WO2025100528A1 - 双性イオン含有組成物及びその使用 - Google Patents

双性イオン含有組成物及びその使用 Download PDF

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WO2025100528A1
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WO
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group
cation
carbon atoms
spheroids
cells
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PCT/JP2024/039820
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浩介 黒田
英周 平田
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Japan Science and Technology Agency
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Japan Science and Technology Agency
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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
    • A01N1/10—Preservation of living parts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Definitions

  • the present invention relates to a composition used for non-cryopreservation of cultured cell systems of multicellular groups, such as spheroids, organoids, and tissues, and uses thereof.
  • Regenerative medicine is expected to be useful in the treatment of intractable diseases such as myocardial infarction, stroke, and liver cirrhosis.
  • One aspect of regenerative medicine is transplanting cells into the affected area to be regenerated.
  • transplanting spheroids is expected to increase the rate of attachment because apoptosis is less likely to occur when transplanting single cells.
  • insulin production has been significantly improved from spheroids in which ⁇ cells and ⁇ cells from pancreatic islets of Langerhans coexist.
  • organoids are expected to have functions closer to those of organs than spheroids, and are therefore attracting more attention for their use in regenerative medicine.
  • cryopreservation which is used to preserve cells and microorganisms for long periods of time.
  • One known invention involves freezing and preserving spheroids at -196°C using a cryopreservative such as dimethyl sulfoxide (DMSO) and additives such as vitamin E (Patent Document 1).
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Patent Document 1 Patent Document 1
  • DMSO is classified as Class 3, the same as ethanol, by the United States Food and Drug Administration (FDA) and the International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH), and has been considered to have little or no significant toxicity, but is known to be relatively harmful as an organic solvent (Non-Patent Literature 1).
  • FDA United States Food and Drug Administration
  • ICH International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use
  • ICH International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use
  • the objective of the present invention is to enable storage for one month, and to achieve a recovery rate of live cells of 90% or more after storage by minimizing damage to the spheroids during non-cryopreservation.
  • cryopreservation compositions capable of forming a non-cryopreservation medium that can be utilized for such purposes.
  • compositions that does not freeze even at -25°C or below, does not have a melting point at storage temperatures, does not vitrify, and does not undergo supercooling could be a candidate for solving the above problems, and discovered that by using an aprotic zwitterionic compound in combination with two or more specific additives, a composition for non-cryopreservation of multicellular populations can be obtained that does not have a melting point at storage temperatures, does not vitrify, does not undergo supercooling, and does not freeze even at -25°C or below, and thus completed the present invention.
  • a composition for non-cryopreservation of a multicellular population comprising one or more aprotic zwitterionic compounds (A) and two or more additives (X) compatible with component (A).
  • a composition for non-cryopreservation of a multicellular population comprising one or more aprotic zwitterionic compounds (A) and two or more additives (X) compatible with component (A).
  • X additives
  • the aprotic compound (A) is represented by the general formula (1)
  • R 1 represents a linear alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 8 carbon atoms, or a C1-8 linear alkyl group -(OCH 2 CH 2 ) m -;
  • A is a cationic portion of the zwitterion and is a cation selected from the group consisting of imidazolium cation, phosphonium cation, ammonium cation, sulfonium cation, pyrazolium cation, pyridinium cation, pyrrolidinium cation, morpholinium cation, cyclopropenium cation, and piperidinium cation;
  • R2 represents an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms;
  • R3 represents an alkylene group having 2 to 4 carbon atoms;
  • m represents the number 1 or 2;
  • n represents a number from 0 to 10;
  • B represents an anion selected from -
  • the additive X is (i) a small molecule compound having no hydroxyl group or a compound having planarity, (ii) a compound having one or more hydroxyl groups, (iii) a peptide or protein, (iv) a polymer compound,
  • the multi-cell population can be preserved in a non-frozen state because it does not have a melting point at the preservation temperature, does not vitrify, does not supercool, and does not freeze even at temperatures below -25°C. This makes regenerative medicine using multi-cell populations industrially possible.
  • FIG. 1 shows DSC charts of compositions prepared by changing the ratio of OE 2 imC 3 C/DMSO/EG to 10/5/5, 10/10/10, 10/15/15, 10/20/20, and 10/25/25. This shows the recovery of viable cells from MAF1 spheroids when stored in OE 2 imC 3 C/DMSO/EG at ⁇ 25° C. for 3 days, and the viability of the surviving cells after storage relative to the cell population including dead cells.
  • This figure shows the recovery of viable cells when MAF1 spheroids were stored at -25°C for 20 days using the compositions OE2imC3C /DMSO/EG (10/20/20), C1imC3C / DMSO/EG (10/20/20), and C4imC3S ( 20/20/20), and the viability of the surviving cells after storage relative to the cell group including dead cells.
  • This figure shows the recovery rate of MAF1 after storage for 3 days at -25 °C in a composition consisting of OE2imC3C /DMSO, showing that the recovery rate was poor when the composition was solid (S) at the storage temperature and high when the composition was liquid (L).
  • S solid
  • L liquid
  • FIG. 1 shows the recovery rate of MAF1 spheroids after storing them at ⁇ 25° C. for 3 days in compositions of OE 2 imC 3 C/DMSO at 10/10, 10/20, 10/30, 10/40, and 10/50.
  • FIG. 1 shows the transition of the recovery rate of viable cells when MAF1 spheroids were stored at ⁇ 25° C. for 30 days using a composition of OE 2 imC 3 C/DMSO/EG (10/20/20).
  • FIG. 1 shows the transition of the recovery rate of viable cells when 5555 spheroids were stored at ⁇ 25° C. for 30 days using a composition of OE 2 imC 3 C/DMSO/EG (10/20/20).
  • FIG. 1 shows the transition of the recovery rate of viable cells when BOSC spheroids were stored at ⁇ 25° C. for 30 days using a composition of OE 2 imC 3 C/DMSO/EG (10/20/20).
  • FIG. 1 shows the change in viable cell recovery rate over time when MAF1 cells were preserved at ⁇ 25° C. for 30 days using a composition of OE 2 imC 3 C/DMSO/EG (10/20/20).
  • FIG. 1 shows the transition of the recovery rate of viable cells when 5555 cells were preserved at ⁇ 25° C. for 30 days using a composition of OE 2 imC 3 C/DMSO/EG (10/20/20).
  • FIG. 1 shows the transition of the recovery rate of viable cells when BOSC cells were preserved at ⁇ 25° C.
  • FIG. 13 shows the transition of the recovery rate of viable cells when MAF1 spheroids were stored at ⁇ 25° C. for 30 days using a composition that uses 0.9% NaCl instead of the zwitterionic liquid.
  • the right shows an optical microscope photograph of MDA-MB-231 cells stored in a 10% by mass aqueous solution of OE 2 imC 3 C at ⁇ 80° C.
  • the left shows an optical microscope photograph of MAF1 cell spheroids stored in a medium at room temperature.
  • This figure shows the difference in cell recovery rate when MAF1 spheroids were stored at -25 ° C for 10 days using test solutions containing different compositions of OE2imC3C , OE2imC3S , C1imC3C , and C1imC3S in addition to DMSO (20 wt %) and EG (20 wt%).
  • This figure shows the difference in cell recovery rate when MAF1 spheroids were treated for 1 hour at 0°C with test solutions containing different compositions of OE2imC3C, OE2imC3S, C1imC3C, and C1imC3S in addition to DMSO ( 20 wt %) and EG (20 wt%).
  • the term "multicellular population” refers to a collection of cells such as a spheroid, an organoid, a cell sheet, a tissue structure, a slice of an organ, or an organ.
  • the term “spheroid” refers to a three-dimensional structure of one or several types of cells.
  • the spheroid in the present invention is spherical and has a diameter of 0.01 to 0.1 mm. After forming a spheroid of iPS cells, the spheroid is differentiated, or after differentiating iPS cells, a spheroid is formed, and the spheroid is transplanted into a patient.
  • Spheroids can be obtained by culturing a single cell alone or together with multiple cells in three dimensions. The formation of extracellular matrices between cells that was not seen in single cell cultures, and sometimes cell-cell interactions, are observed, which is said to be closer to in vivo tissues than cells cultured in two dimensions. These matrices provide a scaffold for cells to move within the spheroids, just as cells move within living tissues. Thus, spheroids can also be used as an improved culture model for cell migration, differentiation, survival, and proliferation. Furthermore, in two-dimensional cultures, cells are only partially polarized, whereas in three-dimensional cell cultures, cell polarization can be seen throughout the entire cell. It is also said that cells grown in three dimensions show different gene expression than cells grown in two dimensions.
  • organoid refers to a three-dimensional structure of cells that is similar to the structure of an organ. In spheroids, only a relatively simple extracellular matrix exists, whereas in organoids, more complex intercellular interactions are observed through the extracellular matrix.
  • tissue structure refers to a structure consisting of cells and tissues. Sections of organs derived from kidney, liver, testis, etc., fall under this category, and may also correspond to materials for forming organoids.
  • the present invention provides a composition for non-cryopreservation that allows non-cryopreservation without the need for cryopreservation at low temperatures, even in areas where the site for forming spheroids is far from the site for using them, or where the social infrastructure does not have advanced cryopreservation facilities.
  • "storage under non-frozen conditions"("non-frozenstorage”) refers to storage in a state in which neither the water in the culture medium surrounding the cell group nor the water inside the cell group is frozen.
  • Non-frozen storage is performed in a storage space at liquid nitrogen temperature to 37°C, preferably -85°C to room temperature, and more preferably -50°C to 0°C.
  • the composition is non-frozen at -85°C to 4°C, preferably -30°C to -4°C, and more preferably -30°C to -15°C. Even if the composition is non-frozen in a stationary state, ice crystals may precipitate due to vibration during transportation. Therefore, it is necessary that the composition used in the present invention is not supercooled at the storage temperature.
  • One aspect of the present invention is a composition for non-cryopreservation of a multicellular population, which contains one or more aprotic zwitterionic compounds (A) and two or more additives (X) that are compatible with component (A).
  • A aprotic zwitterionic compounds
  • X additives
  • Aprotic Zwitterionic Compound (A) The aprotic zwitterionic compound (A) used in the present invention is represented by the general formula (1):
  • R 1 represents a linear alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 8 carbon atoms, or a C1-8 linear alkyl group -(OCH 2 CH 2 ) m -;
  • A is a cationic portion of a zwitterion and is a cation selected from the group consisting of an imidazolium cation, a phosphonium cation, an ammonium cation, a sulfonium cation, a pyrazolium cation, a pyridinium cation, a pyrrolidinium cation, a morpholinium cation, a cyclopropenium cation, and a piperidinium cation;
  • R2 represents an alkylene group having 1 to 4 carbon atoms;
  • R3 represents an alkylene group having 2 to 4 carbon atoms;
  • m represents the number 1 or 2;
  • n represents
  • a zwitterion is a molecule that has both a positive charge and a negative charge in one molecule.
  • the zwitterion of the present invention has a cationic portion represented by A and an anionic portion represented by B.
  • the zwitterion of the present invention may have one or more oxyalkylene groups between the cationic portion represented by A and the anionic portion represented by B.
  • the alkyl group refers to a saturated chain hydrocarbon group, and includes a linear alkyl group and a branched alkyl group. It is preferably an alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, and includes a linear or branched alkyl group having 1 to 8 carbon atoms. It is more preferably a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and more preferably a linear or branched alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • alkyl groups include methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl, n-butyl, isobutyl, sec-butyl, tert-butyl, n-pentyl, n-hexyl, n-heptyl, and n-octyl groups.
  • the alkenyl group refers to an unsaturated chain hydrocarbon group having one double bond, and includes linear alkenyl groups and branched alkenyl groups. Preferably, it includes a linear or branched alkenyl group having 2 to 8 carbon atoms.
  • the alkylene group refers to a divalent saturated chain hydrocarbon group, including linear and branched alkylene groups. It is preferably a linear or branched alkylene group having 1 to 4 carbon atoms, and more preferably a linear or branched alkylene group having 2 to 4 carbon atoms. Specific examples include a methylene group, an ethylene group, a trimethylene group, a propylene group, and a tetramethylene group.
  • R 1 represents a linear alkyl group having 1 to 8 carbon atoms, an alkenyl group having 2 to 8 carbon atoms, or a C1-8 linear alkyl group -(OCH 2 CH 2 )m-.
  • the linear alkyl group having 1 to 8 carbon atoms is preferably a linear alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, and more preferably a linear alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • these alkyl groups include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, an n-pentyl group, an n-hexyl group, an n-heptyl group, an n-octyl group, etc.
  • a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an n-butyl group, an n-pentyl group, and an n-hexyl group are preferred, and a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, and an n-butyl group are more preferred.
  • alkenyl group having 2 to 8 carbon atoms examples include linear or branched alkenyl groups having 2 to 8 carbon atoms.
  • a linear or branched alkenyl group having 2 to 6 carbon atoms is preferred, and a linear or branched alkenyl group having 2 to 4 carbon atoms is more preferred.
  • a vinyl group, a propenyl group, a butenyl group, a pentenyl group, or a hexenyl group is preferred, and a vinyl group, a 1-propenyl group, a 2-propenyl group (allyl group), or a butenyl group is more preferred.
  • the C1-8 straight chain alkyl group is preferably a straight chain alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, more preferably a straight chain alkyl group having 1 to 4 carbon atoms.
  • Specific examples of these alkyl groups include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an n-butyl group, an isobutyl group, an n-pentyl group, an n-hexyl group, an n-heptyl group, an n-octyl group, etc.
  • a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an n-butyl group, an n-pentyl group, and an n-hexyl group are preferred, and a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, and an n-butyl group are more preferred.
  • m is a number of 1 or 2.
  • R3 may be a linear or branched alkylene group having 2 to 4 carbon atoms, specifically an ethylene group, a trimethylene group, a propylene group, or a tetramethylene group. Therefore, OR3 is preferably an oxyethylene group, an oxytrimethylene group, an oxypropylene group, or an oxytetramethylene group. Although n may be a number from 0 to 10, a number from 1 to 10 is preferable, a number from 1 to 8 is more preferable, a number from 1 to 6 is even more preferable, and a number from 1 to 4 is even more preferable.
  • R4 is preferably a methyl group, an ethyl group, or the like.
  • anions selected from --COO.sup.- , --SO.sub.3.sup.- , and --OP.dbd.O( OH ) O.sup.- are preferred, with --COO.sup.- being more preferred.
  • A is a cationic portion of the zwitterion and is a cation selected from the group consisting of imidazolium cation, phosphonium cation, ammonium cation, sulfonium cation, pyrazolium cation, pyridinium cation, pyrrolidinium cation, morpholinium cation, cyclopropenium cation and piperidinium cation.
  • the imidazolium cation, the ammonium cation, the pyrazolium cation, the pyridinium cation, the pyrrolidinium cation, the morpholinium cation, or the piperidinium cation is preferred, the imidazolium cation, the pyrazolium cation, the pyridinium cation, the pyrrolidinium cation, or the piperidinium cation is more preferred, and the imidazolium cation is even more preferred.
  • imidazolium cation, pyrazolium cation, pyridinium cation, pyrrolidinium cation, or piperidinium cation is cationized by substituting at least one of the functional groups of R1 or R2 on the nitrogen, and the cation generated at this time forms a betaine structure together with the acidic group of the substituent of R2 .
  • Specific examples of cations with such a structure include:
  • the additive (X) used in the present invention may be two or more types compatible with the component (A), and specifically, two or more types may be selected from the following (i) to (Vi) for use. A plurality of types (i) to (Vi) may be selected from the same category.
  • compatibility does not necessarily mean compatibility with the component (A), but rather compatibility after the addition of a solvent such as water and a plurality of additives (X).
  • small molecular weight compounds without hydroxyl groups or compounds having planarity
  • small molecular weight compounds having polar functional groups other than hydroxyl groups preferably compounds with a molecular weight of 120 or less
  • compounds having planarity are suitably used, and compounds that pass through cell membranes and exhibit cell permeability are preferred.
  • dimethyl sulfoxide (DMSO) is cell-permeable, and is considered to permeate into cells and suppress the crystallization of free water.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • amide compounds such as dimethylformamide, dimethylacetamide, methylacetamide, acetamide, acrylamide, propionamide, methacrylamide, isobutyramide, lactamide, nicotinamide, and isophthalamide; organic solvents such as hexane, benzene, toluene, and ⁇ -valerolactone; aromatic (fluorescent dye) molecules such as propidium iodide; and steroid compounds such as cholesterol.
  • amide compounds such as dimethylformamide, dimethylacetamide, methylacetamide, acetamide, acrylamide, propionamide, methacrylamide, isobutyramide, lactamide, nicotinamide, and isophthalamide
  • organic solvents such as hexane, benzene, toluene, and ⁇ -valerolactone
  • aromatic (fluorescent dye) molecules such as propidium iodide
  • steroid compounds such as cholesterol.
  • Examples of compounds having one or more hydroxyl groups include monohydric alcohols, polyhydric alcohols, monosaccharides, disaccharides, and oligosaccharides.
  • Examples of the monohydric alcohol include methanol, ethanol, n-propanol, isopropanol, n-butanol, t-butanol, octanol, and phenol.
  • the polyhydric alcohol is preferably a dihydric or trihydric polyhydric alcohol, and specific examples thereof include ethylene glycol, propylene glycol, glycerin, diethylene glycol, dipropylene glycol, and diglycerin, with ethylene glycol, propylene glycol, and glycerin being more preferred.
  • Monosaccharides include aldoses and ketoses, which are classified according to the carbonyl group, trioses, tetroses, pentoses, hexoses, and heptoses, which are classified according to the number of carbon atoms, and sugar alcohols.
  • glyceraldehyde dihydroxyacetone, erythrose, erythrulose, ribose, ribulose, glucose, fructose, and sedoheptulose.
  • sugar alcohols such as erythritol, sorbitol, and mannitol, which are obtained by reducing aldehydes or ketones to alcohols, are also included in monosaccharides. Specifically, monosaccharides such as glucose and fructose, and sugar alcohols such as erythritol, sorbitol, and mannitol are more preferred.
  • disaccharides examples include maltose, cellobiose, lactose, sucrose, isomaltose, and trehalose.
  • oligosaccharides in which three or more units are linked together examples include raffinose, panose, maltotriose, cellotriose, melezitose, and gentianose, and examples of oligosaccharides in which four or more units are linked together include stachyose and cellotetraose.
  • polyhydric alcohols and sugars such as ethylene glycol, propylene glycol, and glycerin; monosaccharides such as glucose and fructose; sugar alcohols such as erythritol, sorbitol, and mannitol; and disaccharides such as maltose, cellobiose, lactose, sucrose, isomaltose, and trehalose are more preferred. It is believed that these polyhydric alcohols and sugars adhere to the outermost cell surface of spheroids and the like, thereby enhancing the protective effect during storage.
