WO2025249491A1 - ハイポブラスト幹細胞の製造方法、ハイポブラスト幹細胞の誘導用培地、ハイポブラスト幹細胞、卵黄嚢オルガノイドの製造方法、及び卵黄嚢オルガノイド - Google Patents

ハイポブラスト幹細胞の製造方法、ハイポブラスト幹細胞の誘導用培地、ハイポブラスト幹細胞、卵黄嚢オルガノイドの製造方法、及び卵黄嚢オルガノイド

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WO2025249491A1
WO2025249491A1 PCT/JP2025/019383 JP2025019383W WO2025249491A1 WO 2025249491 A1 WO2025249491 A1 WO 2025249491A1 JP 2025019383 W JP2025019383 W JP 2025019383W WO 2025249491 A1 WO2025249491 A1 WO 2025249491A1
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hypoblast
stem cells
medium
yolk sac
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隆博 有馬
寛明 岡江
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Tohoku University NUC
Kumamoto University NUC
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Tohoku University NUC
Kumamoto University NUC
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing hypoblast stem cells, a medium for inducing hypoblast stem cells, hypoblast stem cells, a method for producing yolk sac organoids, and yolk sac organoids.
  • Human preimplantation embryos are composed of three types of cells: the epiblast, which contributes to the future fetus; the trophectoderm, which contributes to the placenta; and the hypoblast, which contributes to the yolk sac.
  • Embryonic stem cells ES cells
  • TS cells Trophoblast stem cells
  • Non-Patent Document 1 primitive endoderm stem cells (PrES cells) have been reported as cells capable of differentiating into yolk sac cells (Non-Patent Document 1). It has also been reported that hypoblast-like cells have been induced from human pluripotent stem cells (Non-Patent Document 2).
  • hypoblast stem cells In addition to ES cells and TS cells, if it were possible to establish hypoblast stem cells with the ability to differentiate into yolk sac cells, this would be useful for basic research into early mammalian development, testing the effects of drugs on fetuses during early pregnancy, and assisted reproductive technology.
  • Non-Patent Document 1 mouse PrES cells are induced by culturing mouse blastocysts in the presence of fibroblast growth factor 4 (FGF4), platelet-derived growth factor (PDGF), and a GSK3 ⁇ inhibitor.
  • FGF4 fibroblast growth factor 4
  • PDGF platelet-derived growth factor
  • GSK3 ⁇ inhibitor a GSK3 ⁇ inhibitor
  • Non-Patent Document 2 hypoblast-like cells are induced by culturing human pluripotent stem cells in the presence of FGF4, bone morphogenetic protein 4 (BMP4), interleukin 6 (IL-6), PDGF, a Wnt inhibitor, and a TGF ⁇ /SMAD inhibitor.
  • BMP4 bone morphogenetic protein 4
  • IL-6 interleukin 6
  • PDGF a Wnt inhibitor
  • TGF ⁇ /SMAD inhibitor e.g., six months or more.
  • the objective of the present disclosure is to provide a method for producing hypoblast stem cells that is applicable to humans and enables the production of hypoblast stem cells that can be maintained through long-term culture, a medium for inducing hypoblast stem cells that can be used in the production method, hypoblast stem cells produced by the production method, a method for producing yolk sac organoids using the hypoblast stem cells, and yolk sac organoids containing the hypoblast stem cells.
  • the present disclosure includes the following aspects.
  • a method for producing hypoblast stem cells comprising a step of culturing cells isolated from a mammalian yolk sac in a medium containing an epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, and a ROCK inhibitor.
  • the method for producing hypoblast stem cells described in (1) wherein the culture medium further contains a TGF ⁇ /SMAD inhibitor.
  • the medium further contains at least one selected from the group consisting of an HDAC inhibitor and a p38 inhibitor.
  • a medium for inducing hypoblast stem cells comprising an epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, and a ROCK inhibitor.
  • the medium for inducing hypoblast stem cells according to (4) further containing a TGF ⁇ /SMAD inhibitor.
  • the medium for inducing hypoblast stem cells according to (4) or (5) further comprising at least one selected from the group consisting of an HDAC inhibitor and a p38 inhibitor.
  • Hypoblast stem cells having the following characteristics (a) to (e): (a) Cells derived from cells isolated from mammalian yolk sacs; (b) expressing a lower amount of alpha-fetoprotein compared to cells isolated from the mammalian yolk sac; (c) having the ability to differentiate into yolk sac organoids containing cells expressing at least one selected from the group consisting of alpha-fetoprotein and albumin; (d) having the ability to proliferate; and (e) forming cell clusters. (9) Hypoblast stem cells according to (8), which can be maintained in culture for 6 months or more by subculturing in a medium for inducing hypoblast stem cells according to any one of (4) to (7).
  • a yolk sac organoid comprising the hypoblast stem cells according to any one of (8) to (10).
  • the present disclosure provides a method for producing hypoblast stem cells that is applicable to humans and capable of producing hypoblast stem cells that can be maintained through long-term culture, a medium for inducing hypoblast stem cells that can be used in the method, hypoblast stem cells produced by the method, a method for producing yolk sac organoids using the hypoblast stem cells, and yolk sac organoids containing the hypoblast stem cells.
  • 1 shows a phase-contrast microscope image of hypoblast stem cells obtained in Experimental Example 1.
  • 1 shows a phase contrast microscope image (left) and an immunofluorescence stained image (right) of the yolk sac organoid obtained in Experimental Example 2.
  • 1 shows the expression levels of ⁇ -fetoprotein (AFP) obtained from RNA-seq analysis of hypoblast stem cells (HS cells) and yolk sac organoids (HS organoids) in Experimental Example 3.
  • 1 shows the expression levels of albumin obtained from RNA-seq analysis of hypoblast stem cells (HS cells) and yolk sac organoids (HS organoids) in Experimental Example 3.
  • gene expression data from RNA-seq analysis of hypoblast stem cells (HS cells) and yolk sac organoids (HS organoids) was analyzed using UMAP.
  • the cell classification was obtained from a previous study (Issac Goh et al., Science. 2023 Aug 18;381(6659):eadd7564. doi: 10.1126/science.add7564.).
  • gene expression data from single-cell RNA-seq analysis of hypoblast stem cells (HS cells) and yolk sac organoids (HS organoids) was analyzed using UMAP.
  • Cell classification was obtained from a previous study (Issac Goh et al., Science. 2023 Aug 18;381(6659):eadd7564. doi: 10.1126/science.add7564.).
  • the results of comparing gene expression between HS cells and HS organoids based on gene expression data obtained by single-cell RNA-seq analysis are shown.
  • Comprise means that it may contain components other than the target component.
  • consist of means that it does not contain components other than the target component.
  • consist essentially of means that it does not contain components other than the target component in a manner that would exert a special function (such as a manner that would completely lose the effects of the invention). In this specification, when “comprise” is used, it includes both an embodiment that "consists of” and an embodiment that "consists essentially of.”
  • a numerical range expressed using " ⁇ ” means a range that includes the numerical values written before and after " ⁇ " as the upper and lower limits. When multiple upper and lower limit values are listed for a specific parameter, any of these upper and lower limit values can be combined to create a suitable numerical range.
  • Proteins, cells, and organoids may be isolated. "Isolated” means separated from other components. An “isolated” component may be separated from its natural state. “Isolated” may be substantially free of other components. “Substantially free of other components” means that the content of other components in the isolated component is negligible. The content of other components in the isolated component may be, for example, 10% by mass or less, 5% by mass or less, 4% by mass or less, 3% by mass or less, 2% by mass or less, 1% by mass or less, 0.5% by mass or less, or 0.1% by mass or less.
  • the proteins, cells, and organoids described herein may be isolated proteins, isolated cells, and isolated organoids, respectively.
  • a first aspect of the present disclosure is a method for producing hypoblast stem cells, which includes a step of culturing cells isolated from a mammalian yolk sac in a medium containing an epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, and a ROCK inhibitor (hereinafter also referred to as a "culturing step").
  • HS cells “Hypoblast stem cells” refer to cells having the following characteristics (a) to (e). HS cells may also be cells having the following characteristics (b) to (e).
  • HS cells may also be cells having the following characteristics (b) to (e).
  • HS cells are cells induced from cells isolated from the yolk sac (hereinafter also referred to as "yolk sac cells”). HS cells can be induced by culturing cells isolated from the yolk sac in a medium containing epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, and a ROCK inhibitor. Specific examples of the culture method will be described later.
  • HS cells Compared to yolk sac cells, HS cells express a lower amount of alpha-fetoprotein (AFP).
  • the yolk sac cells used for comparison are the yolk sac cells from which HS cells are derived.
  • AFP is a yolk sac marker that is highly expressed in the yolk sac.
  • the expression level of AFP decreases. The decrease in the expression level of AFP in HS cells is thought to indicate that the HS cells have transitioned to a more undifferentiated state than yolk sac cells.
  • the expression level of AFP in yolk sac cells and HS cells can be measured by known methods. Such methods include, for example, RNA-seq analysis, quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR), Northern blotting analysis, fluorescent immunostaining, Western blotting analysis, and ELISA.
  • AFP sequence information that can be used to measure AFP expression levels can be obtained from known sequence databases such as GeneBank. For example, the sequence information for human AFP registered in GeneBank under accession numbers NM_001134.3 and NM_001354717.2 can be used. Commercially available anti-AFP antibodies can be used to measure AFP expression levels.
  • HS cells have the ability to differentiate into yolk sac organoids.
  • "Yolk sac organoids” are organoids containing cells expressing at least one selected from the group consisting of AFP and albumin (hereinafter also referred to as "AFP/Alb-expressing cells”).
  • AFP/Alb-expressing cells may be cells expressing only AFP, cells expressing only albumin, or cells expressing both AFP and albumin.
  • yolk sac organoids are mainly composed of AFP/Alb-expressing cells.
  • yolk sac organoids are composed of AFP/Alb-expressing cells, with 50% or more, 60% or more, 70% or more, 80% or more, 90% or more, or 95% or more of the total cells being AFP/Alb-expressing cells.
  • AFP and albumin in yolk sac organoids can be measured by known methods such as those described above.
  • AFP sequence information that can be used to measure the expression levels of AFP and albumin can be obtained from known sequence databases such as GeneBank.
  • sequence information for human albumin registered in GeneBank under accession number NM_000477.7 can be used.
  • Commercially available anti-albumin antibodies can be used to measure the expression levels of albumin.
  • the expression levels of AFP and albumin in yolk sac organoids are similar to those of the yolk sac from which the HS cells are derived.
  • the relative expression level of AFP in yolk sac organoids is preferably 0.1 or more, 0.2 or more, 0.5 or more, 0.6 or more, or 0.7 or more.
  • the upper limit of the relative expression level of AFP in yolk sac organoids is, for example, 10.0 or less, 9.0 or less, 8.0 or less, 7.0 or less, 6.0 or less, 5.0 or less, 4.0 or less, 3.0 or less, or 2.0 or less.
  • the relative expression level of albumin in yolk sac organoids is preferably 0.1 or more, 0.2 or more, 0.5 or more, 0.6 or more, or 0.7 or more.
  • the upper limit of the relative expression level of albumin in the yolk sac organoid is, for example, 10.0 or less, 9.0 or less, 8.0 or less, 7.0 or less, 6.0 or less, 5.0 or less, 4.0 or less, 3.0 or less, or 2.0 or less.
  • yolk sac organoids are composed of cells with gene expression patterns similar to those of the yolk sac.
  • the cells are located in the same cluster as the yolk sac.
  • Whether or not cells have the ability to differentiate into yolk sac organoids can be confirmed by culturing the cells to be evaluated in a hydrogel. If the cells to be evaluated have the ability to differentiate into organoids, organoids are formed by culturing them in the hydrogel for approximately 5 to 20 days. If the formed organoids contain AFP/Alb cells, the organoids can be determined to be yolk sac organoids. If the formed organoids are yolk sac organoids, the cells can be determined to have the ability to differentiate into yolk sac organoids. Details of the method for forming yolk sac organoids from HS cells will be described below.
  • HS cells have the ability to proliferate.
  • media capable of proliferating HS cells include media containing epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, and a ROCK inhibitor. Specific examples of such media include the media for inducing hypoblast stem cells described below.
  • the conditions for culturing HS cells can be the same as those normally used for culturing animal cells.
  • culture temperatures include 32 to 40°C (preferably 35 to 38°C, typically 37°C).
  • CO2 concentrations include 2 to 5% (preferably 5%).
  • HS cells can be cultured as adhesion culture using a culture substrate such as laminin.
  • culture substrate refers to a substance that serves as a scaffold for cell adhesion during cell culture. Examples of culture substrates include extracellular matrices.
  • HS cells can also be said to be cells that can proliferate when cultured in the presence of a culture substrate at 37°C and 5% CO2 using a medium containing epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, and a ROCK inhibitor.
