ativar e/ou induzir a proliferação ou divisão em células T semelhantes às células T não naives ou um subgrupo delas. As células T semelhantes às células T naives geralmente requerem um sinal mínimo da via TCR/CD3 para atingir um limiar de ativação, por exemplo, para se tornar totalmente ativadas e direcionadas para o ciclo celular. Este sinal mínimo é geralmente mais alto do que o sinal necessário para induzir a ativação/entrada no ciclo celular em células T não naives e/ou em certos subgrupos. As células T não naives geralmente requerem um nível muito mais baixo de envolvimento de TCR/CD3 para se tornar ativado e entrar no ciclo celular. Em alguns aspectos, sinais mais fortes podem causar ou aumentar os níveis de morte celular induzida por ativação em células não naives ou em determinadas populações.

[00132] Assim, em algumas modalidades, nas quais a composição inclui uma população de células T semelhantes às células T naives e não naive e as condições são usadas para induzir um sinal de ativação que está abaixo do limiar de ativação necessário para a ativação das células T semelhantes às células T naives, primariamente células T não naives, serão ativadas e serão suscetíveis a condições estimulantes que podem levar à morte celular. Por exemplo, em condições estimulantes específicas, a morte celular pode resultar da morte celular induzida por ativação.

[00133] Em alguns aspectos, as condições estimulantes são tais que a morte celular induzida por ativação em células não naives é induzida em comparação com outras condições, tais como condições padronizadas. Assim, a presente invenção fornece métodos para a eliminação de pelo menos uma porção substancial de qualquer subpopulação indesejada de células T, por exemplo, células T não naives da composição de entrada. Para os propósitos dos métodos fornecidos, uma porção substancial significa pelo menos 70% da subpopulação indesejada de células, por exemplo, células T não naives da composição de entrada. Em certas modalidades, uma porção substancial significa 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais da subpopulação indesejada de células, por exemplo células T semelhantes às células T não naives da composição de entrada. A eliminação de células, tal como a morte celular de células T não naives, pode ser medida usando inúmeras técnicas, que incluem entre outras, análise citométrica de fluxo usando uma variedade de anticorpos e/ou tetrâmeros do peptídeo-MHC e ensaios funcionais, tais como ensaios de proliferação e liberação de cromo.

[00134] Em algumas modalidades, uma enzima é adicionada à composição de entrada para remover componentes celulares residuais da eliminação de células. Por exemplo, desoxirribonuclease (DNAse) ou uma desoxirribonuclease humana recombinante I (Pulmozyme®) são adicionadas à composição de entrada em algumas modalidades exemplificadoras. Em alguns aspectos, as condições estimulantes incluem desoxirribonuclease (DNAse) ou desoxirribonuclease humana recombinante I (Pulmozyme®).

[00135] Em alguns casos, as condições estimulantes não compreendem componentes de cultura que são suplementados para preservar subgrupos particulares de células T, por exemplo células T não naives. Portanto, em alguns casos, a remoção de componentes da cultura das condições estimulantes pode contribuir para a eliminação de células T não naives. Em alguns aspectos, a condição estimulatória é realizada, ou é adicionalmente realizada, excluindo ou reduzindo a concentração de reagentes de cultura que são conhecidos ou prováveis de reduzir o AICD e/ou que promovem a sobrevivência de células mais antigas, tais como células não naives. Em alguns casos, a condição estimulatória não inclui N-acetilcisteína ou inclui N-acetilcisteína em uma quantidade ou concentração reduzida. Em alguns casos, a condição estimulatória não inclui uma IL-7 recombinante e/ou IL-15 recombinante ou inclui uma quantidade ou concentração reduzidas de IL-7 ou IL-15 recombinante. Em algumas modalidades, podem ser incluídos aditivos de cultura que auxiliam ou promovem adicionalmente a remoção de células não naives (por exemplo, toxinas ligadas a CD45RO).

[00136] Em certas modalidades, os tempos de estimulação e/ou expansão podem ser entre 2 e 15 dias, entre 2 e 12 dias, entre 2 e 10 dias, entre 2 e 8 dias, entre 2 e 6 dias, entre 2 e 6 dias, entre 2 e 4 dias,

entre 4 e 12 dias, entre 4 e 10 dias, entre 4 e 8 dias, entre 4 e 6 dias, entre 6 e 12 dias, entre 6 e 10 dias, entre 6 e 8 dias, entre 8 e 12 dias, entre 8 e 10 dias ou entre 10 e 12 dias. Em algumas modalidades, as células são incubadas por pelo menos 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias, ou mais de 14 dias. Em uma modalidade dos métodos fornecidos, a mistura pode ser cultivada por 30 minutos a várias horas (cerca de 3 horas) a cerca de 14 dias ou qualquer valor inteiro de cada hora ou minuto. Em outra modalidade, a mistura pode ser cultivada por 21 dias. Em uma modalidade, as esferas e as células T são cultivadas juntas por cerca de oito dias. Em outra modalidade, as esferas e as células T são cultivadas juntas por pelo menos ou pelo menos cerca de 2-3 dias. Em outra modalidade, as esferas e as células T são cultivadas juntas por pelo menos ou pelo menos cerca de 2 dias ou pelo menos ou pelo menos cerca de 48 horas. Em alguns aspectos, vários ciclos de estimulação também podem ser desejados, de modo que o tempo de cultura das células T possa ser de 60 dias ou mais.

[00137] A incubação e/ou manipulação pode ser realizada em um recipiente de cultura, como uma unidade, câmara, poço, coluna, tubo, conjunto de tubulação, válvula, frasco, disco de cultura, saco ou outro recipiente para células de cultura ou cultivo. Em algumas modalidades, as composições ou células são incubadas na presença de condições estimulantes ou de um agente estimulador. Tais condições incluem aquelas projetadas para induzir a proliferação, expansão, ativação e/ou sobrevivência de células na população, para mimetizar a exposição ao antígeno e/ou preparar as células para manipulação genética, tal como para a introdução de um receptor de antígeno recombinante.

[00138] Os métodos fornecidos geralmente incluem a incubação (por exemplo, de composições de entrada contendo células T) sob condições estimulantes. No contexto de células T estimulantes, as condições estimulantes geralmente incluem um agente primário capaz de se ligar, acoplar, reticular e/ou induzir a ativação através de um domínio de sinalização intracelular de um complexo de TCR ou membro do mesmo, tal como CD3. Em algumas modalidades, as condições estimulantes incluem um agente primário que se liga especificamente a um membro de um complexo de TCR e um agente secundário que se liga especificamente a uma molécula coestimulatória de células T. Em alguns exemplos específicos, o agente primário se liga especificamente a CD3 e/ou a molécula coestimulatória é selecionada do grupo que consiste em CD28, CD137 (4-1-BB), OX40 ou ICOS.

[00139] Em algumas modalidades, as condições estimulantes incluem anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 imobilizados, anticorpos anti- CD3 solúveis, derivados de tais anticorpos e/ou outros ligantes que envolvem o complexo TCR/CD3 nas células T. Em alguns aspectos, o agente primário ativa ou inicia a cascata de sinalização intracelular de TCR/CD3 em uma célula T. Tais agentes podem incluir parceiros de ligação, tais como ligantes naturais e/ou anticorpos, incluindo fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno, como aqueles específicos para um componente de TCR, tal como CD3. Anticorpos anti-CD3 exemplificadores são BC3, OKT3 e G19-4.

[00140] Em algumas modalidades, as condições estimulantes incluem ainda a incubação com um agente secundário, tal como um agente capaz de induzir um sinal coestimulador de células T para uma célula T, como um sinal que em combinação com um sinal primário (por exemplo, ligação de TCR/CD3 ), leva à proliferação e/ou ativação das células T. Agentes secundários exemplificadores são aqueles que se ligam especificamente a, conectam, reticulam e/ou induzem eventos de sinalização intracelular por meio de uma molécula coestimulatória ou acessória de células T, tal como CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, ICOS, CD40, LFA-1, DAP10 e/ou CD54. Os agentes incluem anticorpos,

incluindo seus fragmentos, ligantes naturais e outros parceiros de ligação. Em algumas modalidades, o agente secundário se liga ao CD28, como um anticorpo anti-CD28, incluindo fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno. Em alguns aspectos, é um anticorpo anti-CD28. Anticorpos anti-CD28 exemplificadores são B-T3 e XR-CD28.

[00141] Em algumas modalidades, o parceiro ou agente de ligação que se liga especificamente a uma molécula específica, tal como uma molécula estimuladora ou coestimuladora de célula T, inclui anticorpos específicos para tais moléculas, incluindo fragmentos de anticorpo de ligação ao antígeno. Em alguns aspectos, o anticorpo, por exemplo, anticorpo anti-CD3 e/ou anti-CD28, é incluído em uma concentração de pelo menos cerca de 0,5 ng / mL. Em alguns aspectos, os agentes incluem um ou mais outros parceiros de ligação para tal molécula, como um parceiro de ligação natural. Os agentes também podem incluir ligantes e complexos naturais, incluindo moléculas e/ou complexos em células que apresentam antígenos e/ou superantígenos (enterotoxina A de Staphylococcus (SEA), (enterotoxina B de Staphylococcus (SEB) , Toxina 1 da Síndrome do Choque Tóxico (TSST-1)), endotoxina). Outros agentes exemplificadores são aqueles que mimetizam a sinalização através de uma molécula de sinalização primária ou coestimulatória de células T, tal como um mitógeno, incluindo um ativador de PKC, acetato miristato de forbol (PMA), fito-hemaglutinina (PHA) e/ou ionóforo de cálcio, por exemplo, ionomicina, lipopolissacarídeo (LPS), mitógeno de células T e citocinas. Em alguns aspectos, as condições incluem incubação com uma ou mais citocinas estimuladoras ou outros fatores, tais como IL-2 e/ou IL-15. Em alguns aspectos, a concentração de citocina é de pelo menos cerca de 10 unidades/mL.

[00142] Os agentes primário e secundário (coestimulatórios), em algumas modalidades, estão ligados a uma superfície sólida ou suporte,

como uma partícula, por exemplo, esfera. Em algumas modalidades, as células podem ser incubadas e/ou contatadas com um agente estimulador que é capaz de ativar e/ou expandir células T. Em alguns aspectos, os agentes primário e secundário são acoplados a uma superfície sólida, tal como uma partícula, por exemplo, esfera. Em certas modalidades, o agente estimulador compreende uma partícula, por exemplo, uma esfera, que é conjugada ou ligada a um ou mais agentes, por exemplo, biomoléculas, que são capazes de ativar e/ou expandir células, por exemplo, células T. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes estão ligados a uma esfera. Em algumas modalidades, a esfera é bio-compatível, isto é, composta por um material que é adequado para uso biológico. Em algumas modalidades, as esferas não são tóxicas para células cultivadas, por exemplo, células T cultivadas. Em algumas modalidades, as esferas podem ser quaisquer partículas que sejam capazes de acoplar agentes de uma maneira que permita uma interação entre o agente e uma célula.

[00143] Em algumas modalidades, um agente estimulador compreende um ou mais agentes que são capazes de ativar e/ou expandir células, por exemplo, células T, que estão ligadas a ou acopladas de outra maneira a uma esfera, por exemplo, à superfície da esfera. Em certas modalidades, a esfera é uma partícula não celular. Em modalidades particulares, a esfera pode incluir uma partícula coloidal, uma microesfera, nanopartícula, uma a esfera magnética ou semelhante. Em algumas modalidades, as esferas são esferas de agarose. Em certas modalidades, as esferas são esferas de sefarose.

[00144] Em modalidades particulares, o agente estimulador compreende esferas que são monodispersas. Em certas modalidades, as esferas que são monodispersas compreendem dispersões de tamanho com um desvio padrão de diâmetro inferior a 5% uma da outra.

[00145] Em algumas modalidades, a esfera contém um ou mais agentes, tal como um agente que é acoplado, conjugado ou ligado (diretamente ou indiretamente) à superfície da esfera. Em algumas modalidades, um agente como aqui contemplado pode incluir, mas não está limitado a RNA, DNA, proteínas (por exemplo, enzimas), antígenos, anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais, fragmentos de anticorpos, carboidratos, lectinas lipídicas ou qualquer outra biomolécula com uma afinidade para um alvo desejado. Em algumas modalidades, o alvo desejado é um receptor de célula T e/ou um componente de um receptor de célula T. Em certas modalidades, o alvo desejado é CD3. Em certa modalidade, o alvo desejado é uma molécula coestimulatória, por exemplo, CD28. O um ou mais agentes podem ser ligados direta ou indiretamente a esfera por uma variedade de métodos. A ligação pode ser covalente, não covalente, eletrostática ou hidrofóbica e pode ser realizada por uma variedade de meios de ligação, incluindo, por exemplo, um meio químico, um meio mecânico ou um meio enzimático. Em algumas modalidades, uma biomolécula (por exemplo, um anticorpo anti-CD3 biotinilado) pode ser anexada indiretamente à esfera através de outra biomolécula (por exemplo, anticorpo antibiotina) que está diretamente ligada à esfera.

[00146] Em algumas modalidades, um ou mais dos agentes ligados a esfera é um anticorpo. O anticorpo pode incluir um anticorpo policlonal, anticorpo monoclonal (incluindo anticorpos de extensão completa que possuem uma região Fc de imunoglobulina), composições de anticorpos com especificidade poliepitópica, anticorpos multiespecíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos, diacorpos e moléculas de cadeia simples, assim como fragmentos de anticorpos (por exemplo, Fab, F(ab')2 e Fv). Em algumas modalidades, o reagente estimulador é um fragmento de anticorpo (incluindo fragmento de ligação ao antígeno), por exemplo, um fragmento Fab, Fab'-SH, Fv, scFv ou (Fab')2. Será apreciado que regiões constantes de qualquer isotipo podem ser usadas para os anticorpos aqui contemplados, incluindo regiões constantes de IgG, IgM, IgA, IgD e IgE, e que essas regiões constantes podem ser obtidas a partir de qualquer espécie humana ou animal (por exemplo, espécies de murino). Em algumas modalidades, o agente é um anticorpo que se liga a e/ou reconhece um ou mais componentes de um receptor de célula T. Em modalidades particulares, o agente é um anticorpo anti-CD3. Em certas modalidades, o agente é um anticorpo que se liga e/ou reconhece um correceptor. Em algumas modalidades, o reagente estimulador compreende um anticorpo anti-CD28.

[00147] Em algumas modalidades, a esfera tem um diâmetro maior do que cerca de 0,001 μm, maior do que cerca de 0,01 μm, maior do que cerca de 0,1 μm, maior do que cerca de 0,1 μm, maior do que cerca de 1,0 μm, maior do que cerca de 10 μm, maior do que cerca de 10 μm, maior do que cerca de 50 μm, maior do que cerca de 100 μm ou maior do que cerca de 1000 μm e não mais do que cerca de 1500 μm. Em algumas modalidades, a esfera tem um diâmetro de cerca de 1,0 μm a cerca de 500 μm, cerca de 1,0 μm a cerca de 150 μm, cerca de 1,0 μm a cerca de 30 μm, cerca de 1,0 μm a cerca de 10 μm, cerca de 1,0 μm a cerca de 10 μm, cerca de 1,0 μm a cerca de 5,0 μm, cerca de 2,0 μm a cerca de 5,0 μm ou cerca de 3,0 μm a cerca de 5,0 μm. Em algumas modalidades, a esfera tem um diâmetro de cerca de 3 μm a cerca de 5 μm. Em algumas modalidades, a esfera tem um diâmetro de pelo menos ou pelo menos cerca de 0,001 μm, 0,01 μm, Ο. μm, 0,5 μm, 1,0 μm, 1,5 μm, 2,0 μm, 2,5 μm, 3,0 μm, 3,5 μm, 4,0 μm, 4,5 μm, 5,0 μm, 5,5 μm, 6,0 μm, 6,5 μm, 7,0 μm, 7,5 μm , 8,5 μm, 9,0 μm, 9,5 μm, 10 μm, 12 μm, 14 μm, 16 μm, 18 μm ou 20 μm. Em certas modalidades, a esfera tem um diâmetro de cerca de 4,5 μm. Em certas modalidades, a esfera tem um diâmetro de cerca de 2,8 μm.

[00148] Em algumas modalidades, as esferas têm uma densidade maior do que 0,001 g/cm3, maior do que 0,01 g/cm3, maior do que 0,05 g/cm3, maior do que 0,1 g/cm3, maior do que 0,5 g/cm3, maior do que 0,6 g/cm3, maior do que 0,7 g/cm3, maior do que 0,8 g/cm3, maior do que 0,9 g/cm3, maior do que 1 g/cm3, maior do que 1,1 g/cm3, maior do que 1,2 g/cm3, maior do que 1,3 g/cm3, maior do que 1,4 g/cm3, maior do que 1,5 g/cm3, maior do que 2 g/cm3, maior do que 3 g/cm3, maior do que 4 g/cm3, ou maior do que 5g/cm3. Em algumas modalidades, as esferas têm uma densidade entre cerca de 0,001 g/cm3 e cerca de 100 g/cm3, cerca de 0,01 g/cm3 e cerca de 50 g/cm3, cerca de 0,1 g/cm3 e cerca de 10 g/cm3, cerca de 0,1 g/cm3 e cerca de .5 g/cm3, cerca de 0,5 g/cm3 e cerca de 1 g/cm3, cerca de 0,5 g/cm3 e cerca de 1,5 g/cm3, cerca de 1 g/cm3 e cerca de 1,5 g/cm3, cerca de 1 g/cm3 e cerca de 2 g/cm3, ou cerca de 1 g/cm3 e cerca de 5 g/cm3. Em algumas modalidades, as esferas têm uma densidade de cerca de 0,5 g/cm3, cerca de 0,6 g/cm3, cerca de 0,7 g/cm3, cerca de 0,8 g/cm3, cerca de 0,9 g/cm3, cerca de 1.0 g/cm3, cerca de 1,1 g/cm3, cerca de 1,2 g/cm3, cerca de 1,3 g/cm3, cerca de 1,4 g/cm3, cerca de 1,5 g/cm3, cerca de 1,6 g/cm3, cerca de 1,7 g/cm3, cerca de 1,8 g/cm3, cerca de 1,9 g/cm3 ou cerca de 2,0 g/cm3. Em certas modalidades, as esferas têm uma densidade de cerca de 1,6 g/cm3. Em modalidades particulares, as esferas ou partículas têm uma densidade de cerca de 1,5 g/cm3. Em certas modalidades, as partículas têm uma densidade de cerca de 1,3 g/cm3.

[00149] Em certas modalidades, uma pluralidade de esferas tem uma densidade uniforme. Em certas modalidades, uma densidade uniforme compreende um desvio padrão de densidade inferior a 10%, inferior a 5% ou inferior a 1% da densidade média das esferas.

[00150] Em algumas modalidades, as esferas têm uma área superficial entre cerca de 0,001 m2 por cada grama de partículas (m2/g) a cerca de 1.000 m2/g, cerca de 0,010 m2/g a cerca de 100 m2/g, cerca de 0,1 m2/g a cerca de 10 m2/g, cerca de 0,1 m2/g a cerca de 1 m2/g,

cerca de 1 m2/g a cerca de 10 m2/g, cerca de 10 m2/g a cerca de 100 m2/g, cerca de 0,5 m2/g a cerca de 20 m2/g, cerca de 0,5 m2/g a cerca de 5 m2/g, ou cerca de 1 m2/g a cerca de 4 m2/g. Em algumas modalidades, as partículas ou esferas têm uma área superficial de cerca de 1 m2/g a cerca de 4 m2/g.

[00151] Em algumas modalidades, a esfera contém pelo menos um material na superfície da esfera ou próximo a ele que pode ser acoplado, ligado ou conjugado a um agente. Em algumas modalidades, a esfera é funcionalizada na superfície, isto é, compreende grupos funcionais que são capazes de formar uma ligação covalente com uma molécula de ligação, por exemplo, um polinucleotídeo ou um polipeptídeo. Em modalidades particulares, o grânulo compreende grupos carboxila, amino, hidroxila, tosila, epóxi e/ou clorometila expostos na superfície. Em modalidades particulares, as esferas compreendem agarose e/ou sefarose expostas à superfície. Em certas modalidades, a superfície do grânulo compreende reagentes estimuladores acoplados que podem ligar ou conectar moléculas de ligação. Em modalidades particulares, as biomoléculas são polipeptídeos. Em algumas modalidades, as esferas compreendem proteína A, proteína G ou biotina expostas na superfície.

[00152] Em algumas modalidades, a esfera reage em um campo magnético. Em algumas modalidades, a esfera é uma esfera magnética. Em algumas modalidades, a esfera magnética é paramagnética. Em modalidades particulares, a esfera magnética é superparamagnética. Em certas modalidades, as esferas não exibem propriedades magnéticas, a menos que sejam expostas a um campo magnético.

[00153] Em modalidades particulares, a esfera compreende um núcleo magnético, um núcleo paramagnético ou um núcleo superparamagnético. Em algumas modalidades, o núcleo magnético contém um metal. Em algumas modalidades, o metal pode ser, mas não está limitado a, ferro, níquel, cobre, cobalto, gadolínio, manganês,

tântalo, zinco, zircônio ou qualquer combinação dos mesmos. Em certas modalidades, o núcleo magnético compreende óxidos de metal (por exemplo, óxidos de ferro), ferritas (por exemplo, ferritas de manganês, ferritas de cobalto, ferritas de níquel, etc.), hematita e ligas metálicas (por exemplo, CoTaZn). Em algumas modalidades, o núcleo magnético compreende um ou mais de uma ferrita, um metal, uma liga de metal, um óxido de ferro ou dióxido de cromo. Em algumas modalidades, o núcleo magnético compreende ferro elementar ou um composto do mesmo. Em algumas modalidades, o núcleo magnético compreende uma ou mais magnetita (Fe304), maghemita (yFe203) ou greigita (Fe3S4). Em algumas modalidades, o núcleo interno compreende um óxido de ferro (por exemplo, Fe3O4).

[00154] Em certas modalidades, a esfera contém um núcleo magnético, paramagnético e/ou superparamagnético que é coberto por uma camada ou revestimento funcionalizado na superfície. Em algumas modalidades, o revestimento pode conter um material que pode incluir, mas não está limitado a um polímero, um polissacarídeo, uma sílica, um ácido graxo, uma proteína, um carbono, agarose, sefarose ou uma combinação dos mesmos. Em algumas modalidades, o polímero pode ser um polietileno glicol, poli(ácido lático-co-glicólico), poliglutaraldeído, poliuretano, poliestireno ou um álcool polivinílico. Em certas modalidades, o revestimento ou revestimento externo compreendem poliestireno. Em modalidades particulares, o revestimento externo é funcionalizado na superfície.

[00155] Em algumas modalidades, o reagente estimulador compreende uma esfera que contém um núcleo de óxido de metal (por exemplo, um núcleo de óxido de ferro) e um revestimento, em que o núcleo de óxido de metal compreende pelo menos um polissacarídeo (por exemplo, dextran) e em que o revestimento compreende pelo menos um polissacarídeo (por exemplo, amino dextran), pelo menos um polímero (por exemplo, poliuretano) e sílica. Em algumas modalidades, o núcleo de óxido de metal é um núcleo de óxido de ferro coloidal. Em certas modalidades, o um ou mais agentes incluem um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno. Em modalidades particulares, o um ou mais agentes incluem um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti- CD28. Em algumas modalidades, o reagente estimulador compreende um anticorpo anti-CD3, anticorpo anti-CD28 e um anticorpo anti-biotina. Em algumas modalidades, o reagente estimulador compreende um anticorpo anti-biotina. Em algumas modalidades, a esfera tem um diâmetro de cerca de 3 μm a cerca de 10 μm. Em algumas modalidades, a esfera tem um diâmetro de cerca de 3 μm a cerca de 5 μm. Em certas modalidades, a esfera tem um diâmetro de cerca de 3,5 μm.

[00156] Em algumas modalidades, o reagente estimulador compreende um ou mais agentes que estão ligados a uma esfera que compreende um núcleo de óxido de metal (por exemplo, um núcleo interno de óxido de ferro) e um revestimento (por exemplo, um revestimento protetor), em que o revestimento compreende poliestireno. Em certas modalidades, as esferas são esferas superparamagnéticas monodispersas que compreendem um núcleo de ferro superparamagnético, por exemplo, um núcleo que compreende magnetita (Fe3O4) e/ou maghemita (yFe2O3) c e um revestimento ou revestimento de poliestireno. Em algumas modalidades, a esfera é não porosa. Em algumas modalidades, as esferas contêm uma superfície funcionalizada à qual um ou mais agentes estão ligados. Em certas modalidades, o um ou mais agentes são ligados covalentemente às esferas na superfície. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes incluem um anticorpo ou seu fragmento de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes incluem um anticorpo anti- CD3 e um anticorpo anti-CD28. Em certas modalidades, as esferas têm uma densidade de cerca de 1,5 g/cm3 e uma área superficial de cerca de 1 m2/g a cerca de 4 m2/g. Em modalidades particulares; as esferas são esferas superparamagnéticas monodispersas que têm um diâmetro de cerca de 4,5 μm e uma densidade de cerca de 1,5 g/cm 3. Em algumas modalidades, as esferas são esferas superparamagnéticas monodispersas que têm um diâmetro médio de cerca de 2,8 μm e uma densidade de cerca de 1,3 g/cm3.

[00157] Para efetuar o isolamento de diferentes populações de células T, os tempos de exposição às partículas podem variar. Por exemplo, em uma modalidade preferida, as células T são isoladas por incubação com 3 x 28 esferas, tais como DYNABEADS® M-450 ou Dynabeads® CD3/CD28CTS™, por um período de tempo suficiente para a seleção positiva das células T desejadas. Em uma modalidade, o período de tempo é de cerca de 30 minutos. Em uma modalidade adicional, o período de tempo é de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 horas. Em outra modalidade preferida, o período de tempo é de 10 a 24 horas ou mais. Em uma modalidade preferida, o período de incubação é de 24 horas. Para o isolamento de células T de pacientes com câncer, o uso de tempos de incubação mais longos, tal como 24 horas, pode aumentar o rendimento das células.

[00158] Quando acoplados a uma superfície, os agentes podem ser acoplados na mesma superfície (isto é, na formação "cis") ou em superfícies separadas (isto é, na formação "trans"). Alternativamente, um agente pode ser acoplado a uma superfície e o outro agente em solução. Em uma modalidade, o agente que fornece o sinal coestimulatório está ligado a uma superfície celular e o agente que fornece o sinal de ativação primário está em solução ou acoplado a uma superfície. Em uma modalidade preferida, os dois agentes estão imobilizados nas esferas, na mesma esfera, isto é, "cis", ou em esferas separadas, isto é, "trans”. A título de exemplo, o agente que fornece o sinal de ativação primário é um anticorpo anti-CD3 e o agente que fornece o sinal coestimulatório é um anticorpo anti-CD28; e ambos os agentes são imobilizados na mesma esfera em quantidades moleculares equivalentes.

Em uma modalidade, é utilizada uma proporção de 1:1 de cada anticorpo ligado às esferas para expansão de células T CD4+ e crescimento de células T.

Em certos aspectos da presente invenção, é utilizada uma proporção de anticorpos anti- CD3:CD28 ligados às esferas, de modo que seja observado um aumento na expansão das células T em comparação com a expansão observada usando uma proporção de 1:1. Em uma modalidade particular, é observado um aumento de cerca de 0,5 a cerca de 3 vezes, em comparação com a expansão observada utilizando uma proporção de 1:1. Em uma modalidade, a proporção de anticorpo anti-CD3:CD28 ligado às esferas varia de 100:1 a 1:100 e todos os valores inteiros entre eles.

Em um aspecto da presente invenção, mais anticorpo anti-CD28 está ligado às partículas do que o anticorpo anti-CD3, isto é, a proporção de CD3:CD28 é menor que um.

Em certas modalidades da invenção, a proporção de anticorpo anti-CD28 para anticorpo anti-CD3 ligado às esferas é maior que 2:1. Em uma modalidade particular, é utilizada uma proporção de 1:200 de anticorpo anti-CD3:CD28 ligado às esferas.

Em uma modalidade particular, é utilizada uma proporção de 1:150 de anticorpo anti-CD3:CD28 ligado às esferas.

Em uma modalidade particular, é utilizada uma proporção de 1:100 de anticorpo anti- CD3:CD28 ligado às esferas.

Em outra modalidade, é utilizada uma proporção de 1:75 de anticorpo anti-CD3:CD28 ligado às esferas.

Em uma modalidade adicional, é usada uma proporção de 1:50 de anticorpo anti-CD3:CD28 ligado às esferas.

Em outra modalidade, é usada uma proporção de 1:45 de anticorpo anti-CD3:CD28 ligado às esferas.

Em outra modalidade, é usada uma proporção de 1:40 de anticorpo anti- CD3:CD28 ligado às esferas.

Em outra modalidade, é usada uma proporção de 1:35 de anticorpo anti-CD3:CD28 ligado às esferas.

Em outra modalidade, é usada uma proporção de 1:30 de anticorpo anti- CD3:CD28 ligado às esferas. Em outra modalidade, é usada uma proporção de 1:25 de anticorpo anti-CD3:CD28 ligado às esferas. Em outra modalidade, é usada uma proporção de 1:20 de anticorpo anti- CD3:CD28 ligado às esferas. Em outra modalidade, é usada uma proporção de 1:15 de anticorpo anti-CD3:CD28 ligado às esferas. Em uma modalidade, uma proporção de 1:10 de anticorpo anti-CD3:CD28 ligado às esferas é usada. Em outra modalidade, é usada uma proporção de 1:5 de anticorpo anti-CD3:CD28 ligado às esferas. Em outra modalidade, é usada uma proporção de 1:4 de anticorpo anti- CD3:CD28 ligado às esferas. Em outra modalidade, é usada uma proporção de 1:3 de anticorpo anti-CD3:CD28 ligado às esferas. Em outra modalidade ainda, é usada uma proporção de 3:1 de anticorpo anti-CD3:CD28 ligado às esferas.

[00159] Em algumas modalidades, o agente, por exemplo, anticorpo, é adicionado na forma solúvel à cultura ou composição. Em algumas modalidades, um agente é incluído na forma solúvel e outro agente é incluído acoplado ao suporte sólido. Em alguns aspectos, onde dois ou mais agentes estão acoplados ao (s) suporte (s) sólido (s), dois agentes são acoplados ao mesmo suporte ou partícula, por exemplo, incubação com esferas anti-CD3/anti-CD28, as esferas contendo anticorpos que reconhecem CD3 e CD28. Em outros aspectos, os dois ou mais agentes estão acoplados a suportes separados, tal como esferas separadas. Por exemplo, esferas anti-CD3 e anti-CD28 em alguns aspectos são adicionadas separadamente à cultura.

[00160] Em algumas modalidades, as condições de cultura incluem células que apresentam antígeno artificiais. Por exemplo, em alguns aspectos, a superfície é uma célula que apresentam antígeno artificial carregada com um agente ou agentes capazes de potencializar um sinal através de um complexo TCR, como anticorpos anti-CD3 e/ou anti-

CD28. Células que apresentam antígeno exemplificadoras são células geneticamente modificadas, tal como células mieloides (por exemplo, K562 ou U937) manipuladas para expressar receptores Fc, tal como receptores Fc com afinidade intermediária por CD32 ou alta afinidade por CD64. Tais células podem ser carregadas com anticorpos anti-CD3 e/ou anti-CD28 reconhecidos pelos receptores Fc e incubadas com as células T para liberar o sinal na cultura. Exemplos de APCs artificiais e proporções e métodos de uso dos mesmos em condições de cultura são descritos, por exemplo, em Suhoski et al., Molecular Therapy (2007) 15 5, 981-988; Thomas et ai., Clin Immunol (2002) 105 (3): 259-72; Kim et ai., Nature Biotechnology 22, 403-410 (2004). Em algumas modalidades, as condições de cultura incluem células que apresentam antígeno, tais como PBMCs, carregadas com antígeno, tal como o antígeno reconhecido pelo complexo TCR ou outro receptor nas células a serem transduzidas, tal como células T específicas para um antígeno tumoral particular.

[00161] Em algumas modalidades, a expansão ou proliferação preferencial de células T semelhantes às células T naives versus do tipo não naive é alcançada pelo uso de condições estimuladoras projetadas para induzir uma força específica do sinal, tal como uma força do sinal estimulador ou ativador que é mais alta que um certo nível, por exemplo, para induzir a morte celular de células T não naive. Em alguns aspectos, um sinal mais forte induz a morte celular de células T não naives da composição de entrada, enquanto um sinal mais fraco não induz a morte celular de células T não naives na composição de entrada e/ou mantém a sobrevivência de células T não naives, em comparação com um sinal mais forte. Assim, em algumas modalidades, um sinal mais forte ativa preferencialmente ou causa a morte celular de células T não naives.

[00162] Em alguns aspectos, a expansão ou proliferação preferencial de células T semelhantes às células T naives versus do tipo não naive é alcançada por uma proporção específica de esferas para células. Em algumas modalidades, qualquer condição estimuladora que desvie a expansão ou sobrevivência ou células T semelhantes às células T naives sobre células T semelhantes às células T não naives pode ser empregada. Em algumas modalidades, as condições de estimulação incluem incubação na presença de um reagente de esfera que contém um sinal primário e/ou secundário para a ativação de células T, por exemplo, um reagente de esferas anti-CD3/anti-CD28, tal como fornecido em uma quantidade que favoreça a proliferação e/ou sobrevivência de células do tipo naive e/ou que induza preferencialmente a morte celular induzida por ativação (AICD) de células do tipo não naive. Em alguns casos, tais reagentes de esferas são incubados com células na proporção de esferas para células de 1:1 ou mais, o que, em alguns aspectos, pode direcionar para mais AICD e aumentar o percentual de células do tipo naive sobreviventes. Veja, por exemplo, Kalamasz et al., J. Immunother. (2004) 27 (5): 405-418 e Patentes U.S. Nos.7.977.095 e 9.528.088. Em uma modalidade, a proporção é de cerca de 50:1 a cerca de 5:1. Em certas modalidades, a proporção é de cerca de 100:1 a cerca de 1:1. Em uma modalidade, a proporção é de pelo menos cerca de 45:1. Em certas modalidades, a proporção é de pelo menos cerca de 40:1, 35:1, 30:1, 25:1, 20:1, 15:1, 14:1, 13:1, 12:1, 11:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1 ou 1:1. Em alguns aspectos, é usada uma proporção de esfera para célula menor do que 5:1 ou menor do que 3:1. Em uma modalidade particular, a proporção é de cerca de 3:1.

[00163] Em uma modalidade dos métodos fornecidos, as proporções de esfera:célula podem ser adaptadas para obter um fenótipo de célula T desejado. Em uma modalidade particular, as proporções de esfera:célula podem ser variadas para expandir ou excluir seletivamente subgrupos de células T. Em uma modalidade, a proporção de esfera:célula específica usada induz seletivamente a morte celular em células T não naive ou células derivadas de células T não naives da composição de entrada. Em uma modalidade adicional, a proporção de esfera:célula específica usada expande seletivamente células T semelhantes às células T naives ou células derivadas de células T semelhantes às células T naives. Em algumas modalidades, uma proporção particular pode ser usada desde que ocorra a expansão ou deleção desejadas de subgrupos de células T. Portanto, as composições e métodos aqui descritos podem ser utilizados para expandir populações específicas de células T ou excluir populações específicas de células T, para uso em qualquer variedade de configurações imunoterapêuticas aqui descritas.

[00164] Também são fornecidas condições estimulantes apropriadas para o método de incubar (por exemplo, estimular) células T. As condições apropriadas para a cultura de células T incluem um meio apropriado (por exemplo, OpTmizer™ (Gibco) ou Minimal Essential Media ou RPMI Media 1640 ou X-vivo 15, (BioWhittaker)) que podem conter fatores necessários para a proliferação e viabilidade, incluindo soro (por exemplo, soro fetal bovino ou humano), produtos de reposição de soro ou interleucina-2 (IL-2), insulina ou quaisquer outros aditivos para o crescimento das células. O meio pode incluir RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 e X-Vivo 20, com adição de aminoácidos e vitaminas, sem soro ou suplementados com uma quantidade adequada soro (ou plasma) ou substituinte de soro ou um conjunto definido de hormônios e/ou uma quantidade de citocina(s) suficiente para o crescimento e expansão das células T. Antibióticos, por exemplo, penicilina e estreptomicina, são incluídos apenas em culturas experimentais, não em culturas de células que devem ser infundidas em um indivíduo. As células alvo são mantidas sob condições necessárias para suportar o crescimento, por exemplo, uma temperatura apropriada (por exemplo, 37°C) e atmosfera (por exemplo, ar mais 5% de CO2).

[00165] Em outra modalidade, o tempo de exposição aos agentes estimuladores, tais como esferas revestidas com anti-CD3/anti-CD28 (isto é, 3 x 28), pode ser modificado ou adaptado de modo a obter um fenótipo de célula T desejado. Pode ser desejado uma população maior de células T auxiliares (TH), tipicamente CD4+, em oposição às células T CD8+ citotóxicas ou reguladoras, porque uma expansão das células TH pode melhorar ou restaurar a responsividade imunológica geral. Enquanto muitas respostas imunes específicas são mediadas por células T CD8+ específicas para o antígeno, que podem lisar ou matar diretamente as células-alvo, a maioria das respostas imunes requer a ajuda de células T CD4+, que expressam importantes moléculas imunorreguladoras, tais como GM-CSF, CD40L e IL-2, por exemplo. Onde a ajuda mediada por CD4 é preferida, um método, tal como o descrito aqui, que preserva ou aprimora a proporção de CD4: CD8 pode ser um benefício significativo. Um número maior de células T CD4+ pode aumentar a quantidade de CD40L expressa em células introduzida nos pacientes, potencialmente melhorando a visibilidade da célula alvo (função APC aprimorada). Efeitos semelhantes podem ser observados aumentando o número de células infundidas que expressam GM-CSF ou IL-2, toda as quais são expressas predominantemente por células T CD4+. Da mesma forma, pode ser desejável, em certas aplicações, utilizar uma população de células T reguladoras (por exemplo, Autoimmun Rev. 2002 August; 1(4):190-7; Curr Opin Immunol. 2002 December; 14(6): 771-8) que podem ser geradas e expandidas usando os métodos aqui descritos. Alternativamente, em situações em que é necessária menos CD4 auxiliar e um número aumentado de células T CD8+ é desejável, as abordagens XCELLERATE™ aqui descritas também podem ser utilizadas, por exemplo, pré-selecionando as células

CD8+ antes da estimulação e/ou cultura. Tais situações podem existir onde são preferidos níveis aumentados de IFN-γ ou citólise aumentada de uma célula alvo. Pode-se também modificar o tempo e o tipo de exposição a agentes estimuladores para expandir as células T com um repertório de TCR desejado, por exemplo, expressar os genes da família Vβ desejados.

[00166] Outras condições das condições estimulantes, em algumas modalidades, também incluem um ou mais meios particulares, temperatura, conteúdo de oxigênio, conteúdo de dióxido de carbono, tempo, agentes, por exemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, íons e/ou fatores estimulantes, tais como citocinas, quimiocinas, antígenos, parceiros de ligação, proteínas de fusão, receptores solúveis recombinantes e quaisquer outros agentes projetados para ativar as células.

[00167] Em algumas modalidades, as células ou composições são avaliadas e/ou ajustadas durante as etapas de incubação. Por exemplo, a avaliação e/ou ajuste pode ser em qualquer momento subsequente ao início da incubação ou cultura, como em um momento durante a incubação. A avaliação pode incluir a realização de uma ou mais medições de uma composição ou vaso que contém as células, como avaliar as células quanto à taxa de proliferação, grau de sobrevivência, fenótipo, por exemplo, expressão de um ou mais marcadores de superfície ou intracelulares, tais como proteínas ou polinucleotídeos e/ou avaliar a composição ou vaso quanto à temperatura, componente(s) do meio, conteúdo de oxigênio ou dióxido de carbono e/ou presença ou ausência ou quantidade ou quantidade relativa de um ou mais fatores, agentes, componentes e/ou tipos de células, incluindo subtipos. A avaliação também pode incluir a avaliação de um indicador ou preditor de um resultado tóxico, como o uso de um in vitro ou ex vivo, conforme descrito aqui.

[00168] Em alguns aspectos, a avaliação é realizada de maneira automatizada, por exemplo, usando um dispositivo conforme descrito aqui e/ou é definida com antecedência para ser realizada em determinados momentos da incubação. Em alguns aspectos, o resultado da avaliação indica que um ajuste deve ser feito.

