WO2025197945A1 - 腸管バリア保護剤および腸管バリア破綻関連疾患予防剤 - Google Patents

腸管バリア保護剤および腸管バリア破綻関連疾患予防剤

Info

Publication number
WO2025197945A1
WO2025197945A1 PCT/JP2025/010599 JP2025010599W WO2025197945A1 WO 2025197945 A1 WO2025197945 A1 WO 2025197945A1 JP 2025010599 W JP2025010599 W JP 2025010599W WO 2025197945 A1 WO2025197945 A1 WO 2025197945A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
intestinal barrier
yit
bifidobacterium adolescentis
fraction
stimulation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2025/010599
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
貴秀 重山
護也 月本
達也 伊吹
竜太 山崎
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yakult Honsha Co Ltd
Original Assignee
Yakult Honsha Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP2024044857A external-priority patent/JP2025144931A/ja
Priority claimed from JP2024168810A external-priority patent/JP2026060322A/ja
Application filed by Yakult Honsha Co Ltd filed Critical Yakult Honsha Co Ltd
Publication of WO2025197945A1 publication Critical patent/WO2025197945A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A61K35/741—Probiotics
    • A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
    • A61K35/745—Bifidobacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/20—Hypnotics; Sedatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/06—Antihyperlipidemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds

Definitions

  • the present invention relates to an intestinal barrier protecting agent and an agent for preventing diseases associated with intestinal barrier breakdown, which contain Bifidobacterium adolescentis or a component derived from Bifidobacterium adolescentis as an active ingredient.
  • intestinal bacteria have on the pathology of metabolic disorders in the host, particularly the pathogenesis of obesity and diabetes. It is now believed that intestinal bacteria, along with dietary habits and lack of exercise, are a cause of obesity, and new treatments for obesity are being sought that alter the intestinal flora of obese patients and even improve the intestinal environment.
  • Dysbiosis a disruption of the intestinal microbiota, is caused by a variety of factors (stress, aging, alcohol, smoking, diet, antibiotics, lack of physical activity, etc.), and as a result, the intestinal barrier function is disrupted by three stimuli: lipopolysaccharide (LPS), a toxin derived from intestinal bacteria; inflammatory cytokines in the intestinal tract; and oxidative stress.
  • LPS lipopolysaccharide
  • This disruption allows LPS and inflammatory cytokines to enter the bloodstream and circulate, reaching the adipose tissue and liver that determine insulin sensitivity, causing chronic inflammation and insulin resistance (Non-Patent Documents 1 and 2).
  • protecting intestinal barrier function can also prevent diseases associated with intestinal barrier breakdown, such as obesity and diabetes.
  • Non-Patent Documents 3-6 Bifidobacterium bifidum and Bifidobacterium animalis have the intestinal barrier protective effect against cytokine stimulation
  • Non-Patent Documents 7-8 Bifidobacterium longum and Bifidobacterium animalis have the intestinal barrier protective effect against LPS stimulation
  • no intestinal bacteria have been reported that have the intestinal barrier protective effect against multiple stimuli.
  • the objective of the present invention was to discover an intestinal bacterium that protects intestinal barrier function and is more effective than conventional bacteria, and further to discover its active ingredient.
  • the present invention is as follows.
  • An intestinal barrier protecting agent characterized by containing Bifidobacterium adolescentis as an active ingredient.
  • the intestinal barrier protecting agent according to [1] wherein the intestinal barrier protection is protection of the intestinal barrier from one or more stimuli selected from LPS stimulation, inflammatory cytokine stimulation, and oxidative stress stimulation.
  • a preventive agent for diseases associated with intestinal barrier breakdown comprising the intestinal barrier protecting agent according to [1] or [2].
  • the preventive agent for intestinal barrier breakdown-associated diseases according to [3], wherein the intestinal barrier breakdown-associated disease is selected from diabetes, obesity, inflammatory bowel disease, fatty liver, Parkinson's disease, cancer, irritable bowel disease, dyslipidemia, atopy, asthma, dementia, insomnia, depression, and rheumatoid arthritis.
  • An intestinal barrier protection agent containing as an active ingredient a polysaccharide having a repeating structure of rhamnose, glucose, and galactose in a ratio of 4-3:1:2-1, and a molecular weight cutoff by an ultrafiltration membrane of 10,000 to 30,000.
  • An intestinal barrier protector containing uridine diphosphate-N-acetylmuramic acid-L-alanine-D-glutamic acid-L-lysine as an active ingredient.
  • a polysaccharide characterized by having a repeating structure of rhamnose, glucose, and galactose in a ratio of 4-3:1:2-1, and having a molecular weight cutoff of 10,000 to 30,000 by ultrafiltration membrane.
  • a method for producing a polysaccharide having a repeating structure of rhamnose, glucose and galactose in a ratio of 4-3:1:2-1, and a molecular weight cutoff of 10,000 to 30,000 by ultrafiltration membrane comprising: [10] The method for producing a polysaccharide according to claim 9, wherein the lysis treatment is performed by treating with muramidase, followed by treatment with a nuclease and a protease. [11] A preventive agent for diseases associated with intestinal barrier breakdown, comprising the intestinal barrier protecting agent according to any one of [5] to [7].
  • the preventive agent for intestinal barrier breakdown-associated diseases according to [11], wherein the intestinal barrier breakdown-associated disease is selected from diabetes, obesity, inflammatory bowel disease, fatty liver, Parkinson's disease, cancer, irritable bowel disease, dyslipidemia, atopy, asthma, dementia, insomnia, depression, and rheumatoid arthritis.
  • the intestinal barrier protector of the present invention contains as its active ingredient Bifidobacterium adolescentis present in the intestine, a cell wall polysaccharide fraction and/or cytoplasmic fraction of Bifidobacterium adolescentis, a polysaccharide derived from said fraction and having a repeating structure of rhamnose, glucose, and galactose in a ratio of 4-3:1:2-1 and a molecular weight cutoff of 10,000-30,000 using an ultrafiltration membrane, or uridine diphosphate-N-acetylmuramic acid-L-alanine-D-glutamic acid-L-lysine, and is therefore capable of safely protecting the intestinal barrier for a long period of time.
  • FIG. 1 shows the relationship between TEER and time in LPS-stimulated monolayers in Example 1.
  • FIG. 1 shows TEER after 48 hours in LPS-stimulated monolayer membranes in Example 1.
  • 1 shows the relationship between TEER and time in monolayers stimulated with inflammatory cytokines in Example 1.
  • TI represents TNF- ⁇ +IFN- ⁇ .
  • 1 shows the TEER after 48 hours in the monolayer membrane stimulated with inflammatory cytokines in Example 1.
  • TI represents TNF- ⁇ +IFN- ⁇ .
  • FIG. 1 shows the relationship between TEER and time in the monolayer membrane stimulated with oxidative stress in Example 1.
  • FIG. 1 shows the TEER after 6 hours in the monolayer membrane stimulated with oxidative stress in Example 1.
  • FIG. 1 shows the effect of Example 1 on the localization of tight junction proteins (+: YIT 13021 added, -: YIT 13021 not added).
  • FIG. 1 shows the relationship between TEER and time for the monolayer film without stimulation in Example 2.
  • FIG. 1 shows the TEER after 6 hours in the monolayer film without stimulation in Example 2.
  • FIG. 1 shows TEER after 48 hours in LPS-stimulated monolayers in Example 3.
  • 1 shows the TEER after 48 hours in monolayer membranes stimulated with inflammatory cytokines in Example 3.
  • TI represents TNF- ⁇ +IFN- ⁇ .
  • FIG. 1 shows the TEER after 6 hours in the monolayer membrane stimulated with oxidative stress in Example 3.
  • FIG. 1 shows the TEER after 24 hours in the monolayer film without stimulation in Example 4.
  • FIG. 1 shows the relationship between TEER and time for the monolayer film without stimulation in Example 2.
  • FIG. 1 shows the TEER after 6 hours in the monolayer film without stimulation in Example 2.
  • those containing as an active ingredient a cell wall polysaccharide fraction and/or cytoplasmic fraction of Bifidobacterium adolescentis those containing as an active ingredient a cell wall polysaccharide fraction and/or cytoplasmic fraction of Bifidobacterium adolescentis, a polysaccharide having a repeating structure of rhamnose, glucose, and galactose in a ratio of 4-3:1:2-1 and a molecular weight cutoff of 10,000 to 30,000 using an ultrafiltration membrane, or uridine diphosphate-N-acetylmuramic acid-L-alanine-D-glutamic acid-L-lysine are referred to as Protective Agent of the Present Invention 2.
  • Inventive Protective Agent 1 which contains Bifidobacterium adolescentis as an active ingredient.
  • the Bifidobacterium adolescentis used in the protective agent 1 of the present invention may be a strain known as Bifidobacterium adolescentis or one isolated by conventional methods (for example, (1) Research on Bifidobacteria, edited by Mitsuoka Tomotari, Japan Bifidobacteria Center; (2) Methods for Identifying Intestinal Bacteria and Intestinal Constituent Bacteria, Fujisawa Michihiko, Japanese Journal of Bacteriology 2014; (3) PMID: 28394924 (Bifidobacterium adolescentis is isolated from mouse feces, but can be applied to humans)).
  • conventional methods for example, (1) Research on Bifidobacteria, edited by Mitsuoka Tomotari, Japan Bifidobacteria Center; (2) Methods for Identifying Intestinal Bacteria and Intestinal Constituent Bacteria, Fujisawa Michihiko, Japanese Journal of Bacteriology 2014; (3) PMID: 28
  • Bifidobacterium adolescentis examples include Bifidobacterium adolescentis YIT 13021, Bifidobacterium adolescentis YIT 13609, Bifidobacterium adolescentis YIT 12828, Bifidobacterium adolescentis type strain (ATCC15703), Bifidobacterium adolescentis YIT 13022, Bifidobacterium adolescentis YIT 11033, Bifidobacterium adolescentis YIT 11034, and Bifidobacterium adolescentis YIT 11040. These Bifidobacterium adolescentis can be used alone or in combination of two or more types.
  • Bifidobacterium adolescentis YIT 13021 Bifidobacterium adolescentis YIT 13609, and Bifidobacterium adolescentis YIT 12828 are preferred, with Bifidobacterium adolescentis YIT 13021 being more preferred.
  • the Bifidobacterium adolescentis used in the protective agent 1 of the present invention includes the strains described above, as well as strains that have been artificially genetically manipulated while maintaining the properties of Bifidobacterium adolescentis. Furthermore, both live and dead Bifidobacterium adolescentis are effective, although live bacteria are preferred.
  • Bifidobacterium adolescentis YIT 13021 has been internationally deposited as Bifidobacterium adolescentis YIT 13021 (NITE BP-03808, date of deposit: January 24, 2023) with the Patent Microorganisms Depositary of the National Institute of Technology and Evaluation, an international depository authority under the Budapest Treaty (Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, 292-0818, Japan).
  • Bifidobacterium adolescentis YIT 13609 was originally deposited domestically at the National Institute of Technology and Evaluation's Patent Microorganisms Depositary (Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, 292-0818) as YIT 13609 (NITE P-04064, date of deposit: January 15, 2024), and a request for transfer to international deposit was made on December 9, 2024, and it has now been internationally deposited at the above-mentioned Patent Microorganisms Depositary, the international depositary authority under the Budapest Treaty, as YIT 13609 (NITE BP-04064, date of deposit: January 15, 2024).
  • Bifidobacterium adolescentis YIT 12828 was domestically deposited at the above-mentioned Patent Microorganisms Depositary as YIT 12828 (NITE P-04065, date of deposit: January 15, 2024), and a request for transfer to international deposit was made on December 9, 2024, and it has now been internationally deposited at the above-mentioned Patent Microorganisms Depositary, the international depositary authority under the Budapest Treaty, as YIT 12828 (NITE BP-04065, date of deposit: January 15, 2024).
  • Bifidobacterium adolescentis YIT 13022 has been internationally deposited with the above-mentioned international depository authority as Bifidobacterium adolescentis YIT 13022 (NITE BP-03809, date of deposit: January 24, 2023).
  • Bifidobacterium adolescentis YIT 11033 has been internationally deposited with the above-mentioned international depository authority as Bifidobacterium adolescentis YIT 11033 (NITE BP-03810, date of deposit: January 24, 2023).
  • Bifidobacterium adolescentis YIT 11034 has been internationally deposited with the above-mentioned international depository authority as Bifidobacterium adolescentis YIT 11034 (NITE BP-03811, date of deposit: January 24, 2023).
  • Bifidobacterium adolescentis YIT 11040 has been internationally deposited with the above-mentioned international depository authority as Bifidobacterium adolescentis YIT 11040 (NITE BP-03812, date of deposit: January 24, 2023).
  • the protective agent 1 of the present invention contains the above-mentioned Bifidobacterium adolescentis as an active ingredient, and is therefore capable of protecting the intestinal barrier from one or more stimuli selected from LPS stimulation, inflammatory cytokine stimulation, and oxidative stress stimulation, preferably from two or more of the above stimuli, and more preferably from the three above stimuli.
  • LPS stimulation refers to the action of lipopolysaccharide (LPS), a toxin derived from enteric bacteria, on intestinal epithelial cells.
  • LPS lipopolysaccharide
  • Inflammatory cytokine stimulation refers to the action of inflammatory cytokines such as TNF- ⁇ , IFN- ⁇ , and IL-6 on intestinal epithelial cells.
  • Oxidative stress stimulation refers to the action of reactive oxygen species such as hydrogen peroxide produced by oxidative stress on intestinal epithelial cells.
  • protection of the intestinal barrier means that the expression or localization of tight junction proteins present in the intestinal tract is not disrupted or disrupted even when subjected to one or more stimuli selected from LPS stimulation, inflammatory cytokine stimulation, and oxidative stress stimulation, preferably two or more of the above stimuli, and more preferably three of the above stimuli, or that a decrease in the index of intestinal barrier strength (transepithelial electrical resistance; TEER) is suppressed, as will be shown in the Examples described below.
  • TEER transepithelial electrical resistance
