WO2025216261A1 - 薬物を内包する微小カプセル - Google Patents

薬物を内包する微小カプセル

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WO2025216261A1
WO2025216261A1 PCT/JP2025/014157 JP2025014157W WO2025216261A1 WO 2025216261 A1 WO2025216261 A1 WO 2025216261A1 JP 2025014157 W JP2025014157 W JP 2025014157W WO 2025216261 A1 WO2025216261 A1 WO 2025216261A1
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WO
WIPO (PCT)
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solution
polymer
present disclosure
plga
added
Prior art date
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Pending
Application number
PCT/JP2025/014157
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English (en)
French (fr)
Inventor
博樹 上岡
明治 礒脇
徹 荒金
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Senju Pharmaceutical Co Ltd
Toray Industries Inc
Original Assignee
Senju Pharmaceutical Co Ltd
Toray Industries Inc
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Filing date
Publication date
Application filed by Senju Pharmaceutical Co Ltd, Toray Industries Inc filed Critical Senju Pharmaceutical Co Ltd
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Pending legal-status Critical Current

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    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
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    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
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    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials

Definitions

  • the present disclosure relates to microcapsules containing drugs, and compositions containing the microcapsules.
  • polymeric drugs such as peptide drugs, protein drugs, and nucleic acid drugs
  • polymeric drugs are generally less stable than conventional small molecule drugs. For this reason, technologies for stable formulation of polymeric drugs have been investigated.
  • Patent Document 1 attempts to improve the stability of antibody molecules by using dried antibody molecule-loaded polymeric microspheres that contain antibody molecules, a polymer, and cyclodextrin, and optionally further contain a buffer and/or a surfactant.
  • the polymers represented by this name include polymers with a wide variety of structures depending on the polymerization method, molecular weight, etc.
  • properties such as stability can vary greatly depending on the amino acid sequence, etc.
  • the inventors therefore aimed to provide a polymer-containing formulation that provides excellent stability for at least one drug, particularly one selected from the group consisting of cetuximab, bevacizumab, faricimab, ranibizumab, and brolucizumab.
  • Item 1 A microcapsule containing a drug, a polymer having a chemical structure in which a branched polyalkylene glycol having 3 to 10 terminal hydroxy groups per molecule and a polyhydroxyalkanoic acid are bonded together; and a drug, wherein the number of polyhydroxyalkanoic acid monomer units per polyhydroxyalkanoic acid chain in the polymer is 50 to 230; and The microcapsules, wherein the drug is at least one selected from the group consisting of bevacizumab, faricimab, ranibizumab, and brolucizumab.
  • Item 2. Item 2.
  • Item 3. Item 3.
  • Item 4. Item 4.
  • Item 6. Item 6.
  • the ratio of the number of moles of lactic acid contained in the lactic acid-glycolic acid copolymer to 1 mole of glycolic acid contained in the lactic acid-glycolic acid copolymer is 2 to 8.
  • Microcapsules according to any one of items 1 to 7. Item 9. Item 9. The microcapsules according to any one of Items 1 to 8, wherein the number average molecular weight of the polymer is 30,000 to 70,000.
  • Item 10. The microcapsules according to any one of Items 1 to 9, wherein the drug is ranibizumab.
  • Item 11. Item 11.
  • a composition comprising the microcapsules according to any one of Items 1 to 10.
  • the composition according to Item 11, which is a sustained release pharmaceutical composition. Item 13.
  • the technology disclosed herein can provide a formulation containing at least one drug selected from the group consisting of cetuximab, bevacizumab, faricimab, ranibizumab, and brolucizumab, which has excellent drug stability.
  • the formulation can also have excellent sustained drug release properties.
  • the present disclosure preferably encompasses, but is not limited to, microcapsules containing drugs and compositions containing said microcapsules, and the present disclosure encompasses everything disclosed herein and recognizable by a person skilled in the art.
  • microcapsules encompassed by the present disclosure encapsulate a drug, and the microcapsules comprise a polymer having a chemical structure in which a branched polyalkylene glycol having 3 to 10 terminal hydroxy groups per molecule is bonded to a polyhydroxyalkanoic acid, the number of polyhydroxyalkanoic acid monomer units per polyhydroxyalkanoic acid chain in the polymer is 50 to 230, and the drug is at least one selected from the group consisting of cetuximab, bevacizumab, faricimab, ranibizumab, and brolucizumab.
  • the microcapsules encompassed by the present disclosure may be referred to as "microcapsules of the present disclosure.”
  • the microcapsules of the present disclosure comprise a polymer having a chemical structure in which a branched polyalkylene glycol having 3 to 10 terminal hydroxy groups per molecule is bonded to a polyhydroxyalkanoic acid, and in the polymer, the number of polyhydroxyalkanoic acid monomer units per polyhydroxyalkanoic acid chain is 50 to 230.
  • This polymer may be referred to as the "polymer of the present disclosure.”
  • the polymer of the present disclosure is described in detail below.
  • the branched polyalkylene glycol constituting the polymer of the present disclosure has a structure in which polyalkylene glycol is ether-bonded to at least some of the hydroxy groups of a polyhydric alcohol.
  • the branched polyalkylene glycol preferably has a structure in which polyalkylene glycol is ether-bonded to all of the hydroxy groups of the polyhydric alcohol.
  • the branched polyalkylene glycol more preferably has a structure in which linear polyalkylene glycol is ether-bonded to all of the hydroxy groups of the polyhydric alcohol.
  • the number of hydroxy groups possessed by the polyhydric alcohol may be, for example, 3 to 20.
  • the upper or lower limit of this range may be 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20.
  • the number of hydroxy groups possessed by the polyhydric alcohol is preferably 2 to 15, more preferably 3 to 10, even more preferably 4 to 8, and particularly preferably 4 or 8.
  • polyhydric alcohol examples include glycerin, polyglycerin, and pentaerythritol; as well as sugars such as glucose, fructose, xylose, galactose, mannose, erythrose, arabinose, sucrose, maltose, lactose, trehalose, and cellobiose.
  • sugars such as glucose, fructose, xylose, galactose, mannose, erythrose, arabinose, sucrose, maltose, lactose, trehalose, and cellobiose.
  • polyglycerin examples include dimers to hexamers of glycerin.
  • the upper or lower limit of the range may be 2, 3, 4, 5, or 6.
  • the polyhydric alcohol may have a structure in which two or more of the above polyhydric alcohols are polymerized, such as dipentaerythritol.
  • the branched polyalkylene glycol has 3 to 10 branches per molecule.
  • the upper or lower limit of this range may be 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, or 10.
  • the number of branches in the branched polyalkylene glycol can be expressed in other words as the number of terminal hydroxy groups possessed by the branched polyalkylene glycol. That is, for example, a 4-branched polyalkylene glycol has 4 terminal hydroxy groups per molecule.
  • the branched polyalkylene glycol preferably has 4 to 8 terminal hydroxy groups per molecule, and particularly preferably has 4 or 8 terminal hydroxy groups per molecule.
  • branched polyethylene glycol is preferred as the branched polyalkylene glycol that constitutes the polymer of the present disclosure.
  • the number-average molecular weight of the branched polyalkylene glycol that constitutes the polymer of the present disclosure is not particularly limited as long as the effects of the present disclosure are achieved, and may be, for example, 3,000 to 50,000. From the perspective of being able to stably retain a drug within the microcapsules of the present disclosure and being able to impart excellent sustained drug release properties to the microcapsules of the present disclosure, the number-average molecular weight of the branched polyalkylene glycol that constitutes the polymer of the present disclosure is preferably 3,000 to 30,000, more preferably 5,000 to 20,000, even more preferably 7,000 to 15,000, and particularly preferably 8,000 to 13,000.
  • a preferred embodiment of the branched polyalkylene glycol that constitutes the polymer of the present disclosure is a 4- or 8-branched polyethylene glycol that has a chemical structure in which a linear polyethylene glycol is bonded to a polyhydric alcohol and has a number average molecular weight in the polymer of 5,000 to 20,000.
  • a more preferred embodiment of the branched polyalkylene glycol that constitutes the polymer of the present disclosure is a 4- or 8-branched polyethylene glycol that has a chemical structure in which a linear polyethylene glycol is bonded to a polyhydric alcohol and has a number average molecular weight of 7,000 to 15,000.
  • Branched polyalkylene glycols can be produced by known chemical synthesis methods, and are also commercially available. Examples of commercially available products include NOF Corporation's "SUNBRIGHT (registered trademark) PTE” series and “SUNBRIGHT (registered trademark) HGEO” series.
  • the "SUNBRIGHT (registered trademark) PTE” series is a four-branched polyethylene glycol in which a linear polyethylene glycol chain is bonded to each of the four hydroxyl groups of pentaerythritol.
  • HGEO is an eight-branched polyethylene glycol in which a linear polyethylene glycol chain is bonded to each of the eight hydroxyl groups of polyglycerin, a tetramer of glycerin.
  • the polyhydroxyalkanoic acid constituting the polymer of the present disclosure may be a single polymer (i.e., a homopolymer) composed of only one type of monomer, or a copolymer (i.e., a copolymer) composed of two or more types of monomers.
  • a copolymer i.e., a copolymer
  • the polyhydroxyalkanoic acid is a copolymer, it may be either a random copolymer or a block copolymer.
  • monomers that constitute the polyhydroxyalkanoic acid include lactic acid, glycolic acid, 6-hydroxycaproic acid, 3-hydroxybutyric acid, 3-hydroxyvaleric acid, and malic acid.
  • raw material monomers used to produce polyhydroxyalkanoic acid include ⁇ -caprolactone.
  • the monomers that constitute the polyhydroxyalkanoic acid may be either L- or D-isomers, and the polymer of the present disclosure may contain a mixture of D- and L-isomers. From the perspective of imparting excellent mechanical strength to the polymer of the present disclosure, it is preferable that the monomers that constitute the polyhydroxyalkanoic acid consist exclusively of D- or L-isomers.
  • the polyhydroxyalkanoic acid is preferably a homopolymer of a monomer selected from the group consisting of lactic acid, glycolic acid, and 6-hydroxycaproic acid, or a copolymer containing two or more of the above monomers.
  • the polyhydroxyalkanoic acid is more preferably a copolymer of lactic acid and glycolic acid (i.e., a lactic acid-glycolic acid copolymer), and particularly preferably a random copolymer of lactic acid and glycolic acid.
  • the ratio of the number of moles of lactic acid contained in the lactic acid/glycolic acid copolymer to 1 mole of glycolic acid contained in the lactic acid/glycolic acid copolymer may be, for example, 1 to 10.
  • the upper or lower limit of the range may be 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, or 10.
  • the ratio of the number of moles of lactic acid contained in the lactic acid/glycolic acid copolymer to 1 mole of glycolic acid contained in the lactic acid/glycolic acid copolymer is preferably 2 to 8, more preferably 3 to 6, and particularly preferably 3 to 5.
  • the biodegradation rate is fastest when the ratio of the number of moles of lactic acid contained in the lactic acid-glycolic acid copolymer to 1 mole of glycolic acid contained in the lactic acid-glycolic acid copolymer is 1, and the degradation rate decreases as the composition ratio of lactic acid increases.
  • the number-average molecular weight of the polyhydroxyalkanoic acid constituting the polymer of the present disclosure is not particularly limited as long as the effects of the present disclosure are achieved, and may be, for example, 8,000 to 80,000. From the perspective of being able to stably retain drugs within the microcapsules of the present disclosure and being able to impart excellent sustained drug release properties to the microcapsules of the present disclosure, the number-average molecular weight of the polyhydroxyalkanoic acid constituting the polymer of the present disclosure is preferably 10,000 to 65,000, more preferably 10,000 to 60,000, even more preferably 15,000 to 55,000, and particularly preferably 20,000 to 50,000.
  • a preferred embodiment of the polyhydroxyalkanoic acid that constitutes the polymer of the present disclosure is a lactic acid/glycolic acid copolymer having a number average molecular weight of 10,000 to 65,000, in which the ratio of the number of moles of lactic acid contained in the lactic acid/glycolic acid copolymer to 1 mole of glycolic acid contained in the lactic acid/glycolic acid copolymer is 2 to 8.
  • a particularly preferred embodiment of the polyhydroxyalkanoic acid that constitutes the polymer of the present disclosure is a lactic acid/glycolic acid copolymer having a number average molecular weight of 15,000 to 55,000, in which the ratio of the number of moles of lactic acid contained in the lactic acid/glycolic acid copolymer to 1 mole of glycolic acid contained in the lactic acid/glycolic acid copolymer is 3 to 6.
  • the polymer of the present disclosure has a chemical structure in which a branched polyalkylene glycol having 3 to 10 terminal hydroxy groups per molecule is bonded to a polyhydroxyalkanoic acid. More specifically, the polymer has a chemical structure in which the hydroxy group of the branched polyalkylene glycol and the carboxy group of the polyhydroxyalkanoic acid are ester-bonded. Furthermore, in the polymer of the present disclosure, the number of polyhydroxyalkanoic acid monomer units per polyhydroxyalkanoic acid chain is 35 to 233, and preferably 50 to 230.
  • the term "number of polyhydroxyalkanoic acid monomer units per polyhydroxyalkanoic acid chain” refers to the value obtained by dividing the number average of all polyhydroxyalkanoic acid monomer units contained in the polymer by the number of terminal hydroxy groups of the branched polyalkylene glycol.
  • the number of polyhydroxyalkanoic acid monomer units per polyhydroxyalkanoic acid chain is 35 to 233, preferably 50 to 230.
  • the upper or lower limit of the range may be 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, or 230.
  • the number of polyhydroxyalkanoic acid monomer units per polyhydroxyalkanoic acid chain in the polymer of the present disclosure is preferably 70 to 220, more preferably 80 to 210, even more preferably 90 to 205, and particularly preferably 100 to 200.
  • the ratio of the number average molecular weight of the branched polyalkylene glycol in the polymer of the present disclosure to the number average molecular weight of the polyhydroxyalkanoic acid in the polymer is not particularly limited as long as the effects of the present disclosure are achieved, and may be, for example, 1:0.5 to 1:10.
  • the upper or lower limit of the range may be 1:0.5, 1:1, 1:1.5, 1:2, 1:2.5, 1:3, 1:3.5, 1:4, 1:4.5, 1:5, 1:5.5, 1:6, 1:6.5, 1:7, 1:7.5, 1:8, 1:8.5, 1:9, 1:9.5, or 1:10.
  • the ratio of the number average molecular weight of the branched polyalkylene glycol in the polymer of the present disclosure to the number average molecular weight of the polyhydroxyalkanoic acid in the polymer is preferably 1:1 to 1:8, more preferably 1:1 to 1:6.5, even more preferably 1:1.5 to 1:6, and particularly preferably 1:1.5 to 1:5.5.
  • the number average molecular weight of the polymer of the present disclosure is not particularly limited as long as the effects of the present disclosure are achieved, and may be, for example, 20,000 to 100,000. From the perspective of being able to stably retain drugs within the microcapsules of the present disclosure and being able to impart excellent sustained drug release properties to the microcapsules of the present disclosure, the number average molecular weight of the polymer of the present disclosure is preferably 20,000 to 80,000, more preferably 30,000 to 70,000, even more preferably 35,000 to 65,000, and particularly preferably 40,000 to 60,000.
  • the number of polyhydroxyalkanoic acid monomer units per polyhydroxyalkanoic acid chain in the polymer of the present disclosure can be measured by known methods, such as a method using 1H NMR or a method in which the molecular weight is calculated as polystyrene or polymethyl methacrylate (PMMA) measured by gel permeation chromatography (GPC).
  • known methods such as a method using 1H NMR or a method in which the molecular weight is calculated as polystyrene or polymethyl methacrylate (PMMA) measured by gel permeation chromatography (GPC).
  • a general method for analyzing polymers using 1 H NMR is detailed below: First, the peak area per proton is calculated from the 1H NMR chart of the polymer. The peak area per proton is calculated by dividing the sum of the areas of the peaks derived from the protons of a certain substituent by the number of protons contained in the group.
  • the group selected is one whose amount present in one molecule of the monomer is known in advance;
  • the number of other monomer units is calculated by dividing the sum of the areas of the peaks derived from the protons of the monomer units by the number of protons contained in the monomer units, and then dividing the sum by the peak area per proton calculated above;
  • the number average molecular weight of the entire polymer and the number average molecular weight of each repeating portion can be calculated, since the molecular weights of the monomers constituting the polymer and the portions other than the repeating portion are known.
  • a general method for analyzing polymers using GPC is described in detail below: First, the polymer is dissolved in a solvent such as chloroform and filtered to obtain a sample solution. Using a high-performance liquid chromatograph equipped with a GPC column, the sample solution is injected, separated using a column adjusted to a constant temperature, and detected using a differential refractometer. The number-average molecular weight can be measured using a data analysis workstation or the like, and can be calculated using a calibration curve obtained from the relationship between the molecular weight of standard polystyrene or polymethyl methacrylate and the column elution time.
  • polymers disclosed herein can also be analyzed in accordance with the general analytical methods described above, or by methods that can be easily derived by a person skilled in the art from the general methods described above.
  • a preferred embodiment of the polymer of the present disclosure is a polymer having a chemical structure in which 4- or 8-branched polyethylene glycol and a lactic acid/glycolic acid copolymer are bonded, and in which the number of polyhydroxyalkanoic acid monomer units per polyhydroxyalkanoic acid chain in the polymer is 50 to 230.
  • the number of polyhydroxyalkanoic acid monomer units per polyhydroxyalkanoic acid chain is preferably 70 to 220, more preferably 80 to 210, even more preferably 90 to 205, and particularly preferably 100 to 200; furthermore, in the polymer, the number average molecular weight of the polyethylene glycol in the polymer is preferably 3,000 to 30,000, more preferably 5,000 to 20,000, even more preferably 7,000 to 15,000, and particularly preferably 8,000 to 13,000; and furthermore, In this polymer, the number average molecular weight of the lactic acid/glycolic acid copolymer in the polymer is preferably 20,000 to 70,000, more preferably 20,000 to 60,000, even more preferably 25,000 to 55,000, and particularly preferably 30,000 to 50,000; furthermore, in this polymer, the ratio of the number of moles of lactic acid contained in the lactic acid/glycolic acid copolymer to 1 mole of glycolic acid contained in the lactic acid/glycolic acid copoly
  • a preferred embodiment of the polymer of the present disclosure is a polymer represented by the following formula (I):
  • the polymer has a chemical structure in which a 4-branched polyethylene glycol and a lactic acid/glycolic acid copolymer are bonded together.
  • k, m, n, and p are each independently a natural number from 16 to 170, preferably from 28 to 110, more preferably from 39 to 84, and even more preferably from 45 to 73.
  • the molecular weight of the 4-branched polyethylene glycol constituting the polymer is 30,000, the average of k, m, n, and p is approximately 170.
  • This value is calculated using the formula [(30,000-132)/44]/4 (30,000: molecular weight of 4-branched polyethylene glycol, 132: molecular weight of branched moiety C(CH 2 O) 4 , 44: molecular weight of CH 2 CH 2 O, 4: number of branches).
  • the molecular weight of the 4-branched polyethylene glycol constituting the polymer is 3,000, the average of k, m, n, and p is approximately 16, and when the molecular weight of the 4-branched polyethylene glycol constituting the polymer is 10,000, the average of k, m, n, and p is approximately 56.
  • X 1 , X 2 , X 3 , and X 4 are each independently a group represented by the following formula (II).
  • s is a natural number from 19 to 193, preferably from 25 to 189, and more preferably from 27 to 184.
  • t is a natural number from 3 to 115, preferably from 4 to 74, and more preferably from 5 to 55.
  • s in each of X 1 , X 2 , X 3 , and X 4 may be the same or different from each other.
  • t in each of X 1 , X 2 , X 3 , and X 4 may be the same or different from each other.
  • brackets [ ]: brackets
  • brackets means that the monomer units enclosed in parentheses (() : parentheses) are randomly polymerized (the same applies hereinafter in this specification).
  • formula (II) is more preferably the following formula (III):
  • v is a natural number from 9 to 97, preferably from 12 to 95, and more preferably from 13 to 92.
  • w is a natural number from 1 to 58, preferably from 2 to 37, and more preferably from 2 to 28.
  • the number of polyhydroxyalkanoic acid monomer units per polyhydroxyalkanoic acid chain is expressed as the number-average value of s + t for each chain. Therefore, in the technology disclosed herein, s + t is 35 to 233, and preferably 50 to 230. For example, if the number of polyhydroxyalkanoic acid units in the structure of the above polymer is 50, the number-average value of s + t for each polyhydroxyalkanoic acid chain is 50.
