WO2025154643A1 - 複合粒子、標識物質、免疫学的測定法、免疫学的測定用試薬、及び複合粒子の製造方法 - Google Patents
複合粒子、標識物質、免疫学的測定法、免疫学的測定用試薬、及び複合粒子の製造方法Info
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- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
Definitions
- the present invention relates to composite particles that can be used in immunoassays, labeling substances using the same, immunoassays, and reagents for immunoassays, as well as a method for producing the composite particles.
- plasmonic nanoparticles such as gold nanoparticles
- the color of plasmonic nanoparticles is determined by their particle size and preparation conditions, it is difficult to obtain the desired vivid, deep color, and there is a problem of insufficient visibility, which is particularly noticeable when the antigen concentration is low.
- Prior documents 1 and 2 disclose a method of amplifying the detection sensitivity by further modifying the labeling substance with another metal after the antibody (labeled antibody) bound to the labeling substance reacts with the antigen in order to improve the visibility of the labeling substance, but this requires a dedicated device and the environment in which it can be used is limited.
- Prior documents 3 and 4 disclose composite particles in which gold nanoparticles are bound to resin particles, but because the three-dimensional arrangement and particle size distribution of the gold nanoparticles are not controlled, the optical properties due to surface plasmon resonance are not fully exhibited, and the color clarity and luminescence intensity are insufficient. In addition, the gold nanoparticles bound to the surface of the resin particles are easily detached by external forces, and there are also issues with the stability of sensitivity.
- the present invention was made in consideration of these circumstances, and provides composite particles with excellent rigidity and visibility.
- the composite particles of the present invention have excellent rigidity because the core part has a high glass transition temperature, and have excellent visibility because the metal particles are localized in the vicinity of the surface of the resin particles.
- a composite particle comprising a resin particle and a metal particle, the resin particle comprising a core portion and a shell layer covering a surface of the core portion, the core portion having a glass transition temperature of 50 to 200°C, the shell layer having a glass transition temperature of -100 to 0°C, and 80 to 100% by volume of the metal particles relative to a total of 100% by volume of the metal particles being encapsulated within the shell layer or present on the surface of the shell layer.
- [2] The composite particle according to [1], wherein 80 to 100 volume % of the metal particles are encapsulated in the shell layer relative to a total of 100 volume % of the metal particles.
- [3] The composite particle according to [1] or [2], having an average particle size of 200 to 1,500 nm.
- [4] The composite particle according to any one of [1] to [3], wherein the metal particles are gold nanoparticles having an average particle size of 5 to 80 nm and a particle size polydispersity index (PDI) of 0.2 or less as determined by a dynamic light scattering method.
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Abstract
剛性及び視認性に優れた複合粒子を提供する。 本発明によれば、樹脂粒子と、金属粒子とを備える複合粒子であって、前記樹脂粒子が、コア部と、前記コア部の表面を被覆するシェル層とを備え、前記コア部のガラス転移温度が５０～２００℃であり、前記シェル層のガラス転移温度が－１００～０℃であり、前記金属粒子の合計１００体積％に対して、前記金属粒子の８０～１００体積％が、前記シェル層に内包されているか、前記シェル層表面に存在している、複合粒子が提供される。
Description
本発明は、免疫学的測定法に利用可能な複合粒子、それを用いた標識物質、免疫学的測定法、及び免疫学的測定用試薬、並びに複合粒子の製造方法に関する。
多種多様な物質が含まれる混合物から特定の物質を検出する分析技術は多くの産業で活用されている。このような分析技術の１つとしては、例えば、免疫学的測定法が挙げられる。これは、抗原－抗体間の選択性の高い反応を利用した測定方法である。例えば、抗原、抗体、又はこれらの複合体に、標識物質を結合させ、その標識物質の濃度変化等を検出することで、定性的・定量的に測定することが可能となる。そのため、標識能力が優れた標識物質を用いることで、分析対象の物質を簡便に検出したり、より高精度に測定したりすることができる。
標識物質として金ナノ粒子等のプラズモニックナノ粒子を用いると、特別な分析装置を用いることなく目視により検出を確認することが可能となる。しかしながら、プラズモニックナノ粒子は、その粒子径及び調製条件によって色調が決定されてしまうため、所望の鮮明な濃い色調のものを得難く、視認性が不十分であるという問題があり、特に抗原濃度が低い場合、この問題は顕著であった。
