WO2025258931A1 - 디지털 pcr 기반의 살아있는 미생물 검출 방법 - Google Patents

디지털 pcr 기반의 살아있는 미생물 검출 방법

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WO2025258931A1
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pma
microorganism
salmonella
microorganisms
living microorganisms
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김세일
박민규
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Korea Research Institute of Standards and Science
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    • C12Q2565/10—Detection mode being characterised by the assay principle
    • C12Q2565/101—Interaction between at least two labels

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting living microorganisms based on digital PCR.
  • qPCR Real-time PCR
  • the first condition is classification according to the type of sample. When the sample is in the form of RNA, it is called one-step, and when the sample is in the form of DNA, it is called two-step.
  • the other condition is classification according to the type of dye used, such as the existing Evagreen and Taqman methods.
  • the standard curve the unknown sample is identified by comparing the standard curve of a specific gene with the standard curve for the unknown sample.
  • dPCR digital PCR
  • This method involves amplifying individual PCR sites, then analyzing them using fluorescent dyes.
  • dPCR utilizes single partitions, such as oil (droplet PCR), microwells, or microvalves. Samples are randomly distributed within these partitions, and partitions containing the sample are labeled positive, while those without are labeled negative. After amplifying each partition, the amplification status is confirmed by detecting the fluorescent substance. Analysis of this random distribution and amplification can be used to infer the original concentration using Poisson statistics.
  • qPCR and dPCR are excellent experimental methods and have shown excellent efficiency in detecting bacteria. Despite this high efficiency, qPCR and dPCR have difficulty detecting live but unculturable bacteria or only live bacteria. Considering that CFU counting is more labor-intensive than PCR, and that it can generally detect live bacteria, a bridge between CFU counting and PCR was deemed necessary.
  • vPCR viability-PCR
  • PMA Propidium Monoazide
  • Ethidium Monoazide (EMA) and PMA could be used, but in the case of EMA, since the solution is made with DMSO, DMSO above a certain concentration can affect the cell wall, and in the case of PMA, since it is made into D.W., the effect on the cell is minimal, so PMA was used in the present invention.
  • PMA when blue light of 565 nm to 500 nm is irradiated on the DNA of a cell, PMA covalently bonds to the DNA of the dead cells and attaches to the DNA of the dead cells, but PMA is blocked by the cell wall of the living cells and cannot bind. After that, when the PCR reaction is performed, only the living cells are amplified, and the dead cells are not amplified.
  • the present invention aims to use PMA to suppress the amplification of dead cells or viable but non-culturable cells (VBNCs) and to amplify and detect only viable cells. Accordingly, the efficacy of PMA was first confirmed, followed by comparison of the number of viable cells using qPCR and dPCR. If any discrepancies exist, the gaps were narrowed. Finally, the number of viable cells was compared using CFU, qPCR, and dPCR. It is anticipated that vPCR will replace CFU in the long term.
  • the present invention was derived from the above-mentioned needs, and the inventors completed the present invention by confirming a method for detecting living microorganisms based on digital PCR.
  • the present invention provides a method for detecting living microorganisms, comprising the steps of: 1) preparing a separated sample containing microorganisms; 2) treating the sample with propidium monoazide; 3) extracting DNA from the sample; and 4) performing a digital polymerase chain reaction using the DNA as a template and microorganism-specific primers and probes.
  • the step 2) may further include a step of treating a surfactant
  • the surfactant may include any surfactant known in the art, and preferably, the surfactant may be Triton X-100, but is not limited thereto.
  • the primers and probes may be primers having SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 and a probe having SEQ ID NO: 3; or primers having SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 and a probe having SEQ ID NO: 6.
  • the probe is labeled with at least one fluorophore, quencher or tetrahydrofuran (THF) selected from the group consisting of the 5' end, the 3' end and the sequence interior, and the fluorophore is fluorescein, 6-carboxyfluorescein (FAM, 6-carboxyfluorescein), hexachloro-6-carboxyfluorescein (HEX, hexachloro-6-carboxyfluorescein), tetrachloro-6-carboxyfluorescein (TET, tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 2-chloro-7-phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein (VIC, 2-chloro-7-phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein), 2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein (JOE, At least one selected from the group consisting of 2,
  • the concentration of the above primer or probe can be selected and used in various ways by a person skilled in the art depending on the experimental conditions, and is preferably 1 to 1000 nM each, and more preferably 100 to 500 nM each, but is not limited thereto.
  • the above separated sample may be separated from feces, blood, cerebrospinal fluid, serum, sputum, urine or biological tissue.
  • the above microorganism includes all microorganisms known in the technical field to which the present invention belongs, preferably includes microorganisms capable of causing food poisoning, more preferably Salmonella or Cronobacter, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a composition for detecting living microorganisms, comprising: a) propidium monoazide; and b) microorganism-specific primers and probes for digital polymerase chain reaction.
  • composition may further comprise a surfactant, and the surfactant may include any surfactant known in the art, preferably, but not limited to, Triton X-100.
  • the present invention provides a method for providing diagnostic information on food poisoning caused by a microorganism, comprising the steps of: 1) preparing a separated sample containing microorganisms; 2) treating the sample with propidium monoazide; 3) extracting DNA from the sample; 4) performing a digital polymerase chain reaction using the DNA as a template and microorganism-specific primers and probes; and 5) determining a positive result if a live microorganism is detected.
  • the present invention provides a composition for diagnosing food poisoning caused by a microorganism, comprising: a) propidium monoazide; and b) a microorganism-specific primer and probe for digital polymerase chain reaction.
  • the live microorganism detection method based on digital PCR of the present invention can replace the CFU method previously used to detect pathogenic microorganisms, thereby providing a new microorganism detection method that suppresses the amplification of dead cells or cells that are alive but cannot be cultured, and amplifies and detects only live cells.
  • Figure 1a shows the number of colonies at Salmonella dilution ratios of 10 -6 and 10 -7 according to one embodiment of the present invention.
  • Figure 1b shows the number of colonies at dilution ratios of 10 -6 and 10 -7 of Cronobacter according to one embodiment of the present invention.
  • Figure 2a shows a standard curve of Ct values of serially diluted Salmonella using qPCR according to one embodiment of the present invention.
  • Figure 3 shows the number of Salmonella pores according to changes in PMA concentration using dPCR according to one embodiment of the present invention.
  • Figure 5 shows the number of pores of Salmonella according to the concentration change of TritonX-100 using dPCR according to one embodiment of the present invention.
  • Figure 6 shows the number of pores of Cronobacter according to the concentration of TritonX-100 using dPCR according to one embodiment of the present invention.
  • the Salmonella species used in the present invention is Salmonella enterica subsp. enterica LT2:DSM17058, and the Cronobacter species is Cronobacter sakajaki KCTC2949.
  • Salmonella was cultured in Brain Heart Infusion (BHI, BD, USA) medium at 37°C, 200RPM, for 15 hours, and when inoculated into BHI medium, 25ul of the Salmonella dilution was cultured in a 37°C incubator for 15 hours.
  • Cronobacter was cultured in Brain Heart Infusion (BHI, BD, USA) medium at 37°C, 200RPM, for 15 hours, and when inoculated into BHI medium, 25ul of the Cronobacter dilution was cultured in a 37°C incubator for 15 hours.
  • Salmonella and Cronobacter cultured in BHI medium at 200 rpm, 37°C, for 15 hours were diluted to an OD 600 of 1, and 500 ⁇ l of the diluted solution was prepared. At least 8 tubes were prepared to distinguish live and dead cells, and to check whether PMA was treated and whether the surfactant worked.
