WO2025192252A1 - エタノールを生成する組換え好熱性細菌およびそれを用いたエタノールの製造方法 - Google Patents

エタノールを生成する組換え好熱性細菌およびそれを用いたエタノールの製造方法

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WO2025192252A1
WO2025192252A1 PCT/JP2025/006167 JP2025006167W WO2025192252A1 WO 2025192252 A1 WO2025192252 A1 WO 2025192252A1 JP 2025006167 W JP2025006167 W JP 2025006167W WO 2025192252 A1 WO2025192252 A1 WO 2025192252A1
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WO
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bacterium
recombinant
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ethanol
thermophilic bacterium
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豊 中島田
節 加藤
淳也 加藤
達也 藤井
友岳 森田
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Hiroshima University NUC
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Hiroshima University NUC
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12P7/06—Ethanol, i.e. non-beverage
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    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
    • Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
    • Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel

Definitions

  • the present invention relates to a recombinant thermophilic bacterium that produces ethanol and a method for producing ethanol using the same, and in particular to a thermophilic acetogenic bacterium whose metabolic pathway has been modified by genetic engineering techniques and a method for producing ethanol using the same.
  • one alternative method for producing these materials is the use of genetically modified microorganisms to produce useful substances from carbon sources, a technology that uses these microorganisms to produce useful substances from carbon sources.
  • gas fermentation the technology of converting gaseous materials such as H 2 , CO, and CO 2 into compounds by fermentation using microorganisms is called gas fermentation, and is expected to contribute to carbon recycling.
  • Ethanol is an important basic chemical that is used as a solvent and disinfectant, as well as a raw material for polymers such as polyethylene.
  • Current ethanol production relies on petrochemicals, raising concerns about the future depletion of fossil fuels, as mentioned above, and the generation of greenhouse gases, primarily CO2 . Therefore, alternative production methods with lower CO2 emissions are needed.
  • Non-Patent Document 1 discloses that genetic manipulation of Moorella thermoacetica, a thermophilic acetogenic bacterium, has enabled the production of ethanol from gas feedstock via acetyl-CoA.
  • PTA phosphotransacetylase
  • pduL1 and pduL2 two genes that produce PTA, pduL1 and pduL2, were replaced with a gene that expresses aldehyde dehydrogenase, thereby blocking part of the acetate pathway and introducing a pathway that converts acetyl-CoA to acetaldehyde instead. This acetaldehyde is then converted to ethanol by endogenous alcohol dehydrogenase.
  • Non-Patent Document 1 The technology in Non-Patent Document 1 is capable of producing ethanol, but it is necessary to leave part of the acetic acid production pathway intact. This is because if the acetic acid production pathway were completely destroyed, a sufficient amount of ATP would not be produced and the metabolic redox balance would be disrupted, making it impossible to maintain autotrophy. In this way, with conventional technology, part of the raw material is consumed in producing acetic acid, an undesired substance. Furthermore, because the product contains a large amount of acetic acid in addition to ethanol, ethanol purification requires a lot of time, energy, and equipment. Therefore, there is room for improvement in this technology before it can be applied to industrial mass production.
  • the present invention aims to enable ethanol to be obtained with high efficiency by microbial fermentation using a carbon source such as CO or CO2 as a raw material.
  • thermophilic acetogenic bacterium derived from a thermophilic acetogenic bacterium having a metabolic pathway for producing acetate from a carbon source via acetyl-CoA as an intermediate, At least some of the enzymes involved in the metabolic pathway are deleted by genetic engineering techniques, A recombinant thermophilic ethanol-producing bacterium expressing an exogenous NADPH-dependent thermostable enzyme that catalyzes the reaction of producing acetaldehyde from acetyl-CoA, and a thermostable enzyme that catalyzes the reaction of producing ethanol from acetaldehyde.
  • the thermophilic acetogenic bacterium is a Moorella bacterium.
  • thermophilic bacterium described in [1] above.
  • the deficient enzyme is an enzyme that produces acetyl phosphate using acetyl-CoA as a substrate.
  • the thermophilic acetogenic bacterium is a Moorella bacterium, the defective enzymes are PduL1 and PduL2; The recombinant thermophilic bacterium according to any one of [1] to [3] above.
  • the exogenous thermostable enzyme that catalyzes the reaction of producing acetaldehyde from acetyl-CoA is NADPH-dependent aldehyde dehydrogenase.
  • the recombinant thermophilic bacterium according to any one of claims [1] to [4].
  • the NADPH-dependent aldehyde dehydrogenase is AdhE G544D , in which the 544th glycine of AdhE derived from Thermoanaerobacterium saccharolyticum is substituted with aspartic acid.
  • thermostable enzyme that catalyzes a reaction to produce ethanol from acetaldehyde is an NADPH-dependent alcohol dehydrogenase.
  • the recombinant thermophilic bacterium according to any one of [1] to [6] above.
  • the NADPH-dependent alcohol dehydrogenase is at least one of an enzyme derived from Moorella bacteria, AdhE G544D derived from Thermoanaerobacterium saccharolyticum in which the 544th glycine of AdhE is substituted with aspartic acid, and AdhA derived from Thermoanaerobacterium saccharolyticum.
  • AdhA derived from Thermoanaerobacterium saccharolyticum.
  • thermophilic bacterium [9] Deposited under accession number NITE ABP-04297, The recombinant thermophilic bacterium according to any one of [1] to [8] above. [10] Further expressing an exogenous thermostable enzyme that assists in the reaction of producing ATP from ADP via a pathway different from the metabolic pathway. The recombinant thermophilic bacterium according to any one of [1] to [9] above. [11] The exogenous thermostable enzyme that assists in the reaction of producing ATP from ADP via a pathway different from the metabolic pathway is ferredoxin hydrogenase. The recombinant thermophilic bacterium according to [10] above.
  • the ferredoxin hydrogenase is CpI derived from Clostridium pasteurianum.
  • a method for producing ethanol comprising culturing the recombinant thermophilic bacterium according to any one of [1] to [14] above in the presence of CO or in the presence of both CO and CO2 to produce ethanol.
  • the step of producing ethanol by culturing the recombinant thermophilic bacterium is further carried out in the presence of H2 .
  • the step of producing ethanol comprises culturing the recombinant thermophilic bacterium at 55°C to 65°C.
  • thermophilic bacterium According to the ethanol-producing recombinant thermophilic bacterium and the method for producing ethanol using the same of the present invention, ethanol can be obtained highly efficiently from gas substrates such as CO, H2 , or CO2 by microbial fermentation.
  • FIG. 1 shows the metabolic pathway for producing acetate inherent in thermophilic acetogenic bacteria.
  • FIG. 2 is a diagram showing the ethanol synthesis pathway introduced into the recombinant bacterium.
  • FIG. 3 shows the structure of the plasmid pHM62, which disrupts the endogenous phosphoacetyltransferase gene (pduL2) and introduces the genes for ethanol synthase (adhE G544D and adhA).
  • FIG. 4 shows the structure of the plasmid pHM75, which disrupts the endogenous phosphoacetyltransferase gene (pduL1) and introduces the hydrogenase gene (cpI) and the ferredoxin gene (fd).
  • 1 is a graph showing the time-dependent changes in the amount of recombinant bacteria HMC53 strain and the amounts of ethanol and acetic acid produced when cultured in CO gas.
  • 10 is a graph showing the changes over time in the concentrations of the substrate fructose and the products ethanol and acetic acid in the medium, as well as the proportion of CO in the gas, when the recombinant bacterium HMC71 strain was cultured under the same conditions as in FIG. 9 .
  • 10 is a graph showing the change over time in the headspace N2 reference gas ratios of CO, CO 2 , and H 2 and the total pressure (bar) when the recombinant bacterium HMC71 strain was cultured under the same conditions as in FIG. 9 .
  • One embodiment of the present invention relates to a recombinant bacterium derived from a thermophilic acetogenic bacterium having a metabolic pathway for producing acetate from a carbon source via acetyl-CoA as an intermediate.
  • the recombinant bacterium is genetically engineered to lack at least some of the enzymes involved in the metabolic pathway.
  • the recombinant bacterium expresses an exogenous NADPH-dependent thermostable enzyme that catalyzes the reaction of producing acetaldehyde from acetyl-CoA and a thermostable enzyme that catalyzes the reaction of producing ethanol from acetaldehyde.
  • This recombinant bacterium is capable of producing ethanol.
  • Thermophilic acetogenic bacteria are bacteria that have an optimum growth temperature of 45°C or higher and produce acetic acid from a substrate.
  • the thermophilic acetogenic bacteria of this embodiment can produce acetic acid using at least one gas substrate, CO and CO2 , as a carbon source.
  • the thermophilic acetogenic bacteria may also be able to use organic substances, such as sugars, as a carbon source.
  • the thermophilic acetogenic bacteria used as parent bacteria for the recombinant bacteria of this embodiment are not particularly limited as long as they have a metabolic pathway that produces acetic acid from a carbon source via acetyl-CoA as an intermediate.
  • thermophilic acetogenic bacteria are not limited to bacteria and may be archaea, and are preferably bacteria of the genus Moorella.
  • examples of thermophilic acetogenic bacteria include Moorella thermoacetica and Moorella thermoautotrophica.
  • An example of a bacterium other than Moorella is Thermoanaerobacter kivui, and an example of an archaebacterium is Archaeoglobus fulgidus.
  • the recombinant bacterium need only be deficient in an enzyme involved in the metabolic pathway that produces acetic acid via acetyl-CoA, and there are no specific limitations on the enzyme that is deficient. Furthermore, it is sufficient that the expression of at least a portion of the enzyme involved in this metabolic pathway is deficient. In the recombinant bacterium, this deficiency may result in a reduced amount of acetic acid being produced, or may completely block acetic acid production.
  • thermophilic acetogenic bacteria produce acetic acid from acetyl-CoA.
  • thermophilic acetogenic bacteria produce acetyl-CoA from a carbon source through the action of various enzymes (illustration and explanation of this production pathway are omitted), then produce acetyl phosphate by removing CoA from acetyl-CoA and adding phosphate, and then produce acetic acid by removing the phosphate from acetyl phosphate.
  • the enzyme that is deficient in the recombinant bacterium is preferably a phosphoacetyltransferase, an enzyme that produces acetyl phosphate using acetyl-CoA as a substrate.
  • the genus Moorella has two endogenous phosphoacetyltransferases, PduL1 and PduL2, and it is preferable that both of these enzymes are deficient in the recombinant bacterium. By deficient in both of the two phosphoacetyltransferases, the amount of acetic acid produced can be significantly reduced, allowing for efficient production of ethanol.
  • the exogenous thermostable enzyme preferably functions at the growth temperature of the thermophilic acetogenic bacteria.
  • the thermostable enzyme is preferably derived from a thermophilic bacterium, but is not particularly limited as long as the enzyme itself is thermostable. Specifically, the thermostable enzyme preferably functions at 45°C or higher, and more preferably functions at 55°C or higher.
  • the exogenous thermostable enzyme catalyzing the reaction of producing acetaldehyde from acetyl-CoA is preferably an NADPH-dependent aldehyde dehydrogenase.
  • the NADPH-dependent aldehyde dehydrogenase is preferably derived from Thermoanaerobacterium, and particularly preferably AdhE G544D , which is a G544D mutant of aldehyde dehydrogenase AdhE derived from Thermoanaerobacterium saccharolyticum, in which the 544th glycine of AdhE is substituted with aspartic acid.
  • AdhE is an enzyme that functions as both an aldehyde dehydrogenase and an alcohol dehydrogenase.
  • the wild type is NADH-dependent, but the G544D mutant is NADPH-dependent as both an aldehyde dehydrogenase and an alcohol dehydrogenase.
  • NADPH-dependent alcohol dehydrogenase is preferred as a thermostable enzyme that catalyzes the reaction of producing ethanol from acetaldehyde.
  • NADPH-dependent alcohol dehydrogenase may be endogenous to the cell or introduced extracellularly.
