WO2025197935A1 - 薬物－ポリマー複合体、医薬組成物、および薬物送達用ポリマー - Google Patents

薬物－ポリマー複合体、医薬組成物、および薬物送達用ポリマー

Info

Publication number
WO2025197935A1
WO2025197935A1 PCT/JP2025/010561 JP2025010561W WO2025197935A1 WO 2025197935 A1 WO2025197935 A1 WO 2025197935A1 JP 2025010561 W JP2025010561 W JP 2025010561W WO 2025197935 A1 WO2025197935 A1 WO 2025197935A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
polymer
drug
poly
group
conjugate
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
PCT/JP2025/010561
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
オラシオ カブラル
台勲 洪
ジョウイ レイ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokyo NUC
Original Assignee
University of Tokyo NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by University of Tokyo NUC filed Critical University of Tokyo NUC
Publication of WO2025197935A1 publication Critical patent/WO2025197935A1/ja
Pending legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/59—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes
    • A61K47/60—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyureas or polyurethanes the organic macromolecular compound being a polyoxyalkylene oligomer, polymer or dendrimer, e.g. PEG, PPG, PEO or polyglycerol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/61—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule the organic macromolecular compound being a polysaccharide or a derivative thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system

Definitions

  • DDS drug delivery systems
  • Non-Patent Document 1 the use of a mitoporter composed of a liposome with a lipid bilayer and containing octaarginine on its surface has been proposed (Non-Patent Document 1), and the use of a triphenylphosphonium (TPP) group or a protein or peptide containing a signal recognized by a transport protein on the mitochondrial membrane has been proposed (e.g., Non-Patent Documents 2 and 3).
  • TPP triphenylphosphonium
  • PC phosphocholine
  • Mitochondrial targeting using positively charged and hydrophobic structures or moieties has the following problems in in vivo applications: (i) it may form aggregates with negatively charged plasma proteins in the blood, and these aggregates may be eliminated from the body by the reticuloendothelial system or may cause capillary blockages; (ii) it may nonspecifically interact with lipid bilayers, resulting in adsorption to the cell membranes of various cells, resulting in off-targeting; (iii) even if taken up by cells, it may interact with various negatively charged intracellular substances such as mRNA, resulting in intracellular off-targeting; and (iv) even if delivered to mitochondria, the surfactant-like structure may mix with the lipid bilayer, resulting in mitochondrial membrane destruction. These problems make practical application difficult. Furthermore, the mitochondrial targeting using PC groups described in Patent Document 1 has not been thoroughly studied for in vivo applications.
  • the present invention was made to solve the above-mentioned problems, and its main purpose is to provide a technology that can deliver drugs to mitochondria in vivo, and in particular, a technology that can selectively deliver drugs to the mitochondria of cancer cells.
  • a drug-polymer conjugate comprising a drug and a drug delivery polymer having a phosphocholine group, the drug-polymer conjugate having a dissociation constant (K D ) for STARD7 of 1.0 ⁇ 10 ⁇ 6 M or less.
  • K D dissociation constant
  • the drug-polymer conjugate according to [1] above may be for delivering the drug to mitochondria.
  • the drug-polymer conjugate according to the above [1] or [2] may have an average particle size of more than 5.2 nm.
  • the drug delivery polymer may be a branched polymer having two or more polymer chains, and the phosphocholine group may be bonded to at least one of the two or more polymer chains.
  • the drug delivery polymer may be a polymer that exhibits a zeta potential of 0 or less when measured as a polymer having sulfo-cy5 introduced at one end of the two or more polymer chains and an uncharged group at the other end.
  • the molecular weight (Mw) of the drug delivery polymer may be 5,000 to 100,000.
  • the molecular weight (Mw) of each of the two or more polymer chains of the drug delivery polymer may be 200 to 50,000.
  • the drug may be bound to at least one of the two or more polymer chains.
  • the drug delivery polymer may comprise a hydrophilic polymer composed of poly(ethylene glycol), poly(saccharide), poly(vinylpyrrolidone), poly(vinyl alcohol), poly(acrylamide), poly(acrylic acid), poly(methacrylamide), poly(methacrylic acid), poly(methacrylic acid ester), poly(acrylic acid ester), poly(amino acid), poly(malic acid), or a derivative thereof.
  • the drug may comprise at least one selected from a physiologically active substance, a fluorescent reagent, and a contrast agent.
  • a pharmaceutical composition comprising the drug-polymer conjugate according to any one of [1] to [10] above.
  • a drug delivery polymer having two or more polymer chains, at least one of which has a phosphocholine group bound thereto, and having a dissociation constant (K D ) for STARD7 of 1.0 ⁇ 10 ⁇ 6 M or less.
  • the drug delivery polymer described in [12] above may be a polymer that exhibits a zeta potential of 0 or less when measured as a polymer having sulfo-cy5 introduced at one end of the two or more polymer chains and an uncharged group at the other end.
  • the drug delivery polymer according to the above [12] or [13] may have a molecular weight (Mw) of 5,000 to 100,000.
  • the molecular weight (Mw) of each of the two or more polymer chains may be 200 to 50,000.
  • the drug delivery polymer according to any one of [12] to [15] above may comprise a hydrophilic polymer composed of poly(ethylene glycol), poly(saccharide), poly(vinylpyrrolidone), poly(vinyl alcohol), poly(acrylamide), poly(acrylic acid), poly(methacrylamide), poly(methacrylic acid), poly(methacrylic acid ester), poly(acrylic acid ester), poly(amino acid), poly(malic acid), or a derivative thereof.
  • a hydrophilic polymer composed of poly(ethylene glycol), poly(saccharide), poly(vinylpyrrolidone), poly(vinyl alcohol), poly(acrylamide), poly(acrylic acid), poly(methacrylamide), poly(methacrylic acid), poly(methacrylic acid ester), poly(acrylic acid ester), poly(amino acid), poly(malic acid), or a derivative thereof.
  • mitochondrial targeting preferably in vivo, can be achieved by using a drug-polymer conjugate or drug delivery polymer (DDS polymer) that has a certain level of binding affinity with the phospholipid transfer protein "STARD7 (StAR-related lipid transfer domain protein 7)," which has the activity of transporting phosphatidylcholine to mitochondria.
  • DDS polymer drug-polymer conjugate or drug delivery polymer
  • FIG. 1 is an image of a drug-polymer complex prepared in an experimental example.
  • (a) is a microscopic image of in vitro mitochondrial accumulation evaluation
  • (b) is a graph showing the fluorescence intensity in mitochondria.
  • FIG. 1 illustrates a preparation scheme for ligand-conjugated gold nanoparticles.
  • 1 shows images showing co-localization of mitochondria and drug-polymer complexes in STARD7-inactivated and native cells.
  • 1 is a graph showing the results of quantitative evaluation of mitochondrial accumulation of a drug-polymer conjugate. Fluorescence images of tumors and organ surfaces in mice administered with a drug-polymer conjugate.
  • FIG. 1 is a graph showing the fluorescence intensity of tumors and organs in mice administered drug-polymer conjugates. This is an observation image of a tumor stained for mitochondria. 1 shows an image of a tumor section stained for mitochondria. 1 is a graph showing the results of quantitative evaluation of the accumulation of drug-polymer conjugates in tumor mitochondria. This is a graph showing the results of evaluating the uptake of protein-polymer complexes into mitochondria in vitro. 1 is a graph showing the results of evaluating nucleic acid delivery to mitochondria.
  • FIG. 1 illustrates a scheme for preparing a ligand-bound Sim-polymer conjugate. 1 is a graph showing the results of evaluating the cytotoxicity of ligand-bound Sim-polymer conjugates by MTT assay.
  • 1 is a graph showing the results of evaluating the cytotoxicity of ligand-bound Sim-polymer conjugates by CCK-8 assay.
  • 1 is a graph showing the results of measuring reactive oxygen species generated from mitochondria in cells treated with a ligand-bound Sim-polymer conjugate.
  • 1 is a graph showing the results of measuring changes in mitochondrial membrane potential in cells treated with a ligand-bound Sim-polymer conjugate.
  • 1 is a graph showing the results of measuring changes in mitochondrial membrane potential in cells treated with a ligand-bound Sim-polymer conjugate.
  • 1 is a graph showing normalized and quantified fluorescence intensity of sulfo-Cy5 conjugated to a ligand-conjugated polymer in blood vessels.
  • FIG. 1 shows images of extravasation of a ligand-bound polymer into the blood vessel.
  • 21 is a graph quantifying the fluorescence intensity of each marker in the region of interest in FIG. 20.
  • FIG. 1 shows images of cells treated with PC-8-PEG20 and the colocalization rate at multiple time points after the start of observation.
  • 1 is a graph showing the relationship between the contact time between lysosomes and mitochondria and the type of ligand.
  • Drug-polymer conjugates according to embodiments of the present invention comprise a drug and a drug delivery polymer having phosphocholine (PC) groups (PC group-containing DDS polymers).
  • the average particle size of drug-polymer conjugates according to embodiments of the present invention is typically greater than 5 nm, for example, greater than 5.2 nm, greater than 5.5 nm, or greater than 6 nm.
  • the PC group is a zwitterionic group represented by formula (I):
  • the dissociation constant (K D ) of a drug-polymer conjugate according to an embodiment of the present invention with STARD7 is, for example, 1.0 ⁇ 10 ⁇ 6 M or less, preferably 5.0 ⁇ 10 ⁇ 7 M or less, more preferably 3.0 ⁇ 10 ⁇ 7 M or less, even more preferably 2.0 ⁇ 10 ⁇ 7 M or less, and even more preferably 5.0 ⁇ 10 ⁇ 8 M or less, and may be, for example, 1.0 ⁇ 10 ⁇ 9 M or more or 1.0 ⁇ 10 ⁇ 8 M or more. If the dissociation constant is within the above range, STARD7-mediated uptake of the drug-polymer conjugate into mitochondria can be preferably achieved.
  • STARD7 is typically mammalian STARD7, preferably human STARD7.
  • drug-polymer conjugates according to embodiments of the present invention will be described in two distinct embodiments: one in which the drug-polymer conjugate contains one drug delivery polymer (DDS polymer) (first embodiment), and another in which the drug-polymer conjugate contains two or more DDS polymers (second embodiment).
  • DDS polymer drug delivery polymer
  • second embodiment drug-polymer conjugates
  • the drug-polymer conjugates may be formed using covalent and/or non-covalent interactions, and may be, for example, conjugates, associations, or aggregates.
  • the drug-polymer conjugate in the first embodiment comprises one PC group-containing DDS polymer and one or more drugs.
  • the PC group-containing DDS polymer and the drug may be covalently bonded (including by coordinate bonding) directly or via a linker, or may be conjugated by non-covalent interactions.
  • the PC group-containing DDS polymer and the drug are covalently bonded.
  • Any linker used in DDS applications can be used as the linker.
  • the number of atoms in the main chain of the linker can be, for example, 1 to 20, preferably 1 to 15, and more preferably 1 to 10.
  • the PC group-containing DDS polymer may be a branched polymer having two or more polymer chains.
  • the drug-polymer conjugate may include a branched PC group-containing DDS polymer having two or more polymer chains, and a drug bound to at least one of the two or more polymer chains.
  • the polymer that constitutes the PC group-containing DDS polymer is preferably a hydrophilic polymer with high biocompatibility.
  • examples include poly(ethylene glycol), poly(saccharide), poly(vinylpyrrolidone), poly(vinyl alcohol), poly(acrylamide), poly(acrylic acid), poly(methacrylamide), poly(methacrylic acid), poly(methacrylic acid ester), poly(acrylic acid ester), poly(amino acid), poly(malic acid), or derivatives thereof, with poly(ethylene glycol) being particularly preferred.
  • the PC group-containing DDS polymer is composed of a polymer that has no charge at physiological pH (pH 7.4).
  • the number of polymer chains in a branched PC group-containing DDS polymer is, for example, 3 or more, preferably 4 or more, more preferably 5 or more, and even more preferably 6 to 32, and may be, for example, 7 or more or 8 or more, and may be, for example, 24 or less, 20 or less, or 16 or less.
  • the number of polymer chains is within the above range, it is possible to effectively suppress steric hindrance while ensuring the introduction amount of PC groups.
  • the PC group-containing DDS polymer has at least one PC group.
  • the number of PC groups contained in the PC group-containing DDS polymer (the number of PC groups per polymer molecule) is not limited as long as the drug-polymer conjugate satisfies the above-mentioned dissociation constant for STARD7, and is preferably 3 or more, more preferably 4 or more, even more preferably 5 or more, and still more preferably 6 to 32, and may be, for example, 7 or more or 8 or more, or may be, for example, 24 or less, 20 or less, or 16 or less.
  • the dissociation constant (K D ) of the PC group-containing DDS polymer itself (the PC group-containing DDS polymer before being conjugated with a drug) for STARD7 is, for example, 1.0 ⁇ 10 ⁇ 6 M or less, preferably 5.0 ⁇ 10 ⁇ 7 M or less, more preferably 3.0 ⁇ 10 ⁇ 7 M or less, even more preferably 2.0 ⁇ 10 ⁇ 7 M or less, and still more preferably 5.0 ⁇ 10 ⁇ 8 M or less, and may be, for example, 1.0 ⁇ 10 ⁇ 9 M or more or 1.0 ⁇ 10 ⁇ 8 M or more.
  • the PC group may be introduced at any position, preferably at the end of the polymer chain.
  • PC groups introduced at the end of the polymer chain are more likely to be exposed on the surface of the drug-polymer conjugate, making it possible to preferably obtain a drug-polymer conjugate with high affinity for STARD7.
  • a PC group is bonded to at least one polymer chain, preferably two or more polymer chains, and more preferably two or more polymer chains have PC groups bonded to their ends.
  • the PC group equivalent of the PC group-containing DDS polymer (molecular weight of the PC group-containing DDS polymer/number of PC groups) is, for example, 200 to 10,000, preferably 1,000 to 5,000, and more preferably 1,000 to 4,000, and may be 1,500 or more or 2,000 or more, and 3,000 or less or 2,500 or less.
  • the degree of exposure of PC groups on the surface of the drug-polymer conjugate is increased, making it possible to preferably obtain a drug-polymer conjugate that satisfies the above-mentioned dissociation constant for STARD7.
  • a branched PC group-containing DDS polymer when measured as a polymer having sulfo-cy5 (hereinafter also referred to as "sulfo-cy5") attached to the end of one polymer chain and uncharged groups (e.g., PC groups, acetyl groups) attached to the other polymer chain ends, can be a polymer that exhibits a zeta potential of preferably 0 or less, more preferably -3 or less, for example, a zeta potential of -15 to -3, -12 to -4, or -11 to -5.
  • drugs include proteins or peptides (e.g., antibodies or functional fragments thereof, hormones, and enzymes), nucleic acids (e.g., high-molecular-weight nucleic acids such as plasmid DNA and mRNA, and low-molecular-weight nucleic acids such as siRNA, miRNA, antisense nucleic acids, and aptamers), and other physiologically active substances (e.g., antitumor agents, signal transduction inhibitors, antimetabolites, analgesics, anti-inflammatory agents, and antibacterial agents).
  • the drug may also be a detection reagent such as a fluorescent dye or contrast agent. Only one type of drug may be used, or two or more types may be used.
  • Two or more drugs or two or more types of drugs may be used in the form of a complex.
  • the drug can be attached to any appropriate site on the PC group-containing DDS polymer, for example, to the end of the polymer chain or to a side chain of the polymer chain.
  • the average particle size of the drug-polymer conjugate is, for example, greater than 5.2 nm, and preferably greater than 6 nm. If the average particle size is, for example, 5 nm or less, or, for example, 5.2 nm or less or 6 nm or less, the conjugate tends to be easily excreted in urine via the kidney. There are no limitations on the average particle size, as long as it satisfies the dissociation constant for STARD7.
  • the average particle size is typically 100 nm or less, preferably 30 nm or less, and may be, for example, 20 nm or less or 10 nm or less.
  • the average particle size can be measured using a dynamic light scattering (DLS) measurement device.
  • DLS dynamic light scattering
  • the drug-polymer conjugate can be produced by any suitable method.
  • the drug-polymer conjugate can be produced by a method comprising: reacting a branched polymer having a polymer chain with a terminal functional group A introduced therein with a PC group-containing compound having a PC group and a functional group reactive with functional group A to obtain a PC group-containing DDS polymer; and reacting the unreacted functional group A of the PC group-containing DDS polymer with a functional group possessed by the drug; reacting a branched polymer having a terminal functional group A introduced therein with a drug having a functional group reactive with functional group A to obtain a drug-conjugated polymer; and reacting the unreacted functional group A of the drug-conjugated polymer with a PC group-containing compound having a PC group and a functional group reactive with functional group A; or reacting a branched polymer having a terminal functional group A introduced therein and a terminal functional group B introduced therein with a drug having
  • PC group-containing compounds include 6-(O-phosphorylcholine)hydroxyhexanoic acid, 2-(meth)acryloyloxyethyl phosphorylcholine, 3-(meth)acryloyloxypropyl phosphorylcholine, 4-(meth)acryloyloxybutyl phosphorylcholine, 6-(meth)acryloyloxyhexyl phosphorylcholine, 10-(meth)acryloyloxydecyl phosphorylcholine, ⁇ -(meth)acryloyl(poly)oxyethylene phosphorylcholine, 2-(meth)acrylamidoethyl phosphorylcholine, 3-(meth)acrylamidopropyl phosphorylcholine, 4-(meth)acrylamidobutyl phosphorylcholine, 6-(meth)acrylamidohexyl phosphorylcholine, 10-(meth)acrylamidodecyl phosphorylcholine, and ⁇ -(meth)acrylamido(polyl)
  • the drug-polymer conjugate in the second embodiment comprises two or more DDS polymers, including a PC group-containing DDS polymer, and one or more drugs.
  • the drug-polymer conjugate in the second embodiment includes a configuration in which the two or more DDS polymers are covalently bonded to a drug or a carrier (Configuration 1) and a configuration in which the two or more DDS polymers are associated by non-covalent interactions (Configuration 2).
  • Configuration 1 the DDS polymer and the drug or carrier can be bonded directly or via a linker.
  • Drug-polymer conjugates containing two or more DDS polymers can also be suitably used for drug delivery into mitochondria, particularly in vivo, as long as they satisfy the above-mentioned dissociation constant for STARD7.
  • the two or more DDS polymers may include a DDS polymer that does not have a PC group (a PC group-free DDS polymer) in addition to a PC group-containing DDS polymer.
  • the DDS polymer may also exhibit effects such as solubilizing the drug, sustaining its release, improving blood retention, and preventing enzymatic degradation.
  • Examples of the drug-polymer conjugate of Configuration 1 include a configuration in which two or more DDS polymers, including a PC group-containing DDS polymer, are bound to one drug (Configuration 1a), and a configuration in which a PC group-containing DDS polymer and a drug-containing polymer are bound to one carrier or drug (Configuration 1b).
  • Configuration 1a In the drug-polymer conjugate of structure 1a, preferred examples of the polymer constituting the PC group-containing DDS polymer include the hydrophilic polymers described in section A-1, as well as poly(propylene glycol), poly(ethylene glycol)-poly(propylene glycol), soluble proteins such as albumin, polysaccharides, etc. Among these, poly(ethylene glycol) is preferred.
  • the PC group-containing DDS polymer may be linear or branched.
  • the molecular weight of the PC group-containing DDS polymer (if branched, the Mw of each chain) is, for example, 200 or more, preferably 1000 or more, and may be, for example, 1500 or more or 2000 or more, and is typically 50,000 or less, preferably 5000 or less, and may be, for example, 4000 or less or 3000 or less. Only one type of PC group-containing DDS polymer may be used, or two or more types may be used in combination. When two or more types are used in combination, the molecular weights of the PC group-containing DDS polymers may be the same or different.
  • the molecular weights of the polymer chains may be the same or different.
  • the molecular weight of the PC group-containing DDS polymer is within the above range, exposure of the PC groups and coating of the drug can be optimally achieved at the same time.
  • the PC groups can be bonded to any suitable site on the polymer, preferably at the end of the polymer.
  • a PC group-containing DDS polymer which has an end with a PC group introduced and an end with a functional group introduced, to a drug using the functional group
  • the drug surface can be covered in a layer of the polymer, and the PC groups can be exposed on the surface of the polymer layer.
  • the number of PC groups in a PC group-containing DDS polymer can be one or more, for example, 1 to 8.
  • PC group-containing DDS polymers can be applied to the above-mentioned PC group-free DDS polymers, except that they do not have PC groups.
  • the PC group-containing DDS polymer and the PC group-free DDS polymer may be substantially the same polymers except for the presence or absence of PC groups, or they may be different polymers (for example, polymers with different molecular weights, types or ratios of structural units, etc.).
  • the number of PC group-containing DDS polymers bound to one drug is not limited, as long as the drug-polymer conjugate exhibits the above-mentioned dissociation constant for STARD7.
  • the PC group-containing DDS polymers can be bound to the drug such that the number of PC groups contained in the drug-polymer conjugate is, for example, 2 or more, preferably 3 or more, and more preferably 5 or more.
  • the number of PC group-containing DDS polymers bound to one drug can be, for example, 2 or more, or, for example, 7 or more, and can be, for example, 5 x 10 or less, 5 x 10 or less, or 5 x 10 or less.
  • the ratio of the number of polymers bound to one drug may be, for example, 100:0 to 1:99, preferably 10:90 to 50:50, and more preferably 20:80 to 30:70.
  • the drugs can be the same as those described above, with relatively large ones such as proteins, nucleic acids, and polysaccharides being preferred.
  • the drug is a biopolymer such as a protein, nucleic acid, or polysaccharide
  • its mass can be, for example, 1,000 Da to 150,000 Da, or, for example, 3,000 Da to 150,000 Da.
  • the average particle size of the drug-polymer conjugate is, for example, greater than 5.2 nm, and preferably greater than 6 nm. If the average particle size is, for example, 5 nm or less, or, for example, 5.2 nm or less or 6 nm or less, the drug tends to be easily excreted in urine via the kidney. There are no limitations on the average particle size, as long as it satisfies the dissociation constant for STARD7.
  • the average particle size is preferably 200 nm or less, and may be, for example, 150 nm or less or 100 nm or less.
  • the average particle size can be measured using a dynamic light scattering (DLS) measurement device.
  • DLS dynamic light scattering
  • the drug-polymer conjugate can be produced by any suitable method.
  • the drug-polymer conjugate can be obtained by a method that includes reacting a polymer having functional group A introduced at one end and functional group B introduced at the other end with a PC group-containing compound having a PC group and a functional group reactive with functional group A to obtain a PC group-containing DDS polymer, and reacting functional group B of the PC group-containing DDS polymer with a drug having a functional group reactive with functional group B.
  • a PC group-containing DDS polymer and a PC group-free DDS polymer can also be reacted with a drug.
  • the PC group-containing DDS polymer can be the same as that described in section A-2-1.
  • drug-containing DDS polymers include PC group-containing DDS polymers in which a drug is substituted for the PC group.
  • a PC group-drug-containing DDS polymer having a PC group and a drug may be used instead of or in addition to the PC group-containing DDS polymer or drug-containing DDS polymer.
  • the PC group-drug-containing DDS polymer for example, has a drug introduced into its side chain, a PC group at one end, and a functional group at the other end, and can be bonded to a carrier or a drug via a reaction via the functional group.
  • a PC group-drug-free DDS polymer having neither a PC group nor a drug may be bonded to a carrier or a drug in addition to the DDS polymer described above, depending on the purpose.
  • the number of PC group-containing DDS polymers bound to one carrier or drug is not limited as long as the drug-polymer conjugate exhibits the above-mentioned dissociation constant for STARD7.
  • the number of PC group-containing DDS polymers bound to one carrier or drug may be, for example, 2 or more, or, for example, 7 or more, and may be, for example, 5 x 10 or less, 5 x 10 or less , or 5 x 10 or less.
  • the ratio (former:latter) of the number of PC group-containing DDS polymers bound to one carrier or drug to the number of PC group-drug-free DDS polymers may be, for example, 100:0 to 1:99, preferably 10:90 to 50:50, and more preferably 20:80 to 30:70.
  • the number of drug-containing polymers bound to one carrier or drug can be set appropriately depending on the number and type of drugs bound to the drug-containing polymer.
  • the number of drugs carried by one carrier or drug via drug-containing polymers can be, for example, 1 to 100, or 5 to 30.
  • the drug contained in the drug-containing polymer can be the same as the drugs described in Section A-1.
  • drugs with a relatively small size are used, and their mass can be, for example, 1,000 Da or less.
  • the average particle size of the drug-polymer conjugate is, for example, greater than 5.2 nm, and preferably greater than 6 nm. If the average particle size is, for example, 5 nm or less, or, for example, 5.2 nm or less or 6 nm or less, the drug tends to be easily excreted in urine via the kidney. There are no limitations on the average particle size, as long as it satisfies the dissociation constant for STARD7.
