WO2024248014A1

WO2024248014A1 - 種子の選別方法

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Publication number: WO2024248014A1
Application number: PCT/JP2024/019621
Authority: WO
Inventors: 修松田
Original assignee: Kyushu University NUC
Current assignee: Kyushu University NUC
Priority date: 2023-05-30
Filing date: 2024-05-29
Publication date: 2024-12-05
Anticipated expiration: 2025-11-30
Also published as: JPWO2024248014A1; CN121219571A

Abstract

本発明は、所望の形質を有する植物種子の選別方法であって、以下の第１工程～第７工程を含む、方法を提供する：（第１工程）種子集団から一部の種子を取り出す工程、（第２工程）取り出された種子に対するデータセットを構築する工程であって、該データセットを構築する工程は以下（ａ）～（ｃ）を含み：　（ａ）取り出された種子に対して光を照射してスペクトルデータおよび／またはその派生スペクトルデータを取得すること、　（ｂ）スペクトルデータを取得した種子を所望の形質に対する品質検査に供し、該取り出された種子の事前良品率を決定すること、　ここで、事前良品率は次式で定義される：　［事前良品率（％）］＝［品質評価に供された種子のうち、所望の形質を有していた種子数］／［品質評価に供された種子数］×１００　（ｃ）各種子のスペクトルデータと品質検査の結果とを対応させること、（第３工程）第２工程で構築されたデータセットに対して多変量判別分析を適用することにより、各種子における所望の形質に対する判別スコアを算出するための良否判別モデルの候補を導出する工程、（第４工程）回収率および適合率を次式で定義し：［回収率（％）］＝［品質評価に供された種子のうち、判別スコアに基づいて選択される種子数］／［品質評価に供された種子数］×１００［適合率（％）］＝［品質評価に供された種子であって、判別スコアに基づいて選択される種子のうち、所望の形質を有している種子数］／［品質評価に供された種子のうち、判別スコアに基づいて選択される種子数］×１００かつ、事前良品率と回収率を同値とする選別条件を「標準選別条件」と定義するとき、　該標準選別条件下で、適合率が事前良品率を上回るとの基準を満たす候補を良否判別モデルとして選択することを含む、第３工程で導出された良否判別モデルの候補から判別モデルを選択する工程、（第５工程）第１工程で種子集団から取り出されなかった残りの種子、および／または該種子と実質的に同一の条件下で得られた別の種子に対して光を照射してスペクトルデータを取得し、該スペクトルデータに第４工程で選択された判別モデルを適用することで各種子の判別スコアを決定する工程、（第６工程）第５工程で決定された判別スコアに基づいて、判別スコアの閾値を決定する工程、（第７工程）第５工程で決定された各種子の判別スコアと第６工程で決定された判別スコアの閾値とを比較することで、所望の形質を有すると予測される種子を回収する工程。

Description

種子の選別方法

　本発明は、種子の選別方法に関し、詳細には、種子のスペクトルデータを多変量統計分析で解析することによる、所望の形質を有する植物種子の選別方法に関する。

　世界人口は増加を続け、２０２２年には８０億人、２０３０年には８５億人、２０５０年には９７億人に達すると予測されている。従って、人類社会を存続させていくためには、食料の安定的生産および供給の重要性がますます高まっている。かかる問題を解決するには、多収品種を開発し、世界中に普及させることが有効な手段の一つと考えられている。しかし、どのような品種で作物を生産するにしても、良質な苗がなければその品種の優れた形質は発揮され得ない。古来日本には「苗半作（なえはんさく）」との言葉があり、この言葉は「成長の半分は苗で決まる」との意味を有する。さらに踏み込めば、良質な種子なしには、良質な苗を作ることはできない。したがって、高品質の種子をどのように生産し調製するか、その品質を劣化させずにどのように保存するか、そしてその品質の現状をどのように評価するかは、人類が協力して取り組むべき緊急の技術的課題である。

　種子の品質管理の重要性は、国内外の公的機関によって強く認識されている。国際種子検査協会（ＩＳＴＡ）は、主要な作物種のほぼすべての種子についての品質検査方法に関するガイドラインを提供している。また、日本政府は、市場に流通する農作物生産用の種子の品質基準を定めた法律「種苗法」を施行している。このような公的監視が行われる理由の１つは、種子の品質（とりわけ発芽性や遺伝的純度）は、通常、種子の外観やその他の簡易な基準によっては識別することが非常に難しいことにある。低品質の種子が誤って拡散してしまうと、地域的な食糧不足につながるのみならず、農家の貧困にもつながる可能性がある。

　公的な品質管理は確かに種子がもたらす作物の不作を防ぐのに役立つものであるが、何事にも必ず２つの側面が存在する。例えば、公的な品質管理の観点から種子が満たさなければならない良品率が９０％と設定されている場合、当該９０％から僅か１％低い良品率（即ち、８９％の良品率）を有する種子ロットは、その商品価値を失ってしまう。なお、実状としては、種子供給業者らによる熾烈な品質競争により、そのような法的基準でさえも無関係或いは競争力のないものとなっている。その結果として、作物生産に貢献する可能性があるにもかかわらず、商業的価値がない種子が大量に生み出され続けており、この状況は無慈悲な「シードロス」と称し得る。

　主要な作物種であっても、種子の良品率は、収穫後の選別されていない状態では通常９０％には及ばない。不良種子の発生は母植物での種子の成熟不全が一因であるが、収穫後の種子の調製プロセス中の損傷、劣化、または汚染などもまたその一因となり得る。多段階の選別を経て初めて法定基準内の高い良品率を達成することができるが、かかる選別において使用される大規模な装置としては、スパイラル比重選別機、トロンメル回転式選別機、振動選別機、磁力選別機、重量選別機、色彩選別機などが挙げられる。しかし、選別後の最終的な良品率が目標を下回ってしまった場合、播種、栽培、収穫および選別を経てようやく調製された種子はただのゴミの山と化す。現状、この段階から「最後の１パーセント」であっても良品率を改善させる方法は存在しない。

　上述される種子の選別装置は、種子の品質が、その外表面または外部から検出可能な特徴に反映されるとの前提に基づくものである。種子の外表面または外部から検出可能な特徴としては、形状、表面の質感や粘着性、比重および色などが含まれる。上述の装置は大量選別に適しており、収穫された種子のほとんどを高品質の状態に調製し得る。対照的に、これらの装置は動作条件の微調整が難しいとの欠点もある。さらに、種子の生化学的特性に着目すると、外部から隠れた胚や胚乳の変化は、露出した種皮における変化よりも、種子の機能に遥かに大きな影響を及ぼし得る。たとえば、胚乳脂質の酸化や特定の害虫による胚の摂食は、種子の外観や重量に直ちに変化を引き起こすわけではないが、発芽能を大きく毀損させる。「シードロス」は、このような不良種子によってもたらされるものと推定される。

　近赤外（ＮＩＲ）分光法は、主に有機化合物で構成される物質の化学組成の違いや変化を非破壊的に評価する有効な手法である。換言すれば、ＮＩＲ分光法は、食品、医薬品、農産物との親和性が高く、それらの品質管理への応用が広がりつつある。主にリモートセンシングの分野において発展してきたイメージング分光法も、不等質であることを特徴とするこれらの商品に関する品質管理において注目を集める技術である。これらの新技術が融合した近赤外イメージング分光法は「シードロス」をなくす鍵を提供すると大いに期待される。

　実際、生存、成長力、遺伝的純度、虫害や菌害の有無などの観点から種子の品質を評価する際に、ＮＩＲイメージング分光法を応用した事例も報告されている（非特許文献１～４）。しかし、未だに「シードロス」が続いているということは、この技術がまだ実用レベルに達していない、あるいは社会実装が十分に進んでいないことを如実に物語っているように思われる。

Rahman A. et al., Assessment of seed quality using non-destructive measurement techniques: A Review., Seed Science Research, Volume 26, Issue 4, December 2016, pp.285-305. Feng L. et al., Hyperspectral imaging for seed quality and safety inspection: A Review, Plant Methods, 15, Article number: 91 (2019) Venkatesan S. et al., Role of near-infrared spectroscopy in seed quality evaluation: A review. Agric Rev. 2020;41. Long W. et al., A Review of Artificial Intelligence Methods for Seed Quality Inspection based on Spectral Imaging and Analysis., J. Phys.: Conf. Ser., 1769, 012013.