  • the form of the protective agent 1 of the present invention is not particularly limited, and, like conventionally known bifidobacteria, examples include foods and beverages such as fermented milk, yogurt, and bacterial powder supplements, as well as pharmaceuticals such as lactic acid bacteria and bifidobacterial preparations. Of these, fermented foods such as fermented milk, and pharmaceuticals such as lactic acid bacteria and bifidobacterial preparations are preferred.
  • the intestinal barrier can be protected by administering the protective agent 1 of the present invention to mammals, including humans.
  • the protective agent 1 of the present invention may contain Bifidobacterium adolescentis in an amount that results in an intake of approximately 10 to 10 cfu per day.
  • the protective agent 1 of the present invention can protect the intestinal barrier and therefore can be used as a preventive agent for diseases associated with intestinal barrier disruption (hereinafter referred to as "preventive agent 1 of the present invention").
  • diseases associated with intestinal barrier disruption also include diseases associated with intestinal barrier disruption. Examples of diseases associated with intestinal barrier disruption include diabetes, obesity, inflammatory bowel disease (Crohn's disease, ulcerative colitis, etc.), fatty liver, Parkinson's disease, cancer, irritable bowel disease, dyslipidemia, atopy, asthma, dementia, insomnia, depression, and rheumatoid arthritis. Of these diseases associated with intestinal barrier disruption, obesity and diabetes are preferred.
  • the preventive agent 1 of the present invention can prevent diseases associated with intestinal barrier disruption by administering it to mammals, including humans.
  • the preventive agent 1 of the present invention may contain Bifidobacterium adolescentis in an amount that results in an intake of approximately 10 to 10 cfu per day.
  • Bifidobacterium adolescentis strains used in the present invention's protective agent 1 and the present invention's preventive agent 1 Bifidobacterium adolescentis YIT 13021, Bifidobacterium adolescentis YIT 13022, Bifidobacterium adolescentis YIT 11033, Bifidobacterium adolescentis YIT 11034, Bifidobacterium adolescentis YIT 11040, etc. have the ability to adhere to and assimilate starch granules. This ability is not present in the Bifidobacterium adolescentis type strain (ATCC15703). This, along with test methods for confirming the above-mentioned ability, is described in the international application (PCT/JP2023/3018) filed on January 31, 2023.
  • Bifidobacterium adolescentis having the above-mentioned properties is used in the protective agent 1 of the present invention and the preventive agent 1 of the present invention, it is preferable to contain starch granules together with these. This inhibits the adhesion of enterobacteria such as Eubacterium lectare, which compete with them in the intestine, to the starch granules, allowing the bacteria to adhere and colonize, thereby enhancing the effect.
  • enterobacteria such as Eubacterium lectare
  • starch granules refer to starch derived from potatoes, sweet potatoes, and other potatoes; grains, such as wheat, rice, and corn; beans, such as soybeans and adzuki beans; or tapioca, bananas, etc., which have not undergone any heating process involving water (boiling, steaming, etc.) except for the drying process during production, or which have undergone a heating process involving water but have not gelatinized; they retain their natural granular state and are insoluble in water at room temperature.
  • starch granules refer to uncooked starch derived from potatoes, such as uncooked potatoes, sweet potatoes, and other potatoes; grains, such as wheat, rice, and corn; beans, such as soybeans and adzuki beans; or tapioca, bananas, etc.; and have granular shapes, such as spherical, ovoid, or polyhedral, and typically have a diameter of 1 to 120 ⁇ m, depending on the plant species. This diameter can be measured using a microscope or particle size measuring device.
  • starch granules When starch granules are contained in the protective agent 1 of the present invention and the preventive agent 1 of the present invention, they should be contained so that the daily intake is approximately 0.5 to 100 g.
  • the protective agent 1 and preventive agent 1 of the present invention described above can safely protect the intestinal barrier and prevent diseases associated with intestinal barrier breakdown over a long period of time.
  • the protective agent 1 of the present invention not only protects the intestinal barrier, but can also strengthen the intestinal barrier in the absence of any irritation. Therefore, the protective agent 1 of the present invention can also be used as an intestinal barrier strengthening agent.
  • strengthening the intestinal barrier refers to increasing the index value of intestinal barrier strength (transepithelial electrical resistance; TEER).
  • inventive protective agent 2 which contains one of the following components derived from Bifidobacterium adolescentis as an active ingredient.
  • protection of the intestinal barrier refers to increasing the index value of intestinal barrier strength (transepithelial electrical resistance; TEER) compared to when nothing is added.
  • TEER epidermaal electrical resistance
  • the active ingredient of the protective agent 2 of the present invention (1) the cell wall polysaccharide fraction and/or cytoplasmic fraction of Bifidobacterium adolescentis, is now described.
  • the cell wall polysaccharide fraction and/or cytoplasmic fraction of Bifidobacterium adolescentis are obtained by lysing Bifidobacterium adolescentis.
  • the Bifidobacterium adolescentis used above can be the Bifidobacterium adolescentis used in the protective agent 1 of the present invention, which contains Bifidobacterium adolescentis as an active ingredient.
  • Bifidobacterium adolescentis it is preferable to culture the above-mentioned Bifidobacterium adolescentis before subjecting it to a lysis treatment. Culturing can be carried out under conventionally known conditions. After culturing, the bacteria can be collected by centrifugation or washed with PBS or the like according to standard methods.
  • the lysis treatment of Bifidobacterium adolescentis described above is not particularly limited as long as it allows for the production of a cell wall polysaccharide fraction and/or a cytoplasmic fraction from Bifidobacterium adolescentis.
  • known methods that use an appropriate combination of multiple enzymes such as muramidase, nuclease, and protease can be used.
  • a preferred method is to treat the DNA with muramidase, followed by treatment with a nuclease and a protease.
  • muramidases include mutanolysin, lysozyme, and labiase.
  • nucleases include benzonase.
  • proteases include pronase and trypsin.
  • the above preferred method is carried out as follows. First, Bifidobacterium adolescentis is sufficiently cultured in advance according to standard methods, then the cells are collected by centrifugation and washed with PBS. 1 to 100 U, preferably 4 U, of muramidase is added to 1 mg of live Bifidobacterium adolescentis cells, and the mixture is allowed to react at 37 to 60°C, preferably 37°C, for 12 hours or more, preferably 16 to 24 hours. Next, centrifugation or other methods are performed as necessary to remove insoluble matter, and the supernatant is obtained.
  • nuclease 1 to 100 U, preferably 1.4 U, of nuclease is added to 1 mg of live cells, and the mixture is allowed to react at 37 to 60°C, preferably 37°C, for 12 hours or more, preferably 16 to 24 hours.
  • 0.0001 to 0.5 mg, preferably 0.006 mg, of protease is added to 1 mg of live cells, and the mixture is allowed to react at 37 to 60°C, preferably 37°C, for 12 hours or more, preferably 16 to 24 hours.
  • purification may be performed using a dialysis membrane or the like.
  • the molecular weight cutoff of the dialysis membrane is 3,500 to 14,000, preferably 3,500 to 8,000.
  • the cell wall polysaccharide fraction and/or cytoplasmic fraction of Bifidobacterium adolescentis (1) is obtained.
  • the physical properties of this cell wall polysaccharide fraction and/or cytoplasmic fraction of Bifidobacterium adolescentis are as follows: Appearance: White to pale grayish brown solid
  • the cell wall polysaccharide fraction and/or cytoplasmic fraction of Bifidobacterium adolescentis have the effect of protecting the intestinal barrier.
  • the active ingredient of the protective agent 2 of the present invention (2) a polysaccharide having a repeating structure of rhamnose, glucose, and galactose in a ratio of 4-3:1:2-1, preferably 3:1:1 or 4:1:2, and having a molecular weight cutoff of 10,000-30,000 using an ultrafiltration membrane.
  • This polysaccharide has a structure represented by the following formula and is a novel substance.
  • the Bifidobacterium adolescentis and lysis treatment used above are the same as above.
  • a cell wall polysaccharide fraction and/or cytoplasmic fraction of Bifidobacterium adolescentis is obtained. This is then purified using an ultrafiltration membrane to obtain a fraction with a molecular weight cutoff of 10,000 to 30,000.
  • the ultrafiltration membrane used in this process is not particularly limited as long as it can obtain the above molecular weights, but for example, it is preferable to use a combination of ultrafiltration membranes with a molecular weight cutoff of 100,000, a molecular weight cutoff of 30,000, and a molecular weight cutoff of 10,000, and it is even more preferable to use a combination of ultrafiltration membranes with a molecular weight cutoff of 30,000 and a molecular weight cutoff of 10,000.
  • a fraction with a molecular weight cutoff of 10,000 to 30,000 is obtained using an ultrafiltration membrane. This is then subjected to hydrophilic interaction chromatography under the conditions described above to obtain a polysaccharide with a repeating structure of rhamnose, glucose, and galactose in a ratio of 4-3:1:2-1, and a molecular weight cutoff of 10,000 to 30,000 using an ultrafiltration membrane.
  • the hydrophilic interaction chromatography can be performed under equivalent conditions that can be modified as needed to obtain a polysaccharide with a repeating structure of rhamnose, glucose, and galactose in a ratio of 4-3:1:2-1, and a molecular weight cutoff of 10,000-30,000 through an ultrafiltration membrane.
  • equivalent conditions can be established by a person skilled in the art by referring to the above conditions and appropriately modifying the flow rate, mobile phase composition, type of column carrier, particle size of the column carrier, column length, temperature, injection volume, and injection solution concentration, and specific examples include the following:
  • a polysaccharide (2) which has a repeating structure of rhamnose, glucose, and galactose in a ratio of 4-3:1:2-1, and has a molecular weight cutoff of 10,000 to 30,000 using an ultrafiltration membrane.
  • this polysaccharide has been obtained can be confirmed, for example, by structural analysis using NMR, HPLC, etc., or by analysis of the constituent sugars.
  • a peak can be confirmed at an elution time of approximately 8 to 9 minutes. More specifically, it can be confirmed by the method described in the Examples below.
  • This polysaccharide has a repeating structure of rhamnose, glucose, and galactose in a ratio of 4-3:1:2-1, and has a molecular weight cutoff of 10,000-30,000 when filtered through an ultrafiltration membrane, and has the effect of protecting the intestinal barrier.
  • This uridine diphosphate-N-acetylmuramic acid-L-alanine-D-glutamic acid-L-lysine (e.g., CAS No. 143436-84-4) is a known compound, a cytoplasmic component, and has the following chemical formula (Nicolas Gisch, Birte Buske, Holger Heine, Buko Lindner, Ulrich Zahringer, Synthesis of biotinylated muramyl tripeptides with NOD2-stimulating activity, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2011(21) 3362.).
  • This uridine diphosphate-N-acetylmuramic acid-L-alanine-D-glutamic acid-L-lysine may be a commercially available product, may be obtained based on the above-mentioned literature, or may be obtained from the cell wall polysaccharide fraction and/or cytoplasmic fraction of (1) Bifidobacterium adolescentis as described in the Examples below.
  • This uridine diphosphate-N-acetylmuramic acid-L-alanine-D-glutamic acid-L-lysine has the effect of protecting the intestinal barrier.
  • the protective agent 2 of the present invention can protect the intestinal barrier by using any of the above (1) to (3) as an active ingredient.
  • the form of the protective agent 2 of the present invention is not particularly limited as long as it contains any of the above (1) to (3) and is suitable for administration, and can be, for example, a human pharmaceutical product, food or drink, supplement, etc.
  • any of the above (1) to (3) can be formulated as a pharmaceutical product, either as is or, if necessary, in combination with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carriers include glucose, lactose, starch, mannitol, dextrin, fatty acid glycerides, polyethylene glycol, hydroxyethyl starch, ethylene glycol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, amino acids, gelatin, albumin, water, and physiological saline.
  • conventional additives such as stabilizers, wetting agents, emulsifiers, binders, isotonicity agents, and excipients can also be added as needed.
  • the dosage form is not particularly limited, and examples include liquids, powders, granules, capsules, tablets, etc., and can be manufactured according to conventional methods.
  • the content of the active ingredient in the protective agent 2 of the present invention is not particularly limited, and is, for example, preferably 1 to 100% by mass, more preferably 5 to 70% by mass, and particularly preferably 10 to 60% by mass.
  • any of the above (1) to (3) can be used as is, or, if necessary, can be blended with additives, ingredients, etc. used in known food and beverage products, and prepared according to conventional methods.
  • food and beverage products include starch-based foods such as bread, biscuits, pancakes, noodles, and tablet candy; confectioneries such as gum, candy, and Japanese sweets; meat products such as ham and sausage; fish products such as chikuwa and kamaboko; seafood products; seasonings such as dressing, soy sauce, jam, and furikake; beverages such as tea, juice, soft drinks, and alcoholic beverages.
  • any of the above (1) to (3) can be used as is, or, if necessary, can be blended with additives, materials, etc. used in known supplements and prepared according to conventional methods.
  • the protective agent 2 of the present invention can protect the intestinal barrier by administering it to mammals, including humans.
