WO2025242591A1 - Verfahren zum effizienten enzymatischen abbau aromatischer polycarbonate - Google Patents

Verfahren zum effizienten enzymatischen abbau aromatischer polycarbonate

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WO2025242591A1
WO2025242591A1 PCT/EP2025/063663 EP2025063663W WO2025242591A1 WO 2025242591 A1 WO2025242591 A1 WO 2025242591A1 EP 2025063663 W EP2025063663 W EP 2025063663W WO 2025242591 A1 WO2025242591 A1 WO 2025242591A1
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enzyme
organic solvent
polar organic
seq
amino acid
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Kristina Schell
Lukas REISKY
Simone Goebbels
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Covestro Deutschland AG
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Covestro Deutschland AG
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/02—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group
    • C12P7/22—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a hydroxy group aromatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/01—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12Y301/01074—Cutinase (3.1.1.74)

Definitions

  • the present invention provides an efficient enzymatic process for the cleavage of aromatic carbonates.
  • the sequence of the process steps plays a crucial role in this process.
  • Polycarbonates characterized by high transparency and impact strength can be obtained through the reaction of phosgene and bisphenol A. Because of these properties, such polycarbonates have found widespread use as glass substitutes, in vehicle construction, and as casings for electronic devices, such as mobile phones. Accordingly, the annual production of these polymers is very high.
  • polycarbonates are thermoplastic, recycling by melting is generally possible. However, this is complicated by the fact that polycarbonates are often mixed with additives to improve their application properties. Separating these additives may be desirable, but is technically challenging. Furthermore, repeated melting of a polycarbonate leads to partial depolymerization, which can release bisphenol A. Due to the harmful effects of bisphenol A on health, this is undesirable and limits the number of recycling cycles for the polymer. If polycarbonates are used in mixtures with other thermoplastics, the additional problem of separating these mixtures arises during reuse if pure polymers are required.
  • the present invention is based on an extensive investigation of known and unknown amino acid sequences for the desired enzymatic activity. During the analysis of enzyme activity, it was surprisingly found that for all enzymes exhibiting the desired activity, the process has a significant influence on the efficiency of the degradation. It makes a crucial difference whether a mixture of enzyme, buffer, and a polar organic solvent is mixed with the polymer to be degraded, or whether the polymer is first pretreated with the polar organic solvent and then the enzyme is added with the appropriate buffer. The study underlying the present invention has shown that the latter process leads to noticeably higher degradation rates.
  • the present invention relates to a method comprising the steps a) providing an aromatic polycarbonate; b) contacting the aromatic polycarbonate with a composition containing a polar organic solvent; c) contacting an enzyme capable of cleaving ester bonds of aromatic carbonates with the mixture obtained in process step b); and d) incubating the mixture from process step b) with the enzyme.
  • Providing an aromatic polycarbonate means that the aromatic polycarbonate is prepared in a manner that enables enzymatic degradation. This may, in particular, mean separating the aromatic polycarbonate from impurities. If these impurities can inhibit the enzymes used or hinder subsequent purification or utilization of the degradation products, such separation is preferable. Furthermore, it is preferred that the The aim is to increase the surface area to volume ratio of the aromatic polycarbonate. This is particularly advantageous for recycling larger components. All methods known to those skilled in the art for comminuting solids can be used for this purpose. Preferred methods include grinding, cryogenic grinding, cryogenic comminution in liquid nitrogen, comminution by ultrasound, comminution with suitable solvents, or by melting. Grinding is particularly preferred.
  • the aromatic polycarbonate provided is in a grain size of 0.01 to 5 mm, preferably 0.05 to 2 mm, more preferably 0.05 to 1 mm and particularly preferably 0.1 to 0.8 mm.
  • aromatic polycarbonate preferably refers to polymers obtained by reacting at least one compound selected from the group consisting of bisphenol A, bisphenol S, dihydroxydiphenyl sulfide, tetramethylbisphenol A, 1,1-bis(4-hydroxyphenyl)-3,3,5-trimethylcyclohexane (BPTMC), and 1,1,1-tris(4-hydroxyphenyl)ethane (THPE) with phosgene or diphenyl carbonate.
  • BPTMC 1,1-bis(4-hydroxyphenyl)-3,3,5-trimethylcyclohexane
  • THPE 1,1,1-tris(4-hydroxyphenyl)ethane
  • Such polycarbonates preferably have a number-average molecular weight between 10,000 and 50,000 g/mol, more preferably between 18,000 and 40,000 g/mol.
  • such polycarbonates contain small amounts of tert-butylphenol and/or cumylphenol. These are used as chain terminators in the polymerization.
  • Preferred polycarbonates are those obtainable by reacting bisphenol A with phosgene or diphenyl carbonate. The presence of other compounds mentioned above is not excluded, but less preferred. It is preferred that bisphenol A constitutes at least 80 wt.%, preferably at least 90 wt.%, and particularly preferably at least 95 wt.% of the total weight of all hydroxy-functional components of the polycarbonate.
  • Such polycarbonates are preferably defined by formula (I).
  • a compound according to formula (I) is typically obtained by the reaction of bisphenol A and phosgene or by a melt condensation of bisphenol A and diphenyl carbonate.
  • the aromatic polycarbonate is present as a component of a mixture of at least two different polymers. Different polymers are understood here to be those cross-linked by different functional groups. Thus, in this embodiment, the aromatic polycarbonate is present together with at least one polymer that is not a polycarbonate.
  • a polycarbonate as defined above is present as a mixture with at least one polymer selected from the group consisting of polyesters, styrene-acrylonitrile copolymer, and acrylonitrile-butadiene-styrene copolymer. Polyethylene terephthalate and/or polybutylene terephthalate are preferred as polyesters. It is particularly preferred that a bisphenol A-based polycarbonate is present as a mixture with at least one of the aforementioned polymers.
  • Aromatic polycarbonates can thus be selectively removed from polymer mixtures.
  • non-polycarbonate polymers can be purified in this way. This enables the recovery of pure polymers from polycarbonate-containing polymer mixtures.