先行文献１～２には、標識物質の視認性を向上させるために、標識物質が結合した抗体（標識抗体）と抗原が反応した後に、これらの標識物質に対しさらに他の金属を修飾させることで検出感度を増幅させる方法が開示されているが、専用の装置が必要であり、使用環境が限られている。先行文献３～４には、樹脂粒子に金ナノ粒子を結合させた複合粒子が開示されているが、金ナノ粒子の三次元的な配置や粒度分布が制御されていないことから、表面プラズモン共鳴による光特性が十分に発揮されず、色調の鮮明さや発光強度が不十分であった。また、樹脂粒子の表面に結合している金ナノ粒子は外力によって脱落しやすく、感度の安定性にも課題があった。
本発明はこのような事情に鑑みてなされたものであり、剛性及び視認性に優れた複合粒子を提供するものである。
本発明の複合粒子は、コア部のガラス転移温度が高いので剛性に優れ、樹脂粒子の表面近傍に金属粒子が局在化しているので視認性に優れている。すなわち、本発明は、下記に関する。
［１］樹脂粒子と、金属粒子とを備える複合粒子であって、前記樹脂粒子が、コア部と、前記コア部の表面を被覆するシェル層とを備え、前記コア部のガラス転移温度が５０～２００℃であり、前記シェル層のガラス転移温度が－１００～０℃であり、前記金属粒子の合計１００体積％に対して、前記金属粒子の８０～１００体積％が、前記シェル層に内包されているか、前記シェル層表面に存在している、複合粒子。
［２］前記金属粒子の合計１００体積％に対して、前記金属粒子の８０～１００体積％が、前記シェル層に内包されている、［１］に記載の複合粒子。
［３］平均粒子径が２００～１５００ｎｍである、［１］又は［２］に記載の複合粒子。
［４］前記金属粒子が、平均粒子径５～８０ｎｍ、動的光散乱法により求められる粒子径の多分散指数（ＰＤＩ）が０．２以下の金ナノ粒子である、［１］～［３］の何れか１つに記載の複合粒子。
［５］倍率１０万～５０万倍、加速電圧５０ｋＶの条件で電界放出型走査電子顕微鏡（ＦＥ－ＳＥＭ）により観察される前記複合粒子の画像から、前記複合粒子の円周に内接する正方形内にある前記金属粒子の合計面積（ΣＡｍ）を、前記正方形の面積（Ａ）で割ることで得られる金属粒子被覆率（ΣＡｍ／Ａ）が２０～８０％である、［１］～［４］の何れか１つに記載の複合粒子。
［６］前記シェル層がアミノ基含有ポリマーを含有する、［１］～［５］の何れか１つに記載の複合粒子。
［７］前記コア部がスチレン系ポリマーを含有する、［１］～［６］の何れか１つに記載の複合粒子。
［８］［１］～［７］の何れか１つに記載の複合粒子を備えた標識物質。
［９］前記複合粒子の表面に抗原又は抗体を有する、［８］に記載の標識物質。
［１０］［８］に記載の標識物質を用いた、免疫学的測定法。
［１１］［８］に記載の標識物質を有する、免疫学的測定用試薬。
［１２］担持工程を備える、複合粒子の製造方法であって、前記担持工程では、樹脂粒子に金属粒子を担持させ、前記樹脂粒子が、コア部と、前記コア部の表面を被覆するシェル層とを備え、前記コア部のガラス転移温度が５０～２００℃であり、前記シェル層のガラス転移温度が－１００～０℃である、製造方法。
［１］樹脂粒子と、金属粒子とを備える複合粒子であって、前記樹脂粒子が、コア部と、前記コア部の表面を被覆するシェル層とを備え、前記コア部のガラス転移温度が５０～２００℃であり、前記シェル層のガラス転移温度が－１００～０℃であり、前記金属粒子の合計１００体積％に対して、前記金属粒子の８０～１００体積％が、前記シェル層に内包されているか、前記シェル層表面に存在している、複合粒子。
［２］前記金属粒子の合計１００体積％に対して、前記金属粒子の８０～１００体積％が、前記シェル層に内包されている、［１］に記載の複合粒子。
［３］平均粒子径が２００～１５００ｎｍである、［１］又は［２］に記載の複合粒子。
［４］前記金属粒子が、平均粒子径５～８０ｎｍ、動的光散乱法により求められる粒子径の多分散指数（ＰＤＩ）が０．２以下の金ナノ粒子である、［１］～［３］の何れか１つに記載の複合粒子。
［５］倍率１０万～５０万倍、加速電圧５０ｋＶの条件で電界放出型走査電子顕微鏡（ＦＥ－ＳＥＭ）により観察される前記複合粒子の画像から、前記複合粒子の円周に内接する正方形内にある前記金属粒子の合計面積（ΣＡｍ）を、前記正方形の面積（Ａ）で割ることで得られる金属粒子被覆率（ΣＡｍ／Ａ）が２０～８０％である、［１］～［４］の何れか１つに記載の複合粒子。
［６］前記シェル層がアミノ基含有ポリマーを含有する、［１］～［５］の何れか１つに記載の複合粒子。
［７］前記コア部がスチレン系ポリマーを含有する、［１］～［６］の何れか１つに記載の複合粒子。
［８］［１］～［７］の何れか１つに記載の複合粒子を備えた標識物質。
［９］前記複合粒子の表面に抗原又は抗体を有する、［８］に記載の標識物質。
［１０］［８］に記載の標識物質を用いた、免疫学的測定法。
［１１］［８］に記載の標識物質を有する、免疫学的測定用試薬。
［１２］担持工程を備える、複合粒子の製造方法であって、前記担持工程では、樹脂粒子に金属粒子を担持させ、前記樹脂粒子が、コア部と、前記コア部の表面を被覆するシェル層とを備え、前記コア部のガラス転移温度が５０～２００℃であり、前記シェル層のガラス転移温度が－１００～０℃である、製造方法。
以下、図面を用いて本発明の実施形態について説明する。以下に示す実施形態中で示した各種特徴事項は、互いに組み合わせ可能である。また、各特徴事項について独立して発明が成立する。
１．複合粒子１００
図１は、本発明の一実施形態に係る、金属粒子２０として内包粒子２１、一部露出粒子２２、及び表面吸着粒子２３を備える複合粒子１００の断面模式図である。図２は、本発明の一実施形態に係る、金属粒子２０として内包粒子２１のみを備える複合粒子１００の断面模式図である。図１～図２に示すように、複合粒子１００は、コア部１１とその表面を被覆するシェル層１２とを備える樹脂粒子１０と、樹脂粒子１０に担持されている複数の金属粒子２０を備える。金属粒子２０は、樹脂粒子１０に完全に内包された金属粒子である内包粒子２１、樹脂粒子１０内に埋包された部位及び樹脂粒子１０外に露出した部位を有する金属粒子である一部露出粒子２２、及び樹脂粒子１０の表面に吸着している金属粒子である表面吸着粒子２３に分類することができる。図１～図２に示すように、複合粒子１００全体の粒子径Ｄ１と、樹脂粒子１０の粒子径Ｄ２と、金属粒子２０の粒子径Ｄ３との関係は、Ｄ１≧Ｄ２＞Ｄ３である。図２に示すように、金属粒子２０が全て内包粒子２１である場合、Ｄ１＝Ｄ２である。
図１は、本発明の一実施形態に係る、金属粒子２０として内包粒子２１、一部露出粒子２２、及び表面吸着粒子２３を備える複合粒子１００の断面模式図である。図２は、本発明の一実施形態に係る、金属粒子２０として内包粒子２１のみを備える複合粒子１００の断面模式図である。図１～図２に示すように、複合粒子１００は、コア部１１とその表面を被覆するシェル層１２とを備える樹脂粒子１０と、樹脂粒子１０に担持されている複数の金属粒子２０を備える。金属粒子２０は、樹脂粒子１０に完全に内包された金属粒子である内包粒子２１、樹脂粒子１０内に埋包された部位及び樹脂粒子１０外に露出した部位を有する金属粒子である一部露出粒子２２、及び樹脂粒子１０の表面に吸着している金属粒子である表面吸着粒子２３に分類することができる。図１～図２に示すように、複合粒子１００全体の粒子径Ｄ１と、樹脂粒子１０の粒子径Ｄ２と、金属粒子２０の粒子径Ｄ３との関係は、Ｄ１≧Ｄ２＞Ｄ３である。図２に示すように、金属粒子２０が全て内包粒子２１である場合、Ｄ１＝Ｄ２である。
複合粒子１００の平均粒子径、すなわち、図１～図２における粒子径Ｄ１の平均は、２００～１５００ｎｍであることが好ましい。複合粒子１００の平均粒子径は、具体的には例えば、２００，３００，４００，５００，６００，７００，８００，９００，１０００，１１００，１２００，１３００，１４００，１５００ｎｍであり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。なお、本明細書では、複合粒子１００、樹脂粒子１０及び金属粒子２０の「平均粒子径」は、何れも動的光散乱法によって求めた粒度分布における積算値５０％での粒子径（メジアン径）を意味する。複合粒子１００の平均粒子径が小さすぎると、金属粒子２０の担持量が少なくなり、視認性が不十分になる傾向があり、平均粒子径が大きすぎると、免疫学的測定用標識物質（以下、単に「標識物質」ともいう。）や免疫学的測定用試薬（以下、単に「試薬」ともいう。）とした際に、メンブレンフィルタ等のクロマトグラフ媒体の細孔内に詰まりやすい傾向や、分散性が低下する傾向がある。複合粒子１０の平均粒子径は、動的光散乱法により測定することができる。
２．樹脂粒子１０