  • the protective agent 2 of the present invention can be administered in the following amounts per day: (1) 0.000060 to 270 mg for the cell wall polysaccharide fraction and/or cytoplasmic fraction of Bifidobacterium adolescentis; (2) 0.00000324 to 15 mg for a polysaccharide having a repeating structure of rhamnose, glucose, and galactose in a 4-3:1:2-1 ratio and having a molecular weight cutoff of 10,000 to 30,000 using an ultrafiltration membrane; or (3) 0.00000420 to 19 mg for uridine diphosphate-N-acetylmuramic acid-L-alanine-D-glutamic acid-L-lysine.
  • Preventive agent 2 of the present invention can prevent diseases associated with intestinal barrier disruption by administering it to mammals, including humans.
  • preventive agent 2 of the present invention can be administered in the following amounts per day: (1) 0.000060 to 270 mg of cell wall polysaccharide fraction and/or cytoplasmic fraction of Bifidobacterium adolescentis; (2) 0.00000324 to 15 mg of a polysaccharide having a repeating structure of rhamnose, glucose, and galactose in a 4-3:1:2-1 ratio and having a molecular weight cutoff of 10,000 to 30,000 using an ultrafiltration membrane; or (3) 0.00000420 to 19 mg of uridine diphosphate-N-acetylmuramic acid-L-alanine-D-glutamic acid-L-lysine.
  • the protective agent 2 of the present invention and the preventive agent 2 of the present invention can safely protect the intestinal barrier and prevent diseases associated with intestinal barrier breakdown over a long period of time.
  • the intestinal barrier protector 2 of the present invention not only protects the intestinal barrier, but can also strengthen the intestinal barrier in the absence of any irritation. Therefore, the intestinal barrier protector 2 of the present invention can also be used as an intestinal barrier strengthener.
  • strengthening the intestinal barrier means increasing the index value of intestinal barrier strength (transepithelial electrical resistance; TEER) compared to when nothing is added.
  • Example 1 Intestinal barrier protection The test strain used was Bifidobacterium adolescentis YIT 13021 (NITE BP-03808) (hereinafter referred to as "YIT 13021").
  • the control strain used was Bifidobacterium breve type strain (ATCC15700) (hereinafter referred to as "YIT 4014"). These strains were cultured in mGAM medium supplemented with 1% glucose, and the intestinal barrier protective effects against LPS stimulation, inflammatory cytokine stimulation, or oxidative stress stimulation were tested using an unstimulated control. The effect of YIT 13021 on the localization of tight junction proteins was also tested.
  • T84 Cryopreserved human colon epithelial cell line T84 was used. T84 cells were subcultured in DMEM/F-12 medium (10% FBS/F-12) containing 10% FBS and 100 ⁇ g/mL streptomycin at 37 °C in 5% CO .
  • T84 monolayer membranes were prepared using a 24-well cell culture insert plate (Millipore). T84 cells were harvested from a culture dish at 80% confluence and seeded onto the apical side of the well in 400 ⁇ L of 10% FBS/F-12 at 60,000 cells/well. 800 ⁇ L of 10% FBS/F-12 was added to the basal side, and the cells were cultured at 37°C in 5% CO . The medium was replaced every 2-3 days, with 400 ⁇ L of medium added to the apical side and 800 ⁇ L to the basal side. T84 monolayer membranes were prepared by culturing for 10 days.
  • LPS (WAKO, #128-05171) derived from Escherichia coli O55 was dissolved in 10% FBS/F-12 to a test concentration of 10 ng/mL.
  • LPS stimulation was performed by adding LPS-containing medium to both the apical and basal sides of the prepared monolayers.
  • Heat-killed YIT 13021 or YIT 4014 cells were prepared by a known method and added only to the apical side of the monolayer membrane at a concentration of 100 ⁇ g/mL (approximately 2.4 ⁇ 10 cells/mL).
  • the protective effect against stimulation-induced damage to the monolayer membrane was evaluated by the transepithelial electrical resistance (TEER) value ( ⁇ / cm2 ), which was calculated by dividing the actual resistance value ( ⁇ ) measured using a Millicell MRS-2 (Millipore) by the culture area ( cm2 ) of the cell culture insert plate.
  • Barrier breakdown was calculated as the percentage change from the start of stimulation by dividing the TEER value of the monolayer membrane at various times after the start of stimulation by the TEER value at time 0, immediately after the start of stimulation.
  • T84 cells were seeded onto cell culture insert plates and cultured for 10 days to prepare monolayers. LPS and heat-killed cells of the respective strains were added to the monolayers, and TEER values were measured every 24 hours for up to 48 hours (Fig. 1). 48 hours after addition, no decrease in TEER was observed in monolayers treated with YIT 13021, and the decrease in TEER due to LPS stimulation was significantly suppressed. For YIT 4014, the decrease was the same as that observed with LPS stimulation alone (Fig. 2).
  • the inflammatory cytokines used were TNF- ⁇ (R&D Systems, #210-TA-005) and IFN- ⁇ (R&D Systems, #285-IF-100). Equal amounts of both cytokines were dissolved in 10% FBS/F-12 to prepare a test concentration of 1 ng/mL. Stimulation with TNF- ⁇ and IFN- ⁇ was performed by adding cytokine-containing medium only to the basal side of the prepared monolayer membrane. Measurement of the TEER value of the monolayer membrane after each elapsed time from the start of stimulation and calculation of the percentage change (%) were performed as described in 1.3 of (1) LPS stimulation above.
  • H2O2 Mitsubishi, #K-8230
  • FBS/F-12 10% FBS/F-12
  • Stimulation with H2O2 was performed by adding H2O2 - containing medium to both the apical and basal sides of the prepared monolayer membrane.
  • Measurement of the TEER value of the monolayer membrane at each elapsed time from the start of stimulation and calculation of the rate of change (%) were performed as in 1.3 of (1) LPS stimulation above.
  • Example 2 Strengthening of intestinal barrier: YIT 13021 and YIT 4014 were used as test strains. To examine their effects on intestinal barrier function, T84 cells prepared as in Example 1 were seeded onto cell culture insert plates and cultured for 10 days to prepare monolayer membranes. Heat-killed YIT 13021 or YIT 4014 cells were added to the apical side of the monolayer membrane (no stimulation), and TEER values were measured every hour for up to 6 hours ( Figure 8). Six hours after the addition of YIT 13021, a significant increase in TEER value was observed in the monolayer membrane compared to the untreated Ctrl ( Figure 9). Meanwhile, the TEER value in the monolayer membrane with the addition of YIT 4014 was comparable to that in the untreated Ctrl.
  • Example 3 Intestinal barrier protection Bifidobacterium adolescentis strains other than YIT 13021 were also tested for their intestinal barrier protective effect similar to that of YIT 13021.
  • the Bifidobacterium adolescentis strains used were YIT 13609 (NITE BP-04064) and YIT 12828 (NITE BP-04065).
  • Example 4 Strengthening of intestinal barrier: The test strains used were YIT 13021, YIT 13609, and YIT 12828. To examine their effects on intestinal barrier function, T84 cells prepared as in Example 1 were seeded onto cell culture insert plates and cultured for 10 days to produce monolayer membranes. Heat-killed cells of YIT 13021, YIT 13609, or YIT 12828 were added to the apical side of the monolayer membrane, and the TEER value was measured 24 hours later. The results showed that YIT 13609 and YIT 12828 had the same intestinal barrier enhancing effect as YIT 13021 ( Figure 13).
  • Example 5 Strengthening of intestinal barrier: To examine the effect of live YIT 13021 bacteria on intestinal barrier function, T84 cells prepared as in Example 1 were seeded onto cell culture insert plates and cultured for 10 days to produce monolayer membranes. Live or heat-killed YIT 13021 bacteria were added to the apical side of the monolayer membrane at various concentrations, and TEER values were measured and compared 24 hours later. A significant increase in TEER value was observed with the heat-killed bacteria starting at an added concentration of 10 ⁇ g/mL ( FIG. 14 ), while a significant increase in TEER value was observed with the live bacteria starting at an added concentration of 1 ⁇ g/mL, demonstrating that the live bacteria exerted a barrier-enhancing effect even at low concentrations ( FIG. 15 ).
  • YIT 13021 has the characteristic of adhering to and assimilating starch granules, and the presence or absence of starch granules during culture may affect the properties of the bacterial cells. Therefore, we investigated the effect of live YIT 13021 bacteria cultured in mGAM medium, where the carbon source was changed from glucose to starch granules, on the intestinal barrier function. T84 cells prepared as in Example 1 were seeded on cell culture insert plates and cultured for 10 days to produce monolayer membranes. Live YIT 13021 bacteria cultured in the presence of starch granules were added to the apical side of the monolayer membrane at various concentrations, and TEER values were measured and compared after 24 hours.
  • Example 7 Intestinal barrier protective effect of cell wall polysaccharide fraction of Bifidobacterium adolescentis: After culturing a strain belonging to Bifidobacterium adolescentis, the strain was subjected to lysis treatment to obtain a cell wall polysaccharide fraction, which was then analyzed.
  • YIT 13021 Bacterial Strain Bifidobacterium adolescentis YIT 13021 (NITE BP-03808) (hereinafter referred to as "YIT 13021”) was used as the bacterial strain.
  • the remaining reaction solution was centrifuged at 12,000 ⁇ g at 24°C for 45 minutes to precipitate insoluble matter, and the supernatant was collected.
  • Benzonase (nuclease) was added to the supernatant at a rate of 1.4 U per 1 mg of bacterial cells, and the mixture was allowed to react at 37°C for 24 hours.
  • Pronase protease
  • the cell wall polysaccharide fraction (42.5 mg) was obtained by lyophilization.
  • T84 monolayers were prepared using 24-well cell culture insert plates (Millipore). T84 cells were harvested from 80% confluent culture dishes and seeded at 60,000 cells/well in 400 ⁇ L of 10% FBS/F-12 on the apical side of the wells. 800 ⁇ L of 10% FBS/F-12 was added to the basal side, and the cells were cultured at 37°C in 5% CO . Medium was replaced every 2–3 days, with 400 ⁇ L of medium on the apical side and 800 ⁇ L on the basal side. T84 monolayers were cultured for 10 days.
  • the test substance was added at various concentrations to the apical part of the prepared monolayer membrane, and after 24 hours, the actual resistance ( ⁇ ) measured using a Millicell MRS-2 (Millipore) was divided by the culture area ( cm2 ) of the cell culture insert plate to evaluate the barrier enhancement effect based on the transepithelial electrical resistance (TEER) value ( ⁇ / cm2 ).
  • the TEER value of the monolayer membrane at each elapsed time from the start of stimulation was divided by the TEER value at time 0, immediately after the start of stimulation, to calculate the barrier breakdown as the percentage change (%) from the start of stimulation.
  • Example 8 Intestinal barrier protection effect of fractions with molecular weight cutoff of 10,000 or less: The cell wall polysaccharide fraction having the protective effect on the intestinal barrier obtained in Example 7 was dissolved in ultrapure water to a concentration of 5 mg/mL, and SEC was measured under the following conditions. The results are shown in Figure 18.
  • the cell wall polysaccharide fraction contained molecules with molecular weights of 10,000 or more, 30,000, 100,000, and 400,000 or more. This was then fractionated using an ultrafiltration membrane with a molecular weight cutoff of 100,000 (Millipore, UFC910008), an ultrafiltration membrane with a molecular weight cutoff of 30,000 (Millipore, UFC903008), and an ultrafiltration membrane with a molecular weight cutoff of 10,000 (Millipore, UFC901008) into molecular weights of 100,000 or more, 100,000 to 30,000, 30,000 to 10,000, and less than 10,000.
  • the TEER values of these fractions under unstimulated conditions were measured using the following method. The results are shown in Figure 19.
  • fraction 2 had a signal at ⁇ , indicating that it was the cell wall precursor uridine diphosphate-N-acetylmuramic acid-L-alanine-D-glutamic acid-L-lysine (literature value (Table 1): Nicolas Gisch, et al., Bioorganic Med. Chem. Lett. 21. 3362. 2011).
  • the structure is shown in Figure 23.
  • the molecular weight of uridine diphosphate-N-acetylmuramic acid-L-alanine-D-glutamic acid-L-lysine is 1008, but mass spectrometry analysis of fraction 2 revealed an [M+1] of 1008.8 (not shown). Since fraction 2 contains cell wall precursors, it was determined that the cell wall polysaccharide fractions measured up to that point also contained cytoplasmic fractions.
  • Example 9 Intestinal barrier protection effect of the fraction with a molecular weight cutoff of 10,000 to 30,000: HILIC analysis was performed on the fractions with a molecular weight cutoff of 10,000 to 30,000 obtained in Example 8 ( Figure 24). The liquid was passed through 48 times (total of 2.4 mg), and fractions 1 to 4 in Figure 24 were collected each time (1 (22-30 min): 1.19 mg, 2 (30-35 min): 1.26 mg, 3 (35-42.5 min): 1.01 mg, 4 (51.5-57.5 min): 0.79 mg).
  • Standard mixture 1 was prepared by mixing aqueous solutions of GlcN, Man, Rib, 6-deoxytal, GlcA, Glc, and Xyl at concentrations of 0.0625, 0.25, 1, and 4 mM.
  • aqueous solutions of MurA, GalN, Rha, GalA, Gal, Ara, and Fuc sugars were mixed to prepare standard mixture 2 at concentrations of 0.0625, 0.25, 1, and 4 mM.
  • 0.0625 mM D-Talose (Tal) was used as the internal standard.
  • Fraction 2 was dissolved in ultrapure water to a concentration of 5 mg/mL to prepare the analytical sample.
  • the tubes were then capped and stirred, followed by reaction at 70°C for 30 minutes. After cooling, 1 mL of 0.1 M hydrochloric acid solution was added to make the tube acidic. The tubes were washed three times with approximately 1 mL of chloroform.
  • the aqueous layer was filtered through a 0.45 ⁇ m filter (Millipore UFC30HVNB) and subjected to HPLC analysis under the following conditions. The number of moles of each sugar was calculated from the peak area using the calibration curve of each sugar standard. The column was washed every 4 to 6 analyses.
  • the number of sugars in the repeating unit was thought to be octasaccharides based on the 1H -NMR results, but because the sugar ratio was thought to be 4:1:2 or 3:1:1, it was estimated to be pentose-sevenose.
  • the chemical structure of the active substance isolated from the fraction with a molecular weight cutoff of 10,000 to 30,000 using an ultrafiltration membrane was found to be a repeating unit of pentose-sevenose sugars, with rhamnose as the main sugar and glucose and galactose as the other sugars, with the repeating units of rhamnose, glucose, and galactose in a ratio of 4-3:1:2-1 ( Figure 28).
  • the intestinal barrier protector of the present invention can be used to protect the intestinal barrier and as a preventative agent for diseases associated with intestinal barrier breakdown.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)