  • 500 ⁇ l of 70% isopropanol (IPA, Sigma-Aldrich, USA) was added to live Salmonella and Cronobacter, and the bacteria were incubated at room temperature for 10 minutes to kill the bacteria. After that, centrifugation was performed at 13,000 rpm for 3 minutes to isolate only the bacteria and resuspended in 450 ⁇ l of BHI medium.
  • DNA extraction was performed using the GenElute TM Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich, USA) according to the kit protocol.
  • the protocol was as follows: The sample was centrifuged at 13,000 rpm for 10 minutes to obtain only the pellet. 200 ⁇ l of 45 mg/ml lysozyme and 20 ⁇ l of RNase were added to the pellet, pipetted, and incubated at 37°C for 30 minutes. Next, 20 ⁇ l of 20 mg/ml Proteinase K and 200 ⁇ l of Lysis Solution C were added, vortexed, and incubated at 55°C for 10 minutes.
  • Salmonella and Cronobacter were cultured in BHI broth for 15 hours, and the OD600 value was quantified as 1 to set the standard. After that, serial dilutions were performed up to 10-7 .
  • the culture conditions were as follows: 25ul each of Salmonella and Cronobacter diluted to 10-7 were cultured in an incubator for 15 hours at 37°C. The number of colonies was counted on each plate and the reverse calculation was performed to calculate the CFU per 1ml.
  • the target gene of the primers used was InvA for Salmonella, and was not separately notified for Cronobacter.
  • the primer and probe sets were designed for bacterial detection provided by the Ministry of Food and Drug Safety.
  • the forward primer is InvA_F
  • the reverse primer is InvA_R
  • the probe is InvA_P.
  • InvA_F (SEQ ID NO: 1) was designed as 5'-GAA TCC TCA GTT TTT CAA CGT TTC-3'
  • InvA_R (SEQ ID NO: 2) was designed as 5'-CGA ATT GCC CGA ACG TGG CGA-3'
  • InvA_P (SEQ ID NO: 3) was designed as 5'-FAM-CTC TTT CGT CTG GCA TTA TCG ATC AGT ACC AG-BHQ1-3'.
  • the forward primer is CS_F
  • the reverse primer is CS_R
  • the probe is CS_P.
  • the qPCR kit used is TaKaRa Probe qPCR Mix (Takara, Japan). The total volume used is 20ul, which contains 10ul of Probe qPCR mix (2X), 0.4ul of Forward primer (10uM), 0.4ul of Reverse primer (10uM), 0.8ul of Probe (5uM), 0.4ul of Rox Reference Dye (50X), 2ul of Template, and 6ul of Sterile purified water.
  • the qPCR reaction was 95°C 20sec 1cycle, and the cycling stage was 95°C 1sec and 60°C 20sec, repeated 40 times.
  • Figure 1 is a boxplot created with R studio to measure the number of colonies by dilution multiple of Salmonella after inoculating 25ul each into BHI medium.
  • Figure 2 is a boxplot created with Python to measure the number of colonies by dilution multiple of Cronobacter after inoculating 25ul each into BHI medium. 2-3 plates were used for each dilution multiple of the sample concentration for one experiment, and 20 experiments were performed. The number of colonies measured in the range of 1:10 -2 to 1:10 -5 was so large that counting was meaningless, while the numbers of 10 -6 and 10 -7 were countable, although there was some margin of error. The average number of colonies for each is shown in Tables 1 and 2 below.
  • Figure 2a is a graph showing the Ct values obtained using qPCR for Salmonella samples serially diluted from 10 -1 to 10 -7 . It is generally said that the efficiency of R 2 , which is in the range of 0 ⁇ R 2 ⁇ 1, is higher the closer it is to 1, and the slope is also better when it is in the range of primer -3.8 ⁇ slope ⁇ -3.2. Looking at the graphs of A to D, we can see that the values of R 2 are all 0.98 or higher, and the slopes are also in the range except for D, so we can say that the efficiency of the dilution or primer is high.
  • a and C which did not add PMA, can be said to have a good amplification using the dilution or primer, and in the case of B, although PMA was added, there was almost no difference when comparing A and C, so we can say that PMA did not affect live Salmonella.
  • D it is different from the graphs of A to C and most of the y values are not shown, so it can be seen that PMA binds to the DNA of dead Salmonella and inhibits amplification.
  • Figure 2b is a graph showing the number of pores obtained using dPCR for serially diluted Salmonella samples.
  • the threshold value is set to 4500, and the results show the number of pores from A to E.
  • dilutions were performed from 10 -1 to 10 -4 , and DW was used as the negative control (NTC).
  • NTC negative control
  • Table 3 shows the results showing the number of Salmonella pores from A to D more clearly. Since A to C showed a considerably large number of 10 -1 , it can be seen that it is in a supersaturated state, and D shows a noticeable decrease. Looking at Figure 2b and Table 3, it can be explained that PMA inhibited the amplification of dead Salmonella by binding to DNA.
  • Dilute Copy number Dilute Copy number A 10 -1 1*10 6 C 10 -1 1*10 6 10 -2 7900 10 -2 4430 10 -3 1082 10 -3 438 10 -4 115 10 -4 33.2 B 10 -1 1*10 6 D 10 -1 327 10 -2 6270 10 -2 32.5 10 -3 585 10 -3 3.3 10 -4 52.8 10 -4 0.5
  • Table 4 shows the Ct values of qPCR according to PMA concentration.
  • the change in PMA concentration was added as a condition. The experiment was conducted to find the most ideal concentration by observing the change in Ct value when the final concentration of PMA was 10uM, 50uM, 100uM, and 200uM. Except for the Ct value of Dead PMA, the other values did not change significantly, although there was a slight difference. However, in the case of Dead PMA, the Ct value differed slightly depending on the concentration, and it was most noticeable at 50uM and 100uM, where the difference in the Ct values of Live and Dead was large.
  • Figure 3 shows the results of diluting Salmonella to 10 -3 and 10 -4 , respectively, and representing them as A and B.
  • A is B01
  • D01 to B02 have PMA concentrations of 10uM, 50uM, 100uM, and 200uM, respectively
  • D02 is Dead-non PMA
  • F02 to D03 have PMA concentrations of 10uM, 50uM, 100uM, and 200uM, respectively.
  • A11 was tested by adding DW instead of the sample. Also, in Table 5 and Fig.
  • B is F03 Live-non PMA
  • H03 to F04 have PMA concentrations of 10uM, 50uM, 100uM, and 200uM, respectively
  • H04 is Dead-non PMA
  • B05 to G05 have PMA concentrations of 10uM, 50uM, 100uM, and 200uM, respectively.
  • A11 was tested by adding DW instead of the sample. Similar to Fig. 3, it can be seen that the number of pores decreased sharply when it was Dead PMA. Also, when the PMA concentration was 50uM and 100uM, the comparison of the qPCR values and the number of pores in dPCR when Live and Dead PMA were treated was the most appropriate.
  • Figure 4 and Table 6 are graphs showing the dPCR results according to the change in PMA concentration of Cronobacter.
  • the dilution ratio was the same as that of Salmonella, 10 -3 and 10 -4 , and the PMA concentrations were 0uM, 10uM, 100uM, and 200uM, respectively.
  • B06 is Live-non PMA
  • the PMA concentrations of C06, G06, and A07 were 10uM, 100uM, and 200uM, respectively.
  • D07 is Dead-non PMA
  • the PMA concentrations of F07, B08, and C08 were 10uM, 100uM, and 200uM, respectively.
  • E08 is Live-non PMA
  • G08, C09, and E09 had PMA concentrations of 10uM, 100uM, and 200uM, respectively.
  • G09 is Dead-non PMA
  • B10, F10, and G10 had PMA concentrations of 10uM, 100uM, and 200uM, respectively.
  • B11 was added as DW rather than Cronobacter. As with Salmonella, it was seen that as the concentration of PMA increased, the number of pores in Fig. 4-B was lower than that in Fig. 4-A.
  • PMA is a reagent that can covalently bind to the DNA of dead cells to suppress amplification and amplify only living cells.
  • vbnc viable but non-cultured
  • the reagent used was Triton X-100, a type of surfactant.
  • the experimental conditions are PMA concentration 100uM, 4 conditions of the final concentration of Triton X-100 from 0% to 1%, and other experimental conditions are the same as the previous experiment.
  • Table 7 shows that Salmonella was used as a sample, and although there are some differences in concentration depending on the condition in qPCR, the Ct value for Dead PMA tends to be much higher than that of other conditions. In particular, the 1% concentration is higher than the other conditions. Considering that Dead was already killed with IPA, it is presumed that vbnc was additionally removed.
  • Detergent conc. NTC Live Dead NTC Non-PMA PMA Non-PMA PMA A10 B10 C10 D10 A06 431.5 660 382.4 0.3 0 Detergent conc.: 0.1% Live Dead NTC Non-PMA PMA Non-PMA PMA E10 F10 G10 H10 A06 545 188 401 0.3 0 Detergent conc.: 0.25% Live Dead NTC Non-PMA PMA Non-PMA PMA A11 B11 C11 D11 A06 1800 382.5 610 0 0 Detergent conc.: 0.5% Live Dead NTC Non-PMA PMA Non-PMA PMA E11 F11 G11 H11 A06 1625 905 423 0 0 Detergent conc.: 0.75% Live Dead NTC Non-PMA PMA Non-PMA PMA A12 B12 C12 D12 A06 640 660 406 0 0 Detergent conc.: 1% Live Dead NTC Non-PMA PMA Non-PMA PMA E12 F12