[00169] O ajuste pode incluir o ajuste de qualquer fator ou parâmetro de cultura celular, tal como temperatura, duração (tempo) para o qual a incubação ou uma etapa da mesma será realizada (duração da incubação), reposição, adição e/ou remoção de um ou mais componentes na composição a ser incubada, por exemplo, meio ou tampão ou componentes dos mesmos, agentes, por exemplo, nutrientes, aminoácidos, antibióticos, íons e/ou fatores estimuladores, como citocinas, quimiocinas, antígenos, parceiros de ligação, proteínas de fusão, receptores solúveis recombinantes ou células ou tipos de células ou populações de células. Em alguns aspectos, a remoção ou adição de vários componentes ou outro ajuste é realizada de maneira automatizada, por exemplo, usando um dispositivo ou sistema, conforme descrito aqui. Em algumas modalidades, o sistema é programado de modo que um ajuste seja iniciado automaticamente com base em uma determinada leitura de uma avaliação intermediária. Por exemplo, em alguns casos, um sistema ou dispositivo é programado para executar uma ou mais avaliações em um determinado momento; o sistema ou dispositivo nesses casos pode ser programado adicionalmente, de modo que um resultado específico de tal avaliação, tal como uma proporção específica de um tipo de célula para outro, inicie um ajuste específico, tal como a adição de um ou mais tipos de células.

[00170] Em alguns aspectos, o ajuste é realizado pela adição ou remoção de uma maneira que não perturbe um ambiente fechado que contém as células e composições, tais como através de válvulas de entrada e/ou remoção, projetadas para adicionar ou remover componentes enquanto mantém a esterilidade, tal como em um ou mais dispositivos ou sistemas, como descritos aqui. Vários ajustes de condições estimulantes para favorecer respostas e/ou resultados em tipos de células específicos estão descritos, por exemplo, na Patente US No. 8.617.884 e na Publicação de Pedido de Patente No: US20030235908 A1.

[00171] Em algumas modalidades, as células são incubadas por ou por cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ou 14 dias ou por ou por cerca de 1, 2, 3, 4 ou mais semanas, no total ou antes da manipulação. Em alguns exemplos, a incubação é realizada por mais do que ou cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 dias.

[00172] Em alguns aspectos, a incubação é realizada de acordo com técnicas tais como aquelas descritas na Patente US 6.040, 177 de Riddell et al., Klebanoff et al. ( 2012) J Immunother. 35(9): 651-660, Terakura et al. ( 2012) Blood.1: 72-82, e/ou Wang et al. ( 2012) J Immunother. 35(9):689-701.

[00173] Em algumas modalidades, as condições estimuladoras incluem a adição de células alimentadoras, como células mononucleares do sangue periférico (PBMC) não divididas (por exemplo, tal que a população resultante de células contenha pelo menos cerca de 5, 10, 20 ou 40 ou mais células PBMC alimentadoras para cada linfócito T na população inicial a ser expandida); e incubar a cultura (por exemplo, por um tempo suficiente para expandir o número de células T). Em alguns aspectos, as células alimentadoras não divididas podem compreender células PBMC alimentadoras irradiadas por gama. Em algumas modalidades, PBMC é irradiada com raios gama na faixa de cerca de 3000 a 3600 rads para impedir a divisão celular. Em alguns aspectos, as células alimentadoras são adicionadas ao meio de cultura antes da adição das populações de células T.

[00174] Em algumas modalidades, as condições estimulantes incluem temperatura adequada para o crescimento de linfócitos T humanos, por exemplo, pelo menos cerca de 25 graus Celsius, geralmente pelo menos cerca de 30 graus e geralmente a ou cerca de 37 graus Celsius. Opcionalmente, a incubação pode ainda compreender a adição de células linfoblastoides transformadas por EBV não divididas (LCL) como células alimentadoras. LCL pode ser irradiada com raios gama na faixa de cerca de 6000 a 10.000 rads. As células LCL alimentadoras em alguns aspectos são fornecidas em qualquer quantidade adequada, tal como uma proporção de células LCL alimentadoras para linfócitos T iniciais de pelo menos cerca de 10:1.

[00175] Em modalidades, as células T específicas para o antígeno, tais como as células T CD4+ e/ou CD8+ específicas para o antígeno, são obtidas pela estimulação de linfócitos T naives ou específicos para o antígeno com antígeno. Por exemplo, linhagens celulares ou clones de células T específicas para o antígeno podem ser geradas para antígenos do citomegalovírus pelo isolamento de células T de indivíduos infectados e estimulando as células in vitro com o mesmo antígeno.

[00176] A incubação e/ou manipulação podem ser realizadas em um recipiente de cultura, tal como uma unidade, câmara, poço, coluna, tubo, conjunto de tubos, válvula, frasco, disco de cultura, bolsa ou outro recipiente para cultura ou cultivo de células.

[00177] Também são fornecidas composições iniciadoras de cultura usadas no método, tais como aquelas que contêm as células T, por exemplo, células T primárias humanas, condições estimulantes, por exemplo, os vários agentes em concentrações/ proporções designadas para a ativação ou expansão preferencial de células T não naives.

[00178] Em algumas modalidades, onde as células são manipuladas, por exemplo, para introduzir um receptor de antígeno geneticamente modificado, a incubação na presença de um ou mais agentes estimulantes continua durante a fase de manipulação.

[00179] Proporções de esferas para células de 1:500 a 500:1 e quaisquer valores inteiros entre eles podem ser usadas para estimular células T ou outras células alvo. Em alguns casos, a proporção de esferas para células pode depender do tamanho da partícula em relação à célula alvo. Por exemplo, esferas de tamanho pequeno podem ligar apenas algumas células, enquanto esferas maiores podem ligar várias. Em certas modalidades, a proporção de células para partículas varia de 1:100 a 100:1 e qualquer valor inteiro entre estes e em outras modalidades a proporção compreende 1:50 a 50:1 e quaisquer valores inteiros entre estes. Em outra modalidade, a proporção de células para partículas varia de 1:9 a 9:1 e quaisquer valores inteiros entre estes também podem ser usados para estimular células T. A proporção de partículas acopladas a anti-CD3 e anti-CD28 e células T que resultam em estimulação de células T pode variar conforme descrito aqui, no entanto, certos valores preferidos incluem pelo menos 1:150, 1:125, 1:100, 1:75, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1: 9, 1: 8, 1: 7, 1: 6, 1: 5, 1: 4, 1: 3, 1: 2,5, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1 e 15:1, com uma proporção preferida sendo pelo menos 1:1 esferas para célula T. Em uma modalidade particular, a proporção preferida de esferas para células é 3:1. Em alguns casos, a proporção de esferas para células é de 1:3.

[00180] Em modalidades adicionais, a proporção de partículas para células pode variar dependendo do dia da estimulação. Por exemplo, em uma modalidade, a proporção de partículas para células é de 1:1 a 10:1 no primeiro dia e partículas adicionais são adicionadas às células todos os dias ou em dias alternados por até 10 dias, nas proporções finais de 1:1 a 1:10 (com base na contagem de células no dia da adição). Em outra modalidade, a proporção de partículas para células é de pelo menos cerca de 1:2,5 no primeiro dia e partículas adicionais são adicionadas às células no dia 5 em cerca de 1:10, 1:25, 1:50 ou 1:100, no dia 7 em 1:10, 1:25, 1:50 ou 1:100 e no dia 9 em 1:10, 1:25, 1:50 ou 1:100. Em uma modalidade particular, a proporção de partículas para células é de 1:1 no primeiro dia de estimulação e ajustada para 1:5 no terceiro e quinto dias de estimulação. Em outra modalidade, as partículas são adicionadas diariamente ou em dias alternados até uma proporção final de 1:1 no primeiro dia e 1:5 no terceiro e quinto dias de estimulação. Em outra modalidade, a proporção de partículas para células é de 2:1 no primeiro dia de estimulação e ajustada para 1:10 no terceiro e quinto dias de estimulação. Em outra modalidade, as partículas são adicionadas diariamente ou em dias alternados até uma proporção final de 1:1 no primeiro dia e 1:10 no terceiro e quinto dias de estimulação. Em alguns aspectos, uma variedade de outras proporções pode ser adequada para uso na presente invenção. Em particular, as proporções variarão dependendo do tamanho das partículas e do tamanho e tipo de célula.

[00181] Um aspecto da presente invenção se refere à observação de que o uso de diferentes proporções de esferas (por exemplo, reagente anti-CD3/anti-CD28) para células pode levar a resultados diferentes em relação à expansão de células T específicas para o antígeno. Em particular, as proporções de esfera para célula podem ser variadas para expandir ou deletar seletivamente células T específicas ou com experiência nos antígenos (tal como de memória ou efetoras ou ativadas), em oposição a outros tipos de células, tal como células T naives ou do tipo naive. Em uma modalidade, a proporção específica de esfera para célula usada exclui seletivamente células T específicas para o antígeno. Especificamente, as proporções de esfera para célula, tal como proporções de esfera para célula em ou maior que 1:1 e/ou altas proporções de esfera para célula, tais como pelo menos ou cerca de

3:1, 5:1, 10:1, 15:1, 20:1, 25:1, 30:1, 35:1, 40:1, 45:1, 50:1 e superior, podem induzir a exclusão de células T específicas para o antígeno. Sem estar limitado pela teoria, acredita-se que as células T específicas para o antígeno sejam sensibilizadas para estimulação adicional. Assim, em algumas modalidades, a força do sinal de ativação liberada uma célula T através do reagente ou composição pode impactar na expansão e/ou morte de um ou mais subgrupos específicos de células T. Em alguns aspectos, a expansão seletiva das células T de memória (células T específicas para o antígeno) pode ocorrer com sinais através de TCR e/ou correceptores que são fracos em comparação com outros; enquanto que em algumas modalidades, a exclusão seletiva de células T de memória e/ou outras células T com experiência no antígeno, enquanto poupa células naives, pode ocorrer após a incubação com reagentes que liberam sinais que são relativamente mais fortes. A quantidade de receptores CD3/TCR (e CD28) que estão ligados por ligantes, entre outros fatores, pode, em alguns aspectos, determinar ou contribuir para a determinação da intensidade do sinal. Assim, a estimulação com altas proporções de esfera/ célula em alguns contextos pode fornecer uma alta concentração de anticorpo estimulante (ou seja, sinal "forte"), levando a superestimulação de células T específicas para o antígeno, causando a morte, por apoptose ou outros mecanismos. Assim, a este respeito, as composições de esferas aqui descritas podem, em alguns contextos e/ou em relação a certas composições, funcionar tal como uma composição pró-apoptótica. Em alguns aspectos, o sinal não deve ser muito forte para matar também as células T semelhantes às células T naives, tal como também pela morte celular induzida pela ativação. Em algumas modalidades, a proporção de um reagente de esfera estimulador, por exemplo, reagente anti-CD3/anti- CD28, é menor que 10:1.

[00182] Além disso, a este respeito, em certas modalidades, tal reagente ou composição usado como condições pró-apoptóticas, por exemplo, com relação a certos tipos de células (por exemplo, uma superfície que tenha acoplada a ela um agente que estimule uma porção da superfície celular, tal como as composições de esferas descritas aqui) é usada para expandir a população restante de células para uso em qualquer variedade de configurações imunoterapêuticas tal como aqui descritas. Em uma modalidade adicional, a proporção específica de esfera para célula usada expande seletivamente células T semelhantes às células T naives. A proporção particular pode ser ajustada para gerar a expansão desejada de células T em particular ou a exclusão de células T em particular. Portanto, as composições e métodos aqui descritos podem ser utilizados para expandir populações específicas de células T na população da composição de entrada ou excluir populações específicas de células T na população da composição de entrada, para uso em qualquer variedade de configurações imunoterapêuticas aqui descritas.

[00183] Além disso, a este respeito, em certas modalidades, o mesmo reagente, substância ou composição usada como uma composição pró-apoptótica, tal como em relação a certos tipos de células (por exemplo, uma superfície que tem um agente acoplado a ela que estimula uma porção da superfície celular, tal como as composições de esferas descritas aqui) é usada para expandir a população restante de células para uso em qualquer variedade de configurações imunoterapêuticas, como aqui descrito. O uso de proporções mais baixas de esfera para célula fornece um sinal de estimulação para células T específicas para o antígeno que não estimulam demais, mas induzem a rápida proliferação dessas células. Em uma modalidade adicional, a proporção específica de esfera para célula usada expande seletivamente células T específicas para o antígeno. Em alguns aspectos, qualquer proporção pode ser usada desde que ocorra a expansão ou a exclusão desejada. Portanto, as composições e métodos aqui descritos podem ser utilizados para expandir populações específicas de células T ou excluir populações específicas de células T, para uso em qualquer variedade de configurações imunoterapêuticas aqui descritas.

[00184] Utilizando certas metodologias, pode ser vantajoso manter a estimulação a longo prazo de uma população de células T após a ativação e estimulação iniciais, separando as células T do estímulo após um período de 2 a cerca de 14 dias. A taxa de proliferação de células T é monitorada periodicamente (por exemplo, diariamente), por exemplo, examinando o tamanho ou medindo o volume das células T, tal como com um Contador Coulter. Nesse sentido, uma célula T em repouso tem um diâmetro médio de cerca de 6,8 mícra e, após a ativação e estimulação iniciais, na presença do ligante estimulante, o diâmetro médio da célula T aumentará para mais de 12 mícra no dia 4 e começará a diminuir por volta do dia 6. Quando o diâmetro médio das células T diminui para aproximadamente 8 micra, as células T podem ser reativadas e reestimuladas para induzir uma proliferação adicional das células T. Alternativamente, a taxa de proliferação de células T e o tempo para estimulação de células T podem ser monitorados através do teste da presença de moléculas de superfície celular, tal como CD154, CD54, CD25, CD137, CD134, que são induzidas em células T ativadas.

[00185] Para induzir o estímulo a longo prazo de uma população de células T CD4+ e/ou CD8+, pode ser necessário reativar e reestimular as células T com um agente estimulador, tal como um anticorpo anti- CD3 e um anticorpo anti-CD28 (por exemplo, B-T3, XR-CD28 (Diaclone, Besancon, França)) várias vezes para produzir uma população de células CD4+ ou CD8+ aumentada em número de cerca de 10 para cerca de 1.000 vezes a população original de células T. Por exemplo, em uma modalidade da presente invenção, as células T são estimuladas tal como descrito por 2 a 3 vezes. Em outras modalidades, as células T são estimuladas tal como descrito por 4 ou 5 vezes. Usando a presente metodologia, é possível obter números de células T de cerca de 100 a cerca de 100.000 vezes que tiveram a policlonalidade aumentada em comparação com antes da estimulação. Além disso, as células T expandidas pelo método da presente invenção secretam níveis substanciais de citocinas (por exemplo, IL-2, IFN-γ, IL-4, GM-CSF e TNF-α) nos sobrenadantes da cultura. Por exemplo, em comparação com a estimulação com IL-2, as células T CD4+ expandidas pelo uso de coestimulação anti-CD3 e anti-CD28 secretam altos níveis de GM-CSF e TNF-α no meio de cultura. Estas citocinas podem ser purificadas a partir dos sobrenadantes da cultura ou os sobrenadantes podem ser utilizados diretamente para manter as células em cultura. Do mesmo modo, as células T expandidas pelo método da presente invenção, juntamente com o sobrenadante da cultura e citocinas, podem ser administradas para suportar o crescimento de células in vivo.

[00186] Em uma modalidade, a estimulação de células T é realizada, por exemplo, com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 coimobilizados em esferas (3 x 28 esferas), por um período de tempo suficiente para que as células retornem a um estado de repouso (proliferação baixa ou inexistente) (aproximadamente 8-14 dias após a estimulação inicial). O sinal de estimulação é então removido das células e as células são lavadas e infundidas de volta no paciente. As células no final da fase de estimulação são tornadas "super induzíveis" pelos métodos da presente invenção, tal como demonstrado por sua capacidade de responder a antígenos e a capacidade dessas células de demonstrar um fenótipo semelhante à memória, tal como evidenciado pelos exemplos. Consequentemente, após a re-estimulação exogenamente ou por um antígeno in vivo após a infusão, as células T ativadas demonstram uma resposta robusta caracterizada por propriedades fenotípicas únicas, tal como expressão sustentada de CD154, aumento da produção de citocinas, etc.

[00187] Em outras modalidades da presente invenção, as células, tal como as células T, são combinadas com esferas revestidas ou conjugadas com agente, as esferas e as células são subsequentemente separadas e, em seguida, as células são cultivadas. Em uma modalidade alternativa, antes da cultura, as esferas revestidas ou conjugadas com agente e as células não são separadas, mas são cultivadas juntas. Em uma modalidade adicional, as esferas e as células são primeiro concentradas pela aplicação de uma força, resultando na ligação da porção da superfície celular, induzindo assim a estimulação celular e/ou polarização do sinal de ativação.

[00188] A título de exemplo, quando as células T são a população de células alvo, as porções da superfície celular podem ser ligadas permitindo que esferas paramagnéticas às quais estão ligados os anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 (3 x 28 esferas) contatem as células T preparadas. Em uma modalidade, as células (por exemplo, 104 a 109 células T) e esferas (por exemplo, esferas paramagnéticas DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T na proporção de 1:1) são combinadas em um tampão, preferencialmente PBS (sem cátions divalentes tal como cálcio e magnésio). Em alguns aspectos, qualquer concentração celular pode ser usada. Por exemplo, a célula alvo pode ser muito rara na amostra e compreender apenas 0,01% da amostra ou a amostra inteira (isto é, 100%) pode compreender a célula alvo de interesse. Por conseguinte, qualquer número de células está dentro do contexto da presente invenção. Em certas modalidades, pode ser desejável diminuir significativamente o volume no qual partículas e células são misturadas (isto é, aumentar a concentração de células), para garantir o contato máximo de células e partículas. Por exemplo, em uma modalidade, é usada uma concentração de cerca de 2 bilhões de células/mL. Em outra modalidade, é usado mais de 100 milhões de células/mL. Em uma modalidade adicional, é utilizada uma concentração de células de 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 50 milhões de células/mL. Em outra modalidade ainda, é utilizada uma concentração de células de 75, 80, 85, 90, 95 ou 100 milhões de células/mL. Em outras modalidades, podem ser usadas concentrações de 125 ou 150 milhões de células/mL. O uso de altas concentrações pode resultar em aumento do rendimento celular, ativação e expansão celular. Além disso, o uso de altas concentrações de células permite a captura mais eficiente de células que podem expressar fracamente antígenos alvo de interesse, tal como células T negativas para CD28. Tais populações de células podem ter valor terapêutico e pode ser desejável sua obtenção. Por exemplo, o uso de alta concentração de células permite a seleção mais eficiente de células T CD8+ que normalmente têm expressão mais fraca de CD28.

[00189] Em uma modalidade relacionada, pode ser desejável usar concentrações mais baixas de células. Ao diluir significativamente a mistura de células T e partículas, as interações entre partículas e células são minimizadas. Isso seleciona células que expressam grandes quantidades de antígenos desejados para serem ligadas às partículas. Por exemplo, as células T CD4+ expressam níveis mais altos de CD28 e são mais eficientemente capturadas e estimuladas do que as células T CD8+ em concentrações diluídas. Em uma modalidade, a concentração de células utilizada é de cerca de 5 x 106/ mL. Em outras modalidades, a concentração usada pode ser de cerca de 1 x 105/ mL a cerca de 1 x 106/ mL, e qualquer valor integral entre estes.

[00190] O tampão no qual as células estão suspensas pode ser qualquer um que seja apropriado para o tipo de célula específico. Ao utilizar certos tipos de células, o tampão pode conter outros componentes, por exemplo, 1 a 5% de soro, necessários para manter a integridade das células durante o processo. Em outra modalidade, as células e as esferas podem ser combinadas em meios de cultura de células. As células e as esferas podem ser misturadas, por exemplo, por rotação, agitação ou qualquer meio de mistura, por um período de tempo que varia de um minuto a várias horas. O recipiente de esferas e células é então concentrado por uma força, tal como a colocação em um campo magnético. O meio e as células não ligadas são removidas e as células ligadas às esferas ou a outra superfície são lavadas, por exemplo, por bombeamento através de uma bomba peristáltica e, em seguida, ressuspensas no meio apropriado para a cultura de células.

[00191] Em uma modalidade da presente invenção, a mistura pode ser cultivada por 30 minutos a várias horas (cerca de 3 horas) a cerca de 14 dias ou qualquer valor inteiro de hora ou minuto. Em outra modalidade, a mistura pode ser cultivada por 21 dias. Em uma modalidade da invenção, as esferas e as células T são cultivadas juntas por cerca de oito dias. Em outra modalidade, as esferas e as células T são cultivadas juntas por 2-3 dias. Tal como descrito acima, também podem ser desejados vários ciclos de estimulação, de modo que o tempo de cultura das células T possa ser de 60 dias ou mais. As condições apropriadas para a cultura de células T incluem um meio apropriado (por exemplo, Minimal Essential Media ou RPMI Media 1640 ou, X-vivo 15, (BioWhittaker)) que pode conter fatores necessários para a proliferação e viabilidade, incluindo soro (por exemplo, bovino ou humano fetal). soro) ou interleucina-2 (IL-2), insulina ou quaisquer outros aditivos para o crescimento das células. O meio pode incluir RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15 e X-Vivo 20, com aminoácidos e vitaminas adicionados, sem soro ou suplementados com uma quantidade adequada soro (ou plasma) ou um conjunto definido de hormônios e/ou uma quantidade de citocinas suficientes para o crescimento e expansão das células T. Antibióticos, por exemplo,

penicilina e estreptomicina, são incluídos apenas em culturas experimentais, não em culturas de células que devem ser infundidas em um indivíduo. As células alvo são mantidas sob condições necessárias para suportar o crescimento, por exemplo, uma temperatura apropriada (por exemplo, 37°C) e atmosfera (por exemplo, ar mais CO2 5%).

[00192] Em uma modalidade da presente invenção, as proporções esfera:célula podem ser adaptadas para obter um fenótipo de célula T desejado. Em uma modalidade particular, as proporções esfera:célula podem ser variadas para expandir ou excluir seletivamente células T específicas para o antígeno (memória). Em uma modalidade, a proporção de esfera:célula específica usada exclui seletivamente células T específicas para o antígeno. Em outra modalidade, a proporção específica de esfera:célula usada expande seletivamente células T específicas para o antígeno. Em alguns aspectos, qualquer proporção pode ser usada desde que ocorra a expansão ou seleção desejada de células T específicas para o antígeno. Portanto, as composições e métodos aqui descritos podem ser utilizados para expandir populações específicas de células T ou excluir populações específicas de células T, para uso em qualquer variedade de configurações imunoterapêuticas aqui descritas.

[00193] Em outra modalidade, o tempo de exposição a agentes estimuladores, tais tal como esferas revestidas com anti-CD3/anti-CD28 (isto é, 3x28), pode ser modificado ou adaptado de modo a obter um fenótipo de célula T desejado. Alternativamente, uma população desejada de células T pode ser selecionada usando qualquer número de técnicas de seleção, antes da estimulação. Pode-se desejar uma população maior de células T auxiliares (TH), tipicamente CD4+, em oposição às células T CD8+ citotóxicas ou reguladoras, porque uma expansão das células TH pode melhorar ou restaurar a responsividade imunológica global. Enquanto muitas respostas imunes específicas são mediadas por células T CD8+ específicas para o antígeno, que podem lisar ou matar diretamente as células-alvo, a maioria das respostas imunes requer a ajuda de células T CD4+, que expressam importantes moléculas imunorreguladoras, tal como GM-CSF, CD40L e IL-2, por exemplo. Onde a ajuda mediada por CD4 é preferida, um método, tal como o descrito aqui, que preserva ou melhora a proporção entre CD4: CD8 pode ser de benefício significativo. Números maiores de células T CD4+ podem aumentar a quantidade de CD40L expresso em células introduzidas nos pacientes, potencialmente melhorando a visibilidade da célula alvo (função APC aprimorada). Efeitos semelhantes podem ser observados aumentando o número de células infundidas que expressam GM-CSF ou IL-2, todas expressas predominantemente por células T CD4+. Da mesma forma, pode ser desejável, em certas aplicações, utilizar uma população de células T reguladoras (por exemplo, Autoimmun Rev. 2002 Agosto; 1 (4):190-7; Curr Opin Immunol. 2002 Dezembro; 14 (6): 771-8) que podem ser geradas e expandidas usando os métodos aqui descritos. Alternativamente, em situações nas quais é necessário menos auxílio de CD4 e números aumentados de células T CD8+ é desejável, as abordagens XCELLERATE™ aqui descritas também podem ser utilizadas, por exemplo, pré-seleção de células CD8+ antes da estimulação e/ou cultura. Tais situações podem existir onde são preferidos níveis aumentados de IFN-γ ou citólise aumentada de uma célula-alvo. Pode- se também modificar o tempo e o tipo de exposição a agentes estimuladores para expandir as células T com um repertório de TCR desejado, por exemplo, expressar os genes da família Vβ desejados.

[00194] Para efetuar o isolamento de diferentes populações de células T, os tempos de exposição às partículas podem variar. Por exemplo, em uma modalidade preferida, as células T são isoladas por incubação com 3 x28 esferas, tal como DYNABEADS® M-450, por um período de tempo suficiente para a seleção positiva das células T desejadas. Em uma modalidade, o período de tempo é de cerca de 30 minutos. Em uma modalidade adicional, o período de tempo é de pelo menos 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 horas. Em ainda outra modalidade preferida, o período de tempo é de 10 a 24 horas ou mais. Em uma modalidade preferida, o período de incubação é ou é de cerca de 24 horas. Para o isolamento de células T de pacientes com câncer, o uso de tempos de incubação mais longos, tal como pelo menos ou pelo menos cerca de 24 horas, pode aumentar o rendimento celular.

[00195] Em certas modalidades, o tempo total de estimulação e/ou expansão pode estar entre 2 e 15 dias, entre 2 e 12 dias, entre 2 e 12 dias, entre 2 e 8 dias, entre 2 e 6 dias, entre 2 e 6 dias, entre 2 e 4 dias, entre 4 e 12 dias, entre 4 e 10 dias, entre 4 e 8 dias, entre 4 e 6 dias, entre 6 e 12 dias, entre 6 e 10 dias, entre 6 e 8 dias, entre 6 e 8 dias, entre 8 e 12 dias, entre 8 e 10 dias ou entre 10 e 12 dias, todos os intervalos incluídos. Em algumas modalidades, as células são incubadas e/ou incubadas com um reagente estimulante (por exemplo, uma partícula tal como aqui descrita) por pelo menos ou pelo menos cerca de 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias, 12 dias, 13 dias, 14 dias ou mais de 14 dias. Quando a estimulação de células T é realizada por períodos mais curtos, a população de células T pode não aumentar em número, pode não aumentar em número tão dramaticamente, pode diminuir em número ou pode permanecer a mesma em número, mas a população fornecerá células T ativadas mais robustas e saudáveis que possam continuar a proliferar in vivo e/ou se assemelhar mais ao pool de células T efetoras naturais. Por exemplo, quando a estimulação de células T é realizada por períodos mais curtos, a população de células T pode compreender um percentual e/ou proporção maior de células T naives ou do tipo naive ou células T manipuladas, em comparação com um processo paralelo em que a estimulação de células T é realizada por um período de tempo mais longo. Em algumas modalidades, um período de tempo mais curto pode ser caracterizado por um tempo total de incubação, em algumas modalidades um tempo total de incubação com um agente estimulatório, menor do que ou menor do que cerca de 6 dias, menor do que ou menor do que cerca de 5 dias, menor do que ou menor do que cerca de 4 dias, menor do que ou menor do que cerca de 3 dias ou menor do que ou menor do que cerca de 2 dias. Tal como a disponibilidade da ajuda de células T é frequentemente o fator limitante nas respostas de anticorpos a antígenos proteicos, a capacidade de expandir ou infundir seletivamente uma população rica em células T CD4+ em um indivíduo é extremamente benéfica. Outros benefícios de tais populações enriquecidas são facilmente aparentes, já que as células T auxiliares ativadas que reconhecem antígenos apresentados pelos linfócitos B liberam dois tipos de estímulos, contato físico e produção de citocinas, que resultam na proliferação e diferenciação de células B.

[00196] Em alguns casos, as condições estimulantes não compreendem componentes ou agentes de cultura que são suplementados para preservar subgrupos específicos de células T, por exemplo, células T semelhantes às células T não naives. Portanto, em alguns casos, a remoção de componentes ou agentes da cultura das condições estimulantes pode contribuir para a eliminação de células T semelhantes às células T não naives. Em algumas modalidades, as condições estimulantes não incluem agentes, tal como N-acetilcisteína, que podem ser usados para modular e/ou ajustar a intensidade da sinalização de TCR/CD3. Em alguns aspectos, esses agentes são removidos ou reduzidos em quantidades/proporções para aumentar a força do sinal de ativação. Em alguns aspectos, a condição estimulatória é realizada, ou é adicionalmente realizada, pela exclusão ou redução da concentração de reagentes de cultura que são conhecidos ou que provavelmente reduzem AICD e/ou que promovem a sobrevivência de células mais antigas, tal como células não naives . Em alguns casos, a condição estimulatória não inclui N-acetilcisteína ou inclui N- acetilcisteína em uma quantidade ou concentração reduzida. Em alguns casos, a condição estimulatória não inclui uma IL-7 recombinante e/ou IL-15 recombinante ou inclui uma quantidade ou concentração reduzida de IL-7 ou IL-15 recombinante. Em algumas modalidades, podem ser incluídos aditivos de cultura que auxiliam ou promovem adicionalmente a remoção de células não naives (por exemplo, toxinas ligadas a CD45RO). C. Composição Estimulada

[00197] Também é fornecida uma composição estimulada produzida pelos métodos de incubação (por exemplo, estimulação) descritos. Em algumas modalidades, as células da composição estimulada são manipuladas adicionalmente, por exemplo, para introduzir um receptor de antígeno geneticamente modificado, após a incubação da composição de entrada. Em algumas modalidades, o método inclui ainda a incubação na presença de um ou mais agentes estimulantes durante a fase de manipulação genética.

[00198] As células da composição estimulada que não sofreram apoptose usando os métodos de incubação (por exemplo, estimulação) aqui descritos, podem aumentar a policlonalidade da dita população remanescente de células T, como medida pela amplitude da resposta da população a um determinado antígeno. A restauração ou aumento da policlonalidade pode ser medida determinando a amplitude da resposta a um antígeno particular de interesse, por exemplo, medindo o número de diferentes epítopos reconhecidos pelas células específicas para o antígeno. Isto pode ser realizado utilizando técnicas padronizadas para gerar e clonar células T específicas para o antígeno in vitro.

[00199] Em algumas modalidades dos métodos aqui fornecidos, as condições de cultura induzem preferencialmente a expansão, proliferação e/ou sobrevivência de células T semelhantes às células T não naives em comparação com as células T semelhantes às células T naives. Expansão, proliferação e/ou sobrevivência preferenciais de um primeiro tipo ou população de células em comparação com um segundo tipo ou população de células significa que a expansão, proliferação e/ou sobrevivência relativa é maior para o primeiro tipo ou população do que para o segundo. Isso pode incluir um cenário em que o percentual do primeiro tipo de célula ou população expandida, proliferada e/ou sobrevivente seja maior e/ou que o grau (por exemplo, grau geral ou médio entre as células da população ou tipo) no qual as células são expandidas, proliferadas e/ou sobrevividas é maior para a primeira população ou tipo do que para a segunda.

[00200] Em algumas modalidades, a expansão, proliferação e/ou sobrevida preferencial é expressa pela comparação do percentual de células semelhantes às células naives na composição de entrada com o percentual de células manipuladas na composição estimulada que são derivadas de células semelhantes às células naives na composição original de entrada. Em alguns exemplos, o percentual de células manipuladas na composição estimulada que são derivadas de células semelhantes às células naives na composição de entrada original são geralmente maiores que a anterior nas condições de simulação aqui descritas. Por exemplo, em uma modalidade, o percentual de células na composição estimulada que são derivadas de células semelhantes às células naives na composição de entrada original é maior que o percentual de células naives na composição de iniciação de cultura. Em um aspecto, a composição de entrada (ou as células T dela) contém cerca de 70% de células T semelhantes às células T naives e 30% de células T semelhantes às células T não naives, enquanto que mais do que 50%, por exemplo, pelo menos 70% das células manipuladas na composição estimulada resultante são derivadas de células semelhantes às células naives na composição de entrada. Em alguns casos, o uso de outras condições, tais como a estimulação com agentes que induzem um sinal forte através do complexo TCR, resultaria em menos do que 50%, por exemplo, cerca de 5 a 10% das células na composição estimulada sendo de origem do tipo não naive. Em algumas modalidades, as condições de simulação induzem um sinal forte que induz a morte celular induzida por ativação em células T semelhantes às células T não naives da composição de entrada.

[00201] Em algumas modalidades, o percentual de células T semelhantes às células T naives ou células derivadas das células T semelhantes às células T naives da composição de entrada na composição estimulada é aumentado em mais do que ou mais do que cerca de 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes em comparação com a composição de entrada. Em alguns casos, a proporção de células derivadas das células T semelhantes às células T naives da composição de entrada em comparação com células derivadas das células T semelhantes às células T não naives da composição de entrada ou a proporção de células T semelhantes às células T naives em comparação com as células T semelhantes às células T não naives na composição estimulada aumentam mais ou mais que cerca de 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes em comparação com a proporção de células T semelhantes às células T naives em comparação com células T semelhantes às células T não naives na composição de entrada. Em algumas modalidades, a composição estimulada compreende mais de 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% das células que são derivadas a partir de células T semelhantes às células T naives da composição de entrada.

[00202] Em algumas modalidades de uso do método para estimular células T aqui descritas, das células na composição de entrada, um percentual maior de células T semelhantes às células T naives, em comparação com as células do tipo não naive, são induzidas a proliferar e/ou se tornarem ativadas. Em alguns aspectos, a composição estimulada que resulta dos métodos de estimulação descritos aqui contém menos de 10% de células derivadas de células T semelhantes às células T não naives. Em alguns casos, a composição estimulada contém menos do que 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% de células derivadas de células T não naives . Em algumas modalidades, um percentual maior de células T que eram do tipo naive na composição de entrada, em comparação com o percentual de células T que eram do tipo não naive na composição de entrada, estão se dividindo no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 após o início da dita incubação. Em alguns casos, as condições de estimulação induzem a morte celular. Em exemplos particulares, as condições de estimulação do método induzem a ativação de células T semelhantes às células T não naives, induzindo assim a morte celular induzida pela ativação (AICD).

[00203] Em algumas modalidades, o método inclui condições estimulantes que são capazes de induzir a proliferação de um percentual maior de células da população de células T semelhantes às células T naives, em comparação com as células T semelhantes às células T não naives, no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 após o início da incubação sob as condições.

[00204] Em algumas modalidades, as condições estimulantes produzem uma composição estimulada, em que as condições estimulantes induzem preferencialmente a expansão de células T semelhantes às células T naives, tal que uma quantidade alvo de células

T da composição estimulada derivada de células T semelhantes às células T naives da composição de entrada seja produzida. Em algumas modalidades, a composição estimulada é ainda ajustada para alcançar uma proporção preferida de células T CD4:CD8 c. Em alguns casos, populações celulares específicas podem ser removidas da composição estimulada para atingir uma proporção preferida de CD4:CD8.

[00205] Em algumas modalidades, as condições estimulantes, por exemplo, sob as quais as composições de entrada são incubadas, preferencialmente induzem expansão, proliferação e/ou sobrevivência de células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo delas em comparação com células T semelhantes às células T não naives ou um subgrupo delas. Em alguns aspectos, as condições estimulantes são ativar fortemente células T semelhantes às células T não naives da composição de entrada, ativando assim a morte celular particularmente em células T semelhantes às células T não naives da composição de entrada. Em alguns aspectos, isso favorece preferencialmente a sobrevivência de células T semelhantes às células T naives. Em alguns aspectos, tais condições estimulantes levam a um nível reduzido de toxicidade e/ou resultados associados à citotoxicidade ou sintomas depois da administração a indivíduos das células e composições produzidas pelos métodos.

[00206] Se uma resposta particular foi induzida ou é preferivelmente induzida em uma população sobre outra, pode ser medida por uma variedade de métodos. Por exemplo, se uma célula é induzida a entrar no ciclo celular, isso pode ser medido por métodos baseados em citometria de fluxo, incluindo aqueles que envolvem o uso de corantes e outros agentes, tais como CFSE e outros agentes interquelantes para avaliar a divisão celular seguida pela avaliação por citometria de fluxo, avaliação da incorporação de timidina marcada com trítio (H3) e agentes similares e/ou contagem de células. As comparações podem ser feitas avaliando várias populações de teste puras, tais como comparando populações de células T naives e não naives sob condições particulares, separadamente. A ativação pode ser medida, por exemplo, pela secreção de várias citocinas e/ou regulação positiva ou expressão de vários marcadores de ativação, incluindo CD25, CD69 e/ou tamanho da célula (por exemplo, dispersão direta conforme medido por citometria de fluxo). A sobrevivência e/ou apoptose podem ser avaliadas por vários métodos, incluindo métodos de citometria de fluxo, incorporação de vários corantes, incluindo iodeto de propídio, e coloração com agentes como a coloração com Anexina V e agentes similares.

[00207] Em algumas modalidades, o percentual de células T semelhantes às células T naives na composição de entrada é menor do que o percentual de células T na composição estimulada derivada de células T semelhantes às células T naives na composição de entrada. Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos produzem um percentual maior de células introduzidas com o ácido nucleico são ou são derivadas da proliferação de células T semelhantes às células T naives na composição de entrada, em comparação com células T semelhantes às células T não naives na composição de entrada. Vários ajustes de condições estimulantes para favorecer respostas e/ou resultados em tipos de células específicos estão descritos, por exemplo, na Patente US Número 8.617.884 e na Publicação de Pedido de Patente US No.: US 20030235908 A1.

[00208] Em algumas modalidades, a composição estimulada contém células que expressam ou são derivadas de células que expressam marcadores particulares de células T semelhantes às células T naives. Por exemplo, a composição estimulada produzida pelos métodos fornecidos é derivada de populações de células com superfície positiva para um marcador de ativação de células T selecionado do grupo que consiste em CD27, CD28, CD45RA e CCR7. Em alguns casos, a composição estimulada produzida pelos métodos fornecidos é derivada de populações de células que são negativas para um marcador de ativação de células T, como CD62L. Em alguns aspectos, as células da composição estimulada são ou são derivadas de células com superfície negativa para CD56 e/ou CD45RO. Em algumas modalidades particulares, a composição estimulada produzida pelos métodos fornecidos é derivada de populações de células que são CD27+, CD45RA+, CD45RO- e CCR7+. Em alguns casos, as células da composição estimulada são ou são derivadas de células negativas para expressão intracelular de uma citocina como IL-2, IFN-γ, IL-4 e/ou IL-

10. Em alguns exemplos adicionais, as células da composição estimulada são ou são derivadas de células que são negativas para a expressão dos marcadores de CD25 e/ou perforina. Em alguns casos, as células da composição estimulada são ou são derivadas de células que são CD95lo.

[00209] Em alguns casos, a composição estimulada contém células que são derivadas de pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% das células T com superfície positiva para um marcador de ativação de células T tais como CD27, CD28, CD45RA e CCR7 e superfície negativa para CD62L. Em algumas modalidades, a composição estimulada contém células que são derivadas de pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% das células T que tem a superfície negativa para CD56 e/ou CD45RO. Em alguns aspectos, a composição estimulada contém células que são derivadas de pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% das células T que têm a superfície negativa para CD45RO e superfície celular positiva para CD27, CD45RA e CCR7. Em alguns exemplos, a composição estimulada contém células derivadas de pelo menos 40%, pelo menos

50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% das células T negativas para expressão intracelular de uma citocina como IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10. Em alguns aspectos, a composição estimulada contém células derivadas de pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% das células T negativas para expressão dos marcadores CD25 e/ou perforina. Em alguns casos, a composição estimulada contém células derivadas de pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 80% ou pelo menos 90% das células T que são CD95lo.

[00210] Em certas modalidades, a composição estimulada é mais policlonal ou multiclonal comparada com a composição de entrada. Em algumas modalidades, a composição estimulada é mais diversa em comparação com a composição de entrada. Em algumas modalidades, esse aumento na policlonalidade compreende uma mudança de mono para oligoclonalidade ou policlonalidade da população de células T, medida por um perfil espectral de Vβ, Va, Vy ou Vδ de pelo menos uma família de gene de Vβ, Va, Vy ou Vδ. A estimulação e ativação das células restantes que sobreviveram, expandiram e proliferaram usando os métodos fornecidos, podem aumentar a policlonalidade das ditas células T restantes da composição estimulada, conforme medido pela amplitude da resposta da população a um determinado antígeno. A restauração ou aumento da policlonalidade da composição estimulada pode ser medida determinando a amplitude da resposta a um antígeno particular de interesse, por exemplo, medindo o número de diferentes epítopos reconhecidos pelas células específicas para o antígeno. Isto pode ser realizado utilizando técnicas padrão para gerar e clonar células T específicas para o antígeno in vitro. II. MÉTODOS PARA MANIPULAR GENETICAMENTE AS CÉLULAS

[00211] Em algumas modalidades, o método inclui ainda a introdução de um receptor recombinante geneticamente modificado, por exemplo, um receptor quimérico, tal como receptor de antígeno quimérico (CAR), na composição estimulada de células T, gerando uma composição de saída que compreende células T que expressam o receptor recombinante geneticamente modificado. Em alguns casos, a incubação da composição de entrada sob condições estimulantes é realizada antes, durante e/ou subsequente à introdução de um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente modificado. Em alguns exemplos, a introdução é por transdução. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos produzem uma composição estimulada que pode ser uniformemente transduzida. Em alguns aspectos, o ácido nucleico contém um vetor viral. Em alguns casos, o vetor viral é um vetor retroviral. Em alguns exemplos, o vetor viral é um vetor lentiviral ou um vetor gamaretroviral. O método, em algumas modalidades, incluindo a introdução, é realizado in vitro ou ex vivo.