  • a culture substrate at 37°C and 5% CO2 using a medium containing epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, and a ROCK inhibitor.
  • the size of the cell clusters described in (e) below increases. Therefore, HS cell proliferation can be confirmed by the increase in the size of the cell clusters.
  • HS cells form cell clusters. More specifically, when HS cells are cultured in a medium containing an epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, and a ROCK inhibitor, they form spherical cell clusters as shown in FIG. 1 .
  • the size of the cell clusters is, for example, about 20 to 200 ⁇ m in minimum diameter.
  • the maximum diameter of the cell clusters is, for example, about 20 to 200 ⁇ m.
  • HS cells can also be said to be cells that can form cell masses when cultured in a medium containing an epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, and a ROCK inhibitor in the presence of a culture substrate at 37°C and 5% CO2 .
  • the HS cells preferably have the following characteristic (f): (f) Maintenance culture for 6 months or more is possible by subculturing in a medium containing an epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, and a ROCK inhibitor.
  • An example of a medium containing an epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, and a ROCK inhibitor is the medium for inducing hypoblast stem cells described below.
  • the culture conditions for subculture can be the same as those typically used for culturing animal cells.
  • the culture temperature can be the same as the culture conditions listed in (d) above.
  • Subculture may be performed, for example, every 3 to 10 days, or when the culture vessel becomes confluent.
  • HS cells can be subcultured using methods commonly used for subculture of animal cells. For example, a proteolytic enzyme (e.g., trypsin, trypsin substitute, etc.) is added, and the cells are detached from the culture vessel by pipetting or other methods. At this time, cell clumps may be dispersed into free cells. The detached cells are recovered by centrifugation or other methods. The recovered cells can be subcultured by seeding them in new medium.
  • a proteolytic enzyme e.g., trypsin, trypsin substitute, etc.
  • the HS cells are preferably cells that can be maintained in culture for 6 months or more by subculturing them in a medium containing an epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, and a ROCK inhibitor in the presence of a culture substrate at 37°C and 5% CO2.
  • Maintenance culture refers to culturing cells while maintaining their properties. HS cells maintain the characteristics (a) to (e) above during maintenance culture.
  • HS cells vary depending on the organism from which the yolk sac cells are derived.
  • HS cells induced from human yolk sac cells have a cell diameter of approximately 10-50 ⁇ m.
  • the mammal from which the yolk sac cells are derived is a mammal that has a yolk sac at the time of conception.
  • mammals include humans and non-human mammals.
  • non-human mammals include, but are not limited to, non-human primates (monkeys, chimpanzees, gorillas, marmosets, etc.), rodents (mice, hamsters, rats, guinea pigs, etc.), rabbits, dogs, cats, cows, pigs, goats, sheep, horses, etc.
  • the mammal from which the yolk sac cells are derived is preferably a primate, and more preferably a human.
  • Yolk sac cells are cells isolated from the yolk sac.
  • a cultured line of cells isolated from the yolk sac may also be used as the yolk sac cells.
  • the yolk sac may be extracted, for example, from a mammal in the early stages of pregnancy. When the mammal is a human, yolk sacs extracted by surgical abortion may also be used.
  • Yolk sac cells can be isolated, for example, by separating the cells by appropriately using mechanical and/or enzymatic treatment of the yolk sac.
  • Mechanical treatment includes cutting with scissors or a scalpel.
  • Enzymatic treatment includes treatment with proteolytic enzymes (trypsin, etc.) and proteases with extracellular matrix degrading activity (e.g., dispase, collagenase, etc.).
  • proteolytic enzymes trypsin, etc.
  • proteases with extracellular matrix degrading activity e.g., dispase, collagenase, etc.
  • yolk sac cells can be collected using centrifugation, a strainer, a filter, or the like.
  • the collected yolk sac cells may be washed with medium (TS medium, etc.), buffer (phosphate-buffered saline (PBS, etc.), etc.), as appropriate.
  • ⁇ Culture medium examples include a medium obtained by adding an epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, a ROCK inhibitor, and the like to a basal medium.
  • basal media include media commonly used for culturing animal cells.
  • basal media include Doulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, DMEM/F12 medium, Advanced DMEM/F12 medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Ham's F12 medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, and mixed media of two or more of these.
  • DMEM/F12 Doulbecco's modified Eagle's Medium
  • DMEM/F12 DMEM/F12 medium
  • Advanced DMEM/F12 medium Advanced DMEM/F12 medium
  • IMDM medium Medium 199 medium
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • RPMI 1640 Ham's F12 medium
  • Fischer's medium Fischer's medium
  • the basal medium may contain serum (such as fetal bovine serum (FBS)) and/or serum substitutes as needed.
  • serum substitutes include albumin, transferrin, sodium selenite, ITS-X (Invitrogen), Knockout Serum Replacement (KSR), N2 supplement (Invitrogen), B27 supplement (Invitrogen), fatty acids, insulin, collagen precursors, trace elements, 2-mercaptoethanol, and 3'-thiolglycerol.
  • the basal medium may contain components such as lipids, amino acids, L-glutamine, Glutamax, non-essential amino acids, vitamins, growth factors, antibiotics, antioxidants, pyruvic acid, buffers, and inorganic salts as needed. These can be used in appropriate combinations.
  • a basal medium is a medium obtained by adding bovine serum albumin (BSA), ITS-X, a serum substitute (such as KSR), and an antibiotic (such as penicillin or streptomycin) to the above-mentioned basal medium (e.g., DMEM/F12).
  • BSA bovine serum albumin
  • ITS-X ITS-X
  • KSR serum substitute
  • antibiotic such as penicillin or streptomycin
  • DMEM/F12 a specific example of a basal medium.
  • EGF Epidermal growth factor
  • EGFR EGF receptors
  • the organism from which EGF is derived is not particularly limited, but is preferably the same as the organism from which yolk sac cells are derived. When human yolk sac cells are used, human EGF is preferred. Human EGF may also be a recombinant form produced by non-human cells. Commercially available EGF can be used.
  • the concentration of EGF in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 5 to 200 ng/mL.
  • the concentration of EGF in the medium is preferably 10 to 150 ng/mL, more preferably 10 to 100 ng/mL, even more preferably 10 to 80 ng/mL, and particularly preferably 10 to 60 ng/mL.
  • GSK (Glycogen Synthase Kinase) 3 ⁇ inhibitors are substances that inhibit the function of GSK3 ⁇ , for example, its kinase activity (for example, its ability to phosphorylate ⁇ -catenin).
  • GSK3 ⁇ inhibitors include 6-[[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]nicotinonitrile, Kenpaullone, 1-Azakenpaullone, CHIR98014, AR-A014418, and CT9902.
  • GSK3 ⁇ inhibitors may be antisense nucleic acids, siRNA, dominant-negative mutants, and expression vectors thereof against GSK3 ⁇ .
  • Commercially available products of 6-[[2-[[4-(2,4-dichlorophenyl)-5-(4-methyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]ethyl]amino]nicotinonitrile include CHIR99021.
  • GSK3 ⁇ inhibitors may be used singly or in combination of two or more. The GSK3 ⁇ inhibitor used is preferably CHIR99021.
  • the concentration of the GSK3 ⁇ inhibitor in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 0.1 to 50 ⁇ M, preferably 0.2 to 30 ⁇ M, more preferably 0.5 to 20 ⁇ M, and even more preferably 1 to 10 ⁇ M.
  • ROCK (Rho associated coiled-coil containing protein kinase: Rho-associated kinase) inhibitors are substances that inhibit the function of Rho-associated kinase.
  • ROCK inhibitors include trans-N-(4-pyridyl)-4-(1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide, 1-(5-isoquinolinylsulfonyl)homopiperazine, and salts thereof.
  • ROCK inhibitors also include small molecule inhibitors such as Fasudil/HA1077, H-1152, and Wf-536, as well as derivatives thereof.
  • the ROCK inhibitor may be an antisense nucleic acid, siRNA, dominant negative mutant, or expression vector thereof against ROCK.
  • Commercially available trans-N-(4-pyridyl)-4-(1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide or a salt thereof includes Y27632 ((R)-(+)-trans-N-(4-pyridyl)-4-(1-aminoethyl)-cyclohexanecarboxamide.2HCl.H 2 O).
  • One ROCK inhibitor may be used alone, or two or more may be used in combination.
  • the ROCK inhibitor used is preferably Y27632.
  • the concentration of the ROCK inhibitor in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 0.1 to 50 ⁇ M, preferably 0.5 to 20 ⁇ M, more preferably 1 to 15 ⁇ M, and even more preferably 1 to 10 ⁇ M.
  • the medium may contain other factors in addition to the epidermal growth factor, the GSK3 ⁇ inhibitor, and the ROCK inhibitor, such as a TGF ⁇ /SMAD inhibitor, an HDAC inhibitor, a p38 inhibitor, and nicotinamide.
  • TGF ⁇ /SMAD inhibitors are substances that inhibit the binding of TGF ⁇ to the ALK (Activin Receptor-Like Kinase) family, or substances that inhibit the phosphorylation of SMAD by the ALK family.
  • TGF ⁇ /SMAD inhibitors include substances that inhibit the kinase activity of ALK4, ALK5, ALK7, etc.
  • TGF ⁇ /SMAD inhibitors include Lefty-1 (NCBI accession numbers: mouse: NP_034224.1, human: NP_066277.1), SB431542, SB202190 (R.K. Lindemann et al., Mol.
  • the TGF ⁇ /SMAD inhibitor may be an antisense nucleic acid against the ALK family, an RNA interference-inducing nucleic acid (e.g., siRNA), a dominant-negative mutant, an expression vector thereof, or the like.
  • the TGF ⁇ /SMAD inhibitor may be used alone or in combination of two or more. It is preferable to use A83-01 as the TGF ⁇ /SMAD inhibitor.
  • the concentration of the TGF ⁇ /SMAD inhibitor in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 0.1 to 50 ⁇ M, preferably 0.5 to 20 ⁇ M, more preferably 1 to 15 ⁇ M, and even more preferably 1 to 10 ⁇ M.
  • HDAC (histone deacetylase) inhibitors are substances that inhibit the function of histone deacetylase.
  • the HDAC inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress the function of HDAC.
  • HDAC inhibitors include small molecule inhibitors such as valproic acid (VPA), trichostatin A, sodium butyrate, MC1293, and M344.
  • HDAC inhibitors may be antisense nucleic acids, siRNA, dominant-negative mutants, and expression vectors thereof against HDAC.
  • One HDAC inhibitor may be used alone, or two or more may be used in combination.
  • the HDAC inhibitor is preferably VPA.
  • the concentration of the HDAC inhibitor in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 0.01 to 10 ⁇ M, preferably 0.05 to 5 ⁇ M, more preferably 0.1 to 2 ⁇ M, and even more preferably 0.5 to 1 ⁇ M.
  • p38 inhibitors are substances that inhibit the function of p38 MAPK (P38 mitogen-activated protein kinase).
  • Examples of p38 inhibitors include SB202190 (4-(4-fluorophenyl)-2-(4-hydroxyphenyl)-5-(4-pyridyl)-1H-imidazole), SB203580 (4-[4-(4-fluorophenyl)-2-[4-(methylsulfinyl)phenyl]-1H-imidazol-5-yl]pyridine), VX702 (6-(N-carbamoyl-2,6-difluoroanilino)-2-(2,4-difluorophenyl)pyridine-3-carboxamide), and VX745 (5-(2,6-dichlorophenyl)-2-[2,4-difluorophenyl)thio]-6H-pyrimido[ 1,6-b]pyridazine-6-one), PD169316
  • the p38 inhibitor may be an antisense nucleic acid, siRNA, dominant-negative mutant, or expression vector thereof against p38 MAPK.
  • the p38 inhibitor may be used alone or in combination of two or more.
  • the p38 inhibitor used is preferably SB202190.
  • the concentration of the p38 inhibitor in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 0.01 to 50 ⁇ M, preferably 0.1 to 20 ⁇ M, more preferably 0.5 to 10 ⁇ M, and even more preferably 0.5 to 5 ⁇ M.
  • the medium may contain nicotinamide in addition to the above components.
  • concentration of nicotinamide in the medium is not particularly limited, but can be, for example, 0.01 to 500 nM, preferably 0.1 to 100 nM, more preferably 0.5 to 50 nM, and even more preferably 1 to 30 nM.
  • the media include media containing epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, and a ROCK inhibitor; media containing epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, a ROCK inhibitor, and a TGF ⁇ /SMAD inhibitor; media containing epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, and a ROCK inhibitor, as well as at least one selected from the group consisting of an HDAC inhibitor and a p38 inhibitor; media supplemented with epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, a ROCK inhibitor, and a TGF ⁇ /SMAD inhibitor, as well as at least one selected from the group consisting of an HDAC inhibitor and a p38 inhibitor; epidermal growth factor
  • suitable media include a medium containing an epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, a ROCK inhibitor, and an HDAC inhibitor; a medium containing an epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, a ROCK inhibitor, and a p38 inhibitor; a medium containing an epi
  • the media may further contain nicotinamide.
