WO2025254035A1 - 複数種類の標的分子を検出する方法 - Google Patents

複数種類の標的分子を検出する方法

Info

Publication number
WO2025254035A1
WO2025254035A1 PCT/JP2025/019685 JP2025019685W WO2025254035A1 WO 2025254035 A1 WO2025254035 A1 WO 2025254035A1 JP 2025019685 W JP2025019685 W JP 2025019685W WO 2025254035 A1 WO2025254035 A1 WO 2025254035A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
target molecule
target molecules
capture carrier
target
molecule capture
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2025/019685
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
匠 平瀬
洋一 牧野
祐二 久保
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toppan Holdings Inc
Original Assignee
Toppan Holdings Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toppan Holdings Inc filed Critical Toppan Holdings Inc
Publication of WO2025254035A1 publication Critical patent/WO2025254035A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting multiple types of target molecules.
  • Quantitative detection of target molecules in biological samples is being used to detect disease early and predict the effectiveness of medication.
  • protein quantification has been carried out using enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs), and nucleic acids have been quantified using methods such as real-time PCR.
  • ELISAs enzyme-linked immunosorbent assays
  • nucleic acids have been quantified using methods such as real-time PCR.
  • the sample solution is divided into an extremely large number of micro-solutions.
  • the signal from each micro-solution is then binarized, and the number of target molecules is measured by determining only whether or not the target molecule is present.
  • Digital measurement can significantly improve detection sensitivity and quantitativeness compared to conventional methods such as ELISA and real-time PCR.
  • Patent Document 3 discloses a microarray-shaped reaction vessel formed so that each well has a volume of 6 nl (nanoliters).
  • Patent Document 1 also discloses a method for introducing a sample into each well of a microarray having multiple wells, each 3 ⁇ m deep and 5 ⁇ m in diameter, formed in a flow channel. The sample is then introduced into each well by flowing the sample through the flow channel and then pushing out excess reagent in the flow channel with oil.
  • Patent Document 4 describes a method for measuring protein and gene expression in cells using a barcode sequence nucleic acid-modified antibody and target gene-binding barcode particles.
  • Patent Document 5 describes a method for detecting surface target molecules present on the surface of a structure and internal target molecules present inside the structure.
  • Patent No. 6183471 Special Publication No. 2014-503831 International Publication No. 2013-151135 Patent No. 7091348 International Publication No. 2020-235607
  • the separation conditions may differ, making it difficult to extract or separate them simultaneously.
  • conditions for extracting nucleic acids may cause proteins to denature and be lost.
  • different measurement methods and devices are required for each type of target molecule, making it difficult to measure multiple types of target molecules simultaneously.
  • the present invention aims to provide technology for detecting multiple types of target molecules on the same device.
  • a method for detecting multiple types of target molecules in a sample on the same well array comprising: (a) a step of binding the multiple types of target molecules to target molecule capture carriers and separating the target molecule capture carriers to which the target molecules are bound from the sample; (b) a step of suspending the separated target molecule capture carriers in a reaction solution and introducing the suspended target molecule capture carriers into wells of the well array; (c) a step of sealing the wells with a sealing solution; (d) a step of pretreating the multiple types of target molecules in the wells; and (e) a step of detecting each of the multiple types of target molecules in the wells by Invasive Cleavage Assay (ICA), wherein the multiple types of target molecules include at least nucleic acids, the pretreatment includes dissociating the nucleic acids from the target molecule capture carriers or transcribing the nucleic acids into complementary strands, and the reaction solution is for carrying out the pretreatment and the ICA without
  • ICA Invasive Cleavage Assay
  • [2] The method according to [1], wherein the target molecule capture carrier is a magnetic particle, and the separation is performed by magnetism.
  • the target molecule capture carrier comprises solid-phase reversible immobilization (SPRI) particles.
  • SPRI solid-phase reversible immobilization
  • [4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the volume of the well is 10 fL to 100 pL.
  • [5] The method according to any one of [1] to [4], wherein the reaction solution contains 5 to 25 mM magnesium ions.
  • [6] The method according to any one of claims [1] to [5], wherein the reaction solution contains 0.01 to 0.05 mM ethylenediaminetetraacetic acid.
  • a method for detecting multiple types of target molecules in a sample on the same well array comprising: a step (a) of binding the multiple types of target molecules to a target molecule capture carrier and separating the target molecule capture carrier bound to the target molecules from the sample; a step (b) of suspending the separated target molecule capture carrier in a reaction solution and introducing the resulting suspension into wells of the well array; a step (c) of sealing the wells with a sealing liquid; a step (d) of pretreating the multiple types of target molecules in the wells; and a step (e) of invasively cleaving the multiple types of target molecules in the wells.
  • step (e) detecting each of the target molecules by Indirect Cadence Assay (ICA), wherein the multiple types of target molecules include at least nucleic acids, the pretreatment includes dissociating the nucleic acids from the target molecule capture carrier or transcribing the nucleic acids into complementary strands, the reaction solution contains 5 to 25 mM magnesium ions, 0.01 to 0.05 mM ethylenediaminetetraacetic acid, and 10 to 50 mM trishydroxymethylaminomethane, the pH of the reaction solution at 25°C is 7.5 to 8.5, and the target molecules are HER2 protein and ErbB2 gene.
  • ICA Indirect Cadence Assay
  • the present invention provides technology that allows multiple types of target molecules to be detected on the same device.
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device.
  • FIG. 2 is a schematic cross-sectional view illustrating a method for detecting a target molecule.
  • FIG. 3 is a schematic cross-sectional view illustrating a method for detecting a target molecule.
  • FIG. 4 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device.
  • FIG. 5 is a schematic cross-sectional view illustrating a method for detecting a target molecule.
  • FIG. 6 is a schematic cross-sectional view illustrating a method for detecting a target molecule.
  • Figure 7 is a schematic diagram illustrating an example of Invasive Cleavage Assay (ICA).
  • FIG. 8 is an image showing the results of Experimental Example 1.
  • ICA Invasive Cleavage Assay
  • a numerical range expressed as, for example, "1 to 2" means a numerical range that includes the numbers 1 and 2 before and after ⁇ as the lower and upper limits.
  • the present invention provides a method for detecting multiple types of target molecules in a sample on the same well array, comprising the steps of: (a) binding the multiple types of target molecules to a target molecule capture carrier and separating the target molecule-bound target molecule capture carrier from the sample; (b) suspending the separated target molecule capture carrier in a reaction solution and introducing it into a well of the well array; (c) sealing the well with a sealing solution; (d) pretreating the multiple types of target molecules in the well; and (e) detecting each of the multiple types of target molecules in the well by Invasive Cleavage Assay (ICA), wherein the multiple types of target molecules include at least nucleic acids, the pretreatment includes dissociating the nucleic acid from the target molecule capture carrier or transcribing the nucleic acid into a complementary strand, and the reaction solution is for carrying out the pretreatment and the ICA without mutually inhibiting each other.
  • ICA Invasive Cleavage Assay
  • the sample is not particularly limited as long as it contains multiple types of target molecules, and examples include serum, urine, exosomes, cells, tissue, and whole blood.
  • the sample may be, for example, cells themselves, a cell lysate, or a cell population containing multiple cells.
  • Target molecules include proteins, nucleic acids, and metabolites.
  • Nucleic acids include DNA and RNA.
  • Multiple types of target molecules means, for example, that the target molecules are a combination of multiple types, such as a combination of protein and DNA, a combination of protein and RNA, a combination of protein, DNA, and RNA, a combination of DNA and RNA, a combination of multiple types of DNA with different sequences, a combination of multiple types of RNA with different sequences, a combination of one or multiple types of DNA and one or multiple types of RNA, or a combination of multiple types of proteins.
  • Multiple types of DNA may be, for example, multiple types of DNA with different sequences.
  • multiple types of RNA may be, for example, multiple types of RNA with different sequences.
  • Multiple types of target molecules include at least nucleic acids.
  • step (a) multiple types of target molecules in the sample are bound to a target molecule capture carrier, and the target molecule capture carrier to which the target molecules are bound is separated from the sample.
  • the sample is a structure such as an exosome or cell, it is preferable to disrupt the structure in advance to expose the target molecules contained within the structure.
  • the target molecule capture carrier may include an antibody-modified carrier against the protein and a nucleic acid-binding carrier that binds to the nucleic acid.
  • the nucleic acid modified onto the target molecule capture carrier has a sequence complementary to the target nucleic acid.
  • the multiple types of target molecules are separated by binding to multiple types of target molecule capture carriers, respectively.
  • the target molecule capture carrier may include a first target molecule capture carrier that binds to the first target molecule, and a second target molecule capture carrier that binds to the second target molecule.
  • the nucleic acid modified onto the target molecule capture carrier may have a sequence corresponding to the Poly A sequence.
  • one type of target molecule capture carrier may be modified with an antibody against a protein and a probe against a nucleic acid, and one target molecule capture carrier may capture and separate proteins and nucleic acids in a sample.
  • the number of proteins and/or nucleic acids is not limited to one type.
  • one type of target molecule capture carrier may be modified with an antibody against one or more types of proteins and/or a probe against one or more types of nucleic acids, and one target molecule capture carrier may capture and separate one or more types of proteins and/or one or more types of nucleic acids in a sample.
  • one type of target molecule capture carrier may be modified with an antibody against exosomes, an antibody against proteins, and a probe against nucleic acids, and in step (a), the target molecule capture carrier may first capture and recover exosomes from the sample, and then a separation and extraction operation may be performed to extract the proteins and nucleic acids in the exosomes, and the extracted proteins and nucleic acids may be captured and separated by the target molecule capture carrier.
  • the target molecules include first to third target molecules
  • the target molecule capture carrier may be modified with first to third probes corresponding to the first to third target molecules, respectively.
  • the target molecule capture carrier is preferably a magnetic particle, and separation is preferably performed magnetically. This allows multiple types of target molecules to be separated simultaneously using the same method.
  • the nucleic acid-binding carrier may be a solid-phase reversible immobilization (SPRI) particle.
  • SPRI particles have a core covered with a thin film of magnetic iron, allowing for easy recovery using magnetism. The surface of the magnetic particles is coated with carboxyl groups, allowing them to bind to DNA/RNA in the presence of salt.
  • the target molecule capture carrier may be, for example, the Invitrogen TM Dynabeads TM series.
  • the Invitrogen TM Dynabeads TM series are beads with a uniform particle size, which have a core of a high molecular weight polymer in which magnetizable substances ( ⁇ Fe 2 O 3 and Fe 3 O 4 ) are uniformly distributed, and which are covered with a hydrophilic polymer, and the probe to be modified can be changed depending on the application.
  • the target molecule capture carrier has at least one of the following groups on the particle surface to modify antibodies or nucleic acids: carboxyl groups, amino groups, epoxy groups, and tosyl groups.
  • the surface of the target molecule capture carrier may be either a hydrophilic surface or a hydrophobic surface.
  • step (b) the separated target molecule capture carrier is suspended in a reaction solution and introduced into the wells of the well array.
  • the reaction solution used here is capable of carrying out the pretreatment described below, as well as for carrying out Invasive Cleavage Assay (ICA). If the target molecule contains a protein, the reaction solution must also not inhibit the detection of the protein by ICA. In other words, the reaction solution is adjusted so that neither the pretreatment nor the ICA is inhibited.