　上述の先行技術文献において報告されている手法は、いずれも一定の条件下において非破壊的な種子の選別を可能とするものであり有用性を有するものである。しかしながら、かかる先行技術はいずれも特定の植物種子の、特定の形質への適用に制限されていることから、より多くの品種および形質に対応できる汎用性の高い新たな種子選別手法の構築には依然として強いニーズがある。

　本発明者は、上記課題に対して鋭意検討した結果、光学的分析手法等を用いて構築した各植物種子に対するデータセットを多変量判別分析に適用して種子の判別モデル候補を多数生成させ、当該モデル候補から予測精度の高い判別モデルを選択する際に、「標準選別条件」との概念を導入することで予測精度の高いモデルの選択が可能となること等を見出し、かかる知見に基づいてさらに研究を進めることによって本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の通りである。

［１］
　所望の形質を有する植物種子の選別方法であって、以下の第１工程～第７工程を含む、方法：
（第１工程）種子集団から一部の種子を取り出す工程、
（第２工程）取り出された種子に対するデータセットを構築する工程であって、該データセットを構築する工程は以下（ａ）～（ｃ）を含み：
　（ａ）取り出された種子に対して光を照射してスペクトルデータおよび／またはその派生スペクトルデータを取得すること、
　（ｂ）スペクトルデータを取得した種子を所望の形質に対する品質検査に供し、該取り出された種子の事前良品率を決定すること、
　ここで、事前良品率は次式で定義される：
　［事前良品率（％）］＝［品質評価に供された種子のうち、所望の形質を有していた種子数］／［品質評価に供された種子数］×１００
　（ｃ）各種子のスペクトルデータと品質検査の結果とを対応させること、
（第３工程）第２工程で構築されたデータセットに対して多変量判別分析を適用することにより、各種子における所望の形質に対する判別スコアを算出するための良否判別モデルの候補を導出する工程、
（第４工程）回収率および適合率を次式で定義し：
［回収率（％）］＝［品質評価に供された種子のうち、判別スコアに基づいて選択される種子数］／［品質評価に供された種子数］×１００
［適合率（％）］＝［品質評価に供された種子であって、判別スコアに基づいて選択される種子のうち、所望の形質を有している種子数］／［品質評価に供された種子のうち、判別スコアに基づいて選択される種子数］×１００
かつ、事前良品率と回収率を同値とする選別条件を「標準選別条件」と定義するとき、
　該標準選別条件下で、適合率が事前良品率を上回るとの基準を満たす候補を良否判別モデルとして選択することを含む、第３工程で導出された良否判別モデルの候補から判別モデルを選択する工程、
（第５工程）第１工程で種子集団から取り出されなかった残りの種子、および／または該種子と実質的に同一の条件下で得られた別の種子に対して光を照射してスペクトルデータを取得し、該スペクトルデータに第４工程で選択された判別モデルを適用することで各種子の判別スコアを決定する工程、
（第６工程）第５工程で決定された判別スコアに基づいて、判別スコアの閾値を決定する工程、
（第７工程）第５工程で決定された各種子の判別スコアと第６工程で決定された判別スコアの閾値とを比較することで、所望の形質を有すると予測される種子を回収する工程。
［２］
　２以上の所望の形質を有する植物種子の選別方法である、［１］記載の選別方法。
［３］
　形質が、発芽能、発芽勢、遺伝子型、ストレス耐性、休眠性、病害抵抗性、虫害抵抗性、ＱＴＬ特性、食味性、出穂期、および形態学的な特徴からなる群から選択される形質の少なくとも１つである、［１］または［２］記載の選別方法。
［４］
　２以上の所望の形質の予測が、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの方法によって行われることを特徴とする、［１］～［３］のいずれか記載の選別方法：
（ｉ）形質ごとの良否に着目して形質ごとの判別モデルにより個別に種子をスコア化し、すべてのスコアが閾値以上のものを良種子と予測する方法、
（ｉｉ）形質ごとの良否は顧みず、所望の形質のすべてが良好である場合を良好とし、それ以外の場合は不良とすることで単一の判別モデルを選択し、当該単一の判別モデルにより種子をスコア化し、スコアが閾値以上のものを良種子と予測する方法、
（ｉｉｉ）形質ごとの良否に着目して形質ごとの判別モデルを選択した後に、当該形質ごとの判別モデルを用いて得られたスコアを統合して統合スコアとし、該統合スコアの順位に基づき、各種子の良否を予測する方法。
［５］
　判別モデルの精度を評価する工程をさらに含む、［１］～［４］のいずれか記載の選別方法。
［６］
　植物が園芸作物である、［１］～［５］のいずれか記載の選別方法。

　本発明によれば、所望の形質を有する植物種子と、所望の形質を有さない植物種子の集団から、非破壊的、高効率、且つ高精度に所望の形質を有する植物種子を選別することができる。

品質区分別の野菜種子の外観を示す図である。枠下の数値は、表２の判別モデルにより算出した各種子のスコアを表す。品質区分別の野菜種子の近赤外反射スペクトルを示す図である。Ａ～Ｉでは区分ごとの平均反射スペクトル、Ｊでは個別種子の反射スペクトルを示す。良否判別モデルの導出手順を示すフロー図である。良否判別モデルの導出手順を示す概略図である。判別スコアの分布域と判別精度の関係を示す図である。Ａは高精度、Ｂは低精度な判別モデルを使用した仮想的な状況を示す。事前良品率は８０％とする。黒及び灰色の三角印は、それぞれ事前良品率及び標準閾値（表３脚注２参照）を示す。略号：ｅＣＤＦ（empirical Cumulative Distribution Function）、経験的累積分布関数。（ａ）全種子における判別スコアの密度分布と横軸スコアを上回る種子比率のｅＣＤＦ。（ｂ）良否別種子における判別スコアの密度分布。（ｃ）良否別種子における判別スコアの分布域（箱ひげ図及び散布図）。（ｄ）スコア下限閾の設定値と判別精度の関係。（ｅ）種子回収率と判別精度の関係。良否判別モデルにおける選択波長と変数重要度を示す図である。略号：ＳＰＲＣ（Standardized Partial Regression Coefficient）、標準偏回帰係数；ＶＩＰ（Variable Importance in Projection）、射影における変数重要度。カリフラワー種子の良否判別におけるスコア下限閾と精度指標の関係を示す図である。Ａ．内的妥当性検証、Ｂ．外的妥当性検証。発芽形質、交配形質をそれぞれモデルｍ－Ｃａ４７ｇ、ｍ－Ｃａ４７ｘにより逐次的に予測する際、両モデルの判別スコアに対する下限閾の設定値と、良種子（正常発芽能を持つＦ１雑種）の判別における精度指標との関係を示す。灰色の三角印は標準閾値（表３脚注２参照）を示す。良否判別モデルの内的妥当性検証を示す図である。Ａ．カボチャ品種５、Ｂ．エンドウ品種１９、Ｃ．レタス品種８０３、Ｄ．ネギ品種２２、Ｅ．トマト品種９４、Ｇ．ネギ品種５１、Ｈ．トマト品種２２１、Ｆ・Ｉ～Ｋ．カリフラワー品種４７。Ｆは発芽形質のみ、Ｉは交配形質のみの判別の結果と精度を示す。Ｊは良種子（正常発芽能を持つＦ１雑種）かそれ以外かの判別の結果と精度を示す。ＫはＦ及びＩで使用した２つの判別モデルに基づく両形質の予測を反映した、統合スコアによる良否判別の結果と精度を示す。記号、略号及び（ａ）～（ｅ）のグラフの概要は、図５における説明と共通する。良否判別モデルの外的妥当性検証を示す図である。Ａ．カボチャ品種５、Ｂ．エンドウ品種１９、Ｃ．レタス品種８０３、Ｄ．ネギ品種２２、Ｅ．トマト品種９４、Ｆ～Ｉ．カリフラワー品種４７。Ａ～Ｆは図８Ａ～Ｆ、Ｇ～Ｉは図８Ｉ～Ｋと対応する。記号、略号及び（ａ）～（ｅ）のグラフの概要は図５における説明と共通する。カリフラワー種子の良否判別におけるＰＲ／ｒＰＲ曲線を示す図である。Ａ．ＰＲ曲線、Ｂ．ｒＰＲ曲線。発芽形質、交配形質をそれぞれモデルｍ－Ｃａ４７ｇ、ｍ－Ｃａ４７ｘにより逐次的に判別する際、各形質の判別における再現率と、良種子（正常発芽能を持つＦ１雑種）の判別における適合率（Ａ）及び相対適合率（Ｂ）との関係を示す。適合率及び相対適合率は曲面、全体的な判別精度は、その曲面下体積として表れるが、図１１及び図１２の表現に合わせ、これらも「曲線」及び「ＡＵＣ（曲線下面積）」と称する。略号：（ｒ）ＰＲ（(relative) Precision-Recall）、（相対）適合率と再現率の関係；ＡＵＣ（Area Under Curve）。良否判別モデルとデータセットの各組み合わせにおけるＰＲ曲線を示す図である。略号：ＰＲ（Precision-Recall）、適合率と再現率の関係。良否判別モデルとデータセットの各組み合わせにおけるｒＰＲ曲線を示す図である。相対適合率（Relative Precision）を次式により定義する。[相対適合率]＝（適合率－初期適合率）／（１－初期適合率）。尚、本明細書において「適合率」は「事後良品率」と、「初期適合率」は「事前良品率」とそれぞれ同義である。再現率と相対適合率の関係を「ｒＰＲ曲線」、その曲線下面積を「ｒＰＲ－ＡＵＣ」と称することとする。良否判別スコアの画像表示を示す図である。Ａ．カボチャ品種５、Ｂ．エンドウ品種１９。良否判別スコアにより区分した種子の発芽及び初期成長特性を示す図である。Ａ・Ｂ．エンドウ品種１９、Ｃ．レタス品種８０３、Ｄ．ネギ品種２２、Ｅ．カリフラワー品種４７。ＢはＡの緑葉に対応する画素のみを抽出した画像である。Ａ～Ｄ及びＥの上段に示す順位は発芽形質、Ｅの下段に示す順位は交配形質の判別モデルによる予測順位である。