  • the media may also contain the above-mentioned factors in a basal medium (e.g., TS basal medium).
  • a basal medium e.g., TS basal medium.
  • Specific examples of media include YS-2D medium, YS medium, YS-2D-3 medium, and YS-2D-5 medium, which are used in the examples described below. Liquid media are preferred.
  • Culture conditions can be those generally used for culturing animal cells, such as a culture temperature of 32 to 40°C (preferably 35 to 38°C, typically 37°C) and a CO2 concentration of 2 to 5% (preferably 5%).
  • the cell seeding density at the start of culture is, for example, 10 3 to 10 7 cells/ml, or 10 4 to 10 6 cells/ml.
  • Culturing can be, for example, adhesion culture using a culture substrate.
  • culture substrates that can be used include extracellular matrices.
  • extracellular matrices include basement membrane-based extracellular matrices such as laminin, type IV collagen, heparan sulfate proteoglycan, and entactin; cartilage-based extracellular matrices such as hyaluronic acid, type II collagen, and link protein; and interstitial extracellular matrices such as type I collagen, proteoglycans (versican, decorin, etc.), and fibronectin.
  • iMatrix 511 is a preferred culture substrate.
  • the culture vessel can be any culture vessel commonly used for culturing animal cells.
  • Examples of culture vessels include well plates, culture dishes, and culture flasks.
  • the culture period can be, for example, about 2 to 60 days, about 4 to 50 days, or about 5 to 30 days.
  • Culture may be continued until the expression levels of yolk sac markers such as AFP and albumin in the cells decrease.
  • culture may be continued until the expression levels of yolk sac markers such as AFP and albumin become 1/100 or less, 1/300 or less, 1/500 or less, 1/800 or less, or 1/1000 or less compared to yolk sac cells.
  • Culturing may be carried out, for example, until the cells form cell clusters (e.g., cell clusters as shown in Figure 1).
  • Cultures may be subcultured at appropriate intervals. Subculture can be performed, for example, when the cells reach a confluent state. Subculture can be performed, for example, every 2 to 10 days, every 2 to 8 days, every 2 to 5 days, or every 2 to 4 days. When subcultured, cells may be detached by pipetting or the like. A protein enzyme such as trypsin may be used to detach the cells.
  • the medium used for subculture can be one containing epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, and a ROCK inhibitor.
  • the medium used for subculture can be the same as the medium described above in the ⁇ Culture Medium> section.
  • HS cells can be obtained by culturing yolk sac cells as described above.
  • the production method of this embodiment may include other steps in addition to the culturing step, such as recovering HS cells after the culturing step, measuring the expression level of yolk sac markers in HS cells, and observing HS cells using a phase-contrast microscope or the like.
  • HS cells can be recovered by detaching the cells by pipetting or other means, and then centrifuging the cell suspension.
  • the recovered cells can be passaged in new medium, or frozen and preserved using a cell freezing medium.
  • Commercially available cryopreservation media such as CELLBANKER (registered trademark) 1 (Xenogen Pharma) can be used as the cell freezing medium.
  • the cells can be maintained by subculture using the method described above.
  • the expression levels of yolk sac markers such as AFP and albumin may be measured for HS cells. If the expression levels of these yolk sac markers are reduced compared to yolk sac cells, it can be determined that HS cells have been induced.
  • the expression levels of yolk sac markers can be measured using known methods such as those described above.
  • HS cells may be observed for the formation of cell clusters using a phase-contrast microscope, etc. If the cells form cell clusters, it can be determined that HS cells have been induced.
  • HS cells obtained by the manufacturing method of this embodiment are thought to have the ability to differentiate into yolk sac cells. Therefore, in addition to forming yolk sac organoids (hereinafter also referred to as "HS organoids") as described below, HS cells are expected to be used as model cells for drug evaluation tests in early pregnancy, in regenerative medicine, assisted reproductive technology, etc.
  • HS organoids yolk sac organoids
  • a second aspect of the present disclosure is a medium for inducing hypoblast stem cells (hereinafter also referred to as "medium for HS cell induction”), which contains an epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, and a ROCK inhibitor.
  • the medium for inducing HS cells is the same as the medium described in the section ⁇ Culture Medium> of the (Culture Step) in the above [Method for producing hypoblast stem cells].
  • the HS cell induction medium can be used to induce HS cells from yolk sac cells.
  • HS stem cells A third aspect of the present invention relates to hypoblast stem cells (HS cells).
  • HS cells are the same as those described in the section "Method for Producing Hypoblast Stem Cells" above.
  • the HS cells are derived from cells isolated from human yolk sacs.
  • a fourth aspect of the present invention is a method for producing yolk sac organoids, which includes a step of culturing the hypoblast stem cells according to the third aspect in a hydrogel (hereinafter also referred to as a "hydrogel culture step").
  • HS cells are cultured in a hydrogel.
  • Hydrogels are polymeric materials that gel with water inside.
  • polymeric materials used in hydrogels include, but are not limited to, extracellular matrices such as collagen (type I, type II, type III, type V, type XI, etc.), gelatin, elastin, proteoglycans, glycosaminoglycans, fibronectin, vitronectin, laminin, pectin, hyaluronic acid, chitin, and chitosan; polysaccharides such as alginic acid and starch; amino acid polymers such as polylysine and polyarginine; fibrous proteins such as fibrin; and synthetic polymers such as polyethylene glycol.
  • Commercially available hydrogels such as Matrigel® (Corning) and iMatrix® (Fujifilm Wako), may also be used.
  • Culturing can be initiated by embedding HS cells in the hydrogel.
  • the HS cells may be subcultured as described above, or cryopreserved cells. If cryopreserved, the HS cells are preferably cultured in a medium containing epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, and a ROCK inhibitor before culturing in the hydrogel. Examples of the medium used in this process include the same medium as described in the "Culture Medium” section of the "Culture Step" in the "Method for Producing Hypoblast Stem Cells" section above.
  • HS cells may be detached from the culture vessel by pipetting or other means before being embedded in the hydrogel. If the HS cells have formed cell clusters, the cell clusters may be separated by pipetting or other means to obtain free cells. A protein enzyme such as trypsin may be used to detach the cells and/or separate the cell clusters.
  • the number of HS cells to be embedded in the hydrogel can be, for example, 10 3 to 10 10 cells.
  • the HS cells can be embedded, for example, at a depth of approximately 0.1 to 5 cm, or approximately 0.5 to 3 cm, from the surface of the hydrogel.
  • the hydrogel with embedded HS cells can be cultured by immersing it in an appropriate liquid medium.
  • a medium containing epidermal growth factor, a GSK3 ⁇ inhibitor, and a ROCK inhibitor examples include the same medium as described in the "Culture Medium” section of the "Culture Step” in the "Method for Producing Hypoblast Stem Cells" above.
  • Culture conditions can be those generally used for culturing animal cells, such as a culture temperature of 32 to 40°C (preferably 35 to 38°C, typically 37°C) and a CO2 concentration of 2 to 5% (preferably 5%).
  • the culture period should be long enough to allow yolk sac organoids to form.
  • the formation of yolk sac organoids can be confirmed by observation using a phase-contrast microscope, for example.
  • Culture periods can be, for example, 3 days or more, 5 days or more, 7 days or more, or 10 days or more. Culture periods can range, for example, from about 3 to 50 days, from about 5 to 50 days, from about 7 to 50 days, or from about 10 to 50 days.
  • the yolk sac organoids obtained by the manufacturing method of this embodiment are the same as the yolk sac organoids described in “Regarding (c)" in the section (Hypoblast Stem Cells) in the above [Method for Manufacturing Hypoblast Stem Cells].
  • the yolk sac organoids obtained by the manufacturing method of this embodiment have a gene expression pattern similar to that of the yolk sac, and are presumed to have functions similar to those of the yolk sac. Therefore, the yolk sac organoids are expected to be used as a model for drug evaluation tests in early pregnancy, in regenerative medicine, assisted reproductive technology, and other applications.
  • the present disclosure also provides yolk sac organoids obtained by the production method according to the fourth aspect.
  • the yolk sac organoids contain HS cells as described in the section (Hypoblast Stem Cells) in the above [Method for producing Hypoblast Stem Cells].
  • TS basal medium The composition of TS basal medium is shown in Table 4. TS basal medium was stored at 4°C and used within one month of preparation.
  • YS-2D medium The composition of YS-2D medium is shown in Table 5.
  • YS-2D medium was stored at 4°C and used within two weeks of preparation.
  • YS medium The composition of YS medium is shown in Table 6. YS medium was stored at 4°C and used within two weeks of preparation.
  • Hypoblast stem cells (hereinafter also referred to as "HS cells") were induced from human yolk sac cells according to the following procedure. (1) 1 ml of YS-2D medium and 1 ⁇ l of iMatrix 511 were added to each well of a 12-well dish. (2) The 12-well dish was kept at 37°C for at least 10 minutes. (3) Cells were suspended in YS-2D medium in each well at approximately 0.5 x 10 5 cells/well. (4) The cells were cultured at 37°C in 5 % CO2, and passaged every 3 days using YS-2D medium.
  • the cells prepared as described above could be cryopreserved using CELLBANKER (registered trademark) 1 (Xenogen Pharma).
  • the cells were passaged according to the following procedure.
  • (1) The YS-2D medium in the wells was aspirated.
  • (4) The cells were detached by pipetting.
  • the detached cells were transferred to a new tube containing 0.5 ml of TS basal medium.
  • the tube was centrifuged at approximately 380 g for 2 minutes.
  • Figure 1 shows a phase-contrast microscope image of HS cells induced by the above method.
  • the HS cells in Figure 1 were obtained by subculturing yolk sac cells in YS-2D medium for approximately one month. HS cells were used on the sixth day after the last subculture. The HS cells formed cell clusters and had a different appearance from yolk sac cells. No clear boundaries between cells were observed in the HS cell clusters. This suggested that they were cell clusters with a high cell density. The appearance of the HS cells was also different from that of previously reported mouse PrES cells (Ohinata et al. Science. 2022 Feb 4;375(6580):574-578.) and hypoblast-like cells (Okubo et al. Nature. 2024 Feb;626(7998):357-366).
  • Yolk sac organoids were passaged according to the following procedure.
  • (2) PBS and TrypLE (PBS:TrypLE 1:1; 1.5 ml/35 cm dish) were added to a 35 cm dish.
  • Using a Pipetman P200 (Gilson) the liquid in the dish was pipetted approximately 10 times.
  • the cell mass was transferred to a new 15 ml tube containing 5 ml of TS basal medium.
  • the tube was centrifuged at approximately 800 g for 2 minutes.
  • Figure 2 shows a phase-contrast microscope image (left) and an immunofluorescent staining image (right) of the organoids obtained using the above method.
  • the organoids in Figure 2 were obtained by subculturing HS cells in Matrigel for approximately one month. Organoids used were those 11 days after the last subculture. Immunofluorescent staining was performed using an anti-AFP (alpha-fetoprotein) antibody.
  • AFP is a yolk sac marker that is highly expressed in the yolk sac.
  • Yolk sac organoids induced from HS cells hereinafter also referred to as "HS organoids" highly expressed AFP.
  • RNA-seq analysis Gene expression was examined by RNA-seq analysis for the HS cells obtained in Experimental Example 1 and the HS organoids obtained in Experimental Example 2.
  • Figure 3A shows the expression levels of AFP obtained by RNA-seq analysis. Almost no AFP was expressed in HS cells. On the other hand, AFP was expressed in HS organoids.
  • Figure 3B shows the expression levels of albumin obtained by RNA-seq analysis. Albumin was barely expressed in HS cells. However, albumin was expressed in HS organoids.
  • FIG. 4 shows the results of UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) analysis of gene expression data obtained by RNA-seq analysis.
  • Yolk sac gene expression data was obtained from the data reported by Issac Goh et al. (Science. 2023 Aug 18;381(6659)).
  • the gene expression patterns of HS cells and HS organoids were similar to those of yolk sac endoderm.
  • HS cells were induced from yolk sac cells using the same method as in Experimental Example 1, except that media containing the combinations of factors shown in Table 7 were used. After 5 days of culture in each of the media in Table 7, the number of cells was counted using an automatic cell counter (Olympus Cell Counter model R1) and cell proliferation was evaluated. The results are also shown in Table 7. A “+” indicates that cell proliferation was confirmed; the more "+” there are, the greater the amount of cell proliferation. A "-” indicates that no cell proliferation was confirmed.