  • the average particle size is preferably 200 nm or less, and may be, for example, 150 nm or less or 100 nm or less.
  • the drug-polymer conjugates can be produced by any suitable method. For example, they can be obtained by preparing DDS polymers each having a functional group at one end, reacting the functional group with a functional group on the carrier or drug, and then chemically adsorbing the DDS polymer to the surface of the carrier or drug using the functional group.
  • the drug-polymer conjugate of Configuration 2 is an association comprising two or more molecules of a DDS polymer (preferably a PC group-containing DDS polymer) and a drug associated by non-covalent interaction.
  • a DDS polymer preferably a PC group-containing DDS polymer
  • a drug associated by non-covalent interaction examples include nanoparticles such as micelles and vesicles, or polyion complexes (PICs).
  • PICs polyion complexes
  • the drug may be bound to the DDS polymer, or may be encapsulated in the association (e.g., nanoparticles) without being bound.
  • the average particle size of the drug-polymer conjugate is, for example, 400 nm or less, preferably 200 nm or less, more preferably 150 nm or less, even more preferably 100 nm or less, and even more preferably 80 nm or less, and is, for example, 20 nm or more or 30 nm or more.
  • the average particle size can be measured using a dynamic light scattering (DLS) measurement device.
  • DLS dynamic light scattering
  • Examples of the drug-polymer conjugate include the aggregates described in paragraphs [0074] to [0080] of WO2020/116640.
  • PICs are formed by electrostatic interaction between a charged drug and a PC group and a charged polymer with an opposite charge to that of the drug; polymer micelles encapsulating a drug formed from a PC group-containing block copolymer containing a hydrophilic polymer segment with a PC group at its terminal and a hydrophobic polymer segment; and drug-loaded microparticles formed from PC group-containing biocompatible polymers such as polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLA), their copolymers (PLGA), poly- ⁇ -caprolactone, and chitosan.
  • PGA polyglycolic acid
  • PLA polylactic acid
  • PLGA poly- ⁇ -caprolactone
  • chitosan examples of the drug-polymer conjugate.
  • These drug-polymer conjugates can also be used to achieve optimal in vivo drug delivery into mitochondria by satisfying the dissociation constant for STARD7.
  • increasing the proportion of PC group-containing DDS polymers in the DDS polymers constituting the conjugate can improve the affinity of the conjugate for STARD7.
  • the pharmaceutical composition according to this embodiment comprises the drug-polymer conjugate described in Section A.
  • the pharmaceutical composition may further comprise a drug other than the drug in the drug-polymer conjugate, depending on the purpose.
  • any appropriate additive may be included as needed.
  • the additive may be any pharmaceutically acceptable additive, and examples thereof include excipients, diluents, solubilizing agents, suspending agents, isotonicity agents, pH adjusters, buffers, stabilizers, etc.
  • the pharmaceutical composition may be prepared in any suitable dosage form.
  • the pharmaceutical composition is typically a parenteral preparation, and may be an injection such as a subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, or intraperitoneal injection, as well as an infusion solution, eye drops, or nasal drops.
  • Methods of Delivering Drugs to Mitochondria comprising administering to an individual to be treated a drug-polymer conjugate described in Section A or a pharmaceutical composition described in Section B.
  • the individual to be treated is a human or a non-human mammal.
  • Non-human mammals include mice, rats, hamsters, rabbits, goats, dogs, cats, monkeys, chimpanzees, cows, horses, pigs, etc.
  • Administration to an individual may be systemic or local.
  • Systemic administration includes injections such as intravenous, subcutaneous, and intramuscular injections, or infusions.
  • Local administration includes administration to the skin, mucous membranes, nose, eyes, etc.
  • the dosage can be set at any appropriate amount depending on the disease or symptoms to be treated, the individual to be treated, the method of administration, etc.
  • 8-PEG10-NH 2 , 8-PEG20-NH 2 , or 8-PEG40-NH 2 was mixed with sulfo-Cy5-NHS (1 equivalent relative to the amine) in N,N-dimethylformamide (DMF) and stirred for 24 hours at room temperature.
  • the resulting sulfo-Cy5-labeled polymer was purified by alternating dialysis against methanol and pure water three times each (MWCO: 3,500). The product was recovered by lyophilization. The conjugation of sulfo-Cy5 to the polymer was confirmed by fluorescence detection and 1 H-NMR (acetonitrile-d 3 ; 25°C).
  • the sulfo-Cy5-labeled polymer was dissolved in water (10 mg/ml) and mixed with 6-(O-phosphorylcholine) hydroxyhexanoic acid (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (10 equivalents relative to the amine) and 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride n-hydrate (hereinafter referred to as "DMT-MM"; Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (10 equivalents relative to the amine) in water at room temperature for 24 hours. Additional DMT-MM (2 equivalents relative to the amine) was added every 6 hours during the reaction.
  • 6-(O-phosphorylcholine) hydroxyhexanoic acid Flujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • 4-(4,6-Dimethoxy-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride n-hydrate hereinafter referred to as "DMT-
  • TPP-bound drug-polymer conjugates TPP-8-PEG10, TPP-8-PEG20, TPP-8-PEG40
  • the binding of TPP to the polymer was investigated by 1 H-NMR in acetonitrile-d 3 (0.05% V/V TMS), and the binding rate of TPP to the polymer was 86%-87%.
  • 1 H-NMR (acetonitrile-d 3 ) ⁇ 6.0-9.0 ppm (15H: (C 6 H 5 ) 3 -P-)
  • Figure 1 shows an image of the drug-polymer complex obtained in steps (1) to (3) above.
  • the results are shown in Table 1, along with the number of ligands (PC groups, TPP groups, or Ac groups) and sulfo-Cy5 conjugates in each drug-polymer conjugate.
  • the number of ligands and sulfo-Cy5 conjugates is an estimated number calculated from NMR data. Since the affinity between the polymer and the solvent varies depending on the length of the polymer, the type of the ligand, etc., the estimated number of bonds may deviate slightly from the actual value. However, when the sum of the estimated number of bonds of the ligand and the estimated number of bonds of Sulfo-Cy5 is 7 or more, it can be assumed that all of the terminal amino groups have reacted.
  • the mobile phase was exchanged for 50 mM HEPES (RB; running buffer) containing 150 mM NaCl and 5 mM CaCl2 .
  • RB running buffer
  • a 2 ⁇ g/mL solution of GST-tagged STARD7 (LifeSpan BioSciences, "Human STARD7 Protein (Recombinant GST) (aa61-307)-LS-G22208", Lot# LS-G22208/198058) in RB was injected until the response unit reached 200 RU.
  • Antibody binding was performed using RB as a reference channel instead of the STARD7 solution.
  • the drug-polymer conjugates are those prepared in (1) to (3) above (as listed in Table 1).
  • BxPC3 cells were seeded in 12-well plates at a concentration of 1,000,000 cells/well in RPMI containing 10% v/v FBS and 1% v/v penicillin-streptomycin and incubated overnight.
  • the drug-polymer conjugate was added to the wells containing BxPC3 cells at a concentration of 25 ⁇ M and incubated for 24 hours. After thoroughly and carefully washing the cells with fresh medium to remove excess polymer, the cells were incubated with 0.1 mg/mL Hoechst 33342 for 15 minutes to stain the cell nuclei.
  • Mitochondria were isolated from cells using a mitochondria isolation kit (Abcam) according to the manufacturer's protocol.
  • the content of drug-polymer conjugates in mitochondria was evaluated by measuring the fluorescence intensity of sulfo-Cy5 in mitochondria using a SPARK® multimode microplate reader (TECAN).
  • TECAN SPARK® multimode microplate reader
  • PC-conjugated drug-polymer conjugates exhibited better mitochondrial accumulation than Ac-conjugated drug-polymer conjugates and TPP-conjugated drug-polymer conjugates at all molecular weights.
  • Ligand-introduced primary amine-terminated PEG or methoxy- and primary amine-terminated PEG was coupled to lipoic acid via 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide coupling in DMF.
  • the dithiolane moiety of the product was reduced to dihydrolipoic acid to generate thiol-containing polymers (MeO-PEG-(SH) 2 , PC-PEG-(SH) 2 , and TPP-PEG-(SH) 2 ), which were mixed in the ratios shown in Table 3 and chelated to gold nanoparticles under aqueous conditions.
  • the PEG used was linear, and all had a molecular weight (Mw) of 2,000.
  • the size and surface potential of the polymer-chelated gold nanoparticles were evaluated using DLS and ELS, respectively, and the morphology of the gold nanoparticles was observed by TEM.
  • BxPC3 cells were incubated with gold nanoparticles at a concentration of 2.5 x 10 12 particles/mL in RPMI containing 10% FBS for 24 hours, and the intracellular microdistribution of the gold nanoparticles was observed by TEM.
  • TEM samples were prepared as previously reported (Hirabayashi, Y. et al. Science 358, 623-630 (2017)). The results are shown in Table 3 and Figure 4.
  • FIG 4 (a) and (b) are TEM images of cells incubated with MeO-PEG-S-AuNP and enlarged images of their mitochondrial portions, respectively; (c) and (d) are TEM images of cells incubated with 25% PC-PEG-S-AuNP and enlarged images of their mitochondrial portions, respectively; and (e) is a tomographic image showing the mitochondria and gold nanoparticles in (d) (scale bars for (a) and (c): 500 nm, scale bars for (b) and (d): 200 nm).
  • STARD7 was inactivated (knocked out) in BxPC3 cells by transfection using Lipofectamine® as follows: STARD7 is a protein that transports phosphatidylcholine from surrounding organelles, such as the Golgi apparatus, smooth endoplasmic reticulum, and cytoplasm, to mitochondria. BxPC3 cells were incubated with 5% mitochondria-GFP (BacMam2.0) (Mito-GFP) in RPMI containing 10% v/v FBS and 1% v/v penicillin-streptomycin, and mature cells were washed three times with fresh medium.
  • mitochondria-GFP BacMam2.0
  • Mito-GFP mitochondria-GFP
  • STARD7-knockout siRNA or scrambled RNA as a negative control was transfected into cells using RNAiMAX.
  • Cells were incubated with medium containing RNAiMAX for 24 hours. After washing the cells three times with fresh medium, 25 ⁇ M PC- or TPP-conjugated drug-polymer conjugates dissolved in the medium were added, and the cells were incubated for 24 hours. Differences in the colocalization of mitochondria and drug-polymer conjugates between STARD7-inactivated and native cells were examined using colocalization images acquired with a CLSM (LSM 780) and quantitative data from mitochondrial isolation.
  • CLSM LSM 780
  • BxPC3 cells (5 ⁇ 10 cells ml) suspended in 50 ⁇ L of RPMI 1640 were subcutaneously inoculated into the right dorsal region of female BALB/c nude mice (5 weeks old) to create tumor models. When tumor volumes reached ⁇ 100 mm, they were subjected to biodistribution and mitochondrial accumulation evaluation.
  • Figures 7 and 8 show that PC-8-PEG20 selectively accumulates in tumors 24 hours after administration.
  • drug-polymer conjugates with a PEG molecular weight of 10K (PC-8-PEG10, TPP-8-PEG10, and Ac-8-PEG10) all showed low accumulation in tumors and other organs. Because the drug-polymer conjugates with a PEG molecular weight of 10K are less than 5 nm in size, they may have been filtered by the kidney and excreted from the body.
  • drug-polymer conjugates with a PEG molecular weight of 40K (PC-8-PEG40, TPP-8-PEG40, and Ac-8-PEG40) and Ac-8-PEG20 all accumulated nonspecifically in tumors and other organs. Furthermore, TPP ligands tended to accumulate more in the liver and kidneys. The above results are considered as follows. Drug-polymer conjugates with a molecular weight of 40K exhibited low ligand accessibility due to the large molecular weight of PEG, resulting in low ligand specificity.
  • 8-PEG20-(NH 2 )7-(N 3 ) was mixed with the following three ligands in PBS(-), DMT-MM (10 equivalents relative to the amine), and TEA (100 equivalents relative to the amine) at room temperature for 24 hours. Additional DMT-MM (2 equivalents relative to the amine) was added every 6 hours during the reaction.
  • ligand-conjugated polymers Three types of ligand-conjugated polymers (PC-8-PEG20-(N 3 ), TPP-8-PEG20-(N 3 ), and Ac-8-PEG20-(N 3 )) were synthesized by reacting with 6-(O-phosphorylcholine)hydroxyhexanoic acid (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) (10 equivalents relative to the amine), (3-Carboxybutyl)triphenylphosphonium bromide (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd. ) (10 equivalents relative to the amine), or acetic acid ( Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) (10 equivalents relative to the amine ) as the ligand.
  • 6-(O-phosphorylcholine)hydroxyhexanoic acid Flujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • 3-Carboxybutyl)triphenylphosphonium bromide (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd
  • DBCO-PEG4-NHS Ester (CAS RN: 1427004-19-0) was purchased from Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. The three ligand-conjugated polymers synthesized above were dissolved in DMF at 20 ⁇ g/mL. The resulting DBCO-PEG4-NHS Ester was mixed in 10 mM phosphate buffer at a molar ratio of 1:1.1 (ligand:DBCO), and the mixture was frozen at -30°C and thawed at 4°C three times. The click reaction between -N3 and DBCO was carried out to synthesize PC-8-PEG20-NHS, TPP-8-PEG20-NHS, and Ac-8-PEG20-NHS.
  • the resulting three polymers were purified by ultracentrifugal filtration (MWCO: 10,000, 3,500 g, 8 min).
  • the three purified polymers were reacted with DNASE1 in a 2:1 molar ratio in phosphate buffer (pH 8.0) at 4°C overnight.
  • a ligand PC, TPP, or Ac
  • the three ligand-bound DNASE1-polymer complexes with different ligands were purified by ultracentrifugal filtration (MWCO: 35,000, 3,500 g, 8 min).
  • the concentration of DNASE1 loaded in the purified complexes was quantified using a BCA protein assay (ThermoFisher).
  • BxPC3 cells were seeded in 12-well plates at a concentration of 1,000,000 cells/well in RPMI containing 10% v/v FBS and 1% v/v penicillin-streptomycin and incubated overnight.
  • Ligand-bound DNASE1-polymer complexes were added to BxPC3 cells at a DNASE1 concentration of 100 ⁇ g/mL and incubated for 3 hours. Cells were thoroughly and carefully washed with fresh medium to remove excess polymer, followed by a 21-hour postincubation in medium. Mitochondria were then isolated from the cells using a mitochondrial isolation kit (Abcam) according to the manufacturer's protocol. The amount of DNA remaining in the isolated mitochondria was quantified using PCR. The results are shown in Figure 12.
  • the amount of DNA in mitochondria decreased only in samples incubated with the PC-bound DNASE1-polymer complex. This suggests that the PC-bound DNASE1-polymer complex was delivered to the mitochondria.
  • the molecular weight (Mw) of each PEG chain in 8-PEG20-(NH 2 )7-(N 3 ) is approximately 2500, with an amino group introduced at each end of seven PEG chains and an azide group introduced at the end of the remaining PEG chain.
  • 8-PEG20-(NH 2 )7-(N 3 ) was dissolved in PBS at a concentration of 10 mg/ml.
  • PC-COOH (10 equivalents of amine) or TPP-COOH (10 equivalents of amine) and DMT-MM (10 equivalents of amine) were added to the solution and reacted at room temperature for 24 hours. Additional DMT-MM (2 equivalents relative to the amine) was added every 6 hours during the reaction.
  • the product was purified using a disposable PD-10 desalting column containing Sephadex G-25 (Cytiva). Two ligand-conjugated polymers (PC-8-PEG20-(N 3 ) and TPP-8-PEG20-(N 3 )) were recovered by lyophilization. 8-PEG20-(NH 2 )7-(N 3 ) was dissolved in ultra-dehydrated acetonitrile. To the above solution, TEA (100 equivalents of amine) was added under an argon atmosphere. After mixing at room temperature for 30 minutes, acetic anhydride was added dropwise to the reaction system. The mixture was stirred at room temperature for 24 hours under an argon atmosphere.
  • TEA 100 equivalents of amine
  • the acetonitrile was removed by evaporation, and the resulting acetylated polymer (Ac-8-PEG20-(N 3 )) was dissolved in deionized water. Purification and recovery of Ac-8-PEG20-(N 3 ) were carried out in the same manner as above.
  • the polymer was conjugated to ASO via a click chemistry reaction between DBCO and an azide group. Specifically, (PC, TPP, Ac)-8-PEG20-(N 3 ) was dissolved in deionized water, and 1 equivalent of ASO was added to N 3 . The mixture was then subjected to a freeze-thaw cycle (freezing at -30°C, thawing at RT) three times. In this way, three types of ligand-bound ASO-polymer conjugates (Ac-8-PEG20-COX2, TPP-8-PEG20-COX2, and PC-8-PEG20-COX2) were obtained.
  • Figure 13(a) shows the ratio of target mRNA expression to control mRNA expression (transcription), expressed as a relative value when the control ratio is set to 1.
  • Figure 13(b) shows the expression level of ⁇ -actin mRNA, expressed as a relative value when the control expression level is set to 1.
  • the expression level of COX2 relative to ND1 in cells treated with PC-8-PEG20-COX2 was significantly reduced.
  • ND1 is a mitochondrial mRNA but is not the target of the ASO described above, and that the expression level of ⁇ -actin, a cellular mRNA, did not change, PC-8-PEG20-COX2 is thought to have effectively delivered the ASO into mitochondria without affecting other cellular conditions.
  • Experimental Example 8 Delivery of small molecule drugs to mitochondria (Preparation of Ligand-Bound Sim-Polymer Conjugates) Using 8-PEG20-NH 2 (an eight-arm PEG with all terminal amines (—NH 2 ) and a molecular weight (Mw) of 20 kJ, Creative PEGWorks), a ligand-bound Sim-polymer conjugate containing Sim as the drug was synthesized according to the scheme shown in Figure 14.
  • Simvastatin is an HMG-CoA reductase inhibitor used to lower cholesterol. Simvastatin also exhibits anticancer activity.
  • simvastatin reduces mitochondrial membrane potential, releasing Smac/DIABLO and cytochrome C into the cytoplasm and inducing apoptosis in cancer cells.
  • Such mitochondrial damage caused by simvastatin can be enhanced by increasing simvastatin delivery to mitochondria.
  • the secondary alcohol of simvastatin was reacted with succinyl chloride to form an ester bond.
  • Simvastatin 500 mg, 1 equiv.
  • benzene was lyophilized and then dissolved in 10 mL of ultra-dehydrated dichloromethane (DCM).
  • the reaction was monitored by 1H -NMR (methanol-d 4 ; 25°C).
  • the simvastatin-COOH was conjugated to one of the primary amines of 8-PEG20- NH2 via EDC/NHS coupling in DMF.
  • 8-PEG20- NH2 500 mg, 1 equiv.
  • simvastatin-COOH 39 mg, 3 equiv.
  • the mixture was stirred at 4°C for 6 hours.
  • EDC/HCl 7.2 mg, 1.5 equiv.
  • TEA 5.2 ⁇ L, 1.5 equiv.
  • the polymer was purified by alternating dialysis against pure water and methanol three times each (MWCO of dialysis bag: 3,500; Spectrum Laboratories).
  • the conjugation of simvastatin was confirmed by 1H -NMR (methanol- d4 ; 25°C). In this manner, simvastatin-8-PEG20-(NH 2 ) 7 was obtained, in which simvastatin was bound to one amino terminal.
  • the amino groups of the above simvastatin-8-PEG20-(NH 2 ) 7 were capped with each ligand (i.e., PC, TPP, or Ac) in the same manner as above to obtain ligand-bound Sim-polymer conjugates (PC-8-PEG20-Sim, TPP-8-PEG20-Sim, and Ac-8-PEG20-Sim).
  • ligand-bound Sim-polymer conjugates PC-8-PEG20-Sim, TPP-8-PEG20-Sim, and Ac-8-PEG20-Sim.
  • the ratios of the ligand and simvastatin introduced into each ligand-bound Sim-polymer conjugate were evaluated by 1 H-NMR (methanol-d 4 ; 25°C).
  • BxPC3 cells suspended in medium (RPMI 1640 containing 10% v/v FBS and 1% v/v penicillin-streptomycin) were incubated overnight in a 96-well cell culture plate (10,000 cells/well) (IWAKI). The medium was replaced with medium containing various Sim concentrations (0-200 ⁇ M) of ligand-bound Sim-polymer conjugates or free Simvastatin, and the cells were incubated for 6 hours. After treatment, the cells were washed with medium and post-incubated for an additional 48 hours.
  • medium RPMI 1640 containing 10% v/v FBS and 1% v/v penicillin-streptomycin
  • Cytotoxicity was then measured using an MTT assay kit (Dojindo Laboratories) according to the manufacturer's protocol with minor modifications. Briefly, the cells were washed with medium and replaced with 100 ⁇ L of PBS(-). 20 ⁇ L of MTT was added and incubated for 3 hours. The supernatant was carefully removed, and 100 ⁇ L of DMSO was added and mixed for 15 minutes. The absorbance at 530 nm was measured using a SPARK® multimode microplate reader (TECAN). The results are shown in Figure 15.
  • CCK-8 Assay BxPC3 cells were plated into 96-well cell culture plates (IWAKI) at a concentration of 5,000 cells/well. The cells were treated with the ligand-bound Sim-polymer conjugate or free simvastatin, as in the MTT assay described above. The cell viability of the treated samples was assessed using a CCK-8 assay kit (Dojindo Laboratories) according to the manufacturer's protocol. The results are shown in Figure 16.
  • TPP-8-PEG20-Sim and PC-8-PEG20-Sim reduced BxPC3 cell viability more effectively than free simvastatin at simvastatin concentrations above 37.5 ⁇ M.
  • Ac-8-PEG20-Sim showed no reduction in cell viability compared to free simvastatin.
  • BxPC3 cells (5,000 cells/well) were treated with the ligand-conjugated Sim-polymer conjugate in the same manner as in the MTT assay described above. After treatment, the toxicity of simvastatin to the mitochondria of BxPC3 cells was assessed by measuring reactive oxygen species (ROS) generated from mitochondria using the MitoSOX® Red kit (Thermo Fisher Scientific) and measuring changes in mitochondrial membrane potential using the JC-1 mitochondrial membrane potential assay kit (Thermo Fisher Scientific). Measurements of mitochondrial ROS and membrane potential were performed according to the manufacturer's protocols. The results of the ROS measurement and JC-1 assay are shown in Figure 17 and Figures 18A and 18B, respectively.
  • ROS reactive oxygen species
  • Mitochondrial activity was assessed by measuring mitochondrial reactive oxygen species (ROS).
  • ROS mitochondrial reactive oxygen species
  • PC-8-PEG20-Sim and TPP-8-PEG20-Sim exhibited increased mitochondrial toxicity at simvastatin concentrations above 75 ⁇ M compared to free Sim or Ac-8-PEG20-Sim. This suggests that the PC and TPP ligands contribute to mitochondrial delivery of the Sim-polymer complexes.
  • the PC-linked polymer delivered the drug payload, simvastatin, to mitochondria without affecting mitochondrial membrane charge, resulting in a change in mitochondrial membrane charge due to simvastatin.
  • the TPP-linked polymer itself affected mitochondrial membrane charge, and further altered mitochondrial membrane charge by delivering simvastatin.
  • the amounts of simvastatin in the PC and TPP-linked polymers were comparable in this experiment, these results suggest that the PC ligand targeted mitochondria more effectively than the TPP ligand in the simvastatin delivery system.
  • a decrease in green fluorescence intensity indicates a stronger negative charge in the mitochondrial membrane potential or cell death, resulting in a decrease in the number of cells capturing JC-1.
  • Figure 18A suggests that at high simvastatin concentrations, the number of cells was significantly reduced due to the cytotoxicity of PC-8-PEG20-Sim.
  • TPP-8-PEG20-Sim did not reduce green fluorescence intensity as much as PC-8-PEG20-Sim, and even increased it at low simvastatin concentrations. This suggests that TPP-8-PEG20-Sim may have reduced mitochondrial membrane potential at concentrations lower than the effective concentration of simvastatin, and that the TPP ligand itself may have adverse effects on cells.
  • Example 9 Evaluation of blood retention
  • Eight-week-old BALB/c mice were anesthetized with isoflurane inhalation.
  • the right earlobes of the mice were fixed on an intravital confocal laser scanning microscope (IVCLSM).
  • the series of ligand-conjugated polymers prepared in Example 1 (10 kDa, 20 kDa, or 40 kDa 8-arm PEGs conjugated with one sulfo-Cy5 and seven ligands) were intravenously injected into the mice.
  • the fluorescence intensity of sulfo-Cy5 conjugated to the series of ligand-conjugated polymers was evaluated by sequential imaging of the earlobes using IVCLSM. The results are shown in Figure 19.
  • Figure 19 is a graph showing the normalized and quantified intensity of fluorescent labeling within blood vessels.
  • the 10 kDa ligand-conjugated polymers were rapidly cleared from the circulation.
  • the 20 kDa and 40 kDa ligand-conjugated polymers exhibited longer blood circulation than the 10 kDa ligand-conjugated polymer.
  • PC-8-PEG20 exhibited longer blood circulation than TPP-8-PEG20 and Ac-8-PEG20.
  • Ac dextran 10K, TPP dextran 10K, and PC dextran 10K represent the dextran-derived FITC fluorescence intensity in mice administered Ac-8-PEG20, TPP-8-PEG20, and PC-8-PEG20, respectively.
  • Figures 20 and 21 show that PC-8-PEG20 exhibits enhanced extravasation compared to other 20 kDa polymers (i.e., TPP-8-PEG20 and Ac-8-PEG20). Enhanced polymer extravasation may increase polymer accumulation in tumors.
  • Endosomal escape is an effective means of intracellular drug delivery.
  • the above-mentioned ligand-conjugated drug-polymer conjugate using eight-branched PEG does not have a structure that promotes endosomal escape. Therefore, to confirm a mitochondrial targeting pathway that does not involve endosomal escape, we evaluated contact between lysosomes and mitochondria.
  • BxPC3 cells were plated into 8-well coverglass chambers at a density of 15,000 cells/well in RPMI containing 10% v/v FBS and 1% v/v penicillin-streptomycin for 8 hours.
  • the medium was replaced with medium containing 5% by volume of CellLight TM Lysosomal GFP, BacMam 2.0 and CellLight TM Mitochondrial RFP, BacMam 2.0, and incubated for 36 hours. After extensive washing with fresh medium, the cells were treated with a series of ligand-conjugated polymers at 25 ⁇ M for 8 hours. The medium containing the ligand-conjugated polymers was replaced with fresh medium. Cell nuclei were then stained with blue fluorescence by incubation with 0.1 mg/mL Hoechst 33342 for 15 minutes. The medium was then replaced with fresh medium.
  • Colocalization rates were obtained using the Zen software on the LSM 880.
  • images and colocalization rates at multiple time points after the start of observation are shown in Figure 22.
  • the relationship between the contact time between lysosomes and mitochondria and the type of ligand is also shown in Figure 23.
  • the control represents a sample to which no ligand-conjugated polymer was added.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本発明は、薬物と、ホスホコリン基を有する薬物送達用ポリマーと、を含み、ＳＴＡＲＤ７に対する解離定数（ＫＤ）が１．０×１０－６Ｍ以下である、薬物－ポリマー複合体を提供する。