　以下、本発明について具体的に説明する。

　本発明は、所望の形質を有する植物種子の選別方法であって、以下の第１工程～第７工程を含む、方法（以下、「本発明の方法」と称することがある）を提供する：
（第１工程）種子集団から一部の種子を取り出す工程、
（第２工程）取り出された種子に対するデータセットを構築する工程であって、該データセットを構築する工程は以下（ａ）～（ｃ）を含み：
　（ａ）取り出された種子に対して光を照射してスペクトルデータおよび／またはその派生スペクトルデータを取得すること、
　（ｂ）スペクトルデータを取得した種子を所望の形質に対する品質検査に供し、該取り出された種子の事前良品率を決定すること、
　ここで、事前良品率は次式で定義される：
　［事前良品率（％）］＝［品質評価に供された種子のうち、所望の形質を有していた種子数］／［品質評価に供された種子数］×１００
　（ｃ）各種子のスペクトルデータと品質検査の結果とを対応させること、
（第３工程）第２工程で構築されたデータセットに対して多変量判別分析を適用することにより、各種子における所望の形質に対する判別スコアを算出するための良否判別モデルの候補を導出する工程、
（第４工程）回収率および適合率を次式で定義し：
［回収率（％）］＝［品質評価に供された種子のうち、判別スコアに基づいて選択される種子数］／［品質評価に供された種子数］×１００
［適合率（％）］＝［品質評価に供された種子であって、判別スコアに基づいて選択される種子のうち、所望の形質を有している種子数］／［品質評価に供された種子のうち、判別スコアに基づいて選択される種子数］×１００
かつ、事前良品率と回収率を同値とする選別条件を「標準選別条件」と定義するとき、
　該標準選別条件下で、適合率が事前良品率を上回るとの基準を満たす候補を良否判別モデルとして選択することを含む、第３工程で導出された良否判別モデルの候補から判別モデルを選択する工程、
（第５工程）第１工程で種子集団から取り出されなかった残りの種子、および／または該種子と実質的に同一の条件下で得られた別の種子に対して光を照射してスペクトルデータを取得し、該スペクトルデータに第４工程で選択された判別モデルを適用することで各種子の判別スコアを決定する工程、
（第６工程）第５工程で決定された判別スコアに基づいて、判別スコアの閾値を決定する工程、
（第７工程）第５工程で決定された各種子の判別スコアと第６工程で決定された判別スコアの閾値とを比較することで、所望の形質を有すると予測される種子を回収する工程。

　本発明の方法において、「植物種子」とは、あらゆる植物の種子が意図され、特に限定されない。植物としては、種子植物であれば特に限定されず、例えば、被子植物及び裸子植物のいずれであってもよい。また、植物が被子植物である場合、植物は双子葉類及び単子葉類のいずれであってもよい。また、植物が双子葉類であるとき、植物は、合弁花類及び離弁花類のいずれであってもよい。一態様において、本発明の方法は、高付加価値を有する植物の種子の選別に用いられ得る。かかる高付加価値を有する植物としては、例えば、園芸作物や、建築用木材として用いられ得る植物が挙げられるが、これらに限定されない。園芸作物には、野菜、果樹および花卉が含まれる。尚、野菜としては、例えば、カボチャ、エンドウ、レタス、ネギ、トマト、カリフラワー、ニガウリ、オクラ、タマネギ、ミョウガ、大豆、フキ、アスパラ、ニラ、ソラマメ、セロリ、ニンジン、水菜、小松菜、春菊、大根、ブロッコリー、ホウレンソウ、ハクサイ、ルッコラ、レンコン、かぶ、アボカド、キュウリ、パプリカ、ニンニク、トウモロコシ、ズッキーニ、パセリ、パクチー、ナス、およびピーマン等が挙げられるがこれらに限定されない。また、果樹としては、ウメ、イチジク、アケビ、アセロラ、アボカド、オリーブ、オレンジ、カキ、カリン、グアバ、クランベリー、クルミ、グレープフルーツ、サクランボ、およびザクロ等が挙げられるがこれらに限定されない。また、花卉としては、アサガオ、ケイトウ、コスモス、ジニア、セイヨウオダマキ、センニチコウ、ペチュニア、ニチニチソウ、ハボタン、ヒマワリ、ホウセンカ、マツバボタン、ハナスベリヒユ、フウセンカズラ、マリーゴールド、カスミソウ、キンギョソウ、キンセンカ、スイートピー、ストック、ダイアンサス、デージー、ニゲラ、ネメシア、ネモフィラ、ハナビシソウ、バーベナ、パンジー、ビオラ、ヒナゲシ、ヤグルマギク、ルピナス、およびワスレナグサ等が挙げられるがこれらに限定されない。また、建築用木材として用いられ得る植物としては、スギ、ヒノキ、ヒバ、クリ、ケヤキ、サクラ、ブナ、ウォルナット、ファルカタ、およびアカマツ等が挙げられるがこれらに限定されない。

　本発明の方法において、「所望の形質」とは、種子そのものが有する形質および種子を生育させた際に当該種子から発芽した植物が発現する形質の両方を包含する概念とする。本発明の方法において選別の対象となる「形質」としては、例えば、発芽能、発芽勢、遺伝子型、ストレス耐性、休眠性、病害抵抗性、虫害抵抗性、ＱＴＬ特性、食味性、出穂期、および、葉の大きさなどの形態学的な特徴等が挙げられるがこれらに限定されない。

（第１工程）
　本発明の第１工程においては、種子集団から一部の種子を取り出すことを特徴とする。種子集団を構成する種子数は２以上であればよく、特に上限はない。例えば、種子集団は、通常、２粒～１０,０００,０００粒、好ましくは１，０００粒～１０,０００,０００粒、より好ましくは１０，０００粒～１０,０００,０００粒の種子からなる種子集団であってよいがこれらに限定されない。或いは、種子集団は、重量で示されるものであってもよい。例えば、種子集団は、１ｇ～１０，０００ｋｇ、好ましくは１ｋｇ～１０，０００ｋｇ、より好ましくは１０ｋｇ～１０，０００ｋｇの重量の種子集団であってよいがこれらに限定されない。