  • YS-2D medium was best in YS-2D medium, which contained all six factors. Cell proliferation was next best in YS medium (without VPA) and YS-2D-5 medium (without SB202190). In YS-2D-3 medium (without A83-01), HS cell clusters were observed, but cell proliferation was low. In YS-2D-1 medium (without EGF), YS-2D-2 medium (without CHIR99021), and YS-2D-4 medium (without Y27632), no cell proliferation was observed, and no HS cell clusters were observed.
  • Example 5 Long-term culture of HS cells
  • the HS cells obtained in Experimental Example 1 were cultured for 6 months or more at 37°C using YS-2D medium or YS medium.
  • the HS cells were passaged every 3 days by the method described in Experimental Example 1.
  • HS cells formed cell masses similar to those shown in Figure 1 after subculture.
  • HS cells cultured for more than six months were used to form HS organoids using the same method as in Experimental Example 2. As a result, it was confirmed that HS organoids similar to those shown in Figure 2 were formed.
  • FIG. 5 shows the results of UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) analysis of gene expression data obtained by single-cell RNA-seq analysis.
  • Yolk sac gene expression data was obtained from the data reported by Issac Goh et al. (Science. 2023 Aug 18;381(6659)). Similar to the results in Experimental Example 3, the gene expression pattern of HS organoids was similar to that of yolk sac endoderm.
  • Figure 6 shows the results of a comparison of gene expression between HS cells and HS organoids based on gene expression data obtained by single-cell RNA-seq analysis.
  • the upper row (A) in Figure 6 shows the expression of genes involved in cell proliferation, such as DNA replication and cell division.
  • the lower row (B) in Figure 6 shows the expression of genes involved in the uptake, metabolism, transport, and sulfate conjugation of biomolecules (lipids, carbohydrates, proteins), as well as MAPK signaling activity.
  • HS organoids showed decreased expression of genes involved in cell proliferation and increased expression of genes related to yolk sac function.
  • the present disclosure provides a method for producing hypoblast stem cells that can be applied to humans and that can produce hypoblast stem cells that can be maintained through long-term culture, a medium for inducing hypoblast stem cells that can be used in the method, hypoblast stem cells produced by the method, a method for producing yolk sac organoids using the hypoblast stem cells, and yolk sac organoids containing the hypoblast stem cells.
  • the hypoblast stem cells and yolk sac organoids are expected to be applicable to drug evaluation tests targeting early pregnancy, regenerative medicine, assisted reproductive technology, and other fields.

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Abstract

哺乳動物の卵黄嚢から単離された細胞を、上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地で培養する工程を含む、ハイポブラスト幹細胞の製造方法。また、上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する、ハイポブラスト幹細胞の誘導用培地。

Description

ハイポブラスト幹細胞の製造方法、ハイポブラスト幹細胞の誘導用培地、ハイポブラスト幹細胞、卵黄嚢オルガノイドの製造方法、及び卵黄嚢オルガノイド
　本発明は、ハイポブラスト幹細胞の製造方法、ハイポブラスト幹細胞の誘導用培地、ハイポブラスト幹細胞、卵黄嚢オルガノイドの製造方法、及び卵黄嚢オルガノイドに関する。
　本願は、２０２４年５月２８日に、日本に出願された特願２０２４－０８６１８４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　ヒトの着床前胚は、将来、胎児に寄与するエピブラスト、胎盤に寄与する栄養外胚葉、及び卵黄嚢に寄与するハイポブラストの３種類の細胞で構成されている。エピブラストからは胚性幹細胞（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＥＳ細胞）が樹立されている。栄養外胚葉からは栄養膜幹細胞（Ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＴＳ細胞）が樹立されている（特許文献１）。これらの細胞は、基礎から応用まで幅広い分野で活用が進んでいる。
　一方、マウスにおいては、卵黄嚢への分化能を有する細胞として、原始内胚葉幹細胞（Ｐｒｉｍｉｔｉｖｅ　ｅｎｄｏｄｅｒｍ　ｓｔｅｍ　ｃｅｌｌ：ＰｒＥＳ細胞）が報告されている（非特許文献１）。また、ヒト多能性幹細胞から、ハイポブラスト様細胞が誘導されたことが報告されている（非特許文献２）。
特許第６４００８３２号公報
Yasuhide Ohinata et al., Establishment of mouse stem cells that can recapitulate the developmental potential of primitive endoderm. Science. 2022 Feb 4;375(6580):574-578. Takumi Okubo et al., Hypoblast from human pluripotent stem cells regulates epiblast development. Nature. 2024 Feb;626(7998):357-366.
　ＥＳ細胞及びＴＳ細胞に加えて、卵黄嚢への分化能を有するハイポブラスト幹細胞を樹立することができれば、哺乳動物の初期発生の基礎研究、妊娠初期の胎子に対する薬物影響試験、及び生殖補助医療等に有用であると期待される。
　非特許文献１では、マウス胚盤胞を、線維芽細胞増殖因子４（Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　４：ＦＧＦ４）、血小板由来成長因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔ－Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ：ＰＤＧＦ）、及びＧＳＫ３β阻害剤の存在下で培養することにより、マウスＰｒＥＳ細胞を誘導している。しかしながら、非特許文献１に記載の条件では、ヒトのハイポブラスト幹細胞を誘導することはできない。
　非特許文献２では、ヒト多能性幹細胞を、ＦＧＦ４、骨形成因子４（Ｂｏｎｅ　ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ　Ｐｒｏｔｅｉｎ：ＢＭＰ４）、インターロイキン６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ　６：ＩＬ－６）、ＰＤＧＦ、Ｗｎｔ阻害剤、及びＴＧＦβ／ＳＭＡＤ阻害剤の存在下で培養することにより、ハイポブラスト様細胞を誘導している。しかしながら、非特許文献２に記載のハイポブラスト様細胞は、長期間（例えば、６カ月以上）培養して維持することができない。
　本開示は、ヒトにも適用可能であり、長期培養により維持可能なハイポブラスト幹細胞を製造可能な、ハイポブラスト幹細胞の製造方法、前記製造方法に使用可能なハイポブラスト幹細胞の誘導用培地、前記製造方法により製造されるハイポブラスト幹細胞、前記ハイポブラスト幹細胞を用いた卵黄嚢オルガノイドの製造方法、及び前記ハイポブラスト幹細胞を含む卵黄嚢オルガノイドを提供することを課題とする。
　本開示は、以下の態様を含む。
（１）哺乳動物の卵黄嚢から単離された細胞を、上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地で培養する工程を含む、ハイポブラスト幹細胞の製造方法。
（２）前記培地が、ＴＧＦβ／ＳＭＡＤ阻害剤をさらに含有する、（１）に記載のハイポブラスト幹細胞の製造方法。
（３）前記培地が、ＨＤＡＣ阻害剤及びｐ３８阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種をさらに含有する、（１）又は（２）に記載のハイポブラスト幹細胞の製造方法。
（４）上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する、ハイポブラスト幹細胞の誘導用培地。
（５）ＴＧＦβ／ＳＭＡＤ阻害剤をさらに含有する、（４）に記載のハイポブラスト幹細胞の誘導用培地。
（６）ＨＤＡＣ阻害剤及びｐ３８阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種をさらに含有する、（４）又は（５）に記載のハイポブラスト幹細胞の誘導用培地。
（７）哺乳動物の卵黄嚢から単離された細胞から、ハイポブラスト幹細胞を誘導するために用いられる、（４）～（６）のいずれか１つに記載のハイポブラスト幹細胞の誘導用培地。
（８）下記（ａ）～（ｅ）の特徴を有する、ハイポブラスト幹細胞：
　（ａ）哺乳動物の卵黄嚢から単離された細胞から誘導された細胞である；
　（ｂ）前記哺乳動物の卵黄嚢から単離された細胞と比較して、α－フェトプロテインの発現量が低い；
　（ｃ）α－フェトプロテイン及びアルブミンからなる群より選択される少なくとも１種を発現する細胞を含む卵黄嚢オルガノイドへの分化能を有する；
　（ｄ）増殖能を有する；及び
　（ｅ）細胞塊を形成する。
（９）（４）～（７）のいずれか１つに記載のハイポブラスト幹細胞の誘導用培地で継代培養を行うことにより、６カ月以上の維持培養が可能な、（８）に記載のハイポブラスト幹細胞。
（１０）ヒトの卵黄嚢から単離された細胞から誘導された細胞である、（８）又は（９）に記載のハイポブラスト幹細胞。
（１１）（８）又は（９）に記載のハイポブラスト幹細胞を、ハイドロゲル内で培養する工程を含む、卵黄嚢オルガノイドの製造方法。
（１２）（８）～（１０）のいずれか１つに記載のハイポブラスト幹細胞を含む、卵黄嚢オルガノイド。
　本開示によれば、ヒトにも適用可能であり、長期培養により維持可能なハイポブラスト幹細胞を製造可能な、ハイポブラスト幹細胞の製造方法、前記製造方法に使用可能なハイポブラスト幹細胞の誘導用培地、前記製造方法により製造されるハイポブラスト幹細胞、前記ハイポブラスト幹細胞を用いた卵黄嚢オルガノイドの製造方法、及び前記ハイポブラスト幹細胞を含む卵黄嚢オルガノイドを提供することができる。
