WO2025197822A1

WO2025197822A1 - エクソソーム、及び抗がん剤

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Publication number: WO2025197822A1
Application number: PCT/JP2025/010096
Authority: WO
Inventors: プラパッソーンチャロンインパイサン; 咸亨林; 隼人倉田
Original assignee: Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2024-03-19
Filing date: 2025-03-17
Publication date: 2025-09-25
Anticipated expiration: 2026-09-19
Also published as: TW202603158A

Abstract

本発明は、優れた抗がん作用を有する新規治療剤を提供することを目的とする。　本発明は、ｍｉＲ－３１６８、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ及びｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐから成る群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡが高発現であることを特徴とする、エクソソーム、並びにこれを含有する抗がん剤に関する。

Description

エクソソーム、及び抗がん剤

　本発明は、エクソソーム及びそれを含む抗がん剤に関する。

　日本において、がんは１９８１年より死因の第１位であり、２０２２年には約４人に１人ががんで亡くなっている。また、２０１９年には約１００万人ががんに罹患し、生涯のうちに約２人に１人ががんにかかると推計されている。年代別にみても、小児の死因の約１０％、２０歳から６４歳までの死因の約３６％ががんである。厚生労働省が２０２３年９月に公表した「２０２２年の人口動態統計（確定数）」によると、がん（悪性新生物〈腫瘍〉）による死亡は、３８万５，７９７人で、死亡数の２４．６％を占める。さらに、急速な高齢者人口の増加に伴う高齢のがん患者の増加によりがん死亡者数は今後も増加すると想定される。そのため、優れた効果を示す新たな抗がん剤の開発が望まれている。

　間葉系幹細胞は、Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ（１９８２）によって初めて骨髄から単離された多分化能を有する前駆細胞である（非特許文献１参照）。間葉系幹細胞は、骨髄、臍帯、脂肪等の様々な組織に存在することが明らかにされており、間葉系幹細胞移植は、様々な難治性疾患に対する新しい治療方法として、期待されている（特許文献１～２参照）。最近では、脂肪組織、胎盤、臍帯、卵膜等の間質細胞に同等の機能を有する細胞が存在することが知られている。従って、間葉系幹細胞を間質細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｒｏｍａｌ　Ｃｅｌｌ）と称することもある。

　腫瘍に対する間葉系幹細胞及び間葉系幹細胞由来のエクソソームの効果が検討されているが、増強作用（非特許文献２～４参照）と抑制作用の両方が報告されている。

特開２０１２－１５７２６３号公報特表２０１２－５０８７３３号公報

Science, 1999, 284,pp.143-147 Cell Death and Disease, 2018, 9, 218 J. Experimental & Clinical Cancer Research, 2019, 38, 62 Molecular Therapy: Oncolytics, 2021, 20, pp.132-146

　本発明は、上述のような状況の中、優れた抗がん作用を有する新規治療剤を提供することを目的とする。

　上記課題を解決するために鋭意研究した結果、本発明者らは、特定の遺伝子を高発現するエクソソームが、高い抗がん作用を有することを見出し、本発明を完成させた。本発明によれば、高い抗がん作用を有する新規治療剤を提供できる。すなわち本発明の要旨は、以下の通りである。

［１］ｍｉＲ－３１６８、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ及びｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐから成る群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡが高発現であることを特徴とする、エクソソーム。
［２］間葉系幹細胞由来である、［１］に記載のエクソソーム。
［３］間葉系幹細胞が臍帯組織又は脂肪組織由来である、［２］に記載のエクソソーム。
［４］［１］から［３］のいずれかに記載のエクソソームを含有する抗がん剤。
［５］被験体に投与することにより、被験体におけるＴＧＦ－β２又はＧＲＮの発現を上昇させる、［４］に記載の抗がん剤。
［６］がんの治療方法であって、有効量のｍｉＲ－３１６８、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ及びｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐから成る群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡが高発現であるエクソソームを患者に投与する工程を含む、がんの治療方法。
［７］前記エクソソームが間葉系幹細胞由来である、［６］に記載の治療方法。
［８］前記間葉系幹細胞が臍帯組織又は脂肪組織由来である、［７］に記載の治療方法。
［９］抗がん剤の製造における、ｍｉＲ－３１６８、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ及びｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐから成る群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡが高発現であることを特徴とするエクソソームの使用。
［１０］前記エクソソームが間葉系幹細胞由来である、［９］に記載の使用。
［１１］前記間葉系幹細胞が臍帯組織又は脂肪組織由来である、［１０］に記載の使用。