  • the thermophilic acetic acid bacterium is a Moorella bacterium
  • the endogenous NADPH-dependent alcohol dehydrogenase can be used.
  • a Moorella-derived alcohol dehydrogenase gene may be further introduced.
  • the NADPH-dependent alcohol dehydrogenase may be a foreign enzyme derived from a species other than Moorella, and in this case, it is preferably derived from Thermoanaerobacterium.
  • the NADPH-dependent alcohol dehydrogenase may be a foreign enzyme derived from a species other than Moorella, and in this case, it is preferably derived from Thermoanaerobacterium.
  • AdhE G544D and AdhA derived from T. saccharolyticum is used as the NADPH-dependent alcohol dehydrogenase.
  • both of these enzymes may be used.
  • recombinant bacteria convert acetyl-CoA into ethanol through a reduction reaction, as shown in Figure 2.
  • the enzyme that performs the reduction reaction requires a cofactor, and the cofactor is one of the factors that affect productivity.
  • the inventors discovered that using an enzyme that requires NADPH as a cofactor could improve the metabolic redox balance and result in high productivity.
  • recombinant bacteria demonstrated high ethanol productivity by expressing an enzyme that requires NADPH as a cofactor.
  • acetic acid production is coupled with the production of ATP, the cellular energy source, but ethanol production is not. Therefore, in recombinant bacteria in which the metabolic pathway for acetic acid production is disrupted, the amount of intracellular ATP synthesis decreases, and energy deficiencies can occur. Therefore, it is preferable for recombinant bacteria to further express an exogenous thermostable enzyme that assists in the reaction of producing ATP from ADP via a pathway different from the metabolic pathway. Therefore, in order to produce ethanol highly efficiently while suppressing acetic acid production, the inventors introduced an exogenous thermostable enzyme into bacteria that assists in the reaction of producing ATP from ADP via a pathway different from acetic acid production. This resulted in bacteria that can grow by utilizing gaseous substrates and produce ethanol highly efficiently.
  • thermostable enzyme that assists the reaction of generating ATP from ADP is preferably a ferredoxin hydrogenase that reduces ferredoxin using H2 , specifically, the enzyme CpI derived from Clostridium pasteurianum. CpI oxidizes H2 and transfers electrons to oxidized ferredoxin to form reduced ferredoxin.
  • the recombinant bacterium preferably expresses a ferredoxin.
  • the expressed ferredoxin may be either endogenous or exogenous. It is even more preferable that the recombinant bacterium express a ferredoxin derived from C. pasteurianum.
  • an enzyme refers to a state in which the gene that expresses the enzyme is missing.
  • an exogenous enzyme means that the exogenous gene has been "introduced” into the bacterium in a state in which it can be expressed.
  • a variety of genetic engineering techniques can be used to delete endogenous enzymes, and there are no particular limitations as long as the enzyme expression gene in the bacterial genome can be removed or mutated to prevent stable expression of the enzyme.
  • Examples of genetic engineering techniques that can be used include gene knockout methods using homologous recombination.
  • thermostable enzyme expression gene can be used to introduce an exogenous thermostable enzyme expression gene, and there is no particular limitation as long as the enzyme can be introduced into the bacterium so that it can be stably expressed.
  • genetic engineering techniques include gene knock-in, which utilizes homologous recombination.
  • a gene expressing an exogenous thermostable enzyme can be introduced simultaneously with the deletion of a portion of an enzyme involved in the metabolic pathway from acetyl-CoA to acetic acid.
  • HMC71 strain An example of a recombinant bacterium is the HMC71 strain.
  • the HMC71 strain is derived from M. thermoacetica as a parent strain, and is deficient in the expression genes (pduL1 and pduL2) of the endogenous phosphoacetyltransferases PduL1 and PduL2, and is an aldehyde dehydrogenase and alcohol dehydrogenase derived from T. saccharolyticum.
  • AdhE G544D adhE gene number Tsac_0416
  • AdhA gene number Tsac_2087
  • HMC53 strain Another example of a recombinant bacterium into which ferredoxin hydrogenase has been introduced is the HMC53 strain.
  • the HMC53 strain is derived from M. thermoacetica as a parent strain, and the pduL1 and pduL2 genes have been deleted, and the adhE G544D and adhA genes have been introduced in an expressible manner.
  • An expression gene for CpI, a ferredoxin hydrogenase derived from C. pasteurianum (cpI: gene number CPAST_c00280), and expression genes for two types of ferredoxin derived from C. pasteurianum (fd: gene numbers CPAST_c01220 and CPAST_c14230) have been introduced in an expressible manner.
  • HMC71 and HMC53 strains have been deposited at the following depository institution. Name of depository institution: Patent Microorganism Deposit Center, National Institute of Technology and Evaluation, Independent Administrative Institution. Contact: Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, 292-0818.
  • the respective receipt number/deposit number, identification marking, and deposit date are as follows: HMC71 strain: Accession number NITE ABP-04297, M. thermoacetica HMC71, February 3, 2025 HMC53 strain: Accession number NITE ABP-04082, HMC53, February 22, 2024
  • the HMC71 and HMC53 strains can be cultured in a modified version of ATCC1754 PETC medium, which is used to culture Clostridium ljungdahlii, but the medium is not limited to this.
  • the recombinant bacterium described above can be used in a method for producing ethanol.
  • This method for producing ethanol includes culturing the recombinant thermophilic bacterium to produce ethanol. The culturing is carried out in the presence of at least CO. Alternatively, the culturing may be carried out in the presence of CO and CO2 , CO and H2 , or CO, CO2 , and H2 .
  • the recombinant bacterium can use both CO and CO2 as a carbon source.
  • a gas containing at least one of CO and CO2 is exemplified as a carbon source, and more specifically, a mixed gas of CO and CO2 is exemplified.
  • a mixed gas of CO and CO2 in any ratio can be used.
  • a mixed gas in which CO: CO2 is mixed in a ratio of 1:1 can be used, but is not limited to this.
  • sugars can be used as an additional carbon source.
  • pentoses such as xylose can be used as sugars
  • hexoses such as fructose can also be used.
  • sugars are not limited to pentoses and hexoses.
  • sugars may contain two or more of the above-mentioned sugars.
  • the recombinant bacteria are preferably cultured in the presence of H2 in addition to CO2.
  • the recombinant bacteria can use CO2 and H2 as energy sources.
  • the mixing ratio of H2 is not particularly limited.
  • the recombinant bacteria express an exogenous ferredoxin hydrogenase, culturing the recombinant bacteria in the presence of H2 enables more efficient ethanol production.
  • the recombinant bacteria in order to produce ethanol as efficiently as possible, it is preferable to culture the recombinant bacteria at the optimal growth temperature for the bacteria.
  • the method according to this embodiment preferably further comprises a step of recovering the ethanol after ethanol has been produced by culturing the bacteria.
  • the step of recovering the ethanol is not particularly limited as long as it is a method that can separate ethanol from other components and obtain highly pure ethanol.
  • distillation can be used, as the boiling point of ethanol is 78°C and the boiling point of the by-product acetic acid is 118°C.
  • Gas stripping can also be used. This can avoid product inhibition by ethanol and improve the efficiency of ethanol production by the bacteria. Note that gas stripping can be performed using a gas stripping device and conditions such as those disclosed in, for example, K. Inokuma, et al.: J. Biosci. Bioeng., 110, 696 (2010), but is not limited thereto.
  • thermophilic bacterium that produces ethanol according to the present invention and the method for producing ethanol using the same.
  • strains, plasmids and primers used The strains, plasmids and primers used in this example are shown in Tables 1 to 5 below, respectively.
  • Microbiol., 27: 985-987 a modification of Hungate's method (Hungate, R. E., 1969, Methods Microbiol., 3B: 117-132).
  • Composition NH4Cl , 1.0 g; KCl, 0.1 g; MgSO4.7H2O , 0.2 g; NaCl, 0.8 g; KH2PO4 , 0.1 g; CaCl2 , 0.02 g ; yeast extract, 1.0 g (uracil, 0.01 g, if no yeast extract is added); NaHCO3 , 2.0 g; cysteine hydrochloride, 0.3 g; trace element solution, 10 ml; vitamin solution, 10 ml
  • Preparation procedure The ingredients listed above were mixed, adjusted to pH 6.9 with 5N HCl, and then diluted to 900 mL with ion-exchanged water.
  • the medium was boiled in a water bath for 20 minutes and then cooled in ice for 20 minutes while injecting N2 / CO2 (80:20). This was dispensed in 45 mL aliquots into 125 mL vials previously filled with N2 / CO2 (80:20), and N2 / CO2 (80:20) was injected for 3 minutes. The vials were then sealed with butyl rubber stoppers and aluminum seals and autoclaved (121°C, 15 minutes).
  • composition 2.0 g of nitrilotriacetic acid (nitrilotriacetic acid was dissolved and then adjusted to pH 6.0 with KOH ); 1.0 g of MnSO4.H2O ; 0.8 g of Fe( SO4 ) 2 ( NH4 ) 2.6H2O ; 0.2 g of CoCl2.6H2O; 0.2 mg of ZnSO4.7H2O; 20.0 mg of CuCl2.2H2O ; 20.0 mg of NiCl2.6H2O ; 20.0 mg of Na2MoO4.2H2O ; 20.0 mg of Na2SeO4 ; and 20.0 mg of Na2WO4 .
  • composition Biotin 2.0 mg; Folic acid 2.0 mg; Pyridoxine hydrochloride 10.0 mg; Thiamine HCl 5.0 mg; Riboflavin 5.0 mg; Nicotinic acid 5.0 mg; Calcium D-(+)-Pantothenic acid 5.0 mg; Vitamin B12 0.1 mg; p-Aminobenzoic acid 5.0 mg; Thioctic acid 5.0 mg
  • Fructose was mixed with ion-exchanged water to a concentration of 200 g/L, dispensed into vials, and boiled for 20 minutes. The vials were then cooled on ice for 20 minutes while injecting N2 gas, and then sealed with butyl rubber stoppers and aluminum caps. The vials were then autoclaved (121°C, 15 minutes) and stored at room temperature. When transforming and pre-culturing Moorella bacteria using fructose as a substrate, 1/100 of the fructose was added to the medium.
  • N2 was then injected for another 3 minutes, after which the vials were sealed with butyl rubber stoppers and aluminum caps. After autoclaving (121°C, 15 minutes), the vials were stored at room temperature, protected from light. One or two drops of this mixture were added to the culture medium.
  • Uracil 300 mg was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) (30 mL). The solution was transferred to a vial, sealed with a butyl rubber stopper and an aluminum cap, and stored at room temperature in a dark environment. The uracil solution was added in an amount of 1/1000 of the medium only when culturing a uracil-requiring mutant strain ( ⁇ pyrF strain).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • PIPES piperazine-1,2-bis[2-ethanesulfonic acid]
  • the equipment used in this embodiment is as follows: Incubator BR-43FH (Taitec): Shaking culture (55°C, 180 rpm) TVA660DA (Advantech): static culture (55°C) IS-61 (Yamato Scientific): static culture (37°C) Centrifuge MX300 (Tomy Seiko) Centrifuge 5410 (Eppendorf) Absorption photometer Ultrospec 3300 pro (Amersham Biosciences): for measuring bacterial concentration pH meter F-21 (Horiba): electrode CM057-BNC (CEMCO) PCR device PC808 (Astec) GeneAmp PCR System 2400 (PerkinElmer)
  • the HPLC system is as follows: A PU-2080 Plus (HPLC pump), RI-2031 Plus (RI detector), CO-2065 Plus (column oven), and AS-2057 Plus (autosampler) were used (all manufactured by JASCO).
  • the mobile phase was 0.1% (v/v) H 3 PO 4 , and was run at a flow rate of 0.7 mL/min.
  • An RSpak KC-811 (Shodex) was used as the separation column.
  • An RSpak KC-G (Shodex) was installed in front of the separation column as a guard column.