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Abstract

본 발명은 디지털 PCR 기반의 살아있는 미생물 검출 방법에 관한 것이다.

Description

디지털 PCR 기반의 살아있는 미생물 검출 방법
본 발명은 디지털 PCR 기반의 살아있는 미생물 검출 방법에 관한 것이다.
식중독은 과거부터 꾸준히 발생되었던 오래된 질병 중 하나였다. 식품의약품안전처에 따르면, 대한민국에서 처음으로 관측되기 시작한 년도인 2002년에 발생 건수 78회, 환자수 2,980명이고 그 이후 20년동안 발생 건수와 환자의 수는 적지만 꾸준히 늘기 시작해 2023년까지 누적 발생 건수 5,891회, 누적 환자의 수는 144,834명 이었다. 이런 식중독의 원인들은 여러가지가 존재하지만 가장 큰 원인 중 하나는 부패 및 병원성 미생물이었다. 마찬가지로 식품의약품안전처에 따르면, Salmonella, Cronobacter, Vibrio의 순으로 3개의 병원성 미생물의 원인 물질 빈도가 가장 많았었다.
이런 식중독을 포함한 병원성 미생물을 검출하는 가장 전통적인 방법은 배지를 이용한 미생물 검출이었다. 현대의 트랜드는 microbiology, microbial culture, fungal, virus, etc를 분석하는 것인데, 놀랍게도 이 분야들은 내부적인 제한으로는 샘플 자체의 낮은 농도, 느린 성장력, 복잡한 배양조건 낮은 적응력 등의 문제가 대두되었고, 인력이나 재정 등 여러 외부적인 제한이 존재했다. 따라서 이런 전통적 방법을 제외하고 검출법은 여러가지 방법이 존재했다. 배지를 이용한 CFU를 제외하고 가장 초창기의 모델은 Polymerase Chain Reaction(PCR)이었다. 그리고 약 20년전부터 사용되던 상대적인 정량으로 분석하는 quantitative PCR(qPCR)과 비교적 최근부터 사용이 되기 시작하는 절대적인 정량으로 분석을 하는 digital PCR(dPCR)이 존재했다.
qPCR 혹은 Real-time PCR이라고 불리는 기술은 현대의 분자생물학에서 널리 사용이 되고 있는 실험 기술 중 하나였다. DNA 합성을 진행하는 결과로 signal이나 형광 물질의 변화를 측정하는 분석 방법이었다. 크게 2가지의 조건에 따라 분류가 되었다. 첫번째 조건은, 시료의 종류에 따라 분류를 하는 경우로 시료가 RNA 상태일 때는 one-step이고, DNA의 경우에는 two-step이라고 불리고 있었다. 다른 하나의 조건은 사용되는 염료의 종류에 따라 분류가 되는 경우로 기존의 evagreen과 taqman 방식이 있었다. 표준 곡선에서는 특정 유전자의 표준 곡선과 미지의 시료에 대한 표준 곡선을 비교하여 미지의 시료를 확인 하는 방식이다.
반면에 qPCR과 달리 digitalPCR(dPCR)은 RNA와 DNA의 정밀한 정량화를 제공하는 특수한 PCR 기술로, 기존 PCR의 아날로그적 특성을 디지털 신호로 변환하는 새로운 접근법이다. 이 방법은 개별 PCR로 증폭 후, 형광 염료를 사용하여 각 PCR 부위를 증폭시켜 분석하는 접근법이다. dPCR의 단일의 파티션 사용은 oil(droplet droplet PCR), micro well 혹은 microvalves를 사용하는 방법이 있다. 각 시료들은 이런 파티션 안에 무작위로 분포되며, 시료가 존재하는 파티션은 positive, 시료가 존재하지 않는 파티션은 negative라고 표시한다. 각 파티션을 증폭 후 형광 물질의 검출을 확인하는 방법으로 증폭의 상태를 확인한다. 이런 무작위적인 분포 및 증폭에 대한 분석은 포아송 통계를 사용하여 원래의 농도를 유추가 가능하다.
이런 qPCR과 dPCR은 매우 좋은 실험 방법이고 박테리아의 검출을 상대로 매우 좋은 효율을 보여주었다. 이런 높은 효율을 보여주는데도 불구하고 qPCR과 dPCR은 살아있지만 배양이 불가능한 박테리아 혹은 살아있는 박테리아만의 검출이 힘들었다. CFU가 들이는 수고에 비해 살아있는 박테리아의 검출이 대락적으로 가능하다는 점을 생각해보면, 이런 CFU와 PCR의 중간 가교 역할을 하는 분석법이 필요하다 생각이 되었다.
그래서 등장한 분석법은 Propidium Monoazide(PMA)를 이용한 미생물 생균 검출법인 viability-PCR(vPCR)이었다. 기존의 vPCR의 경우 Ethidium Monoazide (EMA)와 Propidium Monoazide (PMA) 모두 사용이 가능했지만 EMA의 경우 DMSO로 용액을 만들기 때문에 일정 농도 이상의 DMSO가 세포벽에 영향을 줄 수 있고, PMA의 경우 D.W으로 만들어 세포에 미치는 영향이 미미하기 때문에 본 발명에서는 PMA를 사용했다. PMA의 경우 세포의 DNA에 565nm ~ 500nm의 청색광을 쏘면, 죽은 세포의 DNA에 PMA가 공유결합을 해서 죽은 세포의 DNA에 붙고 살아있는 세포는 세포벽에 PMA가 막혀 결합을 하지 못하게 된다. 그 이후 PCR 반응을 진행하면 살아있는 세포만 증폭이 되고 죽은 세포는 증폭이 되지 않는다.
본 발명에서는 PMA를 사용하여, 죽은 세포 혹은 살아있지만 배양이 불가능한 세포(VBNC)의 증폭을 억제하고 살아있는 세포만 증폭하여 검출하는 것을 목표로 했다. 그에 따라 우선적으로 PMA의 작동 여부를 확인하고, 그 이후 qPCR과 dPCR을 이용하여 살아있는 세포의 수를 비교하고, 차이가 존재할 경우 그 간격을 좁히려고 했다. 마지막으로 CFU, qPCR과 dPCR을 비교하여 살아있는 세포의 수를 비교 분석을 하여 장기적으로 vPCR이 CFU를 대체할 수 있을 것이라 예상된다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 디지털 PCR 기반의 살아있는 미생물 검출 방법을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 1) 미생물이 포함된 분리된 시료를 준비하는 단계; 2) 상기 시료에 프로피디움 모노아자이드(propidium monoazide)를 처리하는 단계; 3) 상기 시료에서 DNA를 추출하는 단계; 및 4) 상기 DNA를 주형으로 하고, 미생물 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 디지털 중합효소 연쇄반응(digital polymerase chain reaction)을 수행하는 단계;를 포함하는 살아있는 미생물 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 일 예에서, 상기 2) 단계에 계면활성제를 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것일 수 있고, 상기 계면활성제는 해당 분야에 알려진 모든 계면활성제를 포함하는 것이며, 바람직하게 상기 계면활성제는 트라이톤 엑스-100 (Triton X-100)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 예에서, 상기 프라이머 및 프로브는 서열번호 1 및 서열번호 2인 프라이머 및 서열번호 3인 프로브; 또는 서열번호 4 및 서열번호 5인 프라이머 및 서열번호 6인 프로브인 것일 수 있다.