樹脂粒子１０は、金属粒子２０よりも相対的に大きな粒子であり、コア部１１と、その表面を被覆するシェル層１２とを備える。コア部１１及びシェル層１２は互いにガラス転移温度（Ｔｇ）の異なるポリマーで構成されており、コア部１１はＴｇが５０～２００℃であり、シェル層１２はＴｇが－１００～０℃である。すなわち、コア部１１はシェル層１２よりも硬くなっており、それにより、後述するような金属粒子２０を樹脂粒子１０に担持させる工程（担持工程）において、金属粒子２０がコア部１２に含侵しにくくなっている。なお、ポリマーのガラス転移温度は、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎに記載された値を採用する。ポリマーのガラス転移温度が上記文献に記載されていない場合は、他の文献や製品カタログに記載された値や、ポリマーを製造して実測した値を使用することができる。
樹脂粒子１０は、金属粒子２０よりも相対的に大きな粒子であり、コア部１１と、その表面を被覆するシェル層１２とを備える。コア部１１及びシェル層１２は互いにガラス転移温度（Ｔｇ）の異なるポリマーで構成されており、コア部１１はＴｇが５０～２００℃であり、シェル層１２はＴｇが－１００～０℃である。すなわち、コア部１１はシェル層１２よりも硬くなっており、それにより、後述するような金属粒子２０を樹脂粒子１０に担持させる工程（担持工程）において、金属粒子２０がコア部１２に含侵しにくくなっている。なお、ポリマーのガラス転移温度は、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｈａｎｄｂｏｏｋ Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎに記載された値を採用する。ポリマーのガラス転移温度が上記文献に記載されていない場合は、他の文献や製品カタログに記載された値や、ポリマーを製造して実測した値を使用することができる。
コア部１１を構成するポリマーは、Ｔｇが５０～２００℃であり、且つ疎水性を有するポリマーである。コア部１１を構成するポリマーのＴｇは、具体的には例えば、５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０，８５，９０，９５，１００，１０５，１１０，１１５，１２０，１２５，１３０，１３５，１４０，１４５，１５０，１５５，１６０，１６５，１７０，１７５，１８０，１８５，１９０，１９５，２００℃であり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。コア部１１を構成するポリマーとしては、例えば、スチレン、メチルスチレン、ジメチルスチレン、トリメチルスチレン、エチルスチレン、ジエチルスチレン等のスチレン系モノマーを含む原料モノマーを重合して得られるスチレン系ポリマーや、ポリエステル、ポリオレフィン、ポリ（メタ）アクリレート、ポリカーボネート、ポリフェニレンスルフィド、ポリフェニレンオキシド、ポリエーテルサルフォン、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアクリロニトリル、これらのポリマーを構成する単量体を共重合したもの等が挙げられる。これらの中でも、樹脂粒子１０の機械的強度や水等の分散媒に対する分散性を確保するという観点から、実用上十分な剛性を有し、比較的比重の小さいポリマーであるスチレン系ポリマーを使用することが好ましい。スチレン系ポリマーの原料モノマーは、上記したようなスチレン系モノマーのみであってもよく、スチレン系モノマー以外のその他モノマーを含んでいてもよい。スチレン系モノマーは、１種単独で用いてもよく、２種以上を併用してもよい。原料モノマー中のスチレン系モノマーの割合は、例えば、６０～１００質量％であり、具体的には例えば、６０，６５，７０，７５，８０，８５，９０，９５，１００質量％であり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。このようなポリマーを用いてコア部１１を構成することで、樹脂粒子１０の機械的強度が増し、例えば、輸送時や検査キット等の試薬の製造時において加わる外力によって複合粒子１００が破壊されることを防ぐことができる。コア部１１を構成するポリマーの構造は、ランダムポリマーでも、ブロックポリマーでも、グラフトポリマーでもよい。
シェル層１２を構成するポリマーは、Ｔｇが－１００～０℃であり、且つ金属粒子２０との間で静電相互作用が働き得るポリマーである。シェル層１２を構成するポリマーのＴｇは、具体的には例えば、－１００，－９５，－９０，－８５，－８０，－７５，－７０，－６５，－６０，－５５，－５０，－４５，－４０，－３５，－３０，－２５，－２０，－１５，－１０，－５，０℃であり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。一実施形態において、シェル層１２を構成するポリマーは、アミノ基含有ポリマーであることが好ましい。アミノ基含有ポリマーは、アミノ基を有する重合性単量体を含むモノマー成分を共重合させたポリマーや、ベースポリマーにアミノ基を修飾させたポリマー等である。ベースポリマーとしては、例えば、ポリブタジエン、ポリイソプレン、ポリイソブチレン、スチレン－ブタジエン共重合体（ＳＢＲ）、イソブチレン－イソプレン共重合体、アクリロニトリル－ブタジエン共重合体、エチレン-プロピレン共重合体、ポリクロロプレン、ポリオキシメチレン、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリフッ化ビニリデン、ポリブトキシアクリレート等が挙げられる。ベースポリマーをアミノ基で修飾する方法は特に限定されず、例えば、アンモニアによる置換反応（アンモノリシス）や、還元的アミノ化反応等の従来公知の方法を採用することができる。このようなアミノ基含有ポリマーとしては、例えば、アミン化ポリブタジエン（ＰＢ－ＮＨ２）、アミン化スチレン－ブタジエン共重合体（ＳＢＲ－ＮＨ２）、アミン化ポリイソプレン、アミン化ポリブチルアクリレート等が挙げられる。アミノ基含有ポリマー中のアミノ基の含有量は、アミノ基含有ポリマー１００質量％に対して、０．０１～２．０質量％であることが好ましい。アミノ基含有ポリマー中のアミノ基の含有量は、具体的には例えば、０．０１，０．０２，０．０５，０．１，０．２，０．５，１．０，１．５，２．０質量％であり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。シェル層１２を構成するポリマーの構造は、ランダムポリマーでも、ブロックポリマーでも、グラフトポリマーでもよい。
一実施形態において、アミノ基含有ポリマーはアミン化ポリブタジエン（ＰＢ－ＮＨ２）であることが好ましい。アミン化ポリブタジエン中のアミノ基の含有量は、アミン化ポリブタジエン１００質量％に対して、０．０１～２．０質量％であることが好ましい。アミン化ポリブタジエン中のアミノ基の含有量は、具体的には例えば、０．０１，０．０２，０．０５，０．１，０．２，０．５，１．０，１．５，２．０質量％であり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。
シェル層１２を構成するポリマーがアミノ基を含有することにより、カルボキシ基を有する抗体に複合粒子１００を容易に結合させることができる。また、アミノ基含有ポリマーは正の表面電位を有するため、金属粒子２０が負の表面電位を有する場合、これらは静電相互作用により結合し得る。このため、金属粒子２０を樹脂粒子１０に担持させる際、金属粒子２０はシェル層１２に含侵し、シェル層１２に内包されやすい傾向があり、内包粒子２１のうち、コア部１１内に存在する金属粒子の割合は０ないし略０質量％となる。このように、シェル層１２がアミノ基を含有することにより、一部露出粒子２２及び表面吸着粒子２３の割合が少なくなり、金属粒子２０をシェル層１２内に集中的に分布させることができ、複合粒子１００を免疫学的測定に使用する場合に優れた視認性と感度安定性を得ることができる。
樹脂粒子１０の平均粒子径、すなわち、図１～図２における粒子径Ｄ２の平均は、２００～１５００ｎｍであることが好ましい。樹脂粒子１０の平均粒子径は、具体的には例えば、２００，３００，４００，５００，６００，７００，８００，９００，１０００，１１００，１２００，１３００，１４００，１５００ｎｍであり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。樹脂粒子１０の平均粒子径が小さすぎると、金属粒子２０の担持量が少なくなり、視認性が不十分になる傾向がある。また、平均粒子径が大きすぎると、標識物質や試薬とした際に、メンブレンフィルタ等のクロマトグラフ媒体の細孔内に詰まりやすい傾向や、分散性が低下する傾向がある。樹脂粒子１０の平均粒子径は、動的光散乱法により測定することができる。
３．金属粒子２０