  • ICA Invasive Cleavage Assay
  • nucleic acid-label the protein captured on the target molecule capture carrier it is preferable to nucleic acid-label the protein captured on the target molecule capture carrier prior to step (b).
  • Nucleic acid labeling makes it possible to detect the protein by ICA.
  • Nucleic acid labeling can be performed, for example, by binding an antibody against the target molecule, the protein, which has been labeled with nucleic acid, to the protein captured on the target molecule capture carrier.
  • step (c) the wells are sealed with a sealing liquid.
  • each well in the well array becomes an independent reaction space.
  • step (d) the multiple types of target molecules in the wells are pretreated.
  • Pretreatment can be carried out by incubating the target molecule capture carrier in the above-mentioned reaction solution.
  • Pretreatment may also involve dissociating the captured nucleic acid from the target molecule capture carrier. Dissociating the nucleic acid from the target molecule capture carrier makes detection easier.
  • the pretreatment may involve transcribing the captured nucleic acid into a complementary strand.
  • the nucleic acid captured on the target molecule capture carrier may be RNA
  • the pretreatment may involve reverse transcribing the captured RNA into cDNA using a reverse transcriptase. Reverse transcribing RNA into cDNA facilitates detection.
  • the reaction solution contains a reverse transcriptase and nucleoside triphosphates (NTPs).
  • NTPs nucleoside triphosphates
  • the reaction solution may further contain a primer for reverse transcription.
  • step (e) the multiple types of target molecules in the wells are each detected by Invasive Cleavage Assay (ICA).
  • ICA Invasive Cleavage Assay
  • ICA can be detected in multiple colors, with each target molecule being detected as a fluorescent signal of a different wavelength.
  • the above method allows for simultaneous separation of multiple types of target molecules that require different separation conditions and are difficult to extract or separate simultaneously, and also makes it possible to simultaneously measure multiple types of target molecules that previously required different measurement methods and devices.
  • FIG. 1 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device in which the method of this embodiment can be suitably implemented.
  • the fluidic device 200 includes a substrate 210 and a lid member 220 arranged opposite the substrate 210.
  • the lid member 220 has a convex portion 221, the tip of which contacts the substrate 210.
  • a well array 240 is integrally molded with the substrate 210 on one side of the substrate 210 and faces the lid member 220.
  • the well array 240 has a plurality of wells 241.
  • the lid member 220 may be welded or glued to the substrate 210.
  • the wells 241 are open on the surface of the substrate 210. There are no particular limitations on the shape, dimensions, or arrangement of the wells 241, but it is preferable that the wells 241 be microwells with small volumes. For example, the volume of one well 241 may be approximately 10 fL to 100 pL. In the fluidic device 200, multiple wells 241 of the same shape and size form the well array 240. "Same shape and size" means that the wells have the same shape and capacity to the extent required for digital measurement, and variations within the range of manufacturing error are acceptable.
  • the diameter of the wells 241 may be, for example, approximately 1 to 10 ⁇ m, and the depth of the wells 241 may be, for example, approximately 1 to 10 ⁇ m.
  • the arrangement of the wells 241 is not particularly limited; for example, they may be arranged in a triangular lattice pattern, a square lattice pattern, or they may be arranged randomly.
  • the presence of the convex portion 221 forms a space between the well array 240 and the lid member 220.
  • This space constitutes the flow path 230.
  • the flow path 230 functions as a path for transporting liquids such as a reaction liquid in which target molecule capture carriers are suspended, and a sealing liquid, which will be described later.
  • the shape, structure, capacity, etc. of the flow path 230 are not particularly limited, but the height of the flow path 230 (the distance between the surface of the substrate 210 and the surface of the lid member 220 facing the substrate 210) may be, for example, 500 ⁇ m or less, or 300 ⁇ m or less, or 200 ⁇ m or less, or 100 ⁇ m or less.
  • the convex portion 221 may be molded integrally with the lid member 220.
  • the lid member 220 can be formed into a plate shape having the convex portion 221, for example, by molding a thermoplastic resin fluid using a molding die.
  • the lid member 220 may also be formed with an inlet port 222 and an outlet port 223 for the reagent.
  • the lid member 220 has a protrusion 221
  • the lid member 220 and the substrate 210 are stacked so that the protrusion 221 contacts the surface of the substrate 210 where the well 241 opens.
  • the space between the lid member 220 and the substrate 210 becomes the flow path 230.
  • the lid member 220 and the substrate 210 may be welded together by laser welding or the like.
  • FIG. 4 is a schematic cross-sectional view showing an example of a fluidic device.
  • the fluidic device 500 comprises a substrate 210 and a wall member 510.
  • the well array 240 is integrally formed with the substrate 210 on one side of the substrate 210.
  • the well array 240 has a plurality of wells 241.
  • the fluidic device 500 differs mainly from the fluidic device 200 described above in that it does not have a lid member 220.
  • the lid member 220 and the protrusion 221 are molded as a single unit.
  • the lid member 220 and the protrusion 221 may also be molded as separate bodies.
  • the well array 240 is integrally molded with the substrate 210 on one side of the substrate 210.
  • the well array does not have to be integrally molded with the substrate 210.
  • the well array 240 molded separately from the fluidic device may be placed on the substrate 210 of the fluidic device.
  • a resin layer may be laminated on the surface of the substrate 210, and the well array may be formed in the resin layer by etching or the like.
  • the substrate 210 is formed, for example, using a resin.
  • a resin there are no particular restrictions on the type of resin, but it is preferable that the resin be resistant to reagents and sealing liquids. Furthermore, if the signal to be detected is fluorescence, it is preferable that the resin have little autofluorescence. Examples include, but are not limited to, cycloolefin polymers, cycloolefin copolymers, silicone, polypropylene, polycarbonate, polystyrene, polyethylene, polyvinyl acetate, fluororesins, and amorphous fluororesins.
  • a plurality of wells 241 may be formed on one surface of the substrate 210 in the thickness direction.
  • Methods for forming wells using resin include injection molding, thermal imprinting, and optical imprinting.
  • a fluororesin may be layered on the substrate 210 and then processed by etching or the like to form a well array.
  • CYTOP registered trademark
  • Asahi Glass or the like can be used as the fluororesin.
  • the material of the lid member 220 is preferably a resin with low autofluorescence, and may be, for example, a thermoplastic resin such as a cycloolefin polymer or a cycloolefin copolymer.
  • the lid member 220 may be made of a material that does not transmit light of wavelengths close to the wavelength detected during fluorescent observation of the signal, or may be made of a material that does not transmit light at all.
  • the lid member 220 may be made of a thermoplastic resin to which carbon, metal particles, etc. have been added.
  • reaction liquid L210 in which a target molecule capture carrier is suspended, is introduced from the inlet port 222 of the fluidic device 200 and sent to the flow path 230.
  • the reaction liquid L210 is capable of carrying out the pretreatment described above and is also used to perform ICA. Furthermore, if the target molecule contains a protein, the reaction liquid L210 must also not inhibit the detection of the protein by ICA.
  • the reaction solution L210 sent to the flow channel 230 comes into contact with the well array 240.
  • the reaction solution L210 is then contained inside the wells 241.
  • the target molecules and reaction solution are introduced into the wells 241.
  • target molecules introduced into one well 241 there is no particular limit to the number of target molecules introduced into one well 241, but preferably one or less target molecules are introduced into one well 241, i.e., 0 or 1 target molecule. This allows target molecules to be detected one at a time, making digital measurement possible. Furthermore, it is not necessary to introduce target molecules into all wells of the well array.
  • one or less target molecule capture carriers may be introduced into one well 241.
  • multiple types of target molecules are captured on one target molecule capture carrier, multiple types of target molecules may be contained in one well 241.
  • ICA may be detected in multiple colors, and each target molecule may be detected as a fluorescent signal of a different wavelength.
  • sealing solution L220 is sent from the inlet port 222 of the lid member 220 to the flow path 230 between the substrate 210 and the lid member 220.
  • the sealing solution L220 sent to the flow path 230 comes into contact with the well array 240.
  • the sealing solution L220 then washes away and replaces the reagent solution L210 sent to the flow path 230 that is not contained in the wells 241.
  • the sealing solution L220 individually seals each of the multiple wells 241 containing the reaction solution L210 containing the target substance, and the wells 241 become independent reaction spaces (also referred to as microcompartments 242).
  • the flow path 230 is filled with sealing solution L220, excess sealing solution L220 is discharged from the discharge port 223.
  • Figure 3 shows the state in which all of the wells 241 in the well array 240 have been sealed with sealing liquid L220, forming sealed wells (i.e., microcompartments) 242.
  • the sealing liquid is a liquid that can individually seal the liquids introduced into multiple wells 241 to prevent them from mixing with each other, forming droplets (also called microdroplets). It is preferably an oily solution, and more preferably an oil.
  • oils that can be used include fluorine-based oils, silicone-based oils, hydrocarbon-based oils, and mixtures of these. More specifically, products such as Sigma's "FC-40” product and Shin-Etsu Chemical's "KF-96” product can be used.
  • FC-40 (CAS number: 86508-42-1) is a fluorinated aliphatic compound with a specific gravity of 1.85 g/mL at 25°C.
  • FIG. 7 is a schematic diagram illustrating an example of ICA.
  • ICA detects double-stranded nucleic acid 150 formed by hybridization of at least a portion of a first single-stranded nucleic acid fragment 141 and at least a portion of a second single-stranded nucleic acid fragment 171.
  • an allele probe (also called a flap probe) is hybridized to the first single-stranded nucleic acid fragment 141 or the second single-stranded nucleic acid fragment 171.
  • An allele probe is a single-stranded nucleic acid fragment that hybridizes to the DNA to be detected to form a flap site.
  • the allele probe 810 hybridizes to the second single-stranded nucleic acid fragment 171. As a result, a first flap site 811 is formed.
  • a flap endonuclease is an endonuclease that recognizes a specific DNA higher-order structure (also known as a flap structure) rather than a DNA sequence, and has the activity of cleaving the flap strand.
  • nucleic acid fragment 811 hybridizes to a fluorescent substrate (nucleic acid fragment 820, also known as a FRET cassette) to form a second flap site 821.
  • a fluorescent substrate also known as a FRET cassette
  • fluorescent substance F is bound to the 5' end of nucleic acid fragment 820, and quencher Q is bound a few bases 3' from the 5' end of nucleic acid fragment 820.
  • second flap site 821 is cleaved and nucleic acid fragment 821 is generated.
  • fluorescent substance F separates from quencher Q and generates a fluorescent signal. By detecting this fluorescent signal, the formation of double-stranded nucleic acid 150 can be detected.
  • the reaction liquid L210 can be any liquid commonly used in biochemical analyses performed using fluidic devices, and is preferably an aqueous solution. Furthermore, the reaction liquid L210 may contain a surfactant or the like to make it easier to seal the liquid within the well.
  • ICA ICA is used to detect the formation of double-stranded nucleic acid 150
  • an isothermal enzymatic reaction causes fluorescent substance F to be liberated from quencher Q, emitting a predetermined fluorescent signal in response to excitation light.
  • a known appropriate method can be selected depending on the type of signal to be detected. For example, when observing a fluorescent signal, excitation light corresponding to the fluorescent substance is irradiated onto well 242, and the fluorescence emitted by the fluorescent substance is observed. For example, as shown in Figure 3, a predetermined reaction is carried out within sealed well 242, and the generated signal is observed.
  • well 242R is a well in which a signal was detected
  • well 242 is a well in which no signal was detected.
  • a reaction solution L210 is introduced into the fluidic device 500.
  • the reaction solution L210 is capable of carrying out the pretreatment described above and is also used to perform ICA.
  • the reaction solution L210 must also not inhibit the detection of the protein by ICA.
  • the concentration of the target molecule in the reaction solution L210 may be adjusted to a concentration such that one or less target molecule molecules are introduced into each well 241.
