WO2025005076A1 - 骨格筋内脂肪組織（ＩＭＡＴ；Ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）形成抑制物質をスクリーニングする方法、及びＩＭＡＴ形成抑制用組成物 - Google Patents

骨格筋内脂肪組織（ＩＭＡＴ；Ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ）形成抑制物質をスクリーニングする方法、及びＩＭＡＴ形成抑制用組成物 Download PDF

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孝基 紙崎
康博 南
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Kobe University NUC
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Definitions

  • the present disclosure relates to a method for screening for IMAT formation inhibitors, and a composition for inhibiting IMAT formation, etc.
  • Satellite cells which are skeletal muscle tissue stem cells, and mesenchymal progenitor cells (MPCs) play important roles in the maintenance and regeneration of skeletal muscles.
  • SCs After skeletal muscle injury, SCs proliferate, differentiate and fuse, and eventually form muscle fibers, which contribute to the repair of the injured area.
  • MPCs which are resident in skeletal muscle, promote skeletal muscle regeneration by promoting the proliferation and differentiation of SCs.
  • pathological conditions of skeletal muscle such as muscular dystrophy and sarcopenia
  • MPCs differentiate into adipocytes, forming IMAT, which should not exist in skeletal muscle, and causing a significant decrease in muscle function.
  • the molecular mechanism that determines whether MPCs contribute to the maintenance and regeneration of skeletal muscle or promote the formation of IMAT has not been fully elucidated, but it is expected that pathological conditions of skeletal muscle can be inhibited by maintaining the skeletal muscle maintenance and regeneration mechanism of MPCs and suppressing the IMAT formation ability of MPCs. Therefore, if a substance that suppresses the IMAT formation ability can be identified, it will greatly contribute to improving the condition of skeletal muscle diseases and aging-related skeletal muscle diseases (locomotor syndrome, frailty, etc.), and it will also greatly contribute to improving people's QOL and ADL internationally, including in Japan, which has become a super-aging society.
  • An objective of the present disclosure is to provide a method for screening substances that suppress IMAT formation.
  • Another objective of the present disclosure is to provide a composition for suppressing IMAT formation.
  • Ror2 Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 2
  • Wnt11-Ror2 contributes to the maintenance and regeneration of skeletal muscle by suppressing cellular senescence of MPCs, while in pathological conditions, activation of the Wnt5b-Ror2 signal in MPCs may promote IMAT formation.
  • the present disclosure includes, for example, the subject matter described in the following sections: Item 1. (I) contacting a Wnt5b protein, a Ror2 protein, and a test substance; and (II) confirming that the test substance inhibits binding between the Wnt5b protein and the Ror2 protein. A method for screening for a substance that inhibits IMAT formation. Item 2. In step (I), a Wnt11 protein is further contacted, Item 2. The method according to Item 1, further comprising confirming in step (II) that the test substance does not inhibit binding between Wnt11 protein and Ror2 protein. Item 3.
  • Item 6. The method according to any one of Items 1 to 5, wherein the inhibition of IMAT formation is due to inhibition of proliferation of MPCs.
  • Item 7. A composition for inhibiting IMAT formation, comprising as an active ingredient a neutralizing antibody to Wnt5b protein or a nucleic acid that inhibits the expression of the Wnt5b gene.
  • Item 8. A composition for inhibiting IMAT formation according to item 7, for use in inhibiting or treating a muscular disease or condition in which accumulation of IMAT is observed.
  • Item 9. Item 9. The composition for inhibiting IMAT formation according to item 8, wherein the muscle disease or condition in which accumulation of IMAT is observed is muscular dystrophy, amyotrophic lateral sclerosis, sarcopenia, frailty or locomotive syndrome.
  • Wnt5b, Wnt11, and Ror2 as therapeutic targets for muscle diseases will lead to the development of highly effective therapeutic methods with few side effects, and is one of the major advantages in discovering such therapeutic methods.
  • MPCs are also important for the maintenance and regeneration of skeletal muscle, it is not sufficient to simply suppress the function of MPCs; it is necessary to suppress the ability to form IMAT while maintaining the mechanisms for maintaining and regenerating skeletal muscle.
  • the inventors have established a method for identifying substances that can select substances that suppress Wnt5b-Ror2 signaling while maintaining Wnt11-Ror2 signaling, and that can greatly contribute to improving the conditions of various skeletal muscle diseases and age-related skeletal muscle disorders (locomotor syndrome, frailty, etc.).
  • a method for screening for an IMAT formation inhibitor is provided.
  • Also provided is a composition for inhibiting IMAT formation.
  • the results of measuring the expression levels of Ror2 in SCs and MPCs are shown.
  • the figures show the results of measuring the proliferation ability, adipocyte differentiation ability, and cellular senescence of MPCs isolated from tibialis anterior (TA) muscle administered Ctx.
  • the results of measuring the weights of the TA muscle, gastrocnemius muscle, and soleus muscle in control mice and Ror2cKO mice, as well as the results of staining of muscle fibers in the TA muscle, are shown.
  • 1 shows the results of myofiber and fat staining in the TA muscle of control mice and Ror2cKO mice.
  • 1 shows the results of measuring the expression level of Wnt11 and cellular senescence in MPCs isolated from TA muscles administered Ctx.
  • 1 shows the results of stress fiber and nuclear staining in MPCs isolated from Ctx-administered TA muscles.
  • 1 shows the expression levels of Wnt family genes in Ctx-administered muscles and glycerol-administered muscles, as well as the results of measuring cell proliferation when Wnt5a or Wnt5b was added to MPCs isolated from Ctx-administered TA muscles. Shown are the results of Western blot using MPCs isolated from Ctx-administered TA muscles, and the results of WST-8 assay using MPCs isolated from Ctx-administered TA muscles.
  • EDL Extra digitorum longus muscle 3 days after administration of Ctx or glycerol
  • 1 shows the results of measuring the expression level of Wnt5b in various cells isolated from TA muscle 3 days after administration of Ctx or glycerol.
  • the figures show the results of measuring the expression level of Wnt5b and cell proliferation in MPCs isolated from Ctx-administered TA muscles.
  • the present disclosure includes a method for screening for a substance that inhibits IMAT formation.
  • the method may be referred to as the "screening method of the present disclosure” or the like.
  • IMAT intramuscular adipose tissue
  • ectopic adipose tissue found within skeletal muscle. This is a condition in which fat accumulates in skeletal muscle, even though there is essentially no fat in the muscle.
  • the screening method disclosed herein includes a step of contacting the Wnt5b protein, the Ror2 protein, and the test substance.
  • this step may be referred to as step (I), etc.
  • Wnt (wingless-type MMTV integration site family) proteins are secreted glycoproteins and are known to bind to Ror proteins and the like.
  • Wnt proteins Nineteen types have been identified in mammals, including Wnt5a, Wnt5b, and Wnt11.
  • the amino acid sequences, nucleotide sequences, and the like of the proteins can be known from known databases and the like.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the accession number of the mRNA sequence of the human Wnt5b gene is NM_030775
  • the accession number of the mRNA sequence of the human Wnt11 gene is XM_005274231.
  • Wnt5b-producing cells include SCs, MPCs, Schwann cells, and the like.
  • Wnt11-producing cells include, for example, MPCs.
  • Ror (Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor) protein is a single-pass transmembrane receptor that functions as a receptor for Wnt protein and is known to activate the non-classical Wnt pathway.
  • Ror proteins include Ror1 and Ror2.
  • the amino acid sequence, base sequence, and the like of the protein can be known from known databases and the like.
  • the accession number of the mRNA sequence of the human Ror2 gene at NCBI is NM_001318204.
  • Ror2-expressing cells include, for example, MPCs.
  • the test substance is not particularly limited.
  • it may be a compound or a composition.
  • the compound may be, for example, a low molecular weight compound, a nucleic acid (e.g., DNA, RNA, etc.), a protein (e.g., an antibody or a part thereof, etc.), or a polymeric compound such as a polymer.
  • the composition may also be an extract obtained from a living organism (e.g., an animal, a plant, a microorganism, etc.), or a combination of two or more compounds.
  • the method for contacting the Wnt5b protein, the Ror2 protein, and the test substance is not particularly limited.
  • the Wnt5b protein, the Ror2 protein, and the test substance may be added to an appropriate solvent, or the Wnt5b protein and the test substance may be added to a cell expressing the Ror2 protein.
  • the suitable solvent is not particularly limited, and examples thereof include water, liquid medium for cell culture, and the like.
  • the concentration of the Wnt5b protein is not particularly limited and can be, for example, about 0.1 to 4 ⁇ g/ml.
  • the concentration of the Ror2 protein is not particularly limited, and may be, for example, about 0.1 to 4 ⁇ g/ml.
  • the concentration of the test substance can be appropriately set depending on the type of the test substance.
  • the temperature during contact is not particularly limited, and may be, for example, about 25 to 40° C., preferably about 30 to 40° C.
  • the contact time is not particularly limited, and can be, for example, about 10 seconds to 3 hours, preferably about 3 minutes to 1 hour. During the contact, for example, stirring or shaking can be performed as necessary.
  • Cells expressing Ror2 protein include, for example, MPCs.
  • the screening method of the present disclosure can further include contacting Wnt11 protein in step (I).
  • the screening method of the present disclosure can include contacting Wnt5b protein, Wnt11 protein, Ror2 protein, and the test substance in step (I).
  • the method for contacting the Wnt5b protein, the Wnt11 protein, the Ror2 protein, and the test substance is not particularly limited.
  • the Wnt5b protein, the Wnt11 protein, the Ror2 protein, and the test substance may be added to an appropriate solvent, or the Wnt5b protein, the Wnt11 protein, and the test substance may be added to a cell expressing the Ror2 protein.
  • the concentration of the Wnt11 protein is not particularly limited and may be, for example, about 0.1 to 4 ⁇ g/ml. For other contact methods, the above description can be used.
  • the screening method of the present disclosure further includes a step of confirming that the test substance inhibits the binding between the Wnt5b protein and the Ror2 protein.
  • this step may be referred to as step (II) or the like.
  • step (II) the method for confirming that the test substance inhibits the binding between the Wnt5b protein and the Ror2 protein is not particularly limited.
  • the ELISA method, the AlphaScreen method, and analysis using the Biacore system can be used.
  • the amount of binding between Wnt5b protein and Ror2 protein is reduced by 35% or more when the test substance is added compared to when the test substance is not added.
  • the upper or lower limit of the range may be, for example, about 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%. Specifically, it may be about 35 to 100%.
  • the screening method disclosed herein makes it possible to screen for substances that can inhibit the binding between Wnt5b protein and Ror2 protein when the test substance is added, compared to when the test substance is not added.
  • Wnt5b and Ror2 promote the proliferation of MPCs via p38, thereby inducing excessive accumulation of MPCs in skeletal muscle tissue and contributing to the formation of IMAT.
  • an IMAT formation inhibitor obtained by the screening method disclosed herein may inhibit the binding between Wnt5b protein and Ror2 protein, thereby suppressing the excessive proliferation of MPCs and suppressing the formation of IMAT.
  • the screening method of the present disclosure further includes, in step (II), a step of confirming that the test substance does not inhibit the binding between Wnt11 protein and Ror2 protein.
  • the screening method of the present disclosure can confirm in step (II) that the test substance inhibits the binding between Wnt5b protein and Ror2 protein and does not inhibit the binding between Wnt11 protein and Ror2 protein.
  • the method for confirming that the test substance does not inhibit the binding between the Wnt11 protein and the Ror2 protein is not particularly limited. Examples include ELISA, AlphaScreen, and analysis using the Biacore system.
  • step (II) it may be possible to first confirm that the test substance inhibits the binding between Wnt5b protein and Ror2 protein, and then confirm that the test substance does not inhibit the binding between Wnt11 protein and Ror2 protein, or it may be possible to first confirm that the test substance does not inhibit the binding between Wnt11 protein and Ror2 protein, and then confirm that the test substance inhibits the binding between Wnt5b protein and Ror2 protein, or it may be possible to simultaneously confirm that the test substance inhibits the binding between Wnt5b protein and Ror2 protein and does not inhibit the binding between Wnt11 protein and Ror2 protein.
  • does not inhibit means that it does not inhibit completely or substantially.
  • Does not substantially inhibit means that, after confirming that the binding between Wnt11 protein and Ror2 protein can be detected by various analytical methods such as absorbance, luminescence, fluorescence, and surface plasmon resonance, the decrease rate of the binding amount between Wnt11 protein and Ror2 protein when the test substance is added is 30% or less compared to when the test substance is not added. It may be preferably about 20%, more preferably about 10%, even more preferably about 5%, even more preferably about 3%, and particularly preferably about 1% or less.
  • the increase rate of actin stress fiber formation and abnormal nuclear morphology is 30% or less compared to when the test substance is not added when the test substance is added. It may be preferably about 20%, more preferably about 10%, even more preferably about 5%, even more preferably about 3%, and particularly preferably about 1% or less.
  • the screening method disclosed herein makes it possible to screen for a substance that, for example, when the test substance is added, is capable of inhibiting the binding between the Wnt5b protein and the Ror2 protein, but is not capable of inhibiting the binding between the Wnt11 protein and the Ror2 protein, compared to when the test substance is not added.
  • Wnt5b and Ror2 promote the proliferation of MPCs via p38, thereby inducing excessive accumulation of MPCs in skeletal muscle tissue and contributing to the formation of IMAT.
  • Wnt11 and Ror2 suppress the formation of stress fibers in MPCs, thereby suppressing nuclear morphological abnormalities and the associated activation of the cGas-Sting pathway, and as a result, they are thought to contribute to the regeneration and maintenance of skeletal muscle by suppressing cellular senescence of MPCs.
  • an IMAT formation inhibitor obtained by the screening method disclosed herein may suppress excessive proliferation of MPCs and suppress the formation of IMAT by inhibiting the binding between Wnt5b protein and Ror2 protein, while it may suppress cellular senescence of MPCs and maintain or regenerate skeletal muscle by not inhibiting the binding between Wnt11 protein and Ror2 protein.
  • Wnt5b-producing cells include SCs, MPCs, Schwann cells, etc.
  • the screening method of the present disclosure may include (1) a step of contacting at least one selected from the group consisting of SCs, MPCs, and Schwann cells with a test substance, and (2) a step of confirming that the test substance suppresses the expression level of Wnt5b.
  • the Wnt5b-producing cells may be cells that further produce Ror2 and/or p38. Therefore, the screening method including the above-mentioned steps (I) and (II) may or may not further include the steps (1) and (2). In addition, the screening method including steps (1) and (2) may not include steps (I) and (II).
  • step (I) MPCs and the like may be contacted with the test substance as cells expressing Ror2 protein, SCs, MPCs and/or Schwann cells and the like as cells expressing Wnt5b protein, and/or MPCs and the like as cells expressing Wnt11 protein.
  • step (2) may be further performed to confirm that the test substance suppresses the expression level of Wnt5b.
  • Step (2) may be performed before step (II), simultaneously with step (II), or after step (II).