Abstract

ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスを有効成分とすることにより、腸管バリア機能を保護するための腸内細菌であって、従来のものよりも効果が高いものを提供し、前記腸管バリア保護剤の活性本体として、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの細胞壁多糖画分および／または細胞質内画分、ラムノース、グルコース、ガラクトースが４～３：１：２～１の繰り返し構造であり、限外濾過膜による分画分子量が１～３万である多糖、または、ウリジン二リン酸－Ｎ－アセチルムラミン酸－Ｌ－アラニン－Ｄ－グルタミン酸－Ｌ－リジンを提供する。

Description

腸管バリア保護剤および腸管バリア破綻関連疾患予防剤
　本発明は、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスまたはビフィドバクテリウム・アドレッセンティス由来の成分を有効成分とする腸管バリア保護剤および腸管バリア破綻関連疾患予防剤に関する。
　近年、腸内細菌が宿主の代謝異常症の病態、とりわけ肥満や糖尿病の病態形成に影響を与えることに注目が集まっている。現在では食習慣、運動不足と並んで腸内細菌が肥満の原因となっていると考えられており、肥満症患者の腸内細菌叢を変化させる、さらには腸内環境を改善することによる肥満症の新規治療法が模索されている。
　腸内細菌叢の乱れ（Ｄｙｓｂｉｏｓｉｓ）は、さまざまな要因（ストレス、加齢、アルコール、喫煙、食生活、抗生物質、身体活動量の不足など）で引き起こされるが、その結果として、腸内細菌由来の毒素であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）による刺激、腸管における炎症性サイトカインによる刺激、酸化ストレスによる刺激の３つの刺激により腸管バリア機能が破錠する。その破錠により、ＬＰＳや炎症性サイトカインが血中に流入して循環し、インスリン感受性を決める脂肪組織や肝臓に達し、慢性炎症やインスリン抵抗性が引き起こされることが知られている（非特許文献１、２）。
　そのため、腸管バリア機能を保護することは、肥満、糖尿病等の腸管バリアが破綻することに関連した疾患の予防もできると考えられている。
　これまで腸管バリア機能を保護するための腸内細菌の探索がされているものの、これまで報告されているのは、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・アニマリスのサイトカイン刺激に対する腸管バリア保護作用（非特許文献３～６）、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・アニマリスのＬＰＳ刺激に対する腸管バリア保護作用（非特許文献７～８）等があるものの、複数の刺激に対する腸管バリア保護作用を有する腸内細菌は報告されていなかった。
Coppe. J-P, et al., PLoS Biol. 6. 2853. 2008 Winer. D. A, et al., Cell Metab. 23. 413. 2016 Al-Sadi. R, et al., Int. J. Mol. Sci. 22. 8070. 2021 Hsieh. C. Y, et al., Physiol Rep. 3. 3. e12327. 2015 Wang. X, et al., Biomedicines. 9. 641. 2011 Castro-Herrera. V. M, et al., Nutrients. 12. 1719. 2020 Zhao. L, et al., J. Funct. Foods . 92. 105030. 2022 Kim. J.Y, et al., Front Microbiol. 13. 817591. 2022
　本発明は、腸管バリア機能を保護するための腸内細菌であって、従来のものよりも効果が高いものを見出し、更に、その活性本体を見出すことを課題とした。
　本発明者らは上記課題を解決するために鋭意研究した結果、特定のビフィズス菌が、優れた腸管バリア機能の保護作用を有することを見出し、更に、その活性本体を見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、以下のものである。
［１］ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスを有効成分とすることを特徴とする腸管バリア保護剤。
［２］腸管バリア保護が、ＬＰＳ刺激、炎症性サイトカイン刺激および酸化ストレス刺激から選ばれる１以上の刺激からの腸管バリアの保護である［１］記載の腸管バリア保護剤。
［３］［１］または［２］記載の腸管バリア保護剤を含有する腸管バリア破綻関連疾患予防剤。
［４］腸管バリア破綻関連疾患が、糖尿病、肥満、炎症性腸疾患、脂肪肝、パーキンソン病、がん、過敏性腸疾患、脂質異常症、アトピー、喘息、認知症、不眠症、うつ、関節リウマチから選ばれるものである［３］記載の腸管バリア破綻関連疾患予防剤。
［５］ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの細胞壁多糖画分および／または細胞質内画分を有効成分とする腸管バリア保護剤。
［６］ラムノース、グルコース、ガラクトースが４～３：１：２～１の繰り返し構造であり、限外濾過膜による分画分子量が１～３万である多糖を有効成分とする腸管バリア保護剤。
［７］ウリジン二リン酸－Ｎ－アセチルムラミン酸－Ｌ－アラニン－Ｄ－グルタミン酸－Ｌ－リジンを有効成分とする腸管バリア保護剤。
［８］ラムノース、グルコース、ガラクトースが４～３：１：２～１の繰り返し構造であり、限外濾過膜による分画分子量が１～３万であることを特徴とする多糖。
［９］ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスを溶菌処理し、次いで、これを限外濾過膜により分画分子量が１～３万の画分を得て、更に、これを以下の条件またはこれと同等の条件で行われる親水性相互作用クロマトグラフィー、
［クロマトグラフィー条件］
　流速: 1.0 mL/min
　移動相 A: MeCN, B: H2O 
　グラジエント：0-3.3 min ：A=95, B=5, 3.3-83.3 min: A=95→0, B=5→100
　カラム: YMC-triart Diol HILIC (φ4.6x250mm, 5μm)
　温度: 40℃
　注入量: 2～10 μL (5 mg/mL in H2O)
　溶出時間：22～35min
で採取することを特徴とするラムノース、グルコース、ガラクトースが４～３：１：２～１の繰り返し構造であり、限外濾過膜による分画分子量が１～３万である多糖の製造方法。
［１０］溶菌処理が、ムラミダーゼで処理をした後、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼで処理するものである［９］請求項９記載の多糖の製造方法。
［１１］［５］～［７］の何れか１に記載の腸管バリア保護剤を含有する腸管バリア破綻関連疾患予防剤。
［１２］腸管バリア破綻関連疾患が、糖尿病、肥満、炎症性腸疾患、脂肪肝、パーキンソン病、がん、過敏性腸疾患、脂質異常症、アトピー、喘息、認知症、不眠症、うつ、関節リウマチから選ばれるものである［１１］記載の腸管バリア破綻関連疾患予防剤。
　本発明の腸管バリア保護剤は、腸内に存在するビフィドバクテリウム・アドレッセンティス、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの細胞壁多糖画分および／または細胞質内画分、前記画分を由来とするラムノース、グルコース、ガラクトースが４～３：１：２～１の繰り返し構造であり、限外濾過膜による分画分子量が１～３万である多糖、または、ウリジン二リン酸－Ｎ－アセチルムラミン酸－Ｌ－アラニン－Ｄ－グルタミン酸－Ｌ－リジンを有効成分とするものであるため、安全に長期間、腸管バリアを保護することができる。
　また、本発明の腸管バリア保護剤は、腸管バリアを保護することができるため、腸管バリアの破綻に関連する疾患の予防剤としても有用である。
　また、本発明の多糖は、ラムノース、グルコース、ガラクトースが４～３：１：２～１の繰り返し構造であり、限外濾過膜による分画分子量が１～３万であり、この多糖は、種々の用途に用いることができる。
実施例１のＬＰＳ刺激した単層膜におけるＴＥＥＲと時間の関係を示す図である。 実施例１のＬＰＳ刺激した単層膜における４８時間後のＴＥＥＲを示す図である。 実施例１の炎症性サイトカイン刺激した単層膜におけるＴＥＥＲと時間の関係を示す図である。ＴＩはＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γを表す。 実施例１の炎症性サイトカイン刺激した単層膜における４８時間後のＴＥＥＲを示す図である。ＴＩはＴＮＦ－α＋ＩＦＮ－γを表す。 実施例１の酸化ストレス刺激した単層膜におけるＴＥＥＲと時間の関係を示す図である。 実施例１の酸化ストレス刺激した単層膜における６時間後のＴＥＥＲを示す図である。 実施例１のタイトジャンクションタンパク質の局在への影響を示す図である（＋：YIT 13021添加、－：YIT 13021無添加） 実施例２の刺激なしの単層膜におけるＴＥＥＲと時間の関係を示す図である。 実施例２の刺激なしの単層膜における６時間後のＴＥＥＲを示す図である。 実施例３のＬＰＳ刺激した単層膜における４８時間後のＴＥＥＲを示す図である。 実施例３の炎症性サイトカイン刺激した単層膜における４８時間後のＴＥＥＲを示す図である。ＴＩはＴＮＦ－α+ＩＦＮ－γを表す。 実施例３の酸化ストレス刺激した単層膜における６時間後のＴＥＥＲを示す図である。 実施例４の刺激なしの単層膜における２４時間後のＴＥＥＲを示す図である。 実施例５（加熱死菌体）の刺激なしの単層膜における２４時間後のＴＥＥＲを示す図である。 実施例５（生菌体）の刺激なしの単層膜における２４時間後のＴＥＥＲを示す図である。 実施例６（でんぷん顆粒と組み合わせて培養した生菌体）の刺激なしの単層膜における２４時間後のＴＥＥＲを示す図である。 細胞壁多糖画分（細胞質内画分も含まれる）の無刺激下でのＴＥＥＲ値の結果を示す図である。 細胞壁多糖画分（細胞質内画分も含まれる）のサイズ排除クロマトグラフィ（Size Exclusion Chromatography, SEC）分析の結果を示す図である。 細胞壁多糖画分（細胞質内画分も含まれる）を限外濾過膜で分画した後、その分画を1μg/mLとなるように添加した際の無刺激下でのＴＥＥＲ値の結果を示す図である。 分子量１万以下の画分の親水性相互作用クロマトグラフィー（Hydrophilic interaction chromatography, HILIC）分析した結果および分取したフラクションを示す図である。 分子量１万以下から採取した分画を1μg/mLとなるように添加した際の無刺激下でのＴＥＥＲ値の結果を示す図である。 分子量１万以下から採取した分画２の１Ｈ－ＮＭＲのスペクトルを示す図である。 ウリジン二リン酸－Ｎ－アセチルムラミン酸－Ｌ－アラニン－Ｄ－グルタミン酸－Ｌ－リジンの構造を示す図である。 分子量１～３万の画分のHILIC分析した結果および分取したフラクションを示す図である。 分子量１～３万から採取した分画を1μg/mLとなるように添加した際の無刺激下でのＴＥＥＲ値の結果を示す図である。 分子量１～３万から採取した分画１および分画２の１Ｈ－ＮＭＲのスペクトルを示す図である。 分画２の構成糖分析の結果を示す図である。 多糖の構造を示す図である。
　本発明の腸管バリア保護剤（以下、「本発明保護剤」という）のうち、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）を有効成分とするものは本発明保護剤１という。また、本発明保護剤のうち、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの細胞壁多糖画分および／または細胞質内画分、ラムノース、グルコース、ガラクトースが４～３：１：２～１の繰り返し構造であり、限外濾過膜による分画分子量が１～３万である多糖、または、ウリジン二リン酸－Ｎ－アセチルムラミン酸－Ｌ－アラニン－Ｄ－グルタミン酸－Ｌ－リジンを有効成分とするものは本発明保護剤２という。
　まず、本発明保護剤のうち、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスを有効成分とする本発明保護剤１について説明する。
　本発明保護剤１に用いられるビフィドバクテリウム・アドレッセンティスは、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスとして公知の株または常法（例えば、（１）ビフィズス菌の研究、編著：光岡知足、日本ビフィズス菌センター、（２）腸内菌検索手法と腸内構成菌、藤澤倫彦、日本細菌学雑誌２０１４、（３）ＰＭＩＤ: ２８３９４９２４(ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスをマウス便から単離しているが、ヒトに適用可能）)で分離したものの何れでもよいが、例えば、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 13021、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 13609、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 12828、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス基準株（ATCC15703）、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 13022、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 11033、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 11034、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 11040等が挙げられる。これらのビフィドバクテリウム・アドレッセンティスは１種または２種以上を組み合わせて用いることができる。
　これらのビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの中でもビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 13021、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 13609、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 12828が好ましく、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 13021がより好ましい。
　本発明保護剤１に用いられるビフィドバクテリウム・アドレッセンティスには、前記した菌株の他、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの性質を維持したまま、人為的に遺伝子操作等した株も含まれる。また、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスは生菌でも死菌でも効果を発揮するが生菌が好ましい。
　上記ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスのうち、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 13021は、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 13021（NITE BP-03808、受託日：２０２３年１月２４日）としてブダペスト条約の国際寄託当局である独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に国際寄託されている。
　ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 13609は、YIT 13609（NITE P-04064、受託日：２０２４年１月１５日）として独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（〒２９２－０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室）に国内寄託されていたものを、２０２４年１２月９日に国際寄託への移管請求を行いYIT 13609（NITE BP-04064、受託日：２０２４年１月１５日）として、ブダペスト条約の国際寄託当局である上記特許微生物寄託センターに国際寄託されている。
　ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 12828は、YIT 12828（NITE P-04065、受託日：２０２４年１月１５日）として上記特許微生物寄託センターに国内寄託されていたものを、２０２４年１２月９日に国際寄託への移管請求を行いYIT 12828（NITE BP-04065、受託日：２０２４年１月１５日）として、ブダペスト条約の国際寄託当局である上記特許微生物寄託センターに国際寄託されている。
　ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 13022は、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 13022（NITE BP-03809、受託日：２０２３年１月２４日）として上記国際寄託当局に国際寄託されている。
　ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 11033は、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 11033（NITE BP-03810、受託日：２０２３年１月２４日）として上記国際寄託当局に国際寄託されている。
　ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 11034は、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 11034（NITE BP-03811、受託日：２０２３年１月２４日）として上記国際寄託当局に国際寄託されている。
　ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 11040は、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 11040（NITE BP-03812、受託日：２０２３年１月２４日）として上記国際寄託当局に国際寄託されている。
　本発明保護剤１は、上記ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスを有効成分とすることにより、ＬＰＳ刺激、炎症性サイトカイン刺激および酸化ストレス刺激から選ばれる１以上の刺激からの腸管バリアの保護、好ましくは前記２以上の刺激からの腸管バリアの保護、より好ましくは前記３の刺激からの腸管バリアの保護をすることができる。
　ここでＬＰＳ刺激とは、腸内細菌由来の毒素であるリポポリサッカライド（ＬＰＳ）が、腸管上皮細胞に作用することをいう。
　炎症性サイトカイン刺激とは、ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６等の炎症性サイトカインが、腸管上皮細胞に作用することをいう。
　酸化ストレス刺激とは、酸化ストレスにより生じた過酸化水素等の活性酸素種が腸管上皮細胞に作用することをいう。
　ここで腸管バリアの保護とは、後述する実施例で示されるように、ＬＰＳ刺激、炎症性サイトカイン刺激、酸化ストレス刺激から選ばれる１以上の刺激、好ましくは前記２以上の刺激、より好ましくは前記３の刺激があっても腸管に存在するタイトジャンクションタンパク質の発現または局在が乱れたり、破綻したりしないこと、または腸管バリア強度の指標値（経上皮電気抵抗値；ＴＥＥＲ）の低下を抑制することを言う。
　本発明保護剤１の形態は特に限定されず、従来公知のビフィズス菌と同様に、発酵乳、ヨーグルト、菌末サプリメント等の飲食品、乳酸菌、ビフィズス菌製剤等の医薬品等が挙げられる。これらの中でも発酵乳等の発酵食品、乳酸菌、ビフィズス菌製剤等の医薬品が好ましい。
　本発明保護剤１は、ヒトを含む哺乳動物に投与することにより腸管バリアの保護をすることができる。この場合、本発明保護剤１にはビフィドバクテリウム・アドレッセンティスを１日あたり１０５～１０１０ｃｆｕ程度の摂取量となる量で含有させればよい。
　本発明保護剤１は、上記した通り、腸管バリアの保護をすることができるため、腸管バリアの破綻に関連する疾患の予防剤（以下、「本発明予防剤１」という）とすることができる。なお、本発明予防剤１は、腸管バリアの乱れも保護することができるため、腸管バリアの破綻に関連する疾患には、腸管バリアの乱れに関連する疾患も含まれる。腸管バリア破綻関連疾患としては、例えば、糖尿病、肥満、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎等）、脂肪肝、パーキンソン病、がん、過敏性腸疾患、脂質異常症、アトピー、喘息、認知症、不眠症、うつ、関節リウマチ等が挙げられる。これらの腸管バリア破綻関連疾患の中でも、肥満および糖尿病が好ましい。
　本発明予防剤１は、ヒトを含む哺乳動物に投与することにより腸管バリア破綻関連疾患の予防をすることができる。この場合、本発明予防剤１にはビフィドバクテリウム・アドレッセンティスを１日あたり１０５～１０１０ｃｆｕ程度の摂取量となる量で含有させればよい。
　上記した疾患が腸管バリアの破綻に関連することは以下の文献に記載されている。
＜炎症性腸疾患、肥満症、脂肪肝＞
Lee. B, et al., J Immunol Res. 2018. 2645465. 2018
＜パーキンソン病＞
Van Ijzendoorn. S. C. D, et al., J Parkinsons Dis. 9. S323. 2019
＜がん、過敏性腸疾患＞
Oshima. T, et al., J Gastroenterol. 51. 768. 2016
＜脂質異常症＞
Flaig. B, et al., Nutrients. 15. 228. 2023
＜アトピー、喘息＞
Niewiem. M, et al., Nutrients. 14. 1893. 2022
＜認知症＞
Stadlbauer. V, et al., BMC Geriatr. 20. 248. 2020
＜不眠症、うつ＞
Li. Y, et al., Front Psychiatry. 9. 669. 2018
＜関節リウマチ＞
Matei. D. E, et al., Med. 2. 864. e9. 2021
　本発明保護剤１や本発明予防剤１に用いられるビフィドバクテリウム・アドレセンティスのうち、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 13021、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 13022、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 11033、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 11034、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 11040等はでんぷん顆粒に接着して資化する性質を有している。このような性質はビフィドバクテリウム・アドレッセンティス基準株（ATCC15703）にはない。このことおよび上記性質を確かめるための試験方法等については、２０２３年１月３１日の国際出願（ＰＣＴ／ＪＰ２０２３／ ３０１８）に記載されている。
　そのため、本発明保護剤１および本発明予防剤１に、上記性質を有するビフィドバクテリウム・アドレッセンティスを用いる場合には、これらと共に、でんぷん顆粒を含有させることが好ましい。それにより腸内で競争状態にあるユウバクテリウム・レクターレ等の腸内細菌のでんぷん顆粒への接着を抑制し、自身が接着、集住することができるため効果が高まる。ここで、上記性質をより得やすくするために、溶性でんぷん、でんぷん顆粒、デキストリン等が添加された培地でビフィドバクテリウム・アドレッセンティスを培養することが好ましい。
　ここででんぷん顆粒とは、バレイショ、サツマイモ等のイモ類、コムギ、コメ、トウモロコシ等の穀類、ダイズ、アズキ等の豆類、あるいはタピオカ、バナナ等由来のでんぷんであって、製造時の乾燥工程を除いて水を含む加熱工程(煮る、蒸すなど)を経ていないか、もしくは水を含む加熱工程を経ても糊化しておらず、天然の顆粒状態を保ち、常温の水に不溶のものをいう。より具体的にでんぷん顆粒は、未調理のバレイショ、サツマイモ等のイモ類、コムギ、コメ、トウモロコシ等の穀類、ダイズ、アズキ等の豆類、あるいはタピオカ、バナナ等に由来する未調理のでんぷんであり、球形、卵型、多面体等の顆粒形状を持ち、植物種によるが、直径は典型的には１～１２０μｍである。この直径は、顕微鏡または粒子径測定機器で測定することができる。
　本発明保護剤１および本発明予防剤１に、でんぷん顆粒を含有させる場合、１日あたり０．５～１００ｇ程度の摂取量となるように含有させればよい。
　以上説明した本発明保護剤１および本発明予防剤１は、安全に長期間、腸管バリアの保護や腸管バリア破綻関連疾患を予防することができる。
　また、本発明保護剤１は、腸管バリアの保護をするが、何も刺激が無い場合には腸管バリアを増強することもできる。そのため、本発明保護剤１は、腸管バリア増強剤としても用いることができる。ここで腸管バリアの増強とは腸管バリア強度の指標値（経上皮電気抵抗値；ＴＥＥＲ）を増加させることをいう。
　次に本発明保護剤のうち、以下のビフィドバクテリウム・アドレッセンティス由来の成分の何れかを有効成分とする本発明保護剤２について説明する。なお、本発明保護剤２でいう、腸管バリアの保護とは腸管バリア強度の指標値（経上皮電気抵抗値；ＴＥＥＲ）を、何も添加しない場合と比較して、上昇させることをいう。
（１）ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの細胞壁多糖画分および／または細胞質内画分
（２）ラムノース、グルコース、ガラクトースが４～３：１：２～１の繰り返し構造であり、限外濾過膜による分画分子量が１～３万である多糖
（３）ウリジン二リン酸－Ｎ－アセチルムラミン酸－Ｌ－アラニン－Ｄ－グルタミン酸－Ｌ－リジン
　本発明保護剤２の有効成分である（１）ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの細胞壁多糖画分および／または細胞質内画分について説明する。
　ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの細胞壁多糖画分および／または細胞質内画分は、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスを溶菌処理して得られるものである。
　上記で用いられるビフィドバクテリウム・アドレッセンティスとしては、上記したビフィドバクテリウム・アドレッセンティスを有効成分とする本発明保護剤１で用いられるビフィドバクテリウム・アドレッセンティスを用いることができる。
　上記したビフィドバクテリウム・アドレッセンティスは溶菌処理をする前に、培養をしておくことが好ましい。培養は従来公知の条件で行えばよい。また、培養後は、常法に従って、遠心分離等で集菌やＰＢＳ等による洗浄を行ってもよい。
　上記したビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの溶菌処理は、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスから細胞壁多糖画分および／または細胞質内画分が得られるものであれば特に限定されず、例えば、ムラミダーゼ、ヌクレアーゼ、プロテアーゼ等の複数の酵素を適宜組み合わせて用いる公知の方法が利用できる。
　このような複数の酵素を用いた方法のうち、好ましい方法としては、ムラミダーゼで処理をした後、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼで処理する方法が挙げられる。ムラミダーゼとしては、例えば、ムタノリシン（Mutanolysin）、リゾチーム（Lysozyme）、ラビアーゼ（Labiase）などが挙げられる。ヌクレアーゼとしては、例えば、ベンゾナーゼ（Benzonase）、などが挙げられる。プロテアーゼとしては、例えば、プロナーゼ（Pronase）、トリプシン（Trypsin）などが挙げられる。
　上記の好ましい方法は次のように行われる。まず、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスを予め常法に従って十分に培養した後、遠心分離で集菌し、ＰＢＳで洗浄しておく。このビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの生菌１ｍｇに対してムラミダーゼを１～１００Ｕ、好ましくは４Ｕ添加し、３７～６０℃、好ましくは３７℃で、１２時間以上、好ましくは１６～２４時間反応させる。次いで必要により遠心等を行い不溶物を取り除き、上清を得て、これにヌクレアーゼを生菌１ｍｇに対して１～１００Ｕ、好ましくは１．４Ｕ添加し、３７～６０℃、好ましくは３７℃で、１２時間以上、好ましくは１６～２４時間反応させる。次いでこれにプロテアーゼを生菌１ｍｇに対して０．０００１～０．５ｍｇ、好ましくは０．００６ｍｇ添加し、３７～６０℃、好ましくは３７℃で、１２時間以上、好ましくは１６～２４時間反応させる。反応後は、透析膜等で精製を行ってもよい。透析膜の分画分子量は３，５００～１４，０００、好ましくは３，５００～８，０００である。
　上記のようにして（１）のビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの細胞壁多糖画分および／または細胞質内画分が得られる。このビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの細胞壁多糖画分および／または細胞質内画分の物性は以下の通りである。
性状：白～淡灰茶色の固体
　このビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの細胞壁多糖画分および／または細胞質内画分は腸管バリア保護作用を有する。
　次に本発明保護剤２の有効成分である（２）ラムノース、グルコース、ガラクトースが４～３：１：２～１の繰り返し構造であり、好ましくは３：１：１あるいは４：１：２の繰り返し構造であり、限外濾過膜による分画分子量が１～３万である多糖について説明する。なお、この多糖は以下の式で表される構造を有しており、新規物質である。
　この多糖の物性は以下の通りである。
性状：白～淡黄色の固体
　この多糖はビフィドバクテリウム・アドレッセンティスを溶菌処理し、次いで、これを限外濾過膜により分画分子量が１～３万の画分を得て、更に、これを以下の条件またはこれと同等の条件で行われる親水性相互作用クロマトグラフィー、
［クロマトグラフィー条件］
　流速: 1.0 mL/min
　移動相 A: MeCN, B: H2O 
　グラジエント：0-3.3 min:A=95, B=5, 3.3-83.3 min: A=95→0, B=5→100
　カラム: YMC-triart Diol HILIC (φ4.6x250 mm, 5 μm)
　温度: 40 ℃
　注入量: 2～10 μL (5 mg/mL in H2O)
　検出：charged aerosol detector (CAD)
　溶出時間：22～35 min
で採取することにより製造することができる。
　上記において用いられるビフィドバクテリウム・アドレッセンティスおよび溶菌処理については、上記と同様である。
　溶菌処理後、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの細胞壁多糖画分および／または細胞質内画分が得られる。これについて限外濾過膜で精製して分画分子量が１～３万の画分を得る。この際に用いる限外濾過膜としては、上記分子量のものが得られれば特に限定されないが、例えば、分画分子量１０万、分画分子量３万、分画分子量１万の限外濾過膜を組み合わせて用いることが好ましく、分画分子量３万、分画分子量１万の限外濾過膜を組み合わせて用いることがより好ましい。
　精製後、限外濾過膜による分画分子量が１～３万の画分が得られる。これについて上記した条件で親水性相互作用クロマトグラフィーを行い、ラムノース、グルコース、ガラクトースが４～３：１：２～１の繰り返し構造であり、限外濾過膜による分画分子量が１～３万である多糖を採取する。
　上記親水性相互作用クロマトグラフィーおいては、上記条件の他に、この条件を適宜変更してラムノース、グルコース、ガラクトースが４～３：１：２～１の繰り返し構造であり、限外濾過膜による分画分子量が１～３万である多糖が得られる同等の条件で行うことができる。このような同等の条件としては、当業者が上記条件を参考に、流速、移動相組成、カラム担体の種類、カラム担体の粒子径、カラムの長さ、温度、注入量および注入液の濃度を適宜変更して設定することができ、具体的には以下のものが挙げられる。
［クロマトグラフィー条件］
　流速: 0.5～1.0 mL/min
　移動相 A: MeCN, B: H2O 
　グラジエント：（a)～c)の何れか）
　　a) 0-2 min: A = 95, B = 5, 2-25 min: A = 95→0, B = 5→100、
　　b) 0-2 min: A = 95, B = 5, 2-50 min: A = 95→0, B = 5→100
　　c) 0-2 min: A = 95, B = 5, 2-100 min: A = 95→0, B = 5→100
　カラム: YMC-triart Diol HILIC (φ4.6x150 mm, 5 μm)
　温度: 40 ℃
　注入量: 2～10 μL (5 mg/mL in H2O)
　検出：charged aerosol detector (CAD)
　溶出時間：流速1.0 mL/min；a) 8～11 min、b) 13～19 min、c) 25～35 min
　　　　　　流速0.5 mL/min；a) 10～13 min、b) 15～21 min、c) 27～37 min