  • the concentration of the target molecule capture carrier in the reaction solution L210 may be adjusted to a concentration such that one or less target molecule capture carriers are introduced into each well 241.
  • sealing liquid L220 is introduced into the fluidic device 500.
  • the specific gravity of the sealing liquid L220 is greater than that of the mixed liquid L210. Therefore, the sealing liquid L220 sinks below the mixed liquid L210 that is not contained in a well 241, and comes into contact with the well array 240.
  • the sealing liquid L220 then individually seals each of the multiple wells 241 that contain the reaction liquid L210 containing the target molecules, forming independent reaction spaces (i.e., microcompartments 242).
  • well 242R is a well in which a signal was detected
  • well 242 is a well in which no signal was detected.
  • the reaction solution must be capable of undergoing the above-mentioned pretreatment, be capable of performing ICA, and, if the target molecule contains a protein, not inhibit detection of the protein by ICA.
  • the inventors found that the above condition is met when the magnesium ion concentration in the reaction solution is 5 to 25 mM, i.e., when the magnesium ion concentration relative to the total volume of the reaction solution is 5 to 25 mM.
  • the inventors also found that the above condition is met when the ethylenediaminetetraacetic acid concentration in the reaction solution is 0.01 to 0.05 mM, i.e., when the ethylenediaminetetraacetic acid concentration relative to the total volume of the reaction solution is 0.01 to 0.05 mM.
  • the inventors also found that the above condition is met when the trishydroxymethylaminomethane concentration in the reaction solution is 10 to 50 mM, i.e., when the trishydroxymethylaminomethane concentration relative to the total volume of the reaction solution is 10 to 50 mM.
  • the inventors also found that the above condition is met when the pH of the reaction solution at 25°C is 7.5 to 8.5.
  • the reaction solution further contains an allele probe, ICA oligo, a FRET cassette, and a flap endonuclease for performing ICA. Furthermore, if the nucleic acid captured by the target molecule capture carrier is RNA and the RNA is reverse transcribed into cDNA in the pretreatment, the reaction solution further contains a reverse transcriptase and nucleoside triphosphates (NTPs). The reaction solution may further contain a primer for reverse transcription.
  • ICA oligos are single-stranded nucleic acid fragments that hybridize to target molecules, such as proteins or nucleic acids. ICA oligos may hybridize directly to target molecules, such as nucleic acids. Alternatively, ICA oligos may hybridize to nucleic acids modified with antibodies against target molecules, such as proteins.
  • the allele probe, FRET cassette, and flap endonuclease are the same as those described above.
  • exosomes are used as the sample, and proteins and RNA are detected as target molecules.
  • the target molecule capture carrier used here has antibodies against exosomes, antibodies against proteins, and RNA-capturing nucleic acids modified on the surface of magnetic particles.
  • step (a) first, a sample of a structure such as cells, tissue, or whole blood is disrupted to expose the exosomes contained in the structure. Next, the exosomes are captured using a target molecule capture carrier, and the target molecule capture carrier with the captured exosomes is recovered by magnetic separation.
  • a sample of a structure such as cells, tissue, or whole blood is disrupted to expose the exosomes contained in the structure.
  • the exosomes are captured using a target molecule capture carrier, and the target molecule capture carrier with the captured exosomes is recovered by magnetic separation.
  • the target molecules, proteins and RNA are extracted from the captured exosomes using an extraction liquid such as a solution containing a surfactant.
  • the proteins and RNA are then captured using a target molecule capture carrier, and the target molecule capture carrier with the captured proteins and RNA is recovered using magnetic separation.
  • a sandwich reaction is carried out using an antibody against the protein that has been labeled with nucleic acid.
  • the target molecule capture carriers are then recovered after the sandwich reaction by magnetic separation.
  • step (b) the recovered target molecule capture carrier, the protein detection ICA reaction solution, the RNA detection ICA reaction solution, and a reaction solution containing reverse transcriptase and nucleoside triphosphates (NTPs) are mixed and introduced into the wells of the well array.
  • NTPs nucleoside triphosphates
  • step (c) the wells are sealed with a sealing liquid.
  • each well in the well array becomes an independent reaction space.
  • step (d) the target molecule, RNA, is reverse transcribed into cDNA using reverse transcriptase.
  • step (e) protein and RNA in the wells are each detected by an ICA reaction. More specifically, protein is detected by detecting nucleic acid labeled to protein by a sandwich reaction using an ICA reaction. RNA is detected by detecting cDNA generated by reverse transcription using an ICA reaction. In this case, the fluorescent signal detected by the ICA reaction for cDNA and the fluorescent signal detected by the ICA reaction for nucleic acid labeled to protein each have different wavelengths. This allows protein and RNA to be detected simultaneously.
  • the above method makes it possible to simultaneously separate protein and RNA, which require different separation conditions and are difficult to extract or separate simultaneously.
  • the target molecule capture carriers used here are SPRI particles as nucleic acid-binding carriers, and magnetic particles with antibodies against proteins modified on their surfaces as protein capture carriers.
  • step (a) first, a sample of a structure such as cells, tissue, or whole blood is disrupted to expose the exosomes contained in the structure.
  • the exosomes are captured using a target molecule capture carrier, and the target molecule capture carrier with the captured exosomes is recovered by magnetic separation.
  • Exosome capture may be performed using a protein capture carrier that has been modified with an antibody for capturing exosomes. Alternatively, a separate capture carrier may be used to capture exosomes.
  • the target molecules, protein and RNA are extracted from the captured exosomes using an extraction liquid such as a solution containing a surfactant. Protein and RNA are then captured using a protein capture carrier and SPRI particles, respectively, and the protein capture carrier with captured protein and the SPRI particles with captured RNA are recovered by magnetic separation.
  • a sandwich reaction is carried out using an antibody against the protein that has been labeled with nucleic acid.
  • the protein capture carrier after the sandwich reaction is then recovered by magnetic separation.
  • step (b) the recovered protein capture carrier and SPRI particles are mixed with an ICA reaction solution for protein detection, an ICA reaction solution for RNA detection, and a reaction solution containing reverse transcriptase and nucleoside triphosphates (NTPs), and the mixture is introduced into the wells of the well array.
  • an ICA reaction solution for protein detection an ICA reaction solution for RNA detection
  • a reaction solution containing reverse transcriptase and nucleoside triphosphates (NTPs) containing reverse transcriptase and nucleoside triphosphates
  • step (c) the wells are sealed with a sealing liquid.
  • each well in the well array becomes an independent reaction space.
  • step (d) the target molecule, RNA, is reverse transcribed into cDNA using reverse transcriptase.
  • step (e) protein and RNA in the wells are each detected by an ICA reaction. More specifically, protein is detected by detecting nucleic acid labeled to protein by a sandwich reaction using an ICA reaction. RNA is detected by detecting cDNA generated by reverse transcription using an ICA reaction. In this case, the fluorescent signal detected by the ICA reaction for cDNA and the fluorescent signal detected by the ICA reaction for nucleic acid labeled to protein each have different wavelengths. This allows protein and RNA to be detected simultaneously.
  • the above method makes it possible to simultaneously separate protein and RNA, which require different separation conditions and are difficult to extract or separate simultaneously.
  • a base material made of cycloolefin (COP) formed by injection molding and a COP lid material (colored with added carbon black, with inlet and outlet ports).
  • the wells (i.e., microcompartments) formed in the base material had a diameter of 5 or 10 ⁇ m and were large enough to allow signal detection by invader reaction within a few minutes.
  • the base material was adhered to the lid material, forming an internal space (i.e., a flow path) for the fluidic device with a height of 100 ⁇ m.
  • Example 1 Serum spiked with protein and DNA was used as a sample, and the protein and DNA in the sample were detected.
  • Samples were prepared by adding protein and DNA to serum.
  • HER2 protein was used as the protein
  • ErbB2 gene fragment (nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1) was used as the DNA.
  • serum without added protein or DNA was also used.
  • Anti-HER2 antibody (BAF1129, R&D Systems) was bound to magnetic particles (Magnosphere MS300/Carboxyl, StreptAvidin, MBL) to prepare anti-HER2 antibody-modified magnetic particles.
  • nucleic acid-labeled anti-HER2 antibody was prepared by binding a DNA fragment for detection (the base sequence of which is shown in SEQ ID NO: 2) to an anti-HER2 antibody (Mab1129, R&D Systems).
  • a commercially available kit (trade name "oYo- Link® Oligo Custom (ssDNA)", Alfathera) was used for binding the DNA fragment.
  • Each recovered magnetic particle was suspended in a reaction solution having the composition shown in Table 1 below to prepare a reaction mixture.
  • This reaction solution has the effect of eluting the nucleic acid captured from the SPRI magnetic particles, and can detect the nucleic acid (SEQ ID NO: 2) and ErbB2 gene fragment (SEQ ID NO: 1) bound to the nucleic acid-labeled anti-HER2 antibody by ICA reaction.
  • the allele probe and ICA oligo were obtained from FASMAC Corporation.
  • the FRET cassette was obtained from Nippon Bioservice Co., Ltd.
  • TKO-FEN was obtained from Nippon Gene Co., Ltd.
  • ⁇ Transport of reaction mixture>> The reaction mixture was delivered to a fluidic device having a well array and introduced into each well. Subsequently, FC-40 (Sigma-Aldrich) was delivered as a sealing liquid to seal each well. This resulted in one or less HER2 protein or ErbB2 gene fragment being sealed in each well.
  • ICA Redmond Red fluorescent signal
  • FIG. 8 shows the microscopic images taken.
  • the top row shows the results for serum without added protein or DNA (negative control), and the bottom row shows the results for serum with added protein and DNA.
  • the left image is a bright-field image
  • the center image is an image detecting Alexa488 fluorescence, which indicates the presence of HER2 protein
  • the right image is an image detecting Redmond Red fluorescence, which indicates the presence of ErbB2 gene fragments.
  • Each reaction mixture was dispensed into a 96-well plate at 20 ⁇ L per well, and the ICA reaction was measured using a LightCycler LC480 (Roche). The temperature of the LightCycler was kept constant at 65°C.
  • reaction solution was evaluated using the following criteria to determine whether it maintained the ability to detect DNA through the ICA reaction.
  • reaction solutions with magnesium ion concentrations of 5-25 mM, EDTA concentrations of 0.01-0.05 mM, trishydroxymethylaminomethane concentrations of 10-50 mM, and pH ranges of 7.5-8.5 are capable of eluting nucleic acids captured from SPRI magnetic particles and of carrying out ICA reactions.
  • the present invention includes the following embodiments.
  • a method for detecting a target molecule comprising: binding a plurality of types of target molecules in a sample to a target molecule capture carrier; separating the target molecule capture carrier to which the target molecules are bound from the sample; suspending the separated target molecule capture carrier in a reaction solution; introducing the reaction solution into wells of a well array; sealing the wells with a sealing solution; pretreating the plurality of types of target molecules in the wells; and detecting each of the plurality of types of target molecules in the wells by invasive cleavage assay, wherein the reaction solution is adjusted so as not to inhibit the pretreatment and the invasive cleavage assay.
  • [15] The method for detecting a target molecule according to [14], wherein the target molecule capture carrier is a magnetic particle, and the separation is carried out by magnetism.
  • [18] The method for detecting a target molecule according to any one of [14] to [17], wherein the reaction solution contains 5 to 25 mM magnesium ions relative to the total volume of the reaction solution.
  • the plurality of types of target molecules include a first target molecule and a second target molecule, and the target molecule capture carrier binds to the first target molecule and the second target molecule.
  • the present invention provides technology that allows multiple types of target molecules to be detected on the same device.
  • 141, 171...single-stranded nucleic acid fragment 150...double-stranded nucleic acid (double-stranded nucleic acid region), 200, 500...fluidic device, 210...substrate, 220...lid member, 221...protrusion, 222...inlet port, 223...exhaust port, 230...flow path, 241, 242, 242R...well (microcompartment), 240...well array, 510...wall member, 810...allele probe, 811, 821...flap region (nucleic acid fragment), 820...nucleic acid fragment.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