Description

薬物－ポリマー複合体、医薬組成物、および薬物送達用ポリマー
　本発明は、薬物－ポリマー複合体、医薬組成物、薬物送達用ポリマー、および薬物送達方法に関する。
　一般に、経口や静脈内注射によって薬物を全身投与すると、投薬対象の患部だけでなく、正常組織にも薬物が集積する。その結果、薬物投与による副作用が認められ、治療方法の変更や中断が必要になる場合がある。これに対し、副作用の低減を目的として、患部に薬物を選択的に輸送する薬物送達システム（ＤＤＳ）が開発されている。
　薬物の患部への集積量の増大に向けて、患部を指向する標的指向型のＤＤＳの開発が進められている。従来は、細胞取り込み量を増大するための研究が中心であったが、近年、がん、心臓病、糖尿病等の難治性疾患の多くがミトコンドリアと密接な関係があることが明らかになってきていることから、細胞内のミトコンドリアへの薬物送達にも関心が向けられている。
　ミトコンドリアへの薬物送達に関しては、これまでに、正電荷を有し、かつ、疎水的な構造体または部位を利用した技術が提案されている。例えば、脂質二重層を有するリポソームによって構成され、表面にオクタアルギニンを含むミトポーターの使用（非特許文献１）、および、トリフェニルホスホニウム（ＴＰＰ）基またはミトコンドリア膜上の輸送タンパク質によって認識されるシグナルを含むタンパク質またはペプチドの利用が提案されている（例えば、非特許文献２、非特許文献３）。また、比較的極性が高く、双性イオンであるホスホコリン（ＰＣ）基の利用も提案されている（特許文献１）。
ＷＯ２０２０／１１６６４０
Ｙａｍａｄａ　Ｙ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ　Ｂｉｏｐｈｙｓ　Ａｃｔａ．　２００８　Ｆｅｂ；１７７８（２）：４２３－３２ Ｌｉｂｅｒｍａｎ　Ｅ．　Ａ．　ｅｔ　ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌｕｍｅ２２２，ｐａｇｅｓ１０７６－１０７８（１９６９） Ｓｗａｔｉ　Ｂｉｓｗａｓ　ｅｔ　ａｌ．，Ａｄｖ　Ｄｒｕｇ　Ｄｅｌｉｖ　Ｒｅｖ．２０１４　Ｆｅｂ；０：２６－４１
　正電荷を有し、かつ、疎水的な構造体または部位を利用したミトコンドリアターゲティングは、ｉｎ　ｖｉｖｏでの適用において、（ｉ）血液中で負に帯電した血漿タンパク質との凝集体を生じさせる場合があり、当該凝集体は細網内皮系によって体内から排除される、または、毛細血管のつまりを引き起こす可能性がある；（ｉｉ）脂質二重層と非特異的に相互作用する結果、種々の細胞の細胞膜に吸着してオフターゲティングが生じる場合がある；（ｉｉｉ）細胞に取り込まれたとしても、ｍＲＮＡ等の種々の負に帯電した細胞内物質と相互作用する結果、細胞内でオフターゲティングが生じる場合がある；（ｉｖ）ミトコンドリアに送達されたとしても、界面活性剤のような構造が脂質二重層と混ざり合う結果、ミトコンドリア膜を破壊する場合がある；等の問題があり、実用化が困難である。また、特許文献１に記載のＰＣ基を用いたミトコンドリアターゲティングに関しては、ｉｎ　ｖｉｖｏでの適用に関して十分な検討がなされていない。
　本発明は、上記課題を解決するためになされたものであり、その主たる目的は、ｉｎ　ｖｉｖｏでミトコンドリアへ薬物を送達可能な技術、なかでも、がん細胞のミトコンドリアへ選択的に薬物を送達可能な技術を提供することにある。
［１］本発明の１つの局面によれば、薬物と、ホスホコリン基を有する薬物送達用ポリマーと、を含み、ＳＴＡＲＤ７に対する解離定数（ＫＤ）が１．０×１０－６Ｍ以下である、薬物－ポリマー複合体が提供される。
［２］上記［１］に記載の薬物－ポリマー複合体は、ミトコンドリアに上記薬物を送達するためのものであってよい。
［３］上記［１］または［２］に記載の薬物－ポリマー複合体は、平均粒子径が、５．２ｎｍを超えてもよい。
［４］上記［１］から［３］のいずれかに記載の薬物－ポリマー複合体において、上記薬物送達用ポリマーが、２つ以上のポリマー鎖を有する分岐型ポリマーであってよく、上記２つ以上のポリマー鎖の少なくとも１つに上記ホスホコリン基が結合されていてよい。
［５］上記［４］に記載の薬物－ポリマー複合体において、上記薬物送達用ポリマーが、上記２つ以上のポリマー鎖の１つの末端にｓｕｌｆｏ－ｃｙ５が導入され、その他の末端に非荷電性基を有するポリマーとして測定された場合に、０以下のゼータ電位を示すポリマーであってよい。
［６］上記［４］または［５］に記載の薬物－ポリマー複合体において、上記薬物送達用ポリマーの分子量（Ｍｗ）が、５０００～１０００００であってよい。
［７］上記［４］から［６］のいずれかに記載の薬物－ポリマー複合体において、上記薬物送達用ポリマーの上記２つ以上のポリマー鎖の分子量（Ｍｗ）がそれぞれ、２００～５００００であってよい。
［８］上記［４］から［７］のいずれかに記載の薬物－ポリマー複合体において、上記２つ以上のポリマー鎖の少なくとも１つに上記薬物が結合されていてよい。
［９］上記［１］から［８］のいずれかに記載の薬物－ポリマー複合体において、上記薬物送達用ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（サッカライド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（リンゴ酸）、またはこれらの誘導体から構成される親水性ポリマーを含んでよい。
［１０］上記［１］から［９］のいずれかに記載の薬物－ポリマー複合体において、上記薬物が、生理活性物質、蛍光試薬、および造影剤から選択される少なくとも１種を含んでよい。
［１１］本発明の別の局面によれば、上記［１］から［１０］のいずれかに記載の薬物－ポリマー複合体を含む、医薬組成物が提供される。
［１２］本発明の別の局面によれば、２つ以上のポリマー鎖を有し、上記２つ以上のポリマー鎖の少なくとも１つにホスホコリン基が結合されており、ＳＴＡＲＤ７に対する解離定数（ＫＤ）が１．０×１０－６Ｍ以下である、薬物送達用ポリマーが提供される。
［１３］上記［１２］に記載の薬物送達用ポリマーは、上記２つ以上のポリマー鎖の１つの末端にｓｕｌｆｏ－ｃｙ５が導入され、その他の末端に非荷電性基を有するポリマーとして測定された場合に、０以下のゼータ電位を示すポリマーであってよい。
［１４］上記［１２］または［１３］に記載の薬物送達用ポリマーは、分子量（Ｍｗ）が、５０００～１０００００であってよい。
［１５］上記［１２］から［１４］のいずれかに記載の薬物送達用ポリマーにおいて、上記２つ以上のポリマー鎖の分子量（Ｍｗ）がそれぞれ、２００～５００００であってよい。
［１６］上記［１２］から［１５］のいずれかに記載の薬物送達用ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（サッカライド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（リンゴ酸）、またはこれらの誘導体から構成される親水性ポリマーを含んでよい。
　本発明によれば、ホスファチジルコリンをミトコンドリアへ輸送する活性を有するリン脂質輸送タンパク質「ＳＴＡＲＤ７（ＳｔＡＲ－ｒｅｌａｔｅｄ　ｌｉｐｉｄ　ｔｒａｎｓｆｅｒ　ｄｏｍａｉｎ　ｐｒｏｔｅｉｎ　７）」と一定以上の結合親和性を有する薬物－ポリマー複合体または薬物送達用ポリマー（ＤＤＳポリマー）を用いることにより、ミトコンドリアターゲティング、好ましくはｉｎ　ｖｉｖｏでのミトコンドリアターゲティングを好適に実施することができる。
実験例で調製した薬物－ポリマー複合体のイメージ図である。 ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのミトコンドリアへの集積評価における顕微鏡観察画像（ａ）と、ミトコンドリアにおける蛍光強度を示すグラフ（ｂ）である。 リガンドが結合された金ナノ粒子の調製スキームを説明する図である。 リガンドが結合された金ナノ粒子とインキュベートした細胞のＴＥＭ画像である。 ＳＴＡＲＤ７不活化細胞と本来の細胞とにおけるミトコンドリアおよび薬物－ポリマー複合体の共局在を示す画像である。 薬物－ポリマー複合体のミトコンドリア集積を定量評価した結果を示すグラフである。 薬物－ポリマー複合体を投与したマウスの腫瘍および臓器表面の蛍光観察画像である。 薬物－ポリマー複合体を投与したマウスの腫瘍および臓器の蛍光強度を示すグラフである。 ミトコンドリアを染色した腫瘍の観察画像である。 ミトコンドリアを染色した腫瘍の切片の観察画像である。 腫瘍のミトコンドリアへの薬物－ポリマー複合体の集積を定量評価した結果を示すグラフである。 ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのミトコンドリアへのタンパク質－ポリマー複合体の取り込みを評価した結果を示すグラフである。 ミトコンドリアへの核酸デリバリーを評価した結果を示すグラフである。 リガンド結合Ｓｉｍ－ポリマー複合体の調製スキームを説明する図である。 リガンド結合Ｓｉｍ－ポリマー複合体のＭＴＴアッセイによる細胞毒性評価結果を示すグラフである。 リガンド結合Ｓｉｍ－ポリマー複合体のＣＣＫ－８アッセイによる細胞毒性評価結果を示すグラフである。 リガンド結合Ｓｉｍ－ポリマー複合体で処理した細胞におけるミトコンドリアから発生する活性酸素種を測定した結果を示すグラフである。 リガンド結合Ｓｉｍ－ポリマー複合体で処理した細胞におけるミトコンドリアの膜電位変化を測定した結果を示すグラフである。 リガンド結合Ｓｉｍ－ポリマー複合体で処理した細胞におけるミトコンドリアの膜電位変化を測定した結果を示すグラフである。 血管内におけるリガンド結合ポリマーに結合されたスルホ－Ｃｙ５の蛍光強度を正規化し、定量化したグラフである。 リガンド結合ポリマーの血管外への漏出を撮像した画像である。 図２０中の関心領域における各標識の蛍光強度を定量化したグラフである。 ＰＣ－８－ＰＥＧ２０で処理した細胞に関して、観察開始後の複数の時点における観察画像および共局在率を示す図である。 リソソームとミトコンドリアとの接触時間と、リガンドの種類との関係を示すグラフである。
　以下、本発明の好ましい実施形態（例えば、ｉｎ　ｖｉｖｏでのミトコンドリアターゲティングに好適に適用され得る薬物－ポリマー複合体およびＤＤＳポリマー等）について説明するが、本発明はこれらの実施形態には限定されない。また、文脈上不適切である場合を除き、各実施形態は適宜組み合わせることができる。さらにまた、本明細書中で、数値範囲を表す「～」は、その上限および下限の数値を含む。
Ａ．薬物－ポリマー複合体
　本発明の実施形態による薬物－ポリマー複合体は、薬物と、ホスホコリン（ＰＣ）基を有する薬物送達用ポリマー（ＰＣ基含有ＤＤＳポリマー）と、を含む。本発明の実施形態による薬物－ポリマー複合体の平均粒子径は、代表的には５ｎｍを超え、例えば５．２ｎｍ超、５．５ｎｍ超、または６ｎｍ超である。ＰＣ基は、下記式（Ｉ）で表される双性イオン性基である。
　本発明の実施形態による薬物－ポリマー複合体のＳＴＡＲＤ７に対する解離定数（ＫＤ）は、例えば１．０×１０－６Ｍ以下、好ましくは５．０×１０－７Ｍ以下、より好ましくは３．０×１０－７Ｍ以下、さらに好ましくは２．０×１０－７Ｍ以下、さらにより好ましくは５．０×１０－８Ｍ以下であり、例えば１．０×１０－９Ｍ以上または１．０×１０－８Ｍ以上であってよい。解離定数が上記範囲内であれば、ＳＴＡＲＤ７を介した薬物－ポリマー複合体のミトコンドリア内への取り込みが好適に行われ得る。このような効果が得られる理由としては、本発明を何ら制限するものではないが、上記解離定数を有する薬物－ポリマー複合体は、ＰＣ基がＳＴＡＲＤ７に好適に認識され得る結果、ミトコンドリア内に効率的に取り込まれると推測される。上記解離定数は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法を用いて測定することができる。ＳＴＡＲＤ７は、代表的には哺乳動物のＳＴＡＲＤ７、好ましくはヒトのＳＴＡＲＤ７である。
　以下、本発明の実施形態による薬物－ポリマー複合体に関して、薬物－ポリマー複合体に含まれる薬物送達用ポリマー（ＤＤＳポリマー）の数が１である実施形態（第１の実施形態）と薬物－ポリマー複合体に含まれるＤＤＳポリマーの数が２以上である実施形態（第２の実施形態）とに分けて説明する。なお、上記薬物－ポリマー複合体は、共有結合および／または非共有結合性の相互作用を利用して形成され得、例えば、結合体（コンジュゲート）、会合体、または凝集体であり得る。
Ａ－１．第１の実施形態
　第１の実施形態における薬物－ポリマー複合体は、１つのＰＣ基含有ＤＤＳポリマーと１つ以上の薬物とを含む。ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーと薬物とは、直接またはリンカーを介して共有結合（配位結合を含む）していてもよく、非共有結合性の相互作用によって複合体化していてもよい。好ましくは、ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーと薬物とは、共有結合している。リンカーとしては、ＤＤＳ用途で用いられる任意のリンカーを用いることができる。リンカーの主鎖の原子数は、例えば１～２０、好ましくは１～１５、より好ましくは１～１０とすることができる。
　１つのＰＣ基含有ＤＤＳポリマーと１つ以上の薬物とが結合した構成を有する薬物－ポリマー複合体において、ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーは、２つ以上のポリマー鎖を有する分岐型ポリマーであり得る。具体的には、上記薬物－ポリマー複合体は、２つ以上のポリマー鎖を有する分岐型のＰＣ基含有ＤＤＳポリマーと、当該２つ以上のポリマー鎖の少なくとも１つに結合された薬物と、を含み得る。
　ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーを構成するポリマーとしては、生体適合性が高い親水性ポリマーが好ましい。例えば、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（サッカライド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（リンゴ酸）、またはこれらの誘導体が例示でき、なかでも、ポリ（エチレングリコール）が好ましい。１つの実施形態において、ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーは、生理的ｐＨ（ｐＨ７．４）において、電荷を有さないポリマーによって構成されている。
　分岐型のＰＣ基含有ＤＤＳポリマーが有するポリマー鎖の数は、例えば３以上、好ましくは４以上、より好ましくは５以上、さらに好ましくは６～３２であり、例えば７以上または８以上であってよく、また例えば２４以下、２０以下、または１６以下であってよい。ポリマー鎖の数が上記範囲内であると、立体障害の抑制とＰＣ基の導入量の確保とを好適に両立することができる。
　ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーは、少なくとも１つのＰＣ基を有する。ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーが有するＰＣ基の数（ポリマー１分子当たりのＰＣ基の数）は、薬物－ポリマー複合体が上記ＳＴＡＲＤ７に対する解離定数を満たす限りにおいて制限されず、好ましくは３以上、より好ましくは４以上、さらに好ましくは５以上、さらにより好ましくは６～３２であり、例えば７以上または８以上であってよく、また例えば２４以下、２０以下、または１６以下であってよい。１つの実施形態において、ＰＣ基含有ＤＤＳポリマー自身（薬物と結合される前のＰＣ基含有ＤＤＳポリマー）のＳＴＡＲＤ７に対する解離定数（ＫＤ）は、例えば１．０×１０－６Ｍ以下、好ましくは５．０×１０－７Ｍ以下、より好ましくは３．０×１０－７Ｍ以下、さらに好ましくは２．０×１０－７Ｍ以下、さらにより好ましくは５．０×１０－８Ｍ以下であり、例えば１．０×１０－９Ｍ以上または１．０×１０－８Ｍ以上であってよい。
　ＰＣ基含有ＤＤＳポリマー中、ＰＣ基は、任意の位置に導入されてよく、好ましくはポリマー鎖の末端に導入される。ポリマー鎖の末端に導入されたＰＣ基は、薬物－ポリマー複合体の表面に露出しやすいことから、ＳＴＡＲＤ７に対する親和性が高い薬物－ポリマー複合体が好適に得られ得る。分岐型のＰＣ基含有ＤＤＳポリマーにおいては、少なくとも１つのポリマー鎖にＰＣ基が結合されており、２以上のポリマー鎖にＰＣ基が結合されていることが好ましく、２以上のポリマー鎖の末端にＰＣ基が結合されていることがより好ましい。
　ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーの分子量（直鎖型、分岐型を問わず、ポリマー全体としてのＭｗ）は、例えば５０００～１０００００、好ましくは１００００～５００００、より好ましくは１２０００～５００００、さらに好ましくは１５０００～５００００、さらにより好ましくは２００００～４００００であり、２００００～３５０００または２００００～３００００であってよい。ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーの分子量分散度（ＰＤＩ）は、例えば１．１以下であり得る。また、ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーが分岐型である場合、各ポリマー鎖の分子量（Ｍｗ）はそれぞれ、代表的には２００以上、好ましくは１０００以上であり、例えば１５００以上または２０００以上であってよく、代表的には５００００以下、好ましくは５０００以下であり、例えば４０００以下または３０００以下であってよい。各ポリマー鎖の分子量は、互いに同じであってもよく、異なっていてもよい。各ポリマー鎖の分子量が同程度であると、その末端基の露出度も同程度となり得る。分子量（Ｍｗ）は、例えば、ゲル濾過浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法で測定することができる。ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーの分子量および／または各ポリマー鎖の分子量が上記範囲内であると、ｉｎ　ｖｉｖｏにおけるミトコンドリアターゲティングがより好適に行われ得る。
　ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーのＰＣ基当量（ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーの分子量／ＰＣ基の数）は、例えば２００～１００００、好ましくは１０００～５０００、より好ましくは１０００～４０００であり、１５００以上または２０００以上であってよく、３０００以下または２５００以下であってよい。ＰＣ基当量が上記範囲であると、薬物－ポリマー複合体の表面におけるＰＣ基の露出度が高くなり、上記ＳＴＡＲＤ７に対する解離定数を満たす薬物－ポリマー複合体を好適に得ることができる。
　分岐型のＰＣ基含有ＤＤＳポリマーは、１つのポリマー鎖の末端にｓｕｌｆｏ－ｃｙ５（以下、「スルホ－ｃｙ５」とも表記され得る）が結合され、その他のポリマー鎖の末端に非荷電性基（例えば、ＰＣ基、アセチル基）を有するポリマーとして測定された場合に、好ましくは０以下、より好ましくは－３以下のゼータ電位、例えば－１５～－３、－１２～－４、または－１１～－５のゼータ電位を示すポリマーであり得る。１つのポリマー鎖が負の荷電性末端基（例えば、ｓｕｌｆｏ－ｃｙ５）を有し、他のポリマー鎖が非荷電性末端基を有する場合、荷電性末端基の露出度が高いと上記ゼータ電位は小さくなり、露出度が低いと上記ゼータ電位は大きくなると考えられる。よって、上記ゼータ電位は、分岐型のＰＣ基含有ＤＤＳポリマーにおける各ポリマー鎖末端基の露出度に対応し得る。上記ゼータ電位を示すポリマー骨格において、ポリマー鎖末端にＰＣ基が結合された構成を有するＰＣ基含有ＤＤＳポリマーは、ＳＴＡＲＤ７に対して十分に小さい解離定数を示し得る。
　上記薬物としては、目的に応じて任意の適切な物質を用いることができる。例えば、細胞増殖抑制活性、抗腫瘍活性、免疫調節活性、抗ウイルス活性、抗菌活性、抗炎症活性等の生理活性を有する物質（生理活性物質）が好ましく用いられ得る。薬物の具体例としては、タンパク質またはペプチド（例えば、抗体またはその機能性断片、ホルモン、酵素）、核酸（例えば、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ等の高分子核酸、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー等の低分子核酸）、その他の生理活性物質（例えば、抗腫瘍剤、シグナル伝達阻害剤、代謝拮抗剤、鎮痛剤、抗炎症剤、抗菌剤）が挙げられる。また、薬物は、蛍光色素、造影剤等の検出試薬であってもよい。薬物は、１種のみを用いてもよく、２種以上を用いてもよい。２つ以上または２種以上の薬物を複合体の状態で用いてもよい。薬物は、ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーの任意の適切な部位に結合され得、例えば、ポリマー鎖の末端またはポリマー鎖の側鎖に結合され得る。
　薬物の質量（分子量）は特に制限されない。具体的には、薬物の質量（分子量）は、５００未満あるいは５００以上であってよい。薬物は、例えば、５００未満の質量（分子量）を有する低分子薬物、５００以上２０００未満の質量（分子量）を有する中分子薬物、または２０００以上の質量（分子量）を有する高分子薬物であり得る。１つの実施形態において、上記その他の生理活性物質は、低分子薬物または中分子薬物であり得る。タンパク質、核酸等の質量は、例えば１０００Ｄａ～１５００００Ｄａ、また例えば３０００Ｄａ～１５００００Ｄａであり得る。
　ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーに結合される薬物の数（薬物－ポリマー複合体１つあたりの薬物の数）は、１以上であり、例えば２以上または３以上であってよい。上記薬物の数の上限は、上記ＳＴＡＲＤ７に対する解離定数が維持される限りにおいて制限されず、例えば１００００以下または１００以下であり得る。異なる種類の薬物を組み合わせて用いてもよい。例えば、抗体と蛍光色素とが結合された薬物－ポリマー複合体は、蛍光色素の蛍光を検出することで抗体の送達効率等を調べることができる。
　上記薬物－ポリマー複合体の平均粒子径は、例えば５．２ｎｍ超であり、好ましくは６ｎｍ超である。上記平均粒子径が例えば５ｎｍ以下、また例えば５．２ｎｍ以下または６ｎｍ以下であると、腎臓から尿中に排泄されやすい傾向がある。上記平均粒子径は、上記ＳＴＡＲＤ７に対する解離定数を満たす限りにおいて制限されない。上記平均粒子径は、代表的には１００ｎｍ以下であり、好ましくは３０ｎｍ以下であり、例えば２０ｎｍ以下または１０ｎｍ以下であってよい。平均粒子径は、動的光散乱（ＤＬＳ）測定装置を用いて測定することができる。
　上記薬物－ポリマー複合体は、任意の適切な方法で製造することができる。例えば、薬物－ポリマー複合体は、末端に官能基Ａが導入されたポリマー鎖を有する分岐型ポリマーと、官能基Ａと反応可能な官能基およびＰＣ基を有するＰＣ基含有化合物と、を反応させて、ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーを得ること、および、ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーの未反応の官能基Ａと、薬物が有する官能基と、を反応させること、を含む方法；末端に官能基Ａが導入されたポリマー鎖を有する分岐型ポリマーと、官能基Ａと反応可能な官能基を有する薬物と、を反応させて薬物結合ポリマーを得ること、薬物結合ポリマーの未反応の官能基Ａと、官能基Ａと反応可能な官能基およびＰＣ基を有するＰＣ基含有化合物と、を反応させること、を含む方法；末端に官能基Ａが導入されたポリマー鎖と官能基Ｂが導入されたポリマー鎖とを有する分岐型ポリマーと、官能基Ａと反応可能な官能基を有する薬物および官能基Ｂと反応可能な官能基およびＰＣ基を有するＰＣ基含有化合物と、を反応させること、を含む方法等によって得ることができる。ＰＣ基含有ポリマーとの反応に用いられる薬物の官能基は、薬物に固有の官能基であってもよく、クロスリンカー等を用いて薬物に導入された官能基であってもよい。
　官能基の組み合わせの具体例としては、アジド基とアルキン、チオール基と（メタ）アクリロイル基、チオール基とマレイミド基、チオール基とチオール基、チオール基とカルボキシル基、（メタ）アクリロイル基とヒドロキシル基、（メタ）アクリロイル基とアミノ基、カルボキシル基とアミノ基、カルボキシル基とヒドロキシル基、アミノ基とヒドロキシル基、アミノ基とＮＨＳエステル基、アミノ基とアルデヒド基等が挙げられる。また、種々の官能基（例えば、アミノ基、マレイミド、ＮＨＳ、チオール、アクリロイルオキシ、カルボキシル）が導入された分岐型ＰＥＧおよびクロスリンカーが市販されている。また、ＰＣ基含有化合物の具体例としては、６－（Ｏ－ホスホリルコリン）ヒドロキシヘキサン酸、２－（メタ）アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、３－（メタ）アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、４－（メタ）アクリロイルオキシブチルホスホリルコリン、６－（メタ）アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、１０－（メタ）アクリロイルオキシデシルホスホリルコリン、ω－（メタ）アクリロイル（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン、２－（メタ）アクリルアミドエチルホスホリルコリン、３－（メタ）アクリルアミドプロピルホスホリルコリン、４－（メタ）アクリルアミドブチルホスホリルコリン、６－（メタ）アクリルアミドヘキシルホスホリルコリン、１０－（メタ）アクリルアミドデシルホスホリルコリン、ω－（メタ）アクリルアミド（ポリ）オキシエチレンホスホリルコリン等が挙げられる。
Ａ－２．第２の実施形態
　第２の実施形態における薬物－ポリマー複合体は、ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーを含む２つ以上のＤＤＳポリマーと１つ以上の薬物とを含む。第２の実施形態における薬物－ポリマー複合体としては、上記２つ以上のＤＤＳポリマーが薬物または担体に共有結合されている構成（構成１）および上記２つ以上のＤＤＳポリマーが非共有結合性の相互作用によって会合している構成（構成２）が挙げられる。構成１において、ＤＤＳポリマーと薬物または担体との結合は、直接またはリンカーを介して行われ得る。
　２つ以上のＤＤＳポリマーを含む薬物－ポリマー複合体においても、上記ＳＴＡＲＤ７に対する解離定数を満たすものであれば、ミトコンドリア内への薬物送達、なかでも、ｉｎ　ｖｉｖｏでのミトコンドリア内への薬物送達が好適に行われ得る。
　２つ以上のＤＤＳポリマーは、ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーに加えて、ＰＣ基を有さないＤＤＳポリマー（ＰＣ基非含有ＤＤＳポリマー）を含み得る。第２の実施形態における薬物－ポリマー複合体において、ＤＤＳポリマーは、薬物の可溶化、徐放化、血中滞留性の向上、酵素分解の回避等の効果も発揮し得る。
　構成１の薬物－ポリマー複合体としては、例えば、１つの薬物にＰＣ基含有ＤＤＳポリマーを含む２つ以上のＤＤＳポリマーが結合した構成（構成１ａ）と、１つの担体または薬物にＰＣ基含有ＤＤＳポリマーおよび薬物含有ポリマーが結合した構成（構成１ｂ）と、が挙げられる。
Ａ－２－１．構成１ａ
　構成１ａの薬物－ポリマー複合体において、ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーを構成するポリマーとしては、Ａ－１項で記載した親水性ポリマーに加えて、ポリ（プロピレングリコール）、ポリ（エチレングリコール）－ポリ（プロピレングリコール）、アルブミン等の可溶性タンパク質、多糖等が好ましく例示される。なかでも、ポリ（エチレングリコール）が好ましい。
　ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーは、直鎖状であってもよく、分岐鎖状であってもよい。ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーの分子量（分岐鎖状である場合は、各鎖のＭｗ）は、例えば２００以上、好ましくは１０００以上であり、例えば１５００以上または２０００以上であってよく、代表的には５００００以下、好ましくは５０００以下であり、例えば４０００以下または３０００以下であってよい。ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーは、１種のみ用いてもよく、２種以上を併用してもよい。２種以上を併用する場合、各ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーの分子量は、互いに同じであってもよく、異なっていてもよい。また、ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーが分岐鎖状の場合、各ポリマー鎖の分子量は、互いに同じであってもよく、異なっていてもよい。ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーの分子量が上記範囲内であると、ＰＣ基の露出と薬物の被覆とが好適に両立され得る。
　ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーにおいて、ＰＣ基は、上記ポリマーの任意の適切な部位に結合され得、好ましくは上記ポリマーの末端に結合される。ＰＣ基が導入された末端と官能基が導入された末端とを有するＰＣ基含有ＤＤＳポリマーを、当該官能基を用いて薬物と結合させることで、薬物の表面を上記ポリマーで層状に覆うことができ、さらに、上記ポリマー層の表面にＰＣ基を露出させることができる。ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーが有するＰＣ基の数は、１以上であり、例えば１～８であり得る。
　上記ＰＣ基非含有ＤＤＳポリマーについては、ＰＣ基を有さないこと以外はＰＣ基含有ＤＤＳポリマーと同様の説明を適用することができる。ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーとＰＣ基非含有ＤＤＳポリマーとは、ＰＣ基の有無を除いて実質的に同じポリマーであってもよく、異なるポリマー（例えば、分子量、構成単位の種類または比率等が異なるポリマー）であってもよい。
　１つの薬物に結合するＰＣ基含有ＤＤＳポリマーの数は、薬物－ポリマー複合体が上記ＳＴＡＲＤ７に対する解離定数を示す限りにおいて制限されない。１つの実施形態において、ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーは、薬物－ポリマー複合体に含まれるＰＣ基の数が、例えば２以上、好ましくは３以上、より好ましくは５以上となるように、薬物に結合され得る。１つの薬物に結合するＰＣ基含有ＤＤＳポリマーの数は、例えば２以上、また例えば７以上であってよく、例えば５×１０７以下、５×１０４以下、または５×１０２以下であり得る。
　１つの薬物に結合する各ポリマー数の比（ＰＣ基含有ＤＤＳポリマー：ＰＣ基非含有ＤＤＳポリマー）は、例えば１００：０～１：９９、好ましくは１０：９０～５０：５０、より好ましくは２０：８０～３０：７０であってよい。
　薬物としては、上述と同様のものを用いることができ、タンパク質、核酸、多糖等の比較的サイズが大きいものが好ましく用いられる。薬物が、タンパク質、核酸、多糖等の生体高分子である場合、その質量は、例えば１０００Ｄａ～１５００００Ｄａ、また例えば３０００Ｄａ～１５００００Ｄａであり得る。
　上記薬物－ポリマー複合体の平均粒子径は、例えば５．２ｎｍ超であり、好ましくは６ｎｍ超である。上記平均粒子径が例えば５ｎｍ以下、また例えば５．２ｎｍ以下または６ｎｍ以下であると、腎臓から尿中に排泄されやすい傾向がある。上記平均粒子径は、上記ＳＴＡＲＤ７に対する解離定数を満たす限りにおいて制限されない。上記平均粒子径は、好ましくは２００ｎｍ以下であり、例えば１５０ｎｍ以下または１００ｎｍ以下であってよい。平均粒子径は、動的光散乱（ＤＬＳ）測定装置を用いて測定することができる。
　上記薬物－ポリマー複合体は、任意の適切な方法で製造することができる。例えば、薬物－ポリマー複合体は、一方の端部に官能基Ａが導入され、他方の端部に官能基Ｂが導入されたポリマーと、官能基Ａと反応可能な官能基およびＰＣ基を有するＰＣ基含有化合物と、を反応させて、ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーを得ること、および、ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーの官能基Ｂと、官能基Ｂと反応可能な官能基を有する薬物と、を反応させること、を含む方法によって得ることができる。ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーおよびＰＣ基非含有ＤＤＳポリマーを薬物と反応させることもできる。
Ａ－２－２．構成１ｂ
　構成１ｂの薬物－ポリマー複合体において、ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーとしては、Ａ－２－１項に記載のものと同様のものを用いることができる。薬物含有ＤＤＳポリマーとしては、ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーにおいて、ＰＣ基の代わりに薬物を有するポリマーを例示することができる。また、ＰＣ基含有ＤＤＳポリマーまたは薬物含有ＤＤＳポリマーの代わりに、あるいは、これらに加えて、ＰＣ基と薬物とを有するＰＣ基－薬物含有ＤＤＳポリマーを用いてもよい。ＰＣ基－薬物含有ＤＤＳポリマーは、例えば、側鎖に薬物が導入され、一方の末端にＰＣ基、他方の末端に官能基を有し、当該官能基による反応を介して担体または薬物と結合され得る。構成１ｂの薬物－ポリマー複合体においては、目的に応じて、上記ＤＤＳポリマーに加えて、ＰＣ基も薬物も有さないＰＣ基－薬物非含有ＤＤＳポリマーを担体または薬物と結合させてもよい。
　ＤＤＳポリマーを結合させる担体または薬物としては、金等の金属ナノ粒子、酸化ガドリニウム等の金属酸化物ナノ粒子等が好ましく例示できる。担体の長径は、例えば５ｎｍ～４０ｎｍ、また例えば５ｎｍ～１５ｎｍであり得る。これらのナノ粒子は、球状であってもよく、ロッド状であってもよい。また、クエン酸緩衝液等の緩衝液に分散されていてもよい。金属ナノ粒子は、造影剤としても機能し得ることから、当該用途においては、金属ナノ粒子は薬物であり得る。
　１つの担体または薬物に結合するＰＣ基含有ＤＤＳポリマーの数は、薬物－ポリマー複合体が上記ＳＴＡＲＤ７に対する解離定数を示す限りにおいて制限されない。１つの担体または薬物に結合するＰＣ基含有ＤＤＳポリマーの数は、例えば２以上、また例えば７以上であってよく、例えば５×１０７以下、５×１０４以下、または５×１０２以下であり得る。
　１つの担体または薬物に結合するＰＣ基含有ＤＤＳポリマーの数とＰＣ基－薬物非含有ＤＤＳポリマーの数との比（前者：後者）は、例えば１００：０～１：９９、好ましくは１０：９０～５０：５０、より好ましくは２０：８０～３０：７０であってよい。
　１つの担体または薬物に結合する薬物含有ポリマーの数は、薬物含有ポリマーに結合している薬物の数、種類等に応じて適宜設定され得る。１つの担体または薬物に薬物含有ポリマーを介して担持される薬物の数は、例えば１～１００、また例えば５～３０であり得る。
　薬物含有ポリマーが有する薬物としては、Ａ－１項に記載される薬物と同様のものを用いることができる。好ましくは比較的サイズが小さいものが好ましく用いられ、その質量は、例えば１０００Ｄａ以下であり得る。
　上記薬物－ポリマー複合体の平均粒子径は、例えば５．２ｎｍ超であり、好ましくは６ｎｍ超である。上記平均粒子径が例えば５ｎｍ以下、また例えば５．２ｎｍ以下または６ｎｍ以下であると、腎臓から尿中に排泄されやすい傾向がある。上記平均粒子径は、上記ＳＴＡＲＤ７に対する解離定数を満たす限りにおいて制限されない。上記平均粒子径は、好ましくは２００ｎｍ以下であり、例えば１５０ｎｍ以下または１００ｎｍ以下であってよい。
