WO2025239447A1 - 逆転写酵素、ｄｎａ編集システム、並びに、これらを用いて標的ｄｎａを編集する方法及び標的ｄｎａが編集された細胞を製造する方法 - Google Patents

逆転写酵素、ｄｎａ編集システム、並びに、これらを用いて標的ｄｎａを編集する方法及び標的ｄｎａが編集された細胞を製造する方法

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WO2025239447A1
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amino acid
dna
terminal fragment
reverse transcriptase
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忠彦 吉間
哲史 佐久間
健 杉山
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Hiroshima University NUC
Sumitomo Chemical Co Ltd
Original Assignee
Hiroshima University NUC
Sumitomo Chemical Co Ltd
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N9/10—Transferases (2.)
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    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)

Definitions

  • the present invention relates to a reverse transcriptase, a DNA editing system, a method for editing target DNA using these, and a method for producing cells in which target DNA has been edited.
  • Genome editing technology specifically cuts target DNA using artificial DNA-cutting enzymes (e.g., zinc-finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs)) or RNA-guided DNA-cutting enzymes (e.g., clustered regularly interspaced short palindromic repeat and CRISPR-associated protein (CRISPR-Cas)), and utilizes the DNA repair system of living organisms to modify genes.
  • Genome editing technology can theoretically be applied to all biological species and cell lines that contain DNA, and allows editing (substitution, deletion, insertion) of anything from a single base to long chains. As such, it is used in a variety of fields, not only in agriculture and industry, but also in the medical field, such as gene therapy.
  • Prime editing is a technology that enables specific editing of all base substitutions, short insertions/deletions (indels), or a combination of these (Anzalone, A.V. et al., Nature 576, pp. 149-157, 2019 (Non-Patent Document 1)).
  • Prime Editor is a fusion of a nickase-type Cas protein (nCas, e.g., nicking Cas9 (nCas9)) that has partially lost its nuclease activity and a reverse transcriptase (RTase), and a prime editing guide RNA (pegRNA).
  • nCas nickase-type Cas protein
  • RTase reverse transcriptase
  • pegRNA prime editing guide RNA
  • the spacer sequence of the pegRNA recognizes the pegRNA recognition sequence on the target DNA, binds to the target DNA, and guides the Cas protein (nCas9 in Figures 1A to 1C) to the vicinity of the target site.
  • the induced Cas protein recognizes a protospacer adjacent motif (PAM) and creates a nick in the strand where the PAM is located (sometimes referred to herein as the "target strand").
  • PAM protospacer adjacent motif
  • the 3'-terminal sequence of the target strand released by the binding of the PEGRNA and the nick is then bound to the primer binding site (PBS) of the PEGRNA ( Figure 1B).
  • PBS primer binding site
  • RTase reverse transcriptase fused to the Cas protein (nCas9) performs reverse transcription using the template sequence (reverse transcription template (RTT)) contained on the 5' side of the PEGRNA following the PBS as a template.
  • Non-Patent Document 1 also describes improved prime editing systems, such as PE2, which introduces five mutations into the reverse transcriptase to increase its processing and binding capacity, and PE3, which introduces an additional nicking guide RNA (ngRNA) to create a nick in the non-edited strand, increasing the probability that the edited strand will be adopted during the DNA repair stage, and reports that these systems improve editing efficiency.
  • PE2 which introduces five mutations into the reverse transcriptase to increase its processing and binding capacity
  • PE3 which introduces an additional nicking guide RNA (ngRNA) to create a nick in the non-edited strand, increasing the probability that the edited strand will be adopted during the DNA repair stage, and reports that these systems improve editing efficiency.
  • ngRNA nicking guide RNA
  • PE3max a technology called PE3max has also been reported, in which two mutations are introduced into nCas9, a double nuclear localization signal (NLS) is placed between nCas9 and the reverse transcriptase, the codons of the reverse transcriptase are optimized, and a c-Myc NLS is placed at the C-terminus of the Prime Editor (Chen, P.J. et al., Nat Rev Genet 24, pp. 161-177, 2023 (Non-Patent Document 3)). Furthermore, it has been found that efficiency can be further improved by using this in combination with the pegRNA described in Non-Patent Document 2.
  • NLS nuclear localization signal
  • target DNA can be edited by prime editing even when nCas9 and reverse transcriptase are not fused together but are separated and expressed separately (Liu, B. et al., Nat Biotechnol 40, p. 1388-1393, 2022 (Non-Patent Document 4)).
  • target DNA can be edited by a double-strand break (DSB) using Cas9 proteins that do not impair nuclease activity (i.e., possess nuclease activity) through a mechanism essentially similar to that of prime editing (Li, X. et al., Nature Communications 14, Article number: 305, 2023, https://doi.org/10.1038/s41467-023-35870-0 (Non-Patent Document 5)).
  • DSB double-strand break
  • the present invention was made in consideration of the problems associated with the prior art described above, and aims to provide a novel reverse transcriptase useful for prime editing that is active only under specific conditions, more specifically, a novel split-type reverse transcriptase that is active only when all of its constituent fragments are present, a DNA editing system containing the same, a method for editing target DNA using the same, and a method for producing cells in which target DNA has been edited.
  • the inventors have designed a new reverse transcriptase that is split into an N-terminal fragment and a C-terminal fragment, and whose activity is restored only when all of the resulting fragments are present.
  • Using this as the reverse transcriptase in a prime editing system is expected to improve the specificity of prime editing.
  • the inventors first split the reverse transcriptase into an N-terminal fragment and a C-terminal fragment at multiple positions, and compared the activity of each fragment when used alone with the activity of both fragments when used in the presence of a split GFP. As a result, they found that reverse transcription activity was not observed in the N-terminal or C-terminal fragments alone, but was specifically restored only when both fragments were present, leading to the completion of the present invention.
  • the reverse transcriptase is a split reverse transcriptase containing two split N-terminal fragments and a C-terminal fragment
  • the N-terminal fragment and the C-terminal fragment are the following (a) to (c): (a) an N-terminal fragment and a C-terminal fragment obtained by splitting a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 at any one position within the region of positions 114 to 133 or any one position within the region of positions 167 to 186 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1; (b) an N-terminal fragment and a C-terminal fragment obtained by dividing a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 have been substituted, deleted, inserted and/or added at any one position within the region corresponding to positions 114 to 133 or any one position within the region corresponding to positions
  • Reverse transcriptase [2] The following (A) to (C): (A) at least one selected from the group consisting of the reverse transcriptase according to [1], an expression vector for the reverse transcriptase, and a polynucleotide encoding the reverse transcriptase; (B) at least one Cas protein selected from the group consisting of a Cas protein (Cas) having nuclease activity and a nickase-type Cas protein (nCas) partially lacking nuclease activity; an expression vector for the Cas protein; and at least one polynucleotide encoding the Cas protein; (C) at least one selected from the group consisting of a prime editing guide RNA (pegRNA) of the Cas protein, an expression vector of the pegRNA, and a polynucleotide encoding the pegRNA; A DNA editing system comprising: [3] (D) a nicking guide RNA (ngRNA) for the Cas protein, wherein
  • a method for editing target DNA comprising: [2] or [3], contacting the DNA editing system with target DNA and editing the target site of the target DNA;
  • the pegRNA comprises, in order from the 5' side, a spacer sequence, a template sequence, and a primer binding sequence,
  • the spacer sequence is a sequence that binds to a pegRNA recognition sequence that includes a complementary sequence of the target site
  • the template sequence is a sequence that serves as a template for the reverse transcriptase
  • the primer binding sequence is a sequence that binds to a primer sequence on the 5' side of the target site.
  • a method for producing a cell with edited target DNA comprising: [0023] The method includes a step of introducing the DNA editing system according to [2] or [3] into a cell, contacting the cell with a target DNA, and editing the target site of the target DNA, the pegRNA comprises, in order from the 5' side, a spacer sequence, a template sequence, and a primer binding sequence, the spacer sequence is a sequence that binds to a pegRNA recognition sequence that includes a complementary sequence of the target site, the template sequence is a sequence that serves as a template for the reverse transcriptase, and the primer binding sequence is a sequence that binds to a primer sequence on the 5' side of the target site.
  • the present invention makes it possible to provide a novel split reverse transcriptase that is active only when all of its constituent fragments are present, a DNA editing system containing the same, a method for editing target DNA using the system, and a method for producing cells in which target DNA has been edited.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of the vector "KS2" that expresses nCas9 under the control of the EF1a promoter, prepared in ⁇ Preparation of vector>.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of the vector "KS15” that expresses RTase under the control of a CMV enhancer/promoter, which was prepared in ⁇ Preparation of a vector>.
  • This is a schematic diagram showing the structure of the vector "#1373” that expresses Prime Editor (a fusion protein of nCas9 and RTase) under the EF1a promoter, which was prepared in ⁇ Preparation of vector>.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of the vector "KS2” that expresses nCas9 under the control of the EF1a promoter, prepared in ⁇ Preparation of vector>.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the positional relationship of PAM, a pegRNA recognition sequence (comp_pegRNA), and a ngRNA recognition sequence (comp_ngRNA) present on the target gene RNF2 used in ⁇ Preparation of vector>.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structure of pegRNA used in ⁇ Vector construction>.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the structures of (a) "KS2-1+ng+peg” and (b) "KS25-1+ng+peg” prepared in ⁇ Preparation of vector>.
  • FIG. 1 is a graph showing the results of comparing the editing efficiency of "KS25-1+ng+peg (all-in-one)" and the combination (separate) of "KS25+ng" with a vector expressing pegRNA, measured in ⁇ Preparation of vector>.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the mechanism of DNA editing by the cooperation of a split body (a fusion protein with split GFP), nCas9, pegRNA, and ngRNA, designed in ⁇ Test Example 1>.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the method of (preparation of N-terminal vector) in ⁇ Test Example 1> and ⁇ Test Example 2>.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the method of (preparation of C-terminal vector) in ⁇ Test Example 1> and ⁇ Test Example 2>.
  • 1 is a graph showing the editing efficiency (%) measured in Test Example 1.
  • 1 is a graph showing the editing efficiency (%) measured in Test Example 2.
  • FIG. 1 shows the results of alignment of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with the amino acid sequences of reverse transcriptases derived from various organisms (positions 3 to 62 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1).
  • FIG. 1 shows the results of alignment of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with the amino acid sequences of reverse transcriptases derived from various organisms (positions 3 to 62 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1).
  • FIG. 1 shows the results of alignment of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with the amino acid sequences of reverse transcriptases derived from various organisms (positions 3 to 62 of the amino acid sequence of SEQ ID NO:
  • FIG. 1 shows the results of alignment of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with the amino acid sequences of reverse transcriptases derived from various organisms (positions 63 to 122/positions 123 to 182 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1).
  • FIG. 1 shows the results of an alignment of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with the amino acid sequences of reverse transcriptases derived from various organisms (positions 183 to 242/positions 243 to 302 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1).
  • FIG. 1 shows the results of alignment of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with the amino acid sequences of reverse transcriptases derived from various organisms (positions 183 to 242/positions 243 to 302 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1).
  • FIG. 1 shows the results of an alignment of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with the amino acid sequences of reverse transcriptases derived from various organisms (positions 303 to 362 and positions 363 to 422 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1).
  • FIG. 1 shows the results of an alignment of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with the amino acid sequences of reverse transcriptases derived from various organisms (positions 423-482 and 483-542 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1).
  • FIG. 1 shows the results of an alignment of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 with the amino acid sequences of reverse transcriptases derived from various organisms (positions 543 to 602/603 to 662 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1).
  • Reverse transcriptase (sometimes referred to as "RTase” in this specification) is an RNA-dependent DNA polymerase, and is an enzyme that catalyzes the reverse transcription reaction that synthesizes DNA using single-stranded RNA as a template.
  • the reverse transcriptase of the present invention is a split-type reverse transcriptase that is split into an N-terminal fragment and a C-terminal fragment and contains these N-terminal and C-terminal fragments, and the presence of both the N-terminal and C-terminal fragments restores the reverse transcriptase activity that it had when unsplit.
  • the N-terminal fragment refers to the N-terminal fragment of the unsplit reverse transcriptase
  • the C-terminal fragment refers to the C-terminal fragment of the unsplit reverse transcriptase.
  • N-terminus (also referred to as the amino terminus, NH2 terminus, N-terminal portion, or amine terminus) refers to the free amine ( -NH2 ) group of the first amino acid residue of a polypeptide
  • C-terminus also referred to as the carboxy terminus, COOH terminus, or C-terminal portion refers to the free carboxy group (-COOH) of the last amino acid residue of a polypeptide.
  • the N-terminal fragment and C-terminal fragment are typically (a) N-terminal fragment and C-terminal fragment obtained by cleaving a polypeptide comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 at either one position within the region of positions 114 to 133 or one position within the region of positions 167 to 186 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is the amino acid sequence of a reverse transcriptase derived from murine leukemia virus (Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase (M-MLV RTase)).
  • split at any one position refers to cleavage between adjacent amino acids (producing the C-terminus and N-terminus).
  • combinations of N-terminal and C-terminal fragments (N-terminal fragment/C-terminal fragment) "split at any one position within the region of positions 114 to 133" include T1 (the first T in the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, hereinafter the same) to D114/L115 to E691, T1 to L115/R116 to E691, T1 to R116/E117 to E691, T1 to E117/V118 to E691, T1 to V118/N119 to E691, T1 to N119/K12 0 ⁇ E691, T1 ⁇ K120/R121 ⁇ E691, T1 ⁇ R121/V122 ⁇ E691, T1 ⁇ V122/E123 ⁇ E691, T1 ⁇ E 123/D124 ⁇ E691, T1 ⁇ D124/I125 ⁇ E691, T1 ⁇ I125/H126 ⁇ E
  • the division position of the N-terminal fragment and the C-terminal fragment is preferably any one position within the region of positions 115 to 132 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, more preferably any one position within the region of positions 118 to 129, even more preferably any one position within the region of positions 120 to 127, particularly preferably any one position within the region of positions 122 to 125, or any one position within the region of positions 168 to 185 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, more preferably any one position within the region of positions 171 to 182, even more preferably any one position within the region of positions 173 to 180, and particularly preferably any one position within the region of positions 175 to 178.
  • Figures 14A to 14F show the results of an alignment of the amino acid sequences of reverse transcriptases derived from each biological (viral) species listed in Table 1 below with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the reverse transcriptase of the present invention can be a reverse transcriptase derived from another biological species or a variant of reverse transcriptase (natural mutant or artificial mutant).
  • the reverse transcriptase of the present invention also includes split products of reverse transcriptase consisting of an amino acid sequence highly homologous to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, as long as reverse transcriptase activity can be restored in the presence of both the N-terminal and C-terminal fragments when split at the above-mentioned positions.
  • embodiments of the reverse transcriptase of the present invention also include those in which the N-terminal fragment and C-terminal fragment are (b) N-terminal fragments and C-terminal fragments obtained by splitting a polypeptide comprising an amino acid sequence in which one or more amino acid residues have been substituted, deleted, inserted, and/or added in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 at any one position within the region corresponding to positions 114 to 133 or any one position within the region corresponding to positions 167 to 186 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • preferred aspects of the split positions into the N-terminal fragment and the C-terminal fragment correspond to the preferred aspects in (a), respectively.
  • amino acid sequence in which amino acid residues have been substituted, deleted, inserted, and/or added refers to an amino acid sequence in which amino acid residues in the amino acid sequence have been substituted, deleted, inserted, or added, or an amino acid sequence in which two or more of these have been combined.
  • “multiple” refers to an integer of 30, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, or 2.
  • “one or multiple” preferably refers to 1 to 30, 1 to 20 (e.g., 1 to 10, 1 to 5, 1 to 3, 2 or less) amino acid residues.
  • embodiments of the reverse transcriptase of the present invention include an embodiment in which the N-terminal fragment and C-terminal fragment are (c) N-terminal fragments and C-terminal fragments obtained by splitting a polypeptide comprising an amino acid sequence having 90% or more homology to the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 at any one position within the region corresponding to positions 114 to 133 or any one position within the region corresponding to positions 167 to 186 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • preferred aspects of the split positions into the N-terminal fragment and the C-terminal fragment correspond to the preferred aspects in (a), respectively.
  • amino acid sequence homology refers to an amino acid in a target amino acid sequence that is located at the same position as an amino acid in a target amino acid sequence (control amino acid) when the two sequences are aligned using amino acid sequence analysis software, etc.
  • the target amino acid may be the same amino acid as the control amino acid, or may have the same properties as the control amino acid.
  • amino acid sequence identity the target amino acid is the same amino acid as the control amino acid.
  • amino acids with similar properties are well known in the technical field to which this invention pertains, and can be classified into, for example, acidic amino acids (aspartic acid and glutamic acid); basic amino acids (lysine, arginine, histidine); neutral amino acids can be classified into amino acids with hydrocarbon chains (glycine, alanine, valine, leucine, isoleucine, proline), amino acids with hydroxyl groups (serine, threonine), sulfur-containing amino acids (cysteine, methionine), amino acids with amide groups (asparagine, glutamine), amino acids with imino groups (proline), and amino acids with aromatic groups (phenylalanine, tyrosine, tryptophan).
  • acidic amino acids aspartic acid and glutamic acid
  • basic amino acids lysine, arginine, histidine
  • neutral amino acids can be classified into amino acids with hydrocarbon chains (glycine, alanine, valine, leucine, isoleu
  • amino acid sequence homology and identity are determined by comparing two sequences aligned to maximize sequence identity. Methods for determining numerical values (%) of sequence homology or identity are well known to those skilled in the art. Algorithms for obtaining optimal alignment and sequence identity can be any algorithm known to those skilled in the art (e.g., the BLAST algorithm, the FASTA algorithm, etc.), and sequence homology or identity of amino acid sequences can be determined using sequence analysis software such as BLASTP or FASTA.
  • amino acid sequence of the polypeptide (c) may have a homology of 90% or more with the amino acid sequence of (a) (SEQ ID NO: 1), but is preferably 95% or more (e.g., 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more). Identity of 90% or more, 95% or more (e.g., 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more) is more preferred.
  • a region "corresponding" to a region consisting of a specific amino acid sequence refers to a region consisting of an amino acid sequence that is located at the same position as the specific amino acid sequence (a reference amino acid sequence, for example, positions 114 to 133 or positions 167 to 186 of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1) when the amino acid sequence is aligned using amino acid sequence analysis software (for example, GENETYX-MAC, Sequencher, ClustalW, etc.) (for example, parameters: default values (i.e., initial settings)).
  • amino acid sequence analysis software for example, GENETYX-MAC, Sequencher, ClustalW, etc.
  • the "presence" of both the N-terminal fragment and the C-terminal fragment means that they are both present in the same reaction field, for example, within the same cell (more preferably, for example, within the same nucleus, the same mitochondrion, or the same chloroplast), and it is preferable that they are in close proximity to each other.
  • "close proximity” means that they are close enough to interact with each other, and in this case, they may be associated by bonding (for example, bonding via intermolecular forces, hydrogen bonds, etc.).
  • the regeneration of reverse transcriptase activity in the presence of both the N-terminal fragment and the C-terminal fragment can be appropriately confirmed by methods known to those skilled in the art.
  • split GFP GFP1-10 and GFP11, Berrios, K.N., et al., Nat Chem Biol 17, pp. 1262-1270, 2021 (Reference I)
  • Reference I is used to prepare a fusion protein of the N-terminal fragment and GFP1-10, and a fusion protein of the C-terminal fragment and GFP11.
  • These are then introduced into cells together with the Cas protein (preferably nCas) and pegRNA described below.
  • DNA editing does not occur or the editing efficiency is significantly low when each fusion protein is used alone, but when the two are combined, DNA editing occurs and the editing efficiency is high.
  • the occurrence of DNA editing and its editing efficiency can be measured by conventional methods, such as EditR analysis described in the Examples below.
  • EditR analysis described in the Examples below.
  • the editing efficiency of the target DNA when using each single fragment is 10% or less compared to the standard efficiency when using a reverse transcriptase (unsplit reverse transcriptase) consisting of a polypeptide with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1
  • the editing efficiency when the two fragments are combined is 15% or more compared to the standard efficiency, it can be determined that DNA editing occurs and the editing efficiency is high.
  • the reverse transcriptase of the present invention may be tagged with an epitope tag (e.g., a flag tag, an HA tag, etc.) for purification or detection, or with various transport signals (e.g., a nuclear transport signal, a mitochondrial transport signal, or a plastid transport signal).
  • an epitope tag e.g., a flag tag, an HA tag, etc.
  • transport signals e.g., a nuclear transport signal, a mitochondrial transport signal, or a plastid transport signal.
  • the N-terminal fragment and C-terminal fragment of the reverse transcriptase of the present invention can be obtained as appropriate by conventional methods. For example, they can be prepared by artificial synthesis based on amino acid sequence information, or they can be prepared at the nucleic acid level. That is, by introducing polynucleotides encoding the N-terminal fragment and C-terminal fragment, respectively, or an expression vector containing the polynucleotide into an appropriate host cell and expressing them, the N-terminal fragment and C-terminal fragment of the reverse transcriptase of the present invention can be obtained in the cell. When using expression vectors, the polynucleotides encoding the N-terminal fragment and C-terminal fragment may be contained in separate vectors or in a single vector.
  • aspects of the reverse transcriptase of the present invention include expression vectors for the reverse transcriptase (i.e., N-terminal fragment expression vector, C-terminal fragment expression vector, and N- and C-terminal fragment expression vectors) and polynucleotides encoding the reverse transcriptase (i.e., polynucleotides encoding the N-terminal fragment and C-terminal fragment, respectively).
  • expression vectors for the reverse transcriptase i.e., N-terminal fragment expression vector, C-terminal fragment expression vector, and N- and C-terminal fragment expression vectors
  • polynucleotides encoding the reverse transcriptase i.e., polynucleotides encoding the N-terminal fragment and C-terminal fragment, respectively.
  • the expression vector can be appropriately selected from vectors used in the field, and examples include plasmid vectors, viral vectors, phage vectors, phagemid vectors, BAC vectors, YAC vectors, MAC vectors, and HAC vectors.
  • the expression vector preferably includes a regulatory element operably linked to the polynucleotide to be expressed. Examples of the regulatory element include a promoter, an enhancer, an internal ribosome entry site (IRES), and other expression control elements (e.g., a transcription termination signal, such as a polyadenylation signal and a polyU sequence).
  • the expression vector preferably is one that can stably express the encoded protein without being integrated into the host genome. Such an expression vector can be prepared according to an appropriate conventional method.
  • Host cells into which the expression vector is introduced can be appropriately selected taking into consideration compatibility with the expression vector, and examples include prokaryotic cells such as Escherichia coli, actinomycetes, and archaea, and eukaryotic cells such as yeast, sea urchin, silkworm, zebrafish, mouse, rat, frog, tobacco, Arabidopsis, and rice.
