WO2024214632A1 - ホスホニウム基を有するカチオン性ポリマーおよびこれを含むポリマー粒子または医薬組成物 - Google Patents

ホスホニウム基を有するカチオン性ポリマーおよびこれを含むポリマー粒子または医薬組成物 Download PDF

Info

Publication number
WO2024214632A1
WO2024214632A1 PCT/JP2024/013965 JP2024013965W WO2024214632A1 WO 2024214632 A1 WO2024214632 A1 WO 2024214632A1 JP 2024013965 W JP2024013965 W JP 2024013965W WO 2024214632 A1 WO2024214632 A1 WO 2024214632A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cationic
group
mrna
phosphonium
peg
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2024/013965
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
泰孝 安楽
純平 乗松
隼斗 水野
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
University of Tokyo NUC
Original Assignee
University of Tokyo NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP2024004164A external-priority patent/JP2024152597A/ja
Application filed by University of Tokyo NUC filed Critical University of Tokyo NUC
Publication of WO2024214632A1 publication Critical patent/WO2024214632A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7105—Natural ribonucleic acids, i.e. containing only riboses attached to adenine, guanine, cytosine or uracil and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/711—Natural deoxyribonucleic acids, i.e. containing only 2'-deoxyriboses attached to adenine, guanine, cytosine or thymine and having 3'-5' phosphodiester links
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/34—Macromolecular compounds obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyesters, polyamino acids, polysiloxanes, polyphosphazines, copolymers of polyalkylene glycol or poloxamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/107—Emulsions ; Emulsion preconcentrates; Micelles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
    • C08G69/02—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids
    • C08G69/08—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids derived from amino-carboxylic acids
    • C08G69/10—Alpha-amino-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
    • C08G69/40—Polyamides containing oxygen in the form of ether groups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
    • C08G69/48—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G81/00—Macromolecular compounds obtained by interreacting polymers in the absence of monomers, e.g. block polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08L—COMPOSITIONS OF MACROMOLECULAR COMPOUNDS
    • C08L101/00—Compositions of unspecified macromolecular compounds
    • C08L101/02—Compositions of unspecified macromolecular compounds characterised by the presence of specified groups, e.g. terminal or pendant functional groups

Definitions

  • the present invention relates to a cationic polymer having a phosphonium group (e.g., a cationic block copolymer or a cationic polyamino acid), and a polymer particle or a pharmaceutical composition containing the cationic polymer.
  • a cationic polymer having a phosphonium group e.g., a cationic block copolymer or a cationic polyamino acid
  • a polymer particle or a pharmaceutical composition containing the cationic polymer e.g., a cationic block copolymer or a cationic polyamino acid
  • nucleic acid medicines such as antisense nucleic acids and siRNA
  • gene medicines consisting of nucleic acids that code for therapeutic protein genes such as plasmid DNA and mRNA
  • genome editing technology using sgRNA (single guide RNA) and Cas9 nuclease.
  • protein medicines such as antibodies, hormones, and enzymes.
  • Patent Document 1 discloses that a cationic block copolymer containing a cationic polymer segment and a hydrophilic polymer segment and a nucleic acid form a micellar PIC (PIC micelle).
  • the micelles may be destroyed by anionic substances in the body, or degrading enzymes may enter the micelles and degrade anionic drugs.
  • the main object of the present invention is to provide a carrier that can improve the structural stability of polymer particles such as micelles and/or the stability of substances encapsulated in the polymer particles.
  • a cationic block copolymer according to an embodiment of the present invention has a cationic polymer segment having a phosphonium group in a side chain and a hydrophilic polymer segment.
  • the phosphonium group may be a phosphonium group having an octanol/water partition coefficient of -1 or more, when measured as a phosphonium cation obtained by introducing the phosphonium group into the 5-position carbon of N-methylpentanamide.
  • the number of the phosphonium groups in the cationic polymer segment may be 5 or more.
  • the cationic polymer segment may be composed of a cationic polyamino acid containing a phosphonium group-containing amino acid residue having a phosphonium group in a side chain.