この方法は、試料中の複数種類の標的分子を同一のウェルアレイ上で検出する方法であって、複数種類の標的分子を、標的分子捕捉担体に結合させて前記試料から分離する工程（ａ）と、分離した標的分子捕捉担体を反応液に懸濁し、ウェルアレイのウェルに導入する工程（ｂ）と、封止液によりウェルを封止する工程（ｃ）と、ウェル中の複数種類の標的分子を前処理する工程（ｄ）と、ウェル中の複数種類の標的分子をＩｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）によりそれぞれ検出する工程（ｅ）と、を含み、複数種類の標的分子が少なくとも核酸を含み、前処理が、核酸の標的分子捕捉担体からの解離、又は核酸の相補鎖への転写を含み、反応液は、前処理及びＩＣＡを、互いに阻害せずに行うためのものである。

Description

複数種類の標的分子を検出する方法
　本発明は、複数種類の標的分子を検出する方法に関する。
　本願は、２０２４年６月６日に日本に出願された特願２０２４－０９２６１６号について優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　生体試料中の標的分子を定量的に検出することにより、疾患の早期発見や投薬の効果予測が行われている。従来より、タンパク質の定量は酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）等により行われ、核酸の定量はリアルタイムＰＣＲ法等により行われている。
　近年、疾患をより早期に発見する等の目的で、標的分子をより精度よく検出するニーズが高まっている。標的分子を精度よく検出する手法として、例えば、特許文献１、特許文献２及び非特許文献１等には、多数の微小区画内で酵素反応を行う技術が記載されている。これらの手法は、デジタル計測と呼ばれている。
　デジタル計測では、試料溶液を極めて多数の微小溶液に分割する。そして、各微小溶液からの信号を２値化し、標的分子が存在するか否かのみを判別して、標的分子数を計測する。デジタル計測によれば、従来のＥＬＩＳＡやリアルタイムＰＣＲ法等と比較して、検出感度及び定量性を格段に向上させることができる。
　デジタルＰＣＲでは、１つの微小液滴に存在する鋳型となる核酸が０個ないし１個になるように、ＰＣＲ反応試薬と核酸との混合物は希釈されている。デジタルＰＣＲでは、核酸増幅の感度を高めるために、また多数の微小液滴に対して同時に核酸増幅を行うために、各微小液滴の体積は小さい方が好ましい。例えば、特許文献３には、各ウェルの容積が６ｎｌ（ナノリットル）となるように形成されたマイクロアレイ状の反応容器が開示されている。また、特許文献１には、深さ３μｍ、直径５μｍのウェルが流路内に多数形成されたマイクロアレイに対して流路に試料を流して各ウェルに試料を導入した後、流路内の余剰試薬をオイルで押し出すことによって、各ウェル内に試料を導入する方法が開示されている。
　ところで、複数種類の標的分子を測定する技術が開発されている。例えば、特許文献４には、バーコード配列核酸修飾抗体及び標的遺伝子結合バーコード粒子を用いて、細胞におけるタンパク質及び遺伝子発現を測定する方法が記載されている。
　また、特許文献５には、構造体の表面に存在する表面標的分子と、構造体の内部に存在する内部標的分子を検出する方法が記載されている。
特許第６１８３４７１号公報 特表２０１４－５０３８３１号公報 国際公開第２０１３－１５１１３５号 特許第７０９１３４８号公報 国際公開第２０２０－２３５６０７号
Kim S. H., et al., Large-scale femtoliter droplet array for digital counting of single biomolecules, Lab on a Chip, 12 (23), 4986-4991, 2012.
　しかしながら、複数種類の標的分子を測定する場合、例えば核酸とタンパク質のように、分離条件が異なり、同時に抽出又は分離することが困難な場合がある。例えば、核酸を抽出する条件ではタンパク質が変性し、喪失する場合がある。また、標的分子の種類ごとに測定方法や測定装置が異なり、複数種類の標的分子を同時に測定することが、困難な場合がある。
　本発明は、複数種類の標的分子を同一のデバイス上で検出する技術を提供することを目的とする。
　本発明は以下の態様を含む。
　［１］試料中の複数種類の標的分子を同一のウェルアレイ上で検出する方法であって、前記複数種類の標的分子を、標的分子捕捉担体に結合させ、前記試料から前記標的分子が結合している前記標的分子捕捉担体を分離する工程（ａ）と、分離した前記標的分子捕捉担体を反応液に懸濁し、前記ウェルアレイのウェルに導入する工程（ｂ）と、封止液により前記ウェルを封止する工程（ｃ）と、前記ウェル中の前記複数種類の標的分子を前処理する工程（ｄ）と、前記ウェル中の前記複数種類の標的分子をＩｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）によりそれぞれ検出する工程（ｅ）と、を含み、前記複数種類の標的分子が少なくとも核酸を含み、前記前処理が、前記核酸の前記標的分子捕捉担体からの解離、又は前記核酸の相補鎖への転写を含み、前記反応液は、前記前処理及び前記ＩＣＡを、互いに阻害せずに行うためのものである、方法。
　［２］前記標的分子捕捉担体が磁性粒子であり、前記分離を磁気により行う、［１］に記載の方法。
　［３］前記標的分子捕捉担体がＳｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ　ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）粒子を含む、［１］又は［２］に記載の方法。
　［４］前記ウェルの容積が１０ｆＬ～１００ｐＬである、［１］～［３］のいずれかに記載の方法。
　［５］前記反応液は、５～２５ｍＭのマグネシウムイオンを含む、［１］～［４］のいずれかに記載の方法。
　［６］前記反応液は、０．０１～０．０５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を含む、請求項［１］～［５］のいずれかに記載の方法。
　［７］前記反応液は、１０～５０ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタンを含む、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
　［８］前記反応液の２５℃におけるｐＨは、７．５～８．５である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
　［９］　前記標的分子捕捉担体は、第１の標的分子捕捉担体と第２の標的分子捕捉担体を含み、前記複数種類の標的分子は、第１の標的分子と第２の標的分子を含み、前記第１の標的分子は、前記第１の標的分子捕捉担体と結合し、前記第２の標的分子は、前記第２の標的分子捕捉担体と結合する、［１］～［８］のいずれかに記載の方法。
　［１０］前記複数種類の標的分子は、タンパク質を含む、［１］～［９］のいずれかに記載の方法。
　［１１］前記試料が細胞を含み、さらに、前記分離する工程（ａ）の前に前記細胞を溶解する工程を含む、［１］～［１０］のいずれかに記載の方法。
　［１２］前記複数種類の標的分子は、ＨＥＲ２タンパク質とＥｒｂＢ２遺伝子を含む、［１］～［１０］のいずれかに記載の方法。
　［１３］試料中の複数種類の標的分子を同一のウェルアレイ上で検出する方法であって、前記複数種類の標的分子を、標的分子捕捉担体に結合させ、前記試料から前記標的分子が結合している前記標的分子捕捉担体を分離する工程（ａ）と、分離した前記標的分子捕捉担体を反応液に懸濁し、前記ウェルアレイのウェルに導入する工程（ｂ）と、封止液により前記ウェルを封止する工程（ｃ）と、前記ウェル中の前記複数種類の標的分子を前処理する工程（ｄ）と、前記ウェル中の前記複数種類の標的分子をＩｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）によりそれぞれ検出する工程（ｅ）と、を含み、前記複数種類の標的分子が少なくとも核酸を含み、前記前処理が、前記核酸の前記標的分子捕捉担体からの解離、又は前記核酸の相補鎖への転写を含み、前記反応液は、５～２５ｍＭのマグネシウムイオンと、０．０１～０．０５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸と、１０～５０ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタンを含み、前記反応液の２５℃におけるｐＨは、７．５～８．５であり、標的分子はHER２タンパク質とＥｒｂＢ２遺伝子である、方法。
　本発明によれば、複数種類の標的分子を同一のデバイス上で検出する技術を提供することができる。
図１は、流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 図２は、標的分子を検出する方法を説明する模式断面図である。 図３は、標的分子を検出する方法を説明する模式断面図である。 図４は、流体デバイスの一例を示す模式断面図である。 図５は、標的分子を検出する方法を説明する模式断面図である。 図６は、標的分子を検出する方法を説明する模式断面図である。 図７は、Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）の一例を説明する模式図である。 図８は、実験例１の結果を示す画像である。
　本明細書において、例えば「１～２」で表される数値範囲は、～の前後の数値である１及び２を下限値及び上限値として含む数値範囲を意味する。
　以下、場合により図面を参照しつつ、本発明の実施形態について詳細に説明する。なお、図面中、同一又は相当部分には同一又は対応する符号を付し、重複する説明は省略する。なお、各図における寸法比は、説明のため誇張している部分があり、必ずしも実際の寸法比とは一致しない。
　一実施形態において、本発明は、試料中の複数種類の標的分子を同一のウェルアレイ上で検出する方法であって、前記複数種類の標的分子を、標的分子捕捉担体に結合させ、前記試料から前記標的分子が結合している前記標的分子捕捉担体を分離する工程（ａ）と、分離した前記標的分子捕捉担体を反応液に懸濁し、前記ウェルアレイのウェルに導入する工程（ｂ）と、封止液により前記ウェルを封止する工程（ｃ）と、前記ウェル中の前記複数種類の標的分子を前処理する工程（ｄ）と、前記ウェル中の前記複数種類の標的分子をＩｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）によりそれぞれ検出する工程（ｅ）と、を含み、前記複数種類の標的分子が少なくとも核酸を含み、前記前処理が、前記核酸の前記標的分子捕捉担体からの解離、又は前記核酸の相補鎖への転写を含み、前記反応液は、前記前処理及び前記ＩＣＡを、互いに阻害せずに行うためのものである、方法を提供する。本実施形態の方法により、複数種類の標的分子を同一のデバイス上で検出することができる。
　試料としては、複数種類の標的分子を含むものであれば特に限定されず、例えば、血清、尿、エクソソーム、細胞、組織及び全血等が挙げられる。試料は、例えば細胞それ自体であってもよく、細胞溶解液であってもよく、複数の細胞を含む細胞集団であってもよい。
　標的分子としては、タンパク質、核酸及び代謝物等が挙げられる。核酸としては、ＤＮＡ及びＲＮＡが挙げられる。複数種類の標的分子とは、例えば、標的分子が、タンパク質とＤＮＡの組み合わせ、タンパク質とＲＮＡの組み合わせ、タンパク質とＤＮＡとＲＮＡの組み合わせ、ＤＮＡとＲＮＡの組み合わせ、配列の異なる複数種類のＤＮＡの組み合わせ、配列の異なる複数種類のＲＮＡの組み合わせ、１種類又は複数種類のＤＮＡ及び１種類又は複数種類のＲＮＡの組み合わせ、又は複数種類のタンパク質の組み合わせ等の複数種類の組み合わせであることを意味する。複数種類のＤＮＡとは、例えば、配列が異なる複数種類のＤＮＡであってもよい。同様に、複数種類のＲＮＡとは、例えば、配列が異なる複数種類のＲＮＡであってもよい。複数種類の標的分子は、少なくとも核酸を含む。
　工程（ａ）において、試料中の複数種類の標的分子を、標的分子捕捉担体に結合させ、試料から前記標的分子が結合している前記標的分子捕捉担体を分離する。試料がエクソソーム又は細胞等の構造物である場合には、予め構造物を破砕して構造物の内部に含まれる標的分子を露出させることが好ましい。