[00212] Assim, os métodos aqui fornecidos incluem uma ou mais etapas para a preparação de células para manipulação genética. Em certas modalidades, a uma ou mais etapas incluem isolar células de uma amostra biológica, estimular uma composição de entrada de células e preparar uma composição de células para serem geneticamente modificadas. Também são fornecidas populações de tais células, composições que contêm essas células e/ou enriquecidas com tais células, tal como nas quais células que expressam o receptor recombinante, por exemplo, receptor quimérico, compõem pelo menos 50, 60, 70, 80, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 por cento ou mais do total de células na composição ou células de um determinado tipo como células T ou células CD8+ ou CD4+. Entre as composições estão composições farmacêuticas e formulações para administração, tais como para terapia celular adotiva. Também são fornecidos métodos para manipulação, produção ou geração de tais células, métodos para administrar as células e composições a indivíduos, por exemplo, pacientes e métodos para detectar, selecionar, isolar ou separar tais células. Assim, são fornecidas células geneticamente modificadas que expressam os receptores recombinantes, por exemplo, CARs.

[00213] Em algumas modalidades, as células incluem um ou mais ácidos nucleicos introduzidos por manipulação genética e, assim, expressam produtos recombinantes ou geneticamente modificados de tais ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são heterólogos, isto é, normalmente não estão presentes em uma célula ou amostra obtida da célula, tal como uma obtida de outro organismo ou célula que, por exemplo, não é normalmente encontrada na célula que está sendo manipulada e/ou um organismo a partir do qual essa célula é derivada. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos não ocorrem naturalmente, tal como um ácido nucleico não encontrado na natureza, incluindo um que compreende combinações quiméricas de ácidos nucleicos que codificam vários domínios de vários tipos de células diferentes. A. Manipulação Genética

1. Receptores de Antígenos Recombinantes

[00214] Em algumas modalidades, são fornecidas células manipuladas, tais como células T, que expressam um CAR com especificidade para um antígeno particular (ou marcador ou ligante), tal como um antígeno expresso na superfície de um tipo de célula particular. Em algumas modalidades, o antígeno é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, é um carboidrato ou outra molécula. Em algumas modalidades, o antígeno é seletivamente expresso ou superexpresso nas células da doença ou condição, por exemplo, o tumor ou células patogênicas, em comparação com células ou tecidos normais ou não atingidos. Em outras modalidades, o antígeno é expresso nas células normais e/ou é expresso nas células manipuladas.

[00215] Em modalidades particulares, o receptor recombinante, tal como o receptor quimérico, contém uma região de sinalização intracelular, que inclui um domínio de sinalização citoplasmático (também chamado, alternativamente, de domínio de sinalização intracelular), tal como uma região citoplasmática (intracelular) capaz de induzir um sinal de ativação primário em uma célula T, por exemplo, um domínio de sinalização citoplasmático de um componente do receptor de célula T (TCR) (por exemplo, um domínio de sinalização citoplasmático de uma cadeia zeta de uma cadeia CD3-zeta (CD3ζ) ou uma variante funcional ou porção de sinalização) e/ou que compreende um motivo de ativação de imunoreceptor baseado em tirosina (ITAM).

[00216] Em algumas modalidades, o receptor quimérico contém ainda um domínio de ligação ao ligante extracelular que se liga especificamente a um antígeno do ligante (por exemplo, antígeno). Em algumas modalidades, o receptor quimérico é um CAR que contém um domínio de reconhecimento de antígeno extracelular que se liga especificamente a um antígeno. Em algumas modalidades, o ligante, tal como um antígeno, é uma proteína expressa na superfície das células. Em algumas modalidades, o CAR é um CAR semelhante a TCR e o antígeno é um antígeno peptídico processado, tal como um antígeno peptídico de uma proteína intracelular, que, tal como um TCR, é reconhecido na superfície celular no contexto de uma molécula de um complexo de histocompatibilidade principal (MHC).

[00217] Exemplos de receptores de antígeno, incluindo CARs e métodos para manipulação e introdução de tais receptores nas células, incluem aqueles descritos, por exemplo, nos números de publicação de pedidos de patente internacional WO2000/14257, WO2013/126726, WO2012/129514, WO2014031687, WO2013/166321, WO2013/071154, WO2013/123061; números de publicação de pedido de patente US2002131960, US2013287748, US20130149337, Patentes US Nos .: 6.451.995, 7.446.190, 8.252.592, 8.339.645,

8.398.282, 7.446.179, 6.410.319, 7.070.995, 7.265.209.435, 7.365.755,

7.365, 7.546, 7.354, 7.346, 7.354, 7.346, 7.346, 5.462, 7.346, 5.462,

7.346, 5.462, 7.346, 5.465, 7.346, 7.354, 7.346, 5.465, 7.346, 5.465,

7.346, 5.425 e o pedido de patente europeia número EP2537416 e/ou aqueles descritos por Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 Abril; 3 (4): 388-398; Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338; Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., Outubro de 2012; 24 (5): 633-39; Wu et al., Cancer, 18 de março de 2012 (2):160-75. Em alguns aspectos, os receptores de antígeno incluem um CAR, conforme descrito na Patente US No.

7.446.190, e aqueles descritos na Publicação de Pedido de Patente Internacional: WO/2014055668 A1. Exemplos de CARs incluem CARs, como descritos em qualquer uma das publicações mencionadas anteriormente, tais como WO2014031687, US 8.339.645, US7.446.179, US 2013/0149337, Patente US No. 7.446.190, Patente US No.

8.389.282, Kochenderfer et al., 2013 , Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013); Wang et al. (2012) J. Immunother. 35 (9): 689-701; e Brentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177). Veja também WO2014031687, US 8.339.645, US 7.446.179, US 2013/0149337, Patente U.S. No .7.446.190 e Patente US No: 8.389.282.

[00218] Em algumas modalidades, o CAR é construído com uma especificidade para um antígeno particular (ou marcador ou ligante), tal como um antígeno expresso em um tipo de célula particular para ser alvo de terapia adotiva, por exemplo, um marcador de câncer e/ou um antígeno destinado a induzir uma resposta de amortecimento, tal como um antígeno expresso em um tipo de célula normal ou não doente. Assim, o CAR inclui tipicamente em sua porção extracelular uma ou mais moléculas de ligação ao antígeno, tais como um ou mais fragmentos, domínio ou porção de ligação ao antígeno ou um ou mais domínios variáveis de anticorpo e/ou moléculas de anticorpo. Em algumas modalidades, o CAR inclui porções de ligação ao antígeno ou porções de uma molécula de anticorpo, tais como um fragmento de anticorpo de cadeia simples (scFv) derivado das cadeias variável pesada (VH) e variável leve (VL) de um anticorpo monoclonal (mAb).

[00219] Em algumas modalidades, o anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno é expresso nas células como parte de um receptor recombinante, tal como um receptor de antígeno. Entre os receptores de antígeno estão receptores funcionais de antígeno não TCR, tais como receptores de antígenos quiméricos (CARs). Geralmente, um CAR que contém um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que exibe especificidade semelhante a TCR direcionada contra complexos peptídeo-MHC, também pode ser referido como um CAR semelhante a TCR. Em algumas modalidades, o domínio de ligação ao antígeno extracelular específico para um complexo de peptídeo-MHC de um CAR semelhante a TCR está ligado a um ou mais componentes de sinalização intracelular, em alguns aspectos, através de ligantes e/ou domínios transmembrana. Em algumas modalidades, essas moléculas podem tipicamente mimetizar ou aproximar um sinal através de um receptor de antígeno natural, tal como um TCR, e, opcionalmente, um sinal através desse receptor em combinação com um receptor coestimulatório.

[00220] Em algumas modalidades, o receptor recombinante, tal como um receptor quimérico (por exemplo, CAR), inclui um domínio de ligação ao ligante que se liga, tal como se liga especificamente, a um antígeno (ou um ligante). Entre os antígenos direcionados pelos receptores quiméricos estão aqueles expressos no contexto de uma doença, condição ou tipo de célula a ser atingida através da terapia celular adotiva. Entre as doenças e condições estão doenças e distúrbios proliferativos, neoplásicos e malignos, incluindo cânceres e tumores, incluindo cânceres hematológicos, cânceres do sistema imunológico, como linfomas, leucemias e/ou mielomas, tais como B, T e mieloide leucemias, linfomas e mielomas múltiplos.

[00221] Em algumas modalidades, o antígeno (ou um ligante) é um polipeptídeo. Em algumas modalidades, é um carboidrato ou outra molécula. Em algumas modalidades, o antígeno (ou um ligante) é seletivamente expresso ou superexpresso nas células da doença ou condição, por exemplo, o tumor ou células patogênicas, em comparação com células ou tecidos normais ou não atingidos. Em outras modalidades, o antígeno é expresso nas células normais e/ou é expresso nas células manipuladas.

[00222] Em algumas modalidades, o CAR contém um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, scFv) que reconhece especificamente um antígeno, tal como um antígeno intacto, expresso na superfície de uma célula.

[00223] Em certas modalidades, o antígeno é ανβ6 integrina (avb6 integrina), antígeno de maturação de células B (BCMA), anidrase carbônica 9 (CAIX), Her2/neu (receptor tirosina quinase erbB2), L1- CAM, B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX ou G250), um antígeno de câncer de testículo, antígeno de câncer/testículo 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA) e antígeno de superfície da hepatite B, receptor anti-folato, ciclina, ciclina A2, Ligante 1 do Motivo C-C da Quimiocina (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44 , CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteoglicano 4 do sulfato de condroitina (CSPG4), proteína do fator de crescimento epidérmico (EGFR), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40 ), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), erb-B2, erb-B3, erb-B4, dímeros de erbB, mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico do tipo

III (EGFR vIII), proteína de ligação ao folato (FBP), receptor Fc semelhante a 5 ( FCRL5; também conhecido como homólogo 5 do receptor Fc ou FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), uma proteína de ligação ao folato (FBP), receptor alfa de folato, gangliosídeo GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glipicano-3 (GPC3), Receptor 5D Acoplado à Proteína G (GPRC5D), Her2/neu (receptor tirosina quinase erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros erbB, antígeno humano de alto peso molecular associado ao melanoma (HMW-MAA), Antígeno de superfície da hepatite B, antígeno A1 leucocitário humano (HLA-A1), antígeno A2 leucocitário humano (HLA- A2), receptor alfa de IL-22 (IL-22R-alfa), IL-13R-alfa2 (IL-13Rα2), de quinase receptor de domínio do inserto de quinase (kdr), cadeia leve kappa, Lewis Y, molécula L1 de adesão celular (L1-CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, Membro A da Família 8 que contém repetição rica em leucina (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado ao Melanoma (MAGE)- A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina (MSLN), c-Met, citomegalovírus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes do Membro D do grupo 2 de natural killer (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adesão de células neurais (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno do melanoma expresso preferivelmente (PRAME), receptor de progesterona, antígeno específico da próstata, antígeno de células- tronco da próstata (PSCA), antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), receptor tirosina quinase semelhante ao receptor órfão 1 (ROR1), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG também conhecida como 5T4), glicoproteína 72 associada ao tumor (TAG72), proteína 1 relacionada à tirosinase (TRP1, também conhecida como TYRP1 ou gp75), proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP2, também conhecida como dopacromo tautomerase, dopacromo delta-isomerase ou DCT), receptor α de folato, 8H9, antígeno duplo, glicoproteína 100 (gp100), receptor de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR),

receptor de fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGF-R2), receptor de estrogênio, receptor de progesterona, Tumor de Wilms 1 (WT-1), um antígeno específico de patógeno ou expresso por patógeno e um antígeno associado a um marcador universal e/ou moléculas biotiniladas e/ou moléculas expressas por HIV, HCV, HBV ou outros patógenos. Os antígenos atingidos pelos receptores em algumas modalidades incluem antígenos associados a uma malignidade de células B, como qualquer um de vários marcadores conhecidos de células B. Em algumas modalidades, o antígeno é ou inclui CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b ou CD30.

[00224] Em algumas modalidades, o antígeno é ou inclui um antígeno específico para ou um antígeno expresso pelo patógeno. Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno viral (tal como um antígeno viral de HIV, HCV, HBV, etc.), antígenos bacterianos e/ou antígenos parasitários.

[00225] Em algumas modalidades, o antígeno ou domínio de ligação ao antígeno é CD19. Em algumas modalidades, o scFv contém uma VH e uma VL derivadas de um anticorpo ou um fragmento de anticorpo específico para CD19. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a CD19 é um anticorpo derivado de camundongo, tal como FMC63 e SJ25C1. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo é um anticorpo humano, por exemplo, como descrito na Publicação de Patente U.S. No. US 2016/0152723.

[00226] Em algumas modalidades, o scFv é derivado de FMC63. FMC63 geralmente se refere a um anticorpo IgG1 monoclonal de camundongo criado contra células Nalm-1 e -16 que expressam CD19 de origem humana (Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). O anticorpo FMC63 compreende CDRH1 e H2 descritas nas SEQ ID

NOS: 38, 39 respectivamente, e CDRH3 descrita na SEQ ID NOS: 40 ou 54 e CDRL1 descrita na SEQ ID NOS: 35 e CDR L2 36 ou 55 e CDR L3 sequências 37 ou 34. O anticorpo FMC63 compreende a região variável da cadeia pesada (VH) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 41 e a região variável da cadeia leve (V L) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, o scFv compreende uma cadeia leve variável que contém a sequência CDRL1 da SEQ ID NO: 35, uma sequência CDRL2 da SEQ ID NO: 36 e uma sequência CDRL3 da SEQ ID NO: 37 e/ou uma cadeia pesada variável que contém uma sequência CDRH1 da SEQ ID NO: 38, uma sequência CDRH2 da SEQ ID NO: 39 e uma sequência CDRH3 da SEQ ID NO: 40. Em algumas modalidades, o scFv compreende uma região variável da cadeia pesada de FMC63 descrita na SEQ ID NO: 41 e uma região variável da cadeia leve de FMC63 descrita na SEQ ID NO: 42. Em algumas modalidades, a cadeia variável leve e variável pesada são conectadas por um ligante. Em algumas modalidades, o ligante está descrito na SEQ ID NO: 56. Em algumas modalidades, o scFv compreende, em ordem, uma VH, um ligante e uma VL. Em algumas modalidades, o scFv compreende, em ordem, uma VL, um ligante e uma VH. Em algumas modalidades, o svFc é codificado por uma sequência de nucleotídeos descrita na SEQ ID NO: 57 ou uma sequência que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92 %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 57. Em algumas modalidades, o scFv compreende a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 43 ou uma sequência que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92% 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de Identidade de sequência com a SEQ ID NO: 43.

[00227] Em algumas modalidades, o scFv é derivado de SJ25C1. SJ25C1 é um anticorpo monoclonal IgG1 de camundongo criado contra células Nalm-1 e -16 que expressam CD19 de origem humana (Ling, N. R., et al. (1987). Leucocyte typing III. 302). O anticorpo SJ25C1 compreende as CDRH1, H2 e H3 descritas nas SEQ ID NOS: 47-49, respectivamente, e as sequências de CDRL1, L2 e L3 descritas nas SEQ ID NOS: 44-46, respectivamente. O anticorpo SJ25C1 compreende a região variável da cadeia pesada (VH) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 50 e a região variável da cadeia leve (VL) que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 51. Em algumas modalidades, o scFv compreende uma cadeia leve variável que contém a sequência de CDRL1 da SEQ ID NO: 44, uma sequência de CDRL2 da SEQ ID NO: 45 e uma sequência de CDRL3 da SEQ ID NO: 46 e/ou uma cadeia pesada variável que contém uma sequência de CDRH1 da SEQ ID NO: 47, uma sequência de CDRH2 da SEQ ID NO: 48 e uma sequência CDRH3 da SEQ ID NO:

49. Em algumas modalidades, o scFv compreende uma região variável da cadeia pesada de SJ25C1 descrita na SEQ ID NO: 50 e uma região variável da cadeia leve de SJ25C1 descrita na SEQ ID NO: 51. Em algumas modalidades, a cadeia leve variável e pesada são conectadas por um ligante. Em algumas modalidades, o ligante está descrito na SEQ ID NO: 52. Em algumas modalidades, o scFv compreende, em ordem, uma VH, um ligante e uma VL. Em algumas modalidades, o scFv compreende, em ordem, uma VL, um ligante e uma VH. Em algumas modalidades, o scFv compreende a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 53 ou uma sequência que exibe pelo menos 85% , 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com SEQ ID NO: 53.

[00228] Em algumas modalidades, o antígeno ou domínio de ligação ao antígeno é BCMA. Em algumas modalidades, o scFv contém uma VH e uma VL derivadas de um anticorpo ou um fragmento de anticorpo específico para BCMA. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga ao BCMA é ou contém uma VH e uma VL de um anticorpo ou fragmento de anticorpo descrito nos Pedidos de Patente Internacional, Número de Publicação WO 2016/090327 e WO 2016/090320.

[00229] Em algumas modalidades, o antígeno ou domínio de ligação ao antígeno é GPRC5D. Em algumas modalidades, o scFv contém uma VH e uma VL derivados de um anticorpo ou um fragmento de anticorpo específico para GPRC5D. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de anticorpo que se liga a GPRC5D é ou contém uma VH e uma VL de um anticorpo ou fragmento de anticorpo descrito nos Pedidos de Patente Internacional, Número de Publicação WO 2016/090329 e WO 2016/090312.

[00230] Em algumas modalidades, o CAR contém um anticorpo semelhante a TCR, tal como um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno (por exemplo, scFv) que reconhece especificamente um antígeno intracelular, tal como um antígeno associado a um tumor, apresentado na superfície celular tal como um complexo MHC-peptídeo. Em algumas modalidades, um anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno que reconhece um complexo de MHC-peptídeo pode ser expresso nas células como parte de um receptor recombinante, tal como um receptor de antígeno. Entre os receptores de antígeno estão os receptores de antígeno não TCR funcionais, tais como os receptores quiméricos de antígeno (CARs). Geralmente, um CAR que contém um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno que exibe especificidade do tipo de TCR direcionada contra complexos peptídeo-MHC também pode ser referido como um CAR semelhante a TCR.

[00231] A referência ao "Complexo de histocompatibilidade principal" (MHC) se refere a uma proteína, geralmente uma glicoproteína, que contém um sítio de ligação ao peptídeo polimórfico ou sulco de ligação que pode, em alguns casos, complexar com antígenos peptídicos de polipeptídeos, incluindo antígenos peptídicos processados pelo maquinario célula. Em alguns casos, as moléculas de MHC podem ser apresentadas ou expressas na superfície celular, inclusive como um complexo com peptídeo, ou seja, Complexo MHC-peptídeo, para apresentação de um antígeno em uma conformação reconhecível por um receptor de antígeno nas células T, tal como TCRs ou um anticorpo semelhante ao TCR. Geralmente, as moléculas de MHC de classe I são heterodímeros que têm uma cadeia α que abrange a membrana, em alguns casos com três domínios α e uma β2 microglobulina não covalentemente associada. Geralmente, as moléculas de MHC classe II são compostas por duas glicoproteínas transmembrana, α e β, ambas tipicamente abrangendo a membrana. Uma molécula de MHC pode incluir uma porção eficaz de um MHC que contém um sítio ou sítios de ligação ao antígeno para a ligação de um peptídeo e as sequências necessárias para o reconhecimento pelo receptor de antígeno apropriado. Em algumas modalidades, as moléculas de MHC classe I liberam peptídeos que se originam no citosol para a superfície celular, onde um complexo de MHC-peptídeo é reconhecido pelas células T, tal como geralmente células T CD8+, mas em alguns casos células T CD4+. Em algumas modalidades, as moléculas de MHC classe II liberam peptídeos originários do sistema vesicular para a superfície celular, onde são tipicamente reconhecidos pelas células T CD4+. Geralmente, as moléculas de MHC são codificadas por um grupo de loci ligados, que são coletivamente denominados H-2 no camundongo e antígeno leucocitário humano (HLA) em humanos. Portanto, o MHC tipicamente humano também pode ser referido como antígeno leucocitário humano (HLA).

[00232] A expressão "complexo MHC-peptídeo" ou "complexo peptídeo-MHC" ou variações do mesmo, se refere a um complexo ou associação de um antígeno peptídico e uma molécula MHC, tal como,

geralmente, por interações não covalentes do peptídeo no sulco ou fenda de ligação da molécula de MHC. Em algumas modalidades, o complexo MHC-peptídeo está presente ou apresentado na superfície das células. Em algumas modalidades, o complexo MHC-peptídeo pode ser especificamente reconhecido por um receptor de antígeno, tal como um TCR, um CAR semelhante a TCR ou porções de ligação a antígeno do mesmo.

[00233] Em algumas modalidades, um peptídeo, tal como um antígeno peptídico ou epítopo, de um polipeptídeo pode se associar a uma molécula de MHC, tal como para reconhecimento por um receptor de antígeno. Geralmente, o peptídeo é derivado de ou baseado em um fragmento de uma molécula biológica mais longa, tal como um polipeptídeo ou proteína. Em algumas modalidades, o peptídeo normalmente tem cerca de 8 a cerca de 24 aminoácidos de extensão. Em algumas modalidades, um peptídeo tem uma extensão de ou de cerca de 9 a 22 aminoácidos para reconhecimento no complexo MHC Classe II. Em algumas modalidades, um peptídeo tem um comprimento de ou de cerca de 8 a 13 aminoácidos para reconhecimento no complexo MHC Classe I. Em algumas modalidades, após o reconhecimento do peptídeo no contexto de uma molécula de MHC, tal como o complexo MHC-peptídeo, o receptor de antígeno, tal como TCR ou CAR semelhante a TCR, produz ou dispara um sinal de ativação para a célula T que induz uma resposta de células T, tal como a proliferação de células T, a produção de citocinas, resposta de células T citotóxicas ou outra resposta.

[00234] Em algumas modalidades, um anticorpo semelhante ao TCR ou uma porção de ligação ao antígeno pode ser produzido (veja, por exemplo, Pedidos Publicados US Nos. US 2002/0150914; US 2003/0223994; US 2004/0191260; US 2006/0034850; US 2007/00992530; US20090226474; US20090304679; e Publicação

Internacional PCT Nº WO 03/068201).

[00235] Em algumas modalidades, um anticorpo ou sua porção de ligação ao antígeno que se liga especificamente a um complexo peptídeo MHC, pode ser produzido pela imunização de um hospedeiro com uma quantidade eficaz de um imunógeno que contém um complexo peptídeo-MHC específico. Em alguns casos, o peptídeo do complexo MHC-peptídeo é um epítopo do antígeno capaz de se ligar ao MHC, tal como um antígeno tumoral, por exemplo, um antígeno de tumor universal, antígeno de mieloma ou outro antígeno, como descrito abaixo. Em algumas modalidades, uma quantidade eficaz do imunógeno é então administrada a um hospedeiro para provocar uma resposta imune, em que o imunógeno retém sua forma tridimensional por um período de tempo suficiente para provocar uma resposta imune contra a apresentação tridimensional do peptídeo no sulco de ligação da molécula de MHC. O soro coletado do hospedeiro é então analisado para determinar se estão sendo produzidos os anticorpos desejados que reconhecem uma apresentação tridimensional do peptídeo no sulco de ligação da molécula de MHC. Em algumas modalidades, os anticorpos produzidos podem ser avaliados para confirmar que o anticorpo pode diferenciar o complexo MHC-peptídeo da molécula MHC sozinha, apenas o peptídeo de interesse e um complexo de MHC e peptídeo irrelevante. Os anticorpos desejados podem então ser isolados.

[00236] Em algumas modalidades, um anticorpo ou sua porção de ligação a antígeno que se liga especificamente a um complexo peptídeo-MHC pode ser produzido empregando métodos de apresentação em bibliotecas de anticorpos, tais como bibliotecas de fagos de anticorpos. Em algumas modalidades, as bibliotecas de apresentação em fagos de Fab mutante, scFv ou outras formas de anticorpo podem ser geradas, por exemplo, nas quais os membros da biblioteca são mutados em um ou mais resíduos de uma CDR ou CDRs. Veja, por exemplo, Pedido Publicado US No. US20020150914, US2014/0294841; e Cohen CJ. et al. ( 2003) J Mol. Recogn. 16:324-

332.

[00237] A expressão "anticorpo" é usada aqui no sentido mais amplo e inclui anticorpos policlonais e monoclonais, incluindo anticorpos intactos e fragmentos de anticorpos funcionais (ligação ao antígeno), incluindo fragmentos de ligação ao antígeno (Fab), fragmentos F(ab')2, fragmentos F(ab')2, fragmentos Fab', fragmentos Fv, fragmentos de IgG recombinante (rlgG), regiões variáveis de cadeia pesada (VH) capazes de se ligar especificamente ao antígeno, fragmentos de anticorpos de cadeia simples, incluindo fragmentos variáveis de cadeia simples (scFv) e anticorpos de domínio único (por exemplo, sdAb, sdFv , nanocorpos). A expressão abrange formas de imunoglobulinas modificadas por manipulação genética e/ou modificadas de outra forma, tais como intracorpos, pepticorpos, anticorpos quiméricos, anticorpos totalmente humanos, anticorpos humanizados e anticorpos heteroconjugados, multiespecíficos, por exemplo, biespecíficos, anticorpos, diacorpos, triacorpos e tetracorpos, di-scFv em tandem, tri-scFv em tandem. Salvo indicação em contrário, a expressão "anticorpo" deve ser entendida como abrangendo fragmentos funcionais de anticorpos. A expressão também abrange anticorpos intactos ou completos, incluindo anticorpos de qualquer classe ou subclasse, incluindo IgG e suas subclasses, IgM, IgE, IgA e IgD.

[00238] Em algumas modalidades, as proteínas de ligação ao antígeno, anticorpos e seus fragmentos de ligação ao antígeno reconhecem especificamente um antígeno de um anticorpo de extensão completa. Em algumas modalidades, as cadeias pesada e leve de um anticorpo podem ser de extensão completa ou podem ser uma porção de ligação ao antígeno (um Fab, F(ab')2, Fv ou um fragmento Fv de cadeia simples (scFv)). Em outras modalidades, a região constante da cadeia pesada do anticorpo é escolhida, por exemplo, entre IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD e IgE, particularmente escolhida entre, por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, mais particularmente, IgG1 (por exemplo, IgG1 humana). Em outra modalidade, a região constante da cadeia leve do anticorpo é escolhida entre, por exemplo, kappa ou lambda, particularmente kappa.

[00239] Entre os anticorpos fornecidos estão fragmentos de anticorpos. Um "fragmento de anticorpo" se refere a uma molécula diferente de um anticorpo intacto que compreende uma porção de um anticorpo intacto que se liga o antígeno ao qual o anticorpo intacto se liga. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; diacorpos; anticorpos lineares; regiões variáveis de cadeia pesada (VH), moléculas de anticorpo de cadeia única, tais como scFvs e anticorpos de domínio VH único; e anticorpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticorpo. Em modalidades particulares, os anticorpos são fragmentos de anticorpo de cadeia única que compreendem uma região variável da cadeia pesada e/ou uma região variável da cadeia leve, tal como scFvs.

[00240] A expressão "região variável" ou "domínio variável" se refere ao domínio de um anticorpo de cadeia pesada ou leve que está envolvido na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios variáveis da cadeia pesada e da cadeia leve (VH e VL, respectivamente) de um anticorpo nativo geralmente têm estruturas semelhantes, com cada domínio compreendendo quatro regiões estruturais conservadas (FRs) e três CDRs. (Veja, por exemplo, Kindt et al. Kuby Immunology, 6ª ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007). Um domínio VH ou VL único pode ser suficiente para conferir especificidade de ligação ao antígeno. Além disso, os anticorpos que se ligam a um antígeno específico podem ser isolados usando um domínio VH ou VL de um anticorpo que se liga ao antígeno para rastrear uma biblioteca de domínios de VH ou VL complementares, respectivamente. Veja, por exemplo, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991).

[00241] Anticorpos de domínio único são fragmentos de anticorpo que compreende todo ou uma porção do domínio variável da cadeia pesada ou todo ou uma porção do domínio variável da cadeia leve de um anticorpo. Em certas modalidades, um anticorpo de domínio único é um anticorpo de domínio único humano. Em algumas modalidades, o CAR compreende um domínio de cadeia pesada de anticorpo que se liga especificamente o antígeno, tal como um marcador de câncer ou antígeno da superfície celular de uma célula ou doença a ser atingida, tal como uma célula tumoral ou uma célula de câncer, tal como qualquer um dos os antígenos alvo aqui descritos ou conhecidos na técnica.

[00242] Os fragmentos de anticorpos podem ser produzidos por várias técnicas, incluindo, entre outras, a digestão proteolítica de um anticorpo intacto, assim como a produção por células hospedeiras recombinantes. Em algumas modalidades, os anticorpos são fragmentos produzidos de forma recombinante, tal como fragmentos que compreendem arranjos que não ocorrem naturalmente, tal como aqueles com duas ou mais regiões ou cadeias de anticorpos unidas por ligantes sintéticos, por exemplo, ligantes peptídicos e/ou que podem não ser produzido pela digestão enzimática de um anticorpo intacto de ocorrência natural. Em algumas modalidades, os fragmentos de anticorpo são scFvs.

[00243] Um anticorpo "humanizado" é um anticorpo no qual todos ou substancialmente todos os resíduos de aminoácidos da CDR são derivados de CDRs não humanas e todos ou substancialmente todos os resíduos de aminoácidos de FR são derivados de FRs humanas. Um anticorpo humanizado pode opcionalmente incluir pelo menos uma porção de uma região constante de anticorpo derivada de um anticorpo humano. Uma "forma humanizada" de um anticorpo não humano se refere a uma variante do anticorpo não humano que foi submetido à humanização, tipicamente para reduzir a imunogenicidade para humanos, mantendo a especificidade e afinidade do anticorpo não humano parental. Em algumas modalidades, alguns resíduos FR em um anticorpo humanizado são substituídos por resíduos correspondentes de um anticorpo não humano (por exemplo, o anticorpo do qual os resíduos de CDR são derivados), por exemplo, para restaurar ou melhorar a especificidade ou afinidade do anticorpo.

[00244] Assim, em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico, incluindo CARs semelhantes a TCR, inclui uma porção extracelular que contém um anticorpo ou fragmento de anticorpo. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento inclui um scFv. Em alguns aspectos, o receptor de antígeno quimérico inclui uma porção extracelular que contém o anticorpo ou fragmento e uma região de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular é ou compreende um domínio de sinalização primário, um domínio de sinalização que é capaz de induzir um sinal de ativação primária em uma célula T, um domínio de sinalização de um componente do receptor de célula T (TCR) e/ou um domínio de sinalização que compreende um motivo de ativação de imuno-receptor baseado em tirosina (ITAM).

[00245] Em algumas modalidades, o receptor recombinante, tal como o CAR, tal como a porção de anticorpo do mesmo, inclui ainda um espaçador, que pode ser ou incluir pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina ou uma variante ou sua versão modificada, tal como uma região de dobradiça, por exemplo, uma região de dobradiça de IgG4 e/ou uma região CH1/CL e/ ou Fc.

Em algumas modalidades, o receptor recombinante compreende ainda um espaçador e/ou uma região de dobradiça.

Em algumas modalidades, a região ou porção constante é de uma IgG humana, como IgG4 ou IgG1. Em alguns aspectos, a porção da região constante serve como uma região espaçadora entre o componente de reconhecimento de antígeno, por exemplo, scFv e o domínio transmembrana.

O espaçador pode ter uma extensão que forneça maior capacidade de resposta da célula após a ligação ao antígeno, em comparação com a ausência do espaçador.

Em alguns exemplos, o espaçador tem aproximadamente 12 aminoácidos de extensão ou não tem mais que 12 aminoácidos de extensão.

Espaçadores exemplificadores incluem aqueles com pelo menos cerca de 10 a 229 aminoácidos, cerca de 10 a 200 aminoácidos, cerca de 10 a 175 aminoácidos, cerca de 10 a 150 aminoácidos, cerca de 10 a 125 aminoácidos, cerca de 10 a 125 aminoácidos, cerca de 10 a 100 aminoácidos, cerca de 10 a 75 aminoácidos, cerca de 10 a 50 aminoácidos, cerca de 10 a 40 aminoácidos, cerca de 10 a 30 aminoácidos, cerca de 10 a 20 aminoácidos ou cerca de 10 a 15 aminoácidos, incluindo qualquer número inteiro entre os pontos finais de qualquer um dos intervalos listados.

Em algumas modalidades, uma região espaçadora tem cerca de 12 aminoácidos ou menos, cerca de 119 aminoácidos ou menos, ou cerca de 229 aminoácidos ou menos.

Espaçadores exemplificadores incluem dobradiça de IgG4 isolada, dobradiça de IgG4 ligada aos domínios CH2 e CH3 ou dobradiça de IgG4 ligada ao domínio CH3. Espaçadores exemplificadores incluem, mas não estão limitados aos descritos em Hudecek et al. ( 2013) Clin.

Cancer Res., 19:3153 ou publicação do pedido de patente internacional número WO2014031687. Em algumas modalidades, o espaçador tem a sequência descrita na SEQ ID NO:1 e é codificado pela sequência descrita na SEQ ID NO: 2. Em algumas modalidades, o espaçador tem a sequência descrita na SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o espaçador tem a sequência descrita na SEQ ID NO: 4.

[00246] Em algumas modalidades, a região constante ou porção é de IgD. Em algumas modalidades, o espaçador tem a sequência descrita na SEQ ID NO: 5. Em algumas modalidades, o espaçador tem uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%>, 89%>, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95 %, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS:1, 3, 4 e 5. Em algumas modalidades, o espaçador tem a sequência descrita na SEQ ID NOS: 23-31. Em algumas modalidades, o espaçador tem uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96 %, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com qualquer uma das SEQ ID NOS: 27-31, 58, 59.

[00247] O domínio de reconhecimento de antígeno geralmente está ligado a um ou mais componentes de sinalização intracelular, tal como componentes de sinalização que imitam a ativação através de um complexo receptor de antígeno, tal como um complexo TCR, no caso de um CAR e/ou sinal através de outro receptor de superfície celular. Assim, em algumas modalidades, o componente de ligação ao antígeno (por exemplo, anticorpo) está ligado a uma ou mais regiões de sinalização transmembrana e intracelular. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana é fundido ao domínio extracelular. Em uma modalidade, é utilizado um domínio transmembrana que naturalmente está associado a um dos domínios no receptor, por exemplo, CAR. Em alguns casos, o domínio transmembrana é selecionado ou modificado por substituição de aminoácidos para evitar a ligação de tais domínios aos domínios transmembranas da mesma ou de diferentes proteínas da superfície da membrana para minimizar as interações com outros membros do complexo de receptor.

[00248] O domínio transmembrana em algumas modalidades é derivado de uma fonte natural ou de uma fonte sintética. Onde a fonte é natural, em alguns aspectos, o domínio é derivado de qualquer proteína ligada à membrana ou transmembrana. As regiões transmembranas incluem aquelas derivadas (isto é, compreendem pelo menos as regiões transmembrana) da cadeia alfa, beta ou zeta do receptor de células T, CD28, CD3 epsilon, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154. Alternativamente, o domínio transmembrana em algumas modalidades é sintético. Em alguns aspectos, o domínio transmembrana sintético compreende resíduos predominantemente hidrofóbicos, tais como leucina e valina. Em alguns aspectos, um tripleto de fenilalanina, triptofano e valina será encontrado em cada extremidade de um domínio transmembrana sintético. Em algumas modalidades, a ligação é feita por ligantes, espaçadores e/ou domínios transmembrana.

[00249] Entre a região de sinalização intracelular estão aquelas que mimetizam ou se aproximam de um sinal através de um receptor de antígeno natural, um sinal através de tal receptor em combinação com um receptor coestimulatório e/ou um sinal através de um receptor coestimulatório sozinho. Em algumas modalidades, um ligante oligo- ou polipeptídico curto, por exemplo, um ligante entre 2 e 10 aminoácidos de extensão, tal como aquele que contém glicinas e serinas, por exemplo, dubleto de glicina-serina, está presente e forma uma ligação entre o domínio transmembrana e o domínio de sinalização citoplasmático de CAR.

[00250] O receptor, por exemplo, o CAR, geralmente inclui pelo menos um componente ou componentes de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o receptor inclui um componente intracelular de um complexo TCR, tal como uma cadeia de TCR CD3 que medeia a ativação de células T e a citotoxicidade, por exemplo, cadeia zeta de

CD3. Assim, em alguns aspectos, o anticorpo de ligação a ROR1 está ligado a um ou mais módulos de sinalização celular. Em algumas modalidades, os módulos de sinalização celular incluem o domínio transmembrana de CD3, domínios de sinalização intracelular de CD3 e/ou outros domínios transmembranas de CD. Em algumas modalidades, o receptor, por exemplo, CAR, inclui ainda uma porção de uma ou mais moléculas adicionais, tais como o receptor γ de Fc, CD8, CD4, CD25 ou CD16. Por exemplo, em alguns aspectos, o CAR inclui uma molécula quimérica entre CD3-zeta (CD3-ζ) ou receptor γ de Fc e CD8, CD4, CD25 ou CD16.

[00251] Em algumas modalidades, após a ligação do CAR, o domínio citoplasmático ou a região de sinalização intracelular do CAR ativa pelo menos uma das funções efetoras normais ou respostas da célula imune, por exemplo, célula T manipulada para expressar o CAR. Por exemplo, em alguns contextos, o CAR induz uma função de uma célula T, tal como atividade citolítica ou atividade auxiliar de T, tal como a secreção de citocinas ou outros fatores. Em algumas modalidades, uma porção truncada de uma região de sinalização intracelular de um componente do receptor de antígeno ou molécula coestimulatória é usada no lugar de uma cadeia imuno-estimulatória intacta, por exemplo, se ela transduz o sinal da função efetora. Em algumas modalidades, as regiões de sinalização intracelular, por exemplo, que compreende os domínios ou domínios intracelulares, incluem as sequências citoplasmáticas do receptor de células T (TCR) e, em alguns aspectos, também aqueles de correceptores que no contexto natural agem em conjunto com tal receptor para iniciar a transdução de sinal após a ligação do receptor de antígeno e/ou qualquer derivado ou variante de tais moléculas e/ou qualquer sequência sintética que tenha a mesma capacidade funcional.

[00252] No contexto de um TCR natural, a ativação total geralmente requer não apenas a sinalização através de TCR, mas também um sinal coestimulatório. Assim, em algumas modalidades, para promover a ativação completa, um componente para gerar sinal secundário ou coestimulatório também é incluído no CAR. Em outras modalidades, o CAR não inclui um componente para gerar um sinal coestimulatório. Em alguns aspectos, um CAR adicional é expresso na mesma célula e fornece o componente para gerar o sinal secundário ou coestimulatório.

[00253] A ativação de células T é, em alguns aspectos, descrita como seno mediada por duas classes de sequências de sinalização citoplasmáticas: aquelas que iniciam a ativação primária dependente de antígeno através de TCR (sequências primárias de sinalização citoplasmática) e aquelas que agem de maneira independente do antígeno para fornecer uma sinal secundário ou coestimulatório (sequências secundárias de sinalização citoplasmática). Em alguns aspectos, o CAR inclui um ou ambos os componentes de sinalização.

[00254] Em alguns aspectos, o CAR inclui uma sequência de sinalização citoplasmática primária que regula a ativação primária do complexo TCR. As sequências de sinalização citoplasmáticas primárias que atuam de maneira estimulante podem conter motivos de sinalização que são conhecidos como motivos de ativação de imunorreceptores baseados em tirosina ou ITAMs. Exemplos sequências de sinalização citoplasmáticas primárias que contêm ITAM incluem aquelas derivadas de TCR ou CD3 zeta, FcR gama ou FcR beta. Em algumas modalidades, as moléculas de sinalização citoplasmática no CAR contêm um domínio de sinalização citoplasmático, uma porção do mesmo ou uma sequência derivada de CD3 zeta.

[00255] Em algumas modalidades, o CAR inclui uma região de sinalização e/ou porção transmembrana de um receptor coestimulatório, tal como CD28, 4-1BB, OX40, DAP10 e ICOS. Em alguns aspectos, o mesmo CAR inclui a região de sinalização e os componentes coestimuladores.

[00256] Em algumas modalidades, a região de sinalização está incluída dentro de um CAR, enquanto que o componente coestimulatório é fornecido por outro CAR que reconhece outro antígeno. Em algumas modalidades, os CARs incluem CARs ativadores ou estimuladores e CARs coestimulatórios, ambos expressos na mesma célula (veja WO2014/055668).