  • the ratio of the number of the phosphonium group-containing amino acid residues to the degree of polymerization of the cationic polyamino acid may be 5% or more.
  • the hydrophilic polymer segment may be composed of poly(ethylene glycol), polysaccharide, poly(vinylpyrrolidone), poly(vinyl alcohol), poly(acrylamide), poly(acrylic acid), poly(methacrylamide), poly(methacrylic acid), poly(methacrylic acid ester), poly(acrylic acid ester), polyamino acid, poly(malic acid), or a derivative thereof.
  • the cationic polyamino acid according to an embodiment of the present invention comprises a phosphonium group-containing amino acid residue having a phosphonium group in the side chain.
  • the phosphonium group may be a phosphonium group having an octanol/water partition coefficient of -1 or more, when measured as a phosphonium cation obtained by introducing the phosphonium group into the 5-carbon of N-methylpentanamide.
  • the ratio of the number of the phosphonium group-containing amino acid residues to the degree of polymerization of the cationic polyamino acid according to [7] or [8] above may be 5% or more.
  • the degree of polymerization of the cationic polyamino acid according to any one of [7] to [9] above may be 5 or more and 150 or less.
  • a polymer particle according to an embodiment of the present invention comprises a cationic block copolymer according to any one of [1] to [6] above and/or a cationic polyamino acid according to any one of [7] to [10] above.
  • the polymer particles according to [11] above may be micelles or vesicles.
  • the polymer particles according to the above [11] or [12] may further comprise a drug.
  • the drug may be at least one selected from a nucleic acid and a protein.
  • a pharmaceutical composition according to an embodiment of the present invention comprises the cationic block copolymer according to any one of [1] to [6] above and/or the cationic polyamino acid according to any one of [7] to [10] above, and a drug.
  • a cationic polymer having a phosphonium group as the cationic group as a DDS carrier, it is possible to improve the structural stability of the polymer particles and/or the stability of the substance encapsulated in the polymer particles.
  • FIG. 1A shows the CLogP of phosphonium cations or ammonium cations in which various phosphonium groups or amino groups have been introduced at the 5-carbon position of N-methylpentanamide.
  • FIG. 1B shows the CLogP of phosphonium cations in which various phosphonium groups are introduced at the 5-carbon position of N-methylpentanamide.
  • Figure 2 shows the fluorescence spectrum and FRET ratio of mRNA-encapsulating micelles doubly labeled with Cy3/Cy5 when excited at 520 nm.
  • FIG. 3 shows the results of evaluating the FBS resistance of mRNA-encapsulating micelles.
  • FIG. 4 shows the results of evaluating intracellular protein expression in mRNA-encapsulated micelles.
  • FIG. 5 shows the results of evaluating the blood retention of mRNA-encapsulated micelles.
  • FIG. 6 shows the results of stability evaluation 1 of ASO-encapsulated micelles.
  • FIG. 7 shows the results of stability evaluation 2 of ASO-encapsulated micelles.
  • FIG. 8 shows fluorescence observation images of U87 cells in an evaluation of the cellular uptake of cRGD-modified mRNA-encapsulating micelles.
  • FIG. 9 shows the analysis results of the fluorescence intensity in the fluorescence observation images obtained in the evaluation of the cellular uptake of cRGD-modified mRNA-encapsulating micelles.
  • FIG. 10 shows the results of evaluating intracellular protein expression in cRGD-modified mRNA-encapsulating micelles.
  • FIG. 11 shows the results of evaluating the blood retention of cRGD-modified mRNA-encapsulating micelles.
  • Figure 12 shows the results of in vivo expression evaluation of mRNA-encapsulated micelles.
  • FIG. 13 shows the results of evaluating the stability of mRNA-encapsulating micelles.
  • FIG. 14 shows the titration curves of PEG-PLL, PEG-PLL(TPP), and PEG-PAsp(DET(TPP)).
  • FIG. 15 shows fluorescence images of cells incubated with Cy5-labeled mRNA-encapsulating micelles prepared using various cationic polymers.