상기 프로브는 5' 말단, 3' 말단 및 서열내부로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상에 형광단, 소광체 또는 테트라하이드로퓨란(THF)이 표지된 것이고, 상기 형광단은 플루오레세인(fluorescein), 6-카르복시플루오레세인(FAM, 6-carboxyfluorescein), 헥사클로로-6-카르복시플루오레세인(HEX, hexachloro-6-carboxyfluorescein), 테트라클로로-6-카르복시플루오레세인(TET, tetrachloro-6-carboxyfluorescein), 2-클로로-7-페닐-1,4-디클로로-6-카르복시플루오레세인(VIC, 2-chloro-7-phenyl-1,4-dichloro-6-carboxyfluorescein), 2,7-디메톡시-4,5-디클로로-6-카르복시플루오레세인(JOE, 2,7-dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein), 5-((2-아미노에틸)아미노)나프탈렌-1-술폰산(5-((2-aminoethyl)amino)naphthalene-1-sulfonic acid), 쿠마린(coumarin) 및 쿠마린 유도체, 시아닌-5(Cy5, Cyanine-5), 루시퍼 옐로우(lucifer yellow), 텍사스 레드(texas red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), 야키마 옐로우(YG, Yakima Yellow), 및 칼 플루오르 레드 610(CFR, Cal Fluor Red 610)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이며, 상기 소광체는 테트라메틸로다민(TAMRA, tetramethylrhodamine), 4-(4-디메틸아미노페닐아조)벤조산(4-(4-dimethylaminophenylazo)benzoic acid), 4-디메틸아미노페닐아조페닐-4-말레이미드(4-dimethylaminophenylazophenyl-4-maleimide), 카르복시테트라메틸로다민(carboxytetramethylrhodamine) 및 BHQ 염료(BHQ dyes)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다.
상기 프라이머 또는 프로브의 농도는 실험 조건에 따라 통상의 기술자가 다양하게 선택하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 각각 1 내지 1000 nM일 수 있고, 더욱 바람직하게는 각각 100 내지 500 nM일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 분리된 시료는 분변, 혈액, 뇌척수액, 혈청, 객담, 소변 또는 생체 조직으로부터 분리된 것일 수 있다.
상기 미생물은 본 발명이 속하는 기술분야에 알려진 모든 미생물을 포함하고, 바람직하게는 식중독을 유발할 수 있는 미생물을 포함하는 것이며, 더욱 바람직하게는 살모넬라균 또는 크로노박터균인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 a) 프로피디움 모노아자이드(propidium monoazide); 및 b) 디지털 중합효소 연쇄반응(digital polymerase chain reaction)을 위한 미생물 특이적인 프라이머 및 프로브를 포함하는 살아있는 미생물 검출용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 계면활성제를 추가로 포함하는 것일 수 있고, 상기 계면활성제는 해당 분야에 알려진 모든 계면활성제를 포함하는 것이며, 바람직하게 상기 계면활성제는 트라이톤 엑스-100 (Triton X-100)인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 1) 미생물이 포함된 분리된 시료를 준비하는 단계; 2) 상기 시료에 프로피디움 모노아자이드(propidium monoazide)를 처리하는 단계; 3) 상기 시료에서 DNA를 추출하는 단계; 4) 상기 DNA를 주형으로 하고, 미생물 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 디지털 중합효소 연쇄반응(digital polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및 5) 살아있는 미생물이 검출되면 양성인 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 미생물에 의해 유발되는 식중독 진단정보 제공방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 프로피디움 모노아자이드(propidium monoazide); 및 b) 디지털 중합효소 연쇄반응(digital polymerase chain reaction)을 위한 미생물 특이적인 프라이머 및 프로브를 포함하는 미생물에 의해 유발되는 식중독 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 디지털 PCR 기반의 살아있는 미생물 검출 방법은 기존에 병원성 미생물 검출을 위하여 사용하던 CFU법을 대체하여 죽은 세포 또는 살아있지만 배양이 불가능한 세포의 증폭을 억제하고 살아있는 세포만 증폭하여 검출할 수 있는 새로운 미생물 검출 방법을 제공할 수 있다.