  • Peptides or Proteins Peptides are composed of 2 to 50 amino acids linked together, and examples of such peptides include whey peptides, fish peptides, soybean peptides, sardine peptides, and collagen peptides. It is believed that peptides enhance their protective effect during storage by electrostatically interacting with cells on the surface of spheroids and the like. Other examples include polypeptides known as antifreeze proteins that have the ability to inhibit ice crystal formation.
  • Polymer compounds may be either natural or non-natural, and examples of natural polymers include starch, glycogen, cellulose, alginic acid, pectin, agarose, carrageenan, etc.
  • examples of non-natural polymers include carboxymethylcellulose, polyvinyl alcohol, and vinyl alcohol oligomers.
  • Cellulose nanofibers are also sometimes used for culture, and can be used continuously as a storage medium. They are useful for regulating osmotic pressure and have the function of protecting cells on the surface of spheroids, etc.
  • surfactants examples include anionic surfactants, cationic surfactants, amphoteric surfactants, and nonionic surfactants.
  • nonionic surfactants are used.
  • nonionic surfactants include ester type, ether type, ester-ether type, and fatty acid alkanolamide type.
  • the ester type is characterized by a structure in which a polyhydric alcohol and a fatty acid are ester-bonded, and examples of such surfactants include glycerin fatty acid ester, sorbitan fatty acid ester, and sucrose fatty acid ester.
  • ether type surfactants include polyoxyethylene alkyl ether, polyoxyethylene alkyl phenyl ether, and polyoxyethylene polyoxypropylene glycol.
  • the ester-ether type surfactant is an ester of a polyhydric alcohol and a fatty acid to which ethylene oxide has been added to introduce a polyethylene ether side chain. All of these surfactants regulate the osmotic pressure and protect the cells in the outermost layer of the spheroid.
  • This zwitterionic polymer (2) has an aprotic zwitterion, i.e., a cationic moiety and an anionic moiety, in the side chain of at least l repeating units.
  • the zwitterionic structure is formed by X1 and a heterocyclic cation containing a nitrogen atom (N) in general formula (2) and an anion of Y1 .
  • the zwitterionic polymer (2) may have a zwitterionic structure formed by X2 and a heterocyclic cation containing a nitrogen atom (N) and an anion of Y2 in the side chain of m repeating units.
  • the term "zwitterionic structure" is a general term for compounds (internal salts) that have a positive charge and a negative charge at non-adjacent positions in the same molecule, have no dissociable hydrogen bonded to the positively charged atom, and have no charge as a whole molecule.
  • the zwitterionic polymer (2) is believed to have a protective effect on cell membranes and function as a non-cryopreservative by having zwitterions in the side chains of the repeating units.
  • the zwitterionic polymer (2) is believed to act on cell membranes and exhibit a non-cryopreservative function by changing from an associated state due to the zwitterions in the side chains to a dispersed state when used in combination with one or more additives selected from (i) to (v).
  • general formula (2) represents a homopolymer having a functional group of zwitterionic structure in the side chain.
  • general formula (2) represents a random or block copolymer having two types of zwitterionic structure.
  • general formula (2) represents a random or block copolymer having a repeating unit having a functional group of zwitterionic structure in the side chain and a repeating unit having Z in the side chain.
  • general formula (2) represents a ternary random or block copolymer.
  • p, q, and t each independently represent an integer of 0 to 6. Specifically, this portion is a single bond or a linear alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, and a single bond, a methylene group, an ethylene group, a trimethylene group, or a tetramethylene group is preferable.
  • this portion is more preferably a single bond, a methylene group, or an ethylene group, and further preferably a single bond or a methylene group.
  • p, q, and t may be the same or different.
  • Each of r and s independently represents an integer of 0 to 6, preferably an integer of 1 to 6.
  • This portion is preferably a linear alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, specifically, a methylene group, an ethylene group, a trimethylene group, a tetramethylene group, a pentamethylene group, or a hexamethylene group.
  • r and s may be the same or different.
  • X 1 and X 2 may be the same or different and each represents a carbon atom or a nitrogen atom.
  • Z represents a hydrogen atom, an aromatic hydrocarbon group having 6 to 10 carbon atoms which may be substituted with an alkyl group, a 5- to 6-membered aromatic heterocyclic group which may be substituted with an alkyl group, a nitrogen-containing heterocyclic ammonium salt which may be substituted with an alkyl group, a tetraalkylammonium salt, a tetraphenylphosphonium salt, a tetraalkylphosphonium salt, a trialkylsulfonium salt, or a linear or branched alkyl group having 1 to 22 carbon atoms which may have 1 to 3 oxygen atoms in the molecular chain.
  • examples of the alkyl groups include a hydrogen atom, a phenyl group, a naphthyl group, a C1-C22 alkyl-substituted phenyl group, a C1-22 alkyl-substituted naphthyl group, an imidazolyl group, a triazolyl group, a pyridyl group, a pyrrolyl group, a pyrazinyl group, a furyl group, a thienyl group, an oxazolyl group, a thiazolyl group, pyridinium chloride, a C1-C22 alkyl pyridinium chloride, an imidazolinium chloride, a C1-C22 alkyl imidazolinium chloride, a pyridinium bromide, a C1-C22 alkyl pyridinium bromide, an imidazolinium bromide, a C1-C22 alky
  • Z include a 5- to 6-membered aromatic heterocyclic group which may be substituted with an alkyl group or a nitrogen-containing heterocyclic ammonium salt which may be substituted with an alkyl group, and more preferred examples include an imidazolyl group, a triazolyl group, a pyridyl group, a pyrrolyl group, a pyrazinyl group, a furyl group, a thienyl group, an oxazolyl group, a thiazolyl group, pyridinium chloride, a C1-C22 alkylpyridinium chloride, an imidazolinium chloride, a C1-C22 alkylimidazolinium chloride, a pyridinium bromide, a C1-C22 alkylpyridinium bromide, an imidazolinium bromide, a C1-C22 alkylimidazolinium bromide, a pyrrolidin
  • an imidazolyl group More preferred are an imidazolyl group, a pyridyl group, pyridinium chloride, C1 to C22 alkyl pyridinium chloride, imidazolinium chloride, C1 to C22 alkyl imidazolinium chloride, pyridinium bromide, C1 to C22 alkyl pyridinium bromide, imidazolinium bromide, and C1 to C22 alkyl imidazolinium bromide.
  • the molecular weight of the zwitterionic polymer (2) must be determined based on the main chain structure, the side chain structure, the ratio of the side chains to the whole, etc., and a known measurement method that reflects the characteristics of each can be used. Furthermore, in the case of zwitterionic polymers, it is known that the conformation of the main chain changes depending on the type of zwitterion, pH, and the concentration of electrolytes such as NaCl.
  • the main chain structure of the zwitterionic polymer (2) may be a star, comb, or crosslinked structure, and any of these structures may be used for the purpose of the present invention, but the conformation of the main chain differs depending on the type of side chain.
  • the polymer can be expanded by adding an electrolyte such as NaCl to increase dispersibility in water.
  • the molecular weight of the zwitterionic polymer (2) is preferably of a certain size from the viewpoint of cell membrane structure and cell permeability, and from the viewpoint of the formation of ice crystals outside the cell and the solubility of poorly soluble substances, due to the zwitterionic structure present in the side chain.
  • the Mw is 10,000 or more and the Mn is 5,000 or more in terms of polyethylene oxide, and more preferably that the Mw is 10,000 to 2,000,000 and the Mn is 5,000 to 1,500,000.
  • the molecular weight distribution of the polymer is also taken into consideration.
  • Zwitterionic polymer (2) does not penetrate into cells, so it forms a matrix outside the cells and accumulates around the cell membrane outside the cells.
  • the zwitterionic molecule has a betaine structure, so it has an electric charge and cannot penetrate the cell membrane as a zwitterionic polymer.
  • the hydrophilic polymer is tethered to the cell membrane outside the cell, and the polymer accumulates around the cell membrane outside the cell.
  • a functional group that contributes to such accumulation is one having an alkylene group between the cation and anion in general formula (2).
  • Z has an alkyl group of C1 to C22, and further an alkyl group of C3 to C18.
  • the ratio of such substituents to the entire polymer is preferably 0.001 to 10 mol%, 0.01 to 1 mol%, and more preferably 0.1 to 0.5 mol%.
  • the additive (X) is used by selecting two or more kinds from the additives described in (i) to (vi) above.
  • Preferred combinations include combinations of two or more selected from (i) (e.g., a combination of DMSO and dimethylacetamide, a combination of DMSO and acetamide, a combination of DMSO and dimethylformamide, etc.); combinations of two or more selected from (ii) (e.g., a combination of methanol and propylene glycol, a combination of glycerol and propylene glycol, a combination of ethanol, ethylene glycol and sucrose, etc.); combinations of one or more selected from (i) and one or more selected from (ii) to (vi); combinations of one or more selected from (ii) and one or more selected from (i), (iii) to (vi); combinations of one or more selected from (i), one or more selected from (ii), and one or more selected from (iii) to (vi) (e.g., a combination
  • hydroxyl group-containing compounds selected from polyhydric alcohols such as ethylene glycol, propylene glycol, glycerin, etc., monosaccharides such as glucose, fructose, etc., sugar alcohols such as erythritol, sorbitol, mannitol, etc., and disaccharides such as maltose, cellobiose, lactose, sucrose, isomaltose, trehalose, etc., and one or more selected from peptides, polymer compounds, surfactants, and zwitterionic polymers (2); (4) a combination of DMSO, dimethylacetamide, and ethylene glycol or propylene glycol.
  • polyhydric alcohols such as ethylene glycol, propylene glycol, glycerin, etc.
  • monosaccharides such as glucose, fructose, etc.
  • sugar alcohols such as erythritol, sorbitol, mannitol, etc.
  • composition for non-cryopreservation of a multicellular population of the present invention contains one or more aprotic zwitterionic compounds (A) and two or more additives (X) that are compatible with a solution containing component (A).
  • compatibility does not necessarily mean compatibility with component (A), but rather compatibility after addition of a solvent such as water and multiple additives (X).
  • the aprotic zwitterionic compound (A) and additive (X) are preferably used in a ratio of 1:0.1 to 1:50 by mass, more preferably 1:0.5 to 1:5, and even more preferably 1:1 to 1:4.
  • the composition of the present invention may contain water, a cell culture medium, and a physiological saline component in addition to the aprotic zwitterionic compound (A) and two or more additives (X).
  • the composition of the present invention is preferably used in a ratio of aprotic zwitterionic compound (A):water of 0.1:10 to 4:10, more preferably 0.5:10 to 3:10, and even more preferably 0.5:10 to 2:10, in terms of mass.
  • the aprotic zwitterionic compound (A) increases the antifreeze property at low temperatures by mixing with water in the entire medium, and the additive (X) regulates the osmotic pressure, protects the entire spheroid, and increases the antifreeze property of the free water in the cells when it penetrates the cells.
  • the additive (X) regulates the osmotic pressure, protects the entire spheroid, and increases the antifreeze property of the free water in the cells when it penetrates the cells.
  • the cells on the surface of the aggregate are in direct contact with the medium, but since the extracellular matrix generated by the formation of spheroids acts as a barrier, it is unclear whether the additives penetrate into the cells inside.
  • some aprotic zwitterionic compounds (A) and additives (X) are thought to be useful in preventing free water in the intercellular matrix from freezing.
  • the high molecular weight additive (X) cannot penetrate between the cells as desired, it is thought to play a role in protecting the spheroid as a whole and regulating the osmotic pressure. From this point of view, when selecting two or more types of additives (X), it is preferable to select those that are thought to have different functions. Therefore, the combination of two or more types of additives (X) is preferably the above-mentioned combination.
  • Another aspect of the present invention is a method for preserving a multicellular population under non-freezing conditions, using the non-cryopreservation composition of the present invention.
  • the subject of non-cryopreservation in the method of the present invention is a multicellular population.
  • the multicellular population includes spheroids, organoids, cell sheets, tissue structures, organ slices, organs, and living organisms/individuals, with spheroids, organoids, cell sheets, and cell structures being preferred, and spheroids being more preferred.
  • the multicellular population may be added to the composition of the present invention and stored in an unfrozen state.
  • Unfrozen storage is performed in a storage space of liquid nitrogen temperature to 37°C, preferably -85°C to room temperature, and more preferably -50°C to 0°C.
  • the aprotic zwitterion used in the present invention can be produced with reference to J. Am. Chem. Soc. 139, 16052-16055 (2017).
  • C 4 imC 3 S was obtained by the same procedure as in Synthesis Example 2, except that 4-butylimidazole was used instead of 1-methylimidazole and 1,3-propanesultone was used instead of ethyl 4-bromobutyrate.
  • VimC 3 C was obtained in the same manner as in Synthesis Example 2, except that vinylimidazole (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was used instead of 1-methylimidazole.
  • VimC 3 C To 10 mL of pure water, 3 g (0.014 mmol) of VimC 3 C was added, and 22.83 g (0.0014 mmol) of 2,2′-azobis(isobutyronitrile) (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) was added as a polymerization initiator, followed by stirring for 16 hours at 80° C. The mixture was dialyzed against pure water and dried under reduced pressure to obtain Poly(VimC 3 C).
  • Tetrahydrofuran with stabilizer and hydrochloric acid were purchased from FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation.
  • Aluminum oxide active, basic, Brockmann 1
  • Amberlite IRN-78, ion exchange resin, nuclear grade was purchased from Alfa Aesar.
  • tert-butyl 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoate was purchased from Accela ChemBio.
  • OE 2 im was prepared with reference to Cellulose, 29, 3017-3024.
  • sodium hydroxide 2.5 equivalents, 55 g, 1.38 mol
  • water 55 g
  • the solution was added to a solution of diethylene glycol monomethyl ether (1 equivalent, 60 g, 0.5 mol) in toluene (1000 mL), followed by the addition of diethylene glycol monomethyl ether.
  • a catalytic amount of benzyltrimethylammonium hydroxide (10 mL) was added and stirred in an ice bath.
  • benzenesulfonyl chloride (97 g, 0.6 mol) was added dropwise under stirring and refluxed at 70° C. for 6 hours. After evaporating the toluene, the resulting solution was dissolved in dichloromethane, washed once with water (3000 mL), and dried over sodium sulfate to obtain the product.
  • OE2im 1-(2-(2-methoxyethoxy)ethyl)imidazole
  • an aqueous solution of sodium hydroxide was prepared using sodium hydroxide (2.5 equivalents, 56.4 g, 1.4 mol) and an equal amount of water (57 g).
  • the anion exchange resin was removed using filter paper (5C, ADVANTEC), and the reaction solution was transferred to a 50 mL eggplant flask. The resulting reaction solution was concentrated, and the neutralization reaction and the production reaction of OE 2 imC 2 OE 3 C were allowed to proceed. After that, diethyl ether was added to the 50 mL eggplant flask containing the product and washed (30 mL, 1 day, 3 times). After washing, the product was dried under reduced pressure to obtain a liquid product. The purity was 98%, and the yield was about 50% relative to tert-butyl 12-hydroxy-4,7,10-trioxadodecanoate.
  • 1-Ethylimidazole, toluene, dichloromethane, methanol, chloroform-d 1 , 99.8 atom % D with 0.03 vol % TMS, and dimethyl sulfoxide-d 6 , 99.9 atom % D with 0.03 vol % TMS were purchased from Kanto Chemical Co., Ltd.
  • Hydrochloric acid was purchased from FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation.
  • Amberlite IRN-78, ion exchange resin, nuclear grade was purchased from Alfa Aesar.
  • the DCM layer dried under reduced pressure was transferred to a 300 mL eggplant flask, an excess of water 100 mL was added, and the mixture was stirred at 60 ° C. for 1 hour to decompose unreacted p-toluenesulfonyl chloride.
  • the reaction solution was dissolved in DCM, charged into a separatory funnel, water was added, and the pH was measured using pH test paper, and separation was performed until the pH of the aqueous layer reached 6.
  • the DCM layer was dried under reduced pressure to obtain p-toluenesulfonyl PEG4 acid (2a) (properties: liquid, yield: 20% based on the initial amount of raw materials).
  • the DCM layer dried under reduced pressure was transferred to a 300 mL eggplant flask, an excess of water 100 mL was added, and the mixture was stirred at 60 ° C. for 1 hour to decompose unreacted p-toluenesulfonyl chloride.
  • the reaction solution was dissolved in DCM, charged into a separatory funnel, water was added, and the pH was measured using pH test paper, and separation was performed until the pH of the aqueous layer reached 6.
  • the DCM layer was dried under reduced pressure to obtain p-toluenesulfonyl PEG4 acid (2a) (properties: liquid, yield: 39% based on the initial amount of raw materials).
  • 1-Vinylimidazole, toluene, dichloromethane, methanol, chloroform- d1 , 99.8 atom% D with 0.03 vol% TMS, and dimethyl sulfoxide- d6 , 99.9 atom% D with 0.03 vol% TMS were purchased from Kanto Chemical Co., Ltd.
  • Hydrochloric acid was purchased from FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation.
  • Amberlite IRN-78, ion exchange resin, nuclear grade was purchased from Alfa Aesar.
  • the DCM layer dried under reduced pressure was transferred to a 300 mL eggplant flask, an excess of water 100 mL was added, and the mixture was stirred at 60 ° C. for 1 hour to decompose unreacted p-toluenesulfonyl chloride.
  • the reaction solution was dissolved in DCM, charged into a separatory funnel, water was added, and the pH was measured using pH test paper, and separation was performed until the pH of the aqueous layer reached 6.
  • the DCM layer was dried under reduced pressure to obtain p-toluenesulfonyl PEG4 acid (2a) (properties: liquid, yield: 39% based on the initial amount of raw materials).
  • the cells were cultured in a medium (high glucose containing L-glutamine and phenol red, Fujifilm Wako Co., Ltd.) containing 10% fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin-amphotericin B suspension (Fujifilm Wako Co., Ltd.) at 37°C in a humidified 5% CO2 atmosphere and were aliquoted in trypsin solution (0.5 w/v% trypsin-5.3 mmol/L EDTA ⁇ 4Na solution, phenol red-free, Fujifilm Wako Co., Ltd.).
  • trypsin solution 0.5 w/v% trypsin-5.3 mmol/L EDTA ⁇ 4Na solution, phenol red-free, Fujifilm Wako Co., Ltd.