　また、種子集団の「一部」としては、選別の対象となる「形質」によって異なり得るが、通常、５０粒～５０,０００粒、好ましくは１００～３０,０００粒、より好ましくは２００粒～３,０００粒程度であるが、これらに限定されない。

（第２工程）
　本発明の第２工程は、取り出された種子に対するデータセットを構築する工程である。なお、データセットの構築は、少なくとも以下の（ａ）～（ｃ）を含む。

　（ａ）取り出された種子に対して光を照射してスペクトルデータおよび／またはその派生スペクトルデータを取得すること。
　（ｂ）スペクトルデータを取得した種子を所望の形質に対する品質検査に供し、該取り出された種子の事前良品率を決定すること。尚、（ｂ）における事前良品率は次式で定義される：
　［事前良品率（％）］＝［品質評価に供された種子のうち、所望の形質を有していた種子数］／［品質評価に供された種子数］×１００
　（ｃ）各種子のスペクトルデータと品質検査の結果とを対応させること。

　尚、本明細書において、「事前良品率」を「初期適合率」と表記することがある。

　データセットの構築の（ａ）における、種子に対して光を照射してスペクトルデータ（反射、吸収、および／または透過スペクトルデータ）および／またはその派生スペクトルデータを取得する方法は、光学的分析の技術分野において一般的に用いられる自体公知の方法を用いることができる。また、種子に照射する光は、スペクトルデータを得られるものであれば特に限定されない。種子に照射する光としては、例えば、マイクロ波、テラヘルツ波、赤外光、可視光、紫外光、Ｘ線、およびγ線であり得るが、これらに限定されない。本発明の好ましい一態様において、光は可視光または赤外光であり得る。尚、スペクトルデータの取得は、例えば、本願の実施例で用いた方法や条件のほか、特許第６７８２４０８号等で教示される方法を例示することができるがこれらに限定されない。

　また、得られたスペクトルデータの派生スペクトルデータを生成する方法も光学的分析の技術分野における自体公知の方法を用いればよい。例えば、得られたスペクトルデータ（Ｒ）に対して、逆数（１／Ｒ）変換、対数変換、標準正規化、ＳＧ（Savizky-Golay）フィルタによる平滑化および平滑化微分、又はこれらを任意に組み合わせた変換を行うことで、派生スペクトルデータを生成することができる。尚、スペクトルデータおよび派生スペクトルデータは、そのいずれか１つのみを用いてもよいし、２つ以上を用いてもよい。好ましい一態様において、用いられるスペクトルデータはスペクトルデータおよびそれより生成した派生スペクトルデータのうち、最も精度の高い予測モデルを導き得る１つのスペクトルデータであり得る。

　尚、スペクトルデータを取得するための機器についても、自体公知の機器を用いればよい。例えば、生体組織の分光特性は、光ファイバー式の分光器による点計測が可能なほか、リモートセンサの一種であるハイパースペクトルカメラを用いることにより、座標情報（画像）と併せて計測（測定）することができる（面計測）。計測に際しては、対象とする波長域において高い検出感度を示す機器を適宜選択すればよい。本発明の方法においては、例えば、ＣＣＤ、ＣＭＯＳ、ＣＱＤ、ＩｎＧａＡｓ、ＨｇＣｄＴｅ（ＭＣＴ）、ＴｙｐｅＩＩ超格子（Ｔ２ＳＬ）等の光検出器を備えた機器を用いることができるが、これらに限定されない。また、スペクトルデータを取得する際に、必要に応じて、反射率補正画像を生成し、種子認識モデルを適用することもできる（図３のＳＴ１～３を参照）。

　データセットの構築の（ｂ）における品質検査もまた、所望の形質に対する事前良品率が決定できる限り、特に限定されない。例えば、所望の形質が「発芽能」である場合、スペクトルデータを取得した種子を、例えばＩＳＴＡが定める国際種子検査規定に準拠した発芽試験やこれに準ずる発芽試験に供することで容易に確認することができる。そして、発芽試験に供した種子数をＡ（個）、実際に発芽した種子数をＢ（個）としたとき、［事前良品率（％）（即ち、発芽率）］は、［品質評価に供された種子のうち、発芽した種子数（Ｂ個）］／［品質評価に供された種子数（Ａ個）］×１００との定義式から、１００Ｂ／Ａ（％）と決定することができる。

　データセットの構築の（ｃ）における、「各種子のスペクトルデータと品質検査の結果とを対応させること」を、具体的に形質が「発芽能」の場合を用いて説明するに、種子Ａ、種子Ｂおよび種子Ｃに対して光を照射して得られた各種子のスペクトルデータ（反射、吸収、若しくは透過スペクトルデータまたはその派生スペクトルデータ）を、それぞれ、ＳＡ、ＳＢ、ＳＣとし、また、当該種子Ａ、種子Ｂおよび種子Ｃを品質検査に供することにより種子Ａが正常発芽、種子Ｂが異常発芽し、種子Ｃが不発芽であるとの検査結果を得た場合に、（ｃ）においては、ＳＡは正常発芽、ＳＢは異常発芽、ＳＣは不発芽といったように、スペクトルデータと品質結果とを対応させることが意図される。なお、この際に、良否の判別を容易にする目的で、ダミー変数を充ててもよい。例えば、「発芽能」の場合、正常発芽には１（良好）、異常発芽および不発芽には－１（不良）といった変数を充てることができるが、これに限定されない。

（第３工程）
　本発明の第３工程は、第２工程で構築されたデータセットに対して多変量判別分析を適用することにより、各種子における所望の形質に対する判別スコアを算出するための良否判別モデルの候補を導出する工程である。

　本工程における多変量判別分析は、自体公知の方法を用いればよく、本発明の所望の効果を得られる限り、いずれの方法を用いてもよい。本発明の方法において、多変量統計分析技法としては、部分的最小二乗法（ＰａｒｔｉａｌＬｅａｓｔＳｑｕａｒｅｓ；ＰＬＳ）または主成分分析（Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔａｎａｌｙｓｉｓ；ＰＣＡ）を用いることができるがこれらに限定されない。多変量判別分析は、好ましくは部分的最小二乗判別分析（ＰａｒｔｉａｌＬｅａｓｔＳｑｕａｒｅ－ＤｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔＡｎａｌｙｓｉｓ；ＰＬＳ－ＤＡ）であり得る。

　一例として、ＰＬＳ－ＤＡを用いて多変量判別分析を行う場合を概説する。

　ＰＬＳ－ＤＡは、設定された説明変数および目的変数を用いて次式１のような式をモデリングするものである。

（式１）
ｙ＝ａ＋ｂ_１ｘ_１＋ｂ_２ｘ_２＋ｂ_３ｘ_３＋ｂ_４ｘ_４＋…

　ここで、ｘ_１、ｘ_２、ｘ_３およびｘ_４は説明変数であり、ｙは目的変数であり、ａは切片（定数）であり、ｂ_１、ｂ_２、ｂ_３およびｂ_４は偏回帰係数（定数）である。

　第２工程で取得されたスペクトルデータを説明変数とし、品質検査により得られた結果を目的変数とし、各種子における所望の形質に対する判別スコアを算出するための良否判別モデルの候補を導出する。良否判別モデルの候補の導出方法もまた、自体公知の方法を用いればよいが、以下に、本発明の実施例において用いた方法を一例として説明する。

　種子に光を照射して取得した反射、吸収、若しくは透過スペクトルデータ（Ｒ）から、自身（Ｘ１）を含めて、上述した変換方法およびその任意の組み合わせから、派生スペクトルデータＸsを生成させる。判別分析では、その全派生スペクトルの、説明変数としての使用を試みるが、導出された判別モデルの予測性能が同等の場合は、なるべく単純な派生パターンを採択すればよい。