実験例１において得られたハイポブラスト幹細胞の位相差顕微鏡画像である。 実験例２において得られた卵黄嚢オルガノイドの位相差顕微鏡画像（左図）及び免疫蛍光染色画像（右図）である。 実験例３における、ハイポブラスト幹細胞（ＨＳ細胞）及び卵黄嚢オルガノイド（ＨＳオルガノイド）のＲＮＡ－ｓｅｑ解析から得られた、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）の発現量を示す。 実験例３における、ハイポブラスト幹細胞（ＨＳ細胞）及び卵黄嚢オルガノイド（ＨＳオルガノイド）のＲＮＡ－ｓｅｑ解析から得られた、アルブミンの発現量を示す。 実験例３において、ハイポブラスト幹細胞（ＨＳ細胞）及び卵黄嚢オルガノイド（ＨＳオルガノイド）のＲＮＡ－ｓｅｑ解析による遺伝子発現データを、ＵＭＡＰ解析した結果を示す。細胞の分類は、先行研究（Issac Goh et al., Science. 2023 Aug 18;381(6659):eadd7564. doi: 10.1126/science.add7564.）から取得した。 実験例６において、ハイポブラスト幹細胞（ＨＳ細胞）及び卵黄嚢オルガノイド（ＨＳオルガノイド）のシングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ解析による遺伝子発現データを、ＵＭＡＰ解析した結果を示す。細胞の分類は、先行研究（Issac Goh et al., Science. 2023 Aug 18;381(6659):eadd7564. doi: 10.1126/science.add7564.）から取得した。 実験例６において、シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ解析による遺伝子発現データに基づいて、ＨＳ細胞とＨＳオルガノイドとの遺伝子発現を比較した結果を示す。
［定義］
　「を含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を含んでいてもよいことを意味する。「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｏｆ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を含まないことを意味する。「から本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ）という用語は、対象となる構成要素以外の構成要素を特別な機能を発揮する態様（発明の効果を完全に喪失させる態様など）では含まないことを意味する。本明細書において、「を含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）と記載する場合、「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｏｆ）態様、及び「から本質的になる」（ｃｏｎｓｉｓｔ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ）態様を包含する。
　「～」を用いて表される数値範囲は、「～」の前後に記載される数値を下限値及び上限値として含む範囲を意味する。特定のパラメータについて、複数の上限値及び下限値が記載されている場合、これらの上限値及び下限値の内、任意の上限値と下限値とを組合せて好適な数値範囲とすることができる。
　タンパク質、細胞、及びオルガノイドは、単離されたものであり得る。「単離された」とは、他の成分から分離された状態を意味する。「単離された」成分は、天然状態から分離された状態であってもよい。「単離された」ものは、他の成分を実質的に含まないものであり得る。「他の成分を実質的に含まない」とは、単離された成分に含まれる他の成分の含有量が無視できる程度であることを意味する。単離された成分に含まれる他の成分の含有量は、例えば、１０質量％以下、５質量％以下、４質量％以下、３質量％以下、２質量％以下、１質量％以下、０．５質量％以下、又は０．１質量％以下であり得る。本明細書に記載されるタンパク質、細胞、及びオルガノイドは、それぞれ、単離されたタンパク質、単離された細胞、及び単離されたオルガノイドであり得る。
［ハイポブラスト幹細胞の製造方法］
　本開示の第１の態様は、ハイポブラスト幹細胞の製造方法である。前記製造方法は、哺乳動物の卵黄嚢から単離された細胞を、上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地で培養する工程（以下、「培養工程」ともいう）を含む。
（ハイポブラスト幹細胞）
　「ハイポブラスト幹細胞」（以下、「ＨＳ細胞」ともいう）とは、下記の（ａ）～（ｅ）の特徴を有する細胞を指す。ＨＳ細胞は、下記（ｂ）～（ｅ）の特徴を有する細胞であってもよい。
　（ａ）哺乳動物の卵黄嚢から単離された細胞から誘導された細胞である；
　（ｂ）前記哺乳動物の卵黄嚢から単離された細胞と比較して、α－フェトプロテインの発現量が低い；
　（ｃ）α-フェトプロテイン及びアルブミンからなる群より選択される少なくとも１種を発現する細胞を含む卵黄嚢オルガノイドへの分化能を有する；
　（ｄ）増殖能を有する；及び
　（ｅ）細胞塊を形成する。
（ａ）について：
　ＨＳ細胞は、卵黄嚢から単離された細胞（以下、「卵黄嚢細胞」ともいう）から誘導された細胞である。ＨＳ細胞は、卵黄嚢から単離された細胞を、上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地で培養することにより、誘導することができる。培養方法の具体例については後述する。
（ｂ）について：
　ＨＳ細胞は、卵黄嚢細胞と比較して、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）の発現量が低い。比較対象となる卵黄嚢細胞は、ＨＳ細胞の誘導元である卵黄嚢細胞である。ＡＦＰは、卵黄嚢において高発現している卵黄嚢マーカーである。卵黄嚢細胞からＨＳ細胞を誘導すると、ＡＦＰの発現量が低下する。ＨＳ細胞におけるＡＦＰの発現量の低下は、ＨＳ細胞が、卵黄嚢細胞よりも未分化な状態に移行したことを示すと考えられる。
　卵黄嚢細胞及びＨＳ細胞におけるＡＦＰの発現量は、公知の方法により、測定することができる。そのような方法としては、例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析、定量的逆転写ＰＣＲ（ＲＴ－ｑＰＣＲ）、ノーザンブロッティング解析、蛍光免疫染色、ウェスタンブロッティング解析、ＥＬＩＳＡ等が挙げられる。ＡＦＰの発現量の測定に使用可能なＡＦＰの配列情報は、ＧｅｎｅＢａｎｋ等の公知の配列データベースから入手することができる。ヒトＡＦＰの配列情報は、例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋに、アクセッション番号ＮＭ＿００１１３４．３、及びＮＭ＿００１３５４７１７．２で登録されているもの等を利用することができる。ＡＦＰの発現量の測定に使用可能な抗ＡＦＰ抗体は、市販のものを用いることができる。
（ｃ）について：
　ＨＳ細胞は、卵黄嚢オルガノイドへの分化能を有する。「卵黄嚢オルガノイド」は、ＡＦＰ及びアルブミンからなる群より選択される少なくとも１種を発現する細胞（以下、「ＡＦＰ／Ａｌｂ発現細胞」ともいう）を含むオルガノイドである。ＡＦＰ／Ａｌｂ発現細胞は、ＡＦＰのみを発現する細胞でもよく、アルブミンのみを発現する細胞でもよく、ＡＦＰ及びアルブミンの両方を発現する細胞でもよい。卵黄嚢オルガノイドは、ＡＦＰ／Ａｌｂ発現細胞から主に構成されていることが好ましい。卵黄嚢オルガノイドは、例えば、全細胞の５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、又は９５％以上がＡＦＰ／Ａｌｂ発現細胞により構成されていることが好ましい。
　卵黄嚢オルガノイドにおけるＡＦＰ及びアルブミンの発現は、上記のような公知の方法により測定することができる。ＡＦＰ及びアルブミンの発現量の測定に使用可能なＡＦＰの配列情報は、ＧｅｎｅＢａｎｋ等の公知の配列データベースから入手することができる。ヒトアルブミンの配列情報は、例えば、ＧｅｎｅＢａｎｋに、アクセッション番号ＮＭ＿０００４７７．７で登録されているもの等を利用することができる。アルブミンの発現量の測定に使用可能な抗アルブミン抗体は、市販のものを用いることができる。
　卵黄嚢オルガノイドにおけるＡＦＰ及びアルブミンの発現量は、ＨＳ細胞の誘導元である卵黄嚢と同程度であることが好ましい。例えば、卵黄嚢におけるＡＦＰの発現量を１とした場合、卵黄嚢オルガノイドにおけるＡＦＰの相対発現量は、０．１以上、０．２以上、０．５以上、０．６以上、又は０．７以上であることが好ましい。卵黄嚢におけるＡＦＰの発現量を１とした場合の、卵黄嚢オルガノイドにおけるＡＦＰの相対発現量の上限値は、例えば、１０．０以下、９．０以下、８．０以下、７．０以下、６．０以下、５．０以下、４．０以下、３．０以下、又は２．０以下である。例えば、卵黄嚢におけるアルブミンの発現量を１とした場合、卵黄嚢オルガノイドにおけるアルブミンの相対発現量は、０．１以上、０．２以上、０．５以上、０．６以上、又は０．７以上であることが好ましい。卵黄嚢におけるアルブミンの発現量を１とした場合の、卵黄嚢オルガノイドにおけるアルブミンの相対発現量の上限値は、例えば、１０．０以下、９．０以下、８．０以下、７．０以下、６．０以下、５．０以下、４．０以下、３．０以下、又は２．０以下である。
　卵黄嚢オルガノイドは、卵黄嚢と遺伝子発現パターンが類似した細胞から構成されることが好ましい。例えば、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析又はシングルＲＮＡ－ｓｅｑ解析により得られた遺伝子発現データのＵＭＡＰ解析を行った場合に、卵黄嚢と同じクラスターに位置することが好ましい。
　細胞が、卵黄嚢オルガノイドへの分化能を有するか否かは、評価対象の細胞をハイドロゲル内で培養することにより、確認することができる。評価対象の細胞がオルガノイドへの分化能を有する場合、ハイドロゲル内で５～２０日程度培養することにより、オルガノイドが形成される。形成されたオルガノイドが、ＡＦＰ／Ａｌｂ細胞を含む場合、当該オルガノイドは、卵黄嚢オルガノイドであると判定することができる。形成されたオルガノイドが卵黄嚢オルガノイドである場合、当該細胞は卵黄嚢オルガノイドへの分化能を有する、と判定することができる。ＨＳ細胞からの卵黄嚢オルガノイドの形成方法の詳細については、後述する。
（ｄ）について：
　ＨＳ細胞は、増殖能を有する。ＨＳ細胞が増殖可能な培地としては、例えば、上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地が挙げられる。そのような培地の具体例としては、後述のハイポブラスト幹細胞の誘導用培地が挙げられる。
　ＨＳ細胞の培養条件としては、動物細胞の培養に通常用いられる条件を用いることができる。培養温度としては、３２～４０℃（好ましくは３５～３８℃、典型的には３７℃）が挙げられる。ＣＯ２濃度としては、２～５％（好ましくは５％）が挙げられる。ＨＳ細胞の培養は、ラミニン等の培養基質を用いた接着培養とすることができる。「培養基質」とは、細胞の培養において、細胞が接着するための足場となる物質を指す。培養基質としては、細胞外マトリクスが挙げられる。
　ＨＳ細胞は、上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地を用いて、培養基質の存在下、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した場合に、増殖可能な細胞であるともいえる。ＨＳ細胞が増殖すると、後述の（ｅ）に記載される細胞塊のサイズが大きくなっていく。そのため、細胞塊のサイズの増大により、ＨＳ細胞の増殖を確認することができる。
（ｅ）について：
　ＨＳ細胞は、細胞塊を形成する。より具体的には、ＨＳ細胞は、上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地で培養することにより、図１に示すような球状の細胞塊を形成する。細胞塊のサイズは、例えば、最小径２０～２００μｍ程度である。細胞塊の最大径は、例えば、２０～２００μｍ程度である。ＨＳ細胞により形成される細胞塊は、位相差顕微鏡を用いて、倍率２０倍で観察した場合、通常、細胞間の境界を明瞭に観察することができない。これは、細胞が密に集まった細胞密度の高い細胞塊であるためと考えられる。
　ＨＳ細胞は、上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地を用いて、培養基質の存在下、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した場合に、細胞塊を形成可能な細胞であるともいえる。
　その他の特徴：
　ＨＳ細胞は、上記（ａ）～（ｅ）の特徴に加えて、下記（ｆ）の特徴を有することが好ましい。
（ｆ）上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地で継代培養を行うことにより、６カ月以上の維持培養が可能である。
　上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地としては、後述のハイポブラスト幹細胞の誘導用培地が挙げられる。継代培養の培養条件としては、動物細胞の培養に通常用いられる条件を用いることができる。培養温度としては、上記（ｄ）で挙げた培養条件と同様の培養条件が挙げられる。
　継代は、例えば、３～１０日毎に行ってもよく、培養容器がコンフルエントな状態となったときに行ってもよい。ＨＳ細胞の継代は、動物細胞の継代に通常用いられる方法により、行うことができる。例えば、タンパク質分解酵素（例えば、トリプシン、トリプシン代替品等）を添加し、ピペッティング等により細胞を培養容器から剥離する。この際、細胞塊を、遊離細胞に分散させてもよい。剥離した細胞を遠心分離等により回収する。回収した細胞を新たな培地に播種することにより、継代を行うことができる。
　ＨＳ細胞は、上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地を用いて、培養基質の存在下、３７℃、５％ＣＯ２条件下で継代培養を行うことにより、６カ月以上維持培養が可能な細胞であることが好ましい。
　「維持培養」とは、細胞の性質が維持されたまま、細胞を培養することをいう。ＨＳ細胞においては、維持培養中、上記（ａ）～（ｅ）の特徴が維持される。
　ＨＳ細胞のサイズは、誘導元の卵黄嚢細胞が由来する生物により異なる。例えば、ヒト卵黄嚢細胞から誘導されたＨＳ細胞のサイズは、細胞径１０～５０μｍ程度の大きさである。
（培養工程）
　培養工程では、哺乳動物の卵黄嚢から単離された細胞（卵黄嚢細胞）を、上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地で培養する。
＜卵黄嚢細胞＞
　卵黄嚢細胞が由来する哺乳動物は、妊娠時に卵黄嚢を有する哺乳動物である。哺乳動物としては、例えば、ヒト、及びヒト以外の哺乳動物が挙げられる。ヒト以外の哺乳動物としては、例えば、ヒト以外の霊長類（サル、チンパンジー、ゴリラ、マーモセットなど）、齧歯類（マウス、ハムスター、ラット、モルモットなど）、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ等が挙げられるが、これらに限定されない。卵黄嚢細胞が由来する哺乳動物としては、霊長類が好ましく、ヒトがより好ましい。