　本発明によると、効果の高い抗がん剤を提供できる。本発明の抗がん剤は、高い腫瘍抑制効果があるため、優れた治療効果を奏する。

図１は、本発明のエクソソームの、Ａ５４９－ＬＵＣ２に対する抗腫瘍効果を検討した結果を示す図である（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）。図２は、本発明のエクソソームの、Ａ５４９－ＬＵＣ２に対する抗腫瘍効果を示す図である（ｉｎ　ｖｉｖｏ）。図３は、本発明のエクソソームの、Ａ５４９－ＬＵＣ２に対する抗腫瘍効果を示す図である（ｉｎ　ｖｉｖｏ）。図４は、本発明のエクソソームの、Ａ５４９－ＬＵＣ２に対する抗腫瘍効果を示す図である（ｉｎ　ｖｉｖｏ、写真）。図５－１は、本発明のエクソソームでの処理によるＡ５４９－ＬＵＣ２の遺伝子発現の変化を示すヒートマップである。図５－２は、本発明のエクソソームでの処理によるＡ５４９－ＬＵＣ２に集積するマウス細胞の遺伝子発現の変化を示すヒートマップである。図６－１は、本発明のエクソソームでの処理によるＡ５４９－ＬＵＣ２の遺伝子発現の変化を示すＶｏｌｃａｎｏ　ｐｌｏｔである。図６－２は、本発明のエクソソームでの処理によるＡ５４９－ＬＵＣ２に集積するマウス細胞の遺伝子発現の変化を示すＶｏｌｃａｎｏ　ｐｌｏｔである。図７－１は、実施例４で得られた遺伝子発現データを用いたコア分析の結果を示す図である。図７－２は、実施例４で得られた遺伝子発現データを用いたコア分析の結果を示す図である。図８は、各種細胞由来のエクソソームが有する遺伝子パターンの類似性評価のためのヒートマップである。図９は、ｍｉＲＮＡとその標的遺伝子との相互作用を視覚化した図である。図１０は、遺伝子の発現変化の規模と統計的有意性を視覚的に表現するためのＶｏｌｃａｎｏプロットである。

　以下、本発明の抗がん剤について詳細に説明する。

［抗がん剤］
　本発明の抗がん剤は、ｍｉＲ－３１６８、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ及びｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐから成る群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡが高発現であるエクソソーム（エキソソーム、ｅｘｏｓｏｍｅ）を含むことを特徴とする。また、本発明の抗がん剤は、投与することにより、体内のＴＧＦ－β２もしくはＧＲＮ（Ｇｒａｎｕｌｉｎ：グラニュリン）の発現を上昇させることを特徴とする。

　本発明において、エクソソームにおいて上記ｍｉＲＮＡが「高発現」であるとは、従来のエクソソームに対し、その含有量が、２倍以上、より好ましくは３倍以上、さらに好ましくは５倍以上、特に好ましくは１０倍以上であることをいう。ここで、従来のエクソソームとは、間葉系幹細胞を無血清培地中で２日～５日培養して得られた培養上清から、超遠心法によって取得されたエクソソームをいう。

　「本発明の抗がん剤を投与することにより、体内のＴＧＦ－β２もしくはＧＲＮの発現を上昇させる」とは、被験体に本発明の抗がん剤を投与することで、血中、腫瘍組織中、腫瘍を有しない組織中等において、ＴＧＦ－β２もしくはＧＲＮのタンパク質及び／又は遺伝子の発現が投与前と比較して上昇することを意味する。

　ｍｉＲ－３１６８、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ及びｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐから成る群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡが高発現であるエクソソーム（エキソソーム、ｅｘｏｓｏｍｅ）は、がん細胞の増殖を抑制し、腫瘍を退縮させる効果を有するため、このようなエクソソームを含むことで、本発明の抗がん剤は、がんに対する優れた治療効果を奏する。

〈エクソソーム〉
　本発明におけるエクソソームは、細胞のエンドソーム由来の小胞体であり、細胞から放出される、電子顕微鏡で確認することができるサイズの小胞である。エクソソームの具体的なサイズとしては、平均粒子径が１ｎｍ～１，０００ｎｍであり、１０ｎｍ～５００ｎｍであることが好ましく、３０ｎｍ～２００ｎｍであることがより好ましい。ここで、平均粒子径とは、動的光散乱法又は電子顕微鏡での測定による各粒子の直径の平均値である。上記エクソソームは、生体分子を囲む脂質二重層を有することができる。また、上記エクソソームは、例えば、膜粒子、膜小胞、微小胞、ナノ小胞、微小小胞体（ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ、平均粒子径３０～１，０００ｎｍ）、エクソソーム様小胞、エクトソーム様小胞、エクトソーム（ｅｃｔｏｓｏｍｅ）及び／又はエキソベシクルと呼ばれるものを含んでいてもよい。異なる種類の細胞由来のエクソソームは、細胞内起源、スクロース中でのエクソソームの密度、形状、沈降速度、脂質組成、タンパク質マーカー及び分泌の様式（即ち、シグナル（誘導性）後又は自発的（構成的））に基づいても区別され得る。エクソソームは、例えば、密度勾配遠心法では、１．０～１．５ｇ／ｍＬ、好ましくは１．１～１．３ｇ／ｍＬに分画される。