（良否判別モデルの候補の導出手順）
　データセットの最終準備を次のように行う。
　反射、吸収、または透過スペクトルを取得し、さらにその派生スペクトルを生成させ、説明変数データを準備する。必要に応じて、目的変数および説明変数のいずれか又は両方に対して標準化を行う。多変量判別分析により判別モデルの導出を行う。例えば、線形スパースモデリングによる判別モデルの導出は次のように行うことができる。目的変数と説明変数データのすべての組み合わせについて、最初にＰＬＳ回帰やＲｉｄｇｅ回帰により、各説明変数の重みの初期値を決定する。続いてＡｄａｐｔｉｖｅ　ＬＡＳＳＯ回帰により、正則化係数λと偏回帰係数、及び偏回帰係数が０とならない説明変数の個数の関係を表す解パスを算定する。回帰における残差平方和を最小化する説明変数の個数をｐとすると、説明変数をｐ個以下に削減する場合に適した説明変数の組み合わせの候補は、解パスより決定できる。最終的な判別モデルはＰＬＳ－ＤＡにより導出する。Ａｄａｐｔｉｖｅ　ＬＡＳＳＯ回帰における解パスより決定した、２～ｐ個の説明変数を使用して判別モデルを導出する。導出された判別モデルを良否判別モデルの候補とする。尚、この段階では多数の候補判別モデルが提示される。良種子に対して、より高い相対スコアを与える判別モデルの選択は、次の工程４において、実施される。

（第４工程）
　本発明の第４工程は、第３工程で導出された良否判別モデルの候補から判別モデルを選択する工程である。

　第４工程における、「回収率」、「適合率」、「標準選別条件」は、以下のように定義される。

［回収率（％）］＝［品質評価に供された種子のうち、判別スコアに基づいて選択される種子数］／［品質評価に供された種子数］×１００

［適合率（％）］＝［品質評価に供された種子であって、判別スコアに基づいて選択される種子のうち、所望の形質を有している種子数］／［品質評価に供された種子のうち、判別スコアに基づいて選択される種子数］×１００

［標準選別条件］：［事前良品率］と［回収率］を同値とする選別条件

　回収率、適合率および標準選別条件を上述のとおり定義した時、適合率が事前良品率を上回るとの基準を満たす候補を良否判別モデルとして選択することで、第３工程で得られた多数のモデル候補から、所望の形質に対して良否を判別し得る判別モデルを選択することができる。なお、適合率が事前良品率を大きく上回るほど、優れた判別モデルであると考えられる。また、適合率を必要に応じて簡便に調整できることを可能とする目的で、回収率の増減と適合率の増減とに高い順位相関（即ち、回収率を減少させると適合率が確実に増加し、回収率を増加させると適合率が確実に減少する関係）を有する判別モデルを選択することが好ましい。

　尚、本明細書において、「適合率」を「事後良品率」と表記することがある。

（第５工程）
　本発明の第５工程は、第１工程で種子集団から取り出されなかった残りの種子、および／または該種子と実質的に同一の条件下で得られた別の種子に対して光を照射してスペクトルデータを取得し、該スペクトルデータに第４工程で選択された判別モデルを適用することで各種子の判別スコアを決定する工程である。換言すれば、第５工程は、種子集団のうち、非訓練種子に対してのスペクトルデータを取得し、これに第４工程で得られた判別モデルを適用することで、各種子の判別スコアを決定する工程である。スペクトルデータの取得方法や条件などは、訓練種子において使用したものと同じものを用いればよく、また、所望の効果を得られる限り、部分的に異なっていてもよい。

（第６工程）
　本発明の第６工程は、第５工程で決定された判別スコアに基づいて、判別スコアの閾値を決定する工程である。閾値は、種子集団における事前良品率が「ｋ％」であったとすると、上位から「ｋ％」に位置するスコアが標準的な選別を行うための閾値（標準閾値）と設定することができる。尚、上述の第４工程において、回収率の増減と事後良品率の増減とに高い順位相関を有する判別モデルを選択した場合は、標準閾値を基準として当該閾値を適宜増減すれば、適合率を調整することもできる。

（第７工程）
　本発明の第７工程は、第５工程で決定された各種子の判別スコアと第６工程で決定された判別スコアの閾値とを比較することで、所望の形質を有すると予測される種子を回収する工程である。種子の回収は、所望の形質を有すると予測される種子を選別して取り出すことで達成してもよいし、或いは、所望の形質を有さないと予測される種子を選別して取り出し、取り出されなかった種子を、所望の形質を有する種子として回収してもよい。

　本発明の一態様において、本発明の方法は、２以上の所望の形質を有する植物種子の選別方法であり得る。

　例えば、２以上の形質としては、先に列挙した形質（即ち、発芽能、発芽勢、遺伝子型、ストレス耐性、休眠性、病害抵抗性、虫害抵抗性、ＱＴＬ特性、食味性、出穂期、および、葉の大きさなどの形態学的な特徴等）のいずれか２つ以上の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

　本発明の方法が、２以上の所望の形質の選別方法である場合、２以上の所望の形質の予測は、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの方法によって行われることを特徴とする。

（ｉ）形質ごとの良否に着目して形質ごとの判別モデルにより個別に種子をスコア化し、すべてのスコアが閾値以上のものを良種子と予測する方法（「複数モデルによる逐次予測」）。

（ｉｉ）形質ごとの良否は顧みず、所望の形質のすべてが良好である場合を良好とし、それ以外の場合は不良とすることで単一の判別モデルを選択し、当該単一の判別モデルにより種子をスコア化し、スコアが閾値以上のものを良種子と予測する方法（「単一モデルによる直接予測」）。

（ｉｉｉ）形質ごとの良否に着目して形質ごとの判別モデルを選択した後に、当該形質ごとの判別モデルを用いて得られたスコアを統合して統合スコアとし、該統合スコアの順位に基づき、各種子の良否を予測する方法（「統合モデルによる直接予測」）。

　いずれの方法を用いても、２以上の所望の形質を有する種子の選別が達成できる。

　また、本発明の一態様において、本発明の方法は、判別モデルの精度を評価する工程をさらに含んでもよい。尚、精度評価とは、選択した判別モデルの「汎化的な性能」を評価するものである。良否判別モデルの精度評価は、具体的には以下のような手法により実施することができる。

　上述した工程の実施により得られた判別モデルについて、その導出時に使用した内部データ（即ち、データセットを構築した種子集団）に対して適用した際の内的妥当性検証および当該モデルの導出とは独立に取得した外部データに対して適用した際の外的妥当性検証を実施する。

　スコア下限閾の設定値に依存しない、良否判別モデルの全般的な精度の評価には、ＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線や、ＰＲ（Precision-Recall）曲線が用いられ得る。とりわけ、誤判別のうち、良品の棄却（False Negative、偽陰性）よりも不良品の採択（False Positive，偽陽性）を深刻視する品質検査においては、偽陽性に対して鋭敏な、ＰＲ曲線が用いられることが多い。

　ＲＯＣ曲線、ＰＲ曲線のいずれにおいても、ＡＵＣ（Area Under Curve，曲線下面積）が最大値である１に近い値を取る判別モデルほど優れているとされる。しかし、ＲＯＣ－ＡＵＣでは、最小値が必ず０．５であるのに対し、ＰＲ－ＡＵＣでは、初期適合率、すなわち事前良品率が最小値となり、適用先のデータセットにより変動する。

　ＰＲ－ＡＵＣは、特定のデータセットに対し、数ある判別モデルのいずれが優れた性能を示すかを検証する目的には適しているが、単一の判別モデルが異なるデータセットに対し、同等の性能を発揮するかを検証する目的には適さない。これは、事前良品率に影響を受けてしまうためである。

　ＰＲ曲線における前記の欠点を補完するため、次式により表される相対適合率（Relative Precision）を定義する。

［相対適合率］＝（適合率－初期適合率）／（１－初期適合率）

　相対適合率と再現率の関係をｒＰＲ（relative Precision-Recall）曲線、その曲線下面積をｒＰＲ－ＡＵＣと称する。ｒＰＲ－ＡＵＣは、適用先のデータセットに依存せず、必ず閉区間［０，１］の値を取る。

　良否判別においてｎ個のモデルを使用する場合、適合率や相対適合率と再現率との関係は、ｎ＋１次元空間を占める超曲面の形状を成すこととなる。ここでは便宜上、使用する判別モデルの数によらず、適合率及び相対適合率と再現率との関係はＰＲ曲線及びｒＰＲ曲線、それらが成す超曲面より下部の比率はＰＲ－ＡＵＣ及びｒＰＲ－ＡＵＣと称する。

　導出したすべての判別モデルについて、それぞれが対象とする作物種に由来するデータセットに適用した際のＰＲ曲線及びｒＰＲ曲線を作成する。また、各曲線からＰＲ－ＡＵＣ及びｒＰＲ－ＡＵＣを算出する。作成された曲線の形状やＡＵＣ値から、判別モデルの精度評価が達成される。