  • the "contacting of the aromatic polycarbonate with a composition containing an organic polar solvent” is achieved by mixing the two components. All methods familiar to those skilled in the art for mixing granular solids, particularly those with the particle sizes defined above, and liquids can be used here. No significant incubation time is required after contacting the aromatic polycarbonate with the polar organic solvent and before contacting the aromatic polycarbonate with the enzyme used according to the invention. The process steps can therefore follow one another with a time interval of 5, 15, 45, 120, or 240 seconds.
  • a “polar organic solvent” is preferably an organic solvent that contains no carbonate or ester groups and has a log P value of at most 1.3.
  • Preferred polar organic solvents are acetone, acetonitrile, dichloromethane, THF, and DMF.
  • DMSO is particularly preferred as a polar organic solvent.
  • composition containing a polar organic solvent is a composition of liquids containing at least one of the polar organic solvents defined above. It may also contain two, three, or more of these solvents. Additionally, the composition may contain water or nonpolar organic solvents. However, to achieve the strongest possible effect, it is preferred that the composition, based on its total weight, consists of at least 50% by weight, more preferably at least 65% by weight, even more preferably at least 80% by weight, and most preferably at least 90% by weight of one or more of the polar organic solvents defined above. In particular, a composition consisting of at least 95% by weight of one or more of the polar organic solvents defined above is preferred.
  • the enzyme added in process step b) is preferably present in a suitable buffer and is brought into contact with the mixture obtained in process step b) in such a way that the enzyme can react with the aromatic polycarbonate contained in the mixture.
  • the enzyme can be dissolved in the buffer or immobilized on a solid.
  • continuous processes are also possible in principle, in which the mixture from process step b) is fed into the first opening of the reaction vessel and withdrawn from the second. The residence time—and thus the possible reaction time—then results from the flow rate of the mixture and the volume of the tubular reaction vessel.
  • the volume of the buffer containing the enzyme added in process step c), the volume of the composition added in process step b), and the concentration of the polar organic solvent in this composition are adjusted so that the proportion of the polar organic solvent to the total volume of the liquid at the end of process step c) is between 10 and 50 vol.%.
  • An enzyme that can cleave ester bonds of aromatic carbonates is preferably an enzyme that can cleave the carbonate bond shown in formula (II) given below.
  • RI is selected from the group consisting of hydrogen, hydroxyl, and any organic residues
  • R2 independently of RI, is selected from the group consisting of hydrogen, a compound according to formula (II) and any organic residues.
  • the carbonate group to which R2 is bonded is located in the para position; more preferably, both substituents, RI and the oxygen of the carbonate group, are located in the para position as shown in formula (I aa):
  • cleavage of the ester bond refers to the hydrolytic cleavage of the carbonate group represented in formula (II) or (Ia). This releases a diphenylmethane derivative as an alcohol and a carbonate derivative as a carboxylic acid. Cleavage of the carbonate group at the oxygen atom bearing R2 yields a primary alcohol derived from R2 and a carboxylic acid derived from diphenylmethane. If R2 in formula (Ia) is hydrogen, carbonic acid is released. If RI is a hydroxyl group, bisphenol A is released.
  • a particularly preferred test substrate is a bisphenol A-based polycarbonate defined by the general formula (I).
  • (c) is an enzyme defined by an amino acid sequence according to SEQ ID NO.: 11 or a variant thereof with at least 85% sequence identity; or
  • (d) is an enzyme defined by an amino acid sequence according to SEQ ID NO.: 12 or a variant thereof with at least 85% sequence identity.
  • Enzymes with sequence identities defined elsewhere in this application can be obtained by adding, exchanging, or deleting amino acids.
  • Such enzymes with amino acid sequences that differ from those of SEQ ID NO.: 1 to 12 are also referred to as "variants".
  • Each variant according to the invention is preferably characterized in that it can cleave the carbonate bond shown in formula (II). This is preferably demonstrated by the release of bisphenol from a polycarbonate obtained by the reaction of bisphenol A and phosgene.
  • the process according to the invention uses an enzyme whose amino acid sequence is defined as follows: (i) The amino acid positions of the enzyme homologous to the conserved amino acid positions according to SEQ ID NO.: 1 exhibit at least 90% greater (ii) preferably exhibits at least 95% sequence identity with the conserved amino acid positions from SEQ ID NO.: 1 and (ii) the amino acid positions homologous to the arbitrary amino acid positions from SEQ ID NO.: 1 exhibit at least 70%, preferably at least 80%, sequence identity with the homologous amino acid positions of one of the amino acid sequences selected from the group consisting of SEQ ID NO.: 3, 8, 2, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 13 and 14.
  • the arbitrary amino acid positions exhibit the aforementioned sequence identities with SEQ ID NO.: 3 or 8.
  • the process according to the invention employs an enzyme having an amino acid sequence as defined in SEQ ID NO.: 3, 8, 2, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13 or 14, or a variant of one of the aforementioned enzymes with at least 85% sequence identity to one of the aforementioned sequences, for the cleavage of an aromatic carbonate in an aqueous medium. All definitions for the aromatic carbonate given above also apply to this embodiment.
  • the incubation of the mixture from process step b) with the enzyme capable of cleaving ester bonds of aromatic carbonates is preferably carried out under physicochemical conditions that enable the enzyme to exhibit the desired activity. These conditions are, in particular, the pH, temperature, and ionic strength of the medium. These parameters can be determined for the enzyme in question through simple preliminary experiments. Suitable incubation conditions for the enzymes used in the study underlying this application can be found in the exemplary embodiments.
  • the medium in which the incubation takes place is preferably an aqueous medium.
  • This is a medium that consists of at least 50 wt% water, based on the total weight of all solvents present.
  • the pretreatment of the organic polycarbonate in process step b) introduces at least one polar organic solvent into the reaction mixture. Therefore, the aqueous medium contains at least one polar organic solvent.
  • the mass ratio of water and the at least one polar organic solvent is adjusted such that the proportion of the at least one polar organic solvent is between 10 and 50 wt%, and preferably 30 to 50 wt%, wherein the mass fractions of water and all solvents present, including the polar organic solvent, add up to 100%.