  • the method of contacting at least one selected from the group consisting of SCs, MPCs, and Schwann cells with the test substance is not particularly limited.
  • at least one cell selected from the group consisting of SCs, MPCs, and Schwann cells and the test substance may be added to an appropriate solvent, or the test substance may be added to a culture solution containing the cells.
  • the suitable solvent is not particularly limited, and the above description can be used.
  • SCs, MPCs, and Schwann cells may be used alone or in combination of two or more.
  • the concentration of the cells is not particularly limited, and the cell concentration (total cell concentration) when contacted with the test substance may be, for example, about 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 6 cells/ml.
  • the concentration of the test substance can be appropriately set depending on the type of the test substance.
  • the test substance is not particularly limited, and the above description can be used.
  • the temperature during contact is not particularly limited, and may be, for example, about 25 to 40°C, preferably about 30 to 40°C.
  • the contact time is not particularly limited, and can be, for example, about 1 to 6 hours, preferably about 12 to 48 hours. During the contact, for example, stirring or shaking can be performed as necessary.
  • the method for confirming that the test substance suppresses the expression level of Wnt5b is not particularly limited.
  • the expression level of Wnt5b may be the expression level of the Wnt5b gene or the expression level of the Wnt5b protein.
  • the method for confirming that the expression level of Wnt5b is suppressed is not particularly limited, and examples thereof include quantitative RT-PCR, fluorescence in situ hybridization, Western blotting, immunostaining, and flow cytometry.
  • the expression level of Wnt5b is reduced by 35% or more when the test substance is added compared to when the test substance is not added.
  • the upper or lower limit of the range may be, for example, about 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%. Specifically, it may be about 35 to 100%.
  • the screening method including steps (1) and (2) of the present disclosure makes it possible to screen for a substance that can suppress the expression level of Wnt5b when the test substance is added, as compared to when the test substance is not added.
  • Wnt5b and Ror2 promote the proliferation of MPCs via p38, thereby inducing excessive accumulation of MPCs in skeletal muscle tissue and contributing to the formation of IMAT.
  • an IMAT formation inhibitor obtained by the screening method comprising steps (1) and (2) of the present disclosure may inhibit the excessive proliferation of MPCs and inhibit the formation of IMAT by suppressing the expression level of Wnt5b.
  • step (2) may further include a step of confirming that the test substance does not suppress the expression level of Wnt11.
  • step (2) it can be confirmed that the test substance suppresses the expression level of Wnt5b and does not suppress the expression level of Wnt11.
  • the method for confirming that the test substance does not suppress the expression level of Wnt11 is not particularly limited.
  • the expression level of Wnt11 may be the expression level of the Wnt11 gene or the expression level of the Wnt11 protein.
  • the method for confirming that the test substance does not suppress the expression level of Wnt11 is not particularly limited, and examples thereof include quantitative RT-PCR, fluorescence in situ hybridization, Western blotting, immunostaining, and flow cytometry.
  • step (2) it may be possible to first confirm that the test substance suppresses the expression level of Wnt5b and then confirm that the test substance does not suppress the expression level of Wnt11, or it may be possible to first confirm that the test substance does not suppress the expression level of Wnt11 and then confirm that the test substance suppresses the expression level of Wnt5b, or it may be possible to simultaneously confirm that the test substance suppresses the expression level of Wnt5b and does not suppress the expression level of Wnt11.
  • does not suppress means that it does not suppress completely or substantially.
  • Does not substantially suppress means that, after confirming that the expression level of Wnt11 can be measured by, for example, luminescence or fluorescence analysis using various analytical methods, the decrease rate of the expression level of Wnt11 when the test substance is added is 30% or less compared to when the test substance is not added. It may be preferably about 20%, more preferably about 10%, even more preferably about 5%, even more preferably about 3%, and particularly preferably about 1% or less. Alternatively, it means that in cells (such as MPCs) that co-express Wnt11 protein and Ror2 protein, the increase rate of actin stress fiber formation, abnormal nuclear morphology, etc. is 30% or less compared to when the test substance is not added when the test substance is added. It may be preferably about 20%, more preferably about 10%, even more preferably about 5%, even more preferably about 3%, and particularly preferably about 1% or less.
  • the screening method including steps (1) and (2) of the present disclosure, it is possible to further screen for a substance that can suppress the expression level of Wnt5b and cannot suppress the expression level of Wnt11 when the test substance is added, compared to when the test substance is not added.
  • Wnt5b and Ror2 promote the proliferation of MPCs via p38, thereby inducing the excessive accumulation of MPCs in skeletal muscle tissue and contributing to the formation of IMAT.
  • Wnt11 and Ror2 suppress the formation of stress fibers in MPCs, thereby suppressing nuclear morphological abnormalities and the associated activation of the cGas-Sting pathway, and as a result, they are thought to contribute to the regeneration and maintenance of skeletal muscle by suppressing cellular senescence of MPCs.
  • an IMAT formation inhibitor obtained by the screening method comprising steps (1) and (2) of the present disclosure may inhibit the excessive proliferation of MPCs and inhibit the formation of IMAT by suppressing the expression level of Wnt5b, while it may inhibit cellular senescence of MPCs and maintain or regenerate skeletal muscle by not suppressing the expression level of Wnt11.
  • step (A) when the above-mentioned Wnt5b and Ror2 are contacted with the test substance, the p38 protein may be further coexistent (hereinafter, this may be referred to as step (A)).
  • a preferable example of step (A) is, for example, contacting the cells (MPCs, etc.) expressing Ror2 protein and p38 protein with Wnt5b protein and the test substance.
  • step (A) may be performed in the same manner as described in the above step (I) or (1) except that the p38 protein is contacted with the test substance, etc.
  • concentration of the p38 protein is not particularly limited and may be, for example, about 0.1 to 4 ⁇ g/ml.
  • the method may include a step of confirming that the test substance inhibits the phosphorylation of p38 protein (hereinafter, this may be referred to as step (B)). For this reason, step (A) may be further carried out in step (I) and/or (1). Also, step (B) may be further carried out together with step (II) and/or (2).
  • Step (B) may be carried out before step (II) and/or (2), simultaneously with step (II) and/or (2), or after step (II) and/or (2). From the test examples described later, it can be said that phosphorylation of p38 protein is Wnt5b-dependent. Therefore, it can be said that by confirming the inhibition of phosphorylation, inhibition of phosphorylation of p38 protein by Wnt5b protein can be confirmed.
  • a candidate substance capable of inhibiting the binding and/or suppressing the expression level and inhibiting the phosphorylation of p38 protein can be said to be a substance capable of inhibiting Wnt5b protein and Ror2 protein-dependent phosphorylation of p38 protein.
  • the candidate substance when confirming that a test substance inhibits the phosphorylation of p38 protein, it may be confirmed in advance that the test substance inhibits the binding of Wnt5b protein and Ror2 protein and/or suppresses the expression level of Wnt5b according to the above steps (II) and/or (2).
  • the candidate substance when a test substance that has been previously confirmed to be capable of inhibiting binding and/or suppressing expression levels is used, and it is further confirmed that phosphorylation of p38 protein is inhibited, the candidate substance can be said to be a substance that can inhibit Wnt5b protein- and Ror2 protein-dependent phosphorylation of p38 protein.
  • the p38 protein is also known as p38 MAP kinase (Mitogen-activated Protein Kinase, MAPK), and is known to be involved in the signal transduction cascade that controls the cellular response to cytokines and stress.
  • MAPK Mitogen-activated Protein Kinase
  • Four types of p38 protein have been identified in mammals, for example, p38- ⁇ (MAPK14), p38- ⁇ (MAPK11), p38- ⁇ (MAPK12/ERK6), and p38- ⁇ (MAPK13/SAPK4).
  • the amino acid sequence, nucleotide sequence, etc. of the protein can be known from publicly known databases, etc. For example, the accession number of the mRNA sequence of p38- ⁇ (MAPK14) at NCBI is NM_139012.3.
  • the method for confirming that the test substance inhibits the phosphorylation of p38 protein is not particularly limited.
  • the method for confirming that the test substance inhibits the phosphorylation of p38 protein is not particularly limited, and examples thereof include Western blotting, immunofluorescence staining, and flow cytometry. As shown in the examples below, a preferred example is a method that uses an anti-phosphorylated p38 antibody.
  • the confirmation of inhibition of phosphorylation of p38 protein may be performed before, at the same time as, or after the confirmation of the inhibition of binding and/or the confirmation of the suppression of expression level.
  • inhibiting phosphorylation means completely or substantially inhibiting phosphorylation.
  • substantially inhibiting preferably means that, after confirming that phosphorylation of p38 protein can be measured by luminescence, fluorescence, or the like using various analytical techniques, phosphorylation of p38 protein is reduced by 35% or more when the test substance is added compared to when the test substance is not added.
  • the upper or lower limit of the range may be, for example, about 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99%, or 100%. Specifically, it may be about 35 to 100%.
  • the screening method of the present disclosure which includes the steps (A) and (B), it is further possible to screen for a substance that can inhibit phosphorylation of p38 protein when the test substance is added, compared to when the test substance is not added.
  • compositions for inhibiting IMAT formation that contain, as an active ingredient, a neutralizing antibody to Wnt5b protein, or a nucleic acid (siRNA, antisense oligonucleotide, etc.) that inhibits expression of the Wnt5b gene.
  • compositions for inhibiting IMAT formation that contain, in addition to these, for example, low molecular weight compounds, peptides, proteins, etc. as active ingredients.
  • compositions for inhibiting IMAT formation may be referred to as "compositions of the present disclosure", etc.
  • a neutralizing antibody to Wnt5b protein can be obtained, for example, by preparing an antibody that recognizes Wnt5b protein by a known method or a method that can be easily derived from a known method. Furthermore, a nucleic acid (siRNA, antisense oligonucleotide, etc.) that suppresses the expression of the Wnt5b gene can be designed and synthesized, for example, based on the Wnt5b gene sequence by a known method or a method that can be easily derived from a known method. Furthermore, the thus obtained antibodies that recognize Wnt5b protein and nucleic acids that suppress the expression of the Wnt5b gene can be screened by the screening method of the present disclosure described above to obtain particularly preferred ones.
  • a nucleic acid siRNA, antisense oligonucleotide, etc.
  • the number of bases in either the sense strand or the antisense strand is not limited as long as it has the function of suppressing the expression of the Wnt5b gene, and preferably each has 18 to 25 bases, more preferably 20 to 22 bases.
  • the nucleic acid that suppresses the expression of the Wnt5b gene is an antisense oligonucleotide
  • the number of bases is not limited as long as it has the function of suppressing the expression of the Wnt5b gene, and preferably each has 12 to 28 bases, more preferably 15 to 25 bases.
  • examples of nucleic acids that suppress the expression of the Wnt5b gene include, for example, siRNAs shown in SEQ ID NOs: 9 and 10, and siRNAs shown in SEQ ID NOs: 11 and 12.
  • the siRNA may have a protruding sequence (overhang) at its 5' and/or 3' end, and may have a mutation in its base sequence (e.g., substitution, deletion, or addition of 1, 2, or 3 base sequences), and the base lengths of the sense strand and the antisense strand may be the same or different.
  • having the function of suppressing the expression of the Wnt5b gene is preferably exemplified by a decrease in the expression level of Wnt5b by 35% or more when the nucleic acid is added, compared to when the nucleic acid is not added, according to the above-mentioned steps (1) and (2), and the suppression of expression, etc. is explained in the same manner as above.
  • composition of the present disclosure can be prepared by a conventional method by combining the above-mentioned active ingredients with other ingredients as necessary.
  • other ingredients include pharmacologically acceptable bases, carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, thickeners, surfactants, antioxidants, preservatives, coating agents, colorants, fragrances, pH adjusters, gastric mucosa protectants, and other drugs.
  • these ingredients can be used alone or in combination of two or more.
  • mice Male mice (C57BL/6N) aged 8 to 12 weeks were purchased from Japan SLC (Shizuoka). Cardiotoxin (Ctx) (Latoxan, Valence, France) or glycerol (Nacalai Tesque, Kyoto) was used to induce injury to the tibialis anterior (TA) muscle. Ctx (2.5 ⁇ l of 10 ⁇ M Ctx/g body weight) or glycerol (50 ⁇ l of 50% (v/v) glycerol/TA muscle) was injected into the TA muscle to induce injury to the TA muscle.
  • Ctx 2.5 ⁇ l of 10 ⁇ M Ctx/g body weight
  • glycerol 50 ⁇ l of 50% (v/v) glycerol/TA muscle
  • Ctx induces injury repair without fat accumulation
  • glycerol induces injury repair with fat accumulation
  • Ror2 flox/flox mice were generated as previously described (Endo M. et al., Glia, 2017, 65, 1).
  • Ctx or glycerol was injected into the extensor digitorum longus (EDL) muscle, and analysis was performed by fluorescent staining.
  • Wnt5b and Wnt11 were injected into the TA muscle after Ctx treatment.
  • Pdgfr ⁇ CreER/+ mice were obtained from Jackson Laboratory (Stock No. 018280, Bar Harbor, ME). 10-14 week old Ror2 flox/flox ; Pdgfr ⁇ CreER/+ mice were intraperitoneally injected with tamoxifen (100 ⁇ g/g body weight) (Sigma-Aldrich, St.
  • SCs and MPCs were separated from the cell suspension by FACS Aria III (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ) using anti-CD31, CD45, Sca-1, and SM/C-2.6 antibodies (antibody list is shown in Table 1).
  • SCs can be identified as SM/C-2.6 positive, CD31, CD45, Sca-1 negative cells.
  • MPCs are identified as Sca-1 positive, CD31-, CD45-, SM/C-2.6 negative cells.
  • Cos7 cells were cultured in 10% FBS-containing DMEM under 5% CO2 and 20% O2 at 37°C.
  • Cos7 cells were transfected with pCMV5-mWnt11 and a plasmid (pBabe-Puro) encoding a puromycin resistance gene at a ratio of 10:1, and puromycin-resistant cells that constitutively express mWnt11 were selected (Cos7-Wnt11).
  • Cos7 cells transfected with an empty vector (pCMV5) together with pBabe-Puro were also selected by puromycin treatment (Cos7-mock).
  • conditioned medium 5 x 105 Cos7-Wnt11 or Cos7-mock were cultured in 0% FBS DMEM in four ⁇ 10 dishes for 2 days. The medium was collected and centrifuged at 500 ⁇ g for 5 minutes to remove dead cells, and then concentrated by centrifugation at 2000 ⁇ g for 60 minutes using Vivaspin 20-10K (Cytiva, Marlborough, MA). The concentrated conditioned medium was administered to the injured TA muscle.
  • MPCs were isolated from both TA, soleus, and gastrocnemius muscles by FACS as described above 3 days after Ctx administration, and cultured in DMEM (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) containing 10% FBS, 50 U/ml Penicillin (Meiji Seika Pharma, Tokyo, Japan), 50 ⁇ g/ml Kanamycin (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and 10 ng/ml bFGF (Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at 5% CO 2 , 3% O 2 , and 37°C for 3 to 4 days. The MPCs were then used in the following in vitro experiments. In vitro experiments using MPCs were performed at 37°C under 5% CO 2 and 20% O 2 .