[00257] Em certas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização e transmembrana de CD28 ligado a um domínio intracelular de CD3 (por exemplo, CD3-zeta). Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende um domínio coestimulatório quimérico de CD28 e CD137 (4-1BB, TNFRSF9), ligado a um domínio intracelular CD3 zeta.

[00258] Em algumas modalidades, o CAR abrange um ou mais, por exemplo, dois ou mais, domínios coestimulatórios e um domínio de ativação, por exemplo, domínio de ativação primário, na porção citoplasmática. CARs exemplificadores incluem componentes intracelulares de CD3-zeta, CD28 e 4- 1BB.

[00259] Em alguns casos, os CARs são referidos como CARs de primeira, segunda e/ou terceira geração. Em alguns aspectos, um CAR de primeira geração é aquele que apenas fornece um sinal induzido pela cadeia de CD3 após a ligação ao antígeno; em alguns aspectos, um CAR de segunda geração é aquele que fornece esse sinal e o sinal coestimulatório, como um que inclui um domínio de sinalização intracelular de um receptor coestimulatório tal como CD28 ou CD137; em alguns aspectos, um CAR de terceira geração em alguns aspectos é aquele que inclui múltiplos domínios coestimulatórios de diferentes receptores coestimulatórios.

[00260] Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico inclui uma porção extracelular que contém o anticorpo ou fragmento aqui descrito. Em alguns aspectos, o receptor de antígeno quimérico inclui uma porção extracelular que contém o anticorpo ou fragmento aqui descrito e um domínio de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento inclui um scFv ou uma VH de domínio único de anticorpo e o domínio intracelular contém um ITAM. Em alguns aspectos, o domínio de sinalização intracelular inclui um domínio de sinalização de uma cadeia zeta de uma cadeia CD3-zeta (CD3ζ). Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico inclui um domínio transmembrana disposto entre o domínio extracelular e a região de sinalização intracelular.

[00261] Em alguns aspectos, o domínio transmembrana contém uma porção transmembrana de CD28. O domínio extracelular e transmembrana podem ser ligados direta ou indiretamente. Em algumas modalidades, o domínio extracelular e o transmembrana estão ligados por um espaçador, tal como qualquer um aqui descrito. Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico contém um domínio intracelular de uma molécula coestimulatória de células T, tal como entre o domínio transmembrana e o domínio de sinalização intracelular. Em alguns aspectos, a molécula coestimulatória de células T é CD28 ou 4-1BB.

[00262] Em algumas modalidades, o CAR contém um anticorpo, por exemplo, um fragmento de anticorpo, um domínio transmembrana que é ou contém uma porção transmembrana de CD28 ou uma variante funcional do mesmo e um domínio de sinalização intracelular que contém uma porção de sinalização do CD28 ou sua variante funcional e uma porção de sinalização de CD3 zeta ou sua variante funcional. Em algumas modalidades, o CAR contém um anticorpo, por exemplo, fragmento de anticorpo, um domínio transmembrana que é ou contém uma porção transmembrana de CD28 ou sua variante funcional e um domínio de sinalização intracelular que contém uma porção de sinalização de um 4-1BB ou sua variante funcional e uma porção de sinalização de CD3 zeta ou sua variante funcional. Em algumas dessas modalidades, o receptor inclui ainda um espaçador que contém uma porção de uma molécula de Ig, tal como uma molécula de Ig humana, tal como uma dobradiça de Ig, por exemplo, uma dobradiça de IgG4, tal como um espaçador apenas da dobradiça.

[00263] Em algumas modalidades, o domínio transmembrana do receptor, por exemplo, o CAR é um domínio transmembrana de CD28 humano ou uma variante do mesmo, por exemplo, um domínio transmembrana com 27 aminoácidos de um CD28 humano (Nº de Acesso: P10747.1) ou é um domínio transmembrana que compreende a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência da SEQ ID NO: 8; em algumas modalidades, a porção que contém o domínio transmembrana do receptor recombinante compreende a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 9 ou uma sequência de aminoácidos com pelo menos cerca de 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com ela.

[00264] Em algumas modalidades, o receptor de antígeno quimérico contém um domínio intracelular de uma molécula coestimulatória de células T. Em alguns aspectos, a molécula coestimulatória de células T é CD28 ou 4-1BB.

[00265] Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização coestimulatório intracelular de CD28 humano ou uma variante ou porção funcional do mesmo, tal como um domínio de 41 aminoácidos do mesmo e/ou um domínio com uma substituição de LL para GG nas posições 186-187 de uma proteína CD28 nativa. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular pode compreender a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO:10 ou 11 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID NO:10 ou 11. Em algumas modalidades, a região intracelular compreende um domínio de sinalização coestimulatório intracelular de 4- 1BB ou sua variante funcional ou porção, tal como um domínio citoplasmático de 42 aminoácidos de um 4-1BB humano (Nº de Acesso Q07011.1) ou sua variante funcional ou porção, tal como a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO:12 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID NO:12.

[00266] Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende uma cadeia de CD3 humana, opcionalmente um domínio de sinalização estimulatória de CD3 zeta ou sua variante funcional, tal como um domínio citoplasmático de 112 AA da isoforma 3 de CD3ζ humana (Nº de Acesso: P20963.2) ou um domínio de sinalização de CD3 zeta tal como descrito na Patente US No. 7.446.190 ou Patente US No. 8.911.993. Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO:13, 14 ou 15 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89% , 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID NO:13, 14 ou 15.

[00267] Em alguns aspectos, o espaçador contém apenas uma região de dobradiça de uma IgG, tal como apenas uma dobradiça de IgG4 ou IgG1, tal como o espaçador da dobradiça descrito na SEQ ID NO:1. Em outras modalidades, o espaçador é uma dobradiça de Ig, por exemplo, e uma dobradiça de IgG4, ligada a um domínio CH2 e/ou CH3.

Em algumas modalidades, o espaçador é uma dobradiça de Ig, por exemplo, uma dobradiça de IgG4, ligada aos domínios CH2 e CH3, tal como descrito na SEQ ID NO: 3. Em algumas modalidades, o espaçador é uma dobradiça de Ig, por exemplo, uma dobradiça de IgG4, ligada apenas a um domínio CH3, tal como descrito na SEQ ID NO: 4. Em algumas modalidades, o espaçador é ou compreende uma sequência rica em glicina-serina ou outro ligante flexível, tal como ligantes flexíveis conhecidos.

2. Receptores de Autoanticorpo Quimérico (CAARs)

[00268] Em algumas modalidades, entre o receptor recombinante expresso pelas células manipuladas usadas em conexão com os métodos, usos, artigos de fabricação e composições fornecidos, está um receptor de autoanticorpo quimérico (CAAR). Em algumas modalidades, o CAAR é específico para um autoanticorpo. Em algumas modalidades, uma célula que expressa o CAAR, tal como uma célula T manipulada para expressar um CAAR, pode ser usada para se ligar especificamente e matar células que expressam autoanticorpos, mas não células que expressam anticorpos normais. Em algumas modalidades, as células que expressam CAAR podem ser usadas para tratar uma doença autoimune associada à expressão de autoantígenos, tais como doenças autoimunes. Em algumas modalidades, as células que expressam CAAR podem atingir as células B que em última análise produzem os autoanticorpos e exibem os autoanticorpos em suas superfícies celulares, marcando essas células B como alvos específicos da doença para intervenção terapêutica. Em algumas modalidades, as células que expressam CAAR podem ser usadas para atingir e matar eficientemente as células B patogênicas em doenças autoimunes, atingindo as células B causadoras de doenças usando um receptor de autoanticorpo quimérico específico para o antígeno. Em algumas modalidades, o receptor recombinante é um CAAR, tal como qualquer um descrito na Publicação de Pedido de Patente U.S. No. US 2017/0051035.

[00269] Em algumas modalidades, o CAAR compreende um domínio de ligação ao autoanticorpo, um domínio transmembrana e uma região de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização intracelular. Em algumas modalidades, o domínio de sinalização intracelular é ou compreende um domínio de sinalização primário, um domínio de sinalização que é capaz de induzir um sinal de ativação primária em uma célula T, um domínio de sinalização de um componente do receptor de célula T (TCR) e/ou um domínio de sinalização que compreende um motivo de ativação de imunorreceptor baseado em tirosina (ITAM). Em algumas modalidades, a região de sinalização intracelular compreende uma região de sinalização secundária ou coestimulatória (regiões de sinalização intracelular secundárias).

[00270] Em algumas modalidades, o domínio de ligação do autoanticorpo compreende um autoantígeno ou seu fragmento. A escolha do autoantígeno pode depender do tipo de autoanticorpo que está sendo atingido. Por exemplo, o autoantígeno pode ser escolhido porque reconhece um autoanticorpo em uma célula alvo, tal como uma célula B, associada a um estado de doença particular, por exemplo, uma doença autoimune, tal como uma doença autoimune mediada por autoanticorpos. Em algumas modalidades, a doença autoimune inclui o pênfigo vulgar (PV). Autoantígenos exemplificadores incluem desmogleina 1 (Dsgl) e Dsg3.

3. Direcionamento Múltiplo

[00271] Em algumas modalidades, as células usadas em conexão com os métodos, usos, artigos de fabricação e composições fornecidos incluem células que empregam estratégias de direcionamento múltiplo.

Em algumas modalidades, as células expressam receptores de antígeno quiméricos de cadeia múltipla (CAR) ou expressam dois ou mais receptores geneticamente modificados na célula, cada um reconhecendo o mesmo de um antígeno diferente e tipicamente cada um incluindo um componente de sinalização intracelular diferente. Tais estratégias de direcionamento múltiplo são descritas, por exemplo, no Pedido de Patente Internacional, Publicação No. WO 2014055668 A1 (que descreve combinações de CARs ativadores e coestimuladores, por exemplo, que visam dois antígenos diferentes presentes individualmente fora do alvo, por exemplo, em células normais, mas presentes juntos apenas nas células da doença ou condição a ser tratada) e Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215) (2013) (que descreve células que expressam um CAR ativador e um inibidor, tal como aqueles nos quais o CAR ativador se liga a um antígeno expresso em células normais ou não doentes e nas células da doença ou condição a ser tratada e o CAR inibitório liga-se a outro antígeno expresso apenas nas células normais ou células que não se deseja tratar.

[00272] Por exemplo, em algumas modalidades, as células incluem um receptor que expressa um primeiro receptor de antígeno geneticamente modificado (por exemplo, CAR ou TCR) que é capaz de induzir um sinal de ativação ou estímulo à célula, geralmente mediante a ligação específica ao antígeno reconhecido pelo primeiro receptor, por exemplo, o primeiro antígeno. Em algumas modalidades, a célula inclui ainda um segundo receptor de antígeno geneticamente modificado (por exemplo, CAR ou TCR), por exemplo, um receptor coestimulatório quimérico, capaz de induzir um sinal coestimulatório para a célula imune, geralmente mediante ligação específica a um segundo antígeno reconhecido pelo segundo receptor. Em algumas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são os mesmos. Em algumas modalidades, o primeiro antígeno e o segundo antígeno são diferentes.

[00273] Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo receptor de antígeno geneticamente modificado (por exemplo, CAR ou TCR) é capaz de induzir um sinal de ativação para a célula. Em algumas modalidades, o receptor inclui um componente de sinalização intracelular que contém os motivos ITAM ou semelhante a ITAM. Em algumas modalidades, a ativação induzida pelo primeiro receptor envolve uma transdução de sinal ou alteração na expressão de proteínas na célula, resultando no início de uma resposta imune, tal como a fosforilação de ITAM e/ou iniciação da cascata de transdução do sinal mediada por ITAM, formação de uma sinapse imunológica e/ou agrupamento de moléculas perto do receptor ligado (por exemplo, CD4 ou CD8, etc.), ativação de um ou mais fatores de transcrição, tais como NF-kB e/ou AP-1, e/ou indução da expressão gênica de fatores tais como citocinas, proliferação e/ou sobrevivência.

[00274] Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo receptor incluem domínios de sinalização intracelular ou regiões de receptores coestimulatórios, tais como CD28, CD137 (4-1BB), OX40 e/ou ICOS. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo receptor incluem um domínio de sinalização intracelular de um receptor coestimulatório que são diferentes. Em uma modalidade, o primeiro receptor contém uma região de sinalização coestimulatória de CD28 e o segundo receptor contém uma região de sinalização coestimulatória de 4-1BB ou vice-versa.

[00275] Em algumas modalidades, o primeiro e/ou o segundo receptor incluem um domínio de sinalização intracelular que contêm motivos ITAM ou semelhantes a ITAM e um domínio de sinalização intracelular de um receptor coestimulatório.

[00276] Em algumas modalidades, o primeiro receptor contém um domínio de sinalização intracelular que contém motivos do tipo ITAM ou semelhantes a ITAM e o segundo receptor contém um domínio de sinalização intracelular de um receptor coestimulatório. O sinal coestimulatório em combinação com o sinal de ativação induzido na mesma célula é aquele que resulta em uma resposta imune, tal como uma resposta imune robusta e sustentada, tal como aumento da expressão gênica, secreção de citocinas e outros fatores e funções efetoras mediadas por células T, tal como a morte celular.

[00277] Em algumas modalidades, nem a ligação do primeiro receptor isoladamente nem a ligação do segundo receptor isoladamente induzem uma resposta imune robusta. Em alguns aspectos, se apenas um receptor é ligado, a célula se torna tolerada ou não responsiva ao antígeno ou inibida e/ou não é induzida a proliferar ou secretar fatores ou desempenhar funções efetoras. Em algumas dessas modalidades, no entanto, quando a pluralidade de receptores está ligada, tal como depois do encontro de uma célula que expressa o primeiro e o segundo antígenos, é alcançada uma resposta desejada, tal como a ativação ou estimulação imune completa, por exemplo, conforme indicado pela secreção de um ou mais citocinas, proliferação, persistência e/ou realização de uma função efetora imunológica, tal como a morte citotóxica de uma célula alvo.

[00278] Em algumas modalidades, os dois receptores induzem, respectivamente, um sinal de ativação e um inibitório à célula, de modo que a ligação de um dos receptores ao seu antígeno ativa a célula ou induz uma resposta, mas a ligação do segundo receptor inibitório ao seu antígeno induz um sinal que suprime ou amortece essa resposta. Exemplos são combinações de CARs ativadores e CARs inibidores ou iCARs. Essa estratégia pode ser usada, por exemplo, na qual o CAR ativador se liga um antígeno expresso em uma doença ou condição, mas que também é expresso em células normais e o receptor inibitório se liga a um antígeno separado que é expresso nas células normais,

mas não em células da doença ou condição.

[00279] Em algumas modalidades, a estratégia de direcionamento múltiplo é empregada em um caso em que um antígeno associado a uma doença ou condição particular é expresso em uma célula não doente e/ou é expresso na própria célula manipulada, de forma transitória (por exemplo, mediante estimulação em associação com manipulação genética) ou permanentemente. Nesses casos, ao exigir a ligação de dois receptores de antígeno separados e individualmente específicos, a especificidade, a seletividade e/ou a eficácia podem ser melhoradas.

[00280] Em algumas modalidades, a pluralidade de antígenos, por exemplo, o primeiro e o segundo antígenos, são expressos na célula, tecido ou doença ou condição a ser atingida, tal como na célula de câncer. Em alguns aspectos, a célula, tecido, doença ou condição é o mieloma múltiplo ou uma célula de mieloma múltiplo. Em algumas modalidades, um ou mais da pluralidade de antígenos geralmente também é expresso em uma célula que não é desejável atingir com a terapia celular, tal como uma célula ou tecido normal ou não doente e/ou as próprias células manipuladas. Em tais modalidades, ao exigir a ligação de múltiplos receptores para obter uma resposta da célula, é alcançada especificidade e/ou eficácia.

4. Receptor de células T

[00281] Em algumas modalidades, são fornecidas células manipuladas, tais como células T, que expressam um receptor de célula T (TCR) ou uma porção de ligação ao antígeno do mesmo que reconhece um epítopo peptídico ou epítopo da célula T de um polipeptídeo alvo, como um antígeno de um tumor, proteína viral ou autoimune.

[00282] Em algumas modalidades, um "receptor de célula T" ou "TCR" é uma molécula que contém as cadeias variáveis α e β (também conhecidas como TCRα e TCRβ, respectivamente) ou cadeias variáveis γ e δ (também conhecidas como TCRa e TCRP, respectivamente), ou porções de ligação ao antígeno e que é capaz de se ligar especificamente a um peptídeo ligado a uma molécula de MHC. Em algumas modalidades, o TCR está na forma αβ. Tipicamente, os TCRs que existem nas formas αβ e γδ são geralmente estruturalmente semelhantes, mas as células T que as expressam podem ter locais ou funções anatômicas distintas. Um TCR pode ser encontrado na superfície de uma célula ou na forma solúvel. Geralmente, um TCR é encontrado na superfície das células T (ou linfócitos T), onde geralmente é responsável pelo reconhecimento de antígenos ligados às moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC).

[00283] Salvo indicação em contrário, a expressão "TCR" deve ser entendida como abrangendo TCRs completos, assim como porções de ligação ao antígeno ou seus fragmentos de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR intacto ou de extensão completa, incluindo TCRs na forma αβ ou γδ. Em algumas modalidades, o TCR é uma porção de ligação a antígeno que é menor que um TCR de extensão completa, mas que se liga a um peptídeo específico ligado a uma molécula de MHC, tal como se liga a um complexo MHC- peptídeo. Em alguns casos, uma porção ou fragmento de ligação ao antígeno de um TCR pode conter apenas uma porção dos domínios estruturais de um TCR de extensão completa ou intacto, mas ainda é capaz de se ligar ao epítopo peptídico, tal como o complexo MHC- peptídeo, ao qual o TCR completo se liga. Em alguns casos, uma porção de ligação ao antígeno contém os domínios variáveis de um TCR, tais como uma cadeia α variável e a cadeia β variável de um TCR, suficientes para formar um local de ligação para a ligação específica ao complexo MHC-peptídeo. Geralmente, as cadeias variáveis de um TCR contêm regiões determinantes de complementaridade envolvidas no reconhecimento do peptídeo, MHC e/ou complexo MHC-peptídeo.

[00284] Em algumas modalidades, os domínios variáveis do TCR contêm alças hipervariáveis ou regiões determinantes de complementaridade (CDRs), que geralmente são os principais contribuintes para o reconhecimento de antígenos e capacidades e especificidade de ligação. Em algumas modalidades, uma CDR de um TCR ou uma combinação das mesmas forma todo ou substancialmente todo o sítio de ligação ao antígeno de uma determinada molécula de TCR. As várias CDRs dentro de uma região variável de uma cadeia de TCR geralmente são separadas por regiões estruturais (FRs), que geralmente exibem menos variabilidade entre as moléculas de TCR em comparação com as CDRs (veja, por exemplo, Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. EUA. 87:9138, 1990; Chothia et al., EMBO J. 7: 3745, 1988; veja também Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol. 27:55, 2003). Em algumas modalidades, CDR3 é a principal CDR responsável pela ligação ou especificidade do antígeno ou é a mais importante entre as três CDRs em uma determinada região variável do TCR para reconhecimento do antígeno e/ou para interação com a porção peptídica processada do complexo MHC-peptídeo. Em alguns contextos, a CDR1 da cadeia alfa pode interagir com a parte N-terminal de certos peptídeos antigênicos. Em alguns contextos, CDR1 da cadeia beta pode interagir com a parte C-terminal do peptídeo. Em alguns contextos, a CDR2 contribui mais fortemente para ou é a principal CDR responsável pela interação ou reconhecimento da porção MHC do complexo MHC- peptídeo. Em algumas modalidades, a região variável da cadeia β pode conter uma região hipervariável adicional (CDR4 ou HVR4), que geralmente está envolvida na ligação de superantígenos e não no reconhecimento de antígenos (Kotb (1995) Clinical Microbiology Reviews, 8: 411-426).

[00285] Em algumas modalidades, um TCR também pode conter um domínio constante, um domínio transmembrana e/ou uma cauda citoplasmática curta (ver, por exemplo, Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3ª Ed., Current Biology Publications p. 4:33, 1997). Em alguns aspectos, cada cadeia do TCR pode possuir um domínio variável de imunoglobulina N-terminal, um domínio constante de imunoglobulina, uma região transmembrana e uma cauda citoplasmática curta na extremidade C-terminal. Em algumas modalidades, um TCR está associado a proteínas invariantes do complexo CD3 envolvidas na mediação da transdução de sinal.

[00286] Em algumas modalidades, uma cadeia de TCR contém um ou mais domínios constantes. Por exemplo, a porção extracelular de uma determinada cadeia de TCR (por exemplo, cadeia α ou cadeia β) pode conter dois domínios semelhantes à imunoglobulina, tais como um domínio variável (por exemplo, Vα ou νβ; tipicamente os aminoácidos 1 a 116 com base em Numeração de Kabat, Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, National Public Service National Institutes of Health, 1991, 5ª ed.) e um domínio constante (por exemplo, domínio constante da cadeia α ou Cα, tipicamente nas posições 117 a 259 da cadeia com base na numeração Kabat ou domínio constante da cadeia β ou Cβ, tipicamente nas posições 117 a 295 da cadeia com base em Kabat) adjacente à membrana celular. Por exemplo, em alguns casos, a porção extracelular do TCR formada pelas duas cadeias contém dois domínios constantes proximais à membrana e dois domínios variáveis distais à membrana, cujos domínios variáveis contêm CDRs. O domínio constante do TCR pode conter sequências de conexão curtas nas quais um resíduo de cisteína forma uma ligação dissulfeto, ligando assim as duas cadeias do TCR. Em algumas modalidades, um TCR pode ter um resíduo de cisteína adicional em cada uma das cadeias α e β, de modo que o TCR contenha duas ligações dissulfeto nos domínios constantes.

[00287] Em algumas modalidades, as cadeias de TCR contêm um domínio transmembrana. Em algumas modalidades, o domínio transmembrana é carregado positivamente. Em alguns casos, a cadeia de TCR contém uma cauda citoplasmática. Em alguns casos, a estrutura permite que o TCR se associe a outras moléculas tal como CD3 e suas subunidades. Por exemplo, um TCR que contém domínios constantes com uma região transmembrana pode ancorar a proteína na membrana celular e se associar a subunidades invariantes do aparelho ou complexo de sinalização de CD3. As caudas intracelulares das subunidades de sinalização de CD3 (por exemplo, CD3y, CD3δ, CD3ε e CD3ζ) contêm um ou mais motivos de ativação de imunorreceptor baseados em tirosina ou ITAM que estão envolvidos na capacidade de sinalização do complexo de TCR.

[00288] Em algumas modalidades, o TCR pode ser um heterodímero de duas cadeias α e β (ou opcionalmente γ e δ) ou pode ser um construto de TCR de cadeia única. Em algumas modalidades, o TCR é um heterodímero contendo duas cadeias separadas (cadeias α e β ou cadeias γ e δ) que estão ligadas, tal como por uma ligação de dissulfeto ou ligações de dissulfeto.

[00289] Em algumas modalidades, o TCR pode ser gerado a partir de uma sequência conhecida de TCR, tal como sequências de cadeias Vα,β, para as quais uma sequência codificadora substancialmente de extensão completa está prontamente disponível. Podem ser utilizados métodos para obter sequências de TCR de extensão completa, incluindo sequências da cadeia V, a partir de fontes celulares. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos que codificam o TCR podem ser obtidos a partir de uma variedade de fontes, tais como por amplificação por reação em cadeia da polimerase (PCR) dos ácidos nucleicos que codificam o TCR dentro ou isolados de uma determinada célula ou células ou síntese disponível publicamente nas Sequências de

DNA de TCR.

[00290] Em algumas modalidades, o TCR é obtido a partir de uma fonte biológica, tal como células, tal como uma célula T (por exemplo, célula T citotóxica), hibridomas de células T ou outra fonte disponível publicamente. Em algumas modalidades, as células T podem ser obtidas a partir de células isoladas in vivo. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR selecionado do timo. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR restrito a um neo-epitopo. Em algumas modalidades, as células T podem ser um hibridoma c ou clone de célula T cultivados. Em algumas modalidades, o TCR ou sua porção de ligação ao antígeno ou seu fragmento de ligação ao antígeno podem ser gerado sinteticamente a partir do conhecimento da sequência do TCR.

[00291] Em algumas modalidades, o TCR é gerado a partir de um TCR identificado ou selecionado a partir do rastreamento de uma biblioteca de TCRs candidatos contra um antígeno polipeptídico alvo ou seu epítopo de célula T alvo. As bibliotecas de TCR podem ser geradas por amplificação do repertório de Vα e νβ a partir de células T isoladas de um indivíduo, incluindo células presentes em PBMCs, baço ou outro órgão linfoide. Em alguns casos, as células T podem ser amplificadas a partir de linfócitos que infiltram tumores (TILs). Em algumas modalidades, as bibliotecas de TCR podem ser geradas a partir de células CD4+ ou CD8+. Em algumas modalidades, os TCRs podem ser amplificados a partir de uma fonte de células T de um indivíduo saudável normal, isto é, bibliotecas normais de TCR. Em algumas modalidades, os TCRs podem ser amplificados a partir de uma fonte de células T de um indivíduo doente, isto é, bibliotecas de TCR doentes. Em algumas modalidades, os iniciadores degenerados são usados para amplificar o repertório de genes de Vα e νβ, tal como por RT-PCR em amostras, tal como células T, obtidas de humanos. Em algumas modalidades, as bibliotecas de scTv podem ser montadas a partir de bibliotecas de Vα e νβ naives nas quais os produtos amplificados são clonados ou montados para serem separados por um ligante. Dependendo da fonte do indivíduo e das células, as bibliotecas podem ser específicas para o alelo de HLA. Alternativamente, em algumas modalidades, as bibliotecas de TCR podem ser geradas por mutagênese ou diversificação de uma molécula parental ou do arcabouço de TCR. Em alguns aspectos, os TCRs são submetidos a evolução direcionada, tal como por mutagênese, por exemplo, da cadeia α ou β. Em alguns aspectos, resíduos particulares nas CDRs do TCR estão alterados. Em algumas modalidades, os TCRs selecionados podem ser modificados por maturação por afinidade. Em algumas modalidades, as células T específicas do antígeno podem ser selecionadas, tal como por meio de triagem para avaliar a atividade dos CTL contra o peptídeo. Em alguns aspectos, TCRs, por exemplo, presentes nas células T específicas para o antígeno, podem ser selecionados, tal como por atividade de ligação, por exemplo, afinidade ou avidez particular pelo antígeno.

[00292] Em algumas modalidades, o TCR ou sua porção de ligação ao antígeno é aquele que foi modificado ou manipulado. Em algumas modalidades, métodos de evolução direcionada são usados para gerar TCRs com propriedades alteradas, tais como maior afinidade por um complexo específico de MHC-peptídeo. Em algumas modalidades, a evolução direcionada é alcançada por métodos de apresentação, que incluem entre outros, apresentação em leveduras (Holler et al. (2003) Nat Immunol, 4, 55-62; Holler et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA, 97, 5387-92), apresentação em fagos (Li et al. ( 2005) Nat Biotechnol, 23, 349-54) ou apresentação em células T (Chervin et al. ( 2008) J. Immunol Methods, 339, 175-84). Em algumas modalidades, as abordagens de apresentação envolvem a manipulação ou modificação de um TCR conhecido, parental ou de referência. Por exemplo, em alguns casos, um TCR do tipo selvagem pode ser usado como modelo para produzir

TCRs mutagenizados nos quais um ou mais resíduos das CDRs são mutados e mutantes com uma propriedade alterada desejada, tal como maior afinidade por um antígeno alvo desejado, são selecionados.

[00293] Em algumas modalidades, peptídeos de um polipeptídeo alvo para uso na produção ou geração de um TCR de interesse são conhecidos ou podem ser facilmente identificados. Em algumas modalidades, os peptídeos adequados para uso na geração de TCRs ou porções de ligação ao antígeno podem ser determinados com base na presença de um motivo restrito de HLA em um polipeptídeo alvo de interesse, tal como um polipeptídeo alvo descrito abaixo. Em algumas modalidades, os peptídeos são identificados usando modelos de previsão por computador disponíveis. Em algumas modalidades, para predizer sítios de ligação ao MHC classe I, esses modelos incluem, mas não estão limitados a ProPred1 (Singh e Raghava (2001) Bioinformatics 17(12):1236-1237 e SYFPEITHI (veja Schuler et al. ( 2007) Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, 409(1): 75-93 2007). Em algumas modalidades, o epítopo restrito ao MHC é HLA-A0201, que é expresso em aproximadamente 39-46% de todos os caucasianos e, portanto, representa uma escolha adequada de antígeno MHC para uso na preparação de um TCR ou outra molécula de ligação ao MHC- peptídeo.

[00294] Motivos de ligação ao HLA-A0201 e os sítios de clivagem para proteassomas e imuno-proteassomas usando modelos de previsão por computador podem ser usados. Para predizer sítios de ligação ao MHC classe I, esses modelos incluem, mas não estão limitados a ProPred1 (descrito em mais detalhes em Singh e Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236- 1237 2001) e SYFPEITHI (veja Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction, em Immunoinformatics Methods in Molecular Biology, vol 409(1): 75-93 2007).

[00295] Em algumas modalidades, o TCR ou sua porção de ligação ao antígeno podem ser uma proteína natural produzida de forma recombinante ou uma forma mutada na qual uma ou mais propriedades, tais como a característica de ligação, tenham sido alteradas. Em algumas modalidades, um TCR pode ser derivado de uma de várias espécies de animal, tal como humano, camundongo, rato ou outro mamífero. Um TCR pode estar ligado à célula ou em forma solúvel. Em algumas modalidades, para fins dos métodos fornecidos, o TCR está na forma ligada à célula, expresso na superfície de uma célula.

[00296] Em algumas modalidades, o TCR é um TCR de extensão completa. Em algumas modalidades, o TCR é uma porção de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, o TCR é um TCR dimérico (dTCR). Em algumas modalidades, o TCR é um TCR de cadeia única (sc-TCR). Em algumas modalidades, um dTCR ou scTCR tem as estruturas descritas em WO 03/020763, WO 04/033685, WO 2011/044186.

[00297] Em algumas modalidades, o TCR contém uma sequência que corresponde a sequência transmembrana. Em algumas modalidades, o TCR contém uma sequência que corresponde a sequências citoplasmáticas. Em algumas modalidades, o TCR é capaz de formar um complexo de TCR com CD3. Em algumas modalidades, qualquer um dos TCRs, incluindo um dTCR ou scTCR, pode ser ligado a domínios de sinalização que produzem um TCR ativo na superfície de uma célula T. Em algumas modalidades, o TCR é expresso na superfície das células.

[00298] Em algumas modalidades, um dTCR contém um primeiro polipeptídeo em que uma sequência que corresponde a uma sequência da região variável de cadeia α de TCR é fundida na terminação N de uma sequência que corresponde a uma sequência extracelular da região constante de cadeia α de TCR e um segundo polipeptídeo em que uma sequência que corresponde a uma sequência da região variável da cadeia β de TCR é fundida na terminação N de uma sequência que corresponde a uma sequência extracelular da região constante da cadeia β de TCR, o primeiro e o segundo polipeptídeos sendo ligados por uma ligação de dissulfeto. Em algumas modalidades, a ligação pode corresponder à ligação dissulfeto intercadeia nativa presente nos TCRs αβ diméricos nativos. Em algumas modalidades, as ligações de dissulfeto intercadeia não estão presentes em um TCR nativo. Por exemplo, em algumas modalidades, uma ou mais cisteínas podem ser incorporadas nas sequências extracelulares da região constante do par de polipeptídeos de dTCR. Em alguns casos, uma ligação dissulfeto nativa e uma não nativa podem ser desejáveis. Em algumas modalidades, o TCR contém uma sequência transmembrana para ancorar na membrana.

[00299] Em algumas modalidades, um dTCR contém uma cadeia α de TCR que contém um domínio α variável, um domínio α constante e um primeiro motivo de dimerização acoplado a terminação C do domínio constante α, e uma cadeia de TCR que compreende um domínio β variável, um domínio β constante e um primeiro motivo de dimerização acoplado a terminação C do domínio β constante, em que o primeiro e o segundo motivos de dimerização interagem facilmente para formar uma ligação covalente entre um aminoácido no primeiro motivo de dimerização e um aminoácido no segundo motivo de dimerização que liga a cadeia α de TCR a e cadeia β de TCR juntas.

[00300] Em algumas modalidades, o TCR é um scTCR. Tipicamente, um scTCR pode ser gerado usando métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Veja, por exemplo, Soo Hoo, W. F. et al. PNAS (EUA) 89, 4759 (1992); Wulfing, C. e Pluckthun, A., J. Mol. Biol. 242, 655 (1994); Kurucz, I. et al. PNAS (EUA) 90 3830 (1993); PCT internacionais publicadas WO 96/13593, WO 96/18105, WO99/60120,

WO99/ 18129, WO 03/020763, WO2011/044186; e Schlueter, C.J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859 (1996). Em algumas modalidades, um scTCR contém uma ligação de dissulfeto intercadeia não nativa introduzida para facilitar a associação das cadeias de TCR (veja, por exemplo, PCT Internacional Publicado No. WO 03/020763). Em algumas modalidades, um scTCR é um TCR truncado não ligado por dissulfeto, no qual zíperes de leucina heterólogos fundidos com suas terminações C facilitam a associação de cadeia (veja, por exemplo, PCT Internacional Publicado No. WO99/60120). Em algumas modalidades, um scTCR contém um domínio variável de TCRα covalentemente ligado a um domínio variável de TCRβ por meio de um ligante peptídico (veja, por exemplo, PCT Internacional Publicado Nº W099/18129).

[00301] Em algumas modalidades, um scTCR contém um primeiro segmento constituído por uma sequência de aminoácidos que corresponde a uma região variável da cadeia α de um TCR, um segundo segmento constituído por uma sequência de aminoácidos que corresponde a uma sequência de região variável em cadeia β de TCR fundida a terminação N de um sequência de aminoácidos que corresponde a uma sequência extracelular do domínio constante da cadeia β de TCR e uma sequência ligante que liga a terminação C do primeiro segmento a terminação N do segundo segmento.

[00302] Em algumas modalidades, um scTCR contém um primeiro segmento constituído por uma sequência de região variável da cadeia α fundida a terminação N de uma sequência de domínio constante extracelular de cadeia α e um segundo segmento constituído por uma sequência de região variável de cadeia β fundida a terminação N de uma sequência da cadeia β constante extracelular e uma sequência transmembrana e, opcionalmente, uma sequência ligante que liga a terminação C do primeiro segmento a terminação N do segundo segmento.

[00303] Em algumas modalidades, um scTCR contém um primeiro segmento constituído por uma sequência de região variável de cadeia β de TCR fundida a terminação N de uma sequência do domínio constante extracelular de cadeia β e um segundo segmento constituído por uma sequência de região variável de cadeia α fundido a terminação N de uma sequência, uma sequência extracelular constante da cadeia α e uma sequência transmembrana e, opcionalmente, uma sequência de ligação que liga a terminação C do primeiro segmento a terminação N do segundo segmento.

[00304] Em algumas modalidades, o ligante de um scTCRs que liga o primeiro e o segundo segmentos de TCR pode ser qualquer ligante capaz de formar uma única fita polipeptídica, enquanto mantém a especificidade de ligação ao TCR. Em algumas modalidades, a sequência do ligante pode, por exemplo, ter a fórmula -P-AA-P- em que P é prolina e AA representa uma sequência de aminoácidos em que os aminoácidos são glicina e serina. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo segmentos são pareados de modo que as sequências da região variável dos mesmos sejam orientadas por tal ligação. Portanto, em alguns casos, o ligante tem um comprimento suficiente para abranger a distância entre a terminação C do primeiro segmento e a terminação N do segundo segmento, ou vice-versa, mas não é muito longo para bloquear ou reduzir a ligação do scTCR ao ligante alvo. Em algumas modalidades, o ligante pode conter de ou de cerca de 10 a 45 aminoácidos, tal como 10 a 30 aminoácidos ou 26 a 41 resíduos de aminoácidos, por exemplo 29, 30, 31 ou 32 aminoácidos. Em algumas modalidades, o ligante tem a fórmula -PGGG-(SGGGG) 5-P- em que P é prolina, G é glicina e S é serina (SEQ ID NO: 23). Em algumas modalidades, o ligante tem a sequência GSADDAKKDAAKKDGKS (SEQ ID NO: 24).

[00305] Em algumas modalidades, o scTCR contém uma ligação de dissulfeto covalente que liga um resíduo da região de imunoglobulina do domínio constante da cadeia α a um resíduo da região de imunoglobulina do domínio constante da cadeia β. Em algumas modalidades, a ligação de dissulfeto intercadeia em um TCR nativo não está presente. Por exemplo, em algumas modalidades, uma ou mais cisteínas podem ser incorporadas nas sequências extracelulares da região constante dos primeiro e segundo segmentos do polipeptídeo de scTCR. Em alguns casos, uma ligação de dissulfeto nativa e uma não nativa podem ser desejáveis.

[00306] Em algumas modalidades de um dTCR ou scTCR contendo ligações de dissulfeto intercadeias introduzidas, as ligações de dissulfeto nativas não estão presentes. Em algumas modalidades, a uma ou mais das cisteínas nativas que formam uma ligação de dissulfeto intercadeia nativa são substituídas por outro resíduo, tal como uma serina ou alanina. Em algumas modalidades, uma ligação de dissulfeto introduzida pode ser formada pela mutação de resíduos diferentes de cisteína no primeiro e segundo segmentos em cisteína. Exemplos de ligações de dissulfeto não nativas de um TCR são descritas em publicações PCT internacional n° WO2006/000830.

[00307] Em algumas modalidades, o TCR ou seu fragmento de ligação ao antígeno exibe uma afinidade com uma constante de equilíbrio de ligação para um antígeno alvo entre ou entre cerca de 10- 5 e 10-12 M e todos os valores e faixas individuais entre esses. Em algumas modalidades, o antígeno alvo é um complexo MHC-peptídeo ou ligante.

[00308] Em algumas modalidades, um ácido nucleico ou ácidos nucleicos que codificam um TCR, tal como as cadeias α e β, podem ser amplificados por PCR, clonagem ou outros meios adequados e clonados em um vetor ou vetores de expressão adequados. O vetor de expressão pode ser qualquer vetor de expressão recombinante adequado e pode ser usado para transformar ou transfectar qualquer hospedeiro adequado. Os vetores adequados incluem aqueles projetados para propagação e expansão ou expressão ou ambos, tais como plasmídeos e vírus.

[00309] Em algumas modalidades, o vetor pode um vetor da série pUC (Fermentas Life Sciences), da série pBluescript (Stratagene, LaJolla, Califórnia), da série pET (Novagen,Madison, Wis.), da série pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia) ou da série pEX (Clontech, Palo Alto, Califórnia). Em alguns casos, vetores de bacteriófagos, tais como λG10, λGT11, λZapII (Stratagene), λEMBL4 e λΝΜΙ149, também podem ser usados. Em algumas modalidades, os vetores de expressão de plantas podem ser usados e incluem pBI0l, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 e pBIN19 (Clontech). Em algumas modalidades, os vetores de expressão em animal incluem pEUK-C1, pMAM e pMAMneo (Clontech). Em algumas modalidades, um vetor viral é usado, tal como um vetor retroviral.

[00310] Em algumas modalidades, os vetores de expressão recombinantes podem ser preparados usando técnicas padronizadas de DNA recombinante. Em algumas modalidades, os vetores podem conter sequências reguladoras, tal como códons de iniciação e terminação da transcrição e tradução, que são específicos para o tipo de hospedeiro (por exemplo, bactéria, fungo, planta ou animal) no qual o vetor deve ser introduzido, tal como apropriado e levando em consideração se o vetor é baseado em DNA ou RNA. Em algumas modalidades, o vetor pode conter um promotor não nativo operativamente ligado à sequência de nucleotídeos que codifica o TCR ou a porção de ligação ao antígeno (ou outra molécula de ligação ao MHC-peptídeo). Em algumas modalidades, o promotor pode ser um promotor não viral ou um promotor viral, tal como um promotor de citomegalovírus (CMV), um promotor de SV40, um promotor de RSV e um promotor encontrado na repetição terminal longa da célula-tronco de vírus de murino. Outros promotores conhecidos também são contemplados.

[00311] Em algumas modalidades, para gerar um vetor que codifica um TCR, as cadeias a e β são amplificadas por PCR a partir de cDNA total isolado de um clone de célula T que expressa o TCR de interesse e clonado em um vetor de expressão. Em algumas modalidades, as cadeias a e β são clonadas no mesmo vetor. Em algumas modalidades, as cadeias a e β são clonadas em diferentes vetores. Em algumas modalidades, as cadeias a e β geradas são incorporadas a um retroviral, por exemplo, vetor lentiviral. B. Ácidos Nucleicos e Vetores

[00312] Também são fornecidos um ou mais polinucleotídeos (por exemplo, moléculas de ácido nucleico) que codificam receptores recombinantes, vetores para a manipulação genética de células para expressar os receptores e métodos para produzir as células manipuladas. Em alguns aspectos, o receptor recombinante é ou contém um receptor de antígeno quimérico (CAR). Em alguns aspectos, o receptor recombinante é ou contém um receptor de células T (TCR), por exemplo, um TCR transgênico.