  • prokaryotic cells such as Escherichia coli, actinomycetes, and archaea
  • eukaryotic cells such as yeast, sea urchin, silkworm, zebrafish, mouse, rat, frog, tobacco, Arabidopsis, and rice.
  • polynucleotide encompasses both DNA and RNA (mRNA), and each polynucleotide may have its codons optimized for purposes such as increasing expression efficiency within the cell.
  • the DNA editing system of the present invention comprises the following (A) to (C): (A) at least one selected from the group consisting of the reverse transcriptase of the present invention, an expression vector for the reverse transcriptase, and a polynucleotide encoding the reverse transcriptase; (B) at least one Cas protein selected from the group consisting of a Cas protein (Cas) having nuclease activity and a nickase-type Cas protein (nCas) partially lacking nuclease activity; an expression vector for the Cas protein; and at least one polynucleotide encoding the Cas protein; (C) at least one selected from the group consisting of a prime editing guide RNA (pegRNA) of the Cas protein, an expression vector of the pegRNA, and a polynucleotide encoding the pegRNA;
  • the DNA editing system of the present invention also includes: (D) It is also preferable that the reverse transcriptase further comprises
  • Target DNA DNA containing a target site to be subjected to DNA editing
  • target DNA DNA containing a target site to be subjected to DNA editing
  • target gene DNA containing a target site to be subjected to DNA editing
  • the target DNA according to the present invention has a structure in which one strand (first strand, target strand) contains, from the 5' end, a primer sequence, a target site, and a PAM (PAM_1), and the other strand (second strand) contains a pegRNA recognition sequence containing a sequence complementary to the target site. Furthermore, when the following ngRNA is used, an ngRNA recognition sequence is further present on the 3' side of PAM_1 of the first strand, and a PAM (PAM_2) is also present on the 5' side of the second strand.
  • PAM_1 and PAM_2 may have the same sequence or different sequences.
  • a "PAM (protospacer adjacent motif)" is a sequence recognized by a Cas protein. Its length varies depending on the type of Cas protein, but typically consists of 2 to 5 bases adjacent to the 3' side of the complementary sequence of the pegRNA recognition sequence (and the ngRNA recognition sequence when an ngRNA is used).
  • the nucleotide sequence of the PAM also varies depending on the type of Cas protein, but typically, when the Cas protein is Cas9 or nCas9, the nucleotide sequence of the PAM recognized by this protein is 5'-NGG, for example. However, the nucleotide sequence of such a PAM can also be changed by modifying the Cas protein (e.g., by introducing a mutation) as described below, which can expand the range of target sites available.
  • the "target site” according to the present invention refers to the region of one strand of double-stranded DNA that is replaced by the edited strand. However, because the replaced edited strand is not complementary, when repair is performed by the DNA repair mechanism using the edited strand as a template, both strands are ultimately edited ( Figure 1C (c)).
  • the target site according to the present invention is a site that is set according to the position of the PAM and is designed to include at least one base of the site that is subject to cleavage by the Cas protein (preferably single-strand cleavage by nCas).
  • the site that is subject to cleavage by the Cas protein depends on the type of Cas protein, but is usually between the third and fourth bases from the 5' side of the PAM.
  • the length of such a target site is preferably 1 to 100 bases, and more preferably 1 to 80 bases.
  • the "primer sequence” is a sequence located adjacent to the 5' side of the target site, to which the primer binding sequence of the pegRNA described below binds, and its 3' end serves as the starting point for the reverse transcription reaction by the reverse transcriptase. Therefore, the primer sequence is designed to include the 3' end of the target strand that is generated upon cleavage by the Cas protein (preferably single-strand cleavage by nCas).
  • the length of such a primer sequence is preferably 4 to 30 bases, more preferably 6 to 25 bases, and even more preferably 8 to 20 bases.
  • a "pegRNA recognition sequence” is a sequence that is recognized and bound by the spacer sequence of the pegRNA described below.
  • an “ngRNA recognition sequence” is a sequence that is recognized and bound by the spacer sequence of the ngRNA.
  • These pegRNA recognition sequences and ngRNA recognition sequences are set depending on the positions of the PAM and target site described above.
  • the lengths of the pegRNA recognition sequence and ngRNA recognition sequence according to the present invention are each independently dependent on the type of Cas protein, but in the case of Cas9 or nCas9, they are preferably 12 to 25 bases, more preferably 14 to 23 bases, and even more preferably 15 to 22 bases.
  • the pegRNA recognition sequence and the ngRNA recognition sequence according to the present invention are sequences located in different positions.
  • the length between the pegRNA recognition sequence and the ngRNA recognition sequence is preferably 0 (adjacent to each other) to 200 bases, more preferably 0 to 150 bases, and even more preferably 0 to 100 bases.
  • the nucleotide sequence of such target DNA is not particularly limited, and by designing the DNA editing system of the present invention (particularly pegRNA or ngRNA) to match that sequence, it can become the target of DNA editing in the present invention.
  • the target DNA of the present invention is preferably DNA present within a cell (endogenous DNA).
  • DNA present within a cell may be endogenous DNA or exogenous DNA.
  • endogenous DNA include genomic DNA in chromosomes, mitochondria, or chloroplasts
  • exogenous DNA include DNA introduced into a cell (reporter genes, marker genes, genes of viruses that infect a host, bacteria, or protozoa, etc.).
  • Cas protein refers to a CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeat)-associated enzyme, and is at least one selected from the group consisting of Cas proteins having nuclease activity and nickase-type Cas proteins partially deficient in nuclease activity.
  • the Cas protein may be a class 1-CRISPR-associated enzyme or a class 2-CRISPR-associated enzyme.
  • the Cas protein according to the present invention is preferably a class 2-CRISPR-associated enzyme, and more preferably a nickase-type Cas protein partially deficient in nuclease activity.
  • Cas proteins having nuclease activity are not particularly limited, but include, for example, Cas9 proteins (Cas9, for example, Cas9 proteins derived from Streptococcus pyogenes (SpCas9), Cas9 proteins derived from Staphylococcus aureus (SaCas9), and Cas9 proteins derived from Campylobacter jejuni (CjCas9)), Cas12a proteins (Cas12, for example, Cas12 derived from Francisella novi
  • Cas12a proteins include Cas12a (Cpf1) protein (FnCas12a) derived from Bacillus cida, Cas12a protein (LbCas12a) derived from Lachnospiraceae bacterium, Cas12a protein (AsCas12a) derived from Acidaminococcus sp., Cas12b (C2c1) protein (Cas9
  • a "nickase-type Cas protein partially deficient in nuclease activity” refers to a nickase-type Cas protein in which the nuclease activity of the Cas protein (Cas) is partially deficient and the protein retains nickase activity (single-strand DNA cleavage activity), and may also be referred to as “nCas (nicking Cas)" in some cases in this specification.
  • nCas is not particularly limited, but examples thereof include nickase-type Cas9 proteins (nCas9, for example, nSpCas9 (nickase-type SpCas9) in which at least one selected from the group consisting of D10, E762, D839, H983, D986, H840, and N863 of SpCas9 is mutated; nSaCas9 (nickase-type SaCas9) in which at least one selected from the group consisting of D10, D556, H557, and N580 of SaCas9 is mutated).
  • nSpCas9 nickase-type SpCas9
  • nSaCas9 nickase-type SaCas9 in which at least one selected from the group consisting of D10, D556, H557, and N580 of SaCas9 is mutated
  • nCas12a examples include those obtained by adding nickase-type Cas12a proteins (nCas12a, for example, R1138A for nLbCas12a (nickase-type LbCas12a); R1226A for nAsCas12a (nickase-type AsCas12a), etc.), nickase-type Cas12b proteins (nCas12b), nickase-type Cas14 proteins (nCas14), nickase-type Cas3 proteins (nCas3), and nickase-type Cas10d proteins (nCas10d).
  • the nCas of the present invention is preferably a nickase-type Class 2-CRISPR-associated Cas, and more preferably nCas9.
  • the amino acid sequences encoding these Cas proteins are publicly known and can be obtained from public databases, such as GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) or published literature.
  • Cas proteins of the present invention are not limited to these, and further mutations, such as mutations to alter PAM recognition, may be introduced (Benjamin, P. et al., Nature 523, pp. 481-485, 2015; Hirano, S. et al., Molecular Cell 61, pp. 886-894, 2016).
  • the Cas protein of the present invention may be one that has been appropriately modified (e.g., by substitution, deletion, insertion, and/or addition of amino acid residues) based on the amino acid sequence of a known Cas protein, as long as its functions (such as the ability to form a complex with pegRNA and, if necessary, ngRNA, nuclease activity, or nickase activity) are not inhibited.
  • the ability of the Cas protein to form a complex and nuclease activity or nickase activity can be confirmed, for example, by the Cas protein, when introduced into a cell together with pegRNA and reverse transcriptase, demonstrating target DNA editing efficiency equal to or greater than that (e.g., 50% or greater, preferably 80% or greater) that of the unmodified Cas protein (e.g., a Cas protein consisting of a polypeptide with a known amino acid sequence).
  • the corresponding Cas protein is preferably nCas.
  • the DNA editing system of the present invention may contain multiple Cas proteins, each of which is different for the pegRNA and ngRNA, but from the standpoint of simplicity, it is preferable that the system contain one type of Cas protein common to both.
  • the Cas protein of the present invention may be tagged with an epitope tag (e.g., a flag tag, an HA tag, etc.) for purification or detection, or with various transport signals (e.g., a nuclear transport signal, a mitochondrial transport signal, or a plastid transport signal).
  • an epitope tag e.g., a flag tag, an HA tag, etc.
  • transport signals e.g., a nuclear transport signal, a mitochondrial transport signal, or a plastid transport signal.
  • the Cas protein of the present invention can be obtained appropriately using conventionally known methods. For example, it can be prepared by artificial synthesis based on amino acid sequence information, or it can be prepared at the nucleic acid level. That is, a polynucleotide encoding the Cas protein or an expression vector for the Cas protein containing the polynucleotide can be introduced into an appropriate host cell and expressed, thereby obtaining the Cas protein in the cell.
  • the expression vector and host cell are the same as those listed for the reverse transcriptase of the present invention. Therefore, aspects of the Cas protein of the present invention also include an expression vector for the Cas protein and a polynucleotide encoding the Cas protein.
  • RNA is an RNA comprising, in order from the 5' side, a spacer sequence, a template sequence, and a primer binding sequence. It may be in the form of a single nucleotide chain (RNA chain), or may be in the form of two or more nucleotide chains joined together via bonds between complementary sequences.
  • “prime editing guide RNA” may also be referred to as “pegRNA (prime editing guide RNA)" in some cases.
  • spacer sequence also known as a “protospacer,” is originally a sequence derived from exogenous DNA incorporated during the adaptation process into the CRISPR structure of the bacterial genome from which the CRISPR-Cas system is derived.
  • the spacer sequence of the present invention is a sequence designed to recognize and bind to the pegRNA recognition sequence.
  • Such a spacer sequence is preferably a complementary sequence to the pegRNA recognition sequence, but any nucleotide sequence capable of hybridizing with the pegRNA recognition sequence to form a double strand need not be completely complementary.
  • sequence complementarity between the spacer sequence and the pegRNA recognition sequence is preferably 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more (e.g., 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more).
  • sequence complementarity can appropriately calculate the sequence complementarity using known methods (e.g., BLAST (NCBI)).
  • the spacer sequence of the pegRNA according to the present invention can be designed to correspond to the pegRNA recognition sequence corresponding to the desired target site.
  • Its length although depending on the type of Cas protein, is preferably 10 to 40 bases.
  • Cas9 or nCas9 it is more preferably 12 to 25 bases, even more preferably 14 to 23 bases, and even more preferably 15 to 22 bases.
  • the "template sequence,” also referred to as a “reverse transcription template (RTT),” is a sequence that serves as a template for the reverse transcriptase.
  • the template sequence of the present invention can be designed appropriately depending on the nucleotide sequence desired to be replaced with the target site.
  • the length of the template sequence of the present invention is preferably 1 to 100 bases, more preferably 5 to 90 bases, and even more preferably 10 to 80 bases.
  • a “primer binding sequence,” also referred to as a “primer binding site (PBS),” is a sequence designed to recognize and bind to a primer sequence at the 3' end generated on the target strand of target DNA by a Cas protein (preferably nCas).
  • a primer binding sequence is preferably a complementary sequence to the primer sequence, but it need not be completely complementary as long as it is a nucleotide sequence that can hybridize with the primer sequence to form a double strand.
  • sequence complementarity between such a primer binding sequence and the primer sequence is preferably 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more (e.g., 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more).
  • the length of the primer binding sequence according to the present invention is preferably 4 to 30 bases, more preferably 7 to 23 bases, and even more preferably 10 to 17 bases.
  • the pegRNA of the present invention preferably also includes a scaffold sequence as a tracrRNA structure that forms a complex with the Cas protein. Conventional scaffold sequences or sequences similar thereto can be used as appropriate as the scaffold sequence.
  • the pegRNA of the present invention may also include a reverse transcriptase termination sequence (e.g., a sequence that forms a hairpin loop structure), a linker, an RNA motif (e.g., tmpknot, tevopreQ1, xrRNA), an RNA aptamer (e.g., MS2, PP7, boxB, com), etc.
  • a reverse transcriptase termination sequence e.g., a sequence that forms a hairpin loop structure
  • an RNA motif e.g., tmpknot, tevopreQ1, xrRNA
  • an RNA aptamer e.g., MS2, PP7, boxB, com
  • the pegRNA of the present invention can be obtained appropriately using conventionally known methods. For example, it can be prepared by artificial synthesis based on sequence information designed according to the pegRNA recognition sequence, primer sequence, and desired template sequence, or it can be prepared at the nucleic acid level. That is, pegRNA can be obtained in suitable host cells by introducing and expressing a polynucleotide encoding the pegRNA or an expression vector for pegRNA containing the polynucleotide into the cells. The expression vector and host cell are the same as those described for the reverse transcriptase of the present invention. Therefore, aspects of the pegRNA of the present invention also include an expression vector for the pegRNA and a polynucleotide encoding the pegRNA.
  • the "nicking guide RNA” is a guide RNA used to nick the unedited strand, i.e., the strand opposite the target site, by the Cas protein (preferably nCas), for the purpose of improving the probability of DNA repair occurring in the target DNA using the strand synthesized by reverse transcriptase (edited strand) as a template (Non-Patent Document 1), and is also referred to as "ngRNA (nicking guide RNA)" in this specification.
  • the ngRNA of the present invention comprises at least a spacer sequence designed to recognize and bind to the ngRNA recognition sequence.
  • a spacer sequence is preferably a complementary sequence to the ngRNA recognition sequence, but it need not be completely complementary as long as it is a nucleotide sequence that can hybridize with the ngRNA recognition sequence to form a double strand; it does not have to be completely complementary.
  • the sequence complementarity between such a spacer sequence and the pegRNA recognition sequence is preferably 80% or more, 85% or more, 90% or more, or 95% or more (e.g., 96% or more, 97% or more, 98% or more, or 99% or more).
  • the spacer sequence of the ngRNA according to the present invention can be designed to correspond to the ngRNA recognition sequence corresponding to the desired target site.
  • Its length although depending on the type of Cas protein, is preferably 10 to 40 bases.
  • nCas9 it is more preferably 12 to 25 bases, even more preferably 14 to 23 bases, and even more preferably 15 to 22 bases.
  • the ngRNA of the present invention preferably also includes a scaffold sequence as a tracrRNA structure that forms a complex with the Cas protein.
  • the scaffold sequence may be any known scaffold sequence or a sequence similar thereto.
  • the ngRNA of the present invention can be obtained appropriately using conventionally known methods. For example, it can be prepared by artificial synthesis based on sequence information designed according to the ngRNA recognition sequence, or it can be prepared at the nucleic acid level. That is, ngRNA can be obtained within an appropriate host cell by introducing and expressing a polynucleotide encoding the ngRNA or an ngRNA expression vector containing the polynucleotide into the cell. The expression vector and host cell are the same as those listed for the reverse transcriptase of the present invention. Therefore, aspects of the ngRNA of the present invention also include the ngRNA expression vector and the polynucleotide encoding the ngRNA.
  • the present invention also provides a method for editing target DNA, comprising the steps of contacting the target DNA with the DNA editing system of the present invention and editing a target site in the target DNA.
  • the DNA editing system and the target DNA are each as described above for the DNA editing system of the present invention, including preferred embodiments thereof.
  • the DNA editing system i.e., the reverse transcriptase (N-terminal fragment, C-terminal fragment), Cas protein, pegRNA, and optionally ngRNA of the present invention
  • the spacer sequence of the pegRNA recognizes and binds to the corresponding pegRNA recognition sequence on the target DNA, guiding the Cas protein to the vicinity of the target site on the target DNA.
  • the presence of both the N-terminal fragment and the C-terminal fragment restores reverse transcriptase activity.
  • the primer binding sequence of the pegRNA recognizes the primer sequence containing the nick and binds to the 3' end of the target DNA (first strand, target strand) resulting from the introduction of the nick, and the reverse transcriptase synthesizes a DNA strand (edited strand) using the subsequent template sequence as a starting point and the primer sequence as a template.
  • the 5' flap see (b) of Figure 1C) from the non-edited strand, which is in equilibrium with the 3' flap (see (a) of Figure 1C) from the edited strand, is cut by an intracellular enzyme, repairing the break and replacing the target site with the edited strand, resulting in DNA editing according to the present invention.
  • the incorporated edited strand is not complementary and is in a mismatched state of double-stranded DNA. Therefore, when repair is performed using the edited strand as a template by the intracellular DNA repair mechanism, edited DNA in which both strands have been edited can be obtained.
  • a nick is introduced into the opposite strand (second strand) of the target site by the Cas protein (preferably nCas) induced by the ngRNA, thereby improving the probability of DNA repair using the edited strand as a template (Non-Patent Document 1).
  • DNA editing according to the present invention also includes the deletion of one or more bases, substitution with one or more other bases, or insertion of one or more bases, or a combination of these mutations, in the vicinity of the target site or in a long chain including the target site.
  • the method of editing target DNA of the present invention is preferably carried out intracellularly.
  • the "inside the cell" where the method of editing target DNA of the present invention is carried out may be either a eukaryotic cell or a prokaryotic cell, but is preferably a eukaryotic cell.
  • eukaryotic cells include animal cells (such as cells of mammals, fish, birds, reptiles, amphibians, and insects), plant cells, algae cells, and yeast, while examples of prokaryotic cells include Escherichia coli, Salmonella, Bacillus subtilis, lactic acid bacteria, and extreme thermophiles.
  • Animal cells include, for example, cells constituting an individual animal, cells constituting organs or tissues extracted from an animal, and cultured cells derived from animal tissue. Specific examples include germ cells such as oocytes and sperm; germ cells of various stages of embryos (e.g., 1-cell, 2-cell, 4-cell, 8-cell, 16-cell, and morula stages); stem cells such as induced pluripotent stem (iPS) cells and embryonic stem (ES) cells; and somatic cells such as fibroblasts, hematopoietic cells, neurons, muscle cells, bone cells, liver cells, pancreatic cells, brain cells, and kidney cells.
  • germ cells such as oocytes and sperm
  • germ cells of various stages of embryos e.g., 1-cell, 2-cell, 4-cell, 8-cell, 16-cell, and morula stages
  • stem cells such as induced pluripotent stem (iPS) cells and embryonic stem (ES) cells
  • somatic cells such as fibroblasts, hematopoietic
  • Pre- and post-fertilization oocytes can be used as the oocytes, but fertilized oocytes, i.e., fertilized eggs, are preferred. Pronuclear stage fertilized eggs are particularly preferred. Frozen oocytes can be thawed and used.
  • Plant cells include, for example, cells that make up an individual plant, cells that make up organs or tissues separated from a plant, and cultured cells derived from plant tissue.
  • Examples of plant organs and tissues include leaves, stems, shoot tips (growing points), roots, tubers, and callus.
  • the DNA editing system can be introduced into a cell containing the target DNA, as in the method for producing a cell with edited target DNA described below.
  • the present invention also provides a method for producing a cell in which target DNA has been edited, comprising the steps of introducing the DNA editing system of the present invention into a cell, contacting it with target DNA, and editing a target site in the target DNA.
  • the DNA editing system and target DNA are as described above in the method of the present invention for editing target DNA.
  • the target DNA in the production method of the present invention is genomic DNA, and pegRNA and, if necessary, ngRNA can be designed depending on the purpose of editing the genomic DNA.
  • the DNA editing system i.e., the reverse transcriptase, Cas protein, pegRNA, and, if necessary, ngRNA of the present invention
  • the DNA editing system can be brought into contact with the target DNA by introducing the DNA editing system into cells in the form of protein or RNA, by introducing the system into cells in the form of a polynucleotide encoding the protein or RNA, and/or by introducing the system into cells in the form of an expression vector and expressing it within the cells.
  • the DNA editing systems may be introduced into cells independently in the form of protein or RNA, or in the form of DNA or RNA (polynucleotide) encoding these and expressed within the cells, or in the form of an expression vector and expressed within the cells.
  • vectors that express each protein or RNA separately may be introduced into the cells, or a vector that expresses a combination of these may be introduced into the cells.
  • Methods for introducing the proteins or RNAs, polynucleotides encoding the proteins or RNAs, and expression vectors into cells can be selected from known methods for introducing proteins or polynucleotides into cells, as appropriate for the cell type. Examples of such methods include electroporation, microinjection, particle gun technology, calcium phosphate, polyethyleneimine (PEI), liposomes (lipofection), DEAE-dextran, cationic lipid-mediated transfection, viruses (adenovirus, lentivirus, adeno-associated virus, baculovirus, etc.), Agrobacterium, lithium acetate, spheroplasts, and heat shock methods (calcium chloride, rubidium chloride). These methods are described in many standard laboratory manuals, such as Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, New York: Elsevier, 1986.
  • the introduced constructs or the constructs expressed within the cell come into contact with the target DNA within the cell, and the desired base is replaced at the target site by the DNA editing described above in the method for editing target DNA of the present invention, making it possible to obtain a cell in which the target DNA has been edited.
  • the present invention also provides a method for producing a non-human individual containing cells in which the target DNA has been edited.
  • This method includes the step of producing a non-human individual from cells obtained by the above-mentioned production method.
  • the non-human individual include non-human animals and plants.
  • the non-human animal include mammals (mouse, rat, guinea pig, hamster, rabbit, monkey, pig, cow, goat, sheep, etc.), fish, birds, reptiles, amphibians, and insects.