  • Spheroids were prepared by the hanging drop method. To obtain spheroids, 2.0 x 106 cells were cultured, and 1 mL of 1.2 w/v% methylcellulose (Sigma-Aldrich)/DMEM (Fujifilm Wako Co., Ltd.) was added to make 2 mL, and 20 ⁇ L was dropped onto the back of the lid of the culture plate. The culture plate was then filled with PBS (Fujifilm Wako Co., Ltd.) and the lid of the culture plate was closed. The cells were statically cultured in a humidified incubator at 37 °C and 5% CO2 to obtain spheroids.
  • a humidified incubator at 37 °C and 5% CO2
  • cell recovery rate 10 ⁇ L of cell suspension was added to a 1.5 mL tube and mixed with 10 ⁇ L of trypan blue (Fujifilm Wako). The survival of cells derived from the spheroids was counted using a hemocytometer and calculated using the following formula.
  • the cell recovery rate of the spheroids was calculated from the number of cells that constituted the spheroids and survived before and after storage. It may be simply referred to as cell recovery rate or recovery rate.
  • the collected spheroids were cultured for 24 hours in a humidified incubator at 37°C and 5% CO2 .
  • the medium used was a medium (high glucose containing L-glutamine and phenol red, Fujifilm Wako Co., Ltd.) containing 10% fetal bovine serum and 1% penicillin-streptomycin-amphotericin B suspension (Fujifilm Wako Co., Ltd.).
  • DSC melting and freezing points of the solutions were measured using a differential scanning calorimeter (DSC60-A; Shimadzu Corporation).
  • the solutions (10 ⁇ L) were added to an aluminum pan and placed in the sample chamber of the calorimeter.
  • the samples were cooled to ⁇ 100° C. at 1° C./min and heated to 25° C. at 5° C./min.
  • Example 1 Evaluation of physical properties of OE2imC3C /DMSO/EG
  • the composition comprises: The mixture was prepared as follows: OE2imC3C 10 parts by weight, DMSO 5 parts by weight, EG 5 parts by weight, water 80 parts by weight, total 100 parts by weight, and the ratio of DMSO to EG was 1: 1. Specifically, the mass ratios of OE2imC3C /DMSO/EG were 10/5/5, 10/10/10, 10/15/15, 10/20/20, and 10/25/25, and the compositions are shown in Table 1.
  • Tm, Tf, frozen state, supercooling result The Tm and Tf were measured by DSC.
  • the DSC chart is shown in FIG.
  • whether freezing occurred ⁇ : not frozen, ⁇ : frozen, ⁇ : different depending on the lot
  • whether supercooling occurred at the storage temperature 25°C
  • MAF1 spheroids were stored at ⁇ 25° C. for 3 days with different composition ratios, and the cell recovery and viability after storage were examined. The results are shown in Table 1 and Figure 2. Good results were obtained for compositions that did not have a Tm at the storage temperature, were not visually frozen, and were not supercooled. In this case, the viability is expressed as (number of living cells in the cell group to be evaluated)/(number of living cells in the cell group to be evaluated+number of dead cells in the cell group to be evaluated) ⁇ 100% in the sample to be evaluated.
  • Example 2 Physicochemical properties and biological evaluation of C1imC3C /DMSO/EG A composition was prepared using C1imC3C instead of OE2imC3C in Example 1 , and MAF1 spheroids were stored at -25 °C for 20 days, after which the physicochemical properties and biological evaluation were performed. The results are shown in Table 1 and Figure 3. Although no Example number is given in Table 1, the results of a similar experiment using a composition of OE 2 imC 3 C/DMSO/EG (10/20/20) are also shown in Table 1 and FIG.
  • Example 3 Evaluation of physical properties of C4imC3S /DMSO/EG The recovery rate and survival rate of MAF1 spheroids stored at -25°C for 20 days using a composition of C4imC3S (20/20/20) instead of C1imC3C in Example 2 are shown in Table 1 and Figure 3. The survival rate was calculated in the same manner as in Example 2.
  • the ratio of zwitterion to additive was 10/40, which is the same as the standard ratio of 10/20/20 used in Examples 2 and 3, but the survival rate and recovery rate were poor.
  • One of the reasons for this is thought to be the relative decrease in DMSO concentration due to the addition of EG.
  • Example 4 Table 3 and FIG. 6 show the change in cell recovery rate over time when MAF1 spheroids were stored at ⁇ 25° C. for 30 days using the composition OE 2 imC 3 C/DMSO/EG (10/20/20).
  • Example 5 The change in cell recovery rate when 5555 spheroids were stored at ⁇ 25° C. for 30 days using the composition OE 2 imC 3 C/DMSO/EG (10/20/20) is shown in Table 3 and FIG.
  • Example 6 Table 3 and FIG. 8 show the change in cell recovery rate over time when BOSC spheroids were stored at ⁇ 25° C. for 30 days using the composition OE 2 imC 3 C/DMSO/EG (10/20/20).
  • Table 4 and FIG. 9 show the change in cell recovery rate over time when MAF1 cells were stored at ⁇ 25° C. for 30 days using the composition OE 2 imC 3 C/DMSO/EG (10/20/20).
  • Example 8 The change in cell recovery rate when 5555 cells were stored at -25°C for 30 days using the composition OE 2 imC 3 C/DMSO/EG (10/20/20) is shown in Table 4 and FIG.
  • Example 9 The change in cell recovery rate when BOSC cells were stored at ⁇ 25° C. for 30 days using the composition OE 2 imC 3 C/DMSO/EG (10/20/20) is shown in Table 4 and FIG.
  • FIG. 12 shows the change in recovery rate over time when MAF1 spheroids were stored at ⁇ 25° C. for 30 days using a composition that used 0.9% NaCl instead of the zwitterionic liquid.
  • Figure 13 shows an optical microscope photograph (right in Figure 13) of MDA-MB-231 cells stored at -80°C in a 10% by mass OE2imC3C aqueous solution, and an optical microscope photograph (left in Figure 13) of MAF1 cell spheroids stored in culture medium at room temperature.
  • spheroids are three-dimensional cell masses with diameters of about 10 to several hundred ⁇ m, so if ridges appear during cryopreservation, the spheroids will be damaged and the preservation condition will deteriorate.
  • the ridges visible at 50 ⁇ m intervals are ice crystals, and when preserving single cells, cells can exist between these ridges, making cryopreservation possible.
  • MAF1 spheroids were stored at -25°C for 10 days in test solutions containing different compositions of zwitterionic compounds OE2imC3C, OE2imC3S, C1imC3C , and C1imC3S in addition to DMSO ( 20 wt%) and EG (20 wt%), and the differences in cell recovery rates when the composition ratio of each zwitterionic compound was changed were examined.
  • Example 11 MAF1 spheroids were treated with test solutions containing different compositions of zwitterionic compounds OE2imC3C , OE2imC3S , C1imC3C , and C1imC3S in addition to DMSO ( 20 wt%) and EG (20 wt%) at 0°C for 1 hour to examine the difference in cell recovery rate when the composition ratio of each zwitterionic compound was changed.
  • DMSO 20 wt%)
  • EG 20 wt%
  • Example 12 The recovery rate of MAF1 spheroids was examined when the spheroids were stored at -85° C for 30 days using test solutions containing different compositions in which the ratios of the zwitterionic compounds OE2imC3C , OE2imC3S , C1imC3C , and C1imC3S were changed in addition to DMSO (20 wt %) and EG (20 wt%). As a result, it was confirmed that there is a combination in which the spheroids do not freeze even at -85°C when the composition of the present invention is used.
  • the multi-cell population can be preserved in a non-frozen state because it does not have a melting point at the preservation temperature, does not vitrify, does not supercool, and does not freeze even at temperatures below -25°C. This makes regenerative medicine using multi-cell populations industrially possible.

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Abstract

本発明の課題は、非凍結保存下でのスフェロイドのダメージを最小限に抑えることで保存後の回復率を高くできる組成物を提供することにある。　本発明は、１種又は２種以上の非プロトン性双性イオン化合物（Ａ）、及び成分（Ａ）と相溶し得る２種類以上の添加剤（Ｘ）を含有する、多細胞群の非凍結保存用組成物に関する。

Description

双性イオン含有組成物及びその使用
　本発明は、多細胞群の培養細胞系であるスフェロイド、オルガノイド、組織等を非凍結保存するために用いられる組成物及びその使用に関する。
　心筋梗塞、脳卒中、肝硬変を始めとする難治性疾患の治療においては再生医療が期待されている。再生医療の一つの態様として、再生させたい患部に細胞を移植することが考えられるが、一細胞で移植するよりもスフェロイドで移植した方が、アポトーシスが起こりにくいことから定着率が上がることが期待されている。また、膵臓ランゲルハンス島のα細胞とβ細胞を共存させたスフェロイドからはインスリンの産生が大幅に向上したことが報告されている。また、オルガノイドは、スフェロイドよりもより臓器に近い機能を有することが期待されていることから、より再生医療への活用に注目が集まっている。
　また、再生医療のみならず、現状において動物実験に対する制限が増していることから、創薬においてスフェロイドやオルガノイドを用いることも検討されている。また、制がん剤などの選択にあたって、患者の部位から細胞群を取り出して有効な治療薬を選択する試みも行われている。
　現状、再生医療においては、スフェロイドなどを自家移植することにより行われている。すなわち、現時点での再生医療では、病院にて患者の細胞からｉＰＳ細胞を作りスフェロイドを作製して移植することが行われている。そのため、この作業は最新の技術を持つ細胞培養施設が併設されているような限られた大病院でのみ治療が可能である。さらに、この作業に要する時間は、数か月かかる場合もありコスト的にも負担が大きく、スフェロイドの移植には期待があるものの、未だ汎用的に用いられる状況に至っていない。
　このような自家移植は、免疫応答などを考えると安全な方法であるとも言えるが、コスト的な代償も大きく、必ずしも工業的に汎用な技術とは言えない。再生医療をさらに推進するためには、スフェロイドの他家移植を行なうことが考えられるが、そのためにはスフェロイドを工業的に生産していくことが必要になる。そうすれば、世界各地に拠点施設を設けてスフェロイドを製造し、必要に応じてスフェロイドを病院に送り届けることができる。実現すれば、期間を短縮して必要な時期にスフェロイド治療を受けることができるようになり、かつ、大幅に再生医療のコストを下げることができる。
　このことを可能にするためには、スフェロイド等を一定期間保存することが課題の一つとして挙げられる。スフェロイドを保存する方法として、細胞や微生物を長期間保存するために低温凍結保存をすることが挙げられる。凍結保存にはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの冷凍保存剤及びビタミンＥなどの添加剤を用いて、スフェロイドの保存を－１９６℃で凍結保存を行なう発明が知られている（特許文献１）。ここで、ＤＭＳＯは、ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　Ｆｏｏｄ　ａｎｄ　Ｄｒｕｇ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ（ＦＤＡ）やｔｈｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｏｕｎｃｉｌ　ｆｏｒ　Ｈａｒｍｏｎｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ　Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ　ｆｏｒ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ　ｆｏｒ　Ｈｕｍａｎ　Ｕｓｅ（ＩＣＨ）によってエタノールなどと同等のｃｌａｓｓ　３に分類され、それほどの毒性はない、あるいはあっても微弱であるとされてきたものの、有機溶媒として相対的に有害であることが知られている（非特許文献１）。そのため、ＤＭＳＯなどの使用量を削減する方策として、アミノ酸系界面活性剤を用いることが提案されている（特許文献２）。本発明者らは、既に、冷凍保存用の非イオン性双性イオン化合物を提案している（特許文献３）。
国際公開第９８／３５０２１号明細書 特開２０２３－１１２４１７号公報 国際公開第２０２０／２３０７２１号明細書
Tuncer, S. et al. Low dose dimethyl sulfoxide driven gross molecular changes have the potential to interfere with various cellular processes. Sci. Rep. 8, 14828 (2018).
　世界の各所のスフェロイド生産拠点においてスフェロイドを製造し、地域の医療拠点にオーダーメイドのスフェロイドを提供する再生医療を実現するためには、冷凍で凍結保存をするよりも、－２５℃という汎用冷凍温度においてスフェロイドを非凍結保存する方が、スフェロイドそのものに対するダメージが少ないのみならず、社会インフラの普及状況を考えても有用である。
　本発明の課題は、保存期間としては１ヶ月間保存することができ、非凍結保存下でのスフェロイドのダメージを最小限に抑えることで保存後の生細胞の回収率を９０％以上とすることである。
　このような目的に利用できる非凍結保存培地を形成し得る低温保存用組成物は知られていない。
　本発明者らは、－２５℃以下においても凍結しない組成物であって、保存温度において融点を持たず、ガラス化せず、過冷却を起こさない組成物が、上記課題を解決する候補となり得るとの着想の下、非プロトン性双性イオン化合物と２種以上の特定の添加剤を組み合わせて用いれば、保存温度において融点を持たず、ガラス化せず、過冷却を起こさない、－２５℃以下においても凍結しない、多細胞群の非凍結保存用組成物が得られることを見出し、本発明を完成させた。
　本発明は、次の発明［１］～［４］を提供するものである。
［１］１種又は２種以上の非プロトン性双性イオン化合物（Ａ）、及び成分（Ａ）と相溶し得る２種類以上の添加剤（Ｘ）を含有する、多細胞群の非凍結保存用組成物。
［２］前記非プロトン性化合物（Ａ）が、一般式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
（Ｒ1は、炭素数１～８の直鎖アルキル基、炭素数２～８のアルケニル基、又はＣ１－８直鎖アルキル－（ＯＣＨ2ＣＨ2）ｍ－を示し；