　例えば、複数種類の標的分子が、タンパク質及び核酸を含む場合、標的分子捕捉担体は、タンパク質に対する抗体修飾担体及び核酸に結合する核酸結合性担体を含んでいてもよい。この場合、標的分子捕捉担体に修飾される核酸は、標的核酸に相補的な配列を有している。また、この場合、複数種類の標的分子を、複数種類の標的分子捕捉担体にそれぞれ結合させて分離することになる。例えば、標的分子が第１及び第２の標的分子を含む場合、標的分子捕捉担体は、第１の標的分子に結合する第１の標的分子捕捉担体、及び第２の標的分子に結合する第２の標的分子捕捉担体を含んでいてもよい。
　あるいは、複数種類の標的分子が、タンパク質及びＲＮＡを含む場合、標的分子捕捉担体に修飾される核酸は、Ｐｏｌｙ　Ａ配列に対応する配列でもよい。
　あるいは、１種類の標的分子捕捉担体が、タンパク質に対する抗体及び核酸に対するプローブで修飾されており、１個の標的分子捕捉担体が、試料中のタンパク質及び核酸を捕捉して分離してもよい。ここで、タンパク質及び／又は核酸は１種類に限られない。例えば、１種類の標的分子捕捉担体が、１種類又は複数種類のタンパク質に対する抗体、及び／又は、１種類又は複数種類の核酸に対するプローブで修飾されており、１個の標的分子捕捉担体が、試料中の１種類又は複数種類のタンパク質、及び／又は、１種類又は複数種類の核酸を捕捉して分離してもよい。
　あるいは、例えば、１種類の標的分子捕捉担体が、エクソソームに対する抗体、タンパク質に対する抗体、及び核酸に対するプローブで修飾されており、工程（ａ）において、まず、試料から、標的分子捕捉担体がエクソソームを捕捉・回収し、続いて、分離抽出操作により、エクソソーム中のタンパク質及び核酸が抽出され、抽出されたタンパク質及び核酸を標的分子捕捉担体が捕捉して分離してもよい。つまり、標的分子が第１～第３の標的分子を含む場合、標的分子捕捉担体が第１～第３の標的分子のそれぞれに対応する第１～第３のプローブで修飾されていてもよい。
　標的分子捕捉担体は、磁性粒子であり、分離を磁気により行うことが好ましい。これにより複数種類の標的分子を同じ手法で同時に分離することができる。
　捕捉担体が核酸結合性担体を含む場合、核酸結合性担体は、Ｓｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ　ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）粒子であってもよい。ＳＰＲＩ粒子とは、コア部が磁性鉄の薄い膜で覆われた構造を有しており、磁気で容易に回収することができる。磁性粒子の表面はカルボキシル基でコートされており、塩の存在下でＤＮＡ／ＲＮＡと結合することができる。
　標的分子捕捉担体は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ　ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭシリーズであってもよい。ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＴＭ　ＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭシリーズは、可磁化物質（γＦｅ２Ｏ３とＦｅ３Ｏ４)が一様に分布した高分子ポリマーのコアを親水性ポリマーで覆った、粒径が均一なビーズであり、用途に応じて修飾するプローブを変更することができる。
　標的分子捕捉担体は、抗体や核酸を修飾するために、粒子表面にはカルボキシル基、アミノ基、エポキシ基及びトシル基のうちの少なくとも一種を有する。
　標的分子捕捉担体の表面は、親水性表面であってもよく、疎水性表面であってもよい。
　続いて、工程（ｂ）において、分離した標的分子捕捉担体を反応液に懸濁し、前記ウェルアレイのウェルに導入する。
　ここで用いる反応液は、後述する前処理を行うことができるとともに、Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）を行うためのものである。標的分子がタンパク質を含む場合、反応液は、更に、タンパク質のＩＣＡによる検出を阻害しないものである必要がある。つまり、反応液は、前処理とＩＣＡの双方が阻害されないよう調整されている。
　標的分子が、タンパク質を含む場合、工程（ｂ）の前に、標的分子捕捉担体に捕捉されたタンパク質を核酸標識することが好ましい。核酸標識により、タンパク質をＩＣＡにより検出することが可能になる。核酸標識は、例えば、標的分子であるタンパク質に対する抗体を核酸で標識したものを、標的分子捕捉担体に捕捉されたタンパク質に結合させることにより行うことができる。
　続いて、工程（ｃ）において、封止液によりウェルを封止する。この結果、ウェルアレイの各ウェルはそれぞれ独立した反応空間となる。ここで、１つのウェルに０個又は１個の標的分子が収容されることが好ましい。これによりデジタル計測が可能となる。
　続いて、工程（ｄ）において、ウェル中の複数種類の標的分子を前処理する。前処理は、上記の反応液中で標的分子捕捉担体をインキュベートすることにより行うことができる。前処理は、捕捉された核酸の標的分子捕捉担体からの解離であってもよい。核酸を標的分子捕捉担体から解離させることにより、検出が容易になる。
　あるいは、前処理は、捕捉された核酸の相補鎖への転写であってもよい。例えば、標的分子捕捉担体に捕捉された核酸がＲＮＡであり、前処理が、捕捉されたＲＮＡを、逆転写酵素によりｃＤＮＡに逆転写することであってもよい。ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写することにより、検出が容易になる。この場合、上記の反応液は、逆転写酵素及びヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を含む。反応液は更に、逆転写用のプライマーを含んでいてもよい。
　続いて、工程（ｅ）において、ウェル中の複数種類の標的分子をＩｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）によりそれぞれ検出する。ＩＣＡについては後述する。
　１個の標的分子捕捉担体が、試料中の複数種類の標的分子を捕捉する場合、ＩＣＡを多色検出し、それぞれの標的分子をそれぞれ異なる波長の蛍光シグナルとして検出してもよい。
　以上の方法により、分離条件が異なり、同時に抽出又は分離することが困難な複数種類の標的分子を同時に分離し、また、従来、測定方法や測定装置が異なる複数種類の標的分子を同時に測定することができる。
　図１は、本実施形態の方法を好適に実施することができる流体デバイスの一例を示す模式断面図である。図１に示すように、流体デバイス２００は、基板２１０と、基板２１０に対向して配置される蓋部材２２０とを備えている。蓋部材２２０は凸部２２１を有しており、凸部２２１の先端は基板２１０に接している。流体デバイス２００においては、ウェルアレイ２４０は基板２１０の一方面上に基板２１０と一体成型されており、蓋部材２２０と対向している。ウェルアレイ２４０は複数のウェル２４１を有する。蓋部材２２０は、基板２１０に溶着又は接着されていてもよい。
　ウェル２４１は、基板２１０の表面に開口している。ウェル２４１の形状、寸法、及び配置は特に限定されないが、ウェル２４１は、容積が小さい微小ウェルであることが好ましい。例えば、１つのウェル２４１の容積は、１０ｆＬ～１００ｐＬ程度であってもよい。流体デバイス２００では、同形同大の複数のウェル２４１がウェルアレイ２４０を構成している。同形同大とは、デジタル計測を行うために要求される程度に同一の形状で同一の容量であればよく、製造上の誤差程度のばらつきであれば許容される。
　ウェル２４１の直径は、例えば１～１０μｍ程度であってもよく、ウェル２４１の深さは、例えば１～１０μｍ程度であってもよい。また、ウェル２４１の配置は特に制限されず、例えば三角格子状に整列していてもよいし、正方格子状も整列していてもよいし、ランダムに配置されていてもよい。
　流体デバイス２００では、凸部２２１の存在により、ウェルアレイ２４０と蓋部材２２０との間に空間が形成されている。当該空間は、流路２３０を構成している。流路２３０は、標的分子捕捉担体を懸濁した反応液等の液体及び後述する封止液を送液するための経路として機能する。流路２３０の形状、構造及び容量等は特に限定されないが、流路２３０の高さ（基板２１０の表面と、蓋部材２２０の基板２１０と対向する面との間の距離）は、例えば５００μｍ以下であってもよいし、例えば３００μｍ以下であってもよいし、例えば２００μｍ以下であってもよいし、例えば１００μｍ以下であってもよい。
　凸部２２１は、蓋部材２２０と一体に成形されていてもよい。蓋部材２２０は、例えば、熱可塑性樹脂の流動体を、成形型を用いて成形することで、凸部２２１を有する板状に成形することができる。また、蓋部材２２０には試薬の導入ポート２２２及び排出ポート２２３が形成されていてもよい。
　蓋部材２２０が凸部２２１を有する場合、基板２１０のウェル２４１が開口する面に凸部２２１が接するように、蓋部材２２０と基板２１０とが重ねられる。この結果、蓋部材２２０と基板２１０との間の空間が流路２３０となる。蓋部材２２０と基板２１０とは、レーザー溶着等により溶着されてもよい。
　本実施形態の方法に用いられる流体デバイスは、上述した流体デバイス２００に限られない。図４は、流体デバイスの一例を示す模式断面図である。図４に示すように、流体デバイス５００は、基板２１０と、壁部材５１０とを備えている。流体デバイス５００においては、ウェルアレイ２４０は基板２１０の一方面上に基板２１０と一体成形されている。ウェルアレイ２４０は、複数のウェル２４１を有する。流体デバイス５００は、蓋部材２２０を有していない点で上述した流体デバイス２００と主に異なっている。
　上述した流体デバイス２００においては、蓋部材２２０と凸部２２１は、一体成形されている。しかしながら、蓋部材２２０と凸部２２１は、別体として成形されていてもよい。
　また、上述した流体デバイス２００及び流体デバイス５００においては、ウェルアレイ２４０は、基板２１０の一方面上に基板２１０と一体成形されている。しかしながら、ウェルアレイは、基板２１０と一体成形されていなくてもよい。例えば、流体デバイスとは別体として成形されたウェルアレイ２４０を、流体デバイスの基板２１０上に配置してもよい。あるいは、基板２１０の表面に樹脂層を積層し、エッチング等により、樹脂層にウェルアレイが形成されていてもよい。
　流体デバイスにおいて、基板２１０は、例えば樹脂を用いて形成される。樹脂の種類は特に限定されないが、試薬及び封止液に対して耐性のある樹脂であることが好ましい。また、検出するシグナルが蛍光である場合には、自家蛍光が少ない樹脂であることが好ましい。例えば、シクロオレフィンポリマーや、シクロオレフィンコポリマー、シリコーン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ酢酸ビニル、フッ素樹脂及びアモルファスフッ素樹脂等が挙げられるがこれらに限定されない。
　基板２１０の板厚方向の一方面に複数のウェル２４１が形成されていてもよい。樹脂を用いたウェルの形成方法としては、射出成形、熱インプリント及び光インプリント等が挙げられる。
　あるいは、例えば、基板２１０の上にフッ素樹脂を積層し、当該フッ素樹脂をエッチング等により加工してウェルアレイを形成してもよい。フッ素樹脂としては、例えばＣＹＴＯＰ（登録商標）（旭硝子）等を用いることができる。
　また、流体デバイスが蓋部材２２０を有する場合、蓋部材２２０の材質は、自家蛍光の少ない樹脂であることが好ましく、例えば、シクロオレフィンポリマー及びシクロオレフィンコポリマー等の熱可塑性樹脂であってもよい。
　また、蓋部材２２０は、シグナルを蛍光観察する際に検出される波長の近傍の波長の光を透過しない材料から形成されていてもよく、完全に光を透過しない材料から形成されていてもよい。例えば、蓋部材２２０は、カーボンや金属粒子等を添加した熱可塑性樹脂から形成されていてもよい。
　続いて、図１～図３を参照しながら、流体デバイス２００を用いた場合を例に、本実施形態の方法について説明する。