[00313] Em alguns casos, a sequência de ácido nucleico que codifica o receptor recombinante, por exemplo, receptor de antígeno quimérico (CAR) contém uma sequência de sinal que codifica um peptídeo de sinal. Exemplos não limitantes de peptídeos de sinal incluem, por exemplo, o peptídeo de sinal da cadeia alfa de GMCSFR descrito na SEQ ID NO: 26 e codificado pela sequência de nucleotídeos descrita na SEQ ID NO: 25 ou o peptídeo de sinal alfa de CD8 descrito SEQ ID NO:18.

[00314] Em certos casos em que as moléculas de ácido nucleico codificam duas ou mais cadeias polipeptídicas diferentes, cada uma das cadeias polipeptídicas pode ser codificada por uma molécula de ácido nucleico separada. Por exemplo, são fornecidos dois ácidos nucleicos separados e cada um pode ser transferido ou introduzido individualmente na célula para expressão na célula.

[00315] Em algumas modalidades, tal como aquelas em que o polinucleotídeo contém uma primeira e segunda sequência de ácido nucleico, as sequências codificadoras que codificam cada uma das diferentes cadeias polipeptídicas podem ser operativamente ligadas a um promotor, que pode ser o mesmo ou diferente. Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucleico pode conter um promotor que direciona a expressão de duas ou mais cadeias polipeptídicas diferentes. Em algumas modalidades, tais moléculas de ácido nucleico podem ser multicistrônicas (bicistrônicas ou tricistrônicas, veja, por exemplo, Patente U.S. No. 6.060.273). Em algumas modalidades, as unidades de transcrição podem ser manipuladas como uma unidade bicistrônica que contém um IRES (sítio interno de entrada do ribossomo), que permite a coexpressão de produtos de gene por uma mensagem de um único promotor. Alternativamente, em alguns casos, um único promotor pode direcionar a expressão de um RNA que contém, em uma única fase de leitura aberta (ORF), dois ou três genes separados um do outro por sequências que codificam um peptídeo de autoclivagem (por exemplo, sequências 2A ) ou um sítio de reconhecimento de protease (por exemplo, furina). A ORF codifica assim um único polipeptídeo, que, durante (no caso de 2A) ou após a tradução, é processado nas proteínas individuais. Em alguns casos, o peptídeo, como um T2A, pode fazer com que o ribossomo pule (pulo do ribossomo) a síntese de uma ligação peptídica na terminação C de um elemento 2A, levando à separação entre o final da sequência 2A e o próximo peptídeo a jusante {veja, por exemplo, de Felipe. Vacinas Genéticas e Ther. 2:13 (2004) e de Felipe et al. Traffic 5: 616-626 (2004)). Vários elementos 2A são conhecidos. Exemplos de sequências

2A que podem ser usadas nos métodos e sistemas aqui descritos, incluem sem limitação, sequências 2A do vírus da febre aftosa (F2A, por exemplo, SEQ ID NO: 22), vírus A da rinite equina (E2A, por exemplo, SEQ ID NO: 21), vírus Thosea asigna (T2A, por exemplo, SEQ ID NO: 6 ou 17) e tescovirus-1 porcino (P2A, por exemplo, SEQ ID NO:19 ou 20), conforme descrito na Publicação de Patente US No. 20070116690.

[00316] Em algumas modalidades, genes marcadores extrínsecos podem, em alguns casos, ser utilizados em conexão com terapias de células manipuladas para permitir a detecção ou seleção de células e, em alguns casos, também para promover o suicídio celular. Marcadores substitutos exemplificadores podem incluir formas truncadas de polipeptídeos da superfície celular, tais como formas truncadas que não são funcionais e que não transduzem ou não são capazes de transduzir um sinal ou um sinal normalmente transduzido pela forma de extensão completa do polipeptídeo de superfície celular, e/ou não são ou não são capazes de internalizar. Polipeptídeos de superfície celular truncados exemplificadores, incluindo formas truncadas de fatores de crescimento ou outros receptores, tais como um receptor 2 do fator de crescimento epidérmico humano truncado (tHER2), um receptor de fator de crescimento epidérmico truncado (tEGFR, sequência de tEGFR exemplificadora apresentada na SEQ ID NO: 7 ou 16 ou um antígeno de membrana específico para a próstata (PSMA) ou sua forma modificada. O tEGFR pode conter um epítopo reconhecido pelo anticorpo cetuximab (Erbitux®) ou outro anticorpo terapêutico anti- EGFR ou molécula de ligação, que pode ser usado para identificar ou selecionar células que tenham sido manipuladas com o construto de tEGFR e uma proteína exógena codificada e/ou eliminar ou separar as células que expressam a proteína exógena codificada. Veja Patente U.S. No. 8.802.374 e Liu et al., Nature Biotech. 2016 Abril; 34 (4): 430- 434). Em alguns aspectos, o marcador, por exemplo, marcador substituto, inclui todo ou parte {por exemplo, forma truncada) de CD34, um NGFR, um CD 19 ou um CD19 truncado, por exemplo, um CD19 não humano truncado ou receptor do fator de crescimento epidérmico (por exemplo, tEGFR).

[00317] Em algumas modalidades, o marcador é ou compreende uma proteína fluorescente, tal como a proteína verde fluorescente (GFP), proteína verde fluorescente intensificada (EGFP), tal como GFP super dobrada (sfGFP), proteína fluorescente vermelha (RFP), tal como tdTomato, mCherry, mStrawberry, AsRed2, DsRed ou DsRed2, proteína fluorescente cianp (CFP), proteína fluorescente verde azul (BFP), proteína fluorescente azul intensificada (EBFP) e proteína fluorescente amarela (YFP) e suas variantes, incluindo variantes de espécies, variantes monoméricas e variantes otimizadas por códon e/ou intensificadas das proteínas fluorescentes. Em algumas modalidades, o marcador é ou compreende uma enzima, tal como uma luciferase, o gene lacZ de E. coli, fosfatase alcalina, fosfatase alcalina embrionária secretada (SEAP), cloranfenicol acetil transferase (CAT). Exemplos de genes repórteres emissores de luz incluem luciferase (luc), β- galactosidase, cloranfenicol acetiltransferase (CAT), β-glicuronidase (GUS) ou variantes dos mesmos.

[00318] Em algumas modalidades, o marcador é um marcador de seleção. Em algumas modalidades, o marcador de seleção é ou compreende um polipeptídeo que confere resistência a agentes ou fármacos exógenos. Em algumas modalidades, o marcador de seleção é um gene de resistência a antibióticos. Em algumas modalidades, o marcador de seleção é um gene de resistência a antibióticos que confere resistência a antibióticos para uma célula de mamífero. Em algumas modalidades, o marcador de seleção é ou compreende um gene de resistência a Puromicina, um gene de resistência a Higromicina, um gene de resistência a Blasticidin, um gene de resistência a Neomicina, um gene de resistência a Geneticina ou um gene de resistência a Zeocina ou uma forma modificada dos mesmos.

[00319] Em algumas modalidades, o ácido nucleico que codifica o marcador está operativamente ligado a um polinucleotídeo que codifica para uma sequência ligante, tal como uma sequência ligante clivável, por exemplo, T2A. Por exemplo, um marcador e, opcionalmente, uma sequência de ligação, pode ser qualquer um tal como divulgado no PCT Pub. Mo. WO2014031687. Por exemplo, o marcador pode ser um EGFR truncado (tEGFR) que está, opcionalmente, ligado a uma sequência ligante, tal como uma sequência de ligante clivável T2A. Um polipeptídeo exemplicador para um EGFR truncado (por exemplo, tEGFR) compreende a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO: 7 ou 16 ou uma sequência de aminoácidos que exibe pelo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a SEQ ID NO: 7 ou 16. Em alguns exemplos, um receptor de fator de crescimento epidérmico truncado (EGFRt), tal como descrito nas SEQ ID NOs: 7 ou 16, em alguns casos pode ser coexpresso com um transgene de interesse (um CAR ou TCR) em células transduzidas (veja por exemplo Patente U.S. No. 8.802.374). EGFRt pode conter um epítopo reconhecido pelo anticorpo cetuximab (Erbitux®) ou outro anticorpo terapêutico ou molécula de ligação anti-EGFR, que pode ser usado para identificar ou selecionar células que foram manipuladas com o construto de EGFRt e outro receptor recombinante, tal como um receptor de antígeno quimérico (CAR) e/ou para eliminar ou separar células que expressam o receptor. Veja Patente U.S. No. 8.802.374 e Liu et al., Nature Biotech. 2016 Abril; 34 (4): 430-434).

[00320] Também são fornecidos vetores ou construtos que contêm esses ácidos nucleicos e/ou polinucleotídeos. Em algumas modalidades, os vetores ou construtos contêm um ou mais promotores operativamente ligados ao ácido nucleico que codifica o receptor recombinante para direcionar sua expressão. Em algumas modalidades, o promotor está operativamente ligado a uma ou mais moléculas ou polinucleotídeos de ácido nucleico. Assim, também são fornecidos vetores, tais como aqueles que contêm qualquer um dos polinucleotídeos aqui fornecidos.

[00321] Em alguns casos, o vetor é um vetor viral, tal como um vetor retroviral, por exemplo, um vetor lentiviral ou um vetor gamaretroviral. Também são fornecidas composições que contêm esses vetores ou combinação de vetores. Em algumas modalidades, o conjunto ou combinação de vetores é usado em conjunto para a manipulação de células. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo vetores do conjunto são introduzidos simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem em uma célula para manipulação.

[00322] Em algumas modalidades, os vetores incluem vetores virais, por exemplo, retrovirais ou lentivirais, vetores ou transposons não virais, por exemplo, Sistema de transposons Sleeping Beauty, vetores derivados do vírus símio 40 (SV40), adenovírus, vírus adenoassociado (AAV), vetores lentivirais ou vetores retrovirais, tais como vetores gama- retrovirais, vetor retroviral derivado do vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV) , vírus do sarcoma mieloproliferativo (MPSV), vírus das células-tronco embrionárias de murino (MESV), vírus das células- tronco de murino (MSCV), vírus formador do foco do baço (SFFV) ou vírus adenoassociado (AAV). C. Vetores e métodos para a manipulação genética

[00323] Vários métodos para a introdução de componentes geneticamente modificados, por exemplo, receptores recombinantes, por exemplo, CARs ou TCRs, são bem conhecidos. Métodos exemplificadores incluem aqueles para transferência de ácidos nucleicos que codificam os receptores, incluindo a via viral, por exemplo,

retroviral ou lentiviral, transdução, transposons e eletroporação. Em algumas modalidades, a expressão na superfície de glicano é avaliada em uma composição de células que são coletadas antes, durante ou imediatamente após o processo de manipulação genética. Em algumas modalidades, a expressão de glicano na superfície é avaliada e comparada entre composições de células em estágios que correspondentes do processo para introduzir componentes geneticamente modificados. Em algumas modalidades, as composições são ou foram manipuladas para expressar o mesmo receptor recombinante, mas por métodos diferentes de introdução do material genético.

[00324] Em algumas modalidades, a transferência de genes é realizada primeiro pela estimulação da célula, tal como pela combinação com um estímulo que induz uma resposta tal como a proliferação, sobrevivência e/ou ativação, por exemplo, conforme medido pela expressão de uma citocina ou marcador de ativação, seguida pela transdução das células ativadas e expansão em cultura para números suficientes para aplicações clínicas.

[00325] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes são transferidos para as células usando partículas infecciosas de vírus recombinantes, tais como, por exemplo, vetores derivados do vírus 40 de símio (SV40), adenovírus, vírus adenoassociado (AAV). Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes são transferidos para as células T usando vetores lentivirais ou vetores retrovirais recombinantes, tais como vetores gama- retrovirais (veja, por exemplo, Koste et al. Gene Therapy doi:

10.1038/gt.2014.25 (2014); Carlens et al. Exp Hematol, 28 (10):1137-46 (2000); Alonso-Camino et al. Mol Ther Nucl Acids, 2, e93 (2013); Park et al., Trends Biotechnol, 29 de novembro (11): 550-557 (2011). Em algumas modalidades, o vírus é um vírus adenoassociado (AAV).

[00326] Em algumas modalidades, o vetor retroviral possui uma longa sequência de repetição terminal (LTR), por exemplo, um vetor retroviral derivado do vírus da leucemia murina de Moloney (MoMLV), vírus do sarcoma mieloproliferativo (MPSV), vírus da célula-tronco embrionária de murino (MESV), vírus das células-tronco de murino (MSCV), vírus formador do foco esplênico (SFFV). A maioria dos vetores retrovirais são derivados de retrovírus de murino. Em algumas modalidades, os retrovírus incluem aqueles derivados de qualquer fonte de células aviária ou de mamífero. Os retrovírus são tipicamente anfotrópicos, o que significa que são capazes de infectar células hospedeiras de várias espécies, incluindo seres humanos. Em uma modalidade, o gene a ser expresso substitui as sequências de gag, pol e/ou env retrovirais. Vários sistemas retrovirais ilustrativos foram descritos (por exemplo, Pat. US No. 5.219.740; 6.207.453; 5.219.740; Miller e Rosman, BioTechniques, 7:980-990 (1989); Miller, A. D. Human Gene Therapy, 1: 5-14 (1990); Scarpa et al. Virology, 180: 849-852 (1991); Burns et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 8033-8037 (1993); e Boris-Lawrie e Temin, Cur. Opin. Genet. Develop., 3:102-109 (1993).

[00327] São conhecidos métodos de transdução lentiviral. Métodos exemplificadores estão descritos em, por exemplo, Wang et al., J. Immunother., 35 (9): 689-701 (2012); Cooper et al. Blood. 101:1637- 1644 (2003); Verhoeyen et al., Methods Mol Biol., 506: 97-114 (2009); e Cavalieri et al., Blood. 102 (2): 497-505 (2003).

[00328] Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes são transferidos para as células T através da eletroporação (veja, por exemplo, Chicaybam et al., PLoS ONE 8 (3):e60298 (2013) e Van Tedeloo et al. Gene Therapy 7(16):1431-1437 (2000)). Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos recombinantes são transferidos para as células T através da transposição (veja, por exemplo, Manuri et al. Hum Gene Ther 21 (4): 427- 437 (2010); Sharma et al. Molec Ther Nucl Acids 2, e74 ( 2013) e Huang et al. Methods Mol Biol 506:1 15-126 (2009)). Outros métodos de introdução e expressão de material genético em células imunes incluem a transfecção com fosfato de cálcio (por exemplo, como descrito em Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N. Y.), fusão de protoplastos, transfecção mediada por lipossoma catiônico; bombardeamento de micropartículas facilitado por partículas de tungstênio (Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)); e co-precipitação de DNA de fosfato de estrôncio (Brash et al., Mol. Cell Biol, 7: 2031- 2034 (1987)).

[00329] Outras abordagens e vetores para transferência dos ácidos nucléicos que codificam os produtos recombinantes são aqueles descritos, por exemplo, no pedido de patente internacional, Publicação Nº: WO2014055668 e Patente US Nº 7.446.190.

[00330] Em algumas modalidades, as células, por exemplo, células T, podem ser transfectadas durante ou após a expansão, por exemplo, com um receptor de célula T (TCR) ou um receptor de antígeno quimérico (CAR). Esta transfecção para a introdução do gene do receptor desejado pode ser realizada com qualquer vetor retroviral adequado, por exemplo. A população de células geneticamente modificadas pode então ser liberada do estímulo inicial (o estímulo com CD3/CD28, por exemplo) e subsequentemente ser estimulada com um segundo tipo de estímulo, por exemplo, através de um receptor introduzido de novo). Este segundo tipo de estímulo pode incluir um estímulo antigênico na forma de uma molécula de peptídeo/MHC, o ligante cognato (reticulação) do receptor geneticamente introduzido (por exemplo, ligante natural de um CAR) ou qualquer ligante (tal como um anticorpo) que se liga diretamente à estrutura do novo receptor (por exemplo, pelo reconhecimento de regiões constantes dentro do receptor). Veja, por exemplo, Cheadle et al, Methods Mol Biol. 907: 645-

66 (2012); ou Barrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy ou Cancer Annual Review of Medicine, vol. 65: 333-347 (2014).

[00331] Em alguns casos, pode ser usado um vetor que não requeira que as células, por exemplo, células T, sejam ativadas. Em alguns desses casos, as células podem ser selecionadas e/ou transduzidas antes da ativação. Assim, as células podem ser manipuladas antes ou após a cultura das células e, em alguns casos, ao mesmo tempo ou durante pelo menos uma porção da cultura.

[00332] Em alguns aspectos, as células são manipuladas para promover a expressão de citocinas ou outros fatores. Entre ácidos nucleicos adicionais, por exemplo, genes para introdução são aqueles que melhoram a eficácia da terapia, tal como, por exemplo, promovendo a viabilidade e/ou a função das células transferidas; genes para fornecer um marcador genético para seleção e/ou avaliação das células, como para avaliar a sobrevivência ou localização in vivo; genes para melhorar a segurança, por exemplo, tornando a célula suscetível à seleção negativa in vivo, tal como descrito por Lupton S. D. et al., Mol. e Cell Biol, 11: 6 (1991); e Riddell et al., Human Gene Therapy 3: 319-338 (1992); veja também as publicações de PCT/US91/08442 e PCT/US94/05601 de Lupton et al. que descreve o uso de genes de fusão selecionáveis bifuncionais derivados da fusão de um marcador selecionável positivo dominante com um marcador selecionável negativo. Veja, por exemplo, Riddell et al., Patente US No. 6.040.177, nas colunas 14-17. D. Características da Composição de Saída

[00333] Em modalidades particulares, os métodos aqui fornecidos produzem ou geram uma composição de células que contêm células geneticamente modificadas, por exemplo, uma composição de saída. Em certas modalidades, uma composição de saída é uma composição celular que resulta de algumas ou de todas as etapas para a manipulação genética de células. Em certas modalidades, a composição de saída resulta de um processo de manipulação genética de células de uma composição de células de entrada. Em certas modalidades, o processo contém uma ou mais etapas para ativar, transduzir ou transfectar, expandir e/ou coletar as células, tais como as células que foram obtidas a partir de uma composição de células de entrada. Em certas modalidades, a composição da célula de saída contém células que foram geneticamente modificadas. Em modalidades particulares, as células da composição de saída passaram por todas as etapas de um processo de manipulação genética.

[00334] Em algumas modalidades, a composição de saída contém células que incluem um ou mais ácidos nucleicos introduzidos através da manipulação genética e, dessa maneira expressam produtos recombinantes ou geneticamente modificados de tais ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos são heterólogos, ou seja, normalmente não estão presentes em uma célula ou amostra obtida da célula, tal como aquela obtida de outro organismo ou célula que, por exemplo, não é normalmente encontrada na célula a ser manipulada e/ou um organismo a partir do qual essa célula é derivada. Em algumas modalidades, os ácidos nucleicos não ocorrem naturalmente, tais como um ácido nucleico não encontrado na natureza, incluindo um que compreende combinações quiméricas de ácidos nucleicos que codificam vários domínios de vários tipos de células diferentes.

[00335] Em algumas modalidades, a composição de saída contém células que foram geneticamente modificadas. Em modalidades particulares, a composição da célula de saída contém células T manipuladas. Em algumas modalidades, as células T manipuladas incluem células T CD4+ manipuladas e células T CD8+ manipuladas. Em modalidades particulares, a composição de saída contém ou inclui pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%,

pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,9% ou cerca de 100% de células T manipuladas. Em certas modalidades, as células manipuladas expressam um receptor recombinante. Em modalidades particulares, a composição de saída contém ou inclui pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, pelo menos 99,5%, pelo menos 99,9% ou 100% ou cerca de 100% de células T que expressam um receptor recombinante. Em algumas modalidades, o receptor recombinante é um TCR ou um CAR. Em modalidades particulares, o receptor recombinante é um CAR. III. COMPOSIÇÕES E FORMULAÇÕES

[00336] São fornecidas aqui composições ou formulações que contêm células preparadas de acordo com os métodos de incubação (por exemplo, estimulantes) aqui descritos. Em algumas modalidades, as composições e métodos aqui descritos podem ser usados para eliminar pelo menos uma porção de populações de células, tais como células T semelhantes às células T não naives de uma população de células. Além disso, são fornecidas composições que compreendem populações de células que não contêm mais células indesejadas ou que possuem um número significativamente reduzido de células indesejadas na composição estimulada, tais como células derivadas de células T semelhantes às células T não naives e seus usos. As composições e métodos aqui fornecidos também são usados para expandir seletivamente uma população de células que tenham sido excluídas para subpopulações indesejadas para uso no tratamento. Também é fornecida aqui uma composição de saída ou estimulada enriquecida produzida por qualquer um dos métodos de estimulação de células T aqui descritos.

[00337] Em algumas modalidades, as células produzidas usando qualquer um dos métodos de incubação (por exemplo, estimulação) aqui descritos, tal como células geneticamente modificadas com um receptor recombinante (por exemplo, células CAR-T) são fornecidas como composições, incluindo composições e formulações farmacêuticas, tais como composições em forma de dose unitária que incluem o número de células para administração em uma dada dose ou fração da mesma. As composições e formulações farmacêuticas geralmente incluem um ou mais veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis opcionais. Em algumas modalidades, a composição inclui pelo menos um agente terapêutico adicional.

[00338] Em algumas modalidades, uma composição de células é gerada ou fabricada para os propósitos de uma terapia celular. Em algumas modalidades, a composição celular é uma composição ou formulação farmacêutica. Tais composições podem ser usadas de acordo com os métodos fornecidos, por exemplo, para avaliar sua liberação para uso na prevenção ou tratamento de doenças, condições e distúrbios, ou em métodos de detecção, diagnóstico e prognóstico.

[00339] A expressão "formulação farmacêutica" se refere a uma preparação que existe de forma a permitir que a atividade biológica de um ingrediente ativo contido nela seja eficaz e que não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um indivíduo ao qual a formulação seria administrada. Em algumas modalidades, os métodos aqui fornecidos podem ser utilizados para comparar a expressão de glicano na superfície de composições de células compostas pelas mesmas células manipuladas, mas com diferentes formulações farmacêuticas.

[00340] Um "veículo farmaceuticamente aceitável" se refere a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, diferente de um ingrediente ativo, que não é tóxico para um indivíduo. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a um tampão, excipiente, estabilizador ou conservante. Em modalidades particulares, os métodos aqui fornecidos podem ser utilizados para comparar a expressão de glicano na superfície de composições de células compostas pelas mesmas células manipuladas, mas com diferentes veículos farmaceuticamente aceitáveis.

[00341] Em algumas modalidades, a terapia com célula T, tal como células T manipuladas (por exemplo, células T CAR), é formulada com um veículo farmaceuticamente aceitável. Em alguns aspectos, a escolha do veículo é determinada em parte pela célula particular e/ou pelo método de administração. Consequentemente, existe uma variedade de formulações adequadas. Por exemplo, a composição farmacêutica pode conter conservantes. Conservantes adequados podem incluir, por exemplo, metilparabeno, propilparabeno, benzoato de sódio e cloreto de benzalcônio. Em alguns aspectos, é usada uma mistura de dois ou mais conservantes. O conservante ou suas misturas estão tipicamente presentes em uma quantidade de cerca de 0,0001% a cerca de 2% em peso da composição total. Os veículos estão descritos, por exemplo, por Remington's Pharmaceutical Sciences 16ª edição, Osol, A. Ed. (1980). Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações empregadas e incluem, mas não estão limitados a: tampões tais como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes, incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tal como cloreto de octadecildimetilbenzil amônia; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio; cloreto de benzetônio; fenol, álcool butílico ou benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos de cerca de 10 resíduos); proteínas, tais como albumina sérica, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos e outros carboidratos, incluindo glicose, manose ou dextrinas; agentes quelantes tais como EDTA; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol; contra-íons formadores de sal, tal como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de proteína-Zn); e/ou tensoativos não iônicos, como polietilenoglicol (PEG).

[00342] Agentes de tamponamento, em alguns aspectos, estão incluídos nas composições. Os agentes de tamponamento adequados incluem, por exemplo, ácido cítrico, citrato de sódio, ácido fosfórico, fosfato de potássio e vários outros ácidos e sais. Em alguns aspectos, é usada uma mistura de dois ou mais agentes de tamponamento. O agente de tamponamento ou suas misturas estão tipicamente presentes em uma quantidade de cerca de 0,001% a cerca de 4% em peso da composição total. São conhecidos métodos para preparar composições farmacêuticas administráveis. Métodos exemplificadores estão descritos em mais detalhes, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21 ed. (1 de maio de 2005).

[00343] As formulações podem incluir soluções aquosas. A formulação ou composição também pode conter mais de um ingrediente ativo útil para a indicação, doença ou condição particulares que estão sendo prevenidas ou tratadas com as células, incluindo um ou mais ingredientes ativos em que as atividades são complementares às células e/ou as respectivas atividades não afetem adversamente uma a outra. Tais ingredientes ativos estão adequadamente presentes em combinação em quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida. Assim, em algumas modalidades, a composição farmacêutica inclui ainda outros agentes ou fármacos farmaceuticamente ativos, tais como agentes quimioterapêuticos, por exemplo, asparaginase, bussulfan, carboplatina, cisplatina, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracil, gemcitabina, hidroxiureia, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc.

[00344] A composição farmacêutica em algumas modalidades contém células em quantidades eficazes para tratar ou prevenir a doença ou condição, tal como uma quantidade terapeuticamente eficaz ou profilaticamente eficaz. A eficácia terapêutica ou profilática em algumas modalidades é monitorada pela avaliação periódica dos indivíduos tratados. Para administrações repetidas por vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é repetido até que ocorra uma supressão desejada dos sintomas da doença. No entanto, outros regimes de dosagem podem ser úteis e podem ser determinados. A dosagem desejada pode ser administrada por uma administração em bolus única da composição, por múltiplas administrações em bolus da composição ou por administração em infusão contínua da composição.

[00345] As células podem ser formuladas para administração utilizando técnicas de administração padronizadas, formulações e/ou dispositivos. São fornecidas formulações e dispositivos, tais como seringas e frascos, para armazenamento e administração das composições. No que diz respeito às células, a administração pode ser autóloga ou heteróloga. Por exemplo, células ou progenitores imunorresponsivos podem ser obtidos de um indivíduo e administrados ao mesmo indivíduo ou a um indivíduo compatível diferente. As células imunorresponsivas derivadas de sangue periférico ou sua progênie (por exemplo, derivada in vivo, ex vivo ou in vitro) podem ser administradas por injeção localizada, incluindo administração por cateter, injeção sistêmica, injeção localizada, injeção intravenosa ou administração parenteral. Ao administrar uma composição terapêutica (por exemplo,

uma composição farmacêutica que contém uma célula imunorresponsiva geneticamente modificada), ela geralmente será formulada em uma forma injetável de dosagem unitária (solução, suspensão, emulsão).

[00346] As formulações incluem aquelas para administração oral, intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, pulmonar, transdérmica, intramuscular, intranasal, bucal, sublingual ou supositório. Em algumas modalidades, as populações de agentes ou células são administradas por via parenteral. A expressão "parenteral", como usada aqui, inclui administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, retal, vaginal e intraperitoneal. Em algumas modalidades, as populações de agentes ou células são administradas a um indivíduo usando a administração sistêmica periférica por injeção intravenosa, intraperitoneal ou subcutânea.

[00347] As composições, em algumas modalidades, são fornecidas como preparações líquidas estéreis, por exemplo, soluções aquosas isotônicas, suspensões, emulsões, dispersões ou composições viscosas, que podem em alguns aspectos ser tamponadas até um pH selecionado. As preparações líquidas são normalmente mais fáceis de preparar do que os géis, outras composições viscosas e composições sólidas. Além disso, as composições líquidas são um pouco mais convenientes para administrar, especialmente por injeção. As composições viscosas, por outro lado, podem ser formuladas dentro da faixa de viscosidade apropriada para proporcionar períodos de contato mais longos com tecidos específicos. As composições líquidas ou viscosas podem compreender veículos, que podem ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, polietileno glicol líquido) e suas misturas adequadas.

[00348] Soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando as células em um solvente, tal como em mistura com um veículo, diluente ou excipiente adequados, tal como água estéril, solução salina fisiológica, glicose, dextrose ou similares. As composições também podem ser liofilizadas. As composições podem conter substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes, dispersantes ou emulsificantes (por exemplo, metilcelulose), agentes de tamponamento de pH, aditivos gelificantes ou melhoradores de viscosidade, conservantes, agentes aromatizantes, corantes e similares, dependendo da via de administração e da preparação desejada. Em alguns aspectos, os textos padronizados podem ser consultados para preparar as preparações adequadas.

[00349] Vários aditivos que aumentam a estabilidade e esterilidade das composições, incluindo conservantes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes e tampões, podem ser adicionados. A prevenção da ação de microrganismos pode ser assegurada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico e similares. A absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser obtida pelo uso de agentes que retardam a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina.

[00350] As formulações a serem usadas para administração in vivo são geralmente estéreis. A esterilidade pode ser facilmente alcançada, por exemplo, por filtração através de membranas de filtração estéreis.

[00351] Para a prevenção ou tratamento da doença, a dosagem apropriada pode depender do tipo de doença a ser tratada, do tipo de agente ou agentes, do tipo de células ou receptores recombinantes, da gravidade e do curso da doença, seja o agente ou as células são administrados para fins preventivos ou terapêuticos, terapia anterior, histórico clínico e resposta do indivíduo ao agente ou às células e a critério do médico assistente. As composições são, em algumas modalidades, adequadamente administradas ao indivíduo ao mesmo tempo ou durante uma série de tratamentos.

[00352] Também são fornecidos métodos de uso e usos das células e composições, tais como aquelas presentes em uma composição de saída aqui descrita, no tratamento de doenças, condições e distúrbios nos quais o antígeno é reconhecido pelo receptor recombinante (por exemplo, CAR) é expressa. Também são aqui fornecidos métodos de tratamento, incluindo a administração a um indivíduo de uma composição saída ou de saída enriquecida produzida por qualquer método de incubação (por exemplo, estimulante) descrito. Em algumas modalidades, o método inclui gerar células T geneticamente modificadas usando qualquer um dos métodos descritos aqui e administrar as células T geneticamente modificadas produzidas pelos métodos aqui descritos.

[00353] São fornecidos métodos de administração das células e composições manipuladas e usos de tais células e composições manipuladas para tratar ou prevenir doenças, condições e distúrbios, incluindo cânceres. Em algumas modalidades, a terapia baseada em células é ou compreende a administração de células, tais como células imunes, por exemplo, célula T, que têm como alvo uma molécula expressa na superfície de uma lesão, tal como um tumor ou um câncer. Os métodos e usos fornecidos incluem métodos e usos para terapia celular adotiva. Em algumas modalidades, os métodos incluem a administração de células manipuladas ou uma composição que contenha as células, tais como células de uma composição de saída como descrita, a um indivíduo, tecido ou célula, tal como aquele que tem, está em risco de ter ou é suspeito de ter a doença, condição ou distúrbio. Em algumas modalidades, as células, populações e composições são administradas a um sujeito com a doença ou condição específica a ser tratada, por exemplo, através da terapia celular adotiva,

tal como terapia adotiva com célula T. Em algumas modalidades, as células ou composições são administradas ao indivíduo, tal como um indivíduo que tem ou corre risco de ter a doença ou condição, melhorar um ou mais sintomas da doença ou condição, tal como diminuir a carga do tumor em um câncer que expressa um antígeno reconhecido por uma célula T manipulada.

[00354] A doença ou condição que é tratada em alguns aspectos, pode ser aquela na qual a expressão de um antígeno está associada, é específica e/ou expressa em uma célula ou tecido de uma doença, distúrbio ou condição e/ou envolvida na etiologia de uma doença, condição ou distúrbio, por exemplo causa, exacerba ou está envolvida de outra forma em tal doença, condição ou distúrbio. Doenças e condições exemplificadores podem incluir doenças ou condições associadas a malignidade ou transformação de células (por exemplo, câncer), doença autoimune ou inflamatória ou uma doença infecciosa, por exemplo, causada por um patógeno bacteriano, viral ou outro. Antígenos exemplificadores, que incluem antígenos associados a várias doenças e condições que podem ser tratadas, estão descritos acima. Em modalidades particulares, o polipeptídeo imunomodulador e/ou receptor recombinante, por exemplo, o receptor de antígeno quimérico ou TCR, se liga especificamente a um antígeno associado à doença ou condição. Em algumas modalidades, o indivíduo tem uma doença, distúrbio ou condição, opcionalmente um câncer, um tumor, uma doença autoimune, distúrbio ou condição ou uma doença infecciosa.

[00355] Em algumas modalidades, a doença, distúrbio ou condição inclui tumores associados a vários cânceres. O câncer pode, em algumas modalidades, ser qualquer câncer localizado no corpo de um indivíduo, tal como, entre outros, cânceres localizados na cabeça e pescoço, mama, fígado, cólon, ovário, próstata, pâncreas, cérebro, colo do útero, osso, pele, olho, bexiga, estômago, esôfago, peritônio ou pulmão. Por exemplo, o agente anticâncer pode ser usado para o tratamento de câncer de cólon, câncer cervical, câncer do sistema nervoso central, câncer de mama, câncer de bexiga, carcinoma anal, câncer de cabeça e pescoço, câncer de ovário, câncer endometrial, câncer de pulmão de células pequenas, carcinoma de pulmão de células não pequenas, câncer neuroendócrino, carcinoma de tecidos moles, câncer de pênis, câncer de próstata, câncer de pâncreas, câncer gástrico, câncer de vesícula biliar ou câncer de esôfago. Em alguns casos, o câncer pode ser um câncer no sangue. Em algumas modalidades, a doença, distúrbio ou condição é um tumor, tal como um tumor sólido, linfoma, leucemia, tumor no sangue, tumor metastático ou outro tipo de câncer ou tumor. Em algumas modalidades, a doença, distúrbio ou condição é selecionada dentre os cânceres de cólon, pulmão, fígado, mama, próstata, ovário, pele, melanoma, osso, câncer cerebral, câncer de ovário, câncer epitelial, carcinoma de células renais, adenocarcinoma pancreático carcinoma cervical, câncer colorretal, glioblastoma, neuroblastoma, sarcoma de Ewing, meduloblastoma, osteossarcoma, sarcoma sinovial e/ou mesotelioma.

[00356] Entre as doenças, condições e distúrbios estão os tumores, incluindo tumores sólidos, malignidades hematológicas e melanomas, incluindo tumores localizados e metastáticos, doenças infecciosas, como infecção por vírus ou outro patógeno, por exemplo, HIV, HCV, HBV, CMV, HPV e doença parasitária e doenças autoimunes e inflamatórias. Em algumas modalidades, a doença, distúrbio ou condição é um tumor, câncer, malignidade, neoplasia ou outra doença ou distúrbio proliferativo. Tais doenças incluem, entre outras, leucemia, linfoma, por exemplo, leucemia mieloide aguda (ou mieloide) (LMA), leucemia mieloide crônica (ou mielogênica) (LMC), leucemia linfocítica aguda (ou linfoblástica) (LLA), leucemia linfocítica crônica (LLC), leucemia de células pilosas (HCL), linfoma linfocítico pequeno (SLL),

linfoma de células do manto (MCL), linfoma da zona marginal, linfoma de Burkitt, linfoma de Hodgkin (HL), linfoma não Hodgkin (NHL), linfoma anaplásico de células grandes (ALCL), linfoma folicular, linfoma folicular refratário, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) e mieloma múltiplo (MM), uma malignidade de células B é selecionada dentre leucemia linfoblástica aguda (LLA), LLA do adulto, leucemia linfoblástica crônica (LLC) ), linfoma não Hodgkin (NHL) e linfoma difuso de células B grandes (DLBCL).

[00357] Em algumas modalidades, a doença ou condição é uma doença ou condição infecciosa, tal como, mas não se limitando a infecções virais, retrovirais, bacterianas e protozoárias, imunodeficiência, citomegalovírus (CMV), vírus Epstein-Barr (EBV), adenovírus, poliomavírus BK. Em algumas modalidades, a doença ou condição é uma doença autoimune ou doença ou condição inflamatória, tal como artrite, por exemplo, artrite reumatoide (AR), diabetes tipo I, lúpus eritematoso sistêmico (LES), doença inflamatória intestinal, psoríase, esclerodermia, doença autoimune da tireoide, doença de Gravis, doença de Crohn, esclerose múltipla, asma e/ou uma doença ou condição associada ao transplante.

[00358] Em algumas modalidades, o antígeno associado à doença ou distúrbio é selecionado do grupo que consiste em receptor de tirosina-quinase órfão ROR1, antígeno de maturação de células B (BCMA), anidrase carbônica 9 (CAIX), tEGFR, Her2 / neu (receptor de tirosina-quinase erbB2 ), Ll-CAM, CD 19, CD20, CD22, mesotelina, CEA, antígeno de superfície da hepatite B, receptor anti-folato, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44, EGFR, glicoproteína epitelial 2 (EPG- 2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40), receptor de efrina A2 (EPHa2), Her2 / neu (receptor tirosina-quinase erb-B2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb- B4), dímeros de erbB, fator de crescimento epidérmico do tipo III mutação do receptor (EGFR vIII), proteína de ligação ao folato (FBP),

FCRL5, receptor Fc semelhante a 5 (FCRL5; também conhecido como homólogo do receptor Fc 5 ou FCRH5), receptor fetal de acetilcolina fetal, gangliosídeo GD2, gangliosídeo GD3, receptor proteico G 5 GPCR5D), HMW-MAA, IL-22R-alfa, IL-13R-alfa2, receptor de domínio de inserção de quinase (kdr), cadeia leve kappa, Repetição rica em leucina contendo 8 Fa mily Member A (LRRC8A), Lewis Y, molécula de adesão de células Ll, (Ll-CAM), antígeno associado ao melanoma (MAGE) -Al, MAGE-A3, MAGE-A6, antígeno do melanoma expressado preferencialmente (PRAME), survivina, TAG72, B7-H6, receptor alfa-13 da IL-13 (IL-13Ra2), CA9, GD3, HMW-MAA, CD171, G250 / CAIX, antígeno leucocitário humano Al (HLA-A1), MAGE Al, HLA-A2, NY- ESO-1, PSCA, receptor de folato-a, CD44v6, CD44v7 / 8, integrina ativa (integrina avb6), 8H9, NCAM, receptores VEGF, 5T4, AchR fetal, ligantes naturais do grupo 2 do grupo matador 2 (NKG2D), CD44v6 , antígeno duplo, antígeno testador de câncer, mesotelina, CMV murino, mucina 1 (MUC1), MUC16, antígeno de células-tronco prostáticas (PSCA), KG2D, antígeno IB / CTAG, também conhecido como NY - ESO-1 e LAGE-2), MART-1, glicoproteína 100 (gplOO), antígeno oncofetal, ROR1, glicoproteína trofoblástica (TPBG também conhecida como 5T4), TAG72, VEGF-R2, antígeno carcinoembrionário (CEA), Her2 / neu , receptor de estrogênio, receptor de progesterona, efrinaB2, CD 123, c-Met, GD-2, GD2 O-acetilado (O GD2), CE7, tumor de Wilms 1 (WT-1), uma ciclina, ciclina A2, motivo CC do ligante de quimiocina1 (CCL-1), CD 138, um antígeno específico pra um patógeno e um antígeno associado a um marcador universal e/ou moléculas biotiniladas e/ou moléculas expressas por HIV, HCV, HBV ou outros patógenos.

[00359] Em algumas modalidades, o antígeno ou ligante é um antígeno tumoral ou marcador de câncer. Em algumas modalidades, o antígeno ou ligante do antígeno é ou inclui ανβ6 integrina (avb6 integrina), antígeno de maturação de células B (BCMA), anidrase carbônica 9 (CAIX), Her2/neu (receptor tirosina quinase erbB2), L1- CAM, B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX ou G250), um antígeno de câncer de testículo, antígeno de câncer/testículo 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA) e antígeno de superfície da hepatite B, receptor anti-folato, ciclina, ciclina A2, Ligante 1 do Motivo C-C da Quimiocina (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44 , CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteoglicano 4 do sulfato de condroitina (CSPG4), proteína do fator de crescimento epidérmico (EGFR), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40 ), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), erb-B2, erb-B3, erb-B4, dímeros de erbB, mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico do tipo III (EGFR vIII), proteína de ligação ao folato (FBP), receptor Fc semelhante a 5 ( FCRL5; também conhecido como homólogo 5 do receptor Fc ou FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), uma proteína de ligação ao folato (FBP), receptor alfa de folato, gangliosídeo GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glipicano-3 (GPC3), Receptor 5D Acoplado à Proteína G (GPRC5D), Her2/neu (receptor tirosina quinase erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb-B4), dímeros erbB, antígeno humano de alto peso molecular associado ao melanoma (HMW-MAA), Antígeno de superfície da hepatite B, antígeno A1 leucocitário humano (HLA-A1), antígeno A2 leucocitário humano (HLA- A2), receptor alfa de IL-22 (IL-22R-alfa), IL-13R-alfa2 (IL-13Rα2), de quinase receptor de domínio do inserto de quinase (kdr), cadeia leve kappa, Lewis Y, molécula L1 de adesão celular (L1-CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, Membro A da Família 8 que contém repetição rica em leucina (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado ao Melanoma (MAGE)- A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina (MSLN), c-Met,

citomegalovírus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes do Membro D do grupo 2 de natural killer (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adesão de células neurais (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno do melanoma expresso preferivelmente (PRAME), receptor de progesterona, antígeno específico da próstata, antígeno de células- tronco da próstata (PSCA), antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), receptor tirosina quinase semelhante ao receptor órfão 1 (ROR1), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG também conhecida como 5T4), glicoproteína 72 associada ao tumor (TAG72), proteína 1 relacionada à tirosinase (TRP1, também conhecida como TYRP1 ou gp75), proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP2, também conhecida como dopacromo tautomerase, dopacromo delta-isomerase ou DCT), receptor α de folato, 8H9, antígeno duplo, glicoproteína 100 (gp100), receptor de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor de fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGF-R2), receptor de estrogênio, receptor de progesterona, Tumor de Wilms 1 (WT-1), um antígeno específico de patógeno ou expresso por patógeno e um antígeno associado a um marcador universal e/ou moléculas biotiniladas e/ou moléculas expressas por HIV, HCV, HBV ou outros patógenos.