  • siRNA was introduced into MPCs (the siRNA sequences are Ror2#1 and Ror2#2 in Table 2) and cultured in DMEM containing 10% FBS for 3 days. The cells were then fixed with 4% (w/v) paraformaldehyde (PFA) for 10 minutes at room temperature. The fixed MPCs were then stained with anti-Ki67 antibody and DAPI to evaluate the percentage of Ki67-positive MPCs.
  • PFA paraformaldehyde
  • siRNA (Ror2#1, Ror2#2, Wnt5b#1, or Wnt5b#2 listed in Table 2) was introduced into MPCs and cultured in DMEM containing 10% FBS for 3 days. The MPCs were then treated with EdU (10 ⁇ M, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) for 30 minutes and then fixed with 4% (w/v) PFA. EdU incorporation was detected using the Click-it EdU imaging kit (Thermo Fisher Scientific) according to the manufacturer's instructions.
  • MPCs were cultured for 3 days in adipogenic induction medium (DMEM containing 10% FBS, 0.5 mM IBMX (Sigma-Aldrich), 0.25 ⁇ M dexamethasone (Sigma-Aldrich), and 10 ⁇ g/ml insulin (Sigma-Aldrich)) and then treated with adipogenic maintenance medium (DMEM containing 10% FBS and 10 ⁇ g/ml insulin) for 3 days.
  • DMEM adipogenic induction medium
  • IBMX Sigma-Aldrich
  • dexamethasone Sigma-Aldrich
  • 10 ⁇ g/ml insulin Sigma-Aldrich
  • MPCs transfected with siRNA were cultured in 10% FBS DMEM for 3 days and then stained with SPiDER- ⁇ Gal (Dojindo Laboratories, Kumamoto) according to the manufacturer's instructions.
  • Oil Red O staining To stain the adipocytes, the cells were treated with 4% (w/v) PFA at room temperature for 10 minutes and fixed. The fixed cells were washed with 60% (v/v) isopropanol. Next, the cells were stained with Oil Red O (FUJIFILM Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) at room temperature for 30 minutes. The stained cells were washed with 60% (v/v) isopropanol, and then treated with 100% isopropanol for 20 minutes to extract the Oil Red O taken up into the adipocytes. The absorbance of the Oil Red O in the supernatant was then measured at 490 nm.
  • WST-8 assay MPCs were seeded in a 96-well plate (1000 cells per well) and siRNA was introduced (Wnt5b#1 or Wnt5b#2 shown in Table 2). After that, MPCs were cultured for a given period of time, and WST-8 reagent (Cell counting kit-8, Dojindo Laboratories) was added to the medium and incubated for 90 minutes, and the absorbance at 450 nm was measured.
  • WST-8 reagent Cell counting kit-8, Dojindo Laboratories
  • p38 inhibitor (10 ⁇ M SB203580, Cayman Chemical, Ann Arbor, MI) and recombinant Wnt5b (200 ng/ml, R&D System) were added to the medium 1 day after seeding MPCs in 96-well plates, and then WST-8 assay was performed as described above.
  • Immunofluorescence staining Isolated TA muscles were frozen in isopentane cooled with liquid nitrogen and sectioned using a cryostat (Leica CM1860, Wetzlar, Germany). Frozen sections were permeabilized with 0.2% (v/v) Triton X-100. Sections were then blocked with PBS containing 3% (w/v) BSA and incubated with primary antibodies overnight at 4°C. Sections were washed with PBS, incubated with secondary antibodies at room temperature for 1 hour, and then mounted using Fluor-KEEPER (Nacalai Tesque). Mounted sections were observed under a fluorescence microscope (BZ-X700, Keyence, Osaka, Japan).
  • the percentage of Perilipin-positive areas and CSA in the TA muscle were analyzed using ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD). For whole-mount immunofluorescence staining, isolated EDL muscles were fixed with 4% (w/v) PFA for 30 min and then permeabilized with 0.2% (v/v) Triton X-100. After washing with PBS, the EDL muscles were blocked with 3% (w/v) BSA in PBS for 1 h and incubated with primary antibodies at 4°C overnight. The EDL muscles were then washed with PBS and incubated with secondary antibodies at room temperature for 1 h.
  • the stained EDL muscles were placed on glass-bottom dishes (Matsunami Glass Industry, Osaka) and observed using a laser scanning confocal imaging system (LSM700, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany). Cultured cells were fixed with 4% (w/v) PFA for 10 minutes, then permeabilized with 0.2% (v/v) Triton X-100. After washing with PBS, the cells were blocked with 3% (w/v) BSA-containing PBS for 1 hour, and incubated with primary antibodies at 4°C overnight. Next, the cells were washed with PBS and incubated with secondary antibodies at room temperature for 1 hour. The stained cells were embedded in Fluor-KEEPER (Nacalai Tesque). The embedded cells were observed using a laser scanning confocal imaging system (LSM700, Carl Zeiss).
  • Membranes were blocked with 1% (v/w) BSA in TBST for 1 h and then blotted overnight at 4°C with primary antibodies (listed in Table 1). After treatment with the primary antibody, the membrane was washed with TBST for 30 minutes at room temperature, and then blotted with the secondary antibody (listed in Table 1) for 1 hour at room temperature. Finally, the membrane was washed with TBST for 30 minutes at room temperature.
  • ImmunoStar LD (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation) and LAS 1000 (GE Healthcare, Chicago, IL) were used for analysis. Relative band intensity was determined by ImageJ software.
  • mice The TA, gastrocnemius, soleus, quadriceps, and gluteus maximus muscles of mice were collected, and SCs and MPCs were isolated using FACS AriaIII. After RNA extraction, expression analysis was performed using quantitative RT-PCR.
  • MPCs isolated from Ctx-injected TA muscles were cultured for 3 days at 5% CO2 , 3% O2 , and then siRNA (Ror2#1 or Ror2#2 listed in Table 2) was introduced under normal oxygen concentration. The next day, the medium was replaced with fresh medium. Three days after siRNA introduction, the cells were fixed and stained with Ki67 antibody. MPCs isolated from TA muscles administered with Ctx were cultured for 3 days at 5% CO2 , 3% O2 , and then siRNA (Ror2#1 or Ror2#2 listed in Table 2) was introduced under normal oxygen concentration. The next day, the medium was replaced with a new one.
  • siRNA Three days after the introduction of siRNA, the cells were cultured for 3 days in adipogenic induction medium, followed by culture for 3 days in adipogenic maintenance medium to induce differentiation into adipocytes. After differentiation induction, oil red O staining was performed. MPCs isolated from Ctx-administered TA muscles were cultured for 3 days in 5% CO2 , 3% O2 , and then siRNA (Ror2#1 or Ror2#2 listed in Table 2) was introduced under normal oxygen concentration. The next day, the medium was replaced with fresh medium. Three days after siRNA introduction, senescent cells were stained with SPiDER- ⁇ Gal.
  • Tamixifen was administered to 12-16 week old control mice and Ror2cKO mice, and the mice were then raised for half a year, after which the skeletal muscle weights were compared and analyzed. Frozen sections of the TA muscles were prepared and stained with Laminin antibodies, and the cross-sectional area of each muscle fiber was measured.
  • the thickness of muscle fibers was smaller in Ror2cKO mice 2 weeks after Ctx administration than in control mice, indicating delayed skeletal muscle regeneration, suggesting that Ror2 is important for skeletal muscle regeneration. Furthermore, fat accumulation after glycerol administration was reduced in Ror2cKO mice, indicating that Ror2 is also important in IMAT formation.
  • MPCs isolated from Ctx-administered TA muscles were cultured for 3 days in 5% CO2 , 3% O2 , and then siRNA (Wnt11#1 or Wnt11#2 listed in Table 2) was introduced under normal oxygen concentration. The medium was replaced with fresh medium the next day. Three days after siRNA introduction, RNA was extracted and expression analysis was performed using quantitative RT-PCR. In parallel, SPiDER- ⁇ Gal staining was also performed, and the staining intensity was compared and analyzed using flow cytometry.
  • MPCs isolated from Ctx-administered TA muscles were cultured for 3 days in 5% CO2 , 3% O2 , and then siRNA (Ror2#1, Ror2#2, Wnt11#1, or Wnt11#2 listed in Table 2) was introduced under normal oxygen concentration. The next day, the medium was replaced with fresh medium. Two days after siRNA introduction, the cells were stained with phalloidin and DAPI. MPCs isolated from Ctx-injected TA muscles were cultured for 3 days in 5% CO2 , 3% O2 , and then siRNA (Ror2#1, Ror2#2, Wnt11#1, or Wnt11#2 listed in Table 2) was introduced under normal oxygen concentration. The next day, the medium was replaced with fresh medium. Three days after siRNA introduction, the cells were fixed and stained with LaminB1 and DAPI.
  • Wnt11 and Ror2 suppress the formation of stress fibers in MPCs, thereby suppressing nuclear morphological abnormalities and the associated activation of the cGas-Sting pathway, thereby inhibiting cellular senescence and contributing to the regeneration and maintenance of skeletal muscle.
  • MPCs isolated from Ctx-administered TA muscles were cultured for 3 days in 5% CO2 , 3% O2 , and then siRNA (Ror2#1 or Ror2#2 listed in Table 2) was introduced under normal oxygen concentration. The medium was replaced with fresh medium the next day. Two days after siRNA introduction, the medium was replaced with OPTI-MEM and cultured overnight. Wnt5b was then added at 200 ng/ml, and one hour later, proteins were extracted from the cells using lysis buffer and Western blotting was performed.
  • MPCs isolated from Ctx-administered TA muscles were cultured for 3 days at 5% CO 2 , 3% O 2 and then siRNA (Ror2#1 or Ror2#2 listed in Table 2) was introduced under normal oxygen concentration. The next day, the medium was replaced with one containing Wnt5b (200 ng/ml) or SB203580 (10 ⁇ M). At this time, cells without medium replacement were analyzed by WST-8 assay as day 0 samples. Three days after medium replacement, the number of cells in each well was measured by WST-8 assay.
  • Wnt5b is expressed in Schwann cells (S100 ⁇ -positive cells), and that the proliferation of Wnt5b-positive Schwann cells is enhanced when glycerol is administered. This suggests that Schwann cells may be one of the cells that produce Wnt5b.
  • Ctx or glycerol was administered to the TA muscles of 8-12 week old male mice, and the TA muscles were collected 3 days later.
  • SCs, MPCs, CD31+ and CD45+ cells (a mixed population of hematopoietic cells and endothelial cells), and other cell populations were isolated using FACS AriaIII, and expression analysis was performed using quantitative RT-PCR after RNA extraction.
  • MPCs isolated from Ctx-administered TA muscles were cultured for 3 days in 5% CO2 , 3% O2 , and then siRNA (Wnt5b#1 or Wnt5b#2 shown in Table 2) was introduced under normal oxygen concentration. The next day, the medium was replaced with fresh medium. Three days after siRNA introduction, RNA was extracted and expression analysis was performed by quantitative RT-PCR. MPCs isolated from Ctx-administered TA muscles were cultured for 3 days in 5% CO2 , 3% O2 , after which siRNA (Wnt5b#1 or Wnt5b#2 shown in Table 2) was introduced under normal oxygen concentration. The medium was replaced with fresh medium the next day.
  • Wnt11 and Ror2 suppress cellular senescence in MPCs and contribute to the maintenance and regeneration of skeletal muscle, but that under pathological conditions, Wnt5b, in addition to Wnt11, also functions as a ligand for Ror2, promoting the excessive proliferation of MPCs and the formation of IMAT.
  • muscle diseases and/or conditions in which IMAT accumulation is observed include various skeletal muscle diseases such as muscular dystrophies (Duchenne muscular dystrophy, etc.), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), and other muscular atrophies, as well as various conditions associated with aging in skeletal muscles, such as sarcopenia, frailty, and locomotive syndrome.
  • the present disclosure can be utilized to develop new treatment methods that are effective and have few side effects for such skeletal muscle diseases and conditions, including muscular dystrophies in which IMAT accumulation is observed and sarcopenia associated with aging.