Ａは、双性イオンのカチオン部であり、イミダゾリウムカチオン、ホスホニウムカチオン、アンモニウムカチオン、スルホニウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、ピロリジニウムカチオン、モルホリニウムカチオン、シクロプロペニウムカチオン及びピペリジニウムカチオンから選ばれるカチオンを示し；
Ｒ2は、炭素数１～４のアルキレン基を示し；
Ｒ3は、炭素数２～４のアルキレン基を示し；
ｍは、１又は２の数を示し；
ｎは、０～１０の数を示し；
Ｂは、－ＳＯ3－、－ＣＯＯ－、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ3）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ4）Ｏ－、及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＨ）Ｏ－から選ばれるアニオンを示し；
Ｒ4は炭素数１～８のヘテロ原子を有していても良いアルキル基を示す）
で表される非プロトン性双性イオン化合物である［１］記載の非凍結保存用組成物。
［３］前記添加剤Ｘが、
（ｉ）水酸基を有しない小分子化合物又は平面性を有する化合物、
（ｉｉ）水酸基を１個以上有する化合物、
（ｉｉｉ）ペプチド又はタンパク質、
（ｉｖ）高分子化合物、
（ｖ）界面活性剤、及び
（ｖｉ）次の一般式（２）で表される双性イオンポリマー又は双性イオンオリゴマーから選ばれる添加剤である、［１］又は［２］記載の非凍結保存用組成物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
（式中、
　Ｘ1及びＸ2は、同一でも異なってもよく、炭素原子又は窒素原子を示し；
　Ｙ1及びＹ2は、同一でも異なってもよく、－ＣＯＯ－、－ＳＯ3－、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ3）Ｏ－及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ5）Ｏ－から選ばれるアニオンを示し（ここで、Ｒ5は、水素原子又はメチル基を示す）；
　Ｚは、水素原子、アルキル基が置換していてもよい炭素数６～１０の芳香族炭化水素基、アルキル基が置換していてもよい５～６員の芳香族複素環式基、アルキル基が置換していてもよい窒素含有複素環式アンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩、テトラフェニルホスホニウム塩、テトラアルキルホスホニウム塩、トリアルキルスルホニウム塩、又は分子鎖中に１～３個の酸素原子を有していてもよい炭素数１～２２の直鎖又は分岐アルキル基を示し；
　ｅ及びｆは、それぞれ０又は１の整数を示し；
ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ各繰り返し単位の含有比率を示す数であって、０＜ｌ≦１、０≦ｍ＜１、０≦ｎ＜１、ｌ＋ｍ＋ｎ＝１を満たす数を示し；
　ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔは、それぞれ０～６の整数を示す）
［４］［１］～［３］のいずれかに記載の組成物を用いる、多細胞群を非凍結下で保存する方法。
　本発明の非凍結保存用組成物を用いれば、保存温度において融点を持たず、ガラス化せず、過冷却を起こさず、－２５℃以下においても凍結しないため、多細胞群を非凍結状態で保存できる。従って、多細胞群を用いる再生医療が工業的に可能となる。
ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯ／ＥＧの比率を１０／５／５、１０／１０／１０、１０／１５／１５、１０／２０／２０、１０／２５／２５を変えて作製した組成物のＤＳＣチャートである。 ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯ／ＥＧにより、－２５℃、３日間保存をした場合のＭＡＦ１スフェロイドの生存細胞の回収率（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）と、保存後の生存細胞の死細胞を含めた細胞群に対する生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）である。 ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯ／ＥＧ（１０／２０／２０）、Ｃ1ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯ／ＥＧ（１０／２０／２０）、及びＣ4ｉｍＣ3Ｓ（２０／２０／２０）の組成物を用いてＭＡＦ１スフェロイドを－２５℃で２０日間保存したときの生存細胞の回収率（ｒｅｃｏｖｅｒｙ）と、保存後の生存細胞の死細胞を含めた細胞群に対する生存率（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）を示す図である。 ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯからなる組成物においてＭＡＦ１を－２５℃で３日間保存した後の回収率について、組成物が保存温度で固体（Ｓ）となると回収率が悪く、液体（Ｌ）であると回収率が高くなることを示す図である。 ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯからなる組成物において、１０／１０、１０／２０，１０／３０、１０／４０、１０／５０の組成物を作製し、ＭＡＦ１スフェロイドを－２５℃で３日間保存した後の回収率を示す図である。 ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯ／ＥＧ（１０／２０／２０）の組成物を用いてＭＡＦ１スフェロイドを－２５℃で３０日間保存したときの生細胞の回収率の推移を示す図である。 ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯ／ＥＧ（１０／２０／２０）の組成物を用いて５５５５スフェロイドを－２５℃で３０日間保存したときの生細胞の回収率の推移を示す図である。 ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯ／ＥＧ（１０／２０／２０）の組成物を用いてＢＯＳＣスフェロイドを－２５℃で３０日間保存したときの生細胞の回収率の推移を示す図である。 ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯ／ＥＧ（１０／２０／２０）の組成物を用いてＭＡＦ１一細胞を－２５℃で３０日間保存したときの生細胞の回収率の推移を示す図である。 ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯ／ＥＧ（１０／２０／２０）の組成物を用いて５５５５細胞を－２５℃で３０日間保存したときの生細胞の回収率の推移を示す図である。 ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯ／ＥＧ（１０／２０／２０）の組成物を用いてＢＯＳＣ細胞を－２５℃で３０日間保存したときの生細胞の回収率の推移を示す図である。 双性イオン液体の代わりに０．９％ＮａＣｌを用いた組成物によりＭＡＦ１スフェロイドを－２５℃で３０日間保存したときの生細胞の回収率の推移を示す図である。 ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１０質量％ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ水溶液中－８０℃で保存したときの光学顕微鏡写真（右）、及びＭＡＦ１細胞のスフェロイドを培地中に常温保存したときの光学顕微鏡写真（左）を示す。 ＤＭＳＯ（２０ｗｔ％）とＥＧ（２０ｗｔ％）に加えて、ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ、ＯＥ2ｉｍＣ3Ｓ，Ｃ1ｉｍＣ3Ｃ、Ｃ1ｉｍＣ３Ｓの異なる組成を含む被験溶液を用いてＭＡＦ１スフェロイドを－２５℃で１０日間保存したときの細胞回収率の相異を示す図である。 ＤＭＳＯ（２０ｗｔ％）とＥＧ（２０ｗｔ％）に加えて、ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ、ＯＥ2ｉｍＣ3Ｓ，Ｃ1ｉｍＣ3Ｃ、Ｃ1ｉｍＣ3Ｓの異なる組成を含む被験溶液を用いてＭＡＦ１スフェロイドを０℃で１時間処理したときの細胞回収率の相異を示す図である。
　本発明において、「多細胞群」とは、スフェロイド、オルガノイド、細胞シート、組織構造体、臓器の切片、臓器、などの細胞の集まりを言う。
　本発明において「スフェロイド」とは、１種類又は数種類の細胞の３次元構造体をいう。本発明におけるスフェロイドは球状であり、その直径は０．０１～０．１ｍｍである。ｉＰＳ細胞のスフェロイドを形成した後スフェロイドを分化させ、またはｉＰＳ細胞を分化させた後にスフェロイド形成させ、そのスフェロイドを患者に移植する。
　スフェロイドは、一細胞を単独で、または複数一緒にして三次元培養することで得ることができる。細胞と細胞の間には一細胞の培養では見られなかった細胞外マトリックスの形成が認められ、時に細胞間相互作用が見られるなど、細胞を２次元で培養する場合より生体内の組織に近いとされる。これらのマトリックスは、細胞が生体組織内で動くように、スフェロイド内で細胞が動く足場となる。したがって、スフェロイドは、細胞移動、分化、生存、及び増殖のための改良された培養のモデルとして活用することもできる。さらに、二次元の培養では、細胞は部分的にしか分極しないが、三次元細胞培養では、細胞の分極が全体に見られる場合がある。三次元で増殖した細胞は、二次元で増殖した細胞とは異なる遺伝子発現を示すとも言われる。
　本発明において「オルガノイド」とは、細胞の三次元構造体が、臓器であればより臓器に近い構造を示すものをいう。スフェロイドでは比較的単純な細胞外マトリックスしか存在しないが、オルガノイドでは、細胞外マトリックスを介してより複雑な細胞間の相互作用が観察される。
　本発明において「組織構造体」とは、細胞及び組織からなるものをいう。腎臓、肝臓、精巣などに由来する臓器の切片はこれに当たり、オルガノイドを形成させる上で材料に相当するものである場合もある。
　本発明は、スフェロイドを形成する拠点と使用する拠点が距離的に離れていたり、社会インフラ的に高度な冷凍保存設備がない地域であっても、低温での凍結保存を行う必要がなく、非凍結保存を行うことができる非凍結保存用組成物を提供する。
　本発明においては、「非凍結下で保存」（「非凍結保存という」）とは、細胞群の周辺の培養液中の水も細胞群の内部の水も、凍結した状態にない状態での保存のことをいう。非凍結保存は、液体窒素温度～３７℃、好ましくは－８５℃～室温、さらに好ましくは－５０℃～０℃の保存空間で行われる。食品のコールドチェーンの活用を考えると、－８５℃～４℃、好ましくは－３０℃～－４℃、さらに好ましくは－３０℃～－１５℃において非凍結であることが良い。また、静置状体で非凍結であっても運搬中の振動などによって氷の結晶が析出することがある。そのため、本発明に用いられる組成物は、保存温度で過冷却でないことが必要となる。
　本発明の一態様は、１種又は２種以上の非プロトン性双性イオン化合物（Ａ）、及び成分（Ａ）と相溶し得る２種類以上の添加剤（Ｘ）を含有する、多細胞群の非凍結保存用組成物である。以下、各成分について説明する。
（非プロトン性双性イオン化合物（Ａ））
本発明に用いられる前記非プロトン性双性イオン化合物（Ａ）としては、一般式（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（Ｒ1は、炭素数１～８の直鎖アルキル基、炭素数２～８のアルケニル基、又はＣ１－８直鎖アルキル－（ＯＣＨ2ＣＨ2）ｍ－を示し；
Ａは、双性イオンのカチオン部であり、イミダゾリウムカチオン、ホスホニウムカチオン、アンモニウムカチオン、スルホニウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、ピロリジニウムカチオン、モルホリニウムカチオン、シクロプロペニウムカチオン及びピペリジニウムカチオンから選ばれるカチオンを示し；
Ｒ2は、炭素数１～４のアルキレン基を示し；
Ｒ3は、炭素数２～４のアルキレン基を示し；
ｍは、１又は２の数を示し；
ｎは、０～１０の数を示し；
Ｂは、－ＳＯ3－、－ＣＯＯ－、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ3）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ4）Ｏ－、及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＨ）Ｏ－から選ばれるアニオンを示し；
Ｒ4は炭素数１～８のヘテロ原子を有していても良いアルキル基を示す）
で表される非プロトン性双性イオン化合物が挙げられる。
　本発明において、双性イオンとは、１分子内に正電荷と負電荷の両方を持つ分子である。本発明の双性イオンでは、Ａで示されるカチオン部分と、Ｂで示されるアニオン部分とを有する。そして、本発明の双性イオンは、Ａで示されるカチオン部とＢで示されるアニオン部との間にオキシアルキレン基を１個又は複数有していてもよい。このようにカチオン部分とアニオン部分の間に、回転可能なオキシアルキレン構造を１個又は複数有することによって、カチオンとアニオンがそれぞれ独立して自由な位置をとることができるようになり、融点が下がり、かつ粘性が下がるものと考えられる。カチオン部とアニオン部との間の回転可能なオキシアルキレン構造の個数は、オキシエチレン構造の繰り返し数ｎは１～１０であるものが好ましく用いられ、ｎが１～６の場合がより好ましく、ｎが１～３の場合がさらに好ましい。
　本発明において、アルキル基とは、飽和の鎖状炭化水素基であり、直鎖アルキル基及び分岐鎖アルキル基が含まれる。好ましくは炭素数１～８のアルキル基であり、炭素数１～８の直鎖又は分岐鎖アルキル基が含まれる。さらに好ましくは炭素数１～６の直鎖又は分岐鎖アルキル基であり、より好ましくは炭素数１～４の直鎖又は分岐鎖アルキル基である。
　これらのアルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－ヘプチル基、ｎ－オクチル基などが挙げられる。
　本発明において、アルケニル基とは、２重結合を１個有する不飽和の鎖状炭化水素基であり、直鎖アルケニル基及び分岐鎖アルケニル基が含まれる。好ましくは炭素数２～８の直鎖又は分岐鎖アルケニル基が含まれる。さらに好ましくは炭素数２～６の直鎖又は分岐鎖アルケニル基であり、より好ましくは炭素数２～４の直鎖又は分岐鎖アルケニル基である。
　これらのアルケニル基の具体例としては、ビニル基、１－プロペニル基、２－プロペニル基（アリル基）、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基などが挙げられる。
　本発明において、アルキレン基とは、二価の飽和の鎖状炭化水素基であり、直鎖及び分岐鎖のアルキレン基が含まれる。好ましくは、炭素数１～４の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基であり、より好ましくは炭素数２～４の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基である。具体的には、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、プロピレン基、テトラメチレン基が挙げられる。
　Ｒ1は、炭素数１～８の直鎖アルキル基、炭素数２～８のアルケニル基、又はＣ１－８直鎖アルキル－（ＯＣＨ2ＣＨ2）ｍ－を示す。
　炭素数１～８の直鎖アルキル基としては、好ましくは炭素数１～６の直鎖アルキル基であり、より好ましくは炭素数１～４の直鎖アルキル基である。
　これらのアルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－ヘプチル基、ｎ－オクチル基などが挙げられる。このうち、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基が好ましく、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基がより好ましい。
　炭素数２～８のアルケニル基としては、炭素数２～８の直鎖又は分岐鎖アルケニル基が挙げられる。好ましくは炭素数２～６の直鎖又は分岐鎖アルケニル基であり、より好ましくは炭素数２～４の直鎖又は分岐鎖アルケニル基である。このうち、ビニル基、プロペニル基、ブテニル基、ペンテニル基、ヘキセニル基が好ましく、ビニル基、１－プロペニル基、２－プロぺニル基（アリル基）、ブテニル基がより好ましい。
　Ｃ１－８直鎖アルキル－（ＯＣＨ2ＣＨ2）ｍ－で示される基における、Ｃ１－８直鎖アルキル基としては、好ましくは炭素数１～６の直鎖アルキル基であり、より好ましくは炭素数１～４の直鎖アルキル基である。
　これらのアルキル基の具体例としては、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、イソブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基、ｎ－ヘプチル基、ｎ－オクチル基などが挙げられる。このうち、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基、ｎ－ペンチル基、ｎ－ヘキシル基が好ましく、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、ｎ－ブチル基がより好ましい。
　ｍは、１又は２の数である。
　Ｒ2は、炭素数１～４のアルキレン基を示し、炭素数１～４の直鎖又は分岐鎖アルキレン基が含まれる。具体的には、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、プロピレン基、テトラメチレン基が挙げられる。
　Ｒ3としては、炭素数２～４の直鎖又は分岐鎖のアルキレン基が挙げられ、具体的には、エチレン基、トリメチレン基、プロピレン基、テトラメチレン基が挙げられる。従って、ＯＲ3としては、オキシエチレン基、オキシトリメチレン基、オキシプロピレン基、オキシテトラメチレン基が好ましい。
　ｎとしては、０～１０の数であればよいが、１～１０の数が好ましく、１～８がより好ましく、１～６がさらに好ましく、１～４がよりさらに好ましい。
　Ｂは、双性イオンのアニオン部であり、－ＳＯ3 -、－ＣＯＯ-、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ-、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ3）Ｏ-、－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ4）Ｏ-、及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＨ）Ｏ-から選ばれるアニオンを示し、Ｒ4は炭素数１～８のヘテロ原子を有していても良いアルキル基である。
　ここで、Ｒ4としては、メチル基、エチル基等が好ましい。
　このうち、－ＣＯＯ-、－ＳＯ3 -、及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＨ）Ｏ-から選ばれるアニオンが好ましく、さらに－ＣＯＯ-が好ましい。
　Ａは、双性イオンのカチオン部であり、イミダゾリウムカチオン、ホスホニウムカチオン、アンモニウムカチオン、スルホニウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、ピロリジニウムカチオン、モルホリニウムカチオン、シクロプロペニウムカチオン及びピペリジニウムカチオンから選ばれるカチオンを示す。
　これらのカチオンのうち、イミダゾリウムカチオン、アンモニウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、ピロリジニウムカチオン、モルホリニウムカチオンン又はピペリジニウムカチオンが好ましく、イミダゾリウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、ピロリジニウムカチオン又はピペリジニウムカチオンがより好ましく、イミダゾリウムカチオンがよりさらに好ましい。
　また、イミダゾリウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、ピロリジニウムカチオン又はピペリジニウムカチオンは、Ｒ1又はＲ2の官能基の少なくとも１方が窒素上に置換してカチオン化しており、このときに生成するカチオンはＲ2の置換基の酸性基とベタイン構造を形成する。このような構造のカチオンとしては具体的には、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
を挙げることができる。
（添加剤（Ｘ））
　本発明に用いられる添加剤（Ｘ）としては、成分（Ａ）と相溶し得る２種類以上であればよいが、具体的には、次の（ｉ）～（Ｖｉ）から２種以上を選択して用いることができる。（ｉ）～（Ｖｉ）のうち、同じ分類から複数選択することもできる。ここで相溶とは、かならずしも成分（Ａ）と相溶する必要はなく、水などの溶媒および複数の添加剤（Ｘ）を加えた後に相溶していれば構わない。
（ｉ）水酸基を有しない小分子化合物、
（ｉｉ）水酸基を１個以上有する化合物、
（ｉｉｉ）ペプチド、
（ｉｖ）高分子化合物
（ｖ）界面活性剤、
（ｖｉ）次の一般式（２）で表される双性イオンポリマー又は双性イオンオリゴマー。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（式中、
　Ｘ1及びＸ2は、同一でも異なってもよく、炭素原子又は窒素原子を示し；
　Ｙ1及びＹ2は、同一でも異なってもよく、－ＣＯＯ－、－ＳＯ3－、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ3）Ｏ－及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ5）Ｏ－から選ばれるアニオンを示し（ここで、Ｒ5は、水素原子又はメチル基を示す）；
　Ｚは、水素原子、アルキル基が置換していてもよい炭素数６～１０の芳香族炭化水素基、アルキル基が置換していてもよい５～６員の芳香族複素環式基、アルキル基が置換していてもよい窒素含有複素環式アンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩、テトラフェニルホスホニウム塩、テトラアルキルホスホニウム塩、トリアルキルスルホニウム塩、又は分子鎖中に１～３個の酸素原子を有していてもよい炭素数１～２２の直鎖又は分岐アルキル基を示し；
　ｅ及びｆは、それぞれ０又は１の整数を示し；
ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ各繰り返し単位の含有比率を示す数であって、０＜ｌ≦１、０≦ｍ＜１、０≦ｎ＜１、ｌ＋ｍ＋ｎ＝１を満たす数を示し；
　ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔは、それぞれ０～６の整数を示す）
　（ｉ）水酸基を有しない小分子化合物又は平面性を有する化合物
　この小分子化合物としては、水酸基以外の極性官能基のある小分子化合物（好ましくは分子量１２０以下の化合物）や平面性を有する化合物が好適に用いられ、細胞膜を通り抜けて細胞浸透性を示す化合物が好ましい。
　中でも、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）は細胞浸透性があり、細胞内に浸透して自由水の結晶化を抑えていることが考えられる。本発明においては、ＤＭＳＯを単独で用いるよりも、他の添加剤（Ｘ）と組み合わせることで、ＤＭＳＯの毒性が抑制されている可能性が示唆されている。