　卵黄嚢細胞は、卵黄嚢から単離された細胞である。卵黄嚢細胞は、卵黄嚢から単離された細胞の培養株を用いてもよい。卵黄嚢は、例えば、妊娠初期の哺乳動物から摘出してもよい。哺乳動物がヒトである場合、妊娠中絶手術により摘出されたものを用いてもよい。
　卵黄嚢からの細胞の単離方法は、公知の方法を用いることができる。卵黄嚢細胞は、例えば、卵黄嚢に機械的及び／又は酵素的処理を適宜使用して、細胞を分離することにより、単離することができる。機械的処理としては、ハサミ又はメスによる切断等が挙げられる。酵素処理としては、タンパク質分解酵素（トリプシン等）、細胞外マトリクス分解活性を有するプロテアーゼ（例えば、ディスパーゼ、コラゲナーゼ等）による処理が挙げられる。子宮内膜上皮組織の機械的及び／又は酵素的処理の後、遠心分離、ストレーナー又はフィルター等を用いて卵黄嚢細胞を回収することができる。回収した卵黄嚢細胞は、適宜、培地（ＴＳ培地等）、緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ等））等で洗浄してもよい。
＜培地＞
　培地としては、例えば、基礎培地に、上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤等を添加した培地が挙げられる。
≪基礎培地≫
　基礎培地としては、動物細胞の培養に一般的に用いられる培地が挙げられる。基礎培地としては、例えば、Ｄｏｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、Ａｄｖａｎｃｅｄ　ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓＭｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、及びこれらの２種以上の混合培地等が挙げられる。好ましい基礎培地としては、例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２が挙げられる。
　基礎培地は、必要に応じて、血清（牛胎児血清（ＦＢＳ）など）、及び／又は血清代替物を含んでいてもよい。血清代替物としては、例えば、アルブミン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、ＩＴＳ－Ｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ノックアウト血清代替物（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＳＲ）、Ｎ２サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂ２７サプリメント（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、脂肪酸、インスリン、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロール等が挙げられる。基礎培地は、必要に応じて、脂質、アミノ酸、Ｌ－グルタミン、Ｇｌｕｔａｍａｘ、非必須アミノ酸、ビタミン、増殖因子、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等の成分を含んでいてもよい。これらは、適宜組み合わせて用いることができる。
　基礎培地としては、例えば、上記のような基礎培地（例えば、ＤＭＥＭ／Ｆ１２）に、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＩＴＳ－Ｘ、血清代替物（ＫＳＲ等）、及び抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン等）を添加した培地が挙げられる。基礎培地の具体例としては、後述の実施例で用いられたＴＳ　ｂａｓａｌ培地が挙げられる。
≪上皮成長因子≫
　上皮成長因子（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ　ｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ：ＥＧＦ）は、細胞表面に存在するＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）に結合してＥＧＦシグナル伝達を誘発し、分裂促進因子として作用する。ＥＧＦが由来する生物は、特に限定されないが、卵黄嚢細胞が由来する生物と同じことが好ましい。ヒト卵黄嚢細胞を用いる場合、ヒトＥＧＦが好ましい。ヒトＥＧＦは、非ヒト細胞により生産された組換え体であってもよい。ＥＧＦは、市販のものを用いることができる。培地中のＥＧＦの濃度は、特に限定されないが、例えば、５～２００ｎｇ／ｍＬとすることができる。培地中のＥＧＦの濃度は、１０～１５０ｎｇ／ｍＬが好ましく、１０～１００ｎｇ／ｍＬがより好ましく、１０～８０ｎｇ／ｍＬがさらに好ましく、１０～６０ｎｇ／ｍＬが特に好ましい。
≪ＧＳＫ３β阻害剤≫
　ＧＳＫ（Ｇｌｙｃｏｇｅｎ　Ｓｙｎｔｈａｓｅ　Ｋｉｎａｓｅ）３β阻害剤は、ＧＳＫ３βの機能、例えば、キナーゼ活性（例えば、βカテニンに対するリン酸化能）を阻害する物質である。ＧＳＫ３β阻害剤としては、例えば、６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリル、ケンパウロン（Ｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、１－アザケンパウロン（Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＣＨＩＲ９８０１４、ＡＲ－Ａ０１４４１８、ＣＴ９９０２１、ＣＴ２００２６、ＳＢ２１６７６３、ＡＲ－Ａ０１４４１８、リチウム、ＳＢ４１５２８６、ＴＤＺＤ－８、ＢＩＯ、ＢＩＯ－アセトキシム、（５－メチル－１Ｈ－ピラゾール－３－イル）－（２－フェニルキナゾリン－４－イル）アミン、ピリドカルバゾール－シクロペンタジエニルルテニウム（ｃｙｃｌｏｐｅｎａｄｉｅｎｙｌｒｕｔｈｅｎｉｕｍ）複合体、ＴＤＺＤ－８　４－ベンジル－２－メチル－１，２，４－チアジアゾリジン－３，５－ジオン、２－チオ（３－ヨードベンジル）－５－（１－ピリジル）－［１，３，４］－オキサジアゾール、ＯＴＤＺＴ、アルファ－４－ジブロモアセトフェノン、ＡＲ－ＡＯ　１４４－１８、３－（１－（３－ヒドロキシプロピル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－３－イル］－４－ピラジン－２－イル－ピロール－２，５－ジオン；ＴＷＳｌ　１９ピロロピリミジン化合物、Ｌ８０３　Ｈ－ＫＥＡＰＰＡＰＰＱＳｐＰ－ＮＨ２又はそのミリストイル化形態；２－クロロ－１－（４，５－ジブロモ－チオフェン－２－イル）－エタノン、ＳＢ２１６７６３、及びＳＢ４１５２８６等の低分子阻害剤が挙げられる。ＧＳＫ３β阻害剤は、ＧＳＫ３βに対するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。６－［［２－［［４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）－２－ピリミジニル］アミノ］エチル］アミノ］ニコチノニトリルの市販品としては、ＣＨＩＲ９９０２１等が挙げられる。ＧＳＫ３β阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　ＧＳＫ３β阻害剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を用いることが好ましい。
　培地中のＧＳＫ３β阻害剤の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１～５０μＭとすることができ、０．２～３０μＭが好ましく、０．５～２０μＭがより好ましく、１～１０μＭがさらに好ましい。
≪ＲＯＣＫ阻害剤≫
　ＲＯＣＫ（Ｒｈｏ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｃｏｉｌｅｄ－ｃｏｉｌ　ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ：Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤は、Ｒｈｏ結合キナーゼの機能を阻害する物質である。ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド、１－（５－イソキノリニルスルホニル）ホモピペラジン（１－（５－Ｉｓｏｑｕｉｎｏｌｉｎｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ）ｈｏｍｏｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ）、またはこれらの塩等が挙げられる。ＲＯＣＫ阻害剤としては、例えば、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７、Ｈ－１１５２、およびＷｆ－５３６等の低分子阻害剤、並びにそれらの誘導体等も挙げられる。ＲＯＣＫ阻害剤は、ＲＯＣＫに対するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。
　ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－ピリジル）－４－（１－アミノエチル）－シクロヘキサンカルボキサミド又はその塩の市販品としては、Ｙ２７６３２（（Ｒ）－（＋）－ｔｒａｎｓ－Ｎ－（４－ｐｙｒｉｄｙｌ）－４－（１－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ・２ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ）等が挙げられる。ＲＯＣＫ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ２７６３２を用いることが好ましい。
　培地中のＲＯＣＫ阻害剤の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１～５０μＭとすることができ、０．５～２０μＭが好ましく、１～１５μＭがより好ましく、１～１０μＭがさらに好ましい。
≪他の因子≫
　培地は、上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤に加えて、他の因子を含有してもよい。他の因子としては、例えば、ＴＧＦβ／ＳＭＡＤ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、ｐ３８阻害剤、ニコチンアミド等が挙げられる。
・ＴＧＦβ／ＳＭＡＤ阻害剤
　ＴＧＦβ（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ　β）／ＳＭＡＤ阻害剤は、ＴＧＦβのＡＬＫ（Ａｃｔｉｖｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ－Ｌｉｋｅ　Ｋｉｎａｓｅ）ファミリーへの結合を阻害する物質、又はＡＬＫファミリーによるＳＭＡＤのリン酸化を阻害する物質である。ＴＧＦβ／ＳＭＡＤ阻害剤としては、例えば、ＡＬＫ４、ＡＬＫ５又はＡＬＫ７等のキナーゼ活性を阻害する物質等が挙げられる。ＴＧＦβ／ＳＭＡＤ阻害剤としては、例えば、Ｌｅｆｔｙ－１（ＮＣＢＩアクセッション番号として、マウス：ＮＰ＿０３４２２４．１、ヒト：ＮＰ＿０６６２７７．１が例示される）、ＳＢ４３１５４２、ＳＢ２０２１９０（以上、Ｒ．Ｋ．Ｌｉｎｄｅｍａｎｎ　ｅｔ　ａｌ．，　Ｍｏｌ．　Ｃａｎｃｅｒ，　２００３，　２：２０）、ＳＢ５０５１２４　（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）、ＮＰＣ３０３４５、ＳＤ０９３、ＳＤ９０８、ＳＤ２０８（Ｓｃｉｏｓ）、ＬＹ２１０９７６１、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６（Ｌｉｌｌｙ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ａ８３－０１（３－（６－メチル－２－ピリジニル）－Ｎ－フェニル－４－（４－キノリニル）－１Ｈ－ピラゾール－１－カルボチオアミド、ＷＯ２００９１４６４０８）、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（２－［３－［６－メチルピリジン－２－イル］－１Ｈ－ピラゾル－４－イル］－１，５－ナフチリジン）、ＴＧＦβＲＩキナーゼ阻害剤ＶＩＩＩ（６－［２－ｔｅｒｔ－ブチル－５－［６－メチル－ピリジン－２－イル］－１Ｈ－イミダゾル－４－イル］－キノキサリン）並びにこれらの誘導体等が挙げられるが、これらに限定されない。ＴＧＦβ／ＳＭＡＤ阻害剤は、ＡＬＫファミリーに対するアンチセンス核酸、ＲＮＡ干渉誘導性核酸（例、ｓｉＲＮＡ）、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。ＴＧＦβ／ＳＭＡＤ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　ＴＧＦβ／ＳＭＡＤ阻害剤は、Ａ８３－０１を用いることが好ましい。
　培地中のＴＧＦβ／ＳＭＡＤ阻害剤の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．１～５０μＭとすることができ、０．５～２０μＭが好ましく、１～１５μＭがより好ましく、１～１０μＭがさらに好ましい。
・ＨＤＡＣ阻害剤
　ＨＤＡＣ（Ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｄｅａｃｅｔｙｌａｓｅ）阻害剤は、ヒストンデアセチラーゼの機能を阻害する物質である。ＨＤＡＣ阻害剤としては、ＨＤＡＣの機能を抑制できるものであれば、特に限定されない。ＨＤＡＣ阻害剤としては、例えば、バルプロ酸（ＶＰＡ）、トリコスタチンＡ、酪酸ナトリウム、ＭＣ１２９３、Ｍ３４４等の低分子阻害剤が挙げられる。ＨＤＡＣ阻害剤は、ＨＤＡＣに対するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ドミナントネガティブ変異体、およびそれらの発現ベクター等であってもよい。ＨＤＡＣ阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　ＨＤＡＣ阻害剤は、ＶＰＡを用いることが好ましい。
　培地中のＨＤＡＣ阻害剤の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．０１～１０μＭとすることができ、０．０５～５μＭが好ましく、０．１～２μＭがより好ましく、０．５～１μＭがさらに好ましい。
・ｐ３８阻害剤