  • the column oven temperature was set to 60°C.
  • the sample supernatant was mixed with 0.2% (v/v) H 3 PO 4 containing 20 mM crotonic acid as an internal standard at a 1:1 ratio, and the mixture was filtered through a 0.20 ⁇ m cellulose acetate hydrophilic filter (Dismic®-13CP) before measurement.
  • the injection volume of the autosampler was 10 ⁇ L.
  • E. coli was cultured in LB medium at 37° C. Plates containing kanamycin (50 ⁇ g/mL) were used to screen for kanamycin-resistant strains, and plates containing chloramphenicol (10 ⁇ g/mL) were used to screen for chloramphenicol-resistant strains.
  • Competent cells for heat shock transformation were prepared according to the Inoue method (Inoue et al., 1990, Gene 96: 23-28) as follows: First, E. coli was spread onto LB medium containing agar and cultured overnight at 37°C. The resulting single colony was inoculated into 2xYT medium (5 mL) and cultured with shaking (37°C, 280 rpm) for 6 to 8 hours. The resulting culture (2 mL) was then inoculated into SOB medium (100 mL) and cultured with shaking (18°C, 120 rpm) until an OD600 of approximately 0.55 was reached.
  • the resulting culture was dispensed into 50 mL aliquots and allowed to stand on ice for 10 minutes. After 10 minutes, the mixture was centrifuged (2500 x g, 4°C), the supernatant was removed, and the bacterial pellet was gently suspended in ice-cold Inoue transformation buffer (16 mL) by tapping. After suspension, the mixture was left to stand on ice for 10 minutes and centrifuged (2500 x g, 4°C). After centrifugation, the supernatant was removed, and the bacterial pellet was gently suspended in ice-cold Inoue transformation buffer (4 mL) by tapping.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • 300 ⁇ L DMSO (dimethyl sulfoxide) (300 ⁇ L) was added and mixed, and then appropriate amounts were dispensed and flash-frozen in liquid nitrogen.
  • the prepared competent cells were stored at -80°C. Competent cells for transformation by electroporation were prepared by culturing the bacterial cells in the same manner as above, washing them twice with sterile water, and then suspending them in an amount of 10% glycerol equal to the bacterial cell volume.
  • the prepared competent cells were stored at -80°C.
  • Plasmid construction Plasmids were constructed using artificial gene synthesis and cloning (GENEWIZ) or PCR (KOD FX Neo, TOYOBO) amplification followed by ligation of DNA fragments using the In-Fusion method (In-Fusion HD Cloning Kit, Takara Bio Inc.) and transformation of Escherichia coli HST08 strain. The protocol followed the accompanying manual. The resulting DNA constructs were confirmed to be free of PCR errors by Sanger sequencing. The construction of the two plasmids pHM62 and pHM75 used to transform M. thermoacetica is described below.
  • Plasmid pHM62 The endogenous phosphoacetyltransferase expression gene (pduL2) of M. thermoacetica was disrupted, and the T. saccharolyticum-derived genes adhE and adhA (gene numbers adhE and adhA are Tsac_0416 and Tsac_2087, respectively) were introduced into the plasmid pHM62 by the following procedure.
  • AdhE was modified to incorporate a single amino acid substitution, G544D, during protein translation, and to add a strep II tag to the N-terminus.
  • Template DNA (plasmid pHM59) containing the adhE and adhA genes was prepared by artificial gene synthesis, with the base sequence codon-optimized for optimal expression in M. thermoacetica. Using plasmid pHM59 as a template and primers JK215 and JK216, a DNA fragment containing the adhE and adhA genes was amplified by PCR.
  • PCR was performed to amplify the sequences approximately 1 kbp upstream and downstream of pduL2, as well as the pyrF marker, linked to the pK18mob vector.
  • pHM62 was constructed by combining and cloning the two DNA fragments obtained by PCR using the in-fusion method.
  • SEQ ID NO: 1 shows the insert sequence (7,049 bp) of the pHM62 plasmid. pHM62 disrupts pduL2 and inserts adhA and mutant adhE.
  • pyrF is located at 1164-1922
  • mutant adhE is located at 2191-4806, and adhA is located at 4837-6036.
  • Plasmid pHM75 used for transformation was constructed through multi-step plasmid DNA construction as described below.
  • the pduL1 gene was disrupted, and instead, a DNA sequence in which cpI and two ferredoxin genes were arranged as a synthetic operon under the control of the G3PD promoter was introduced together with the kanamycin resistance gene htk under the control of the G3PD promoter.
  • cpI is derived from C. pasteurianum and has the gene number CPAST_c00280.
  • the two ferredoxin genes fd are also derived from C. pasteurianum and have the gene numbers CPAST_c01220 and CPAST_c14230, respectively. All of the introduced genes were codon-optimized for expression in M. thermoacetica.
  • pHM14 was obtained by cloning the hydrogenase cpII gene (derived from C. pasteurianum, gene number CPAST_c33960) that had been codon-optimized for expression in M. thermoacetica and synthesized by artificial gene synthesis.
  • pHM14 as a template and JK67 and JK68 as a primer set
  • a DNA fragment to be used as an insert was amplified by PCR.
  • a DNA fragment to be used as a plasmid vector was amplified by PCR using pK18-d0940-kan as a template and JK58 and JK59 as a primer set.
  • pHM9 (2-2) Construction of pHM9 Using pHM8 as a template and JK95 and JK96 as a primer set, a DNA fragment to be used as an insert was amplified by PCR. Using pK18-dpyrF as a template and JK97 and JK98 as a primer set, a DNA fragment to be used as a plasmid vector was amplified by PCR. These two DNA fragments were ligated using the in-fusion method and cloned to construct pHM9.
  • pHM33 (2-3) Construction of pHM33 Using the chromosomal DNA of M. thermoacetica as a template and primers JK56 and JK100, a region containing the hydrogenase gene hydABC was amplified by PCR to obtain a DNA fragment to be used as an insert. Using pHM9 as a template and JK59 and JK97 as a primer set, a DNA fragment to be used as a plasmid vector was amplified by PCR. These two DNA fragments were ligated using the in-fusion method and cloned to construct pHM33.
  • pHM40 (2-4) Construction of pHM40 Using pHM26, which was obtained by cloning an artificially synthesized kanamycin resistance gene htk, as a template and JK131 and JK132 as a primer set, a DNA fragment to be used as an insert was amplified by PCR. DNA to be used as a plasmid vector was amplified by PCR using pK18-kan2 as a template and JK52 and JK71 as a primer set. These two DNA fragments were ligated using the in-fusion method and cloned to construct pHM40.
  • pHM55 (2-5) Construction of pHM55 Using pHM40 as a template and JK9 and JK207 as a primer set, a region containing the kanamycin gene htk was amplified by PCR to obtain a DNA fragment to be used as an insert. A DNA fragment to be used in a plasmid vector was amplified by PCR using pHM33 as a template and JK200 and JK206 as a primer set. These two DNA fragments were ligated using the in-fusion method and cloned to construct pHM55.
  • pHM52 A DNA fragment containing two ferredoxin genes was amplified as follows. PCR was performed using pHM27 containing artificially synthesized fd(CPAST_c14230) as a template and JK141 and JK186 as a primer set. Furthermore, PCR was performed using pHM28 containing artificially synthesized fd (CPAST_c01220) as a template and JK142 and JK188 as a primer set. Furthermore, a DNA fragment to be used in a plasmid vector was amplified by PCR using pK18- ⁇ pduL1-kan as a template and JK187 and JK189 as a primer set. The above three DNA fragments were ligated and cloned using the in-fusion method to construct pHM52.
  • pHM57 (2-7) Construction of pHM57 Using pHM29, which was artificially synthesized and contained a cpI gene with a strepII tag attached to the C-terminus, as a template and JK138 and JK198 as a primer set, a DNA fragment to be used as an insert was amplified by PCR. A DNA fragment to be used as a plasmid vector was amplified by PCR using pHM52 as a template and JK101 and JK197 as a primer set. These two DNA fragments were ligated using the in-fusion method and cloned to construct pHM57.
  • pHM66 (2-8) Construction of pHM66 Using pHM57 as a template and JK224 and JK225 as a primer set, a DNA fragment to be used as an insert was amplified by PCR. Using pHM55 as a template and JK59 and JK97 as a primer set, a DNA fragment to be used as a plasmid vector was amplified by PCR. These two DNA fragments were ligated using the in-fusion method and cloned to construct pHM66.
  • pHM75 Using pHM66 as a template and JK251 and JK252 as a primer set, a DNA fragment to be used as an insert was amplified by PCR. A DNA fragment containing the plasmid vector was amplified by PCR using pK18- ⁇ pduL1-kan as a template and JK249 and JK250 as a primer set. These two DNA fragments were ligated and cloned using the in-fusion method to construct pHM75.
  • the insert sequence (5,760 bp) of the pHM75 plasmid is shown in SEQ ID NO: 2. pHM75 disrupts pduL1 and introduces cpI and two ferredoxin genes. In SEQ ID NO: 2, htk is located at 1308-2069, cpI at 2389-4143, and the two ferredoxin genes are located at 4195-4503 and 4534-4704, respectively.
  • Transformation of M. thermoacetica was carried out according to the method established by Kita et al., 2013, J. Biosci. Bioeng. 115(4):347-352.
  • the constructed plasmids pHM62 and pHM75 were introduced into Escherichia coli Top10 by electroporation together with the plasmid pBAD1281, which contained the DNA methylase gene of M. thermoacetica (ATCC39073 strain).
  • DNA methylated to the M. thermoacetica (ATCC39073 strain) type was obtained by preparing DNA from this E. coli.
  • the ⁇ pyrF strain was used as the host because uracil auxotrophy was used as a marker.
  • the strain was cultured at 55°C in a medium containing fructose as a carbon source at a final concentration of 11 mM until the absorbance (OD) reached approximately 0.3 to 0.6. Transformation was performed by adding 5-10 ⁇ g of the pHM62 plasmid.
  • the pduL2 region of the transformed clones was amplified by PCR, and a significant change in size was confirmed as a result of gene transfer.
  • the resulting HMC40 strain was further used as a host for constructing the HMC53 strain.
  • the HMC40 strain was similarly transformed with the pHM75 plasmid, and clones were selected based on kanamycin resistance (250 ⁇ g/ml). DNA amplification of the pduL1 region was performed by PCR, and a significant change in size was confirmed as a result of gene introduction. Thus, the target HMC53 strain was obtained.
  • the HMC71 strain was obtained by the same procedure as for the HMC53 strain, except that the plasmid pK18- ⁇ pduL1-kan was used instead of the plasmid pHM75.
  • Fermentation production tests were conducted using the obtained HMC53 strain, using CO or syngas (a mixture of CO and H2 ) as the raw material.
  • 50 ml of Moorella basal medium was placed in a 125 ml glass vial and cultured in a sealed state with a butyl stopper.
  • the partial pressure of CO gas was 0.04 MPa.
  • Culture was performed at 55°C with shaking.
  • the amount of ethanol and acetic acid produced was measured by collecting the medium and using HPLC.
  • the HMC53 strain produced ethanol while growing ( Figures 5 to 8). In both cases, only ethanol was produced, with no acetic acid produced at all while the bacterial cells were growing. The highest ethanol production at growth halt was 5.3 mM when the gas mixture ratio CO:H 2 was 1:1. As the culture continued, the production rate decreased, but ethanol production increased, reaching 6.6 mM. During this period, only 0.5 mM acetic acid was produced. A similar production pattern was observed with other gas mixture ratios. The small amount of acetic acid produced is thought to be due to the existence of an endogenous acetic acid production pathway in addition to the pathway using the enzymes PduL2 and PduL1, which is the main endogenous acetic acid production pathway.
  • Non-Patent Document 1 when the pduL2 and pduL1 genes were disrupted, the recombinant bacteria were unable to grow and no ethanol was produced. However, in each of the above examples, it was found that the recombinant bacteria were able to grow and produce almost exclusively ethanol from gas feedstock.