金属粒子２０としては、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、白金、パラジウム、ニッケル等の粒子が挙げられる。特に、負の表面電位を有し、且つ優れた視認性が得られることから、金ナノ粒子を使用することが好ましい。金属粒子２０の平均粒子径、すなわち、図１～図２における粒子径Ｄ３の平均は、５～８０ｎｍであることが好ましい。金属粒子２０の平均粒子径は、具体的には例えば、５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０ｎｍであり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。金属粒子２０の平均粒子径が小さすぎる場合や大きすぎる場合には、局在型表面プラズモン共鳴及び電子遷移による光エネルギー吸収が発現しにくくなるため、検出感度が低下する傾向がある。金属粒子２０の平均粒子径は、金属粒子２０が金ナノ粒子である場合には、５～８０ｎｍが好ましく、５～５０ｎｍがより好ましい。
金属粒子２０としては、例えば、金、銀、銅、アルミニウム、白金、パラジウム、ニッケル等の粒子が挙げられる。特に、負の表面電位を有し、且つ優れた視認性が得られることから、金ナノ粒子を使用することが好ましい。金属粒子２０の平均粒子径、すなわち、図１～図２における粒子径Ｄ３の平均は、５～８０ｎｍであることが好ましい。金属粒子２０の平均粒子径は、具体的には例えば、５，１０，１５，２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０ｎｍであり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。金属粒子２０の平均粒子径が小さすぎる場合や大きすぎる場合には、局在型表面プラズモン共鳴及び電子遷移による光エネルギー吸収が発現しにくくなるため、検出感度が低下する傾向がある。金属粒子２０の平均粒子径は、金属粒子２０が金ナノ粒子である場合には、５～８０ｎｍが好ましく、５～５０ｎｍがより好ましい。
金属粒子２０の粒子径Ｄ３は、動的光散乱法により測定することができる。金属粒子２０として金ナノ粒子を使用する場合、動的光散乱法により求められる金ナノ粒子の粒子径の多分散指数（Ｐｏｌｙｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ：ＰＤＩ）は、０．２以下であることが好ましい。ＰＤＩは粒子径分布の幅を表す指標であり、その値の範囲は０～１である。ＰＤＩの値が小さいほど、粒子径分布の幅が小さいことを表す。動的光散乱法により求められる金ナノ粒子の粒子径のＰＤＩは、具体的には例えば、０，０．０１，０．０２，０．０３，０．０４，０．０５，０．０６，０．０７，０．０８，０．０９，０．１０，０．１１，０．１２，０．１３，０．１４，０．１５，０．１６，０．１７，０．１８，０．１９，０．２０であり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。金ナノ粒子の粒子径のＰＤＩの値を０．２以下とすることで、プラズモン吸収帯がよりシャープになり、所望の鮮明な濃い色調を得ることができ、その結果、標識物質として用いる際に優れた視認性を得ることができる。なお、金属粒子２０の平均粒子径及びＰＤＩは、メーカー等により公称値が提供されている場合はその公称値を採用してもよい。
シェル層１２の厚さＴと金属粒子２０の粒子径Ｄ３の比Ｔ／Ｄ３は、少なくとも１以上であり、好ましくは１～５であり、より好ましくは１～３である。Ｔ／Ｄ３は、具体的には例えば、１．０，１．５，２．０，２．５，３．０，３．５，４．０，４．５，５．０であり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。Ｔ／Ｄ３をこのような範囲にすることにより、金属粒子２０をシェル層１２に内包させることができ、且つ、樹脂粒子１０の表面近傍に金属粒子２０を集中的に分布させることができる。これにより、局在型表面プラズモン共鳴に加え、電子遷移による光エネルギー吸収の発現を最大化できるため、好ましい。
上記の通り、金属粒子２０は、内包粒子２１と、一部露出粒子２２と、表面吸着粒子２３に分類される。内包粒子２１は、表面の全てが樹脂粒子１０を構成するポリマーに覆われている粒子である。一部露出粒子２２は、表面積の５％以上１００％未満が、樹脂粒子１０を構成するポリマーに覆われている粒子である。表面吸着粒子２３は、表面積の０％超５％未満が、樹脂粒子１０を構成するポリマーに覆われている粒子である。内包粒子２１、一部露出粒子２２、及び表面吸着粒子２３は、何れも局在型表面プラズモン共鳴に加え、電子遷移による光エネルギー吸収を発現するため、標識物質や試薬等の視認性の向上に寄与する。そのため、視認性の観点では、金属粒子２０は内包粒子２１、一部露出粒子２２、及び表面吸着粒子２３の何れであってもよい。一方、内包粒子２１は、一部露出粒子２２及び表面吸着粒子２３と比べて、樹脂粒子１０との接触面積が大きいことに加え、埋包状態によるアンカー効果がより顕著に奏されるため、樹脂粒子１０から脱離しにくい。そのため、複合粒子１００を使用した標識物質や試薬の感度安定性及び耐久性という観点では、金属粒子２０における内包粒子２１の存在比率を高くすることが好ましい。
一実施形態において、複合粒子１００における金属粒子２０の合計１００体積％に対して、金属粒子２０の８０～１００体積％が、内包粒子２１としてシェル層１２に内包されているか、一部露出粒子２２及び／又は表面吸着粒子２３としてシェル層１２の表面に存在していることが好ましい。一実施形態において、複合粒子１００における金属粒子２０の合計１００体積％に対して、金属粒子２０の８０～１００体積％が、内包粒子２１としてシェル層１２に内包されていることがより好ましい。複合粒子１００における金属粒子２０の合計１００体積％に対する、シェル層１２中の内包粒子２１の体積比は、具体的には例えば、８０，８１，８２，８３，８４，８５，８６，８７，８８，８９，９０，９１，９２，９３，９４，９５，９６，９７，９８，９９，１００体積％であり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。なお、金属粒子２０の合計１００体積％に対する、一部露出粒子２２及び表面吸着粒子２３、シェル層１２中の内包粒子２１、並びにコア部１１中の内包粒子２１の各体積比（金属粒子存在比率）は、例えば、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）を用いて、実施例で説明する方法により算出することができる。
金属粒子２０は、複合粒子１００の表面近傍にあることが好ましい。具体的には、倍率１０万～５０万倍、加速電圧５０ｋＶの条件で電界放出型走査電子顕微鏡（ＦＥ－ＳＥＭ）により観察される複合粒子１００の画像から、複合粒子１００の円周に内接する正方形内にある金属粒子２０の合計面積（ΣＡｍ）を、前記正方形の面積（Ａ）で割ることで得られる金属粒子被覆率（ΣＡｍ／Ａ）が２０～８０％であることが好ましい。金属粒子被覆率（ΣＡｍ／Ａ）は、具体的には例えば、２０，２５，３０，３５，４０，４５，５０，５５，６０，６５，７０，７５，８０であり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。
複合粒子１００の円周は、複合粒子１００が一部露出粒子２２または表面吸着粒子２３を有する場合は粒子径Ｄ１に係る円の円周であり、複合粒子１００の金属粒子２０が全て内包粒子２１である場合は粒子径Ｄ２に係る円の円周である。また、金属粒子２０の合計面積（ΣＡｍ）と正方形の面積（Ａ）は、得られた複合粒子１００のＳＥＭ画像から、従来公知の画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ Ｊ等）を用いて算出することができる。図３は、金属粒子被覆率（ΣＡｍ／Ａ）を算出するために、倍率１０万～５０万倍、加速電圧５０ｋＶの条件でＦＥ－ＳＥＭにより得られる、表面吸着粒子２３を含む金属粒子２０を備える複合粒子１００の上面像において、画像解析ソフトを用いて複合粒子１００の円周３０と、円周３０に内接する正方形４０を設けた例を示す模式図である。図３に示すように、上記の条件で撮影すると、樹脂粒子１０の表面から数十ｎｍの深さにある金属粒子２０まで映し出すことができるため、複合粒子１００の表面近傍がどの程度の金属粒子２０で覆われているかがわかる。金属粒子被覆率（ΣＡｍ／Ａ）が上記範囲内にあると、プラズモン吸収帯がよりシャープになり、所望の鮮明な濃い色調を得ることができ、その結果、標識物質として用いる際に優れた視認性を得ることができる。
４．樹脂粒子１０の製造方法
樹脂粒子１０の製造方法は特に限定されないが、例えば、従来公知のコア－シェル構造の製造方法を用いることができる。具体的には、例えば、特許第５２３９００４号（異方性ポリマー微粒子の製造法）に開示されている比較的簡便な方法を採用することができる。この方法では、溶解度パラメータが互いに異なる２種のポリマーを良溶媒に溶解した良溶媒溶液を調製し、該良溶媒と相溶する前記ポリマーの貧溶媒を添加した後、良溶媒を除去することによって、各ポリマーがそれぞれ集合ないし凝集して形成される複数の相を有する、略球形の微粒子を製造することができる。
樹脂粒子１０の製造方法は特に限定されないが、例えば、従来公知のコア－シェル構造の製造方法を用いることができる。具体的には、例えば、特許第５２３９００４号（異方性ポリマー微粒子の製造法）に開示されている比較的簡便な方法を採用することができる。この方法では、溶解度パラメータが互いに異なる２種のポリマーを良溶媒に溶解した良溶媒溶液を調製し、該良溶媒と相溶する前記ポリマーの貧溶媒を添加した後、良溶媒を除去することによって、各ポリマーがそれぞれ集合ないし凝集して形成される複数の相を有する、略球形の微粒子を製造することができる。