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Abstract

骨格筋内脂肪組織（ＩＭＡＴ；Ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ　ａｄｉｐｏｓｅ　ｔｉｓｓｕｅ）形成抑制物質をスクリーニングする方法等の提供。 （Ｉ）Ｗｎｔ５ｂタンパク質、Ｒｏｒ２タンパク質、及び被験物質を接触させる工程、並びに （ＩＩ）前記被験物質がＷｎｔ５ｂタンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害することを確認する工程を含む、 ＩＭＡＴ形成抑制物質をスクリーニングする方法、並びにＩＭＡＴ形成抑制用組成物。

Description

骨格筋内脂肪組織（ＩＭＡＴ；Ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ　ａｄｉｐｏｓｅ　ｔｉｓｓｕｅ）形成抑制物質をスクリーニングする方法、及びＩＭＡＴ形成抑制用組成物
　本開示は、ＩＭＡＴ形成抑制物質をスクリーニングする方法、及びＩＭＡＴ形成抑制用組成物等に関する。
　骨格筋の維持や再生には、骨格筋組織幹細胞である衛星細胞（Ｓａｔｅｌｌｉｔｅ　ｃｅｌｌｓ；ＳＣｓ）や間葉系前駆細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ　ｃｅｌｌｓ；ＭＰＣｓ）が重要な役割を担っている。
　骨格筋損傷後にＳＣｓは増殖し、分化・融合を経て最終的に筋線維を形成し損傷部位の修復に寄与する。また、骨格筋に常在するＭＰＣｓは、ＳＣｓの増殖や分化を促進することで骨格筋再生を促す。一方で、筋ジストロフィーやサルコペニアをはじめとする骨格筋の病的状態ではＭＰＣｓが脂肪細胞に分化し、骨格筋中に本来ほとんど存在しないはずのＩＭＡＴを形成し、筋機能の著しい低下を引き起こすことが知られている。これらのことから、骨格筋再生においてＳＣｓとＭＰＣｓは厳密に制御されていると考えられるが、そのメカニズムについては不明な点が多い。
　これまでに、損傷後の骨格筋において分泌性糖タンパク質であるＷｎｔタンパク質の受容体として知られるＲｏｒファミリー受容体Ｒｏｒ１およびＲｏｒ２の発現が上昇することが見出されている（Ｋａｍｉｚａｋｉ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２０１７，　２９２，　３８）。Ｒｏｒ１　（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　ｌｉｋｅ　ｏｒｐｈａｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１）はＳＣｓにおいて高発現しており、骨格筋損傷後のＳＣｓの増殖を促進することで骨格筋再生に寄与することが明らかにされている（Ｋａｍｉｚａｋｉ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ．，　Ｊ．　Ｂｉｏｌ．　Ｃｈｅｍ．，　２０１７，　２９２，　３８）。
　異所性脂肪蓄積：ｅｃｔｏｐｉｃ　ｆａｔ　ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ
　異所性脂肪細胞：ｅｃｔｏｐｉｃ　ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ
Ａｇｉｎｇ（Ａｌｂａｎｙ　ＮＹ）．２０１８　Ａｐｒ　２５；１０（４）：７４７－７６３．ｄｏｉ：１０．１８６３２／ａｇｉｎｇ．１０１４２５． Ｃｅｌｌ　Ｓｔｅｍ　Ｃｅｌｌ．２０１９　Ｍａｒ　７；２４（３）：４３３－４４６．ｅ７．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｓｔｅｍ．２０１８．１２．０１４．Ｅｐｕｂ　２０１９　Ｊａｎ　２４． Ｎａｔｕｒｅ．　２０２２　Ｊｕｌ；６０７（７９２０）：７９０－７９８．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８６－０２２－０４９２４－６．Ｅｐｕｂ　２０２２　Ｊｕｎ　２９． Ｎａｔ　Ｍｅｄ．２０１５　Ｊｕｌ；２１（７）：７８６－９４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．３８６９．Ｅｐｕｂ　２０１５　Ｊｕｎ　８． Ｎａｔ　Ｃｅｌｌ　Ｂｉｏｌ．２０１８　Ａｕｇ；２０（８）：９１７－９２７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５５６－０１８－０１５１－ｙ．Ｅｐｕｂ　２０１８　Ｊｕｌ　２６．
　ＭＰＣｓが骨格筋の維持および再生に寄与するか、ＩＭＡＴの形成を促進するかを決定付ける分子機構は十分に解明されていないが、ＭＰＣｓの骨格筋維持・再生機構を維持するとともに、ＭＰＣｓのＩＭＡＴ形成能を抑制することで、骨格筋の病的状態を阻害できることが期待されることから、ＩＭＡＴ形成能を抑制する物質を同定することができれば、骨格筋の諸疾患や骨格筋の加齢に伴う病変（ロコモティブ症候群、フレイルなど）の病状改善に大きく貢献するとともに、超高齢社会を迎えた我が国をはじめ、国際的にも人々のＱＯＬ、ＡＤＬの向上に大きく寄与することが出来るが、現状そのような効果をもつ物質は見出されておらず、その同定方法やスクリーニング法などは確立されていない。本開示は、ＩＭＡＴ形成抑制物質をスクリーニングする方法を提供することを課題とする。また、本開示は、ＩＭＡＴ形成抑制用組成物を提供することも課題の１つである。
　本発明者らは、Ｒｏｒ２（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ　ｌｉｋｅ　ｏｒｐｈａｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　２）はＭＰＣｓにおいて高発現しているとともに、ＩＭＡＴ形成時に発現上昇するＷｎｔ５ｂの受容体として機能することで、ＭＰＣｓの過剰な増殖を誘導しＩＭＡＴの形成に寄与していることを見出しており、Ｗｎｔ１１－Ｒｏｒ２シグナルがＭＰＣｓの細胞老化を抑えることで骨格筋の維持・再生に寄与する一方で、病的状態ではＭＰＣｓにおいてＷｎｔ５ｂ－Ｒｏｒ２シグナルが活性化することでＩＭＡＴ形成が促進される可能性などを見出してきた。これらの独自の知見を踏まえて、これらの知見の集積に用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ及びｉｎ　ｖｉｖｏでの解析手法を利活用することにより、ＭＰＣｓにおいてＷｎｔ１１－Ｒｏｒ２シグナルを維持しつつ、Ｗｎｔ５ｂ－Ｒｏｒ２シグナルを抑制する物質を選別することで、骨格筋の諸疾患や骨格筋の加齢に伴う病変（ロコモティブ症候群、フレイルなど）の病状改善に大きく貢献し得る物質の同定（スクリーニング）法を見出した。
　本開示は、例えば以下の項に記載の主題を包含する。
項１．
（Ｉ）Ｗｎｔ５ｂタンパク質、Ｒｏｒ２タンパク質、及び被験物質を接触させる工程、並びに
（ＩＩ）前記被験物質がＷｎｔ５ｂタンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害することを確認する工程を含む、
ＩＭＡＴ形成抑制物質をスクリーニングする方法。
項２．
工程（Ｉ）において、さらにＷｎｔ１１タンパク質を接触させ、
工程（ＩＩ）において、さらに前記被験物質がＷｎｔ１１タンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害しないことを確認する、項１に記載の方法。
項３．
（１）ＳＣｓ、ＭＰＣｓ、及びシュワン細胞からなる群より選択される少なくとも１種と、被験物質とを接触させる工程、
並びに
（２）前記被験物質がＷｎｔ５ｂの発現量を抑制することを確認する工程を含む、
ＩＭＡＴ形成抑制物質をスクリーニングする方法。
項４．
前記工程（２）において、前記被験物質がＷｎｔ１１の発現量を抑制しないことを確認する、項３に記載の方法。
項５．
（Ａ）Ｗｎｔ５ｂタンパク質、Ｒｏｒ２タンパク質、ｐ３８タンパク質及び被験物質を接触させる工程、並びに
（Ｂ）前記被験物質がｐ３８タンパク質のリン酸化を阻害することを確認する工程を含む、
ＩＭＡＴ形成抑制物質をスクリーニングする方法。
項６．
ＩＭＡＴ形成抑制が、ＭＰＣｓの増殖抑制によるものである、項１～５のいずれか一項に記載の方法。
項７．
Ｗｎｔ５ｂタンパク質の中和抗体、又はＷｎｔ５ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分とする、ＩＭＡＴ形成抑制用組成物。
項８．
ＩＭＡＴの蓄積が認められる筋疾患又は症状の抑制又は治療に使用するための、項７に記載のＩＭＡＴ形成抑制用組成物。
項９．
前記ＩＭＡＴの蓄積が認められる筋疾患又は症状が、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、サルコペニア、フレイル又はロコモティブ症候群である、項８に記載のＩＭＡＴ形成抑制用組成物。
　ＭＰＣｓが骨格筋の維持・再生に関わるか、あるいはＩＭＡＴ形成の促進に寄与するかを決定付ける分子機構についてはこれまで十分に解明されていなかったが、本発明者らは、ＭＰＣｓにおけるＷｎｔ１１－Ｒｏｒ２シグナルは骨格筋の維持・再生に、一方、Ｗｎｔ５ｂ－Ｒｏｒ２シグナルはＩＭＡＴの形成にそれぞれ重要であることを見出した。これらの知見から、Ｒｏｒ２がＷｎｔ１１の受容体として機能するか、Ｗｎｔ５ｂの受容体として機能するかが、ＭＰＣｓの機能を決定付ける上で重要であることが明らかとなった。Ｗｎｔ５ｂやＷｎｔ１１、Ｒｏｒ２は発生過程における組織・器官形成や、がんの進展において重要な役割を担っているが、正常な成体組織においてはほとんど発現が認められないことから、Ｗｎｔ５ｂやＷｎｔ１１、Ｒｏｒ２を筋疾患の治療標的とすることは、副作用が少なく有効性の高い治療方法の開発に繋がることが期待され、当該治療法発見における大きな優位性の一つである。しかしながら、ＭＰＣｓは骨格筋維持・再生にも重要であることから、単にＭＰＣｓの機能を抑制すれば良い訳ではなく、骨格筋維持・再生機構を保持しつつ、ＩＭＡＴ形成能を抑制する必要がある。
　本発明者らは、以上の独自の知見を踏まえ、Ｗｎｔ１１－Ｒｏｒ２シグナルを保持しつつ、Ｗｎｔ５ｂ－Ｒｏｒ２シグナルを抑制するような物質を選定することが可能であり、骨格筋の諸疾患や骨格筋の加齢に伴う病変（ロコモティブ症候群、フレイルなど）の病状改善に大きく貢献し得る物質を同定する方法を確立した。
　ＩＭＡＴ形成抑制物質をスクリーニングする方法が提供される。また、ＩＭＡＴ形成抑制用組成物が提供される。
ＳＣｓ及びＭＰＣｓにおけるＲｏｒ２の発現量を測定した結果を示す。 Ｃｔｘを投与した前脛骨筋（ＴＡ筋；Ｔｉｂｉａｌｉｓ　ａｎｔｅｒｉｏｒ（ＴＡ）ｍｕｓｃｌｅ）から単離したＭＰＣｓの増殖能、脂肪細胞分化能、及び細胞老化を測定した結果を示す。 コントロールマウス及びＲｏｒ２ｃＫＯマウスにおける、ＴＡ筋、腓腹筋（Ｇａｓｔｒｏｃｎｅｍｉｕｓ　ｍｕｓｃｌｅ）、及びヒラメ筋（Ｓｏｌｅｕｓ）重量の測定結果、並びにＴＡ筋における筋線維の染色結果を示す。 コントロールマウス及びＲｏｒ２ｃＫＯマウスにおける、ＴＡ筋における筋線維、及び脂肪染色結果を示す。 Ｃｔｘを投与したＴＡ筋から単離したＭＰＣｓにおけるＷｎｔ１１の発現量、及び細胞老化を測定した結果を示す。 Ｃｔｘを投与したＴＡ筋から単離したＭＰＣｓにおけるストレスファイバー及び核染色結果を示す。 Ｃｔｘ投与筋、及びＧｌｙｃｅｒｏｌ投与筋におけるＷｎｔファミリー遺伝子の発現量、並びにＣｔｘを投与したＴＡ筋から単離したＭＰＣｓにＷｎｔ５ａ又はＷｎｔ５ｂを添加した際の細胞増殖測定結果を示す。 Ｃｔｘを投与したＴＡ筋から単離したＭＰＣｓを用いたウェスタンブロットの結果、及びＣｔｘを投与したＴＡ筋から単離したＭＰＣｓを用いたＷＳＴ－８アッセイの結果を示す。 Ｃｔｘ又はＧｌｙｃｅｒｏｌを投与し３日後のＥＤＬ（Ｅｘｔｅｎｓｏｒ　ｄｉｇｉｔｏｒｕｍ　ｌｏｎｇｕｓ）筋をホールマウント染色した結果を示す。 ＣｔｘまたはＧｌｙｃｅｒｏｌを投与し３日後のＴＡ筋から単離した各種細胞におけるＷｎｔ５ｂの発現量を測定した結果を示す。 Ｃｔｘを投与したＴＡ筋から単離したＭＰＣｓにおけるＷｎｔ５ｂの発現量、及び細胞増殖を測定した結果を示す。
　以下、本開示に包含される各実施形態について、さらに詳細に説明する。
　本開示は、ＩＭＡＴ形成抑制物質をスクリーニングする方法を包含する。本明細書において、当該方法を、「本開示のスクリーニング方法」等と表記することがある。
　本明細書において、ＩＭＡＴ（骨格筋内脂肪組織；Ｉｎｔｒａｍｕｓｃｕｌａｒ　ａｄｉｐｏｓｅ　ｔｉｓｓｕｅ）は、骨格筋内に見られる異所性脂肪組織を意味する。本来、骨格筋にはほとんど脂肪が存在しないにも関わらず、脂肪が蓄積している状態である。
　本開示のスクリーニング方法は、Ｗｎｔ５ｂタンパク質、Ｒｏｒ２タンパク質、及び被験物質を接触させる工程を含む。本明細書において、当該工程を工程（Ｉ）等と表記することがある。
　Ｗｎｔ（Ｗｉｎｇｌｅｓｓ－ｔｙｐｅ　ＭＭＴＶ　ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　ｓｉｔｅ　ｆａｍｉｌｙ）タンパク質は、分泌性糖タンパク質であり、Ｒｏｒタンパク質等と結合することが知られている。Ｗｎｔタンパク質は哺乳類において１９種類が同定されており、例えば、Ｗｎｔ５ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｗｎｔ１１等が存在する。該タンパク質のアミノ酸配列、塩基配列等は、公知のデータベース等から知ることができる。例えば、ＮＣＢＩ（National Center for Biotechnology Information）において、ヒトのＷｎｔ５ｂ遺伝子のｍＲＮＡ配列のアクセッションＮｏ．は、ＮＭ＿０３０７７５であり、ヒトのＷｎｔ１１遺伝子のｍＲＮＡ配列のアクセッションＮｏ．は、ＸＭ＿００５２７４２３１である。
　Ｗｎｔ５ｂ産生細胞としては、例えば、ＳＣｓ、ＭＰＣｓ、シュワン細胞等が挙げられる。
　Ｗｎｔ１１産生細胞としては、例えば、ＭＰＣｓ等が挙げられる。
　Ｒｏｒ（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｔｙｒｏｓｉｎｅ　ｋｉｎａｓｅ－ｌｉｋｅ　ｏｒｐｈａｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ）タンパク質は、１回膜貫通型受容体であり、Ｗｎｔタンパク質の受容体として機能し、非古典的Ｗｎｔ経路を活性化することが知られている。Ｒｏｒタンパク質としては、例えば、Ｒｏｒ１、Ｒｏｒ２等が知られている。該タンパク質のアミノ酸配列、塩基配列等は、公知のデータベース等から知ることができる。例えば、ＮＣＢＩにおいて、ヒトのＲｏｒ２遺伝子のｍＲＮＡ配列のアクセッションＮｏ．は、ＮＭ＿００１３１８２０４である。
　Ｒｏｒ２発現細胞としては、例えば、ＭＰＣｓ等が挙げられる。
　被験物質としては、特に限定されない。例えば、化合物及び組成物であり得る。化合物としては、例えば低分子化合物や、核酸（例えばＤＮＡ、ＲＮＡ等）やタンパク質（例えば抗体又はその一部等）、ポリマー等の高分子化合物であってよい。組成物としても、生物（例えば動物、植物、微生物等）から得た抽出物等であってもよく、化合物を２種以上組み合わせたものであってもよい。
　工程（Ｉ）において、Ｗｎｔ５ｂタンパク質、Ｒｏｒ２タンパク質、及び被験物質を接触させる方法としては特に限定されない。例えば、Ｗｎｔ５ｂタンパク質、Ｒｏｒ２タンパク質、及び被験物質を適当な溶媒中に添加してもよく、Ｒｏｒ２タンパク質を発現する細胞に対して、Ｗｎｔ５ｂタンパク質、及び被験物質を添加等してもよい。
　適当な溶媒としては、特に限定されない。例えば、水、細胞培養用液体培地等が挙げられる。