　他にも、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、メチルアセトアミド、アセトアミド、アクリルアミド、プロピオンアミド、メタクリルアミド、イソブチルアミド、ラクトアミド、ニコチンアミド、イソフタルアミドなどのアミド化合物、ヘキサン、ベンゼン、トルエン、β―バレロラクトンなどの有機溶媒、ヨウ化プロピジウムのような芳香族を含む（蛍光色素）分子、コレステロールなどのステロイド系化合物が挙げられる。
（ｉｉ）水酸基を１個以上有する化合物
　水酸基を１個以上有する化合物としては、一価アルコール、多価アルコール、単糖類、２糖類、オリゴ糖などが挙げられる。
　一価アルコールとしては、メタノール、エタノール、ｎ－プロパノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール、ｔ－ブタノール、オクタノール、フェノールなどが挙げられる。
　多価アルコールとしては、２価又は３価の多価アルコールが好ましく、具体的にはエチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジエチレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリンなどが挙げられ、このうち、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンがより好ましい。
　単糖類としては、カルボニル基による分類であるアルドース及びケトースを含み、炭素数による分類であるトリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、ヘプトースを含む、また糖アルコールを含む。具体的には、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、エリトロース、エリトルロース、リボース、リブロース、グルコース、フルクトース、セドヘプツローズなどを挙げることができる。また、アルデヒドやケトンがアルコールに還元されているエリトリトール、ソルビトール、マンニトールなどの糖アルコールも単糖類に含まれる。具体的には、グルコース、フルクトースなどの単糖類、エリトリトール、ソルビトール、マンニトールなどの糖アルコールがさらに好ましい。
　２糖類としては、マルトース、セロビオース、ラクトース、スクロース、イソマルトース、トレハロースなどを挙げることができる。
　オリゴ糖としては、３個以上連結したものとしてラフィノース、パノース、マルトトリオース、セロトリオース、メレジトース、ゲンチアノースなどが、４個以上連結したものとしてスタキオース、セロテトラオースなどが挙げられる。
　これらの多価アルコール及び糖類のうち、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール、グルコース、フルクトースなどの単糖類、エリトリトール、ソルビトール、マンニトールなどの糖アルコール、マルトース、セロビオース、ラクトース、スクロース、イソマルトース、トレハロースなどの２糖類がより好ましい。
　これらの多価アルコールや糖類は、スフェロイド等の最外部の細胞表面に付着することで保存時の保護作用が高められていると考えられる。
（ｉｉｉ）ペプチド又はタンパク質
　ペプチドはアミノ酸が２～５０個程度連結されたものであり、ホエイペプチド、魚肉ペプチド、大豆ペプチド、イワシペプチド、コラーゲンペプチドなどが挙げられる。ペプチドはスフェロイド等の表面の細胞と静電的相互作用することで保存時の保護作用が高められていると考えられる。不凍タンパクと呼ばれる、氷晶形成抑制能をもつポリペプチドも挙げられる。
（ｉｖ）高分子化合物
　高分子化合物としては、天然、非天然を問わないが、天然のものとしては、デンプン、グリコーゲン、セルロースのほかアルギン酸、ペクチン、アガロース、カラギナンなどを挙げることが出来る。非天然高分子としては、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコールやビニルアルコールオリゴマーなども挙げられる。また、セルロースナノファイバーが培養に用いられることもあり、連続的に保存培地として用いることも出来る。浸透圧の調節として有益であり、スフェロイド等の表面の細胞を保護する機能がある。
（ｖ）界面活性剤
　界面活性剤としては、アニオン界面活性剤、カチオン界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン系界面活性剤が挙げられる。好ましくは、非イオン系界面活性剤が用いられる。非イオン系界面活性剤としては、エステル型、エーテル型、エステル・エーテル型、その他脂肪酸アルカノールアミド型が挙げられる。エステル型は、多価アルコールと脂肪酸がエステル結合した構造が特徴であり、グリセリン脂肪酸エステル、ソルビタン脂肪酸エステル、蔗糖脂肪酸エステルを挙げることができる。エーテル型としては、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールを挙げることができる。エステル・エーテル型は、多価アルコールと脂肪酸とからなるエステルに酸化エチレンを付加してポリエチレンエーテル側鎖を導入したものである。いずれのものも、浸透圧を調節し、スフェロイドの最外層の細胞を保護する。
（ｖｉ）前記一般式（２）で表される双性イオンポリマー又は双性イオンオリゴマー
　この双性イオンポリマー（２）は、少なくともl個の繰り返し単位の側鎖に、非プロトン性双性イオン、すなわち、カチオン部分とアニオン部分とを有する。当該双性イオン構造は、一般式（２）中のＸ1及び窒素原子（Ｎ）を含む複素環式カチオンとＹ1のアニオンとで形成される。また、ｍ個の繰り返し単位の側鎖に、Ｘ2及び窒素原子（Ｎ）を含む複素環式カチオンとＹ2のアニオンとで形成される双性イオン構造を有していてもよい。
　本発明において双性イオン構造とは、正電荷と負電荷を同一分子内の隣り合わない位置に持ち、正電荷を持つ原子に解離しうる水素が結合しておらず、分子全体としては電荷を持たない化合物（分子内塩）の総称である。
　このように、双性イオンポリマー（２）の繰り返し単位の側鎖に双性イオンを有することにより、細胞膜に対する保護作用を示し、非凍結保存剤として機能するもの考えられる。また、双性イオンポリマー（２）は、前記（ｉ）～（ｖ）から選ばれる１種以上の添加剤と併用することにより、前記側鎖の双性イオンにより会合していた状態から分散状態になるため、細胞膜に作用して非凍結保存機能を示すものと考えられる。
　一般式（２）において、ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ各繰り返し単位の含有比率を示す数であって、０＜ｌ≦１、０≦ｍ＜１、０≦ｎ＜１、ｌ＋ｍ＋ｎ＝１を満たす数を示す。
　ｍ＝ｎ＝０のときは、一般式（２）は側鎖に双性イオン構造の官能基を持つホモポリマーを表す。ｍが０を超える数を示し、ｎ＝０のときは、一般式（２）は２種類の双性イオン構造を有するランダム又はブロック共重合体であることを表す。ｍ＝０であり、ｎが０を超える数を示すときは、一般式（２）は、側鎖に双性イオン構造の官能基を持つ繰り返し単位と、側鎖にＺを有する繰り返し単位とを有するランダム又はブロック共重合体であることを表す。ｍ及びｎが０を超える数を示すときは、一般式（２）は三元系のランダム又はブロック共重合体であることを表す。
　ｐ、ｑ及びｔは、それぞれ独立して０～６の整数を示す。具体的には、この部分は、単結合又は炭素数１～６の直鎖アルキレン基であり、単結合、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基が好ましい。また、この部分は、生体試料の凍結保護作用の観点から、単結合、メチレン基又はエチレン基がより好ましく、単結合又はメチレン基がさらに好ましい。ｐ、ｑ及びｔは、同一でも異なっていてもよい。
　ｒ及びｓは、それぞれ独立して０～６の整数を示し、１～６の整数が好ましい。この部分は、炭素数１～６の直鎖アルキレン基が好ましく、具体的には、メチレン基、エチレン基、トリメチレン基、テトラメチレン基、ペンタメチレン基、ヘキサメチレン基が好ましい。ｒ及びｓは、同一でも異なっていてもよい。
　一般式（２）において、Ｘ1及びＸ2は、同一でも異なってもよく、炭素原子又は窒素原子を示す。
　一般式（２）中、Ｘ1及び窒素原子（Ｎ）を含む複素環式カチオンとしては、イミダゾリウムカチオン（Ｘ1＝Ｎ、ｅ＝０）、ピリジニウムカチオン（Ｘ1＝Ｃ、ｅ＝１）、ピロリニウムカチオン（Ｘ1＝Ｃ、ｅ＝０）、ピラジニウムカチオン（Ｘ1＝Ｎ、ｅ＝１）が挙げられる。このうち、イミダゾリウムカチオン（Ｘ1＝Ｎ、ｅ＝０）、ピリジニウムカチオン（Ｘ1＝Ｃ、ｅ＝１）が好ましい。
　一般式（１）中、Ｘ2及び窒素原子（Ｎ）を含む複素環式カチオンとしては、イミダゾリウムカチオン（Ｘ2＝Ｎ、ｆ＝０）、ピリジニウムカチオン（Ｘ2＝Ｃ、ｆ＝１）、ピロリニウムカチオン（Ｘ2＝Ｃ、ｆ＝０）、ピラジニウムカチオン（Ｘ2＝Ｎ、ｆ＝１）が挙げられる。このうち、イミダゾリウムカチオン（Ｘ2＝Ｎ、ｆ＝０）、ピリジニウムカチオン（Ｘ2＝Ｃ、ｆ＝１）が好ましい。
　Ｙ1及びＹ2は、同一でも異なってもよく、－ＣＯＯ-、－ＳＯ3 -、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ-、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ3）Ｏ-及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ1）Ｏ-から選ばれるアニオンを示す。Ｙ1及びＹ2としては、－ＣＯＯ-、－ＳＯ3 -及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＨ）Ｏ-から選ばれるアニオンが好ましく、－ＣＯＯ-及び－ＳＯ3 -から選ばれるアニオンがより好ましく、－ＣＯＯ-がさらに好ましい。
　Ｚは、水素原子、アルキル基が置換していてもよい炭素数６～１０の芳香族炭化水素基、アルキル基が置換していてもよい５～６員の芳香族複素環式基、アルキル基が置換していてもよい窒素含有複素環式アンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩、テトラフェニルホスホニウム塩、テトラアルキルホスホニウム塩、トリアルキルスルホニウム塩、又は分子鎖中に１～３個の酸素原子を有していてもよい炭素数１～２２の直鎖又は分岐アルキル基を示す。
　具体的には、水素原子、フェニル基、ナフチル基、Ｃ１～Ｃ２２アルキル置換フェニル基、Ｃ１～２２アルキル置換ナフチル基、イミダゾリル基、トリアゾリル基、ピリジル基、ピロリル基、ピラジニル基、フリル基、チエニル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、ピリジニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピリジニウムクロリド、イミダゾリニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルイミダゾリニウムクロリド、ピリジニウムブロミド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピリジニウムブロミド、イミダゾリニウムブロミド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルイミダゾリニウムブロミド、ピロリジニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピロリジニウムクロリド、ピロリジニウムブロミド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピロリジニウムブロミド、テトラメチルアンモニウムクロリド、Ｃ２～Ｃ２２アルキルトリメチルアンモニウムクロリド、テトラメチルアンモニウムブロミド、Ｃ２～Ｃ２２アルキルトリメチルアンモニウムブロミド、テトラフェニルホスホニウムクロリド、テトラフェニルホスホニウムブロミド、トリメチルスルホニウムクロリド、トリメチルスルホニウムブロミド、Ｃ１～Ｃ２２直鎖又は分岐鎖アルキル基、エトキシエチル基、エトキシエトキシエチル基、エトキシエトキシエトキシエチル基等が挙げられる。
　好ましいＺとしては、アルキル基が置換していてもよい５～６員の芳香族複素環式基又はアルキル基が置換していてもよい窒素含有複素環式アンモニウム塩が挙げられ、より好ましくは、イミダゾリル基、トリアゾリル基、ピリジル基、ピロリル基、ピラジニル基、フリル基、チエニル基、オキサゾリル基、チアゾリル基、ピリジニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピリジニウムクロリド、イミダゾリニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルイミダゾリニウムクロリド、ピリジニウムブロミド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピリジニウムブロミド、イミダゾリニウムブロミド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルイミダゾリニウムブロミド、ピロリジニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピロリジニウムクロリド、ピロリジニウムブロミド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピロリジニウムブロミドが挙げられる。
　さらに好ましくは、イミダゾリル基、ピリジル基、ピリジニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピリジニウムクロリド、イミダゾリニウムクロリド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルイミダゾリニウムクロリド、ピリジニウムブロミド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルピリジニウムブロミド、イミダゾリニウムブロミド、Ｃ１～Ｃ２２アルキルイミダゾリニウムブロミドが挙げられる。
　双性イオンポリマー（２）の分子量は、主鎖の構造、側鎖の構造や全体に占める比率などから考慮する必要があり、それぞれの特徴を反映した公知の測定手法を用いることが出来る。さらに、双性イオンポリマーの場合は、双性イオンの種類によりｐＨやＮａＣｌなどの電解質濃度により主鎖のコンフォメーションが変化することが知られている。
　双性イオンポリマー（２）の主鎖の構造は、星形、櫛形、架橋構造などが考えられ、いずれの構造のものであっても本発明の目的に用いることが可能であるが、主鎖のコンフォメーションは側鎖の種類によって異なる。主鎖が直鎖状のポリマーの場合には、ＮａＣｌなどの電解質等の添加によりポリマーを広げることで、水への分散性を高めることができる。また、双性イオンポリマー（２）は、側鎖に存在する双性イオン構造により、細胞膜の構造や細胞透過性の観点から、および細胞外における氷晶の形成、難溶性物質の溶解性に関係することから、その分子量は、一定程度の大きさであることが好ましい。分子鎖を電解質により広げた状態において、ポリエチレンオキサイド換算で、Ｍｗが１万以上、Ｍｎが５０００以上が好ましく、Ｍｗが１万以上２００万以下、Ｍｎが５０００以上１５０万以下がより好ましい。さらに、ポリマーの分子量分布も考慮される。
　双性イオンポリマー（２）は細胞内に侵入しないため細胞の外側でマトリックスを形成し細胞の外側の細胞膜周辺に集積する。その理由の一つとして双性イオン分子がベタイン構造を有することから電荷を有し、双性イオンポリマーとして細胞膜に侵入することができないことが考えられる。そして、ポリマー側鎖に細胞膜と親和性が高い疎水性の官能基が存在し、その官能基が細胞膜に細胞の外側から差し込まれた形になると、親水性ポリマーが細胞の外側で細胞膜に繋留され、ポリマーが細胞の外側の細胞膜周辺に集積されることになることが考えられる。このような性質をスフェロイドなどの多細胞集合体で考えると、最も外層の細胞を保護することにより、細胞集合体を保護する役割が期待される。このような集積に寄与する官能基としては、一般式（２）中のカチオンとアニオンとの間にアルキレン基を有することが挙げられる。また、ＺがＣ１～Ｃ２２のアルキル基、さらにＣ３～Ｃ１８のアルキル基を有する場合も好ましい。また、そのような置換基の存在比は、ポリマー全体に対して０．００１から１０モル％、０．０１～１モル％、より好ましくは０．１～０．５モル％であることが好ましい。
　添加剤（Ｘ）は、前記（ｉ）～（ｖｉ）記載の添加剤から２種類以上を選択して用いられる。好ましい組み合わせは、（ｉ）から選ばれる２種以上の組み合わせ（例えば、ＤＭＳＯとジメチルアセトアミドの組み合わせ、ＤＭＳＯとアセトアミドの組み合わせ、ＤＭＳＯとジメチルホルムアミドの組み合わせなど）；（ｉｉ）から選ばれる２種以上の組み合わせ（例えば、メタノールとプロピレングリコールの組み合わせ、グリセロールとプロピレングリコールの組み合わせ、エタノールとエチレングリコールとスクロースの組み合わせなど）；（ｉ）から選ばれる１種以上と、（ｉｉ）～（ｖｉ）から選ばれる１種以上との組み合わせ；（ｉｉ）から選ばれる１種以上と、（ｉ）、（ｉｉｉ）～（ｖｉ）から選ばれる１種以上との組み合わせ；（ｉ）から選ばれる１種以上と、（ｉｉ）から選ばれる１種以上と、（ｉｉｉ）～（ｖｉ）から選ばれる１種以上との組み合わせ（例えば、ＤＭＳＯとアセトアミドとプロピレングリコールとポリビニルアルコールと不凍タンパクとｐｏｌｙＺＩの組み合わせなど）が挙げられる。
　より具体的には、（１）ＤＭＳＯと、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール、グルコース、フルクトースなどの単糖類、エリトリトール、ソルビトール、マンニトールなどの糖アルコール、及びマルトース、セロビオース、ラクトース、スクロース、イソマルトース、トレハロースなどの２糖類から選ばれる１種以上の水酸基含有化合物との組み合わせ；（２）ＤＭＳＯと、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール、グルコース、フルクトースなどの単糖類、エリトリトール、ソルビトール、マンニトールなどの糖アルコール、及びマルトース、セロビオース、ラクトース、スクロース、イソマルトース、トレハロースなどの２糖類から選ばれる１種以上の水酸基含有化合物と、ペプチド、高分子化合物、界面活性剤及び双性イオンポリマー（２）から選ばれる１種以上との組み合わせ；（３）エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリンなどの多価アルコール、グルコース、フルクトースなどの単糖類、エリトリトール、ソルビトール、マンニトールなどの糖アルコール、及びマルトース、セロビオース、ラクトース、スクロース、イソマルトース、トレハロースなどの２糖類から選ばれる１種以上の水酸基含有化合物と、ペプチド、高分子化合物、界面活性剤及び双性イオンポリマー（２）から選ばれる１種以上との組み合わせ；（４）ＤＭＳＯとジメチルアセトアミドとエチレングリコール又はプロピレングリコールの組み合わせなどが挙げられる。
（組成物）
　本発明の多細胞群の非凍結保存用組成物は、１種又は２種以上の非プロトン性双性化合物（Ａ）、及び成分（Ａ）を含む溶液と相溶し得る２種類以上の添加剤（Ｘ）を含有する。ここで相溶とは、かならずしも成分（Ａ）と相溶する必要はなく、水などの溶媒及び複数の添加剤（Ｘ）を加えた後に相溶していれば構わない。非凍結保存に用いる場合、非プロトン性双性イオン化合物（Ａ）と添加剤（Ｘ）は、質量換算で１：０．１～１：５０の比率で用いるのが好ましく、１：０．５～１：５の割合で用いるのがより好ましく、１：１～１：４の割合で用いるのがさらに好ましい。
　また、本発明の組成物には、非プロトン性双性イオン化合物（Ａ）と２種以上の添加剤（Ｘ）以外に、水、細胞培養用の培地、生理食塩水成分を含んでいてもよい。この場合、本発明の組成物は、質量換算で、非プロトン性双性イオン化合物（Ａ）：水が０．１：１０～４：１０の割合で用いるのが好ましく、０．５：１０～３：１０の割合で用いることがより好ましく、０．５：１０～２：１０の割合で用いることがさらに好ましい。非プロトン性双性イオン化合物（Ａ）は培地全体で水と混合することで低温での不凍性を増大させており、添加剤（Ｘ）は、浸透圧の調節、スフェロイド全体の保護、細胞内に浸透した場合は細胞内の自由水の不凍性を増大させていることが考えられる。しかしながら、スフェロイド等の場合、集合体表面の細胞は培地と直接接するが、スフェロイドになることで生成する細胞外マトリックスがバリアとなることから必ずしも内部の細胞にまで浸透するかどうかは不明の点はあるが、一部の非プロトン性双性イオン化合物（Ａ）や添加剤（Ｘ）は、細胞間マトリクス内の自由水の不凍化に役立っていると考えられる。ただし、高分子量の添加剤（Ｘ）は思うようには細胞間に入り込むができないので、スフェロイド等全体の保護や浸透圧の調節の役割をしているものと考えられる。このような点から、添加剤（Ｘ）を２種以上選択する場合、異なる機能を有すると思われるものを選択することが好ましい。従って、添加剤（Ｘ）の２種以上の組み合わせは、前述の組み合わせが好ましい。
　ｉＰＳ細胞のスフェロイド化して分化させたスフェロイド、又はｉＰＳ細胞を分化させてスフェロイド化したものを再生医療に適用するにあたっては、スフェロイドを製造する場所と、再生医療を行う場所が別々の場所にあって運搬するということから、低温保存であっても刺激により培地の水が結晶化しないことが重要である。そのために考えられる条件としては、保存温度以上において、融点がなく、ガラス転移点がなく、培地が過冷却になっていないことが重要である。融点及びガラス転移点は、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって調べることが出来る。また、過冷却になっているかどうかは、保存温度で培地を観察しながら刺激をして結晶化が起こらないかどうかを調べることで知ることができる。
　本発明の別の一態様は、本発明の非凍結保存用組成物を用いる、多細胞群を非凍結下で保存する方法である。
　本発明方法の非凍結保存対象は、多細胞群である。多細胞群には、前記のように、スフェロイド、オルガノイド、細胞シート、組織構造体、臓器の切片、臓器、生体・個体が含まれるが、スフェロイド、オルガノイド、細胞シート、細胞構造体が好ましく、スフェロイドがより好ましい。
　具体的には、本発明の組成物に多細胞群を添加し、非凍結下で保存すればよい。非凍結保存は、液体窒素温度～３７℃、好ましくは－８５℃～室温、さらに好ましくは－５０℃～０℃の保存空間で行われる。食品のコールドチェーンの活用を考えると、－８５℃～４℃、好ましくは－３０℃～－４℃、さらに好ましくは－３０℃～－１５℃において非凍結であることが良い。
　次に実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
（評価物質）
　本発明に用いられる非プロトン性双性イオンはＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３９，１６０５２－１６０５５（２０１７）を参考に製造することができる。
（合成例１）ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　１５．７ｇ（６５６ｍｍｏｌ）のＮａＨ（関東化学株式会社）を５０ｍＬのテトラヒドロフラン（富士フイルム和光純薬株式会社）に懸濁させ、１３．８ｇ（２０２ｍｍｏｌ）のイミダゾール（東京化成工業株式会社）を添加し、室温で２４時間撹拌した。３７．０ｇ（２０２ｍｍｏｌ）の１－ブロモ－２－（２－メトキシエトキシ）エタン（東京化成工業株式会社）を加え、７０℃で６時間撹拌した。白色の析出物を濾別し、ろ液を濃縮後、蒸留（１２５℃、１ｍｍＨｇ）により１－（２－（２－メトキシエトキシ）エチル）イミダゾールを得た。これを２５０ｍＬのアセトニトリルに溶解し、２９ｇ（１５０ｍｍｏｌ）のエチル４－ブロモブチレートを加え、８０℃で１６時間還流した。ジエチルエーテルで洗浄後、アニオン交換樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＩＲＮ　７８Ａ）のカラムに付した。溶出液を減圧留去することでＯＥ2ｉｍＣ3Ｃを得た。