　以下の実施例において本発明を更に具体的に説明するが、本発明はこれらの例によってなんら限定されるものではない。

［出荷要件を満たす品質を備えた野菜種子の判別］
（材料）供試資料として、トキタ種苗株式会社の提供による、２０１５～２０２２年産の野菜種子（カボチャ、エンドウ、レタス、ネギ、トマト、カリフラワー）を用いた（表１）。

　種子に対する近赤外光の照射は、２４Ｖ２５０Ｗのアルミミラー付ハロゲンランプ（河北ライティングソリューションズ社製ＪＴＲ２４Ｖ２５０Ｗ１０Ｈ／５－ＡＬ、ＧＸ５．３口金）２灯への直流電圧印加により行い、近赤外ハイパースぺクトル画像は、ラインスキャン型ハイパースぺクトルカメラ（住友電工社製ＣＶ－Ｎ８０１ＨＳ）を用いて撮影した。近赤外レンズは、焦点距離が３０ｍｍの像側テレセントリックレンズ（住友電工社製）であり、撮影時の作動距離は２８ｃｍ、空間分解能は９０ｐｐｉ、波長サンプリング間隔は６ｎｍであった。また、使用したカメラの波長感度域は９８０～２，３５０ｎｍであった。各波長における反射率は、コントラストターゲット（米Ｌａｂｓｐｈｅｒｅ社製ＳＲＴ－ＭＳ－０５０）を構成する、反射率が９９％の標準反射板及び暗電流（反射率０％）の撮影画像をもとに、拡散反射率相当に較正した。種子の反射スペクトルは、各種子が占める領域に含まれる画素ごとに記録された反射スペクトルの平均を使用した。

　種子の外観は、白色ＬＥＤ光源（Ｌｅｉｍａｃ社製ＩＤＢＡ－ＨＭＳ１５０ＷＨＶ－Ｓ）の照射下において、８ｋカラーラインスキャンカメラ（ｅ２ｖ社製ＥＶ７１Ｃ４ＣＣＬ８００５－ＢＡ０）を使用して撮影した。レンズは光学倍率が０．４倍の物体側テレセントリックレンズ（オプトアート社製ＦＴ０４－１５０ＣＬ）であり、空間分解能は２，０３２ｐｐｉであった。カメラのホワイトバランス調整には、コントラストターゲット（前記ＳＲＴ－ＭＳ－０５０）を構成する反射率が２５％（種子表面が暗色の場合）又は５０％（種子表面が明色の場合）の標準反射板を使用した。

（方法）
Ｉ．データセットの構築
（１）種子に対し、ハロゲンランプより光を均一に照射し、近赤外波長域の分光情報を含む近赤外ハイパースペクトル画像を撮影した。種子の一部については、８ｋラインカメラにより、高解像度の外観画像も併せて撮影した（図１）。

（２）近赤外ハイパースペクトル画像から、各種子が占める領域の近赤外反射スペクトルを算出した（図２）。

（３）前記の種子は、ＩＳＴＡ（International Seed Testing Association）が定める国際種子検査規定に準拠した発芽試験に供し、それぞれの発芽形質を正常発芽、異常発芽、不発芽の３群に区分した。

（４）カリフラワー品種４７（以下、品種番号は省略する）は、Ｆ１雑種として利用されるが、不完全な自家不和合性により、自殖種子が形成される場合がある。それぞれの種子の交配形質がＦ１、自殖のいずれであったかについては、芽生えを用いたアイソザイム型解析により決定した。

（５）良否それぞれの種子にダミー変数を充て、これを後述の判別分析における目的変数とした。ダミー変数の値は、発芽形質の判別では、正常発芽種子を１（良好）、それ以外を－１（不良、以下同様）とした。カリフラワーにおける交配形質の判別では、Ｆ１雑種を１、それ以外を－１とした。また、発芽及び交配形質が揃って良種子の要件を満たしているかの判別では、正常発芽能を持つＦ１雑種を１、それ以外を－１とした。

II．野菜種子の良否判別モデルの導出
（６）種子の近赤外反射スペクトルから、それが所望の形質を備えているか（すべての作物種において正常発芽すること、カリフラワーではさらにＦ１雑種であること）を予測するための判別分析を行った。

（７）判別分析の手順は、特開２０２３－１２５３０１に記載の手法に準拠した。本発明においては、近赤外反射スペクトルの平滑化微分や、異なる微分次数のスペクトルの列結合は省略した（図３）。

（８）説明変数となる近赤外反射スペクトル（Ｒ）には、逆数（１／Ｒ）及び対数（疑似吸光度、－ｌｏｇＲ）変換のほか、標準正規化（ＳＮＶ，Standard Normal Variate；有効波長範囲は９８０～２，２００ｎｍ）、ＳＧ（Savizky-Golay）フィルタによる平滑化（５点，３次多項式近似）を任意の組み合わせで施し、１１通りの派生スペクトルを生成した。原スペクトルを含む計１２通りのスペクトルを、説明変数として使用した（図４）。

（９）種子の良否判別モデルは、Ａｄａｐｔｉｖｅ　ＬＡＳＳＯ（Least Absolute Shrinkage and Selection Operator）及びＰＬＳ－ＤＡ（Partial Least Squares-Discriminant Analysis）を組み合わせた多変量線形スパースモデリングの手法により導出した。この段階では多数の候補モデルが提示されるが、良種子に対し、より高い相対スコアを与えるものを選び出す必要がある。以下にモデル選択の方法を具体的に示す。

III．良否判別モデルの選択
（１０）前記において提示された多数の候補の中から、望ましい判別モデルを選択する手法を考案するため、以下の思考実験を行った。

１）良否それぞれの種子に対し、明確に離れたスコアを与える高精度な判別モデルと、幅広く重なるスコアを与える低精度な判別モデルを仮定する。ここでは、事前良品率を８０％とし、良否それぞれの種子に対し、前者が平均１及び－１、標準偏差が共に０．２５の正規分布に従うスコアを与え、後者が平均０．０５及び－０．０５、標準偏差が共に０．２５の正規分布に従うスコアを与えるものとする（図５）。

２）スコアの降順に種子を回収する選種作業を行うものとする。高精度な判別モデルを使用した場合には、回収率が事前良品率と一致する８０％に至るまで、適合率（事後良品率）は１００％近傍を維持する（図５Ａ（ｅ））。一方、低精度な判別モデルを使用した場合には、適合率は速やかに事前良品率に収束する（図５Ｂ（ｅ））。いずれの場合も、回収率が事前良品率と一致した時点で、適合率と再現率（良種子の回収率）は同値となる。

３）判別モデルを利用した良種子の選別では、全ての種子の計測を終えた後に、スコアが上位を占める種子を回収するのではなく、実用上は予め定めた下限閾を上回るスコアを示す種子を順次回収することとなる。スコアとその順位の関係は容易に求められるため、適合率や再現率を含む判別精度にかかわる各指標と回収率との関係（図５（ｅ））は、判別スコアとの関係（図５（ｄ））に描き替えることができる。

４）ここで、事前良品率と回収率を同値とする選別条件を「標準選別条件」と定義し、且つ、その際に回収の対象となる種子の判別スコアの下限閾を「標準閾値」と定義する。

　前記より、標準選別条件を用いた選別を行ったときに、適合率（即ち、事後良品率）及び、それと同値となる再現率が、事前良品率を大きく上回ることが、優れた判別モデルの要件であることが分かる。

（１１）加えて、良種子の選別では、適合率を必要に応じて調整できることが望ましい。すなわち、回収率を下げる（スコアの下限閾を上げる）に従い、適合率を高確度に上げられる関係が成り立っていることがより好ましい。

（１２）以下の表２－１、表２－２及び表２－３に示した各作物種子に対する良否判別モデルは、前記２点を満たすことを要件として選択したものである。また、同表の各モデルにおいて、必要な説明変数として採択された波長帯と、標準偏回帰係数及び変数重要度（ＶＩＰ，Variable Importance in Projection）との関係を図６に示した。