  • a preferred embodiment of the polymer of the present disclosure is a polymer represented by the following formula (IV):
  • the polymer has a chemical structure in which an eight-branched polyethylene glycol and a lactic acid/glycolic acid copolymer are bonded together.
  • k, m, n, p, and q are each, and independently of one another in each repetition, a natural number from 7 to 84, preferably from 10 to 56, more preferably from 12 to 41, and even more preferably from 13 to 36.
  • r is a natural number from 1 to 6.
  • the upper or lower limit of the range may be 1, 2, 3, 4, 5, or 6.
  • X 1 , X 2 , X 3 , X 4 and X 5 are each, and independently of one another in each repetition, a group represented by the following formula (II).
  • s is a natural number of 10 to 96, preferably 12 to 95, and more preferably 14 to 92.
  • t is a natural number of 2 to 58, preferably 2 to 37, and more preferably 3 to 27.
  • s in X1 , X2 , X3 , X4 , and X5 may be the same or different from each other.
  • t in X1 , X2 , X3 , X4 , and X5 may be the same or different from each other.
  • formula (II) is more preferably the following formula (III):
  • v is a natural number of 5 to 48, preferably 6 to 48, and more preferably 7 to 46.
  • w is a natural number of 1 to 29, preferably 1 to 19, and more preferably 1 to 14.
  • the linking of polyalkylene glycol and polyhydroxyalkanoic acid can be carried out by a conventionally known method or a method easily conceivable from a conventionally known method. Examples include a method of polymerizing hydroxyalkanoic acid starting from the terminal hydroxy group of a polyalkylene glycol chain, and a method of linking polyalkylene glycol and polyhydroxyalkanoic acid by a condensation reaction.
  • the polymer of the present disclosure can be obtained by, for example, ring-opening polymerization of a cyclic ester intermediate of hydroxyalkanoic acid, such as lactide, in the presence of polyalkylene glycol using a catalyst such as tin octoate under reduced pressure.
  • a catalyst such as tin octoate under reduced pressure.
  • methods for removing moisture and low-molecular-weight compounds from the reaction system by adjusting the conditions for heating and refluxing in an organic solvent used for the polymerization reaction, as well as methods for suppressing depolymerization by deactivating the catalyst after the polymerization reaction is complete.
  • the unreacted cyclic ester intermediate can be sublimated and removed by heat-treating the resulting polymer under reduced pressure.
  • the polymer of the present disclosure can be prepared, for example, according to the method described in International Publication No. 2018/062464 (Patent Document 2), or by appropriately modifying the method described in Patent Document 2.
  • the polymer of the present disclosure can stably retain a drug within the microcapsules of the present disclosure and can also impart excellent sustained drug release properties to the microcapsules of the present disclosure.
  • Drug stability and sustained drug release properties can be evaluated by conventionally known methods or methods that can be easily derived from conventionally known methods. For example, when the drug is a protein, the total protein amount in a composition containing microcapsules can be quantified by the BCA method, Bradford method, Lowry method, or the like, and the active protein amount in the composition can be quantified by the ELISA method or the like, and the activity retention rate (%) can be calculated using the formula [active protein amount/total protein amount] x 100. Furthermore, sustained drug release properties can be evaluated, for example, by mixing a composition containing microcapsules with a release test solution and quantifying the amount of drug released into the release test solution over time.
  • microcapsules of the Present Disclosure B-1 are examples of particles having an average particle size in the nanometer to micrometer range.
  • the average particle size of the microcapsules of the present disclosure is not particularly limited, and may be, for example, about 10 nm to 1000 ⁇ m, about 50 nm to 100 ⁇ m, about 100 nm to 50 ⁇ m, or about 1 ⁇ m to 10 ⁇ m.
  • the average particle size refers to the average of the maximum diameters of individual particles.
  • the average particle size can be measured by laser diffraction scattering, dynamic light scattering, image analysis using a scanning electron microscope (SEM), sieving tests, or the like.
  • the average particle size refers to the volume-based average particle size measured by laser diffraction scattering.
  • the average particle size of the microcapsules can be adjusted by conventionally known methods or methods that a person skilled in the art can easily devise from conventionally known methods.
  • the average particle size of the microcapsules can be adjusted by changing the pore size of the emulsifying membrane used when preparing the W/O emulsion or W/O/W emulsion.
  • the average particle size of the microcapsules can be adjusted by changing the stirring speed of the stirrer used when preparing the W/O emulsion or W/O/W emulsion.
  • one preferred embodiment of the method for producing microcapsules of the present disclosure involves preparing an oil phase solution containing the polymer of the present disclosure and an aqueous phase solution containing the drug, and then mixing the two to prepare a W/O emulsion.
  • the individual emulsified particles contained in the W/O emulsion are preferably included in the microcapsules of the present disclosure.
  • the volatile components in the internal and external phases of the emulsified particles volatilize, yielding a dried product containing capsule-like structures encapsulating the drug.
  • the capsule-like structures in the dried product are also preferably included in the microcapsules of the present disclosure.
  • the polymer of the present disclosure is contained in a membrane, and the drug is encapsulated in the space surrounded by the membrane.
  • the “membrane” refers to the part that separates the internal and external phases of each emulsified particle in the W/O emulsion.
  • the drug encapsulated in the microcapsules of the present disclosure is at least one selected from the group consisting of cetuximab, bevacizumab, faricimab, ranibizumab, and brolucizumab.
  • Cetuximab is an anti-EGFR antibody
  • bevacizumab is an anti-VEGF antibody
  • faricimab is a bispecific antibody of anti-VEGF and anti-Ang-2
  • brolucizumab is known to function as a single-chain fragment of an anti-VEGF antibody.
  • Ranibizumab is a Fab fragment of an anti-VEGF antibody.
  • the drugs mentioned above there are some that can easily decompose, denature, or change in quality, and lose their physiological activity. According to the technology of the present disclosure, even such drugs can maintain their activity in the formulation. Whether or not a drug maintains its activity can be evaluated using conventionally known methods or methods that can be easily derived from conventionally known methods. For example, if the drug is a protein, the total protein amount in the formulation can be quantified using the BCA method, Bradford method, Lowry method, or the like, and the active protein amount in the formulation can be quantified using the ELISA method, or the like, and the activity retention rate (%) can be calculated using the formula [active protein amount/total protein amount] x 100.
  • microcapsules of the present disclosure can be produced by a conventionally known method or a method that can be easily derived from a conventionally known method. Specific examples include emulsion solvent evaporation, phase separation, phase transition, and polymer spherical crystallization (including spherical granulation (SA) and emulsion solvent diffusion (ESD)). The solvent used can be appropriately selected depending on the method.
  • SA spherical granulation
  • ESD emulsion solvent diffusion
  • an oil phase solution containing the polymer of the present disclosure and an aqueous phase solution containing the drug may be prepared, and then the two may be mixed to prepare a W/O emulsion.
  • Mixing may be performed using a magnetic stirrer, propeller-type agitator, turbine-type agitator, disperser mixer, homomixer, ultrasonic irradiator, homogenizer, or membrane emulsification device equipped with a porous membrane.
  • the W/O emulsion may also be dried to volatilize the volatile components in the internal and external phases, resulting in a dried product.
  • the oil phase solution preferably contains a water-immiscible organic solvent.
  • water-immiscible organic solvent refers to an organic solvent having a solubility in water of 30 g (water-immiscible organic solvent)/100 mL (water) or less.
  • the solubility in water of the water-immiscible organic solvent used in the production of the microcapsules of the present disclosure is more preferably 0.1 g (water-immiscible organic solvent)/100 mL (water) or less.
  • the water-immiscible organic solvent used in the production of the microcapsules of the present disclosure is preferably volatile, and more specifically, preferably one that can be removed by evaporation using methods such as freeze-drying or spray-drying.
  • water-immiscible organic solvents include ethyl acetate, isopropyl acetate, butyl acetate, dimethyl carbonate, diethyl carbonate, dichloromethane, and trichloromethane. Of these, dichloromethane is particularly preferred.
  • the oil phase solution and the aqueous phase solution may further contain other components.
  • they may contain pharmaceutically acceptable bases, carriers, excipients, polymers other than the polymers disclosed herein, diluents, surfactants, preservatives, pH adjusters, adjuvants, chelating agents, etc., either alone or in combination of two or more.
  • polymers other than those disclosed herein include polyalkylene glycols, polyhydroxyalkanoic acids, polyvinylpyrrolidone, polyvinyl alcohol, polyethyleneimine, polyacrylic acid, polymethacrylic acid, poly-1,3-dioxolane, 2-methacryloyloxyethyl phosphorylcholine polymer, and poly-1,3,6-trioxane, as well as polysaccharides.
  • Polymers other than those disclosed herein can be used alone or in combination of two or more.
  • Surfactants include, for example, nonionic surfactants, specifically, polyoxyalkylene alkyl ethers, polyoxyalkylene glycols, polyoxyalkylene fatty acid esters, polyoxyalkylene sorbitan fatty acid esters, polyoxyalkylene sorbit fatty acid esters, polyoxyalkylene glycerin fatty acid esters, polyoxyalkylene fatty acid amides, polyoxyalkylene glycol fatty acid esters, polyoxyalkylene castor oil derivatives, polyoxyalkylene hydrogenated castor oil derivatives other than polyoxyethylene hydrogenated castor oil, polyglycerin fatty acid esters, monoglycerin fatty acid esters, sorbitan fatty acid esters, sorbit fatty acid esters, alkylene glycol fatty acid esters, alkyl polyglycosides, sugar fatty acid esters (sucrose fatty acid esters, maltose fatty acid esters, lactose fatty acid esters, etc.
  • a preferred nonionic surfactant in the technology disclosed herein is sorbitan monooleate, a type of sorbitan fatty acid ester.
  • Other preferred examples include alkyl sulfates such as sodium lauryl sulfate, ammonium lauryl sulfate, and sodium stearyl sulfate, as well as lecithin and its derivatives.
  • Surfactants can be used alone or in combination of two or more.
  • preservatives examples include parabens such as methylparaben, ethylparaben, propylparaben, and butylparaben, sodium benzoate, phenoxyethanol, and alkyldiaminoethylglycine hydrochloride. Preservatives can be used alone or in combination of two or more.
  • pH adjusters examples include citric acid, phosphoric acid, malic acid, pyrophosphoric acid, lactic acid, tartaric acid, glycerophosphoric acid, acetic acid, nitric acid, and their chemically possible salts, as well as sodium hydroxide and potassium hydroxide.
  • compositions of the Present Disclosure The present disclosure also encompasses compositions containing the microcapsules of the present disclosure. Such compositions may be referred to as "compositions of the present disclosure.” The matters described above regarding the microcapsules of the present disclosure are incorporated by reference into the compositions of the present disclosure.
  • the compositions of the present disclosure may be the microcapsules of the present disclosure themselves, or may be microcapsules of the present disclosure mixed with other components. There are no limitations on the components that can be mixed as long as the effects of the present disclosure are achieved, and preferred examples include the components described in the section "B-3. Method for producing microcapsules of the present disclosure.”
  • a W/O emulsion containing the microcapsules of the present disclosure may be dispersed in a separate aqueous phase to form a W/O/W emulsion.
  • the dosage form of the composition of the present disclosure is not particularly limited and may be, for example, sphere, sheet, needle, rod, or coil shape. Of these dosage forms, microspheres are particularly preferred.
  • microspheres refers to a spherical composition containing a polymer and a drug and having an average particle size of approximately 1 to 100 ⁇ m. Nanoparticles, microparticles, nanospheres, and microcapsules are also preferred dosage forms of the composition of the present disclosure.
  • the composition of the present disclosure is preferably a sustained-release pharmaceutical composition.
  • the drug is encapsulated in the microcapsules of the present disclosure, allowing the drug to be stably maintained. Furthermore, in the composition of the present disclosure, the drug is encapsulated in the microcapsules of the present disclosure, allowing the composition of the present disclosure to have sustained drug release properties. Therefore, when the composition of the present disclosure is applied to a subject, the drug is gradually released from the composition of the present disclosure within the body of the subject, and it is expected that a sustained effect will be achieved.
  • compositions of the present disclosure can be applied to, for example, humans and non-human mammals (e.g., rats, mice, rabbits, cows, pigs, dogs, cats, sheep, monkeys, etc.), with humans being preferred.
  • non-human mammals e.g., rats, mice, rabbits, cows, pigs, dogs, cats, sheep, monkeys, etc.
  • composition of the present disclosure contains microcapsules encapsulating at least one drug selected from the group consisting of cetuximab, bevacizumab, faricimab, ranibizumab, and brolucizumab. These drugs, particularly anti-VEGF antibodies, are used in the treatment of age-related macular degeneration and other conditions. Therefore, the composition of the present disclosure is suitable for use in improving and treating age-related macular degeneration.
  • the terms “improving age-related macular degeneration” and “treating age-related macular degeneration” encompass the suppression of the progression of age-related macular degeneration, the halting of the progression of age-related macular degeneration, the reduction of lesions, and the elimination of lesions when administered to a subject diagnosed with age-related macular degeneration.
  • composition of the present disclosure may be administered locally, such as intravitreal, by direct injection; or may be administered intravenously, intraarterially, intraperitoneally, intramuscularly, subcutaneously, intrapleurally, etc., by injection or infusion; may be administered by perfusion via a catheter; or may be applied to the skin, mucosa, tissue, etc. It is particularly preferred that the composition of the present disclosure be administered directly into the vitreous of the subject by injection.
  • the frequency of administration of the composition of the present disclosure may be administered once or multiple times per day, once or multiple times per week, once or multiple times per month, or once or multiple times per year.
  • the administration period of the composition of the present disclosure so long as the effects of the present disclosure are achieved.
  • the dosage of the composition of the present disclosure so long as the effects of the present disclosure are achieved.
  • the frequency of application, application period, and dosage can be adjusted as appropriate by those skilled in the art depending on the condition of the subject, the course of treatment, etc.
  • composition of the present disclosure may be optionally combined with other pharmaceutical compositions and/or treatment methods, etc. that can be applied to a subject with age-related macular degeneration.
  • composition of the present disclosure may be combined with other pharmaceutical compositions and/or treatment methods, etc., they may be applied to the subject simultaneously, or may be applied separately at any time.
  • molecular weight refers to number average molecular weight.
  • PEG refers to polyethylene glycol
  • PLGA refers to lactic acid-glycolic acid copolymer.
  • LA:GA refers to the molar ratio of lactic acid monomer units to glycolic acid monomer units in lactic acid-glycolic acid copolymer.
  • Numberer of PLGA units refers to the number of PLGA units per PEG chain of the polymer.
  • Test 1 Polymer-Dependent Stability (During Manufacturing): Comparison of 4-Branch PEG-PLGA and PLGA.
  • the inventors evaluated the stability of drugs encapsulated in microspheres during manufacturing using a polymer having a chemical structure in which 4-branched polyethylene glycol and lactic acid/glycolic acid copolymer are bonded (hereinafter, sometimes referred to as "4-branched PEG-PLGA”) or lactic acid/glycolic acid copolymer (hereinafter, sometimes referred to as "PLGA”).
  • 4-branched PEG-PLGA 4-branched polyethylene glycol and lactic acid/glycolic acid copolymer are bonded
  • PLGA lactic acid/glycolic acid copolymer
  • the 4-branched PEG-PLGA used had a total molecular weight of 50 kDa, a PEG portion molecular weight of 10 kDa, a PLGA portion molecular weight of 40 kDa, and an LA:GA ratio of 8:2.
  • the number of PLGA units per PEG chain of this polymer was approximately 160.
  • This 4-branched PEG-PLGA is sometimes referred to as 4PEG(10 kDa)-PLGA(40 kDa).
  • This PLGA may be referred to as PLGA (45 kDa). Cetuximab was used as the drug to be encapsulated in the microspheres. Details of this test are described below.
  • the mixture was spray-dried (two-fluid nozzle ⁇ 1.4, N2 flow 30 mm, temperature 10-15°C) using a spray dryer (Mini Spray Dryer B-290, Nippon Buchi Co., Ltd.) to obtain white particulate cetuximab-encapsulated microspheres.
  • a MicroBCA Assay was used to measure the total amount of cetuximab. 100 ⁇ L of sample solution or calibration curve solution was added to each well of a 96-well plate, followed by 100 ⁇ L of Working Reagent prepared according to the protocol provided with the MicroBCA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). The plate was agitated for 30 seconds and then incubated at 60°C for 1 hour. After visually confirming color development, the absorbance at a wavelength of 562 nm was measured using a microplate reader (Synergy HTX multimode plate reader, BioTek Instruments, Inc.). The total amount of cetuximab calculated from the absorbance is shown in Table 1.
  • ELISA was used to measure the amount of active cetuximab.
  • 100 ⁇ L of a 100 ng/mL human EGFR solution was added to a 96-well immunoplate (MaxiSorp Nunc-ImmunoPlate, Thermo Fisher Scientific), and the plate was shaken for 1 minute on a shaker and then left to stand at 37°C for 1 hour. After standing, the liquid in the wells was discarded, and washing solution (PBS containing 0.05% Tween® 20) was added to each well to wash the wells. After washing, 200 ⁇ L of a 1% BSA solution was added to each well, and the plate was shaken at room temperature for 1 hour. After shaking, the liquid in the wells was discarded, and washing solution was added to each well to wash the wells.
  • sample solution or calibration curve solution was added to each well and shaken at room temperature for 2 hours. After shaking, the liquid in the wells was discarded, washing solution was added to each well, and the wells were washed. After washing, 100 ⁇ L of secondary antibody solution (Goat Anti-Human IgG (H+L) solution) was added and the wells were shaken at room temperature for 1 hour. After shaking, the secondary antibody solution was discarded, washing solution was added to each well, and the wells were washed. After washing, 100 ⁇ L of ABTS Microwell Peroxidase Substrate (SeraCare Life Sciences, Inc.) was added and the wells were shaken at room temperature for 15 minutes.
  • secondary antibody solution Goat Anti-Human IgG (H+L) solution
  • Example 1 As shown in Summary Table 1, in Comparative Example 1, in which PLGA was used as the polymer in preparing the microspheres, no cetuximab that maintained its activity was detected in the microspheres, and the activity retention rate was 0%. On the other hand, in Example 1, in which 4-branched PEG-PLGA was used as the polymer in preparing the microspheres, a high activity retention rate of 84.6% was obtained.
  • Study 2 Stability (at the time of manufacture) depending on the branch number of PEG-PLGA: Based on the results of Study 1, the inventors investigated whether the branch number of PEG-PLGA affects the stability of the drug encapsulated in the microspheres.
  • bevacizumab-loaded microspheres were prepared using mono-, di-, tetra-, or octa-branched PEG-PLGA as the polymer, and the stability of the encapsulated bevacizumab in each microsphere was evaluated.
  • the mono-branched PEG-PLGA used had a molecular weight of 50 kDa for the entire polymer, a molecular weight of 10 kDa for the PEG portion, a molecular weight of 40 kDa for the PLGA portion, and an LA:GA ratio of 8:2.
  • the number of PLGA units per PEG chain of this polymer was approximately 640.
  • This mono-branched PEG-PLGA is sometimes referred to as 1PEG (10 kDa)-PLGA (40 kDa).
  • the two-branched PEG-PLGA used had a molecular weight of 50 kDa for the entire polymer, a molecular weight of 10 kDa for the PEG portion, and a molecular weight of 40 kDa for the PLGA portion, with an LA:GA ratio of 8:2.
  • the number of PLGA units per PEG chain of this polymer was approximately 320.
  • This two-branched PEG-PLGA is sometimes referred to as 2PEG(10 kDa)-PLGA(40 kDa).
  • the four-branched PEG-PLGA used was the 4PEG(10 kDa)-PLGA(40 kDa) described in Test 1.
  • the eight-branched PEG-PLGA used had a molecular weight of 50 kDa for the entire polymer, a molecular weight of 10 kDa for the PEG portion, and a molecular weight of 40 kDa for the PLGA portion, with an LA:GA ratio of 8:2.
  • the number of PLGA units per PEG chain of this polymer was approximately 80.
  • This 8-branched PEG-PLGA may be referred to as 8PEG (10 kDa)-PLGA (40 kDa). Details of this test are described below.