  • the aqueous medium consists of 80 wt%, more preferably 90 wt%, and most preferably 95 wt% water and the at least one polar organic solvent, based on the total mass of all solvents present.
  • the following exemplary embodiments serve to illustrate the present invention. They are not intended to limit the scope of protection of the patent claims in any way.
  • Genes of interest were synthesized by Eurofins Genomics (Ebersberg, Germany) and cloned into the pET26b(+) vector from Merck (Darmstadt, Germany) via restriction cloning with Xhol and Ndel, or cloned using suitable restriction sites at the multiple cloning site into one of the following vectors: pET21b(+), pET100D-TOPO, pBAD, pET28a(+). Heterologous expression of the enzymes was performed in E. coli BL21 (DE3) cells transformed with the plasmid construct.
  • the cells were either dissolved in 15 ml of lysis buffer (50 mM NaH2PO4 , 300 mM NaCl , and 10 mM imidazole) and lyse twice using ultrasound (Bandelin Sonoplus HD, Sonotrode MS73, Berlin, Germany) under constant cooling in an ice bath for 2 min (50% cycle), or resuspended in 6 ml of ammonium acetate buffer (20 mM ammonium acetate, 0.4% w/v n-dodecyl- ⁇ -maltoside, 1% w/v lysozyme, and 1 pl/ml benzoase) and incubated for 30 min at room temperature with shaking to lyse the cells. His-tagged enzymes were purified from the lysate by IMAC affinity chromatography.
  • BPA-PC (Makrolon 2408, Covestro GmbH AG) was milled to 500, 320, or 200 pm before use.
  • DMSO 1,3-bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]propane pH 7 or 0.45% (w/v) lyophilized enzyme lysate to achieve a total volume of 200 pl. 0% and 30% (v/v) DMSO concentrations were tested using 10 hydrolases.
  • the reactions were incubated at 50 °C, 60 °C, or 70 °C and 1000 rpm for 72 h. DMSO was then added to the reaction in a 1:1 ratio. The samples were pre-tested and incubated for 5 min. Centrifuged at 11,000 xg. The supernatant was diluted 1:10 and filtered with a PVDF filter (0.2 pm).
  • HPLC measurements were performed on an Agilent 1260 Infinity IL system (Santa Clara, USA).
  • the LC system was equipped with a multisampler (G7167A), a DAD (diode array detector) for UV and visible light, and a Zorbax Eclipse Plus C18 column (4.6 mm x 150 mm, 5 pm, Agilent, Santa Clara, USA).
  • a multisampler G7167A
  • DAD diode array detector
  • Zorbax Eclipse Plus C18 column 4.6 mm x 150 mm, 5 pm, Agilent, Santa Clara, USA.
  • 5 pl of sample was injected, and the column was heated to 40 °C.
  • the flow rate was 1.0 ml/min.
  • Table 2 The method developed for the analysis and quantification of the BPA-PC hydrolysis reaction is shown in Table 2.
  • the data were analyzed using Chromeeon Chromatography Data System 7.3.1 software (Thermo Scientific, Waltham, USA).
  • amino acid sequences of the enzymes are highly heterogeneous. This suggests that the observed effect is not limited to a specific group of enzymes with a particular amino acid sequence, but occurs in all enzymes capable of degrading aromatic polycarbonates. ⁇

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein effizientes enzymatisches Verfahren zur Spaltung von aromatischen Carbonaten, gezeigt am Beispiel der Hydrolyse von Bisphenol A Polycarbonat mittels mehrerer Lipasen/Cutinasen. Hierbei spielt die Abfolge der Verfahrensschritte eine wesentliche Rolle, da das Hinzufügen eines polaren, organischen Lösungsmittels zum Polycarbonat gezeigt am Beispiel von DMSO gefolgt vom Hinzufügen des Enzyms zu einer gesteigerten Hydrolyse führt.

Description

Verfahren zum effizienten enzymatischen Abbau aromatischer Polycarbonate
Die vorliegende Erfindung ein effizientes enzymatisches Verfahren zur Spaltung von aromatischen Carbonaten. Hierbei spielt die Abfolge der Verfahrensschritte eine wesentliche Rolle.
Durch die Reaktion von Phosgen und Bisphenol A können Polycarbonate erhalten werden, die sich durch hohe Transparenz und Schlagzähigkeit auszeichnen. Wegen dieser Eigenschaften haben derartige Polycarbonate weite Anwendung als Glasersatz, im Fahrzeugbau und als Hüllen von elektronischen Geräten, z.B. von Mobiltelefonen, gefunden. Entsprechend hoch ist die Jahresproduktion dieser Polymere.
Da Polycarbonate thermoplastisch sind, ist grundsätzlich ein Recycling durch Aufschmelzen möglich. Erschwert wird dies aber durch den Umstand, dass Polycarbonate häufig mit Additiven versetzt werden, um ihre anwendungstechnischen Eigenschaften zu verbessern. Ein Abtrennung dieser Additive kann wünschenswert sein, ist technisch aber schwierig. Zudem führt wiederholtes Aufschmelzen eines Polycarbonats zu einer teilweisen Depolymerisierung, wobei Bisphenol A freigesetzt werden kann. Wegen der gesundheitsschädlichen Eigenschaften von Bisphenol A ist dies unerwünscht und beschränkt die Anzahl der Recycling-Zyklen des Polymers. Wenn Polycarbonate in Mischungen mit anderen Thermoplasten verwendet werden, stellt sich bei der Wiederverwendung zusätzlich das Problem der Trennung dieser Gemische, wenn für die Weiterverwendung reine Polymere gewünscht sind.
Aus diesem Grund besteht ein erheblicher Bedarf nach weiteren Verfahren, mit denen Polycarbonate rezykliert werden können. Ein von anderen Polymeren gut bekannter Ansatz ist der gezielte Abbau des Polymers mit Hilfe von Enzymen, um unter schonenden Reaktionsbedingungen gut definierte Chemierohstoffe wiederzugewinnen. Dies ist z.B. bei Polyurethanen (EP 3 587 570) und Polyethylenterephthalat bereits gezeigt worden (Tournier (2020) „An engineered PET depolymerase to break down and recycle plastic bottles", Nature 580: 216-219. Auch für aliphatische Polycarbonate ist dies möglich (Suyama & Tokiwa (1997), „Enzymatic degradation of an aliphatic polycarbonate, poly(tetramethylene carbonate)", Enzyme and Microbial Technology, 20: 122-126").