　エクソソームはその構成脂質としてフォスファチジルセリン、コレステロール、スフィンゴミエリン及びセラミドのいずれかを含有する。本発明におけるエクソソームには、エンドソーム由来の蛋白質や細胞内輸送に関与する蛋白質、細胞膜由来の蛋白質をはじめとする様々な分泌細胞由来の蛋白質やＲＮＡが含まれているとともに、分泌細胞の細胞膜やエンドソーム膜由来の脂質が含まれている。エンドソーム由来の蛋白質としては、ＥＳＣＲＴｓ及びＴＳＧ１０１、細胞内輸送に関与する蛋白質としては、Ｒａｂ及びＧＴＰａｓｅ、細胞膜由来の蛋白質としては、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１、エンドソーム膜由来の脂質としては、コレステロールやスフィンゴミエリンが例示される。

　本発明におけるエクソソームに含まれるその他のタンパク質、脂肪酸としては、例えば、ＩＬ－１０、ＨＧＦ（Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ）、ペラルゴン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、イソペンタデカン酸、パルミチン酸、イソパルミチン酸、マルガリン酸、Ｉｓｏｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、ノナデシル酸、イソノナデシル酸、アラキジン酸、１１Ｚ－ｅｉｃｏｓｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、Ｄｉｈｏｍｏ－γ－ｌｉｎｏｌｅｎｉｃ　ａｃｉｄ、アラキドン酸、エルカ酸、１３Ｚ，　１６Ｚ－Ｄｏｃｏｓａｄｉｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、１３Ｚ，　１６Ｚ，１９Ｚ－Ｄｏｃｏｓａｄｉｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、アドレン酸、Ｃｌｕｐａｎｏｄｏｎｉｃ　ａｃｉｄ等、好ましくはＩＬ－１０、ＨＧＦ、ペラルゴン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、イソペンタデカン酸、パルミチン酸、イソパルミチン酸、マルガリン酸、Ｉｓｏｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、ステアリン酸、イソステアリン酸、オレイン酸、エライジン酸、リノール酸、アラキジン酸、１１Ｚ－ｅｉｃｏｓｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、アラキドン酸、エルカ酸、１３Ｚ，　１６Ｚ－Ｄｏｃｏｓａｄｉｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、更に好ましくはＩＬ－１０、ＨＧＦ、ミリスチン酸、ペンタデカン酸、パルミチン酸、マルガリン酸、Ｉｓｏｈｅｐｔａｄｅｃａｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、ノナデシル酸、エルカ酸、１３Ｚ，　１６Ｚ－Ｄｏｃｏｓａｄｉｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ、特に好ましくはＩＬ－１０、ＨＧＦ、パルミチン酸、マルガリン酸、ステアリン酸、オレイン酸、１３Ｚ，１６Ｚ－Ｄｏｃｏｓａｄｉｅｎｏｉｃ　ａｃｉｄ等が挙げられ、本発明におけるエクソソームはこれらを含むことが好ましい。

　本発明におけるエクソソームは、細胞中に含まれるものでもよく、細胞培養上清中に含まれるものでもよく、細胞中もしくは細胞培養上清から単離されたエクソソームでもよい。単離されたエクソソームは、間質細胞（間葉系幹細胞）等の細胞を含んでいてもよく、また、間質細胞（間葉系幹細胞）用培養培地等の培地を含んでいてもよい。

　本発明におけるエクソソームの由来は、特に限定されず、ヒト、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラビット、マウス、ラット等の哺乳動物の細胞であってもよいし、微生物であってもよいし、コメ等の植物であってもよい。間葉系幹細胞を培養して得られる培養上清、エクソソームを含むコメなどの植物や微生物から回収することができる。さらに、本発明におけるエクソソームは生物によって作られるものに限定されずリポソームなどの人工小胞体であっても構わない。

　本発明におけるエクソソームの由来が上記哺乳類である場合、由来細胞としては、例えば間葉系幹細胞、肝臓由来細胞、線維芽細胞、上皮細胞、筋芽細胞、多能性幹細胞、植物幹細胞、が挙げられ、中でも間葉系幹細胞、多能性幹細胞が好ましく、間葉系幹細胞がより好ましい。