  • the recombinant bacterium according to the present invention can produce ethanol from carbon sources such as CO and CO . This is preferable because ATP production is ensured and ethanol can be produced more efficiently.
  • HMC71 strain 5 ml of cells precultured with fructose was inoculated into 45 ml of Moorella basal medium and cultured with shaking at 55°C. The resulting culture was cultured with shaking in Moorella basal medium in a large 800 ml vial filled with 1 bar of N 2 -CO 2 (80:20) and 0.4 bar each of CO 2 and H 2 .
  • the bacterial mass (OD600), fructose and product concentrations in the medium, headspace gas ratio in the vial (by gas chromatography), and total pressure were measured over time.
  • the HMC71 strain also grew using CO as a carbon and energy source and produced ethanol.

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Abstract

微生物発酵によって、ＣＯまたはＣＯ２といった炭素源を基質としてエタノールを高効率で得られるようにする。本発明の組換え細菌は、炭素源から中間体としてのアセチル‐ＣｏＡを経て酢酸を生成する代謝経路を有する好熱性酢酸生成菌由来の組換え細菌であって、遺伝子工学的手法により前記代謝経路に関わる酵素の少なくとも一部を欠損し、アセチル‐ＣｏＡからアセトアルデヒドを生成する反応を触媒する外来のＮＡＤＰＨ依存型耐熱性酵素、およびアセトアルデヒドからエタノールを生成する反応を触媒する耐熱性酵素を発現しエタノールを生成する。

Description

エタノールを生成する組換え好熱性細菌およびそれを用いたエタノールの製造方法
　本発明は、エタノールを生成する組換え好熱性細菌およびそれを用いたエタノールの製造方法に関し、特に遺伝子工学的手法により代謝経路が改変された好熱性酢酸生成菌およびそれを用いたエタノールの製造方法に関する。
　これまで人類は石炭および石油等の化石資源を消費することによって様々な材料を合成し、この材料を利用することで産業を発達させてきた。しかし、このような化石資源は限りがあり枯渇が懸念されているため、上記材料の代替製法の開発が急務となっている。そこで、上記材料の代替製法の一つとして、遺伝子組換え微生物を利用して、炭素源から有用物質を生成する技術が検討されている。
　特に、Ｈ２、ＣＯおよびＣＯ２などのガス原料を、微生物による発酵法により化合物に変換する技術はガス発酵と呼ばれ、カーボンリサイクルに貢献する技術として期待されている。
　また、エタノールは溶媒および殺菌剤として使われる他、ポリエチレンなどのポリマーの原料ともなる重要な基礎化学品である。現在のエタノール製造は石油化学に依存しているので、上述したように将来的な化石資源の枯渇が懸念されるとともに、ＣＯ２を中心とした温室効果ガスの発生が問題となっている。そのため、ＣＯ２排出量の少ない代替製法が求められている。
　例えば、非特許文献１には、好熱性酢酸生成菌であるモーレラ・サーモアセチカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ　ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）において、遺伝子を操作することで、ガス原料からアセチルＣｏＡを介しエタノールを生成させたことが開示されている。通常、Ｍ．　ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａではホスホトランスアセチラーゼ（ＰＴＡ）がアセチルＣｏＡをアセチルリン酸に変換し、これが酢酸に変換される。この文献では、ＰＴＡを生産する２つの遺伝子ｐｄｕＬ１およびｐｄｕＬ２のうち特にｐｄｕＬ２が、アルデヒドデヒドロゲナーゼを発現する遺伝子に置き換えられることで、酢酸の経路の一部が遮断され、代わりにアセチルＣｏＡをアセトアルデヒドに変換する経路が導入された。このアセトアルデヒドが内在性アルコールデヒドロゲナーゼによってエタノールに変換される。
　非特許文献１の技術では、エタノール生成は可能であるものの、酢酸生成経路の一部を残す必要がある。これは、酢酸生成経路を完全に破壊すると、充分な量のＡＴＰが生成されず、また代謝の酸化還元バランスが崩れるために独立栄養を維持することができないからである。このように従来の技術では原料の一部が目的外の物質である酢酸生成に消費される。また、生産物がエタノールに加えて多くの酢酸を含むので、エタノールの精製に多くの時間、エネルギーおよび設備が必要となる。したがって、工業的な大量生産に適用するためには、この技術には改良の余地がある。
　本発明は、微生物発酵によって、ＣＯまたはＣＯ２等の炭素源を原料としてエタノールを高効率で得られるようにすることにある。
　［１］炭素源から中間体としてのアセチル‐ＣｏＡを経て酢酸を生成する代謝経路を有する好熱性酢酸生成菌由来の組換え細菌であって、
　遺伝子工学的手法により前記代謝経路に関わる酵素の少なくとも一部を欠損し、
　アセチル‐ＣｏＡからアセトアルデヒドを生成する反応を触媒する外来のＮＡＤＰＨ依存型耐熱性酵素、およびアセトアルデヒドからエタノールを生成する反応を触媒する耐熱性酵素、を発現する、エタノールを生成する組換え好熱性細菌。
　［２］前記好熱性酢酸生成菌は、モーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属細菌である、
上記［１］に記載の組換え好熱性細菌。
　［３］欠損している前記酵素はアセチル‐ＣｏＡを基質としてアセチルリン酸を生成する酵素である、
上記［１］または［２］に記載の組換え好熱性細菌。
　［４］前記好熱性酢酸生成菌はモーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属細菌であって、
　欠損している前記酵素はＰｄｕＬ１およびＰｄｕＬ２である、
上記［１］～［３］のいずれか１項に記載の組換え好熱性細菌。
　［５］アセチル‐ＣｏＡからアセトアルデヒドを生成する反応を触媒する外来の前記耐熱性酵素は、ＮＡＤＰＨ依存型アルデヒドデヒドロゲナーゼである、
請求項上記［１］～［４］のいずれか１項に記載の組換え好熱性細菌。
　［６］前記ＮＡＤＰＨ依存型アルデヒドデヒドロゲナーゼはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のＡｄｈＥの５４４番目のグリシンがアスパラギン酸に置換されたＡｄｈＥＧ５４４Ｄである、
上記［５］に記載の組換え好熱性細菌。
　［７］アセトアルデヒドからエタノールを生成する反応を触媒する前記耐熱性酵素は、ＮＡＤＰＨ依存型アルコールデヒドロゲナーゼである、
上記［１］～［６］のいずれか１項に記載の組換え好熱性細菌。
　［８］前記ＮＡＤＰＨ依存型アルコールデヒドロゲナーゼは、モーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属細菌由来の酵素、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のＡｄｈＥの５４４番目のグリシンがアスパラギン酸に置換されたＡｄｈＥＧ５４４Ｄ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のＡｄｈＡの少なくとも一方である、
上記［７］に記載の組換え好熱性細菌。
　［９］受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０４２９７として寄託された、
上記［１］～［８］のいずれか１項に記載の組換え好熱性細菌。
　［１０］前記代謝経路とは異なる経路でＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を補助する外来の耐熱性酵素をさらに発現する、
上記［１］～［９］のいずれか１項に記載の組換え好熱性細菌。
　［１１］前記代謝経路とは異なる経路でＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を補助する外来の前記耐熱性酵素は、フェレドキシンヒドロゲナーゼである、
上記［１０］に記載の組換え好熱性細菌。
　［１２］前記フェレドキシンヒドロゲナーゼは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ由来のＣｐＩである、
上記［１１］に記載の組換え好熱性細菌。
　［１３］Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ由来のフェレドキシンをさらに発現する、
上記［１１］に記載の組換え好熱性細菌。
　［１４］受託番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０４０８２として寄託された、
上記［１１］に記載の組換え好熱性細菌。
［１５］ＣＯの存在下、またはＣＯおよびＣＯ２の両方の存在下で上記［１］～［１４］のいずれか一項に記載の組換え好熱性細菌を培養することでエタノールを生成するステップを備える、エタノールの製造方法。
［１６］前記組換え好熱性細菌を培養することでエタノールを生成するステップは、さらにＨ２の存在下で行われる、
上記［１５］に記載のエタノールの製造方法。
［１７］前記エタノールを生成するステップは、前記組換え好熱性細菌を５５℃～６５℃で培養することを含む、
上記［１５］に記載のエタノールの製造方法。
　本発明に係るエタノールを生成する組換え好熱性細菌およびそれを用いたエタノールの製造方法によると、微生物発酵によって、ＣＯ、Ｈ２またはＣＯ２といったガス基質からエタノールを高効率で得ることができる。
図１は、好熱性酢酸生成菌に内在する、酢酸を生成する代謝経路を示す図である。 図２は、組換え細菌に導入されるエタノール合成経路を示す図である。 図３は、内在のホスホアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐｄｕＬ２）を破壊し、エタノール合成酵素の遺伝子（ａｄｈＥ　Ｇ５４４ＤおよびａｄｈＡ）を導入するプラスミドｐＨＭ６２の構造を示す図である。 図４は、内在のホスホアセチルトランスフェラーゼ遺伝子（ｐｄｕＬ１）を破壊し、ヒドロゲナーゼ遺伝子（ｃｐＩ）およびフェレドキシン遺伝子（ｆｄ）を導入するプラスミドｐＨＭ７５の構造を示す図である。 ＣＯガス中で培養したときの組換え細菌ＨＭＣ５３株の量、並びにエタノールおよび酢酸の生成量の経時的変化を示すグラフである。 ＣＯおよびＨ２をＣＯ：Ｈ２＝１：１の分圧比で有する合成ガス中で培養したときの組換え細菌ＨＭＣ５３株の量、並びにエタノールおよび酢酸の生成量の経時的変化を示すグラフである。 ＣＯおよびＨ２をＣＯ：Ｈ２＝１：２の分圧比で有する合成ガス中で培養したときの組換え細菌ＨＭＣ５３株の量、並びにエタノールおよび酢酸の生成量の経時的変化を示すグラフである。 ＣＯおよびＨ２をＣＯ：Ｈ２＝１：４の分圧比で有する合成ガス中で培養したときの組換え細菌ＨＭＣ５３株の量、並びにエタノールおよび酢酸の生成量の経時的変化を示すグラフである。 Ｎ２およびＣＯ２をＮ２：ＣＯ２＝８０：２０の分圧比で有するヘッドスペースガスにＣＯおよびＨ２を０．４ｂａｒずつ充填した雰囲気中で、フルクトース含有培地において前培養した組換え細菌ＨＭＣ７１株の量の経時的変化を示すグラフである。 図１０は、図９と同条件で組換え細菌ＨＭＣ７１株を培養したときの、基質であるフルクトース、並びに生産物であるエタノールおよび酢酸の培地中における濃度、並びにガス中のＣＯの割合の経時的変化を示すグラフである。 図９と同条件で組換え細菌ＨＭＣ７１株を培養したときの、ＣＯ、ＣＯ２、Ｈ２のヘッドスペースＮ２基準ガス割合と、全圧（ｂａｒ）の経時的変化を示すグラフである。