Für die wegen ihrer umfangreichen Anwendung technisch und wirtschaftlich sehr wichtigen aromatischen Polycarbonate, insbesondere solche, die auf Bisphenol A basieren, sind technisch sinnvolle enzymatische Abbauverfahren bisher noch nicht beschrieben. Die Freisetzung von Bisphenol A aus solchen Verbindungen durch ein Bakterium, Pseudoxanthomonas sp., ist beschrieben worden (Yue et. al. (2021), „Biodegradation of bisphenol-A polycarbonate plastic by Pseudoxanthomonas sp. strain NY3600" Journal of Hazardous Materials, 416: 125775). Allerdings wurde nicht gezeigt, welche Enzyme für den Abbau verantwortlich sind. Es ist noch nicht einmal klar, ob es sich ein einziges Enzym oder um einen Enzymkomplex handelt. Für die technische Anwendung eines Recyclingverfahrens sind klar definierte und isolierte Enzyme aber wegen ihrer besser kontrollierbaren Eigenschaften vorzuziehen. Es wurde beschrieben (Artham et al. (2011), „Mechanistic investigations of lipase- catalyzed degradation of polycarbonate in organic solvents", Enzyme and Microbial Technology, 48: 71-79), dass Lipasen wie sie z.B. in Candidada rugosa oder Candida antarctica gefunden werden, Bisphenol A aus Polycarbonaten freisetzen. Es hat sich allerdings gezeigt, dass diese Reaktion von den dort eingesetzten Enzymen nicht in wässrigem Medium katalysiert wird. Der enzymatische Abbau von aromatischem Polycarbonat in organischen Lösungsmitteln wurde auch an anderer Stelle berichtet (Sivalingam & Madras (2004) „Dynamics of Lipase Catalyzed Enzymatic Degradation of Poly(bisphenol- A carbonate), Journal of Polymer Science, 91: 2391-2396).
Die vorliegende Erfindung basiert auf einer umfangreichen Untersuchung bekannter und unbekannter Aminosäuresequenzen auf die gewünschte enzymatische Aktivität. Im Zuge der Analyse der Enzymaktivität wurde überraschend festgestellt, dass für alle Enzyme, die die gewünschte Aktivität zeigen, die Verfahrensführung einen wesentlichen Einfluss auf die Effizienz des Abbaus hat. Es macht einen entscheidenden Unterschied, ob ein Gemisch von Enzym, Puffer und einem polaren organischen Lösungsmittel mit dem abzubauenden Polymer vermischt wird, oder ob das Polymer zunächst mit dem organischen polaren Lösungsmittel vorbehandelt wird und dann erst das Enzym mit dem entsprechenden Puffer zugesetzt wird. Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Studie hat gezeigt, dass die letztgenannte Verfahrensführung zu spürbar höheren Abbauleistungen führt.
Deswegen betrifft die vorliegende Erfindung in einer ersten Ausführungsform ein Verfahren enthaltend die Schritte a) Bereitstellen eines aromatischen Polycarbonats; b) Kontaktieren des aromatischen Polycarbonats mit einer Zusammensetzung, die ein polares organisches Lösungsmittel enthält; c) Kontaktieren eines Enzyms, das Esterbindungen aromatischer Carbonate spalten kann zu dem in Verfahrensschritt b) erhaltenen Gemisch; und d) Inkubation des Gemisches aus Verfahrensschritt b) mit dem Enzym.
Bereitstellen
„Bereitstellen eines aromatischen Polycarbonats" bedeutet, dass das aromatische Polycarbonat in einer Weise vorbereitet wird, die einen enzymatischen Abbau ermöglicht. Dies kann insbesondere die Trennung des aromatischen Polycarbonats von Fremdstoffen bedeuten. Wenn diese Fremdstoffe die verwendeten Enzyme hemmen können oder eine anschließende Aufreinigung oder Verwertung der Abbauprodukte behindern, ist eine solche Trennung vorzuziehen. Weiterhin ist es bevorzugt, das Verhältnis von Oberfläche und Volumen des aromatischen Polycarbonats zu vergrößern. Dies ist für das Recycling größerer Bauteile besonders vorteilhaft. Hierzu können alle dem Fachmann geläufigen Verfahren zur Zerkleinerung von Feststoffen zur Anwendung kommen. Bevorzugt sind das Mahlen, Kryomahlen, die kryogene Zerkleinerung in flüssigem Stickstoff, die Zerkleinerung durch Ultraschall, die Zerkleinerung mit Hilfe geeigneter Lösungsmittel oder durch Schmelzen. Besonders bevorzugt ist das Mahlen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das bereitgestellte aromatische Polycarbonat in einer Korngröße von 0,01 bis 5 mm, bevorzugt 0,05 bis 2 mm, stärker bevorzugt 0,05 bis 1 mm und besonders bevorzugt 0,1 bis 0,8 mm vor.
Aromatisches Polycarbonat
Der Begriff „aromatisches Polycarbonat" bezeichnet vorzugsweise Polymere, die durch Reaktion wenigstens einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bisphenol A, Bisphenol S, Dihydroxydiphenylsulfid, Tetramethylbisphenol A, l,l-Bis(4-hydroxyphenyl)-3,3,5- trimethylcyclohexan (BPTMC) und l,l,l-Tris(4-hydroxyphenyl)-ethan (THPE) mit Phosgen oder Diphenylcarbonat erhältlich sind. Derartige Polycarbonate haben vorzugsweise ein zahlenmittleres Molekulargewicht zwischen 10.000 und 50.000 g/mol, bevorzugt zwischen 18.000 und 40.000 g/mol. Optional enthalten derartige Polycarbonate geringe Anteile von tert-Butylphenol und/oder Cumylphenol. Diese werden in der Polymerisation als Kettenabbrecher verwendet.