  • the mammal is preferably a rodent such as a mouse, rat, guinea pig, or hamster, with mice being particularly preferred.
  • the plant include grains, oilseed crops, forage crops, fruits, and vegetables. Specific examples of crops include rice, corn, banana, peanut, sunflower, tomato, rapeseed, tobacco, wheat, barley, potato, soybean, cotton, and carnation.
  • Known methods can be used to create non-human individuals from cells in which the target DNA has been edited.
  • germ cells or pluripotent stem cells are typically used.
  • the DNA editing system can be microinjected into the oocytes, and the resulting oocytes can be implanted into the uterus of a pseudopregnant female non-human mammal, after which offspring can be obtained.
  • the somatic cells of plants possess totipotency and for example, a plant in which the desired DNA has been edited can be obtained by microinjecting the DNA editing system into plant cells and regenerating a plant from the resulting plant cells.
  • offspring or clones in which the desired DNA has been edited can also be obtained from the resulting non-human individuals.
  • Confirmation of the presence or absence of targeted DNA editing and determination of the genotype can be performed using conventionally known methods, such as PCR, sequencing, Southern blotting, etc.
  • the present invention relates to a kit for use in the method for editing target DNA of the present invention, the production method of the present invention, or the method for producing a non-human individual of the present invention, (A) at least one selected from the group consisting of the reverse transcriptase of the present invention, an expression vector for the reverse transcriptase, and a polynucleotide encoding the reverse transcriptase;
  • the kit of the present invention also includes the following (B) to (C): (B) at least one selected from the group consisting of a Cas protein, an expression vector for the Cas protein, and a polynucleotide encoding the Cas protein; (C) at least one selected from the group consisting of a pegRNA, an expression vector for the pegRNA, and a polynucleotide encoding the pegRNA; It is preferable that the composition further contains at least one selected from the group consisting of: (D) It is more preferable that the composition further comprises at least one selected from the group
  • the kit of the present invention comprises (B) to (C) or (B) to (D), and when the above (A) to (D) are in the form of an expression vector, these may be in an embodiment in which two or more components are combined and contained in one vector. Furthermore, when the above (C) and (D) are in the form of an expression vector, these may be in a form in which the user can design the pegRNA and ngRNA according to the target site of the target DNA, and the expression vector for the pegRNA is (C')
  • the ngRNA expression vector may be an expression vector for pegRNA including an insertion site for a spacer sequence, an insertion site for a template sequence, and an insertion site for a primer binding sequence, and the ngRNA expression vector is (D')
  • the ngRNA expression vector may include an insertion site for a spacer sequence.
  • the kit of the present invention may further include one or more additional reagents.
  • additional reagents include, but are not limited to, a dilution buffer, a nucleic acid introduction reagent, a protein introduction reagent, and a control reagent (e.g., a complete reverse transcriptase consisting of a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1).
  • the kit may also further include instructions for use in carrying out the method of the present invention.
  • Each component included in the kit of the present invention may be contained in a separate container, or may be contained in the same container. Each component may be contained in a container in a single-use amount, or multiple doses may be contained in a single container. Each component may be contained in a container in a dry form, or in a form dissolved in an appropriate solvent (a solvent containing a buffer, stabilizer, preservative, antiseptic, etc.).
  • an appropriate solvent a solvent containing a buffer, stabilizer, preservative, antiseptic, etc.
  • test examples including working examples, but the present invention is not limited to the following test examples.
  • Agarose electrophoresis 1-3% by mass of Agarose S was added to 1x TAE and dissolved by heating. This solution was poured into a gel maker, a comb was inserted, and the gel was allowed to stand at room temperature to solidify. The solidified gel was placed in an electrophoresis tank, and an appropriate amount of 1x TAE was poured in. Loading buffer was added to the sample to a concentration of 1x or higher, and the sample was applied to the gel wells along with a DNA size marker. If the gel was to be excised after electrophoresis and DNA extracted, electrophoresis was performed at 50 V for approximately 1 hour; if not, electrophoresis was performed at 100 V for approximately 30 minutes.
  • the gel after electrophoresis was placed in ion-exchanged water, 2 ⁇ L of ethidium bromide was added, and the gel was shaken for approximately 20 minutes. The gel was photographed using a UV transilluminator to confirm the bands. If DNA was to be extracted, the gel was excised at the position where the target band was located.
  • PCR using PrimeSTAR Max DNA Polymerase (Takara Bio Inc.) 5 ⁇ L of PrimeSTAR Max Premix (2 ⁇ ), 0.3 ⁇ L of 10 ⁇ M forward primer, 0.3 ⁇ L of 10 ⁇ M reverse primer, 0.2 ⁇ L of 1 ng/ ⁇ L template, and 4.2 ⁇ L of autoclaved ultrapure water were mixed in a PCR tube.
  • the tube was preheated to 94°C for 2 minutes, followed by 35 cycles of heat denaturation at 98°C for 10 seconds, annealing at 60-68°C (depending on the Tm value of the primer) for 5 seconds, and extension at 72°C for 5-70 seconds (depending on the number of bases to be amplified), and then stored at 4°C.
  • PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 0.5 ⁇ L, 5 ⁇ PrimeSTAR GXL Buffer 5 ⁇ L, 2 ⁇ L of 2.5 mM each dNTP mixture, 0.75 ⁇ L of 10 ⁇ M forward primer, 0.75 ⁇ L of 10 ⁇ M reverse primer, 1.25 ⁇ L of 1 to 10 ng/ ⁇ L template, and 14.75 ⁇ L of autoclaved ultrapure water were mixed in a PCR tube.
  • the mixture was preheated at 94°C for 2 minutes, followed by 45 cycles of thermal denaturation at 98°C for 10 seconds, annealing at 60 to 68°C (depending on the Tm value of the primer) for 15 seconds, and extension at 68°C for 300 to 350 seconds (depending on the number of bases to be amplified), and then stored at 4°C.
  • In-Fusion reaction 0.8 ⁇ L of insert DNA and 0.8 ⁇ L of vector DNA, or 1.6 ⁇ L of vector DNA alone, were mixed with 0.4 ⁇ L of 5x In-Fusion Premix (Takara Bio Inc.) in a PCR tube. The reaction was carried out at 50°C for 15 minutes using a thermal cycler and then stored at 4°C.
  • Restriction enzyme treatment 200 ng/ ⁇ L of plasmid, 0.3 ⁇ L of restriction enzyme (0.3 ⁇ L each if two restriction enzymes were used), 1 ⁇ L of buffer corresponding to the restriction enzyme, and 7.7 ⁇ L of autoclaved ultrapure water (7.4 ⁇ L if two restriction enzymes were used) were mixed in a 1.5 mL tube. This was left to stand in a 37°C incubator for at least 1 hour to allow for restriction enzyme reaction.
  • ROCHE rAPid Alkaline Phosphatase 2
  • Transformation into E. coli The sample (all transformed samples in the following test examples have the Ampicillin resistance gene) was mixed with at least 10 times the amount of competent cells (XL10-Gold) in a 1.5 mL tube. After leaving it to stand on ice for at least 10 minutes, it was incubated at 42°C for 30 seconds using a heat block, and then cooled on ice for approximately 2 minutes. In a safety cabinet, the bacterial solution was spread on an LB + Ampicillin plate, which was then placed in a 37°C incubator and cultured for 16 to 18 hours.
  • competent cells XL10-Gold
  • PCR reaction solution was prepared by mixing 4 ⁇ L of 2 ⁇ SapphireAmp Fast PCR Master Mix (manufactured by Takara Bio Inc.), 0.16 ⁇ L of 10 ⁇ M forward primer, 0.16 ⁇ L of 10 ⁇ M reverse primer, and 3.68 ⁇ L of autoclaved ultrapure water in a PCR tube. A colony on the plate was picked with a 200 ⁇ L pipette tip, touched to the replica LB + Ampicillin plate, and then the tip was immersed in the PCR reaction solution.
  • the chip was discarded, and the mixture was preheated at 94°C for 2 minutes using a thermal cycler, followed by 27 cycles of heat denaturation at 98°C for 5 seconds, annealing at 52-68°C (depending on the Tm value of the primer) for 5 seconds, and extension at 72°C for 10-40 seconds (depending on the number of bases to be amplified), and then stored at 4°C.
  • the presence of the target band was confirmed by agarose electrophoresis as described in 1 above.
  • Plasmid extraction using GenElute Plasmid Miniprep Kit (Sigma-Aldrich) 11.1 Small culture 15 ⁇ L of 25 mg/mL Ampicillin was added to 3 mL of LB liquid medium in a test tube. An E. coli colony was picked with a 200 ⁇ L pipette tip and dropped into the test tube, followed by shaking culture at 37°C for 16 hours or more.
  • the mixture was then centrifuged at 20°C and 12,000 g for 1 minute.
  • the filtrate was discarded, and the mixture was again centrifuged at 20°C and 12,000 g for 1 minute.
  • the column was placed in a DNA LoBind tube, and 15 ⁇ L of Elution solution was added.
  • the mixture was left for 1 minute, and then centrifuged at 20°C and 12,000 g for 1 minute.
  • 15 ⁇ L of Elution solution was added again, and the mixture was left for 1 minute, and then centrifuged at 20°C and 12,000 g for 1 minute.
  • the DNA concentration of the filtrate was measured using NanoDrop2000 (manufactured by Thermo Fisher Scientific), and the filtrate was diluted with Elution solution to 200 ng/ ⁇ L (100 ng/ ⁇ L if the measured concentration was below 200 ng/ ⁇ L).
  • Annealing of Oligo DNA 0.5 ⁇ L each of sense and antisense strand oligo DNA (100 ⁇ M) synthesized for the template of the ngRNA target sequence was mixed with 1 ⁇ L of 10x Annealing Buffer (a mixture of 400 ⁇ M Tris-HCl (pH 8.0), 200 ⁇ M MgCl 2 , and 500 ⁇ M NaCl) and 8 ⁇ L of autoclaved ultrapure water. After incubating at 95°C for 5 minutes using a thermal cycler, the temperature was lowered to 25°C over 90 minutes to anneal the oligo DNA.
  • 10x Annealing Buffer a mixture of 400 ⁇ M Tris-HCl (pH 8.0), 200 ⁇ M MgCl 2 , and 500 ⁇ M NaCl
  • Lipofection using Lipofectamin LTX (Thermo Fisher Scientific) The day before or the day of lipofection, the plasmid to be introduced was diluted with autoclaved ultrapure water to a concentration of 90 ng/6 ⁇ L or 200 ng/6 ⁇ L and a volume of 7.2 ⁇ L. 25 ⁇ L of D-MEM was added to each well of a 96-well plate, followed by 6 ⁇ L of the pre-adjusted plasmid. Both reagents were mixed in a reservoir so that 0.7 ⁇ L of Lipofectamine LTX and 25 ⁇ L of D-MEM were added to each well, and then the mixture was added to each well and incubated at room temperature for 30 minutes.
  • cells were prepared as follows: The culture medium of HEK293T cells cultured in a 100 mm dish was removed using an aspirator, and 3 mL of TrypLE TM Express was added to the dish and incubated for 30 seconds. 7 mL of complete medium was added to the dish, and the cells were detached using an electric pipettor. 3 mL of the cell suspension was transferred to a 50 mL tube. This tube was centrifuged at 20°C and 1000 rpm for 3 minutes, the supernatant was removed using an aspirator, and 1.5 mL of complete medium was added for resuspension. 10 ⁇ L of the cell suspension was placed in a LUNA automated cell counter (Logos Biosystems) to measure the cell concentration, and the cells were diluted with complete medium to 1.5 x 10 5 cells/mL.
  • LUNA automated cell counter Logos Biosystems
  • ExoSAP-IT (Applied Biosystems) was added to the 7 ⁇ L PCR product, and a thermal cycler was run with a program consisting of 37°C for 15 minutes or more followed by 80°C for 15 minutes, followed by storage at -20°C.
  • sequence analysis was performed using SeqStudio Genetic Analyzer (manufactured by Thermo Fisher Scientific) to obtain waveform data of the nucleotide sequence including the edited site.
  • ⁇ Vector construction> Preparation of nCas9 vector, RTase vector, and PE vector
  • a vector "KS2" nCas9 vector, SEQ ID NO: 4
  • a vector "KS15” RTase vector, SEQ ID NO: 5
  • Schematic diagrams of the structures of "KS2" and "KS15” are shown in Figures 2 and 3, respectively.
  • KS2 has an ngRNA promoter and a scaffold sequence
  • Cas9 indicates nCas9 (hereinafter, the same applies to Figures 4 and 7).
  • the amino acid sequence of the RTase encoded by “KS15” is the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, in which S at position 92 has been replaced with R (S92R).
  • vector "#1373” (PE vector, SEQ ID NO: 6), which expresses Prime Editor (a fusion protein of nCas9 and RTase) under the EF1a promoter, was also prepared following Non-Patent Document 4.
  • a schematic diagram of the structure of "#1373” is shown in Figure 4.
  • "#1373” has an ngRNA promoter and a scaffold sequence.
  • FIG. 5 shows a schematic diagram of the relative positions of PAM, the pegRNA recognition sequence (comp_pegRNA), and the ngRNA recognition sequence (comp_ngRNA) to which the ngRNA below binds, all present on RNF2.
  • ngRNA and insertion into PE vector ngRNA was designed separately from pegRNA, based on PE3max described in Non-Patent Document 3.
  • an ngRNA expression cassette encoding ngRNA (SEQ ID NO: 9) obtained by annealing the oligo DNA "RNF2-nick-s (sense strand, SEQ ID NO: 7)" and "RNF2-nick-as (antisense strand, SEQ ID NO: 8)" according to the above basic procedure 12. was inserted into the above nCas9 vector "KS2" and PE vector "#1373" by the Golden Gate reaction of the above basic procedure 13.
  • the vector in which the ngRNA expression cassette was inserted into the nCas9 vector "KS2" was designated “KS2+ng”
  • the vector in which the ngRNA expression cassette was inserted into the PE vector "#1373" was designated “KS25+ng.”
  • PEGRNA is expressed from the U6 promoter, and from the 5' end, it consists of a 20 nt spacer sequence (protospacer), a scaffold sequence (gRNA scaffold), a 14 nt template sequence (RTT), a 15 nt primer binding sequence (PBS), a linker (PEGLIT linker), tmpknot, and a U6 terminator.
  • a schematic diagram of the structure of PEGRNA is shown in Figure 6, and the nucleotide sequence of PEGRNA is shown in SEQ ID NO: 10.
  • bases 1 to 20 represent the spacer sequence
  • bases 21 to 96 represent the scaffold sequence
  • bases 97 to 110 represent the template sequence
  • bases 111 to 125 represent the primer binding sequence
  • bases 134 to 184 represent tmpknot, respectively.
  • a vector expressing pegRNA targeting RNF2 was subjected to restriction enzyme digestion with Esp3I as described in Basic Procedure 6 above.
  • the digested sample was subjected to agarose electrophoresis as described in Basic Procedure 1 above, and the gel was excised at the position where the band for the pegRNA expression cassette (SEQ ID NO: 11) encoding the pegRNA was located.
  • DNA was extracted as described in Basic Procedure 2 above, and ligation as described in Basic Procedure 7 above was performed using "KS2+ng" or "KS25+ng" prepared in Basic Procedure 2 above as vector DNA.
  • ⁇ Test Example 1> Design of Split Enzymes RTase was split, and a split-type RTase (hereinafter sometimes referred to as "split enzymes") was designed in which the RTase functions to cause prime editing only when all of the constituent fragments are present.
  • split enzymes a split-type RTase (hereinafter sometimes referred to as "split enzymes") was designed in which the RTase functions to cause prime editing only when all of the constituent fragments are present.
  • split enzymes a split-type RTase (hereinafter sometimes referred to as "split enzymes”) was designed in which the RTase functions to cause prime editing only when all of the constituent fragments are present.
  • GFP was split into two fragments, GFP1-10 on the N-terminus and GFP11 on the C-terminus, and the regeneration of the activity of the split RTase was verified using the association between these two fragments.
  • a fusion protein was prepared by linking the N-terminal fragment of RTase split into two and GFP1-10 with a GSAGSAAGSG linker (SEQ ID NO: 16), and the remaining C-terminal fragment of RTase split into two and GFP11 with a (GGGGS)3 linker (SEQ ID NO: 17).
  • This split protein (in this test example, a fusion protein with split GFP) was made to cooperate with nCas9 and pegRNA, and as shown in Figure 9, when both fusion proteins were present, the target DNA was edited by prime editing.
  • ngRNA was also made to cooperate with the aim of improving the probability of adopting the edited strand during the DNA repair stage (Non-Patent Documents 1 and 3).
  • the split form is obtained by splitting a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 or a polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 in which S at position 92 is substituted with R (S92R) as an RTase at the following seven positions: Split between E123 and D124: “SPL RT1" Split between E176 and M177 (S92R): “SPL RT2" Split between E233 and L234 (S92R): “SPL RT3" Split between T293 and P294 (S92R): “SPL RT4" Split between G405 and W406 (S92R): “SPL RT5" Split between L21 and G22 (S92R): “SPL RT+N” Split between E488 and E489 (S92R): “SPL RT+C” We verified the following.
  • the region on the plasmid encoding GFP1-10 (SEQ ID NO: 18) was used as a template, and the region encoding GFP1-10 was amplified according to Basic Procedure 3 above.
  • the primer combinations used here, as well as their Tm values and SEQ ID NOs indicating their nucleotide sequences, are also shown in Table 2 below.
  • the primers were designed so that after amplification, a 15-base homologous sequence would be generated at the end of each fragment, and the N-terminal fragment of RTase and GFP1-10 would be linked by the GSAGSAAGSG linker (FIG. 10).
  • inverse-PCR was performed using PrimeSTAR Max DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) or PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) with the RTase-expressing plasmid "KS15" or "KS16" as a template, according to Basic Procedure 3 or 4 above, to amplify a region of the split C-terminal fragment of RTase that did not contain the unnecessary portion (here, the N-terminal fragment).
  • the primer combinations used in each inverse-PCR, as well as their Tm values and SEQ ID NOs indicating their nucleotide sequences, are shown in Table 3 below.
  • a region on the plasmid encoding GFP11 (SEQ ID NO: 42) was used as a template, and the region encoding GFP11 was amplified according to Basic Procedure 3 or 4 above.
  • the primer combinations used here, as well as their Tm values and SEQ ID NOs indicating their nucleotide sequences, are also shown in Table 3 below.
  • the primers were designed so that after amplification, a 15-base homologous sequence would be generated at the end of each fragment, and the C-terminal fragment of RTase and GFP11 would be linked by the (GGGGS)3 linker ( Figure 11).
  • the primers were designed so that, after amplification, a 15-base homologous sequence would be generated at the end of each fragment, and the N-terminal fragment of RTase and GFP1-10 would be linked by the GSAGSAAGSG linker ( FIG. 10 ).
  • the primers were designed so that, after amplification, a 15-base homologous sequence would be generated at the end of each fragment, and the C-terminal fragment of RTase and GFP11 would be linked by the (GGGGS)3 linker ( FIG. 11 ).
  • the present invention makes it possible to provide a novel split reverse transcriptase that is active only when all of its constituent fragments are present, a DNA editing system containing the same, a method for editing target DNA using the system, and a method for producing cells in which target DNA has been edited.
  • a reverse transcriptase is useful as a reverse transcriptase for prime editing and can improve the specificity of the prime editing.