  • Example 2 2.1.1 Microsphere Preparation : 0.025 g of Span80 and 0.25 g of 4PEG (10 kDa)-PLGA (40 kDa) were dissolved in 10 mL of dichloromethane (oil phase solution). 0.1 mL of 2.5% bevacizumab solution (Bevacizumab BS Intravenous Infusion 100 mg "Pfizer” (Pfizer Inc.) was used as is) was added to the oil phase solution, and the mixture was emulsified using a homogenizer at 20,500 rpm for 1 minute. After emulsification, the mixture was spray-dried using a spray dryer (two-fluid nozzle ⁇ 1.4, N2 flow 30 mm, temperature 10-15°C) to obtain white particulate bevacizumab-encapsulated microspheres.
  • a spray dryer two-fluid nozzle ⁇ 1.4, N2 flow 30 mm, temperature 10-15°C
  • a MicroBCA Assay was used to measure the total amount of bevacizumab. 100 ⁇ L of sample solution or calibration curve solution was added to each well of a 96-well plate, followed by 100 ⁇ L of Working Reagent prepared according to the protocol provided with the MicroBCA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). The plate was agitated for 30 seconds and then incubated at 37°C for 2 hours. After visually confirming color development, the absorbance at a wavelength of 562 nm was measured using a microplate reader. The total amount of bevacizumab calculated from the absorbance is shown in Table 2.
  • ELISA was used to measure the amount of active bevacizumab.
  • 100 ⁇ L of 100 ng/mL human VEGF-A 165 solution was added to a 96-well immunoplate, and the plate was stirred on a shaker for 1 minute and then allowed to stand at 37°C for 1 hour. After standing, the liquid in the wells was discarded, and a washing solution was added to each well to wash the wells. After washing, 200 ⁇ L of 1% BSA solution was added to each well and the plate was shaken at room temperature for 1 hour. After shaking, the liquid in the wells was discarded, and a washing solution was added to each well to wash the wells.
  • Example 2 in which 4-branched PEG-PLGA was used as the polymer in preparing the microspheres, and Example 3, in which 8-branched PEG-PLGA was used, achieved a higher activity retention rate than Comparative Example 2, in which monobranched PEG-PLGA was used, and Comparative Example 3, in which bibranched PEG-PLGA was used.
  • Test 3 Comparison of stability of different drugs (polymer used during manufacturing: 4-branched PEG-PLGA)
  • microspheres were prepared using the same polymer as in Studies 1 and 2: 4PEG (10 kDa)-PLGA (40 kDa).
  • the drugs encapsulated in the microspheres were bevacizumab, ranibizumab, faricimab, brolucizumab, or aflibercept. Details of this study are described below.
  • a MicroBCA Assay was used to measure the amount of total ranibizumab. 100 ⁇ L of sample solution or calibration curve solution was added to each well of a 96-well plate, followed by 100 ⁇ L of Working Reagent prepared according to the protocol provided with the MicroBCA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). The plate was agitated for 30 seconds and then incubated at 37°C for 2 hours. After visually confirming color development, the absorbance at a wavelength of 562 nm was measured using a microplate reader. The amount of total ranibizumab calculated from the absorbance is shown in Table 3.
  • ranibizumab-encapsulated microspheres obtained in 3.2.1 was dissolved in 1 mL of dimethyl sulfoxide/PBS (7:3 mixture). This solution was diluted 1000 times with PBS to prepare a sample solution. Additionally, 10 mg/mL of Lucentis® intravitreal injection solution was diluted with PBS to prepare a calibration curve solution ranging from 2 to 200 ng/mL.
  • ELISA was used to measure the amount of active ranibizumab.
  • 100 ⁇ L of 100 ng/mL human VEGF-A 165 solution was added to a 96-well immunoplate, and the plate was stirred on a shaker for 1 minute and then allowed to stand at 37°C for 1 hour. After standing, the liquid in the wells was discarded, and a washing solution was added to each well to wash the wells. After washing, 200 ⁇ L of 1% BSA solution was added to each well and the plate was shaken at room temperature for 1 hour. After shaking, the liquid in the wells was discarded, and a washing solution was added to each well to wash the wells.
  • sample solution or calibration curve solution was added to each well and shaken at room temperature for 2 hours. After shaking, the liquid in the wells was discarded, washing solution was added to each well, and the wells were washed. After washing, 100 ⁇ L of secondary antibody solution was added and the wells were shaken at room temperature for 1 hour. After shaking, the secondary antibody solution was discarded, washing solution was added to each well, and the wells were washed. After washing, 100 ⁇ L of TMB ELISA Substrate (High Sensitivity) was added and the wells were shaken at room temperature for 15 minutes.
  • TMB ELISA Substrate High Sensitivity
  • ELISA was used to measure the amount of active faricimab.
  • 100 ⁇ L of a 100 ng/mL human VEGF-A 165 solution was added to a 96-well immunoplate, which was then stirred on a shaker for 1 minute and allowed to stand at 37°C for 1 hour. After standing, the liquid in the wells was discarded, and a washing solution was added to each well to wash the wells. After washing, 200 ⁇ L of a 1% BSA solution was added to each well and the plate was shaken at room temperature for 1 hour. After shaking, the liquid in the wells was discarded, and a washing solution was added to each well to wash the wells.
  • sample solution or calibration curve solution was added to each well and shaken at room temperature for 2 hours. After shaking, the liquid in the wells was discarded, washing solution was added to each well, and the wells were washed. After washing, 100 ⁇ L of secondary antibody solution was added and the wells were shaken at room temperature for 1 hour. After shaking, the secondary antibody solution was discarded, washing solution was added to each well, and the wells were washed. After washing, 100 ⁇ L of TMB ELISA Substrate (High Sensitivity) was added and the wells were shaken at room temperature for 15 minutes.
  • TMB ELISA Substrate High Sensitivity
  • the MicroBCA Assay was used to measure the total amount of brolucizumab. 100 ⁇ L of sample solution or calibration curve solution was added to each well of a 96-well plate, followed by 100 ⁇ L of Working Reagent prepared according to the protocol provided with the MicroBCA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). The plate was agitated for 30 seconds and then incubated at 37°C for 2 hours. After visually confirming color development, the absorbance at a wavelength of 562 nm was measured using a microplate reader. The total amount of brolucizumab calculated from the absorbance is shown in Table 3.
  • ELISA was used to measure the amount of active brolucizumab.
  • 100 ⁇ L of a 100 ng/mL human VEGF-A 165 solution was added to a 96-well immunoplate, which was then agitated on a shaker for 1 minute and allowed to stand at 37°C for 1 hour. After standing, the liquid in the wells was discarded, and a washing solution was added to each well to wash the wells. After washing, 200 ⁇ L of a 1% BSA solution was added to each well and the plate was shaken at room temperature for 1 hour. After shaking, the liquid in the wells was discarded, and a washing solution was added to each well to wash the wells.
  • sample solution or calibration curve solution was added to each well and shaken at room temperature for 2 hours. After shaking, the liquid in the wells was discarded, washing solution was added to each well, and the wells were washed. After washing, 100 ⁇ L of secondary antibody solution was added and the wells were shaken at room temperature for 1 hour. After shaking, the secondary antibody solution was discarded, washing solution was added to each well, and the wells were washed. After washing, 100 ⁇ L of TMB ELISA Substrate (High Sensitivity) was added and the wells were shaken at room temperature for 15 minutes.
  • TMB ELISA Substrate High Sensitivity
  • a MicroBCA Assay was used to measure the total amount of aflibercept. 100 ⁇ L of sample solution or calibration curve solution was added to each well of a 96-well plate, followed by 100 ⁇ L of Working Reagent prepared according to the protocol provided with the MicroBCA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). The plate was agitated for 30 seconds and then incubated at 37°C for 2 hours. After visually confirming color development, the absorbance at a wavelength of 562 nm was measured using a microplate reader. The total amount of aflibercept calculated from the absorbance is shown in Table 3.
  • ELISA was used to measure the amount of active aflibercept.
  • 100 ⁇ L of 100 ng/mL human VEGF-A 165 solution was added to a 96-well immunoplate, and the plate was stirred on a shaker for 1 minute and then allowed to stand at 37°C for 1 hour. After standing, the liquid in the wells was discarded, and a washing solution was added to each well to wash the wells. After washing, 200 ⁇ L of 1% BSA solution was added to each well and the plate was shaken at room temperature for 1 hour. After shaking, the liquid in the wells was discarded, and a washing solution was added to each well to wash the wells.
  • sample solution or calibration curve solution was added to each well and shaken at room temperature for 2 hours. After shaking, the liquid in the wells was discarded, washing solution was added to each well, and the wells were washed. After washing, 100 ⁇ L of secondary antibody solution was added and the wells were shaken at room temperature for 1 hour. After shaking, the secondary antibody solution was discarded, washing solution was added to each well, and the wells were washed. After washing, 100 ⁇ L of TMB ELISA Substrate (High Sensitivity) was added and the wells were shaken at room temperature for 15 minutes.
  • TMB ELISA Substrate High Sensitivity
  • Test 4 Stability depending on the number of PLGA units (drug used: bevacizumab, Example 7 and Comparative Example 5)
  • drug used bevacizumab, Example 7 and Comparative Example 5
  • bevacizumab-encapsulated microspheres were prepared using 4-branched PEG-PLGA with various numbers of PLGA units as shown in Table 4 in Section 4.1, and the stability of the encapsulated bevacizumab in each microsphere was evaluated.
  • the LA:GA ratio of the PEG-PLGA used in this study was 8:2 in all cases. Details of this study are described below.
  • Microsphere Preparation 0.025 g of Span 80 and 0.25 g of 4-branched PEG-PLGA were dissolved in 10 mL of dichloromethane (oil phase solution). The number of PLGA units in the 4-branched PEG-PLGA used was 100, 110, 160, 200, 250, 300, 350, 500, or 1000, as shown in Table 4. 0.1 mL of 2.5% bevacizumab solution was added to each oil phase solution, and the mixture was emulsified at 20,500 rpm for 1 minute using a homogenizer. After emulsification, the mixture was spray-dried using a spray dryer (two-fluid nozzle ⁇ 1.4, N2 flow 30 mm, temperature 10-15°C) to obtain white particulate bevacizumab-encapsulated microspheres.
  • a spray dryer two-fluid nozzle ⁇ 1.4, N2 flow 30 mm, temperature 10-15°C
  • a MicroBCA Assay was used to measure the total amount of bevacizumab. 100 ⁇ L of sample solution or calibration curve solution was added to each well of a 96-well plate, followed by 100 ⁇ L of Working Reagent prepared according to the protocol provided with the MicroBCA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). The plate was agitated for 30 seconds and then incubated at 37°C for 2 hours. After visually confirming color development, the absorbance at a wavelength of 562 nm was measured using a microplate reader. The total amount of bevacizumab in each microsphere calculated from the absorbance is shown in Table 5.
  • ELISA was used to measure the amount of active bevacizumab.
  • 100 ⁇ L of 100 ng/mL human VEGF-A 165 solution was added to a 96-well immunoplate, and the plate was stirred on a shaker for 1 minute and then allowed to stand at 37°C for 1 hour. After standing, the liquid in the wells was discarded, and a washing solution was added to each well to wash the wells. After washing, 200 ⁇ L of 1% BSA solution was added to each well and the plate was shaken at room temperature for 1 hour. After shaking, the liquid in the wells was discarded, and a washing solution was added to each well to wash the wells.
  • sample solution or calibration curve solution was added to each well and shaken at room temperature for 2 hours. After shaking, the liquid in the wells was discarded, washing solution was added to each well, and the wells were washed. After washing, 100 ⁇ L of secondary antibody solution was added and the wells were shaken at room temperature for 1 hour. After shaking, the secondary antibody solution was discarded, washing solution was added to each well, and the wells were washed. After washing, 100 ⁇ L of TMB ELISA Substrate (High Sensitivity) was added and the wells were shaken at room temperature for 15 minutes.
  • TMB ELISA Substrate High Sensitivity
  • Test 5 Stability depending on the number of 4-branched PEG-PLGA units (drug used: ranibizumab, Example 8 and Comparative Example 6) Based on the results of Study 4, the inventors investigated whether the number of PLGA units in PEG-PLGA affects drug stability when drugs other than bevacizumab are encapsulated, as in the case of encapsulating bevacizumab.
  • ranibizumab-encapsulated microspheres were prepared using four-branched PEG-PLGA with various numbers of PLGA units as shown in Table 6 in Section 5.1, and the stability of the ranibizumab encapsulated in each prepared microsphere was evaluated.
  • the LA:GA ratio of the PEG-PLGA used in this study was 8:2 in all cases. Details of this study are described below.
  • Microsphere Preparation 0.025 g of Span 80 and 0.25 g of 4-branched PEG-PLGA were dissolved in 10 mL of dichloromethane (oil phase solution). The number of PLGA units in the 4-branched PEG-PLGA used was 160, 200, 250, 300, or 350, as shown in Table 6. 0.1 mL of 0.5% ranibizumab solution was added to each oil phase solution, and the mixture was emulsified at 20,500 rpm for 1 minute using a homogenizer. After emulsification, the mixture was spray-dried using a spray dryer to obtain white, particulate ranibizumab-encapsulated microspheres.
  • a MicroBCA Assay was used to measure the total amount of ranibizumab. 100 ⁇ L of sample solution or calibration curve solution was added to each well of a 96-well plate, followed by 100 ⁇ L of Working Reagent prepared according to the protocol provided with the MicroBCA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). The plate was agitated for 30 seconds and then incubated at 37°C for 2 hours. After visually confirming color development, the absorbance at a wavelength of 562 nm was measured using a microplate reader. The total amount of ranibizumab in each microsphere calculated from the absorbance is shown in Table 7.
  • ELISA was used to measure the activity of ranibizumab.
  • 100 ⁇ L of 100 ng/mL human VEGF-A 165 solution was added to a 96-well immunoplate, and the plate was stirred on a shaker for 1 minute and then allowed to stand at 37°C for 1 hour. After standing, the liquid in the wells was discarded, and a washing solution was added to each well to wash the wells. After washing, 200 ⁇ L of 1% BSA solution was added to each well and the plate was shaken at room temperature for 1 hour. After shaking, the liquid in the wells was discarded, and a washing solution was added to each well to wash the wells.
  • sample solution or calibration curve solution was added to each well and shaken at room temperature for 2 hours. After shaking, the liquid in the wells was discarded, washing solution was added to each well, and the wells were washed. After washing, 100 ⁇ L of secondary antibody solution was added and the wells were shaken at room temperature for 1 hour. After shaking, the secondary antibody solution was discarded, washing solution was added to each well, and the wells were washed. After washing, 100 ⁇ L of TMB ELISA Substrate (High Sensitivity) was added and the wells were shaken at room temperature for 15 minutes.
  • TMB ELISA Substrate High Sensitivity
  • Test 6 Evaluation of sustained release (activity value) in microspheres using 4-branched PEG-PLGA (Example 9)
  • the inventors evaluated the sustained drug release properties of microspheres using 4-branched PEG-PLGA.
  • the evaluation of sustained drug release properties was carried out using the ranibizumab-loaded microspheres obtained in 3.2. Details are described below.
  • sampling was performed at 1 week, 2 weeks, 3 weeks, 4 weeks, 6 weeks, 60 days, 90 days, 120 days, 150 days, and 180 days. Specifically, 1 mL of release test liquid was collected at each sampling time point (the collected release test liquid may be referred to as the sampling liquid).
  • the total amount of ranibizumab released into the sampling solution was measured using the MicroBCA method described in 6.2.
  • the amount of active ranibizumab released into the sampling solution was measured using the ELISA method described in 6.3.
  • the activity retention rate (%) was calculated using the formula [amount of active ranibizumab/total amount of ranibizumab] x 100.
  • the activity retention rate (%) at each time point is shown in Figure 11.
  • ELISA was used to measure the amount of active ranibizumab.
  • 100 ⁇ L of 100 ng/mL human VEGF-A 165 solution was added to a 96-well immunoplate, and the plate was stirred on a shaker for 1 minute and then allowed to stand at 37°C for 1 hour. After standing, the liquid in the wells was discarded, and a washing solution was added to each well to wash the wells. After washing, 200 ⁇ L of 1% BSA solution was added to each well and the plate was shaken at room temperature for 1 hour. After shaking, the liquid in the wells was discarded, and a washing solution was added to each well to wash the wells.
  • sample solution or calibration curve solution was added to each well and shaken at room temperature for 2 hours. After shaking, the liquid in the wells was discarded, washing solution was added to each well, and the wells were washed. After washing, 100 ⁇ L of secondary antibody solution was added and the wells were shaken at room temperature for 1 hour. After shaking, the secondary antibody solution was discarded, washing solution was added to each well, and the wells were washed. After washing, 100 ⁇ L of TMB ELISA Substrate (High Sensitivity) was added and the wells were shaken at room temperature for 15 minutes.
  • TMB ELISA Substrate High Sensitivity
  • the ranibizumab-encapsulated microspheres obtained in 3.2 showed a high ranibizumab activity retention rate of 80% or more at 6 weeks (42 days) after the start of the drug release test. In other words, the microspheres continued to release the active drug for a long period of time.
  • Test 7 Stability of PEG-PLGA depending on the number of branches (drug used: ranibizumab) 7.1.1 Microsphere Preparation: 0.025 g of Span 80 and 0.25 g of PLGA (50 kDa), 2PEG (10 kDa)-PLGA (40 kDa), or 8PEG (10 kDa)-PLGA (40 kDa) were dissolved in 10 mL of dichloromethane (oil phase solution).
  • ranibizumab solution a 2-fold diluted solution of Lucentis® intravitreal injection solution 10 mg/mL (Novartis Pharma K.K.)
  • ranibizumab solution a 2-fold diluted solution of Lucentis® intravitreal injection solution 10 mg/mL (Novartis Pharma K.K.)
  • the mixture was emulsified using a homogenizer at 20,500 rpm for 1 minute. After emulsification, the mixture was spray-dried using a spray dryer (drying conditions were the same as in 1.1) to obtain white, particulate ranibizumab-encapsulated microspheres.
  • a MicroBCA Assay was used to measure the amount of total ranibizumab. 100 ⁇ L of sample solution or calibration curve solution was added to each well of a 96-well plate, followed by 100 ⁇ L of Working Reagent prepared according to the protocol provided with the MicroBCA Assay Kit (Thermo Fisher Scientific). The plate was agitated for 30 seconds and then incubated at 37°C for 2 hours. After visually confirming color development, the absorbance at a wavelength of 562 nm was measured using a microplate reader (Synergy HTX multimode plate reader, BioTek Instruments, Inc.). The amount of total ranibizumab calculated from the absorbance is shown in Table 8.
  • ELISA was used to measure the amount of active cetuximab.
  • 100 ⁇ L of 1000 ng/mL human VEGF-A 165 solution was added to a 96-well immunoplate (MaxiSorp Nunc-Immuno Plate, Thermo Fisher Scientific), stirred on a shaker for 1 minute, and then allowed to stand overnight at 4°C. After standing, the liquid in the wells was discarded, and a washing solution (PBS containing 0.05% Tween (registered trademark) 20) was added to each well to wash the wells. After washing, 200 ⁇ L of 1% BSA solution was added to each well, and the plate was shaken at room temperature for 1 hour. After shaking, the liquid in the wells was discarded, and a washing solution was added to each well to wash the wells.
  • sample solution or calibration curve solution was added to each well and shaken at room temperature for 2 hours. After shaking, the liquid in the wells was discarded, washing solution was added to each well, and the wells were washed. After washing, 100 ⁇ L of secondary antibody solution (Goat Anti-Human IgG (H+L) solution) was added and shaken at room temperature for 1 hour. After shaking, the secondary antibody solution was discarded, washing solution was added to each well, and the wells were washed. After washing, 100 ⁇ L of TMB ELISA Substrate (High Sensitivity) was added and shaken at room temperature for 15 minutes.
  • secondary antibody solution Goat Anti-Human IgG (H+L) solution
  • the technology of the present disclosure may provide a formulation containing at least one drug selected from the group consisting of cetuximab, bevacizumab, faricimab, ranibizumab, and brolucizumab, which has excellent drug stability. It also suggests that the formulation may have excellent sustained drug release properties.