　以下、本発明におけるエクソソームの由来が間葉系幹細胞である場合について説明する。

　本発明の抗がん剤が含むエクソソームは、上記細胞が間葉系幹細胞である場合には、間葉系幹細胞を培養して得られる培養上清から回収することができる。例えば、間葉系幹細胞を培養容器中でサブコンフルエント又はコンフルエントの状態にし、新しい培地へと交換してから、更に１～５日間培養を行って、その培養上清を回収する。エクソソームは間葉系幹細胞の培養上清より分離することにより取得することができる。

　本発明の抗がん剤は、上記エクソソームに加えて、上記エクソソームを包含する、又は分泌する能力を有する間葉系幹細胞自体を含んでいてもよい。

（間葉系幹細胞）
　本発明において間葉系幹細胞とは、間葉系に属する一種以上の細胞（骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞など）への分化能を有し、当該能力を維持したまま増殖できる細胞を意味する。本発明において用いる間葉系幹細胞なる用語は、間質細胞と同じ細胞を意味し、両者を特に区別するものではない。また、単に間葉系細胞と表記される場合もある。間葉系幹細胞を含む組織としては、例えば、脂肪組織、臍帯、骨髄、臍帯血、子宮内膜、胎盤、羊膜、絨毛膜、脱落膜、真皮、骨格筋、骨膜、歯小嚢、歯根膜、歯髄、歯胚等が挙げられる。本発明における間葉系幹細胞としては、脂肪組織、臍帯、骨髄、臍帯血、子宮内膜、胎盤、羊膜、絨毛膜、脱落膜、真皮、骨格筋、骨膜、歯小嚢、歯根膜、歯髄、歯胚等由来のものが挙げられるが、中でも、脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞が好ましく、脂肪組織由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞がより好ましい。

　本発明における間葉系幹細胞の種として、ヒト、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラビット、マウス、ラットが挙げられる。本発明における間葉系幹細胞は、処置される対象（被検体）と同種由来であってもよいし、異種由来であってもよい。

　間葉系幹細胞は、例えば、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社、Ｌｏｎｚａ社、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、Ｖｅｒｉｔａｓ社、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社及びＣｏｒｎｉｎｇ社などから提供されている細胞であってもよく、当業者に周知の方法により調製した細胞であってもよい。また、間葉系幹細胞は、ドナーの組織から分離したプライマリーの細胞であってもよいし、株化された細胞であってもよい。

　本発明において間葉系幹細胞を培養するために用いる培地は、間葉系幹細胞の状態を良好に保って培養することができる培地であれば特に限定されないが、例えば、骨細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞への分化能を維持した状態でヒト間葉系幹細胞を増殖させることができる培地であることが好ましい。

　本発明において用いる培地は、基礎培地に、血清を添加する、及び／又は、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、コレステロール、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロール等の１つ以上の血清代替物を添加して作製してもよい。また、これらの培地には、必要に応じて、さらに、グルタミンなどのアミノ酸類、グルコース等の糖類、塩化ナトリウムや硫酸マグネシウムなどの金属塩類、セレンなどの微量金属類、コレステロールや不飽和脂肪酸などの脂質類、パントテン酸などのビタミン類、アルブミン、インスリン、トランスフェリン、成長因子、増殖因子、サイトカインなどのタンパク質、多糖、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等の物質を添加してもよい。

　上記基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＭＣＤＢ２０１培地及びこれらの混合培地等が挙げられる。

　本発明において用いる間葉系幹細胞を培養するために用いる培地は、患者に投与するという観点から、血清等の異種由来成分を含まない（ゼノフリー）培地であることが好ましい。このような培地としては、例えば、間葉系幹細胞増殖培地２（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　２　（Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ）ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）、間葉系幹細胞増殖培地ＸＦ（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　ＸＦ　（Ｒｅａｄｙ－ｔｏ－ｕｓｅ）、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社製）、ＭＳＣＧＭ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔｔｍ、ＭＳＣＧＭｔｍ　Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｍｅｄｉｕｍ　ＢｕｌｌｅｔＫｉｔｔｍ（Ｌｏｎｚａ社製）、ヒト間葉系幹細胞用ゼノフリー培地（ＭＳＣ　ＮｕｔｒｉＳｔｅｍ（登録商標）　ＸＦ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）、ＭｅｓｅｎＣｕｌｔ－ＡＣＦ　Ｐｌｕｓ（Ｖｅｒｉｔａｓ社製）、ＳｔｅｍＸＶｉｖｏｔｍ　Ｓｅｒｕｍ－Ｆｒｅｅ　Ｈｕｍａｎ　ＭＳＣ　Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ　Ｍｅｄｉａ（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ社製）脂肪由来幹細胞用無血清培地（ＫＢＭ　ＡＤＳＣ－４、コージンバイオ社製）及び間葉系幹細胞用無血清培地（Ｒ：ＳＴＥＭ　Ｍｅｄｉｕｍ　ｆｏｒ　ｈＭＳＣ　Ｈｉｇｈ　Ｇｒｏｗｔｈ、Ｒｏｈｔｏ社製）など、間葉系幹細胞（間質細胞）用として予め調製された培地として提供されている培地が挙げられる。