　以下、本発明を実施するための形態を図面に基づいて説明する。以下の好ましい実施形態の説明は、本質的に例示に過ぎず、本発明、その適用方法或いはその用途を制限することを意図するものではない。
　＜組換え細菌＞
　本発明の一実施形態の組換え細菌は、炭素源から中間体としてのアセチル‐ＣｏＡを経て酢酸を生成する代謝経路を有する好熱性酢酸生成菌に由来する。組換え細菌は、遺伝子工学的手法により前記代謝経路に関わる酵素の少なくとも一部を欠損する。さらに、組換え細菌は、アセチル‐ＣｏＡからアセトアルデヒドを生成する反応を触媒する外来のＮＡＤＰＨ依存型耐熱性酵素、およびアセトアルデヒドからエタノールを生成する反応を触媒する耐熱性酵素を発現する。この組換え細菌はエタノールを生成することができる。
　好熱性酢酸生成菌とは、至適生育温度が４５℃以上であり、基質から酢酸を生成する細菌である。本実施形態の好熱性酢酸生成菌は、炭素源として、ＣＯおよびＣＯ２の少なくとも一方のガス基質を利用して酢酸を生成することができる。好熱性酢酸生成菌は炭素源としてさらに糖などの有機物を炭素源として利用することができてもよい。本実施形態の組換え細菌の親細菌としての好熱性酢酸生成菌は、炭素源から中間体としてのアセチル‐ＣｏＡを経て酢酸を生成する代謝経路を有するものであれば、特に限定はされない。好熱性酢酸菌は、細菌に限らず古細菌であってもよく、モーレラ属細菌であることが好ましい。好熱性酢酸菌の例として、モーレラ・サーモアセチカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ　ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）およびモーレラ・サーモオートトロフィカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ　ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）が挙げられる。モーレラ属細菌以外の例としては、サーモアナエロバクター・キヴイ（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ　ｋｉｖｕｉ）が挙げられ、古細菌の例としてはアルカエオグロブス・フルギダス（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ　ｆｕｌｇｉｄｕｓ）が挙げられる。
　組換え細菌は、アセチル‐ＣｏＡを経て酢酸を生成する代謝経路に関わる酵素を欠損していればよく、欠損する酵素は具体的なものに限定されない。また、この代謝経路にかかわる酵素の少なくとも一部の発現が欠損していればよい。組換え細菌では、この欠損により、酢酸の生成量が低減してもよいし、酢酸生成が完全に遮断されてもよい。
　好熱性酢酸生成菌がアセチル‐ＣｏＡから酢酸を生成するまでの代謝経路として、図１に示す経路が知られている。図１に示すように、好熱性酢酸生成菌は、炭素源から種々の酵素の作用によりアセチル‐ＣｏＡを生成し（この生成経路の図示および説明は省略する）、アセチル‐ＣｏＡからＣｏＡを脱離させると共にリン酸を付加させることでアセチルリン酸を生成し、さらにアセチルリン酸のリン酸を脱離させて酢酸を生成する。
　組換え細菌において欠損している前記酵素は、アセチル‐ＣｏＡを基質としてアセチルリン酸を生成する酵素であるホスホアセチルトランスフェラーゼであることが好ましい。モーレラ属は、２つの内在性ホスホアセチルトランスフェラーゼＰｄｕＬ１およびＰｄｕＬ２を有しており、組換え細菌ではこれら酵素の両方が欠損していることが好ましい。２つのホスホアセチルトランスフェラーゼのいずれもが欠損することで、酢酸の生成量を著しく低下させることができ、エタノールを効率よく生成することができる。
　外来の耐熱性酵素は、好熱性酢酸生成菌の生育温度で機能することが好ましい。耐熱性酵素は、好熱性細菌由来であることが好ましいが、酵素自体が耐熱性であれば特に限定されない。耐熱性酵素は、具体的には４５℃以上で機能することが好ましく、５５℃以上で機能することがより好ましい。
　アセチル‐ＣｏＡからアセトアルデヒドを生成する反応を触媒する外来の耐熱性酵素としては、ＮＡＤＰＨ依存型アルデヒドデヒドロゲナーゼが好ましい。ＮＡＤＰＨ依存型アルデヒドデヒドロゲナーゼはサーモアナエロバクテリウム由来であることが好ましく、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼＡｄｈＥの５４４番目のグリシンがアスパラギン酸に置換されたＧ５４４Ｄ変異型であるＡｄｈＥＧ５４４Ｄであることが特に好ましい。
　ＡｄｈＥは、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼの両方の機能を持つ酵素である。野生型はＮＡＤＨ依存型だが、Ｇ５４４Ｄ変異型は、アルデヒドデヒドロゲナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼのいずれとしてもＮＡＤＰＨ型となる。
　また、アセトアルデヒドからエタノールを生成する反応を触媒する耐熱性酵素としては、ＮＡＤＰＨ依存型アルコールデヒドロゲナーゼが好ましい。ＮＡＤＰＨ依存型アルコールデヒドロゲナーゼは、細胞に内在していてもよいし、細胞外から導入されてもよい。例えば、好熱性酢酸菌がモーレラ属細菌である場合、内在するＮＡＤＰＨ依存型アルコールデヒドロゲナーゼを利用することができる。また、発現量を増やす等の目的で、モーレラ属由来のアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子をさらに導入してもよい。あるいは、ＮＡＤＰＨ依存型アルコールデヒドロゲナーゼは、モーレラ属以外に由来する外来の酵素であってもよく、この場合は、サーモアナエロバクテリウム由来であることが好ましい。ＮＡＤＰＨ依存型アルコールデヒドロゲナーゼとしては、例えば、上述のＡｄｈＥＧ５４４Ｄ、およびＴ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のＡｄｈＡの少なくとも一方が用いられる。また、これらの酵素の両方が用いられてもよい。
　以上の酵素が発現することで、組換え細菌では、図２に示すように、アセチルＣｏＡが還元反応によりエタノールに変換される。還元反応を行う酵素は補因子を要し、補因子は生産性に影響する要素の１つである。本発明者らは、化学量論計算による検討を行うことで、ＮＡＤＰＨを補因子として要求する酵素を用いれば、代謝の酸化還元バランスが改善されて高い生産性が得られる可能性を見出した。実際、後述の実施例のとおり、ＮＡＤＰＨを補因子とする酵素を発現することで、組換え細菌は高いエタノール生産性を示した。
　また、図１に示すように、酢酸生成は細胞エネルギーであるＡＴＰの生成と共役するが、エタノール生成は共役しない。したがって、酢酸生成経路である代謝経路が破壊された組換え細菌では、細胞内ＡＴＰ合成量が低下し、エネルギーが不足することがある。よって、組換え細菌において、代謝経路とは異なる経路でＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を補助する外来の耐熱性酵素がさらに発現することが好ましい。そこで、本発明者らは、酢酸の生成を抑制しながらエタノールを高効率で生産させるために、酢酸生成とは異なる経路でＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を補助する外来の耐熱性酵素を細菌に導入し、これによって、ガス基質を資化して生育することが可能であり、かつエタノールを高効率で生産することができる細菌を実現した。
　ＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を補助する耐熱性酵素としては、Ｈ２を使ってフェレドキシンを還元するフェレドキシンヒドロゲナーゼが好ましく、具体的にはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍに由来する酵素ＣｐＩが挙げられる。ＣｐＩはＨ２を酸化し、電子を酸化型フェレドキシンへ渡すことで還元型フェレドキシンを形成する。
　組換え細菌は、フェレドキシンを発現することが好ましい。発現されるフェレドキシンは内在性および外来性のいずれであってもよい。また、組換え細菌は、Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍに由来するフェレドキシンを発現することがさらに好ましい。
　酵素を「欠損」するとは、酵素を発現する遺伝子が欠損している状態を指す。また、外来性酵素を「発現」するとは、外来遺伝子が発現可能な状態で細菌内に「導入」されている状態である、と言い換えられる。
　内在性の酵素を欠損させる手法としては、種々の遺伝子工学的手法を用いることができ、細菌のゲノム上の当該酵素の発現遺伝子を除去するまたは変異させる等により、当該酵素を安定的に発現させないことができれば、特に限定されない。遺伝子工学的手法としては、例えば相同組換えを利用した遺伝子ノックアウト法等を用いることができる。
　また、外来の耐熱性酵素の発現遺伝子を導入する手法としては、種々の遺伝子工学的手法を用いることができ、それらの酵素を安定的に発現できるように細菌内に導入させることができるものであれば特に限定されない。遺伝子工学的手法としては、例えば相同組換えを利用した遺伝子ノックイン法等を用いることができる。例えば、上記アセチル‐ＣｏＡから酢酸を生成するまでの代謝経路に関わる酵素の一部を欠損させるのと同時に外来の耐熱性酵素の発現遺伝子を導入することができる。すなわち、細菌の染色体上において欠損させるためのアセチル‐ＣｏＡから酢酸を生成するための酵素の遺伝子座と外来の耐熱性酵素の発現遺伝子群とを相同組換えすることにより、アセチル‐ＣｏＡから酢酸を生成するまでの代謝経路に関わる酵素の一部を欠損させるのと同時に外来の耐熱性酵素の発現遺伝子を導入することができる。これにより、１度の工程で上記内在性酵素の発現遺伝子の欠損と外来酵素の発現遺伝子の導入とを同時に実行できる。
　組換え細菌としては、例えばＨＭＣ７１株が挙げられる。ＨＭＣ７１株は、Ｍ．　ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａを親株とし、内在性のホスホアセチルトランスフェラーゼであるＰｄｕＬ１およびＰｄｕＬ２の発現遺伝子（ｐｄｕＬ１およびｐｄｕＬ２）が欠損し、かつＴ．　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のアルデヒドデヒドロゲナーゼかつアルコールデヒドロゲナーゼであるＡｄｈＥの５４４番目のグリシンがアスパラギン酸に置換されたＡｄｈＥＧ５４４Ｄの発現遺伝子（ａｄｈＥ　Ｇ５４４Ｄ：ａｄｈＥの遺伝子番号　Ｔｓａｃ＿０４１６）、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のアルコールデヒドロゲナーゼであるＡｄｈＡ（ａｄｈＡ：遺伝子番号　Ｔｓａｃ＿２０８７）が発現可能に導入されている。
　さらにフェレドキシンヒドロゲナーゼが導入された組換え細菌として、例えばＨＭＣ５３株が挙げられる。ＨＭＣ５３株は、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａを親株とし、遺伝子ｐｄｕＬ１およびｐｄｕＬ２が欠損し、遺伝子ａｄｈＥ　Ｇ５４４ＤおよびａｄｈＡが発現可能に導入されている。Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ由来のフェレドキシンヒドロゲナーゼであるＣｐＩの発現遺伝子（ｃｐＩ：遺伝子番号　ＣＰＡＳＴ＿ｃ００２８０）、Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ由来の２種類のフェレドキシンの発現遺伝子（ｆｄ：遺伝子番号　ＣＰＡＳＴ＿ｃ０１２２０およびＣＰＡＳＴ＿ｃ１４２３０）が発現可能に導入されている。
　ＨＭＣ７１株およびＨＭＣ５３株は、下記受託機関に寄託されている。
寄託機関名：独立行政法人　製品評価技術基盤機構　特許微生物寄託センター
連絡先：〒２９２－０８１８　千葉県木更津市かずさ鎌足２－５－８　１２２号室