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Abstract

本開示は、セツキシマブ、ベバシズマブ、ファリシマブ、ラニビズマブ、及びブロルシズマブからなる群より選択される少なくとも一種の薬物の安定性に優れた、ポリマーを含む製剤の提供を主な目的とする。本発明者らは、セツキシマブ、ベバシズマブ、ファリシマブ、ラニビズマブ、及びブロルシズマブからなる群より選択される少なくとも一種の薬物を内包する微小カプセルであって、前記微小カプセルは、一分子あたり３～１０個の末端ヒドロキシ基を有する分岐型ポリアルキレングリコールとポリヒドロキシアルカン酸とが結合した化学構造を有するポリマーを含み、前記ポリマーにおいて、ポリヒドロキシアルカン酸鎖一鎖あたりの、ポリヒドロキシアルカン酸モノマーのユニット数が５０～２３０である、微小カプセルによれば、前記薬物の安定性に優れたポリマーを含む製剤が提供され得ることを見出した。

Description

薬物を内包する微小カプセル
　本開示は、薬物を内包する微小カプセル、及び前記微小カプセルを含む組成物等に関する。
　近年、ペプチド医薬、タンパク質医薬、及び核酸医薬等の高分子医薬の重要性が高まっている。しかしながら、一般的に高分子医薬は、従来の低分子医薬よりも安定性が劣る。このため、高分子医薬を安定的な製剤とする技術が従来検討されてきた。
　例えば特許文献１では、抗体分子、ポリマー、及びシクロデキストリンを含み、任意選択で緩衝剤及び／又は界面活性剤を更に含む乾燥抗体分子ロード高分子マイクロスフェアによって、当該抗体分子の安定性改善が試みられている。
特表２０２２－５３３０３８号公報 国際公開第２０１８／０６２４６４号
　しかしながら、例えばポリマーのなかでも特許文献１の実施例で用いられたポリ（ラクチド－コ－グリコシド）コポリマー（本開示においては以降、乳酸・グリコール酸共重合体と称する）に限っても、当該名称で表されるポリマーには、重合の仕方や分子量等により多種多様な構造のポリマーが含まれる。また、高分子医薬のなかでもアミノ酸を構成要素とするペプチド医薬又はタンパク質医薬に限っても、安定性等の性質はアミノ酸配列等により大きく異なり得る。
　しかしながら、特定の高分子医薬、より具体的には加齢黄斑変性の治療等に用いられるセツキシマブ、ベバシズマブ、ファリシマブ、ラニビズマブ、及びブロルシズマブからなる群より選択される少なくとも一種の薬物と相性の良いポリマーの具体的な構造については、これまでに十分な検討がされていなかった。
　そこで本発明者らは、特にセツキシマブ、ベバシズマブ、ファリシマブ、ラニビズマブ、及びブロルシズマブからなる群より選択される少なくとも一種の薬物の安定性に優れた、ポリマーを含む製剤の提供を主な目的とした。
　上記検討の結果、本発明者らは、セツキシマブ、ベバシズマブ、ファリシマブ、ラニビズマブ、及びブロルシズマブからなる群より選択される少なくとも一種の薬物を内包する微小カプセルであって、前記微小カプセルは、一分子あたり３～１０個の末端ヒドロキシ基を有する分岐型ポリアルキレングリコールとポリヒドロキシアルカン酸とが結合した化学構造を有するポリマーを含み、前記ポリマーにおいて、ポリヒドロキシアルカン酸鎖一鎖あたりの、ポリヒドロキシアルカン酸モノマーのユニット数が５０～２３０である、微小カプセルによれば、前記薬物の安定性に優れた製剤が提供され得る可能性を見出した。そしてさらに改良を重ね、本開示を完成させるに至った。
　本開示は例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
薬物を内包する微小カプセルであって、
一分子あたり３～１０個の末端ヒドロキシ基を有する分岐型ポリアルキレングリコールとポリヒドロキシアルカン酸とが結合した化学構造を有するポリマーと、薬物と、を含み、前記ポリマーにおいて、ポリヒドロキシアルカン酸鎖一鎖あたりの、ポリヒドロキシアルカン酸モノマーのユニット数は５０～２３０であり、かつ、
前記薬物は、ベバシズマブ、ファリシマブ、ラニビズマブ、及びブロルシズマブからなる群より選択される少なくとも一種である、微小カプセル。
項２．
前記分岐型ポリアルキレングリコールが、分岐型ポリエチレングリコールである、項１に記載の微小カプセル。
項３．
前記分岐型ポリアルキレングリコールが、４又は８分岐型ポリエチレングリコールである、項１又は２に記載の微小カプセル。
項４．
前記ポリヒドロキシアルカン酸が、乳酸・グリコール酸共重合体である、項１～３のいずれか一項に記載の微小カプセル。
項５．
前記ポリマー中の、前記分岐型ポリアルキレングリコールの数平均分子量が５０００～２００００である、項１～４のいずれか一項に記載の微小カプセル。
項６．
前記ポリマー中の、前記ポリヒドロキシアルカン酸の数平均分子量が１００００～６００００である、項１～５のいずれか一項に記載の微小カプセル。
項７．
前記ポリマー中の、前記分岐型ポリアルキレングリコールの数平均分子量と、前記ポリヒドロキシアルカン酸の数平均分子量との比が、１：１～１：６である、項１～６のいずれか一項に記載の微小カプセル。
項８．
前記ポリヒドロキシアルカン酸が、乳酸・グリコール酸共重合体であり、
前記乳酸・グリコール酸共重合体に含有されるグリコール酸１モルに対する、当該乳酸・グリコール酸共重合体に含有される乳酸のモル数の比が、２～８である、項１～７のいずれか一項に記載の微小カプセル。
項９．
前記ポリマーの数平均分子量が３００００～７００００である、項１～８のいずれか一項に記載の微小カプセル。
項１０．
前記薬物がラニビズマブである、項１～９のいずれか一項に記載の微小カプセル。
項１１．
項１～１０のいずれか一項に記載の微小カプセルを含有する、組成物。
項１２．
徐放性医薬組成物である、項１１に記載の組成物。
項１３．
マイクロスフェアである、項１１又は１２に記載の組成物。
　本開示の技術によれば、セツキシマブ、ベバシズマブ、ファリシマブ、ラニビズマブ、及びブロルシズマブからなる群より選択される少なくとも一種の薬物を含む、前記薬物の安定性に優れた製剤が提供され得る。また、前記製剤は優れた薬物徐放性をも有し得る。
試験１．１．１で得たセツキシマブ内包マイクロスフェア（ポリマーは４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）の走査型電子顕微鏡（以下、ＳＥＭと表記することがある）画像を示す。Ｂａｒ＝１０μｍ。 試験１．２．１で得たセツキシマブ内包マイクロスフェア（ポリマーはＰＬＧＡ）のＳＥＭ画像を示す。Ｂａｒ＝１０μｍ。 試験２．１．１で得たベバシズマブ内包マイクロスフェア（ポリマーは４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）のＳＥＭ画像を示す。Ｂａｒ＝１０μｍ。 試験２．２．１で得たベバシズマブ内包マイクロスフェア（ポリマーは８分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）のＳＥＭ画像を示す。Ｂａｒ＝１０μｍ。 試験２．３．１で得たベバシズマブ内包マイクロスフェア（ポリマーは単分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）のＳＥＭ画像を示す。Ｂａｒ＝１０μｍ。 試験２．４．１で得たベバシズマブ内包マイクロスフェア（ポリマーは２分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）のＳＥＭ画像を示す。Ｂａｒ＝１０μｍ。 試験３．２．１で得たラニビズマブ内包マイクロスフェア（ポリマーは４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）のＳＥＭ画像を示す。Ｂａｒ＝１０μｍ。 試験３．３．１で得たファリシマブ内包マイクロスフェア（ポリマーは４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）のＳＥＭ画像を示す。Ｂａｒ＝１０μｍ。 試験３．４．１で得たブロルシズマブ内包マイクロスフェア（ポリマーは４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）のＳＥＭ画像を示す。Ｂａｒ＝１０μｍ。 試験３．５．１で得たアフリベルセプト内包マイクロスフェア（ポリマーは４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）のＳＥＭ画像を示す。Ｂａｒ＝１０μｍ。 試験６で行った薬物徐放性評価の結果を示す。横軸は薬物放出試験開始からの日数を、縦軸はラニビズマブ活性維持率（％）を、それぞれ示す。 試験７．１．１で得たラニビズマブ内包マイクロスフェア（ポリマーはＰＬＧＡ）のＳＥＭ画像を示す。Ｂａｒ＝１０μｍ。 試験７．１．１で得たラニビズマブ内包マイクロスフェア（ポリマーは２ＰＥＧ（１０ｋＤａ）－ＰＬＧＡ（４０ｋＤａ））のＳＥＭ画像を示す。Ｂａｒ＝１０μｍ。 試験７．１．１で得たラニビズマブ内包マイクロスフェア（ポリマーは８ＰＥＧ（１０ｋＤａ）－ＰＬＧＡ（４０ｋＤａ））のＳＥＭ画像を示す。Ｂａｒ＝１０μｍ。
　本開示は、薬物を内包する微小カプセル、及び前記微小カプセルを含む組成物等を好ましく包含するが、これらに限定されるわけではなく、本開示は本明細書に開示され当業者が認識できる全てを包含する。
　本開示に包含される微小カプセルは、薬物を内包し、前記微小カプセルは、一分子あたり３～１０個の末端ヒドロキシ基を有する分岐型ポリアルキレングリコールとポリヒドロキシアルカン酸とが結合した化学構造を有するポリマーを含み、前記ポリマーにおいて、ポリヒドロキシアルカン酸鎖一鎖あたりの、ポリヒドロキシアルカン酸モノマーのユニット数は５０～２３０であり、かつ、前記薬物は、セツキシマブ、ベバシズマブ、ファリシマブ、ラニビズマブ、及びブロルシズマブからなる群より選択される少なくとも一種である。以下、本開示に包含される当該微小カプセルを「本開示の微小カプセル」と称することがある。
Ａ．　本開示のポリマー
　上述の通り、本開示の微小カプセルは、一分子あたり３～１０個の末端ヒドロキシ基を有する分岐型ポリアルキレングリコールとポリヒドロキシアルカン酸とが結合した化学構造を有するポリマーを含み、前記ポリマーにおいて、ポリヒドロキシアルカン酸鎖一鎖あたりの、ポリヒドロキシアルカン酸モノマーのユニット数は５０～２３０である。当該ポリマーを「本開示のポリマー」と称することがある。以下に、本開示のポリマーについて詳述する。
Ａ－１．　分岐型ポリアルキレングリコール
　本開示のポリマーを構成する分岐型ポリアルキレングリコールは、多価アルコールが有する複数のヒドロキシ基のうち少なくとも一部のヒドロキシ基にポリアルキレングリコールがエーテル結合した構造を有する。特に、当該分岐型ポリアルキレングリコールは、多価アルコールが有する全てのヒドロキシ基にポリアルキレングリコールがエーテル結合した構造を有することが好ましい。また、当該分岐型ポリアルキレングリコールは、多価アルコールが有する全てのヒドロキシ基に、直鎖状のポリアルキレングリコールがエーテル結合した構造を有することがさらに好ましい。
　前記多価アルコールが有するヒドロキシ基の数は、例えば３～２０個であってもよい。前記範囲の上限又は下限は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０個であってもよい。当該多価アルコールが有するヒドロキシ基の数は、２～１５個であることが好ましく、３～１０個であることがより好ましく、４～８個であることがさらに好ましく、４又は８個であることが特に好ましい。
　当該多価アルコールとして、具体的には、グリセリン、ポリグリセリン、及びペンタエリトリトール；並びにグルコース、フルクトース、キシロース、ガラクトース、マンノース、エリトロース、アラビノース、スクロース、マルトース、ラクトース、トレハロース及びセロビオース等の糖類が挙げられる。前記ポリグリセリンとしては、例えばグリセリンの２～６量体であるものが挙げられる。前記範囲の上限又は下限は、２、３、４、５、又は６であってもよい。また、当該多価アルコールは、例えばジペンタエリスリトールのように、上記した多価アルコールが２以上重合した構造を有するものであってもよい。
　当該分岐型ポリアルキレングリコールの分岐数は、一分子あたり３～１０個である。前記範囲の上限又は下限は、３、４、５、６、７、８、９、又は１０個であってもよい。なお、当該分岐型ポリアルキレングリコールの分岐数は、当該分岐型ポリアルキレングリコールが有する末端ヒドロキシ基の個数と換言することができる。すなわち、例えば４分岐型ポリアルキレングリコールは、一分子あたり４個の末端ヒドロキシ基を有する。本開示の微小カプセル内に薬物を安定に保持し得る観点、及び本開示の微小カプセルに優れた薬物徐放性を付与し得る観点から、当該分岐型ポリアルキレングリコールは、一分子あたり４～８個の末端ヒドロキシ基を有することが好ましく、一分子あたり４又は８個の末端ヒドロキシ基を有することが特に好ましい。
　本開示のポリマーを構成する分岐型ポリアルキレングリコールとしてより具体的には、分岐型ポリエチレングリコール、分岐型ポリプロピレングリコール、及び分岐型ポリブチレングリコール等が例示される。これらのなかでも、生体適合性の観点等から、本開示のポリマーを構成する分岐型ポリアルキレングリコールは、分岐型ポリエチレングリコールであることが好ましい。なお一般的に、アルキレン基は炭素数が少ない方が、親水性が高い。
　本開示のポリマーを構成する分岐型ポリアルキレングリコールの、当該ポリマー中での数平均分子量は、本開示の効果が奏される限りにおいて特に制限されず、例えば３０００～５００００であってもよい。本開示の微小カプセル内に薬物を安定に保持し得る観点、及び本開示の微小カプセルに優れた薬物徐放性を付与し得る観点から、本開示のポリマーを構成する分岐型ポリアルキレングリコールの、当該ポリマー中での数平均分子量は、３０００～３００００であることが好ましく、５０００～２００００であることがより好ましく、７０００～１５０００であることがさらに好ましく、８０００～１３０００であることが特に好ましい。
　本開示のポリマーを構成する分岐型ポリアルキレングリコールの好ましい一態様として、多価アルコールに直鎖ポリエチレングリコールが結合した化学構造を有し、かつ当該ポリマー中での数平均分子量が５０００～２００００である、４又は８分岐型ポリエチレングリコールが挙げられる。本開示のポリマーを構成する分岐型ポリアルキレングリコールのより好ましい一態様として、多価アルコールに直鎖ポリエチレングリコールが結合した化学構造を有し、かつ当該ポリマー中でのポリエチレングリコールの数平均分子量が７０００～１５０００である、４又は８分岐型ポリエチレングリコールが挙げられる。
　分岐型ポリアルキレングリコールは、公知の化学合成法等により製造することができ、また、市場で市販品を入手することもできる。市販品としては例えば、日油社の「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＰＴＥ」シリーズ、及び「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＨＧＥＯ」シリーズ等が挙げられる。前記「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＰＴＥ」シリーズは、ペンタエリトリトールが有する４つのヒドロキシ基のそれぞれに、直鎖状のポリエチレングリコール鎖が結合した構造を有する、４分岐型ポリエチレングリコールである。また、前記「ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ（登録商標）ＨＧＥＯ」シリーズは、グリセリンの４量体であるポリグリセリンが有する８つのヒドロキシ基のそれぞれに、直鎖状のポリエチレングリコール鎖が結合した構造を有する、８分岐型ポリエチレングリコールである。
Ａ－２．　ポリヒドロキシアルカン酸
　本開示の技術において、本開示のポリマーを構成するポリヒドロキシアルカン酸は、一種のモノマーのみからなる単独重合体（すなわちホモポリマー）であってもよく、二種以上のモノマーからなる共重合体（すなわちコポリマー）であってもよい。当該ポリヒドロキシアルカン酸が共重合体である場合、ランダム共重合体及びブロック共重合体の、いずれであってもよい。
　当該ポリヒドロキシアルカン酸を構成するモノマーとして、具体的には、乳酸、グリコール酸、6‐ヒドロキシカプロン酸、３－ヒドロキシ酪酸、３－ヒドロキシ吉草酸、及びリンゴ酸等が挙げられる。また、ポリヒドロキシアルカン酸を生成する原料モノマーの具体例として、ε－カプロラクトン等が挙げられる。当該ポリヒドロキシアルカン酸を構成するモノマーは、Ｌ体及びＤ体のいずれであってもよく、本開示のポリマー中にてＤ体とＬ体が混在していてもよい。本開示のポリマーに優れた機械的強度を付与する観点等から、当該ポリヒドロキシアルカン酸を構成するモノマーは、Ｄ体又はＬ体のみからなることが好ましい。
　当該ポリヒドロキシアルカン酸は、乳酸、グリコール酸及び6‐ヒドロキシカプロン酸からなる群より選択されるモノマーの単独重合体であるか、又は、前記モノマーを２種以上含む共重合体であることが好ましい。本開示のポリマーに優れた生分解性を付与し得る観点から、当該ポリヒドロキシアルカン酸は、乳酸とグリコール酸との共重合体（すなわち乳酸・グリコール酸共重合体）であることがより好ましく、乳酸とグリコール酸のランダム共重合体であることが特に好ましい。
　当該ポリヒドロキシアルカン酸が乳酸・グリコール酸共重合体である場合、当該乳酸・グリコール酸共重合体に含有されるグリコール酸１モルに対する、当該乳酸・グリコール酸共重合体に含有される乳酸のモル数の比は、例えば１～１０であってもよい。前記範囲の上限又は下限は、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、又は１０であってもよい。生体内分解性の観点から、当該乳酸・グリコール酸共重合体に含有されるグリコール酸１モルに対する、当該乳酸・グリコール酸共重合体に含有される乳酸のモル数の比は、２～８であることが好ましく、３～６であることがより好ましく、３～５であることが特に好ましい。なお一般的に、当該乳酸・グリコール酸共重合体に含有されるグリコール酸１モルに対する、当該乳酸・グリコール酸共重合体に含有される乳酸のモル数の比が、１のとき生体内分解速度が最も速く、乳酸の組成比が増加すると分解速度が減少する。
　本開示のポリマーを構成するポリヒドロキシアルカン酸の、当該ポリマー中での数平均分子量は、本開示の効果が奏される限りにおいて特に制限されず、例えば８０００～８００００であってもよい。本開示の微小カプセル内に薬物を安定に保持し得る観点、及び本開示の微小カプセルに優れた薬物徐放性を付与し得る観点から、本開示のポリマーを構成するポリヒドロキシアルカン酸の、当該ポリマー中での数平均分子量は、１００００～６５０００であることが好ましく、１００００～６００００であることがより好ましく、１５０００～５５０００であることがさらに好ましく、２００００～５００００であることが特に好ましい。
　本開示のポリマーを構成するポリヒドロキシアルカン酸の好ましい一態様として、数平均分子量が１００００～６５０００の乳酸・グリコール酸共重合体であって、当該乳酸・グリコール酸共重合体に含有されるグリコール酸１モルに対する、当該乳酸・グリコール酸共重合体に含有される乳酸のモル数の比が２～８である乳酸・グリコール酸共重合体が挙げられる。本開示のポリマーを構成するポリヒドロキシアルカン酸の特に好ましい一態様として、数平均分子量が１５０００～５５０００の乳酸・グリコール酸共重合体であって、当該乳酸・グリコール酸共重合体に含有されるグリコール酸１モルに対する、当該乳酸・グリコール酸共重合体に含有される乳酸のモル数の比が３～６である乳酸・グリコール酸共重合体が挙げられる。
Ａ－３．　本開示のポリマーの構造
　上述の通り、本開示のポリマーは一分子あたり３～１０個の末端ヒドロキシ基を有する分岐型ポリアルキレングリコールとポリヒドロキシアルカン酸とが結合した化学構造を有する。より具体的には、分岐型ポリアルキレングリコールが有するヒドロキシ基と、ポリヒドロキシアルカン酸が有するカルボキシ基とが、エステル結合した化学構造を有する。また、本開示のポリマー中、ポリヒドロキシアルカン酸鎖一鎖あたりの、ポリヒドロキシアルカン酸モノマーのユニット数は３５～２３３であり、５０～２３０であることが好ましい。
　本開示において、「ポリヒドロキシアルカン酸鎖一鎖あたりの、ポリヒドロキシアルカン酸モノマーのユニット数」との用語は、ポリマーに含まれる全ポリヒドロキシアルカン酸モノマーユニット数の数平均を、分岐型ポリアルキレングリコールの末端ヒドロキシ基の数で除した値を指すものとする。
　上述の通り、本開示のポリマー中、ポリヒドロキシアルカン酸鎖一鎖あたりの、ポリヒドロキシアルカン酸モノマーのユニット数は３５～２３３であり、５０～２３０であることが好ましい。前記範囲の上限又は下限は、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、又は２３０であってもよい。本開示の微小カプセル内に薬物を安定に保持し得る観点、及び本開示の微小カプセルに優れた薬物徐放性を付与し得る観点から、本開示のポリマー中、ポリヒドロキシアルカン酸鎖一鎖あたりの、ポリヒドロキシアルカン酸モノマーのユニット数は７０～２２０であることが好ましく、８０～２１０であることがより好ましく、９０～２０５であることがさらに好ましく、１００～２００であることが特に好ましい。
　本開示のポリマー中の分岐型ポリアルキレングリコールの数平均分子量と、当該ポリマー中のポリヒドロキシアルカン酸の数平均分子量との比は、本開示の効果が奏される限りにおいて特に制限されず、例えば１：０．５～１：１０であってもよい。前記範囲の上限又は下限は、１：０．５、１：１、１：１．５、１：２、１：２．５、１：３、１：３．５、１：４、１：４．５、１：５、１：５．５、１：６、１：６．５、１：７、１：７．５、１：８、１：８．５、１：９、１：９．５、又は１：１０であってもよい。本開示の微小カプセル内に薬物を安定に保持し得る観点、及び本開示の微小カプセルに優れた薬物徐放性を付与し得る観点から、本開示のポリマー中の分岐型ポリアルキレングリコールの数平均分子量と、当該ポリマー中のポリヒドロキシアルカン酸の数平均分子量との比は、１：１～１：８であることが好ましく、１：１～１：６．５であることがより好ましく、１：１．５～１：６であることがさらに好ましく、１：１．５～１：５．５であることが特に好ましい。
　本開示のポリマーの数平均分子量は、本開示の効果が奏される限りにおいて特に制限されず、例えば２００００～１０００００であってもよい。本開示の微小カプセル内に薬物を安定に保持し得る観点、及び本開示の微小カプセルに優れた薬物徐放性を付与し得る観点から、本開示のポリマーの数平均分子量は、２００００～８００００であることが好ましく、３００００～７００００であることがより好ましく、３５０００～６５０００であることがさらに好ましく、４００００～６００００であることが特に好ましい。