  • FIG. 16(a) shows the fluorescence intensity derived from Cy5 in cells incubated with Cy5-labeled mRNA-encapsulated micelles prepared using various cationic polymers
  • FIG. 16(b) shows the Pearson's coefficient values calculated to evaluate the colocalization of mRNA and lysosomes in the above cells.
  • FIG. 17 shows the results of evaluating intracellular protein expression in Fab′-modified mRNA-encapsulating micelles.
  • Figure 18 shows the results of in vivo expression evaluation of Fab'-modified mRNA-encapsulated micelles.
  • a cationic polymer having a phosphonium group in a side chain is provided.
  • conventional DDS carriers cationic polymers having an amino group as a cationic group have been used, but the cationic polymer according to the embodiment of the present invention has a phosphonium group as a cationic group.
  • the reason for obtaining such an effect is that, although it does not limit the present invention, the presence of a phosphonium group strengthens intermolecular interactions such as electrostatic interactions and hydrophobic interactions.
  • the term "cationic polymer” includes those in the form of salts.
  • reference to a “cationic polymer” includes, unless clearly incompatible, pharmacologically acceptable salts of the cationic polymer, such as hydrochloride, hydrobromide, maleate, mesylate, phosphate, sulfate, tartrate, acetate, lactate, etc., even if not explicitly stated.
  • the cationic polymer is a cationic block copolymer having a cationic polymer segment having a phosphonium group in a side chain and a hydrophilic polymer segment.
  • the hydrophilic polymer segment has a higher hydrophilicity than the cationic polymer segment.
  • the hydrophilicity of the hydrophilic polymer segment is preferably higher than that of the cationic polymer segment to such an extent that the cationic block copolymer can aggregate in an aqueous solution such as water, PBS, blood, etc.
  • the cationic polymer does not have two or more polymer segments with different hydrophilicity to the extent that they can form micelles, and is composed only of cationic polymer segments having phosphonium groups in their side chains. Therefore, the cationic polymer of the second embodiment typically does not form micelles by itself in water.
  • the cationic polymer of the second embodiment is also called a homopolycation.
  • the cationic polymer of the first embodiment is a cationic block copolymer having a cationic polymer segment having a phosphonium group in a side chain and a hydrophilic polymer segment, and is typically a diblock copolymer represented by the formula: A-L-B (wherein A represents a hydrophilic polymer segment, B represents a cationic polymer segment, and L represents a linking portion between the hydrophilic polymer segment and the cationic polymer segment, and represents a single bond or any suitable linking group).
  • the phosphonium group in the cationic polymer segment is typically a quaternary phosphonium group.
  • the phosphonium group one that can increase the hydrophobicity of the cationic polymer segment can be appropriately used.
  • the phosphonium group ([P + ]) one that gives a polyamino acid having a higher hydrophobicity than the original polylysine when the side chain (-(CH 2 ) 4 -NH 2 ) of polylysine is changed to a 4-phosphonium butyl group (-(CH 2 ) 4 -[P + ]) can be used.
  • the phosphonium group contained in the cationic polymer segment is represented, for example, by the following formula (i):
  • the cationic polymer segment can have one or more types of phosphonium groups.
  • R 1 , R 2 , and R 3 each independently represent an optionally substituted linear or branched alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, an optionally substituted cycloalkyl group having 3 to 12 carbon atoms, an optionally substituted cycloalkylalkyl group having 3 to 12 carbon atoms, or an optionally substituted aromatic hydrocarbon group having 6 to 27 carbon atoms, and * represents a bond.
  • the linear or branched alkyl group having 1 to 12 carbon atoms is preferably a linear or branched alkyl group having 1 to 6 carbon atoms, more preferably a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms.
  • the cycloalkyl group having 3 to 12 carbon atoms is preferably a cycloalkyl group having 3 to 8 carbon atoms, more preferably a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms.
  • the cycloalkylalkyl group having 3 to 12 carbon atoms is preferably a linear or branched alkyl group having 1 to 3 carbon atoms substituted with a cycloalkyl group having 3 to 8 carbon atoms, more preferably a methyl group or an ethyl group substituted with a cycloalkyl group having 3 to 6 carbon atoms, for example, a cyclohexylmethyl group, a cyclohexylethyl group, etc.