上記方法で使用される２種のポリマーは、上記に列挙されるようなポリマーの中から、ポリマー間の溶解度パラメータの差が０．１ＭＰａ１／２以上２０ＭＰａ１／２以下となるように選択されるポリマーである。例えば、２種のポリマーとしてポリマーＡとポリマーＢを利用する場合、ポリマーＡＢはその間の溶解度パラメータの差が０．１ＭＰａ１／２以上２０ＭＰａ１／２以下となるような組み合わせとして選択される。なお、各ポリマーの溶解度パラメータは、Ｆｅｄｏｒｓの計算方法「Ｒｏｂｅｒｔ Ｆ．Ｆｅｄｏｒｓ，Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４，１４７－１５４（１９７４）」によって算出される。
例えば、本発明の一実施形態に係る樹脂粒子１０は、ポリスチレン（ＰＳｔ、溶解度パラメータ：１８ＭＰａ１／２）とアミン化ポリブタジエン（ＰＢ－ＮＨ２）を用いて、上記方法により製造することができる。非アミン化ポリブタジエン（ＰＢ）の溶解度パラメータは１７．５ＭＰａ１／２であり、アミン化によって溶解度パラメータは大きく変化しないため、ポリスチレンとアミン化ポリブタジエンの溶解度パラメータの差は０．１ＭＰａ１／２以上２０ＭＰａ１／２以下となる。また、ポリスチレンとアミン化スチレン－ブタジエン共重合体（ＳＢＲ－ＮＨ２）の組み合わせや、アミン化ポリブタジエンとアミン化スチレン－ブタジエン共重合体の組み合わせ等を利用して、樹脂粒子１０を製造することもできる。
また、上記方法で用いられる良溶媒及び貧溶媒は、互いに相溶姓を示すが、上記した２種以上のポリマーに対する溶解力が大きく異なる溶媒である。ポリマーに対する溶解力が強い溶媒を良溶媒として、溶解力が弱いか又はほとんど溶解力を有しない溶媒を貧溶媒として、適宜選択され、組み合わせて使用される。良溶媒としては、上記した２種以上のポリマーそれぞれに対する溶解度パラメータとの差が５．０ＭＰａ１／２以下である溶解度パラメータを有する良溶媒を使用することが好ましい。また、貧溶媒としては、上記のように決定した良溶媒の溶解度パラメータとの差が５．０Ｍｐａ１／２超３０ＭＰａ１／２以下である貧溶媒を選択することが好ましく、１０．０Ｍｐａ１／２超３０ＭＰａ１／２以下である貧溶媒を選択することが好ましい。
上記方法で使用可能な溶媒としては、例えば、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、ジメチルエーテル、ベンゼン、トルエン、ヘキサン、クロロホルム、アセトン、メタノール、エタノール、水、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジオキサン、アセトニトリル、１－プロパノール、イソプロパノール等が挙げられる。これらの中から、使用される２種以上のポリマーに応じて、上記したような性質を有する良溶媒と貧溶媒とを選択することができる。その際、使用されるポリマーの各種溶媒に対する溶解度パラメータのデータ、溶媒間の相溶性データ、沸点等の既知のデータを収集或いは確認し、これらを考慮することが望ましい。溶媒の溶解度パラメータは、Ｆｅｄｏｒｓの計算方法によって算出される。
例えば、本発明の一実施形態に係る樹脂粒子１０は、良溶媒としてテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、溶解度パラメータ：１８．６ＭＰａ１／２）、貧溶媒として水（溶解度パラメータ：４７．９ＭＰａ１／２）を用いて、上記方法により製造することができる。
上記方法では、良溶媒溶液に貧溶媒を添加した後に良溶媒を除去することによって、多相ポリマー微粒子（本発明における樹脂粒子１０に相当）を形成することができる。多相ポリマー微粒子の粒子径は、２種以上のポリマーの良溶媒溶液における濃度、及び添加する貧溶媒の量（良溶媒の量に対する比率）を調整することによって制御することができる。また、良溶媒は、貧溶媒との沸点の違いを利用して除去することができる。例えば、本発明の一実施形態に係る樹脂粒子１０は、２種以上のポリマーを溶解している良溶媒溶液に貧溶媒を混合した後、良溶媒を減圧下で急速に除去するという比較的簡便な操作によって製造することができる。減圧の程度は、例えば１０－３Ｐａ～１０４Ｐａであり、好ましくは１０Ｐａ～１０３Ｐａである。減圧の程度は、具体的には例えば、１０－３，１０－２，１０－１，１，１０，１０２，１０３，１０４Ｐａであり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。このような減圧は、例えば、ロータリーエバポレータや減圧ポンプ、その他の一般的な減圧用機器を用いて実現することができる。また、減圧せずに、常温常圧で良溶媒を蒸発させて除去することもできる。
５．複合粒子１００の製造方法
本発明の複合粒子１００の製造方法は、担持工程を備える。担持工程は、樹脂粒子１０に金属粒子２０を担持させる工程である。担持工程では、金属粒子２０の分散液を樹脂粒子１０に接触させ、金属粒子２０を樹脂粒子１０に含侵させる。担持工程の具体的な例としては、樹脂粒子１０の分散液と金属粒子２０の分散液を混合した後に、所定時間静置することが挙げられる。
本発明の複合粒子１００の製造方法は、担持工程を備える。担持工程は、樹脂粒子１０に金属粒子２０を担持させる工程である。担持工程では、金属粒子２０の分散液を樹脂粒子１０に接触させ、金属粒子２０を樹脂粒子１０に含侵させる。担持工程の具体的な例としては、樹脂粒子１０の分散液と金属粒子２０の分散液を混合した後に、所定時間静置することが挙げられる。
本発明の一実施形態に係る複合粒子１００は、樹脂粒子１０の水分散液に金ナノ粒子コロイド溶液を添加した後、所定時間静置することによって製造することができる。例えば、樹脂粒子１０の水分散液は、上記した樹脂粒子１０の製造工程において貧溶媒として水を使用する場合、良溶媒を除去することによって得ることができる。また、金ナノ粒子コロイド溶液は、市販品を使用することができる。特に、平均粒子径５～８０ｎｍ、動的光散乱法により求められる粒子径のＰＤＩが０．２以下の金ナノ粒子のコロイド溶液を使用することが好ましい。
樹脂粒子１０の水分散液の濃度は０．０１～１０ｍｇ／ｍＬが好ましい。また、金ナノ粒子コロイド溶液の濃度は、１．０×１０－３～１．０×１０４ｍｇ／ｍＬが好ましい。樹脂粒子１０の水分散液と金ナノ粒子コロイド溶液の量は、所望する複合粒子１００の製造量に応じて適宜決定することができる。
十分な担持量を確保する観点から、樹脂粒子１０の水分散液と金ナノ粒子コロイド溶液を混合した後の静置時間は、０．５～５時間が好ましく、１～３時間がより好ましい。静置時間は、具体的には例えば、０．５，１，２，３，４，５時間であり、ここで例示した数値の何れか２つの間の範囲内であってもよい。
また、複合粒子１００の水への分散性を保持するために、混合の際、必要に応じてポリエチレングリコール等の分散剤を添加してもよい。
このように、本発明の複合粒子１００の製造方法を用いることで、粒子径の揃った金属粒子２０を樹脂粒子１０のシェル層１２内に集中的に配置することができ、標識物質として使用する際の視認性及び感度安定性、並びに耐久性に優れる複合粒子１００を製造することができる。
６．複合粒子１００の用途
本発明の複合粒子１００は、抗原又は抗体と結合させることにより、標識物質として、免疫学的測定法に好ましく適用できる。また、本発明の複合粒子１００を備える標識物質は、免疫学的測定用試薬の材料として好ましく適用できる。
本発明の複合粒子１００は、抗原又は抗体と結合させることにより、標識物質として、免疫学的測定法に好ましく適用できる。また、本発明の複合粒子１００を備える標識物質は、免疫学的測定用試薬の材料として好ましく適用できる。
また、複合粒子１００は、顔料、塗料、導電性材料、電極等の免疫学的測定用標識物質又は免疫学的測定用試薬以外の用途にも使用することができる。顔料や塗料に用いると鮮明な濃い色調が得られ、導電性材料や電極に用いると、機械的強度が向上し、且つ金属粒子に起因する導電性が発現する。
７．免疫学的測定法
本発明の複合粒子１００を備える標識物質を用いた免疫学的測定法もまた、本発明の１つである。免疫学的測定法としては、例えば、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＥＣＬＩＡ、ＣＬＩＡ、ＣＬＥＩＡ、ＨＡ、ＰＡ、ＬＡ等が挙げられるが、本発明の免疫学的測定法はこれらに限定されるものではない。また、本発明の免疫学的測定法は、本発明の複合粒子１００で標識した標識抗体を含む試薬と、測定試薬とを反応させ、測定試薬中に含まれる抗原と標識抗体とを結合させ、これを別の抗体が固定化されたクロマト担体に流すことにより、クロマト担体中で抗原を補足し、補足された抗原の標識をもとに分析するというイムノクロマト法として好適である。