　上記のようにして（２）のラムノース、グルコース、ガラクトースが４～３：１：２～１の繰り返し構造であり、限外濾過膜による分画分子量が１～３万である多糖が得られる。この多糖が得られたかどうかは、例えば、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ等を用いた構造解析や構成糖分析で確認することができる。具体的には、Shodex SUGER KS-804カラム（昭和電工 F6378035）を用いたSEC分析において、溶出時間８～９分付近にピークを確認することができる。より具体的には、後記する実施例に記載の方法で確認することができる。
　このラムノース、グルコース、ガラクトースが４～３：１：２～１の繰り返し構造であり、限外濾過膜による分画分子量が１～３万である多糖は腸管バリア保護作用を有する。
　最後に本発明保護剤２の有効成分である（３）ウリジン二リン酸－Ｎ－アセチルムラミン酸－Ｌ－アラニン－Ｄ－グルタミン酸－Ｌ－リジンについて説明する。
　このウリジン二リン酸－Ｎ－アセチルムラミン酸－Ｌ－アラニン－Ｄ－グルタミン酸－Ｌ－リジン（CAS No. 143436-84-4など、）は、公知の化合物であり、細胞質内の構成成分で以下の化学式で表されるものである（Nicolas Gisch, Birte Buske, Holger Heine, Buko Lindner, Ulrich Zahringer, Synthesis of biotinylated muramyl tripeptides with NOD2-stimulating activity, Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 2011(21) 3362.）。
　このウリジン二リン酸－Ｎ－アセチルムラミン酸－Ｌ－アラニン－Ｄ－グルタミン酸－Ｌ－リジンは、市販品を利用してもよいし、上記文献に基づいて得てもよいし、後記する実施例に記載に基づいて、上記（１）ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの細胞壁多糖画分および／または細胞質内画分から得てもよい。
　このウリジン二リン酸－Ｎ－アセチルムラミン酸－Ｌ－アラニン－Ｄ－グルタミン酸－Ｌ－リジンは腸管バリア保護作用を有する。
　本発明保護剤２は、上記（１）～（３）の何れかを有効成分とすることにより腸管バリアを保護することができる。
　本発明保護剤２の形態は、上記（１）～（３）の何れかを含有していて投与に適したものであれば特に限定されず、例えば、ヒト用の医薬品、飲食品、サプリメント等とすることができる。
　医薬品としては、上記（１）～（３）の何れかをそのまままたは必要に応じ、薬学的に許容される担体と組み合わせて製剤化できる。薬学的に許容される担体としては、例えば、グルコース、乳糖、澱粉、マンニトール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレングリコール、ヒドロキシエチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水等が挙げられる。更に必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、賦形剤等の慣用の添加剤を適宜添加することもできる。
　また、剤型も特に限定されず、液剤、粉剤、顆粒剤、カプセル剤、錠剤等が例示され、常法に従って製造することができる。本発明保護剤２中の有効成分の含有量は特に制限されず、例えば、１～１００質量％が好ましく、より好ましくは５～７０質量％であり、特に好ましくは１０～６０質量％である。
　本発明保護剤２を飲食品の形態とする場合、上記（１）～（３）の何れかをそのまままたは必要に応じ、公知の飲食品に用いられる添加物、素材等を配合し、常法に従って調製することができる。飲食品としては、例えば、パン、ビスケット、ホットケーキ、麺、錠菓等のデンプンを主体とする食品、ガム、キャンディー、和菓子等の菓子類、ハム、ソーセージ等の畜肉食品、ちくわ、かまぼこ等の魚肉食品、魚介類食品、ドレッシング、醤油、ジャム、ふりかけ等の調味料、茶、ジュース、清涼飲料、酒類等の飲料等が挙げられる。
　本発明保護剤２をサプリメントの形態とする場合、上記（１）～（３）の何れかをそのまままたは必要に応じ、公知のサプリメントに用いられる添加物、素材等を配合し、常法に従って調製することができる。
　本発明保護剤２は、ヒトを含む哺乳動物に投与することにより腸管バリアの保護をすることができる。この場合、本発明保護剤２を一日あたり、（１）ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの細胞壁多糖画分および／または細胞質内画分であれば０．００００６０～２７０ｍｇとなる量で投与すればよく、（２）ラムノース、グルコース、ガラクトースが４～３：１：２～１の繰り返し構造であり、限外濾過膜による分画分子量が１～３万である多糖であれば０．０００００３２４～１５ｍｇとなる量で投与すればよく、（３）ウリジン二リン酸－Ｎ－アセチルムラミン酸－Ｌ－アラニン－Ｄ－グルタミン酸－Ｌ－リジンであれば０．０００００４２０～１９ｍｇとなる量で投与すればよい。
　以上説明した本発明保護剤２は、上記した通り、腸管バリアの保護をすることができるため、腸管バリアの破綻に関連する疾患の予防剤（以下、「本発明予防剤２」という）とすることができる。なお、本発明予防剤２は、腸管バリアの乱れも保護することができるため、腸管バリアの破綻に関連する疾患には、腸管バリアの乱れに関連する疾患も含まれる。腸管バリア破綻関連疾患としては、例えば、糖尿病、肥満、炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎等）、脂肪肝、パーキンソン病、がん、過敏性腸疾患、脂質異常症、アトピー、喘息、認知症、不眠症、うつ、関節リウマチ等が挙げられる。これらの腸管バリア破綻関連疾患の中でも、肥満および糖尿病が好ましい。
　本発明予防剤２は、ヒトを含む哺乳動物に投与することにより腸管バリア破綻関連疾患の予防をすることができる。この場合、本発明予防剤２を一日あたり、（１）ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの細胞壁多糖画分および／または細胞質内画分であれば０．００００６０～２７０ｍｇとなる量で投与すればよく、（２）ラムノース、グルコース、ガラクトースが４～３：１：２～１の繰り返し構造であり、限外濾過膜による分画分子量が１～３万である多糖であれば０．０００００３２４～１５ｍｇとなる量で投与すればよく、（３）ウリジン二リン酸－Ｎ－アセチルムラミン酸－Ｌ－アラニン－Ｄ－グルタミン酸－Ｌ－リジンであれば０．０００００４２０～１９ｍｇとなる量で投与すればよい。
　上記した疾患が腸管バリアの破綻に関連することは本発明予防剤１の説明で用いたのと同様の文献に記載されている。
　本発明保護剤２および本発明予防剤２は、安全に長期間、腸管バリアの保護や腸管バリア破綻関連疾患を予防することができる。
　また、本発明保護剤２は、腸管バリアの保護をするが、何も刺激が無い場合には腸管バリアを増強することもできる。そのため、本発明保護剤２は、腸管バリア増強剤としても用いることができる。ここで腸管バリアの増強とは腸管バリア強度の指標値（経上皮電気抵抗値；ＴＥＥＲ）を何も添加しない場合と比較して、上昇させることをいう。
　以下、本発明を実施例を挙げて詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に何ら限定されるものではない。なお、以下の全ての実施例において有意差検定はｔ検定で行われ、＊はｐ＜０．０５、＊＊はｐ＜０．０１、＊＊＊はｐ＜０．００１を示している。
実　施　例　１
　　　腸管バリア保護作用：
　試験菌株として、ビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 13021（NITE BP-03808）（以下、「YIT 13021」という）を用いた。対照菌株としては、ビフィドバクテリウム・ブレーベ基準株（ATCC15700）（以下、「YIT 4014」という）を用いた。これらの菌株は、ｍＧＡＭ培地に１％グルコースを追加して培養し、ＬＰＳ刺激、炎症性サイトカイン刺激または酸化ストレス刺激に対する腸管バリア保護作用について、刺激を与えていないものをコントロールとして試験した。また、YIT 13021のタイトジャンクションタンパク質の局在への影響も試験した。
（１）ＬＰＳ刺激
１．１　細胞
　凍結保存済みのヒト結腸上皮細胞株Ｔ８４を使用した。Ｔ８４は、１０％ ＦＢＳ、１００ μｇ/ｍＬストレプトマイシンを含んだＤＭＥＭ/Ｆ－１２培地（１０％ ＦＢＳ／Ｆ－１２）を用いて、５％ ＣＯ２、３７℃で継代培養を行った。
１．２　単層膜の作製
　Ｔ８４単層膜は２４ウェルセルカルチャーインサートプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて作製した。培養ディッシュにて８０％コンフルエントのＴ８４を回収し、６０，０００ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるように４００μＬの１０％ ＦＢＳ/Ｆ－１２にてウェルのＡｐｉｃａｌ側に播種し、Ｂａｓａｌ側には８００μＬの１０％ ＦＢＳ／Ｆ－１２を添加し、５％ ＣＯ２、３７℃で培養を行った。２～３日ごとにＡｐｉｃａｌ側に４００μＬ、Ｂａｓａｌ側には８００μＬの培地で培地交換を行った。Ｔ８４は培養を１０日間行うことで単層膜を作製した。
１．３　ＬＰＳ刺激した単層膜に対する保護作用の評価
　ＬＰＳは、大腸菌Ｏ５５由来のＬＰＳ（ＷＡＫＯ， ♯１２８－０５１７１）を用い、１０％ ＦＢＳ/Ｆ－１２に溶かして試験濃度である１０ ｎｇ/ｍＬに調製した。ＬＰＳによる刺激は、作製した単層膜のＡｐｉｃａｌおよびＢａｓａｌの両側にＬＰＳ含有培地を加えることで行った。YIT 13021またはYIT 4014の加熱死菌体を公知の方法で調製し、これを１００ μｇ/ｍＬ（約２．４×１０８ ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）の濃度になるように単層膜のＡｐｉｃａｌ側のみに添加し、刺激による単層膜へのダメージに対する保護作用は、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ ＭＲＳ－２（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により測定した実測抵抗値（Ω）をセルカルチャーインサートプレートの培養面積（cm2）で割った値である経上皮電気抵抗（ＴＥＥＲ）値（Ω/cm2）により評価した。刺激開始から各経過時間後の単層膜のＴＥＥＲ値を、刺激開始直後である０時間時のＴＥＥＲ値で割ることにより、バリアの破綻を刺激開始時からの変化率（％）として算出した。
１．４　結果
　YIT 13021またはYIT 4014の腸管バリア機能への影響を検討するため、Ｔ８４をセルカルチャーインサートプレートに播種し、１０日間培養して単層膜を作製した。その単層膜にＬＰＳおよび菌株の加熱死菌体をそれぞれ添加し、４８時間後まで２４時間ごとにＴＥＥＲ値を測定した（図１）。その結果、添加から４８時間後において、YIT 13021を添加した単層膜においてＴＥＥＲ値の低下が認められず、ＬＰＳ刺激によるＴＥＥＲ値の低下が有意に抑制され、YIT 4014についてはＬＰＳ刺激のみと同じであった（図２）。
（２）炎症性サイトカイン刺激
２．１　細胞
　上記（１）ＬＰＳ刺激の１．１と同様の細胞を用いた。
２．２　単層膜の作製
　上記（１）ＬＰＳ刺激の１．２と同様にして単層膜を作製した。
２．３　炎症性サイトカイン刺激した単層膜に対する保護作用の評価
　炎症性サイトカインは、ＴＮＦ－α（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ♯２１０－ＴＡ－００５）およびＩＦＮ－γ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ, ♯２８５－ＩＦ－１００）を用い、両サイトカインは等量で１０％ ＦＢＳ/Ｆ－１２に溶かして試験濃度である１ ｎｇ/ｍＬに調製した。ＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γによる刺激は、作製した単層膜のＢａｓａｌ側のみにサイトカイン含有培地を加えることで行った。刺激開始から各経過時間後の単層膜のＴＥＥＲ値の測定や変化率（％）の算出は上記（１）ＬＰＳ刺激の１．３と同様にして行った。
２．４　結果
　Ｔ８４の単層膜に炎症性サイトカインであるＴＮＦ－αおよびＩＦＮ－γを加え、同時にYIT 13021またはYIT 4014をそれぞれ添加することで、炎症性サイトカインによるバリアの破綻に対するそれらの保護作用を評価した。２４、４８時間後のＴＥＥＲ値を評価した（図３）。ＴＩはＴＮＦ－α+ＩＦＮ－γを表す。その結果、炎症性サイトカイン刺激のみ、YIT 4014を添加した単層膜は２４時間後ではあまり変化が認められなかったが４８時間後にはＴＥＥＲ値が５０％程にまで低下した。一方で、YIT 13021を添加した単層膜では、２４時間後にＴＥＥＲ値がＣｔｒｌと比べて２０％程上昇した。４８時間後での刺激による低下も７０％程にとどまり、炎症性サイトカイン刺激によるＴＥＥＲ値の低下が有意に抑制された（図４）。
（３）酸化ストレス刺激
３．１　細胞
　上記（１）ＬＰＳ刺激の１．１と同様の細胞を用いた。
３．２　単層膜の作製
　上記（１）ＬＰＳ刺激の１．２と同様にして単層膜を作製した。
３．３　酸化ストレス刺激した単層膜に対する保護作用の評価
　酸化ストレスには、Ｈ２Ｏ２（三菱, ＃Ｋ－８２３０）を用い、１０％ ＦＢＳ/Ｆ－１２に希釈して試験濃度である１５００ μＭに調製した。Ｈ２Ｏ２による刺激は、作製した単層膜のＡｐｉｃａｌおよびＢａｓａｌの両側にＨ２Ｏ２含有培地を加えることで行った。刺激開始から各経過時間後の単層膜のＴＥＥＲ値の測定や変化率（％）の算出は上記（１）ＬＰＳ刺激の１．３と同様にして行った。
３．４　結果
　Ｔ８４の単層膜にＨ２Ｏ２を加え、同時にYIT 13021またはYIT 4014をそれぞれ添加することで、酸化ストレスによるバリアの破綻に対するそれらの保護作用を評価した。添加６時間後まで１時間ごとにＴＥＥＲ値を測定した（図５）。その結果、YIT 4014ではＨ２Ｏ２刺激に対する保護作用は見られなかったが、YIT 13021を添加した単層膜ではＨ２Ｏ２刺激のみの場合と比較して有意にＴＥＥＲ値の低下が抑制され、Ｈ２Ｏ２刺激に対する保護作用が認められた（図６）。
（４）タイトジャンクションタンパク質の局在への影響
４．１　細胞
　上記（１）ＬＰＳ刺激の１．１と同様の細胞を用いた。
４．２　単層膜の作製
　上記（１）ＬＰＳ刺激の１．２と同様にして単層膜を作製した。
４．３　単層膜の免疫染色
　単層膜をＰＢＳにて２回洗浄後、２４ウェルセルカルチャーインサートプレートに１０％ 中性緩衝ホルマリン液を加え、固定化を１５分間行った。２回の洗浄操作後、０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００/ＰＢＳによる透過処理を５分間行った。さらに２回の洗浄操作、３７℃にて１０％ ＢＳＡ/ＰＢＳによるブロッキングを６０分間行った。これを除去した後、ＰＢＳに１００倍希釈したＡｎｔｉ－ＺＯ－１抗体（Ａｂｃａｍ， ＃ａｂ２１６８８０）を添加し、４℃にて一晩インキュベートした。洗浄操作を2回行い、ＰＢＳにて５００倍に希釈した抗ラビット Ａｌｅｘａ ５４６抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， ＃Ａ１１０１０）を添加し、３７℃、暗所にて６０分間インキュベートした。最後に洗浄操作を3回行い、セルカルチャーインサートプレートのメンブレンを切り取ってスライドガラスに乗せ、封入剤であるＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ ｗｉｔｈ ＤＡＰＩ（ＶＥＣＴＯＲ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＩＥＳ）を一滴乗せてカバーガラスを被せて観察用のスライドガラスを作製した。細胞はオールインワン蛍光顕微鏡ＢＺ－Ｘ７００（Ｋｅｙｅｎｃｅ）を用いて観察した。
４．４　結果
　上記（１）～（３）と同様に単層膜に対して各刺激を行い、炎症性サイトカインおよびＬＰＳ刺激は４８時間、酸化ストレス刺激は６時間後に、タイトジャンクションを構成するタンパク質であるＺＯ－１を免疫染色して各単層膜を観察したもの（図７中－のもの）、あるいは、ＺＯ－１を免疫染色したものに、上記（１）～（３）と同様にして各刺激するのと同時にYIT 13021を添加した後、単層膜を観察したもの（図７中＋のもの）でYIT 13021のバリア機能の保護作用を評価した（図７）。ＬＰＳ刺激、炎症性サイトカイン刺激、酸化ストレス刺激に対するYIT 13021の保護作用を評価した結果、刺激のみではＺＯ－１の網目状の局在の一部が途切れており、細胞膜だけでなく細胞質にもＺＯ－１の存在が認められ、タイトジャンクションが乱れていることが確認できた。その一方、YIT 13021を刺激と同時に添加した単層膜では、ＺＯ－１の網目状の局在の途切れ、および細胞質における存在量が減っており、YIT 13021によりタイトジャンクションの乱れが抑えられていることが分かった。この結果から、タイトジャンクションタンパク質の局在の観点からも腸管バリアの保護作用が確認できた。
実　施　例　２
　　　腸管バリア増強作用：