　また、それぞれの受領番号／受託番号、識別の表示、受託日は以下のとおりである。
　ＨＭＣ７１株：受領番号　ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０４２９７、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ　ＨＭＣ７１、２０２５年２月３日
　ＨＭＣ５３株：受託番号　ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０４０８２、ＨＭＣ５３、２０２４年２月２２日
　ＨＭＣ７１株およびＨＭＣ５３株は、後述の実施例のとおり、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの培養に用いられるＡＴＣＣ１７５４　ＰＥＴＣ培地を改変したもので培養可能であるが、培地はこれに限定されない。
　＜エタノールの製造方法＞
　上述の組換え細菌はエタノールの製造方法に利用可能である。このエタノールの製造方法は、組換え好熱性細菌を培養することでエタノールを生成するステップを備える。培養は、少なくともＣＯの存在下で行われる。また、培養は、ＣＯおよびＣＯ２、ＣＯおよびＨ２、またはＣＯ、ＣＯ２およびＨ２の存在下で行われてもよい。
　組換え細菌は、ＣＯおよびＣＯ２のいずれも炭素源として利用できる。本実施形態において、炭素源としてＣＯおよびＣＯ２の少なくとも一方を含むガスが例示され、より具体的にはＣＯおよびＣＯ２の混合ガスが例示される。ＣＯおよびＣＯ２の混合ガスは、任意の割合で混合したものを用いることができる。例えば、混合ガスは、ＣＯ：ＣＯ２が１：１の比で混合したガスを用いることができるが、これに限定されるものではない。
　なお、必要に応じて、さらなる炭素源として糖を用いることもできる。糖としては、例えばキシロース等の五炭糖を用いることができるし、フルクトース等の六炭糖を用いることもできる。また、糖は五炭糖および六炭糖に限定されるものではない。さらに、糖は、上述した糖を２種類以上含有するものであってもよい。
　組換え細菌は、ＣＯに加えてＨ２の存在下で培養されることが好ましい。組換え細菌はエネルギー源としてＣＯおよびＨ２を利用することができる。なお、Ｈ２の混合割合は、特に限定されるものではない。特に、組換え細菌が外来のフェレドキシンヒドロゲナーゼを発現する場合には、Ｈ２存在下で組換え細菌を培養することで、より効率のよいエタノール生成が可能となる。
　また、組換え細菌の培養は、可能な限り高い効率でエタノールを生成させるために、当該細菌の至適生育温度で行われることが好ましく、モーレラ属細菌を用いる場合、５５℃～６５℃で培養することが好ましい。
　本実施形態に係る方法において、上記細菌の培養によってエタノールを生成した後に、当該エタノールを回収するステップをさらに備えていることが好ましい。エタノールを回収するステップは、他の成分からエタノールを分離して、純度が高いエタノールを得ることができる方法であれば特に限定されない。例えば、エタノールの沸点が７８℃であり、副生成物である酢酸の沸点が１１８℃であるため、蒸留を採用することができる。また、ガスストリッピングを採用することもできる。このようにすると、エタノールによる生産物阻害を回避することができ、上記細菌によるエタノールの生産効率が向上する。なお、ガスストリッピングは、例えばK. Inokuma, et al.: J. Biosci. Bioeng., 110, 696 (2010)に開示されるようなガスストリッピング装置および条件を採用することができるが、これに限定されるものではない。
　以下に、本発明に係るエタノールを生成する組換え好熱性細菌およびそれを用いたエタノールの製造方法について詳細に説明するための実施例を示す。
　［使用菌株、プラスミドおよびプライマー］
　本実施例で使用した菌株、プラスミドおよびＰＣＲプライマーをそれぞれ下記表１～表５に示す。
　［基本培地および基本溶液の調製］
　（モーレラ属細菌用基本培地の調製）
　本実施例では、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｌｊｕｎｇｄａｈｌｉｉの培養に用いられるＡＴＣＣ　１７５４　ＰＥＴＣ培地を改変したものを基本培地として用いた。改変として、塩酸システイン・一水和物の最終濃度を１．２ｇ／Ｌに減らし、Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏを除いた。培地の作製において、還元剤（システインおよびＴｉ（ＩＩＩ）クエン酸）および基質（フルクトース等）は別に調製した。嫌気的に培地を調製する方法として、Ｈｕｎｇａｔｅの方法（Hungate, R. E., 1969, Methods Microbiol., 3B: 117-132）を改変したＭｉｌｌｅｒらの方法（Miller, T. L. et al., 1974, Appl. Microbiol., 27: 985-987）を用いた。
　組成：ＮＨ４Ｃｌ、１．０ｇ；ＫＣｌ、０．１ｇ；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ；ＮａＣｌ、０．８ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．１ｇ；ＣａＣｌ２、０．０２ｇ；酵母エキス、１．０ｇ（酵母エキス無添加の場合　ウラシル　０．０１ｇ）；ＮａＨＣＯ３、２．０ｇ；システイン塩酸塩、０．３ｇ；微量元素溶液、１０ｍｌ；ビタミン溶液、１０ｍｌ
　調製手順：上記組成に挙げた成分を混合し、５Ｎ　ＨＣｌでｐＨ６．９に調整後、イオン交換水で９００ｍＬにメスアップした。培地を湯浴でボイル（２０分間）した後、Ｎ２／ＣＯ２（８０：２０）を注入しながら氷中で冷却（２０分間）した。これを予めＮ２／ＣＯ２（８０：２０）を注入しておいた１２５ｍＬバイアル瓶に４５ｍＬずつ分注し、Ｎ２／ＣＯ２（８０：２０）を３分間注入した。その後、バイアル瓶をブチルゴム栓およびアルミシールで密閉して、オートクレーブ（１２１℃、１５分）した。
　（微量元素溶液の調製）
　イオン交換水に以下の組成に挙げる成分を溶解後、１Ｌにフィルアップした。得られた溶液を遮光し４℃で保存した。
　組成：ニトリロトリ酢酸（ニトリロトリ酢酸を溶解させた後、ＫＯＨでｐＨ６．０に調整）２．０ｇ；ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ　１．０ｇ；Ｆｅ（ＳＯ４）２（ＮＨ４）２・６Ｈ２Ｏ　０．８ｇ；ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　０．２ｇ；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ　０．２ｍｇ；ＣｕＣｌ２・２Ｈ２Ｏ　２０．０ｍｇ；ＮｉＣｌ２・６Ｈ２Ｏ　２０．０ｍｇ；Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ　２０．０ｍｇ；Ｎａ２ＳｅＯ４　２０．０ｍｇ；Ｎａ２ＷＯ４　２０．０ｍｇ
　（ビタミン溶液の調製）
　イオン交換水に以下の組成に挙げる成分を溶解後、１Ｌにフィルアップした。得られた溶液は遮光し４℃で保存した。
　組成：ビオチン　２．０ｍｇ；葉酸　２．０ｍｇ；ピリドキシン塩酸塩　１０．０ｍｇ；チアミン・ＨＣｌ　５．０ｍｇ；リボフラビン　５．０ｍｇ；ニコチン酸　５．０ｍｇ；カルシウム　Ｄ－（＋）－パントテン酸　５．０ｍｇ；ビタミンＢ１２　０．１ｍｇ；ｐ－アミノ安息香酸　５．０ｍｇ；チオクト　酸５．０ｍｇ
　（フルクトース溶液（２００ｇ／Ｌ）の調製）
　フルクトースをイオン交換水と混合して２００ｇ／Ｌの濃度で調製し、バイアル瓶に分注した後、２０分間ボイルした。その後、Ｎ２ガスを注入しながら氷冷し２０分間冷却後、ブチルゴム栓およびアルミキャップで密閉した。その後、オートクレーブ（１２１℃、１５分）を行った後、室温保存した。モーレラ属細菌の形質転換および前培養にてフルクトースを基質とした培養を行う場合、培地に１／１００量添加した。
　（還元剤システイン（６０ｇ／Ｌ）の調製）
　Ｌ－システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏをイオン交換水と混合して６０ｇ／Ｌの濃度で調製し、バイアル瓶に分注した後、２０分間ボイルした。その後、Ｎ２ガスを注入しながら氷冷し２０分間冷却後、ブチルゴム栓およびアルミキャップで密閉した。その後、オートクレーブ（１２１℃、１５分）を行った後、遮光し室温保存した。培地使用前に１／５０量を添加した。
　（還元剤Ｔｉ（ＩＩＩ）クエン酸溶液の調製）
　イオン交換水にクエン酸ナトリウム二水和物（１１．７６ｇ）を加えて、２００ｍＬにメスアップした。２０分間ボイルして脱気後、Ｎ２を注入しつつ氷中で２０分間冷却した。その後、２０％塩化チタン（ＩＩＩ）水溶液（ナカライテスク）（１０．６ｍＬ）を混合し、湯煎で沈殿を溶解させた飽和炭酸ナトリウム水溶液でｐＨ６．０に調整後、予めＮ２を注入しておいた１２５ｍＬバイアル瓶に８０ｍＬずつ分注した。さらにＮ２を３分間注入した後、ブチルゴム栓およびアルミキャップで密閉した。オートクレーブ（１２１℃、１５分）後に遮光し室温保存した。これを培地に対して１、２滴添加した。
　（ウラシル溶液（１０ｍｇ／ｍＬ）の調製）
　ウラシル（３００ｍｇ）をジメチルスルホオキシド（ＤＭＳＯ）（３０ｍＬ）に溶解した。バイアル瓶に移し、ブチルゴム栓およびアルミキャップで密閉、遮光し室温保存した。ウラシル溶液は、ウラシル要求性変異株（ΔｐｙｒＦ株）培養時のみ培地に対して１／１０００量を添加した。
　（モーレラ属細菌用エレクトロポレーション・バッファーの調製）
　スクロースおよびグリセロールをミリＱ水に溶解し、２５０ｍＭ溶液を調製した。２０分間ボイルして脱気後、Ｎ２を注入しつつ氷中で２０分間冷却した。ブチルゴム栓およびアルミキャップで密閉し、オートクレーブ（１２１℃、１５分）後に室温保存した。
　（大腸菌培養用ＬＢ培地の作製）
　１０ｇのトリプトン（ナカライテスク）、５ｇの酵母エキス（ナカライテスク）、１０ｇのＮａＣｌを１０００ｍＬのイオン交換水に溶かしてオートクレーブした。プレート作製時には寒天末を１．５％添加した。
　（Ｉｎｏｕｅトランスフォーメーションバッファーの調製）
　まず以下の手順で、０．５Ｍ ＰＩＰＥＳ（ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅ－１，２－ｂｉｓ［２－ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ］）を準備した。ＰＩＰＥＳ（１５．１ｇ）をミリＱ水（８０ｍＬ）に溶解し、５Ｎ ＫＯＨを用いてｐＨを６．７に調整後、ミリＱ水で１００ｍＬにメスアップした。その後、０．４５μｍフィルターで濾過滅菌し、－２０℃で保存した。次に、以下の試薬をミリＱ水（８００ｍＬ）に溶解して、Ｉｎｏｕｅトランスフォーメーションバッファーを調製した。１０．８８ｇのＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ、２．２０ｇのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１８．６５ｇのＫＣｌを溶解後、０．５Ｍ　ＰＩＰＥＳ（２０ｍＬ）を添加し、ミリＱ水で１０００ｍＬにメスアップした。その後、０．４５μｍフィルターで濾過滅菌し、－２０℃で保存した。
　（２×ＹＴ培地の作製）
　１６ｇのトリプトン（ナカライテスク）、１０ｇの酵母エキス（ナカライテスク）、５ｇのＮａＣｌを１０００ｍＬのイオン交換水に溶かしてオートクレーブした。プレート作成時には寒天末を１％添加した。
　（ＳＯＢ培地の作製）
　９５０ｍＬのイオン交換水に対して、２０ｇのトリプトン（ナカライテスク）、５ｇの酵母エキス（ナカライテスク）、０．５ｇのＮａＣｌ、および１０ｍＬの２５０ｍＭ ＫＣｌを溶解後、ｐＨを７．０に調整し、イオン交換水で１０００ｍＬにメスアップした。オートクレーブ後、使用直前にオートクレーブ滅菌した２Ｍ ＭｇＣｌ２（５ｍＬ）を添加した。
　［使用機器］
　本実施形態において使用した機器は以下のとおりである。
　インキュベーター
　　ＢＲ－４３ＦＨ（タイテック）：振とう培養（５５℃、１８０ｒｐｍ）
　　ＴＶＡ６６０ＤＡ（アドバンテック）：静置培養（５５℃）ｌｋｊ
　　ＩＳ－６１（ヤマト科学）：静置培養（３７℃）
　遠心分離機
　　ＭＸ３００（トミー精工）