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Abstract

逆転写酵素が２分割されたＮ末断片とＣ末断片とを含む分割型の逆転写酵素であり、　前記Ｎ末断片及びＣ末断片が、下記（ａ）～（ｃ）： （ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドが、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の第１１４～１３３位の領域内のいずれか１箇所又は第１６７～１８６位の領域内のいずれか１箇所で分割されてなるＮ末断片及びＣ末断片、 （ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドが、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の第１１４～１３３位に対応する領域内のいずれか１箇所又は第１６７～１８６位に対応する領域内のいずれか１箇所で分割されてなるＮ末断片及びＣ末断片、 （ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の第１１４～１３３位に対応する領域内のいずれか１箇所又は第１６７～１８６位に対応する領域内のいずれか１箇所で分割されてなるＮ末断片及びＣ末断片、 からなる群から選択される少なくとも１種であり、　前記Ｎ末断片と前記Ｃ末断片とが存在することにより逆転写酵素活性が再生する、 逆転写酵素。

Description

逆転写酵素、ＤＮＡ編集システム、並びに、これらを用いて標的ＤＮＡを編集する方法及び標的ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法
　本発明は、逆転写酵素、ＤＮＡ編集システム、並びに、これらを用いて標的ＤＮＡを編集する方法及び標的ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法に関する。
　ゲノム編集技術とは、人工ＤＮＡ切断酵素（例えば、ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＺＦＮ）、ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ－ｌｉｋｅ　ｅｆｆｅｃｔｏｒ　ｎｕｃｌｅａｓｅ（ＴＡＬＥＮ））やＲＮＡ誘導型ＤＮＡ切断酵素（例えば、ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　ｓｈｏｒｔ　ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　ｒｅｐｅａｔ　ａｎｄ　ＣＲＩＳＰＲ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ））によって標的ＤＮＡを特異的に切断し、生物が有するＤＮＡ修復システムを利用して遺伝子の改変を行う技術である。ゲノム編集技術は、理論上ＤＮＡを有する全ての生物種、細胞株に対して応用することができ、１塩基から長鎖までの編集（置換、欠失、挿入）が可能であることから、農業及び産業分野のみならず、遺伝子治療等の医療分野など、様々な分野で応用されている。
　数あるゲノム編集の中でも、プライム編集（ｐｒｉｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ（ＰＥ））は、特異的に、全種の塩基の置換、短鎖の挿入／欠失（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ／ｄｅｌｅｔｉｏｎ（ｉｎｄｅｌ））、又はこれらを組み合わせた編集が可能な技術である（Ａｎｚａｌｏｎｅ，Ａ．Ｖ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　５７６，ｐ．１４９－１５７，２０１９（非特許文献１））。
　プライム編集では、典型的には、ヌクレアーゼ活性を一部欠損させたニッカーゼ型のＣａｓタンパク質（ｎＣａｓ、例えば、ｎｉｃｋｉｎｇ　Ｃａｓ９（ｎＣａｓ９））と逆転写酵素（ＲＴａｓｅ）とが融合したＰｒｉｍｅ　Ｅｄｉｔｏｒ、及びプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｒｉｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ））を用いることにより、例えば、図１Ａ～図１Ｃに示す機構で、標的ＤＮＡ（ｔａｒｇｅｔ　ＤＮＡ）の編集が起きると考えられている。すなわち、先ず、ｐｅｇＲＮＡのスペーサー配列（ｓｐａｃｅｒ）が標的ＤＮＡ上のｐｅｇＲＮＡ認識配列を認識して標的ＤＮＡに結合し、Ｃａｓタンパク質（図１Ａ～図１ＣではｎＣａｓ９）を標的部位付近に誘導する。誘導されたＣａｓタンパク質（ｎＣａｓ９）はプロトスペーサー隣接モチーフ（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ　ａｄｊａｃｅｎｔ　ｍｏｔｉｆ（ＰＡＭ））を認識し、ＰＡＭが存在する鎖（本明細書ではこれを場合により「標的鎖」と称する）に切れ目（ニック）を入れる。かかるｐｅｇＲＮＡの結合とニックとによって遊離した標的鎖の３’末端配列には、ｐｅｇＲＮＡのプライマー結合配列（ｐｒｉｍｅｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｉｔｅ（ＰＢＳ））が結合する（図１Ｂ）。すると、ｐｅｇＲＮＡのＰＢＳに続く５’側に含まれるテンプレート配列（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｌａｔｅ（ＲＴＴ））を鋳型として、Ｃａｓタンパク質（ｎＣａｓ９）に融合された逆転写酵素（ＲＴａｓｅ）が逆転写を行う。これにより、標的ＤＮＡにおいては、編集鎖（逆転写酵素によって合成された鎖）が遊離した３’ｆｌａｐ（図１Ｃの（ａ））と非編集鎖が遊離した５’ｆｌａｐ（図１Ｃの（ｂ））とが存在する平衡状態が生じる。５’ｆｌａｐは細胞内酵素により削られてニックが修復され、編集鎖が標的ＤＮＡに取り込まれて標的部位が置換されるが、取り込まれた編集鎖は相補的になっていない。そのため、ＤＮＡの修復機構によって編集鎖を鋳型とした修復が行われると、目的の編集がなされた編集ＤＮＡ（Ｅｄｉｔｅｄ　ＤＮＡ）を得ることができる（図１Ｃの（ｃ））。
　非特許文献１には、また、逆転写酵素に５つの変異を導入して処理能力及び結合能を上昇させたＰＥ２や、ニッキングガイドＲＮＡ（ｎｉｃｋｉｎｇ　ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ））を追加で導入することで非編集鎖にニックを入れ、ＤＮＡの修復の段階で編集鎖が採用される確率を上げたＰＥ３といった改良型のプライム編集システムも記載されており、これらによって編集効率が向上したことが報告されている。
　さらに、プライム編集による編集効率を上げる取り組みとして、ｐｅｇＲＮＡの３’末端に８ｎｔのリンカー及び５１ｎｔのｔｍｐｋｎｏｔ（ｔｒｉｍｍｅｄ　ｍｐｋｎｏｔ）というＲＮＡモチーフを付与することで、遊離した状態にある３’末端がｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅによって削られてしまうことを抑制することが報告されている（Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　４０，ｐ．４０２－４１０，２０２２（非特許文献２））。
　また、他にも、ｎＣａｓ９に２つの変異を導入し、ｎＣａｓ９と逆転写酵素との間に二連の核移行シグナル（ｎｕｃｌｅａｒ　ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ（ＮＬＳ））を配置し、逆転写酵素のコドンを最適化し、かつ、Ｐｒｉｍｅ　ＥｄｉｔｏｒのＣ末端にｃ－Ｍｙｃ　ＮＬＳを配置したＰＥ３ｍａｘという技術も報告されている（Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｊ．　ｅｔ．　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｇｅｎｅｔ　２４，ｐ．１６１－１７７，２０２３（非特許文献３））。さらに、これと非特許文献２に記載のｐｅｇＲＮＡとの併用でさらに効率が向上することも判明している。
　また、Ｐｒｉｍｅ　Ｅｄｉｔｏｒとしては、ｎＣａｓ９と逆転写酵素とを融合させず、切り離して別々に発現させてもプライム編集により標的ＤＮＡの編集が可能であったことが報告されている（Ｌｉｕ，　Ｂ．　ｅｔ．　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　４０，ｐ．１３８８－１３９３，２０２２（非特許文献４））。さらに、ニッカーゼ型のＣａｓ９タンパク質以外にも、例えば、ヌクレアーゼ活性を欠損させない（ヌクレアーゼ活性を有する）Ｃａｓ９タンパク質を用いた２本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ　ｓｔｒａｎｄ　ｂｒｅａｋ（ＤＳＢ））により、上記プライム編集と基本的に同様の機構によって、標的ＤＮＡを編集したことが報告されている（Ｌｉ，　Ｘ．　ｅｔ．　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　１４，Ａｒｔｉｃｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ：３０５，２０２３，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２３－３５８７０－０（非特許文献５））
Ａｎｚａｌｏｎｅ，Ａ．Ｖ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　５７６，ｐ．１４９－１５７，２０１９ Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｗ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　４０，ｐ．４０２－４１０，２０２２ Ｃｈｅｎ，Ｐ．Ｊ．　ｅｔ．　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｒｅｖ　Ｇｅｎｅｔ　２４，ｐ．１６１－１７７，２０２３ Ｌｉｕ，　Ｂ．　ｅｔ．　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ　４０，ｐ．１３８８－１３９３，２０２２ Ｌｉ，　Ｘ．　ｅｔ．　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　１４，Ａｒｔｉｃｌｅ　ｎｕｍｂｅｒ：３０５，２０２３，ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０３８／ｓ４１４６７－０２３－３５８７０－０
　しかしながら、近年開発されたばかりであるプライム編集の研究の進展は未だ十分とはいえず、さらなる編集効率の向上や、オフターゲットの抑制のためのシステムの改良が求められている。特にこれまで、逆転写酵素の改良については検討が不十分であった。
　本発明は、上記従来技術の有する課題に鑑みてなされたものであり、プライム編集に有用な逆転写酵素として、特異的条件下でのみ活性を示す新規の逆転写酵素、より具体的には、構成断片が全て存在した場合にのみ活性を示す新規の分割型の逆転写酵素、及びそれを含むＤＮＡ編集システム、並びに、これらを用いて標的ＤＮＡを編集する方法及び標的ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、前記目的を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、逆転写酵素を分割して、かかる分割後の構成断片が全て揃ったときにのみ活性が回復する新たな逆転写酵素を設計した。これをプライム編集システムの逆転写酵素として用いることで、プライム編集の特異性の向上を図ることが期待できる。本発明者らは、先ず、複数の位置において、逆転写酵素をＮ末断片とＣ末断片とに２分割し、これらをそれぞれ単体で用いたときの活性と、分割型ＧＦＰを用いて両者を存在させたときの活性とを比較検証した。その結果、ある特定の位置で分割した分割体（Ｓｐｌｉｔ体）でのみ、Ｎ末断片及びＣ末断片単体では逆転写活性が確認されず、他方、これらを両者とも存在させた場合にのみ特異的に逆転写活性が再生されることを見出し、本発明を完成するに至った。
　かかる知見により提供される本発明の態様は以下のとおりである。
［１］
　逆転写酵素が２分割されたＮ末断片とＣ末断片とを含む分割型の逆転写酵素であり、
　前記Ｎ末断片及びＣ末断片が、下記（ａ）～（ｃ）：
（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドが、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の第１１４～１３３位の領域内のいずれか１箇所又は第１６７～１８６位の領域内のいずれか１箇所で分割されてなるＮ末断片及びＣ末断片、
（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドが、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の第１１４～１３３位に対応する領域内のいずれか１箇所又は第１６７～１８６位に対応する領域内のいずれか１箇所で分割されてなるＮ末断片及びＣ末断片、
（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の第１１４～１３３位に対応する領域内のいずれか１箇所又は第１６７～１８６位に対応する領域内のいずれか１箇所で分割されてなるＮ末断片及びＣ末断片、
からなる群から選択される少なくとも１種であり、
　前記Ｎ末断片と前記Ｃ末断片とが存在することにより逆転写酵素活性が再生する、
逆転写酵素。
［２］
　下記（Ａ）～（Ｃ）：
（Ａ）［１］に記載の逆転写酵素、前記逆転写酵素の発現ベクター、及び前記逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種、
（Ｂ）ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓタンパク質（Ｃａｓ）及びヌクレアーゼ活性が一部欠損したニッカーゼ型のＣａｓタンパク質（ｎＣａｓ）からなる群から選択される少なくとも１種のＣａｓタンパク質、前記Ｃａｓタンパク質の発現ベクター、並びに、前記Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種、
（Ｃ）前記Ｃａｓタンパク質のプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）、前記ｐｅｇＲＮＡの発現ベクター、及び前記ｐｅｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種、
を含む、ＤＮＡ編集システム。
［３］
　（Ｄ）前記Ｃａｓタンパク質のニッキングガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）であって、前記ｐｅｇＲＮＡが結合するｐｅｇＲＮＡ認識配列とは別の配列であるｎｇＲＮＡ認識配列に結合するｎｇＲＮＡ、前記ｎｇＲＮＡの発現ベクター、及び前記ｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種、
をさらに含む、［２］に記載のＤＮＡ編集システム。
［４］
　標的ＤＮＡを編集する方法であり、
　［２］又は［３］に記載のＤＮＡ編集システムを標的ＤＮＡに接触させ、前記標的ＤＮＡの標的部位を編集する工程を含み、
　前記ｐｅｇＲＮＡが、５’側から順に、スペーサー配列、テンプレート配列、及びプライマー結合配列を含み、前記スペーサー配列が、前記標的部位の相補配列を含むｐｅｇＲＮＡ認識配列に結合する配列であり、前記テンプレート配列が、前記逆転写酵素の鋳型となる配列であり、前記プライマー結合配列が、前記標的部位の５’側のプライマー配列に結合する配列である、方法。
［５］
　標的ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法であり、
　［２］又は［３］に記載のＤＮＡ編集システムを細胞内に導入して標的ＤＮＡに接触させ、前記標的ＤＮＡの標的部位を編集する工程を含み、
　前記ｐｅｇＲＮＡが、５’側から順に、スペーサー配列、テンプレート配列、及びプライマー結合配列を含み、前記スペーサー配列が、前記標的部位の相補配列を含むｐｅｇＲＮＡ認識配列に結合する配列であり、前記テンプレート配列が、前記逆転写酵素の鋳型となる配列であり、前記プライマー結合配列が、前記標的部位の５’側のプライマー配列に結合する配列である、方法。
　本発明によれば、構成断片が全て存在した場合にのみ活性を示す新規の分割型の逆転写酵素、及びそれを含むＤＮＡ編集システム、並びに、これらを用いて標的ＤＮＡを編集する方法及び標的ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法を提供することが可能となる。
従来のプライム編集の機構の一態様を示す模式図であり、該プライム編集システムに含まれる（ａ）標的ＤＮＡ、（ｂ）Ｐｒｉｍｅ　Ｅｄｉｔｏｒ、（ｂ）ｐｅｇＲＮＡを示す。 従来のプライム編集の機構の一態様を示す模式図であり、標的ＤＮＡ、Ｐｒｉｍｅ　Ｅｄｉｔｏｒ、及びｐｅｇＲＮＡが結合した状態を示す。 従来のプライム編集の機構の一態様を示す模式図であり、（ａ）標的ＤＮＡにおいて編集鎖が遊離した３’ｆｌａｐ、（ｂ）標的ＤＮＡにおいて非編集鎖が遊離した５’ｆｌａｐ、及びそれらの平衡状態；並びに、５’ｆｌａｐが削られて編集鎖が標的ＤＮＡの標的部位に置換され、該編集鎖を鋳型とした修復によって得られた（ｃ）編集ＤＮＡを示す。 ＜ベクターの作製＞において作製した、ＥＦ１ａプロモーター下でｎＣａｓ９を発現するベクター「ＫＳ２」の構成を示す模式図である。 ＜ベクターの作製＞において作製した、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター下でＲＴａｓｅを発現するベクター「ＫＳ１５」の構成を示す模式図である。 ＜ベクターの作製＞において作製した、ＥＦ１ａプロモーター下でＰｒｉｍｅ　Ｅｄｉｔｏｒ（ｎＣａｓ９とＲＴａｓｅとの融合タンパク質）を発現するベクター「＃１３７３」の構成を示す模式図である。 ＜ベクターの作製＞において用いた、標的遺伝子ＲＮＦ２上に存在する、ＰＡＭ、ｐｅｇＲＮＡ認識配列（ｃｏｍｐ＿ｐｅｇＲＮＡ）及びｎｇＲＮＡ認識配列（ｃｏｍｐ＿ｎｇＲＮＡ）の位置関係を示す模式図である。 ＜ベクターの作製＞において用いた、ｐｅｇＲＮＡの構成を示す模式図である。 ＜ベクターの作製＞において作製した、（ａ）「ＫＳ２－１＋ｎｇ＋ｐｅｇ」及び（ｂ）「ＫＳ２５－１＋ｎｇ＋ｐｅｇ」の構成を示す模式図である。 ＜ベクターの作製＞において測定した、「ＫＳ２５－１＋ｎｇ＋ｐｅｇ（ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ）」及び「ＫＳ２５＋ｎｇ」とｐｅｇＲＮＡを発現するベクターとの組み合わせ（ｓｅｐａｒａｔｅ）の編集効率を比較した結果を示すグラフである。 ＜試験例１＞において設計した、Ｓｐｌｉｔ体（分割ＧＦＰとの融合タンパク質）、ｎＣａｓ９、ｐｅｇＲＮＡ、及びｎｇＲＮＡの協働によるＤＮＡ編集の機構を示す模式図である。 ＜試験例１＞、＜試験例２＞の（Ｎ末側ベクターの作製）の方法を示す模式図である。 ＜試験例１＞、＜試験例２＞の（Ｃ末側ベクターの作製）の方法を示す模式図である。 ＜試験例１＞において測定した編集効率（％）を示すグラフである。 ＜試験例２＞において測定した編集効率（％）を示すグラフである。 配列番号：１に示すアミノ酸配列と、各生物種由来の逆転写酵素のアミノ酸配列とのアラインメントの結果を示す図である（配列番号：１のアミノ酸配列の第３～６２位）。 配列番号：１に示すアミノ酸配列と、各生物種由来の逆転写酵素のアミノ酸配列とのアラインメントの結果を示す図である（配列番号：１のアミノ酸配列の第６３～１２２位／１２３～１８２位）。 配列番号：１に示すアミノ酸配列と、各生物種由来の逆転写酵素のアミノ酸配列とのアミノ酸配列のアラインメントの結果を示す図である（配列番号：１のアミノ酸配列の第１８３～２４２位／２４３～３０２位）。 配列番号：１に示すアミノ酸配列と、各生物種由来の逆転写酵素のアミノ酸配列とのアミノ酸配列のアラインメントの結果を示す図である（配列番号：１のアミノ酸配列の第３０３～３６２位／３６３～４２２位）。 配列番号：１に示すアミノ酸配列と、各生物種由来の逆転写酵素のアミノ酸配列とのアミノ酸配列のアラインメントの結果を示す図である（配列番号：１のアミノ酸配列の第４２３～４８２位／４８３～５４２位）。 配列番号：１に示すアミノ酸配列と、各生物種由来の逆転写酵素のアミノ酸配列とのアミノ酸配列のアラインメントの結果を示す図である（配列番号：１のアミノ酸配列の第５４３～６０２位／６０３～６６２位）。
　以下、場合により図面を参照しながら本発明の好ましい実施形態を例に挙げてより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、以下の説明及び図面中、同一又は相当する要素には同一の符号を付し、重複する説明は省略する。
　＜逆転写酵素＞
　逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ、本明細書中、場合により「ＲＴａｓｅ」とも称する）は、ＲＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼであり、１本鎖ＲＮＡを鋳型としてＤＮＡを合成する逆転写反応を触媒する酵素である。
　本発明の逆転写酵素は、Ｎ末断片とＣ末断片とに分割され、これらＮ末断片及びＣ末断片を含む分割型の逆転写酵素であり、前記Ｎ末断片とＣ末断片とがいずれも存在することにより、分割されない場合に有していた逆転写酵素活性が再生する。なお、Ｎ末断片とは、分割されない場合の逆転写酵素のＮ末端側の断片、Ｃ末断片とは、分割されない場合の逆転写酵素のＣ末端側の断片を示し、「Ｎ末端（アミノ末端、ＮＨ２末端、Ｎ末端部、又はアミン末端とも称される）」は、ポリペプチドの第１のアミノ酸残基の遊離アミン（－ＮＨ２）基を示し、「Ｃ末端」（カルボキシ末端、ＣＯＯＨ末端、又はＣ末端部とも称される）」は、ポリペプチドの最後のアミノ酸残基の遊離カルボキシ基（－ＣＯＯＨ）を示す。
　本発明の逆転写酵素において、前記Ｎ末断片及びＣ末断片は、典型的には、（ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドが、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の第１１４～１３３位の領域内のいずれか１箇所又は第１６７～１８６位の領域内のいずれか１箇所で分割されてなるＮ末断片及びＣ末断片である。配列番号：１に記載のアミノ酸配列は、マウス白血病ウイルス由来の逆転写酵素（Ｍｏｌｏｎｅｙ　Ｍｕｒｉｎｅ　Ｌｅｕｋｅｍｉａ　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｍ－ＭＬＶ　ＲＴａｓｅ））のアミノ酸配列である。
　本明細書において「いずれか１箇所で分割」とは、隣接するアミノ酸とアミノ酸との間における切断（Ｃ末端及びＮ末端を生じさせること）を示し、例えば、「第１１４～１３３位の領域内のいずれか１箇所で分割」されたＮ末断片とＣ末断片との組み合わせ（Ｎ末断片／Ｃ末断片）は、Ｔ１（配列番号：１に記載のアミノ酸配列の第１位のＴ、以下同様）～Ｄ１１４／Ｌ１１５～Ｅ６９１、Ｔ１～Ｌ１１５／Ｒ１１６～Ｅ６９１、Ｔ１～Ｒ１１６／Ｅ１１７～Ｅ６９１、Ｔ１～Ｅ１１７／Ｖ１１８～Ｅ６９１、Ｔ１～Ｖ１１８／Ｎ１１９～Ｅ６９１、Ｔ１～Ｎ１１９／Ｋ１２０～Ｅ６９１、Ｔ１～Ｋ１２０／Ｒ１２１～Ｅ６９１、Ｔ１～Ｒ１２１／Ｖ１２２～Ｅ６９１、Ｔ１～Ｖ１２２／Ｅ１２３～Ｅ６９１、Ｔ１～Ｅ１２３／Ｄ１２４～Ｅ６９１、Ｔ１～Ｄ１２４／Ｉ１２５～Ｅ６９１、Ｔ１～Ｉ１２５／Ｈ１２６～Ｅ６９１、Ｔ１～Ｈ１２６／Ｐ１２７～Ｅ６９１、Ｔ１～Ｐ１２７／Ｔ１２８～Ｅ６９１、Ｔ１～Ｔ１２８／Ｖ１２９～Ｅ６９１、Ｔ１～Ｖ１２９／Ｐ１３０～Ｅ６９１、Ｔ１～Ｐ１３０／Ｎ１３１～Ｅ６９１、Ｔ１～Ｎ１３１／Ｐ１３２～Ｅ６９１、又はＴ１～Ｐ１３２／Ｙ１３３～Ｅ６９１であり、他の領域において同様である。