　上記血清としては、例えば、ヒト血清、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清、仔ウシ血清、ヤギ血清、ウマ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、ラット血清等が挙げられるがこれらに限定されない。血清を用いる場合、基礎培地に対して、５ｖ／ｖ％から１５ｖ／ｖ％、好ましくは、１０ｖ／ｖ％を添加してもよい。

（間葉系幹細胞培養上清の調製）
　以下の方法によって得られる間葉系幹細胞の上清を、本発明における間葉系幹細胞培養上清とすることができる。また、該上清から透析・限外濾過等の手段により不要な成分を除去したもの、該上清をカラム等で分画して得られる画分、特定の分子に対する抗体等を用いて選択した画分、遠心操作により取得した画分等を本発明における間葉系幹細胞培養上清としてもよい。

　培養上清を取得する際に用いる培地としては、間葉系幹細胞を培養するための培地と同様の培地を使用することができる。培養上清の取得方法は、それぞれの間葉系幹細胞の培養に適した方法であれば特に限定されないが、例えば、２０℃～３７℃の温度、２％～７％ＣＯ_２環境下、５％～２１％Ｏ_２環境下、好ましくは室温～３７℃、５％ＣＯ_２環境下で間葉系幹細胞を培養し、その培養上清を取得する方法である。

　本発明の間葉系幹細胞培養上清は、間葉系幹細胞と培地が接触すればよく、間葉系幹細胞を培地で洗浄することによって得られる洗浄液も、本発明における培養上清とすることができる。間葉系幹細胞と培地の接触時間は例えば、１４日間以内、好ましくは１０日間以内、さらに好ましくは７日間以内、より好ましくは５日間以内である。具体的に好ましくは、例えば、間葉系幹細胞を培養容器中でサブコンフルエント又はコンフルエントの状態にし、新しい培地へと交換してから、更に１～５日間培養を行って、その培養上清を回収する。培養上清を取得するための培養は、フラスコに付着させて行われる平面培養であってもよいし、マイクロビーズ等に付着させた浮遊・撹拌培養であってもよい。

（エクソソームの単離）
　エクソソームを単離する場合は、上述の方法で回収された間葉系幹細胞の培養上清を、限外ろ過法、超遠心分離法、密度勾配遠心法、アフィニティー精製法、サイズ排除クロマトグラフィー法、各種エクソソーム分離キット等により分離する方法等、従来公知の方法により取得することができる。エクソソームの分離方法は、限外ろ過法、超遠心分離法やアフィニティー精製法、サイズ排除クロマトグラフィー法が好ましい。限外ろ過方法としては、タンジェンシャルフローろ過が挙げられ、タンジェンシャルフローろ過を行うシステムとして、ミニメイトＥＶＯシステム（ＰＡＬＬ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ＴＦＦ－Ｅａｓｙ（ＨａｎｓａＢｉｏＭｅｄ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｌｔｄ）、Ａｍｂｒ（登録商標）　Ｃｒｏｓｓｆｌｏｗ（ザルトリウス）、Ｓａｒｔｏｆｌｏｗ（登録商標）シリーズ（ザルトリウス）、ＦｌｅｘＡｃｔ（登録商標）　Ｍｏｄｕｌａｒ　ＣＦ（ザルトリウス）、ＫｒｏｓＦｌｏ（登録商標）　ＴＦＤＦ（登録商標）システム（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）等がある。

　本発明の抗がん剤が含むエクソソームの量としては、抗がん剤全体における濃度として、０．００１ｐｇ／ｍＬ以上１００ｕｇ／ｍＬ以下であり、０．００５ｐｇ／ｍＬ以上１００ｕｇ／ｍＬ以下であることが好ましく、０．０１ｐｇ／ｍＬ以上１０ｕｇ／ｍＬ以下であることがより好ましく、０．１ｐｇ／ｍＬ以上１００ｎｇ／ｍＬ以下であることが特に好ましい。本発明の抗がん剤が含むエクソソームの量を上記数値範囲内とすることで、本発明の抗がん剤は、優れた抗がん効果を奏する。

　本発明の抗がん剤は、エクソソーム以外に、本発明の効果を妨げない範囲でその他の成分を含有してもよい。その他の成分としては、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）やアルブミン等の保護剤、抗生物質、糖類、アミノ酸類、ビタミン類、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水等が挙げられる。

　本発明の組成物の対象となる間葉系幹細胞の種として、哺乳動物であればよいが、例えばヒト、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラビット、マウス、ラット、希少動物等が挙げられる。