　ＮＭＲデータ：δ＝２．１３－２．２７（４Ｈ，ｍ，ＣＨ2ＣＯ　ａｎｄ　ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ），３．３７（３Ｈ，ｓ，ＣＨ3Ｏ），３．５１－３．６５（４Ｈ，ｍ，ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＨ2），３．８６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝３．６Ｈｚ，ＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ），４．４０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．７Ｈｚ，ＮＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯ），４．６６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝３．７Ｈｚ，ＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ），７．２９　ａｎｄ　７．４９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝ｂｏｔｈ　１．６Ｈｚ，ＮＣＨＣＨＮ），１１．００（１Ｈ，ｓ，ＮＣＨＮ）．
　１３Ｃ　ＮＭＲ（１００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ3；Ｍｅ4Ｓｉ）δ＝２７．２０　ａｎｄ　３４．３０（ＮＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯ），４８．９４（ＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ），４９．４７（ＮＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯ），５８．６５（ＣＨ3Ｏ），６９．１９（ＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ），６９．９３　ａｎｄ　７１．２９（ＯＣＨ2ＣＨ2Ｏ），１２１．２２　ａｎｄ　１２２．５８（ＮＣＨＣＨＮ），１３８．７３（ＮＣＨＮ），１７６．６３（ＣＨ2ＣＯＯ）．
　Ｅｌｅｍｅｎｔａｌ　ａｎａｌｙｓｉｓ：ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ・２．５Ｈ2Ｏ（Ｆｏｕｎｄ：Ｃ，４８．０；Ｈ，８．４；Ｎ，９．３．
　Ｃａｌｃ．ｆｏｒ　Ｃ12Ｈ25Ｎ2Ｏ6.5：Ｃ，４７．８；Ｈ，８．４；Ｎ，９．３％）．
（合成例２）Ｃ1ｉｍＣ3Ｃ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
　２２．２ｇ（２７０ｍｍｏｌ）の１－メチルイミダゾールと（５３．７ｇ：２７０ｍｍｏｌ）のエチル４－ブロモブチレートを、２０ｍＬのアセトニトリルに溶解させ、５０℃で５ｈｒ撹拌した。析出物を除去後、減圧乾燥し、ジエチルエーテルで３回洗浄し、減圧乾燥した。残渣を陰イオン交換樹脂に付しＣ1ｉｍＣ3Ｃを得た。
　１Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＤＭＳＯ－ｄ６；Ｍｅ4Ｓｉ）δ＝１．７７（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４Ｈｚ，ＣＨ2ＣＯ），１．８６（２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，ｑｕｉｎ，ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ），３．８２（３Ｈ，ｓ，ＣＨ3Ｎ），４．１３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，ＮＣＨ2ＣＨ2），７．６６　ａｎｄ　７．７６（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝ｂｏｔｈ　１．６Ｈｚ，ＮＣＨＣＨＮ），９．５０（１Ｈ，ｓ，ＮＣＨＮ）．
　１３Ｃ　ＮＭＲ（１００ＭＨｚ；ＤＭＳＯ－ｄ６；Ｍｅ4Ｓｉ）δ＝２７．８０（ＣＨ2ＣＨ2ＣＯ），３５．３６（ＣＨ2ＣＯ），３６．１０（ＣＨ3Ｎ），４９．６１（ＮＣＨ2ＣＨ2），１２２．９１　ａｎｄ　１２３．８９（ＮＣＨＣＨＮ），１３７．７００（ＮＣＨＮ），１７４．０２（ＣＨ2ＣＯＯ）．
（合成例３）Ｃ1ｉｍＣ3Ｓ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　合成例２において、エチル４－ブロモブチレートの代わりに、１，３－プロパンスルトンを用いた以外は合成２と同様な操作を行い、Ｃ1ｉｍＣ3Ｓを得た。
（合成例４）Ｃ4ｉｍＣ3Ｓ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　合成例２において、１－メチルイミダゾールの代わりに４－ブチルイミダゾールを用い、エチル４－ブロモブチレートの代わりに、１，３－プロパンスルトンを用いた以外は合成例２と同様の操作を行い、Ｃ4ｉｍＣ3Ｓを得た。
（合成例５）ＶｉｍＣ3Ｃ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　合成例２において、１－メチルイミダゾールの代わりに、ビニルイミダゾール（東京化成工業株式会社）を用いた以外は、合成例２と同様の操作を行いＶｉｍＣ3Ｃを得た。
（合成例６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
　１０ｍＬの純水に、３ｇ（０．０１４ｍｍｏｌ）のＶｉｍＣ3Ｃを添加し、重合開始剤として２２．８３ｇ（０．００１４ｍｍｏｌ）の２，２'－アゾビス（イソブチロニトリル）（東京化成工業株式会社）を加え、８０℃で１６時間撹拌した。純水で透析、減圧乾燥することでＰｏｌｙ（ＶｉｍＣ3Ｃ）を得た。
合成例７（Ｃ1ｉｍＣ2ＯＥ3Ｃ（Ｒ1＝ＣＨ3、Ａ＝イミダゾリウムカチオン、Ｒ2＝ＣＨ2ＣＨ2、Ｒ3＝ＣＨ2ＣＨ2、ｎ＝３、Ｂ＝－ＣＯＯ-）の合成）
［原料］
　ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ、１－ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｓｏｄｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ、ジエチルエーテルは東京化成工業株式会社より購入した。トルエン、ジクロロメタン、ＭｅＯＨ、ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ1，９９．８ａｔｏｍ％　Ｄ　ｗｉｔｈ　０．０３ｖｏｌ％　ＴＭＳは関東化学株式会社より購入した。ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ　ｗｉｔｈ　ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ、ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ　ａｃｉｄはＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより購入した。ａｌｕｍｉｎｕｍ　ｏｘｉｄｅ（ａｃｔｉｖｅ，　ｂａｓｉｃ，　Ｂｒｏｃｋｍａｎｎ　１）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社より購入した。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＩＲＮ－７８，　ｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｒｅｓｉｎ，　ｎｕｃｌｅａｒ　ｇｒａｄｅはＡｌｆａ　Ａｅｓａｒ社より購入した。ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅはＡｃｃｅｌａ　ＣｈｅｍＢｉｏ社より購入した。
（１）ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　ｅｓｔｅｒ（１ａ）の合成
　５０ｍＬのナスフラスコにｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅ　４．９ｇを入れ、ジクロロメタン（ＤＣＭ）３０ｍＬを加えて溶解させた。その後、ナスフラスコを氷冷し、ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅに対して３．５ｅｑｕｉｖ．（モル当量）となるように、ＮａＯＨ　２．４５ｇを加えて氷冷撹拌した。さらに、ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅに対して１．３ｅｑｕｉｖ．となるように、氷冷中撹拌のナスフラスコへｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　４．４ｇを少しずつ滴下した。全量滴下後、室温で２８時間撹拌し、反応させた。２８時間撹拌後、濾紙（５Ｃ，ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を用いて固体不純物を除去した。濾過後の生成物を含む反応溶液を分液ロートに充填し、ＤＣＭ　６０ｍＬで共洗いを行った。その後、水を加えて、分液後の水層のｐＨとナトリウム濃度を測定し、ｐＨが７になるまで、かつ、ナトリウム濃度が実測値で０ｐｐｍを示すまで分液操作を行った。分液後、ＤＣＭ層を減圧乾燥して生成物を得た。生成物の構造は１Ｈ ＮＭＲにより確認し、生成物は精製せず次の原料として用いた。
（２）ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ａｃｉｄ（２ａ）の合成
　２００ｍＬナスフラスコに合成したｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　ｅｓｔｅｒを入れ、ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　ｅｓｔｅｒに対して２５ｅｑｕｉｖ．となるように３６％ＨＣｌａｑ．　４５ｇを加え、室温で３時間撹拌し、反応させた。３時間撹拌後、生成物を含む反応溶液を分液ロートに充填し、ＤＣＭ　１２０ｍＬで共洗いを行った。その後、水を加えて、分液後の水層のｐＨが７になるまで分液操作を行った。分液後、ＤＣＭ層を減圧乾燥して生成物を得た。生成物の構造は１Ｈ ＮＭＲにより確認し、生成物は精製せず次の原料として用いた。
（３）ｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（３ａ）の合成
　２００ｍＬナスフラスコに合成したｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ａｃｉｄを入れ、ａｌｕｍｉｎｕｍ　ｏｘｉｄｅ（ａｃｔｉｖｅ，ｂａｓｉｃ，Ｂｒｏｃｋｍａｎｎ　１）で精製したテトラヒドロフラン　２０ｍＬを加えて溶解させた。その後、ナスフラスコを氷冷し、１－ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ　１．７７ｇを加えて氷冷撹拌した後、還流冷却器を用いて７０℃で４５時間還流し、反応させた。４５時間還流後、反応溶液の減圧乾燥を行い、得られた生成物を含む２００ｍＬナスフラスコにジエチルエーテルを加えて洗浄を行った（４０ｍＬ，４ｈ，３ｔｉｍｅｓ）。洗浄後、減圧乾燥して生成物を得た。生成物の構造は１Ｈ ＮＭＲにより確認し、生成物は精製せず次の原料として用いた。
（４）ｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ（４ａ）及びＣ1ｉｍＣ2ＯＥ3Ｃの合成
　合成したｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅをＨ2Ｏ／ＭｅＯＨ（１／２：ｗ／ｗ）溶媒６００ｍＬに溶解させ、１Ｌビンへ移した。その後、アニオン交換樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＩＲＮ－７８、交換容量１．１ｅｑ／Ｌ）３５ｍＬを加え、室温で１０日間撹拌してｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｘｉｄｅを生成した。
　アニオン交換後、濾紙（５Ｃ，ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を用いてアニオン交換樹脂を除去し、２０ｍＬナスフラスコに反応溶液を移した。得られた反応溶液を濃縮し、中和反応及びＣ1ｉｍＣ2ＯＥ3Ｃの生成反応を進行させた。その後、生成物を含む２０ｍＬナスフラスコにジエチルエーテルを加えて洗浄を行った（２０ｍＬ，１ｄａｙ，３ｔｉｍｅｓ）
。洗浄後、減圧乾燥して油状の生成物を得た（純度９８％）。ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅからの収率は５６％であった。
1Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ3；Ｍｅ4Ｓｉ）δ＝２．４２４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝４．０Ｈｚ，ＣＨ2ＣＯＯ），３．５３８－３．６４４（８Ｈ，ｍ，ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯ），３．７９０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，ＮＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2），３．９１９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，ＮＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2），３．９８０（３Ｈ，ｓ，ＣＨ3Ｎ），４．４９９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，ＮＣＨ2ＣＨ2Ｏ），７．２３８　ａｎｄ　７．２４３（１Ｈ，ｍ，ＮＣＨＣＨＮ），１０．４６５（１Ｈ，ｓ，ＮＣＨＮ）．
　Ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　ｗｉｔｈ　ｆａｓｔ　ａｔｏｍ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ｉｎ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｍｏｄｅ，ｍ／ｚ＝２８７．１６１０（Ｍ＋Ｈ+、ｆｏｕｎｄ）　ａｎｄ　２８７．１６０７（Ｍ＋Ｈ+，ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）；ａｎｄ　ｉｎ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｍｏｄｅ，　ｍ／ｚ＝２８５．１４５２（Ｍ－Ｈ+，ｆｏｕｎｄ）　ａｎｄ　２８５．１４５０（Ｍ－Ｈ+）（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）．
合成例８（ＯＥ2ｉｍＣ2ＯＥ3Ｃ（Ｒ1＝Ｈ3Ｃ（ＯＣＨ2ＣＨ2）2、Ａ＝イミダゾリウムカチオン、Ｒ2＝ＣＨ2ＣＨ2、Ｒ3＝ＣＨ2ＣＨ2、ｎ＝３、Ｂ＝－ＣＯＯ-）の合成）
［原料］
　ｂｅｎｚｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅ　ｇｌｙｃｏｌ　ｍｏｎｏｍｅｔｈｙｌ　ｅｔｈｅｒ、ｓｏｄｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ、ジエチルエーテルは東京化成工業株式会社より購入した。トルエン、ジクロロメタン、ＭｅＯＨ、ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ1，９９．８ａｔｏｍ％　Ｄ　ｗｉｔｈ　０．０３ｖｏｌ％　ＴＭＳは関東化学株式会社より購入した。ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｆｕｒａｎ　ｗｉｔｈ　ｓｔａｂｉｌｉｚｅｒ、ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ　ａｃｉｄはＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより購入した。ａｌｕｍｉｎｕｍ　ｏｘｉｄｅ（ａｃｔｉｖｅ，ｂａｓｉｃ，Ｂｒｏｃｋｍａｎｎ１）はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社より購入した。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＩＲＮ－７８，ｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｒｅｓｉｎ，ｎｕｃｌｅａｒ　ｇｒａｄｅはＡｌｆａ　Ａｅｓａｒ社より購入した。ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅはＡｎｇｅｎｅ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｌｉｍｉｔｅｄ社より購入した。
（１）ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　ｅｓｔｅｒ（１ａ）の合成
　５０ｍＬのナスフラスコにｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅ　３．７２ｇを入れ、ＤＣＭ　１０ｍＬを加えて溶解させた。その後、ナスフラスコを氷冷し、ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅに対して６．２ｅｑｕｉｖ．（モル当量）となるように、ＮａＯＨ　３．３８ｇを加えて氷冷撹拌した。さらに、ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅに対して１．３ｅｑｕｉｖ．となるように、氷冷中撹拌のナスフラスコへｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　３．３ｇを少しずつ滴下した。全量滴下後、室温で１７時間撹拌し、反応させた。１７時間撹拌後、濾紙（５Ｃ，ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を用いて固体不純物を除去した。濾過後の生成物を含む反応溶液を分液ロートに充填し、ＤＣＭ　６０ｍＬで共洗いを行った。その後、水を加えて、分液後の水層のｐＨとナトリウム濃度を測定し、ｐＨが６になるまで、かつ、ナトリウム濃度が実測値で０ｐｐｍを示すまで分液操作を行った。分液後、ＤＣＭ層を減圧乾燥して生成物を得た。生成物の構造は１Ｈ ＮＭＲにより確認し、次の反応に用いた。
（２）ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ａｃｉｄ（２ａ）の合成
　２００ｍＬナスフラスコに合成したｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　ｅｓｔｅｒを入れ、ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　ｅｓｔｅｒに対して２５ｅｑｕｉｖ．となるように３６％ＨＣｌａｑ．３４．４ｇを加え、室温で３時間撹拌し、反応させた。３時間撹拌後、生成物を含む反応溶液を分液ロートに充填し、ＤＣＭ　５０ｍＬで共洗いを行った。その後、水を加えて、分液後の水層のｐＨが７になるまで分液操作を行った。分液後、ＤＣＭ層を減圧乾燥して生成物を得た。生成物の構造は１ＨＮＭＲにより確認し、次の反応に用いた。
ＯＥ2ｉｍの合成
　Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ，２９，３０１７－３０２４を参考に作製した。
　ジエチレングリコールモノメチルベンゼンスルホン酸塩を合成するために、水酸化ナトリウム（２．５当量、５５ｇ、１．３８ｍｏｌ）と等量の水（５５ｇ）を混合し、その溶液をトルエン（１０００ｍＬ）中のジエチレングリコールモノメチルエーテル（１当量、６０ｇ、０．５ｍｏｌ）の溶液に加え、さらに、ジエチレングリコールモノメチルエーテルを加えた。触媒量の水酸化ベンジルトリメチルアンモニウム（１０ｍＬ）を加え、氷浴中で攪拌した。その後、塩化ベンゼンスルホニル（９７ｇ，０．６ｍｏｌ）を攪拌下で滴下し、７０℃で６時間還流した。トルエンを蒸発させた後、得られた溶液をジクロロメタンに溶かし、水（３０００ｍＬ）で一度洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させて、生成物を得た。
　１－（２－（２－メトキシエトキシ）エチル）イミダゾール（ＯＥ２ｉｍ）を合成するために、水酸化ナトリウム（２．５当量、５６．４ｇ、１．４ｍｏｌ）及び等量の水（５７ｇ）を用いて水酸化ナトリウムの水溶液を調製した。この塩基をトルエン（１０００ｍＬ）中のイミダゾール（１当量、３２ｇ，０．５ｍｏｌ）の溶液に加え、続いて触媒量のベンジルトリメチルアンモニウムヒドロキシド（１０ｍＬ）を添加した。その後、氷浴で冷却しながらジエチレングリコールモノメチルベンゼンスルホネート（１２３ｇ，０．５ｍｏｌ）をゆっくりと加え、７０℃で６時間加熱して無色粘稠な液体を得た。トルエンを蒸発させた後、減圧下（１Ｐａ）、１６０℃で蒸留し、ＯＥ２ｉｍを得た（収率：９２％）。生成物の構造は１Ｈ　ＮＭＲにより確認し、次の反応に用いた。
（３）ｏｌｉｇｏｅｔｈｅｒ　ｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（３ｂ）の合成
　２００ｍＬナスフラスコに合成したｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ａｃｉｄを入れ、トルエン４０ｍＬを加えて溶解させた。その後、ＯＥ2ｉｍ　２．３ｇを加えて撹拌した後、還流冷却器を用いて８０℃で２７時間還流し、反応させた。２７時間還流後、反応溶液の減圧乾燥を行い、得られた生成物を含む２００ｍＬナスフラスコにジエチルエーテルを加えて洗浄を行った（５０ｍＬ，１ｄａｙ，３ｔｉｍｅｓ）。洗浄後、減圧乾燥して生成物を得た。生成物の構造は１Ｈ ＮＭＲにより確認し、次の反応に用いた。
（４）ｏｌｉｇｏｅｔｈｅｒ　ｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ（４ｂ）及びＯＥ2ｉｍＣ2ＯＥ3Ｃの合成
　合成したｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅをＨ2Ｏ／ＭｅＯＨ（１／３：ｗ／ｗ）溶媒４００ｍＬに溶解させ、１Ｌビンへ移した。その後、過剰のアニオン交換樹脂（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＩＲＮ－７８、交換容量１．１ｅｑ／Ｌ）２７ｍＬを加え、室温で１０日間撹拌してｏｌｉｇｏｅｔｈｅｒ　ｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｘｉｄｅを生成した。