[00360] Em algumas modalidades, a doença ou condição é uma malignidade de células B. Em algumas modalidades, a malignidade das células B é uma leucemia ou um linfoma. Em alguns aspectos, a doença ou condição é leucemia linfoblástica aguda (LLA), LLA do adulto, leucemia linfoblástica crônica (LLC), linfoma não Hodgkin (NHL) ou linfoma difuso de células B grandes (DLBCL). Em alguns casos, a doença ou condição é um NHL, tal como ou incluindo um NHL agressivo, linfoma difuso de células B grandes (DLBCL), NOS (novo e transformado de indolente), linfoma mediastinal primário de células B grandes (PMBCL), linfoma de células B grandes e rico em histócitos

(TCHRBCL), linfoma de Burkitt, linfoma de células do manto (MCL) e/ou linfoma folicular (FL), opcionalmente, linfoma folicular de grau 3B (FL3B). Em alguns aspectos, o receptor recombinante, tal como um CAR, se liga especificamente a um antígeno associado à doença ou condição ou expresso nas células do ambiente de uma lesão associada à malignidade das células B. Os antígenos direcionados pelos receptores em algumas modalidades incluem antígenos associados a uma malignidade de células B, tal como qualquer um de vários marcadores conhecidos de células B. Em algumas modalidades, o antígeno direcionado pelo receptor é CD20, CD19, CD22, ROR1, CD45, CD21, CD5, CD33, Igkappa, Iglambda, CD79a, CD79b ou CD30.

[00361] Em algumas modalidades, a doença ou condição é um mieloma, tal como um mieloma múltiplo. Em alguns aspectos, o receptor recombinante, tal como um CAR, se liga especificamente a um antígeno associado à doença ou condição ou expresso nas células do ambiente de uma lesão associada ao mieloma múltiplo. Os antígenos direcionados pelos receptores em algumas modalidades incluem antígenos associados ao mieloma múltiplo, como GPRC5d ou BCMA.

[00362] Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno específico ao patógeno ou expresso para o patógeno. Em algumas modalidades, o antígeno é um antígeno viral (como um antígeno viral de HIV, HCV, HBV, etc.), antígenos bacterianos e/ou antígenos parasitários.

[00363] Em algumas modalidades, as células imunes expressam um receptor de célula T (TCR) ou outro receptor de ligação ao antígeno. Em algumas modalidades, as células imunes expressam um receptor recombinante, como um TCR transgênico ou um receptor de antígeno quimérico (CAR). Em algumas modalidades, as células são autólogas para o indivíduo. Em algumas modalidades, as células são alogênicas para o indivíduo.

[00364] Os métodos para administração de células manipuladas para terapia celular adotiva são conhecidos e podem ser utilizados em conexão com os métodos e composições fornecidos. Por exemplo, os métodos para terapia adotiva com células T são descritos, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente US No. 2003/0170238 de Gruenberg et al; Patente US No. 4.690.915 de Rosenberg; Rosenberg (2011) Nat Rev Clin Oncol. 8(10):577-85). Veja, por exemplo, Themeli et al., (2013) Nat Biotechnol. 31(10): 928- 933; Tsukahara et al., (2013) Biochem Biophys Res Commun 438 (1): 84-9; Davila et al., (2013) PLoS ONE 8 (4): e61338.

[00365] Em algumas modalidades, a terapia celular, por exemplo, terapia adotiva com células T, é realizada por transferência autóloga, na qual as células são isoladas e/ou preparadas de outro modo a partir do indivíduo que deve receber a terapia celular ou de uma amostra derivada de tal indivíduo. Assim, em alguns aspectos, as células são derivadas de um indivíduo, por exemplo, paciente, que necessita de um tratamento e as células, após isolamento e processamento, são administradas ao mesmo indivíduo.

[00366] Em algumas modalidades, a terapia celular, por exemplo, terapia adotiva com células T, é realizada por transferência alogênica, na qual as células são isoladas e/ou preparadas de outro modo a partir de um indivíduo que não seja um indivíduo que deve receber ou que finalmente recebe a terapia celular, por exemplo, um primeiro indivíduo. Em tais modalidades, as células são então administradas a um indivíduo diferente, por exemplo, um segundo indivíduo, da mesma espécie. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo indivíduos são geneticamente idênticos. Em algumas modalidades, o primeiro e o segundo indivíduos são geneticamente semelhantes. Em algumas modalidades, o segundo indivíduo expressa a mesma classe ou supertipo de HLA que o primeiro indivíduo.

[00367] Em certas modalidades, as células ou populações individuais de subtipos de células, são administradas ao indivíduo em uma faixa de cerca de um milhão a cerca de 100 bilhões de células e/ou essa quantidade de células por quilograma de peso corporal, tal como, por exemplo, 1 milhão a cerca de 50 bilhões de células (por exemplo, cerca de 5 milhões de células, cerca de 25 milhões de células, cerca de 500 milhões de células, cerca de 1 bilhão de células, cerca de 5 bilhões de células, cerca de 20 bilhões de células, cerca de 30 bilhões de células, cerca de 40 bilhões células ou um intervalo definido por dois dos valores anteriores), tal como cerca de 10 milhões a cerca de 100 bilhões de células (por exemplo, cerca de 20 milhões de células, cerca de 30 milhões de células, cerca de 40 milhões de células, cerca de 40 milhões de células, cerca de 60 milhões de células, cerca de 70 milhões de células, cerca de 80 milhões de células, cerca de 90 milhões de células, cerca de 10 bilhões de células, cerca de 25 bilhões de células, cerca de 50 bilhões de células, cerca de 75 bilhões de células, cerca de 90 bilhões de células ou um intervalo definido por dois dos valores anteriores) e, em alguns casos, cerca de 100 milhões de células a cerca de 50 bilhões células (por exemplo, cerca de 120 milhões de células, cerca de 250 milhões de células, cerca de 350 milhões de células, cerca de 450 milhões de células, cerca de 650 milhões de células, cerca de 800 milhões de células, cerca de 900 milhões de células, cerca de 3 bilhões de células, cerca de 30 bilhões de células, cerca de 45 bilhões de células) ou qualquer valor entre essas faixas e/ou por quilograma de peso corporal. As dosagens podem variar dependendo dos atributos particulares da doença ou distúrbio e/ou paciente e/ou outros tratamentos.

[00368] Em algumas modalidades, por exemplo, onde o indivíduo é um humano, a dose inclui menos do que cerca de 5 x 108 do total de células expressam o receptor recombinante (por exemplo, CAR),

células T ou células mononucleares do sangue periférico (PBMCs). Em algumas modalidades, por exemplo, onde o indivíduo é humano, a dose inclui menos do que cerca de 1 x 108 do total de células expressam o receptor recombinante (por exemplo, CAR), células T ou células mononucleares do sangue periférico (PBMCs), por exemplo, no intervalo entre cerca de 1 x 106 a 1 x 108 de tais células, tal como 2 x 106, 5 x 106, 1 x 107, 5 x 107 ou 1 x 108 ou total de tais células, ou o intervalo entre dois dos valores anteriores.

[00369] Em algumas modalidades, a dose de células geneticamente modificadas compreende entre ou entre cerca de 1 x 105 a 5 x 108 do total de células que expressam CAR, 1 x 105 a 2,5 x 108 do total de células que expressam CAR, 1 x 105 to 1 x 108 do total de células que expressam CAR, 1 x 105 a 5 x 107 do total de células que expressam CAR, 1 x 105 a 2,5 x 107 do total de células que expressam CAR, 1 x 105 a 1 x 107 do total de células que expressam CAR, 1 x 105 a 5 x 106 do total de células que expressam CAR, 1 x 105 a 2,5 x 106 do total de células que expressam CAR, 1 x 105 a 1 x 106 do total de células que expressam CAR, 1 x 106 a 5 x 108 do total de células que expressam CAR, 1 x 106 a 2,5 x 108 do total de células que expressam CAR, 1 x 106 a 1 x 108 do total de células que expressam CAR, 1 x 106 a 5 x 107 do total de células que expressam CAR, 1 x 106 a 2,5 x 107 do total de células que expressam CAR, 1 x 106 a 1 x 107 do total de células que expressam CAR, 1 x 106 a 5 x 106 do total de células que expressam CAR, 1 x 106 a 2,5 x 106 do total de células que expressam CAR, 2,5 x 106 a 5 x 108 do total de células que expressam CAR, 2,5 x 106 a 2,5 x 108 do total de células que expressam CAR, 2,5 x 106 a 1 x 108 do total de células que expressam CAR, 2,5 x 106 a 5 x 107 do total de células que expressam CAR, 2,5 x 106 a 2,5 x 107 do total de células que expressam CAR, 2,5 x 106 a 1 x 107 do total de células que expressam CAR, 2,5 x 106 a 5 x 106 do total de células que expressam CAR, 5 x

106 a 5 x 108 do total de células que expressam CAR, 5 x 106 to 2,5 x 108 do total de células que expressam CAR, 5 x 10 6 a 1 x 108 do total de células que expressam CAR, 5 x 106 a 5 x 107 do total de células que expressam CAR, 5 x 106 a 2,5 x 107 do total de células que expressam CAR, 5 x 106 a 1 x 107 do total de células que expressam CAR, 1 x 107 a 5 x 108 do total de células que expressam CAR, 1 x 107 a 2,5 x 108 do total de células que expressam CAR, 1 x 107 a 1 x 108 do total de células que expressam CAR, 1 x 10 7 a 5 x 107 do total de células que expressam CAR, 1 x 107 a 2,5 x 107 do total de células que expressam CAR, 2,5 x 107 a 5 x 108 do total de células que expressam CAR, 2,5 x 107 a 2,5 x 108 do total de células que expressam CAR, 2,5 x 107 a 1 x 108 do total de células que expressam CAR, 2,5 x 107 a 5 x 107 do total de células que expressam CAR, 5 x 107 a 5 x 108 do total de células que expressam CAR, 5 x 107 a 2,5 x 108 do total de células que expressam CAR, 5 x 107 a 1 x 108 do total de células que expressam CAR, 1 x 108 a 5 x 108 do total de células que expressam CAR, 1 x 108 a 2,5 x 108 do total de células que expressam CAR ou 2,5 x 108 a 5 x 108 do total de células que expressam CAR.

[00370] Em algumas modalidades, a dose de células geneticamente modificadas compreende pelo menos ou pelo menos cerca de 1 x 105 células que expressam CAR, pelo menos ou pelo menos cerca de 2,5 x 105 células que expressam CAR, pelo menos ou pelo menos cerca de 5 x 105 células que expressam CAR, pelo menos ou pelo menos cerca de 1 x 106 células que expressam CAR, pelo menos ou pelo menos cerca de 2,5 x 106 células que expressam CAR, pelo menos ou em pelo menos cerca de 5 x 106 células que expressam CAR, pelo menos ou pelo menos cerca de 1 x 107 células que expressam CAR, pelo menos ou pelo menos cerca de 2,5 x 107células que expressam CAR, pelo menos ou pelo menos cerca de 5 x 107 células que expressam CAR, pelo menos ou pelo menos cerca de 1 x 108 células que expressam

CAR, pelo menos ou pelo menos cerca de 2,5 x 108 células que expressam CAR, ou em pelo menos ou pelo menos cerca de 5 x 10 8 células que expressam CAR.

[00371] Em algumas modalidades, a terapia celular compreende a administração de uma dose que compreende um número de células entre ou entre cerca de 1 x 105 a 5 x 108 do total de células que expressam receptores recombinantes, células T totais ou células mononucleares totais do sangue periférico (PBMCs), entre ou entre cerca de 5 x 105 a 1 x 107 do total de células que expressam receptores recombinantes, células T totais ou células mononucleares do sangue periférico totais (PBMCs) ou entre ou entre cerca de 1 x 106 a 1 x 107 do total de células que expressam receptores recombinantes, células T totais ou células mononucleares totais do sangue periférico (PBMCs), cada uma inclusive. Em algumas modalidades, a terapia celular compreende a administração de uma dose de células que compreende um número de células pelo menos ou pelo menos cerca de 1 x 105 do total de células que expressam receptores recombinantes, células T totais ou células mononucleares totais do sangue periférico (PBMCs), pelo menos ou pelo menos 1 x 106, pelo menos ou pelo menos cerca de 1 x 107, pelo menos ou pelo menos cerca de 1 x 108 dessas células. Em algumas modalidades, o número é com referência ao número total de CD3 + ou CD8+, em alguns casos também células que expressam receptores recombinantes (por exemplo, CAR+). Em algumas modalidades, a terapia celular compreende a administração de uma dose que compreende um número de células entre ou entre cerca de 1 x 105 a 5 x 108 do total de células T CD3 + ou CD8+ ou de células CD3 + ou CD8+ que expressam receptores recombinantes, entre ou entre cerca de 1 x 105 a 5 x 107 do total de células T CD3 + ou CD8+ ou de células CD3 + ou CD8+ que expressam receptores recombinantes, entre ou entre cerca de 1 x 106 a 5 x 107 do total de células T CD3 + ou

CD8+ ou de células CD3 + ou CD8+ que expressam receptores recombinantes, incluindo cada intervalo. Em algumas modalidades, a terapia celular compreende a administração de uma dose que compreende um número de células entre ou entre cerca de 1 x 105 a 5 x 108 do total de células CD3+/CAR+ ou CD8+/ CAR+, entre ou entre cerca de 1 x 105 a 5 x 107 do total de células CD3+/CAR+ ou CD8+/ CAR+, entre ou entre cerca de 1 x 106 a 5 x 107 do total de células CD3+/CAR+ ou CD8+/ CAR+, incluindo cada intervalo.

[00372] Em algumas modalidades, as células T da dose incluem células T CD4+, células T CD8+ ou células T CD4+ e CD8+.

[00373] Em algumas modalidades, por exemplo, onde o indivíduo é humano, as células T CD8+ da dose, incluindo uma dose que inclui células T CD4+ e CD8+, incluem entre cerca de 1 x 106 e 5 x 108 do total de células CD8+ que expressam um receptor recombinante (por exemplo, CAR), por exemplo, na faixa de cerca de 5 x 106 a 1 x 108 de tais células, 1 x 107, 2.5 x 107, 5 x 107, 7.5 x 107, 1 x 108, ou 5 x 108 do total de tais células ou o intervalo entre dois dos valores anteriores. Em algumas modalidades, o paciente recebe doses múltiplas e cada uma das doses ou a dose total pode estar dentro de qualquer um dos valores anteriores. Em algumas modalidades, a dose de células compreende a administração entre cerca de 1 x 107 a 0,75 x 108 do total de células CD8+ que expressam um receptor recombinante, 1 x 107 a 2,5 x 107 do total de células CD8+ que expressam um receptor recombinante, entre cerca de 1 x 107 a 0,75 x 108 do total de células T CD8+ que expressam receptores recombinantes, incluindo cada intervalo. Em algumas modalidades, a dose de células compreende a administração de ou de cerca de 1 x 107, 2,5 x 107, 5 x 107, 7,5 x 107, 1 x 108 ou 5 x 108 do total de células T CD8+ que expressam receptores recombinantes.

[00374] Em algumas modalidades, a dose de células, por exemplo, células T que expressam receptores recombinantes, é administrada ao indivíduo como uma dose única ou é administrada apenas uma vez dentro de um período de duas semanas, um mês, três meses, seis meses, 1 ano ou mais.

[00375] Em alguns aspectos, as composições e formulações farmacêuticas são fornecidas como composições em forma de dose unitária que incluem o número de células para administração em uma dada dose ou fração da mesma. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos produzem células em uma linha do tempo previsível para dosagem em comparação com outros métodos de incubação (por exemplo, estimulante) de células. Em alguns casos, a dose de células para administração é determinada com base no número de células semelhantes às células naives na composição de entrada. Em algumas modalidades, uma dose que compreende células fabricadas usando um processo que compreende um período mais curto de estimulação (por exemplo, em algumas modalidades, um tempo de incubação de aproximadamente 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias ou 6 dias de células com um agente estimulador) pode ser menor que uma dose que compreende células fabricadas em um processo que compreende um período mais longo de estimulação. Em algumas modalidades, uma dose que compreende células fabricadas usando um processo que compreende um período mais curto de estimulação pode compreender um percentual ou proporção maior de células do tipo naive e pode compreender menos células totais em comparação com uma dose que compreende células fabricadas usando um processo que compreende um período mais longo de estimulação.

[00376] Em algumas modalidades, as células da dose podem ser administradas pela administração de uma pluralidade de composições ou soluções, tal como uma primeira e uma segunda, opcionalmente mais, cada uma contendo algumas células da dose. Em alguns aspectos, a pluralidade de composições, cada uma contendo uma população diferente e/ou subtipos de células, é administrada separadamente ou independentemente, opcionalmente dentro de um certo período de tempo. Por exemplo, as populações ou subtipos de células podem incluir células T CD8+ e CD4+, respectivamente, e/ou populações enriquecidas com células T CD8+- e CD4+-, respectivamente, por exemplo, células T CD4+ e/ou CD8+, cada uma individualmente incluindo células geneticamente modificadas para expressar o receptor recombinante. Em algumas modalidades, a administração da dose compreende a administração de uma primeira composição que compreende uma dose de células T CD8+ ou uma dose de células T CD4+ e a administração de uma segunda composição que compreende a outra dose de célulae T CD4+ e as células T CD8+ .

[00377] Em algumas modalidades, a administração da composição ou dose, por exemplo, a administração da pluralidade de composições celulares, envolve a administração das composições celulares separadamente. Em alguns aspectos, as administrações separadas são realizadas simultaneamente ou sequencialmente, em qualquer ordem. Em algumas modalidades, a dose compreende uma primeira composição e uma segunda composição e a primeira composição e a segunda composição são administradas com intervalo de 0 a 12 horas, intervalo de 0 a 6 horas ou intervalo de 0 a 2 horas. Em algumas modalidades, o início da administração da primeira composição e o início da administração da segunda composição são realizados em não mais que 2 horas, não mais que 1 hora ou não mais que 30 minutos separados, não mais que 15 minutos, não mais que 10 minutos ou não mais que 5 minutos. Em algumas modalidades, a iniciação e/ou conclusão da administração da primeira composição e a conclusão e/ou iniciação da administração da segunda composição são realizadas em não mais que 2 horas, não mais que 1 hora ou não mais que 30 minutos separados, não mais que 15 minutos, não mais que 10 minutos ou não mais que 5 minutos.

[00378] Em alguma composição, a primeira composição, por exemplo, primeira composição da dose, compreende células T CD4+. Em algumas modalidades, a primeira composição, por exemplo, a primeira composição da dose, compreende células T CD8+. Em algumas modalidades, a primeira composição é administrada antes da segunda composição.

[00379] Em algumas modalidades, a dose ou composição de células inclui uma proporção definida ou alvo de células CD4+ que expressam um receptor recombinante para células CD8+ que expressam um receptor recombinante e/ou de células CD4+ para células CD8+, cuja proporção é opcionalmente de aproximadamente 1:1 ou está entre aproximadamente 1:3 e aproximadamente 3:1, tal como aproximadamente 1:1. Em alguns aspectos, a administração de uma composição ou dose com a proporção alvo ou desejada de diferentes populações celulares (tal como a proporção de CD4+:CD8+ ou a proporção de CAR+CD4+:CAR+CD8+, por exemplo, 1:1) envolve a administração de uma composição de célula separada que contém uma das populações e, em seguida, administração de uma composição celular separada que compreende as outras populações, onde a administração está no ou aproximadamente no alvo ou na proporção desejada. Em alguns aspectos, a administração de uma dose ou composição de células em uma proporção definida leva a uma expansão, persistência e/ou atividade antitumor aperfeiçoadas da terapia com células T.

[00380] Em algumas modalidades, o indivíduo recebe doses múltiplas, por exemplo, duas ou mais doses ou doses consecutivas múltiplas, das células. Em algumas modalidades, duas doses são administradas a um indivíduo. Em algumas modalidades, o indivíduo recebe a dose consecutiva, por exemplo, segunda dose, é administrada aproximadamente 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou 21 dias após a primeira dose. Em algumas modalidades, várias doses consecutivas são administradas após a primeira dose, de modo que uma dose ou doses adicionais são administradas após a administração da dose consecutiva. Em alguns aspectos, o número de células administradas ao indivíduo na dose adicional é igual ou semelhante à primeira dose e/ou dose consecutiva. Em algumas modalidades, a dose ou doses adicionais são maiores que as doses anteriores.

[00381] Em alguns aspectos, o tamanho da primeira e/ou da dose consecutiva é determinado com base em um ou mais critérios, tais como resposta do indivíduo ao tratamento anterior, por exemplo, quimioterapia, carga de doença no indivíduo, tal como a carga tumoral, volume, tamanho ou grau, extensão ou tipo de metástase, estágio e/ou probabilidade ou incidência do indivíduo desenvolver resultados tóxicos, por exemplo, CRS, síndrome de ativação de macrófagos, síndrome de lise tumoral, neurotoxicidade e/ou uma resposta imune do hospedeiro contra as células e/ou receptores recombinantes que estão sendo administrados.

[00382] Em alguns aspectos, o tempo entre a administração da primeira dose e a administração da dose consecutiva é de cerca de 9 a cerca de 35 dias, cerca de 14 a cerca de 28 dias ou 15 a 27 dias. Em algumas modalidades, a administração da dose consecutiva é em um ponto no tempo de mais do que cerca de 14 dias depois e menos do que cerca de 28 dias após a administração da primeira dose. Em alguns aspectos, o tempo entre a primeira e a dose consecutiva é de aproximadamente 21 dias. Em algumas modalidades, uma dose ou doses adicionais, por exemplo doses consecutivas, são administradas após a administração da dose consecutiva. Em alguns aspectos, a dose ou doses consecutivas adicionais são administradas pelo menos cerca de 14 e menos de cerca de 28 dias após a administração de uma dose anterior. Em algumas modalidades, a dose adicional é administrada em menos do que cerca de 14 dias após a dose anterior, por exemplo, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13 dias após a dose anterior. Em algumas modalidades, nenhuma dose é administrada em menos do que cerca de 14 dias após a dose anterior e/ou nenhuma dose é administrada em mais do que cerca de 28 dias após a dose anterior.

[00383] Em algumas modalidades, a dose de células, por exemplo, células que expressam receptores recombinantes, compreende duas doses (por exemplo, uma dose dupla), que compreende uma primeira dose das células T e uma dose consecutiva das células T, em que uma ou ambas a primeira dose e a segunda dose compreendem a administração da dose dividida de células T.

[00384] Em algumas modalidades, as células são administradas como parte de um tratamento de combinação adicional, tal como simultaneamente ou sequencialmente com, em qualquer ordem, outra intervenção terapêutica, como um anticorpo ou célula ou receptor ou agente manipulado, como um agente citotóxico ou terapêutico. Por exemplo, em algumas modalidades, um agente anticâncer ou o agente imunomodulador podem ser utilizados na terapia de combinação com a terapia celular adotiva com a célula manipulada que expressa um receptor recombinante, e. um CAR. Em alguns contextos, as células são coadministradas com outra terapia suficientemente próxima no tempo, de modo que as populações celulares aumentam o efeito de P de um ou mais agentes terapêuticos adicionais, ou vice-versa. Em algumas modalidades, as células são administradas antes de um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, as células são administradas após um ou mais agentes terapêuticos adicionais.

[00385] Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais incluem uma citocina, tal como IL-2, por exemplo, para melhorar a persistência. Em algumas modalidades, os métodos compreendem a administração de um agente quimioterapêutico. Em algumas modalidades, o um ou mais agentes terapêuticos adicionais incluem uma ou mais terapias de linfodepleção, tal como antes ou simultaneamente ao início da administração das células manipuladas. Em algumas modalidades, a terapia de linfodepleção compreende a administração de uma fosfamida, tal como a ciclofosfamida. Em algumas modalidades, a terapia de linfodepleção pode incluir a administração de fludarabina. Em algumas modalidades, a fludarabina é excluída da terapia de linfodepleção. Em algumas modalidades, uma terapia de linfodepleção não é administrada.

[00386] Em algumas modalidades, os métodos incluem a administração de um agente de precondicionamento, tal como um agente de linfodepleção ou quimioterápico, tal como ciclofosfamida, fludarabina ou combinações dos mesmos, a um indivíduo antes do início da terapia celular. Por exemplo, o indivíduo pode ser tratado com um agente de precondicionamento pelo menos 2 dias antes, tal como pelo menos 3, 4, 5, 6 ou 7 dias antes, do início da terapia celular. Em algumas modalidades, o indivíduo é tratado com um agente de precondicionamento não mais que 7 dias antes, tal como não mais que 6, 5, 4, 3 ou 2 dias antes, do início da terapia celular.

[00387] Em algumas modalidades, o indivíduo é precondicionado com ciclofosfamida em uma dose entre ou entre cerca de 20 mg/kg e 100 mg/kg, tal como entre ou entre cerca de 40 mg/kg e 80 mg/kg. Em alguns aspectos, o indivíduo é precondicionado com ou com cerca de 60 mg/kg de ciclofosfamida. Em algumas modalidades, a ciclofosfamida pode ser administrada em uma dose única ou em uma pluralidade de doses, tal como aquelas administradas diariamente, a cada dois dias ou a cada três dias. Em algumas modalidades, a ciclofosfamida é administrada uma vez ao dia por um ou dois dias. Em algumas modalidades, onde o agente de linfodepleção compreende ciclofosfamida, o indivíduo é tratado com ciclofosfamida em uma dose entre ou entre cerca de 100 mg/m2 e 500 mg/m2, tal como entre ou entre 200 mg/m2 e 400 mg/m2 ou 250 mg/m2 e 350 mg/m2, inclusive. Em alguns casos, o indivíduo é tratado com cerca de 300 mg/m2 de ciclofosfamida. Em algumas modalidades, a ciclofosfamida pode ser administrada em uma dose única ou em uma pluralidade de doses, tal como aquelas administradas diariamente, a cada dois dias ou a cada três dias. Em algumas modalidades, a ciclofosfamida é administrada diariamente, tal como por 1 a 5 dias, por exemplo, por 3 a 5 dias. Em alguns casos, o indivíduo é tratado com cerca de 300 mg/m2 de ciclofosfamida, diariamente por 3 dias, antes do início da terapia celular.

[00388] Em algumas modalidades, onde o agente de linfodepleção compreende fludarabina, o indivíduo é tratado com fludarabina em uma dose entre ou entre cerca de 1 mg/m2 e 100 mg/m2, como entre ou entre 10 mg/m2 e 75 mg/m2, 15 mg/m2 e 50 mg/m2, 20 mg/m2e 40 mg/m2, ou 24 mg/m2 e 35 mg/m2, inclusive. Em alguns casos, o indivíduo é tratado com cerca de 30 mg/m2 de fludarabina. Em algumas modalidades, a fludarabina pode ser administrada em uma dose única ou em uma pluralidade de doses, tal como aquelas administradas diariamente, a cada dois dias ou a cada três dias. Em algumas modalidades, a fludarabina é administrada diariamente, tal como por 1 a 5 dias, por exemplo, por 3 a 5 dias. Em alguns casos, o indivíduo é tratado com cerca de 30 mg/m2 de fludarabina, diariamente por 3 dias, antes do início da terapia celular.

[00389] Em algumas modalidades, o agente de linfodepleção compreende uma combinação de agentes, tal como uma combinação de ciclofosfamida e fludarabina. Assim, a combinação de agentes pode incluir ciclofosfamida em qualquer dose ou esquema de administração, tal como aqueles descritos acima, e fludarabina em qualquer dose ou esquema de administração, tal como aqueles descritos acima. Por exemplo, em alguns aspectos, o indivíduo recebe 60 mg/kg (~ 2 mg/m2) de ciclofosfamida e 3 a 5 doses de 25 mg/m2 de fludarabina antes da primeira ou da dose subsequente.

[00390] As células podem ser administradas por qualquer meio adequado. As células são administradas em um regime de dosagem para alcançar um efeito terapêutico, como uma redução na carga do tumor. A dosagem e administração podem depender em parte do regime da administração do composto imunomodulador, que pode ser administrado antes, subsequentemente e/ou simultaneamente com o início da administração da terapia com células T. Vários esquemas de dosagem da terapia com células T incluem, mas não estão limitados a administrações únicas ou múltiplas ao longo de vários pontos de tempo, administração em bolus e infusão em pulsos. IV. KITS E ARTIGOS DE FABRICAÇÃO

[00391] Também são fornecidos artigos de fabricação, tais como kits e dispositivos, para administração das células a indivíduos de acordo com os métodos fornecidos para terapia celular adotiva e armazenamento e administração de células e composições, tais como composições de entrada ou composições de saída como descritas.

[00392] Em algumas modalidades, é fornecido um kit que contém as composições descritas acima e instruções de uso. Em algumas modalidades, os kits fornecidos incluem uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das células manipuladas estimuladas de acordo com qualquer um dos métodos aqui descritos. Em algumas modalidades, são fornecidos kits que incluem uma composição que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das células manipuladas aqui descritas e instruções para administração a um indivíduo para tratamento de uma doença ou condição. Em alguns aspectos, as instruções são para selecionar ou enriquecer a partir de uma população de células, células que expressam um receptor de antígeno que contém um domínio de ligação ao antígeno especificamente reconhecido por um reagente estimulatório. Em alguns casos, as instruções são para expandir células que expressam um receptor de antígeno que contém um domínio de ligação ao antígeno especificamente reconhecido pelo reagente estimulatório de uma população de células.

[00393] Em algumas modalidades, o kit contém ainda instruções para administrar, a um indivíduo para tratamento de uma doença ou condição, a célula manipulada estimulada usando os métodos descritos aqui, em uma terapia combinada para tratamento da doença ou condição. Em alguns exemplos, o kit contém ainda um agente terapêutico. Em algumas modalidades, o agente terapêutico é um agente imunomodulador, um agente citotóxico, um agente anticâncer ou um radioterapêutico.

[00394] Também são fornecidos aqui artigos de fabricação. Em algumas modalidades, os artigos de fabricação incluem qualquer uma das células manipuladas, composições, polinucleotídeos, conjunto de polinucleotídeos, composição contendo conjuntos de polinucleotídeos, vetores, conjunto de vetores, composição contendo conjuntos de vetores ou kits aqui fornecidos.

[00395] Os artigos de fabricação ou kits incluem um ou mais recipientes, tipicamente uma pluralidade de recipientes, material de embalagem e um rótulo ou bula no ou associados ao recipiente ou recipientes e/ou embalagem, geralmente incluindo instruções para administração das células a um indivíduo. Os kits e artigos de fabricação podem incluir um recipiente e um rótulo ou bula no ou associados ao recipiente.

[00396] Em algumas modalidades, os recipientes contêm as células a serem administradas, por exemplo, uma ou mais doses unitárias das mesmas. O artigo de fabricação inclui tipicamente uma pluralidade de recipientes, cada um contendo uma única dose unitária das células. A dose unitária pode ser uma quantidade ou número de células a serem administradas ao indivíduo na primeira dose ou duas vezes o número (ou mais) de células a serem administradas na primeira ou em qualquer uma ou mais doses consecutivas. Pode ser a dose mais baixa ou a dose mais baixa possível das células que seriam administradas ao indivíduo em conexão com o método de administração. Em algumas modalidades, a dose unitária é o número mínimo de células ou número de células ou o número mínimo de unidades de referência ou as unidades de referência alvo ou unidades de referência dentro de um intervalo alvo que seria administrado em uma dose única a qualquer indivíduo com uma determinada doença ou condição ou qualquer indivíduo, de acordo com os métodos aqui descritos.

[00397] Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos, seringas, bolsas para solução IV, etc. Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, tais como vidro ou plástico. O recipiente em algumas modalidades contém uma composição que é por si só ou combinada com outra composição eficaz para tratar, prevenir e/ou diagnosticar a condição. Em algumas modalidades, o recipiente possui uma porta de acesso estéril. Recipientes exemplificadores incluem bolsas de solução intravenosa, frascos, incluindo aqueles com rolhas perfuráveis por uma agulha para injeção, ou garrafas ou frascos para agentes administrados por via oral. O rótulo ou bula pode indicar que a composição é usada para o tratamento de uma doença ou condição. O artigo de fabricação pode ainda incluir uma bula indicando que as composições podem ser usadas para tratar uma condição específica. Alternativamente, ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode ainda incluir outro ou o mesmo recipiente que compreende um tampão farmaceuticamente aceitável. Pode ainda incluir outros materiais, tais como outros tampões, diluentes, filtros, agulhas e/ou seringas.

[00398] Em modalidades particulares, os recipientes são bolsas, por exemplo, bolsas flexíveis, tais como aquelas adequadas para infusão de células a indivíduos, por exemplo, bolsas de plástico ou PVC flexíveis e/ou bolsas de solução IV. As bolsas em algumas modalidades são seláveis e/ou podem ser esterilizadas, de modo a fornecer a solução estéril e liberação das células e composições. Em algumas modalidades, os recipientes, por exemplo, sacos, têm uma capacidade igual ou superior a pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 ou 1000 mL de capacidade, tal como entre ou cerca de 10 ou cerca de 100, entre ou cerca de 10 ou cerca de 500 mL de capacidade, incluindo os intervalos. Em algumas modalidades, os recipientes, por exemplo, bolsas, são e/ou são feitos de material que é estável e/ou fornece armazenamento e/ou manutenção estáveis de células em uma ou mais de várias temperaturas, tal como abaixo ou cerca de ou em ou cerca de -20°C, -80°C, -120°C, 135°C de temperatura e/ou temperaturas adequadas para preservação de criopreservação e/ou outras temperaturas, tal como temperaturas adequadas para descongelar as células e a temperatura corporal tal como a ou a cerca de 37°C, por exemplo, para permitir o descongelamento, por exemplo, no local do indivíduo ou no local de tratamento, por exemplo, à beira do leito, imediatamente antes do tratamento.

[00399] Os recipientes podem ser formados a partir de uma variedade de materiais, como vidro ou plástico. Em algumas modalidades, o recipiente possui uma ou mais portas, por exemplo, portas de acesso estéreis, por exemplo, para conexão de tubos ou canulação para um ou mais tubos, por exemplo, para infusão intravenosa ou outra infusão e/ou conexão para fins de transferência para e de outros recipientes, tais como cultura de células e/ou bolsas de armazenamento ou outros recipientes. Recipientes exemplificadores incluem bolsas de infusão, bolsas de solução intravenosa, frascos, incluindo aqueles com tampas perfuráveis por uma agulha para injeção.

[00400] O artigo de fabricação pode ainda incluir uma bula ou etiqueta com uma ou mais informações de identificação e/ou instruções de uso. Em algumas modalidades, as informações ou instruções indicam que o conteúdo pode ou deve ser usado para tratar uma condição ou doença específica e/ou fornecer instruções para as mesmas. O rótulo ou a bula pode indicar que o conteúdo do artigo de fabricação deve ser usado no tratamento da doença ou condição. Em algumas modalidades, o rótulo ou a bula fornece instruções para tratar um indivíduo, por exemplo, o indivíduo do qual as células são derivadas, através de um método que envolve a administração de uma primeira e uma ou mais doses consecutivas das células, por exemplo, de acordo com qualquer uma das modalidades dos métodos fornecidos. Em algumas modalidades, as instruções especificam a administração, em uma primeira dose, de uma dose unitária, por exemplo, o conteúdo de um único recipiente individual no artigo de fabricação, seguido por uma ou mais doses consecutivas em um momento especificado ou dentro de um período especificado. janela de tempo e/ou após a detecção da presença ou ausência ou quantidade ou grau de um ou mais fatores ou resultados no indivíduo.

[00401] Em algumas modalidades, as instruções especificam a administração de uma ou mais doses unitárias ao indivíduo.

[00402] Em algumas modalidades, o rótulo ou bula ou embalagem compreende um identificador para indicar a identidade específica do indivíduo a partir do qual as células são derivadas e/ou devem ser administradas. No caso de transferência autóloga, a identidade do indivíduo do qual as células são derivadas é a mesma que a identidade do indivíduo ao qual as células devem ser administradas. Assim, a informação de identificação pode especificar que as células devem ser administradas a um paciente em particular, como aquele de onde as células foram originalmente derivadas. Essas informações podem estar presentes no material de embalagem e/ou etiqueta na forma de um código de barras ou outro identificador codificado ou podem indicar o nome e/ou outras características de identificação do indivíduo.

[00403] O artigo de fabricação em algumas modalidades inclui um ou mais, tipicamente uma pluralidade de recipientes contendo composições que compreendem as células, por exemplo, formas de dose unitária individuais das mesmas e inclui ainda um ou mais recipientes adicionais com uma composição nela contida que inclui um agente adicional, tal como um agente citotóxico ou outro agente terapêutico, por exemplo, que deve ser administrado em combinação, por exemplo, simultânea ou sequencialmente em qualquer ordem, com as células. Alternativamente, ou adicionalmente, o artigo de fabricação pode ainda incluir outro ou o mesmo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável. Pode ainda incluir outros materiais, como outros tampões, diluentes, filtros, tubos, agulhas e/ou seringas.

[00404] A expressão "bula" é usada para se referir às instruções normalmente incluídas em embalagens comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, administração, terapia combinada, contraindicações e/ou avisos sobre o uso de tais produtos terapêuticos. V. DEFINIÇÕES

[00405] A menos que definido de outra forma, todas as expressões da técnica, notações e outros termos ou terminologia técnica e científica usados neste documento têm o mesmo significado como são comumente entendidos por aquele versado na técnica a que o assunto reivindicado pertence. Em alguns casos, expressões com significados comumente entendidos são aqui definidos para maior clareza e/ou referência imediata, e a inclusão de tais definições aqui não deve necessariamente ser interpretada como representando uma diferença substancial em relação ao que é geralmente entendido na técnica.

[00406] Como usado aqui, um "indivíduo" é um mamífero, tal como um humano ou outro animal, e tipicamente é humano. Em algumas modalidades, o indivíduo, por exemplo, paciente, a quem o polipeptídeos imunomoduladores, células manipuladas ou composições são administrados, é um mamífero, tipicamente um primata, tal como um humano. Em algumas modalidades, o primata é um macaco ou um chipanzé. O indivíduo pode ser homem ou mulher e pode ter qualquer idade adequada, incluindo crianças, jovens, adolescentes, adultos e idosos. Em algumas modalidades, o indivíduo é um mamífero não primata, tal como um roedor.

[00407] Como usado aqui, "tratamento" (e suas variações gramaticais, tais como "tratar" ou "tratando") se refere à melhoria ou redução completa ou parcial de uma doença ou condição ou distúrbio, ou um sintoma, efeito ou resultado adverso ou fenótipo associado com isso. Os efeitos desejáveis do tratamento incluem, entre outros, prevenção da ocorrência ou recorrência da doença, alívio dos sintomas, diminuição de quaisquer consequências patológicas diretas ou indiretas da doença, prevenção de metástases, diminuição da taxa de progressão da doença, melhoria ou alivio do estado de doença e remissão ou prognóstico melhorado. As expressões não implicam a cura completa de uma doença ou a eliminação completa de qualquer sintoma ou efeito em todos os sintomas ou resultados.

[00408] Como usado aqui, "retardar o desenvolvimento de uma doença" significa adiar, impedir, alentecer, retardar, estabilizar, suprimir e/ou adiar o desenvolvimento da doença (tal como o câncer). Esse retardo pode ser de duração variável, dependendo da história da doença e/ou do indivíduo a ser tratado. Como é evidente, um retardo suficiente ou significativo pode, com efeito, abranger a prevenção, na medida em que o indivíduo não desenvolve a doença. Por exemplo, um câncer em estágio avançado, tal como com o desenvolvimento de metástases, pode ser retardado.