本発明の複合粒子１００を備える標識物質を用いた免疫学的測定法もまた、本発明の１つである。免疫学的測定法としては、例えば、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡ、ＥＣＬＩＡ、ＣＬＩＡ、ＣＬＥＩＡ、ＨＡ、ＰＡ、ＬＡ等が挙げられるが、本発明の免疫学的測定法はこれらに限定されるものではない。また、本発明の免疫学的測定法は、本発明の複合粒子１００で標識した標識抗体を含む試薬と、測定試薬とを反応させ、測定試薬中に含まれる抗原と標識抗体とを結合させ、これを別の抗体が固定化されたクロマト担体に流すことにより、クロマト担体中で抗原を補足し、補足された抗原の標識をもとに分析するというイムノクロマト法として好適である。
本発明において、抗体としては特に制限はなく、例えば、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、遺伝子組み換えにより得られた抗体、抗原と結合能を有する抗体断片（Ｈ鎖、Ｌ鎖、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ'）２等）等を用いることができる。また、免疫グロブリンは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤの何れでもよい。抗体としては、具体的には例えば、抗ＰＳＡ抗体、抗ＡＦＰ抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗アデノウイルス抗体、抗インフルエンザウイルス抗体、抗ＨＣＶ抗体、抗ＩｇＧ抗体、抗ヒトＩｇＥ抗体等が挙げられる。
本発明において、測定試薬としては特に制限はなく、例えば、臨床検体、食品検体、環境サンプリング検体等が挙げられる。臨床検体としては、例えば、血液、血漿、血清、リンパ液、尿、唾液、膵液、胃液、喀痰、鼻や咽等の粘膜から採取したぬぐい液等の体液や便等が挙げられる。食品検体としては、例えば、液体飲料、半固形食品、固形食品等が挙げられる。環境サンプリング検体としては、例えば、土壌、河川、海水等の自然界のサンプル、工場内の生産ラインやクリーンルームに設置されたエアーサンプラーによるサンプリング検体、ふき取り検体等が挙げられる。
免疫学的測定法としてイムノクロマト法を採用する場合、標識抗体がクロマト担体に濃縮される。そのため、クロマト担体は、標識物質（複合粒子１００）の表面プラズモン共鳴により光吸収し、発色する。測定試薬中に含まれる抗原が一定量以上であれば、このような表面プラズモン共鳴による発色を目視で確認することができる。また、表面プラズモン共鳴による発色は、紫外可視分光光度計を用いて光学密度を測定することにより定量的に評価することができる。同様に、イムノクロマト法以外の免疫学的測定法を採用する場合であっても、表面プラズモン共鳴による発色は、紫外可視分光光度計を用いて光学密度を測定することにより定量的に評価することができる。また、表面プラズモン共鳴による発色は、画像解析ソフトを用いて、例えば８ビットグレースケールに変換した画像の平均グレー値（ＭＧＶ）を求めることにより定量的に評価することもできる。
以下、詳細な内容について実施例を用いて説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
１．各種測定・評価
実施例及び比較例について、下記の各種測定・評価を実施した。
実施例及び比較例について、下記の各種測定・評価を実施した。
（平均粒子径の測定）
樹脂粒子１０及び複合粒子１００の平均粒子径は、動的光散乱分析装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ ＺＳ、マルバーン・パナリティカル社製）を用いて、動的光散乱法により測定した。なお、金属粒子２０の平均粒子径及びＰＤＩについては、メーカーの公称値を採用した。
樹脂粒子１０及び複合粒子１００の平均粒子径は、動的光散乱分析装置（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ ｎａｎｏ ＺＳ、マルバーン・パナリティカル社製）を用いて、動的光散乱法により測定した。なお、金属粒子２０の平均粒子径及びＰＤＩについては、メーカーの公称値を採用した。
（金属粒子存在比率の算出）
複合粒子１００の分散液５００μＬを測定容器に計りとり、乾燥させた後に包埋樹脂（エポキシ樹脂Ｅｐｏｋ－８１２セット、和光純薬工業）２００ｍｇと混合した後、７０℃で１２時間熱硬化させ、得られた硬化体をミクロトーム（ＵＣ－６、Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により厚さ１００ｎｍの切片を作製した後、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、Ｈ－７６５０、日立ハイテク製）で複合粒子１００の断面写真を得た。得られた断面写真からランダムに選択した１０個の複合粒子１００について、金属粒子２０の円相当径から体積を計算し、その比率を存在箇所毎に算出した。なお、表１及び表２において、金属粒子２０における一部露出粒子２２及び表面吸着粒子２３、シェル層１２中の内包粒子２１、並びにコア部１１中の内包粒子２１の各存在比率は、それぞれ部分露出［体積％］、シェル層 内包［体積％］、コア部 内包［体積％］として示されている。
複合粒子１００の分散液５００μＬを測定容器に計りとり、乾燥させた後に包埋樹脂（エポキシ樹脂Ｅｐｏｋ－８１２セット、和光純薬工業）２００ｍｇと混合した後、７０℃で１２時間熱硬化させ、得られた硬化体をミクロトーム（ＵＣ－６、Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）により厚さ１００ｎｍの切片を作製した後、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ、Ｈ－７６５０、日立ハイテク製）で複合粒子１００の断面写真を得た。得られた断面写真からランダムに選択した１０個の複合粒子１００について、金属粒子２０の円相当径から体積を計算し、その比率を存在箇所毎に算出した。なお、表１及び表２において、金属粒子２０における一部露出粒子２２及び表面吸着粒子２３、シェル層１２中の内包粒子２１、並びにコア部１１中の内包粒子２１の各存在比率は、それぞれ部分露出［体積％］、シェル層 内包［体積％］、コア部 内包［体積％］として示されている。
（金属粒子被覆率の算出）
複合粒子１００の懸濁液をシリコン基板上にキャストし、加速電圧５０ｋＶで複合粒子１００を電界放出形走査電子顕微鏡（ＦＥ－ＳＥＭ、Ｓ－５２００、日立ハイテク製）で観察した。
図３に示すように、得られた複合粒子１００のＳＥＭ画像から、画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ Ｊ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）製）を用いて、複合粒子１００の円周３０に内接する正方形４０内にある金属粒子２０の合計面積（ΣＡｍ）を、前記正方形４０の面積（Ａ）で割った値を金属粒子被覆率（ΣＡｍ／Ａ）として算出した。
複合粒子１００の懸濁液をシリコン基板上にキャストし、加速電圧５０ｋＶで複合粒子１００を電界放出形走査電子顕微鏡（ＦＥ－ＳＥＭ、Ｓ－５２００、日立ハイテク製）で観察した。
図３に示すように、得られた複合粒子１００のＳＥＭ画像から、画像解析ソフト（Ｉｍａｇｅ Ｊ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（ＮＩＨ）製）を用いて、複合粒子１００の円周３０に内接する正方形４０内にある金属粒子２０の合計面積（ΣＡｍ）を、前記正方形４０の面積（Ａ）で割った値を金属粒子被覆率（ΣＡｍ／Ａ）として算出した。
２．実施例及び比較例
２－１．実施例１
（樹脂粒子１０（Ｐ１）の作製）
ポリスチレン（ＰＳｔ、Ｍｎ＝１７０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０３、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ社製）とアミン化ポリブタジエン（ＰＢ－ＮＨ２、Ｍｎ＝３５０００、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ社製）を、重量比で１：１の割合で混合し、ＴＨＦに溶解して０．１ｍｇ／ｍＬの溶液１ｍＬを調製した。この溶液に１．０ｍＬ／秒の速度で水１ｍＬを攪拌しながら加えた。全量の水を加えた後、攪拌を止め、常温常圧でＴＨＦを蒸発させ、樹脂粒子１０（Ｐ１）の分散液を得た。樹脂粒子１０（Ｐ１）の平均粒子径は５００ｎｍであった。
２－１．実施例１
（樹脂粒子１０（Ｐ１）の作製）