도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따른 살모넬라 희석배수 10-6과 10-7의 콜로니의 수를 나타낸 것이다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따른 크로노박터 희석배수 10-6과 10-7의 콜로니의 수를 나타낸 것이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따른 qPCR을 사용해서 연속희석된 살모넬라의 Ct값의 표준곡선을 나타낸 것이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따른 dPCR을 사용해서 연속희석된 살모넬라 포어의 수를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 dPCR을 사용해서 PMA 농도 변화에 따른 살모넬라 포어의 수를 나타낸 것이다. A)는 살모넬라의 10-3의 희석배수, B) 살모넬라의 10-4의 희석배수.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 dPCR을 사용해서 PMA 농도 변화에 따른 크로노박터 포어의 수를 나타낸 것이다. A)는 크로노박터의 10-3의 희석배수, B) 크로노박터의 10-4의 희석배수.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 dPCR을 사용해서 TritonX-100의 농도 변화에 따른 살모넬라의 포어 수를 나타낸 것이다. A) 계면활성제 농도 0%, B) 계면활성제 농도 0.1%, C) 계면활성제 농도 0.25%, D) 계면활성제 농도 0.5%, E) 계면활성제 농도 0.75%, F) 계면활성제 농도 1%.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 dPCR을 사용해서 TritonX-100의 농도 변화에 따른 크로노박터의 포어 수를 나타낸 것이다. 계면활성제 조건에 따른 결과 A) 계면활성제 농도 0%, B) 계면활성제 농도 0.1%, C) 계면활성제 농도 0.25%, D) 계면활성제 농도 0.5%, E) 계면활성제 농도 0.75%, F) 계면활성제 농도 1%.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 본 발명의 범위가 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> Bacteria strains and cultivation
본 발명에서 사용된 살모넬라 종은 Salmonella enterica subsp. enterica LT2:DSM17058, 크로노박터종은 Cronobacter sakajaki KCTC2949이다. 살모넬라는 Brain Heart Infusion (BHI, BD, USA) 배양액에 37℃, 200RPM, 15시간동안 배양을 진행했고, BHI 배지에 접종 시 살모넬라 희석액 25ul를 37℃ 인큐베이터에서 15시간동안 배양을 진행했다. 크로노박터는 Brain Heart Infusion (BHI, BD, USA) 배양액에 37℃, 200RPM, 15시간동안 배양을 진행했고, BHI 배지에 접종 시 크로노박터 희석액 25ul를 37℃ 인큐베이터에서 15시간동안 배양을 진행했다. 광학 밀도(OD600)값을 1로 정량을 잡아 차후 실험에서도 OD600값이 1이 되도록 했다. 단일 콜로니를 얻기 위해 BHI 배지에 살모넬라 희석액을 25ul 접종하여 단일 콜로니를 얻었다.
<실시예 2> Detergent & PMA treatment
BHI 배양액에서 200rpm, 37℃, 15시간동안 배양한 살모넬라균과 크로노박터균을 OD600은 1을 기준으로 희석을 하여 500ul의 희석액을 준비했다. 최소 8개의 튜브를 준비하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 구분하고, PMA의 처리 여부 및 계면활성제의 작동여부를 확인했다. 죽은 살모넬라의 경우는 살아있는 살모넬라와 크로노박터에 500ul의 70% 이소프로판올(IPA, Sigma-Aldrich, USA)를 넣은 후 10분간 상온에서 배양하여 박테리아를 사멸시켰다. 그 이후 13000rpm에 3분간 원심분리를 진행해서 박테리아만 분리 후 BHI 배양액 450ul에 재현탁을 했다. 경우에 따라 계면활성제인 Triton X-100을 50ul 추가하여 계면활성제의 최종 농도가 1%가 되게 한 뒤, 10분간 상온에서 배양했다. 그 이후 13000rpm에 3분간 원심분리를 진행해서 박테리아만 분리 후 BHI 배양액 395ul에 재현탁을 했다. PMA의 처리의 경우 PMA가 필요 없을 튜브의 경우 105ul의 증류수를 추가해 500ul으로 만들고, PMA가 필요한 튜브의 경우 PMA Enhancer for Gram Negative Bacteria (PMA Enhancer, Biotium, USA) 100ul와 10mM PMA 5ul를 추가해서 PMA의 최종 농도가 100uM이 되도록 했다. PMA 반응은 암실의 상온에서 15분간 배양 후, PMA-Lite LED Photolysis Device (PMA-Lite, Biotium, USA)에서 15분간 청색광을 노출시켰다.
<실시예 3> DNA extraction
DNA 추출은 GenEluteTM Bacterial Genomic DNA Kit (Sigma-Aldrich, USA)를 사용하여 키트에서 제공하는 프로토콜을 따라 수행했다. 프로토콜은 다음과 같다. 샘플을 13000rpm에서 10분간 원심분리하여 펠렛만 얻었다. 펠렛에 45mg/ml 농도의 리소자임 200ul와 RNase 20ul를 추가하고 피펫팅 후 37℃에서 30분간 배양했다. 다음 단계로 20mg/ml의 Proteinase K 20ul와 Lysis Solution C 200ul를 추가 후 vortex를 한 뒤 55℃에서 10분간 배양했다. 다음으로, 키트에 제공된 컬럼 튜브에 Column Preparation of Solution 500ul을 추가한 후 13000rpm에 1분간 원심분리를 했습니다. 55℃에 10분간 배양한 튜브에 95% ~ 100%의 에탄올 200ul를 추가하고 vortex를 한 후 컬럼튜브에 옮긴 뒤 13000rpm에 1분간 원심분리를 진행했다. 상층액을 제거 후 남아있는 펠렛에 Wash solution 1를 500ul 추가한 후 13000rpm에 1분간 윈심분리를 진행했다. Wash Solution Concentration을 500ul를 추가한 후 13000rpm에 2분간 원심 분리 후 상층액을 제거하고, 다시한번 13000rpm에 2분간 원심분리해서 남아있는 상층액을 추가적으로 제거했다. 컬럼을 새 튜브에 옮긴 뒤 Elution Solution 200ul를 컬럼 에 추가한 후 5분간 배양을 진행했다. 배양시간이 지나면 혼합물을 13000rpm에서 2분간 원심분리해서 튜브에 남아있는 용액을 보관했다.