　Ｗｎｔ５ｂタンパク質の濃度としては、特に限定されない。例えば、０．１～４μｇ／ｍｌ程度等とすることができる。
　Ｒｏｒ２タンパク質の濃度としては、特に限定されない。例えば、０．１～４μｇ／ｍｌ程度等とすることができる。
　被験物質の濃度は、被験物質の種類に応じて、適宜設定することができる。
　接触時の温度としては、特に限定されない。例えば、２５～４０℃程度、好ましくは３０～４０℃程度等とすることができる。
　接触時間としては、特に限定されない。例えば、１０秒～３時間程度、好ましくは３分～１時間程度等とすることができる。
　接触時には、必要に応じて、例えば、攪拌、振盪等することができる。
　Ｒｏｒ２タンパク質を発現する細胞としては、例えば、ＭＰＣｓ等が挙げられる。
　本開示のスクリーニング方法は、工程（Ｉ）において、さらにＷｎｔ１１タンパク質を接触させることができる。換言すれば、本開示のスクリーニング方法は、工程（Ｉ）において、Ｗｎｔ５ｂタンパク質、Ｗｎｔ１１タンパク質、Ｒｏｒ２タンパク質、及び被験物質を接触させることができる。
　Ｗｎｔ５ｂタンパク質、Ｗｎｔ１１タンパク質、Ｒｏｒ２タンパク質及び被験物質を接触させる方法としては特に限定されない。例えば、Ｗｎｔ５ｂタンパク質、Ｗｎｔ１１タンパク質、Ｒｏｒ２タンパク質、及び被験物質を適当な溶媒中に添加してもよく、Ｒｏｒ２タンパク質を発現する細胞に対して、Ｗｎｔ５ｂタンパク質、Ｗｎｔ１１タンパク質、及び被験物質を添加等してもよい。
　Ｗｎｔ１１タンパク質の濃度としては、特に限定されない。例えば、０．１～４μｇ／ｍｌ程度等とすることができる。
　その他、接触方法については、上述した記載を援用することができる。
　本開示のスクリーニング方法は、さらに、被験物質がＷｎｔ５ｂタンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害することを確認する工程を含む。本明細書において、当該工程を工程（ＩＩ）等と表記することがある。
　工程（ＩＩ）において、被験物質がＷｎｔ５ｂタンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害することを確認する方法としては、特に限定されない。例えば、ＥＬＩＳＡ法やアルファスクリーン法、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを用いた解析等が挙げられる。
　例えば、各種解析手法による吸光度や発光、蛍光、表面プラズモン共鳴等の分析により、Ｗｎｔ５ｂタンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合が検出可能であることを確認した上で、被験物質を添加しない場合と比較して、被験物質を添加した場合に、Ｗｎｔ５ｂタンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合量が３５％以上減少することが好ましい。当該範囲の上限若しくは下限は、例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％程度であってもよい。具体的には、３５～１００％程度であってもよい。
　本開示のスクリーニング方法によれば、例えば、被験物質を添加しない場合と比較して、被験物質を添加した場合に、Ｗｎｔ５ｂタンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害し得る物質をスクリーニングすることができる。
　後述する実施例に示すとおり、Ｗｎｔ５ｂ及びＲｏｒ２はｐ３８を介してＭＰＣｓの増殖を促進することにより、骨格筋組織中におけるＭＰＣｓの過剰な蓄積を誘導し、ＩＭＡＴの形成に寄与していると考えられる。
　理論に拘束されることを望むものではないが、本開示のスクリーニング方法により得られるＩＭＡＴ形成抑制物質は、Ｗｎｔ５ｂタンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害することによって、ＭＰＣｓの過剰な増殖を抑制し、ＩＭＡＴの形成を抑制し得ると推測される。
　工程（Ｉ）において、Ｗｎｔ５ｂタンパク質、Ｒｏｒ２タンパク質、Ｗｎｔ１１タンパク質及び被験物質を接触させた場合、本開示のスクリーニング方法は、工程（ＩＩ）において、さらに、被験物質がＷｎｔ１１タンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害しないことを確認する工程を含む。換言すれば、本開示のスクリーニング方法は、工程（ＩＩ）において、被験物質がＷｎｔ５ｂタンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害すること、かつＷｎｔ１１タンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害しないことを確認することができる。
　被験物質がＷｎｔ１１タンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害しないことを確認する方法としては、特に限定されない。例えば、ＥＬＩＳＡ法やアルファスクリーン法、Ｂｉａｃｏｒｅシステムを用いた解析等が挙げられる。
　工程（ＩＩ）において、最初に被験物質がＷｎｔ５ｂタンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害することを確認し、次に当該被験物質がＷｎｔ１１タンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害しないことを確認してもよく、最初に被験物質がＷｎｔ１１タンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害しないことを確認し、次に当該被験物質がＷｎｔ５ｂタンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害することを確認してもよく、被験物質がＷｎｔ５ｂタンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害し、かつＷｎｔ１１タンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害しないことを同時に確認してもよい。
　本明細書において、「阻害しない」とは、完全に、又は実質的に阻害しないことを意味する。「実質的に阻害しない」とは、例えば、各種解析手法による吸光度や発光、蛍光、表面プラズモン共鳴等の分析により、Ｗｎｔ１１タンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合が検出可能であることを確認した上で、被験物質を添加しない場合と比較して、被験物質を添加した場合に、Ｗｎｔ１１タンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合量の減少率が３０％以下であることを意味する。好ましくは２０％程度、より好ましくは１０％程度、さらにより好ましくは５％程度、いっそう好ましくは３％程度、特に好ましくは１％程度以下であってもよい。あるいは、Ｗｎｔ１１タンパク質およびＲｏｒ２タンパク質を共発現する細胞（ＭＰＣｓなど）において、被験物質を添加しない場合と比較して、被験物質を添加した場合に、アクチン・ストレスファイバーの形成や核形態の異常などの増加率が３０％以下であることを意味する。好ましくは２０％程度、より好ましくは１０％程度、さらにより好ましくは５％程度、いっそう好ましくは３％程度、特に好ましくは１％程度以下であってもよい。
　本開示のスクリーニング方法によれば、例えば、被験物質を添加しない場合と比較して、被験物質を添加した場合に、Ｗｎｔ５ｂタンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害し得、かつＷｎｔ１１タンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害し得ない物質をスクリーニングすることができる。
　後述する実施例に示すとおり、Ｗｎｔ５ｂ及びＲｏｒ２はｐ３８を介してＭＰＣｓの増殖を促進することにより、骨格筋組織中におけるＭＰＣｓの過剰な蓄積を誘導し、ＩＭＡＴの形成に寄与していると考えられる。また、後述する実施例に示すとおり、Ｗｎｔ１１及びＲｏｒ２は、ＭＰＣｓにおけるストレスファイバーの形成を抑制することで、核形態異常とそれに伴うｃＧａｓ－Ｓｔｉｎｇ経路の活性化を抑制し、その結果、ＭＰＣｓの細胞老化を抑制することにより骨格筋の再生や維持に寄与していると考えられる。
　理論に拘束されることを望むものではないが、本開示のスクリーニング方法により得られるＩＭＡＴ形成抑制物質は、Ｗｎｔ５ｂタンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害することによって、ＭＰＣｓの過剰な増殖を抑制し、ＩＭＡＴの形成を抑制し得る一方で、Ｗｎｔ１１タンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害しないことによって、ＭＰＣｓの細胞老化を抑制し、骨格筋を維持又は再生し得ると推測される。
　また、このようにＷｎｔ５ｂタンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害することによって、ＭＰＣｓの過剰な増殖が抑制され、ＩＭＡＴの形成を抑制し得る。従って、Ｗｎｔ５ｂの発現量を抑制することによっても、Ｗｎｔ５ｂタンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合が低減し、これによってＭＰＣｓの過剰な増殖が抑制され、ＩＭＡＴの形成を抑制し得るといえる。Ｗｎｔ５ｂ産生細胞として例えばＳＣｓ、ＭＰＣｓ、シュワン細胞等が挙げられる。このことから、本開示のスクリーニング方法は、（１）ＳＣｓ、ＭＰＣｓ、及びシュワン細胞からなる群より選択される少なくとも１種と、被験物質とを接触させる工程、並びに（２）前記被験物質がＷｎｔ５ｂの発現量を抑制することを確認する工程を包含するものであってもよい。また、Ｗｎｔ５ｂ産生細胞は、更にＲｏｒ２及び／又はｐ３８を産生する細胞であってもよい。このことから、前述の工程（Ｉ）及び（ＩＩ）を包含するスクリーニング方法は、該工程（１）及び（２）をさらに含んでもよく、含まなくてもよい。また、該工程（１）及び（２）を包含するスクリーニング方法は、前記工程（Ｉ）及び（ＩＩ）を含まなくてもよい。本開示を制限するものではないが、例えば前述の通り、前記工程（Ｉ）において、Ｒｏｒ２タンパク質を発現する細胞としてＭＰＣｓ等を、Ｗｎｔ５ｂタンパク質を発現する細胞としてＳＣｓ、ＭＰＣｓ及び／もしくはシュワン細胞等を、並びに／又はＷｎｔ１１タンパク質タンパク質を発現する細胞としてＭＰＣｓ等を、被験物質と接触させてもよく、前記工程（ＩＩ）において前記結合の阻害を確認する際に、さらに工程（２）を実施して被験物質がＷｎｔ５ｂの発現量を抑制することを確認してもよい。工程（２）は、前記工程（ＩＩ）よりも前に行ってもよく、前記工程（ＩＩ）と同時に行ってもよく、前記工程（ＩＩ）よりも後に行ってもよい。
　工程（１）において、ＳＣｓ、ＭＰＣｓ、及びシュワン細胞からなる群より選択される少なくとも１種と、被験物質とを接触させる方法としては特に限定されない。例えば、ＳＣｓ、ＭＰＣｓ、及びシュワン細胞からなる群より選択される少なくとも１種の細胞と被験物質とを適当な溶媒中に添加してもよく、該細胞を含む培養液に被験物質を添加等してもよい。
　適当な溶媒としては、特に限定されず、上述した記載を援用することができる。
　ＳＣｓ、ＭＰＣｓ、及びシュワン細胞は、１種単独で使用してもよく、２種以上を組み合わせて使用してもよい。該細胞の濃度は特に限定されず、被験物質と接触させる際の細胞濃度（細胞合計濃度）として、例えば１×１０４～１×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ程度等とすることができる。
　被験物質の濃度は、被験物質の種類に応じて、適宜設定することができる。被験物質は、特に限定されず、上述した記載を援用することができる。
　接触時の温度は、特に限定されず、例えば、２５～４０℃程度、好ましくは３０～４０℃程度等とすることができる。
　接触時間としては、特に限定されず、例えば、１時間～６時間程度、好ましくは１２時間～４８時間程度等とすることができる。
　接触時には、必要に応じて、例えば、攪拌、振盪等することができる。
　工程（２）において、被験物質がＷｎｔ５ｂの発現量を抑制することを確認する方法は特に限定されない。Ｗｎｔ５ｂの発現量は、Ｗｎｔ５ｂ遺伝子の発現量であってもよく、Ｗｎｔ５ｂタンパク質の発現量であってもよい。Ｗｎｔ５ｂの発現量を抑制することを確認する方法は、特に制限されず、例えば、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法、ウェスタンブロッティング法、免疫染色法、フローサイトメトリー法等が挙げられる。
　例えば、各種解析手法による発光や蛍光等の分析により、Ｗｎｔ５ｂの発現量を測定できることを確認した上で、被験物質を添加しない場合と比較して、被験物質を添加した場合に、Ｗｎｔ５ｂの発現量が３５％以上減少することが好ましい。当該範囲の上限若しくは下限は、例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％程度であってもよい。具体的には、３５～１００％程度であってもよい。
　本開示の工程（１）及び（２）を含むスクリーニング方法によれば、例えば、被験物質を添加しない場合と比較して、被験物質を添加した場合に、Ｗｎｔ５ｂの発現量を抑制し得る物質をスクリーニングすることができる。
　後述する実施例に示すとおり、Ｗｎｔ５ｂ及びＲｏｒ２はｐ３８を介してＭＰＣｓの増殖を促進することにより、骨格筋組織中におけるＭＰＣｓの過剰な蓄積を誘導し、ＩＭＡＴの形成に寄与していると考えられる。
　理論に拘束されることを望むものではないが、本開示の工程（１）及び（２）を含むスクリーニング方法により得られるＩＭＡＴ形成抑制物質は、Ｗｎｔ５ｂの発現量を抑制することによって、ＭＰＣｓの過剰な増殖を抑制し、ＩＭＡＴの形成を抑制し得ると推測される。
　また、例えばＭＰＣｓはＷｎｔ１１産生細胞でもある。このため、前述のとおり、前記工程（１）において、例えばＭＰＣｓと被験物質とを接触させた場合、前記工程（２）は、さらに、被験物質がＷｎｔ１１の発現量を抑制しないことを確認する工程を含んでもよい。換言すれば、前記工程（２）において、被験物質がＷｎｔ５ｂの発現量を抑制すること、かつＷｎｔ１１の発現量を抑制しないことを確認することができる。
　被験物質がＷｎｔ１１の発現量を抑制しないことを確認する方法は特に限定されない。Ｗｎｔ１１の発現量は、Ｗｎｔ１１遺伝子の発現量であってもよく、Ｗｎｔ１１タンパク質の発現量であってもよい。Ｗｎｔ１１の発現量を抑制しないことを確認する方法は、特に制限されず、例えば、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法、Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ　ｉｎ　ｓｉｔｕ　ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ法、ウェスタンブロッティング法、免疫染色法、フローサイトメトリー法等が挙げられる。
　工程（２）において、最初に被験物質がＷｎｔ５ｂの発現量を抑制することを確認し、次に当該被験物質がＷｎｔ１１の発現量を抑制しないことを確認してもよく、最初に被験物質がＷｎｔ１１の発現量を抑制しないことを確認し、次に当該被験物質がＷｎｔ５ｂの発現量を抑制することを確認してもよく、被験物質がＷｎｔ５ｂの発現量を抑制し、かつＷｎｔ１１の発現量を抑制しないことを同時に確認してもよい。