　本発明の逆転写酵素において、前記Ｎ末断片及びＣ末断片の分割位置として好ましくは、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の第１１５～１３２位の領域内のいずれか１箇所、さらに好ましくは第１１８～１２９位の領域内のいずれか１箇所、さらにより好ましくは第１２０～１２７位の領域内のいずれか１箇所、特に好ましくは第１２２～１２５位の領域内のいずれか１箇所、又は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の第１６８～１８５位の領域内のいずれか１箇所、さらに好ましくは第１７１～１８２位の領域内のいずれか１箇所、さらにより好ましくは第１７３～１８０位の領域内のいずれか１箇所、特に好ましくは第１７５～１７８位の領域内のいずれか１箇所である。
　逆転写酵素のアミノ酸配列は、例えば、図１４Ａ～図１４Ｆに示すように、生物種間で高く保存されている。図１４Ａ～図１４Ｆには、下記の表１に示す各生物（ウイルス）種由来の逆転写酵素のアミノ酸配列と、配列番号：１に記載のアミノ酸配列とのアラインメントの結果を示す。
　また、下記の実施例に示すように、逆転写酵素の改変体（例えば、Ｓ９２Ｒ）の分割体であっても上記位置で分割した場合には、Ｎ末断片とＣ末断片とがいずれも存在することで逆転写酵素活性が再生する。したがって、本発明の逆転写酵素は、他の生物種由来の逆転写酵素や逆転写酵素の改変体（天然の変異体及び人工的な変異体）であり得る。すなわち、本発明の逆転写酵素には、上記位置で分割した場合に、Ｎ末断片とＣ末断片とがいずれも存在することで逆転写酵素活性が再生する限り、配列番号：１に記載のアミノ酸配列と高い相同性を有するアミノ酸配列からなる逆転写酵素の分割体も含まれる。
　よって、本発明の逆転写酵素の態様には、前記Ｎ末断片及びＣ末断片が、（ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドが、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の第１１４～１３３位に対応する領域内のいずれか１箇所又は第１６７～１８６位に対応する領域内のいずれか１箇所で分割されてなるＮ末断片及びＣ末断片である態様も含まれる。この態様（ｂ）において、Ｎ末断片とＣ末断片との分割位置の好ましい態様は、それぞれ、（ａ）における好ましい態様と対応する。
　ここで、アミノ酸配列において、「アミノ酸残基が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列」とは、当該アミノ酸配列中のアミノ残基が、置換、欠失、挿入、若しくは付加されたアミノ酸配列、又は、これらのうちの２種以上の組み合わせがなされたアミノ酸配列であることを示す。また、「複数個」とは、３０、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、又は２個の整数であることを示す。（ｂ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、１若しくは複数個として好ましくは、アミノ酸残基が１～３０個、１～２０個（例えば、１～１０個、１～５個、１～３個、２個以下）である。
　また、本発明の逆転写酵素の態様には、前記Ｎ末断片及びＣ末断片が、（ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の第１１４～１３３位に対応する領域内のいずれか１箇所又は第１６７～１８６位に対応する領域内のいずれか１箇所で分割されてなるＮ末断片及びＣ末断片である態様も含まれる。この態様（ｃ）においても、Ｎ末断片とＣ末断片との分割位置の好ましい態様は、それぞれ、（ａ）における好ましい態様と対応する。
　ここで、アミノ酸配列の相同性という場合には、対照のアミノ酸配列と対象のアミノ酸配列とをアミノ酸配列解析ソフトウェア等を用いて整列させた際に、対照のアミノ酸配列上のアミノ酸（対照アミノ酸）と同位置になる対象のアミノ酸配列上のアミノ酸（対象アミノ酸）が、前記対照アミノ酸と同じアミノ酸であっても、前記対照アミノ酸と同じ性質を持つアミノ酸であってもよい。アミノ酸配列の同一性という場合には、前記対象アミノ酸は、前記対照アミノ酸と同じアミノ酸である。同じ性質を持つアミノ酸のグループは、本発明の属する技術分野でよく知られており、例えば、酸性アミノ酸（アスパラギン酸及びグルタミン酸）；塩基性アミノ酸（リシン・アルギニン・ヒスチジン）；中性アミノ酸においては、炭化水素鎖を持つアミノ酸（グリシン・アラニン・バリン・ロイシン・イソロイシン・プロリン）、ヒドロキシ基を持つアミノ酸（セリン・トレオニン）、硫黄を含むアミノ酸（システイン・メチオニン）、アミド基を持つアミノ酸（アスパラギン・グルタミン）、イミノ基を持つアミノ酸（プロリン）、芳香族基を持つアミノ酸（フェニルアラニン・チロシン・トリプトファン）で分類することができる。
　このようなアミノ酸配列の相同性及び同一性は、配列の一致が最大となる状態にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列相同性又は同一性の数値（％）を求める方法は、当業者に公知である。最適なアラインメント及び配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者に既知のいずれかのアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズム等）を利用することができ、アミノ酸配列の配列相同性又は同一性は、例えば、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ等の配列解析ソフトウェアを用いて決定することができる。また、（ｃ）のポリペプチドのアミノ酸配列において、（ａ）のアミノ酸配列（配列番号：１）との相同性は、９０％以上であればよいが、好ましくは、９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。より好ましくは、同一性で、９０％以上、９５％以上（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）である。
　また、アミノ酸配列において、特定のアミノ酸配列からなる領域に「対応する」領域とは、アミノ酸配列解析ソフトウェア（例えば、ＧＥＮＥＴＹＸ－ＭＡＣ、ＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒやＣｌｕｓｔａｌＷ等）を用いて（例えば、パラメータ：デフォルト値（すなわち初期設定値））アミノ酸配列を整列させた際に、前記特定のアミノ酸配列（対照アミノ酸配列、例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の第１１４～１３３位、又は、第１６７～１８６位）と同位置になるアミノ酸配列からなる領域を示す。
　本発明において、Ｎ末断片とＣ末断片とがいずれも「存在」するとは、同一の反応場内、例えば、同一の細胞内（より好ましくは、例えば、同一の核内、同一のミトコンドリア内、同一の葉緑体内）に両者が存在することを示し、両者は互いに近接していることが好ましく、この場合「近接」とは、両者が相互作用を及ぼす程度に近い距離にあることを示し、このとき、両者は結合（例えば、分子間力、水素結合等による結合）して会合していてもよい。
　なお、本発明において、前記Ｎ末断片とＣ末断片とがいずれも存在することで逆転写酵素活性が再生することは、当業者に公知の方法で適宜確認することができる。例えば、下記の実施例に記載のように、分割型のＧＦＰ（ＧＦＰ１－１０とＧＦＰ１１、Ｂｅｒｒｉｏｓ，Ｋ．Ｎ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｌ　１７，ｐ．１２６２－１２７０，２０２１（文献Ｉ））を利用して、Ｎ末断片とＧＦＰ１－１０との融合タンパク質、Ｃ末断片とＧＦＰ１１との融合タンパク質をそれぞれ作製し、下記のＣａｓタンパク質（好ましくはｎＣａｓ）及びｐｅｇＲＮＡと共に細胞に導入した場合に、各融合タンパク質単体ではＤＮＡ編集が起こらない又は編集効率が著しく低いが、両者を組み合わせた場合にはＤＮＡ編集が起きて編集効率が高いことにより、確認することができる。ＤＮＡ編集が起きたこと及びその編集効率は、従来公知の方法で測定することができ、例えば、下記の実施例に記載のＥｄｉｔＲによる解析を採用することができる。この方法においては、例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列のポリペプチドからなる逆転写酵素（分割していない逆転写酵素）を用いた場合の標的ＤＮＡの編集効率（基準効率）に対して、各単体（Ｎ末断片又はＣ末断片）を用いた場合の編集効率が１０％以下であれば、ＤＮＡ編集が起こらない又は編集効率が著しく低いと判断することができ、他方、前記基準効率に対して、両者を組み合わせた場合の編集効率が１５％以上であれば、ＤＮＡ編集が起きて編集効率が高いと判断することができる。
　本発明の逆転写酵素としては、精製や検出のためのエピトープタグ（例えば、フラグタグ、ＨＡタグなど）や、各種移行シグナル（例えば、核移行シグナル、ミトコンドリア移行シグナル、色素体移行シグナル）が付加されていてもよい。
　本発明の逆転写酵素に係るＮ末断片及びＣ末断片は、従来公知の方法により適宜得ることができる。例えば、アミノ酸配列情報を基に人工合成して調製することが可能であり、また、核酸レベルで調製することも可能である。すなわち、前記Ｎ末断片及びＣ末断片をそれぞれコードするポリヌクレオチド、又は、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを適当な宿主細胞内に導入して発現させることにより、同細胞内に本発明の逆転写酵素に係るＮ末断片及びＣ末断片を得ることができる。発現ベクターとする場合、前記Ｎ末断片及びＣ末断片をコードするポリヌクレオチドは、それぞれ別のベクターに含めてもよいし、１つのベクターに含めてもよい。よって、本発明の逆転写酵素の態様には、前記逆転写酵素の発現ベクター（すなわち、Ｎ末断片発現ベクター、Ｃ末断片発現ベクター、Ｎ末断片及びＣ末断片の発現ベクター）、及び前記逆転写酵素をコードするポリヌクレオチド（すなわち、Ｎ末断片及びＣ末断片をそれぞれコードするポリヌクレオチド）も含まれる。
　前記発現ベクターとしては、当該分野で使用されるベクターから適宜選択することができ、例えば、プラスミドベクター、ウイルスベクター、ファージベクター、ファージミドベクター、ＢＡＣベクター、ＹＡＣベクター、ＭＡＣベクター、ＨＡＣベクターが挙げられる。また、前記発現ベクターとしては、発現させるべきポリヌクレオチドに作動可能に連結している調節エレメントを含むことが好ましい。前記調節エレメントとしては、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリＵ配列）が挙げられる。さらに、前記発現ベクターとしては、宿主ゲノムに組み込まれることなく、コードするタンパク質を安定して発現することができるものであることが好ましい。このような発現ベクターは、適宜従来公知の方法に準じて作製することができる。
　前記発現ベクターを導入する宿主細胞としては、発現ベクターとの適合性を考慮して適宜選択することができ、例えば、大腸菌、放線菌、古細菌などの原核生物や酵母、ウニ、カイコ、ゼブラフィッシュ、マウス、ラット、カエル、タバコ、シロイヌナズナ、イネ等の真核生物の細胞が挙げられる。なお、「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡ及びＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のいずれも包含し、各ポリヌクレオチドにおいては、細胞内での発現効率を高める等の目的で、コドンの最適化を行っていてもよい。
　＜ＤＮＡ編集システム＞
　本発明のＤＮＡ編集システムは、下記（Ａ）～（Ｃ）：
（Ａ）上記本発明の逆転写酵素、前記逆転写酵素の発現ベクター、及び前記逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種、
（Ｂ）ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓタンパク質（Ｃａｓ）及びヌクレアーゼ活性が一部欠損したニッカーゼ型のＣａｓタンパク質（ｎＣａｓ）からなる群から選択される少なくとも１種のＣａｓタンパク質、前記Ｃａｓタンパク質の発現ベクター、並びに、前記Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種、
（Ｃ）前記Ｃａｓタンパク質のプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）、前記ｐｅｇＲＮＡの発現ベクター、及び前記ｐｅｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種、
を含む。また、本発明のＤＮＡ編集システムとしては、
（Ｄ）前記Ｃａｓタンパク質のニッキングガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）、前記ｎｇＲＮＡの発現ベクター、及び前記ｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種
をさらに含むことも好ましい。前記逆転写酵素、前記逆転写酵素の発現ベクター、及び前記逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドとしては、それぞれ、それらの好ましい態様も含めて、上述のとおりである。
　（標的ＤＮＡ）
　本発明においては、ＤＮＡ編集の対象となる標的部位を含むＤＮＡを「標的ＤＮＡ」という。また、前記標的部位が特定の遺伝子をコードする領域に含まれる場合は、前記標的ＤＮＡは「標的遺伝子」とも称する。本発明に係る標的ＤＮＡは２本鎖ＤＮＡであり、便宜的に、「標的部位」とは、このうち一方の鎖の、逆転写酵素によって合成された鎖（編集鎖）で置き換えられる領域を示す。本発明のＤＮＡ編集システムとの対応を示すため便宜的に、本発明に係る標的ＤＮＡは、一方の鎖（第１の鎖、標的鎖）が、５’側から順に、プライマー配列、標的部位、及びＰＡＭ（ＰＡＭ＿１）を含む構造であり、他方の鎖（第２の鎖）に、前記標的部位の相補配列を含むｐｅｇＲＮＡ認識配列が存するものとする。また、下記のｎｇＲＮＡを用いる場合には、第１の鎖のＰＡＭ＿１の３’側にさらにｎｇＲＮＡ認識配列が存し、第２の鎖の５’側にもＰＡＭ（ＰＡＭ＿２）が存するものとする。ここで、ｐｅｇＲＮＡ及びｎｇＲＮＡに対してそれぞれ別のＣａｓタンパク質を用いる場合、ＰＡＭ＿１とＰＡＭ＿２とは同一の配列であっても異なる配列であってもよい。
　「ＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）」は、Ｃａｓタンパク質が認識する配列であり、Ｃａｓタンパク質の種類に応じてその長さは異なるが、典型的には、前記ｐｅｇＲＮＡ認識配列（及びｎｇＲＮＡを用いる場合には前記ｎｇＲＮＡ認識配列）の相補配列の３’側に隣接する２～５塩基である。ＰＡＭのヌクレオチド配列としても、Ｃａｓタンパク質の種類に応じて異なるが、典型的には、例えば、Ｃａｓタンパク質がＣａｓ９又はｎＣａｓ９である場合、これが認識するＰＡＭのヌクレオチド配列としては、５’－ＮＧＧ等が挙げられる。ただし、かかるＰＡＭのヌクレオチド配列は、下記のＣａｓタンパク質の改変（例えば、変異の導入）によって変更することも可能であり、これにより標的部位の選択肢を拡大することが可能である。
　本発明に係る「標的部位」とは、上述のとおり２本鎖ＤＮＡの一方の鎖の、編集鎖で置き換えられる領域を示すが、置き換えられた編集鎖は相補的になっていないため、ＤＮＡの修復機構によって編集鎖を鋳型とした修復が行われると、結果的に２本鎖とも編集がなされる（図１Ｃの（ｃ））。本発明に係る標的部位は、ＰＡＭの位置に応じて設定される、Ｃａｓタンパク質による切断（好ましくはｎＣａｓによる１本鎖切断）を受ける部位の少なくとも１塩基を含むように設定される部位である。Ｃａｓタンパク質による切断を受ける部位は、Ｃａｓタンパク質の種類にもよるが、通常、ＰＡＭの５’側から３塩基目と４塩基目との間である。このような標的部位の長さとしては、１～１００塩基であることが好ましく、１～８０塩基であることがより好ましい。
　本発明において、「プライマー配列」は、前記標的部位の５’側に隣接して位置し、下記ｐｅｇＲＮＡのプライマー結合配列が結合する配列であり、その３’末端が逆転写酵素による逆転写反応の始点となる。そのため、プライマー配列は、Ｃａｓタンパク質による切断（好ましくはｎＣａｓによる１本鎖切断）を受けた際に生じる標的鎖上の３’末端を含むように設定される。このようなプライマー配列の長さとしては、４～３０塩基であることが好ましく、６～２５塩基であることがより好ましく、８～２０塩基であることがさらに好ましい。
　本発明において、「ｐｅｇＲＮＡ認識配列」は、下記ｐｅｇＲＮＡのスペーサー配列が認識して結合する配列である。また、「ｎｇＲＮＡ認識配列」は、ｎｇＲＮＡのスペーサー配列が認識して結合する配列である。これらのｐｅｇＲＮＡ認識配列及びｎｇＲＮＡ認識配列は、上記のＰＡＭ及び標的部位の位置に応じて設定される。本発明に係るｐｅｇＲＮＡ認識配列及びｎｇＲＮＡ認識配列の長さとしては、それぞれ独立して、Ｃａｓタンパク質の種類にもよるが、Ｃａｓ９又はｎＣａｓ９の場合、１２～２５塩基であることが好ましく、１４～２３塩基であることがより好ましく、１５～２２塩基であることがさらに好ましい。
　下記のｎｇＲＮＡを用いる場合、本発明に係るｐｅｇＲＮＡ認識配列とｎｇＲＮＡ認識配列とは別位置に存する配列である。かかるｐｅｇＲＮＡ認識配列とｎｇＲＮＡ認識配列との間の長さとしては、０（互いに隣接）～２００塩基であることが好ましく、０～１５０塩基であることがより好ましく、０～１００塩基であることがさらに好ましい。
　このような標的ＤＮＡのヌクレオチド配列としては特に制限されず、その配列に合わせて本発明のＤＮＡ編集システム（特にｐｅｇＲＮＡやｎｇＲＮＡ）を設計することで、本発明のＤＮＡ編集の対象とすることができる。
　本発明に係る標的ＤＮＡとしては、細胞内に存在するＤＮＡ（内在性ＤＮＡ）であることが好ましい。細胞内に存在するＤＮＡとしては、内因性ＤＮＡであっても、外因性ＤＮＡであってもよい。内因性ＤＮＡとしては、例えば、染色体、ミトコンドリア、又は葉緑体におけるゲノムＤＮＡが挙げられ、外因性ＤＮＡとしては、例えば、細胞内に導入したＤＮＡ（レポーター遺伝子、マーカー遺伝子、宿主に感染するウイルス、細菌や原虫の遺伝子等）が挙げられる。
　（Ｃａｓタンパク質）
　本発明において、「Ｃａｓタンパク質」は、ＣＲＩＳＰＲ（ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ　ｒｅｇｕｌａｒｌｙ　ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ　ｓｈｏｒｔ　ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ　ｒｅｐｅａｔ）関連酵素を示し、ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓタンパク質及びヌクレアーゼ活性が一部欠損したニッカーゼ型のＣａｓタンパク質からなる群から選択される少なくとも１種である。前記Ｃａｓタンパク質としては、クラス１－ＣＲＩＳＰＲ関連酵素であっても、クラス２－ＣＲＩＳＰＲ関連酵素であってもよい。これらの中でも、本発明に係るＣａｓタンパク質としては、クラス２－ＣＲＩＳＰＲ関連酵素であることが好ましく、ヌクレアーゼ活性が一部欠損したニッカーゼ型のＣａｓタンパク質であることがより好ましい。
　前記Ｃａｓタンパク質のうち、「ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓタンパク質」としては、特に制限されないが、例えば、Ｃａｓ９タンパク質（Ｃａｓ９、例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＳｐＣａｓ９）、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＳａＣａｓ９）、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ　ｊｅｊｕｎｉ由来のＣａｓ９タンパク質（ＣｊＣａｓ９））、Ｃａｓ１２ａタンパク質（Ｃａｓ１２、例えば、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ　ｎｏｖｉｃｉｄａ由来のＣａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）タンパク質（ＦｎＣａｓ１２ａ）、Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ　ｂａｃｔｅｒｉｕｍ由来のＣａｓ１２ａタンパク質（ＬｂＣａｓ１２ａ）、Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．由来のＣａｓ１２ａタンパク質（ＡｓＣａｓ１２ａ））、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）タンパク質（Ｃａｓ１２ｂ）、Ｃａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）タンパク質（Ｃａｓ１２ｅ）、Ｃａｓ１４タンパク質（Ｃａｓ１４）、Ｃａｓ１３タンパク質（Ｃａｓ１３）、Ｃａｓ３タンパク質（Ｃａｓ３）が挙げられる。これらの中でも、本発明に係るＣａｓとしては、複合体（カスケード）を要さないことから、クラス２－ＣＲＩＳＰＲ関連酵素であることが好ましく、Ｃａｓ９であることがより好ましい。
　また、本発明において、「ヌクレアーゼ活性が一部欠損したニッカーゼ型のＣａｓタンパク質」とは、前記Ｃａｓタンパク質（Ｃａｓ）のヌクレアーゼ活性の一部が欠損してニッカーゼ活性（１本鎖ＤＮＡ切断活性）を有するニッカーゼ型のＣａｓタンパク質を示し、本明細書中、場合により「ｎＣａｓ（ｎｉｃｋｉｎｇ　Ｃａｓ）」とも称する。
　このようなｎＣａｓとしては、特に制限されないが、例えば、ニッカーゼ型のＣａｓ９タンパク質（ｎＣａｓ９、例えば、ｎＳｐＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９のニッカーゼ型）であれば、ＳｐＣａｓ９のＤ１０、Ｅ７６２、Ｄ８３９、Ｈ９８３、Ｄ９８６、Ｈ８４０及びＮ８６３からなる群から選択される少なくとも１種が変異したもの；ｎＳａＣａｓ９（ＳａＣａｓ９のニッカーゼ型）であれば、ＳａＣａｓ９のＤ１０、Ｄ５５６、Ｈ５５７及びＮ５８０からなる群から選択される少なくとも１種が変異したもの等）、ニッカーゼ型のＣａｓ１２ａタンパク質（ｎＣａｓ１２ａ、例えば、ｎＬｂＣａｓ１２ａ（ＬｂＣａｓ１２ａのニッカーゼ型）であればＲ１１３８Ａ；ｎＡｓＣａｓ１２ａ（ＡｓＣａｓ１２ａのニッカーゼ型）であればＲ１２２６Ａ等）、ニッカーゼ型のＣａｓ１２ｂタンパク質（ｎＣａｓ１２ｂ）、ニッカーゼ型のＣａｓ１４タンパク質（ｎＣａｓ１４）、ニッカーゼ型のＣａｓ３タンパク質（ｎＣａｓ３）、ニッカーゼ型のＣａｓ１０ｄタンパク質（ｎＣａｓ１０ｄ）が挙げられる。これらの中でも、本発明に係るｎＣａｓとしては、クラス２－ＣＲＩＳＰＲ関連Ｃａｓのニッカーゼ型であることが好ましく、ｎＣａｓ９であることがより好ましい。
　これらのＣａｓタンパク質をコードするアミノ酸配列は公知であり、公開されたデータベース、例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）や公開文献等から取得して利用することができる。