　本発明の抗がん剤は、上述のエクソソームと、必要に応じて前記その他の成分とを混合し、常法により製造することができる。

　本発明には、ｍｉＲ－３１６８、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ及びｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐから成る群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡが高発現であるエクソソームを配合することを特徴とする抗がん剤の製造方法も含まれる。

［がんの治療方法］
　本発明は、がんの治療方法であって、有効量のｍｉＲ－３１６８、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ及びｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐから成る群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡが高発現であるエクソソームを患者に投与する工程を含む、がんの治療方法も含む。

　ｍｉＲ－３１６８、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ及びｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐから成る群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡが高発現であるエクソソーム（エキソソーム、ｅｘｏｓｏｍｅ）は、がん細胞の増殖を抑制し、腫瘍を退縮させる効果を有するため、このようなエクソソームの有効量を患者に投与する工程を含む、本発明のがんの治療方法は、がんに対する優れた治療効果を奏する。

　前記エクソソームは、間葉系幹細胞由来であることが好ましい。また、前記間葉系幹細胞は、臍帯組織又は脂肪組織由来であることが好ましい。

　なお、本発明のがんの治療方法は、上述の本発明の抗がん剤を患者に投与する工程を含む方法ということもできる。したがって、上述の「抗がん剤」の項の説明は、本発明の治療方法についても適用される。

［抗がん剤の製造における特定のエクソソームの使用］
　本発明は、抗がん剤の製造における、ｍｉＲ－３１６８、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ及びｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐから成る群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡが高発現であるエクソソームの使用も含む。前記エクソソームは、間葉系幹細胞由来であることが好ましい。また、前記間葉系幹細胞は、臍帯組織又は脂肪組織由来であることが好ましい。

［エクソソーム］
　本発明は、ｍｉＲ－３１６８、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ及びｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐから成る群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡが高発現であるエクソソーム（エキソソーム、ｅｘｏｓｏｍｅ）も含む。ｍｉＲ－３１６８、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ及びｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐから成る群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡが高発現であるエクソソームは、上述のとおり、高い腫瘍抑制効果があるため、抗がん剤に好適に用いられる。本発明のエクソソームの詳細は、抗がん剤の項における説明を適用できる。

　以下に、実施例及び試験例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等によって限定されるものではない。

［実施例１：エクソソームの調製］
　ヒトドナーから同意を得た後、脂肪吸引法で得た皮下脂肪組織を生理食塩液で洗浄した。細胞外基質の破壊、及び細胞の単離を達成するために、コラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を添加し、３７℃で９０分間振盪し、分散した。続いて、この上記懸濁液を８００×ｇで５分間、遠心分離して間質血管細胞群の沈殿を得た。上記細胞の沈殿に間葉系幹細胞用無血清培地（ＲＩＭ培地、ＲＩＭ－ＧＦＭＩＸ（原薬等登録原簿登録予定）、ＥＧＦ、ｂＦＧＦ、アルブミン、トランスフェリン及びインシュリンを含む、Ｒｏｈｔｏ社）を加えて懸濁し、３日間培養後、当該細胞懸濁液を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清除去後にＲＩＭ培地に再懸濁してフラスコに細胞を播種した。細胞を３７℃で数日間、５％ＣＯ_２中で培養した。数日後に培養物をＰＢＳで洗浄して、培養液中に含まれていた血球や脂肪組織の残存等を除去し、プラスチック容器に接着している間葉系幹細胞を得た。得られた脂肪組織由来間葉系幹細胞を接着細胞用Ｔ２５フラスコ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）に５０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ^２で播種し、ＲＩＭ培地で７－１０日間培養（３７℃、５％ＣＯ_２）し、培養上清を得た。培養上清から、Ｔｏｔａｌ　Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ法、超遠心法（Ｕｌｔｒａ　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ）及びタンジェンシャルフローろ過（ＴＦ）によりエクソソームを得た。なお、Ｔｏｔａｌ　Ｅｘｏｓｏｍｅ　Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ法により得られたエクソソームをＴＥＩ、超遠心法により得られたエクソソームをＵＣ、タンジェンシャルフローろ過により得られたエクソソームをＥＶｓという。

［実施例２：エクソソームの抗がん作用（ｉｎ　ｖｉｔｒｏ）］
　Ｄ－ＰＢＳに懸濁したＡ５４９－ＬＵＣ２（肺がん細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社製）（コントロール群）と、５００．８ｐｇの各製造方法により得たエクソソーム（ＴＥＩ、ＵＣ及び、ＥＶ＃１３及びＥＶ＃１４）を添加したＤ－ＰＢＳに懸濁したＡ５４９　－ＬＵＣ２（（ＴＥＩ群、ＵＣ群及び、ＥＶ＃１３群及びＥＶ＃１４群）を、それぞれＤＭＥＭ　ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ（ｇｉｂｃｏ社製）培地中に添加して１日培養後、培地交換をし、さらに１日培養（３７℃、５％ＣＯ_２）を行った。なお、ＥＶ＃１３及びＥＶ＃１４はエクソソームのロット違いである。