　まず、図１に示すように、流体デバイス２００の導入ポート２２２から標的分子捕捉担体を懸濁した反応液Ｌ２１０を導入し、流路２３０に送液する。反応液Ｌ２１０は、上述した前処理を行うことができるとともに、ＩＣＡを行うためのものである。また、標的分子がタンパク質を含む場合、反応液Ｌ２１０は、更に、タンパク質のＩＣＡによる検出を阻害しないものである必要がある。
　流路２３０に送液された反応液Ｌ２１０は、ウェルアレイ２４０に接触する。そして、ウェル２４１の内部に反応液Ｌ２１０が収容される。この結果、ウェル２４１に、標的分子及び反応液が導入される。
　１つのウェル２４１に導入される標的分子の数は特に制限されないが、好ましくは、１つのウェル２４１に１つ以下、すなわち、０個又は１個の標的分子が導入される。これにより、標的分子の検出を１個単位で行うことができ、すなわちデジタル計測が可能となる。また、ウェルアレイの全てのウェルに標的分子が導入される必要はない。
　あるいは、１つのウェル２４１に標的分子捕捉担体が１つ以下導入されてもよい。ここで、１つの標的分子捕捉担体に複数種類の標的分子が捕捉されている場合、１つのウェル２４１に複数種類の標的分子が収容され得ることになる。この場合、ＩＣＡを多色検出し、それぞれの標的分子をそれぞれ異なる波長の蛍光シグナルとして検出してもよい。
　ウェル２４１に、反応液Ｌ２１０を導入した後、ウェル２４１の開口部を封止する工程を実施する。具体的には、図２に示すように、蓋部材２２０の導入ポート２２２から、基板２１０と蓋部材２２０との間の流路２３０に、封止液Ｌ２２０を送液する。流路２３０に送液された封止液Ｌ２２０は、ウェルアレイ２４０に接触する。そして、封止液Ｌ２２０は、流路２３０に送液された試薬液Ｌ２１０のうち、ウェル２４１に収容されていない試薬液Ｌ２１０を押し流して置換する。これにより、封止液Ｌ２２０が、標的物質を含む反応液Ｌ２１０を収容した複数のウェル２４１をそれぞれ個別に封止し、ウェル２４１は独立した反応空間（微小区画２４２ともいう）となる。流路２３０が封止液Ｌ２２０で満たされると、余分な封止液Ｌ２２０は排出ポート２２３から排出される。図３は、ウェルアレイ２４０のウェル２４１の全てが封止液Ｌ２２０で封止され、封止されたウェル（つまり、微小区画）２４２が形成された状態を示す。
　封止液は、複数のウェル２４１に導入された液体同士を互いに混合しないように個別に封止して液滴（微小液滴ともいう）を形成することができる液であり、好ましくは油性溶液であり、より好ましくはオイルである。オイルとしては、フッ素系オイル、シリコーン系オイル、炭化水素系オイル又はこれらの混合物等を使用することができる。より具体的には、シグマ社製の商品名「ＦＣ－４０」、信越化学工業社の商品名「ＫＦ－９６」等を用いることができる。ＦＣ－４０（ＣＡＳ番号：８６５０８－４２－１）はフッ素化脂肪族化合物であり、２５℃における比重が１．８５ｇ／ｍＬである。
　ここで、Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）について説明する。図７は、ＩＣＡの一例を説明する模式図である。図７の例では、ＩＣＡにより、第１の一本鎖核酸断片１４１の少なくとも一部及び第２の一本鎖核酸断片１７１の少なくとも一部がハイブリダイズして形成された二本鎖核酸１５０を検出する。
　まず、第１の一本鎖核酸断片１４１又は第２の一本鎖核酸断片１７１にアレルプローブ（フラッププローブともいう）をハイブリダイズさせる。アレルプローブは、検出対象であるＤＮＡにハイブリダイズしてフラップ部位を形成する一本鎖核酸断片である。図７の例では、アレルプローブ８１０は、第２の一本鎖核酸断片１７１にハイブリダイズする。その結果、第１フラップ部位８１１が形成される。
　続いて、第１フラップ部位８１１にフラップエンドヌクレアーゼ（ＦＥＮ）を反応させると、第１フラップ部位８１１が切断され、核酸断片８１１が生成される。フラップエンドヌクレアーゼとは、ＤＮＡ配列ではなく、特定のＤＮＡ高次構造（フラップ構造ともいう）を認識し、フラップ鎖を切断する活性を有するエンドヌクレアーゼである。
　続いて、核酸断片８１１は、蛍光基質（ＦＲＥＴカセットともいう、核酸断片８２０）にハイブリダイズして第２フラップ部位８２１を形成する。
　図７の例では、核酸断片８２０の５’末端には蛍光物質Ｆが結合されており、核酸断片８２０の５’末端から数塩基３’側に消光物質Ｑが結合されている。続いて、第２フラップ部位８２１にＦＥＮを反応させると、第２フラップ部位８２１が切断され、核酸断片８２１が生成される。その結果、蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから離れ、蛍光シグナルを発生する。この蛍光シグナルを検出することにより、二本鎖核酸１５０の形成を検出することができる。
　反応液Ｌ２１０としては、流体デバイスを用いて行われる生化学分析において使用される一般的な液体を用いることができ、好ましくは水性溶液である。また、反応液Ｌ２１０に界面活性剤等を含ませることにより、ウェル内に液体を封入しやすくしてもよい。
　二本鎖核酸１５０の形成の検出にＩＣＡを用いる場合、二本鎖核酸１５０が存在する場合には、等温反応による酵素反応によって、蛍光物質Ｆが消光物質Ｑから遊離し、励起光に対応して所定の蛍光シグナルを発する。
　二本鎖核酸１５０の形成の検出は、検出するシグナルの種類に応じて公知の適切な方法を選択することができる。例えば、蛍光シグナルを観察する場合は、蛍光物質に対応する励起光をウェル２４２に照射し、蛍光物質が発する蛍光を観察する。例えば、図３に示すように、封止されたウェル２４２内で所定の反応を行い、発生したシグナルを観察する。図３において、ウェル２４２Ｒはシグナルが検出されたウェルであり、ウェル２４２はシグナルが検出されなかったウェルである。
　続いて、図４～図６を参照しながら、流体デバイス５００を用いた場合を例に、本実施形態の方法について説明する。まず、図４に示すように、流体デバイス５００の内部に反応液Ｌ２１０を導入する。反応液Ｌ２１０は、上述した前処理を行うことができるとともに、ＩＣＡを行うためのものである。また、標的分子がタンパク質を含む場合、反応液Ｌ２１０は、更に、タンパク質のＩＣＡによる検出を阻害しないものである必要がある。反応液Ｌ２１０において、標的分子の濃度は、ウェル２４１に１ウェルあたり１分子以下の標的分子が導入される濃度に調整されていてもよい。あるいは、反応液Ｌ２１０において、標的分子捕捉担体の濃度は、１つのウェル２４１に１ウェルあたり１つ以下の標的分子捕捉担体が導入される濃度に調整されていてもよい。
　続いて、図５に示すように、流体デバイス５００の内部に封止液Ｌ２２０を導入する。封止液Ｌ２２０の比重は、混合液Ｌ２１０よりも大きい。このため、封止液Ｌ２２０は、混合液Ｌ２１０のうち、ウェル２４１に収容されていない混合液Ｌ２１０よりも下に沈み、ウェルアレイ２４０に接する。そして、封止液Ｌ２２０は、標的分子を含む反応液Ｌ２１０を収容した複数のウェル２４１をそれぞれ個別に封止し、独立した反応空間（つまり、微小区画２４２）となる。
　続いて、図６に示すように、ウェル２４２内で所定の反応を行い、発生したシグナルを観察する。図６中、ウェル２４２Ｒはシグナルが検出されたウェルであり、ウェル２４２はシグナルが検出されなかったウェルである。
　本実施形態の方法において、反応液は、上述した前処理を行うことができるとともに、ＩＣＡを行うことができ、また、標的分子がタンパク質を含む場合には、タンパク質のＩＣＡによる検出を阻害しないという条件を満たす必要がある。
　実施例において後述するように、発明者らは、反応液のマグネシウムイオン濃度が５～２５ｍＭ、つまり、反応液の総体積に対するマグネシウムイオン濃度が５～２５ｍＭであると、上記の条件が満たされることを見出した。発明者らはまた、反応液のエチレンジアミン四酢酸濃度が０．０１～０．０５ｍＭ、つまり、反応液の総体積に対するエチレンジアミン四酢酸濃度が０．０１～０．０５ｍＭであると、上記の条件が満たされることを見出した。発明者らはまた、反応液のトリスヒドロキシメチルアミノメタン濃度が１０～５０ｍＭ、つまり、反応液の総体積に対するトリスヒドロキシメチルアミノメタン濃度が１０～５０ｍＭであると、上記の条件が満たされることを見出した。発明者らは、また、反応液の２５℃におけるｐＨが７．５～８．５であると、上記の条件が満たされることを見出した。
　反応液は更に、ＩＣＡを行うためのアレルプローブ、ＩＣＡオリゴ、ＦＲＥＴカセット及びフラップエンドヌクレアーゼを含む。また、標的分子捕捉担体に捕捉された核酸がＲＮＡであり、前処理においてＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写する場合、反応液は更に、逆転写酵素及びヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を含む。反応液は更に、逆転写用のプライマーを含んでいてもよい。
　ＩＣＡオリゴは、標的分子であるタンパク質又は核酸にハイブリダイズする一本鎖核酸断片である。ＩＣＡオリゴは、標的分子である核酸に直接ハイブリダイズするものであってもよい。あるいは、ＩＣＡオリゴは、標的分子であるタンパク質に対する抗体に修飾された核酸にハイブリダイズするものであってもよい。
　アレルプローブ、ＦＲＥＴカセット、フラップエンドヌクレアーゼについては上述したものと同様である。
　一つの例として、一種の標的分子捕捉担体と、試料としてエクソソームを用い、標的分子としてタンパク質とＲＮＡを検出する場合について説明する。
　ここで使用される標的分子捕捉担体は、磁気粒子表面上に、エクソソームに対する抗体、タンパク質に対する抗体及びＲＮＡ捕捉核酸が修飾されている。
　工程（ａ）として、まず、細胞、組織及び全血等の構造物である試料を破砕し、構造物に含まれるエクソソームを露出させる。次に、標的分子捕捉担体を用いて、エクソソームを捕捉し、磁気分離によりエクソソームを捕捉した標的分子捕捉担体を回収する。
　界面活性剤を含む溶液等の抽出液を用いて、捕捉されたエクソソームから標的分子であるタンパク質及びＲＮＡを抽出する。次いで標的分子捕捉担体を用いて、タンパク質とＲＮＡを捕捉し、磁気分離によりタンパク質とＲＮＡを捕捉した標的分子捕捉担体を回収する。
　回収された標的分子捕捉担体に含まれるタンパク質を核酸標識するため、核酸で標識された、タンパク質に対する抗体によりサンドイッチ反応を行う。その後、磁気分離によりサンドイッチ反応後の標的分子捕捉担体を回収する。
　工程（ｂ）として、回収された標的分子捕捉担体と、タンパク質検出用ＩＣＡ反応液と、ＲＮＡ検出用ＩＣＡ反応液と、逆転写酵素及びヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を含む反応液とを混合し、ウェルアレイのウェルに導入する。
　工程（ｃ）として、封止液によりウェルを封止する。この結果、ウェルアレイの各ウェルはそれぞれ独立した反応空間となる。
　工程（ｄ）として、標的分子であるＲＮＡを逆転写酵素によりｃＤＮＡに逆転写する。
　工程（ｅ）として、ウェル中のタンパク質及びＲＮＡをＩＣＡ反応によりそれぞれ検出する。より具体的には、タンパク質の検出は、サンドイッチ反応によりタンパク質に標識された核酸をＩＣＡ反応により検出して行う。ＲＮＡの検出は、逆転写により生じたｃＤＮＡをＩＣＡ反応により検出して行う。この際、ｃＤＮＡに対するＩＣＡ反応で検出される蛍光シグナルと、タンパク質に標識された核酸に対するＩＣＡ反応で検出される蛍光シグナルとをそれぞれ異なる波長とする。これにより、同時にタンパク質とＲＮＡとを検出できる。
　以上の方法により、分離条件が異なり、同時に抽出又は分離することが困難であるタンパク質とＲＮＡを同時に分離できる。
　もう一つの例として、複数種の標的分子捕捉担体と、試料としてエクソソームを用い、標的分子としてタンパク質とＲＮＡを検出する場合について説明する。
　ここで使用される標的分子捕捉担体は、核酸結合性担体としてＳＰＲＩ粒子、タンパク質捕捉担体として表面上にタンパク質に対する抗体が修飾されている磁気粒子を用いる。
　工程（ａ）として、まず、細胞、組織及び全血等の構造物である試料を破砕し、構造物に含まれるエクソソームを露出させる。次に、標的分子捕捉担体を用いて、エクソソームを捕捉し、磁気分離によりエクソソームを捕捉した標的分子捕捉担体を回収する。エクソソームの捕捉は、タンパク質捕捉担体にエクソソームを捕捉するための抗体を修飾しておき、タンパク質捕捉担体を利用しておこなってもよい。また、エクソソームを補足するための捕捉担体を別途用いてもよい。