  • the aromatic hydrocarbon group having 6 to 27 carbon atoms is, for example, an aryl group or an aralkyl group, for example, a phenyl group, a naphthyl group, a benzyl group, and a phenethyl group are preferable, and a phenyl group or a benzyl group is more preferable.
  • examples of the substituent include C1-6 alkoxy groups (e.g., methoxy and ethoxy groups), aryloxy groups (e.g., phenyloxy and tolyloxy groups), aryl C1-3 oxy groups, hydroxyl groups, C1-6 haloalkyl groups (e.g., trifluoromethyl groups), and halogen atoms (e.g., chlorine and fluorine).
  • examples of the substituent include C1-3 alkyl groups in addition to the above.
  • At least one of R 1 , R 2 , and R 3 represents an aryl group or an aralkyl group which may be substituted.
  • the cationic polymer segment has a phosphonium group containing an aromatic ring, so that the polymer particle structure can be stabilized by ⁇ - ⁇ stacking interaction.
  • aryl groups or aralkyl groups are preferably phenyl groups or benzyl groups which may be substituted.
  • two or three of R 1 , R 2 , and R 3 are aryl groups or aralkyl groups, they may be the same group or different groups.
  • the phosphonium group may be a phosphonium group having an octanol/ water partition coefficient of ⁇ 1 or more when measured (calculated ) as a phosphonium cation obtained by introducing the phosphonium group into the carbon at the 5-position of N-methylpentanamide (CH 3 NHCOCH 2 CH 2 CH 2 CH 3 ). More specifically, the phosphonium group may be a phosphonium group that, when introduced into the carbon at the 5-position of N-methylpentanamide, forms a phosphonium cation having an octanol/water partition coefficient of, for example, ⁇ 1 or more, preferably ⁇ 0.5 or more, more preferably 0 or more.
  • the octanol/water partition coefficient of the phosphonium cation may be, for example, 1 or more and 8 or less, or, for example, 3 or more and 7 or less.
  • the octanol/water partition coefficient is a predicted value (CLogP) calculated from the structure of a compound using the software "ChemDraw.”
  • Figures 1A and 1B show the CLogP of phosphonium cations or ammonium cations in which various phosphonium groups or amino groups are introduced at the 5-carbon of N-methylpentanamide.
  • the phosphonium group may be bonded directly to the main chain or via a linking group.
  • the linking group is not particularly limited as long as the effects of the present invention can be obtained.
  • the linking group may be, for example, a C1-C6 linear or branched alkylene group, an amide bond (-NHCO-), an ester bond (-COO-), an ether bond (-O-), an environmentally responsive bond (disulfide bond, boronic acid ester, etc.), a secondary or tertiary amino group, a carbonyl group, or any combination thereof.
  • linking group examples include "-alkylene group-amide bond-alkylene group-", “-alkylene group-ester bond-alkylene group-", “-alkylene group-amide bond-alkylene group-secondary amino group-alkylene group-amide bond-alkylene group-”, and the like.
  • the length of the linking group (the number of atoms connecting the main chain atom and the phosphorus atom of the phosphonium group at the shortest distance) may be, for example, 1 to 30, 1 to 25, 1 to 20, 3 to 18, or 5 to 15.
  • the phosphonium group is introduced into the side chain of the polymer by a reaction utilizing a reactive site (amino group, carboxyl group, hydroxyl group, thiol group, amide bond, ester bond, etc.) present in the side chain, and the cationic polymer obtained in this manner may have a larger CLogP than the polymer before the introduction.
  • a reactive site amino group, carboxyl group, hydroxyl group, thiol group, amide bond, ester bond, etc.
  • the cationic polymer segment may have a cationic group other than a phosphonium group in the side chain, for example, a primary to tertiary amino group or a guanidino group.