　本明細書において、「抑制しない」とは、完全に、又は実質的に抑制しないことを意味する。「実質的に抑制しない」とは、例えば、各種解析手法による発光や蛍光等の分析により、Ｗｎｔ１１の発現量を測定可能であることを確認した上で、被験物質を添加しない場合と比較して、被験物質を添加した場合に、Ｗｎｔ１１の発現量の減少率が３０％以下であることを意味する。好ましくは２０％程度、より好ましくは１０％程度、さらにより好ましくは５％程度、いっそう好ましくは３％程度、特に好ましくは１％程度以下であってもよい。あるいは、Ｗｎｔ１１タンパク質及びＲｏｒ２タンパク質を共発現する細胞（ＭＰＣｓなど）において、被験物質を添加しない場合と比較して、被験物質を添加した場合に、アクチン・ストレスファイバーの形成や核形態の異常などの増加率が３０％以下であることを意味する。好ましくは２０％程度、より好ましくは１０％程度、さらにより好ましくは５％程度、いっそう好ましくは３％程度、特に好ましくは１％程度以下であってもよい。
　このことから、本開示の工程（１）及び（２）を含むスクリーニング方法によれば、さらに、被験物質を添加しない場合と比較して、被験物質を添加した場合に、Ｗｎｔ５ｂの発現量を抑制し得、かつＷｎｔ１１の発現量を抑制し得ない物質をスクリーニングすることができる。
　また、前述のとおり、Ｗｎｔ５ｂ及びＲｏｒ２はｐ３８を介してＭＰＣｓの増殖を促進することにより、骨格筋組織中におけるＭＰＣｓの過剰な蓄積を誘導し、ＩＭＡＴの形成に寄与していると考えられる。また、後述する実施例に示すとおり、Ｗｎｔ１１及びＲｏｒ２は、ＭＰＣｓにおけるストレスファイバーの形成を抑制することで、核形態異常とそれに伴うｃＧａｓ－Ｓｔｉｎｇ経路の活性化を抑制し、その結果、ＭＰＣｓの細胞老化を抑制することにより骨格筋の再生や維持に寄与していると考えられる。
　理論に拘束されることを望むものではないが、本開示の工程（１）及び（２）を含むスクリーニング方法により得られるＩＭＡＴ形成抑制物質は、Ｗｎｔ５ｂの発現量を抑制することによって、ＭＰＣｓの過剰な増殖を抑制し、ＩＭＡＴの形成を抑制し得る一方で、Ｗｎｔ１１の発現量を抑制しないことによって、ＭＰＣｓの細胞老化を抑制し、骨格筋を維持又は再生し得ると推測される。
　また、前述のとおり、Ｗｎｔ５ｂ及びＲｏｒ２はｐ３８を介してＭＰＣｓの増殖を促進するといえる。このことから、本開示のスクリーニング方法は、前述のＷｎｔ５ｂ及びＲｏｒ２と被験物質との接触の際に、さらにｐ３８タンパク質を共存させてもよい（以下、これを工程（Ａ）と記載する場合がある）。本開示を制限するものではないが、工程（Ａ）として、例えば、Ｒｏｒ２タンパク質及びｐ３８タンパク質を発現した前記細胞（ＭＰＣｓ等）と、Ｗｎｔ５ｂタンパク質と、被験物質とを接触させることが好ましく例示できる。工程（Ａ）における接触は、ｐ３８タンパク質を被験物質等と接触させる以外は、前述の工程（Ｉ）又は（１）における説明と同様にして行えばよい。ｐ３８タンパク質の濃度としては、特に限定されず、例えば０．１～４μｇ／ｍｌ程度等とすることができる。また、この場合、該方法は、前記被験物質がｐ３８タンパク質のリン酸化を阻害することを確認する工程（以下、これを工程（Ｂ）と記載する場合がある）を含むことができる。
　このことから、前記工程（Ｉ）及び／又は（１）において、さらに工程（Ａ）が行われてもよい。また、前記工程（ＩＩ）及び／又は（２）と共に、さらに工程（Ｂ）が行われてもよい。工程（Ｂ）は、前記工程（ＩＩ）及び／又は（２）よりも前に行ってもよく、前記工程（ＩＩ）及び／又は（２）と同時に行ってもよく、前記工程（ＩＩ）及び／又は（２）よりも後に行ってもよい。
　後述の試験例から、ｐ３８タンパク質のリン酸化は、Ｗｎｔ５ｂ依存的といえる。このことから、該リン酸化阻害の確認によれば、Ｗｎｔ５ｂタンパク質によるｐ３８タンパク質のリン酸化の阻害を確認できるともいえる。
　前述のとおり、Ｗｎｔ５ｂ及びＲｏｒ２はｐ３８を介してＭＰＣｓの増殖を促進するといえることから、Ｗｎｔ５ｂ刺激によるｐ３８タンパク質のリン酸化を阻害できる物質もＩＭＡＴ形成抑制物質として好ましいといえる。従って、前記結合阻害及び／又は前記発現量抑制が可能であって、かつｐ３８タンパク質のリン酸化阻害が可能である候補物質は、Ｗｎｔ５ｂタンパク質及びＲｏｒ２タンパク質依存的なｐ３８タンパク質のリン酸化を阻害し得る物質であり得るといえる。この観点から、被験物質がｐ３８タンパク質のリン酸化を阻害することを確認する場合、被験物質が、前記工程（ＩＩ）及び／又は（２）に従って、Ｗｎｔ５ｂタンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害すること及び／又はＷｎｔ５ｂの発現量を抑制することを予め確認しておいてもよい。このように結合阻害及び／又は発現量抑制が可能であることを予め確認した被験物質を用いた場合に、さらにｐ３８タンパク質のリン酸化が阻害されたことを確認できた場合も、当該候補物質は、Ｗｎｔ５ｂタンパク質及びＲｏｒ２タンパク質依存的なｐ３８タンパク質のリン酸化を阻害し得る物質であり得るといえる。
　ｐ３８タンパク質は、ｐ３８ＭＡＰキナーゼ（Ｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｋｉｎａｓｅ、ＭＡＰＫ）とも称され、サイトカインやストレスに対する細胞応答を制御するシグナル伝達カスケードに関与することが知られている。ｐ３８タンパク質は、例えば哺乳類において４種類が同定されており、ｐ３８－α（ＭＡＰＫ１４）、ｐ３８－β（ＭＡＰＫ１１）、ｐ３８－γ（ＭＡＰＫ１２／ＥＲＫ６）、ｐ３８－δ（ＭＡＰＫ１３／ＳＡＰＫ４）が存在する。当該タンパク質のアミノ酸配列、塩基配列等は、公知のデータベース等から知ることができる。例えば、ＮＣＢＩにおいて、ｐ３８－α（ＭＡＰＫ１４）のｍＲＮＡ配列のアクセッションＮｏ．は、ＮＭ＿１３９０１２．３である。
　被験物質がｐ３８タンパク質のリン酸化を阻害することを確認する方法は特に限定されない。ｐ３８タンパク質のリン酸化を阻害することを確認する方法は、特に制限されず、例えば、ウェスタンブロッティング法、免疫蛍光染色法、フローサイトメトリー法等が挙げられる。後述する実施例に示すとおり、抗リン酸化ｐ３８抗体を利用した手法が好ましく例示される。
　ｐ３８タンパク質のリン酸化の阻害の確認は、前記結合阻害の確認及び／又は前記発現量抑制の確認よりも前に行っても良く、同時に行ってもよく、後に行ってもよい。
　本明細書において、「リン酸化を阻害する」とは、完全に、又は実質的にリン酸化を阻害することを意味する。「実質的に阻害する」とは、例えば、各種解析手法による発光や蛍光等の分析により、ｐ３８タンパク質のリン酸化を測定できることを確認した上で、被験物質を添加しない場合と比較して、被験物質を添加した場合に、ｐ３８タンパク質のリン酸化が３５％以上減少することが好ましい。当該範囲の上限若しくは下限は、例えば、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、又は１００％程度であってもよい。具体的には、３５～１００％程度であってもよい。
　このことから、前記工程（Ａ）及び（Ｂ）を含む本開示のスクリーニング方法によれば、さらに、被験物質を添加しない場合と比較して、被験物質を添加した場合に、ｐ３８タンパク質のリン酸化を阻害し得る物質をスクリーニングすることができる。
　また、本開示は、Ｗｎｔ５ｂタンパク質の中和抗体、又はＷｎｔ５ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸（ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド等）を有効成分とするＩＭＡＴ形成抑制用組成物を好ましく包含する。また、本開示は、これら以外に、例えば、低分子化合物、ペプチド、タンパク質等を有効成分として含むＩＭＡＴ形成抑制用組成物をも包含する。本明細書において、このようなＩＭＡＴ形成抑制用組成物を「本開示の組成物」等と表記することがある。
　Ｗｎｔ５ｂタンパク質の中和抗体は、例えば、Ｗｎｔ５ｂタンパク質を認識する抗体を、公知の方法又は公知の方法から容易に想到できる方法によって調製することで得ることもできる。また、Ｗｎｔ５ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸（ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド等）は、例えば、Ｗｎｔ５ｂ遺伝子配列に基づき、公知の方法又は公知の方法から容易に想到できる方法によって設計して合成することができる。またさらに、このようにして得たＷｎｔ５ｂタンパク質を認識する抗体やＷｎｔ５ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸について、上述した本開示のスクリーニング方法によりスクリーニングして特に好ましいものを取得することができる。
　本開示を制限するものではないが、Ｗｎｔ５ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸がｓｉＲＮＡの場合、Ｗｎｔ５ｂ遺伝子の発現抑制機能を有する限りにおいて、センス鎖とアンチセンス鎖の塩基数はいずれも制限されず、好ましくはそれぞれ塩基数１８～２５、より好ましくは塩基数２０～２２が例示される。また、Ｗｎｔ５ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸がアンチセンスオリゴヌクレオチドの場合も、Ｗｎｔ５ｂ遺伝子の発現抑制機能を有する限りにおいて、その塩基数は制限されず、好ましくは塩基数１２～２８、より好ましくは塩基数１５～２５が例示される。
　また、本開示を制限するものではないが、Ｗｎｔ５ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸として、例えば、配列番号９及び１０で示されるｓｉＲＮＡ、配列番号１１及び１２で示されるｓｉＲＮＡが例示される。ｓｉＲＮＡは、Ｗｎｔ５ｂ遺伝子の発現抑制機能を有する限りにおいて、その５’及び／又は３’末端に突出部配列（オーバーハング）を有していてもよく、また、その塩基配列に変異を有していてもよく（例えば１、２又は３個の塩基配列の置換、欠損又は付加）、また、センス鎖とアンチセンス鎖の塩基の長さは同じであっても異なってもよい。本開示においてＷｎｔ５ｂ遺伝子の発現抑制機能を有するとは、前述の工程（１）及び（２）に従って、核酸を添加しない場合と比較して、核酸を添加した場合に、Ｗｎｔ５ｂの発現量が３５％以上減少することが好ましく例示され、発現の抑制等は前述と同様にして説明される。
　本開示の組成物は、上述した有効成分と、必要に応じて他の成分とを組み合わせて常法により調製することができる。当該他の成分としては、例えば、薬理学上許容される基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤、コーティング剤、着色料、香料、ｐＨ調整剤、胃粘膜保護剤などのその他の薬剤等が例示される。これらの成分は、１種単独で、又は２種以上を組み合わせて用いることができる。
　なお、本明細書において「含む」とは、「本質的にからなる」と、「からなる」をも包含する（Ｔｈｅ　ｔｅｒｍ　“ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ”　ｉｎｃｌｕｄｅｓ　“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ　ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ　ｏｆ”　ａｎｄ　“ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ　ｏｆ．”）。また、本開示は、本明細書に説明した構成要件の任意の組み合わせを全て包含する。
　また、上述した本開示の各実施形態について説明した各種特性（性質、構造、機能等）は、本開示に包含される主題を特定するにあたり、どのように組み合わせられてもよい。すなわち、本開示には、本明細書に記載される組み合わせ可能な各特性のあらゆる組み合わせからなる主題が全て包含される。
　本開示の内容を以下の実験例を用いて具体的に説明する。しかし、本開示はこれらに何ら限定されるものではない。下記において、特に言及する場合を除いて、実験は大気圧及び常温条件下で行っている。また特に言及する場合を除いて、「％」は「容量％」を意味する。
動物実験
　８～１２週齢の雄マウス（Ｃ５７ＢＬ／６Ｎ）を日本ＳＬＣ（静岡）から購入した。Ｃａｒｄｉｏｔｏｘｉｎ（Ｃｔｘ）（Ｌａｔｏｘａｎ，Ｖａｌｅｎｃｅ，Ｆｒａｎｃｅ）又はＧｌｙｃｅｒｏｌ（Ｎａｃａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ，京都）を用いて前脛骨筋（ＴＡ筋）への損傷を誘導した。Ｃｔｘ（２．５μｌ　ｏｆ　１０μＭ　Ｃｔｘ／ｇ　ｂｏｄｙ　ｗｅｉｇｈｔ）又はＧｌｙｃｅｒｏｌ（５０μｌ　ｏｆ　５０％（ｖ／ｖ）Ｇｌｙｃｅｒｏｌ／ＴＡ　ｍｕｓｃｌｅ）をＴＡ筋に注入することでＴＡ筋の損傷を誘導し、２週間後に損傷ＴＡ筋を採取し、免疫蛍光染色を行うことで、筋繊維の断面積（ＣＳＡ：Ｃｒｏｓｓ　ｓｅｃｔｉｏｎａｌ　ａｒｅａ）とＰｅｒｉｌｉｐｉｎ陽性領域の割合を解析した。なお、Ｃｔｘは、脂肪蓄積を伴わない損傷修復を誘導するのに対して、Ｇｌｙｃｅｒｏｌは脂肪蓄積を伴う損傷修復を誘導する。Ｒｏｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘマウスは、以前に記載したように作製した（Ｅｎｄｏ　Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｇｌｉａ，２０１７，６５，１）。
　また、末端シュワン細胞の数を解析する際には、Ｃｔｘ又はＧｌｙｃｅｒｏｌを長趾伸筋（ＥＤＬ）に注入し、蛍光染色法により解析した。
　ＩＭＡＴの蓄積におけるＷｎｔ５ｂ及びＷｎｔ１１の役割を調べるために、Ｃｔｘ処理後に、組み換えＷｎｔ５ｂ（４μｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）及びＷｎｔ１１安定発現細胞のＣｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ（詳細は後述）をＴＡ筋に注入した。
　ＰｄｇｆｒαＣｒｅＥＲ／＋マウスはＪａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した（ストック番号０１８２８０、Ｂａｒ　Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）。１０～１４週齢のＲｏｒ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ；ＰｄｇｆｒαＣｒｅＥＲ／＋マウスにタモキシフェン（１００μｇ／ｇ　体重）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を１日１回、計９日間腹腔内注射し、ＭＰＣｓにおけるＲｏｒ２の発現を抑えた。本研究におけるすべての動物実験は、神戸大学動物実験規程に基づき、施設動物管理使用委員会（許可番号：Ｐ１７１０１１－Ｒ１，Ｐ２２０９０４）の承認を得て、神戸大学大学院医学研究科実験動物研究所で実施した。
ＳＣｓ及びＭＰＣｓの単離