<실시예 4> Colony Forming Units (CFU)
살모넬라 균과 크로노박터 균을 BHI 배양액에서 15시간 동안 배양 후 OD600의 값을 1로 정량하여 기준을 맞췄다. 그 이후 10-7까지 연속 희석을 진행했다. 배양 조건은 37℃에서 10-7까지 희석한 살모넬라 균과 크로노박터 균 각각 25ul를 15시간 동안 인큐베이터에서 배양을 했다. 각 플레이트마다 콜로니의 개수를 센 뒤, 역으로 계산을 해서 1ml일 때 CFU를 계산했다.
Colony numbers * 1/diluted factor *1/ inoculated volume =CFU/ml
<실시예 5> Primer design
사용된 프라이머의 target gene은 살모넬라의 경우 InvA, 크로노박터는 따로 고시되어 있지 않았다. 프라이머와 프로브 세트는 식품의약품안전처에서 제공한 박테리아 검출을 위해 디자인이 되었다. 살모넬라의 경우 포워드 프라이머는 InvA_F, 리버스 프라이머는 InvA_R, 프로브는 InvA_P이다. 우선 InvA_F (서열번호 1)는 5'-GAA TCC TCA GTT TTT CAA CGT TTC-3'이고, InvA_R (서열번호 2)은 5'-CGA ATT GCC CGA ACG TGG CGA-3', InvA_P (서열번호 3)는 5'-FAM-CTC TTT CGT CTG GCA TTA TCG ATC AGT ACC AG-BHQ1-3'로 디자인을 했다. 크로노박터의 경우 포워드 프라이머는 CS_F, 리버스 프라이머는 CS_R, 프로브는 CS_P이다. 우선 CS_F (서열번호 4)는 5'-GGG ATA TTG TCC CCT GAA ACA G-3'이고, CS_R (서열번호 5)은 5'-CGA GAA TAA GCC GCG CAT T-3', CS_P (서열번호 6)는 5'-FAM-AGA GTA GTA GTT GTA GAG GCC GTG CTT CCG AAA G-BHQ1-3'로 디자인이 되었다.
<실시예 6> qPCR
사용된 qPCR 키트는 TaKaRa Probe qPCR Mix (Takara, Japan)이다. 사용되는 전체 볼륨은 20ul이고, 그에 따라 Probe qPCR mix (2X) 10ul, Forward primer (10uM) 0.4ul, Reverse primer (10uM) 0.4ul, Probe (5uM) 0.8ul, Rox Reference Dye (50X) 0.4ul, Template 2ul, Sterile purified water 6ul가 포함된다. qPCR의 반응은 95℃ 20sec 1cycle, cycling stage was 95℃ 1sec에 60℃ 20sec를 40회 반복을 한다.
<실시예 7> Digital PCR
Droplet digital PCR의 키트는 ddPCRTM Supermix for Probes (Bio-rad, USA)를 사용했다. 사용되는 프라이머는 q-PCR에 사용되었던 프라이머와 동일했다. Reaction 반응은 2x ddPCR Supermix for Probes 10ul, 20x target primers 2ul, 20x target probe 1ul, RNase free water 2ul, Template 5ul이다. dPCR의 반응은 95도 10분 1회, 94도 30초에 60도 1분을 40회 반복, 98도 10분 1회였다. PCR기기의 온도 변화 비율은 20%로 설정해서 dPCR의 개별 파티션이 깨지지 않도록 진행했다.
<시험예 1> 콜로니의 수
도 1은 살모넬라의 희석 배수 별 콜로니의 수를 측정하기 위해서 BHI 배지에 25ul씩 접종을 한 후 R studio로 만든 boxplot 이다. 도 2는 크로노박터의 희석 배수 별 콜로니의 수를 측정하기 위해서 BHI 배지에 25ul씩 접종을 한 후 python으로 만든 boxplot이다. 1회의 실험 진행시 시료 농도의 희석 배수 별 2~3개의 플레이트를 사용했고, 20회를 진행했다. 1:10-2 ~1:10-5는 세는게 의미가 없을 정도로 많은 양의 콜로니 수가 측정이 되었고, 10-6과 10-7은 어느정도의 오차가 존재하긴 하지만 카운팅이 가능한 수였고, 각각의 콜로니 수의 평균은 아래 표 1 및 2와 같다.
살모넬라 1:10-2 ~ 1:10-5 1:10-6 1:10-7
Colony count Saturation 205±(21) 22±(8)
크로노박터 1:10-2 ~ 1:10-5 1:10-6 1:10-7
Colony count Saturation 177±(15) 17±(3.2)
<시험예 2> qPCR과 dPCR로 보는 PMA 작동 여부(연속희석 데이터)
도 2a는 10-1 ~ 10-7까지 연속희석한 살모넬라 시료를 qPCR을 이용해서 얻은 Ct값을 그래프로 나타낸 그림이다. 범위가 0<R2<1 사이인 R2의 효율은 1에 가까울수록 효율이 높고 기울기 역시 프라이머 -3.8<기울기<-3.2 사이일수록 좋다고 일반적으로 이야기한다. A~D의 그래프를 보게 되면 R2의 값은 전부 0.98 이상인 것을 알 수 있고 기울기 역시 D를 제외하고는 사이에 존재하기 때문에 희석이나 프라이머의 효율성은 높다고 이야기를 할 수 있다. PMA를 추가하지 않은 A와 C는 희석이나 프라이머를 사용한 증폭이 잘 되었다고 할 수 있고, B의 경우 PMA를 추가했지만 A와 C를 비교했을 때 차이가 거의 없는 것으로 보아 PMA가 살아있는 살모넬라에는 영향을 주지 않았다고 이야기를 할 수 있다. 그러나 D의 경우 A~C의 그래프와 다르고 y의 값이 대부분 나타나지 않은 것으로 볼 때, PMA가 죽은 살모넬라의 DNA에 결합이 되어 증폭을 억제했다고 볼 수 있다.
도 2b는 연속희석한 살모넬라 시료를 dPCR을 이용해서 얻은 포어의 수를 나타낸 그림이다. threshold의 값을 4500으로 잡고, A~E까지의 포어의 수를 나타낸 결과다. 각 결과마다 10-1부터 10-4까지 희석을 진행했고, Negative control(NTC)는 D.W를 사용했다. A~C까지는 포어의 밀도나 수가 크게 차이가 나진 않지만, D의 경우 포어의 밀도와 수가 차이가 현저히 나는 것을 알 수 있다. 표 3은 A~D까지의 살모넬라의 포어 수를 나타낸 결과로 좀 더 명확하게 알 수 있다. A~C는 10-1가 상당히 많은 수가 나타났기 때문에 과포화 상태로 볼 수 있고, D는 눈에 띄게 감소된 것을 볼 수 있다. 도 2b와 표 3을 볼 때, PMA가 DNA에 부착되어 죽은 살모넬라의 증폭을 억제했다고 설명이 된다.
Dilute Copy number Dilute Copy number