Bevorzugte Polycarbonate sind solche, die durch Reaktion von Bisphenol A mit Phosgen oder Diphenylcabonat erhältlich sind. Hierbei ist die Anwesenheit weiterer der oben genannten Verbindungen nicht ausgeschlossen, aber weniger bevorzugt. Es ist bevorzugt, dass Bisphenol A wenigstens 80 Gew.-%, bevorzugt wenigstens 90 Gew.-% und besonders bevorzugt wenigstens 95 Gew.-% des Gesamtgewichts aller hydroxyfunktionellen Aufbaukomponenten des Polycarbonats ausmacht.
Derartige Polycarbonate werden vorzugsweise durch Formel (I) definiert. Eine Verbindung gemäß Formel (I) wird typischerweise durch die Reaktion von Bisphenol A und Phosgen oder durch eine Schmelzkondensation von Bisphenol A und Diphenylcarbonat erhalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt das aromatische Polycarbonat als Bestandteil einer Mischung aus wenigstens zwei unterschiedlichen Polymeren vor. Als unterschiedlich werden hier Polymere verstanden, die durch unterschiedliche funktionelle Gruppe vernetzt sind. Das aromatische Polycarbonat liegt also in dieser Ausführungsform zusammen mit wenigstens einem Polymer vor, das kein Polycarbonat ist. Bevorzugt liegt in dieser Ausführungsform ein Polycarbonat wie oben definiert als Gemisch mit wenigstens einem Polymer ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Polyestern, Styrol-Acrylnitril-Copolymer und Acrylnitril-Butadien-Styrol- Copolymer vor. Hierbei sind Polyethylenterephthalat und/oder Polybutylenterephthalat als Polyester bevorzugt. Es ist besonders bevorzugt, dass ein auf Bisphenol A basierendes Polycarbonat mit wenigstens einem der vorgenannten Polymeren als Gemisch vorliegt.
So ist es möglich, das Polycarbonat gezielt enzymatisch abzubauen, während das weitere oder die weiteren Polymere im Gemisch nicht angegriffen werden. Auf diese Art lassen sich aromatische Polycarbonate gezielt aus Polymergemischen entfernen. Umgekehrt werden auf diese Weise Polymere, die keine Polycarbonate sind, aufgereinigt. Dies ermöglicht die Rückgewinnung sortenreiner Polymere aus polycarbonathaltigen Polymergemischen.
Kontaktieren
Das „Kontaktieren des aromatischen Polycarbonats mit einer Zusammensetzung, die ein organisches polares Lösungsmittel enthält" erfolgt durch das Vermischen der beiden Komponenten. Hier können alle dem Fachmann geläufigen Verfahren der Mischung von gekörnten Feststoffen, insbesondere solchen mit den oben definierten Korngrößen, und Flüssigkeiten genutzt werden. Nach dem Kontaktieren des aromatischen Polycarbonats mit dem polaren organischen Lösungsmittel und vor dem Kontaktieren des aromatischen Polycarbonats mit dem erfindungsgemäß einzusetzenden Enzym wird keine nennenswerte Inkubationszeit benötigt. Bei Verfahrensschritte können also mit einem Zeitabstand von 5, 15, 45, 120 oder 240 Sekunden aufeinander folgen.
Polares organisches Lösungsmittel
Ein „polares organisches Lösungsmittel" ist vorzugsweise ein organisches Lösungsmittel, das keine Carbonat- oder Estergruppen enthält und einen log P-Wert von höchstens 1,3 hat. Bevorzugte polare organische Lösungsmittel sind Aceton, Acetonitril, Dichlormethan, THF und DMF Besonders bevorzugt ist DMSO als polares organisches Lösungsmittel. Zusammensetzung
Die „Zusammensetzung enthaltend ein polares organisches Lösungsmittel" ist eine Zusammensetzung von Flüssigkeiten, die wenigstens eines der oben definierten polaren organischen Lösungsmitteln enthält. Sie kann auch zwei, drei oder mehrere dieser Lösungsmittel enthalten. Zusätzlich ist es möglich, dass die Zusammensetzung Wasser oder auch unpolare organische Lösungsmittel enthält. Um einen möglichst starken Effekt zu erzielen ist es aber bevorzugt, dass die Zusammensetzung bezogen auf ihr Gesamtgewicht zu wenigstens 50 Gew.-%, stärker bevorzugt wenigstens 65 Gew.-%, noch stärker bevorzugt wenigstens 80 Gew.-% und am stärksten bevorzugt wenigstens 90 Gew.-% aus einem oder mehreren der oben definierten polaren organischen Lösungsmittel besteht. Insbesondere ist eine Zusammensetzung bevorzugt, die zu wenigstens 95 Gew.-% aus einem oder mehreren der oben definierten polaren organischen Lösungsmittel besteht.
Kontaktieren eines Enzyms
Das in Verfahrensschritt zugegebene Enzym liegt vorzugsweise in einem geeigneten Puffer vor und wird mit diesem zusammen mit dem in Verfahrensschritt b) erhaltenen Gemisch so in Kontakt gebracht, dass das Enzym mit dem im Gemisch enthaltenen aromatischen Polycarbonat reagieren kann. Das Enzym kann hierbei im Puffer gelöst vorliegen, aber auch an einem Feststoff immobilisiert sein. Es ist aber auch umgekehrt denkbar, das in Verfahrensschritt b) erhaltene Gemisch in ein Reaktionsgefäß einzubringen, in dem das Enzym an einem Feststoff immobilisiert vorliegt. Bei rohrförmigen Reaktionsgefäßen sind so grundsätzlich auch kontinuierlich Verfahrensführungen denkbar, bei denen das Gemisch aus Verfahrensschritt b) in die erste Öffnung des Reaktionsgefäßes geführt und aus der zweiten entnommen wird. Die Verweildauer - und damit die mögliche Reaktionszeit - ergeben sich dann aus Flussrate des Gemisches und dem Volumen des rohrförmigen Reaktionsgefäßes.