　両側ＴＡ筋、ヒラメ筋、腓腹筋、大腿四頭筋及び大殿筋を、０．５％（ｗ／ｖ）コラゲナーゼＩＩ型（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ，Ｌａｋｅｗｏｏｄ，ＮＪ）を含むＤＭＥＭ／Ｆ－１２（富士フイルム和光純薬株式会社、大阪、日本）中で、９０分間３７℃で消化した。消化した骨格筋を４０μｍのナイロンメッシュ（ｐｌｕｒｉＳｅｌｅｃｔ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｅｉｐｚｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で濾過した。得られた細胞懸濁液は、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含む氷冷したＰＢＳで洗浄した。抗ＣＤ３１、ＣＤ４５、Ｓｃａ－１、及びＳＭ／Ｃ－２．６抗体を用いて、ＦＡＣＳ　Ａｒｉａ　ＩＩＩ（ＢＤ　Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ　Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）により細胞懸濁液からＳＣｓ及びＭＰＣｓを分離した（抗体リストは表１に記載）。ＳＣｓは、ＳＭ／Ｃ－２．６陽性、ＣＤ３１、ＣＤ４５、Ｓｃａ－１陰性の細胞として同定することができる。ＭＰＣｓは、Ｓｃａ－１陽性、ＣＤ３１－、ＣＤ４５－、ＳＭ／Ｃ－２．６陰性の細胞として同定される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
細胞培養
　Ｃｏｓ７細胞は、１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭで、５％ＣＯ２及び２０％Ｏ２の下で３７℃にて培養した。Ｃｏｓ７細胞に、ｐＣＭＶ５－ｍＷｎｔ１１とピューロマイシン耐性遺伝子をコードするプラスミド（ｐＢａｂｅ－Ｐｕｒｏ）を１０：１の割合でトランスフェクトし、ｍＷｎｔ１１を恒常的に発現するピューロマイシン耐性細胞を選択した（Ｃｏｓ７－Ｗｎｔ１１）。また、ｐＢａｂｅ－Ｐｕｒｏとともに空ベクター（ｐＣＭＶ５）を導入したＣｏｓ７細胞もピューロマイシン処理により選択した（Ｃｏｓ７－ｍｏｃｋ）。Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍを調製するために、５×１０５個のＣｏｓ７－Ｗｎｔ１１又はＣｏｓ７－ｍｏｃｋを０％ＦＢＳ　ＤＭＥＭで４つのφ１０ディッシュで２日間培養した。培地を回収し、５００×ｇで５分間遠心分離して死細胞を除去した後、Ｖｉｖａｓｐｉｎ　２０－１０Ｋ（Ｃｙｔｉｖａ，Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ，ＭＡ）を用いて２０００×ｇで６０分間遠心して濃縮した。濃縮したＣｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍを損傷したＴＡ筋に投与した。
　Ｃｔｘ投与３日後の両側ＴＡ筋、ヒラメ筋、腓腹筋から上記のようにＦＡＣＳによりＭＰＣを単離し、１０％ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍｌ　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ（明治製菓ファルマ、東京、日本）、５０μｇ／ｍｌ　Ｋａｎａｍｙｃｉｎ（富士フイルム和光純薬株式会社）、１０ｎｇ／ｍｌ　ｂＦＧＦ（富士フイルム和光純薬株式会社）を含むＤＭＥＭ（富士フイルム和光純薬株式会社）で、５％ＣＯ２，３％Ｏ２、３７℃で３～４日間培養した。その後、ＭＰＣを以下のｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験に使用した。ＭＰＣｓを用いたｉｎ　ｖｉｔｒｏ実験は、５％ＣＯ２及び２０％Ｏ２の下、３７℃で行った。
　Ｋｉ６７陽性ＭＰＣｓの割合を調べるために、ＭＰＣｓにｓｉＲＮＡを導入し（ｓｉＲＮＡの配列は表２に記載のＲｏｒ２＃１、Ｒｏｒ２＃２）、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで３日間培養した。その後、細胞を４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１０分間、室温で固定した。その後、固定したＭＰＣを抗Ｋｉ６７抗体とＤＡＰＩで染色し、Ｋｉ６７陽性ＭＰＣの割合を評価した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＥｄＵ陽性ＭＰＣｓの割合を調べるために、ＭＰＣｓにｓｉＲＮＡ（表２に記載のＲｏｒ２＃１，Ｒｏｒ２＃２，Ｗｎｔ５ｂ＃１又はＷｎｔ５ｂ＃２）を導入し、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭで３日間培養した。その後、ＭＰＣｓをＥｄＵ（１０μＭ、Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で３０分間処理し、その後４％（ｗ／ｖ）ＰＦＡで固定した。ＥｄＵの取り込みは、Ｃｌｉｃｋ－ｉｔ　ＥｄＵ　ｉｍａｇｉｎｇ　ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて、製造者の説明書に従って検出した。
　脂肪分化のために、ＭＰＣをＡｄｉｐｏｇｅｎｉｃ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ（１０％ＦＢＳ、０．５ｍＭ　ＩＢＭＸ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．２５μＭデキサメタゾン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０μｇ／ｍｌ　Ｉｎｓｕｌｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）含有ＤＭＥＭ）で３日間培養した後に、Ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ｍｅｄｉｕｍ（１０％ＦＢＳ，１０μｇ／ｍｌ　Ｉｎｓｕｌｉｎ含有ＤＭＥＭ）で３日間処理した。
　老化細胞を検出するため、ｓｉＲＮＡ（表２に記載のＲｏｒ２＃１，Ｒｏｒ２＃２、Ｗｎｔ１１＃１又はＷｎｔ１１＃２）を導入したＭＰＣｓを１０％ＦＢＳ　ＤＭＥＭで３日間培養した後、製造者の指示に従ってＳＰｉＤＥＲ－βＧａｌ（同仁化学研究所、熊本）で染色した。
オイルレッドＯ染色
　脂肪細胞を染色するために、細胞を４％（ｗ／ｖ）ＰＦＡで室温にて１０分間処理し、固定した。固定した細胞を６０％（ｖ／ｖ）イソプロパノールで洗浄した。次に、オイルレッドＯ（富士フイルム和光純薬株式会社）で室温にて３０分間染色した。染色した細胞を６０％（ｖ／ｖ）イソプロパノールで洗浄した後、１００％イソプロパノールで２０分間処理し、脂肪細胞内に取り込まれたオイルレッドＯを抽出した。その後、上清のオイルレッドＯの吸光度を４９０ｎｍで測定した。
ＷＳＴ－８アッセイ
　ＭＰＣを９６ウェルプレートに播種し（１ウェルあたり１０００細胞）、ｓｉＲＮＡを導入（表２に記載のＷｎｔ５ｂ＃１又はＷｎｔ５ｂ＃２）した。その後、ＭＰＣを任意の期間培養し、培地にＷＳＴ－８試薬（Ｃｅｌｌ　ｃｏｕｎｔｉｎｇ　ｋｉｔ－８、同仁化学研究所）を加えて９０分間インキュベートし、４５０ｎｍの吸光度を測定した。
　Ｗｎｔ５ｂ誘導性増殖におけるｐ３８の関与を評価するため、９６ウェルプレートにＭＰＣを播種した１日後に、ｐ３８阻害剤（１０μＭ　ＳＢ２０３５８０，Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）及び組換えＷｎｔ５ｂ（２００ｎｇ／ｍｌ，Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍ）を培地に追加した。その後、ＷＳＴ－８アッセイを上記のように実施した。
免疫蛍光染色
　単離したＴＡ筋を液体窒素で冷却したイソペンタンで凍結し、クライオスタット（Ｌｅｉｃａ　ＣＭ１８６０，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で切片を作製した。凍結切片を０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００で透過処理を行った。その後、切片を３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳでブロッキングし、一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。切片をＰＢＳで洗浄し、二次抗体と室温で１時間インキュベートした後、Ｆｌｕｏｒ－ＫＥＥＰＥＲ（ナカライテスク）を用いて封入した。封入した切片を蛍光顕微鏡（ＢＺ－Ｘ７００、キーエンス、大阪、日本）により観察した。ＴＡ筋におけるＰｅｒｉｌｉｐｉｎ陽性領域の割合やＣＳＡについては、ＩｍａｇｅＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を用いて解析した。
　ホールマウント免疫蛍光染色を行うために、単離したＥＤＬ筋を４％（ｗ／ｖ）ＰＦＡで３０分間固定し、その後０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００で透過処理した。ＰＢＳで洗浄後、ＥＤＬ筋を３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳで１時間ブロッキングし、一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。その後、ＥＤＬ筋をＰＢＳで洗浄し、二次抗体と室温で１時間インキュベートした。染色したＥＤＬ筋をガラスボトムディッシュ（松浪硝子工業、大阪）の上にのせ、レーザー走査型共焦点イメージングシステム（ＬＳＭ７００、Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ、Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観察した。
　培養細胞を４％（ｗ／ｖ）ＰＦＡで１０分間固定し、その後０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００で透過処理した。ＰＢＳで洗浄後、３％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ含有ＰＢＳで１時間ブロッキングし、一次抗体と４℃で一晩インキュベートした。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、二次抗体と室温で１時間インキュベートした。染色した細胞をＦｌｕｏｒ－ＫＥＥＰＥＲ（ナカライテスク社製）で封入した。封入した細胞を、レーザー走査型共焦点イメージングシステム（ＬＳＭ７００，Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ）を用いて観察した。
ウェスタンブロッティング
　細胞を溶解バッファー（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ　ＮａＣｌ，１％（ｖ／ｖ）Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ－４０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ，１０ｍＭ　ＮａＦ，１ｍＭ　Ｎａ３ＶＯ４，１０μｇ／ｍｌ　ａｐｒｏｔｉｎｉｎ，１０μｇ／ｍｌ　ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ，１μＭ　ｐ－ＡＰＭＳＦ）で可溶化させた。タンパク質（１レーンあたり合計１０μｇ）をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分離し、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ－Ｐメンブレン（Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）上に転写した。メンブレンは１％（ｖ／ｗ）ＢＳＡ含有ＴＢＳＴで１時間ブロッキングした後、一次抗体（表１に記載）を用いて４℃で一晩ブロットした。一次抗体で処理した後、メンブレンをＴＢＳＴにより室温で３０分間洗浄し、その後、二次抗体（表１に記載）を用いて室温で１時間ブロットした。最後に、メンブレンを室温で３０分間ＴＢＳＴによって洗浄した。解析時にはＩｍｍｕｎｏＳｔａｒ　ＬＤ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）及びＬＡＳ　１０００（ＧＥ　Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を使用した。相対的なバンド強度は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアによって決定された。
定量的ＲＴ－ＰＣＲ
　Ｓｅｐａｓｏｌ－ＲＮＡ　Ｉ　ＳｕｐｅｒＧ（ナカライテスク）を用いて培養細胞あるいはＴＡ筋からＴｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、これらのＲＮＡからＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ　ＲＴ　Ｒｅａｇｅｎｔ（タカラバイオ、滋賀）を用いてｃＤＮＡを合成した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ　４８０　ＩＩ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、それぞれの目的遺伝子の発現を定量化した。対象ｍＲＮＡの量は、１８ＳリボソームＲＮＡの量に対して正規化した。プライマーペアの配列は、表３に記載されている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
統計解析
　データは、ＢｅｌｌＣｕｒｖｅ　ｆｏｒ　Ｅｘｃｅｌ（株式会社社会調査研究情報、東京）及びＧｒａｐｈＰａｄ　Ｐｒｉｓｍ　９．０（ＧｒａｐｈＰａｄ　Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）を用いて分析された。データは、平均値±標準偏差（Ｓ．Ｄ．）で示した。有意性は、２つのグループを比較した場合はｕｎｐａｉｒｅｄ　ｔｗｏ－ｔａｉｌｅｄ　Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ　ｔｅｓｔ、３つ以上のグループを分析した場合はｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ　ｗｉｔｈ　Ｈｏｌｍ’ｓ　ｔｅｓｔあるいはＤｕｎｎｅｔｔ’ｓ　ｔｅｓｔを用いて、＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１又は＊＊＊Ｐ＜０．００１として決定された。
　マウスのＴＡ筋、腓腹筋、ヒラメ筋、大腿四頭筋、大殿筋を回収し、ＦＡＣＳ　ＡｒｉａＩＩＩを用いてＳＣｓ及びＭＰＣｓを単離し、ＲＮＡ抽出後、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法を用いて発現解析を行った。
　図１に示すとおり、ＭＰＣｓにおいてＲｏｒ２が選択的に発現していることが確認された。
　Ｃｔｘを投与したＴＡ筋から単離したＭＰＣｓを５％ＣＯ２，３％Ｏ２で３日間培養した後、通常酸素濃度下でｓｉＲＮＡ（表２に記載のＲｏｒ２＃１又はＲｏｒ２＃２）を導入した。翌日培地を新しいものに置換した。ｓｉＲＮＡを導入して３日後に細胞を固定し、Ｋｉ６７抗体を用いて染色した。
　Ｃｔｘを投与したＴＡ筋から単離したＭＰＣｓを５％ＣＯ２，３％Ｏ２で３日間培養した後、通常酸素濃度下でｓｉＲＮＡ（表２に記載のＲｏｒ２＃１又はＲｏｒ２＃２）を導入した。翌日培地を新しいものに置換した。ｓｉＲＮＡを導入して３日後にＡｄｉｐｏｇｅｎｉｃ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｍｅｄｉｕｍで３日間培養し、続いてＡｄｉｐｏｇｅｎｉｃ　ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ　ｍｅｄｉｕｍで３日間培養することで脂肪細胞への分化を誘導した。分化誘導後、オイルレッドＯ染色を行った。