　　Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ　５４１０（エッペンドルフ）
　吸光光度計
　　Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ　３３００　ｐｒｏ（アマシャムバイオサイエンス）：菌体濃度測定
　ｐＨメーター　Ｆ－２１（堀場製作所）：電極はＣＭ０５７－ＢＮＣ（ＣＥＭＣＯ）を使用
　ＰＣＲ装置ＰＣ８０８（アステック）ＧｅｎｅＡｍｐ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ　２４００（パーキンエルマー）
　ＨＰＬＣのシステムは、以下のとおりである。
　ＰＵ－２０８０　Ｐｌｕｓ（ＨＰＬＣポンプ）、ＲＩ－２０３１　Ｐｌｕｓ（ＲＩディテクター）、ＣＯ－２０６５　Ｐｌｕｓ（カラムオーブン）、ＡＳ－２０５７　Ｐｌｕｓ（オートサンプラー）を用いた（いずれもＪＡＳＣＯ）。移動相は０．１％（ｖ／ｖ）Ｈ３ＰＯ４を用い、０．７ｍＬ／分の流速で流した。分離カラムには、ＲＳｐａｋ ＫＣ－８１１（Ｓｈｏｄｅｘ）を用いた。また、ガードカラムとして、ＲＳｐａｋ ＫＣ－Ｇ（Ｓｈｏｄｅｘ）を分離カラムの前に設置した。カラムオーブンの温度は、６０℃に設定した。測定時にはサンプルの上清に、内部標準として２０ｍＭのクロトン酸を含む０．２％（ｖ／ｖ）Ｈ３ＰＯ４を１：１で混合し、酢酸セルロース親水性フィルター０．２０μｍ（Ｄｉｓｍｉｃ（登録商標）－１３ＣＰ）で濾過してから測定を行った。オートサンプラーのインジェクションボリュームは１０μＬとした。
　［組換え細菌（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）の作製］
　（大腸菌の培養）
　大腸菌はＬＢ培地を使用し３７℃で培養した。カナマイシン耐性株のスクリーニングはカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を含むプレートを使用し、クロラムフェニコール耐性株のスクリーニングにはクロラムフェニコール（１０μｇ／ｍＬ）を含むプレートを使用した。
　（大腸菌コンピテントセルの作製）
　ヒートショックによる形質転換に用いるコンピテントセルの作製は、井上法（Inoue et al., 1990, Gene 96: 23-28）を参考に、以下の手順で行った。まず、大腸菌を寒天入りＬＢ培地に塗布し、３７℃で１晩培養した。得られたシングルコロニーを２×ＹＴ培地（５ｍＬ）に植菌し、６～８時間振とう培養（３７℃、２８０ｒｐｍ）した。さらに、得られた培養液（２ｍＬ）をＳＯＢ培地（１００ｍＬ）に植菌し、ＯＤ６００＝０．５５程度になるまで振とう培養（１８℃、１２０ｒｐｍ）した。得られた培養液を５０ｍｌずつ分注し、１０分間氷上静置した。１０分後、遠心分離（２５００×ｇ、４℃）し、上清を取り除いた後、氷冷したＩｎｏｕｅトランスフォーメーションバッファー（１６ｍＬ）で菌体ペレットをタッピングにより静かに懸濁した。懸濁後、氷上で１０分間静置し、遠心分離（２５００×ｇ、４℃）した。遠心分離後、上清を取り除き、氷冷したＩｎｏｕｅトランスフォーメーションバッファー（４ｍＬ）で菌体ペレットをタッピングにより静かに懸濁した。ＤＭＳＯ（ジメチルスルホオキシド）（３００μＬ）を添加し、混合した後、適当量分注し、液体窒素により急速冷凍した。作製したコンピテントセルは－８０℃で保存した。エレクトロポレーションによる形質転換に用いるコンピテントセルの作製は、上記と同様に培養した菌体を滅菌水にて２回洗浄後、菌体量と同量の１０％グリセロールに懸濁し行った。作製したコンピテントセルは－８０℃で保存した。
　（プラスミドの構築）
　プラスミドの構築は人工遺伝子合成およびクローニング（ＧＥＮＥＷＩＺ社）、もしくは、ＰＣＲ（ＫＯＤ　ＦＸ　Ｎｅｏ、ＴＯＹＯＢＯ社）による増幅に続くＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ　ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ、タカラバイオ社）を用いたＤＮＡ断片の結合と大腸菌ＨＳＴ０８株の形質転換によりクローニングした。プロトコルは添付のマニュアルに従った。得られたＤＮＡコンストラクトはサンガーシーケンス法によりＰＣＲエラーなどがないことを確認した。以下に、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａの形質転換に用いた２つのプラスミドｐＨＭ６２とｐＨＭ７５の構築について述べる。
　（１）プラスミドｐＨＭ６２の構築
　Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａの内在性ホスホアセチルトランスフェラーゼ発現遺伝子（ｐｄｕＬ２）を破壊し、Ｔ．ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ由来の遺伝子ａｄｈＥおよびａｄｈＡ（遺伝子番号はａｄｈＥがＴｓａｃ＿０４１６、ａｄｈＡがＴｓａｃ＿２０８７）を導入するプラスミドｐＨＭ６２を以下の手順で構築した。なお、ａｄｈＥとしては、タンパク質翻訳時に一アミノ酸置換Ｇ５４４Ｄが導入され、Ｎ末端側にｓｔｒｅｐＩＩタグが付加されるように、改変が施されたものを用いた。
　遺伝子ａｄｈＥおよびａｄｈＡを含む鋳型ＤＮＡ（プラスミドｐＨＭ５９）は、塩基配列をＭ．　ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａでの発現に最適となるようコドン最適化を行い、人工遺伝子合成によって準備した。プラスミドｐＨＭ５９を鋳型とし、かつＪＫ２１５およびＪＫ２１６をプライマーセットとして、ＰＣＲにより、２つの遺伝子ａｄｈＥおよびａｄｈＡを含むＤＮＡ断片を増幅した。
　ｐＫ１８－ΔｐｄｕＬ２：：ｌｄｈを鋳型とし、ＪＫ５２およびＪＫ７１をプライマーセットとして、ＰＣＲ法により、ｐｄｕＬ２の上流および下流のそれぞれ約１ｋｂｐ、並びにｐｙｒＦマーカーが、ｐＫ１８ｍｏｂベクターにつながれた配列を増幅した。
　ＰＣＲで得られた上記２つのＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法を用いて結合しクローニングすることで、ｐＨＭ６２を構築した。配列番号１にｐＨＭ６２プラスミドのインサート配列（７，０４９ｂｐ）を示す。ｐＨＭ６２により、ｐｄｕＬ２が破壊され、ａｄｈＡおよび変異型ａｄｈＥが挿入される。配列番号１において、ｐｙｒＦは１１６４－１９２２に、変異型ａｄｈＥは２１９１－４８０６に、ａｄｈＡは４８３７－６０３６に位置する。
　（２）プラスミドｐＨＭ７５の構築
　後述するような多段階にわたるプラスミドＤＮＡ構築を経て、形質転換に用いたプラスミドｐＨＭ７５を構築した。ｐＨＭ７５では、ｐｄｕＬ１遺伝子が破壊され、代わりにＧ３ＰＤプロモーター制御下に、ｃｐＩおよび２つのフェレドキシン遺伝子が合成オペロンとして配置されたＤＮＡ配列が、Ｇ３ＰＤプロモーター制御下のカナマイシン耐性遺伝子ｈｔｋとともに導入された。ｃｐＩはＣ．　ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ由来であり、遺伝子番号はＣＰＡＳＴ＿ｃ００２８０である。２つのフェレドキシン遺伝子ｆｄもＣ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ由来であり、遺伝子番号はそれぞれＣＰＡＳＴ＿ｃ０１２２０およびＣＰＡＳＴ＿ｃ１４２３０である。なお、導入したいずれの遺伝子についても、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａでの発現用にコドン最適化を行った。
　（２－１）ｐＨＭ８の構築
　Ｍ．　ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａでの発現用にコドン最適化し、人工遺伝子合成により合成したヒドロゲナーゼｃｐＩＩ遺伝子（Ｃ．ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ由来、遺伝子番号はＣＰＡＳＴ＿ｃ３３９６０）をクローニングすることでｐＨＭ１４を得た。ｐＨＭ１４を鋳型とし、かつＪＫ６７およびＪＫ６８をプライマーセットとして、ＰＣＲ法により、インサートとして用いるＤＮＡ断片を増幅した。
　ｐＫ１８－ｄ０９４０－ｋａｎを鋳型として、ＪＫ５８およびＪＫ５９をプライマーセットとして、ＰＣＲ法により、プラスミドベクターとして用いるＤＮＡ断片を増幅した。
　これら２つのＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法を用いて結合し、クローニングすることで、ｐＨＭ８を構築した。
　（２－２）ｐＨＭ９の構築
　ｐＨＭ８を鋳型とし、かつＪＫ９５およびＪＫ９６をプライマーセットとして、ＰＣＲ法により、インサートとして用いるＤＮＡ断片を増幅した。
　ｐＫ１８－ｄｐｙｒＦを鋳型とし、かつＪＫ９７およびＪＫ９８をプライマーセットとして、ＰＣＲ法により、プラスミドベクターとして用いるＤＮＡ断片を増幅した。
　これら２つのＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法を用いて結合し、クローニングすることで、ｐＨＭ９を構築した。
　（２－３）ｐＨＭ３３の構築
　Ｍ．　ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａの染色体ＤＮＡを鋳型とし、かつＪＫ５６およびＪＫ１００をプライマーセットとして、ＰＣＲ法により、ヒドロゲナーゼ遺伝子ｈｙｄＡＢＣを含む領域を増幅することで、インサートとして用いるＤＮＡ断片を得た。
　ｐＨＭ９を鋳型とし、かつＪＫ５９およびＪＫ９７をプライマーセットとして、ＰＣＲ法により、プラスミドベクターとして用いるＤＮＡ断片を増幅した。
　これら２つのＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法を用いて結合し、クローニングすることで、ｐＨＭ３３を構築した。
　（２－４）ｐＨＭ４０の構築
　人工合成したカナマイシン耐性遺伝子ｈｔｋをクローニングすることで得られたｐＨＭ２６を鋳型とし、かつＪＫ１３１およびＪＫ１３２をプライマーセットとして、ＰＣＲ法により、インサートとして用いるＤＮＡ断片を増幅した。
　ｐＫ１８－ｋａｎ２を鋳型とし、かつＪＫ５２およびＪＫ７１をプライマーセットとして、ＰＣＲ法により、プラスミドベクターとして用いるＤＮＡを増幅した。
　これら２つのＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法を用いて結合し、クローニングすることで、ｐＨＭ４０を構築した。
　（２－５）ｐＨＭ５５の構築
　ｐＨＭ４０を鋳型とし、かつＪＫ９およびＪＫ２０７をプライマーセットとして、ＰＣＲ法により、カナマイシン遺伝子ｈｔｋを含む領域を増幅することで、インサートとして用いるＤＮＡ断片を得た。
　ｐＨＭ３３を鋳型とし、かつＪＫ２００およびＪＫ２０６をプライマーセットとして、ＰＣＲ法により、プラスミドベクターに用いるＤＮＡ断片を増幅した。
　これら２つのＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法を用いて結合し、クローニングすることで、ｐＨＭ５５を構築した。
　（２－６）ｐＨＭ５２の構築
　２つのフェレドキシン遺伝子を含むＤＮＡ断片を、次のとおり増幅した。
　人工合成により作製したｆｄ（ＣＰＡＳＴ＿ｃ１４２３０）を含むｐＨＭ２７を鋳型とし、かつＪＫ１４１およびＪＫ１８６をプライマーセットとして、ＰＣＲを行った。
　また、人工合成により作製したｆｄ（ＣＰＡＳＴ＿ｃ０１２２０）を含むｐＨＭ２８を鋳型とし、かつＪＫ１４２およびＪＫ１８８をプライマーセットとして、ＰＣＲを行った。
　さらに、ｐＫ１８－ΔｐｄｕＬ１－ｋａｎを鋳型とし、かつＪＫ１８７およびＪＫ１８９をプライマーセットとして、ＰＣＲ法により、プラスミドベクターに用いるＤＮＡ断片を増幅した。
　以上３つのＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法を用いて結合しクローニングすることで、ｐＨＭ５２を構築した。
　（２－７）ｐＨＭ５７の構築
　人工合成により作製した、Ｃ末端にｓｔｒｅｐＩＩタグが付加されたｃｐＩ遺伝子を含むｐＨＭ２９を鋳型とし、かつＪＫ１３８およびＪＫ１９８をプライマーセットとして、ＰＣＲ法により、インサートとして用いるＤＮＡ断片を増幅した。