　また、本発明に係るＣａｓタンパク質としては、これらに限定されるものではなく、さらなる変異、例えば、ＰＡＭ認識を改変するための変異が導入されていてもよい（Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｐ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　５２３，ｐ。４８１－４８５，２０１５；Ｈｉｒａｎｏ，Ｓ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｅｌｌ　６１，ｐ．８８６－８９４，２０１６）。
　さらに、本発明に係るＣａｓタンパク質としては、その機能（ｐｅｇＲＮＡ及び必要に応じてｎｇＲＮＡとの複合体形成能、ヌクレアーゼ活性又はニッカーゼ活性等）を阻害しない限り、公知のＣａｓタンパク質のアミノ酸配列に基づいて、適宜改変（例えば、アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び／又は付加の導入）がなされたものであってもよい。前記Ｃａｓタンパク質が前記複合体形成能、及びヌクレアーゼ活性又はニッカーゼ活性を有することは、例えば、ｐｅｇＲＮＡ及び逆転写酵素と共に細胞内に導入したときに、改変前（例えば公知のアミノ酸配列のポリペプチドからなるＣａｓタンパク質）と同等以上（例えば５０％以上、好ましくは８０％以上）の標的ＤＮＡの編集効率を示すことにより確認することができる。
　下記のｎｇＲＮＡを用いる場合、これに対するＣａｓタンパク質は、ｎＣａｓであることが好ましい。またこの場合、本発明のＤＮＡ編集システムとしては、前記Ｃａｓタンパク質として、ｐｅｇＲＮＡ及びｎｇＲＮＡに対してそれぞれ別種の複数のＣａｓタンパク質を含んでいてもよいが、簡易性の観点からは両者に共通の１種のＣａｓタンパク質を含むことが好ましい。
　本発明に係るＣａｓタンパク質としては、精製や検出のためのエピトープタグ（例えば、フラグタグ、ＨＡタグなど）や、各種移行シグナル（例えば、核移行シグナル、ミトコンドリア移行シグナル、色素体移行シグナル）が付加されていてもよい。
　本発明に係るＣａｓタンパク質は、従来公知の方法により適宜得ることができる。例えば、アミノ酸配列情報を基に人工合成して調製することが可能であり、また、核酸レベルで調製することも可能である。すなわち、Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドを含むＣａｓタンパク質の発現ベクターを適当な宿主細胞内に導入して発現させることにより、同細胞内にＣａｓタンパク質を得ることができる。前記発現ベクター及び宿主細胞については、本発明の逆転写酵素において挙げたものと同様である。よって、本発明に係るＣａｓタンパク質の態様には、前記Ｃａｓタンパク質の発現ベクター及び前記Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含まれる。
　（プライム編集ガイドＲＮＡ）
　本発明において、「プライム編集ガイドＲＮＡ」は、５’側から順に、スペーサー配列、テンプレート配列、及びプライマー結合配列を含むＲＮＡである。１本のヌクレオチド鎖（ＲＮＡ鎖）からなる形態であっても、また、例えば相補的な配列間の結合を介して繋ぎ合わされた２本以上のヌクレオチド鎖からなる形態であってもよい。本明細書中、「プライム編集ガイドＲＮＡ」を場合により「ｐｅｇＲＮＡ（ｐｒｉｍｅ　ｅｄｉｔｉｎｇ　ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ）」とも称する。
　「スペーサー配列」は、「ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ」とも称され、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓシステムが由来する細菌ゲノムのＣＲＩＳＰＲ構造において、本来は、アダプテーションの過程において取り込まれた外因性ＤＮＡ由来の配列であるが、本発明に係るスペーサー配列は、前記ｐｅｇＲＮＡ認識配列を認識して結合する配列として設計される配列である。このようなスペーサー配列としては、前記ｐｅｇＲＮＡ認識配列の相補配列であることが好ましいが、前記ｐｅｇＲＮＡ認識配列とハイブリダイズして２本鎖を形成可能なヌクレオチド配列であればよく、完全に相補的でなくともよい。本発明において、かかるスペーサー配列とｐｅｇＲＮＡ認識配列との配列相補性としては、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）であることが好ましい。なお、前記配列相補性は、当業者であれば公知の手法（例えば、ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ））を用いて適宜計算することができる。
　本発明に係るｐｅｇＲＮＡのスペーサー配列としては、目的の標的部位に応じた前記ｐｅｇＲＮＡ認識配列に対応して設計することができ、その長さとしては、Ｃａｓタンパク質の種類にもよるが、１０～４０塩基であることが好ましく、例えばＣａｓ９又はｎＣａｓ９の場合、１２～２５塩基であることがより好ましく、１４～２３塩基であることがさらに好ましく、１５～２２塩基であることがさらにより好ましい。
　本発明において、「テンプレート配列」は、「ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｔｅｍｐｌａｔｅ（ＲＴＴ）」とも称され、前記逆転写酵素の鋳型となる配列である。本発明に係るテンプレート配列は、前記標的部位に置き換えることを所望するヌクレオチド配列に応じて適宜設計することができる。本発明に係るテンプレート配列の長さとしては、１～１００塩基であることが好ましく、５～９０塩基であることがより好ましく、１０～８０塩基であることがさらに好ましい。
　本発明において、「プライマー結合配列」は、「ｐｒｉｍｅｒ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｉｔｅ（ＰＢＳ）」とも称され、Ｃａｓタンパク質（好ましくはｎＣａｓ）によって標的ＤＮＡの標的鎖に生じた３’末端にあるプライマー配列を認識して結合する配列として設計される配列である。このようなプライマー結合配列としては、前記プライマー配列の相補配列であることが好ましいが、前記プライマー配列とハイブリダイズして２本鎖を形成可能なヌクレオチド配列であればよく、完全に相補的でなくともよい。本発明において、かかるプライマー結合配列とプライマー配列との配列相補性としては、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）であることが好ましい。
　本発明に係るプライマー結合配列の長さとしては、４～３０塩基であることが好ましく、７～２３塩基であることがより好ましく、１０～１７塩基であることがさらに好ましい。
　本発明に係るｐｅｇＲＮＡは、他に、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成するｔｒａｃｒＲＮＡ構造として、スカフォールド配列も含むことが好ましい。前記スカフォールド配列としては、従来公知のもの又はそれに準じたものを適宜採用することができる。また、本発明に係るｐｅｇＲＮＡとしては、逆転写酵素の停止配列（例えば、ヘアピンループ構造を形成する配列）、リンカー、ＲＮＡモチーフ（例えば、ｔｍｐｋｎｏｔ、ｔｅｖｏｐｒｅＱ１、ｘｒＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー（例えば、ＭＳ２、ＰＰ７、ｂｏｘＢ、ｃｏｍ）等をさらに含んでいてもよい。
　本発明に係るｐｅｇＲＮＡは、従来公知の方法により適宜得ることができる。例えば、前記ｐｅｇＲＮＡ認識配列及びプライマー配列、並びに、所望のテンプレート配列に応じて設計した配列情報を基に人工合成して調製することが可能であり、また、核酸レベルで調製することも可能である。すなわち、ｐｅｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドを含むｐｅｇＲＮＡの発現ベクターを適当な宿主細胞内に導入して発現させることにより、同細胞内にｐｅｇＲＮＡを得ることができる。前記発現ベクター及び宿主細胞については、本発明の逆転写酵素において挙げたものと同様である。よって、本発明に係るｐｅｇＲＮＡの態様には、前記ｐｅｇＲＮＡの発現ベクター及び前記ｐｅｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドも含まれる。
　（ニッキングガイドＲＮＡ）
　本発明において、「ニッキングガイドＲＮＡ」は、標的ＤＮＡにおいて、逆転写酵素により合成された鎖（編集鎖）を鋳型としたＤＮＡ修復が起きる確率を向上させることを目的として（非特許文献１）、編集されていない鎖、すなわち、前記標的部位の反対鎖を前記Ｃａｓタンパク質（好ましくはｎＣａｓ）によってニッキングするために用いるガイドＲＮＡであり、本明細書中、「ｎｇＲＮＡ（ｎｉｃｋｉｎｇ　ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ）」とも称する。
　本発明に係るｎｇＲＮＡは、少なくとも前記ｎｇＲＮＡ認識配列を認識して結合する配列として設計されるスペーサー配列を含む。このようなスペーサー配列としては、前記ｎｇＲＮＡ認識配列の相補配列であることが好ましいが、前記ｎｇＲＮＡ認識配列とハイブリダイズして２本鎖を形成可能なヌクレオチド配列であればよく、完全に相補的でなくともよい。本発明において、かかるスペーサー配列とｐｅｇＲＮＡ認識配列との配列相補性としては、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、（例えば、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上）であることが好ましい。
　本発明に係るｎｇＲＮＡのスペーサー配列としては、目的の標的部位に応じた前記ｎｇＲＮＡ認識配列に対応して設計することができ、その長さとしては、Ｃａｓタンパク質の種類にもよるが、１０～４０塩基であることが好ましく、例えばｎＣａｓ９の場合、１２～２５塩基であることがより好ましく、１４～２３塩基であることがさらに好ましく、１５～２２塩基であることがさらにより好ましい。
　本発明に係るｎｇＲＮＡは、他に、Ｃａｓタンパク質と複合体を形成するｔｒａｃｒＲＮＡ構造として、スカフォールド配列も含むことが好ましい。前記スカフォールド配列としては、従来公知のもの又はそれに準じたものを適宜採用することができる。
　本発明に係るｎｇＲＮＡは、従来公知の方法により適宜得ることができる。例えば、前記ｎｇＲＮＡ認識配列に応じて設計した配列情報を基に人工合成して調製することが可能であり、また、核酸レベルで調製することも可能である。すなわち、ｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド又は前記ポリヌクレオチドを含むｎｇＲＮＡの発現ベクターを適当な宿主細胞内に導入して発現させることにより、同細胞内にｎｇＲＮＡを得ることができる。前記発現ベクター及び宿主細胞については、本発明の逆転写酵素において挙げたものと同様である。よって、本発明に係るｎｇＲＮＡの態様には、前記ｎｇＲＮＡの発現ベクター及び前記ｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドも含まれる。
　＜標的ＤＮＡを編集する方法＞
　本発明は、上記本発明のＤＮＡ編集システムを標的ＤＮＡに接触させ、前記標的ＤＮＡの標的部位を編集する工程を含む、標的ＤＮＡを編集する方法も提供する。本発明の標的ＤＮＡを編集する方法において、前記ＤＮＡ編集システム及び標的ＤＮＡは、それぞれ、それらの好ましい態様も含めて、上記本発明のＤＮＡ編集システムで述べたとおりである。
　前記ＤＮＡ編集システム、すなわち、本発明の逆転写酵素（Ｎ末断片、Ｃ末断片）、Ｃａｓタンパク質、ｐｅｇＲＮＡ、及び必要に応じてｎｇＲＮＡを前記標的ＤＮＡに接触させると、ｐｅｇＲＮＡのスペーサー配列が標的ＤＮＡ上の対応するｐｅｇＲＮＡ認識配列を認識して結合し、Ｃａｓタンパク質を当該標的ＤＮＡ上の標的部位近傍に誘導する。これにより、Ｃａｓタンパク質がＰＡＭを認識して標的部位又はその近傍に切れ目（２本鎖切断（カット）又はニック、好ましくはニック）を導入する。また、前記Ｎ末断片及びＣ末断片は両者がいずれも存在することで逆転写酵素活性を再生する。前記切れ目が導入されて生じた標的ＤＮＡ（第１の鎖、標的鎖）の３’末端には、それを含むプライマー配列を認識してｐｅｇＲＮＡのプライマー結合配列が結合し、それに続くテンプレート配列を鋳型、前記プライマー配列を始点として、前記逆転写酵素がＤＮＡ鎖（編集鎖）を合成する。標的ＤＮＡにおいては、編集鎖が遊離した３’ｆｌａｐ（図１Ｃの（ａ）参照）と平衡状態にある、非編集鎖が遊離した５’ｆｌａｐ（図１Ｃの（ｂ）参照）が細胞内酵素により削られて前記切れ目が修復され、前記標的部位が前記編集鎖に置換され、本発明に係るＤＮＡ編集が起きる。さらにその結果、取り込まれた編集鎖は相補的になっていない、２本鎖ＤＮＡのミスマッチ状態にあるため、細胞内のＤＮＡの修復機構によって編集鎖を鋳型とした修復が行われると、２本鎖とも編集がなされた編集ＤＮＡを得ることができる。このとき、ｎｇＲＮＡをさらに用いた場合には、前記標的部位の反対鎖（第２の鎖）にもｎｇＲＮＡによって誘導されたＣａｓタンパク質（好ましくはｎＣａｓ）によってニックが導入されるため、編集鎖を鋳型としたＤＮＡ修復が起きる確率を向上させることができる（非特許文献１）。これにより、標的部位及びその相補鎖では主に塩基の置換が起こるが、２本鎖ＤＮＡのミスマッチ修復の際にさらに他の塩基に置換されたり、１塩基又は１０数塩基の欠失若しくは挿入を生じることによる種々の変異が導入されることを否定するものではない。また、例えば、本発明のＤＮＡ編集システムをペアで用いることで、両切断部位間の長鎖の欠失や置換といった広範囲（例えば、１６メガ塩基以下）の編集も可能であり（Ｃｈｏｉ　Ｊ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　４０，ｐ．２１８－２２６，２０２２；Ｔａｏ　Ｒ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｓｉｇｎａｌ　Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｔａｒｇｅｔｅｄ　Ｔｈｅｒａｐｙ，２０２２　Ａｐｒ　２０，７（１）：１０８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１３９２－０２２－００９３６－ｗ．等を参照）、例えば、染色体の転座、逆位、重複も可能であることも示唆される。したがって、本発明に係るＤＮＡ編集には、前記標的部位近傍や、前記標的部位を含む長鎖における、１以上の塩基の欠失、他の１以上の塩基への置換、若しくは１以上の塩基の挿入、又はこれらの変異の組み合わせも含む。
　本発明の標的ＤＮＡを編集する方法は、細胞内において行うことが好ましい。本発明の標的ＤＮＡを編集する方法の場となる「細胞内」としては、真核細胞内であっても原核細胞内であってもよいが、好ましくは真核細胞内である。前記真核細胞としては、例えば、動物細胞（哺乳類、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、昆虫類の細胞等）、植物細胞、藻細胞、酵母が挙げられ、前記原核細胞としては、例えば、大腸菌、サルモネラ菌、枯草菌、乳酸菌、高度好熱菌が挙げられる。
　「動物細胞」には、例えば、動物の個体を構成している細胞、動物から摘出された器官・組織を構成する細胞、動物の組織に由来する培養細胞等が含まれる。具体的には、例えば、卵母細胞や精子などの生殖細胞；各段階の胚の胚細胞（例えば、１細胞期胚、２細胞期胚、４細胞期胚、８細胞期胚、１６細胞期胚、桑実期胚など）；誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞や胚性幹（ＥＳ）細胞などの幹細胞；線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵臓細胞、脳細胞、腎細胞などの体細胞などが挙げられる。前記卵母細胞としては、受精前及び受精後の卵母細胞を利用することができるが、好ましくは受精後の卵母細胞、すなわち受精卵である。特に好ましくは、受精卵は前核期胚のものである。卵母細胞としては、凍結保存されたものを解凍して用いることができる。
　「植物細胞」には、例えば、植物の個体を構成している細胞、植物から分離した器官や組織を構成する細胞、植物の組織に由来する培養細胞等が含まれる。植物の器官や組織としては、例えば、葉、茎、茎頂（生長点）、根、塊茎、カルスなどが挙げられる。
　前記ＤＮＡ編集システムと前記標的ＤＮＡとを接触させる方法としては特に制限されない。細胞内においては、例えば、下記の標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法のように、前記標的ＤＮＡを含む細胞に対して前記ＤＮＡ編集システムを導入する方法が挙げられる。
　＜標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法＞
　本発明は、上記本発明のＤＮＡ編集システムを細胞内に導入して標的ＤＮＡに接触させ、前記標的ＤＮＡの標的部位を編集する工程を含む、標的ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法も提供する。
　本発明の標的ＤＮＡが編集された細胞の製造方法（以下、場合により単に「製造方法」という）において、前記ＤＮＡ編集システム及び標的ＤＮＡは、それぞれ、それらの好ましい態様も含めて、上記本発明の標的ＤＮＡを編集する方法で述べたとおりである。本発明の製造方法における標的ＤＮＡとしては、ゲノムＤＮＡであり、当該ゲノムＤＮＡの編集目的に応じて、ｐｅｇＲＮＡ及び必要に応じてｎｇＲＮＡを設計することができる。
　また、本発明の製造方法において、前記ＤＮＡ編集システム、すなわち、本発明の逆転写酵素、Ｃａｓタンパク質、ｐｅｇＲＮＡ、及び必要に応じてｎｇＲＮＡと標的ＤＮＡとの接触は、前記ＤＮＡ編集システムの、細胞へのタンパク質又はＲＮＡの形態での導入の他、当該タンパク質又はＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの形態での導入、及び／又は、細胞への発現ベクターの形態での導入により細胞内で発現させることによって行うことができる。よって、前記ＤＮＡ編集システムとしては、それぞれ独立に、タンパク質又はＲＮＡの形態で細胞内に導入しても、これらをコードするＤＮＡやＲＮＡ（ポリヌクレオチド）の形態で細胞内に導入して細胞内で発現させても、発現ベクターの形態で細胞内に導入して細胞内で発現させてもよい。
　また、前記ＤＮＡ編集システムを発現ベクターの形態で細胞内に導入する場合には、例えば、各タンパク質又はＲＮＡをそれぞれ別個に発現するベクターを細胞内に導入してもよく、これらを組み合わせて発現するベクターを細胞内に導入してもよい。
　前記各タンパク質又はＲＮＡ、当該タンパク質又はＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、発現ベクターを細胞内に導入する方法としては、タンパク質やポリヌクレオチドを細胞内に導入するための公知の方法を細胞の種類に応じて適宜採用することができ、このような方法としては、例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、マイクロインジェクション法、パーティクルガン法、リン酸カルシウム法、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）法、リポソーム法（リポフェクション法）、ＤＥＡＥ－デキストラン法、カチオン性脂質媒介トランスフェクション、ウイルス（アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウィルス等）、アグロバクテリウム法、酢酸リチウム法、スフェロプラスト法、熱ショック法（塩化カルシウム法、塩化ルビジウム法）等が挙げられる。このような方法は、「Ｄａｖｉｓｅｔ　ａｌ．，Ｂａｓｉｃ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，１９８６」等、多くの標準的研究室マニュアルに記載されている。
　前記ＤＮＡ編集システムが細胞内に導入されると、導入された各構成又は細胞内で発現した各構成と細胞内の標的ＤＮＡとが接触し、上記の本発明の標的ＤＮＡを編集する方法で述べたＤＮＡ編集により、標的部位で目的の塩基の置換が起こり、その結果、標的ＤＮＡが編集された細胞を得ることが可能となる。
　本発明はまた、前記標的ＤＮＡの編集がされた細胞を含む非ヒト個体の作製方法を提供する。この方法は、上記の製造方法により得られた細胞から非ヒト個体を作製する工程を含む。前記非ヒト個体としては、例えば、非ヒト動物及び植物が挙げられる。前記非ヒト動物としては、哺乳類（マウス、ラット、モルモット、ハムスター、ウサギ、サル、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジなど）、魚類、鳥類、爬虫類、両生類、昆虫類が挙げられる。モデル動物を作製する場合、哺乳動物は、好ましくは、マウス、ラット、モルモット、ハムスターなどのげっ歯類であり、特に好ましくはマウスである。前記植物としては、例えば、穀物類、油料作物、飼料作物、果物、野菜類が挙げられる。具体的な作物としては、例えば、イネ、トウモロコシ、バナナ、ピーナツ、ヒマワリ、トマト、アブラナ、タバコ、コムギ、オオムギ、ジャガイモ、ダイズ、ワタ、カーネーションを例示することができる。
　前記標的ＤＮＡの編集がされた細胞から非ヒト個体を作製する方法としては、公知の方法を利用することができる。動物において細胞から非ヒト個体を作製する場合、通常、生殖細胞又は多能性幹細胞が利用される。例えば、前記ＤＮＡ編集システムを前記卵母細胞にマイクロインジェクションし、得られた卵母細胞を偽妊娠状態にした雌非ヒト哺乳動物の子宮に移植し、その後産仔を得ることができる。また、植物においては、古くから、その体細胞が分化全能性を有していることが知られており、例えば、前記ＤＮＡ編集システムを植物細胞にマイクロインジェクションし、得られた植物細胞から植物体を再生することにより、所望のＤＮＡが編集された植物体を得ることができる。また、得られた非ヒト個体からは、所望のＤＮＡが編集された子孫やクロ－ンを得ることもできる。
　標的ＤＮＡ編集の有無の確認、及び遺伝子型の決定は、従来公知の手法に基づいて行うことができ、例えばＰＣＲ法、配列決定法、サザンブロッティング法等を利用することができる。
　＜キット＞
　本発明は、上記本発明の標的ＤＮＡを編集する方法、本発明の製造方法、又は上記本発明の非ヒト個体の作製方法に用いるためのキットであり、
（Ａ）本発明の逆転写酵素、前記逆転写酵素の発現ベクター、及び前記逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種、
を含む、キットも提供する。本発明のキットとしては、下記（Ｂ）～（Ｃ）：
（Ｂ）Ｃａｓタンパク質、前記Ｃａｓタンパク質の発現ベクター、及び前記Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種、
（Ｃ）ｐｅｇＲＮＡ、前記ｐｅｇＲＮＡの発現ベクター、及び前記ｐｅｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種、
からなる群から選択される少なくとも１種をさらに含むことが好ましく、
（Ｄ）ｎｇＲＮＡ、前記ｎｇＲＮＡの発現ベクター、及び前記ｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種
をさらに含むことがより好ましい。
　本発明のキットが（Ｂ）～（Ｃ）又は（Ｂ）～（Ｄ）を含む場合であって、上記（Ａ）～（Ｄ）が発現ベクターの形態である場合、これらは、１つのベクターに２以上の構成が組み合わせて含まれる態様であってよい。また、上記（Ｃ）、（Ｄ）が発現ベクターの形態である場合、これらは、標的ＤＮＡの標的部位に応じてユ－ザ－が前記ｐｅｇＲＮＡ及びｎｇＲＮＡを設計することができる形態であってもよく、前記ｐｅｇＲＮＡの発現ベクターは、
（Ｃ’）スペーサー配列の挿入部位、テンプレート配列の挿入部位、及びプライマー結合配列の挿入部位、を含むｐｅｇＲＮＡの発現ベクター