　最後に、ＯＥ2ｉｍＣ2ＯＥ3Ｃの合成を行った。アニオン交換後、濾紙（５Ｃ，ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を用いてアニオン交換樹脂を除去し、５０ｍＬナスフラスコに反応溶液を移した。得られた反応溶液を濃縮し、中和反応及びＯＥ2ｉｍＣ2ＯＥ3Ｃの生成反応を進行させた。その後、生成物を含む５０ｍＬナスフラスコにジエチルエーテルを加えて洗浄を行った（３０ｍＬ，１ｄａｙ，３ｔｉｍｅｓ）。洗浄後、減圧乾燥して液状の生成物を得た。純度は９８％であり、収率は、ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅに対して約５０％であった。
　1Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ3；Ｍｅ4Ｓｉ）δ＝２．４２８（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１０．８Ｈｚ，ＣＨ2ＣＯＯ），３．３５４（３Ｈ，ｓ，ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ），３．４９８－３．６５４（６Ｈ，ｍ，ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ　ａｎｄ　ＮＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯ），３．７８２（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝１１．６Ｈｚ，ＣＨ3ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2Ｎ），３．８７５（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，ＮＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯ），４．４７４（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．６Ｈｚ，ＮＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯ），４．５６３（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝９．２Ｈｚ，ＮＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯ），７．２４２　ａｎｄ　７．３９５（１Ｈ，ｍ，ＮＣＨＣＨＮ），１０．６５９（１Ｈ，ｓ，ＮＣＨＮ）．
　Ｍａｓｓ　ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ　ｗｉｔｈ　ｆａｓｔ　ａｔｏｍ　ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ　ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ：ｉｎ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｍｏｄｅ　ｍ／ｚ＝３７５．２１２９（Ｍ＋Ｈ+、ｆｏｕｎｄ）　ａｎｄ　３７５．２１３１（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）；ａｎｄ　ｉｎ　ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｍｏｄｅ，ｍ／ｚ＝３７３．１９７７（Ｍ－Ｈ+ｆｏｕｎｄ）　ａｎｄ　３７３．１９７５（ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ）．
合成例９（Ｃ2ｉｍＯＥ3Ｃ（Ｒ1＝Ｃ2Ｈ5、Ａ＝イミダゾリウムカチオン、Ｒ2＝ＣＨ2ＣＨ2、Ｒ3＝ＣＨ2ＣＨ2、ｎ＝３、Ｂ＝－ＣＯＯ-）の合成）
［原料］
　ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅはＡｎｇｅｎｅ社より購入した。ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｓｏｄｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ、ジエチルエーテルは東京化成工業株式会社より購入した。１－エチルイミダゾール、トルエン、ジクロロメタン、メタノール、ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ1，９９．８ａｔｏｍ％　Ｄ　ｗｉｔｈ　０．０３ｖｏｌ％　ＴＭＳ、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ－ｄ6，９９．９ａｔｏｍ　％　Ｄ　ｗｉｔｈ　０．０３ｖｏｌ％　ＴＭＳは関東化学株式会社より購入した。ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ　ａｃｉｄはＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより購入した。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＩＲＮ－７８，　ｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｒｅｓｉｎ，　ｎｕｃｌｅａｒ　ｇｒａｄｅはＡｌｆａ　Ａｅｓａｒ社より購入した。
（１）ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　ｅｓｔｅｒ（１ａ）の合成
　５０ｍＬのナスフラスコにｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅ３．７ｇを入れ、ジクロロメタン（ＤＣＭ）４０ｍＬを加えて溶解させた。その後、ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅに対して６ｅｑｕｉｖ．（モル当量）のＮａＯＨ　３．８ｇを加えた。さらに、ナスフラスコを氷冷し、ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅに対して１．５ｅｑｕｉｖ．のｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ５．０ｇを少しずつ滴下した。全量滴下後、室温で３４時間撹拌して反応させ、濾紙（５Ｃ，ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を用いて固体不純物を除去した。濾過後の生成物を含む反応溶液を分液ロートに充填した。その後、水を加え、ナトリウム濃度計を用いて水層のナトリウム濃度を測定し、ナトリウム濃度が実測値で０ｐｐｍを示すまで分液操作を行った。分液後、ＤＣＭ層を減圧乾燥してｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　ｅｓｔｅｒ（１ａ）を得た（性状：液体）。
（２）ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ａｃｉｄ（２ａ）の合成
　２００ｍＬナスフラスコにｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　ｅｓｔｅｒを入れ、ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　ｅｓｔｅｒに対して過剰量の３６％ＨＣｌａｑ．９．０ｇを加え、室温で３時間撹拌して反応させ、生成物を含む反応溶液をＤＣＭに溶解させ、分液ロートに充填した。その後、水を加え、ｐＨ試験紙を用いてｐＨを測定し、水層のｐＨが６を示すまで分液操作を行った。分液後、減圧乾燥したＤＣＭ層を３００ｍＬナスフラスコへ移し、過剰量の水１００ｍＬを加え、６０℃で１時間撹拌して未反応ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅを分解させた。反応溶液をＤＣＭに溶解させ、分液ロートに充填して水を加え、ｐＨ試験紙を用いてｐＨを測定し、水層のｐＨが６を示すまで分液操作を行った。分液後、ＤＣＭ層を減圧乾燥してｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ａｃｉｄ（２ａ）を得た（性状：液体、収率：初期原料投入量に対して２０％）。
（３）ｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（３ａ）の合成
　５０ｍＬナスフラスコにｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ａｃｉｄを入れ、トルエン１０ｍＬを加えて溶解させた。さらに、ナスフラスコを氷冷し、ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ａｃｉｄに対して１．０５ｅｑｕｉｖ．の１－エチルイミダゾール０．２７ｇを少しずつ滴下した。全量滴下後、還流冷却器を用いて８０℃で２０時間反応させ、未反応物を含む上層と生成物を含む下層に層分離させた。上層をデカンテーションで廃棄し、生成物を含む下層にジエチルエーテルを加えて洗浄を行った（２０ｍＬ，１ｈ，３ｔｉｍｅｓ）。洗浄後、減圧乾燥してｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（３ａ）を得た（性状：液体）。
（４）ｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ（４ａ）およびＣ2ｉｍＯＥ3Ｃの合成
　１１０ｍＬバイアルにｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅを入れ、メタノール７０ｍＬを加えて溶解させた。さらに、強アニオン交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＩＲＮ－７８（交換容量１．１ｅｑ．／Ｌ）９ｍＬを加えて室温で５日間撹拌してｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ（４ａ）を生成させた。反応溶液を５０ｍＬフラスコに濃縮し、中和反応を進行させた。その後、生成物を含むナスフラスコにジエチルエーテルを加えて洗浄を行った（２０ｍＬ，３０　ｍｉｎ，３ｔｉｍｅｓ）。洗浄後、減圧乾燥してＣ2ｉｍＯＥ3Ｃを得た（性状：液体）。
　Ｃ2ｉｍＯＥ3Ｃ：1Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＤＭＳＯ；Ｍｅ4Ｓｉ）δ＝１．３８０（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，ＮＣＨ2ＣＨ3），１．９７０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，ＣＨ2ＣＯＯ），３．３２５－３．４９７（１０Ｈ，ｍ，ＮＣＨ2Ｈ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯ），３．７５０　ａｎｄ　４．３２０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝ｂｏｔｈ　５．０Ｈｚ，ＮＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2），４．１９９（２Ｈ，ｑ，ＮＣＨ2ＣＨ3），７．７４７　ａｎｄ　７．８２６（１Ｈ，ｍ，ＮＣＨＣＨＮ），９．６１３（１Ｈ，ｓ，ＮＣＨＮ）．
合成例１０（ＡｉｍＯＥ3Ｃ（（Ｒ1＝－ＣＨ2－ＣＨ＝ＣＨ2、Ａ＝イミダゾリウムカチオン、Ｒ2＝ＣＨ2ＣＨ2、Ｒ3＝ＣＨ2ＣＨ2、ｎ＝３、Ｂ＝－ＣＯＯ-）
）の合成）
［原料］
　ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅはＡｎｇｅｎｅ社より購入した。ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｓｏｄｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ、ジエチルエーテルは東京化成工業株式会社より購入した。１－アリルイミダゾール、トルエン、ジクロロメタン、メタノール、ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ１，９９．８ａｔｏｍ％　Ｄｗｉｔｈ０．０３ｖｏｌ％ＴＭＳ、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ－ｄ６，９９．９ａｔｏｍ％　Ｄｗｉｔｈ０．０３ｖｏｌ％　ＴＭＳは関東化学株式会社より購入した。ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ　ａｃｉｄはＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより購入した。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＩＲＮ－７８，ｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｒｅｓｉｎ，ｎｕｃｌｅａｒ　ｇｒａｄｅはＡｌｆａ　Ａｅｓａｒ社より購入した。
（１）ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　ｅｓｔｅｒ（１ａ）の合成
　５０ｍＬのナスフラスコにｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅ３．０ｇを入れ、ＤＣＭ３０ｍＬを加えて溶解させた。その後、ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅに対して３．７ｅｑｕｉｖ．（モル当量）のＮａＯＨ１．６ｇを加えた。さらに、ナスフラスコを氷冷し、ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅに対して１．３ｅｑｕｉｖ．のｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ２．６ｇを少しずつ滴下した。全量滴下後、室温で２４時間撹拌して反応させ、濾紙（５Ｃ，ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を用いて固体不純物を除去した。濾過後の生成物を含む反応溶液を分液ロートに充填した。その後、水を加え、ナトリウム濃度計を用いて水層のナトリウム濃度を測定し、ナトリウム濃度が実測値で０ｐｐｍを示すまで分液操作を行った。分液後、ＤＣＭ層を減圧乾燥してｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　ｅｓｔｅｒ（１ａ）を得た（性状：液体）。
（２）ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ａｃｉｄ（２ａ）の合成
　２００ｍＬナスフラスコにｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　ｅｓｔｅｒを入れ、ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　ｅｓｔｅｒに対して過剰量の３６％ＨＣｌａｑ．９．０ｇを加え、室温で３時間撹拌して反応させ、生成物を含む反応溶液をＤＣＭに溶解させ、分液ロートに充填した。その後、水を加え、ｐＨ試験紙を用いてｐＨを測定し、水層のｐＨが６を示すまで分液操作を行った。分液後、減圧乾燥したＤＣＭ層を３００ｍＬナスフラスコへ移し、過剰量の水１００ｍＬを加え、６０℃で１時間撹拌して未反応ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅを分解させた。反応溶液をＤＣＭに溶解させ、分液ロートに充填して水を加え、ｐＨ試験紙を用いてｐＨを測定し、水層のｐＨが６を示すまで分液操作を行った。分液後、ＤＣＭ層を減圧乾燥してｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ａｃｉｄ（２ａ）を得た（性状：液体、収率：初期原料投入量に対して３９％）。
（３）ａｌｌｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（３ｂ）の合成
　５０ｍＬナスフラスコにｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ａｃｉｄ１．１６ｇを入れ、トルエン１０ｍＬを加えて溶解させた。さらに、ナスフラスコを氷冷し、ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ａｃｉｄに対して１．１ｅｑｕｉｖ．の１－アリルイミダゾール０．３６ｇを少しずつ滴下した。全量滴下後、還流冷却器を用いて８０℃で２１時間反応させ、未反応物を含む上層と生成物を含む下層に層分離させた。上層をデカンテーションで廃棄し、生成物を含む下層にジエチルエーテルを加えて洗浄を行った（２０ｍＬ，１ｈ，３ｔｉｍｅｓ）。洗浄後、減圧乾燥してａｌｌｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（３ｂ）を得た（性状：液体）。
（４）ａｌｌｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ（４ｂ）及びＡｉｍＯＥ3Ｃの合成
　１１０ｍＬバイアルにａｌｌｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅを入れ、メタノール８０ｍＬを加えて溶解させた。さらに、強アニオン交換樹脂Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＩＲＮ－７８（交換容量１．１ｅｑ．／Ｌ）１１ｍＬを加えて室温で６日間撹拌してａｌｌｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ（４ｂ）を生成させた。反応溶液を５０ｍＬフラスコに濃縮し、中和反応を進行させた。その後、生成物を含むナスフラスコにジエチルエーテルを加えて洗浄を行った（２０ｍＬ，３０ｍｉｎ，３ｔｉｍｅｓ）。洗浄後、減圧乾燥してＡｉｍＯＥ3Ｃを得た（性状：液体）。
　ＡｉｍＯＥ3Ｃ：1Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＤＭＳＯ；Ｍｅ4Ｓｉ）δ＝２．００９（３Ｈ，ｔ，Ｊ＝７．０Ｈｚ，ＣＨ2ＣＯＯ），３．３９０－３．５４８（１０Ｈ，ｍ，ＮＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯ），３．７９７　ａｎｄ　４．３８０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝５．０　ａｎｄ　４．８Ｈｚ，ＮＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2），４．９１５（２Ｈ，ｄ，ＮＣＨ2ＣＨＣＨ2），５．２４９－５．３５７（２Ｈ，ｍ，ＮＣＨ2ＣＨＣＨ2），６．０１６－６．１１４（１Ｈ，ｍ，ＮＣＨ2ＣＨＣＨ2），７．７７５　ａｎｄ　７．８２３（１Ｈ，ｍ，ＮＣＨＣＨＮ），９．６５６（１Ｈ，ｓ，ＮＣＨＮ）．
合成例１１（ＶｉｍＯＥ3Ｃ（（（Ｒ1＝－ＣＨ＝ＣＨ2、Ａ＝イミダゾリウムカチオン、Ｒ2＝ＣＨ2ＣＨ2、Ｒ3＝ＣＨ2ＣＨ2、ｎ＝３、Ｂ＝－ＣＯＯ-））前駆体－Ｖｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅの合成）
［原料］
　ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅはＡｎｇｅｎｅ社より購入した。ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ｓｏｄｉｕｍ　ｈｙｄｒｏｘｉｄｅ、ジエチルエーテルは東京化成工業株式会社より購入した。１－ビニルイミダゾール、トルエン、ジクロロメタン、メタノール、ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ－ｄ1，９９．８ａｔｏｍ％　Ｄｗｉｔｈ０．０３ｖｏｌ％ＴＭＳ、Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ－ｄ6，９９．９ａｔｏｍ％　Ｄｗｉｔｈ０．０３ｖｏｌ％ＴＭＳは関東化学株式会社より購入した。ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｃ　ａｃｉｄはＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより購入した。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ　ＩＲＮ－７８，ｉｏｎ　ｅｘｃｈａｎｇｅ　ｒｅｓｉｎ，ｎｕｃｌｅａｒ　ｇｒａｄｅはＡｌｆａ　Ａｅｓａｒ社より購入した。
（１）ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　ｅｓｔｅｒ（１ａ）の合成
　５０ｍＬのナスフラスコにｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅ３．０ｇを入れ、ＤＣＭ３０ｍＬを加えて溶解させた。その後、ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅに対して３．７ｅｑｕｉｖ．（モル当量）のＮａＯＨ１．６ｇを加えた。さらに、ナスフラスコを氷冷し、ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　１２－ｈｙｄｒｏｘｙ－４，７，１０－ｔｒｉｏｘａｄｏｄｅｃａｎｏａｔｅに対して１．３ｅｑｕｉｖ．のｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ２．６ｇを少しずつ滴下した。全量滴下後、室温で２４時間撹拌して反応させ、濾紙（５Ｃ，ＡＤＶＡＮＴＥＣ）を用いて固体不純物を除去した。濾過後の生成物を含む反応溶液を分液ロートに充填した。その後、水を加え、ナトリウム濃度計を用いて水層のナトリウム濃度を測定し、ナトリウム濃度が実測値で０ｐｐｍを示すまで分液操作を行った。分液後、ＤＣＭ層を減圧乾燥してｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　ｅｓｔｅｒ（１ａ）を得た（性状：液体）。
（２）ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ａｃｉｄ（２ａ）の合成
　２００ｍＬナスフラスコにｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　ｅｓｔｅｒを入れ、ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ｔｅｒｔ－ｂｕｔｙｌ　ｅｓｔｅｒに対して過剰量の３６％ＨＣｌａｑ．９．０ｇを加え、室温で３時間撹拌して反応させ、生成物を含む反応溶液をＤＣＭに溶解させ、分液ロートに充填した。その後、水を加え、ｐＨ試験紙を用いてｐＨを測定し、水層のｐＨが６を示すまで分液操作を行った。分液後、減圧乾燥したＤＣＭ層を３００ｍＬナスフラスコへ移し、過剰量の水１００ｍＬを加え、６０℃で１時間撹拌して未反応ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ｃｈｌｏｒｉｄｅを分解させた。反応溶液をＤＣＭに溶解させ、分液ロートに充填して水を加え、ｐＨ試験紙を用いてｐＨを測定し、水層のｐＨが６を示すまで分液操作を行った。分液後、ＤＣＭ層を減圧乾燥してｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ａｃｉｄ（２ａ）を得た（性状：液体、収率：初期原料投入量に対して３９％）。