Hierbei werden das Volumen des Puffers der das in Verfahrensschritt c) zugegebene Enzym enthält so wie das Volumen der in Verfahrensschritt b) zugegebenen Zusammensetzung und die Konzentration des polaren organischen Lösungsmittels in dieser Zusammensetzung so eingestellt, dass der Anteil des polaren organischen Lösungsmittels am Gesamtvolumen der Flüssigkeit am Ende des Verfahrensschritts c) zwischen 10 und 50 Vol.-% beträgt.
Enzym
Ein Enzym, das Esterbindungen aromatischer Carbonate spalten kann, ist vorzugsweise ein Enzym, das die in der unten gegebenen Formel (II) gezeigte Carbonatbindung spalten kann.
Wobei
RI ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Hydroxyl und beliebigen organischen Resten; und
R2 unabhängig von RI ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, einer Verbindung gemäß Formel (II) und beliebigen organischen Resten.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung befindet sich die Carbonatgruppe, an die R2 gebunden ist, in der para-Position, stärker bevorzugt, befinden sich beide Substituenten, RI und der Sauerstoff der Carbonatgruppe, in der para-Position wie in Formel ( I la) dargestellt:
Der Begriff „Spaltung der Esterbindung" bezieht sich auf die hydrolytische Spaltung der in Formel (II) oder ( I la) dargestellten Carbonatgruppe. Hierbei wird ein Diphenylmethan-Derivat als Alkohol und ein Derivat des Carbonats als Carbonsäure freigesetzt. Bei Spaltung der Carbonatgruppe am Sauerstoffatom, das R2 trägt, entsteht ein von R2 abgeleiteter primärer Alkohol und eine von Diphenylmethan abgeleitete Carbonsäure. Wenn in Formal (Ila) R2 Wasserstoff ist, so wird Kohlensäure freigesetzt. Wenn RI eine Hydroxylgruppe ist, so wird Bisphenol A freigesetzt. Ein besonders bevorzugtes Testsubstrat ist ein durch die allgemeine Formel (I) definiertes, auf Bisphenol A basierendes Polycarbonat.
Wie in den Ausführungsbeispielen belegt führt die Vorbehandlung eines aromatischen Polycarbonats mit einem polaren organischen Lösungsmittel bei allen Enzymen, deren Fähigkeit zur Spaltung aromatischer Polycarbonate festgestellt wurde, zu einem effizienteren Abbau. Unter „Abbau" wird in dieser Anmeldung die Freisetzung von Monomeren, insbesondere Bisphenol A, aus dem aromatischen Polycarbonat verstanden. Die Aminosäuresequenzen dieser Enzyme sind sehr heterogen. Deswegen ist davon auszugehen, dass dieser Effekt auf alle Enzyme mit den entsprechenden katalytischen Fähigkeiten verallgemeinerbar ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Enzym aber
(a) ein Enzym, das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 1 oder eine Variante des vorgenannten Enzyms, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 85 % Identität zu den in SEQ ID NO.: 1 definierten konservierten Aminosäuren definiert ist; oder
(b) ein Enzym, das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 2 oder 7 oder eine Variante eines der vorgenannten Enzyme, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 74 % Identität zu SEQ ID NO.: 2 oder wenigstens 85 % Sequenzidentität zu SEQ ID NO.: 7 definiert ist; oder
(c) ein Enzym ist, das eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 11 definiert ist oder eine Variante davon mit wenigstens 85 % Sequenzidentität; oder
(d) ein Enzym ist, das eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 12 definiert ist oder eine Variante davon mit wenigstens 85 % Sequenzidentität.
Enzyme mit den an anderer Stelle in dieser Anmeldung definierten Sequenzidentitäten zu den durch SEQ ID NO.: 2 bis SEQ ID NO.: 12 definierten Enzymen bzw. zu der durch SEQ ID NO.: 1 definierten Konsensussequenz können durch Hinzufügung, Austausch oder Deletion von Aminosäuren erhalten werden. Solche Enzyme mit Aminosäuresequenzen die von SEQ ID NO.: 1 bis 12 abweichen, werden auch als „Varianten" bezeichnet". Jede erfindungsgemäße Variante ist vorzugsweise dadurch gekennzeichnet, dass sie die in Formel (II) dargestellte Carbonatbindung spalten kann. Dies wird vorzugsweise durch Freisetzung von Bisphenol aus einem durch die Reaktion von Bisphenol A und Phosgen erhaltenen Polycarbonats nachgewiesen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird im erfindungsgemäßen Verfahren ein Enzym verwendet, dessen Aminosäuresequenz wie folgt definiert ist: (i) Die zu den konservierten Aminosäurepositionen gemäß SEQ ID NO.: 1 homologen Aminosäurepositionen des Enzyms weisen wenigstens 90 %, stärker bevorzugt wenigstens 95 % Sequenzidentität zu den konservierten Aminosäurepositionen aus SEQ ID NO.: 1 auf und (ii) die zu den beliebigen Aminosäurepositionen aus SEQ ID NO.: 1 homologen Aminosäurepositionen weisen wenigstens 70 %, bevorzugt wenigstens 80 % Sequenzidentität zu den homologen Aminosäurepositionen einer der Aminosäuresequenzen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO.: 3, 8, 2, 4, 5, 6, 7 , 9, 10, 13 und 14 auf. Bevorzugt weisen die beliebigen Aminosäurepositionen hierbei die vorgenannten Sequenzidentitäten zu SEQ ID NO.: 3 oder 8 auf.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird im erfindungsgemäßen Verfahren ein Enzym eingesetzt, das eine Aminosäuresequenz hat wie in SEQ ID NO.: 3, 8, 2, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 13 oder 14 definiert oder einer Variante eines der vorgenannten Enzyme mit wenigstens 85 % Sequenzidentität zu einer der vorgenannten Sequenzen zur Spaltung eines aromatischen Carbonats in einem wässrigen Medium. Alle oben gegebenen Definitionen für das aromatische Carbonat gelten auch für diese Ausführungsform.