としてもよく、前記ｎｇＲＮＡの発現ベクターは、
（Ｄ’）スペーサー配列の挿入部位を含むｎｇＲＮＡの発現ベクター
としてもよい。
　本発明のキットとしては、一つ又は複数の追加の試薬をさらに含んでいてもよい。このような追加の試薬としては、例えば、希釈緩衝液、核酸導入試薬、タンパク質導入試薬、対照試薬（例えば、配列番号：１に記載のアミノ酸配列のポリペプチドからなる完全体の逆転写酵素）が挙げられるが、これらに制限されるものではない。また、当該キットは、本発明の方法を実施するための使用説明書をさらに含んでいてもよい。
　本発明のキットに含まれる各構成は、それぞれ別個の容器に収容されていてもよいし、同一の容器に収容されていてもよい。各構成は、一回の使用量ごとに容器に収容されていてもよいし、複数回分の量が一つの容器に収容されていてもよい。各構成は乾燥形態で容器に収容されていてもよいし、適当な溶媒（緩衝液、安定剤、保存剤、防腐剤等を含む溶媒）中に溶解した形態で容器に収容されていてもよい。
　以下、実施例を含む試験例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は以下の試験例に限定されるものではない。
　＜基本操作＞
　本試験例で実施した各基本操作を以下に示す。
　１．アガロース電気泳動
　１×ＴＡＥに対して１～３％の質量のＡｇａｒｏｓｅ　Ｓを加え、加熱して溶解させた。この溶液をゲルメーカーに流し込み、コームを挿して室温で静置してゲルを固めた。泳動槽に固まったゲルを入れてから適量の１×ＴＡＥを注ぎ、Ｌｏａｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒを１×以上の濃度となるようサンプルに加え、ＤＮＡサイズマーカーと共にゲルのウェルにアプライした。泳動後にゲルを切り出してＤＮＡを抽出する場合には５０Ｖで１時間程度、抽出しない場合には１００Ｖで３０分間程度泳動した。イオン交換水に泳動後のゲルを入れ、２μＬのエチジウムブロマイドを加えて２０分間程度振盪させた。ゲルをＵＶトランスイルミネーターで撮影してバンドを確認し、ＤＮＡを抽出する場合には目的のバンドがある位置のゲルを切り出した。
　２．Ｗｉｚａｒｄ　ＳＶ　Ｇｅｌ　ａｎｄ　ＰＣＲ　Ｃｌｅａｎ－Ｕｐ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を用いたＤＮＡの抽出
　上記１．で切り出したゲルの重さを測定し、１％アガロースゲル０．１ｇに対して１００μＬのＭｅｍｂｒａｎｅ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加えた。これに１５秒間程度ボルテックスを行い、５５℃のヒートブロックで１０～１５分間程度温めた。各ゲルが溶解していることを確認し、ＣｏｌｕｍｎをのせたＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｔｕｂｅに溶解液を移してから室温で１分間静置した。２０℃、１６０００ｇの条件で１分間遠心し、濾液を捨てた。７００μＬのＭｅｍｂｒａｎｅ　Ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎをＣｏｌｕｍｎに加え、再び２０℃、１６０００ｇの条件で１分間遠心し、濾液を捨てた。さらに、５００μＬのＭｅｍｂｒａｎｅ　Ｗａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎをＣｏｌｕｍｎに加え、２０℃、１６０００ｇの条件で５分間遠心し、濾液を捨てた。Ｃｏｌｕｍｎを新しい１．５ｍＬチューブへ移してＮｕｃｌｅａｓｅ　Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒを１５μＬ加え、室温で１分間静置した後、２０℃、１６０００ｇの条件で１分間遠心した。再度Ｎｕｃｌｅａｓｅ　Ｆｒｅｅ　Ｗａｔｅｒを１５μＬ加え、室温で１分間静置してから２０℃、１６０００ｇの条件で１分間遠心した。濾液の濃度をＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）で測定し、２００ｎｇ／μＬに調製してから－２０℃で保存した。
　３．ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）を用いたＰＣＲ
　ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　Ｐｒｅｍｉｘ（２×）　５μＬ、１０μＭのＦｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　０．３μＬ、１０μＭのＲｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　０．３　μＬ、１ｎｇ／μＬのテンプレート　０．２μＬ、及びオートクレーブ超純水　４．２μＬをＰＣＲチューブ内で混合した。サーマルサイクラーを用いて、９４℃で２分間プレヒートした後、９８℃で１０秒間の熱変性→６０～６８℃（ｐｒｉｍｅｒのＴｍ値による）で５秒間のアニーリング→７２℃で５～７０秒間（増幅させる塩基数による）の伸長反応を３５サイクル行い、４℃で保存した。
　４．ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）を用いたＰＣＲ
　ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　０．５μＬ、５×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　Ｂｕｆｆｅｒ　５μＬ、２．５ｍＭ　ｅａｃｈ　ｄＮＴＰ　ｍｉｘｔｕｒｅ　２μＬ、１０μＭのＦｏｒｗａｒｄ　Ｐｒｉｍｅｒ　０．７５μＬ、１０μＭ　のＲｅｖｅｒｓｅ　Ｐｒｉｍｅｒ　０．７５μＬ、１～１０ｎｇ／μＬのテンプレート　１．２５μＬ、オートクレーブ超純水　１４．７５μＬをＰＣＲチューブ内で混合した。サーマルサイクラーを用いて、９４℃で２分間プレヒートした後、９８℃で１０秒間の熱変性→６０～６８℃（ｐｒｉｍｅｒのＴｍ値による）で１５秒間のアニーリング→６８℃で３００～３５０秒間（増幅させる塩基数による）の伸長反応を４５サイクル行い、４℃で保存した。
　５．Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応
　インサート側ＤＮＡ０．８μＬとベクター側ＤＮＡ０．８μＬ、又は、ベクター側ＤＮＡのみ１．６μＬを、ＰＣＲチューブ内で５×Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ株式会社製）０．４μＬと混合した。サーマルサイクラーを用いて５０℃で１５分間反応させた後、４℃で保存した。
　６．制限酵素処理
　２００ｎｇ／μＬのプラスミド、制限酵素０．３μＬ（制限酵素が２種の場合：各０．３μＬ）、制限酵素に対応するｂｕｆｆｅｒ　１μＬ、オートクレーブ超純水　７．７μＬ（制限酵素が２種の場合：７．４μＬ）を１．５ｍＬチューブ内で混合した。これを３７℃のインキュベーターに１時間以上静置し、制限酵素反応を行った。この後、Ｌｉｇａｔｉｏｎ（下記の７．）を実施する場合には、ｒＡＰｉｄ　Ａｌｋａｌｉｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ　２（ＲＯＣＨＥ社製）を０．５μＬ加え、再び３７℃のインキュベーターに１時間静置してリン酸化させた。
　７．Ｌｉｇａｔｉｏｎ
　インサート側ＤＮＡ１μＬ、ベクター側ＤＮＡ１μＬ、２×Ｌｉｇａｔｉｏｎ　Ｍｉｘ（タカラバイオ株式会社製）１．０μＬをＰＣＲチューブ内で混合した後、サーマルサイクラーを用いて１６℃で３０分間反応させた。
　８．ＳｅｑＳｔｕｄｉｏ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）によるシーケンス解析
　８．１　Ｃｙｃｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ反応
　２００ｎｇ／μＬ又は１００ｎｇ／μＬのプラスミド１μＬ、ＢｉｇＤｙｅ　Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ　ｖ３．１　Ｒｅａｄｙ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）１μＬ、５×Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ　１．５μＬ、１０μＭのｐｒｉｍｅｒ　０．３２μＬ、オートクレーブ超純水　６．１８μＬを混合した。サーマルサイクラーを用いて、９６℃で２分間のプレヒートの後、９６℃で１０秒間の熱変性→５０℃で５秒間のアニーリング→６０℃で４分間の伸長反応を２５サイクル行い、４℃で保存した。
　８．２　Ｏｐｔｉｍａ　ＤＴＲ　８－Ｗｅｌｌ　Ｓｔｒｉｐ　Ｋｉｔ（ＥｄｇｅＢｉｏ社製）を用いたＣｙｃｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ産物の精製
　９６－ｗｅｌｌホルダーから８－ｗｅｌｌストリップをはずし、ｆｌａｔ　ｂｏｔｔｏｍ　Ｗａｓｔｅ　ｐｌａｔｅにセットしてから２６００ｒｐｍで３分間遠心した。９６－ｗｅｌｌ　ｖ　ｂｏｔｔｏｍ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｐｌａｔｅに８－ｗｅｌｌストリップをセットし、Ｃｙｃｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ産物　１０μＬを８－ｗｅｌｌストリップに加えて２６００ｒｐｍで５分間遠心した。
　８．３　シーケンス解析
　上記８．２で精製された産物１０μＬをシーケンス用プレートに加えてスピンダウンし、ＳｅｑＳｔｕｄｉｏ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）にかけてシーケンス解析を実施した。
　９．大腸菌への形質転換
　１．５ｍＬチューブ内でサンプル（下記の試験例で形質転換したサンプルは全てＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎ耐性遺伝子を有する）と１０倍量以上のコンピテントセル（ＸＬ１０－Ｇｏｌｄ）とを混合した。氷上で１０分間以上静置した後にヒートブロックを用いて４２℃で３０秒間インキュベートし、２分間程度氷冷した。安全キャビネット内でＬＢ＋Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎプレートに菌液を塗り広げ、３７℃のインキュベーターに入れて１６～１８時間培養した。
　１０．コロニーＰＣＲ
　ＰＣＲチューブ内で２×ＳａｐｐｈｉｒｅＡｍｐ　Ｆａｓｔ　ＰＣＲ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ（タカラバイオ株式会社製）４μＬ、１０μＭのＦｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ　０．１６μＬ、１０μＭのＲｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ　０．１６μＬ、オートクレーブ超純水　３．６８μＬを混合してＰＣＲ反応液を調製した。２００μＬピペットチップでプレート上のコロニーをつついて、レプリカ用ＬＢ＋Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎプレートに触れた後、チップを前記ＰＣＲ反応液に浸けた。チップを捨て、サーマルサイクラーを用いて９４℃で２分間のプレヒートを行った後、９８℃で５秒間の熱変性→５２～６８℃（ｐｒｉｍｅｒのＴｍ値による）で５秒間のアニーリング→７２℃で１０～４０秒間（増幅させる塩基数による）の伸長反応を２７サイクル行い、４℃で保存した。上記１．のアガロース電気泳動によって目的のバンドが存在することを確かめた。
　１１．ＧｅｎＥｌｕｔｅ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ｍｉｎｉｐｒｅｐ　Ｋｉｔ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製）を用いたプラスミド抽出
　１１．１　Ｓｍａｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ
　試験管に入った３ｍＬのＬＢ液体培地に２５ｍｇ／ｍＬのＡｍｐｉｃｉｌｌｉｎを１５μＬ加えた。大腸菌のコロニーを２００μＬピペットチップでつつき、チップごと試験管内に落とした後に３７℃で１６時間以上振盪培養した。
　１１．２　大腸菌からのプラスミド抽出
　上記１１．１のＳｍａｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ後の培養液の約半量をデカントでＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｔｕｂｅに入れ、２０℃、１００００ｇの条件で１分間遠心してから上清を捨てた。残りの培養液もチューブに入れ、２０℃、１００００ｇの条件で１分間遠心してから上清を捨てた。４℃で保存していたＲｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを各Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｔｕｂｅに２００μＬ加え、ボルテックスによって沈殿を懸濁させた。各Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｔｕｂｅにＬｙｓｉｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを２００μＬ加え、転倒混和した後ふたを開けて室温で３分間放置した。次いで、Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ／Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒを３５０μＬ加えて転倒混和し、２０℃、１２０００ｇの条件で１０分間遠心した。その間にＣｏｌｕｍｎをＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｔｕｂｅにセットし、Ｃｏｌｕｍｎ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　５００μＬを加え、２０℃、１２０００ｇの条件で１分間遠心した。濾液を捨て、ＣｏｌｕｍｎにＬｙｓａｔｅの上清を移し、２０℃、１２０００ｇの条件で１分間遠心した。濾液を捨ててＷａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　１を５００μＬ加え、２０℃、１２０００ｇの条件で１分間遠心した。次いで、濾液を捨ててＷａｓｈ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　２を７５０μＬ加え、２０℃、１２０００ｇの条件で１分間遠心した。濾液を捨てて再度２０℃、１２０００ｇの条件で１分間遠心した。ＣｏｌｕｍｎをＤＮＡ　ＬｏＢｉｎｄ　ｔｕｂｅにセットし、Ｅｌｕｔｉｏｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを１５μＬ加え、１分間放置してから２０℃、１２０００ｇの条件で１分間遠心した。再びＥｌｕｔｉｏｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎを１５μＬ加え、１分間放置後に２０℃、１２０００ｇの条件で１分間遠心した。ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いて濾液のＤＮＡ濃度を測定し、２００ｎｇ／μＬ（測定濃度が２００ｎｇ／μＬを下回った場合は１００ｎｇ／μＬ）になるようＥｌｕｔｉｏｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎで希釈した。
　１２．オリゴＤＮＡのアニーリング
　ｎｇＲＮＡの標的配列のｔｅｍｐｌａｔｅ用に合成したセンス鎖及びアンチセンス鎖のオリゴＤＮＡ（１００μＭ）をそれぞれ０．５μＬ、１０×Ａｎｎｅａｌｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（４００μＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２００μＭ　ＭｇＣｌ２、５００μＭ　ＮａＣｌを混合したもの）１μＬ、オートクレーブ超純水　８μＬを混合した。サーマルサイクラーを用いて９５℃で５分間インキュベートした後、９０分間かけて２５℃まで温度を下げ、オリゴＤＮＡをアニーリングした。
　１３．Ｇｏｌｄｅｎ　Ｇａｔｅ反応によるプラスミドへの挿入
　２５ｎｇ／μＬのプラスミド０．３μＬ、上記１２．でアニールさせたオリゴＤＮＡ　０．５μＬ、ＢｐｉＩ　０．１μＬ、Ｑｕｉｃｋ　Ｌｉｇａｓｅ（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ社製）０．１μＬ、１０×Ｔ４　ＤＮＡ　Ｌｉｇａｓｅ　Ｂｕｆｆｅｒ（タカラバイオ株式会社製）０．２μＬ、オートクレーブ超純水　０．８μＬを混合した。サーマルサイクラーを用いて、３７℃で５分間の制限酵素反応→１６℃で１０分間のライゲーション反応を３サイクル行った後、４℃で保存した。
　＜細胞実験＞
　本試験例で実施した細胞実験は以下に示す操作で行った。細胞実験操作はいずれもクリーンベンチ内で行い、使用器具は予めクリーンベンチ内で１５分間以上ＵＶ処理したものを用いた。
　１．完全培地の作製
　Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ及びフェノールレッド含有Ｄ－ＭＥＭ培地（Ｈｉｇｈ　Ｇｌｕｃｏｓｅ）５００ｍＬに１０×Ｎｏｎ－Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ａｍｉｎｏ　Ａｃｉｄ（ＮＥＡＡ）５．５ｍＬ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（ＳＴ－ＰＮ）５．５ｍＬ、５６℃で３０分間非働化したＦｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）５５ｍＬを加え、よく混ぜてから４℃で保存した。
　２．ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養
　１００ｍｍ　ｄｉｓｈで培養中の培地をアスピレーターで取り除き、１０ｍＬの新しい完全培地を入れた。このとき電動ピペッターでピペッティングを行うことで細胞をｄｉｓｈから剥がし、細胞懸濁液とした。新しい１００ｍｍ　ｄｉｓｈに９ｍＬ程度の完全培地と１ｍＬ程度の細胞懸濁液とを入れ、細胞が均一になるよう振盪してから３７℃、５％ＣＯ２の条件でインキュベートした。細胞の増殖具合に応じて完全培地及び細胞懸濁液の量を調整しつつ、この操作を２～３日に一度行ってｄｉｓｈ内に細胞が増えすぎないようにした。
　３．Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ　ＬＴＸ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）を用いたｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎ
　Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎを行う前日又は当日に、導入するプラスミドの濃度が９０ｎｇ／６μＬ又は２００ｎｇ／６μＬで、液量が７．２μＬとなるようにオートクレーブ超純水で希釈した。９６ｗｅｌｌプレートの使用する各ｗｅｌｌにＤ－ＭＥＭを２５μＬ加え、事前に調整したプラスミドを６μＬ加えた。１つのｗｅｌｌに０．７μＬのＬｉｐｏｏｆｅｃｔａｍｉｎ　ＬＴＸと２５μＬのＤ－ＭＥＭとが加わるよう、両試薬をリザーバーで混合し、各ｗｅｌｌに加えてから常温で３０分間インキュベートした。
　この間、次のように細胞を調製した。すなわち、１００ｍｍ　ｄｉｓｈで培養していたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養液をアスピレーターで吸って取り除き、３ｍＬのＴｒｙｐＬＥＴＭ　Ｅｘｐｒｅｓｓをｄｉｓｈに加えて３０秒間インキュベートした。完全培地７ｍＬをｄｉｓｈに加えて電動ピペッターで細胞を剥がし、細胞懸濁液３ｍＬを５０ｍＬチューブへ移した。このチューブを２０℃、１０００ｒｐｍの条件で３分間遠心し、上清をアスピレーターで取り除き、完全培地１．５ｍＬを加えて再懸濁した。ＬＵＮＡ自動細胞計数装置（Ｌｏｇｏｓ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）に１０μＬの細胞懸濁液を入れて細胞の濃度を測り、１．５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるよう完全培地で希釈した。
　上記の３０分間のインキュベートが終了したタイミングで１００μＬの細胞懸濁液を各ｗｅｌｌに加え、３７℃、５％ＣＯ２の条件で７２時間培養した。
　＜ＥｄｉｔＲを用いた編集効率の測定＞
　本試験例において、編集効率は以下のＥｄｉｔＲにより測定した。
　１．細胞の回収
　細胞にＧＦＰ発現ベクターを導入していた場合、細胞回収前に９６ｗｅｌｌプレートを蛍光顕微鏡で観察し、プラスミドが細胞に導入されたか否かを確認した。その後細胞の培地を取り除き、各ｗｅｌｌにＴｒｙｐＬＥＴＭ　Ｅｘｐｒｅｓｓ　５０μＬを加えてから３７℃で５分間インキュベートした。全てのｗｅｌｌに１５０μＬの１×ＰＢＳ（－）を加えてピペッティングで細胞を剥がし、細胞懸濁液を全量ＰＣＲチューブに移した後、２０℃、１３０００ｒｐｍの条件で３分間遠心した。上清を捨てて再び１５０μＬの１×ＰＢＳ（－）を加え、２０℃、１３０００ｒｐｍの条件で３分間遠心した。上清を捨て、各チューブに２０μＬのＣｅｌｌ　Ｌｙｓｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）と０．８μＬのＰｒｏｔｅｉｎ　Ｄｅｇｒａｄｅｒ（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社製）とを加えた。サーマルサイクラーを用いて６０℃で１５分間→９５℃で１０分間のプログラムを実行し、－２０℃で保存した。
　２．ゲノムＰＣＲとＥｘｏＳＡＰ－ＩＴ処理
　上記基本操作３．により、Ｐｒｉｍｅ　ＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）を用いて標的部位周辺をＰＣＲで増幅した。ＲＮＦ２遺伝子座を標的とした実験では、プライマーとしてＲＮＦ２－ＫＮ－Ｆ１（配列番号：２、Ｔｍ値：６２．１℃）とＲＮＦ２－ＫＮ－Ｒ１（配列番号：３、Ｔｍ値：６３．９℃）とを用いた。ＰＣＲ産物１０μＬのうち、３μＬをアガロース電気泳動で使い、残りの７μＬを解析に用いた。７μＬのＰＣＲ産物に１μＬのＥｘｏＳＡＰ－ＩＴ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）を加え、サーマルサイクラーを用いて３７℃で１５分間以上→８０℃で１５分間のプログラムを実行し、－２０℃で保存した。
　３．シーケンス解析
　上記基本操作８．により、ＳｅｑＳｔｕｄｉｏ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）によりシーケンス解析を行い、編集箇所を含むヌクレオチド配列の波形データを得た。
　４．ＥｄｉｔＲを用いたゲノム編集効率の測定
　上記３．で得られた波形データをＥｄｉｔＲ（ｈｔｔｐｓ：／／ｍｏｒｉａｒｉｔｙｌａｂ．ｓｈｉｎｙａｐｐｓ．ｉｏ／ｅｄｉｔｒ＿ｖ１０／，Ｋｌｕｅｓｎｅｒ　ＭＧ　ｅｔ　ａｌ．，２０１８）に入力し、ゲノム編集の効率（編集効率（％））を算出した。
　＜ベクターの作製＞
　１．ｎＣａｓ９ベクター、ＲＴａｓｅベクター、及びＰＥベクターの作製