　試験菌株として、YIT 13021およびYIT 4014を用いた。これらの腸管バリア機能への影響を検討するため、実施例１と同様に調製したＴ８４をセルカルチャーインサートプレートに播種し、１０日間培養して単層膜を作製した。その単層膜のＡｐｉｃａｌ側にYIT 13021またはYIT 4014の加熱死菌体をそれぞれ添加し（刺激なし）、６時間後まで1時間ごとにＴＥＥＲ値を測定した（図８）。その結果、YIT 13021を添加した６時間後の単層膜において無処置のＣｔｒｌと比べ有意なＴＥＥＲ値の上昇がみられた（図９）。一方、YIT 4014を添加した単層膜においては無処置のＣｔｒｌと同程度であった。
　この結果から、YIT 13021は腸管バリアの増強作用を有することが分かった。
実　施　例　３
　　　腸管バリア保護作用：
　YIT 13021以外のビフィドバクテリウム・アドレッセンティスにもYIT 13021と同様の腸管バリア保護作用を試験した。ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスとしては、YIT 13609（NITE BP-04064）、YIT 12828（NITE BP-04065）を用いた。
（１）ＬＰＳ刺激
　実施例１の（１）ＬＰＳ刺激と同様にして単層膜のＡｐｉｃａｌ側にそれぞれの菌株の加熱死菌体を添加し、４８時間後にＴＥＥＲ値を測定した。その結果、添加から４８時間後において、YIT 13609、YIT 12828はYIT 13021と同等のＬＰＳ刺激に対する腸管バリア保護作用があることが分かった（図１０）。
（２）炎症性サイトカイン刺激
　実施例１の（２）炎症性サイトカイン刺激と同様にして単層膜のＡｐｉｃａｌ側にそれぞれの菌株の加熱死菌体を添加し、４８時間後にＴＥＥＲ値を測定した。その結果、添加から４８時間後において、YIT 13609、YIT 12828はYIT 13021と同等の炎症性サイトカイン刺激に対する腸管バリア保護作用があることが分かった（図１１）。
（３）酸化ストレス刺激
　実施例１の（３）酸化ストレス刺激と同様にして単層膜のＡｐｉｃａｌ側にそれぞれの菌株の加熱死菌体を添加し、６時間後にＴＥＥＲ値を測定した。その結果、添加から６時間後において、YIT 13609、YIT 12828はYIT 13021と同等の酸化ストレス刺激に対する腸管バリア保護作用があることが分かった（図１２）。
実　施　例　４
　　　腸管バリア増強作用：
　試験菌株として、YIT 13021、YIT 13609およびYIT 12828を用いた。これらの腸管バリア機能への影響を検討するため、実施例１と同様に調製したＴ８４をセルカルチャーインサートプレートに播種し、１０日間培養して単層膜を作製した。その単層膜のＡｐｉｃａｌ側にYIT 13021、YIT 13609またはYIT 12828の加熱死菌体をそれぞれ添加し、２４時間後にＴＥＥＲ値を測定した。その結果、YIT 13609、YIT 12828はYIT 13021と同等の腸管バリアの増強作用を有することが分かった（図１３）。
実　施　例　５
　　　腸管バリア増強作用：
　YIT 13021の生菌の腸管バリア機能への影響を検討するため、実施例１と同様に調製したＴ８４をセルカルチャーインサートプレートに播種し、１０日間培養して単層膜を作製した。その単層膜のＡｐｉｃａｌ側にYIT 13021の生菌または加熱死菌体を各濃度で添加し、２４時間後にＴＥＥＲ値を測定して比較した。その結果、加熱死菌体は、１０ μｇ/ｍＬの添加濃度から有意なＴＥＥＲ値の上昇が認められ（図１４）、生菌では1 μｇ/ｍＬの添加濃度から有意なＴＥＥＲ値の上昇が確認され、生菌の方が低濃度域からバリア増強作用を発揮することが分かった（図１５）。
実　施　例　６
　　　腸管バリア増強作用：
　YIT 13021は、でんぷん顆粒に接着して資化する特徴を有しており、培養時におけるでんぷん顆粒の有無は菌体の性質に影響を及ぼす可能性がある。そこで、ｍＧＡＭ培地中の炭素源をグルコースからでんぷん顆粒へと変更して培養したYIT 13021の生菌の腸管バリア機能への影響を検討した。実施例１と同様に調製したＴ８４をセルカルチャーインサートプレートに播種し、１０日間培養して単層膜を作製した。その単層膜のＡｐｉｃａｌ側にでんぷん顆粒存在下で培養したYIT 13021の生菌を各濃度で添加し、２４時間後にＴＥＥＲ値を測定して比較した。その結果、でんぷん顆粒存在下で培養したYIT 13021の生菌では０．１ μｇ/ｍＬの添加濃度から有意なＴＥＥＲ値の上昇が確認され、グルコースを炭素源として培養したYIT 13021の生菌（図１５）よりも、でんぷん顆粒と組み合わせて培養した生菌の方が低濃度域からバリア増強作用を発揮することが分かった（図１６）。
実　施　例　７
　　　ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの細胞壁多糖画分の腸管バリア保護作用：
　ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスに属する菌株を培養した後、溶菌処理をして細胞壁多糖画分を取得し、分析をした。
（１）菌株
　菌株としてビフィドバクテリウム・アドレッセンティス YIT 13021（NITE BP-03808）（以下、「YIT 13021」という）を用いた。
（２）培養
　YIT 13021菌株を1% 溶性でんぷん（富士フィルム和光純薬 191-03985）を添加した変法GAM培地（以下「1% Starch mGAM」という）で、嫌気条件下、37℃で培養を行った。
（３）溶菌処理
2 mM MgCl2含有5 mM Tris-maleate buffer（pH 6.8）の調製
　Tris-maleate（Sigma 93328-25G）1.91 g（8.05 mmol）を超純水800 mLに溶解し、0.1 mol/L 水酸化ナトリウム水溶液（関東化学 37851-08）でpH 6.8に調製した。この液に超純水を加え、1.6 Lとし、0.2 μmフィルタ（Thermo 567-0020）でろ過滅菌した。ろ液270 mLに、塩化マグネシウム六水和物（関東化学 25009-30）109.78 mg（0.540 mmol）を加え、2 mM MgCl2含有5 mM Tris-maleate buffer（pH 6.8）を調製した。
　1% Starch mGAM培地から培養した生菌400 mg（乾燥菌体量）を、2 mM MgCl2含有5 mM Tris-maleate buffer（pH 6.8）に13.9 mg/mLとなるように懸濁し、菌体1 mgに対してムラミダーゼとしてMutanolysinを4 U加え、37℃で振とうしながら24時間反応させた。
　残りの反応液を24℃、12,000 ×gで45分遠心し、不溶物を沈殿させ、上清を回収した。上清にヌクレアーゼとしてBenzonaseを菌体1 mgに対して1.4 U加え、37℃ で24時間反応させた。続いて、プロテアーゼとしてPronaseを菌体1 mgに対して0.006 mg加え、37℃ で振とうしながら24時間反応させた。分画分子量3,500の透析膜を用いて純水中、室温下、72時間透析を行った後、凍結乾燥することで細胞壁多糖画分（42.5 mg）を得た。
　この細胞壁多糖画分の無刺激下でのＴＥＥＲ値を以下の方法に基づいて測定した。その結果を図１７に示した。この結果から細胞壁多糖画分に腸管バリアの保護作用があることが分かった。
＜無刺激下のＴＥＥＲ値測定＞
　T84単層膜は24ウェルセルカルチャーインサートプレート（Millipore）を用いて作製した。培養ディッシュにて80%コンフルエントのT84細胞を回収し、60,000 cells/wellとなるように400μLの10% FBS/F-12にてウェルのApical側に播種し、Basal側には800μLの10% FBS/F-12を添加し、5% CO2、37℃で培養を行った。2～3日ごとにApical側に400μL、Basal側には800μLの培地で培地交換を行った。T84は培養を10日間行うことで単層膜を作製した。
　作製した単層膜のApicalに被験物質を各濃度で添加し、24時間後にMillicell MRS-2（Millipore）にて測定した実測抵抗値（Ω）をセルカルチャーインサートプレートの培養面積（cm2）で割った値である経上皮電気抵抗（TEER）値（Ω/cm2）により、バリアの増強作用を評価した。刺激開始から各経過時間後の単層膜のTEER値を、刺激開始直後である0時間時のTEER値で割ることにより、バリアの破綻を刺激開始時からの変化率（%）として算出した。
実　施　例　８
　　　分画分子量１万以下の画分の腸管バリア保護作用：
　実施例７で得られた腸管バリアの保護作用のある細胞壁多糖画分を超純水で5 mg/mLになるように溶解し、以下の条件でSECを測定した。この結果を図１８に示した。
＜サイズ排除クロマトグラフィ（Size Exclusion Chromatography, SEC）測定＞
カラム : Shodex SUGER KS-804 (φ8.0 mm × 300 mm)
移動相 : 50 mM NaCl aq.
流速 : 1.0 mL/min
温度: 80℃
検出: refractive index detector (RI)
　SECにより細胞壁多糖画分には分子量が１万、３万、１０万、４０万以上のものが含まれることが分かった。次にこれを分画分子量１０万の限外濾過膜（ミリポア、UFC910008）、分画分子量３万の限外濾過膜（ミリポア、UFC903008）、分画分子量１万の限外濾過膜（ミリポア、UFC901008）を用いて、分子量１０万以上、１０～３万、３～１万、１万以下のものに分画した。これらについて無刺激下でのＴＥＥＲ値を以下の方法に基づいて測定した。その結果を図１９に示した。
＜無刺激下でのＴＥＥＲ値測定＞
　上記実施例７の無刺激下でのTEER値測定と同様の測定を行った。
　この結果から、分画分子量３万以下の画分（１～３万の画分および１万以下の画分）に活性があることが分かった。次に分子量１万以下の画分について親水性液体相互作用クロマトグラフィー（HILIC）分析を行った（図２０）。また、通液は２４回（計１．２ｍｇ）行い、各回、図２０中の１～４のフラクションを分取した（１（１６～２０．５分）：０．４５ｍｇ、２（２０．５～２２分）：０．２５ｍｇ、３（２２～２５分）：０．４０ｍｇ、４（５１～５６分）：０．２９ｍｇ）。
＜HILIC分析＞
流速: 1.0 mL/min
移動相 A: MeCN, B: H2O 
グラジエント：0-3.3 min:A=95, B=5, 3.3-83.3 min: A=95→0, B=5→100
カラム: YMC-triart Diol HILIC (Φ4.6x250 mm, 5 μm)
温度: 40 ℃
注入量: 10 μL (5 mg/mL in H2O)
　上記で得られた１～４の画分について、上記と同様にしてＴＥＥＲ値測定を行った。その結果を図２１に示した。分画２のみに腸管バリアの保護作用の増強が認められた。この分画２について１Ｈ－ＮＭＲ（700 MHz in D2O at 25℃）を用いて構造解析を行った。その結果を図２２に示した。
＜１Ｈ－ＮＭＲ構造解析＞
　分画２を重水（関東化学 32070-1A）に溶解し、25℃で1H-NMR（700 MHz）を測定した。
　１Ｈ－ＮＭＲの結果から、分画２は■にシグナルを有することから、細胞壁前駆物質のウリジン二リン酸－Ｎ－アセチルムラミン酸－Ｌ－アラニン－Ｄ－グルタミン酸－Ｌ－リジンであることが分かった（文献値（表１）：Nicolas Gisch, et al., Bioorganic Med. Chem. Lett. 21. 3362. 2011）。構造を図２３に示した。また、ウリジン二リン酸－Ｎ－アセチルムラミン酸－Ｌ－アラニン－Ｄ－グルタミン酸－Ｌ－リジンの分子量は１００８であるが、分画２を質量分析したところ［Ｍ＋１］が１００８．８であった（図示せず）。分画２は細胞壁前駆物質を含んでいることから、これまで測定をしていた細胞壁多糖画分には細胞質内画分も含まれていることが分かった。
（ウリジン二リン酸－Ｎ－アセチルムラミン酸－Ｌ－アラニン－Ｄ－グルタミン酸－Ｌ－リジンのシグナル）
実　施　例　９
　　　分画分子量１～３万の画分の腸管バリア保護作用：
　実施例８で得られた分画分子量１～３万の画分についてHILIC分析を行った（図２４）。また、通液は４８回（計２．４ｍｇ）行い、各回、図２４中の１～４のフラクションを分取した（１（２２～３０分）：１．１９ｍｇ、２（３０～３５分）：１．２６ｍｇ、３（３５～４２．５分）：１．０１ｍｇ、４（５１．５～５７．５分）：０．７９ｍｇ）。
＜HILIC分析＞
流速: 1.0 mL/min
移動相 A: MeCN, B: H2O, 0-3.3 min: A=95, B=5, 3.3-83.3 min: A=95→0, B=5→100
カラム: YMC-triart Diol HILIC (φ4.6x250 mm, 5 μm)
温度: 40 ℃
注入量:10 μL (5 mg/mL in H2O)
　上記で得られた１～４の画分について、上記と同様にしてＴＥＥＲ値測定を行った。その結果を図２５に示した。分画１および分画２に腸管バリアの保護作用の増強が認められた。この分画１および分画２について上記と同様にして１Ｈ－ＮＭＲ（700MHz in D2O at 25℃）を用いて構造解析を行った。その結果を図２６に示した。
　この結果によれば、分画１と分画２はNMRが類似していたことから、同一物質であることが示唆された。また、5 ppm付近の●は８糖、1 ppm付近の●はラムノース由来のシグナルであった。次に、分画２の構成糖分析を行った。
＜構成糖分析＞
　構成糖分析は1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone（PMP）誘導化による定量を行った。検量線作成のための標準品にはL-Arabinose（Ara）、6-deoxtalose（6dT）、L-Fucose（Fuc）、D-Galactosamine（GalN）、D-Galactose（Gal）、D-Galacturonic acid（GalA）、D-Glucosamine（GlcN）、D-Glucose（Glc）、D-Glucuronic acid（GlcA）、D-Mannose（Man）、Muramic acid（MurA）、L-Rhamnose（Rha）、D-Ribose（Rib）、D-Xylose（Xyl）を使用した。GlcN, Man, Rib, 6-Deoxy Tal, GlcA, GlcおよびXylの各糖の水溶液を混合し標準品混合液1として、0.0625、0.25、1および4 mMの濃度の溶液を調製した。同様に、MurA, GalN, Rha, GalA, Gal, AraおよびFuc各の糖の水溶液を混合し標準品混合液2として、0.0625、0.25、1および4 mMの濃度の溶液を調製した。内部標準には0.0625 mM D-Talose（Tal）を使用した。分画2を超純水で5 mg/mLになるように溶解して分析サンプルとした。
　超純水400 μLと8Mトリフルオロ酢酸水溶液 500 μLを各ねじ口試験管に添加し、分析サンプルまたは各濃度の標準品混合液1、2を100 μLを加え、フタをして撹拌した後、100℃で 2時間酸分解した。冷却後、遠心エバポレーターにて乾固した。400 μLの超純水を加え攪拌後、100 μLを新たなねじ口試験管に取り、内部標準100 μL、0.6 M 水酸化ナトリウム水溶液 100 μL、0.5 M PMPメタノール溶液 200 μLを加え、フタをして撹拌した後、70℃で30分間反応させた。冷却後、0.1 M 塩酸水溶液1 mLを加えて酸性とした。クロロホルム約1 mLで3回洗浄した。
　クロロホルム洗浄後の水層を0.45 μmフィルタ（ミリポア UFC30HVNB）でろ過し、以下の条件でHPLC分析を行い、ピーク面積から各糖のモル数を各糖の標準品の検量線から算出した。4～6分析毎にカラム洗浄を行った。
（HPLC分析）
カラム温度: 40 ℃
カラム: Waters CORTECS UPLC T3 (φ2.1 mm × 100 mm, 1.6 μm ) 
流速: 0.3 mL/min
移動相: 10 mM トリエチルアミン（TEA）-ギ酸（FA） (pH4.7)/MeCN=75/25
測定時間: 8 min
検出: UV 245 nm
（カラム洗浄）
カラム温度: 40 ℃
流速: 0.3 mL/min
移動相: A  H2O, B MeCN
グラジエント: 0-3 min : A=75, B=25, 3-6 min : A=75→5, B=25→95, 6-9 min : A=5, B=95, 9-12 min : A=5→75, B=95→25%, 12-15 min : A=75, B=25
検出: UV 245 nm
　構成糖分析の結果から、分画２にはラムノース（Ｒｈａ）、グルコース（Ｇｌｃ）およびガラクトース（Ｇａｌ）が含まれており、比率はＲｈａ：Ｇｌｃ：Ｇａｌ＝３．７：１．０：１．５であることが分かった（図２７）。繰り返し構造の糖数は、１Ｈ－ＮＭＲの結果から、８糖と考えていたが、糖の比率が４：１：２あるいは３：１：１と考えられるため、５～７糖と考えた。以上のことから、限外濾過膜による分画分子量１～３万の画分から単離された活性本体の化学構造は、ラムノースが主糖で他にグルコースとガラクトースを含む５～７糖の繰り返し構造で、ラムノース、グルコース、ガラクトースが４～３：１：２～１の繰り返し構造であることが分かった（図２８）。
　本発明の腸管バリア保護剤は、腸管バリアの保護や、腸管バリアの破綻に関連する疾患の予防剤に利用できる。
[規則26に基づく補充 02.04.2025]