Inkubation
Die Inkubation des Gemisches aus Verfahrensschritt b) mit dem Enzym, das Esterbindungen aromatischer Carbonate spalten kann, erfolgt vorzugsweise unter physikochemischen Bedingungen, die eine entsprechende Aktivität des Enzyms ermöglichen. Dies sind insbesondere pH, Temperatur und lonenstärke des Mediums. Diese lassen sich für das betreffende Enzym durch einfache Vorversuche ermitteln. Geeignete Inkubationsbedingungen für die in der dieser Anmeldung zugrunde liegenden Studie verwendeten Enzyme lassen sich den Ausführungsbeispielen entnehmen.
Das Medium, in dem die Inkubation erfolgt ist vorzugsweise ein wässriges Medium. Dies ist ein Medium, das bezogen auf das Gesamtgewicht aller anwesenden Lösungsmittel zu wenigstens 50 Gew.-% aus Wasser besteht. Durch die Vorbehandlung des organischen Polycarbonats in Verfahrensschritt b) wird wenigstens ein polares organisches Lösungsmittel in das Reaktionsgemisch eingetragen. Deswegen enthält das wässrige Medium wenigstens ein polares organisches Lösungsmittel. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Massenverhältnis von Wasser und dem wenigstens einen polaren organischen Lösungsmittel so eingestellt, das der Anteil des wenigstens einen polaren organischen Lösungsmittels zwischen 10 und 50 Gew.-%und bevorzugt 30 bis 50 Gew.-% liegt, wobei sich die Massenanteile von Wasser und aller anwesenden Lösungsmittel inklusive des polaren organischen Lösungsmittels zu 100 % addieren. Es ist besonders bevorzugt, dass das wässrige Medium bezogen auf die Gesamtmasse aller anwesenden Lösungsmittel zu 80 Gew.-%, stärker bevorzugt zu 90 Gew.-% und am stärksten bevorzugt zu 95 Gew.-% aus Wasser und dem wenigstens einen polaren organischen Lösungsmittel besteht. Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele dienen dazu, die vorliegende Erfindung zu illustrieren. Sie sollen den Schutzbereich der Patentansprüche in keiner Weise beschränken.
Beispiele
Rekombinante Expression
Gene von Interesse wurden von Eurofins Genomics (Ebersberg, Deutschland) synthetisiert und mittels Restriktionsklonierung mit Xhol und Ndel in den pET26b(+)-Vektor von Merck (Darmstadt, Deutschland) kloniert oder mit geeigneten Schnittstellen in der multiple cloning site in einen der folgenden Vektoren kloniert: pET21b(+), pETlOO D-TOPO, pBAD, pET28a(+). Die heterologe Expression der Enzyme erfolgte in mit dem Plasmid-Konstrukt transformierten E. coli BL21 (DE3)-Zellen. 4,5 ml LB-Medium mit 1 % (w/v) Glucose und 50 pg/ml Kanamycin wurden aus einer Glycerol-Stammkultur beimpft und über Nacht bei 37 °C und 200 rpm inkubiert. 200 ml ZYP-5052-Autoinduktionsmedium mit 50 pg/ml Kanamycin wurden mit 0,1 % frisch gewachsenen Zellen beimpft und bei 37 °C und 200 rpm für 5 h in Kolben mit Schikanen inkubiert. Die Expression erfolgte über Nacht bei 20 °C und 200 rpm. Die Zellen wurden bei 4 °C für 10 min bei 8000 x g geerntet. Die Zellen wurden entweder in 15 ml Lysepuffer (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCI und 10 mM Imidazol) gelöst und zweimal mit Ultraschall (Bandelin Sonoplus HD, Sonotrode MS73, Berlin, Deutschland) unter konstanter Kühlung in einem Eisbad für 2 min (Zyklus 50 %) aufgeschlossen oder mit 6 ml Ammoniumacetatpuffer (20 mM Ammoniumacetat, 0,4 % (w/v) n-Dodecyl-ß-maltosid, 1 % (w/v) Lysozym und 1 pl/ml Benzonase) resuspendiert und 30 min unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubiert, um die Zellen zu lysieren. Enzyme mit His-Tag wurden mittels IMAC-Affinitätschromatographie aus dem Lysat gereinigt.
Abbauversuche
BPA-PC (Makrolon 2408, Covestro Deutschland AG) wurde vor der Verwendung auf 500, 320 oder 200 pm gemahlen. Der Effekt von DMSO auf die Hydrolyse von 1 % (w/v) BPA-PC wurde untersucht. Reaktionen mit 0, 10, 20, 30, 40 und 50 % (v/v) DMSO wurden angesetzt indem zu dem BPA-PC 100 mM 1,3-Bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]propane Puffer pH 7 und ThcCutl-ACCG und LCC- ICCG zu einer finalen Konzentration von 50 pg/ml zugegeben wurde. Der entsprechende Anteil DMSO wurde zu der Lösung pipettiert und die Reaktion bei 70°C und 1000 rpm für 68 h inkubiert.
Zur Untersuchung der Zugabe Reihenfolge von DMSO wurde zusätzlich DMSO direkt zum BPA-PC zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 100 mM 1,3-Bis[tris(hydroxymethyl)methylamino]propan pH 7 oder 0,45 % (w/v) lyophilisiertem Enzymlysat, um ein Gesamtvolumen von 200 pl zu erreichen. Mit 10 Hydrolasen wurden 0 % und 30 % (v/v) DMSO als Bedingungen getestet.
Die Reaktionen wurden bei 50 °C, 60 °C oder 70 °C und 1000 rpm für 72 h inkubiert. Anschließend wurde DMSO im Verhältnis 1:1 zur Reaktion hinzugegeben. Die Proben wurden gevortext und 5 min bei 11.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde 1:10 verdünnt und mit einem PVDF-Filter (0,2 pm) filtriert.
Tabelle 1: Reaktionstemperaturen der verwendeten Enzyme
Die HPLC-Messungen wurden an einem Agilent 1260 Infinity Il-System (Santa Clara, USA) durchgeführt. Die LC war mit einem Multisampler (G7167A), einem DAD (Diodenarray-Detektor) für UV und den sichtbaren Lichtbereich und einer Zorbax Eclipse Plus C18-Säule (4,6 mm x 150 mm, 5 pm, Agilent, Santa Clara, USA) ausgestattet. Für alle Methoden wurden 5 pl Probe injiziert und die Säule auf 40 °C beheizt. Der Fluss betrug 1,0 ml/min. Die für die Analyse und Quantifizierung der BPA-PC-Hydrolyse Reaktion entwickelte Methode ist in Tabelle 2 aufgeführt. Die Daten wurden mit der Software Chromeieon Chromatography Data System 7.3.1 (Thermo Scientific, Waltham, USA) analysiert.