  • the charge amount per molecule of the cationic block copolymer at physiological pH (7.4) may vary depending on the charge amount of the anionic substance to be delivered, and may be, for example, +5 or more and +150 or less, preferably +10 or more and +125 or less, and more preferably +15 or more and +100 or less.
  • the cationic polymer segment has a cationic group having a pKa of, for example, 5 or more and less than 7.4, preferably 5.5 to 7.2, and more preferably 6 to 7.
  • a cationic group is in a deprotonated state in a physiological pH environment, and therefore does not exhibit cytotoxicity, and can be protonated in the acidic environment in the endosome.
  • a cationic polymer segment containing multiple such cationic groups can form a cationic polymer having a pKa of, for example, 5 or more and less than 7.4, preferably 5.5 to 7.2, and more preferably 6 to 7, and can form a polymer particle that can suitably escape from an endosome by the proton sponge effect.
  • the number of cationic groups having the above pKa possessed by the cationic polymer segment can be, for example, 5 to 200, or, for example, 10 to 100, and may be 15 or more, 20 or more, or 30 or more.
  • the cationic polymer segment may have only one cationic group having the above pKa in one side chain, or may have two or more.
  • the cationic polymer segment may have one or more cationic groups having the above pKa and one or more phosphonium groups in one side chain.
  • the ratio (C:N) of the carbon atom in the linking group connecting the main chain and the phosphonium group to the nitrogen atom contained in the cationic group having the above pKa may be, for example, 1:1 to 50:1, or, for example, 2:1 to 25:1.
  • the ratio of the number of cationic groups having the above pKa to the degree of polymerization of the cationic polymer segment may be, for example, 10% to 300%, or, for example, 20% to 150%.
  • the ratio of the number of cationic groups having the above pKa to the number of phosphonium groups in the cationic polymer segment (the former:the latter) may be, for example, 1:100 to 100:1, or, for example, 1:50 to 50:1.
  • the pKa of the cationic polymer segment may be measured, for example, by acid-base titration.
  • the pKa of the cationic group present in the side chain of the cationic polymer segment may vary depending on the chain length of the cationic polymer segment, the structure of the hydrophilic polymer segment, the structure from the main chain to the cationic group, etc., but the cationic group capable of exhibiting the above pKa may be a secondary amino group or a tertiary amino group.
  • Specific examples of the group containing a cationic group capable of exhibiting the above pKa include the following groups and groups represented by the formulae (v) to (viii) described below.
  • the number of phosphonium groups in the cationic polymer segment is not limited as long as the effects of the present invention are obtained, and may be, for example, 5 or more.
  • the number of phosphonium groups in the cationic polymer segment may be preferably 5 or more and 150 or less, more preferably 10 or more and 125 or less, and even more preferably 15 or more and 100 or less.
  • cationic polymer constituting the cationic polymer segment one that can have a phosphonium group in the side chain can be appropriately selected and used, and examples of such polymers that can be used include polyamino acids, polysaccharides, acrylic polymers, amide polymers, and vinyl polymers.
  • a cationic polymer having a phosphonium group in the side chain can be obtained by synthesizing a polymer using a phosphonium group-containing monomer, synthesizing a polymer having a functional group such as an amino group (preferably a primary amino group), a carboxyl group, a hydroxyl group, or a thiol group in the side chain, and introducing a phosphonium group into the side chain by a reaction using the functional group.
  • the degree of polymerization of the cationic polymer can be, for example, 5 to 150, 10 to 125, or 15 to 100.
  • the cationic polymer segment is preferably composed of a cationic polyamino acid because of its high biocompatibility and ease of synthesis.
  • the cationic polyamino acid includes a phosphonium group-containing amino acid residue having a phosphonium group in the side chain.
  • the number of phosphonium groups in the phosphonium group-containing amino acid residue is not particularly limited and may be, for example, 1.
  • the phosphonium group is typically linked to a carbon in the main chain via a linking group.
  • the linking group is as described above.
  • the phosphonium group can be introduced, for example, into an amino acid residue having a reactive site in the side chain by a reaction utilizing the reactive site.