　上記薬物－ポリマー複合体は、任意の適切な方法で製造することができる。例えば、上記薬物－ポリマー複合体は、一方の末端に官能基を有する各ＤＤＳポリマーを準備し、当該官能基を担体または薬物が有する官能基と反応させること、当該官能基を用いて各ＤＤＳポリマーを担体または薬物表面に化学吸着させること等によって得られ得る。
Ａ－２－３．構成２
　構成２の薬物－ポリマー複合体は、非共有結合性の相互作用によって会合した２分子以上のＤＤＳポリマー（好ましくはＰＣ基含有ＤＤＳポリマー）と薬物とを含む会合体である。上記会合体としては、例えば、ミセル、ベシクル等のナノ粒子またはポリイオンコンプレックス（ＰＩＣ）が挙げられる。薬物は、ＤＤＳポリマーに結合されていてもよく、結合されることなく、会合体（例えば、ナノ粒子）に内包されていてもよい。
　上記薬物－ポリマー複合体の平均粒子径は、例えば４００ｎｍ以下、好ましくは２００ｎｍ以下、より好ましくは１５０ｎｍ以下、さらに好ましくは１００ｎｍ以下、さらにより好ましくは８０ｎｍ以下であり、例えば２０ｎｍ以上または３０ｎｍ以上である。平均粒子径は、動的光散乱（ＤＬＳ）測定装置を用いて測定することができる。
　上記薬物－ポリマー複合体としては、ＷＯ２０２０／１１６６４０の［００７４］～［００８０］に記載される会合体が例示できる。具体的には、電荷を有する薬物とＰＣ基および上記薬物と反対の電荷を有する荷電性ポリマーとが静電相互作用によって会合して形成されるＰＩＣ；末端にＰＣ基を有する親水性ポリマーセグメントと疎水性ポリマーセグメントとを含むＰＣ基含有ブロックコポリマーによって形成され、薬物を内包するポリマーミセル；ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、およびそれらの共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリε－カプロラクトン、キトサン等のＰＣ基含有生体適合性ポリマーによって形成され、薬物を担持する微粒子；等が例示できる。これらの薬物－ポリマー複合体においても、上記ＳＴＡＲＤ７に対する解離定数を満たすことにより、ｉｎ　ｖｉｖｏでのミトコンドリア内への薬物送達が好適に行われ得る。例えば、会合体を構成するＤＤＳポリマーにおけるＰＣ基含有ＤＤＳポリマーの割合を増加させることにより、会合体のＳＴＡＲＤ７との親和性を向上させ得る。
Ｂ．医薬組成物
　本実施形態による医薬組成物は、Ａ項に記載の薬物－ポリマー複合体を含む。医薬組成物は、目的に応じて、薬物－ポリマー複合体中の薬物以外の薬物をさらに含んでいてもよい。また、必要に応じて、任意の適切な添加剤を含むことができる。添加剤は、薬学的に許容され得るものであればよく、例えば賦形剤、希釈剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、ｐＨ調整剤、緩衝剤、安定化剤等を例示できる。
　医薬組成物は、任意の適切な剤形に調製される。医薬組成物は、代表的には、非経口剤であり、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤等の注射剤、輸液剤、点眼剤、点鼻剤等であり得る。
Ｃ．ミトコンドリアに薬物を送達する方法
　本発明の別の局面によれば、Ａ項に記載の薬物－ポリマー複合体またはＢ項に記載の医薬組成物を処置対象の個体に投与することを含む、ｉｎ　ｖｉｖｏでミトコンドリアに薬物を送達する方法が提供される。
　Ａ項に記載の薬物－ポリマー複合体またはＢ項に記載の医薬組成物によって処置され得る疾患としては、ミトコンドリアが関与する疾患が挙げられる。ミトコンドリアが関与する疾患としては、ミトコンドリア病、がん、糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病、神経変性疾患、心血管疾患、代謝性疾患等が挙げられる。１つの実施形態において、上記薬物－ポリマー複合体および医薬組成物は、がん細胞のミトコンドリアへの薬物の送達に用いられ得る。
　処置対象の個体は、代表的には、ヒトまたはヒト以外の哺乳類である。ヒト以外の哺乳類としては、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ、ヤギ、イヌ、ネコ、サル、チンパンジー、ウシ、ウマ、ブタ等が挙げられる。
　個体への投与は、全身投与であってもよく、局所投与であってもよい。全身投与としては、静脈内注射、皮下注射、筋肉内注射等の注射または点滴が挙げられる。局所投与としては、皮膚、粘膜、鼻、眼等への投与が挙げられる。
　投与量は、処置対象となる疾患、症状、処置対象の個体、投与方法等に応じて任意の適切な量に設定され得る。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。以下の実施例において、統計解析は、２グループ間の比較に対して、ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ　ｔ　ｔｅｓｔで行い、３グループ以上の比較に対して、ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｎｃｅ　（ＡＮＯＶＡ）　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　Ｔｕｋｅｙ　ｐｏｓｔ－ｈｏｃ　ｔｅｓｔで行った。
［実験例１：薬物－ポリマー複合体の作製］
（１）ＰＣ結合薬物－ポリマー複合体
　下記に示す構造を有し、３つの異なる分子量（Ｍｗ＝１０ｋ、２０ｋ、または４０ｋ）を有する８分岐型ポリエチレングリコール（以下、「８－ＰＥＧ１０－ＮＨ２」、「８－ＰＥＧ２０－ＮＨ２」、「８－ＰＥＧ４０－ＮＨ２」）をＣｒｅａｔｉｖｅ　ＰＥＧＷｏｒｋｓから購入した。これらのＰＤＩは、１．０２～１．０６であった。８－ＰＥＧ１０－ＮＨ２、８－ＰＥＧ２０－ＮＨ２、および８－ＰＥＧ４０－ＮＨ２における各ＰＥＧ鎖の分子量（Ｍｗ）はそれぞれ、約１２５０、約２５００、および約５０００であり、各ＰＥＧ鎖の末端にはアミノ基が導入されている。
　Ｓｕｌｆｏ－ｃｙａｎｉｎｅ　５　ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ　ｅｓｔｅｒ（以下、「スルホ－Ｃｙ５－ＮＨＳ」）をＬｕｍｉｐｒｏｂｅから購入した。
　８－ＰＥＧ１０－ＮＨ２、８－ＰＥＧ２０－ＮＨ２、または８－ＰＥＧ４０－ＮＨ２をＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のスルホ－Ｃｙ５－ＮＨＳ（アミンに対して１当量）と混合し、室温で２４時間撹拌した。得られたスルホ－Ｃｙ５標識ポリマーをメタノールおよび純水に対して交互に各３回透析することによって精製した（ＭＷＣＯ：３，５００）。生成物を凍結乾燥により回収した。ポリマーに対するスルホ－Ｃｙ５の結合を蛍光検出および１Ｈ－ＮＭＲ（アセトニトリル－ｄ３；２５℃）によって確認した。スルホ－Ｃｙ５標識ポリマーを水に溶解し（１０ｍｇ／ｍｌ）、６－（Ｏ－ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ（富士フイルム和光純薬社）（アミンに対して１０当量）および４－（４，６－Ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－１，３，５－ｔｒｉａｚｉｎ－２－ｙｌ）－４－ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｎ－ｈｙｄｒａｔｅ（以下、「ＤＭＴ－ＭＭ」、富士フイルム和光純薬社）（アミンに対して１０当量）と、水中、室温で２４時間混合した。追加のＤＭＴ－ＭＭ（アミンに対して２当量）を反応の間６時間毎に投入した。生成物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５を含む使い捨てＰＤ－１０脱塩カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を通過させることで精製し、凍結乾燥により回収した。これにより、薬物としてスルホ－Ｃｙ５が結合されたＰＣ結合薬物－ポリマー複合体（ＰＣ－８－ＰＥＧ１０、ＰＣ－８－ＰＥＧ２０、ＰＣ－８－ＰＥＧ４０）を得た。
　ポリマーへのＰＣの結合を、Ｄ２Ｏ（０．０５％Ｖ／Ｖ　ＴＭＳ）中の１Ｈ－ＮＭＲによって調べたところ、ＰＣのポリマーへの結合率は、７２％～９９％であった。
１Ｈ－ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）δ＝３．０－３．２ｐｐｍ（９Ｈ：（ＣＨ３）３－Ｎ－）ａｎｄ　δ＝１．２－２．２ｐｐｍ（６Ｈ：－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－ＣＨ２－）
（２）アセチル化薬物－ポリマー複合体
　上記と同様にして、スルホ－Ｃｙ５で標識した８－ＰＥＧ１０－ＮＨ２、８－ＰＥＧ２０－ＮＨ２、および８－ＰＥＧ４０－ＮＨ２を得た。これらのポリマーを超脱水アセトニトリルに溶解し、アルゴン雰囲気下でトリエチルアミン（以下、「ＴＥＡ」）（アミンに対して１００当量）を加えた。室温で３０分撹拌後、酢酸無水物を超脱水アセトニトリルに溶解し、ポリマー溶液に滴下した。混合物を、アルゴン雰囲気下、室温で２４時間撹拌した。アセトニトリルを蒸発により除去した。生成物（アセチル化ポリマー（Ａｃ－８－ＰＥＧ））を純水に再溶解し、ＰＣ結合薬物－ポリマー複合体と同様の方法で精製した。これにより、ネガティブコントロールとしてのアセチル化薬物－ポリマー複合体（Ａｃ－８－ＰＥＧ１０、Ａｃ－８－ＰＥＧ２０、Ａｃ－８－ＰＥＧ４０）を得た。
　アセチル化の程度を、アセトニトリル－ｄ３（０．０５％Ｖ／Ｖ　ＴＭＳ）中の１Ｈ－ＮＭＲによって調べたところ、アミンの７２％～８５％のアセチル化が確認された。
１Ｈ－ＮＭＲ（Ｃ２Ｄ３Ｎ）δ＝１．８０－１．８５ｐｐｍ（３Ｈ：－ＣＯ－ＣＨ３）
（３）ＴＰＰ結合薬物－ポリマー複合体
　上記と同様にして、スルホ－Ｃｙ５で標識した８－ＰＥＧ１０－ＮＨ２、８－ＰＥＧ２０－ＮＨ２、および８－ＰＥＧ４０－ＮＨ２を得た。これらのポリマーを水に溶解し（１０ｍｇ／ｍｌ）、（３－Ｃａｒｂｏｘｙｂｕｔｙｌ）ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ　Ｂｒｏｍｉｄｅ（富士フイルム和光純薬社）（アミンに対して１０当量）およびＤＭＴ－ＭＭ（アミンに対して５０当量）と、水中、室温で２４時間混合した。追加のＤＭＴ－ＭＭ（アミンに対して２当量）を反応の間６時間毎に添加した。生成物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５を含む使い捨てＰＤ－１０脱塩カラム（Ｃｙｔｉｖａ）を通過させることで精製し、凍結乾燥により回収した。これにより、ポジティブコントロールとしてのＴＰＰ結合薬物－ポリマー複合体（ＴＰＰ－８－ＰＥＧ１０、ＴＰＰ－８－ＰＥＧ２０、ＴＰＰ－８－ＰＥＧ４０）を得た。
　ポリマーへのＴＰＰの結合を、アセトニトリル－ｄ３（０．０５％Ｖ／Ｖ　ＴＭＳ）中の１Ｈ－ＮＭＲによって調べたところ、ＴＰＰのポリマーへの結合率は、８６％～８７％であった。
１Ｈ－ＮＭＲ（アセトニトリル－ｄ３）δ＝６．０－９．０ｐｐｍ（１５Ｈ：（Ｃ６Ｈ５）３－Ｐ－）
　上記（１）～（３）で得られた薬物－ポリマー複合体のイメージ図を図１に示す。
＜粒子径およびゼータ電位の測定＞
　上記（１）～（３）で得られた薬物－ポリマー複合体の流体力学的直径および多分散度指数（ＰＤＩ）を動的光散乱法（ＤＬＳ）で測定した。また、薬物－ポリマー複合体の表面ゼータ電位を電気泳動光散乱法（ＥＬＳ）で測定した。具体的には、各薬物－ポリマー複合体を脱イオン水に溶解したものを測定サンプル（４ｍｇ／ｍｌ）として、室温で、ダイオードレーザー（λ＝５３２ｎｍ）を搭載したＺａｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ．）を用いて、検出角度１７３°で測定を行った。結果を、各薬物－ポリマー複合体におけるリガンド（ＰＣ基、ＴＰＰ基、またはＡｃ基）の結合数およびスルホ－Ｃｙ５の結合数とともに表１に示す。なお、リガンドおよびスルホ－Ｃｙ５の結合数は、ＮＭＲデータから算出した推定結合数である。ポリマーの長さ、リガンドの種類等によってポリマーと溶媒との親和性が変化することから、当該推定結合数は実際の値から多少ずれる場合があるが、リガンドの推定結合数とスルホ－Ｃｙ５の推定結合数との合計が７以上である場合は、末端アミノ基の全てが反応したと推測できる。
＜ＳＴＡＲＤ７に対する解離定数（ＫＤ）測定＞
　表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定は、ＢＩＡＣＯＲＥ　Ｔ２００（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて行った。
　まず、ＥＤＣカップリング法を用いて、抗ＧＳＴ抗体をＣＭ５センサーチップ表面のカルボキシル基に結合させた。具体的には、以下のとおりである。新たに調製した脱イオン水中の０．２Ｍ　Ｎ－ｅｔｈｙｌ－Ｎ’－（３－ｄｅｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ　ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ）と０．０５Ｍ　Ｎ－ｈｙｄｒｏｘｙｓｕｃｃｉｎｅｉｍｉｄｅとの混合液を注入し、ゲル上の表面のカルボキシル基を化学的に活性化した。続いて、１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）中の３０μｇ／ｍＬ抗ＧＳＴ抗体溶液９８μＬを注入し、ＰＢＳ（－）を移動相として流動させ、デキストランゲルの活性化表面に４２０秒間固定化した。最後に、１２８μＬの１Ｍエタノールアミン／ＨＣｌ（ｐＨ８．５）の注入により、デキストランゲル表面の未反応カルボキシル基を確実に失活させた。
　次に、ＳＴＡＲＤ７タンパク質を、ＧＳＴタグを媒介して抗ＧＳＴ抗体に固定化した。具体的には、以下のとおりである。センサーチップへの抗ＧＳＴ抗体の固定化後、移動相を１５０ｍＭ　ＮａＣｌおよび５ｍＭ　ＣａＣｌ２を含む５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ＲＢ；ランニングバッファー）に交換した。次に、ＲＢ中の２μｇ／ｍＬのＧＳＴタグ付きＳＴＡＲＤ７（ＬｉｆｅＳｐａｎ　ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社、「Ｈｕｍａｎ　ＳＴＡＲＤ７　Ｐｒｏｔｅｉｎ　（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＧＳＴ）　（ａａ６１－３０７）－ＬＳ－Ｇ２２２０８」、Ｌｏｔ＃　ＬＳ－Ｇ２２２０８／１９８０５８）溶液を、応答ユニットが２００ＲＵに達するまで注入した。ＳＴＡＲＤ７溶液の代わりにＲＢを注入したものを参照チャネルとして抗体結合を行った。
　次に、ＲＢ中の薬物－ポリマー複合体溶液を、一連の異なる濃度（４８、２４、１２、６、および３μＭ）で、接触時間１２０秒、流速３０μＬ／分で注入してＳＰＲ測定を行った。得られた応答曲線を、Ｂｉａｃｏｒｅ評価ソフトウェア（Ｃｙｔｉｖａ）を用いて処理して、解離定数を決定した。結果を表２に示す。
　なお、上記測定で用いたＳＴＡＲＤ７のアミノ酸配列は、ＬｉｆｅＳｐａｎ　ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ社のＨＰ（https://www.lsbio.com/proteins/human-stard7-protein-recombinant-gst-aa61-307-ls-g22208/22208）に開示されており、配列番号１として示されるとおりである。
　以下の実験例において、特段の記載が無い場合における薬物－ポリマー複合体は、上記（１）～（３）で調製した薬物－ポリマー複合体である（表１に記載のもの）。
［実験例２：ｉｎ　ｖｉｔｒｏでのミトコンドリアへの集積］
　ＢｘＰＣ３細胞を、１０％Ｖ／Ｖ　ＦＢＳおよび１％Ｖ／Ｖ　ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ中、１，０００，０００細胞／ウェルの濃度で１２ウェルプレートに播き、一晩インキュベートした。薬物－ポリマー複合体を、２５μＭの濃度でＢｘＰＣ３細胞を含む上記ウェルに添加し、２４時間インキュベートした。余分のポリマーを取り除くために細胞を新鮮な培地で十分かつ注意深く洗浄した後、０．１ｍｇ／ｍＬ　Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２と１５分間インキュベーションして細胞の核を染色した。細胞を新鮮な培地で十分かつ注意深く洗浄した後、細胞を室温で１５分間４％ＰＦＡ（４％パラホルムアルデヒド含有ＰＢＳ溶液）で固定した。試料を共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ）（ＬＳＭ　７８０；カールツァイス）で観察した。各蛍光を以下のように異なる励起（ｅｘ．）および発光（ｅｍ．）フィルターによって観察した。Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２：ｅｘ．４０５ｎｍ／ｅｍ．４１０－４８５ｎｍ、ＧＦＰ：ｅｘ．４８８ｎｍ／ｅｍ．４８９－５５１ｎｍ、スルホ－Ｃｙ５：ｅｘ．６３３ｎｍ／ｅｍ．６３８－７４６ｎｍ。製造業者のプロトコルに従ってミトコンドリア分離キット（Ａｂｃａｍ）を用いて細胞からミトコンドリアを分離した。ミトコンドリア中の薬物－ポリマー複合体の含有量は、ＳＰＡＲＫ（Ｒ）マルチモードマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）を用いてミトコンドリア中のスルホ－Ｃｙ５の蛍光強度で評価した。結果を図２に示す。図中、（ａ）は顕微鏡観察画像であり、（ｂ）はミトコンドリアにおける蛍光強度を示すグラフである。
　図２に示されるとおり、ＰＣ結合薬物－ポリマー複合体は、すべての分子量において、Ａｃ化薬物－ポリマー複合体およびＴＰＰ結合薬物－ポリマー複合体よりも良好なミトコンドリア集積性を示した。
［実験例３：金ナノ粒子のミトコンドリアへの送達］
　図３に示すスキームでリガンドが結合された金ナノ粒子を調製した。