Tabelle 2: HPLC-Methode
Die nachfolgende Tabelle 3 zeigt den Einfluss verschiedener DMSO-Anteile auf die Hydrolyse von BPA-
PC zu BPA für 2 ausgewählte Enzyme. Für ThcCutl-ACCG zeigten DMSO-Konzentrationen ab 20 % eine Erhöhung des Umsatzes bis zu Vollumsatz, wenn zuerst DMSO zugegeben wurde. Wenn zuerst Enzymlösung und danach DMSO zugegeben wurde, war der Umsatz bei 10-40 % DMSO in der Reaktion höher als im Vergleich zu der Reaktion ohne DMSO mit maximal 93 % Umsatz zu BPA bei 30 % DMSO.
Bei LCC-ICCG war ein ähnlicher Trend zu beobachten und der höchste Umsatz von 72 % war bei 30 % DMSO Zugabe bevor die Enzymlösung zugegeben wurde. Alle Angaben zum Anteil des DMSO beziehen sich auf den Volumenanteil von DMSO bezogen auf das Gesamtvolumen des fertigen Reaktionsansatzes, der DMSO, Puffer und Enzym enthält.
Tabelle 3: Einfluss unterschiedlicher DMSO-Konzentrationen auf ausgewählte Enzyme
In der nachfolgenden Tabelle 4 sind die Ergebnisse der Abbauversuche mit 10 Hydrolasen zusammengefasst.
Tabelle 4: Überblick über die Abbauversuche mit allen getesteten Enzymen
*Dieses Enzym wurde nur unzureichend exprimiert. Die Ergebnisse sind deswegen nicht aussagekräftig.
Es ist erkennbar, dass bei allen Enzymen, die Polycarbonat abbauen können, die getrennte Zugabe von DMSO und dem enzymhaltigen Puffer zu einer Steigerung der Abbauleistungen führt. Hierbei ist es wesentlich, dass das DMSO zuerst zum Substrat zugegeben wird.
Die Aminosäuresequenzen der Enzyme sind untereinander sehr heterogen. Dies deutet darauf hin, dass der beobachtete Effekt nicht auf eine bestimmte Gruppe von Enzymen mit spezieller Aminosäuresequenz beschränkt ist, sondern bei allen Enzymen auftritt, die aromatische Polycarbonate abbauen können.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren enthaltend die Schritte a) Bereitstellen eines aromatischen Polycarbonats; b) Kontaktieren des aromatischen Polycarbonats mit einer Zusammensetzung, die ein polares organisches Lösungsmittel enthält; c) Kontaktieren eines Enzyms, das Esterbindungen aromatischer Carbonate spalten kann zu dem in Verfahrensschritt b) erhaltenen Gemisch; und d) Inkubation des Gemisches aus Verfahrensschritt b) mit dem Enzym.
2. Das Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei das polare organische Lösungsmittel dadurch gekennzeichnet ist, dass es keine Carbonat- oder Estergruppen enthält und einen log P-Wert von höchstens 1,3 hat.
3. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Inkubation in Verfahrensschritt d) in einer wässrigen Zusammensetzung erfolgt, in der das Massenverhältnis von Wasser und dem wenigstens einen polaren organischen Lösungsmittel so eingestellt, das bezogen auf das Gesamtgewicht dr wässrigen Zusammensetzung der Anteil des wenigstens einen polaren organischen Lösungsmittels zwischen 10 und 50 Gew.-% liegt.
4. Das Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei die Zusammensetzung, die ein polares organisches Lösungsmittel enthält, bezogen auf ihr Gesamtgewicht zu wenigstens 50 Gew.-% aus dem wenigstens einen polaren organischen Lösungsmittel besteht.
5. Das Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Zusammensetzung, die ein polares organisches Lösungsmittel enthält, bezogen auf ihr Gesamtgewicht zu wenigstens 80 Gew.-% aus dem wenigstens einem polaren organischen Lösungsmittel besteht.
6. Das Verfahren gemäß eines der Ansprüche 1 bis 5, wobei die das aromatische Polycarbonat durch Reaktion wenigstens einer Verbindung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bisphenol A, Bisphenol S, Dihydroxydiphenylsulfid, Tetramethylbisphenol A, l,l-Bis(4- hydroxyphenyl)-3,3,5-trimethylcyclohexan (BPTMC) und l,l,l-Tris(4-hydroxyphenyl)-ethan (THPE) mit Phosgen oder Diphenylcarbonat erhalten wurde oder erhältlich ist.
7. Das Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei das aromatische Polycarbonat durch Reaktion von Bisphenol A mit Phosgen oder Diphenylcarbonat erhalten wurde oder erhältlich ist.
8. Das Verfahren gemäß eines der Ansprüche 1 bis 7 , wobei das Enzym, das Esterbindungen aromatischer Carbonate spalten kann
(a) ein Enzym ist, das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 1 oder eine Variante des vorgenannten Enzyms, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 85 % Identität zu den in SEQ ID NO.: 1 definierten konservierten Aminosäuren definiert ist; oder
(b) ein Enzym ist, das durch eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 2 oder 7 oder eine Variante eines der vorgenannten Enzyme, die durch eine Aminosäuresequenz mit wenigstens 74 % Identität zu SEQ ID NO.: 2 oder wenigstens 85 % Sequenzidentität zu SEQ ID NO.: 7 definiert ist; oder
(c) ein Enzym ist, das eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 11 definiert ist oder eine Variante davon mit wenigstens 85 % Sequenzidentität; oder
(d) ein Enzym ist, das eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO.: 12 definiert ist oder eine Variante davon mit wenigstens 85 % Sequenzidentität.
9. Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei in Verfahrensschritt d) Bisphenol A entsteht.
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