  • the CLogP of the phosphonium group-containing amino acid thus obtained can be equal to or greater than the CLogP of the amino acid before introduction, and is, for example, 1 or more, 1.5 or more, 2 to 10, or 3 to 8 greater than the CLogP of the amino acid before introduction.
  • the CLogP of the phosphonium group-containing amino acid thus obtained is 1 or more, 1.5 or more, 2 to 10, or 3 to 8 greater than the CLogP of lysine.
  • the phosphonium group-containing amino acid residue is a derivative residue of a carboxyl group-containing amino acid such as aspartic acid, glutamic acid, etc., or a derivative residue of an amino group-containing amino acid such as lysine, ornithine, etc.
  • Specific examples of the phosphonium group-containing amino acid residue are shown in the following formulae (ii) to (iv).
  • R 4a and R 4b each independently represent a methylene group or an ethylene group
  • R 5a and R 5b each independently represent -O-, -NH-, or -NH-(CH 2 ) p0 -[NH-(CH 2 ) q0 -] r0 NHCO-
  • p0, q0, and r0 each independently represent an integer of 1 to 5
  • R 6a , R 6b , and R 6c each independently represent an optionally substituted linear or branched alkylene group having 1 to 8 carbon atoms
  • R 7 represents an optionally substituted linear or branched alkylene group having 1 to 6 carbon atoms
  • [P + ] represents a phosphonium group.
  • R 5a and R 5b are each independently preferably 2 or 3, more preferably 2. Additionally, r0 is preferably an integer of 1 to 3. In one embodiment, R 5a and R 5b may each independently be -NH-(CH 2 ) 2 -NH-(CH 2 ) 2 -NHCO-.
  • R 6a , R 6b , and R 6c are each independently preferably an optionally substituted linear or branched alkylene group having 1 to 6 carbon atoms, and more preferably an optionally substituted linear or branched alkylene group having 2 to 5 carbon atoms.
  • R7 is preferably a linear or branched alkylene group having 2 to 5 carbon atoms which may be substituted, more preferably a linear alkylene group having 3 to 4 carbon atoms which may be substituted, and even more preferably an n-butylene group.
  • examples of the substituent when substituted include the same groups as the substituent when the alkyl group R 1 , R 2 , or R 3 in formula (i) is substituted.
  • [P + ] is preferably a phosphonium group of the formula (i).
  • the cationic polyamino acid may contain amino acid residues that do not contain phosphonium groups, so long as the effects of the present invention can be obtained.
  • amino acid residues that do not contain phosphonium groups include amino acid residues that have cationic groups other than phosphonium groups in their side chains (hereinafter sometimes referred to as "other cationic amino acid residues"), nonionic amino acid residues that do not have ionic groups in their side chains, and anionic amino acid residues that have anionic groups in their side chains.
  • cationic amino acid residues include lysine residues, homolysine residues, ornithine residues, arginine residues, homoarginine residues, and histidine residues.
  • cationic amino acid residues have multiple amino groups and can increase the protonation rate in the acidic environment within the endosome, and therefore can contribute to endosomal escape by the proton sponge effect.
  • p1 to p4 and q1 to q6 are each, independently of one another, preferably 2 or 3, and more preferably 2.
  • r1 and r2 are each, independently of one another, preferably an integer of 1 to 3.
  • formula (v) is -NH-(CH 2 ) 2 -NH-(CH 2 ) 2 -NH 2 .
  • nonionic amino acid residues include hydrophobic amino acid residues having a hydrophobic side chain.
  • hydrophobic amino acid residues include nonpolar natural amino acid residues such as leucine, isoleucine, phenylalanine, methionine, and tryptophan, and amino acid derivative residues in which a hydrophobic group has been introduced into the side chain of a natural amino acid.
  • Preferred examples of the hydrophobic group to be introduced include saturated or unsaturated linear or branched aliphatic hydrocarbon groups having 6 to 27 carbon atoms, aromatic hydrocarbon groups having 6 to 27 carbon atoms, and sterol residues.