A		 10-1 1*106

C		 10-1 1*106
10-2 7900 10-2 4430
10-3 1082 10-3 438
10-4 115 10-4 33.2


B		 10-1 1*106

D		 10-1 327
10-2 6270 10-2 32.5
10-3 585 10-3 3.3
10-4 52.8 10-4 0.5
<시험예 3> PMA 농도에 따른 데이터
PMA 농도에 따른 qPCR의 Ct값을 표 4로 나타냈다. 살모넬라의 생존 유무에 추가적으로 PMA의 농도 변화를 조건을 넣었다. 농도는 PMA의 최종 농도가 각자 10uM, 50uM, 100uM, 200uM일 때 Ct값의 변화를 보고 가장 이상적인 농도를 찾기 위한 실험이었다. Dead PMA의 Ct값을 제외한 다른 값들은 차이가 조금은 있을지언정 크게 달라지지는 않았다. 다만 Dead PMA의 경우 농도 별로 Ct값의 차이가 조금 있는 편인데 Live와 Dead의 Ct값에서 차이가 크게 존재하는 50uM과 100uM일 때 가장 두드러진다고 볼 수 있다.
Live Dead
Non PMA PMA Non PMA PMA
10 uM 17.79±(0.14) 18.36±(0.08) 18.89±(0.04) 28.12±(0.12)
50 uM 17.94±(0.002) 18.31±(0.09) 19.01±(0.03) 31.02±(0.06)
100 uM 18.26±(0.02) 17.99±(0.07) 18.89±(0.03) 29.87±(0.07)
200 uM 18.63±(0.07) 18.2±(0.12) 19.33±(0.1) 28.86±(0.04)
이러한 추세는 dPCR에서도 찾아볼 수 있다. 도 3은 살모넬라를 각각 10-3과 10-4로 희석해서 A와 B로 나타낸 그림이다. 표 5와 도 3에서 A는 B01은 Live-non PMA이고 D01 ~ B02는 각각 PMA의 농도가 10uM, 50uM, 100uM, 200uM이고, D02는 Dead-non PMA이고, F02 ~ D03은 각각 PMA 농도가 10uM, 50uM, 100uM, 200uM이다. A11은 시료가 아닌 D.W를 추가해 검사를 진행했다. 또한 표 5와 도 3에서 B는 F03은 Live-non PMA이고 H03 ~ F04는 각각 PMA의 농도가 10uM, 50uM, 100uM, 200uM이고, H04는 Dead-non PMA이고, B05 ~ G05은 각각 PMA 농도가 10uM, 50uM, 100uM, 200uM이다. A11은 시료가 아닌 D.W를 추가해 검사를 진행했다. 도 3과 비슷하게 Dead PMA일 때 포어의 수가 급격하게 감소한 것을 볼 수 있다. 또 PMA 농도가 50uM와 100uM일 때 Live와 Dead의 PMA 처리했을 때의 qPCR의 값과 dPCR의 포어의 수 비교가 가장 적절했다.
도 3 A) 도 3 B)
B01 5358 F03 442.5
D01 5365 H03 319
F01 5755 B04 545
H01 8155 D04 740
B02 2735 F04 0.9
D02 2535 H04 199.5
F02 106.5 B05 6
H02 109.5 D05 5.2
B03 158 F05 8
D03 14.5 G05 0.6
A11 0 A11 0
도 4와 표 6은 크로노박터의 PMA 농도 변화에 따른 dPCR 결과를 나타낸 그림이다. 희석 배수는 살모넬라와 동일하게 10-3, 10-4로 진행을 했으며, PMA 농도는 각각 0uM, 10uM, 100uM, 200uM로 진행을 했었다. 도 4-A와 표 6에서 B06은 Live-non PMA이고, C06, G06, A07은 각각 PMA의 농도가 10uM, 100uM, 200uM이었다. D07의 경우 Dead-non PMA이고, F07, B08, C08의 경우 각각 PMA의 농도가 10uM, 100uM, 200uM이었다. 도 4-B와 표 6에서 E08은 Live-non PMA이고, G08, C09, E09는 각 PMA의 농도가 10uM, 100uM, 200uM이었다. G09의 경우 Dead-non PMA이고, B10, F10, G10 경우 각각 PMA의 농도가 10uM, 100uM, 200uM이었다. B11의 경우 크로노박터 균이 아닌 D.W로 추가해 진행을 했었다. 살모넬라와 마찬가지로 PMA의 농도가 높아질수록 도 4-A보다 4-B에서의 포어 수가 적게 나타나는 것을 볼 수 있었다.
도 4 A) 도 4 B)
B06 7544 E08 584
C06 5816 G08 556
G06 6348 C09 608
A07 5056 E09 488
D07 796 G09 45.6
F07 290.8 B10 20.8
B07 2.68 F10 0.24
D07 0 G10 0
B11 0 B11 0
<시험예 4> Detergent 추가에 따른 데이터
앞서 소개했던 대로 PMA는 죽은 세포의 DNA에 공유 결합하여 증폭을 억제하고, 살아있는 세포만 증폭시킬 수 있는 시약이라고 할 수 있다. 그러나 박테리아는 세포벽이 존재해도 세포가 죽어있는 상태인 viable but non culture(vbnc) 세포는 PMA가 세포벽에 막혀 DNA와 결합을 하지 못하게 되어 증폭이 되기 때문에 qPCR과 dPCR에서 카운팅이 되어 실질적으로 CFU와 차이가 존재할 수도 있다. 이런 상황을 줄이기 위해서 사용한 시약은 계면활성제의 종류 중 하나인 트라이톤 X-100을 사용했다. 실험 조건은 PMA 농도 100uM, 트라이톤 X-100의 최종 농도 조건 0% ~ 1% 4개, 그 외의 실험 조건은 이전의 실험과 동일하다.
표 7은 살모넬라를 시료로 사용하였고, qPCR에서는 조건별로 농도의 차이가 일부 존재하기는 하나 Dead PMA의 경우 다른 조건들의 Ct값보다 훨씬 높은 경향을 알 수 있다. 특히 1%일 때 다른 조건들보다 더 높은 것을 알 수 있는데, Dead의 경우 이미 IPA로 사멸 처리를 진행했다는 것을 생각해보면 추가적으로 vbnc를 제거를 했다고 추측된다.
Live Dead
Non PMA PMA Non PMA PMA
Non Triton X-100 16.38±(0.38) 15.98±(0.24) 20.4±(0.52) 31.28±(0.46)
Triton X-100 0.25% 18.59±(0.49) 20.07±(0.13) 18.16±(0.48) 30.53±(0.4)
Triton X-100 0.5% 18.15±(0.26) 19.41±(0.11) 18.21±(0.26) 32.17±(0.68)
Triton X-100 1% 19.13±(0.2) 19.8±(0.17) 18.99±(0.28) 37.38±(0.3)
다만, dPCR의 경우 도 5와 표 8, 도 6과 표 9를 보면 계면활성제의 조건별로 포어의 수 차이가 존재하고, 예상보다 특히 qPCR에서 도드라지게 나타난 Dead PMA의 포어 수가 dPCR에서는 차이가 크지 않았다.
Detergent conc.: NTC
Live Dead
NTC
Non-PMA PMA Non-PMA PMA
A10 B10 C10 D10 A06
431.5 660 382.4 0.3 0
Detergent conc.: 0.1%
Live Dead
NTC
Non-PMA PMA Non-PMA PMA
E10 F10 G10 H10 A06
545 188 401 0.3 0
Detergent conc.: 0.25%
Live Dead
NTC
Non-PMA PMA Non-PMA PMA
A11 B11 C11 D11 A06
1800 382.5 610 0 0
Detergent conc.: 0.5%
Live Dead
NTC
Non-PMA PMA Non-PMA PMA
E11 F11 G11 H11 A06
1625 905 423 0 0
Detergent conc.: 0.75%
Live Dead
NTC
Non-PMA PMA Non-PMA PMA
A12 B12 C12 D12 A06
640 660 406 0 0
Detergent conc.: 1%
Live Dead
NTC
Non-PMA PMA Non-PMA PMA
E12 F12 G12 H12 A06
710 645 366.5 0.35 0
Detergent conc.: NTC
Live Dead
NTC
Non-PMA PMA Non-PMA PMA
C06 B07 F07 H07 B06
379.2 268 222.8 51.2 1.24
Detergent conc.: 0.1%
Live Dead
NTC
Non-PMA PMA Non-PMA PMA
B08 D08 E08 G08 B06
460 379.6 348.4 110 1.24
Detergent conc.: 0.25%
Live Dead
NTC
Non-PMA PMA Non-PMA PMA
B09 C09 F09 G09 B06
748 584 296.8 117.2 1.24
Detergent conc.: 0.5%
Live Dead
NTC
Non-PMA PMA Non-PMA PMA
A10 B10 F10 H10 B06
472 476 375.2 134.4 1.24
Detergent conc.: 0.75%
Live Dead
NTC
Non-PMA PMA Non-PMA PMA
B11 C11 E11 G11 B06
464 456 300.4 104.8 1.24
Detergent conc.: 1%
Live Dead
NTC
Non-PMA PMA Non-PMA PMA
A12 C12 E12 H12 B06
464 348 367.2 102.8 1.24
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (12)