[00409] "Prevenção", como usada aqui, inclui o fornecimento de profilaxia com relação à ocorrência ou recorrência de uma doença em um indivíduo que pode estar predisposto à doença, mas ainda não foi diagnosticado com a doença. Em algumas modalidades, as células e composições fornecidas são usadas para retardar o desenvolvimento de uma doença ou para retardar a progressão de uma doença.

[00410] Como usado aqui, "suprimir" uma função ou atividade é reduzir a função ou atividade quando comparada com as mesmas condições, exceto por uma condição ou parâmetro de interesse, ou alternativamente, em comparação com outra condição. Por exemplo, as células que suprimem o crescimento do tumor reduzem a taxa de crescimento do tumor em comparação com a taxa de crescimento do tumor na ausência das células.

[00411] Uma "quantidade eficaz" de um agente, por exemplo, uma formulação, células ou composição farmacêutica, no contexto da administração, se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens/quantidades e por períodos de tempo necessários, para alcançar um resultado desejado, tal como como um resultado terapêutico ou profilático.

[00412] Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" de um agente, por exemplo, uma formulação farmacêutica ou células manipuladas, se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar um resultado terapêutico desejado, tal como para o tratamento de uma doença, condição ou distúrbio e/ou efeito farmacocinético ou farmacodinâmico do tratamento. A quantidade terapeuticamente eficaz pode variar de acordo com fatores tais como o estado da doença, idade, sexo e peso do indivíduo e os polipeptídeos imunomoduladores ou células manipuladas administradas. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos envolvem a administração dos polipeptídeos imunomoduladores, células manipuladas ou composições em quantidades eficazes, por exemplo, quantidades terapeuticamente eficazes.

[00413] Uma "quantidade profilaticamente eficaz" se refere a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado profilático desejado. Tipicamente, mas não necessariamente, uma vez que uma dose profilática é usada em indivíduos antes ou em um estágio precoce da doença, a quantidade profilaticamente eficaz será menor do que a quantidade terapeuticamente eficaz.

[00414] A expressão "formulação farmacêutica" se refere a uma preparação que permite que a atividade biológica de um ingrediente ativo contido nela seja eficaz e que não contém componentes adicionais que sejam inaceitavelmente tóxicos para um indivíduo ao qual a formulação seria administrada.

[00415] Um "veículo farmaceuticamente aceitável" se refere a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, diferente de um ingrediente ativo, que não é tóxico para um indivíduo. Um veículo farmaceuticamente aceitável inclui, mas não está limitado a um tampão, excipiente, estabilizador ou conservante.

[00416] Como usado aqui, a citação de que as posições de nucleotídeos ou aminoácidos "correspondem a" posições de nucleotídeos ou aminoácidos em uma sequência divulgada, tal como estabelecido na Listagem de Sequências, se refere a posições de nucleotídeos ou aminoácidos identificadas após o alinhamento com a sequência divulgada para maximizar a identidade usando um algoritmo de alinhamento padronizado, tal como o algoritmo GAP. Alinhando as sequências, pode-se identificar resíduos correspondentes, por exemplo, usando resíduos de aminoácidos conservados e idênticos como guias. Em geral, para identificar posições correspondentes, as sequências de aminoácidos são alinhadas para que seja obtida a correspondência do mais alto grau (veja, por exemplo: Computational Molecular Biology, Lesk, AM, ed., Oxford University Press, Nova York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, DW, ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, AM, e Griffin, HG, eds., Humana Press, New. Jersey, 1994; Análise de Sequência em Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M Stockton Press, Nova Iorque, 1991; Carrillo et al. ( 1988) SIAM J Applied Math 48:1073).

[00417] Como usado aqui, as formas no singular "o/a", "um/uma" incluem as referências no plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, "um" ou "uma" significa "pelo menos um" ou "um ou mais". É entendido que aspectos e variações aqui descritos incluem "consistindo" e/ou "consistindo essencialmente” em aspectos e variações.

[00418] Ao longo desta descrição, vários aspectos do assunto reivindicado são apresentados em um formato de intervalo. Deve ser entendido que a descrição no formato de intervalo é meramente por conveniência e brevidade e não deve ser interpretada como uma limitação inflexível no escopo do assunto em questão reivindicado. Por conseguinte, a descrição de um intervalo deve ser considerada como tendo divulgado especificamente todos os subintervalos possíveis, assim como valores numéricos individuais dentro desse intervalo. Por exemplo, quando é fornecido um intervalo de valores, entende-se que cada valor intermediário, entre o limite superior e inferior desse intervalo e qualquer outro valor declarado ou interveniente nesse intervalo declarado, é abrangido pelo assunto em questão reivindicado. Os limites superior e inferior desses intervalos menores podem ser incluídos independentemente nos intervalos menores e também estão incluídos no assunto em questão reivindicado, sujeitos a qualquer limite excluído especificamente no intervalo indicado. Quando o intervalo declarado inclui um ou ambos os limites, os intervalos que excluem um ou ambos os limites incluídos também são incluídos no assunto reivindicado. Isso se aplica independentemente da amplitude do intervalo.

[00419] A expressão "cerca de", conforme aqui utilizada, se refere à faixa de erro usual para o respectivo valor prontamente conhecido pela pessoa versada na técnica. A referência a "cerca de" um valor ou parâmetro neste documento inclui (e descreve) modalidades que são direcionadas a esse valor ou parâmetro per se. Por exemplo, a descrição referente a "cerca de X" inclui a descrição de "X". Em certas modalidades, "cerca de" um valor declarado se refere a um valor dentro de ±25%, ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0,1% ou ±0,01% do valor indicado.

[00420] Como aqui usado, uma composição se refere a qualquer mistura de dois ou mais produtos, substâncias ou compostos, incluindo células. Pode ser uma solução, uma suspensão, líquido, pó, uma pasta, aquosa, não aquosa ou qualquer combinação dos mesmos.

[00421] Como usado aqui, uma declaração de que uma célula ou população de células é "positiva" para um marcador em particular se refere à presença detectável sobre ou dentro da célula de um marcador em particular, tipicamente um marcador de superfície. Quando se refere a um marcador de superfície, a expressão se refere à presença de expressão na superfície como detectada por citometria de fluxo, por exemplo, pela coloração com um anticorpo que se liga especificamente ao marcador e pela detecção do referido anticorpo, em que a coloração é detectável por citometria de fluxo em um nível substancialmente acima da coloração detectada com a execução do mesmo procedimento com um controle compatível com isotipo sob condições idênticas e/ou em um nível substancialmente semelhante ao da célula que se sabe ser positiva para o marcador e/ou em um nível substancialmente mais alto do que para uma célula que se sabe ser negativa para o marcador.

[00422] Como usado aqui, uma declaração de que uma célula ou população de células é "negativa" para um marcador em particular se refere à ausência de presença substancial detectável sobre ou na célula de um marcador em particular, tipicamente um marcador de superfície. Quando se refere a um marcador de superfície, a expressão se refere à ausência de expressão na superfície como detectada por citometria de fluxo, por exemplo, pela coloração com um anticorpo que se liga especificamente ao marcador e pela detecção do referido anticorpo, em que a coloração não é detectada pela citometria de fluxo em um nível substancialmente acima da coloração detectada executando o mesmo procedimento com um controle compatível com isotipo em condições idênticas, e/ou em um nível substancialmente mais baixo do que o da célula conhecida como positiva para o marcador e/ou em um nível substancialmente semelhante ao de uma célula conhecida como negativa para o marcador.

[00423] A expressão "vetor", como usada aqui, se refere a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar outro ácido nucleico ao qual está ligado. A expressão inclui o vetor como uma estrutura de ácido nucleico autorreplicante, assim como o vetor incorporado no genoma de uma célula hospedeira na qual ele foi introduzido. Certos vetores são capazes de direcionar a expressão de ácidos nucleicos aos quais eles estão operarativamente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão. "

[00424] As expressões "célula hospedeira", "linhagem celular hospedeira" e "cultura de células hospedeiras" são usadas alternativamente e se referem às células nas quais o ácido nucleico exógeno foi introduzido, incluindo a progênie de tais células. As células hospedeiras incluem "transformantes" e "células transformadas", que incluem a célula primária transformada e a progênie derivada da mesma, sem levar em consideração o número de passagens. A progênie pode não ser completamente idêntica no conteúdo de ácido nucleico a uma célula parental, mas pode conter mutações. A progênie mutante que tem a mesma função ou atividade biológica tal como rastreada ou selecionada na célula originalmente transformada está incluída aqui. VI. MODALIDADES EXEMPLIFICADORAS

[00425] Entre as modalidades fornecidas estão:

[00426] 1. Método para manipulação genética de células T, caracterizado pelo fato de que o método compreende:

[00427] (a) incubar uma composição de entrada, sob condições estimulantes, por entre 2 e 6 dias, a dita composição de entrada compreendendo uma população de células T que compreende células T semelhantes às células T naives e células T semelhantes às células T não naives, em que a as condições de estimulação compreendem um reagente estimulatório capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR e/ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimulatórias, gerando assim uma composição estimulada; e

[00428] (b) introduzir um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente modificado na composição estimulada de células T, em que a introdução é realizada durante pelo menos uma porção da incubação.

[00429] 2. Método para manipulação genética de células T, o método compreendendo:

[00430] (a) incubar uma composição de entrada, sob condições estimulantes, por entre 2 e 6 dias, a dita composição de entrada compreendendo uma população de células T que compreende células T semelhantes às células T naives e células T semelhantes às células T não naives, gerando assim uma composição estimulada; e

[00431] (b) introduzir um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente modificado na composição estimulada de células T, em que a introdução é realizada durante pelo menos uma porção da incubação.

[00432] 3. O método da modalidade 2, em que as condições estimulantes compreendem a incubação da composição de entrada com um reagente estimulatório capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo de TCR e/ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais moléculas coestimulatórias.

[00433] 4. Método para a manipulação genética de células T, o método que compreende incubar uma composição de entrada, em condições estimulantes, por entre 2 e 6 dias, a dita composição de entrada compreendendo uma população de células T que compreende células T semelhantes às células T naives e células T semelhantes às células T não naives em que: - as condições estimulantes compreendem um reagente estimulatório capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR e/ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimulatórias, gerando assim uma composição estimulada; e - a incubação da composição de entrada sob condições estimulantes é realizada antes, durante e/ou subsequente à introdução de um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente modificado.

[00434] 5. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que a incubação é realizada por pelo menos 3 dias.

[00435] 6. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que a incubação é realizada por pelo menos 4 dias.

[00436] 7. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que a incubação é realizada por pelo menos 5 dias.

[00437] 8. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 4, em que a incubação é realizada por pelo menos 6 dias.

[00438] 9. Um método para estimular células T, o método compreendendo:

[00439] (a) incubação, sob condições estimulantes, uma composição de entrada que compreende células T que compreendem uma quantidade inicial de cultura de células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+, produzindo assim uma composição estimulada; e

[00440] (b) introduzir na composição celular estimulada um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente manipulado, em que o método gera assim uma composição de saída que compreende células T que expressam o receptor recombinante geneticamente manipulado.

[00441] 10. O método da modalidade 9, em que as células T compreendem células T semelhantes às células T naives e células T semelhantes às células T não naives, em que as condições estimulantes induzem preferencialmente a expansão ou proliferação de células T semelhantes às células T naives em comparação com as células T semelhantes às células T não naives na composição estimulada.

[00442] 11. O método da modalidade 9 ou modalidade 10, em que a introdução é realizada durante pelo menos uma porção da incubação ou é realizada subsequentemente à incubação.

[00443] 12. O método de qualquer uma das modalidades 9 a 11, em que a quantidade inicial de cultura de células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+ é de ou de cerca de 0,1 x 108 a 5 x 108, entre ou entre cerca de 0,1 x 108 a 4 x 108, entre ou entre cerca de 0,1 x 108 a 2 x 108, entre ou entre cerca de 0,1 x 108 a 1 x 108, entre ou entre cerca de 1 x 108 a 5 x 108, entre ou entre cerca de 1 x 1108 a 4 x 108, entre ou entre cerca de 1 x 108 a 2 x 108, entre ou entre cerca de 2 x 108 a 5 x 108, entre ou entre cerca de 2 x 108 a 4 x 108 das células T semelhantes células T naives ou um subgrupo de células T CD8+ dessas.

[00444] 13. O método de qualquer uma das modalidades 9 a 12, em que a quantidade inicial de cultura de células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+ é pelo menos ou pelo menos cerca de ou é ou é cerca de 0,5 x 108, 0,75 x 108, 1 x 108, 1,5 x 108, 2 x 108 ou 4 x 108 das células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+.

[00445] 14. O método de qualquer uma das modalidades 9 a 13, em que a quantidade inicial de cultura de células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+ é pelo menos ou pelo menos cerca de ou é ou é cerca de 2 x 108 células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+.

[00446] 15. Método para estimular células T, o método compreendendo incubar, sob condições estimulantes, uma composição de entrada que compreende células T que compreendem uma quantidade inicial de cultura de células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+ de ou de cerca 1 x 108 a 4 x 108 células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+, produzindo assim uma composição estimulada.

[00447] 16. O método da modalidade 15, em que as células T compreendem células T semelhantes às células T naives e células T semelhantes às células T não naives, em que as condições estimulantes induzem preferencialmente a expansão ou proliferação das células T semelhantes às células T naives em comparação com as células T semelhantes às células T não naives na composição estimulada.

[00448] 17. O método da modalidade 15 ou modalidade 16, em que a quantidade inicial de cultura de células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+ é pelo menos ou pelo menos cerca de ou é ou é cerca de 2 x 108 das células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+.

[00449] 18. O método de qualquer uma das modalidades 17-17, em que a quantidade inicial de cultura é uma quantidade de células T CD8+ semelhantes às células T naives.

[00450] 19. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 18, em que as células T semelhantes às células T naives ou células T CD8+ semelhantes às células T naives: são positivas na superfície para um marcador de ativação de células T selecionado do grupo que consiste em CD45RA, CD27, CD28 e CCR7; e / ou são negativas na superfície para um marcador selecionado do grupo que consiste em CD25, CD45RO, CD56, CD62L, KLRG1; e/ou têm baixa expressão de CD95; e/ou são negativas para a expressão intracelular de uma citocina selecionada do grupo que consiste em IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10.

[00451] 20. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 19, em que as células semelhantes às células naives ou as células CD8+ semelhantes às células naives: são positivas na superfície para um marcador de ativação de células T selecionado do grupo que consiste em CD45RA, CD27, CD28 e CCR7; e/ou são negativas na superfície para um marcador selecionado do grupo que consiste em CD45RO, CD56, KLRG1; e/ou têm baixa expressão de CD95.

[00452] 21. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 20, em que as células T semelhantes às células T naives ou as células CD8+ semelhantes às células naives são CD45RA+, CD27+, CCR7+ e/ou CD45RO-.

[00453] 22. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 17 e 16 a 21, em que as células T semelhantes às células T não naives: são negativas na superfície para um marcador de ativação de células T selecionado do grupo que consiste em CD45RA, CD27, CD28 e CCR7; e/ou têm superfície positiva para um marcador selecionado do grupo que consiste em CD25, CD45RO, CD56, CD62L, KLRG1 e perforina; e/ou têm expressão intracelular positiva de uma citocina selecionada do grupo que consiste em IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10; e/ou tem alta expressão de CD95.

[00454] 23. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 14 e 16 a 22, em que as células T semelhantes às células T não naives são CD45RA-, CD27-, CCR7- e/ou CD45RO+.

[00455] 24. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 23, em que as células da composição de entrada não foram e não são, antes da incubação, submetidas a uma etapa de seleção com base em um marcador de superfície de célula T endógeno que diferencia células T semelhantes às células T naives e não naives.

[00456] 25. O método de qualquer uma das modalidades 15 a 24, compreendendo ainda a introdução de um receptor recombinante geneticamente modificado nas células estimuladas, em que o método gera assim uma composição de saída que compreendem células T que expressam o receptor recombinante geneticamente manipulado.

[00457] 26. O método da modalidade 26, em que a incubação da composição sob condições estimulantes é realizada antes, durante e/ou subsequente à introdução de um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente manipulado.

[00458] 27. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 14 e 25 a 26, em que o receptor recombinante é capaz de se ligar a um antígeno alvo que está associado com, é específico para e/ou expresso em uma célula ou tecido de uma doença, distúrbio ou condição.

[00459] 28. O método da modalidade 27, em que a doença, distúrbio ou condição é uma doença ou distúrbio infeccioso, uma doença autoimune, uma doença inflamatória ou um tumor ou um câncer.

[00460] 29. O método da modalidade 27 ou modalidade 28, em que o antígeno alvo é um antígeno tumoral.

[00461] 30. O método de qualquer uma das modalidades 27 a 29, em que o antígeno alvo é selecionado dentre a ανβ6 integrina (avb6 integrina), antígeno de maturação de células B (BCMA), anidrase carbônica 9 (CAIX), Her2/neu (receptor tirosina quinase erbB2), L1- CAM, B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX ou G250), um antígeno de câncer de testículo, antígeno de câncer/testículo 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA) e antígeno de superfície da hepatite B, receptor anti-folato, ciclina, ciclina A2, Ligante 1 do Motivo C-C da Quimiocina (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44 , CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteoglicano 4 do sulfato de condroitina (CSPG4), proteína do fator de crescimento epidérmico (EGFR), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40 ), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), erb-B2, erb-B3, erb-B4, dímeros de erbB, mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico do tipo

receptor de fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGF-R2), receptor de estrogênio, receptor de progesterona, Tumor de Wilms 1 (WT-1), um antígeno específico de patógeno ou expresso por patógeno e um antígeno associado a um marcador universal.

[00462] 31. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 14 e 25 a 30, em que o receptor recombinante é ou compreende um receptor de antígeno não TCR funcional ou um TCR ou seu fragmento de ligação ao antígeno.

[00463] 32. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 14 e 25 a 30, em que o receptor recombinante é um receptor de antígeno quimérico (CAR).

[00464] 33. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 14 e 25 a 32, em que o receptor recombinante compreende um domínio extracelular que compreende um domínio de ligação ao antígeno, opcionalmente em que o domínio de ligação ao antígeno se liga especificamente ao antígeno alvo.

[00465] 34. O método da modalidade 33, em que o domínio de ligação ao antígeno é ou compreende um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, que opcionalmente é um fragmento de cadeia simples.

[00466] 35. O método da modalidade 33, em que o fragmento compreende regiões variáveis de anticorpo unidas por um ligante flexível.

[00467] 36. O método da modalidade 34 ou modalidade 35, em que o fragmento compreende um scFv.

[00468] 37. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 14 e 25 a 36, em que o receptor recombinante compreende ainda um espaçador e/ou uma região de dobradiça.

[00469] 38. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 14 e 25 a 37, em que o receptor recombinante compreende uma região de sinalização intracelular.

[00470] 39. O método da modalidade 38, em que a região de sinalização intracelular compreende um domínio de sinalização intracelular.

[00471] 40. O método da modalidade 39, em que o domínio de sinalização intracelular é ou compreende um domínio de sinalização primário, um domínio de sinalização que é capaz de induzir um sinal de ativação primário em uma célula T, um componente do domínio de sinalização de um receptor de célula T (TCR) e/ou um domínio de sinalização que compreende um motivo de ativação de imunorreceptor baseado em tirosina (ITAM).

[00472] 41. O método da modalidade 40, em que o domínio de sinalização intracelular é ou compreende um domínio de sinalização intracelular de uma cadeia CD3, opcionalmente uma cadeia CD3-zeta (CD3ζ) ou uma porção de sinalização da mesma.

[00473] 42. O método de qualquer uma das modalidades 38 a 41, em que o receptor recombinante compreende ainda um domínio transmembrana disposto entre o domínio extracelular e a região de sinalização intracelular.

[00474] 43. O método de qualquer uma das modalidades 38 a 42, em que a região de sinalização intracelular compreende ainda uma região de sinalização coestimulatória.

[00475] 44. O método da modalidade 43, em que a região de sinalização coestimulatória compreende um domínio de sinalização intracelular de uma molécula coestimulatória de células T ou uma porção de sinalização da mesma.

[00476] 45. O método da modalidade 43 ou modalidade 44, em que a região de sinalização coestimulatória compreende um domínio de sinalização intracelular de um CD28, um 4- 1BB ou um ICOS ou uma porção de sinalização da mesma.

[00477] 46. O método de qualquer uma das modalidades 43 a 45, em que a região de sinalização coestimulatória está entre o domínio transmembrana e a região de sinalização intracelular.

[00478] 47. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 46, em que a condição estimulante compreende a incubação com um reagente estimulatório capaz de ativar células T, células T CD4+ e/ou células T CD8+; é capaz de induzir um sinal através de um complexo de TCR; e/ou é capaz de induzir a proliferação de células T, células T CD4+ e/ou células T CD8+.

[00479] 48. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 47, em que a condição estimulante compreende a incubação com um reagente de estimulação capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo de TCR e/ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou moléculas mais coestimulatórias.

[00480] 49. O método da modalidade 47 ou modalidade 48, em que o reagente de estimulação compreende um agente primário que se liga especificamente a um membro de um complexo de TCR, opcionalmente que se liga especificamente a CD3.

[00481] 50. O método da modalidade 49, em que o agente de estimulação compreende ainda um agente secundário que se liga especificamente a uma molécula coestimulatória de células T, opcionalmente em que a molécula coestimulatória é selecionada do grupo que consiste em CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, ou ICOS.

[00482] 51. O método de qualquer uma das modalidades 47 a 50, em que os agentes primário e secundário compreendem anticorpos, opcionalmente em que o um ou mais agentes estimulantes compreendem a incubação com um anticorpo anti-CD3 e um anticorpo anti-CD28.

[00483] 52. O método da modalidade 50 ou modalidade 51, em que o primário e/ou secundário estão presentes na superfície de um suporte sólido.

[00484] 53. O método da modalidade 52, em que o suporte sólido é ou compreende uma esfera.

[00485] 54. O método da modalidade 53, em que a esfera compreende um diâmetro maior ou maior que cerca de 3,5 μm, mas não mais do que cerca de 9 μm ou não mais do que cerca de 8 μm ou não mais do que cerca de 7 μm ou não mais do que cerca de 7 μm ou não mais do que cerca de 6 μm ou não mais do que cerca de 5 μm.

[00486] 55. O método da modalidade 53 ou modalidade 54, em que a esfera compreende um diâmetro de cerca de 4,5 μm.

[00487] 56. O método de qualquer uma das modalidades 53 a 55, em que a esfera compreende um diâmetro que é ou tem aproximadamente o mesmo tamanho que um linfócito ou uma célula que apresenta o antígeno.

[00488] 57. O método de qualquer uma das modalidades 53 a 56, em que a esfera é inerte.

[00489] 58. O método de qualquer uma das modalidades 53 a 57, em que a esfera é ou compreende uma superfície de poliestireno e, opcionalmente, compreende um núcleo magnético ou superparamagnético.

[00490] 59. O método de qualquer uma das modalidades 53 a 58, em que a condição estimulante compreende incubar as células com uma proporção de esferas para células que é de ou de cerca de 1:1 a 10:1, de ou de cerca de 1:1 a 8:1 , de ou de cerca de 1:1 a 6:1, de ou de cerca de 1:1 a 4:1, de ou de cerca de 1:1 a 3:1, de ou de cerca de 2:1 a 4:1, de ou de cerca de 2:1 a 3:1, de ou de cerca de 1:1 a 2:1, de ou de cerca de 4:1 a 10:1, de ou de cerca de 4:1 a 8:1, de ou de cerca de 4:1 a 6:1, de ou de cerca de 6:1 a 10:1, de ou de cerca de 6:1 a 8:1, de ou de cerca de 8:1 a 10:1, de ou de cerca de 1 :1 a 1:10, de ou de cerca de 1:1 a 1:8, de ou de cerca de 1:1 a 1:6, de ou de cerca de 1:1 a 1:4, de ou de cerca de 1:2 para 1:3.

[00491] 60. Método para manipulação genética de células T, o método compreendendo:

[00492] (a) incubar uma composição de entrada, sob condições estimulantes, por entre 2 e 6 dias, a dita composição de entrada compreendendo uma população de células T que compreende células T semelhantes às células T naives e células T não naive, em que as condições estimulantes compreendem um reagente de estimulação que compreende um anticorpo anti-CD3 e um agente secundário que é um anticorpo anti-CD28 que está ligado a uma esfera, em que a proporção de esferas para células durante a incubação é de ou de cerca de 1:1 a 4:1; e

[00493] (b) introduzir um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente modificado na composição estimulada de células T, em que a introdução é realizada durante pelo menos uma porção da incubação.

[00494] 61. Um método para manipulação genética de células T, o método compreendendo incubar uma composição de entrada, em condições estimulantes, por entre 2 e 6 dias, a dita composição de entrada compreendendo uma população de células T que compreende células T semelhantes às células T naives e células T não naives, em que: em que as condições estimulantes compreendem um reagente de estimulação que compreende um anticorpo anti-CD3 e um agente secundário que é um anticorpo anti-CD28 que é acoplado a uma esfera, em que a proporção de esferas para células durante a incubação é de aproximadamente 1:1 para 4:1; e a incubação da composição de entrada sob condições estimulantes é realizada antes, durante e/ou subsequente à introdução de um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente manipulado.

[00495] 62. O método da modalidade 59, em que a proporção de esferas para células é de ou de cerca de 3:1.

[00496] 63. O método da modalidade 59, em que a proporção de esferas para células é de ou de cerca de 1:1.

[00497] 64. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 63, em que as células T são de uma amostra biológica, opcionalmente em que a amostra biológica é de um indivíduo humano.

[00498] 65. O método da modalidade 64, em que a amostra biológica é ou compreende uma amostra de sangue total, uma amostra de buffy coat, uma amostra de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), uma amostra de células T não fracionada, uma amostra de linfócitos, uma amostra de células sanguíneas brancas, um produto de aférese ou um produto de leucaférese.

[00499] 66. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 65, em que as células T compreendem células CD4+ e/ou CD8+.

[00500] 67. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 66, caracterizado pelo fato de que as células T compreendem células T CD4+ e CD8+ e a proporção de células T CD4+ para CD8+ está entre ou cerca de 2:1 e entre ou cerca de 1:5

[00501] 68. O método da modalidade 55, em que uma proporção das células CD4+ para as células CD8+ é ou é de cerca de 1:1, 1: 2, 2:1, 1:3 ou 3:1.

[00502] 69. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 68, em que as células T semelhantes às células T naives compreendem células T semelhantes às células T naives CD4+ e/ou células T semelhantes às células T naives CD8+.

[00503] 70. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 69, em que as células T semelhantes às células T naives são policlonais.

[00504] 71. O método da modalidade 70, em que a clonalidade das células T semelhantes às células T naives é determinada por sequenciação clonal, opcionalmente, sequenciamento de próxima geração ou análise espectral.

[00505] 72. O método de qualquer uma das modalidades 1a 71, em que a presença, quantidade, número ou percentual de células T semelhantes às células T naives é detectada por citometria de fluxo.

[00506] 73. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 72, em que a condição estimulante não compreende N-acetilcisteína (NAC).

[00507] 74. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 72, em que a condição estimulante não compreende IL-15 e/ou IL-7.

[00508] 75. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 72, em que a condição estimulante resulta ou induz a morte das células T semelhantes às células T não naives ou uma subpopulação da mesma.

[00509] 76. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 75, em que a condição de estimulação resulta em morte celular induzida por ativação (AICD) de células T semelhantes às células T não naives ou uma subpopulação das mesmas.

[00510] 77. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 76, que compreende ainda adicionar DNAase durante a incubação e/ou à composição estimulada.

[00511] 78. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 77, em que a incubação é realizada por mais de ou cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 dias.

[00512] 79. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 78, em que o percentual de células, na composição estimulada, derivada das células T semelhantes às células T naives está aumentada em mais do que ou mais do que cerca de 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes, em comparação com o percentual de células semelhantes às células na composição de entrada.

[00513] 80. O método de qualquer uma das modalidades 1a 79, em que a proporção, na composição estimulada, de células derivadas das células T semelhantes às células T naives em comparação com células derivadas das células T semelhantes às células T não naives está aumentado em mais do que ou mais do que cerca de 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes em comparação com a proporção de células T semelhantes às células T naives comparadas com células T semelhantes às células T não naives na composição de entrada.

[00514] 81. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 80, em que a composição estimulada compreende mais de 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% das células que são derivadas de células T semelhantes às células T naives da composição de entrada.

[00515] 82. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 81, em que a composição estimulada compreende menos de 10% de células derivadas de células T semelhantes às células T não naives.

[00516] 83. O método de qualquer uma das modalidades 1a 82, em que a composição estimulada compreende menos do que 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% de células derivadas das células T não naives.

[00517] 84. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 83, em que, das células na composição de entrada, um percentual maior de células T semelhantes às células T naives, em comparação com as células T semelhantes às células T não naives, é induzidos a proliferar e/ou se tornar ativado.

[00518] 85. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 84, em que um percentual maior de células T que eram do tipo naive na composição de entrada, em comparação com o percentual de células T que eram do tipo não naive na composição de entrada, está se dividindo no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 após o início da dita incubação.

[00519] 86. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 85, em que as condições estimulantes são capazes de induzir a proliferação de um percentual maior de células de uma população de células T semelhantes às células T naives humanas, em comparação células T semelhantes às células T não naives humanas, no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 após o início da incubação nas condições.

[00520] 87. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 86, em que: (i) as células T semelhantes às células T não naives são selecionadas do grupo que consiste em células T efetoras (TEFF), células T de memória, células T de memória central ( T CM), células T com memória efetora (TEM) e combinações das mesmas ou (ii) as células T semelhantes às células T não naives são uma pluralidade de células T que compreendem ou consistem em células T efetoras (TEFF) e/ou células T de memória, as células T de memória compreendendo opcionalmente células T de memória central (TCM) e/ou células T de memória efetora (TEM).

[00521] 88. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 87, em que: o percentual de células T semelhantes às células T naives na composição de entrada é menor que o percentual de células manipuladas na composição estimulada derivada de células T semelhantes às células T naives na composição de entrada.

[00522] 89. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 14 e 25 a 88, em que um percentual maior de células introduzidas com o ácido nucleico é ou é derivado da proliferação de células T semelhantes às células T naives na composição de entrada, em comparação com células T semelhantes às células T não naives na composição de entrada.

[00523] 90. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 14 e 25 a 89, em que a introdução é por transdução.

[00524] 91. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 14 e 25 a 90, em que o ácido nucleico compreende um vetor viral.

[00525] 92. O método da modalidade 91, em que o vetor viral é um vetor retroviral.

[00526] 93. O método da modalidade 91 ou modalidade 92, em que o vetor viral é um vetor lentiviral ou um vetor gamaretroviral.

[00527] 94. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 14 e 25 a 89, em que a introdução é por transposição de um transposon que compreende a molécula de ácido nucleico.

[00528] 95. O método de qualquer uma das modalidades 1 a 94 que é realizado in vitro ou ex vivo.

[00529] 96. Uma composição de saída produzida pelo método de qualquer uma das modalidades 1 a 83.

[00530] 97. Uma composição farmacêutica que compreende a composição de saída da modalidade

[00531] 98. A composição farmacêutica da modalidade 97, que compreende ainda um veículo farmacêutico.

[00532] 99. Um método de tratamento, que compreende a administração a um indivíduo mamífero de uma composição de saída produzida pelo método de qualquer uma das modalidades 1 a 95 ou uma composição farmacêutica da modalidade 97 ou modalidade 98.

[00533] 100. O método da modalidade 99, em que as células são derivadas do indivíduo no qual as células são administradas. VII. EXEMPLOS

[00534] Os exemplos a seguir são incluídos apenas para fins ilustrativos e não pretendem limitar o escopo da invenção. Exemplo 1: Avaliação de marcadores do tipo naive em composições de células T manipuladas contendo células T CAR +.

[00535] As composições manipuladas de células T primárias contendo células T que expressam receptores de antígeno quiméricos (CARs) foram produzidas por dois processos paralelos que utilizaram um reagente de estimulação composto por esferas paramagnéticas revestidas de poliestireno com anticorpos anti-CD3 e anti-CD28 acoplados para ativar as células T antes de transdução com um vetor viral. em ambos os processos, as células foram manipuladas por transdução lentiviral para expressar o mesmo CAR anti-BCMA. O CAR continha um scFv do domínio de ligação ao antígeno específico para BCMA, uma região transmembrana de CD28, uma região de sinalização coestimulatória de 4-1BB e um domínio de sinalização intracelular derivado de CD3-zeta. Os processos diferiram em sua duração e nas condições de expansão das células. As composições de células T produzidas foram avaliadas quanto a marcadores de superfície celular.

[00536] Em ambos os processos, composições separadas de células CD4+ e CD8+ foram selecionadas a partir de PBMCs isoladas de uma amostra de leucaférese de um doador humano e as composições celulares selecionadas foram congeladas. As composições separadas de células T CD4+ e CD8+ foram subsequentemente descongeladas e misturadas na proporção de 1:1 de células T CD4+ viáveis para células T CD8+ viáveis. Aproximadamente 300 x células T (150 x 10 6 CD4+ e 150 x 106 CD8+ células) da composição mista de células de entrada foram estimuladas incubando as células por 18 a 30 horas na presença de esferas conjugadas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28 na proporção de 1:1 de esfera para célula em meio livre de soro. Os meios também continham IL-2, IL-7 e IL-15 recombinantes. Após a estimulação, as células foram lavadas e ressuspensas no meio sem de soro contendo aditivos, assim como IL-2, IL-7 e IL-15 recombinantes.

[00537] Em um processo (daqui em diante "não expandido"), as células da composição celular estimulada foram então transduzidas com um vetor lentiviral que codifica o CAR anti-BCMA por espinoculação. Após a espinoculação, as células foram lavadas e ressuspensas no meio sem soro contendo IL-2, IL-7 e IL-15 recombinantes. As células das composições ressuspensas foram incubadas a cerca de 37,0°C em uma incubadora. Cerca de 96 horas após o início da estimulação, as células foram lavadas duas vezes na presença de um campo magnético para remover as esferas paramagnéticas conjugadas com anticorpo anti-CD3/anti-CD28 e formuladas em uma solução contendo DMSO 10%. A composição celular formulada foi transferida para um saco ou frasco e foi armazenada em aproximadamente -80°C.

[00538] Em outro processo (daqui em diante "expandido"), após a incubação, aproximadamente 100 x 106 células viáveis da composição celular estimulada foram concentradas no meio sem soro contendo IL- 2, IL-7 e IL-15 recombinantes. As células foram transduzidas com um vetor lentiviral que codifica o mesmo CAR anti-BCMA como descrito acima por espinoculação em aproximadamente 1600 g por 60 minutos. Após a espinoculação, as células foram ressuspensas no meio sem soro contendo IL-2, IL-7 e IL-15 recombinantes e incubadas por cerca de 18 a 30 horas a cerca de 37°C. As células foram então cultivadas para expansão por transferência para um biorreator (por exemplo, um biorreator de movimento de balanço) em cerca de 500 mL do meio sem soro exemplificador contendo duas vezes a concentração de IL-2, IL-7 e IL-15, conforme usado durante as etapas de incubação e transdução. Quando uma densidade celular viável definida foi alcançada, a perfusão foi iniciada, onde o meio foi substituído por perfusão semicontínua com mistura contínua. As células foram cultivadas no dia seguinte no biorreator até que fosse atingida uma densidade celular limite de cerca de 3 x 106 células/ml, o que tipicamente ocorreu em um processo que envolve 6-7 dias de expansão. As esferas paramagnéticas conjugadas com anticorpo anti-CD3 e anti-CD28 foram removidas da composição celular por exposição a um campo magnético. As células foram então coletadas e formuladas e crioprotegidas como descrito acima.

[00539] As composições de células T produzidas a partir de processos de manipulação expandidos e não expandidos foram coradas com anticorpos que reconhecem marcadores de superfície incluindo CD4, CD8, CCR7 e CD27 e quantificadas por citometria de fluxo. O percentual de células T CD4+CAR+ e CD8+CAR+ positivas para a coloração de CCR7 e CD27 é mostrado na FIG. 1A., A FIG. IB e FIG. 1C representa um percentual de células CCR7+CD27+ para células T CD4+CAR+ ou CD8+CAR+, respectivamente, nas composições de células T produzidas, em comparação com o percentual de células CCR7+CD27+ na composição de entrada antes da incubação com o reagente de estimulação de esferas conjugadas com anticorpo anti- CD3/anti-CD28 (CMAT). Como mostrado, um percentual maior de CCR7+CD27+ foi observado nas composições de células T produzidas a partir do processo de manipulação não expandido em comparação com o processo de manipulação expandido.

[00540] Análise adicional das células geradas pelo processo expandido de um doador representativo em vários dias durante o processo de fabricação, incluindo na ativação (AMAT), transdução (XMAT) ou em vários momentos após o início da cultura (inoc +2, inoc +4 ou inoc +5), demonstram que a expansão das células está associada a um fenótipo mais diferenciado, conforme determinado por um percentual reduzido de células CCR7+CD27+ (FIG. 1D). Exemplo 2: Relacionamento do Fenótipo semelhante ao Naive sobre a Resposta do Doador a Células T que expressam CAR

[00541] Foram geradas composições terapêuticas exemplificadoras de células T contendo células T autólogas que expressam um receptor de antígeno quimérico (CAR) específico para CD 9. O CAR anti-CD19 continha um scFv anti-CD19 derivado de um anticorpo de murino (região variável derivada de FMC63), um espaçador derivado de imunoglobulina, um domínio transmembrana derivado de CD28, uma região coestimulatória derivada de 4-1BB e um domínio de sinalização intracelular CD3-zeta.

[00542] Para a geração de composições de células para administração, células autólogas foram isoladas dos indivíduos através de leucaférese. As amostras de leucaférese foram submetidas a um processo para geração de células que expressam CAR. O processo envolveu a lavagem das células usando uma seleção automatizada baseada em lavagem e imunoafinidade para purificação de células T CD4+ e CD8+, resultando em duas composições enriquecidas para CD8+ (na qual uma mediana de 99%, Amplitude interquartil (IQR) 98- 100% das células era CD8+) e CD4+ (na qual uma mediana de 99%, Amplitude interquartil (IQR) 98-100% das células era CD4+), respectivamente.

[00543] As células das composições enriquecidas de CD4+ e CD8+, foram ativadas com esferas paramagnéticas anti-CD3/anti-CD28 e, em seguida, foram submetidas separadamente a transdução por lentivírus com um vetor que codifica um CAR anti-CD19 com um domínio coestimulatório de 4-1BB. As populações transduzidas foram então incubadas separadamente na presença de reagentes estimulantes para expansão celular. As células CD4+ e CD8+ expandidas foram formuladas e criopreservadas separadamente e armazenadas antes da administração. Para minimizar as variações, entre lotes e/ou composições de células derivadas de diferentes pacientes, tal como aqueles com diferentes atributos do paciente, em parâmetros indicativos de saúde celular, as células foram mantidas em volumes constantes entre os lotes. Os produtos celulares exibiram uma faixa estreita de concentrações celulares viáveis (com base na avaliação das composições celulares para um grupo de indivíduos, CD8+: mediana 31 x 106 células/mL, IQR 28-40 x 106 células/mL, N = 38; CD4+: mediana 35 x 106 células/mL, IQR 31-40 x 106, N = 36).

[00544] A composição terapêutica das células T CAR+ acima descrita foi administrada a indivíduos com linfoma não Hodgkin (NHL) agressivo recidivante ou refratário (R/R) em um estudo clínico. Especificamente, uma coorte de indivíduos humanos adultos com NHL R/R, incluindo linfoma difuso de células B grandes (DLBCL) de novo ou transformado a partir de linfoma indolente (NOS), linfoma de células B de alto grau (incluindo acerto duplo triplo), DLBCL transformado a partir de leucemia linfocítica crônica (CLL) ou linfomas da zona marginal (MZL), linfoma primário de grandes células mediastinais (PMBCL) e linfoma folicular grau 3b (FLG3B) foram tratados com composições de células T que expressam CAR 19 anti-CD19. Os resultados foram avaliados separadamente para um subgrupo principal de indivíduos da coorte completa (excluindo aqueles com status de baixo desempenho (ECOG 2), DLBCL transformado a partir de linfomas da zona marginal (MZL) e/ou leucemia linfocítica crônica (CLL, Richter) e excluindo os indivíduos com linfoma primário de células grandes mediastinais (PMBCL) e linfoma folicular grau 3b (FLG3B) (coorte central)). A coorte principal incluiu indivíduos com DLBCL, NOS e linfoma folicular transformado (tFL) ou linfoma de células B de alto grau (acerto duplo/triplo) ou linfoma de células B de alto grau, com rearranjos MYC e BCL2 e/ou BCL6 com histologia de DLBCL (acerto duplo/triplo) e com status de desempenho do Eastern Cooperative Oncology Group (ECOG PS) de 0 ou 1. A análise neste momento apresentada neste exemplo é baseada na avaliação de um total de 91 indivíduos na coorte completa (88 (65 da coorte CORE) avaliados quanto à resposta e 91 (67 da coorte CORE) avaliados quanto à segurança) que foram tratados com células que expressam CAR anti-CD19.