　なお、本開示のポリマー中ポリヒドロキシアルカン酸鎖一鎖あたりのポリヒドロキシアルカン酸モノマーのユニット数、本開示のポリマーの数平均分子量、当該ポリマー中の分岐型ポリアルキレングリコールの数平均分子量、当該ポリマー中のポリヒドロキシアルカン酸の数平均分子量、及びポリヒドロキシアルカン酸が共重合体である場合の各モノマーのモル比等は、公知の方法により測定できる。このような方法として、例えば１ＨＮＭＲを用いた方法や、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）で測定したポリスチレンやポリメタクリ酸メチル（ＰＭＭＡ）換算の分子量として求める方法等が挙げられる。
　１ＨＮＭＲを用いた、ポリマーの一般的な分析方法を、以下に詳述する：
まず、当該ポリマーの１ＨＮＭＲチャートから、プロトン１個あたりのピーク面積を算出する。プロトン１個あたりのピーク面積は、ある置換基のプロトンに由来するピークの面積総和を、当該基に含まれるプロトンの数で除することで算出される。なお、このとき当該基として、当該モノマー１分子中の存在量が予めわかっているものを選択する；
次に、その他のモノマーユニット数を算出する。モノマーユニット数は、当該モノマーユニットのプロトンに由来するピークの面積総和を、当該モノマーユニットに含まれるプロトンの数で除した後、先に算出したプロトン１個あたりのピーク面積で除することで算出される；
モノマーユニット数が求まれば、当該ポリマーを構成するモノマーの分子量及び繰り返し部分以外の部分の分子量は既知であるため、当該ポリマー全体の数平均分子量、及び各繰り返し部分の数平均分子量等を算出できる。
　また、ＧＰＣを用いたポリマーの一般的な分析方法を、以下に詳述する：
まず、当該ポリマーをクロロホルム等の溶媒に溶解させ、フィルターろ過して試料溶液とする。ＧＰＣ用カラムを備えた高速液体クロマトグラフを使用して、当該試料溶液を注入し、一定の温度に調整されたカラムにより分離して、示差屈折率計にて検出する。数平均分子量は、データ解析用ワークステーション等を用いて測定することが可能であり、標準ポリスチレンやポリメタクリ酸メチルの分子量とカラム溶出時間の関係から得られる検量線を用いる等の方法により算出できる。
　本開示のポリマーも、上記一般的な分析方法に準じて、又は上記一般的な方法から当業者が容易に想到可能な方法によって、分析することができる。
　本開示のポリマーの好ましい一態様として、４又は８分岐型ポリエチレングリコールと、乳酸・グリコール酸共重合体とが結合した化学構造を有し、かつ当該ポリマー中、ポリヒドロキシアルカン酸鎖一鎖あたりの、ポリヒドロキシアルカン酸モノマーのユニット数が５０～２３０であるポリマーが挙げられる。当該ポリマー中、ポリヒドロキシアルカン酸鎖一鎖あたりの、ポリヒドロキシアルカン酸モノマーのユニット数は７０～２２０であることが好ましく、８０～２１０であることがより好ましく、９０～２０５であることがさらに好ましく、１００～２００であることが特に好ましい；また当該ポリマーにおいて、前記ポリエチレングリコールの、当該ポリマー中での数平均分子量は、３０００～３００００であることが好ましく、５０００～２００００であることがより好ましく、７０００～１５０００であることがさらに好ましく、８０００～１３０００であることが特に好ましい；さらに、当該ポリマーにおいて、前記乳酸・グリコール酸共重合体の、当該ポリマー中での数平均分子量は、２００００～７００００であることが好ましく、２００００～６００００であることがより好ましく、２５０００～５５０００であることがさらに好ましく、３００００～５００００であることが特に好ましい；さらに、当該ポリマーにおいて、当該乳酸・グリコール酸共重合体に含有されるグリコール酸１モルに対する、当該乳酸・グリコール酸共重合体に含有される乳酸のモル数の比は、２～８であることが好ましく、３～６であることがより好ましく、３～５であることが特に好ましい。
　本開示のポリマーの好ましい一態様は、下記式（Ｉ）で表されるポリマーである。当該ポリマーは、４分岐型ポリエチレングリコールと、乳酸・グリコール酸共重合体とが結合した化学構造を有するポリマーである。
式（Ｉ）中、ｋ、ｍ、ｎ、ｐは、互いに独立して、１６～１７０の自然数であり、２８～１１０であることが好ましく、３９～８４であることがより好ましく、４５～７３であることがさらに好ましい。例えば、当該ポリマーを構成する４分岐型ポリエチレングリコールの分子量が３００００である場合、ｋ、ｍ、ｎ、及びｐの平均は約１７０である。なお、当該値は［（３００００－１３２）／４４］／４の計算式により算出される（３００００：４分岐型ポリエチレングリコールの分子量、１３２：分岐部分Ｃ（ＣＨ２Ｏ）４の分子量、４４：ＣＨ２ＣＨ２Ｏの分子量、４：分岐数）。同様に、当該ポリマーを構成する４分岐型ポリエチレングリコールの分子量が３０００である場合、ｋ、ｍ、ｎ、及びｐの平均は約１６であり、当該ポリマーを構成する４分岐型ポリエチレングリコールの分子量が１００００である場合、ｋ、ｍ、ｎ、及びｐの平均は約５６である。
　Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４は、互いに独立して、下記式（ＩＩ）で表される基である。
式（ＩＩ）中、ｓは１９～１９３の自然数であり、２５～１８９であることが好ましく、２７～１８４であることがさらに好ましい。また、ｔは３～１１５の自然数であり、４～７４であることが好ましく、５～５５であることがさらに好ましい。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４それぞれのｓは、同一であっても、互いに異なっていてもよい。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、及びＸ４それぞれのｔは、同一であっても、互いに異なっていてもよい。なお、角カッコ（［］：ｂｒａｃｋｅｔｓ）で囲んだ部分は、丸カッコ（（）：ｐａｒｅｎｔｈｅｓｅｓ）で囲んだモノマー単位がランダム重合していることを意味する（以下、本明細書において同様である）。
　上記式（ＩＩ）は、下記式（ＩＩＩ）であることがより好ましい。
式（ＩＩＩ）中、ｖは９～９７の自然数であり、１２～９５であることが好ましく、１３～９２であることがさらに好ましい。また、ｗは１～５８の自然数であり、２～３７であることが好ましく、２～２８であることがさらに好ましい。
　上記ポリマー中、ポリヒドロキシアルカン酸鎖一鎖あたりの、ポリヒドロキシアルカン酸モノマーのユニット数は、各鎖のｓ＋ｔの値の数平均値で表される。したがって、本開示の技術においてｓ＋ｔは３５～２３３であり、５０～２３０であることが好ましい。例えば、仮に上記ポリマーの構造中のポリヒドロキシアルカン酸のユニット数が５０であれば、各ポリヒドロキシアルカン酸鎖のｓ＋ｔの値の数平均は５０である。
　本開示のポリマーの好ましい一態様は、下記式（ＩV）で表されるポリマーである。当該ポリマーは、ｒが４のとき、８分岐型ポリエチレングリコールと、乳酸・グリコール酸共重合体とが結合した化学構造を有するポリマーとなる。
式（ＩＶ）中、ｋ、ｍ、ｎ、ｐ、及びｑは、それぞれ、かつ各繰り返しで互いに独立して、７～８４の自然数であり、１０～５６であることが好ましく、１２～４１であることがより好ましく、１３～３６であることがさらに好ましい。式（ＩＶ）中、ｒは１～６の自然数である。前記範囲の上限又は下限は、１、２、３、４、５、又は６であってもよい。
　例えば、上記ｒが４であり、当該ポリマーを構成する８分岐型ポリエチレングリコールの分子量が３００００である場合、ｋ、ｍ、ｎ、ｐ、及びｑの平均は約８４である。なお、当該値は［（３００００－４５４）／４４］／８の計算式により算出される（３００００：８分岐型ポリエチレングリコールの分子量、４５４：下式
で表される分岐部分の分子量、４４：ＣＨ２ＣＨ２Ｏの分子量、８：分岐数）。同様に、上記ｒが４であり、当該ポリマーを構成する８分岐型ポリエチレングリコールの分子量が３０００である場合、ｋ、ｍ、ｎ、ｐ、及びｑの平均は約７であり、上記ｒが４であり、当該ポリマーを構成する８分岐型ポリエチレングリコールの分子量が１００００である場合、ｋ、ｍ、ｎ、ｐ、及びｑの平均は約２７である。
　Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５は、それぞれ、かつ各繰り返しで互いに独立して、下記式（ＩＩ）で表される基である。
式（ＩＩ）中、ｓは１０～９６の自然数であり、１２～９５であることが好ましく、１４～９２であることがさらに好ましい。また、ｔは２～５８の自然数であり、２～３７であることが好ましく、３～２７であることがさらに好ましい。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５それぞれのｓは、同一であっても、互いに異なっていてもよい。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４及びＸ５それぞれのｔは、同一であっても、互いに異なっていてもよい。
　上記式（ＩＩ）は、下記式（ＩＩＩ）であることがより好ましい。
式（ＩＩＩ）中、ｖは５～４８の自然数であり、６～４８であることが好ましく、７～４６であることがより好ましい。また、ｗは１～２９の自然数であり、１～１９であることが好ましく、１～１４であることがより好ましい。
Ａ－４．　本開示のポリマーの製造方法
　ポリアルキレングリコールとポリヒドロキシアルカン酸の結合は、従来公知の方法又は従来公知の方法から容易に想到可能な方法により行うことができる。例えば、ポリアルキレングリコール鎖の末端ヒドロキシ基を起点にヒドロキシアルカン酸を重合する方法、及び、ポリアルキレングリコールとポリヒドロキシアルカン酸とを縮合反応で結合する方法等が挙げられる。より具体的には、例えばポリアルキレングリコールの存在下で、ラクチド等のヒドロキシアルカン酸の環状エステル中間体を、オクチル酸スズ等の触媒を用いて減圧下で開環重合させることにより、本開示のポリマーを得ることができる。また、重合反応を行うための有機溶媒中での加熱還流において条件を調整することにより、反応系から水分及び低分子化合物等を除去する方法、並びに、重合反応終了後に触媒を失活させて解重合反応を抑制する方法等も、当該技術分野において公知である。例えば、得られた重合体を減圧下で熱処理をすると、未反応の環状エステル中間体を昇華させて除去することができる。さらに具体的には、本開示のポリマーは、例えば国際公開第２０１８／０６２４６４号（特許文献２）に記載の方法に準じて、又は前記特許文献２に記載の方法を適宜改変して、調製することができる。
Ａ－５．　本開示のポリマーの性質
　本開示のポリマーは、本開示の微小カプセル内に薬物を安定に保持し得て、また、本開示の微小カプセルに優れた薬物徐放性を付与し得る。薬物の安定性及び薬物徐放性は、従来公知の方法又は従来公知の方法から容易に想到可能な方法により評価し得る。例えば薬物がタンパク質である場合、ＢＣＡ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法、又はＬｏｗｒｙ法等により微小カプセルを含む組成物中の総タンパク質量を定量し、また、ＥＬＩＳＡ法等により前記組成物中の活性タンパク質量を定量することで、［活性タンパク質量／総タンパク質量］×１００の計算式により活性維持率（％）を算出することができる。また、薬物徐放性は、例えば放出試験液に微小カプセルを含む組成物を混合し、当該放出試験液中に放出された薬物量を経時的に定量することにより、評価され得る。
Ｂ．　本開示の微小カプセル
Ｂ－１．　定義
　本開示において「微小カプセル」との用語は、ナノメートル単位からマイクロメートル単位程度の平均粒径を有する粒子を意味する。この限りにおいて本開示の微小カプセルの平均粒径は特に制限されず、例えば１０ｎｍ～１０００μｍ程度であってもよく、５０ｎｍ～１００μｍ程度であってもよく、１００ｎｍ～５０μｍ程度であってもよく、１μｍ～１０μｍ程度であってもよい。なお、本開示において平均粒径とは、個々の粒子の最大直径の平均を意味するものとする。一般的に平均粒径は、レーザー回折散乱法、動的光散乱法、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）による画像解析法、又はふるい分け試験等によって測定され得る。特に本開示において平均粒径とは、レーザー回折散乱法によって測定された体積基準の平均粒径を意味するものとする。
　微小カプセルの平均粒径は、従来公知の方法又は従来公知の方法から当業者が容易に想到可能な方法により、調整され得る。例えば、Ｗ／Ｏエマルション又はＷ／Ｏ／Ｗエマルションを調製する際に用いる乳化膜の細孔径を変えることにより、微小カプセルの平均粒径を調整し得る。あるいは、Ｗ／Ｏエマルション又はＷ／Ｏ／Ｗエマルションを調製する際に用いる撹拌機の撹拌速度を変えることにより、微小カプセルの平均粒径を調整し得る。　
　後述する通り、本開示の微小カプセルの製造方法の好ましい一態様として、本開示のポリマーを含む油相溶液と、薬物を含む水相溶液とをそれぞれ調製した後、両者を混合してＷ／Ｏエマルションを調製する方法が挙げられる。当該Ｗ／Ｏエマルションに含まれる個々の乳化粒子は、本開示の微小カプセルに好ましく包含される。また、当該Ｗ／Ｏエマルションを乾燥させると、前記乳化粒子の内相及び外相中の揮発性成分が揮発して、薬物を内包するカプセル状の構造体を含む乾燥物が得られる。当該乾燥物中のカプセル状の構造体も、本開示の微小カプセルに好ましく包含される。
　特に制限されないが、本開示の微小カプセルの好ましい一態様において、本開示のポリマーは膜に含まれ、当該膜に囲まれた空間に薬物が内包されている。ここで、前記「膜」とは上記Ｗ／Ｏエマルション中で個々の乳化粒子の内相と外相とを隔てる部分を指す。
Ｂ－２．　薬物
　本開示の微小カプセルに内包される薬物は、セツキシマブ、ベバシズマブ、ファリシマブ、ラニビズマブ、及びブロルシズマブからなる群より選択される少なくとも一種である。セツキシマブは抗ＥＧＦＲ抗体、ベバシズマブは抗ＶＥＧＦ抗体、ファリシマブは抗ＶＥＧＦと抗Ａｎｇ－２の二重特異性抗体、ブロルシズマブは抗ＶＥＧＦ抗体の一本鎖フラグメント断片としての機能が知られている。ラニビズマブは抗ＶＥＧＦ抗体のＦａｂ断片である。これらの薬物、特に抗ＶＥＧＦ抗体及びその断片は、加齢黄斑変性等の治療に用いられる薬物である。特に制限されないが、本開示の微小カプセルに内包される薬物は、ラニビズマブであることが特に好ましい。
　上述した薬物の中には、容易に分解、変性、又は変質し、生理活性を失い得るものが含まれる。本開示の技術によれば、そのような薬物であっても製剤中で活性を維持し得る。なお、薬物が活性を維持しているか否かは、従来公知の方法又は従来公知の方法から容易に想到可能な方法により評価し得る。例えば薬物がタンパク質である場合、ＢＣＡ法、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法、又はＬｏｗｒｙ法等により製剤中の総タンパク質量を定量し、また、ＥＬＩＳＡ法等により製剤中の活性タンパク質量を定量することで、［活性タンパク質量／総タンパク質量］×１００の計算式により活性維持率（％）を算出することができる。
Ｂ－３．　本開示の微小カプセルの製造方法
　本開示の微小カプセルは、従来公知の方法又は従来公知の方法から容易に想到可能な方法により製造できる。具体的には例えば、エマルション溶媒蒸発法、相分離法、相転移法、高分子球形晶析法（球形造粒法（ＳＡ法）、エマルション溶媒拡散法（ＥＳＤ法）を含む）等の方法が挙げられる。各方法に応じて、用いる溶媒は適宜選択され得る。
　例えばエマルション溶媒蒸発法を用いて本開示の微小カプセルを製造する場合、本開示のポリマーを含む油相溶液と、薬物を含む水相溶液とを調製した後、両者を混合してＷ／Ｏエマルションを調製してもよい。混合は、マグネティックスターラー、プロペラ型撹拌機、タービン型撹拌機、ディスパーミキサー、ホモミキサー、超音波照射機、ホモジナイザー、又は多孔質膜を備えた膜乳化装置等を用いて行ってもよい。また、当該Ｗ／Ｏエマルションを乾燥させて内相及び外相中の揮発性成分を揮発させ、乾燥物としてもよい。
　前記油相溶液は、水非混和性有機溶媒を含むことが好ましい。本開示において「水非混和性有機溶媒」とは、水への溶解度が３０ｇ（水非混和性有機溶媒）／１００ｍＬ（水）以下である有機溶媒を指すものとする。本開示の微小カプセルの製造に用いられる水非混和性有機溶媒の水への溶解度は、０．１ｇ（水非混和性有機溶媒）／１００ｍＬ（水）以下であることがより好ましい。また、特に制限されないが、本開示の微小カプセルの製造に用いられる水非混和性有機溶媒は、揮発性を有するものが好ましく、より詳細には凍結乾燥又は噴霧乾燥等により揮発させて除去できるものが好ましい。このような水非混和性有機溶媒として具体的には、酢酸エチル、酢酸イソプロピル、酢酸ブチル、炭酸ジメチル、炭酸ジエチル、ジクロロメタン、及びトリクロロメタン等が挙げられる。これらのなかでも、ジクロロメタンが特に好ましい。
　前記油相溶液及び水相溶液には、さらにその他の成分を含んでもよい。例えば、薬学的に許容可能な基剤、担体、賦形剤、本開示のポリマー以外のポリマー、希釈剤、界面活性剤、防腐剤、ｐＨ調整剤、アジュバント、キレート剤等を、単独で又は２種以上を組み合わせて含有し得る。
　本開示のポリマー以外のポリマーとして例えば、ポリアルキレングリコール、ポリヒドロキシアルカン酸、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリエチレンイミン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリ－１，３－ジオキソラン、２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンポリマー、及びポリ－１，３，６－トリオキサン、並びに多糖類等が挙げられる。本開示のポリマー以外のポリマーは、単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
　界面活性剤として例えばノニオン界面活性剤が挙げられ、具体的には、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル類、ポリオキシアルキレングリコール類、ポリオキシアルキレン脂肪酸エステル類、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸エステル類、ポリオキシアルキレンソルビット脂肪酸エステル類、ポリオキシアルキレングリセリン脂肪酸エステル類、ポリオキシアルキレン脂肪酸アミド類、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸エステル類、ポリオキシアルキレンヒマシ油誘導体、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油以外のポリオキシアルキレン硬化ヒマシ油誘導体、ポリグリセリン脂肪酸エステル類、モノグリセリン脂肪酸エステル類、ソルビタン脂肪酸エステル類、ソルビット脂肪酸エステル類、アルキレングリコール脂肪酸エステル類、アルキルポリグリコシド、糖脂肪酸エステル類（ショ糖脂肪酸エステル類、マルトース脂肪酸エステル類、ラクトース脂肪酸エステル類等）、脂肪酸アルカノールアミド類、セバシン酸ジエチル等が挙げられる。本開示の技術において好ましいノニオン界面活性剤として、ソルビタン脂肪酸エステル類の一種であるソルビタンモノオレアートが挙げられる。また、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、及びステアリル硫酸ナトリウム等のアルキル硫酸塩、並びにレシチン及びその誘導体等も、好ましく例示される。界面活性剤は、単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
　防腐剤として例えば、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベン等のパラベン類、安息香酸ナトリウム、フェノキシエタノール、塩酸アルキルジアミノエチルグリシン等が挙げられる。防腐剤は、単独で又は２種以上を組み合わせて使用することができる。
　ｐＨ調整剤として例えば、クエン酸、リン酸、リンゴ酸、ピロリン酸、乳酸、酒石酸、グリセロリン酸、酢酸、硝酸、及びこれらの化学的に可能な塩や水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等が挙げられる。
Ｃ．　本開示の組成物
　本開示は、本開示の微小カプセルを含む組成物をも包含する。当該組成物を、「本開示の組成物」と称することがある。本開示の微小カプセルについて記載した事項は、本開示の組成物に援用される。本開示の組成物は、本開示の微小カプセルそのものであってもよく、本開示の微小カプセルにその他の成分を混合したものであってもよい。本開示の効果が奏される限りにおいて混合され得る成分は制限されず、例えば「Ｂ－３．　本開示の微小カプセルの製造方法」の項に記載した成分が好ましく例示される。さらに、本開示の微小カプセルを含むＷ／Ｏエマルションを、別の水相に分散させ、Ｗ／Ｏ／Ｗエマルションとしてもよい。
　本開示の組成物の剤型は特に制限されず、例えばスフェア状、シート状、ニードル状、ロッド状、又はコイル状であってもよい。これらの剤型のなかでも、マイクロスフェアであることが特に好ましい。なお本開示において「マイクロスフェア」とは、ポリマー及び薬物を含み、平均粒径が１～１００μｍ程度の球状組成物を指すものとする。また、ナノパーティクル、マイクロパーティクル、ナノスフェア、及びマイクロカプセルも、本開示の組成物の剤型として好ましく例示される。
　本開示の組成物は、好ましくは徐放性医薬組成物である。本開示の組成物においては薬物が本開示の微小カプセルに内包されているために、当該薬物が安定に保持され得る。また、本開示の組成物においては薬物が本開示の微小カプセルに内包されているために、本開示の組成物は薬物徐放性を有し得る。このため、本開示の組成物を対象に適用した場合には、当該対象の体内で本開示の組成物から薬物が徐々に放出され、持続的な効果が奏されることが期待される。
　本開示の組成物の適用対象としては、例えば、ヒト、ヒト以外の哺乳動物（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ヒツジ、サル等）等が挙げられ、なかでもヒトであることが好ましい。