　２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）を、マイケル付加によってチオールおよび第一級アミン末端ＰＥＧと結合させて、ＰＣ－ＰＥＧ－ＮＨ２を得た。ＴＰＰ－ＣＯＯＨを、片側遊離で、もう片側はｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）で保護されたアミン末端ＰＥＧと結合させて、結合後、Ｂｏｃを脱保護することで、ＴＰＰ－ＰＥＧ－ＮＨ２を得た。リガンドが導入された第一級アミン末端ＰＥＧまたはメトキシおよび第一級アミン末端ＰＥＧを、ＤＭＦ中の１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドカップリングによってリポ酸と結合させた。生成物のジチオラン部分をジヒドロリポ酸に還元してチオール含有ポリマー（ＭｅＯ－ＰＥＧ－（ＳＨ）２、ＰＣ－ＰＥＧ－（ＳＨ）２、ＴＰＰ－ＰＥＧ－（ＳＨ）２）を生成させ、これらを表３に示す所定の割合で混合して、水性条件下で金ナノ粒子にキレート化した。なお、用いたＰＥＧは直鎖であり、その分子量（Ｍｗ）はいずれも、２０００であった。
　ポリマーにキレート化された金ナノ粒子のサイズおよび表面電位をそれぞれ、ＤＬＳおよびＥＬＳを用いて評価するとともに、当該金ナノ粒子の形態をＴＥＭにより観察した。次に、１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ中で、２．５×１０１２ｐａｒｔｉｃｌｅｓ／ｍＬの濃度の金ナノ粒子とともにＢｘＰＣ３細胞を２４時間インキュベートし、金ナノ粒子の細胞内微小分布を、ＴＥＭ観察した。ＴＥＭのサンプルは、既報（Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉ，Ｙ．ｅｔ　ａｌ．　Ｓｃｉｅｎｃｅ　３５８，６２３－６３０（２０１７））に従って調製した。結果を表３および図４に示す。図４中、（ａ）および（ｂ）はそれぞれ、ＭｅＯ－ＰＥＧ－Ｓ－ＡｕＮＰとインキュベートした細胞のＴＥＭ画像およびそのミトコンドリア部分の拡大画像であり、（ｃ）および（ｄ）はそれぞれ、２５％ＰＣ－ＰＥＧ－Ｓ－ＡｕＮＰとインキュベートした細胞のＴＥＭ画像およびそのミトコンドリア部分の拡大画像であり、（ｅ）は（ｄ）のミトコンドリアおよび金ナノ粒子を示す断層画像である（（ａ）および（ｃ）のスケールバー：５００ｎｍ、（ｂ）および（ｄ）のスケールバー：２００ｎｍ）。
　図４に示されるとおり、ＰＣ基が導入された金ナノ粒子は、ミトコンドリアおよびエンドソームの内部に移行したことが確認されたが、細胞質および核への移行は確認されなかった。一方、ＴＰＰ基が導入された金ナノ粒子は細胞質への移行が確認され、リガンドが導入されていない金ナノ粒子は主にエンドソーム内に分布していた。この結果は、ＰＣ基のミトコンドリアターゲティングの選択性がＴＰＰ基の選択性よりも高いことを裏付けるものである。
［実験例４：ＳＴＡＲＤ７ＫＤ細胞におけるミトコンドリアへの集積］
　下記のようにして、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｒ）を用いたトランスフェクションよりＢｘＰＣ３細胞のＳＴＡＲＤ７を不活化（ノックアウト）した。ＳＴＡＲＤ７は、ゴルジ体、滑面小胞体、細胞質等の周囲の細胞小器官からミトコンドリアにホスファチジルコリンを輸送するタンパク質である。
　ＢｘＰＣ３細胞を、１０％Ｖ／Ｖ　ＦＢＳおよび１％Ｖ／Ｖ　ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ中、５％のミトコンドリア－ＧＦＰ（ＢａｃＭａｍ２．０）（Ｍｉｔｏ－ＧＦＰ）と共にインキュベートし、成熟細胞を新鮮な培地で３回洗浄した。ＳＴＡＲＤ７－ノックアウトｓｉＲＮＡまたは陰性対照としてのスクランブルＲＮＡを、ＲＮＡｉＭＡＸを用いて細胞にトランスフェクトした。ＲＮＡｉＭＡＸを含む培地を用いて細胞を２４時間インキュベートした。新しい培地で細胞を３回洗浄した後、培地に溶解した２５μＭ　ＰＣ結合薬物－ポリマー複合体またはＴＰＰ結合薬物－ポリマー複合体を添加し、細胞を２４時間インキュベートした。ＳＴＡＲＤ７不活化細胞と本来の細胞（ｎａｔｉｖｅ　ｃｅｌｌ）とにおけるミトコンドリアおよび薬物－ポリマー複合体の共局在の違いを、ＣＬＳＭ（ＬＳＭ　７８０）で取得した共局在画像およびミトコンドリア単離からの定量データによって調べた。具体的には、薬物－ポリマー複合体とインキュベートしたＳＴＡＲＤ７ノックダウンＢｘＰＣ３細胞におけるＡｌｅｘａ　４８８標識ミトコンドリアをＬＳＭ　７８０を用いてイメージングすることにより、ＳＴＡＲＤ７のノックダウンによる薬物－ポリマー複合体のミトコンドリア集積への影響を確認した。結果を図５に示す。また、薬物－ポリマー複合体のミトコンドリア集積を、ミトコンドリア単離アッセイで定量した。結果を図６に示す。
　図５および６に示されるとおり、ＰＣ結合薬物－ポリマー複合体のミトコンドリアへの集積はＳＴＡＲＤ７のノックダウンによって効果的に抑制された一方で、ＴＰＰ結合薬物－ポリマー複合体のミトコンドリアへの集積はその影響を受けなかった。これらの結果は、ＰＣ結合薬物－ポリマー複合体はＳＴＡＲＤ７に関連する経路によって輸送されるのに対し、ＴＰＰ結合薬物－ポリマー複合体はこの経路で輸送されなかったことを示す。このことから、ＳＴＡＲＤ７がＰＣ結合薬物－ポリマー複合体をがん細胞内のミトコンドリアに輸送することが示唆される。
　なお、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅトランスフェクションを用いた処理前後の薬物－ポリマー複合体の細胞取り込みの差を比較したところ、ｓｉＲＮＡ処理ＢｘＰＣ３細胞とスクランブルＲＮＡ処理ＢｘＰＣ３細胞との間で細胞取り込みに差はなかった。
［実験例５：ｉｎ　ｖｉｖｏでの薬物－ポリマー複合体の生体内分布およびがん細胞への集積］
　５週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスをチャールズリバーラボラトリーズジャパンから購入した。すべての動物実験は、東京大学が定める実験動物の飼養および使用に関するガイドラインに準拠して実施した。
　ＢＡＬＢ／ｃヌードマウスを腫瘍モデルに用いた。５０μＬのＲＰＭＩ１６４０に懸濁したＢｘＰＣ３細胞（５×１０６ｃｅｌｌｓ　ｍｌ‐１）を雌ＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（５週齢）の右背部に皮下接種し、腫瘍モデルを作製した。腫瘍の体積が≧１００ｍｍ３に達した時点で、生体内分布およびミトコンドリア集積評価に供した。
（生体内分布）
　一連の薬物－ポリマー複合体（０．２ｍＭ、１００μＬ）を、ＢｘＰＣ３腫瘍を有する８週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに尾静脈投与した。２４時間の循環後、マウスを屠殺し、腫瘍、肝臓、腎臓、脾臓、心臓、および肺を摘出した。臓器表面の蛍光はＩＶＩＳイメージングシステムで評価した。結果を図７に示す。その後、臓器および腫瘍を秤量し、ダウンス型組織ホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジナイズした各臓器および腫瘍の赤色蛍光強度（スルホ－Ｃｙ５）をプレートリーダーで測定した。結果を図８に示す。
　図７および図８から、ＰＣ－８－ＰＥＧ２０は、投与後２４時間の時点で、腫瘍に選択的に集積することが分かる。これに対し、ＰＥＧの分子量が１０Ｋである薬物－ポリマー複合体（ＰＣ－８－ＰＥＧ１０、ＴＰＰ－８－ＰＥＧ１０、およびＡｃ－８－ＰＥＧ１０）はいずれも、腫瘍および各臓器への集積性が低かった。ＰＥＧの分子量が１０Ｋである薬物－ポリマー複合体は、サイズが５ｎｍ以下であることから、腎臓でろ過され、体外へ排出された可能性がある。また、ＰＥＧの分子量が４０Ｋである薬物－ポリマー複合体（ＰＣ－８－ＰＥＧ４０、ＴＰＰ－８－ＰＥＧ４０、およびＡｃ－８－ＰＥＧ４０）およびＡｃ－８－ＰＥＧ２０はいずれも、腫瘍および各臓器に非特異的に集積した。また、ＴＰＰリガンドは肝臓および腎臓への集積が多い傾向があった。上記結果から、以下のように考察される。分子量が４０Ｋの薬物－ポリマー複合体は、ＰＥＧの分子量が大きいためにリガンドの露出度が低くなった結果、リガンド特異性が低くなった。一方、ＰＣ－８－ＰＥＧ２０は、良好な血中滞留性およびリガンド露出度を有し、リガンド依存性を有する細胞取り込み（例えば、リン脂質輸送タンパク質（ＰＬＴＰ）を介した細胞取り込み）およびその後のＳＴＡＲＤ７を介したミトコンドリア輸送の点で有利であり得ることから、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいてミトコンドリア（例えば、がん細胞のミトコンドリア）をターゲットするのに適切である。
（ミトコンドリア集積）
　一連の薬物－ポリマー複合体（０．２ｍＭ、１００μＬ）を、ＢｘＰＣ３腫瘍を有する８週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスに尾静脈投与した。２４時間の循環後、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２（１６ｍＭ、１００μＬ）を尾静脈投与し、その３０分後に屠殺し、腫瘍を摘出した。採取した腫瘍の一部をアセトン／ドライアイス混合物中で直ちに凍結し、クライオスタットで厚さ１０μｍに切片化した。切片を固定し、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅでミトコンドリアを染色した。残りの腫瘍の断面および固定化した切片をＬＳＭ　７８０を用いて観察した。腫瘍および切片の観察画像をそれぞれ図９および１０に示す。
　また、採収した腫瘍の一部を、組織用ミトコンドリア分離キットを用いてミトコンドリアを単離し、単離ミトコンドリアにおける蛍光強度を測定することで、腫瘍のミトコンドリアへの薬物－ポリマー複合体の集積を定量評価した。結果を図１１に示す。
　図９に示されるとおり、ＰＥＧの分子量が４０Ｋの複合体はすべて腫瘍への集積が確認された。また、ＰＥＧの分子量が２０Ｋまたは１０Ｋの場合、ＰＣ結合薬物－ポリマー複合体が顕著に腫瘍全体へ集積していた。一方、ＴＰＰ結合薬物－ポリマー複合体は、最も集積が少なかった。また、図１０に示されるとおり、ｉｎ　ｖｉｖｏにおいてはＰＣ結合薬物－ポリマー複合体に関してのみ、ミトコンドリアとの共局在が確認され、集積の定量評価においても、ＰＣ結合薬物－ポリマー複合体が効率的にミトコンドリアに集積することが確認された（図１１）。
［実験例６：ミトコンドリアへのタンパク質デリバリー］
（リガンド結合ＤＮＡＳＥ１－ポリマー複合体の調製）
　末端がアジド（－Ｎ３）およびアミン（－ＮＨ２）であり、２０ｋの分子量（Ｍｗ）を有する８分岐型ポリエチレングリコール「８－ＰＥＧ２０－（ＮＨ２）７―（Ｎ３）」をＣｒｅａｔｉｖｅ　ＰＥＧＷｏｒｋｓから購入した。８－ＰＥＧ２０－（ＮＨ２）７―（Ｎ３）における各ＰＥＧ鎖の分子量（Ｍｗ）は約２５００であり、７つのＰＥＧ鎖の各末端にはアミノ基が導入されており、残りの１つのＰＥＧ鎖の末端にはアジド基が導入されている。８－ＰＥＧ２０－（ＮＨ２）７―（Ｎ３）に下記３種のリガンドをＰＢＳ（－）の中でＤＭＴ－ＭＭ（アミンに対して１０当量）とＴＥＡ（アミンに対して１００当量）と混ぜて、室温で２４時間混合した。追加のＤＭＴ－ＭＭ（アミンに対して２当量）を反応の間、６時間毎に投入した。６－（Ｏ－ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）ｈｙｄｒｏｘｙｈｅｘａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ（富士フイルム和光純薬社）（アミンに対して１０当量）、（３－Ｃａｒｂｏｘｙｂｕｔｙｌ）ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ　Ｂｒｏｍｉｄｅ（富士フイルム和光純薬社）（アミンに対して１０当量）、またはＡｃｅｔｉｃ　Ａｃｉｄ（東京化成工業社）（アミンに対して１０当量）を各リガンドとして反応させ、３種のリガンド結合ポリマー（ＰＣ－８－ＰＥＧ２０－（Ｎ３）、ＴＰＰ－８－ＰＥＧ２０－（Ｎ３）、およびＡｃ－８－ＰＥＧ２０－（Ｎ３））を合成した。
　ＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ　Ｅｓｔｅｒ（ＣＡＳ　ＲＮ：１４２７００４－１９－０）を東京化成工業社から購入した。上記で合成した３種のリガンド結合ポリマーを各ＤＭＦ中に２０μｇ／ｍＬで溶解したＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ　Ｅｓｔｅｒを１０ｍＭリン酸緩衝液中で１：１．１（リガンド：ＤＢＣＯ（モル比））で混合して、－３０℃で凍結、４℃で溶解を３回繰り返し、－Ｎ３とＤＢＣＯでのクリック反応を行い、ＰＣ－８－ＰＥＧ２０－ＮＨＳ、ＴＰＰ－８－ＰＥＧ２０－ＮＨＳ、およびＡｃ－８－ＰＥＧ２０－ＮＨＳを合成した。得られた３種のポリマーを、超遠心フィルターをかけることによって精製した（ＭＷＣＯ：１００００、３５００ｇ、８分）。
　精製した３種のポリマーをリン酸緩衝液（ｐＨ８．０）の中でＤＮＡＳＥ１と２：１のモル比で反応させた（４℃、オーバーナイト）。これにより、約７つのＰＥＧ鎖の末端にリガンド（ＰＣ、ＴＰＰ、またはＡｃ）が結合され、１つのＰＥＧ鎖の末端にＤＮＡＳＥ１が結合されたリガンド結合ＤＮＡＳＥ１－ポリマー複合体を得た。異なるリガンドを有する３種のリガンド結合ＤＮＡＳＥ１－ポリマー複合体を、超遠心フィルターをかけることによって精製した（ＭＷＣＯ：３５０００、３５００ｇ、８分）。精製された複合体に搭載されたＤＮＡＳＥ１の濃度はＢＣＡタンパク質アッセイ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を用いて定量した。
（リガンド結合ＤＮＡＳＥ１－ポリマー複合体のｉｎ　ｖｉｔｒｏでのミトコンドリアへの集積）
　ＢｘＰＣ３細胞を、１０％Ｖ／Ｖ　ＦＢＳおよび１％Ｖ／Ｖ　ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ中、１，０００，０００細胞／ウェルの濃度で１２ウェルプレートに播き、一晩インキュベートした。リガンド結合ＤＮＡＳＥ１－ポリマー複合体を、１００μｇ／ｍＬのＤＮＡＳＥ１濃度でＢｘＰＣ３細胞に添加し、３時間インキュベートした。余分のポリマーを取り除くために細胞を新鮮な培地で十分かつ注意深く洗浄した後、２１時間培地でポストインキュベーションを行った。次に、製造業者のプロトコルに従ってミトコンドリア分離キット（Ａｂｃａｍ）を用いて細胞からミトコンドリアを分離した。分離したミトコンドリアの中に残っているＤＮＡの量を、ＰＣＲを用いて定量した。結果を図１２に示す。
　図１２に示されるように、ＰＣ結合ＤＮＡＳＥ１－ポリマー複合体とインキュベーションしたサンプルにおいてのみミトコンドリア中のＤＮＡ量が減少した。これにより、ＰＣ結合ＤＮＡＳＥ１－ポリマー複合体がミトコンドリアまで送達されたことが示唆される。
［実験例７：ミトコンドリアへの核酸デリバリー］
（リガンド結合ＡＳＯ－ポリマー複合体の調製）
　ミトコンドリアｍＲＮＡであるＣＯＸ　ＩＩ（ＣＯＸ２）のｍＲＮＡを標的とし、ＤＢＣＯ修飾されたＡＳＯを北海道システムサイエンス株式会社から購入した。
・ＣＯＸ２標的ＡＳＯ
　５’－ＣＵＵＧＣＧＣＵＧＣＡＵＧＵＧＣＣＡＵ－ｓｐａｃｅｒ－ＤＢＣＯ－３’（配列番号２）
　末端がアジド（－Ｎ３）およびアミン（－ＮＨ２）であり、２０ｋの分子量（Ｍｗ）を有する８分岐型ポリエチレングリコール「８－ＰＥＧ２０－（ＮＨ２）７―（Ｎ３）」をＣｒｅａｔｉｖｅ　ＰＥＧＷｏｒｋｓから購入した。８－ＰＥＧ２０－（ＮＨ２）７―（Ｎ３）における各ＰＥＧ鎖の分子量（Ｍｗ）は約２５００であり、７つのＰＥＧ鎖の各末端にはアミノ基が導入されており、残りの１つのＰＥＧ鎖の末端にはアジド基が導入されている。
　８－ＰＥＧ２０－（ＮＨ２）７―（Ｎ３）をＰＢＳに１０ｍｇ／ｍｌの濃度で溶解した。上記溶液にＰＣ－ＣＯＯＨ（アミン１０当量）またはＴＰＰ－ＣＯＯＨ（アミン１０当量）とＤＭＴ－ＭＭ（アミン１０当量）とを添加して、室温で２４時間反応させた。追加のＤＭＴ－ＭＭ（アミンに対して２当量）を反応の間、６時間毎に投入した。生成物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ－２５（Ｃｙｔｉｖａ）を含む使い捨てＰＤ－１０脱塩カラムを用いて精製した。凍結乾燥によって２種のリガンド結合ポリマー（ＰＣ－８－ＰＥＧ２０－（Ｎ３）、ＴＰＰ－８－ＰＥＧ２０－（Ｎ３））を回収した。
　８－ＰＥＧ２０－（ＮＨ２）７―（Ｎ３）を超脱水アセトニトリルに溶解した。上記溶液にアルゴン雰囲気下でＴＥＡ（アミン１００当量）を加えた。室温で３０分間混合した後、酢酸無水物を反応系に滴下で添加した。アルゴン雰囲気中で混合物を室温で２４時間撹拌した。蒸発によってアセトニトリルを除去し、得られたアセチル化ポリマー（Ａｃ－８－ＰＥＧ２０－（Ｎ３））を脱イオン水に溶解した。上記と同じ方法でＡｃ－８－ＰＥＧ２０－（Ｎ３）の精製および回収を行った。
　ＤＢＣＯとアジド基とのクリックケミストリー反応を利用して上記ポリマーとＡＳＯとを結合した。具体的には、（ＰＣ、ＴＰＰ、Ａｃ）－８－ＰＥＧ２０－（Ｎ３）を脱イオン水に溶解し、Ｎ３に対して１当量のＡＳＯを混合し、凍結融解法（凍結：－３０°Ｃ、融解：Ｒ．Ｔ．）を３回行った。
　以上のようにして、３種類のリガンド結合ＡＳＯ－ポリマー複合体（Ａｃ－８－ＰＥＧ２０－ＣＯＸ２、ＴＰＰ－８－ＰＥＧ２０－ＣＯＸ２、ＰＣ－８－ＰＥＧ２０－ＣＯＸ２）を得た。
（ＰＣＲによる標的ミトコンドリアｍＲＮＡレベルの定量）
　１ウェル当たり１ｍＬの無血清ＲＰＭＩ培地を含む６ウェルプレート上で、３７℃、５％ＣＯ２／空気雰囲気下、上記３種類のリガンド結合ＡＳＯ－ポリマー複合体をＢｘＰＣ３細胞（１×１０６細胞／ウェル）と３時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、完全培地で２１時間ポストインキュベートした。ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者のプロトコルに従って用いて、上記細胞から全ＲＮＡを精製した。Ｈｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡキット（Ｔｈｅｒｍｏ　ｆｉｓｈｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を製造者のプロトコルに従って用いて、各サンプルから抽出されたＲＮＡ懸濁液から逆転写反応を行った。ＦａｓｔＳｔａｒｔ　Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ　ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍａｓｔｅｒ（ＲＯＸ）（Ｔｈｅｒｍｏ　ｆｉｓｈｉｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、転写されたｃＤＮＡから定量的ＰＣＲ解析を行った。