1) 미생물이 포함된 분리된 시료를 준비하는 단계;
2) 상기 시료에 프로피디움 모노아자이드(propidium monoazide)를 처리하는 단계;
3) 상기 시료에서 DNA를 추출하는 단계; 및
4) 상기 DNA를 주형으로 하고, 미생물 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 디지털 중합효소 연쇄반응(digital polymerase chain reaction)을 수행하는 단계;를 포함하는 살아있는 미생물 검출 방법
제1항에 있어서, 상기 2) 단계에 계면활성제를 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 살아있는 미생물 검출 방법
제2항에 있어서, 상기 계면활성제는 트라이톤 엑스-100 (Triton X-100)인 것을 특징으로 하는 살아있는 미생물 검출 방법
제1항에 있어서, 상기 프라이머 및 프로브는 서열번호 1 및 서열번호 2인 프라이머 및 서열번호 3인 프로브; 또는 서열번호 4 및 서열번호 5인 프라이머 및 서열번호 6인 프로브인 것을 특징으로 하는 살아있는 미생물 검출 방법
제1항에 있어서, 상기 미생물은 살모넬라균 또는 크로노박터균인 것을 특징으로 하는 살아있는 미생물 검출 방법
a) 프로피디움 모노아자이드(propidium monoazide); 및
b) 디지털 중합효소 연쇄반응(digital polymerase chain reaction)을 위한 미생물 특이적인 프라이머 및 프로브를 포함하는 살아있는 미생물 검출용 조성물
제6항에 있어서, 트라이톤 엑스-100 (Triton X-100)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 살아있는 미생물 검출용 조성물
제6항에 있어서, 상기 미생물은 살모넬라균 또는 크로노박터균인 것을 특징으로 하는 살아있는 미생물 검출용 조성물
1) 미생물이 포함된 분리된 시료를 준비하는 단계;
2) 상기 시료에 프로피디움 모노아자이드(propidium monoazide)를 처리하는 단계;
3) 상기 시료에서 DNA를 추출하는 단계;
4) 상기 DNA를 주형으로 하고, 미생물 특이적인 프라이머 및 프로브를 사용하여 디지털 중합효소 연쇄반응(digital polymerase chain reaction)을 수행하는 단계; 및
5) 살아있는 미생물이 검출되면 양성인 것으로 판정하는 단계;를 포함하는 미생물에 의해 유발되는 식중독 진단정보 제공방법
제9항에 있어서, 상기 2) 단계에 트라이톤 엑스-100 (Triton X-100)을 처리하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 살아있는 미생물 검출 방법
a) 프로피디움 모노아자이드(propidium monoazide); 및
b) 디지털 중합효소 연쇄반응(digital polymerase chain reaction)을 위한 미생물 특이적인 프라이머 및 프로브를 포함하는 미생물에 의해 유발되는 식중독 진단용 조성물
제11항에 있어서, 트라이톤 엑스-100 (Triton X-100)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 미생물에 의해 유발되는 식중독 진단용 조성물
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030077790A (ko) * 2002-03-27 2003-10-04 주식회사 코젠바이오텍 병원성 미생물의 유전자 증폭용 프라이머, 이를 이용한병원성 미생물의 검출방법, 및 검출키트
KR20060095175A (ko) * 2005-02-28 2006-08-31 삼성에버랜드 주식회사 식중독 검출용 프라이머 및 이를 이용한 세균성 식중독 검출방법
KR20150077658A (ko) * 2013-12-30 2015-07-08 주식회사 아워홈 미생물의 신속한 검출 방법
KR20170003403A (ko) * 2015-06-30 2017-01-09 (주)비엠에스 디지털 pcr을 이용한 식중독균의 검출 방법

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2017261820B2 (en) 2016-05-13 2021-02-18 Ferring Microbiome Inc. Analytical method for quanitification of viable bacteria contained in microbiota restoration therapy (MRT) compositions

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20030077790A (ko) * 2002-03-27 2003-10-04 주식회사 코젠바이오텍 병원성 미생물의 유전자 증폭용 프라이머, 이를 이용한병원성 미생물의 검출방법, 및 검출키트
KR20060095175A (ko) * 2005-02-28 2006-08-31 삼성에버랜드 주식회사 식중독 검출용 프라이머 및 이를 이용한 세균성 식중독 검출방법
KR20150077658A (ko) * 2013-12-30 2015-07-08 주식회사 아워홈 미생물의 신속한 검출 방법
KR20170003403A (ko) * 2015-06-30 2017-01-09 (주)비엠에스 디지털 pcr을 이용한 식중독균의 검출 방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRAGA L.M.P.S., SAAD B.A.A., DE OLIVEIRA C.T.F., VOLPE-CHAVES C.E., LACERDA M.L.G.G., FORSYTHE S.J., VENTURINI J., DE OLIVEIRA S.M: "Case report of Curtobacterium isolated from a catheter tip sample misidentified as Cronobacter", LETTERS IN APPLIED MICROBIOLOGY, OXFORD, UK : BLACKWELL PUBLISHING LTD, OXFORD, UK, vol. 75, no. 2, 1 August 2022 (2022-08-01), Oxford, UK, pages 396 - 400, XP093383537, ISSN: 0266-8254, DOI: 10.1111/lam.13741 *

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