　Ｃｔｘを投与したＴＡ筋から単離したＭＰＣｓを５％ＣＯ２，３％Ｏ２で３日間培養した後、通常酸素濃度下でｓｉＲＮＡ（表２に記載のＲｏｒ２＃１又はＲｏｒ２＃２）を導入した。翌日培地を新しいものに置換した。ｓｉＲＮＡを導入して３日後にＳＰｉＤＥＲ－βＧａｌを用いて老化細胞を染色した。
　図２に示すとおり、マウス骨格筋から単離・培養したＭＰＣｓにおいてＲｏｒ２の発現を抑制すると、ＭＰＣｓの増殖能及び脂肪細胞への分化能が低下し、細胞老化が亢進することが確認された。ＭＰＣｓは細胞老化を起こすと増殖能及び脂肪細胞への分化能が低下することが報告されていることから（非特許文献１、２）、Ｒｏｒ２はＭＰＣｓの細胞老化を抑制することで増殖能や脂肪細胞への分化能を制御している可能性が考えられた。
　１２～１６週齢のコントロールマウス及びＲｏｒ２ｃＫＯマウスにＴａｍｏｘｉｆｅｎを投与した後、半年間飼育し、骨格筋重量を比較解析した。このときのＴＡ筋について、凍結切片を作製し、Ｌａｍｉｎｉｎ抗体で染色し、各筋線維の断面積を測定した。
　図３に示すとおり、Ｒｏｒ２ｃＫＯマウスではＴＡ筋、腓腹筋（Ｇａｓｔｒｏｃｎｅｍｉｕｓ　ｍｕｓｃｌｅ）、及びヒラメ筋（Ｓｏｌｅｕｓ）の重量が低下し、ＴＡ筋における筋線維が萎縮することが明らかとなった。このことからＲｏｒ２は骨格筋の維持において重要であると考えられる。
　１２～１６週齢のコントロールマウス及びＲｏｒ２ｃＫＯマウスにＴａｍｏｘｉｆｅｎを投与した後、ＣｔｘあるいはＧｌｙｃｅｒｏｌをＴＡ筋に投与した。投与２週間後にＴＡ筋を回収し、Ｌａｍｉｎｉｎ又はＰｅｒｉｌｉｐｉｎで染色した。ＴＡ筋の各筋線維の断面積を測定した。また、Ｇｌｙｃｅｒｏｌ投与筋の染色画像を用いて、筋組織断面積におけるＰｅｒｉｌｉｐｉｎ陽性面積の割合を計測することで、脂肪蓄積の程度を比較解析した。
　図４に示すとおり、Ｃｔｘ投与２週間後の筋線維の太さがＲｏｒ２ｃＫＯマウスではコントロールマウスに比べて小さく、骨格筋の再生遅延が示されたことから、Ｒｏｒ２は骨格筋再生に重要であると考えられる。
　また、Ｒｏｒ２ｃＫＯマウスではＧｌｙｃｅｒｏｌ投与後の脂肪蓄積が減少していたことから、Ｒｏｒ２はＩＭＡＴ形成においても重要であることが示された。
　Ｃｔｘを投与したＴＡ筋から単離したＭＰＣｓを５％ＣＯ２，３％Ｏ２で３日間培養した後、通常酸素濃度下でｓｉＲＮＡ（表２に記載のＷｎｔ１１＃１又はＷｎｔ１１＃２）を導入した。翌日培地を新しいものに置換した。ｓｉＲＮＡを導入して３日後にＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法にて発現解析を行った。これと並行して、ＳＰｉＤＥＲ－βＧａｌ染色も行い、フローサイトメトリー法にて染色強度を比較解析した。
　図５に示すとおり、ＭＰＣｓにおいてＷｎｔ１１の発現を抑制することにより、ＭＰＣｓの細胞老化が誘導されることが明らかになった。
　Ｃｔｘを投与したＴＡ筋から単離したＭＰＣｓを５％ＣＯ２，３％Ｏ２で３日間培養した後、通常酸素濃度下でｓｉＲＮＡ（表２に記載のＲｏｒ２＃１、Ｒｏｒ２＃２、Ｗｎｔ１１＃１又はＷｎｔ１１＃２）を導入した。翌日培地を新しいものに置換した。ｓｉＲＮＡを導入して２日後にＰｈａｌｌｏｉｄｉｎ及びＤＡＰＩで染色した。
　Ｃｔｘを投与したＴＡ筋から単離したＭＰＣｓを５％ＣＯ２，３％Ｏ２で３日間培養した後、通常酸素濃度下でｓｉＲＮＡ（表２に記載のＲｏｒ２＃１、Ｒｏｒ２＃２、Ｗｎｔ１１＃１又はＷｎｔ１１＃２）を導入した。翌日培地を新しいものに置換した。ｓｉＲＮＡを導入して３日後に固定し、ＬａｍｉｎＢ１及びＤＡＰＩで染色した。
　図６に示すとおり、ＭＰＣｓにおいてＷｎｔ１１又はＲｏｒ２の発現を抑制すると、アクチン・ストレスファイバーの形成が促進されることが観察された。また、核形態の異常がみられることも見出された。
　核形態の異常に伴い、細胞質中にＤＮＡが漏出すると、ｃＧａｓ（ｃｙｃｌｉｃ　ＧＭＰ－ＡＭＰ　ｓｙｎｔｈａｓｅ）を介したシグナル伝達経路（ｃＧＡＳ－Ｓｔｉｎｇ経路）が活性化することが報告されている（非特許文献３）。これらの知見から、Ｗｎｔ１１及びＲｏｒ２はＭＰＣｓにおけるストレスファイバーの形成を抑制することで、核形態異常とそれに伴うｃＧａｓ－Ｓｔｉｎｇ経路の活性化を抑制し、その結果、細胞老化を阻害することにより骨格筋の再生や維持に寄与していると考えられた。
　次に、Ｒｏｒ２がＩＭＡＴの形成に関わる分子機構を明らかにすることを目的として、Ｃｔｘ投与筋、及びＧｌｙｃｅｒｏｌ投与筋における遺伝子発現の比較解析を実施した。８～１２週齢の野生型マウスのＴＡ筋にＣｔｘ又はＧｌｙｃｅｒｏｌを投与し、０（投与無し），３，７日後にＴＡ筋を回収し、Ｒｏｒ２のリガンドとして機能し得るＷｎｔファミリー遺伝子について、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法にて発現解析を行った。
　Ｃｔｘを投与したＴＡ筋から単離したＭＰＣｓを５％ＣＯ２，３％Ｏ２で３日間培養した後、通常酸素濃度下でｓｉＲＮＡ（表２に記載のＲｏｒ２＃１又はＲｏｒ２＃２）を導入した。翌日Ｗｎｔ５ａ又はＷｎｔ５ｂを含む培地に置換した。３日後にＥｄＵあるいはＫｉ６７染色による増殖解析を実施した。
　図７に示すとおり、Ｗｎｔ５ｂがＧｌｙｃｅｒｏｌ投与後に発現上昇することを見出した。このことからＷｎｔ５ｂがＩＭＡＴ形成に寄与する可能性が考えられた。
　さらに、培養ＭＰＣｓにＷｎｔ５ｂを添加することでＭＰＣｓの増殖が促進され、他方Ｒｏｒ２の発現抑制によってＷｎｔ５ｂ添加による増殖促進が抑制された。また、Ｒｏｒ２のリガンドとして最もよく知られているＷｎｔ５ａの添加ではＭＰＣｓの増殖は影響を受けなかった。
　Ｃｔｘを投与したＴＡ筋から単離したＭＰＣｓを５％ＣＯ２，３％Ｏ２で３日間培養した後、通常酸素濃度下でｓｉＲＮＡ（表２に記載のＲｏｒ２＃１又はＲｏｒ２＃２）を導入した。翌日培地を新しいものに置換した。ｓｉＲＮＡを導入して２日後に培地をＯＰＴＩ－ＭＥＭに置換し一晩培養した。その後、Ｗｎｔ５ｂを２００ｎｇ／ｍｌで添加し、１時間後に溶解バッファーにて細胞からタンパク質を抽出し、ウェスタンブロットを実施した。
　Ｃｔｘを投与したＴＡ筋から単離したＭＰＣｓを５％ＣＯ２，３％Ｏ２で３日間培養した後、通常酸素濃度下でｓｉＲＮＡ（表２に記載のＲｏｒ２＃１又はＲｏｒ２＃２）を導入した。翌日Ｗｎｔ５ｂ（２００ｎｇ／ｍｌ）又はＳＢ２０３５８０（１０μＭ）を含む培地に置換した。このとき、培地置換していない細胞をｄａｙ０サンプルとしてＷＳＴ－８アッセイにより解析した。培地置換して３日後にＷＳＴ－８アッセイにより各ウェルにおける細胞数を測定した。
　図８に示すとおり、培養ＭＰＣｓを用いた解析から、Ｗｎｔ５ｂはＲｏｒ２依存的にｐ３８をリン酸化（活性化を反映）することを見出した。また、ｐ３８阻害剤であるＳＢ２０３５８０で処理すると、Ｗｎｔ５ｂ刺激依存的なＭＰＣｓの増殖促進が抑制された。以上から、Ｗｎｔ５ｂ、Ｒｏｒ２、及びｐ３８がＭＰＣｓの増殖を促進することが明らかとなった。
　骨格筋でＩＭＡＴや線維化などが生じる際には、ＭＰＣｓが過剰に骨格筋内に蓄積し脂肪細胞や線維芽細胞に分化することが示唆されている（非特許文献４、５）。上記の我々の解析結果から、Ｗｎｔ５ｂ、Ｒｏｒ２、及びｐ３８はＭＰＣｓの増殖を促進することにより骨格筋組織中におけるＭＰＣｓの過剰な蓄積を誘導し、ＩＭＡＴの形成に寄与している可能性が考えられる。
　Ｃｔｘ又はＧｌｙｃｅｒｏｌを投与し３日後のＥＤＬ筋をホールマウント染色した。
　図９に示すとおり、シュワン細胞（Ｓ１００β陽性細胞）においてＷｎｔ５ｂが発現しており、Ｗｎｔ５ｂ陽性シュワン細胞はＧｌｙｃｅｒｏｌ投与時に増殖が亢進することを見出した。このことからＷｎｔ５ｂの産生細胞の一つがシュワン細胞である可能性が示された。
　８～１２週齢の雄マウスのＴＡ筋にＣｔｘ又はＧｌｙｃｅｒｏｌを投与し３日後のＴＡ筋を回収し、ＦＡＣＳ　ＡｒｉａＩＩＩを用いてＳＣｓ、ＭＰＣｓ、ＣＤ３１陽性・ＣＤ４５陽性細胞（造血系細胞と内皮細胞の混合集団）、それ以外の細胞集団をそれぞれ単離し、ＲＮＡ抽出後、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法を用いて発現解析を行った。
　図１０に示すとおり、ＴＡ筋ではＳＣｓ及びＭＰＣｓにおいてＷｎｔ５ｂが発現していることを見出した。このことからＴＡ筋におけるＷｎｔ５ｂの産生細胞はＳＣｓ及びＭＰＣｓであることが示された。
　Ｃｔｘを投与したＴＡ筋から単離したＭＰＣｓを５％ＣＯ２，３％Ｏ２で３日間培養した後、通常酸素濃度下でｓｉＲＮＡ（表２に示すＷｎｔ５ｂ＃１又はＷｎｔ５ｂ＃２）を導入した。翌日培地を新しいものに置換した。ｓｉＲＮＡを導入して３日後にＲＮＡを抽出し、定量的ＲＴ－ＰＣＲ法にて発現解析を行った。
　Ｃｔｘを投与したＴＡ筋から単離したＭＰＣｓを５％ＣＯ２，３％Ｏ２で３日間培養した後、通常酸素濃度下でｓｉＲＮＡ（表２に示すＷｎｔ５ｂ＃１又はＷｎｔ５ｂ＃２）を導入した。翌日培地を新しいものに置換した。このとき、培地置換していない細胞をｄａｙ０サンプルとしてＷＳＴ－８アッセイにより解析した。培地置換して４日後にＷＳＴ－８アッセイにより各ウェルにおける細胞数を測定した。
　Ｃｔｘを投与したＴＡ筋から単離したＭＰＣｓを５％ＣＯ２，３％Ｏ２で３日間培養した後、通常酸素濃度下でｓｉＲＮＡ（表２に示すＷｎｔ５ｂ＃１又はＷｎｔ５ｂ＃２）を導入した。翌日培地を新しいものに置換した。３日後にＥｄＵによる増殖解析を実施した。
　図１１に示すとおり、ｓｉＲＮＡによりＷｎｔ５ｂの発現が抑制されることが明らかになった。また、培養ＭＰＣｓを用いた解析から、ｓｉＲＮＡによるＷｎｔ５ｂの発現抑制により、ＭＰＣｓの増殖能が阻害されることが明らかになった。
　以上の結果から、生理的状態ではＭＰＣｓにおいてＷｎｔ１１及びＲｏｒ２がＭＰＣｓの細胞老化を抑制し骨格筋の維持や再生に寄与するが、病的状態ではＷｎｔ１１に加えてＷｎｔ５ｂもＲｏｒ２のリガンドとして機能することによってＭＰＣｓの過剰な増殖が促進され、ＩＭＡＴ形成が促進される可能性が考えられた。
　ＩＭＡＴの蓄積がみられる筋疾患及び／又は症状として、筋ジストロフィー（デュシェンヌ型筋ジストロフィー等）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）をはじめとする筋委縮症等の各種骨格筋疾患、サルコペニア、フレイル、ロコモティブ症候群等の骨格筋における加齢等に伴う各種症状等が例示される。本開示は、このようなＩＭＡＴの蓄積がみられる筋ジストロフィーや加齢に伴って見られるサルコペニアなどをはじめとする骨格筋疾患・病態に対して有効かつ副作用の少ない新規治療方法の開発に活用できる。

Claims (9)

  1. （Ｉ）Ｗｎｔ５ｂタンパク質、Ｒｏｒ２タンパク質、及び被験物質を接触させる工程、並びに
    （ＩＩ）前記被験物質がＷｎｔ５ｂタンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害することを確認する工程を含む、
    ＩＭＡＴ形成抑制物質をスクリーニングする方法。
  2. 工程（Ｉ）において、さらにＷｎｔ１１タンパク質を接触させ、
    工程（ＩＩ）において、さらに前記被験物質がＷｎｔ１１タンパク質とＲｏｒ２タンパク質との結合を阻害しないことを確認する、請求項１に記載の方法。
  3. （１）ＳＣｓ、ＭＰＣｓ、及びシュワン細胞からなる群より選択される少なくとも１種と、被験物質とを接触させる工程、
    並びに
    （２）前記被験物質がＷｎｔ５ｂの発現量を抑制することを確認する工程を含む、
    ＩＭＡＴ形成抑制物質をスクリーニングする方法。
  4. 前記工程（２）において、前記被験物質がＷｎｔ１１の発現量を抑制しないことを確認する、請求項３に記載の方法。
  5. （Ａ）Ｗｎｔ５ｂタンパク質、Ｒｏｒ２タンパク質、ｐ３８タンパク質、及び被験物質を接触させる工程、並びに
    （Ｂ）前記被験物質がｐ３８タンパク質のリン酸化を阻害することを確認する工程を含む、
    ＩＭＡＴ形成抑制物質をスクリーニングする方法。
  6. ＩＭＡＴ形成抑制が、ＭＰＣｓの増殖抑制によるものである、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. Ｗｎｔ５ｂタンパク質の中和抗体、又はＷｎｔ５ｂ遺伝子の発現を抑制する核酸を有効成分とする、ＩＭＡＴ形成抑制用組成物。
  8. ＩＭＡＴの蓄積が認められる筋疾患又は症状の抑制又は治療に使用するための、請求項７に記載のＩＭＡＴ形成抑制用組成物。
  9. 前記ＩＭＡＴの蓄積が認められる筋疾患又は症状が、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症、サルコペニア、フレイル又はロコモティブ症候群である、請求項８に記載のＩＭＡＴ形成抑制用組成物。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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KAMIZAKI KOKI, ENDO MITSUHARU, MINAMI YASUHIRO, KOBAYASHI YASUHIRO: "Role of noncanonical Wnt ligands and Ror‐family receptor tyrosine kinases in the development, regeneration, and diseases of the musculoskeletal system", DEVELOPMENTAL DYNAMICS, WILEY-LISS INC NEW YORK , NY, US, vol. 250, no. 1, 1 January 2021 (2021-01-01), US , pages 27 - 38, XP093252747, ISSN: 1058-8388, DOI: 10.1002/dvdy.151 *
TAKAKI KAMISAKI : "YIA-01: Regulation of mesenchymal progenitor cell function by Wnt-Ror2 signaling", PROGRAMS AND ABSTRACTS OF JOINT ACADEMIC CONFERENCE OF THE 9TH ANNUAL MEETING OF JAPAN MUSCLE SOCIETY AND THE 10TH MEDICAL RESEARCH GROUP OF MUSCULAR DYSTROPHY, FRIDAY, AUGUST 18TH TO SATURDAY, AUGUST 19TH, 2023, JAPAN MUSCLE SOCIETY, JP, 18 August 2023 (2023-08-18) - 19 August 2023 (2023-08-19), JP, pages 51, XP009559607 *
TAKAKI KAMIZAKI ET AL.: "The function control mechanism of skeletal muscle mesenchymal progenitor cells by Ror2", PROGRAMS AND ABSTRACTS OF THE 7TH ANNUAL MEETING OF JAPAN MUSCLE SOCIETY, JAPAN MUSCLE SOCIETY, JP, vol. 8, 5 August 2022 (2022-08-05) - 2022-08-06, JP, pages 86, XP009559608, ISSN: 2433-975X *

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