　本開示の組成物は、セツキシマブ、ベバシズマブ、ファリシマブ、ラニビズマブ、及びブロルシズマブからなる群より選択される少なくとも一種の薬物を内包する微小カプセルを含有する。これらの薬物、特に抗VEGF抗体は加齢黄斑変性等の治療に用いられる薬物である。したがって本開示の組成物は、加齢黄斑変性の改善・治療等に好適に用いられる。なお本開示において「加齢黄斑変性の改善」又は「加齢黄斑変性の治療」との用語には、加齢黄斑変性と診断された対象に適用することにより、加齢黄斑変性の進行を抑制すること、加齢黄斑変性の進行を停止させること、病変部位を縮小させること、及び病変部位を消滅させること等が包含される。
　本開示の組成物の、対象への適用方法は、本開示の効果が奏される限りにおいて特に制限されない。例えば、本開示の組成物を硝子体内等の局所に注射で直接投与してもよく、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、胸膜内等に注射又は点滴で投与してもよく、カテーテルを介する潅流によって投与してもよく、皮膚・粘膜・組織等に貼付してもよい。本開示の組成物は、対象の硝子体内へ注射で直接投与されることが、特に好ましい。
　本開示の組成物の投与頻度は特に制限されない。例えば1日に1回若しくは複数回、1週間に1回若しくは複数回、1ヶ月に1回若しくは複数回、又は、1年に1回若しくは複数回、適用され得る。また、本開示の組成物の投与期間も本開示の効果が奏される限りにおいて特に制限されない。さらに、本開示の組成物の用量も、本開示の効果が奏される限りにおいて特に制限されない。適用頻度、適用期間、及び用量は、対象の状態及び治療経過等に応じて、当業者によって適宜調整され得る。
　本開示の組成物は、加齢黄斑変性を有する対象に適用され得る他の医薬組成物及び／又は治療方法等と任意に組み合わせられてもよい。本開示の組成物が、他の医薬組成物及び／又は治療方法等と組み合わせられる場合、それらは同時に対象に適用されてもよく、それぞれ別に任意の時点で適用されてもよい。
　なお、本明細書において「含む」とは、「含有する」の他に、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（Ｔｈｅ　ｔｅｒｍ　“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”　ｉｎｃｌｕｄｅｓ　“ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ　ｏｆ”　ａｎｄ　”ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ　ｏｆ．“）。また、本開示は、本明細書に説明した構成要件の任意の組み合わせを全て包含する。
　また、上述した本開示の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本開示に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本開示には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。
　以下、例を示して本開示の実施形態をより具体的に説明するが、本開示の実施形態は下記の例に限定されるものではない。なお、以下特に断らない限り、「分子量」とは数平均分子量を指すものとする。また、「ＰＥＧ」とはポリエチレングリコールを、「ＰＬＧＡ」とは乳酸・グリコール酸共重合体を、それぞれ指すものとする。さらに、「ＬＡ：ＧＡ」は乳酸・グリコール酸共重合体中の乳酸モノマーユニットとグリコール酸モノマーユニットとのモル比を示す。「ＰＬＧＡユニット数」は、当該ポリマーのＰＥＧ鎖一鎖あたりのＰＬＧＡユニット数を指すものとする。
　なお、以下の実施例において、各種ＰＥＧ－ＰＬＧＡポリマーは、国際公開第２０１８／０６２４６４号（特許文献２）に記載の方法に準じて調製した。
１．　試験１　ポリマーによる安定性（製造時）：４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡとＰＬＧＡとの比較
　まず本発明者らは、ポリマーとして４分岐型ポリエチレングリコールと乳酸・グリコール酸共重合体とが結合した化学構造を有するポリマー（以降、「４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡ」と表記することがある）又は乳酸・グリコール酸共重合体（以降、「ＰＬＧＡ」と表記することがある）を用い、マイクロスフェアに内包される薬物の製造時の安定性を評価した。本試験においては、４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡとしてポリマー全体の分子量が５０ｋＤａ、ＰＥＧ部分の分子量が１０ｋＤａ、ＰＬＧＡ部分の分子量が４０ｋＤａ、ＬＡ：ＧＡ＝８：２のものを用いた。当該ポリマーのＰＥＧ鎖一鎖あたりのＰＬＧＡユニット数は約１６０である。当該４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを、４ＰＥＧ（１０ｋＤａ）－ＰＬＧＡ（４０ｋＤａ）と表記することがある。また、ＰＬＧＡとして、分子量４５ｋＤａの「Ｒｅｓｏｍｅｒ　ＲＧ５０４、７３９９４４、ＬＡ：ＧＡ＝１：１」（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いた。当該ＰＬＧＡをＰＬＧＡ（４５ｋＤａ）と表記することがある。マイクロスフェアに内包させる薬物としては、セツキシマブを用いた。本試験の詳細を以下に記す。
１．１　４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いた評価（実施例１）
１．１．１　マイクロクロスフェア調製
　ジクロロメタン２０ｍＬにＳｐａｎ（登録商標）８０　０．０５ｇ及び４ＰＥＧ（１０ｋＤａ）－ＰＬＧＡ（４０ｋＤａ）　０．５ｇを加え溶解させた（油相溶液）。油相溶液に０．５％セツキシマブ溶液（アービタックス（登録商標）注射液１００ｍｇ、メルク株式会社）１ｍＬを加え、ホモジナイザーを用いて９５００ｒｐｍで１分間乳化した。乳化後、スプレードライヤー（ミニスプレードライヤーＢ－２９０、日本ビュッヒ株式会社）で噴霧乾燥（二流体ノズルφ１．４、Ｎ２フロー３０ｍｍ、温度１０～１５℃）し、白色粒子状のセツキシマブ内包マイクロスフェアを得た。
１．１．２　走査型電子顕微鏡による観察
　１．１．１で得たセツキシマブ内包マイクロスフェアを、走査型電子顕微鏡（ＪＳＭ－ＩＴ３００、日本電子株式会社）にて観察した。観察に供した試料には事前にパラジウム－金コーティングを施した。観察画像を図１に示す。
１．１．３　ＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙによる総セツキシマブ量の測定
　１．１．１で得たセツキシマブ内包マイクロスフェア１０ｍｇをジメチルスルホキシド１ｍＬに溶解した。この液１００μＬにＰＢＳを加えて全量を１０ｍＬとし、試料溶液とした。また、アービタックス（登録商標）注射液１００ｍｇをＰＢＳで希釈し、０．１～１０μｇ／ｍＬの検量線溶液を調製した。
　総セツキシマブ量の測定にはＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙを用いた。９６ｗｅｌｌプレートの各ウェルに、試料溶液又は検量線溶液１００μＬを添加し、そこへＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に添付のプロトコールに従って調製したＷｏｒｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ　１００μＬを添加した。プレートを３０秒間撹拌した後、６０℃で１時間インキュベートした。発色を目視で確認した後、マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ　ＨＴＸマルチモードプレートリーダー、ＢｉｏＴｅｋ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，　Ｉｎｃ．）にて波長５６２ｎｍの吸光度を測定した。前記吸光度から算出された総セツキシマブ量を表１に示す。
１．１．４　ＥＬＩＳＡによる活性セツキシマブ量の測定
　１．１．１で得たセツキシマブ内包マイクロスフェア５ｍｇを、ジメチルスルホキシド１ｍＬに溶解した。この液１００μＬにＰＢＳを加えて全量を１０ｍＬとし、試料溶液とした。また、アービタックス（登録商標）注射液１００ｍｇをＰＢＳで希釈し、２～２００ｎｇ／ｍＬの検量線溶液を調製した。
　活性セツキシマブ量の測定にはＥＬＩＳＡを用いた。まず、９６ｗｅｌｌイムノプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ　Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ　Ｐｌａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に１００ｎｇ／ｍＬヒトＥＧＦＲ溶液を１００μＬ添加し、シェーカーで１分間撹拌後、３７℃で１時間静置した。静置後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０含有ＰＢＳ）を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、各ウェルに１％ＢＳＡ溶液を２００μＬ添加し、室温で１時間振盪した。振盪後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。
　洗浄後、各ウェルに試料溶液又は検量線溶液を１００μＬ添加し、室温で２時間振盪した。振盪後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、２次抗体溶液（Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）溶液）を１００μＬ添加し、室温で１時間振盪した。振盪後、２次抗体溶液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、ＡＢＴＳ　Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＳｅｒａＣａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｉｎｃ．）１００μＬを加え、室温で１５分振盪した。発色を目視で確認した後、ＡＢＴＳ　Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　Ｓｔｏｐ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＳｅｒａＣａｒｅ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，　Ｉｎｃ．）１００μＬを加え、マイクロプレートリーダーにて波長４０５ｎｍの吸光度を測定した。前記吸光度から算出された活性セツキシマブ量を表１に示す。また、［活性セツキシマブ量／総セツキシマブ量］×１００の計算式で算出される活性維持率（％）も、表１に示す。
１．２　ＰＬＧＡを用いた評価（比較例１）
１．２．１　マイクロスフェア調製
　ジクロロメタン２０ｍＬにＳｐａｎ８０　０．０５ｇ及びＰＬＧＡ（４５ｋＤａ）　０．５ｇを加え溶解させた（油相溶液）。油相溶液に０．５％セツキシマブ溶液１ｍＬを加え、ホモジナイザーを用いて９５００ｒｐｍで１分間乳化した。乳化後、スプレードライヤーで噴霧乾燥（乾燥条件は１．１と同様）し、白色粒子状のセツキシマブ内包マイクロスフェアを得た。
１．２．２　走査型電子顕微鏡による観察
　１．２．１で得たセツキシマブ内包マイクロスフェアを、１．１．２と同様の手順で観察した。観察画像を図２に示す。
１．２．３　ＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙによる総セツキシマブ量の測定
　１．２．１で得たセツキシマブ内包マイクロスフェアについて、１．１．３と同様の手順で総セツキシマブ量を測定した。測定された総セツキシマブ量を表１に示す。
１．２．４　ＥＬＩＳＡによる活性セツキシマブ量の測定
　１．２．１で得たセツキシマブ内包マイクロスフェアについて、１．１．４と同様の手順で活性セツキシマブ量を測定した。測定された活性セツキシマブ量を表１に示す。また、［活性セツキシマブ量／総セツキシマブ量］×１００の計算式で算出される活性維持率（％）も、表１に示す。
１．３　小括
　表１に示す通り、マイクロスフェア調製時のポリマーとしてＰＬＧＡを用いた比較例１においては、当該マイクロスフェアから活性を維持したセツキシマブは検出されず、活性維持率は０％であった。一方、マイクロスフェア調製時のポリマーとして４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いた実施例１においては、８４．６％もの高い活性維持率が得られた。
　本試験から、薬物内包マイクロスフェアを調製する場合、ポリマーとしてＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いる方が、ＰＬＧＡを用いるよりも、高い薬物安定性が得られる可能性が示唆された。
２．　試験２　ＰＥＧ－ＰＬＧＡの分岐数による安定性（製造時）：分岐数の比較
　試験１の結果を受け本発明者らは、ＰＥＧ－ＰＬＧＡの分岐数が、マイクロスフェアに内包される薬物の安定性に影響するか否かを検討した。本試験では、ポリマーとして単分岐、２分岐、４分岐、又は８分岐のＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いてベバシズマブ内包マイクロスフェアを調製した後、調製した各マイクロスフェアについて内包されるベバシズマブの安定性を評価した。単分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡとしてポリマー全体の分子量が５０ｋＤａ、ＰＥＧ部分の分子量が１０ｋＤａ、ＰＬＧＡ部分の分子量が４０ｋＤａ、ＬＡ：ＧＡ＝８：２のものを用いた。当該ポリマーのＰＥＧ鎖一鎖あたりのＰＬＧＡユニット数は約６４０である。当該単分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを、１ＰＥＧ（１０ｋＤａ）－ＰＬＧＡ（４０ｋＤａ）と表記することがある。２分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡとしてポリマー全体の分子量が５０ｋＤａ、ＰＥＧ部分の分子量が１０ｋＤａ、ＰＬＧＡ部分の分子量が４０ｋＤａ、ＬＡ：ＧＡ＝８：２のものを用いた。当該ポリマーのＰＥＧ鎖一鎖あたりのＰＬＧＡユニット数は約３２０である。当該２分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを、２ＰＥＧ（１０ｋＤａ）－ＰＬＧＡ（４０ｋＤａ）と表記することがある。４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡとして試験１に記載の４ＰＥＧ（１０ｋＤａ）－ＰＬＧＡ（４０ｋＤａ）を用いた。８分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡとしてポリマー全体の分子量が５０ｋＤａ、ＰＥＧ部分の分子量が１０ｋＤａ、ＰＬＧＡ部分の分子量が４０ｋＤａ、ＬＡ：ＧＡ＝８：２のものを用いた。当該ポリマーのＰＥＧ鎖一鎖あたりのＰＬＧＡユニット数は約８０である。当該８分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを、８ＰＥＧ（１０ｋＤａ）－ＰＬＧＡ（４０ｋＤａ）と表記することがある。本試験の詳細を以下に記す。
２．１　４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いた評価（実施例２）
２．１．１　マイクロスフェア調製
　ジクロロメタン１０ｍＬにＳｐａｎ８０　０．０２５ｇ及び４ＰＥＧ（１０ｋＤａ）－ＰＬＧＡ（４０ｋＤａ）　０．２５ｇを加え溶解させた（油相溶液）。油相溶液に２．５％ベバシズマブ溶液（ベバシズマブＢＳ点滴静注１００ｍｇ「ファイザー」（ファイザー株式会社）をそのまま使用）０．１ｍＬを加え、ホモジナイザーを用いて２０５００ｒｐｍで１分間乳化した。乳化後、スプレードライヤーで噴霧乾燥（二流体ノズルφ１．４、Ｎ２フロー３０ｍｍ、温度１０～１５℃）し、白色粒子状のベバシズマブ内包マイクロスフェアを得た。
２．１．２　走査型電子顕微鏡による観察
　２．１．１で得たベバシズマブ内包マイクロスフェアを、走査型電子顕微鏡（ＪＳＭ－ＩＴ３００、日本電子株式会社）にて観察した。観察に供した試料には事前にパラジウム－金コーティングを施した。観察画像を図３に示す。
２．１．３　ＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙによる総ベバシズマブ量の測定
　２．１．１で得たベバシズマブ内包マイクロスフェア５ｍｇを、ジメチルスルホキシド／ＰＢＳ（７：３混液）１ｍＬに溶解した。この液１００μＬにＰＢＳを加えて全量を１０ｍＬとし、試料溶液とした。また、ベバシズマブＢＳ点滴静注１００ｍｇ「ファイザー」をＰＢＳで希釈し、０．１～２０μｇ／ｍＬの検量線溶液を調製した。
　総ベバシズマブ量の測定にはＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙを用いた。９６ｗｅｌｌプレートの各ウェルに、試料溶液又は検量線溶液１００μＬを添加し、そこへＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に添付のプロトコールに従って調製したＷｏｒｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ　１００μＬを添加した。プレートを３０秒間撹拌した後、３７℃で２時間インキュベートした。発色を目視で確認した後、マイクロプレートリーダーにて波長５６２ｎｍの吸光度を測定した。前記吸光度から算出された総ベバシズマブ量を表２に示す。
２．１．４　ＥＬＩＳＡによる活性ベバシズマブ量の測定
　２．１．１で得たベバシズマブ内包マイクロスフェア５ｍｇを、ジメチルスルホキシド／ＰＢＳ（７：３混液）１ｍＬに溶解した。この液をＰＢＳで１０００倍希釈し、試料溶液とした。また、ベバシズマブＢＳ点滴静注１００ｍｇ「ファイザー」をＰＢＳで希釈し、２～２００ｎｇ／ｍＬの検量線溶液を調製した。
　活性ベバシズマブ量の測定にはＥＬＩＳＡを用いた。まず、９６ｗｅｌｌイムノプレートに１００ｎｇ／ｍＬヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５溶液を１００μＬ添加し、シェーカーで１分間撹拌後、３７℃で１時間静置した。静置後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、各ウェルに１％ＢＳＡ溶液を２００μＬ添加し、室温で１時間振盪した。振盪後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。
　洗浄後、各ウェルに試料溶液又は検量線溶液を１００μＬ添加し、室温で２時間振盪した。振盪後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、２次抗体溶液を１００μＬ添加し、室温で１時間振盪した。振盪後、２次抗体溶液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、ＴＭＢ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）、（Ａｂｃａｍ．ｐｌｃ）１００μＬを加え室温で１５分振盪した。発色を目視で確認した後、１Ｎ　ＨＣｌ試液（富士フイルム和光純薬株式会社）１００μＬを加え、マイクロプレートリーダーにて波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。前記吸光度から算出された活性ベバシズマブ量を表２に示す。また、［活性ベバシズマブ量／総ベバシズマブ量］×１００の計算式で算出される活性維持率（％）も、表２に示す。
２．２　８分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いた評価（実施例３）
２．２．１　マイクロスフェア調製
　ジクロロメタン１０ｍＬにＳｐａｎ８０　０．０２５ｇ及び８ＰＥＧ（１０ｋＤａ）－ＰＬＧＡ（４０ｋＤａ）　０．２５ｇを加え溶解させた（油相溶液）。油相溶液に２．５％ベバシズマブ溶液０．１ｍＬを加え、ホモジナイザーを用いて２０５００ｒｐｍで１分間乳化した。乳化後、スプレードライヤーで噴霧乾燥し（乾燥条件は２．１．１と同様）、白色粒子状のベバシズマブ内包マイクロスフェアを得た。
２．２．２　走査型電子顕微鏡による観察
　２．２．１で得たベバシズマブ内包マイクロスフェアを、２．１．２と同様の手順で観察した。観察画像を図４に示す。
２．２．３　ＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙによる総ベバシズマブ量の測定
　２．２．１で得たベバシズマブ内包マイクロスフェアについて、２．１．３と同様の手順で総ベバシズマブ量を測定した。測定された総ベバシズマブ量を表２に示す。
２．２．４　ＥＬＩＳＡによる活性ベバシズマブ量の測定
　２．２．１で得たベバシズマブ内包マイクロスフェアについて、２．１．４と同様の手順で活性ベバシズマブ量を測定した。測定された活性ベバシズマブ量を表２に示す。また、［活性ベバシズマブ量／総ベバシズマブ量］×１００の計算式で算出される活性維持率（％）も、表２に示す。
２．３　単分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いた評価（比較例２）
２．３．１　マイクロスフェア調製
　ジクロロメタン１０ｍＬにＳｐａｎ８０　０．０２５ｇ及び１ＰＥＧ（１０ｋＤａ）－ＰＬＧＡ（４０ｋＤａ）　０．２５ｇを加え溶解させた（油相溶液）。油相溶液に２．５％ベバシズマブ溶液０．１ｍＬを加え、ホモジナイザーを用いて２０５００ｒｐｍで１分間乳化した。乳化後、スプレードライヤーで噴霧乾燥し（乾燥条件は２．１．１と同様）、白色粒子状のベバシズマブ内包マイクロスフェアを得た。
２．３．２　走査型電子顕微鏡による観察
　２．３．１で得たベバシズマブ内包マイクロスフェアを、２．１．２と同様の手順で観察した。観察画像を図５に示す。
２．３．３　ＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙによる総ベバシズマブ量の測定
　２．３．１で得たベバシズマブ内包マイクロスフェアについて、２．１．３と同様の手順で総ベバシズマブ量を測定した。測定された総ベバシズマブ量を表２に示す。
２．３．４　ＥＬＩＳＡによる活性ベバシズマブ量の測定
　２．３．１で得たベバシズマブ内包マイクロスフェアについて、２．１．４と同様の手順で活性ベバシズマブ量を測定した。測定された活性ベバシズマブ量を表２に示す。また、［活性ベバシズマブ量／総ベバシズマブ量］×１００の計算式で算出される活性維持率（％）も、表２に示す。