　ＲＴ－ＰＣＲに使用したプライマーを以下に示す。
・ＣＯＸ２をコードするミトコンドリアｍＲＮＡ（標的ｍＲＮＡ）
　ｆｏｒｗａｒｄ：ＡＴＣＡＴＣＣＴＡＧＴＣＣＴＣＡＴＣＧ　　（配列番号：３）
　ｒｅｖｅｒｓｅ：ＧＡＴＴＴＧＡＴＧＧＴＡＡＧＧＧＡＧＧ　　（配列番号：４）
・ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼサブユニット１（ＮＤ１）をコードするミトコンドリアｍＲＮＡ（コントロールｍＲＮＡ）
　ｆｏｒｗａｒｄ：ＴＴＣＣＴＡＡＴＧＣＴＴＡＣＣＧＡＡＣＧ　　（配列番号：５）
　ｒｅｖｅｒｓｅ：ＧＧＴＧＡＡＧＡＧＴＴＴＴＡＴＧＧＣＧＴ　　（配列番号：６）
・核ＤＮＡにコードされたβ－アクチンｍＲＮＡ（内部コントロールＲＮＡ）
　ｆｏｒｗａｒｄ：ＧＧＧＡＣＧＡＣＡＴＧＧＡＧＡＡＡＡＴＣ　　（配列番号：７）
　ｒｅｖｅｒｓｅ：ＧＡＡＧＧＴＣＴＣＡＡＡＣＡＴＧＡＴＣＴＧＧ　　（配列番号：８）
　結果を図１３に示す。図中、コントロールは、リガンド結合ＡＳＯ－ポリマー複合体で処理されていない細胞サンプルである。
　図１３（ａ）は、コントロールｍＲＮＡの発現（転写）量に対する標的ｍＲＮＡの発現量の割合を、コントロールにおける割合を１とした場合の相対値として示し、図１３（ｂ）は、β－アクチンｍＲＮＡの発現量を、コントロールにおける発現量を１とした場合の相対値として示す。図１３（ａ）に示されるとおり、ＰＣ－８－ＰＥＧ２０－ＣＯＸ２で処理された細胞におけるＮＤ１に対するＣＯＸ２の発現レベルは大きく低下していた。ＮＤ１はミトコンドリアｍＲＮＡであるが、上記ＡＳＯの標的ではないこと、および、細胞ｍＲＮＡであるβ－Ａｃｔｉｎの発現量が変化しなかったことを考慮すると、ＰＣ－８－ＰＥＧ２０－ＣＯＸ２は、細胞の他の状態に影響を与えることなく、ＡＳＯをミトコンドリア内に効果的に送達したと考えられる。
［実験例８：ミトコンドリアへの低分子薬物デリバリー］
（リガンド結合Ｓｉｍ－ポリマー複合体の調製）
　８－ＰＥＧ２０－ＮＨ２（末端がすべてアミン（－ＮＨ２）であり、２０ｋの分子量（Ｍｗ）を有する８分岐型ＰＥＧ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ　ＰＥＧＷｏｒｋｓ）を用いて、図１４に示すスキームで、シンバスタチン（Ｓｉｍ）を薬物として含むリガンド結合Ｓｉｍ－ポリマー複合体を合成した。シンバスタチンは、コレステロールを下げるために使用されるＨＭＧ－ＣｏＡレダクターゼ阻害剤である。シンバスタチンは、また、抗がん作用を示す。具体的には、シンバスタチンは、ミトコンドリアの膜電位を減少させ、Ｓｍａｃ／ＤＩＡＢＬＯおよびシトクロムＣを細胞質に放出して、がん細胞のアポトーシスを引き起こす。このようなシンバスタチンによるミトコンドリア損傷は、ミトコンドリアへのシンバスタチン送達を増加することによって増大され得る。
　まず、エステル結合を作るために、シンバスタチンの二級アルコールを塩化サクシニルと反応させた。ベンゼンに溶解したシンバスタチン（５００ｍｇ、１当量）を凍結乾燥し、１０ｍＬの超脱水ジクロロメタン（ＤＣＭ）に溶解した。塩化スクシニル（３９３μＬ、３当量）およびＴＥＡ（７５μＬ、１．５当量）をシンバスタチンに添加し、室温で３時間撹拌した。その後、脱イオン水を加え、１５分間撹拌して未反応のカルボン酸塩化物を不活性化した。合成したシンバスタチン－ＣＯＯＨをＤＣＭと脱イオン水との相分離抽出により精製した。ＤＣＭ相を採取し、追加の水で５回洗浄した。精製後、ＤＣＭを３０℃で蒸発させ、サンプルをベンゼンに溶解して凍結乾燥することで、残留水分を可能な限り除去した。これにより、深紅色の粘性の液体が得られた。反応は、１Ｈ－ＮＭＲ（メタノール－ｄ４；２５℃）で確認した。
　上記シンバスタチン－ＣＯＯＨを、ＤＭＦ中のＥＤＣ／ＮＨＳカップリングにより、８－ＰＥＧ２０－ＮＨ２の一級アミンの１つに結合した。超脱水ＤＭＦ中で、８－ＰＥＧ２０－ＮＨ２（５００ｍｇ、１当量）をシンバスタチン－ＣＯＯＨ（３９ｍｇ、３当量）と混合した。混合液を４℃で６時間撹拌した。ＥＤＣ／ＨＣｌ（７．２ｍｇ、１．５当量）およびＴＥＡ（５．２μＬ、１．５当量）を触媒として２時間ごとに添加した。ポリマーを純水およびメタノールに対して、交互に各３回透析して精製した（透析バッグのＭＷＣＯ：３，５００；スペクトラムラボラトリーズ）。シンバスタチンの結合は、１Ｈ－ＮＭＲ（メタノール－ｄ４；２５℃）で確認した。以上のようにして、１つのアミノ末端にシンバスタチンが結合されたシンバスタチン－８－ＰＥＧ２０－（ＮＨ２）７を得た。
　上記シンバスタチン－８－ＰＥＧ２０－（ＮＨ２）７に対して、上記と同様の方法でアミノ基を各リガンド（すなわち、ＰＣ、ＴＰＰ、またはＡｃ）でキャップして、リガンド結合Ｓｉｍ－ポリマー複合体（ＰＣ－８－ＰＥＧ２０－Ｓｉｍ、ＴＰＰ－８－ＰＥＧ２０－Ｓｉｍ、およびＡｃ－８－ＰＥＧ２０－Ｓｉｍ）を得た。各リガンド結合Ｓｉｍ－ポリマー複合体におけるリガンドおよびシンバスタチンの導入割合を、１Ｈ－ＮＭＲ（メタノール－ｄ４；２５℃）で評価した。
　また、室温でＺａｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ９０を用いて電気泳動光散乱（ＥＬＳ）測定を行うことにより、各リガンド結合Ｓｉｍ－ポリマー複合体の表面ゼータ電位を測定した。
　下記表に表示される結果から、８ａｒｍ　ＰＥＧに７つのリガンドと１つのＳｉｍとが結合されたことが示唆される。
（リガンド結合Ｓｉｍ－ポリマー複合体の細胞毒性評価：ＭＴＴアッセイ）
　培地（１０％Ｖ／Ｖ　ＦＢＳおよび１％Ｖ／Ｖ　ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０）に懸濁したＢｘＰＣ３細胞を、９６ウェル細胞培養プレート（１０，０００細胞／ウェル）（ＩＷＡＫＩ）上で一晩インキュベートした。培地を、種々のＳｉｍ濃度（０～２００μＭ）のリガンド結合Ｓｉｍ－ポリマー複合体または遊離シンバスタチンを含む培地と交換し、細胞を６時間インキュベートした。処理後の細胞を培地で洗浄し、さらに４８時間ポストインキュベートした。その後、ＭＴＴアッセイキット（Ｄｏｊｉｎｄｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を製造者のプロトコルを少し変更して用いて、細胞毒性を測定した。簡単に説明すると、細胞を培地で洗浄し、１００μＬのＰＢＳ（－）で置換し、２０μＬのＭＴＴを添加して３時間インキュベートした。上清を慎重に除去し、１００μＬのＤＭＳＯを添加し、１５分間混合した。５３０ｎｍでの吸光度を、ＳＰＡＲＫ（Ｒ）マルチモードマイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ）を用いて測定した。結果を図１５に示す。
（リガンド結合Ｓｉｍ－ポリマー複合体の細胞毒性評価：ＣＣＫ－８アッセイ）
　９６ウェル細胞培養プレート（ＩＷＡＫＩ）に、ＢｘＰＣ３細胞を５，０００細胞／ウェルの濃度で分注した。細胞を上記ＭＴＴアッセイと同様にリガンド結合Ｓｉｍ－ポリマー複合体または遊離シンバスタチンで処理した。ＣＣＫ－８アッセイキット（Ｄｏｊｉｎｄｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を製造者のプロトコルに従って用いて、処理後のサンプルの細胞生存率を評価した。結果を図１６に示す。
　図１５および図１６に示されるとおり、ＴＰＰ－８－ＰＥＧ２０－ＳｉｍおよびＰＣ－８－ＰＥＧ２０－Ｓｉｍは、３７．５μＭを超えるシンバスタチン濃度で、遊離シンバスタチンよりもＢｘＰＣ３の細胞生存率を効果的に低下させた。一方、Ａｃ－８－ＰＥＧ２０－Ｓｉｍは、遊離シンバスタチンと比較して細胞生存率の低下を示さなかった。この結果は、ＰＣおよびＴＰＰリガンドがシンバスタチンの細胞毒性を増大したことを示す。
（リガンド結合Ｓｉｍ－ポリマー複合体のミトコンドリア毒性評価）
　５，０００細胞／ウェルのＢｘＰＣ３細胞を上記ＭＴＴアッセイと同様にリガンド結合Ｓｉｍ－ポリマー複合体で処理した。処理後の細胞に関して、ＭｉｔｏＳＯＸ（Ｒ）　Ｒｅｄキット（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてミトコンドリアから発生する活性酸素種（ＲＯＳ）を測定すること、および、ＪＣ－１ミトコンドリア膜電位アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてミトコンドリアの膜電位変化を測定することによって、ＢｘＰＣ３細胞のミトコンドリアに対するシンバスタチンの毒性を評価した。ミトコンドリアのＲＯＳおよび膜電位の測定はそれぞれ、製造者のプロトコルに従って行った。ＲＯＳの測定結果およびＪＣ－１アッセイの結果をそれぞれ、図１７ならびに図１８Ａおよび１８Ｂに示す。
　ミトコンドリアの活性酸素種（ＲＯＳ）の測定によって、ミトコンドリア活性を評価した。図１７に示されるとおり、ＰＣ－８－ＰＥＧ２０－ＳｉｍおよびＴＰＰ－８－ＰＥＧ２０－Ｓｉｍは、遊離ＳｉｍまたはＡｃ－８－ＰＥＧ２０－Ｓｉｍと比較して、７５μＭを超えるシンバスタチン濃度で増大したミトコンドリア毒性を示した。このことから、ＰＣリガンドおよびＴＰＰリガンドがＳｉｍ－ポリマー複合体のミトコンドリア送達に寄与することが示唆される。
　図１８Ａは正規化した緑色蛍光強度を示す。緑色蛍光の強度が大きいことは、ミトコンドリア膜の負電荷が弱いことを示す。図１８Ｂは正規化した赤色蛍光強度を示す。赤色蛍光の強度が大きいことは、ミトコンドリア膜が強く負に帯電していることを示す。
　図１８Ｂに示されるとおり、赤色蛍光強度の減少は、ＰＣ－８－ＰＥＧ２０－Ｓｉｍにおいて最大であり、ＴＰＰ－８－ＰＥＧ２０－Ｓｉｍよりも大きい。一方、シンバスタチンを有さないＰＣまたはＴＰＰ結合ポリマー（ＰＣ－８－ＰＥＧ２０、ＴＰＰ－８－ＰＥＧ２０）で細胞を処理した場合、ＴＰＰ－８－ＰＥＧ２０のみがミトコンドリアの表面電荷を大きく変化させた（データは示さず）。この結果は以下のことを示唆する。ＰＣ結合ポリマーはミトコンドリアの膜電荷に影響せずに、搭載薬物であるシンバスタチンをミトコンドリアに送達し、シンバスタチンの影響でミトコンドリアの膜電荷の変化が生じた。一方で、ＴＰＰ結合ポリマーはそれ自体がミトコンドリアの膜電荷に影響し、さらにシンバスタチンを送達することでミトコンドリアの膜電荷を変化させた。また、本実験でＰＣおよびＴＰＰ結合ポリマーにおけるシンバスタチンの量が同等であることから、上記結果は、シンバスタチン送達システムにおいて、ＰＣリガンドがＴＰＰリガンドよりも効果的にミトコンドリアを標的としたことを示唆する。
　一方、緑色蛍光強度の減少は、ミトコンドリア膜電位がより強く負に帯電したこと、または、細胞が死滅し、ＪＣ－１を捕捉した細胞の数が減少したことを示す。図１８Ａから、シンバスタチン濃度が高い場合、ＰＣ－８－ＰＥＧ２０－Ｓｉｍの細胞毒性のために細胞が大幅に減少したと考えられる。一方、ＴＰＰ－８－ＰＥＧ２０－Ｓｉｍは、ＰＣ－８－ＰＥＧ２０－Ｓｉｍほど緑色蛍光強度を減少させず、シンバスタチンの濃度が低い場合にはむしろ、緑色蛍光強度を増大させた。これは、ＴＰＰ－８－ＰＥＧ２０－Ｓｉｍがシンバスタチンの有効濃度未満でミトコンドリアの膜電位を減少させた可能性があり、ＴＰＰリガンド自体が細胞に悪影響を及ぼし得ることが示唆される。
［実験例９：血中滞留性評価］
　８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスをイソフルラン吸入で麻酔した。マウスの右の耳たぶを生体内共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＩＶＣＬＳＭ）上に固定した。実施例１で調製した一連のリガンド結合ポリマー（１とのスルホ－Ｃｙ５と７つのリガンドとが結合された１０ｋＤａ、２０ｋＤａ、または４０ｋＤａの８分岐ＰＥＧ）をマウスに静脈内注射した。一連のリガンド結合ポリマーに結合されたスルホ－Ｃｙ５の蛍光強度を、ＩＶＣＬＳＭを用いた耳たぶの連続イメージングによって評価した。結果を図１９に示す。図１９は、血管内の蛍光標識の強度を正規化し、定量化したグラフである。
　図１９に示されるとおり、１０ｋＤａのリガンド結合ポリマー、特にＴＰＰ－８－ＰＥＧ１０は、急速に循環から除去された。２０ｋＤａおよび４０ｋＤａのリガンド結合ポリマーは、１０ｋＤａのリガンド結合ポリマーよりも長い血液循環を示した。特に、ＰＣ－８－ＰＥＧ２０は、ＴＰＰ－８－ＰＥＧ２０およびＡｃ－８－ＰＥＧ２０よりも長い血液循環を示した。
［実験例１０：血管外移行性評価］
　ＢｘＰＣ３腫瘍を有する８週齢のＢＡＬＢ／ｃヌードマウスをイソフルラン吸入で麻酔した。Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２を、麻酔の３０分前に静脈内注射した。栄養血管を傷つけることなく、皮下腫瘍の周囲に皮弁を形成した。皮弁を元に戻して伸ばし、これにより、腫瘍をＩＶＣＬＳＭに装着および固定した。０．２ｍＭの濃度の一連のリガンド結合ポリマー（ＰＣ－８－ＰＥＧ２０、ＴＰＰ－８－ＰＥＧ２０、およびＡｃ－８－ＰＥＧ２０）１００μＬを、蛍光強度が１０００ａ．ｕ．になるように濃度を調整した１０ｋ　ＦＩＴＣ標識デキストラン（ＴＣＩ，　Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）水溶液に溶解し、マウスに静脈内注射した。腫瘍周囲の血管外漏出を、ＩＶＣＬＳＭを用いた連続撮像によって可視化した。撮像された画像を図２０に示す。また、図２０中の四角形の枠内の関心領域（ＲＯＩ）における各標識の蛍光強度を定量化した。上記ＲＯＩは、腫瘍のネスト部（ｎｅｓｔ　ｓｉｔｅ）に位置している。結果を図２１に示す。図２１中、Ａｃ　ｄｅｘｔｒａｎ　１０Ｋ、ＴＰＰ　ｄｅｘｔｒａｎ　１０Ｋ、およびＰＣ　ｄｅｘｔｒａｎ　１０Ｋはそれぞれ、Ａｃ－８－ＰＥＧ２０、ＴＰＰ－８－ＰＥＧ２０、およびＰＣ－８－ＰＥＧ２０を投与したマウスにおけるデキストラン由来のＦＩＴＣ蛍光強度を示す。
　図２０および２１から、ＰＣ－８－ＰＥＧ２０は、他の２０ｋＤａポリマー（すなわち、ＴＰＰ－８－ＰＥＧ２０およびＡｃ－８－ＰＥＧ２０）と比較して血管外漏出が促進されることがわかる。ポリマーの血管外漏出が促進されると、腫瘍へのポリマーの集積が増大し得る。
［実験例１１：ミトコンドリアとリソソームの接触時間評価］
　細胞内への薬物送達においてエンドソームエスケープは有効な手段である。その一方で、８分岐ＰＥＧを用いた上記リガンド結合薬物－ポリマー複合体はエンドソームエスケープを促進する構造を有さない。よって、エンドソームエスケープを伴わないミトコンドリアターゲティング経路の確認のために、以下、リソソームとミトコンドリアとの接触を評価した。
　１０％Ｖ／Ｖ　ＦＢＳおよび１％Ｖ／Ｖ　ペニシリン－ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ中のＢｘＰＣ３細胞を１５，０００細胞／ウェルの濃度で８ウェルカバーガラスチャンバーに分注し、８時間置いた。培地を５体積％の「ＣｅｌｌＬｉｇｈｔＴＭリソソームＧＦＰ、ＢａｃＭａｍ　２．０」および「ＣｅｌｌＬｉｇｈｔＴＭミトコンドリアＲＦＰ、ＢａｃＭａｍ　２．０」を含む培地と交換し、３６時間インキュベートした。新鮮な培地で十分に洗浄した後、２５μＭの一連のリガンド結合ポリマーで８時間処理した。上記リガンド結合ポリマーを含む培地を新鮮な培地と交換した。その後、０．１ｍｇ／ｍＬのＨｏｅｃｈｓｔ　３３３４２と１５分間インキュベートすることにより、細胞の核を青色蛍光で染色した。培地を新鮮な培地と交換した。ＣｏｎｆｏＣｏｒ　３モジュールおよび６３Ｘ油浸対物レンズを装備した共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ）（ＬＳＭ　７８０；Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）を用いて、細胞およびオルガネラを観察した。リソソームおよびミトコンドリアの運動の動画を、ＣｏｎｆｏＣｏｒ　３モジュールと６３Ｘ油浸対物レンズを装備した共焦点レーザー走査型顕微鏡（ＣＬＳＭ）（ＬＳＭ　８８０；Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）を用いた４秒ごとの連続イメージングによって作成した。
　各蛍光は、以下の種々の励起（ｅｘ．）および発光（ｅｍ．）フィルターによってイメージングされた：Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２：ｅｘ．４０５ｎｍ／ｅｍ．４１０～４８５ｎｍ、ＧＦＰ：ｅｘ．４８８ｎｍ／ｅｍ．４８９～５５１ｎｍ、ＲＦＰ：ｅｘ．５５５ｎｍ／ｅｍ．５７０～６２０ｎｍ、スルホ－Ｃｙ５：ｅｘ．６３３ｎｍ／ｅｍ．６３８～７４６ｎｍ。ＬＳＭ　８８０のＺｅｎソフトウェアを用いて共局在率を得た。ＰＣ－８－ＰＥＧ２０で処理した細胞に関して、観察開始後の複数の時点における観察画像および共局在率を図２２に示す。また、リソソームとミトコンドリアとの接触時間と、リガンドの種類との関係を図２３に示す。図２３中、コントロールは、リガンド結合ポリマーを添加しなかったサンプルを示す。
　図２２に示されるとおり、リソソームとミトコンドリアとの接触部位において、リソソームからミトコンドリアへのＰＣ－８－ＰＥＧ２０の輸送が観察された。また、経時的に、ＰＣ－８－ＰＥＧ２０のリソソームとの共局在が減少し、ミトコンドリアとの共局在が増加した。これは、ＰＣ－８－ＰＥＧ２０がリソソームからミトコンドリアに輸送されたことを示す。この結果から、ＰＣ－８－ＰＥＧ２０がリソソームからミトコンドリアに直接転換されたことが示唆される。また、図２３に示されるとおり、リソソームとミトコンドリアとの接触時間は、ＰＣ－８－ＰＥＧ２０で処理した細胞において最も長く、ＴＰＰ－８－ＰＥＧ２０で処理した細胞においてその次に長くなった。このことから、リガンド結合ポリマーがリソソームとミトコンドリアとの接触の助けになったことが示唆される。
　本発明は、例えば、ＤＤＳ分野において好適に用いられ得る。