　ｐ３８阻害剤は、ｐ３８　ＭＡＰＫ（Ｐ３８　ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｋｉｎａｓｅ）の機能を阻害する物質である。ｐ３８阻害剤としては、例えば、ＳＢ２０２１９０（４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－ヒドロキシフェニル）－５－（４－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール）、ＳＢ２０３５８０（４－［４－（４－フルオロフェニル）－２－［４－（メチルスルフィニル）フェニル］－１Ｈ－イミダゾール－５－イル］ピリジン）、ＶＸ７０２（６－（Ｎ－カルバモイル－２，６－ジフルオロアニリノ）－２－（２，４－ジフルオロフェニル）ピリジン－３－カルボキシアミド）、ＶＸ７４５（５－（２，６－ジクロロフェニル）－２－［２，４－ジフルオロフェニル）チオ］－６Ｈ－ピリミド［１，６－ｂ］ピリダジン－６－ワン）、ＰＤ１６９３１６（４－（４－フルオロフェニル）－２－（４－ニトロフェニル）－５－（４－ピリジル）－１Ｈ－イミダゾール）、ＲＯ４４０２２５７（６－（２，４－ジフルオロフェノキシ）－２－｛［３－ヒドロキシ－１－（２－ヒドロキシエチル）プロピル］アミノ｝－８－メチルピリド［２，３－Ｄ］ピリミジン－７（８ｈ）－ワン）、ＢＩＲＢ７９６（１－［５－ｔｅｒｔ－ブチル－２－（４－メチルフェニル）ピラゾール－３－イル］－３－［４－（２－モルフォリン－４－イレトキシ）ナフタレン－１－イル］ウレア）等が挙げられる。ｐ３８阻害剤は、ｐ３８　ＭＡＰＫに対するアンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ、ドミナントネガティブ変異体、及びそれらの発現ベクター等であってもよい。ｐ３８阻害剤は、１種を単独で用いてもよく、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
　ｐ３８阻害剤は、ＳＢ２０２１９０を用いることが好ましい。
　培地中のｐ３８阻害剤の濃度は、特に限定されないが、例えば、０．０１～５０μＭとすることができ、０．１～２０μＭが好ましく、０．５～１０μＭがより好ましく、０．５～５μＭがさらに好ましい。
・ニコチンアミド
　培地は、上記成分に加えてニコチンアミドを含有してもよい。
　培地中のニコチンアミドの濃度は、特に限定されないが、例えば、０．０１～５００ｎＭとすることができ、０．１～１００ｎＭが好ましく、０．５～５０ｎＭがより好ましく、１～３０ｎＭがさらに好ましい。
　培地としては、上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地；上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＴＧＦβ／ＳＭＡＤ阻害剤を含有する培地；上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤に加えて、ＨＤＡＣ阻害剤及びｐ３８阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を含有する培地；上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＴＧＦβ／ＳＭＡＤ阻害剤に加えて、ＨＤＡＣ阻害剤及びｐ３８阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種を添加した培地；上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びＨＤＡＣ阻害剤を含有する培地；上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、及びｐ３８阻害剤を含有する培地；上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβ／ＳＭＡＤ阻害剤、及びＨＤＡＣ阻害剤を含有する培地；上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβ／ＳＭＡＤ阻害剤、及びｐ３８阻害剤を含有する培地；上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβ／ＳＭＡＤ阻害剤、ＨＤＡＣ阻害剤、及びｐ３８阻害剤を含有する培地等が挙げられる。培地は、上記各培地がさらにニコチンアミドを含有するものであってもよい。培地は、基礎培地（例えば、ＴＳ　ｂａｓａｌ培地）に、上記各因子を含有させたものであってもよい。培地の具体例としては、例えば、後述の実施例で用いられたＹＳ－２Ｄ培地、ＹＳ培地、ＹＳ－２Ｄ－３培地、ＹＳ－２Ｄ－５培地等が挙げられる。培地は、液体培地が好ましい。
＜培養条件＞
　培養条件は、動物細胞の培養に一般的に用いられる条件とすることができる。例えば、培養温度３２～４０℃（好ましくは３５～３８℃、典型的には３７℃）、ＣＯ２濃度２～５％（好ましくは５％）とすることができる。
　培養開始時の細胞播種密度としては、例えば、１０３～１０７個／ｍｌ、又は１０４～１０６個／ｍｌが挙げられる。
　培養は、例えば、培養基質を用いた接着培養とすることができる。培養基質としては、例えば、細胞外マトリクスを用いることができる。細胞外マトリクスとしては、例えば、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、エンタクチン等の基底膜系細胞外マトリクス；ヒアルロン酸、ＩＩ型コラーゲン、リンクタンパク質等の軟骨系細胞外マトリクス等；Ｉ型コラーゲン、プロテオグリカン（バーシカン、デコリン等）、フィブロネクチン等の間質系細胞外マトリクス等が挙げられる。培養基質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（ＣＯＲＮＩＮＧ）、ｉＭａｔｒｉｘ（登録商標）（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ）等の市販の製品を用いてもよい。培養基質としては、例えば、ｉＭａｔｒｉｘ５１１等が好ましい。
　培養容器は、動物細胞の培養に一般的に用いる培養容器を用いることができる。培養容器としては、例えば、ウェルプレート、培養ディッシュ、培養フラスコ等が挙げられる。
　培養期間は、例えば、２～６０日程度、４～５０日程度、又は５～３０日程度とすることができる。培養は、細胞におけるＡＦＰ、アルブミン等の卵黄嚢マーカーの発現量が低下するまで行ってもよい。例えば、卵黄嚢細胞と比較して、ＡＦＰ、アルブミン等の卵黄嚢マーカーの発現量が、１／１００以下、１／３００以下、１／５００以下、１／８００以下、又は１／１０００以下となるまで、培養を行ってもよい。
　培養は、例えば、細胞が、細胞塊（例えば、図１のような細胞塊）を形成するまで行ってもよい。
　培養は、適度な間隔で、継代培養を行ってもよい。継代は、例えば、コンフルエントな状態となったときに行うことができる。継代は、例えば、２～１０日毎、２～８日毎、２～５日毎、又は２～４日毎に行うことができる。継代培養の際には、ピペッティング等により、細胞を剥離してもよい。細胞の剥離の際には、トリプシン等のタンパク質酵素を用いてもよい。
　継代培養に用いる培地としては、上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地が挙げられる。継代培養に用いる培地は、上記＜培地＞の項で説明した培地と同様のものを用いることができる。
　卵黄嚢細胞を上記のように培養することにより、ＨＳ細胞を得ることができる。
（他の工程）
　本実施形態の製造方法は、上記培養工程に加えて、他の工程を含んでもよい。他の工程としては、例えば、培養工程後にＨＳ細胞を回収する工程、ＨＳ細胞における卵黄嚢マーカー発現量を測定する工程、ＨＳ細胞を位相差顕微鏡等で観察する工程等が挙げられる。
　ＨＳ細胞の回収は、ピペッティング等により細胞を剥離した後、細胞懸濁液を遠心分離することにより、行うことができる。回収した細胞は、新たな培地に継代してもよく、細胞凍結保存液等を用いて凍結保存してもよい。細胞凍結保存液としては、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）１（ゼノジェンファーマ）等の市販の凍結保存液を用いることができる。あるいは、上記のような方法で、継代培養により維持してもよい。
　ＨＳ細胞は、ＡＦＰ、アルブミン等の卵黄嚢マーカーの発現量を測定してもよい。これらの卵黄嚢マーカーの発現量が、卵黄嚢細胞と比較して低下している場合、ＨＳ細胞が誘導されたと判断することができる。卵黄嚢マーカーの発現量の測定は、上記のような公知の方法により行うことができる。
　ＨＳ細胞は、位相差顕微鏡等により、細胞塊の形成を観察してもよい。細胞が細胞塊を形成している場合、ＨＳ細胞が誘導されたと判断することができる。
　本実施形態の製造方法により得られたＨＳ細胞は、卵黄嚢への分化能を有すると考えられる。そのため、ＨＳ細胞は、後述の卵黄嚢オルガノイド（以下、「ＨＳオルガノイド」ともいう）の形成に加えて、妊娠初期における薬物評価試験のモデル細胞、再生医療、生殖補助医療等への応用が期待される。
［ハイポブラスト幹細胞の誘導用培地］
　本開示の第２の態様は、ハイポブラスト幹細胞の誘導用培地（以下、「ＨＳ細胞誘導用培地」ともいう）である。ＨＳ細胞誘導用培地は、上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する。
　ＨＳ細胞誘導用培地は、上記［ハイポブラスト幹細胞の製造方法］における（培養工程）の＜培地＞の項で説明した培地と同じである。
　ＨＳ細胞誘導用培地は、卵黄嚢細胞から、ＨＳ細胞を誘導するために用いることができる。
［ハイポブラスト幹細胞］
　本発明の第３の態様は、ハイポブラスト幹細胞（ＨＳ細胞）である。ＨＳ細胞は、上記［ハイポブラスト幹細胞の製造方法］における（ハイポブラスト幹細胞）の項で説明したＨＳ細胞と同じである。一実施形態において、ＨＳ細胞は、ヒトの卵黄嚢から単離された細胞から誘導された細胞である。
［卵黄嚢オルガノイドの製造方法］
　本発明の第４の態様は、卵黄嚢オルガノイドの製造方法である。前記製造方法は、上記第３の態様に係るハイポブラスト幹細胞を、ハイドロゲル内で培養する工程（以下、「ハイドロゲル内培養工程」ともいう）を含む。
（ハイドロゲル内培養工程）
　ハイドロゲル内培養工程では、ＨＳ細胞を、ハイロドゲル内で培養する。
　ハイドロゲルは、水を内部に含んでゲル化した高分子材料である。ハイドロゲルに用いられる高分子材料としては、例えば、コラーゲン（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、Ｖ型、ＸＩ型等）、ゼラチン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、ペクチン、ヒアルロン酸、キチン、及びキトサン等の細胞外マトリクス；アルギン酸、及びデンプン等の多糖；ポリリジン、及びポリアルギニン等のアミノ酸ポリマー；フィブリン等の繊維状タンパク質；並びに、ポリエチレングリコール等の合成高分子ポリマー等が挙げられるが、これらに限定されない。ハイドロゲルは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（ＣＯＲＮＩＮＧ）、ｉＭａｔｒｉｘ（登録商標）（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ）等の市販品を用いてもよい。
　培養は、ＨＳ細胞をハイドロゲル内に埋め込むことにより、開始することができる。ＨＳ細胞は、上記のように継代培養した細胞を用いてもよく、凍結保存した細胞を用いてもよい。凍結保存していた場合、ハイドロゲル内での培養の前に、上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地で、ＨＳ細胞を培養することが好ましい。この際の培地としては、上記［ハイポブラスト幹細胞の製造方法］における（培養工程）の＜培地＞の項で説明した培地と同様のものが挙げられる。
　ＨＳ細胞は、ハイドロゲル内に埋め込む前に、ピペッティング等により培養容器から剥離してもよい。ＨＳ細胞が、細胞塊を形成している場合、ピペッティング等により、細胞塊を分離させて、遊離の細胞としてもよい。細胞の剥離及び／又は細胞塊の分離の際には、トリプシン等のタンパク質酵素を用いてもよい。
　ハイドロゲル内に埋め込むＨＳ細胞の細胞数は、例えば、１０３～１０１０個とすることができる。
　ハイドロゲルにおいて、ＨＳ細胞を埋め込む位置としては、例えば、ハイドロゲルの表面から深さ０．１～５ｃｍ程度、又は０．５～３ｃｍ程度が挙げられる。
　ＨＳ細胞を埋め込んだハイドロゲルを、適切な液体培地に浸漬して培養することができる。前記培地としては、例えば、上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地が挙げられる。前記培地としては、上記［ハイポブラスト幹細胞の製造方法］における（培養工程）の＜培地＞の項で説明した培地と同様の培地が挙げられる。
　培養条件は、動物細胞の培養に一般的に用いられる条件とすることができる。例えば、培養温度３２～４０℃（好ましくは３５～３８℃、典型的には３７℃）、ＣＯ２濃度２～５％（好ましくは５％）とすることができる。
　培養期間は、卵黄嚢オルガノイドが形成されるのに十分な期間であればよい。卵黄嚢オルガノイドの形成は、位相差顕微鏡による観察等により、確認することができる。培養期間としては、例えば、３日以上、５日以上、７日以上、又は１０日以上が挙げられる。培養期間の範囲としては、例えば、３～５０日程度、５～５０日程度、７～５０日程度、又は１０～５０日程度が挙げられる。
　本実施形態の製造方法により得られる卵黄嚢オルガノイドは、上記［ハイポブラスト幹細胞の製造方法］における（ハイポブラスト幹細胞）の項の「（ｃ）について」で説明した卵黄嚢オルガノイドと同じである。
　本実施形態の製造方法により得られる卵黄嚢オルガノイドは、卵黄嚢と同様の遺伝子発現パターンを有し、卵黄嚢と類似の機能を有すると推測される。そのため、前記卵黄嚢オルガノイドは、妊娠初期における薬物評価試験用モデル、再生医療、生殖補助医療等への応用が期待される。
　別の態様において、本開示は、上記第４の態様に係る製造方法により得られる卵黄嚢オルガノイドもまた提供する。前記卵黄嚢オルガノイドは、上記［ハイポブラスト幹細胞の製造方法］における（ハイポブラスト幹細胞）の項で説明したＨＳ細胞を含む。
　以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
［試薬類、培地］
　実験に使用した試薬類を表１に示す。
　各阻害剤として、表２に示す試薬を用いた。
　培地の調製のために、表３に示す試薬溶液を調製した。