（３）ｖｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（３ｃ）の合成
　５０ｍＬナスフラスコにｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ａｃｉｄ０．５ｇを入れ、トルエン１０ｍＬを加えて溶解させた。さらに、ナスフラスコを氷冷し、ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎｙｌ　ＰＥＧ４　ａｃｉｄに対して１．２ｅｑｕｉｖ．の１－ビニルイミダゾール０．１５ｇを少しずつ滴下した。全量滴下後、還流冷却器を用いて８０℃で１７時間反応させ、未反応物を含む上層と生成物を含む下層に層分離させた。上層をデカンテーションで廃棄し、生成物を含む下層にジエチルエーテルを加えて洗浄を行った（２０ｍＬ，１ｈ，３ｔｉｍｅｓ）。洗浄後、下減圧乾燥してｖｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ（３ｂ）を得た（性状：液体）。
　Ｖｉｎｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｉｕｍ　ｐ－ｔｏｌｕｅｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ：1Ｈ　ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＤＭＳＯ；Ｍｅ4Ｓｉ）δ＝２．２８６（３Ｈ，ｓ，ＣＨＣＣＨ3），２．４３０（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝６．４，ＣＨ2ＣＯＯＨ），３．４６５－３．６３１（１０Ｈ，ｍ，ＮＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＣＯＯＨ），３．７９８　ａｎｄ　４．３７９（２Ｈ，ｔ，Ｊ＝ｂｏｔｈ　５．０Ｈｚ，ＮＣＨ2ＣＨ2ＯＣＨ2），５．４３１（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．８　ａｎｄ　２．４Ｈｚ，ＮＣＨＣＨ2），５．９６３（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ＝２．４Ｈｚ，ＮＣＨＣＨ2），７．１２１　ａｎｄ　７．４９０（２Ｈ，ｄ，Ｊ＝ｂｏｔｈ　７．６Ｈｚ，ＳＯ2ＣＨＣＨＣＣＨ3ＣＨＣＨ），７．２７４－７．３５０（１Ｈ，ｍ，ＮＣＨＣＨ2），７．８８０　ａｎｄ　８．１９９（１Ｈ，ｍ，ＮＣＨＣＨＮ），９．４０８（１Ｈ，ｓ，ＮＣＨＮ），１２．１８１（１Ｈ，ｓ，ＣＨ2ＣＯＯＨ）．
（細胞の培養）
　ヒトメラノーマ繊維芽細胞（ＭＡＦ１）：ルシフェラーゼおよび／または蛍光蛋白（ｍＥＧＦＰ　ｏｒ　ｍＣｈｅｒｒｙ）が導入されたＭＡＦ１は、Ｅｒｉｋ　Ｓａｈａｉ教授（Ｆｒａｎｃｅ－Ｃｌｉｃｋ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）から供与された細胞を使用した。
　マウスメラノーマ細胞（５５５５）：同上
　ヒト腎臓細胞（ＢＯＳＣ）：ＢＯＳＣは、松田道幸教授（京都大学）から供与された細胞を使用した。
　細胞は、１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン－ストレプトマイシン－アンフォテリシンＢ懸濁液（富士フイルム和光株式会社）を含む培地（Ｌ－グルタミンおよびフェノールレッドを含む高グルコース、富士フイルム和光株式会社）を用いて、３７℃、加湿された５％ＣＯ2雰囲気で培養した。トリプシン溶液（０．５ｗ／ｖ％トリプシン－５．３ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ・４Ｎａ溶液、フェノールレッド不含、富士フイルム和光社製）で小分けした。
（一細胞の保存実験と保存前後における生存する細胞の割合）
　１．０×１０6個の細胞を１．５ｍＬチューブに集め、遠心した（１００ｇ、室温で５分間）。上清を除去した後、１００μＬのＣＰＡ溶液Ｃ（双性イオン／ＤＭＳＯ／ＥＧ／水の混合溶液）を加えてピペッティングした。得られたサンプルは直ちに－２５℃の冷蔵庫で３～３０日間保存した。１ｍＬの培地とともに３７℃で解凍し、遠心分離（１００Ｇ、５分間、室温）した。上清を除去後、トリパンブルー（富士フイルム和光純薬株式会社製）を用い、血球計数装置（深江化成株式会社製、ワトソン株式会社製）を用いて細胞生存率をカウントした。
　一般にある細胞集団において全細胞中における生存している細胞の割合を生存率という場合があるが、死細胞のカウントが難しく同じ細胞集団を継続的に観察するとばらつきが大きくなることが多いため、本明細書においては保存前後における生存する細胞数により冷蔵保存効果を評価した。この値を細胞回収率、あるいは単に回収率と記す場合がある。
　保存前後における生存する細胞の割合
＝細胞回収率（％）
＝（保存後の生細胞数（サンプル））／（保存前の細胞数（サンプル））×１００
（一細胞に対する培地の毒性）
　１．０×１０6個の細胞を１．５ｍＬチューブに集め、遠心した（１００Ｇ、室温で５分間）。上清を除去した後、１００μＬのＣＰＡ溶液を加えてピペッティングした。３７℃１時間培養後、血球計数器とトリパンブルーを用いて細胞生存率を数えた。
（スフェロイド）
　スフェロイドはハンギングドロップ法により調製した。スフェロイドを得るために培養した２．０×１０6個の細胞に、培地及び１ｍＬの１．２ｗ／ｖ％メチルセルロース（シグマアルドリッチ社）／ＤＭＥＭ（富士フイルム和光株式会社）を加えて２ｍＬとし、培養プレートの蓋の裏に２０μＬ滴下した。その後培養プレート本体をＰＢＳ（富士フイルム和光株式会社）で満たし、培養プレートの蓋をした。 細胞は、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気で加湿されたインキュベーター内にて静置培養し、スフェロイドを得た。
（スフェロイドの保存実験と保存前後における生存する率の測定）
　４個のスフェロイドを１．５ｍＬのチューブに集め、１ｍＬのＰＢＳで洗浄した。上清を除去した後、１００μＬの被検溶液を加えた。サンプルは－２５℃の冷蔵庫で３～３０日間保存した。保存後、３７℃の培地を１ｍＬ加え、上清を除いた。１ｍＬのＰＢＳで３分間洗浄し、上清を除去した。５０μＬのトリプシン溶液を加え、３７℃で３０分間インキュベートした。５０μＬの培地を加え、ピペッティングでスフェロイドを崩壊させた。１０μＬの細胞懸濁液を１．５ｍＬチューブに加え、１０μＬのトリパンブルー（富士フイルム和光）と混合した。スフェロイド由来の細胞の生存は、血球計数器を用いてカウントし、以下の式を用いて計算した。保存前後におけるスフェロイドを構成して生存する細胞数からスフェロイドの細胞回収率を求めた。単に細胞回収率あるいは回収率と記す場合がある。
保存前後におけるスフェロイドを構成する生存していた細胞の割合
＝スフェロイドの細胞回収率（％）
＝（スフェロイドに由来する保存後の生細胞数（サンプル））／（スフェロイドに由来する保存前の細胞数（サンプル））×１００
　３７℃、５％ＣＯ2雰囲気で加湿されたインキュベーター内にて、回収したスフェロイドを２４時間培養した。そのときの培地は１０％ウシ胎児血清、１％ペニシリン－ストレプトマイシン－アンフォテリシンＢ懸濁液（富士フイルム和光株式会社）を含む培地（Ｌ－グルタミンおよびフェノールレッドを含む高グルコース、富士フイルム和光株式会社）を用いた。２４時間後のスフェロイドの細胞回復率は、以下の式で算出した。細胞数は上記と同様にトリプシンで細胞を崩壊させて評価した。
　細胞回復率（％）＝（２４時間培養後の生細胞数（サンプル））／（２４時間培養後の生細胞数（非凍結））×１００
（スフェロイドへの毒性）
　４個のスフェロイドを１．５ｍＬのチューブに集め、１ｍＬのＰＢＳで洗浄した。上清を除去した後、１００μＬの溶液を加えた。その後、血球計数器とトリパンブルーを用いてスフェロイドの細胞回収率をカウントした。
（ＤＳＣ）
　示差走査熱量計（ＤＳＣ６０－Ａ；島津製作所）を用いて溶液の融点と凝固点を測定した。溶液（１０μＬ）をアルミパンに加え、熱量計の試料室にセットした。試料は１℃／分で－１００℃まで冷却し、５℃／分で２５℃まで昇温した。
（過冷却の確認）
　ＤＳＣの結果から、過冷却になっているかを判断した。
（ＦＴ－ＩＲ）
赤外（ＩＲ）スペクトルの測定にはニコレット１０（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　ｓｃｉｅｎｔｉｃ）を用いた。
（実施例１）
（ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯ／ＥＧの物性評価）
　組成物は、
　　ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ　　　　　　 １０質量部
　　ＤＭＳＯ　　　　　　　　　　５質量部
　　ＥＧ　　　　　　　　　　　　５質量部
　　水　　　　　　　　　　　　８０質量部
　　合計　　　　　　　　　　１００質量部
のように調製し、ＤＭＳＯとＥＧの比率が１：１となるように製造した。具体的には、ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯ／ＥＧの質量比率は、１０／５／５、１０／１０／１０、１０／１５／１５、１０／２０／２０、１０／２５／２５であり、これは組成物を表１に示した。
（Ｔｍ，Ｔｆ，凍結状態、過冷却の結果）
　ＤＳＣにより、Ｔｍ及びＴｆを測定した。ＤＳＣチャートを図１に、凝固点（Ｔｆ／℃）及び融点（Ｔｍ／℃）を表１に示した。
　また、保存温度（－２５℃）において、凍結があったかどうか（凍結しない〇、凍結下×、ロットにより異なった△）、過冷却があったかどうかについて、表１にまとめた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
（非凍結保存の効果）
　組成物の比を変えてＭＡＦ１スフェロイドを－２５℃で３日間保存し、保存後の細胞回収率（recovery）と生存率（viability）を調べた。
　結果を表１及び図２に示す。保存温度においてＴｍを持たず目視でも凍結が見られず過冷却もない組成物において良好な結果が得られた。
　なお、この場合の生存率（viability）は、評価する試料において（評価する細胞群のうち生きている細胞数）／（評価する細胞群のうち生きている細胞数＋評価する細胞群のうち死んでる細胞）×１００％で表される。
（実施例２）Ｃ1ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯ／ＥＧの物理化学的性状及び生物学的評価
　実施例１において、ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃの代わりにＣ1ｉｍＣ3Ｃを用いた組成物を調製し、ＭＡＦ１スフェロイドを－２５℃で２０日間保存し、保存後の物理化学的性状および生物学的評価を行った。結果を表１及び図３に示す。
　なお、表１中、実施例番号を付与していないが、ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯ／ＥＧ（１０／２０／２０）の組成物を用いて、同様の実施を行った結果も表１及び図３に示す。
（実施例３）Ｃ4ｉｍＣ3Ｓ／ＤＭＳＯ／ＥＧの物性評価
　実施例２において、Ｃ1ｉｍＣ3Ｃの代わりにＣ4ｉｍＣ3Ｓ（２０／２０／２０）の組成物を用いてＭＡＦ１スフェロイドを－２５℃で２０日間保存したときの回収率と生存率を表１及び図３に示す。生存率の考え方は実施例２と同様な方法で計算した。
（参考例１、２）
ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯ（添加剤（Ｘ）が１種のみ）の物性評価
（１）ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯからなる組成物においてＭＡＦ１を－２５℃で３日間保存した後の回収率について、組成物が保存温度で固体（Ｓ）になると回復率が悪くなることを表２及び図４に示す。
（２）ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯからなる組成物において、１０／１０、１０／２０，１０／３０、１０／４０、１０／５０の組成物を作製し、ＭＡＦ１スフェロイドを－２５℃で３日間保存した後の回収率を図５に示す。
　双性イオンと添加剤の比は１０／４０であり、実施例２，３で標準的に用いられている１０／２０／２０の時と、双性イオンと添加剤の比は変わらないが、生存率、回収率が悪い。これは、ＥＧを添加することでＤＭＳＯの濃度が相対的に低下したことが一つの理由ではないかと考えている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
（実施例４）
　ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯ／ＥＧ（１０／２０／２０）の組成物を用いてＭＡＦ１スフェロイドを－２５℃で３０日間保存したときの細胞回収率の推移を表３及び図６に示す。
（実施例５）
　ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯ／ＥＧ（１０／２０／２０）の組成物を用いて５５５５スフェロイドを－２５℃で３０日間保存したときの細胞回収率の推移を表３及び図７に示す。
（実施例６）
　ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯ／ＥＧ（１０／２０／２０）の組成物を用いてＢＯＳＣスフェロイドを－２５℃で３０日間保存したときの細胞回収率の推移を表３及び図８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
（実施例７）
　ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯ／ＥＧ（１０／２０／２０）の組成物を用いてＭＡＦ１一細胞を－２５℃で３０日間保存したときの細胞回収率の推移を表４及び図９に示す。
（実施例８）
　ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯ／ＥＧ（１０／２０／２０）の組成物を用いて５５５５細胞を－２５℃で３０日間保存したときの細胞回収率の推移を表４及び図１０に示す。
（実施例９）
　ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ／ＤＭＳＯ／ＥＧ（１０／２０／２０）の組成物を用いてＢＯＳＣ細胞を－２５℃で３０日間保存したときの細胞回収率の推移を表４及び図１１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
（参考例３）
　双性イオン液体の代わりに０．９％ＮａＣｌを用いた組成物によりＭＡＦ１スフェロイドを－２５℃で３０日間保存したときの回収率の推移を図１２に示す。
（参考例４）
　双性イオン液体の代わりにスクロースを用いた組成物によりＭＡＦ１スフェロイドを－２５℃で３０日間保存したときの回収率を測定したところ、凍結してしまい、回復率が低かった。
（参考例５）
　ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を１０質量％ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ水溶液中で－８０℃で保存したときの光学顕微鏡写真（図１３中の右）、及びＭＡＦ１細胞のスフェロイドを培地中に常温保存したときの光学顕微鏡写真（図１３中の左）を図１３に示す。
　図１３の左から、スフェロイドは１０～数百μｍ程度の直径の三次元の細胞塊であるため、凍結保存の状態で畝が発生するとスフェロイドが損傷し保存状態が悪くなる。また、図１３の右から、５０μｍ間隔で見える畝は氷の結晶であり、一細胞保存のときはこの畝の間に細胞が存在することができるため凍結保存が可能である。
（実施例１０）
　ＤＭＳＯ（２０ｗｔ％）とＥＧ（２０ｗｔ％）に加えて、ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ、ＯＥ2ｉｍＣ3Ｓ，Ｃ1ｉｍＣ3Ｃ、Ｃ1ｉｍＣ3Ｓの各双性イオン化合物の組成物の割合を変えた異なる組成を含む被験溶液を用いてＭＡＦ１スフェロイドを－２５℃で１０日間保存し、各双性イオン化合物の組成物の割合を変えた時の細胞回収率の相異を調べた。結果を表５、図１４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
（実施例１１）
　ＤＭＳＯ（２０ｗｔ％）とＥＧ（２０ｗｔ％）に加えて、ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ、ＯＥ2ｉｍＣ3Ｓ，Ｃ1ｉｍＣ3Ｃ、Ｃ1ｉｍＣ3Ｓの各双性イオン化合物の組成物の割合を変えた異なる組成を含む被験溶液を用いてＭＡＦ１スフェロイドを０℃で１時間処理し、各双性イオン化合物の組成物の割合を変えた時の細胞回収率の相異を調べた。結果を表６、図１５に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
（実施例１２）
　ＤＭＳＯ（２０ｗｔ％）とＥＧ（２０ｗｔ％）に加えて、ＯＥ2ｉｍＣ3Ｃ、ＯＥ2ｉｍＣ3Ｓ，Ｃ1ｉｍＣ3Ｃ、Ｃ1ｉｍＣ3Ｓの各双性イオン化合物の組成物の割合を変えた異なる組成を含む被験溶液を用いて、ＭＡＦ１スフェロイドを－８５℃で３０日間保存したときの回収率を検討した。その結果、本発明の組成物用いれば、－８５℃においても凍結しない組合わせのあることを確認した。
　本発明の非凍結保存用組成物を用いれば、保存温度において融点を持たず、ガラス化せず、過冷却を起こさず、－２５℃以下においても凍結しないため、多細胞群を非凍結状態で保存できる。従って、多細胞群を用いる再生医療が工業的に可能となる。

Claims (4)

  1. 　１種又は２種以上の非プロトン性双性イオン化合物（Ａ）、及び成分（Ａ）と相溶し得る２種類以上の添加剤（Ｘ）を含有する、多細胞群の非凍結保存用組成物。
  2. 　前記非プロトン性双性イオン化合物（Ａ）が、一般式（１）
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （Ｒ1は、炭素数１～８の直鎖アルキル基、炭素数２～８のアルケニル基、又はＣ１－８直鎖アルキル－（ＯＣＨ2ＣＨ2）ｍ－を示し；
    Ａは、双性イオンのカチオン部であり、イミダゾリウムカチオン、ホスホニウムカチオン、アンモニウムカチオン、スルホニウムカチオン、ピラゾリウムカチオン、ピリジニウムカチオン、ピロリジニウムカチオン、モルホリニウムカチオン、シクロプロペニウムカチオン及びピペリジニウムカチオンから選ばれるカチオンを示し；
    Ｒ2は、炭素数１～４のアルキレン基を示し；
    Ｒ3は、炭素数２～４のアルキレン基を示し；
    ｍは、１又は２の数を示し；
    ｎは、０～１０の数を示し；
    Ｂは、－ＳＯ3－、－ＣＯＯ－、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ3）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ4）Ｏ－、及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＨ）Ｏ－から選ばれるアニオンを示し；
    Ｒ4は炭素数１～８のヘテロ原子を有していても良いアルキル基を示す）
    で表される非プロトン性双性イオン化合物である請求項１記載の非凍結保存用組成物。
  3. 　前記添加剤Ｘが、
    （ｉ）水酸基を有しない小分子化合物又は平面性を有する化合物、
    （ｉｉ）水酸基を１個以上有する化合物、
    （ｉｉｉ）ペプチド又はタンパク質、
    （ｉｖ）高分子化合物、
    （ｖ）界面活性剤、及び
    （ｖｉ）次の一般式（２）で表される双性イオンポリマー又は双性イオンオリゴマーから選ばれる添加剤である、請求項１記載の非凍結保存用組成物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     （式中、
    　Ｘ1及びＸ2は、同一でも異なってもよく、炭素原子又は窒素原子を示し；
    　Ｙ1及びＹ2は、同一でも異なってもよく、－ＣＯＯ－、－ＳＯ3－、－ＯＰ＝Ｏ（Ｈ）Ｏ－、－ＯＰ＝Ｏ（ＣＨ3）Ｏ－及び－ＯＰ＝Ｏ（ＯＲ5）Ｏ－から選ばれるアニオンを示し（ここで、Ｒ5は、水素原子又はメチル基を示す）；
    　Ｚは、水素原子、アルキル基が置換していてもよい炭素数６～１０の芳香族炭化水素基、アルキル基が置換していてもよい５～６員の芳香族複素環式基、アルキル基が置換していてもよい窒素含有複素環式アンモニウム塩、テトラアルキルアンモニウム塩、テトラフェニルホスホニウム塩、テトラアルキルホスホニウム塩、トリアルキルスルホニウム塩、又は分子鎖中に１～３個の酸素原子を有していてもよい炭素数１～２２の直鎖又は分岐アルキル基を示し；
    　ｅ及びｆは、それぞれ０又は１の整数を示し；
    ｌ、ｍ及びｎは、それぞれ各繰り返し単位の含有比率を示す数であって、０＜ｌ≦１、０≦ｍ＜１、０≦ｎ＜１、ｌ＋ｍ＋ｎ＝１を満たす数を示し；
    　ｐ、ｑ、ｒ、ｓ及びｔは、それぞれ０～６の整数を示す）
  4. 　請求項１～３のいずれか１項記載の組成物を用いる、多細胞群を非凍結下で保存する方法。
PCT/JP2024/039820 2023-11-10 2024-11-08 双性イオン含有組成物及びその使用 Pending WO2025100528A1 (ja)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0538284A (ja) * 1991-07-15 1993-02-19 Hokuren Federation Of Agricult Coop:The 生細胞保存剤
JP2000512625A (ja) * 1996-06-14 2000-09-26 バイオストア ニュージーランド リミテッド 生きている組織の保存用組成物および方法
WO2020230721A1 (ja) * 2019-05-13 2020-11-19 国立研究開発法人科学技術振興機構 非プロトン性双性イオンを用いた未分化促進剤及び凍結保護剤

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0538284A (ja) * 1991-07-15 1993-02-19 Hokuren Federation Of Agricult Coop:The 生細胞保存剤
JP2000512625A (ja) * 1996-06-14 2000-09-26 バイオストア ニュージーランド リミテッド 生きている組織の保存用組成物および方法
WO2020230721A1 (ja) * 2019-05-13 2020-11-19 国立研究開発法人科学技術振興機構 非プロトン性双性イオンを用いた未分化促進剤及び凍結保護剤

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HACHIKAWA SACHIKO, ISHIZAKI TAKERU, TAKAHASHI KENJI, ISHIBASHI KOJIRO, HIRATA EISHU, KURODA KOSUKE: "Preservation of cells in liquid state at -25 degree C in a general freezer using zwitterions ", PREPRINTS OF THE 102ND CSJ ANNUAL MEETING (2022), 1 January 2022 (2022-01-01), XP093313962, Retrieved from the Internet <URL:https://confit.atlas.jp/guide/event-img/csj102nd/B203-4am-06/public/pdf?type=in> *

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