Claims (16)

  1. 　薬物と、ホスホコリン基を有する薬物送達用ポリマーと、を含み、
    　ＳＴＡＲＤ７に対する解離定数（ＫＤ）が１．０×１０－６Ｍ以下である、薬物－ポリマー複合体。
  2. 　ミトコンドリアに前記薬物を送達するための、請求項１に記載の薬物－ポリマー複合体。
  3. 　平均粒子径が、５．２ｎｍを超える、請求項１に記載の薬物－ポリマー複合体。
  4. 　前記薬物送達用ポリマーが、２つ以上のポリマー鎖を有する分岐型ポリマーであって、
    　前記２つ以上のポリマー鎖の少なくとも１つに前記ホスホコリン基が結合されている、請求項１に記載の薬物－ポリマー複合体。
  5. 　前記薬物送達用ポリマーが、前記２つ以上のポリマー鎖の１つの末端にｓｕｌｆｏ－ｃｙ５が導入され、その他の末端に非荷電性基を有するポリマーとして測定された場合に、０以下のゼータ電位を示すポリマーである、請求項４に記載の薬物－ポリマー複合体。
  6. 　前記薬物送達用ポリマーの分子量（Ｍｗ）が、５０００～１０００００である、請求項４に記載の薬物－ポリマー複合体。
  7. 　前記薬物送達用ポリマーの前記２つ以上のポリマー鎖の分子量（Ｍｗ）がそれぞれ、２００～５００００である、請求項４に記載の薬物－ポリマー複合体。
  8. 　前記２つ以上のポリマー鎖の少なくとも１つに前記薬物が結合されている、請求項４に記載の薬物－ポリマー複合体。
  9. 　前記薬物送達用ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（サッカライド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（リンゴ酸）、またはこれらの誘導体から構成される親水性ポリマーを含む、請求項１に記載の薬物－ポリマー複合体。
  10. 　前記薬物が、生理活性物質、蛍光試薬、および造影剤から選択される少なくとも１種を含む、請求項１に記載の薬物－ポリマー複合体。
  11. 　請求項１から１０のいずれかに記載の薬物－ポリマー複合体を含む、医薬組成物。
  12. 　２つ以上のポリマー鎖を有し、
    　前記２つ以上のポリマー鎖の少なくとも１つにホスホコリン基が結合されており、
    　ＳＴＡＲＤ７に対する解離定数（ＫＤ）が１．０×１０－６Ｍ以下である、薬物送達用ポリマー。
  13. 　前記２つ以上のポリマー鎖の１つの末端にｓｕｌｆｏ－ｃｙ５が導入され、その他の末端に非荷電性基を有するポリマーとして測定された場合に、０以下のゼータ電位を示すポリマーである、請求項１２に記載の薬物送達用ポリマー。
  14. 　分子量（Ｍｗ）が、５０００～１０００００である、請求項１２に記載の薬物送達用ポリマー。
  15. 　前記２つ以上のポリマー鎖の分子量（Ｍｗ）がそれぞれ、２００～５００００である、請求項１２に記載の薬物送達用ポリマー。
  16. 　ポリ（エチレングリコール）、ポリ（サッカライド）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリ（アミノ酸）、ポリ（リンゴ酸）、またはこれらの誘導体から構成される親水性ポリマーを含む、請求項１２に記載の薬物送達用ポリマー。

     
PCT/JP2025/010561 2024-03-19 2025-03-18 薬物－ポリマー複合体、医薬組成物、および薬物送達用ポリマー Pending WO2025197935A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2024-043316 2024-03-19
JP2024043316 2024-03-19

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2025197935A1 true WO2025197935A1 (ja) 2025-09-25

Family

ID=97139818

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2025/010561 Pending WO2025197935A1 (ja) 2024-03-19 2025-03-18 薬物－ポリマー複合体、医薬組成物、および薬物送達用ポリマー

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2025197935A1 (ja)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012520856A (ja) * 2009-03-19 2012-09-10 ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ 光学イメージング剤
WO2020116640A1 (ja) * 2018-12-07 2020-06-11 国立大学法人 東京大学 薬物複合体、ポリマー複合体及び薬物送達用組成物
CN115785346A (zh) * 2022-01-20 2023-03-14 北京大学 含非pH敏感型单体的pH敏感聚合物的合成及应用
JP2023053703A (ja) * 2021-10-01 2023-04-13 国立大学法人 東京大学 ｐＨ応答性水溶性ポリマーおよびそれを用いたシアル酸の標識方法
CN116813709A (zh) * 2023-07-01 2023-09-29 上海市第四人民医院 一种pH值响应性生物活性短肽及其制药用途

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012520856A (ja) * 2009-03-19 2012-09-10 ゼネラル・エレクトリック・カンパニイ 光学イメージング剤
WO2020116640A1 (ja) * 2018-12-07 2020-06-11 国立大学法人 東京大学 薬物複合体、ポリマー複合体及び薬物送達用組成物
JP2023053703A (ja) * 2021-10-01 2023-04-13 国立大学法人 東京大学 ｐＨ応答性水溶性ポリマーおよびそれを用いたシアル酸の標識方法
CN115785346A (zh) * 2022-01-20 2023-03-14 北京大学 含非pH敏感型单体的pH敏感聚合物的合成及应用
CN116813709A (zh) * 2023-07-01 2023-09-29 上海市第四人民医院 一种pH值响应性生物活性短肽及其制药用途

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHEN SIQIN; ZHONG YIN; FAN WUFA; XIANG JIAJIA; WANG GUOWEI; ZHOU QUAN; WANG JINQIANG; GENG YU; SUN RUI; ZHANG ZHEN; PIAO YING; WAN: "Enhanced tumour penetration and prolonged circulation in blood of polyzwitterion–drug conjugates with cell-membrane affinity", NATURE BIOMEDICAL ENGINEERING, vol. 5, no. 9, 15 April 2021 (2021-04-15), London , pages 1019 - 1037, XP037581302, DOI: 10.1038/s41551-021-00701-4 *
SAHA PRANAB CHANDRA, CHATTERJEE TANIMA, PATTANAYAK RUDRADIP, DAS RABI SANKAR, MUKHERJEE AYAN, BHATTACHARYYA MAITREE, GUHA SAMIT: "Targeting and Imaging of Mitochondria Using Near-Infrared Cyanine Dye and Its Application to Multicolor Imaging", ACS OMEGA, vol. 4, no. 11, 10 September 2019 (2019-09-10), US , pages 14579 - 14588, XP093357668, ISSN: 2470-1343, DOI: 10.1021/acsomega.9b01890 *
ZHAO TINGBI, MASUDA TSUKURU, TAKAI MADOKA: "pH-Responsive Water-Soluble Polymer Carriers for Cell-Selective Metabolic Sialylation Labeling", ANALYTICAL CHEMISTRY, vol. 93, no. 46, 23 November 2021 (2021-11-23), pages 15420 - 15429, XP093357666, ISSN: 0003-2700, DOI: 10.1021/acs.analchem.1c03261 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Guo et al. Matrix metalloprotein-triggered, cell penetrating peptide-modified star-shaped nanoparticles for tumor targeting and cancer therapy
García‐Fernández et al. New advances in in vivo applications of gated mesoporous silica as drug delivery nanocarriers
Muddineti et al. Cholesterol-grafted chitosan micelles as a nanocarrier system for drug-siRNA co-delivery to the lung cancer cells
Lv et al. Fluoropolymers for intracellular and in vivo protein delivery
Abbina et al. Hyperbranched polyglycerols: recent advances in synthesis, biocompatibility and biomedical applications
Xu et al. Smart and hyper-fast responsive polyprodrug nanoplatform for targeted cancer therapy
Zhou et al. Bioreducible cross-linked hyaluronic acid/calcium phosphate hybrid nanoparticles for specific delivery of siRNA in melanoma tumor therapy
Bi et al. Actively targeted nanoparticles for drug delivery to tumor
Zhao et al. Self-assembly nanomicelles based on cationic mPEG-PLA-b-Polyarginine (R15) triblock copolymer for siRNA delivery
Son et al. Self-crosslinked human serum albumin nanocarriers for systemic delivery of polymerized siRNA to tumors
Lu et al. Redox-sensitive hyaluronic acid polymer prodrug nanoparticles for enhancing intracellular drug self-delivery and targeted cancer therapy
Li et al. Efficient delivery of DOX to nuclei of hepatic carcinoma cells in the subcutaneous tumor model using pH-sensitive pullulan–DOX conjugates
Yang et al. Host–guest interaction-based self-engineering of nano-sized vesicles for co-delivery of genes and anticancer drugs
Nehate et al. Redox responsive polymersomes for enhanced doxorubicin delivery
Kim et al. Peptide 18-4/chlorin e6-conjugated polyhedral oligomeric silsesquioxane nanoparticles for targeted photodynamic therapy of breast cancer
Wang et al. Double click-functionalized siRNA polyplexes for gene silencing in epidermal growth factor receptor-positive tumor cells
Son et al. Recent progress in nanomedicine-mediated cytosolic delivery
Bukchin et al. Amphiphilic polymeric nanoparticles modified with a retro-enantio peptide shuttle target the brain of mice
Bae et al. Intracellular delivery of heparin complexed with chitosan-g-poly (ethylene glycol) for inducing apoptosis
Du et al. pH-triggered surface charge reversed nanoparticle with active targeting to enhance the antitumor activity of doxorubicin
Han et al. Free paclitaxel-loaded E-selectin binding peptide modified micelle self-assembled from hyaluronic acid-paclitaxel conjugate inhibit breast cancer metastasis in a murine model
Park et al. Polyethylenimine grafted-chitosan based Gambogic acid copolymers for targeting cancer cells overexpressing transferrin receptors
Zhang et al. Virus mimetic shell-sheddable chitosan micelles for siVEGF delivery and FRET-traceable acid-triggered release
Gao et al. Polypeptide nanoparticles with pH-sheddable PEGylation for improved drug delivery
WO2020241819A1 (ja) 複合体、医薬、癌治療剤、キット及び結合体

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 25774086

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1