ＩＶ．複数の判別スコアの統合処理
　複数の形質が評価される実施形態をこれ以降説明する。

（１３）カリフラワーにおける良種子を（１）正常な発芽能を有し、且つ（２）Ｆ１雑種と定義したとき、カリフラワーの良種子を判別するには、以下２通りの方法を採用し得る。

方法１）発芽及び交配形質における良否を、２つのモデル（ｍ－Ｃａ４７ｇ及びｍ－Ｃａ４７ｘ）により個別にスコア化し、両スコアが共に上位のものを良種子と予測する。方法２）個々の形質における良否は顧みず、良種子であるかどうかのみを予測する（ｍ－Ｃａ４７）。

（１４）方法１）において、希望の判別精度を得るためには、２つのモデルに対してスコアの下限閾を設定する必要がある。ｎ個の判別モデルを使用する場合、スコア下限閾の設定値と判別精度にかかわる各指標との関係は、ｎ＋１次元の超曲面の形状を成すこととなる。本例のようにｎ＝２の場合は、各指標は曲面をなすが、ヒートマップとして平面的に描くこともできる（図７）。しかし、本方法は、方法２）に比べ、運用の簡便性は著しく劣る。

（１５）複数の判別モデルのスコアを統合し、設定すべき下限閾を１つで済むようにするため、以下の数理的処理を案出した。

１）形質１～ｋの良否を判別するモデルをＭ１～Ｍｋ、これらに説明変数Ｘを代入して得られる判別スコアをｙ１（Ｘ）～ｙｋ（Ｘ）とする。

２）特定のロットを構成する十分数ｎ（数百程度）の種子を計測し、それぞれに対応する説明変数ｘ（ｘ１～ｘｎ）から得られるスコアｙ１（ｘ）～ｙｋ（ｘ）を求める。形質ごとの事前良品率がｐ１～ｐｋと想定される場合、ｙ（ｙ１～ｙｋ）の上位からｎ×ｐ（ｐ１～ｐｋ）番目のスコアをｙｐ（ｙｐ１～ｙｐｋ）とする。また、ｙ（ｙ１～ｙｋ）の標準偏差をｓ（ｓ１～ｓｋ）とする。

３）スコアｙ（ｙ１～ｙｋ）を次式によりスコアｚ（ｚ１～ｚｋ）に変換する。
ｚ＝（ｙ－ｙｐ）／ｓ

４）スコアｚ（ｚ１～ｚｋ）の最小値を、Ｍ１～Ｍｋを使用した判別における統合スコアとする。

５）統合スコアの順位に基づき、各種子の良否を判別する。統合スコアを用いた判別においても、標準条件及び標準閾値を決定できる。

　この処理をｍ－Ｃａ４７ｇ及びｍ－Ｃａ４７ｘに適用し、モデルｍ－Ｃａ４７ｇｘを生成した（表３－１及び表３－２）。

Ｖ．良否判別モデルの精度評価
（１６）選択した全ての判別モデルについて、全種子又は良否別種子の判別スコアの分布域及び、スコア下限閾の設定値又は種子回収率と判別精度にかかわる各指標との関係を、図８及び図９に示した。図の構成は図５と共通である。

（１７）図８及び図９はそれぞれ、各判別モデルを、その導出時に使用した内部データに対して適用した際の内的妥当性検証及び、モデル導出とは独立に取得した外部データに対して適用した際の外的妥当性検証の結果に相当する。図９はすなわち、モデルの汎化性能の評価結果である。

（１８）スコア下限閾の設定値に依存しない、良否判別モデルの全般的な精度の評価には、ＲＯＣ（Receiver Operating Characteristic）曲線や、ＰＲ（Precision-Recall）曲線が用いられることが多い。とりわけ、誤判別のうち、良品の棄却（False Negative，偽陰性）よりも不良品の採択（False Positive，偽陽性）を深刻視する品質検査においては、偽陽性に対して鋭敏な、ＰＲ曲線が用いられることが多い。

（１９）ＲＯＣ曲線、ＰＲ曲線のいずれにおいても、ＡＵＣ（Area Under Curve，曲線下面積）が最大値である１に近い値を取る判別モデルほど優れているとされる。しかし、ＲＯＣ－ＡＵＣでは、最小値が必ず０．５であるのに対し、ＰＲ－ＡＵＣでは、初期適合率、すなわち事前良品率が最小値となり、適用先のデータセットにより変動する。

（２０）ＰＲ－ＡＵＣは、特定のデータセットに対し、数ある判別モデルのいずれが優れた性能を示すかを検証する目的には適しているが、単一の判別モデルが異なるデータセットに対し、同等の性能を発揮するかを検証する目的には適さない。これは、事前良品率に影響を受けてしまうためである。

（２１）ＰＲ曲線における前記の欠点を補完するため、次式により表される相対適合率（Relative Precision）を定義する。

（２２）相対適合率と再現率の関係をｒＰＲ（relative Precision-Recall）曲線、その曲線下面積をｒＰＲ－ＡＵＣと称する。ｒＰＲ－ＡＵＣは、適用先のデータセットに依存せず、必ず閉区間［０，１］の値を取る。

（２３）良否判別においてｎ個のモデルを使用する場合、適合率や相対適合率と再現率との関係も、ｎ＋１次元の超曲面の形状を成すこととなる。ここでは便宜上、使用する判別モデルの数によらず、適合率及び相対適合率と再現率との関係はＰＲ曲線及びｒＰＲ曲線、それらが成す超曲面より下部の比率はＰＲ－ＡＵＣ及びｒＰＲ－ＡＵＣと称する。

（２４）導出したすべての判別モデルについて、それぞれが対象とする作物種に由来するデータセットに適用した際のＰＲ曲線（図１０Ａ及び図１１）及びｒＰＲ曲線（図１０Ｂ及び図１２）を示した。また、各曲線から算出されたＰＲ－ＡＵＣ及びｒＰＲ－ＡＵＣを表３－１及び表３－２に併記した。

ＶＩ．判別モデルに基づく良種子の選別
（２５）種子を撮影した近赤外ハイパースペクトル画像に対し、表２に示した判別モデルによるスコアを、画素又は種子が占有する領域ごとに計算し、疑似色又は輝度値に変換して可視化するソフトウェアを作成した（図１３）。

（２６）前記のソフトウェアを使用し、発芽又は交配形質にかかわる判別スコアが、上位、下位を占める種子をそれぞれ回収した。各区分について、種子の発芽及び初期成長を評価すると共に（図１４）、カリフラワーについてはアイソザイム型を解析し、事後良品率（適合率）を求めた（表４）。

（結果・考察）
（１）いずれの作物種においても、発芽試験後に明らかとなった種子の良否を、発芽前の外観及び近赤外反射スペクトルの概形から、主観的に検知することは不可能であった（図１及び図２）。

（２）導出した判別モデルを、その対象品種に適用した場合、スコアの分布域は例外なく、良種子から不良種子に向けて、高い側から低い側の順序となることが確認された（図８並びに図９（ｂ）及び（ｃ））。

（３）発芽形質を予測するモデルにおいては、異常発芽種子が示すスコアの分布域は、正常発芽及び不発芽種子が示すスコアの中間に位置しており（図８Ａ～Ｈ並びに図９Ａ～Ｆ（ｂ）及び（ｃ））、判別スコアは、概ね種子に備わる成長力を反映しているものと推察された。

（４）判別スコアの分布域は、良種子と不良種子の間で重複が生じており、いずれの作物種においても、誤判別を避けることはできなかった。また、トマトの品種９４、２２１の間では、判別モデルの互換性は確認されたが、同品種に適用した場合と比べて、判別精度が劣ることが示唆された（表３並びに図１２Ｈ及びＩ）。ネギにおいては、品種２２と５１の間で、判別モデルの共用は実用的でないと判断された（表３並びに図１２Ｆ及びＧ）。

（５）判別スコアの分布域は、同品種かつ同ロットの種子を使用した場合でも、試験の機会が異なれば同一とはならなかった（図８、図９（ａ）～（ｃ）；トマト品種９４は、図８と図９で使用ロットが異なる）。導出した判別モデルは、少なくとも同品種に対し、繰り返し適用できるものであったが、良種子を選別する際のスコアの下限閾は、機会ごとに最適化することが望まれた。