　上記培養後、ＷＳＴ－８により細胞増殖、腫瘍の体積及び重量を測定したがコントロール群と、エクソソーム群において腫瘍（肺がん細胞）の体積及び重量に差はなく、エクソソームの直接的な抗がん作用は見られなかった。細胞増殖結果を図１に示す。

［実施例３：エクソソームの抗がん作用（ｉｎ　ｖｉｖｏ）］
　マウス（ＢＡＬＢ／ｃ　Ｓｌｃ－ｎｕ／ｎｕ、雄、６週齢）にＤ－ＰＢＳに懸濁した５×１０^{６ｃｅｌｌｓ}のＡ５４９－ＬＵＣ２（肺がん細胞、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ社製）（コントロール群）、実施例１で調整したタンジェンシャルフローろ過（ＴＦ）により得られたエクソソーム５００．８ｐｇを添加したＤ－ＰＢＳに懸濁した５×１０^{６ｃｅｌｌｓ}のＡ５４９　－ＬＵＣ２（高投与群）及び１６７ｐｇのエクソソームを添加したＤ－ＰＢＳに懸濁した５×１０^{６ｃｅｌｌｓ}のＡ５４９　－ＬＵＣ２（１／３投与群）、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（コージンバイオ社製）をそれぞれ皮下投与を行った（投与量は２００μＬ）。投与後９、１２、１５、１９、２３、２６及び３０日後にデジタルノギスを用いて、がん細胞の腫瘍径を測定し、腫瘍の体積を算出した（図２）。また、３０日後におけるがん細胞の重量を電子天秤により、測定した（図３）。腫瘍の写真を図４に示した。

　図２及び図３に示すように、コントロール群に比べて、エクソソームの高投与群及び１／３投与群においてがん細胞の体積及び重量の減少がみられた。また図４で示すように目視においてもコントロール群に比べて、エクソソームの高投与群及び１／３投与群において腫瘍が小さくなっていることが確認できた。以上より、本発明のエクソソームを投与することにより、がん細胞の増殖を抑制することが示された。

［実施例４：ＲＮＡ－ｓｅｑ解析］
　実施例３で得られた各がん細胞を凍結保存しておき、その凍結組織からｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。その後、分解の有無および核酸濃度を定量するために、電気泳動による品質確認を行った。品質が確認できたＲＮＡからのＴｏｔａｌ　ＲＮＡサンプルから、Ｐｏｌｙ－Ａ選択法を用いてｍＲＮＡを精製した。このｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応を行い、一本鎖ｃＤＮＡを合成した。次に、この一本鎖ｃＤＮＡを鋳型として、ｄＴＴＰの代わりにｄＵＴＰを含むヌクレオシド三リン酸を用いてｓｅｃｏｎｄ－ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡを作成した。その後、得られた二本鎖ｃＤＮＡの両末端を平滑化・リン酸化処理し、３’－ｄＡ突出処理を行った。この処理後に、ｄＵＴＰを含むシーケンス用アダプターを連結した。最後に、アダプター内およびｓｅｃｏｎｄ－ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ内のｄＵＴＰをＵＳＥＲ　ｅｎｚｙｍｅにより選択的に切断することで、方向性情報を持つ一本鎖ＤＮＡで合成されたライブラリー（ｓｔｒａｎｄ－ｓｐｅｃｉｆｉｃライブラリー）の鋳型を得た。

　Ｉｌｌｕｍｉｎａ　ＮｏｖａＳｅｑ　６０００を用いてシーケンスを行った。シーケンスの品質検証のため、ＦａｓｔＱＣソフトウェアを用いてシーケンスリードのクオリティスコアを算出した。次に、Ｔｒｉｍｍｏｍａｔｉｃソフトウェアを用いて設定値に基づきシーケンスリードのトリミングを行った。これにより、クオリティの低いリードやアダプター配列を除去した。マッピング結果を用いて、リードのリファレンスゲノムへのマップ率を計算した。これにより、リードがどれだけ適切にリファレンスゲノムにアライメントされたかを評価した。ｆｅａｔｕｒｅＣｏｕｎｔｓソフトウェアを用いて既知エクソン領域にマッピングされたリード数を算出し、マッピングされたフラグメントのカウントを行った。さらに、ＦＰＫＭ値、ＦＰＫＭ－ＵＱ値、およびＴＰＭ値を算出した。これらの値は、各遺伝子の発現量を表す。ｓｔａｔｓソフトウェアを用いてリードカウント値、ＦＰＫＭ値またはＴＰＭ値に基づく各サンプルの階層的クラスタリングを行った。これにより、サンプル間の遺伝子発現パターンの類似性を評価した。また、同ソフトウェアを用いて各サンプルのヒートマップを描画した（図５－１：ヒト／図５－２：マウス）。ヒートマップには、各遺伝子の発現量の変化量を表すＺスコアを用いた。また、遺伝子の発現変化の規模と統計的有意性を視覚的に表現するためのＶｏｌｃａｎｏプロットを作成した。このプロットの作成には、Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを用いた（図６－１：ヒト／図６－２：マウス）。Ａ５４９のみとＭＳＣ－ＥＶ投与群の間の差異発現解析をＶｏｌｃａｎｏ　ｐｌｏｔで視覚化した。ｘ軸は発現量の変化を、０を中心として右側（赤色：白黒図面においては黒色）が発現上昇遺伝子、左側（青色：白黒図面においては白色）が発現下降遺伝子を示している。一方、ｙ軸は統計的有意性を表し、上に行くほど有意性が高まる。したがって、発現の変動比が大きく、その統計的有意性も高い遺伝子は、プロット上で右上または左上に位置する。