Claims (12)

  1. ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスを有効成分とすることを特徴とする腸管バリア保護剤。
  2. 腸管バリア保護が、ＬＰＳ刺激、炎症性サイトカイン刺激および酸化ストレス刺激から選ばれる１以上の刺激からの腸管バリアの保護である請求項１記載の腸管バリア保護剤。
  3. 請求項１または２記載の腸管バリア保護剤を含有する腸管バリア破綻関連疾患予防剤。
  4. 腸管バリア破綻関連疾患が、糖尿病、肥満、炎症性腸疾患、脂肪肝、パーキンソン病、がん、過敏性腸疾患、脂質異常症、アトピー、喘息、認知症、不眠症、うつ、関節リウマチから選ばれるものである請求項３記載の腸管バリア破綻関連疾患予防剤。
  5. ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスの細胞壁多糖画分および／または細胞質内画分を有効成分とする腸管バリア保護剤。
  6. ラムノース、グルコース、ガラクトースが４～３：１：２～１の繰り返し構造であり、限外濾過膜による分画分子量が１～３万である多糖を有効成分とする腸管バリア保護剤。
  7. ウリジン二リン酸－Ｎ－アセチルムラミン酸－Ｌ－アラニン－Ｄ－グルタミン酸－Ｌ－リジンを有効成分とする腸管バリア保護剤。
  8. ラムノース、グルコース、ガラクトースが４～３：１：２～１の繰り返し構造であり、限外濾過膜による分画分子量が１～３万であることを特徴とする多糖。
  9. ビフィドバクテリウム・アドレッセンティスを溶菌処理し、次いで、これを限外濾過膜により分画分子量が１～３万の画分を得て、更に、これを以下の条件またはこれと同等の条件で行われる親水性相互作用クロマトグラフィー、
    ［クロマトグラフィー条件］
    　流速: 1.0 mL/min
    　移動相 A: MeCN, B: H2O 
    　グラジエント：0-3.3 min ：A=95, B=5, 3.3-83.3 min: A=95→0, B=5→100
    　カラム: YMC-triart Diol HILIC (φ4.6x250 mm, 5 μm)
    　温度: 40 ℃
    　注入量: 2～10 μL (5 mg/mL in H2O)
    　溶出時間：22～35 min
    で採取することを特徴とするラムノース、グルコース、ガラクトースが４～３：１：２～１の繰り返し構造であり、限外濾過膜による分画分子量が１～３万である多糖の製造方法。
  10. 溶菌処理が、ムラミダーゼで処理をした後、ヌクレアーゼおよびプロテアーゼで処理するものである請求項９記載の多糖の製造方法。
  11. 請求項５～７の何れか１に記載の腸管バリア保護剤を含有する腸管バリア破綻関連疾患予防剤。
  12. 腸管バリア破綻関連疾患が、糖尿病、肥満、炎症性腸疾患、脂肪肝、パーキンソン病、がん、過敏性腸疾患、脂質異常症、アトピー、喘息、認知症、不眠症、うつ、関節リウマチから選ばれるものである請求項１１記載の腸管バリア破綻関連疾患予防剤。
PCT/JP2025/010599 2024-03-21 2025-03-19 腸管バリア保護剤および腸管バリア破綻関連疾患予防剤 Pending WO2025197945A1 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2024044857A JP2025144931A (ja) 2024-03-21 2024-03-21 腸管バリア保護剤および腸管バリア破綻関連疾患予防剤
JP2024-044857 2024-03-21
JP2024-168810 2024-09-27
JP2024168810A JP2026060322A (ja) 2024-09-27 2024-09-27 腸管バリア保護剤

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2025197945A1 true WO2025197945A1 (ja) 2025-09-25

Family

ID=97139251

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2025/010599 Pending WO2025197945A1 (ja) 2024-03-21 2025-03-19 腸管バリア保護剤および腸管バリア破綻関連疾患予防剤

Country Status (2)

Country Link
TW (1) TW202602473A (ja)
WO (1) WO2025197945A1 (ja)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09241179A (ja) * 1996-03-01 1997-09-16 Meiji Seika Kaisha Ltd ビフィドバクテリウム属菌由来の水溶性免疫賦活物質およびその精製法
WO2020196374A1 (ja) * 2019-03-25 2020-10-01 株式会社ヤクルト本社 細胞壁分解促進方法
CN116870037A (zh) * 2023-02-03 2023-10-13 浙江大学 青春双歧杆菌atcc15703或者其可溶性多糖成分在制备靶向肠道的抗衰老药物食品或者制剂中的应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH09241179A (ja) * 1996-03-01 1997-09-16 Meiji Seika Kaisha Ltd ビフィドバクテリウム属菌由来の水溶性免疫賦活物質およびその精製法
WO2020196374A1 (ja) * 2019-03-25 2020-10-01 株式会社ヤクルト本社 細胞壁分解促進方法
CN116870037A (zh) * 2023-02-03 2023-10-13 浙江大学 青春双歧杆菌atcc15703或者其可溶性多糖成分在制备靶向肠道的抗衰老药物食品或者制剂中的应用

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FAN LINA, QI YADONG, QU SIWEN, CHEN XUEQIN, LI AIQING, HENDI MAHER, XU CHAOCHAO, WANG LAN, HOU TONGYAO, SI JIANMIN, CHEN SHUJIE: "B. adolescentis ameliorates chronic colitis by regulating Treg/Th2 response and gut microbiota remodeling", GUT MICROBES, LANDES BIOSCIENCE, UNITED STATES, vol. 13, no. 1, 1 January 2021 (2021-01-01), United States , pages 1826746, XP055873929, ISSN: 1949-0976, DOI: 10.1080/19490976.2020.1826746 *
IDA H. HIEMSTRA; GERD BOUMA; DIRK GEERTS; GEORG KRAAL; JOKE M.M. DEN HAAN;: "Nod2 improves barrier function of intestinal epithelial cells via enhancement of TLR responses", MOLECULAR IMMUNOLOGY, PERGAMON, GB, vol. 52, no. 3, 5 June 2012 (2012-06-05), GB , pages 264 - 272, XP028427918, ISSN: 0161-5890, DOI: 10.1016/j.molimm.2012.06.007 *
LIN RONG, JIANG YE, ZHAO XIN YAN, GUAN YANG, QIAN WEI, FU XIAO CHAO, REN HUN YU, HOU XIAO HUA: "ifidobacteria trigger autophagy response in intestinal epithelial cells", JOURNAL OF DIGESTIVE DISEASES, WILEY INTERSCIENCE, HOBOKEN, USA, vol. 15, no. 11, 1 November 2014 (2014-11-01), Hoboken, USA, pages 597 - 605, XP093358388, ISSN: 1751-2972, DOI: 10.1111/1751-2980.12179 *
NICOLAS GISCH; BIRTE BUSKE; HOLGER HEINE; BUKO LINDNER; ULRICH ZHRINGER;: "Synthesis of biotinylated muramyl tripeptides with NOD2-stimulating activity", BIOORGANIC & MEDICINAL CHEMISTRY LETTERS, ELSEVIER, AMSTERDAM NL, vol. 21, no. 11, 3 April 2011 (2011-04-03), Amsterdam NL , pages 3362 - 3366, XP028211481, ISSN: 0960-894X, DOI: 10.1016/j.bmcl.2011.04.005 *
PACYGA-PRUS KATARZYNA, JAKUBCZYK DOMINIKA, SANDSTRÖM CORINE, ŠRŮTKOVÁ DAGMAR, PYCLIK MARCELINA JOANNA, LESZCZYŃSKA KATARZYNA, CIEK: "Polysaccharide BAP1 of Bifidobacterium adolescentis CCDM 368 is a biologically active molecule with immunomodulatory properties", CARBOHYDRATE POLYMERS, APPLIED SCIENCE PUBLISHERS , LTD BARKING, GB, vol. 315, 1 September 2023 (2023-09-01), GB , pages 120980 - 120980-12, XP093358481, ISSN: 0144-8617, DOI: 10.1016/j.carbpol.2023.120980 *
QI YADONG, HE JIAMIN, ZHANG YAWEN, GE QIWEI, WANG QIWEN, CHEN LUYI, XU JILEI, WANG LAN, CHEN XUEQIN, JIA DINGJIACHENG, LIN YIFENG,: "Heat-inactivated Bifidobacterium adolescentis ameliorates colon senescence through Paneth-like-cell-mediated stem cell activation", NATURE COMMUNICATIONS, NATURE PUBLISHING GROUP, UK, vol. 14, no. 1, UK, pages 6121 - 6121-19, XP093358404, ISSN: 2041-1723, DOI: 10.1038/s41467-023-41827-0 *
REICHOLD ASTRID; BRENNER SIBYLLE A.; SPRUSS ASTRID; FÖRSTER-FROMME KARIN; BERGHEIM INA; BISCHOFF STEPHAN C. : "Bifidobacterium adolescentisprotects from the development of nonalcoholic steatohepatitis in a mouse model", THE JOURNAL OF NUTRITIONAL BIOCHEMISTRY, ELSEVIER, AMSTERDAM, NL, vol. 25, no. 2, 6 November 2013 (2013-11-06), AMSTERDAM, NL , pages 118 - 125, XP028811771, ISSN: 0955-2863, DOI: 10.1016/j.jnutbio.2013.09.011 *

Also Published As

Publication number Publication date
TW202602473A (zh) 2026-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pourjafar et al. Functional and health-promoting properties of probiotics’ exopolysaccharides; isolation, characterization, and applications in the food industry
US20230355690A1 (en) Method of treatment with lactic acid bacteria
Chen et al. Monosaccharide composition influence and immunomodulatory effects of probiotic exopolysaccharides
Wang et al. Characterization and immunomodulatory activity of an exopolysaccharide produced by Lactobacillus plantarum JLK0142 isolated from fermented dairy tofu
Bajpai et al. Exopolysaccharide and lactic acid bacteria: Perception, functionality and prospects
Abdhul et al. Antioxidant activity of exopolysaccharide from probiotic strain Enterococcus faecium (BDU7) from Ngari
Jin et al. Isolation and characterization of high exopolysaccharide-producing Weissella confusa VP30 from young children’s feces
Wu et al. Exopolysaccharide activities from probiotic bifidobacterium: Immunomodulatory effects (on J774A. 1 macrophages) and antimicrobial properties
EP4088729B1 (en) Novel lactobacillus plantarum strain, polysaccharides derived from strain, and use thereof
EP2551283A1 (en) Anti-allergic agent
Li et al. Immunoregulatory effects on Caco-2 cells and mice of exopolysaccharides isolated from Lactobacillus acidophilus NCFM
KR20210057748A (ko) 장내 마이크로바이옴의 이상 조성 또는 기능과 관련된 장애 치료용 프리바이오틱
CA3086031C (en) Composition for contact dermatitis
Alsaadi et al. Exopolysaccharide as antiviral, antimicrobial and as immunostimulants: a review.
Kim et al. Structural features of glycoprotein purified from Saccharina japonica and its effects on the selected probiotic properties of Lactobacillus plantarum in Caco-2 cell
EP3578637A1 (en) Novel lactic acid bacteria and use thereof
CA3085995C (en) Composition for type i allergy
WO2025197945A1 (ja) 腸管バリア保護剤および腸管バリア破綻関連疾患予防剤
Çelik et al. Determination of antioxidant and antimicrobial activities of cell-free supernatant (CFSKC27L) and exopolysaccharide (EPSKC27L) obtained from Ligilactobacillus salivarius KC27L
CA3163992A1 (en) Uses of lipoteichoic acid from bifidobacteria
JP2026060322A (ja) 腸管バリア保護剤
길범주 Studies on alleviating intestinal inflammation using probiotic potential of Saccharomyces cerevisiae GILA 118 and its cell wall component
JP2025144931A (ja) 腸管バリア保護剤および腸管バリア破綻関連疾患予防剤
Prakash Medical Advantages of Fermented Sugarcane Juice with Probiotics on Gut Health
RU2790442C2 (ru) Новый штамм lactobacillus plantarum, композиции, содержащие его, и связанный с ним способ и его применение

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 25774096

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1