（６）無作為に抽出した種子から得られた近赤外スペクトルに判別モデルを適用し、スコアを算出した時点では、個々の種子の良否は不明である。また、スコアの密度分布は特徴のないひと山型を示すのみであり（図９Ｃ、Ｅ－Ｉ（ａ）；Ａ、Ｂ、Ｄは無作為抽出ではない）、この形状から希望に適った選別を行うためのスコアの下限閾を推定することは困難である。一方、推定される事前良品率と同率の種子を回収するための標準閾値は決定可能であり、これを標準的な選別条件（標準条件）と定めることは合理的である。よって、使用する種子の事前良品率は、可能な限り正確に把握しておくことが望まれる。

（７）前記の標準条件よりも事後良品率（適合率）を上げたい場合には、判別スコアの下限閾を上げ、再現率（良種子の回収率）を上げたい場合には、スコアの下限閾を下げれば良い。

（８）前記において、判別スコアの下限閾をどの程度変更すれば、適合率や再現率にどの程度の影響が及ぶのかを推定することも容易ではない。スコアから標準閾値を減じ、さらにスコアの標準偏差で除算する変換は、変数の標準化（正規化）と同じく、スコアのばらつきを一律にできる利点をもたらす。このことは、単一のモデルにより良種子を選別する場合においても有効である。

（９）前記のスコア変換により、複数の判別モデルを使用する良種子選別においても、調整すべき閾値を一つに統合することができる。

（１０）カリフラワーでは、良種子である正常発芽能を備えたＦ１雑種を予測するに際し、良否を直接的に判別する単一モデルを使用するよりも、発芽及び交配形質を個別に予測するモデルを組み合わせて使用した場合に、より高い判別精度が認められた（表３並びに図１２Ｌ及びＭ）。

（１１）発芽形質を予測するモデルを適用し、判別スコアが上位、下位を占める種子について、発芽及び初期成長を比較したところ、スコアが上位の種子は、発芽率が高いのみならず、旺盛な発芽後成長を示す傾向が認められた（図１４）。導出した良否判別モデルの性能がやや劣っていたレタスにおいても傾向は同じであった。このことからも、発芽形質に対する判別スコアは、種子に備わる成長力を反映しているものと推察された。

（１２）標準選別条件における適合率（事後良品率と同義であり、再現率と一致する）が事前良品率を十分に上回ることを確認することにより、多数の候補判別モデルから、好ましいモデルを効率的に絞り込むことができた（表３及び図３）。さらに、相対適合率を定義し、これと再現率との関係を表すｒＰＲ曲線の曲線下面積（ｒＰＲ－ＡＵＣ）を算出することにより、モデルとデータセットの組み合わせにかかわりなく、判別精度を客観的に比較することが可能となった（表３及び図１２）。

（１３）本発明技術では、種子の品質評価試験の結果を受けてから概ね１日以内には、その良否判別の可否が明らかとなり、可能な場合は具体的な判別モデルを得ることができる。よって、不良種子の発生が当該品種の遺伝的性質等に起因しない偶発的なものであったとしても、出荷基準に足る良品率を回復させるための選種作業を、問題の発覚から、程なく開始することができる。

（１４）前記を可能とするためには、品質評価試験の結果と紐づけできる、種子の近赤外ハイパースペクトル画像を予め取得しておく必要がある。

（１５）先述の通り、判別モデルの導出には、多大な時間や労力を要するわけではない。特定の作物品種に適用したモデルを、別の機会に再利用することを考慮して、精度向上のための更新を続けることも可能であるが、不良種子の発生事由は機会ごとに異なる場合が多い。様々な作物品種に対応した判別モデルのライブラリを充実させるだけでなく、問題の発生機会ごとに最適な良否判別モデルを導出し、解決に向けて即応できる種子の品質管理体制を整えることが重要である。

（１６）近赤外ハイパースペクトル画像は一度に取得できる一方で、そこから得られるデータは、種子の発芽特性や遺伝子型といった、複数の形質の判別に使用することができる。同画像は、粒径に関する情報を含む上、粒重の推定にも有効である。本発明は、機能の異なる複数の選別機を導入、設置することなく、低コストかつ省スペースに、高度な種子選別を実施する手段を与えるものである。

　本発明によれば、所望の形質を有する植物種子と、所望の形質を有さない植物種子の集団から、非破壊的、高効率、且つ高精度に所望の形質を有する植物種子を選別することができる。従って、本発明は、例えば、種苗産業において極めて有用である。

　本出願は、日本で出願された特願２０２３－０８９０３６（出願日：２０２３年５月３０日）を基礎としており、その内容は本明細書に全て包含されるものである。

Claims

　所望の形質を有する植物種子の選別方法であって、以下の第１工程～第７工程を含む、方法：
（第１工程）種子集団から一部の種子を取り出す工程、
（第２工程）取り出された種子に対するデータセットを構築する工程であって、該データセットを構築する工程は以下（ａ）～（ｃ）を含み：
　（ａ）取り出された種子に対して光を照射してスペクトルデータおよび／またはその派生スペクトルデータを取得すること、
　（ｂ）スペクトルデータを取得した種子を所望の形質に対する品質検査に供し、該取り出された種子の事前良品率を決定すること、
　ここで、事前良品率は次式で定義される：
　［事前良品率（％）］＝［品質評価に供された種子のうち、所望の形質を有していた種子数］／［品質評価に供された種子数］×１００
　（ｃ）各種子のスペクトルデータと品質検査の結果とを対応させること、
（第３工程）第２工程で構築されたデータセットに対して多変量判別分析を適用することにより、各種子における所望の形質に対する判別スコアを算出するための良否判別モデルの候補を導出する工程、
（第４工程）回収率および適合率を次式で定義し：
［回収率（％）］＝［品質評価に供された種子のうち、判別スコアに基づいて選択される種子数］／［品質評価に供された種子数］×１００
［適合率（％）］＝［品質評価に供された種子であって、判別スコアに基づいて選択される種子のうち、所望の形質を有している種子数］／［品質評価に供された種子のうち、判別スコアに基づいて選択される種子数］×１００
かつ、事前良品率と回収率を同値とする選別条件を「標準選別条件」と定義するとき、
　該標準選別条件下で、適合率が事前良品率を上回るとの基準を満たす候補を良否判別モデルとして選択することを含む、第３工程で導出された良否判別モデルの候補から判別モデルを選択する工程、
（第５工程）第１工程で種子集団から取り出されなかった残りの種子、および／または該種子と実質的に同一の条件下で得られた別の種子に対して光を照射してスペクトルデータを取得し、該スペクトルデータに第４工程で選択された判別モデルを適用することで各種子の判別スコアを決定する工程、
（第６工程）第５工程で決定された判別スコアに基づいて、判別スコアの閾値を決定する工程、
（第７工程）第５工程で決定された各種子の判別スコアと第６工程で決定された判別スコアの閾値とを比較することで、所望の形質を有すると予測される種子を回収する工程。
　２以上の所望の形質を有する植物種子の選別方法である、請求項１記載の選別方法。
　形質が、発芽能、発芽勢、遺伝子型、ストレス耐性、休眠性、病害抵抗性、虫害抵抗性、ＱＴＬ特性、食味性、出穂期、および形態学的な特徴からなる群から選択される形質の少なくとも１つである、請求項１または２記載の選別方法。
　２以上の所望の形質の予測が、以下の（ｉ）～（ｉｉｉ）のいずれかの方法によって行われることを特徴とする、請求項１または２記載の選別方法：
（ｉ）形質ごとの良否に着目して形質ごとの判別モデルにより個別に種子をスコア化し、すべてのスコアが閾値以上のものを良種子と予測する方法、
（ｉｉ）形質ごとの良否は顧みず、所望の形質のすべてが良好である場合を良好とし、それ以外の場合は不良とすることで単一の判別モデルを選択し、当該単一の判別モデルにより種子をスコア化し、スコアが閾値以上のものを良種子と予測する方法、
（ｉｉｉ）形質ごとの良否に着目して形質ごとの判別モデルを選択した後に、当該形質ごとの判別モデルを用いて得られたスコアを統合して統合スコアとし、該統合スコアの順位に基づき、各種子の良否を予測する方法。
　判別モデルの精度を評価する工程をさらに含む、請求項１または２記載の選別方法。
　植物が園芸作物である、請求項１または２記載の選別方法。