［実施例５：ＩＰＡ解析］
　実施例４で得られた遺伝子発現データを用いてＱＩＡＧＥＮ　Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ　Ｐａｔｈｗａｙ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　（ＩＰＡ）　ソフトウェアを用いたコア分析を行った。各遺伝子発現データをアップロードし、指定されたパラメータを設定した後、分析を実行した。得られた結果を用いて、遺伝子発現のパターンとパスウェイの変化を解析し、エクソソームの投与ががん細胞の遺伝子発現にどのような影響を与えたかの解釈を行った（図７－１：ヒト／図７－２：マウス）。

　ＲＮＡ－ｓｅｑのデータを用いて既知のパスウェイ、上流因子、および毒性や疾患との関連を調査した結果、図７－１及び７－２に示されている分子または遺伝子をターゲットにする上流因子が高発現していることが明らかとなった。上流調節因子と下流の疾患／機能の解析結果を統合することで、上流調節因子の変動がデータセット内の分子を介して下流でどのような影響を及ぼすのかを理解することができた。なお、図内の各線は関連性のある分子間の結連を示している。解析時にレイアウトを「Ｒａｄｉａｌ」に設定した結果、全ての遺伝子や分子の中心に位置する分子が全体のキーファクターであることが判明した。

［実施例６：ｍｉＲＮＡ解析］
　実施例１で調整したタンジェンシャルフローろ過（ＴＦ）により得られたエクソソームからｍｉＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、ｍｉＲＮＡを抽出した。ライブラリ調製はＳｍａｌｌ　ＲＮＡ－Ｓｅｑ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐ　Ｋｉｔを用いて次世代シーケンサーＮｅｘｔＳｅｑ用ライブラリを以下の工程に従い行った。次に、ＮｅｘｔＳｅｑ５００　（ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いてシーケンスを行った。解析はプログラムｂｃｌ２ｆａｓｔｑ（ｉｌｌｕｍｉｎａ社）を用いて、得られたリードからｆａｓｔｑファイルを作成し、ｇｚ形式に圧縮してＤＶＤに格納した。各遺伝子の発現量を用いて階層的クラスタリングを行った。これにより、サンプル間の遺伝子発現パターンの類似性を評価した。また、同ソフトウェアを用いて各サンプルのヒートマップを描画した（図８）。ヒートマップには、各遺伝子の発現量の変化量を表すＺスコアを用いた。また、ｍｉＲＮｅｔによりｍｉＲＮＡとその標的遺伝子との相互作用を視覚化した。遺伝子の発現変化の規模と統計的有意性を視覚的に表現するためのＶｏｌｃａｎｏプロットを作成した（図９、図１０）。このプロットの作成には、Ｇｒａｐｈｐａｄソフトウェアを用いた。

　エクソソームを投与することにより、ｍｉＲ－３１６８、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ及びｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐの発現が上昇することが明らかとなった。

Claims

　ｍｉＲ－３１６８、ｍｉＲ－９２ａ－１－５ｐ、ｍｉＲ－７－５ｐ及びｍｉＲ－１４６ｂ－５ｐから成る群より選択される少なくとも１種のｍｉＲＮＡが高発現であることを特徴とする、エクソソーム。
　間葉系幹細胞由来である、請求項１に記載のエクソソーム。
　間葉系幹細胞が臍帯組織又は脂肪組織由来である、請求項２に記載のエクソソーム。
　請求項１から３のいずれか１項に記載のエクソソームを含有する抗がん剤。
　被験体に投与することにより、被験体におけるＴＧＦ－β２又はＧＲＮの発現を上昇させる、請求項４に記載の抗がん剤。