ポリスチレン（ＰＳｔ、Ｍｎ＝１７０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０３、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ社製）とアミン化ポリブタジエン（ＰＢ－ＮＨ２、Ｍｎ＝３５０００、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ社製）を、重量比で１：１の割合で混合し、ＴＨＦに溶解して０．１ｍｇ／ｍＬの溶液１ｍＬを調製した。この溶液に１．０ｍＬ／秒の速度で水１ｍＬを攪拌しながら加えた。全量の水を加えた後、攪拌を止め、常温常圧でＴＨＦを蒸発させ、樹脂粒子１０（Ｐ１）の分散液を得た。樹脂粒子１０（Ｐ１）の平均粒子径は５００ｎｍであった。
（複合粒子１００の作製）
樹脂粒子１０の分散液１００μＬに、金属粒子２０の分散液として金（Ａｕ）ナノ粒子コロイド溶液（Ａ１）（平均粒子径：２０ｎｍ、動的光散乱法により求めたＰＤＩ：０．１２、濃度：５２．９ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍＭ ＰＢＳ、ＢＢＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）を５００μＬ、分散剤として１ｇ／Ｌに調製したポリエチレングリコール水溶液を５００μＬ添加し、２時間静置することで複合粒子１００の分散液を得た。複合粒子１００の平均粒子径は５００ｎｍ、金属粒子存在比率は、シェル層内包が１００体積％であった。
樹脂粒子１０の分散液１００μＬに、金属粒子２０の分散液として金（Ａｕ）ナノ粒子コロイド溶液（Ａ１）（平均粒子径：２０ｎｍ、動的光散乱法により求めたＰＤＩ：０．１２、濃度：５２．９ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍＭ ＰＢＳ、ＢＢＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）を５００μＬ、分散剤として１ｇ／Ｌに調製したポリエチレングリコール水溶液を５００μＬ添加し、２時間静置することで複合粒子１００の分散液を得た。複合粒子１００の平均粒子径は５００ｎｍ、金属粒子存在比率は、シェル層内包が１００体積％であった。
（標識抗体の作製）
得られた複合粒子１００の分散液の複合粒子の濃度が２．５ｍｇ／ｍＬになるよう水を添加し、その分散液１ｍＬを遠心分離により上澄みを除去し、インフルエンザ抗体セット（日本シノバイオロジカル社製）を用い、カップリングバッファーを５００μＬ加え、超音波分散させた。さらに遠心分離により上澄みを除去し、カップリングバッファーを３００μＬ加え、超音波分散させた。次に、得られた分散液に、インフルエンザ抗体（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ Ｈ１Ｎ１）１ｍｇ／５０ｍｇメタノール溶液を２５μｇ、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）２５ｍｇ／５０μＬカップリングバッファーを３００μｇ、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ）２２．７ｍｇ／３００μＬカップリングバッファーを３００μｇ混合し、室温で約３時間攪拌して複合粒子１００に抗体を結合させた。終濃度が１％となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて２時間攪拌して表面をブロックした。１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離を行って上澄みを除去し、０．２％牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して、複合粒子１００で標識した２．５ｍｇ／ｍＬの標識抗体の分散液を得た。
得られた複合粒子１００の分散液の複合粒子の濃度が２．５ｍｇ／ｍＬになるよう水を添加し、その分散液１ｍＬを遠心分離により上澄みを除去し、インフルエンザ抗体セット（日本シノバイオロジカル社製）を用い、カップリングバッファーを５００μＬ加え、超音波分散させた。さらに遠心分離により上澄みを除去し、カップリングバッファーを３００μＬ加え、超音波分散させた。次に、得られた分散液に、インフルエンザ抗体（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ Ａ Ｈ１Ｎ１）１ｍｇ／５０ｍｇメタノール溶液を２５μｇ、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）２５ｍｇ／５０μＬカップリングバッファーを３００μｇ、スルホ－Ｎ－ヒドロキシスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ－ＮＨＳ）２２．７ｍｇ／３００μＬカップリングバッファーを３００μｇ混合し、室温で約３時間攪拌して複合粒子１００に抗体を結合させた。終濃度が１％となるように牛血清アルブミン溶液を添加し、室温にて２時間攪拌して表面をブロックした。１２０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離を行って上澄みを除去し、０．２％牛血清アルブミンを含む緩衝液に懸濁して、複合粒子１００で標識した２．５ｍｇ／ｍＬの標識抗体の分散液を得た。
（免疫学的測定法による評価）
ＥＬＩＳＡキット（日本シノバイオロジカル社製）を用い、各ＷＥＬＬに抗体が固定されているＥＬＩＳＡ用プレートの１ＷＥＬＬを洗浄し、抗原液（インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルス）１００μＬをＷＥＬＬに入れ、シールでカバーして２時間室温でインキュベートした。ＷＥＬＬを洗浄した後、作製した標識抗体の分散液１００μＬを添加し、１時間室温でインキュベートした。その後、ＷＥＬＬを洗浄して光学密度測定用試料を準備し、表面プラズモン共鳴による発色について、紫外可視光分光光度計（装置名：Ｖ－６７０、日本分光株式会社製）を用い、波長４５０ｎｍの光学密度測定を実施した。なお、光学密度測定は、抗原液の抗原濃度が１００ｐｇ／ｍＬ及び１０００ｐｇ／ｍＬの場合について実施した。測定結果を表１に示す。
ＥＬＩＳＡキット（日本シノバイオロジカル社製）を用い、各ＷＥＬＬに抗体が固定されているＥＬＩＳＡ用プレートの１ＷＥＬＬを洗浄し、抗原液（インフルエンザＡ（Ｈ１Ｎ１）ウイルス）１００μＬをＷＥＬＬに入れ、シールでカバーして２時間室温でインキュベートした。ＷＥＬＬを洗浄した後、作製した標識抗体の分散液１００μＬを添加し、１時間室温でインキュベートした。その後、ＷＥＬＬを洗浄して光学密度測定用試料を準備し、表面プラズモン共鳴による発色について、紫外可視光分光光度計（装置名：Ｖ－６７０、日本分光株式会社製）を用い、波長４５０ｎｍの光学密度測定を実施した。なお、光学密度測定は、抗原液の抗原濃度が１００ｐｇ／ｍＬ及び１０００ｐｇ／ｍＬの場合について実施した。測定結果を表１に示す。
２－２．実施例２
金属粒子２０の分散液として、金ナノ粒子コロイド溶液（Ａ２）（平均粒子径：１０ｎｍ、動的光散乱法により求めたＰＤＩ：０．１５、濃度：１０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍＭ ＰＢＳ、ＢＢＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）を用いた以外は、実施例１と同様の方法で複合粒子１００を作製して評価した。測定結果を表１に示す。
金属粒子２０の分散液として、金ナノ粒子コロイド溶液（Ａ２）（平均粒子径：１０ｎｍ、動的光散乱法により求めたＰＤＩ：０．１５、濃度：１０ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍＭ ＰＢＳ、ＢＢＩ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社製）を用いた以外は、実施例１と同様の方法で複合粒子１００を作製して評価した。測定結果を表１に示す。
２－３．実施例３
（樹脂粒子１０（Ｐ２）の作製）
ＰＳｔ（Ｍｎ＝１２６００、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ社製）とＰＢ－ＮＨ２（Ｍｎ＝１７００、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ社製）を、重量比で３：７の割合で混合し、ＴＨＦに溶解して０．１ｍｇ／ｍＬの溶液１ｍＬを調製した。この溶液に１ｍＬ／秒の速度で水１ｍＬを撹拌しながら加えた。全量の水を加えた後、撹拌を止め、常温常圧でＴＨＦを蒸発させ、樹脂粒子１０（Ｐ２）の分散液を得た。樹脂粒子１０（Ｐ２）の平均粒子径は１０００ｎｍであった。
（樹脂粒子１０（Ｐ２）の作製）
ＰＳｔ（Ｍｎ＝１２６００、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ社製）とＰＢ－ＮＨ２（Ｍｎ＝１７００、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ社製）を、重量比で３：７の割合で混合し、ＴＨＦに溶解して０．１ｍｇ／ｍＬの溶液１ｍＬを調製した。この溶液に１ｍＬ／秒の速度で水１ｍＬを撹拌しながら加えた。全量の水を加えた後、撹拌を止め、常温常圧でＴＨＦを蒸発させ、樹脂粒子１０（Ｐ２）の分散液を得た。樹脂粒子１０（Ｐ２）の平均粒子径は１０００ｎｍであった。