　界面活性剤を含む溶液等の抽出液を用いて、捕捉されたエクソソームから標的分子であるタンパク質及びＲＮＡを抽出する。次いでタンパク質捕捉担体及びＳＰＲＩ粒子を用いて、タンパク質とＲＮＡをそれぞれ捕捉し、磁気分離によりタンパク質を捕捉したタンパク質捕捉担体とＲＮＡを捕捉したＳＰＲＩ粒子を回収する。
　回収されたタンパク質捕捉担体に含まれるタンパク質を核酸標識するため、核酸で標識された、タンパク質に対する抗体によりサンドイッチ反応を行う。その後、磁気分離によりサンドイッチ反応後のタンパク質捕捉担体を回収する。
　工程（ｂ）として、回収されたタンパク質捕捉担体及びＳＰＲＩ粒子と、タンパク質検出用ＩＣＡ反応液と、ＲＮＡ検出用ＩＣＡ反応液と、逆転写酵素及びヌクレオシド三リン酸（ＮＴＰ）を含む反応液とを混合し、ウェルアレイのウェルに導入する。
　工程（ｃ）として、封止液によりウェルを封止する。この結果、ウェルアレイの各ウェルはそれぞれ独立した反応空間となる。
　工程（ｄ）として、標的分子であるＲＮＡを逆転写酵素によりｃＤＮＡに逆転写する。
　工程（ｅ）として、ウェル中のタンパク質及びＲＮＡをＩＣＡ反応によりそれぞれ検出する。より具体的には、タンパク質の検出は、サンドイッチ反応によりタンパク質に標識された核酸をＩＣＡ反応により検出して行う。ＲＮＡの検出は、逆転写により生じたｃＤＮＡをＩＣＡ反応により検出して行う。この際、ｃＤＮＡに対するＩＣＡ反応で検出される蛍光シグナルと、タンパク質に標識された核酸に対するＩＣＡ反応で検出される蛍光シグナルとをそれぞれ異なる波長とする。これにより、同時にタンパク質とＲＮＡとを検出できる。
　以上の方法により、分離条件が異なり、同時に抽出又は分離することが困難であるタンパク質とＲＮＡを同時に分離できる。
　以下、本発明を実施例に基づいて更に詳細に説明する。本発明はこれらの実施例に何ら限定されない。
　本実施例では、実験用の流体デバイスを製造するために、射出成形で形成したシクロオレフィン（ＣＯＰ）製の基材とＣＯＰ製の蓋材（カーボンブラック添加着色、送液及び廃液ポート付）の２つの樹脂製の部材を使用した。基材に形成されたウェル（つまり微小区画）の直径は、５または１０μｍであり、インベーダー反応によるシグナル検出が数分で可能な体積を有している。基材は、蓋材に対して接着し、高さが１００μｍの流体デバイスの内部空間（つまり流路）を形成した。
［実施例１］
（タンパク質及びＤＮＡの検出）
　タンパク質及びＤＮＡを添加した血清を試料とし、試料中のタンパク質及びＤＮＡを検出した。
《試料の調製》
　血清にタンパク質及びＤＮＡを添加して試料を調製した。タンパク質としてはＨＥＲ２タンパク質を使用した。ＤＮＡとしてはＥｒｂＢ２遺伝子断片（塩基配列を配列番号１に示す。）を使用した。また、比較のために、タンパク質及びＤＮＡを添加していない血清も使用した。
《抗ＨＥＲ２抗体修飾磁気粒子の調製》
　磁気粒子（Ｍａｇｎｏｓｐｈｅｒｅ　ＭＳ３００／Ｃａｒｂｏｘｙｌ，　ＳｔｒｅｐｔＡｖｉｄｉｎ、ＭＢＬ社）に抗ＨＥＲ２抗体（ＢＡＦ１１２９、Ｒ＆Ｄシステムズ社）を結合させて抗ＨＥＲ２抗体修飾磁気粒子を調製した。
《核酸標識抗ＨＥＲ２抗体の調製》
　抗ＨＥＲ２抗体（Ｍａｂ１１２９、Ｒ＆Ｄシステムズ）に、検出用のＤＮＡ断片（塩基配列を配列番号２に示す。）を結合させ、核酸標識抗ＨＥＲ２抗体を調製した。ＤＮＡ断片の結合には、市販のキット（商品名「ｏＹｏ－Ｌｉｎｋ（Ｒ）　Ｏｌｉｇｏ　Ｃｕｓｔｏｍ　（ｓｓＤＮＡ）」、アルファセラ社）を用いた。
《試料中のタンパク質及びＤＮＡの分離》
　試料に、抗ＨＥＲ２抗体修飾磁気粒子及び核酸分離用磁気粒子（ＳＰＲＩ磁気粒子、ＭｉｎｉＭａｘ　ｃｆＤＮＡ　ｉｓｏｌａｔｉｏｎ、ベックマンコールター社）を添加して混合した。この結果、試料中のＨＥＲ２タンパク質が抗ＨＥＲ２抗体修飾磁気粒子に捕捉された。また、試料中のＤＮＡ（ＥｒｂＢ２遺伝子断片）がＳＰＲＩ磁気粒子に捕捉された。続いて、マグネットスタンド（タカラバイオ社）を用いて、抗ＨＥＲ２抗体修飾磁気粒子及びＳＰＲＩ磁気粒子を回収した。
《核酸標識抗ＨＥＲ２抗体の反応》
　続いて、回収した抗ＨＥＲ２抗体修飾磁気粒子及びＳＰＲＩ磁気粒子に、核酸標識抗ＨＥＲ２抗体を反応させた。この結果、抗ＨＥＲ２抗体修飾磁気粒子に捕捉されたＨＥＲ２タンパク質に核酸標識抗ＨＥＲ２抗体が結合した。続いて、各磁気粒子を洗浄し、マグネットスタンド（タカラバイオ社）を用いて回収した。
《反応液との懸濁》
　回収した各磁気粒子に下記表１に示す組成の反応液を懸濁し、反応混合溶液を調製した。この反応液は、ＳＰＲＩ磁気粒子から捕捉した核酸を溶出させる作用を有するとともに、ＩＣＡ反応により、核酸標識抗ＨＥＲ２抗体に結合した核酸（配列番号２）及びＥｒｂＢ２遺伝子断片（配列番号１）を検出することができる。表１中、アレルプローブ及びＩＣＡオリゴはファスマック社より入手した。ＦＲＥＴカセットは、日本バイオサービス社より入手した。ＴＫＯ－ＦＥＮは、ニッポンジーン社より入手した。
《反応混合溶液の送液》
　ウェルアレイを有する流体デバイスに、上記反応混合溶液を送液し、各ウェルに導入した。続いて、封止液としてＦＣ－４０（シグマアルドリッチ社）を送液し、各ウェルを封止した。これにより、１ウェル当たり１個以下のＨＥＲ２タンパク質又はＥｒｂＢ２遺伝子断片がウェル内に封止された。
《ＩＣＡ》
　上記流体デバイスをホットプレート（タイテック社）上にセットし、６６℃で２５分間反応させた。これにより、ＥｒｂＢ２検出用アレルプローブ及びＥｒｂＢ２検出用ＩＣＡオリゴによるＥｒｂＢ２遺伝子断片の認識、ＴＫＯ－ＦＥＮによるアレルプローブの切断、放出されたアレルプローブ断片のＥｒｂＢ２検出用ＦＲＥＴカセットへの結合、ＴＫＯ－ＦＥＮによるＥｒｂＢ２検出用ＦＲＥＴの切断、及びＲｅｄｍｏｎｄ　Ｒｅｄの蛍光シグナルの発生が起こる。また、同様に、ＨＥＲ２検出用アレルプローブ及びＨＥＲ２検出用ＩＣＡオリゴによるＨＥＲ２遺伝子断片の認識、ＴＫＯ－ＦＥＮによるアレルプローブの切断、放出されたアレルプローブ断片のＨＥＲ２検出用ＦＲＥＴカセットへの結合、ＴＫＯ－ＦＥＮによるＨＥＲ２検出用ＦＲＥＴの切断、及びＡｌｅｘａ４８８の蛍光シグナルの発生が起こる。
《ウェルの明視野観察及び蛍光観察》
　６６℃で２５分間加熱した後、蛍光顕微鏡ＢＺ－７１０（ＫＥＹＥＮＣＥ社）で１０倍の対物レンズを用いて流体デバイスにおける各ウェルの明視野画像及び蛍光画像を撮影した。図８は、撮影した顕微鏡画像である。上段はタンパク質及びＤＮＡを添加していない血清（陰性対照）の結果であり、下段はタンパク質及びＤＮＡを添加した血清の結果である。また、左は明視野画像であり、中央はＨＥＲ２タンパク質の存在を示すＡｌｅｘａ４８８の蛍光を検出した画像であり、右はＥｒｂＢ２遺伝子断片の存在を示すＲｅｄｍｏｎｄ　Ｒｅｄの蛍光を検出した画像である。
　その結果、陰性対照では視野内に存在するＡｌｅｘａ４８８陽性のウェルの数は８９個であったのに対し、タンパク質及びＤＮＡを添加した血清ではＡｌｅｘａ４８８陽性のウェルの数は６５９個であった。また、陰性対照では視野内に存在するＲｅｄｍｏｎｄ　Ｒｅｄ陽性のウェルの数は４個であったのに対し、タンパク質及びＤＮＡを添加した血清ではＲｅｄｍｏｎｄ　Ｒｅｄ陽性のウェルの数は５５０個であった。この結果は、本実験例により、血清中のタンパク質及びＤＮＡを同一デバイス上で検出できたことを示す。
［実施例２］
（反応液の検討）
　ＳＰＲＩ磁気粒子から捕捉した核酸を溶出させる作用を有するとともに、ＩＣＡ反応を行う反応液の組成を検討した。下記表２に示す様々な組成の反応液を調製した。表２におけるｐＨは、２５℃で測定した際の値である。調製した反応液は、１４４種類であった。実験はｎ＝２で行った。
　各反応液を、９６ウェルプレートに２０μＬ／ウェルずつ分注し、ライトサイクラーＬＣ４８０（ロシュ）を用いてＩＣＡ反応を測定した。ライトサイクラーの温度条件は、６５℃一定とした。
　続いて、以下の評価基準により、反応液がＩＣＡ反応によりＤＮＡを検出する機能を維持できているか否かを評価した。
（評価基準）
　シグナル輝度４００以上
　ノイズ輝度２５０以下
　シグナル：ノイズ比（Ｓ／Ｎ）２以上
　その結果、実験した全ての反応液で評価基準が満たされた。この結果から、マグネシウムイオン濃度５～２５ｍＭ、ＥＤＴＡ濃度０．０１～０．０５ｍＭ、トリスヒドロキシメチルアミノメタン濃度１０～５０ｍＭ、ｐＨ７．５～８．５の範囲の反応液であれば、ＳＰＲＩ磁気粒子から捕捉した核酸を溶出させる作用を有するとともに、ＩＣＡ反応を行うことができることが示された。
　もう一つの側面として、本発明は以下の態様を包含する。
　［１４］試料中の複数種類の標的分子を標的分子捕捉担体に結合させることと、前記試料から前記標的分子が結合している前記標的分子捕捉担体を分離することと、分離した前記標的分子捕捉担体を反応液に懸濁することと、前記反応液をウェルアレイのウェルに導入することと、封止液により前記ウェルを封止することと、前記ウェル中の前記複数種類の標的分子を前処理することと、前記ウェル中の前記複数種類の標的分子をＩｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙによりそれぞれ検出することと、を含み、前記反応液は、前記前処理及び前記Ｉｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙが阻害されないよう調整されている、標的分子の検出方法。
　［１５］前記標的分子捕捉担体が磁性粒子であり、前記分離することを磁気により行う、［１４］に記載の標的分子の検出方法。
　［１６］前記標的分子捕捉担体がＳｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ　ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ粒子を含む、［１４］又は［１５］に記載の標的分子の検出方法。
　［１７］前記ウェルの容積が１０ｆＬ～１００ｐＬである、［１４］～［１６］のいずれか一項に記載の標的分子の検出方法。
　［１８］前記反応液は、前記反応液の総体積に対して５～２５ｍＭのマグネシウムイオンを含む、［１４］～［１７］のいずれか一項に記載の標的分子の検出方法。
　［１９］前記反応液は、前記反応液の総体積に対して０．０１～０．０５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を含む、請求項［１４］～［１８］のいずれか一項に記載の標的分子の検出方法。
　［２０］前記反応液は、前記反応液の総体積に対して１０～５０ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタンを含む、［１４］～［１９］のいずれか一項に記載の標的分子の検出方法。
　［２１］前記反応液のｐＨは、２５℃における７．５～８．５である、［１４］～［２０］のいずれか一項に記載の標的分子の検出方法。
　［２２前記標的分子捕捉担体が第１の標的分子捕捉担体と第２の標的分子捕捉担体を含み、前記複数種類の標的分子が第１の標的分子と第２の標的分子を含み、前記第１の標的分子が前記第１の標的分子捕捉担体と結合し、前記第２の標的分子が前記第２の標的分子捕捉担体と結合する、［１４］～［１２１］のいずれか一項に記載の標的分子の検出方法。
　［２３］前記複数種類の標的分子が第１の標的分子と第２の標的分子を含み、前記標的分子捕捉担体が前記第１の標的分子と前記第２の標的分子と結合する、［１４］～［２２］のいずれか一項に記載の標的分子の検出方法。
　［２４］前記複数種類の標的分子は、タンパク質を含む、［１４］～［２３］のいずれかに記載の方法。
　［２５］前記試料が細胞を含み、さらに、前記分離工程（ａ）の前に前記細胞を溶解する工程を含む、［１４］～［２４］のいずれかに記載の方法。
　［２６］前記複数種類の標的分子は、ＨＥＲ２タンパク質とＥｒｂＢ２遺伝子を含む、［１４］～［２５］のいずれかに記載の方法。
　本発明によれば、複数種類の標的分子を同一のデバイス上で検出する技術を提供することができる。
　１４１，１７１…一本鎖核酸断片、１５０…二本鎖核酸（二本鎖核酸領域）、２００，５００…流体デバイス、２１０…基板、２２０…蓋部材、２２１…凸部、２２２…導入ポート、２２３…排出ポート、２３０…流路、２４１，２４２，２４２Ｒ…ウェル（微小区画）、２４０…ウェルアレイ、５１０…壁部材、８１０…アレルプローブ、８１１，８２１…フラップ部位（核酸断片）、８２０…核酸断片。