２．４　２分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いた評価（比較例３）
２．４．１　マイクロスフェア調製
　ジクロロメタン１０ｍＬにＳｐａｎ８０　０．０２５ｇ及び２ＰＥＧ（１０ｋＤａ）－ＰＬＧＡ（４０ｋＤａ）　０．２５ｇを加え溶解させた（油相溶液）。油相溶液に２．５％ベバシズマブ溶液０．１ｍＬを加え、ホモジナイザーを用いて２０５００ｒｐｍで１分間乳化した。乳化後、スプレードライヤーで噴霧乾燥し（乾燥条件は２．１．１と同様）、白色粒子状のベバシズマブ内包マイクロスフェアを得た。
２．４．２　走査型電子顕微鏡による観察
　２．４．１で得たベバシズマブ内包マイクロスフェアを、２．１．２と同様の手順で観察した。観察画像を図６に示す。
２．４．３　ＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙによる総ベバシズマブ量の測定
　２．４．１で得たベバシズマブ内包マイクロスフェアについて、２．１．３と同様の手順で総ベバシズマブ量を測定した。測定された総ベバシズマブ量を表２に示す。
２．４．４　ＥＬＩＳＡによる活性ベバシズマブ量の測定
　２．４．１で得たベバシズマブ内包マイクロスフェアについて、２．１．３と同様の手順で活性ベバシズマブ量を測定した。測定された活性ベバシズマブ量を表２に示す。また、［活性ベバシズマブ量／総ベバシズマブ量］×１００の計算式で算出される活性維持率（％）も、表２に示す。
２．５　小括
　表２に示す通り、マイクロスフェア調製時のポリマーとして４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いた実施例２、及び８分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いた実施例３においては、単分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いた比較例２、及び２分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いた比較例３よりも、高い活性維持率が得られた。
　本試験から、ＰＥＧ－ＰＬＧＡの分岐数が、マイクスフェアに内包される薬物の安定性に影響する可能性が示唆された。特に４分岐又は８分岐のＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いた場合に、高い薬物安定性が得られる可能性が示唆された。
３．　試験３　薬物違いの安定性の比較（製造時、使用ポリマー：４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡ）
　次に本発明者らは、ＰＥＧ－ＰＬＧＡマイクロスフェアに内包される薬物の種類によって、マイクロスフェア中での当該薬物の安定性に差が生じるか検討した。本試験では、ポリマーとして試験１及び２で用いた４ＰＥＧ（１０ｋＤａ）－ＰＬＧＡ（４０ｋＤａ）を用いてマイクロスフェアを調製した。マイクロスフェアに内包させる薬物として、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ファリシマブ、ブロルシズマブ、又はアフリベルセプトを用いた。本試験の詳細を以下に記す。
３．１　ベバシズマブでの評価
　ベバシズマブ内包マイクロスフェアは、２．１に記載の通り調製及び評価した。
３．２　ラニビズマブでの評価（実施例４）
３．２．１　マイクロスフェア調製
　ジクロロメタン１０ｍＬにＳｐａｎ８０　０．０２５ｇ及び４ＰＥＧ（１０ｋＤａ）－ＰＬＧＡ（４０ｋＤａ）　０．２５ｇを加え溶解させた（油相溶液）。油相溶液に０．５％ラニビズマブ溶液（ルセンティス（登録商標）硝子体内注射液１０ｍｇ／ｍＬ（ノバルティスファーマ株式会社）の２倍希釈溶液）０．１ｍＬを加え、ホモジナイザーを用いて２０５００ｒｐｍで１分間乳化した。乳化後、スプレードライヤーで噴霧乾燥（二流体ノズルφ１．４、Ｎ２フロー３０ｍｍ、温度１０～１５℃）し、白色粒子状のラニビズマブ内包マイクロスフェアを得た。
３．２．２　走査型電子顕微鏡による観察
　３．２．１で得たラニビズマブ内包マイクロスフェアを、走査型電子顕微鏡（ＪＳＭ－ＩＴ３００、日本電子株式会社）にて観察した。観察に供した試料には事前にパラジウム－金コーティングを施した。観察画像を図７に示す。
３．２．３　ＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙによる総ラニビズマブ量の測定
　３．２．１で得たラニビズマブ内包マイクロスフェア５ｍｇを、ジメチルスルホキシド／ＰＢＳ（７：３混液）１ｍＬに溶解した。この液１００μＬにＰＢＳを加えて全量を１０ｍＬとし、試料溶液とした。また、ルセンティス（登録商標）硝子体内注射液１０ｍｇ／ｍＬをＰＢＳで希釈し、０．１～２０μｇ／ｍＬの検量線溶液を調製した。
　総ラニビズマブ量の測定にはＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙを用いた。９６ｗｅｌｌプレートの各ウェルに、試料溶液又は検量線溶液１００μＬを添加し、そこへＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に添付のプロトコールに従って調製したＷｏｒｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ　１００μＬを添加した。プレートを３０秒間撹拌した後、３７℃で２時間インキュベートした。発色を目視で確認した後、マイクロプレートリーダーにて波長５６２ｎｍの吸光度を測定した。前記吸光度から算出された総ラニビズマブ量を表３に示す。
３．２．４　ＥＬＩＳＡによる活性ラニビズマブ量の測定
　３．２．１で得たラニビズマブ内包マイクロスフェア５ｍｇを、ジメチルスルホキシド／ＰＢＳ（７：３混液）１ｍＬに溶解した。この液をＰＢＳで１０００倍希釈し、試料溶液とした。また、ルセンティス（登録商標）硝子体内注射液１０ｍｇ／ｍＬをＰＢＳで希釈し、２～２００ｎｇ／ｍＬの検量線溶液を調製した。
　活性ラニビズマブ量の測定にはＥＬＩＳＡを用いた。まず、９６ｗｅｌｌイムノプレートに１００ｎｇ／ｍＬヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５溶液を１００μＬ添加し、シェーカーで１分間撹拌後、３７℃で１時間静置した。静置後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、各ウェルに１％ＢＳＡ溶液を２００μＬ添加し、室温で１時間振盪した。振盪後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。
　洗浄後、各ウェルに試料溶液又は検量線溶液を１００μＬ添加し、室温で２時間振盪した。振盪後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、２次抗体溶液を１００μＬ添加し、室温で１時間振盪した。振盪後、２次抗体溶液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、ＴＭＢ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　（Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）１００μＬを加え室温で１５分振盪した。発色を目視で確認した後、１Ｎ　ＨＣｌ試液１００μＬを加え、マイクロプレートリーダーにて波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。前記吸光度から算出された活性ラニビズマブ量を表３に示す。また、［活性ラニビズマブ量／総ラニビズマブ量］×１００の計算式で算出される活性維持率（％）も、表３に示す。
３．３　ファリシマブでの評価（実施例５）
３．３．１　マイクロスフェア調製
　ジクロロメタン１０ｍＬにＳｐａｎ８０　０．０２５ｇ及び４ＰＥＧ（１０ｋＤａ）－ＰＬＧＡ（４０ｋＤａ）　０．２５ｇを加え溶解
させた（油相溶液）。油相溶液に２．４％ファリシマブ溶液（バビースモ（登録商標）硝子体内注射液１２０ｍｇ／ｍＬ（中外製薬株式会社）の５倍希釈溶液）０．１ｍＬを加え、ホモジナイザーを用いて２０５００ｒｐｍで１分間乳化した。乳化後、スプレードライヤーで噴霧乾燥し（乾燥条件は３．２．１と同様）、白色粒子状のファリシマブ内包マイクロスフェアを得た。
３．３．２　走査型電子顕微鏡による観察
　３．３．１で得たファリシマブ内包マイクロスフェアを、３．２．２と同様の手順で観察した。観察画像を図８に示す。
３．３．３　ＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙによる総ファリシマブ量の測定
　３．３．１で得たファリシマブ内包マイクロスフェア５ｍｇを、ジメチルスルホキシド／ＰＢＳ（７：３混液）１ｍＬに溶解した。この液１００μＬにＰＢＳを加えて全量を１０ｍＬとし、試料溶液とした。また、バビースモ（登録商標）硝子体内注射液１２０ｍｇ／ｍＬをＰＢＳで希釈し、０．１～２０μｇ／ｍＬの検量線溶液を調製した。測定はＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙを用いた。９６ｗｅｌｌプレートの各ウェルに、試料溶液又は検量線溶液１００μＬを添加し、そこへＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に添付のプロトコールに従って調製したＷｏｒｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ　１００μＬを添加した。プレートを３０秒間撹拌した後、３７℃で２時間インキュベートした。発色を目視で確認した後、マイクロプレートリーダーにて波長５６２ｎｍの吸光度を測定した。前記吸光度から算出された総ファリシマブ量を表３に示す。
３．３．４　ＥＬＩＳＡによる活性ファリシマブ量の測定
　３．３．１で得たファリシマブ内包マイクロスフェア５ｍｇを、ジメチルスルホキシド／ＰＢＳ（７：３混液）１ｍＬに溶解した。この液をＰＢＳで１０００倍希釈し、試料溶液とした。また、バビースモ（登録商標）硝子体内注射液１２０ｍｇ／ｍＬをＰＢＳで希釈し、２～２００ｎｇ／ｍＬの検量線溶液を調製した。
　活性ファリシマブ量の測定にはＥＬＩＳＡを用いた。まず、９６ｗｅｌｌイムノプレートに１００ｎｇ／ｍＬヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５溶液を１００μＬ添加し、シェーカーで１分間撹拌後、３７℃で１時間静置した。静置後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、各ウェルに１％ＢＳＡ溶液を２００μＬ添加し、室温で１時間振盪した。振盪後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。
　洗浄後、各ウェルに試料溶液又は検量線溶液を１００μＬ添加し、室温で２時間振盪した。振盪後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、２次抗体溶液を１００μＬ添加し、室温で１時間振盪した。振盪後、２次抗体溶液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、ＴＭＢ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）１００μＬを加え室温で１５分振盪した。発色を目視で確認した後、１Ｎ　ＨＣｌ試液１００μＬを加え、マイクロプレートリーダーにて波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。前記吸光度から算出された活性ファリシマブ量を表３に示す。また、［活性ファリシマブ量／総ファリシマブ量］×１００の計算式で算出される活性維持率（％）も、表３に示す。
３．４　ブロルシズマブでの評価（実施例６）
３．４．１　マイクロスフェア調製
　ジクロロメタン１０ｍＬにＳｐａｎ８０　０．０２５ｇ及び４ＰＥＧ（１０ｋＤａ）－ＰＬＧＡ（４０ｋＤａ）　０．２５ｇを加え溶解させた（油相溶液）。油相溶液に２．４％ブロルシズマブ溶液（ベオビュ（登録商標）硝子体内注射用キット１２０ｍｇ／ｍＬ（ノバルティスファーマ株式会社）の５倍希釈溶液）０．１ｍＬを加え、ホモジナイザーを用いて２０５００ｒｐｍで１分間乳化した。乳化後、スプレードライヤーで噴霧乾燥し（乾燥条件は３．２．１と同様）、白色粒子状のブロルシズマブ内包マイクロスフェアを得た。
３．４．２　走査型電子顕微鏡による観察
　３．４．１で得たブロルシズマブ内包マイクロスフェアを、３．２．２と同様の手順で観察した。観察画像を図９に示す。
３．４．３　ＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙによる総ブロルシズマブ量の測定
　３．４．１で得たブロルシズマブ内包マイクロスフェア５ｍｇを、ジメチルスルホキシド／ＰＢＳ（７：３混液）１ｍＬに溶解した。この液１００μＬにＰＢＳを加えて全量を１０ｍＬとし、試料溶液とした。また、ベオビュ（登録商標）硝子体内注射用キット１２０ｍｇ／ｍＬをＰＢＳで希釈し、０．１～２０μｇ／ｍＬの検量線溶液を調製した。
　総ブロルシズマブ量の測定にはＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙを用いた。９６ｗｅｌｌプレートの各ウェルに、試料溶液又は検量線溶液１００μＬを添加し、そこへＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に添付のプロトコールに従って調製したＷｏｒｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ　１００μＬを添加した。プレートを３０秒間撹拌した後、３７℃で２時間インキュベートした。発色を目視で確認した後、マイクロプレートリーダーにて波長５６２ｎｍの吸光度を測定した。前記吸光度から算出された総ブロルシズマブ量を表３に示す。
３．４．４　ＥＬＩＳＡによる活性ブロルシズマブ量の測定
　３．４．１で得たブロルシズマブ内包マイクロスフェア５ｍｇを、ジメチルスルホキシド／ＰＢＳ（７：３混液）１ｍＬに溶解した。この液をＰＢＳで１０００倍希釈し、試料溶液とした。また、ベオビュ（登録商標）硝子体内注射用キット１２０ｍｇ／ｍＬをＰＢＳで希釈し、２～２００ｎｇ／ｍＬの検量線溶液を調製した。
　活性ブロルシズマブ量の測定にはＥＬＩＳＡを用いた。まず、９６ｗｅｌｌイムノプレートに１００ｎｇ／ｍＬヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５溶液を１００μＬ添加し、シェーカーで１分間撹拌後、３７℃で１時間静置した。静置後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、各ウェルに１％ＢＳＡ溶液を２００μＬ添加し、室温で１時間振盪した。振盪後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。
　洗浄後、各ウェルに試料溶液又は検量線溶液を１００μＬ添加し、室温で２時間振盪した。振盪後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、２次抗体溶液を１００μＬ添加し、室温で１時間振盪した。振盪後、２次抗体溶液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、ＴＭＢ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　（Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）１００μＬを加え室温で１５分振盪した。発色を目視で確認した後、１Ｎ　ＨＣｌ試液１００μＬを加え、マイクロプレートリーダーにて波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。前記吸光度から算出された活性ブロルシズマブ量を表３に示す。また、［活性ブロルシズマブ量／総ブロルシズマブ量］×１００の計算式で算出される活性維持率（％）も、表３に示す。
３．５　アフリベルセプトでの評価（比較例４）
３．５．１　マイクロスフェア調製
　ジクロロメタン１０ｍＬにＳｐａｎ８０　０．０２５ｇ及び４ＰＥＧ（１０ｋＤａ）－ＰＬＧＡ（４０ｋＤａ）　０．２５ｇを加え溶解させた（油相溶液）。油相溶液に２．５％アフリベルセプト溶液（ザルトラップ（登録商標）点滴静注１００ｍｇ（サノフィ株式会社）をそのまま使用）０．１ｍＬを加え、ホモジナイザーを用いて２０５００ｒｐｍで１分間乳化した。乳化後、スプレードライヤーで噴霧乾燥し（乾燥条件は３．２．１と同様）、白色粒子状のアフリベルセプト内包マイクロスフェアを得た。
３．５．２　走査型電子顕微鏡による観察
　３．５．１で得たアフリベルセプト内包マイクロスフェアを、３．２．２と同様の手順で観察した。観察画像を図１０に示す。
３．５．３　ＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙによる総アフリベルセプト量の測定
　３．５．１で得たアフリベルセプト内包マイクロスフェア５ｍｇを、ジメチルスルホキシド／ＰＢＳ（７：３混液）１ｍＬに溶解した。この液をＰＢＳで１０００倍希釈し、試料溶液とした。また、ザルトラップ（登録商標）点滴静注１００ｍｇをＰＢＳで希釈し、０．１～２０μｇ／ｍＬの検量線溶液を調製した。
　総アフリベルセプト量の測定にはＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙを用いた。９６ｗｅｌｌプレートの各ウェルに、試料溶液又は検量線溶液１００μＬを添加し、そこへＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に添付のプロトコールに従って調製したＷｏｒｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ　１００μＬを添加した。プレートを３０秒間撹拌した後、３７℃で２時間インキュベートした。発色を目視で確認した後、マイクロプレートリーダーにて波長５６２ｎｍの吸光度を測定した。前記吸光度から算出された総アフリベルセプト量を表３に示す。
３．５．４　ＥＬＩＳＡによる活性アフリベルセプト量の測定
　３．５．１で得たアフリベルセプト内包マイクロスフェア５ｍｇを、ジメチルスルホキシド／ＰＢＳ（７：３混液）１ｍＬに溶解した。この液１００μＬにＰＢＳを加えて全量を１０ｍＬとし、試料溶液とした。また、ザルトラップ（登録商標）点滴静注１００ｍｇをＰＢＳで希釈し、２～２００ｎｇ／ｍＬの検量線溶液を調製した。
　活性アフリベルセプト量の測定にはＥＬＩＳＡを用いた。まず、９６ｗｅｌｌイムノプレートに１００ｎｇ／ｍＬヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５溶液を１００μＬ添加し、シェーカーで１分間撹拌後、３７℃で１時間静置した。静置後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、各ウェルに１％ＢＳＡ溶液を２００μＬ添加し、室温で１時間振盪した。振盪後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。
　洗浄後、各ウェルに試料溶液又は検量線溶液を１００μＬ添加し、室温で２時間振盪した。振盪後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、２次抗体溶液を１００μＬ添加し、室温で１時間振盪した。振盪後、２次抗体溶液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、ＴＭＢ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　（Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）１００μＬを加え室温で１５分振盪した。発色を目視で確認した後、１Ｎ　ＨＣｌ試液１００μＬを加え、マイクロプレートリーダーにて波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。前記吸光度から算出された活性アフリベルセプト量を表３に示す。また、［活性アフリベルセプト量／総アフリベルセプト量］×１００の計算式で算出される活性維持率（％）も、表３に示す。
３．６　小括
　表３に示す通り、マイクロスフェアに内包させる薬物としてベバシズマブ（実施例２）、ラニビズマブ（実施例４）、ファリシマブ（実施例６）、又はブロルシズマブ（実施例６）を用いた場合に、アフリベルセプトを用いた場合（比較例４）よりも、高い活性維持率が得られた。
　本試験から、ＰＥＧ－ＰＬＧＡマイクロスフェアに内包される薬物の種類によって、マイクロスフェア中での当該薬物の安定性に差が生じる可能性が示唆された。特に、マイクロスフェアに内包させる薬物として、ベバシズマブ、ラニビズマブ、ファリシマブ、又はブロルシズマブを用いた場合に、高い薬物安定性が得られる可能性が示唆された。
４．　試験４　ＰＬＧＡユニット数による安定性（使用薬物：ベバシズマブ、実施例７及び比較例５）
　次に本発明者らは、ＰＥＧ－ＰＬＧＡのＰＬＧＡユニット数が、マイクロスフェアに内包される薬物の安定性に影響するか否かを検討した。本試験では、４．１の表４に示す様々なＰＬＧＡユニット数を有する４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いてベバシズマブ内包マイクロスフェアを調製した後、調製した各マイクロスフェアについて内包されるベバシズマブの安定性を評価した。なお、本試験で用いたＰＥＧ－ＰＬＧＡのLA：GAは、いずれも８：２であった。本試験の詳細を以下に記す。
４．１　本試験で使用した４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡポリマーの詳細
４．１．１　マイクロスフェア調製
　ジクロロメタン１０ｍＬにＳｐａｎ８０　０．０２５ｇ及び４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを　０．２５ｇを加え溶解させた（油相溶液）。このとき用いた４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡのＰＬＧＡユニット数は、表４に示す通り１００、１１０、１６０、２００、２５０、３００、３５０、５００、又は１０００であった。各油相溶液に２．５％ベバシズマブ溶液０．１ｍＬを加え、ホモジナイザーを用いて２０５００ｒｐｍで１分間乳化した。乳化後、スプレードライヤーで噴霧乾燥（二流体ノズルφ１．４、Ｎ２フロー３０ｍｍ、温度１０～１５℃）し、白色粒子状のベバシズマブ内包マイクロスフェアをそれぞれ得た。