樹脂粒子１０の分散液として、樹脂粒子１０（Ｐ２）の分散液を用いた以外は、実施例１と同様の方法で複合粒子１００を作製して評価した。測定結果を表１に示す。
２－４．比較例１
複合粒子１００の分散液を用いず、その代わりとしてヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化金ナノ粒子コロイド溶液（Ａ３）（平均粒子径：２０ｎｍ、動的光散乱法により求めたＰＤＩ：０．１２、濃度：２．５ｍｇ／ｍＬ、Ｃｙｔｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いた以外は、実施例１と同様の方法で光学密度を評価した。測定結果を表２に示す。
複合粒子１００の分散液を用いず、その代わりとしてヒドロキシコハク酸イミド（ＮＨＳ）活性化金ナノ粒子コロイド溶液（Ａ３）（平均粒子径：２０ｎｍ、動的光散乱法により求めたＰＤＩ：０．１２、濃度：２．５ｍｇ／ｍＬ、Ｃｙｔｏｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社製）を用いた以外は、実施例１と同様の方法で光学密度を評価した。測定結果を表２に示す。
２－５．比較例２
（樹脂粒子１０（Ｐ３）の作製）
ＰＳｔ（Ｍｎ＝１７０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０３、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ社製）を、ＴＨＦに溶解して０．１ｍｇ／ｍＬの溶液１．０ｍＬを調製した。この溶液に１ｍＬ／秒の速度で水１ｍＬを撹拌しながら加えた。全量の水を加えた後、撹拌を止め、常温常圧でＴＨＦを蒸発させ、樹脂粒子１０（Ｐ３）の分散液を得た。樹脂粒子１０（Ｐ３）の平均粒子径は５００ｎｍであった。
（樹脂粒子１０（Ｐ３）の作製）
ＰＳｔ（Ｍｎ＝１７０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０３、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ社製）を、ＴＨＦに溶解して０．１ｍｇ／ｍＬの溶液１．０ｍＬを調製した。この溶液に１ｍＬ／秒の速度で水１ｍＬを撹拌しながら加えた。全量の水を加えた後、撹拌を止め、常温常圧でＴＨＦを蒸発させ、樹脂粒子１０（Ｐ３）の分散液を得た。樹脂粒子１０（Ｐ３）の平均粒子径は５００ｎｍであった。
樹脂粒子１０の分散液として樹脂粒子１０（Ｐ３）の分散液を用いた以外は実施例１と同様の方法で複合粒子１００の作製を試みたところ、樹脂粒子１０（Ｐ３）に金ナノ粒子が担持されず、複合粒子１００を作製できなかった。
２－６．比較例３
（樹脂粒子１０（Ｐ４）の作製）
ＰＢ－ＮＨ２（Ｍｎ＝３５０００、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ社製）を、ＴＨＦに溶解して０．１ｍｇ／ｍＬの溶液１．０ｍＬを調製した。この溶液に１ｍＬ／秒の速度で水１ｍＬを撹拌しながら加えた。全量の水を加えた後、撹拌を止め、常温常圧でＴＨＦを蒸発させ、樹脂粒子１０（Ｐ４）の分散液を得た。樹脂粒子１０（Ｐ４）の平均粒子径は５００ｎｍであった。
（樹脂粒子１０（Ｐ４）の作製）
ＰＢ－ＮＨ２（Ｍｎ＝３５０００、Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｏｕｒｃｅ社製）を、ＴＨＦに溶解して０．１ｍｇ／ｍＬの溶液１．０ｍＬを調製した。この溶液に１ｍＬ／秒の速度で水１ｍＬを撹拌しながら加えた。全量の水を加えた後、撹拌を止め、常温常圧でＴＨＦを蒸発させ、樹脂粒子１０（Ｐ４）の分散液を得た。樹脂粒子１０（Ｐ４）の平均粒子径は５００ｎｍであった。
樹脂粒子１０の分散液として樹脂粒子１０（Ｐ４）の分散液を用いた以外は実施例１と同様の方法で複合粒子１００を作製したが、複合粒子１００同士の凝集が著しく、評価できなかった。
表１～表２から、実施例１～実施例３の光学密度は比較例１～比較例３の光学密度よりも大きく、複合粒子１００を免疫学的測定用標識物質として用いた場合には視認性に優れることが分かる。また、抗原濃度が１００ｐｇ／ｍＬと低い場合であっても、抗原濃度が１０００ｐｇ／ｍＬの場合と同程度の光学密度が得られており、少量の抗原に対しても高感度の検出が可能であることが分かる。
１０：樹脂粒子、１１：コア部、１２：シェル層、２０：金属粒子、２１：内包粒子、２２：一部露出粒子、２３：表面吸着粒子、３０：円周、４０：正方形、１００：複合粒子
Claims (12)
- 樹脂粒子と、金属粒子とを備える複合粒子であって、
前記樹脂粒子が、コア部と、前記コア部の表面を被覆するシェル層とを備え、
前記コア部のガラス転移温度が５０～２００℃であり、
前記シェル層のガラス転移温度が－１００～０℃であり、
前記金属粒子の合計１００体積％に対して、前記金属粒子の８０～１００体積％が、前記シェル層に内包されているか、前記シェル層表面に存在している、複合粒子。 - 前記金属粒子の合計１００体積％に対して、前記金属粒子の８０～１００体積％が、前記シェル層に内包されている、請求項１に記載の複合粒子。
- 平均粒子径が２００～１５００ｎｍである、請求項１に記載の複合粒子。
- 前記金属粒子が、平均粒子径５～８０ｎｍ、動的光散乱法により求められる粒子径の多分散指数（ＰＤＩ）が０．２以下の金ナノ粒子である、請求項１に記載の複合粒子。
- 倍率１０万～５０万倍、加速電圧５０ｋＶの条件で電界放出型走査電子顕微鏡（ＦＥ－ＳＥＭ）により観察される前記複合粒子の画像から、前記複合粒子の円周に内接する正方形内にある前記金属粒子の合計面積（ΣＡｍ）を、前記正方形の面積（Ａ）で割ることで得られる金属粒子被覆率（ΣＡｍ／Ａ）が２０～８０％である、請求項１に記載の複合粒子。
- 前記シェル層がアミノ基含有ポリマーを含有する、請求項１に記載の複合粒子。
- 前記コア部がスチレン系ポリマーを含有する、請求項１に記載の複合粒子。
- 請求項１に記載の複合粒子を備えた標識物質。
- 前記複合粒子の表面に抗原又は抗体を有する、請求項８に記載の標識物質。
- 請求項８に記載の標識物質を用いた、免疫学的測定法。
- 請求項８に記載の標識物質を有する、免疫学的測定用試薬。
- 担持工程を備える、複合粒子の製造方法であって、
前記担持工程では、樹脂粒子に金属粒子を担持させ、
前記樹脂粒子が、コア部と、前記コア部の表面を被覆するシェル層とを備え、
前記コア部のガラス転移温度が５０～２００℃であり、
前記シェル層のガラス転移温度が－１００～０℃である、製造方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| JP2024004195 | 2024-01-15 | ||
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|---|---|
| WO2025154643A1 true WO2025154643A1 (ja) | 2025-07-24 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PCT/JP2025/000529 Pending WO2025154643A1 (ja) | 2024-01-15 | 2025-01-09 | 複合粒子、標識物質、免疫学的測定法、免疫学的測定用試薬、及び複合粒子の製造方法 |
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS63289454A (ja) * | 1987-02-27 | 1988-11-25 | イーストマン コダック カンパニー | 水不溶性粒子，免疫反応性試薬，分析要素及びその使用法 |
| JP5239004B2 (ja) * | 2006-09-20 | 2013-07-17 | 国立大学法人北海道大学 | 異方性ポリマー微粒子の製造法 |
| JP2017040631A (ja) * | 2015-08-21 | 2017-02-23 | 国立大学法人 千葉大学 | 複合粒子とその製造方法 |
| JP2017120242A (ja) * | 2015-12-29 | 2017-07-06 | 新日鉄住金化学株式会社 | 樹脂−金属複合体、標識物質、免疫学的測定法、免疫学的測定用試薬、アナライトの測定方法、アナライト測定用キット、及び、ラテラルフロー型クロマト用テストストリップ |
| WO2018043633A1 (ja) * | 2016-09-01 | 2018-03-08 | 国立大学法人東北大学 | 磁性体複合粒子およびその製造方法、並びに免疫測定用粒子 |
-
2025
- 2025-01-09 WO PCT/JP2025/000529 patent/WO2025154643A1/ja active Pending
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