　ＴＳ　ｂａｓａｌ培地の組成を表４に示す。ＴＳ　ｂａｓａｌ培地は、４℃で保存し、調製後、１カ月以内に使用した。
　ＹＳ－２Ｄ培地の組成を表５に示す。ＹＳ－２Ｄ培地は、４℃で保存し、調製後、２週間以内に使用した。
　ＹＳ培地の組成を表６に示す。ＹＳ培地は、４℃で保存し、調製後、２週間以内に使用した。
［実験例１］
（ハイポブラスト幹細胞の誘導）
＜ヒト卵黄嚢からの細胞の単離＞
　ヒト卵黄嚢組織をハサミで細断し、ＴｒｙｐＬＥ溶液中で、３７℃で１０分間処理を行った後、遠心分離によって細胞（卵黄嚢細胞）を回収した。
＜ハイポブラスト幹細胞の誘導＞
　以下の手順に従い、ヒト卵黄嚢細胞から、ハイポブラスト幹細胞（以下、「ＨＳ細胞」ともいう）を誘導した。
（１）１２ウェルディッシュの各ウェルに、１ｍｌのＹＳ－２Ｄ培地及び１μｌのｉＭａｔｒｉｘ５１１を添加した。
（２）３７℃で、少なくとも１０分間、１２ウェルディッシュを維持した。
（３）各ウェルのＹＳ－２Ｄ培地に、約０．５×１０５個／ウェルで細胞を懸濁した。
（４）３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養し、３日毎に、ＹＳ－２Ｄ培地を用いて、継代した。
　上記のように調製した細胞は、ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）１（ゼノジェンファーマ）を用いて凍結保存することができた。
　細胞の継代は、以下の手順に従って行った。
（１）ウェル内のＹＳ－２Ｄ培地を吸引した。
（２）各ウェルに、０．２５ｍｌのＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）及び０．２５ｍｌのＴｒｙｐＬＥを添加した。
（３）３７℃で、約１０分間、１２ウェルディッシュを維持した。
（４）ピペッティングにより、細胞を剥離した。
（５）０．５ｍｌのＴＳ　ｂａｓａｌ培地を含む新しいチューブに、剥離した細胞を移した。
（６）約３８０ｇで、２分間、前記チューブを遠心分離した。
（７）新しい１２ウェルディッシュのウェルに、ＹＳ－２Ｄ培地及びｉＭａｔｒｉｘ５１１を入れ、３７℃に温めた。このウェルに、遠心分離で得られた細胞ペレットを播種した（ｓｐｌｉｔ　ｒａｔｉｏ＝１：６～１：８）。
　図１に、上記の方法により誘導されたＨＳ細胞の位相差顕微鏡画像を示す。図１のＨＳ細胞は、ＹＳ－２Ｄ培地において、卵黄嚢細胞を約１カ月間継代培養することにより得られたものである。最後の継代から６日目のＨＳ細胞を用いた。ＨＳ細胞は、細胞塊を形成しており、卵黄嚢細胞とは、外観が異なっていた。ＨＳ細胞の細胞塊において、細胞間の境界は明瞭には観察されなかった。このことから、細胞密度の高い細胞塊であると推測された。ＨＳ細胞の外観は、以前に報告されたマウスＰｒＥＳ細胞（Ohinata et al. Science. 2022 Feb 4;375(6580):574-578.）及びハイポブラスト様細胞（Okubo et al. Nature. 2024 Feb;626(7998):357-366）とも異なっていた。
［実験例２］
（卵黄嚢オルガノイドの形成）
　実験例１で得られたＨＳ細胞を用いて、以下の手順により、卵黄嚢オルガノイドを形成した。
（１）ウェル内のＹＳ－２Ｄ培地を吸引した。
（２）各ウェルに、０．２５ｍｌのＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ｂｕｆｆｅｒｅｄ　ｓａｌｉｎｅ）及び０．２５ｍｌのＴｒｙｐＬＥを添加した。
（３）３７℃で、約１０分間、１２ウェルディッシュを維持した。
（４）ピペッティングにより、細胞を剥離した。
（５）０．５ｍｌのＴＳ　ｂａｓａｌ培地を含む新しいチューブに、剥離した細胞を移した。
（６）約３８０ｇで、２分間、前記チューブを遠心分離した。
（７）Ｍａｔｒｉｇｅｌに、遠心分離で得られた細胞ペレットを埋め込み、新しい１２ウェルディッシュのウェルに入れた。
（８）（７）のＭａｔｒｉｇｅｌを、ＹＳ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
　卵黄嚢オルガノイドの継代は、以下の手順に従って行った。
（１）Ｍａｔｒｉｇｅｌの周囲のＹＳ培地を吸引した。
（２）ＰＢＳ及びＴｒｙｐＬＥ（ＰＢＳ：ＴｒｙｐＬＥ＝１：１；１．５ｍｌ／３５ｃｍディッシュ）を３５ｃｍディッシュに添加した。
（３）ピペットマンＰ１０００（ギルソン）を用いて、ディッシュ内の液体を、約５回ピペッティングした。
（４）３７℃で、約１５分間、ディッシュを維持した。
（５）ピペットマンＰ２００（ギルソン）を用いて、ディッシュ内の液体を、約１０回ピペッティングした。
（６）５ｍｌのＴＳ　ｂａｓａｌ培地を含む新しい１５ｍｌチューブに、細胞塊を移した。
（７）約８００ｇで、２分間、前記チューブを遠心分離した。
（８）Ｍａｔｒｉｇｅｌに、遠心分離で得られた細胞ペレットを埋め込み（ｓｐｌｉｔ　ｒａｔｉｏ＝１：４～１：８）、新しい１２ウェルディッシュのウェルに入れた。これを、ＹＳ培地中で、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
　図２に、上記の方法で得られたオルガノイドの位相差顕微鏡画像（左図）と免疫蛍光染色画像（右図）を示す。図２のオルガノイドは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ内で、ＨＳ細胞を約１カ月間継代培養することにより得られたものである。最後の継代から１１日目のオルガノイドを用いた。免疫蛍光染色は、抗ＡＦＰ（α－フェトプロテイン）抗体を用いて行った。ＡＦＰは、卵黄嚢で高発現する卵黄嚢マーカーである。ＨＳ細胞から誘導された卵黄嚢オルガノイド（以下、「ＨＳオルガノイド」ともいう）は、ＡＦＰを高発現していた。
［実験例３］
（ＲＮＡ－ｓｅｑ解析）
　実験例１で得られたＨＳ細胞及び実験例２で得られたＨＳオルガノイドについて、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析により、遺伝子発現を調べた。
　図３Ａに、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析により得られたＡＦＰの発現量を示す。ＨＳ細胞では、ＡＦＰはほとんど発現していなかった。一方、ＨＳオルガノイドでは、ＡＦＰが発現していた。
　図３Ｂに、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析により得られたアルブミンの発現量を示す。ＨＳ細胞では、アルブミンはほとんど発現していなかった。一方、ＨＳオルガノイドでは、アルブミンが発現していた。
　図４に、ＲＮＡ－ｓｅｑ解析により得られた遺伝子発現データを、ＵＭＡＰ（Ｕｎｉｆｏｒｍ　Ｍａｎｉｆｏｌｄ　Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）解析した結果を示す。卵黄嚢の遺伝子発現データとして、Issac Goh et al.（Science. 2023 Aug 18;381(6659)）で報告されたデータを利用した。ＨＳ細胞及びＨＳオルガノイドの遺伝子発現パターンは、卵黄嚢内胚葉の遺伝子発現パターンを類似していた。
［実験例４］
（ＨＳ細胞の誘導条件の検討）
　ＹＳ－２Ｄ培地（表５参照）のＹ２７６３２、ＥＧＦ、Ａ８３－０、ＣＨＩＲ９９０２１、ＳＢ０２１９０、及びＶＰＡの組合せに替えて、表７に示す因子の組み合わせを用いたこと以外は、ＹＳ－２Ｄ培地と同様の組成で各培地を調製した。
　表７に示す因子の組み合わせを含む培地をそれぞれ用いたこと以外は、実験例１と同様の方法により、卵黄嚢細胞からＨＳ細胞の誘導を行った。表７の各培地で５日間培養後、自動セルカウンター（Ｏｌｙｍｐｕｓ　Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｅｒ　ｍｏｄｅｌ　Ｒ１）を用いて細胞数を計測し、細胞増殖を評価した。その結果を表７に併せて示す。「＋」は細胞増殖が確認されたことを示し、「＋」の数が多いほど、細胞増殖量が多かったことを示す。「－」は、細胞増殖が確認されなかったことを示す。
　細胞増殖が確認された培地では、図１と同様の形状のＨＳ細胞の細胞塊が観察された。細胞増殖が確認されなかった培地では、ＨＳ細胞の細胞塊は観察されなかった。
　６種全ての因子を含むＹＳ－２Ｄ培地での細胞増殖が最も良好であった。次いで、ＹＳ培地（ＶＰＡ非含有）及びＹＳ－２Ｄ－５培地（ＳＢ２０２１９０非含有）での細胞増殖が良好であった。ＹＳ－２Ｄ－３培地（Ａ８３－０１非含有）では、ＨＳ細胞の細胞塊は観察されたが、細胞増殖は低かった。ＹＳ－２Ｄ－１培地（ＥＧＦ非含有）、ＹＳ－２Ｄ－２培地（ＣＨＩＲ９９０２１非含有）及びＹＳ－２Ｄ－４培地（Ｙ２７６３２非含有）では、細胞増殖が観察されず、ＨＳ細胞の細胞塊も観察されなかった。
　以上の結果から、ＥＧＦ、ＧＳＫ３β阻害剤及びＲＯＣＫ阻害剤は、卵黄嚢細胞からＨＳ細胞への誘導に、必須の因子であることが確認された。ＴＧＦβ／ＳＭＡＤ阻害剤は、上記３種の因子と組み合わせて用いることにより、ＨＳ細胞の誘導を効率的に行うことができると考えられた。さらに、ＨＤＡＣ阻害剤及びｐ３８阻害剤を培地に添加することにより、ＨＳ細胞の誘導をより効率的に行うことができると考えられた。
［実験例５］
（ＨＳ細胞の長期培養）
　実験例１で得られたＨＳ細胞について、ＹＳ－２Ｄ培地又はＹＳ培地を用いて、３７℃で、６カ月以上の長期培養を行った。ＨＳ細胞は、３日毎に、実験例１で記載した方法により継代した。
　６カ月以上の培養期間中、ＨＳ細胞は、継代後の培養により、図１と同様の細胞塊を形成した。６カ月以上の培養後のＨＳ細胞を用いて、実験例２と同様の方法により、ＨＳオルガノイドを形成した。その結果、図２と同様のＨＳオルガノイドを形成することが確認された。
　上記の結果から、ＨＳ細胞は、６カ月以上の長期培養による維持が可能であることが確認された。
［実験例６］
（シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ解析）
　実験例２と同様の方法によりＨＳオルガノイドを得た。ＨＳ細胞及びＨＳオルガノイドについて、シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ解析を行った。
　図５に、シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ解析により得られた遺伝子発現データを、ＵＭＡＰ（Ｕｎｉｆｏｒｍ　Ｍａｎｉｆｏｌｄ　Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）解析した結果を示す。卵黄嚢の遺伝子発現データとして、Issac Goh et al.（Science. 2023 Aug 18;381(6659)）で報告されたデータを利用した。実験例３における結果と同様に、ＨＳオルガノイドの遺伝子発現パターンは、卵黄嚢内胚葉の遺伝子発現パターンを類似していた。
　図６に、シングルセルＲＮＡ－ｓｅｑ解析により得られた遺伝子発現データに基づいて、ＨＳ細胞とＨＳオルガノイドとの遺伝子発現を比較した結果を示す。図６における上段（Ａ）は、ＤＮＡ複製及び細胞分裂等の細胞増殖に関わる遺伝子の発現を示す。図６における下段（Ｂ）は、生体分子（脂質、糖質、タンパク質）の取込、代謝、輸送及び硫酸抱合；並びにＭＡＰＫシグナル活性等に関わる遺伝子の発現を示す。ＨＳオルガノイドでは、ＨＳ細胞と比較して、細胞増殖に関わる遺伝子の発現が減少し、卵黄嚢の機能に関する遺伝子の発現が亢進した。
　本開示によれば、ヒトにも適用可能であり、長期培養により維持可能なハイポブラスト幹細胞を製造可能な、ハイポブラスト幹細胞の製造方法、前記製造方法に使用可能なハイポブラスト幹細胞の誘導用培地、前記製造方法により製造されるハイポブラスト幹細胞、前記ハイポブラスト幹細胞を用いた卵黄嚢オルガノイドの製造方法、及び前記ハイポブラスト幹細胞を含む卵黄嚢オルガノイドを提供することができる。前記ハイポブラスト幹細胞及び卵黄嚢オルガノイドは、妊娠初期を対象とする薬物評価試験、再生医療、生殖補助医療等への応用が期待される。
　以上、本発明の好ましい実施例を説明したが、本発明はこれら実施例に限定されることはない。本発明の趣旨を逸脱しない範囲で、構成の付加、省略、置換、およびその他の変更が可能である。本発明は前述した説明によって限定されることはなく、添付のクレームの範囲によってのみ限定される。

Claims (12)

  1. 　哺乳動物の卵黄嚢から単離された細胞を、上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する培地で培養する工程を含む、ハイポブラスト幹細胞の製造方法。
  2. 　前記培地が、ＴＧＦβ／ＳＭＡＤ阻害剤をさらに含有する、請求項１に記載のハイポブラスト幹細胞の製造方法。
  3. 　前記培地が、ＨＤＡＣ阻害剤及びｐ３８阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種をさらに含有する、請求項１又は２に記載のハイポブラスト幹細胞の製造方法。
  4. 　上皮成長因子、ＧＳＫ３β阻害剤、及びＲＯＣＫ阻害剤を含有する、
    　ハイポブラスト幹細胞の誘導用培地。
  5. 　ＴＧＦβ／ＳＭＡＤ阻害剤をさらに含有する、請求項４に記載のハイポブラスト幹細胞の誘導用培地。
  6. 　ＨＤＡＣ阻害剤及びｐ３８阻害剤からなる群より選択される少なくとも１種をさらに含有する、請求項４に記載のハイポブラスト幹細胞の誘導用培地。
  7. 　哺乳動物の卵黄嚢から単離された細胞から、ハイポブラスト幹細胞を誘導するために用いられる、請求項４～６のいずれか一項に記載のハイポブラスト幹細胞の誘導用培地。
  8. 　下記（ａ）～（ｅ）の特徴を有する、ハイポブラスト幹細胞：
    　（ａ）哺乳動物の卵黄嚢から単離された細胞から誘導された細胞である；
    　（ｂ）前記哺乳動物の卵黄嚢から単離された細胞と比較して、α－フェトプロテインの発現量が低い；
    　（ｃ）α－フェトプロテイン及びアルブミンからなる群より選択される少なくとも１種を発現する細胞を含む卵黄嚢オルガノイドへの分化能を有する；
    　（ｄ）増殖能を有する；及び
    　（ｅ）細胞塊を形成する。
  9. 　請求項４～６のいずれか一項に記載のハイポブラスト幹細胞の誘導用培地で継代培養を行うことにより、６カ月以上の維持培養が可能な、請求項８に記載のハイポブラスト幹細胞。
  10. 　ヒトの卵黄嚢から単離された細胞から誘導された細胞である、請求項８に記載のハイポブラスト幹細胞。
  11. 　請求項８に記載のハイポブラスト幹細胞を、ハイドロゲル内で培養する工程を含む、卵黄嚢オルガノイドの製造方法。
  12. 　請求項８に記載のハイポブラスト幹細胞を含む、卵黄嚢オルガノイド。
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