　ｐＨＭ５２を鋳型として、ＪＫ１０１、ＪＫ１９７をプライマーセットとして、ＰＣＲ法により、プラスミドベクターとして用いるＤＮＡ断片を増幅した。
　これら２つのＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法を用いて結合し、クローニングすることで、ｐＨＭ５７を構築した。
　（２－８）ｐＨＭ６６の構築
　ｐＨＭ５７を鋳型とし、かつＪＫ２２４およびＪＫ２２５をプライマーセットとして、ＰＣＲ法により、インサートに用いるＤＮＡ断片を増幅した。
　ｐＨＭ５５を鋳型とし、かつＪＫ５９およびＪＫ９７をプライマーセットとして、ＰＣＲ法により、プラスミドベクターとして用いるＤＮＡ断片を増幅した。
　これら２つのＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法を用いて結合し、クローニングすることで、ｐＨＭ６６を構築した。
　（２－９）ｐＨＭ７５の構築
　ｐＨＭ６６を鋳型とし、かつＪＫ２５１およびＪＫ２５２をプライマーセットとして、ＰＣＲ法により、インサートに用いるＤＮＡ断片を増幅した。
　ｐＫ１８－ΔｐｄｕＬ１－ｋａｎを鋳型として、かつＪＫ２４９およびＪＫ２５０をプライマーセットとして、ＰＣＲ法により、プラスミドベクターを含むＤＮＡ断片を増幅した。
　これら２つのＤＮＡ断片をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法を用いて結合しクローニングすることで、ｐＨＭ７５を構築した。
　配列番号２にｐＨＭ７５プラスミドのインサート配列（５，７６０ｂｐ）を示す。ｐＨＭ７５により、ｐｄｕＬ１が破壊され、ｃｐＩおよび２つのフェレドキシン遺伝子が導入される。配列番号２において、ｈｔｋは１３０８－２０６９に、ｃｐＩは２３８９－４１４３に、２つのフェレドキシン遺伝子はそれぞれ４１９５－４５０３および４５３４－４７０４に位置する。
　（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａへのエタノール合成遺伝子群導入）
　Kita et al.,2013, J. Biosci. Bioeng. 115(4):347-352にて確立された方法に従い、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ（ＡＴＣＣ３９０７３株）の形質転換を行った。
　まず、構築したプラスミドｐＨＭ６２およびｐＨＭ７５を、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ（ＡＴＣＣ３９０７３株）のＤＮＡメチラーゼ遺伝子を導入したプラスミドｐＢＡＤ１２８１とともに、エレクトロポレーション法により大腸菌Ｔｏｐ１０株に導入した。この大腸菌よりＤＮＡを調製することでＭ．ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ（ＡＴＣＣ３９０７３株）型にメチル化されたＤＮＡを取得した。
　ＨＭＣ４０株構築には、ウラシル要求性をマーカーとして用いるため、宿主はΔｐｙｒＦ株を用いた。炭素源として終濃度１１ｍＭフルクトースを添加した培地で、５５℃で、吸光度ＯＤ６００の値が０．３～０．６程度となるまで培養することで、菌体を準備した。
　５～１０μｇのプラスミドｐＨＭ６２を添加することで形質転換を行った。形質転換により得られたクローンに対して、ＰＣＲ法によってｐｄｕＬ２領域のＤＮＡ増幅を行い、遺伝子導入の結果として相当の大きさにサイズが変化したことにより確認した。得られたＨＭＣ４０株はさらに、ＨＭＣ５３株構築のための宿主として用いた。
　プラスミドｐＨＭ７５を用いて同様にＨＭＣ４０株を形質転換し、カナマイシン耐性（２５０μｇ／ｍｌ）を指標としてクローンを選抜した。ＰＣＲ法によってｐｄｕＬ１領域のＤＮＡ増幅を行い、遺伝子導入の結果としてサイズが相当の大きさに変化したことにより確認した。こうして、目的のＨＭＣ５３株を取得した。
　また、プラスミドｐＨＭ７５に代えて、プラスミドｐＫ１８－ΔｐｄｕＬ１－ｋａｎを用いた以外は、ＨＭＣ５３株と同様の操作によって、ＨＭＣ７１株を得た。
　［組換え株のエタノール生成能の評価］
　（１）ＨＭＣ５３株
　上記のようにして得られたＨＭＣ５３株のエタノール生成能を以下のとおりに評価した。
　獲得したＨＭＣ５３株を用い、ＣＯもしくは合成ガス（ＣＯとＨ２との混合ガス）を原料として発酵生産試験を行った。１２５ｍｌ容量のガラスバイアルに５０ｍｌのモーレラ属細菌用基本培地を入れ、ブチル栓で密封した状態で培養した。ＣＯガスの分圧は０．０４ＭＰａとした。合成ガスでのＨ２ガスの分圧を０．０４ＭＰａ、０．０８ＭＰａ、０．１６ＭＰａとすることで、ガス比をそれぞれＣＯ：Ｈ２＝１：１、１：２、１：４とした。培養は５５℃で振とう培養にて行った。
　菌体増殖は吸光光度計による菌体濁度ＯＤ６００をもとに乾燥菌体重量を算出して評価した。具体的に、ＯＤ６００と乾燥菌体重量は正比例の関係にあり、ＯＤ６００＝１．０のとき０．３８３ｇ／Ｌであるため（Iwasaki et al.,2017, Appl. Environ. Microbiol. 83( 8) e00247-17）、この関係式に基づき、測定したＯＤより乾燥菌体重量（ｇ／Ｌ）を算出した。
　エタノールおよび酢酸の生成量（ｍＭ）は、培地を回収し、ＨＰＬＣにより測定した。
　その結果、ＨＭＣ５３株は増殖しながらエタノールを生産した（図５～図８）。いずれの場合も、菌体が増殖している間では酢酸は全く生産されずにエタノールのみが生産された。ガス混合比ＣＯ：Ｈ２＝１：１の場合が増殖停止時のエタノール生産量が最も高く、５．３ｍＭであった。培養を続けると、生産速度は低下するがエタノールは増産され、６．６ｍＭに到達した。この間、酢酸がわずかに０．５ｍＭ生産された。他のガス混合比においても同様の生産パターンを示した。酢酸がわずかに生産されるのは、主な内在の酢酸生成経路である酵素ＰｄｕＬ２およびＰｄｕＬ１を用いる経路以外にも、内在の酢酸生成経路が存在するためであると考えられる。
　非特許文献１では、遺伝子ｐｄｕＬ２およびｐｄｕＬ１を破壊すると、組換え細菌が増殖できず、エタノールの生成はなかったが、以上の各実施例では、組換え細菌が増殖し、かつガス原料からほぼエタノールのみを生産させることができることが分かった。
　以上から、本発明に係る組換え細菌によると、ＣＯおよびＣＯ２等の炭素源からエタノールを生成できることが示された。ＡＴＰ生成が担保されて、より高い効率でエタノールを生成できて好ましいといえる。
　（２）ＨＭＣ７１株
　モーレラ属細菌用基本培地４５ｍｌにフルクトースで前培養した菌体を５ｍｌ植菌し、５５℃で振とう培養した。得られた培養液を、１ｂａｒのＮ２－ＣＯ２（８０：２０）にＣＯおよびＨ２を０．４ｂａｒずつ充填した８００ｍｌの大型バイアル中で、モーレラ属細菌用基本培地を用いて振とう培養した。菌量（ＯＤ６００）、培地中のフルクトースおよび生産物の濃度、バイアル中のヘッドスペースガス割合（ガスクロマトグラフィーによる）および全圧を経時的に測定した。
　図９～図１１に示すように、ＨＭＣ７１株も、ＣＯを炭素源およびエネルギー源として増殖し、エタノールを生産した。
 

Claims (17)

  1. 　炭素源から中間体としてのアセチル‐ＣｏＡを経て酢酸を生成する代謝経路を有する好熱性酢酸生成菌由来の組換え細菌であって、
    　遺伝子工学的手法により前記代謝経路に関わる酵素の少なくとも一部を欠損し、
    　アセチル‐ＣｏＡからアセトアルデヒドを生成する反応を触媒する外来のＮＡＤＰＨ依存型耐熱性酵素、およびアセトアルデヒドからエタノールを生成する反応を触媒する耐熱性酵素、を発現する、エタノールを生成する組換え好熱性細菌。
  2. 　前記好熱性酢酸生成菌は、モーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属細菌である、
    請求項１に記載の組換え好熱性細菌。
  3. 　欠損している前記酵素はアセチル‐ＣｏＡを基質としてアセチルリン酸を生成する酵素である、
    請求項１に記載の組換え好熱性細菌。
  4. 　前記好熱性酢酸生成菌はモーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属細菌であって、
    　欠損している前記酵素はＰｄｕＬ１およびＰｄｕＬ２である、
    請求項３に記載の組換え好熱性細菌。
  5. 　アセチル‐ＣｏＡからアセトアルデヒドを生成する反応を触媒する外来の前記耐熱性酵素は、ＮＡＤＰＨ依存型アルデヒドデヒドロゲナーゼである、
    請求項１に記載の組換え好熱性細菌。
  6. 　前記ＮＡＤＰＨ依存型アルデヒドデヒドロゲナーゼはＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のＡｄｈＥの５４４番目のグリシンがアスパラギン酸に置換されたＡｄｈＥＧ５４４Ｄである、
    請求項５に記載の組換え好熱性細菌。
  7. 　アセトアルデヒドからエタノールを生成する反応を触媒する前記耐熱性酵素は、ＮＡＤＰＨ依存型アルコールデヒドロゲナーゼである、
    請求項１に記載の組換え好熱性細菌。
  8. 　前記ＮＡＤＰＨ依存型アルコールデヒドロゲナーゼは、モーレラ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ）属細菌由来の酵素、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ　由来のＡｄｈＥの５４４番目のグリシンがアスパラギン酸に置換されたＡｄｈＥＧ５４４Ｄ、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｍ由来のＡｄｈＡの少なくとも一方である、
    請求項７に記載の組換え好熱性細菌。
  9. 　受領番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０４２９７として寄託された、
    請求項１に記載の組換え好熱性細菌。
  10. 　前記代謝経路とは異なる経路でＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を補助する外来の耐熱性酵素をさらに発現する、
    請求項１に記載の組換え好熱性細菌。
  11. 前記代謝経路とは異なる経路でＡＤＰからＡＴＰを生成する反応を補助する外来の前記耐熱性酵素は、フェレドキシンヒドロゲナーゼである、
    請求項１０に記載の組換え好熱性細菌。
  12. 　前記フェレドキシンヒドロゲナーゼは、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ由来のＣｐＩである、
    請求項１１に記載の組換え好熱性細菌。
  13. 　Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ　ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｍ由来のフェレドキシンをさらに発現する、
    請求項１１に記載の組換え好熱性細菌。
  14. 　受託番号ＮＩＴＥ　ＡＢＰ－０４０８２として寄託された、
    請求項１１に記載の組換え好熱性細菌。
  15. 　ＣＯの存在下、またはＣＯおよびＣＯ２の両方の存在下で請求項１～１４のいずれか一項に記載の組換え好熱性細菌を培養することでエタノールを生成するステップを備える、エタノールの製造方法。
  16. 　前記組換え好熱性細菌を培養することでエタノールを生成するステップは、さらにＨ２の存在下で行われる、
    請求項１５に記載のエタノールの製造方法。
  17. 　前記エタノールを生成するステップは、前記組換え好熱性細菌を５５℃～６５℃で培養することを含む、
    請求項１５に記載のエタノールの製造方法。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20180195091A1 (en) * 2015-07-23 2018-07-12 The Trustees Of Dartmouth College Thermophilic microorganisms for conversion of lignocellulosic biomass to ethanol

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