  • hydrophobic amino acid residues include residues of aspartic acid derivatives (e.g., 1-benzyl aspartate, 4-benzyl aspartate), glutamic acid derivatives (e.g., 1-benzyl glutamate, 5-benzyl glutamate), and lysine derivatives (N 6 -carbobenzyloxy-L-lysine).
  • anionic amino acid residues include aspartic acid residues, glutamic acid residues, and the like.
  • Cationic polyamino acids can contain one or more types of amino acid residues, each of which is a phosphonium group-containing amino acid residue, other cationic amino acid residues, anionic amino acid residues, or nonionic amino acid residues.
  • the number of phosphonium group-containing amino acid residues contained in the cationic polyamino acid is, for example, 5 or more, preferably 10 or more, more preferably 15 or more, and for example, 150 or less, preferably 125 or less, more preferably 100 or less.
  • the degree of polymerization of the cationic polyamino acid is, for example, 5 to 150, 10 to 125, or 15 to 100.
  • the amount of charge derived from the side chain of the cationic polyamino acid at physiological pH (7.4) is, for example, +5 to +150, preferably +10 to +125, and more preferably +15 to +100.
  • hydrophilic polymer segment is composed of a hydrophilic polymer having a higher hydrophilicity than the cationic polymer segment.
  • hydrophilic polymers include poly(ethylene glycol), polysaccharides, poly(vinylpyrrolidone), poly(vinyl alcohol), poly(acrylamide), poly(acrylic acid), poly(methacrylamide), poly(methacrylic acid), poly(methacrylic acid ester), poly(acrylic acid ester), polyamino acids (e.g., polyaspartic acid, polyglutamic acid, polyserine, etc.), poly(malic acid), or derivatives thereof.
  • nonionic polymers are preferred, and poly(ethylene glycol) is more preferred. Terminally reactive polyethylene glycols of various molecular weights having various functional groups at the terminals are commercially available and can be easily obtained.
  • the number average molecular weight of the hydrophilic polymer is, for example, 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 5 , preferably 5 ⁇ 10 3 to 8 ⁇ 10 4 , and more preferably 1 ⁇ 10 4 to 5 ⁇ 10 4 .
  • the hydrophilic polymer segment may have a target binding site bound thereto.
  • the target binding site is a site that can recognize and specifically bind to target cells, target tissues, etc., such as tumor cells, neovascular cells, inflammatory cells, and cells surrounding these.
  • target binding sites include antibodies or functional fragments thereof, hormones, cytokines, growth factors, and their receptors, and ligands such as sugar chains.
  • the cationic block copolymer in one embodiment of the present invention is represented by the following formula (I) or (II).
  • R 4a , R 4b , R 5a , R 5b , R 6a , R 6b , R 6c , and R 7 are as defined in relation to formulas (ii)-(iv);
  • R 8a and R 8b each independently represent a hydrogen atom or an optionally substituted linear or branched alkyl group having 1 to 12 carbon atoms;
  • R 9 represents a hydrogen atom, an optionally substituted linear or branched alkyl group having 1 to 12 carbon atoms, or an optionally substituted linear or branched alkylcarbonyl group having 1 to 24 carbon atoms;
  • R 10 represents an optionally substituted linear or branched alkylene group having 1 to 6 carbon atoms;
  • R 11 represents a hydroxyl group, an oxybenzyl group, an -O-R 11a group
  • examples of the straight-chain or branched alkyl group having 1 to 12 carbon atoms defined by R 8a , R 8b , R 9 , R 11a , and R 11b include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, a sec-butyl group, a tert-butyl group, an n-hexyl group, a decyl group, and an undecyl group.
  • the linear or branched alkyl moiety having 1 to 12 carbon atoms in the linear or branched alkylcarbonyl group having 1 to 24 carbon atoms defined by R9 can be exemplified by the above-mentioned examples.
  • Examples of the alkyl moiety having 13 or more carbon atoms include a tridecyl group, a tetradecyl group, a pentadecyl group, a nonadecyl group, a docosanyl group, and a tetracosyl group.