４．１．２　ＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙによる総ベバシズマブ量の測定
　４．１．１で得た各ベバシズマブ内包マイクロスフェアについて、５ｍｇをジメチルスルホキシド／ＰＢＳ（７：３混液）１ｍＬに溶解した。この液１００μＬにＰＢＳを加えて全量を１０ｍＬとし、試料溶液とした。また、ベバシズマブＢＳ点滴静注１００ｍｇ「ファイザー」をＰＢＳで希釈し、０．１～２０μｇ／ｍＬの検量線溶液を調製した。
　総ベバシズマブ量の測定にはＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙを用いた。９６ｗｅｌｌプレートの各ウェルに、試料溶液又は検量線溶液１００μＬを添加し、そこへＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に添付のプロトコールに従って調製したＷｏｒｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ　１００μＬを添加した。プレートを３０秒間撹拌した後、３７℃で２時間インキュベートした。発色を目視で確認した後、マイクロプレートリーダーにて波長５６２ｎｍの吸光度を測定した。前記吸光度から算出された各マイクロスフェア中の総ベバシズマブ量を、表５に示す。
４．１．３　ＥＬＩＳＡによる活性ベバシズマブ量の測定
　４．１．１で得た各ベバシズマブ内包マイクロスフェアについて、５ｍｇをジメチルスルホキシド／ＰＢＳ（７：３混液）１ｍＬに溶解した。この液をＰＢＳで１０００倍希釈し、試料溶液とした。また、ベバシズマブＢＳ点滴静注１００ｍｇ「ファイザー」をＰＢＳで希釈し、２～２００ｎｇ／ｍＬの検量線溶液を調製した。
　活性ベバシズマブ量の測定にはＥＬＩＳＡを用いた。まず、９６ｗｅｌｌイムノプレートに１００ｎｇ／ｍＬヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５溶液を１００μＬ添加し、シェーカーで１分間撹拌後、３７℃で１時間静置した。静置後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、各ウェルに１％ＢＳＡ溶液を２００μＬ添加し、室温で１時間振盪した。振盪後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。
　洗浄後、各ウェルに試料溶液又は検量線溶液を１００μＬ添加し、室温で２時間振盪した。振盪後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、２次抗体溶液を１００μＬ添加し、室温で１時間振盪した。振盪後、２次抗体溶液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、ＴＭＢ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　（Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）１００μＬを加え室温で１５分振盪した。発色を目視で確認した後、１Ｎ　ＨＣｌ試液１００μＬを加え、マイクロプレートリーダーにて波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。前記吸光度から算出された各マイクロスフェア中の活性ベバシズマブ量を、表５に示す。また、［活性ベバシズマブ量／総ベバシズマブ量］×１００の計算式で算出される活性維持率（％）も、表５に示す。
４．２　小括
　表５に示す通り、マイクロスフェア調製時のポリマーとしてＰＬＧＡユニット数が１００～２５０の４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いた実施例７（ｉ）～（ｖ）においては、ＰＬＧＡユニット数が３００～１０００の４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いた比較例５（ｉ）～（iv）よりも、高いベバシズマブ活性維持率が得られた。特にＰＬＧＡユニット数が１００～２００の４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いた実施例７（ｉ）～（ｉｖ）においては、約９０％もの高いベバシズマブ活性維持率が得られた。
　本試験から、ＰＥＧ－ＰＬＧＡのＰＬＧＡユニット数が、マイクスフェアに内包される薬物の安定性に影響する可能性が示唆された。特にＰＬＧＡユニット数が１００～２００のＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いた場合に、高い薬物安定性が得られる可能性が示唆された。
５．　試験５　４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡユニット数による安定性（使用薬物：ラニビズマブ、実施例８及び比較例６）
　試験４の結果を受け本発明者らは、ベバシズマブ以外の薬物を内包させた場合でも、ベバシズマブを内包させた場合と同様に、ＰＥＧ－ＰＬＧＡのＰＬＧＡユニット数が薬物の安定性に影響するか否かを検討した。本試験では、５．１の表６に示す様々なＰＬＧＡユニット数を有する４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いてラニビズマブ内包マイクロスフェアを調製した後、調製した各マイクロスフェアについて内包されるラニビズマブの安定性を評価した。なお、本試験で用いたＰＥＧ－ＰＬＧＡのＬＡ：ＧＡは、いずれも８：２であった。本試験の詳細を以下に記す。
５．１　使用した４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡポリマーの詳細
５．１．１　マイクロスフェア調製
　ジクロロメタン１０ｍＬにＳｐａｎ８０　０．０２５ｇ及び４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを０．２５ｇを加え溶解させた（油相溶液）。このとき用いた４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡのＰＬＧＡユニット数は、表６に示す通りそれぞれ１６０、２００、２５０、３００、又は３５０であった。各油相溶液に０．５％ラニビズマブ溶液０．１ｍＬを加え、ホモジナイザーを用いて２０５００ｒｐｍで１分間乳化した。乳化後、スプレードライヤーで噴霧乾燥し、白色粒子状のラニビズマブ内包マイクロスフェアをそれぞれ得た。
５．１．２　ＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙによる総ラニビズマブ量の測定
　５．１．１で得た各ラニビズマブ内包マイクロスフェアについて、５ｍｇをジメチルスルホキシド／ＰＢＳ（７：３）混液１ｍＬに溶解した。この液１００μＬにＰＢＳを加えて全量を１０ｍＬとし、試料溶液とした。また、ルセンティス硝子体内注射液１０ｍｇ／ｍＬをＰＢＳで希釈し、０．１～２０μｇ／ｍＬの検量線溶液を調製した。
　総ラニビズマブ量の測定にはＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙを用いた。９６ｗｅｌｌプレートの各ウェルに、試料溶液又は検量線溶液１００μＬを添加し、そこへＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に添付のプロトコールに従って調製したＷｏｒｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ　１００μＬを添加した。プレートを３０秒間撹拌した後、３７℃で２時間インキュベートした。発色を目視で確認した後、マイクロプレートリーダーにて波長５６２ｎｍの吸光度を測定した。前記吸光度から算出された各マイクロスフェア中の総ラニビズマブ量を、表７に示す。
５．１．３　ＥＬＩＳＡによる活性ラニビズマブ量の測定
　５．１．１で得た各ラニビズマブ内包マイクロスフェアについて、５ｍｇをジメチルスルホキシド／ＰＢＳ（７：３）混液１ｍＬに溶解した。この液をＰＢＳで１０００倍希釈し、試料溶液とした。また、ルセンティス硝子体内注射液１０ｍｇ／ｍＬをＰＢＳで希釈し、２～２００ｎｇ／ｍＬの検量線溶液を調製した。
　活性ラニビズマブの測定にはＥＬＩＳＡを用いた。まず、９６ｗｅｌｌイムノプレートに１００ｎｇ／ｍＬヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５溶液を１００μＬ添加し、シェーカーで１分間撹拌後、３７℃で１時間静置した。静置後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、各ウェルに１％ＢＳＡ溶液を２００μＬ添加し、室温で１時間振盪した。振盪後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。
　洗浄後、各ウェルに試料溶液又は検量線溶液を１００μＬ添加し、室温で２時間振盪した。振盪後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、２次抗体溶液を１００μＬ添加し、室温で１時間振盪した。振盪後、２次抗体溶液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、ＴＭＢ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　（Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）１００μＬを加え室温で１５分振盪した。発色を目視で確認した後、１Ｎ　ＨＣｌ試液１００μＬを加え、マイクロプレートリーダーにて波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。前記吸光度から算出された各マイクロスフェア中の活性ラニビズマブ量を、表７に示す。また、［活性ラニビズマブ量／総ラニビズマブ量］×１００の計算式で算出される活性維持率（％）も、表７に示す。
５．２　小括
　表７に示す通り、マイクロスフェア調製時のポリマーとしてＰＬＧＡユニット数が１６０又は２００の４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いた実施例８（ｉ）及び（ｉｉ）においては、ＰＬＧＡユニット数が２５０～３５０の４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いた比較例６（ｉ）～（ｉｉｉ）よりも、高いラニビズマブ活性維持率が得られた。
　本試験から、ベバシズマブを内包させる場合のみならずラニビズマブを内包させる場合においても、ＰＥＧ－ＰＬＧＡのＰＬＧＡユニット数が、マイクスフェアに内包される薬物の安定性に影響する可能性が示唆された。試験４及び本試験から、特にＰＬＧＡユニット数が１００～２００のＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いた場合に、高い薬物安定性が得られる可能性が示唆された。
６．　試験６　４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いたマイクロスフェアにおける徐放性（活性値）評価（実施例９）
　本試験で本発明者らは、４分岐ＰＥＧ－ＰＬＧＡを用いたマイクロスフェアの薬物徐放性を評価した。薬物徐放性の評価は、３．２で得たラニビズマブ内包マイクロスフェアを用いて行った。詳細を以下に記載する。
６．１　ｉｎ　ｖｉｔｒｏラニビズマブ放出試験
　３．２で得たラニビズマブ内包マイクロスフェアを２０ｍｇ量り取り、１０％ジェランガム溶液１ｍＬに加え、分散させた。この分散液全量を２７Ｇ注射針を用いて放出試験液（０．０２％ＮａＮ３含有ＰＢＳ）２０ｍＬに注入した。注入後、３７℃に設定した恒温槽に入れ、薬物放出試験を開始した。
　薬物放出試験開始後、１週、２週、３週、４週、６週、６０日、９０日、１２０日、１５０日、及び１８０日の時点で、サンプリングを行った。具体的には、サンプリング時点毎に放出試験液１ｍＬを採取した（採取した放出試験液を、サンプリング液と称することがある）。
　サンプリング液中に放出された総ラニビズマブ量を、６．２に記載のＭｉｃｒｏＢＣＡ法で測定した。また、サンプリング液中に放出された活性ラニビズマブ量を、６．３に記載のＥＬＩＳＡ法により測定した。測定した総ラニビズマブ量及び活性ラニビズマブ量から、［活性ラニビズマブ量／総ラニビズマブ量］×１００の計算式で活性維持率（％）を算出した。各時点における活性維持率（％）を図１１に示す。
６．２　ＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙによる総ラニビズマブ量の測定
　６．１で得た各時点のサンプリング液をそのまま試料溶液とした。また、ルセンティス（登録商標）硝子体内注射液１０ｍｇ／ｍＬをＰＢＳで希釈し、０．１～２０μｇ／ｍＬの検量線溶液を調製した。
　総ラニビズマブ量の測定にはＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙを用いた。９６ｗｅｌｌプレートの各ウェルに、試料溶液又は検量線溶液１００μＬを添加し、そこへＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に添付のプロトコールに従って調製したＷｏｒｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ　１００μＬを添加した。プレートを３０秒間撹拌した後、３７℃で２時間インキュベートした。発色を目視で確認した後、マイクロプレートリーダーにて波長５６２ｎｍの吸光度を測定した。前記吸光度から各サンプリング液中の総ラニビズマブ量を算出した。
６．３　ＥＬＩＳＡによる活性ラニビズマブ量の測定
　６．１で得た各時点のサンプリング液をそのまま試料溶液とした。また、ルセンティス（登録商標）硝子体内注射液１０ｍｇ／ｍＬをＰＢＳで希釈し、２～２００ｎｇ／ｍＬの検量線溶液を調製した。
　活性ラニビズマブ量の測定にはＥＬＩＳＡを用いた。まず、９６ｗｅｌｌイムノプレートに１００ｎｇ／ｍＬヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５溶液を１００μＬ添加し、シェーカーで１分間撹拌後、３７℃で１時間静置した。静置後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、各ウェルに１％ＢＳＡ溶液を２００μＬ添加し、室温で１時間振盪した。振盪後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。
　洗浄後、各ウェルに試料溶液又は検量線溶液を１００μＬ添加し、室温で２時間振盪した。振盪後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、２次抗体溶液を１００μＬ添加し、室温で１時間振盪した。振盪後、２次抗体溶液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、ＴＭＢ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）１００μＬを加え室温で１５分振盪した。発色を目視で確認した後、１Ｎ　ＨＣｌ試液１００μＬを加え、マイクロプレートリーダーにて波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。前記吸光度から各サンプリング液中の活性ラニビズマブ量を算出した。
６．４　小括
　図１１に示す通り、３．２で得たラニビズマブ内包マイクロスフェアは、薬物放出試験開始後６週（４２日）の時点で８０％以上もの高いラニビズマブ活性維持率を示した。すなわち、当該マイクロスフェアは、長期間持続的に活性を有する薬剤を放出し続けた。
７．　試験７　ＰＥＧ－ＰＬＧＡの分岐数による安定性（使用薬物：ラニビズマブ）
７．１．１　マイクロスフェア調製
　ジクロロメタン１０ｍＬにＳｐａｎ８０　０．０２５ｇ、及びＰＬＧＡ（５０ｋＤａ）、２ＰＥＧ（１０ｋＤａ）－ＰＬＧＡ（４０ｋＤａ）、又は８ＰＥＧ（１０ｋＤａ）－ＰＬＧＡ（４０ｋＤａ）　０．２５ｇを加え溶解させた（油相溶液）。油相溶液に０．５％ラニビズマブ溶液（ルセンティス（登録商標）硝子体内注射液１０ｍｇ／ｍＬ（ノバルティスファーマ株式会社）の２倍希釈溶液）０．１ｍＬを加え、ホモジナイザーを用いて２０５００ｒｐｍで１分間乳化した。乳化後、スプレードライヤーで噴霧乾燥（乾燥条件は１．１と同様）し、白色粒子状のラニビズマブ内包マイクロスフェアを得た。
７．１．２　走査型電子顕微鏡による観察
　得られた各ラニビズマブ内包マイクロスフェアを、走査型電子顕微鏡（ＪＳＭ－ＩＴ３００、日本電子株式会社）にて観察した。観察に供した試料には事前にパラジウム－金コーティングを施した。観察画像を図１２～１４に示す。
７．１．３　ＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙによる総ラニビズマブ量の測定
　得られた各ラニビズマブ内包マイクロスフェア５ｍｇをジメチルスルホキシド／ＰＢＳ（７：３混液）１ｍＬに溶解した。この液２００μＬにＰＢＳを加えて全量を１０ｍＬとし、試料溶液とした。また、ルセンティス（登録商標）硝子体内注射液１０ｍｇ／ｍＬをＰＢＳで希釈し、０．１～２０μｇ／ｍＬの検量線溶液を調製した。
　総ラニビズマブ量の測定にはＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙを用いた。９６ｗｅｌｌプレートの各ウェルに、試料溶液又は検量線溶液１００μＬを添加し、そこへＭｉｃｒｏＢＣＡ　Ａｓｓａｙ　Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に添付のプロトコールに従って調製したＷｏｒｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ　１００μＬを添加した。プレートを３０秒間撹拌した後、３７℃で２時間インキュベートした。発色を目視で確認した後、マイクロプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ　ＨＴＸマルチモードプレートリーダー、ＢｉｏＴｅｋ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，　Ｉｎｃ．）にて波長５６２ｎｍの吸光度を測定した。前記吸光度から算出された総ラニビズマブ量を表８に示す。
７．１．４　ＥＬＩＳＡによる活性ラニビズマブ量の測定
　得られた各ラニビズマブ内包マイクロスフェア５ｍｇを、ジメチルスルホキシド／ＰＢＳ１ｍＬに溶解した。この液をＰＢＳで２５０倍希釈し、試料溶液とした。また、ルセンティス（登録商標）硝子体内注射液１０ｍｇ／ｍＬをＰＢＳで希釈し、１～１０００ｎｇ／ｍＬの検量線溶液を調製した。
　活性セツキシマブ量の測定にはＥＬＩＳＡを用いた。まず、９６ｗｅｌｌイムノプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ　Ｎｕｎｃ－Ｉｍｍｕｎｏ　Ｐｌａｔｅ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に１０００ｎｇ／ｍＬヒトＶＥＧＦ－Ａ１６５溶液を１００μＬ添加し、シェーカーで１分間撹拌後、４℃で一晩静置した。静置後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０含有ＰＢＳ）を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、各ウェルに１％ＢＳＡ溶液を２００μＬ添加し、室温で１時間振盪した。振盪後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。
　洗浄後、各ウェルに試料溶液又は検量線溶液を１００μＬ添加し、室温で２時間振盪した。振盪後、ウェル内の液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、２次抗体溶液（Ｇｏａｔ　Ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）溶液）を１００μＬ添加し、室温で１時間振盪した。振盪後、２次抗体溶液を捨て、各ウェルに洗浄液を加え、ウェルを洗浄した。洗浄後、ＴＭＢ　ＥＬＩＳＡ　Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ　（Ｈｉｇｈ　Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）１００μＬを加え、室温で１５分振盪した。発色を目視で確認した後、１Ｎ　ＨＣｌ試液１００μＬを加え、マイクロプレートリーダーにて波長４５０ｎｍの吸光度を測定した。前記吸光度から算出された活性ラニビズマブ量を表８に示す。また、［活性ラニビズマブ量／総ラニビズマブ量］×１００の計算式で算出される活性維持率（％）も、表８に示す。
８．　本実施例のまとめ
　以上の試験より、本開示の技術によれば、セツキシマブ、ベバシズマブ、ファリシマブ、ラニビズマブ、及びブロルシズマブからなる群より選択される少なくとも一種の薬物を含む、前記薬物の安定性に優れた製剤が提供される可能性が示唆された。また、当該製剤は優れた薬物徐放性をも有し得ることが示唆された。

Claims (4)

  1. 一分子あたり３～１０個の末端ヒドロキシ基を有する分岐型ポリアルキレングリコールとポリヒドロキシアルカン酸とが結合した化学構造を有するポリマーと、薬物と、を含み、前記ポリマーにおいて、ポリヒドロキシアルカン酸鎖一鎖あたりの、ポリヒドロキシアルカン酸モノマーのユニット数は５０～２３０であり、かつ、
    前記薬物は、セツキシマブ、ベバシズマブ、ファリシマブ、ラニビズマブ、及びブロルシズマブからなる群より選択される少なくとも一種である、微小カプセル。
  2. 前記分岐型ポリアルキレングリコールが、４又は８分岐型ポリエチレングリコールである、請求項１に記載の微小カプセル。
  3. 前記ポリマー中の、前記分岐型ポリアルキレングリコールの数平均分子量と、前記ポリヒドロキシアルカン酸の数平均分子量との比が、１：１～１：６である、請求項１又は２に記載の微小カプセル。
  4. 請求項１又は２に記載の微小カプセルを含有する、組成物。  
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