Claims (13)

  1. 　試料中の複数種類の標的分子を同一のウェルアレイ上で検出する方法であって、
    　前記複数種類の標的分子を、標的分子捕捉担体に結合させ、前記試料から前記標的分子が結合している前記標的分子捕捉担体を分離する工程（ａ）と、
    　分離した前記標的分子捕捉担体を反応液に懸濁し、前記ウェルアレイのウェルに導入する工程（ｂ）と、
    　封止液により前記ウェルを封止する工程（ｃ）と、
    　前記ウェル中の前記複数種類の標的分子を前処理する工程（ｄ）と、
    　前記ウェル中の前記複数種類の標的分子をＩｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）によりそれぞれ検出する工程（ｅ）と、を含み、
    　前記複数種類の標的分子が少なくとも核酸を含み、
    　前記前処理が、前記核酸の前記標的分子捕捉担体からの解離、又は前記核酸の相補鎖への転写を含み、
    　前記反応液は、前記前処理及び前記ＩＣＡを、互いに阻害せずに行うためのものである、方法。
  2. 　前記標的分子捕捉担体が磁性粒子であり、
    　前記分離を磁気により行う、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記標的分子捕捉担体がＳｏｌｉｄ－ｐｈａｓｅ　ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ＳＰＲＩ）粒子を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記ウェルの容積が１０ｆＬ～１００ｐＬである、請求項１又は２に記載の方法。
  5. 　前記反応液は、５～２５ｍＭのマグネシウムイオンを含む、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 　前記反応液は、０．０１～０．０５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  7. 　前記反応液は、１０～５０ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタンを含む、請求項１又は２に記載の方法。
  8. 　前記反応液の２５℃におけるｐＨは、７．５～８．５である、請求項１又は２に記載の方法。
  9. 　前記標的分子捕捉担体は、第１の標的分子捕捉担体と第２の標的分子捕捉担体を含み、
    　前記複数種類の標的分子は、第１の標的分子と第２の標的分子を含み、
    　前記第１の標的分子は、前記第１の標的分子捕捉担体と結合し、
    　前記第２の標的分子は、前記第２の標的分子捕捉担体と結合する、請求項１又は２に記載の方法。
  10. 　前記複数種類の標的分子は、タンパク質を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  11. 　前記試料が細胞を含み、
    　さらに、前記分離する工程（ａ）の前に前記細胞を溶解する工程を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  12. 　前記複数種類の標的分子は、ＨＥＲ２タンパク質とＥｒｂＢ２遺伝子を含む、請求項１又は２に記載の方法。
  13. 　試料中の複数種類の標的分子を同一のウェルアレイ上で検出する方法であって、
    　前記複数種類の標的分子を、標的分子捕捉担体に結合させ、前記試料から前記標的分子が結合している前記標的分子捕捉担体を分離する工程（ａ）と、
    　分離した前記標的分子捕捉担体を反応液に懸濁し、前記ウェルアレイのウェルに導入する工程（ｂ）と、
    　封止液により前記ウェルを封止する工程（ｃ）と、
    　前記ウェル中の前記複数種類の標的分子を前処理する工程（ｄ）と、
    　前記ウェル中の前記複数種類の標的分子をＩｎｖａｓｉｖｅ　Ｃｌｅａｖａｇｅ　Ａｓｓａｙ（ＩＣＡ）によりそれぞれ検出する工程（ｅ）と、を含み、
    　前記複数種類の標的分子が少なくとも核酸を含み、
    　前記前処理が、前記核酸の前記標的分子捕捉担体からの解離、又は前記核酸の相補鎖への転写を含み、
    　前記反応液は、５～２５ｍＭのマグネシウムイオンと、０．０１～０．０５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸と、１０～５０ｍＭのトリスヒドロキシメチルアミノメタンを含み、
    　前記反応液の２５℃におけるｐＨは、７．５～８．５であり、標的分子はＨＥＲ２タンパク質とＥｒｂＢ２遺伝子である、方法。
PCT/JP2025/019685 2024-06-06 2025-05-30 複数種類の標的分子を検出する方法 Pending WO2025254035A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2024092616 2024-06-06
JP2024-092616 2024-06-06

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2025254035A1 true WO2025254035A1 (ja) 2025-12-11

Family

ID=97961152

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2025/019685 Pending WO2025254035A1 (ja) 2024-06-06 2025-05-30 複数種類の標的分子を検出する方法

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2025254035A1 (ja)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023106482A (ja) * 2017-11-17 2023-08-01 凸版印刷株式会社 標的分子の検出方法
JP2024010679A (ja) * 2022-07-01 2024-01-25 Ｔｏｐｐａｎホールディングス株式会社 検出装置

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023106482A (ja) * 2017-11-17 2023-08-01 凸版印刷株式会社 標的分子の検出方法
JP2024010679A (ja) * 2022-07-01 2024-01-25 Ｔｏｐｐａｎホールディングス株式会社 検出装置

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HELENA C. ZEC, TONY ZHENG, LINGSHU LIU, KUANGWEN HSIEH, TUSHAR D. RANE, TODD PEDERSON, TZA-HUEI WANG: "Programmable microfluidic genotyping of plant DNA samples for marker-assisted selection", MICROSYSTEMS & NANOENGINEERING, vol. 4, pages 17097, XP055498037, DOI: 10.1038/micronano.2017.97 *
LIN HUIXIAN; LI BO; GUO JINGYUN; MAI XUEYING; YU HAIYANG; PAN WEILUN; WU BODENG; LIU WEI; ZHONG MINGZHEN; LIAO TONG; ZHANG YE; SIT: "Simultaneous detection of membrane protein and mRNA at single extracellular vesicle level by droplet microfluidics for cancer diagnosis", JOURNAL OF ADVANCED RESEARCH, vol. 73, 26 August 2024 (2024-08-26), NL, pages 645 - 657, XP087797804, ISSN: 2090-1232, DOI: 10.1016/j.jare.2024.08.026 *
YUYAMA KOHEI, SUN HUI, IGARASHI YASUYUKI, MONDE KENJI, HIRASE TAKUMI, NAKAYAMA MASATO, MAKINO YOICHI: "Immuno-digital invasive cleavage assay for analyzing Alzheimer’s amyloid ß-bound extracellular vesicles", ALZHEIMER'S RESEARCH & THERAPY, vol. 14, no. 1, UK, XP093231003, ISSN: 1758-9193, DOI: 10.1186/s13195-022-01073-w *
牧野洋一ほか, 生体分子のデジタル計測技術開発, 日本印刷学会誌, 2017, vol. 54, no. 6, pp. 377-382, (MAKINO, Yoichi et al., Development of Digital Biomolecule Detection System, Journal of Printing Science and Technology) *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3712275B1 (en) Target molecule detection method
US20190241948A1 (en) Biomolecule analysis method
US20240033739A1 (en) Fluidic devices with bead well geometries with spatially separated bead retention and signal detection segments and related methods
WO2012019765A1 (en) Methods and systems for tracking samples and sample combinations
US20230348898A1 (en) Compositions, methods, and systems for single cell barcoding and sequencing
JP2018531369A6 (ja) 空間的に分離してビーズを保持するビーズウェル形状及びシグナル検出セグメントを有する流体デバイス並びに関連する方法
CN113825842A (zh) 靶分子的检测方法
WO2024085132A1 (ja) 生体物質処理方法及び反応検出方法並びに生体物質処理装置及び反応検出装置
US20250164470A1 (en) Evaluation method, complex, and kit
JP2025188101A (ja) 検出方法
WO2023080137A1 (ja) 標的物質の検出方法
JP7831518B2 (ja) ウェルに液体を導入する方法
US20260009067A1 (en) Method and kit for detecting target rna
JP7797508B2 (ja) マイクロ流体方法及びシステム
EP4521119A1 (en) Detection kit, sealing liquid, method for preserving sealing liquid, and method for detecting sample
US20250352999A1 (en) Fluidic device, and method for detecting target molecule
EP4726054A1 (en) Method for detecting target substance in sample, and kit therefor

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 25819793

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1