[00545] As composições de células criopreservadas contendo células que expressam CAR anti-CD19 foram descongeladas antes da administração intravenosa. A dose terapêutica de células T foi administrada como uma composição celular definida pela administração da população de células CD4+ CAR+ formulada e da população CD8+ CAR+ formulada, administradas separadamente a uma proporção alvo de aproximadamente 1:1. Os indivíduos receberam uma dose única ou dupla de células T que expressam CAR (cada dose única através de infusões separadas de células T CD4+ que expressam CAR e células T CD8+ que expressam CAR, respectivamente) da seguinte maneira: uma dose única do nível de dose 1 (DL1) contendo 5 x 107 do total de células T que expressam CAR ou uma dose única do nível de dose 2 (DL2) contendo 1 x 108 do total de células T que expressam CAR. Em alguns casos, os indivíduos receberam uma dose dupla de DL1 na qual cada dose foi administrada com intervalo de aproximadamente 14 (catorze) dias, administrada no dia 1 e no dia 14, incluindo um indivíduo que inadvertidamente recebeu duas doses de DL2 por meio do esquema de duas doses, devido a um erro de dosagem. O nível de dose e o número alvo de subgrupos de células T para a composição administrada em DL1 e DL2 são apresentados na Tabela E1. Na coorte principal, 34 indivíduos receberam DL1 e 27 indivíduos receberam DL2. Tabela E1. Nível de dose alvo e número de subgrupos de células T para composições que contêm células T CAR anti-CD19 Dose Célula T Dose Célula T (TC) Dose Total de Nível de Auxiliar (TH) Citotóxica Célula T dose (CD4+CAR+) (CD8+CAR+) (CD3+ CAR+) 1 25 x 106 25 x 106 50 x 106 2 50 x 106 50 x 106 100 x 106

[00546] A Tabela E2 mostra os resultados globais de resposta e segurança para a coorte completa e a coorte principal nos dois níveis de dose. A taxa de resposta objetiva (ORR) foi de 74%, incluindo 52% dos indivíduos que mostraram uma resposta completa (CR). A incidência de qualquer grau de síndrome de liberação de citocinas

(CRS) foi de 35%, com CRS grave de 1%; e a incidência de qualquer grau de neurotoxicidade (NT) foi de 19%, com 1% de NT grave. Tabela E2. Resposta e Segurança Após a Administração de Célula CAR+

COMPLETA PRINCIPAL Todos os Todos os DL1 DL2 Níveis de Níveis de Dose Dose a Melhor Resposta 88 65 34 27 Global (BOR), nb ORR, % (95% CI) 74 (63,83) 80(68, 89) 77 (59,89) 82 (62, 94) CR, % (95% CI) 52 (41,63) 55(43, 68) 47 (30, 65) 63 (42, 81) c Segurança, n 91 67 34 29 Qualquer CRS, % 35 (25, 46) 36 (24, 48) 41 (25, 59) 24 (10, 44) (95% CI) sCRS(grau 3-4), % 1 (0, 6) 1 (0, 8) 38 (0, 15) 0 (95% CI) Qualquer NT, % (95% 19 (11,28) 21 (12, 33) 24 (11, 41) 17 (6, 36) CI) sNT(grau 3-4), % (95% 12 (6, 21) 15 (7, 26) 21 (9, 38) 7 (1, 23) CI) a Quatro pacientes tratados com DL1D (nível de dose 1, esquema de duas doses) com resultados similares b Inclui pacientes com evento de PD, morte, ou varreduras de re-estadiamento dia

28. Um paciente não tinha varredura de re-estadiamento disponível. c Inclui todos os indivíduos que receberam pelo menos uma dose do produto de célula que expressa CAR 28 dias antes da data dos dados instantâneos ou morte.

A. Associação entre os Atributos de Célula de Células T que Expressam CAR Anti-CD19 e Resposta

[00547] Foi avaliada a relação entre certos atributos fenotípicos das células T CAR+ nas composições terapêuticas e parâmetros associados aos resultados da resposta clínica. As correlações entre o fenótipo de memória na composição e na função se traduziram em uma correlação positiva entre a composição do subgrupo central de memória e o pico de expansão in vivo das células CAR+ (ρ = 0,42, P = 0,002) e sobrevida livre de progressão (PFS) (estimativa de sobrevida de Kaplan-Meier, P=0,0164) que foram observados. As FIGs 2A-2D mostram as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier para indivíduos aos quais foram administradas composições de células T CAR+, divididas em grupos aos quais foram administradas composições contendo uma frequência de células T CAR+ CCR7+CD27+ entre células T CD4+ CAR+ (FIG. 2A para sobrevida livre de progressão, FIG. 2C para duração da resposta) e entre células T CD8+ CAR+ (FIG. 2B para sobrevida livre de progressão, FIG. 2D para a duração da resposta) acima ou abaixo de um determinado nível limiar. Foi observado que um número maior de células CCR7+CD27+ na composição estavam correlacionadas com maior sobrevida livre de progressão. Exemplo 3: Avaliação da clonalidade de células T usando métodos de sequenciamento e análise

[00548] As composições de células T foram avaliadas quanto à abundância clonal de células T, usando o sequenciamento de células únicas de pares de receptores de células T (TCR), antes e depois da manipulação genética para expressar um receptor de antígeno quimérico (CAR).

[00549] As células T autólogas foram isoladas dos indivíduos através de leucaférese pela seleção baseada em imunoafinidade para purificação de células T CD4+ e CD8+, resultando em duas composições enriquecidas para células T CD8+ e CD4+, respectivamente. As células das composições enriquecidas de CD4+ e CD8+ foram ativadas com esferas paramagnéticas anti-CD3/anti-CD28 e depois foram submetidas separadamente à transdução lentiviral com um vetor que codifica um CAR anti-CD19. O CAR anti-CD19 continha scFv um anti-CD19 derivado de um anticorpo de murino (região variável derivada de FMC63), um espaçador derivado de imunoglobulina, um domínio transmembrana derivado de CD28, uma região coestimulatória derivada de 4-1BB e um domínio de sinalização intracelular CD3-zeta. As populações transduzidas foram então incubadas separadamente na presença de reagentes estimulantes para expansão celular. As composições expandidas de CD8+ e CD4+ contendo células T que expressam CAR foram formuladas e criopreservadas separadamente e armazenadas.

[00550] A clonalidade de células T das composições de células T CD8+ e CD4+ isoladas antes da manipulação (CMAT) e das composições terapêuticas de células T CD4+ e CD8+ CAR+ após a manipulação pelo processo descrito acima foi avaliada. Para avaliar a clonalidade das células T, as células foram submetidas ao sequenciamento de TCR de célula única αβ pareado, geralmente como descrito em WO2016044227, WO2016176322 e WO2012048340. Com base no sequenciamento de célula única com código de barras dos genes de TCR, foram determinadas a clonalidade de células T e a diversidade dos clones identificados em uma população de células. Em alguns casos, o índice de Shannon foi usado como um limiar para filtrar clones ("clonalidade ajustada por Shannon"), que preserva as relações entre amostras e elimina o ruído da amostra. Veja Chaara et al. ( 2018) Front Immunol 9:1038).

[00551] FIG. 3 mostra a clonalidade de cada amostra após a aplicação do índice de Shannon. Como mostrado na FIG. 3, a clonalidade das células CD4 e CD8 diferia entre as composições de células T antes e após a manipulação genética, com as composições de células T CAR+ manipuladas exibindo uma clonalidade reduzida em comparação com as células T nas composições antes do início do processo de manipulação das células.

[00552] As composições terapêuticas de células T CD4+ e CD8+ te CAR + após a manipulação genética foram classificadas pela expressão em citometria de fluxo de um fator indicativo de apoptose, tal como coloração da superfície com Anexina V (Anexina V-) ou clivagem com caspase 3 (indicando células não apoptóticas) e para expressão de vários marcadores de superfície, incluindo CD45RA, CCR7, CD27, CD4 e CD8. O fenótipo das células foi correlacionado com o grau de clonalidade das células. Observou-se que, nas composições terapêuticas de células T CD4+ e CD8+ CAR+, a presença de células marcadoras apoptóticas negativas que eram CCR7-/CD27- correlacionou-se positivamente com a clonalidade das células na composição. Da mesma forma, a presença de células marcadoras apoptóticas negativas que eram CCR7+ ou CCR7+/CD27+ correlacionou-se negativamente com a clonalidade das células em cada uma das composições terapêuticas de células T CD4+ e CD8+ CAR+. Estes resultados são consistentes com uma observação de que a clonalidade das células pode ser inversamente correlacionada com células do tipo naive menos diferenciadas, como determinado pela positividade para CCR7 e/ou CD27.

[00553] A presente invenção não pretende ser limitada no seu escopo às modalidades particulares divulgadas, as quais são fornecidas, por exemplo, para ilustrar vários aspectos da invenção. Várias modificações nas composições e métodos descritos se tornarão aparentes a partir da descrição e dos ensinamentos aqui contidos. Tais variações podem ser praticadas sem se afastar do verdadeiro escopo e espírito da descrição e pretendem se enquadrar no escopo da presente descrição.

SEQUÊNCIAS # SEQUÊNCIA ANOTAÇÃO 1 ESKYGPPCPPCP espaçador (IgG4dobradiç a) (aa) Homo sapiens 2 GAATCTAAGTACGGACCGCCCTGCCCCCCTTGCCCT espaçador (IgG4dobradiç a) (nt) Homo sapiens 3 ESKYGPPCPPCPGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSL Dobradiça- TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGS CH3 FFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKS espaçador LSLSLGK Homo sapiens 4 ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP Dobradiça- EVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREE CH2-CH3

QFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSI espaçador EKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVK Homo sapiens

GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS RLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSL

GK 5 RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNT IgD-dobradiça- GRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLL Fc Homo TPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVP sapiens

TGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVT CTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPE AASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARP PPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDS

RTLLNASRSLEVSYVTDH 6 LEGGGEGRGSLLTCGDVEENPGPR T2A artificial 7 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPRKVCNGIGIGEFKDSLSIN tEGFR ATNIKHFKNCTSISGDLHILPVAFRGDSFTHTPPLDPQEL artificial

DILKTVKEITGFLLIQAWPENRTDLHAFENLEIIRGRTKQH GQFSLAVVSLNITSLGLRSLKEISDGDVIISGNKNLCYAN TINWKKLFGTSGQKTKIISNRGENSCKATGQVCHALCSP EGCWGPEPRDCVSCRNVSRGRECVDKCNLLEGEPRE FVENSECIQCHPECLPQAMNITCTGRGPDNCIQCAHYID GPHCVKTCPAGVMGENNTLVWKYADAGHVCHLCHPN CTYGCTGPGLEGCPTNGPKIPSIATGMVGALLLLLVVAL

GIGLFM 8 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV CD28 (aminoácidos1 53-179 do No. de Acesso. P10747) Homo sapiens 9 IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKP CD28 FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV (aminoácidos1 14-179 do No. de Acesso. P10747) Homo sapiens 10 RSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFA CD28 AYRS (aminoácidos1 80-220 do P10747) Homo sapiens 11 RSKRSRGGHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDF CD28 (LL to AAYRS GG) Homo sapiens 12 KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEG 4-1BB GCEL (aminoácidos2 14-255 do Q07011.1) Homo sapiens

13 RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK CD3 zeta RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEI Homo sapiens

GMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP

R 14 RVKFSRSAEPPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK CD3 zeta RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEI Homo sapiens

GMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP

R 15 RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDK CD3 zeta RRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEI Homo sapiens

GMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPP

R 16 RKVCNGIGIGEFKDSLSINATNIKHFKNCTSISGDLHILPV tEGFR AFRGDSFTHTPPLDPQELDILKTVKEITGFLLIQAWPENR artificial

TDLHAFENLEIIRGRTKQHGQFSLAVVSLNITSLGLRSLK EISDGDVIISGNKNLCYANTINWKKLFGTSGQKTKIISNR GENSCKATGQVCHALCSPEGCWGPEPRDCVSCRNVS RGRECVDKCNLLEGEPREFVENSECIQCHPECLPQAM NITCTGRGPDNCIQCAHYIDGPHCVKTCPAGVMGENNT LVWKYADAGHVCHLCHPNCTYGCTGPGLEGCPTNGPK

IPSIATGMVGALLLLLVVALGIGLFM 17 EGRGSLLTCGDVEENPGP T2A artificial 18 MALPVTALLLPLALLLHA peptideo de sinal CD8 alfa 19 GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A 20 ATNFSLLKQAGDVEENPGP P2A 21 QCTNYALLKLAGDVESNPGP E2A 22 VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP F2A 23 PGGG-(SGGGG)5-P- em que P é prolina, G é glicina e S ligante é serina 24 GSADDAKKDAAKKDGKS ligante 25 atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcct sequência de cctgatccca sinal da cadeia alfa de

GMCSFR 26 MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIP sequência de sinal da cadeia alfa de

GMCSFR 27 Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Dobradiça 28 ELKTPLGDTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSCDT Dobradiça

PPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCP 29 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Dobradiça 30 Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Dobradiça 31 Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Dobradiça 32 Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Dobradiça

33 Glu Val Val Val Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Dobradiça 34 QQGNTLPYT FMC63 LC- CDR3 35 RASQDISKYLN FMC63 CDR L1 36 SRLHSGV FMC63 CDR L2 37 GNTLPYTFG FMC63 CDR L3 38 DYGVS FMC63 CDR H1 39 VIWGSETTYYNSALKS FMC63 CDR H2 40 YAMDYWG FMC63 CDR H3 41 EVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIR FMC63 VH

QPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQ VFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGT

SVTVSS 42 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQK FMC63 VL

PDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNL

EQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEIT 43 DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQK FMC63 scFv

PDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNL EQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKP GSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSL PDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRL TIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYA

MDYWGQGTSVTVSS 44 KASQNVGTNVA SJ25C1 CDR L1 45 SJ25C1 CDR SATYRNS L2 46 SJ25C1 CDR QQYNRYPYT L3 47 SJ25C1 CDR SYWMN H1 48 SJ25C1 CDR QIYPGDGDTNYNGKFKG H2 49 SJ25C1 CDR KTISSVVDFYFDY H3 50 EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWV SJ25C1 VH

KQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADK SSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYW GQGTTVTVSS

51 DIELTQSPKFMSTSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQ SJ25C1 VL

QKPGQSPKPLIYSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTIT

NVQSKDLADYFCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR 52 GGGGSGGGGSGGGGS Ligante 53 EVKLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWV SJ25C1 scFv

KQRPGQGLEWIGQIYPGDGDTNYNGKFKGQATLTADK SSSTAYMQLSGLTSEDSAVYFCARKTISSVVDFYFDYW GQGTTVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIELTQSPKFM STSVGDRVSVTCKASQNVGTNVAWYQQKPGQSPKPLI YSATYRNSGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSKDLADY

FCQQYNRYPYTSGGGTKLEIKR 54 HYYYGGSYAMDY FMC63 HC- CDR3 55 HTSRLHS FMC63 LC- CDR2 56 GSTSGSGKPGSGEGSTKG Ligante 57 gacatccagatgacccagaccacctccagcctgagcgccagcctgggcgac Sequência cgggtgaccatcagctgccgggccagccaggacatcagcaagtacctgaac codificadora tggtatcagcagaagcccgacggcaccgtcaagctgctgatctaccacacca de scFv gccggctgcacagcggcgtgcccagccggtttagcggcagcggctccggca ccgactacagcctgaccatctccaacctggaacaggaagatatcgccaccta cttttgccagcagggcaacacactgccctacacctttggcggcggaacaaag ctggaaatcaccggcagcacctccggcagcggcaagcctggcagcggcga gggcagcaccaagggcgaggtgaagctgcaggaaagcggccctggcctg gtggcccccagccagagcctgagcgtgacctgcaccgtgagcggcgtgagc ctgcccgactacggcgtgagctggatccggcagccccccaggaagggcctg gaatggctgggcgtgatctggggcagcgagaccacctactacaacagcgcc ctgaagagccggctgaccatcatcaaggacaacagcaagagccaggtgttc ctgaagatgaacagcctgcagaccgacgacaccgccatctactactgcgcc aagcactactactacggcggcagctacgccatggactactggggccagggc accagcgtgaccgtgagcagc 58 X1PPX2P Dobradiça X1 é glicina, cisteína ou arginina X2 é cisteina ou treonina 59 Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Dobradiça Pro

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método para manipulação genética de células T, caracterizado pelo fato de que o método compreende: (a) incubar uma composição de entrada, sob condições estimulantes, por entre 2 e 6 dias, a dita composição de entrada compreendendo uma população de células T que compreende células T semelhantes às células T naives e células T semelhantes às células T não naives, em que a as condições de estimulação compreendem um reagente de estimulação capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo TCR e/ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimulatórias, gerando assim uma composição estimulada; e (b) introduzir um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente modificado na composição estimulada de células T, em que a introdução é realizada durante pelo menos uma porção da incubação.

2. Método para manipulação genética de células T, caracterizado pelo fato de compreender incubar uma composição de entrada, sob condições estimulantes, por entre 2 e 6 dias, a dita composição de entrada compreendendo uma população de células T que compreende células T semelhantes às células T naives e células T semelhantes às células T não naives, em que as condições de estimulação compreendem a presença de um reagente de estimulação capaz de ativar um ou mais domínios de sinalização intracelular de um ou mais componentes de um complexo de TCR e/ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimulatórias, gerando dessa maneira uma composição estimulada; e a incubação da composição de entrada sob condições estimulantes é realizada antes, durante e/ou subsequente à introdução de um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente manipulado

3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a incubação é realizada por pelo menos 3 dias.

4. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a incubação é realizada por pelo menos 4 dias.

5. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a incubação é realizada por pelo menos 5 dias.

6. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a incubação é realizada por pelo menos 6 dias.

7. Método para estimular células T, caracterizado pelo fato de compreender: (a) incubação, sob condições estimulantes, uma composição de entrada que compreende células T que compreendem uma quantidade inicial de cultura de células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+, produzindo assim uma composição estimulada em que a condição estimulante compreende a presença de um reagente de estimulação capaz de ativar um ou mais domínios de um ou mais componentes de um complexo de TCR e/ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimulatórias, gerando assim uma composição estimulada; e (b) introduzir na composição celular estimulada um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente manipulado, em que o método gera assim uma composição de saída que compreende células T que expressam o receptor recombinante geneticamente manipulado.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que as células T compreendem células T semelhantes às células T naives e células T semelhantes às células T não naives, em que as condições estimulantes induzem preferencialmente a expansão ou proliferação de células T semelhantes às células T naives em comparação com as células T semelhantes às células T não naives na composição estimulada.

9. Método de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a introdução é realizada durante pelo menos uma porção da incubação ou é realizada subsequentemente à incubação.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que a quantidade inicial de cultura de células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+ é de ou de cerca de 0,1 x 108 a 5 x 108, entre ou entre cerca de 0,1 x 108 a 4 x 108, entre ou entre cerca de 0,1 x 108 a 2 x 108, entre ou entre cerca de 0,1 x 108 a 1 x 108, entre ou entre cerca de 1 x 108 a 5 x 108, entre ou entre cerca de 1 x 1108 a 4 x 108, entre ou entre cerca de 1 x 108 a 2 x 108, entre ou entre cerca de 2 x 108 a 5 x 108, entre ou entre cerca de 2 x 108 a 4 x 108 das células T semelhantes células T naives ou um subgrupo de células T CD8+ dessas.

11. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 10, caracterizado pelo fato de que a quantidade inicial de cultura de células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+ é pelo menos ou pelo menos cerca de ou é ou é cerca de 0,5 x 108, 0,75 x 108, 1 x 108, 1,5 x 108, 2 x 108 ou 4 x 108 das células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

7 a 11, caracterizado pelo fato de que a quantidade inicial de cultura de células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+ é pelo menos ou pelo menos cerca de ou é ou é cerca de 2 x 108 células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+.

13. Método para estimular células T, caracterizado pelo fato de compreender incubar, sob condições estimulantes, uma composição de entrada que compreende células T que compreendem uma quantidade inicial de cultura de células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+ de ou de cerca 1 x 108 a 4 x 108 células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+, produzindo assim uma composição estimulada, em que as condições estimulatórias compreendem a presença de um reagente de estimulação capaz de ativar um ou mais domínios de um ou mais componentes de um complexo de TCR e/ou um ou mais domínios de sinalização intracelular de uma ou mais moléculas coestimulatórias, gerando assim uma composição estimulada.

14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que as células T compreendem células T semelhantes às células T naives e células T semelhantes às células T não naives, em que as condições estimulantes induzem preferencialmente a expansão ou proliferação das células T semelhantes às células T naives em comparação com as células T semelhantes às células T não naives na composição estimulada.

15. Método de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que a quantidade inicial de cultura de células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+ é pelo menos ou pelo menos cerca de ou é ou é cerca de 2 x 10 8 das células T semelhantes às células T naives ou um subgrupo de células T CD8+.

16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 15, caracterizado pelo fato de que a quantidade inicial de cultura é uma quantidade de células T CD8+ semelhantes às células T naives.

17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que as células T semelhantes às células T naives ou células T CD8+ semelhantes às células T naives: são positivas na superfície para um marcador de ativação de células T selecionado do grupo que consiste em CD45RA, CD27, CD28 e CCR7; e / ou são negativas na superfície para um marcador selecionado do grupo que consiste em CD25, CD45RO, CD56, CD62L, KLRG1; e/ou têm baixa expressão de CD95; e/ou são negativas para a expressão intracelular de uma citocina selecionada do grupo que consiste em IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10.

18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que as células T semelhantes às células T naives ou células T CD8+ semelhantes às células T naives: são positivas na superfície para um marcador de ativação de células T selecionado do grupo que consiste em CD45RA, CD27, CD28 e CCR7; e / ou são negativas na superfície para um marcador selecionado do grupo que consiste em CD45RO, CD56, KLRG1; e/ou têm baixa expressão de CD95.

19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que as células T semelhantes às células T naives ou as células CD8+ semelhantes às células naives são CD45RA+, CD27+, CCR7+ e/ou CD45RO-.

20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, 8 a 12 e 14 a 19, caracterizado pelo fato de que as células T semelhantes às células T não naives:

são negativas na superfície para um marcador de ativação de células T selecionado do grupo que consiste em CD45RA, CD27, CD28 e CCR7; e/ou têm superfície positiva para um marcador selecionado do grupo que consiste em CD25, CD45RO, CD56, CD62L, KLRG1 e perforina; e/ou têm expressão intracelular positiva de uma citocina selecionada do grupo que consiste em IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10; e/ou tem alta expressão de CD95.

21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, 8 a 12 e 14 a 20, caracterizado pelo fato de que as células T semelhantes às células T não naives são CD45RA-, CD27-, CCR7- e/ou CD45RO+.

22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que as células da composição de entrada não foram e não são, antes da incubação, submetidas a uma etapa de seleção com base em um marcador de superfície de célula T endógeno que diferencia células T semelhantes às células T naives e não naives.

23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 22, caracterizado pelo fato de compreender ainda a introdução de um receptor recombinante geneticamente modificado nas células estimuladas, em que método gera assim uma composição de saída que compreende células T que expressam o receptor recombinante geneticamente manipulado.

24. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a incubação da composição sob condições estimulantes é realizada antes, durante e/ou subsequente à introdução de um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente manipulado.

25. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e 23 a 24, caracterizado pelo fato de que o receptor recombinante é capaz de se ligar a um antígeno alvo que está associado com, é específico para e/ou expresso em uma célula ou tecido de uma doença, distúrbio ou condição.

26. Método de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a doença, distúrbio ou condição é uma doença ou distúrbio infeccioso, uma doença autoimune, uma doença inflamatória ou um tumor ou um câncer.

27. Método de acordo com a reivindicação 25 ou 26, caracterizado pelo fato de que o antígeno alvo é um antígeno tumoral.

28. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 27 a 29, caracterizado pelo fato de que o antígeno alvo é selecionado dentre a ανβ6 integrina (avb6 integrina), antígeno de maturação de células B (BCMA), anidrase carbônica 9 (CAIX), Her2/neu (receptor tirosina quinase erbB2), L1-CAM, B7-H3, B7-H6, anidrase carbônica 9 (CA9, também conhecida como CAIX ou G250), um antígeno de câncer de testículo, antígeno de câncer/testículo 1B (CTAG, também conhecido como NY-ESO-1 e LAGE-2), antígeno carcinoembrionário (CEA) e antígeno de superfície da hepatite B, receptor anti-folato, ciclina, ciclina A2, Ligante 1 do Motivo C-C da Quimiocina (CCL-1), CD19, CD20, CD22, CD23, CD23, CD24, CD30, CD33, CD38, CD44 , CD44v6, CD44v7/8, CD123, CD133, CD138, CD171, proteoglicano 4 do sulfato de condroitina (CSPG4), proteína do fator de crescimento epidérmico (EGFR), glicoproteína epitelial 2 (EPG-2), glicoproteína epitelial 40 (EPG-40 ), efrinaB2, receptor de efrina A2 (EPHa2), erb-B2, erb-B3, erb- B4, dímeros de erbB, mutação do receptor do fator de crescimento epidérmico do tipo III (EGFR vIII), proteína de ligação ao folato (FBP), receptor Fc semelhante a 5 ( FCRL5; também conhecido como homólogo 5 do receptor Fc ou FCRH5), receptor de acetilcolina fetal (AchR fetal), uma proteína de ligação ao folato (FBP), receptor alfa de folato, gangliosídeo GD2, GD2 O-acetilado (OGD2), gangliosídeo GD3, glipicano-3 (GPC3), Receptor 5D Acoplado à Proteína G (GPRC5D), Her2/neu (receptor tirosina quinase erbB2), Her3 (erb-B3), Her4 (erb- B4), dímeros erbB, antígeno humano de alto peso molecular associado ao melanoma (HMW-MAA), Antígeno de superfície da hepatite B, antígeno A1 leucocitário humano (HLA-A1), antígeno A2 leucocitário humano (HLA-A2), receptor alfa de IL-22 (IL-22R-alfa), IL-13R-alfa2 (IL- 13Rα2), de quinase receptor de domínio do inserto de quinase (kdr), cadeia leve kappa, Lewis Y, molécula L1 de adesão celular (L1-CAM), epítopo CE7 de L1-CAM, Membro A da Família 8 que contém repetição rica em leucina (LRRC8A), Lewis Y, antígeno associado ao Melanoma (MAGE)-A1, MAGE-A3, MAGE-A6, MAGE-A10, mesotelina (MSLN), c- Met, citomegalovírus murino (CMV), mucina 1 (MUC1), MUC16, ligantes do Membro D do grupo 2 de natural killer (NKG2D), melan A (MART-1), molécula de adesão de células neurais (NCAM), antígeno oncofetal, antígeno do melanoma expresso preferivelmente (PRAME), receptor de progesterona, antígeno específico da próstata, antígeno de células- tronco da próstata (PSCA), antígeno de membrana específico da próstata (PSMA), receptor tirosina quinase semelhante ao receptor órfão 1 (ROR1), survivina, glicoproteína trofoblástica (TPBG também conhecida como 5T4), glicoproteína 72 associada ao tumor (TAG72), proteína 1 relacionada à tirosinase (TRP1, também conhecida como TYRP1 ou gp75), proteína 2 relacionada à tirosinase (TRP2, também conhecida como dopacromo tautomerase, dopacromo delta-isomerase ou DCT), receptor α de folato, 8H9, antígeno duplo, glicoproteína 100 (gp100), receptor de fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR), receptor de fator de crescimento endotelial vascular 2 (VEGF-R2), receptor de estrogênio, receptor de progesterona, Tumor de Wilms 1

(WT-1), um antígeno específico de patógeno ou expresso por patógeno e um antígeno associado a um marcador universal.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e 23 a 28, caracterizado pelo fato de que o receptor recombinante é ou compreende um receptor de antígeno não TCR funcional ou um TCR ou seu fragmento de ligação ao antígeno.

30. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e 23 a 29, caracterizado pelo fato de que o receptor recombinante é um receptor de antígeno quimérico (CAR).

31. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e 23 a 30, caracterizado pelo fato de que o receptor recombinante compreende um domínio extracelular que compreende um domínio de ligação ao antígeno, que se liga especificamente ao antígeno alvo e a um domínio de sinalização intracelular que compreende um ITAM.

32. Método de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que o domínio de ligação ao antígeno é ou compreende um anticorpo ou um fragmento de anticorpo, que opcionalmente é um fragmento de cadeia simples.

33. Método de acordo com a reivindicação 31 ou 32, caracterizado pelo fato de que caracterizado pelo fato de que o domínio de sinalização intracelular é ou compreende um domínio de sinalização intracelular de uma cadeia de CD3, opcionalmente uma cadeia CD3- zeta (CD3ζ) ou uma porção de sinalização da mesma.

34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 31 a 33, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização intracelular compreende ainda uma região de sinalização coestimulatória

35. Método de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização coestimulatória compreende um domínio de sinalização intracelular de uma molécula coestimulatória de células T ou uma porção de sinalização da mesma.

36. Método de acordo com a reivindicação 34 ou 35, caracterizado pelo fato de que a região de sinalização coestimulatória compreende um domínio de sinalização intracelular de um CD28, um 4- 1BB ou um ICOS ou uma porção de sinalização da mesma.

37. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 30 a 36, caracterizado pelo fato de que: o CAR compreende um scFv específico para o antígeno, um domínio transmembrana, um domínio de sinalização citoplasmática derivado de uma molécula coestimulatória, que opcionalmente é ou compreende 4-1BB e um domínio de sinalização citoplasmático derivado de uma molécula que contém ITAM, que opcionalmente é ou compreende um domínio de sinalização de CD3zeta e opcionalmente ainda compreende um espaçador entre o domínio transmembrana e o scFv; o CAR compreende, em ordem, um scFv específico para o antígeno, um domínio transmembrana, um domínio de sinalização citoplasmática derivado de uma molécula coestimulatória, que opcionalmente é ou compreende 4-1BB e um domínio de sinalização citoplasmático derivado de uma molécula que contém uma sinalização primária de ITAM, que opcionalmente é um domínio de sinalização de CD3zeta; o CAR compreende, em ordem, um scFv específico para o antígeno, um espaçador, um domínio transmembrana, um domínio de sinalização citoplasmática derivado de uma molécula coestimulatória, que opcionalmente é um domínio de sinalização 4-1BB e um domínio de sinalização citoplasmático derivado de uma molécula que contém uma sinalização primária de ITAM, que opcionalmente é ou compreende um domínio de sinalização de CD3zeta.

38. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

1 a 37, caracterizado pelo fato de que o reagente de estimulação compreende um agente primário que se liga especificamente a um membro de um complexo de TCR.

39. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 38, caracterizado pelo fato de que o reagente de estimulação compreende um reagente primário que se liga especificamente a CD3.

40. Método de acordo com a reivindicação 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que o agente primário é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno.

41. Método de acordo com a reivindicação 38 ou 39, caracterizado pelo fato de que o agente de estimulação compreende ainda um agente secundário que se liga especificamente a uma molécula coestimulatória de células T, em que opcionalmente a molécula coestimulatória é selecionada do grupo que consiste em CD28, CD137 (4-1-BB), OX40, ou ICOS.

42. Método de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o agente primário é um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno.

43. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 40, caracterizado pelo fato de que o reagente de estimulação compreende um agente primário que é um anticorpo anti-CD3 e um agente secundário que é um anticorpo anti-CD28.

44. Método de acordo qualquer uma das reivindicações 38 a 43, caracterizado pelo fato de que o primário e/ou secundário estão presentes na superfície de um suporte sólido.

45. Método de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o suporte sólido é ou compreende uma esfera.

46. Método de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a esfera compreende um diâmetro maior ou maior que cerca de 3,5 μm, mas não mais do que cerca de 9 μm ou não mais do que cerca de 8 μm ou não mais do que cerca de 7 μm ou não mais do que cerca de 7 μm ou não mais do que cerca de 6 μm ou não mais do que cerca de 5 μm.

47. Método de acordo com a reivindicação 45 ou 46, caracterizado pelo fato de que a esfera compreende um diâmetro de cerca de 4,5 μm.

48. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 47, caracterizado pelo fato de que a esfera compreende um diâmetro que é ou tem aproximadamente o mesmo tamanho que um linfócito ou uma célula que apresenta o antígeno.

49. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 48, caracterizado pelo fato de que a esfera é inerte.

50. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 49, caracterizado pelo fato de que a esfera é ou compreende uma superfície de poliestireno.

51. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 50, caracterizado pelo fato de que a esfera compreende um núcleo magnético ou superparamagnético.

52. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 45 a 51, caracterizado pelo fato de que a condição estimulante compreende incubar as células com uma proporção de esferas para células que é de ou de cerca de 1:1 a 10:1, de ou de cerca de 1:1 a 8:1, de ou de cerca de 1:1 a 6:1, de ou de cerca de 1:1 a 4:1, de ou de cerca de 1:1 a 3:1, de ou de cerca de 2:1 a 4:1, de ou de cerca de 2:1 a 3:1, de ou de cerca de 1:1 a 2:1, de ou de cerca de 4:1 a 10:1, de ou de cerca de 4:1 a 8:1, de ou de cerca de 4:1 a 6:1, de ou de cerca de 6:1 a 10:1, de ou de cerca de 6:1 a 8:1, de ou de cerca de 8:1 a 10:1, de ou de cerca de 1 :1 a 1:10, de ou de cerca de 1:1 a 1:8, de ou de cerca de 1:1 a 1:6, de ou de cerca de 1:1 a 1:4, de ou de cerca de 1:2 para 1:3.

53. Método para manipulação genética de células T,

caracterizado pelo fato de compreender: (a) incubar uma composição de entrada, sob condições estimulantes, por entre 2 e 6 dias, a dita composição de entrada compreendendo uma população de células T que compreende células T semelhantes às células T naives e células T não naive, em que as condições estimulantes compreendem um reagente de estimulação que compreende um anticorpo anti-CD3 e um agente secundário que é um anticorpo anti-CD28 que está ligado a uma esfera, em que a proporção de esferas para células durante a incubação é de ou de cerca de 1:1 a 4:1; e (b) introduzir um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente modificado na composição estimulada de células T, em que a introdução é realizada durante pelo menos uma porção da incubação.

54. Método para manipulação genética de células T, caracterizado pelo fato de compreender incubar uma composição de entrada, em condições estimulantes, por entre 2 e 6 dias, a dita composição de entrada compreendendo uma população de células T que compreende células T semelhantes às células T naives e células T não naives, em que: as condições estimulantes compreendem um reagente de estimulação que compreende um anticorpo anti-CD3 e um agente secundário que é um anticorpo anti-CD28 que é acoplado a uma esfera, em que a proporção de esferas para células durante a incubação é de aproximadamente 1:1 para 4:1; e a incubação da composição de entrada sob condições estimulantes é realizada antes, durante e/ou subsequente à introdução de um ácido nucleico que codifica um receptor recombinante geneticamente manipulado.

55. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações

52 a 54, caracterizado pelo fato de que a proporção de esferas para células é de ou de cerca de 3:1.

56. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 52 a 54, caracterizado pelo fato de que a proporção de esferas para células é de ou de cerca de 1:1.

57. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 56, caracterizado pelo fato de que as células T são de uma amostra biológica, em que opcionalmente a amostra biológica é de um indivíduo humano.

58. Método de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é ou compreende uma amostra de sangue total, uma amostra de buffy coat, uma amostra de células mononucleares do sangue periférico (PBMC), uma amostra de células T não fracionada, uma amostra de linfócitos, uma amostra de células sanguíneas brancas, um produto de aférese ou um produto de leucaférese.

59. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 58, caracterizado pelo fato de que as células T compreendem células CD4+ e/ou CD8+.

60. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 59, caracterizado pelo fato de que as células T compreendem células T CD4+ e CD8+ e a proporção de células T CD4+ para CD8+ está entre ou cerca de 2:1 e entre ou cerca de 1:5.

61. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 60, caracterizado pelo fato de que uma proporção das células CD4+ para as células CD8+ é ou é de cerca de 1:1, 1: 2, 2:1, 1:3 ou 3:1.

62. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 61, caracterizado pelo fato de que as células T semelhantes às células T naives compreendem células T CD4+ semelhantes às células naives e/ou células T CD8+ semelhantes às células naives.

63. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 62, caracterizado pelo fato de que a condição estimulante não compreende N-acetilcisteína (NAC).

64. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 63, caracterizado pelo fato de que a condição estimulante não compreende IL-15 e/ou IL-7.

66. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 65, caracterizado pelo fato de que a condição estimulante resulta ou induz a morte das células T semelhantes às células T não naives ou uma subpopulação da mesma.

67. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 66, caracterizado pelo fato de que a condição de estimulação resulta em morte celular induzida por ativação (AICD) de células T semelhantes às células T não naives ou uma subpopulação das mesmas.

68. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 67, caracterizado pelo fato de compreender ainda adicionar DNAase durante a incubação e/ou à composição estimulada.

69. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 65, caracterizado pelo fato de que a incubação é realizada por mais de ou cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 ou 16 dias.

70. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 69, caracterizado pelo fato de que o percentual de células, na composição estimulada, derivada das células T semelhantes às células T naives está aumentada em mais do que ou mais do que cerca de 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes, em comparação com o percentual de células semelhantes às células na composição de entrada.

71. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 70, caracterizado pelo fato de que a proporção, na composição estimulada, de células derivadas das células T semelhantes às células T naives em comparação com células derivadas das células T semelhantes às células T não naives está aumentado em mais do que ou mais do que cerca de 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes em comparação com a proporção de células T semelhantes às células T naives comparadas com células T semelhantes às células T não naives na composição de entrada.

72. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 71, caracterizado pelo fato de que a composição estimulada compreende mais de 75%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% das células que são derivadas de células T semelhantes às células T naives da composição de entrada.

73. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 72, caracterizado pelo fato de que a composição estimulada compreende menos de 10% de células derivadas de células T semelhantes às células T não naives.

74. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 73, caracterizado pelo fato de que a composição estimulada compreende menos do que 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% ou 0,1% de células derivadas das células T não naives.

75. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 74, caracterizado pelo fato de que, das células na composição de entrada, um percentual maior de células T semelhantes às células T naives, em comparação com as células T semelhantes às células T não naives, é induzidos a proliferar e/ou se tornar ativado.

76. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 75, caracterizado pelo fato de que um percentual maior de células T que eram do tipo naive na composição de entrada, em comparação com o percentual de células T que eram do tipo não naive na composição de entrada, está se dividindo no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 após o início da dita incubação.

77. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 76, caracterizado pelo fato de que as condições estimulantes são capazes de induzir a proliferação de um percentual maior de células de uma população de células T semelhantes às células T naives humanas, em comparação células T semelhantes às células T não naives humanas, no dia 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 após o início da incubação nas condições.

78. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 77, caracterizado pelo fato de que: (i) as células T semelhantes às células T não naives são selecionadas do grupo que consiste em células T efetoras (TEFF), células T de memória, células T de memória central ( TCM), células T com memória efetora (TEM) e combinações das mesmas ou (ii) as células T semelhantes às células T não naives são uma pluralidade de células T que compreendem ou consistem em células T efetoras (TEFF) e/ou células T de memória, as células T de memória compreendendo opcionalmente células T de memória central (TCM) e/ou células T de memória efetora (TEM).

79. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 78, caracterizado pelo fato de que: o percentual de células T semelhantes às células T naives na composição de entrada é menor que o percentual de células manipuladas na composição estimulada derivada de células T semelhantes às células T naives na composição de entrada.

80. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 e 23 a 79, caracterizado pelo fato de que um percentual maior de células introduzidas com o ácido nucleico é ou é derivado da proliferação de células T semelhantes às células T naives na composição de entrada, em comparação com células T semelhantes às células T não naives na composição de entrada.

81. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e 23 a 80, caracterizado pelo fato de que a introdução é por transdução com um vetor viral que compreende um ácido nucleico que codifica o receptor recombinante.

82. Método de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é um vetor retroviral.

83. Método de acordo com a reivindicação 81 ou 82, caracterizado pelo fato de que o vetor viral é um vetor lentiviral ou um vetor gamaretroviral.

84. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 83, caracterizado pelo fato de que a proporção de células T semelhantes às células T naives em comparação com células T semelhantes às células T não naives na composição de entrada está aumentada em mais do que ou mais do que cerca de 1,5 vezes, 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 50 vezes, 100 vezes em comparação com a proporção de células T semelhantes às células T naives comparadas com células T semelhantes às células T não naives na composição de entrada.

85. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 84, caracterizado pelo fato de que a composição estimulada é mais policlonal ou multiclonal comparada com a composição de entrada.

86. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 85, caracterizado pelo fato de que é realizado in vitro ou ex vivo.

87. Composição de saída, caracterizada pelo fato de ser produzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 86.

88. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de compreender a composição de saída como definida na reivindicação 87.

89. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação

88, caracterizada pelo fato de compreender ainda um veículo farmacêutico.

90. Método de tratamento, caracterizado pelo fato de compreender a administração a um indivíduo mamífero de uma composição de saída produzida pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou uma composição farmacêutica como definida na reivindicação 88 ou 89.

91. Método de acordo com a reivindicação 90, caracterizado pelo fato de que as células são derivadas do indivíduo no qual as células são administradas.