　先ず、ＥＦ１ａプロモーター下でｎＣａｓ９を発現するベクター「ＫＳ２」（ｎＣａｓ９ベクター、配列番号：４）と、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター下でＲＴａｓｅを発現するベクター「ＫＳ１５」（ＲＴａｓｅベクター、配列番号：５）とを、非特許文献４に倣って作製した。「ＫＳ２」及び「ＫＳ１５」の構成の模式図をそれぞれ図２及び図３に示す。ここで、「ＫＳ２」はｎｇＲＮＡのプロモーターとｓｃａｆｆｏｌｄ配列とを有し、図２中、「Ｃａｓ９」はｎＣａｓ９であることを示し（以下、図４、図７において同じ）、「ＫＳ１５」がコードするＲＴａｓｅのアミノ酸配列は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列において、第９２位のＳをＲに置換したもの（Ｓ９２Ｒ）である。
　また、ポジティブコントロールとして使用するために、ＥＦ１ａプロモーター下でＰｒｉｍｅ　Ｅｄｉｔｏｒ（ｎＣａｓ９とＲＴａｓｅとの融合タンパク質）を発現するベクター「＃１３７３」（ＰＥベクター、配列番号：６）も、非特許文献４に倣って作製した。「＃１３７３」の構成の模式図を図４に示す。ここで、「＃１３７３」はｎｇＲＮＡのプロモーターとｓｃａｆｆｏｌｄ配列とを有する。
　標的遺伝子は、プライム編集の初出の論文である非特許文献１で効果が検証されているＲＮＦ２とした。ＲＮＦ２上に存在する、ＰＡＭ、ｐｅｇＲＮＡ認識配列（ｃｏｍｐ＿ｐｅｇＲＮＡ）、及び下記のｎｇＲＮＡが結合するｎｇＲＮＡ認識配列（ｃｏｍｐ＿ｎｇＲＮＡ）の位置関係の模式図を図５に示す。
　２．ｎｇＲＮＡの構築とＰＥベクターへの挿入
　非特許文献３に記載のＰＥ３ｍａｘもベースとするため、ｐｅｇＲＮＡとは別にｎｇＲＮＡを設計した。先ず、上記基本操作１２．によりオリゴＤＮＡ「ＲＮＦ２－ｎｉｃｋ－ｓ（センス鎖、配列番号：７）」と「ＲＮＦ２－ｎｉｃｋ－ａｓ（アンチセンス鎖、配列番号：８）」とをアニーリングして得られたｎｇＲＮＡ（配列番号：９）をコードするｎｇＲＮＡ発現カセットを、上記基本操作１３．のＧｏｌｄｅｎ　Ｇａｔｅ反応で上記のｎＣａｓ９ベクター「ＫＳ２」とＰＥベクター「＃１３７３」とにそれぞれ挿入した。次いで、全量のサンプルにＢｐｉＩ　０．１μＬ、１０×Ｂｕｆｆｅｒ　Ｇ　０．１μＬを加え、サーマルサイクラーを用いて３７℃で１時間の制限酵素反応→８０℃で５分間の制限酵素の熱失活を行い、前記ｎｇＲＮＡ発現カセットが未挿入のプラスミドを消化した。
　次いで、上記基本操作９．の形質転換を行い、同１１．によるプラスミド抽出を行い、同６．によって、抽出後のプラスミドにＢｐｉＩを用いた制限酵素処理を行った。制限酵素処理後のサンプルを上記基本操作１．でアガロース電気泳動し、ＢｐｉＩの認識配列が失われて切断が起きず、複数のバンドが現れることにより、で前記ｎｇＲＮＡ発現カセットが挿入されたことを確認した。
　ｎＣａｓ９ベクター「ＫＳ２」に前記ｎｇＲＮＡ発現カセットが挿入されたベクターを「ＫＳ２＋ｎｇ」、ＰＥベクター「＃１３７３」に前記ｎｇＲＮＡ発現カセットが挿入されたベクターを「ＫＳ２５＋ｎｇ」とした。
　３．ｐｅｇＲＮＡの設計とＰＥベクターへの挿入（ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ型ベクターの作製）
　ｐｅｇＲＮＡは、Ｕ６プロモーターから発現し、５’側から順に、２０ｎｔのスペーサー配列（ｐｒｏｔｏｓｐａｃｅｒ）、スカフォールド配列（ｇＲＮＡ　ｓｃａｆｆｏｌｄ）、１４ｎｔのテンプレート配列（ＲＴＴ）、１５ｎｔのプライマー結合配列（ＰＢＳ）、リンカー（ｐｅｇＬＩＴ　ｌｉｎｋｅｒ）、ｔｍｐｋｎｏｔ、Ｕ６ターミネーターを含む構成とした。ｐｅｇＲＮＡの構成の模式図を図６に、ｐｅｇＲＮＡのヌクレオチド配列を配列番号：１０に、それぞれ示す。配列番号：１０に示すヌクレオチド配列（１９１ｎｔ）のうち、第１～２０塩基がスペーサー配列を、第２１～９６塩基がスカフォールド配列を、第９７～１１０塩基がテンプレート配列を、第１１１～１２５塩基がプライマー結合配列を、第１３４～１８４塩基がｔｍｐｋｎｏｔを、それぞれ示す。
　先ず、ＲＮＦ２を標的とするｐｅｇＲＮＡを発現するベクターから、上記基本操作６．によって、Ｅｓｐ３Ｉを用いた制限酵素処理を行い、制限酵素処理したサンプルを同１．でアガロース電気泳動し、ｐｅｇＲＮＡをコードするｐｅｇＲＮＡ発現カセット（配列番号：１１）のバンドがある位置のゲルを切り出し、上記基本操作２．によってＤＮＡを抽出し、上記２．で調製した「ＫＳ２＋ｎｇ」又は「ＫＳ２５＋ｎｇ」をベクター側ＤＮＡとして、同７．のＬｉｇａｔｉｏｎをそれぞれ行った。上記基本操作９．の形質転換を行った後、同１０．により、プライマーｐｅｇＲＮＡ－ＣｏｌＰ－Ｒ（配列番号：１２、Ｔｍ値：６０．７℃）とＥＦ１α－ｐｒｏｓｅｑ－Ｒ（配列番号：１３、Ｔｍ値：５９．２℃）とを用いてコロニーＰＣＲを行った。次いで、上記基本操作１１．によるプラスミド抽出後、上記基本操作６．によって、ＨｉｎｄＩＩＩとＰｍｅＩとを用いた制限酵素処理を行い、制限酵素処理したサンプルについて同１．のアガロース電気泳動を行い、プラスミドに前記ｐｅｇＲＮＡ発現カセットが挿入されてＨｉｎｄＩＩＩの認識部位が現れ、プラスミド内の２箇所で切断が起きることを確認した。
　「ＫＳ２＋ｎｇ」にｐｅｇＲＮＡ発現カセットが挿入されたベクターを「ＫＳ２－１＋ｎｇ＋ｐｅｇ（配列番号：１４）」、「ＫＳ２５＋ｎｇ」にｐｅｇＲＮＡ発現カセットが挿入されたベクターを「ＫＳ２５－１＋ｎｇ＋ｐｅｇ（配列番号：１５）」とした。「ＫＳ２－１＋ｎｇ＋ｐｅｇ」及び「ＫＳ２５－１＋ｎｇ＋ｐｅｇ」の構成の模式図をそれぞれ図７の（ａ）及び（ｂ）に示す。
　４．ＰＥベクターの効率検証
　上記３．で作製した「ＫＳ２５－１＋ｎｇ＋ｐｅｇ（ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ）」又は上記２．で作製した「ＫＳ２５＋ｎｇ」とｐｅｇＲＮＡを発現するベクターとの組み合わせ（ｓｅｐａｒａｔｅ）を上記細胞実験３．のＬｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、上述のＥｄｉｔＲにより編集効率を測定した。また、細胞に作用しないプラスミドｐｃＤＮＡ、及びＧＦＰのみを発現するプラスミドｐＧＦＰも同様にして編集効率を測定した。結果を図８に示す。図８に示したように、ａｌｌ－ｉｎ－ｏｎｅ型とｓｅｐａｒａｔｅ型とにおいては編集効率に大きな差はないことが確認された。
　＜試験例１＞
　（１）Ｓｐｌｉｔ体の設計
　ＲＴａｓｅを分割し、かかる構成断片が全て揃ったときにのみＲＴａｓｅが機能してプライム編集が起きる分割型のＲＴａｓｅ（以下、場合により「Ｓｐｌｉｔ体」）を設計した。先ず、Ｂｅｒｒｉｏｓ，Ｋ．Ｎ．，ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔ　Ｃｈｅｍ　Ｂｉｏｌ　１７，ｐ．１２６２－１２７０，２０２１（文献Ｉ）の記載を基に、ＧＦＰを２分割したＮ末側のＧＦＰ１－１０とＣ末側のＧＦＰ１１との会合を利用して、分割したＲＴａｓｅの活性の再生を検証した。すなわち、ＲＴａｓｅを２分割したＮ末断片とＧＦＰ１－１０とをＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧリンカー（配列番号：１６）で繋いだ融合タンパク質と、ＲＴａｓｅを２分割した残りのＣ末断片とＧＦＰ１１とを（ＧＧＧＧＳ）３リンカー（配列番号：１７）で繋いだ融合タンパク質とからなるＳｐｌｉｔ体を作製した。このＳｐｌｉｔ体（本試験例では分割ＧＦＰとの融合タンパク質）をｎＣａｓ９及びｐｅｇＲＮＡと協働させることにより、図９に示すように、両融合タンパク質がいずれも存在した場合には、プライム編集により標的ＤＮＡが編集される。また、本試験では、ＤＮＡの修復段階で編集鎖が採用される確率向上を目的として、ｎｇＲＮＡも協働させた（非特許文献１、３）。
　Ｓｐｌｉｔ体としては、配列番号：１に記載のアミノ酸配列からなるポリぺプチド又は配列番号：１に記載のアミノ酸配列の第９２位のＳをＲに置換したアミノ酸配列からなるポリぺプチド（Ｓ９２Ｒ）をＲＴａｓｅとして、以下の７か所の位置でそれぞれ分割したもの：
　　Ｅ１２３とＤ１２４との間で分割したもの：「ＳＰＬ　ＲＴ１」
　　Ｅ１７６とＭ１７７との間で分割したもの（Ｓ９２Ｒ）：「ＳＰＬ　ＲＴ２」
　　Ｅ２３３とＬ２３４との間で分割したもの（Ｓ９２Ｒ）：「ＳＰＬ　ＲＴ３」
　　Ｔ２９３とＰ２９４との間で分割したもの（Ｓ９２Ｒ）：「ＳＰＬ　ＲＴ４」
　　Ｇ４０５とＷ４０６との間で分割したもの（Ｓ９２Ｒ）：「ＳＰＬ　ＲＴ５」
　　Ｌ２１とＧ２２との間で分割したもの（Ｓ９２Ｒ）：「ＳＰＬ　ＲＴ＋Ｎ」
　　Ｅ４８８とＥ４８９との間で分割したもの（Ｓ９２Ｒ）：「ＳＰＬ　ＲＴ＋Ｃ」
について検証した。
　（Ｎ末側ベクターの作製）
　先ず、上記基本操作３．により、ＲＴａｓｅを発現するプラスミド「ＫＳ１５（Ｓ９２Ｒ）」又は「ＫＳ１６（ＫＳ１５においてＲ９２→Ｓ９２に戻したもの）」をテンプレートとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）を用いてＩｎｖｅｒｓｅ－ＰＣＲを実施し、ＲＴａｓｅのうちＳｐｌｉｔ体のＮ末断片で不要な部分（ここではＣ末断片）を含まない領域を増幅させた。このときの各Ｉｎｖｅｒｓｅ－ＰＣＲに使用したプライマーの組み合わせ、並びに、それらのＴｍ値及びヌクレオチド配列を示す配列番号を下記の表２に示す。また、ＧＦＰ１－１０をコードするプラスミド上の領域（配列番号：１８）をテンプレートとして、上記基本操作３．により、ＧＦＰ１－１０をコードする領域を増幅させた。このときに使用したプライマーの組み合わせ、並びに、それらのＴｍ値及びヌクレオチド配列を示す配列番号も下記の表２に示す。プライマーは、増幅後に各断片の端で１５塩基の相同な配列ができ、ＲＴａｓｅのＮ末断片とＧＦＰ１－１０とが前記ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧリンカーで繋がるように設計した（図１０）。
　ＰＣＲ以降の操作は、制限酵素処理の際にＥｃｏＲＩとＡｇｅＩとを使用してＧＦＰ１－１０の挿入を確認したこと以外は上記ベクターの作製２．のｎｇＲＮＡ発現カセットのＰＥベクターへの挿入と同様にして、ＲＴａｓｅの各Ｓｐｌｉｔ体のＮ末断片とＧＦＰ１－１０とがＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧリンカーで繋がれた融合タンパク質（Ｎ）の発現ベクター：「ＳＰＬ　ＲＴ１（Ｎ）－ＧＦＰ１－１０（配列番号：３５）」、「ＳＰＬ　ＲＴ２（Ｎ）－ＧＦＰ１－１０（配列番号：３６）」、「ＳＰＬ　ＲＴ３（Ｎ）－ＧＦＰ１－１０（配列番号：３７）」、「ＳＰＬ　ＲＴ４（Ｎ）－ＧＦＰ１－１０（配列番号：３８）」、「ＳＰＬ　ＲＴ５（Ｎ）－ＧＦＰ１－１０（配列番号：３９）」、「ＳＰＬ　ＲＴ＋Ｎ（Ｎ）－ＧＦＰ１－１０（配列番号：４０）」、「ＳＰＬ　ＲＴ＋Ｃ（Ｎ）－ＧＦＰ１－１０（配列番号：４１）」をそれぞれ作製した。
　（Ｃ末側ベクターの作製）
　先ず、上記基本操作３．又は４．により、ＲＴａｓｅを発現するプラスミド「ＫＳ１５」又は「ＫＳ１６」をテンプレートとして、ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）又はＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　ＧＸＬ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ株式会社製）を用いてＩｎｖｅｒｓｅ－ＰＣＲを実施し、ＲＴａｓｅのうちＳｐｌｉｔ体のＣ末断片で不要な部分（ここではＮ末断片）を含まない領域を増幅させた。このときの各Ｉｎｖｅｒｓｅ－ＰＣＲに使用したプライマーの組み合わせ、並びに、それらのＴｍ値及びヌクレオチド配列を示す配列番号を下記の表３に示す。また、ＧＦＰ１１をコードするプラスミド上の領域（配列番号：４２）をテンプレートとして、上記基本操作３．又は４．により、ＧＦＰ１１をコードする領域を増幅させた。このときに使用したプライマーの組み合わせ、並びに、それらのＴｍ値及びヌクレオチド配列を示す配列番号も下記の表３に示す。プライマーは、増幅後に各断片の端で１５塩基の相同な配列ができ、ＲＴａｓｅのＣ末断片とＧＦＰ１１とが前記（ＧＧＧＧＳ）３リンカーで繋がるように設計した（図１１）。
　ＰＣＲ以降の操作は上記Ｎ末側ベクターの作製と同様にして、ＲＴａｓｅの各Ｓｐｌｉｔ体のＣ末断片とＧＦＰ１１とが（ＧＧＧＧＳ）３リンカーで繋がれた融合タンパク質（Ｃ）の発現ベクター：「ＧＦＰ１１－ＳＰＬ　ＲＴ１（Ｃ）（配列番号：５９）」、「ＧＦＰ１１－ＳＰＬ　ＲＴ２（Ｃ）（配列番号：６０）」、「ＧＦＰ１１－ＳＰＬ　ＲＴ３（Ｃ）（配列番号：６１）」、「ＧＦＰ１１－ＳＰＬ　ＲＴ４（Ｃ）（配列番号：６２）」、「ＧＦＰ１１－ＳＰＬ　ＲＴ５（Ｃ）（配列番号：６３）」、「ＧＦＰ１１－ＳＰＬ　ＲＴ＋Ｎ（Ｃ）（配列番号：６４）」、「ＧＦＰ１１－ＳＰＬ　ＲＴ＋Ｃ（Ｃ）（配列番号：６５）」をそれぞれ作製した。
　（２）細胞への導入、編集効率の検証
　上記（１）で作製した各Ｓｐｌｉｔ体の発現ベクター（融合タンパク質（Ｎ）の発現ベクター、融合タンパク質（Ｃ）の発現ベクター、又はこれらのセット）を、上記ベクターの作製３．で作製した「ＫＳ２－１＋ｎｇ＋ｐｅｇ（ｎＣａｓ９、ｎｇＲＮＡ、及びｐｅｇＲＮＡを発現するベクター）」と共に、上記細胞実験３．のＬｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、上述のＥｄｉｔＲにより編集効率を測定した。また、ポジティブコントロールとして、上記２．で作製した「ＫＳ２５＋ｎｇ」とｐｅｇＲＮＡを発現するベクターとの組み合わせ（ｓｅｐａｒａｔｅ）と、細胞に作用しないプラスミドｐｃＤＮＡ、ＧＦＰのみを発現するプラスミドｐＧＦＰも同様にして編集効率を測定した。結果を図１２に示す。
　図１２に示したように、Ｎ末端に近い位置で分割した「ＳＰＬ　ＲＴ＋Ｎ」とＣ末端に近い位置で分割した「ＳＰＬ　ＲＴ＋Ｃ」以外のＳｐｌｉｔ体では、Ｎ末断片（融合タンパク質（Ｎ））単体又はＣ末断片（融合タンパク質（Ｃ））単体では編集効率が著しく低く、各単体では逆転写活性を示さないことが確認された（図１２中の「（Ｎ）」及び「（Ｃ）」）。また、７種のうち３種のＳｐｌｉｔ体、「ＳＰＬ　ＲＴ３」、「ＳＰＬ　ＲＴ４」、「ＳＰＬ　ＲＴ５」では、Ｎ末断片とＣ末断片とを組み合わせても、編集効率は変わらず低いままであった（図１２中の「（Ｎ）＋（Ｃ）」）。他方、「ＳＰＬ　ＲＴ１」及び「ＳＰＬ　ＲＴ２」の２種のＳｐｌｉｔ体では、Ｎ末断片（融合タンパク質（Ｎ））とＣ末断片（融合タンパク質（Ｃ））とを組み合わせることで編集効率が向上した（図１２中の「（Ｎ）＋（Ｃ）」）。これらの結果より、「ＳＰＬ　ＲＴ１」及び「ＳＰＬ　ＲＴ２」では特異的に、それぞれ単独では逆転写活性を示さず、かつ、Ｎ末断片とＣ末断片とがいずれも存在した場合にのみ逆転写活性を再生できることが確認された。
　＜試験例２＞
　（１）追加のＳｐｌｉｔ体の設計
　Ｓｐｌｉｔ体として、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の第９２位のＳをＲに置換したアミノ酸配列からなるポリぺプチド（Ｓ９２Ｒ）をＲＴａｓｅとして、さらに以下の３か所の位置でそれぞれ分割したもの：
　　Ｐ１４１とＳ１４２との間で分割したもの（Ｓ９２Ｒ）：「ＳＰＬ　ＲＴ１．１」
　　Ｑ１６５とＰ１６６との間で分割したもの（Ｓ９２Ｒ）：「ＳＰＬ　ＲＴ１．２」
　　Ｒ２０５とＤ２０６との間で分割したもの（Ｓ９２Ｒ）：「ＳＰＬ　ＲＴ２．１」
についても追加で検証した。
　（Ｎ末側ベクターの作製）
　上記試験例１のＮ末側ベクターの作製と同様にして、ＲＴａｓｅのうちＳｐｌｉｔ体のＮ末断片で不要な部分（ここではＣ末断片）を含まない領域を増幅させた。このときの各Ｉｎｖｅｒｓｅ－ＰＣＲに使用したプライマーの組み合わせ、並びに、それらのＴｍ値及びヌクレオチド配列を示す配列番号を下記の表４に示す。また同様にして、ＧＦＰ１－１０をコードする領域を増幅させた。このときに使用したプライマーの組み合わせ、並びに、それらのＴｍ値及びヌクレオチド配列を示す配列番号も下記の表４に示す。プライマーは、増幅後に各断片の端で１５塩基の相同な配列ができ、ＲＴａｓｅのＮ末断片とＧＦＰ１－１０とが前記ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧリンカーで繋がるように設計した（図１０）。
　さらに、ＰＣＲ以降も上記試験例１のＮ末側ベクターの作製と同様にして、ＲＴａｓｅの各Ｓｐｌｉｔ体のＮ末断片とＧＦＰ１－１０とがＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧリンカーで繋がれた融合タンパク質（Ｎ）の発現ベクター：「ＳＰＬ　ＲＴ１．１（Ｎ）－ＧＦＰ１－１０（配列番号：７４）」、「ＳＰＬ　ＲＴ１．２（Ｎ）－ＧＦＰ１－１０（配列番号：７５）」、「ＳＰＬ　ＲＴ２．１（Ｎ）－ＧＦＰ１－１０（配列番号：７６）」をそれぞれ作製した。
　（Ｃ末側ベクターの作製）
　上記試験例１のＣ末側ベクターの作製と同様にして、ＲＴａｓｅのうちＳｐｌｉｔ体のＣ末断片で不要な部分（ここではＮ末断片）を含まない領域を増幅させた。このときの各Ｉｎｖｅｒｓｅ－ＰＣＲに使用したプライマーの組み合わせ、並びに、それらのＴｍ値及びヌクレオチド配列を示す配列番号を下記の表５に示す。また同様にして、ＧＦＰ１１をコードする領域を増幅させた。このときに使用したプライマーの組み合わせ、並びに、それらのＴｍ値及びヌクレオチド配列を示す配列番号も下記の表５に示す。プライマーは、増幅後に各断片の端で１５塩基の相同な配列ができ、ＲＴａｓｅのＣ末断片とＧＦＰ１１とが前記（ＧＧＧＧＳ）３リンカーで繋がるように設計した（図１１）。
　さらに、ＰＣＲ以降も上記試験例１のＣ末側ベクターの作製と同様にして、ＲＴａｓｅの各Ｓｐｌｉｔ体のＣ末断片とＧＦＰ１１とが（ＧＧＧＧＳ）３リンカーで繋がれた融合タンパク質（Ｃ）の発現ベクター：「ＧＦＰ１１－ＳＰＬ　ＲＴ１．１（Ｃ）（配列番号：８５）」、「ＧＦＰ１１－ＳＰＬ　ＲＴ１．２（Ｃ）（配列番号：８６）」、「ＧＦＰ１１－ＳＰＬ　ＲＴ２．１（Ｃ）（配列番号：８７）」をそれぞれ作製した。
　（２）細胞への導入
　上記（１）で作製した各Ｓｐｌｉｔ体の発現ベクター（融合タンパク質（Ｎ）の発現ベクター、融合タンパク質（Ｃ）の発現ベクター、又はこれらのセット）を、上記ベクターの作製３．で作製した「ＫＳ２－１＋ｎｇ＋ｐｅｇ（ｎＣａｓ９、ｎｇＲＮＡ、及びｐｅｇＲＮＡを発現するベクター）」と共に、上記細胞実験３．のＬｉｐｏｆｅｃｔｉｏｎによってＨＥＫ２９３Ｔ細胞に導入し、上述のＥｄｉｔＲにより編集効率を測定した。また、ポジティブコントロールとして、上記２．で作製した「ＫＳ２５＋ｎｇ」とｐｅｇＲＮＡを発現するベクターとの組み合わせ（ｓｅｐａｒａｔｅ）と、細胞に作用しないプラスミドｐｃＤＮＡ、ＧＦＰのみを発現するプラスミドｐＧＦＰも同様にして編集効率を測定した。結果を図１３に示す。
　図１３に示したように、追加で作製したＳｐｌｉｔ体ではいずれも、Ｎ末断片（融合タンパク質（Ｎ））単体又はＣ末断片（融合タンパク質（Ｃ））単体では編集効率が著しく低く（図１３中の「（Ｎ）」及び「（Ｃ）」）、また、Ｎ末断片とＣ末断片とを組み合わせてもその編集効率は向上しなかった（図１３中の「（Ｎ）＋（Ｃ）」）。よって、やはり「ＳＰＬ　ＲＴ１」及び「ＳＰＬ　ＲＴ２」で特異的に、Ｎ末断片とＣ末断片とがいずれも存在した場合にのみ逆転写活性を再生することが確認された。
　以上説明したように、本発明によれば、構成断片が全て存在した場合にのみ活性を示す新規の分割型の逆転写酵素、及びそれを含むＤＮＡ編集システム、並びに、これらを用いて標的ＤＮＡを編集する方法及び標的ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法を提供することが可能となる。かかる逆転写酵素は、プライム編集に用いるための逆転写酵素として有用であって、該プライム編集の特異性を向上させることが可能である。

Claims (5)

  1. 　逆転写酵素が２分割されたＮ末断片とＣ末断片とを含む分割型の逆転写酵素であり、
    　前記Ｎ末断片及びＣ末断片が、下記（ａ）～（ｃ）：
    （ａ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列を含むポリペプチドが、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の第１１４～１３３位の領域内のいずれか１箇所又は第１６７～１８６位の領域内のいずれか１箇所で分割されてなるＮ末断片及びＣ末断片、
    （ｂ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び／又は付加されたアミノ酸配列を含むポリペプチドが、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の第１１４～１３３位に対応する領域内のいずれか１箇所又は第１６７～１８６位に対応する領域内のいずれか１箇所で分割されてなるＮ末断片及びＣ末断片、
    （ｃ）配列番号：１に記載のアミノ酸配列と９０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが、配列番号：１に記載のアミノ酸配列の第１１４～１３３位に対応する領域内のいずれか１箇所又は第１６７～１８６位に対応する領域内のいずれか１箇所で分割されてなるＮ末断片及びＣ末断片、
    からなる群から選択される少なくとも１種であり、
    　前記Ｎ末断片と前記Ｃ末断片とが存在することにより逆転写酵素活性が再生する、
    逆転写酵素。
  2. 　下記（Ａ）～（Ｃ）：
    （Ａ）請求項１に記載の逆転写酵素、前記逆転写酵素の発現ベクター、及び前記逆転写酵素をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種、
    （Ｂ）ヌクレアーゼ活性を有するＣａｓタンパク質（Ｃａｓ）及びヌクレアーゼ活性が一部欠損したニッカーゼ型のＣａｓタンパク質（ｎＣａｓ）からなる群から選択される少なくとも１種のＣａｓタンパク質、前記Ｃａｓタンパク質の発現ベクター、並びに、前記Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種、
    （Ｃ）前記Ｃａｓタンパク質のプライム編集ガイドＲＮＡ（ｐｅｇＲＮＡ）、前記ｐｅｇＲＮＡの発現ベクター、及び前記ｐｅｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種、
    を含む、ＤＮＡ編集システム。
  3. 　（Ｄ）前記Ｃａｓタンパク質のニッキングガイドＲＮＡ（ｎｇＲＮＡ）であって、前記ｐｅｇＲＮＡが結合するｐｅｇＲＮＡ認識配列とは別の配列であるｎｇＲＮＡ認識配列に結合するｎｇＲＮＡ、前記ｎｇＲＮＡの発現ベクター、及び前記ｎｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドからなる群から選択される少なくとも１種、
    をさらに含む、請求項２に記載のＤＮＡ編集システム。
  4. 　標的ＤＮＡを編集する方法であり、
    　請求項２又は３に記載のＤＮＡ編集システムを標的ＤＮＡに接触させ、前記標的ＤＮＡの標的部位を編集する工程を含み、
    　前記ｐｅｇＲＮＡが、５’側から順に、スペーサー配列、テンプレート配列、及びプライマー結合配列を含み、前記スペーサー配列が、前記標的部位の相補配列を含むｐｅｇＲＮＡ認識配列に結合する配列であり、前記テンプレート配列が、前記逆転写酵素の鋳型となる配列であり、前記プライマー結合配列が、前記標的部位の５’側のプライマー配列に結合する配列である、方法。
  5. 　標的ＤＮＡが編集された細胞を製造する方法であり、
    　請求項２又は３に記載のＤＮＡ編集システムを細胞内に導入して標的ＤＮＡに接触させ、前記標的ＤＮＡの標的部位を編集する工程を含み、
    　前記ｐｅｇＲＮＡが、５’側から順に、スペーサー配列、テンプレート配列、及びプライマー結合配列を含み、前記スペーサー配列が、前記標的部位の相補配列を含むｐｅｇＲＮＡ認識配列に結合する配列であり、前記テンプレート配列が、前記逆転写酵素の鋳型となる配列であり、前記プライマー結合配列が、前記標的部位の５’側のプライマー配列に結合する配列である、方法。
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