  • R 10 is preferably a linear or branched alkylene group having 2 to 5 carbon atoms which may be substituted, more preferably a linear alkylene group having 3 to 4 carbon atoms which may be substituted, and even more preferably an n-butylene group.
  • examples of the substituent when substituted include the same groups as the substituent when the alkyl group R 1 , R 2 , or R 3 is substituted.
  • a group containing a target binding site may be introduced into R 8a and R 8b .
  • the target binding site may be appropriately selected depending on the purpose.
  • Specific examples of the target binding site include folic acid, hyaluronic acid, sugars (e.g., glucose, galactose, mannose, lactose), oligopeptides (e.g., RGD motifs such as cRGD, NGR motifs), monoclonal antibodies (e.g., bevacizumab, trastuzumab, infliximab, rituximab) or functional fragments thereof.
  • the target binding site may be introduced directly or via any suitable linking group into R 8a and R 8b .
  • the target binding site is introduced into R 8a and R 8b via a linking group containing a short-chain polyalkylene glycol and/or an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms.
  • the polyalkylene glycol is an alkylene glycol having 2 or 3 carbon atoms, preferably polyethylene glycol, and the degree of polymerization is, for example, 1 to 10, preferably 2 to 7.
  • R 14a and R 14b are preferably a group represented by formula (v), more preferably -NH-(CH 2 ) 2 -NH-(CH 2 ) 2 -NH 2 .
  • [P + ] is preferably a phosphonium group of the formula (i).
  • L 1 and L 2 are each a linking moiety between the polyethylene glycol segment and the polyamino acid segment, and may be any suitable linking group.
  • the linking group represented by L 1 is, for example, a linking group selected from -NH-, -O-, -OL 1a -NH-, -CO-, -CH 2 -, and -OL 1a -SL 1a -NH- (wherein each L 1a is independently an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms).
  • the linking group represented by L 2 is, for example, a linking group selected from --OCO-L 2a --CO-- and --NHCO-L 2a --CO-- (wherein L 2a is an alkylene group having 1 to 6 carbon atoms).
  • k represents the number of repeating units of ethylene glycol (or oxyethylene). k is preferably an integer between 30 and 2,000, more preferably between 40 and 1,500, and even more preferably between 50 and 1,000.
  • n is preferably an integer of 10 to 125, more preferably an integer of 15 to 100, for example, 30 to 100, or for example, 40 to 100.
  • m is, for example, 5 to 150, preferably 10 to 125, more preferably 15 to 100.
  • m/(m+n) ⁇ 100 is preferably 10, more preferably 15 or more, even more preferably 20 or more, and even more preferably 25 or more.
  • (n1+n2)/(m+n) ⁇ 100 can be, for example, 5 to 60, 10 to 50, or 15 to 40.
  • (n1+n2)/(m+n) ⁇ 100 is within this range, a cationic block copolymer with excellent endosomal escape ability can be obtained.
  • the amino acid residues whose repeat numbers are m1, m2, m3, n1, n2, or n3 may each have the same structure or different structures.
  • the cationic block copolymer may have two or more types of phosphonium group-containing amino acid residues.
  • the cationic block copolymer can be prepared by any suitable synthesis method.
  • a phosphonium group can also be introduced by introducing a polyalkylene polyamine into the side chain by ester amide exchange reaction, and reacting the resulting amino group at the end of the side chain with a phosphonium group-containing compound.
  • diethylenetriamine (DET) can be introduced into the side chain of the polyamino acid to generate an Asp(DET) residue or a Glu(DET) residue, and the amino group at the end of the side chain of these residues can be reacted with a phosphonium group-containing carboxylic acid compound to introduce a phosphonium group.
  • a block copolymer having a group containing a target binding site introduced therein can be prepared, for example, by preparing a block copolymer having a functional group A at R 8a , preparing a compound having a target binding site and a functional group B, and reacting the functional group A with the functional group B.
  • the reaction between the functional group A and the functional group B can be carried out by click chemistry, for example, the reaction between an azide and an alkyne.
  • the block copolymer according to the embodiment of the present invention is not limited to the embodiment shown in formula (I) and formula (II).
  • the block copolymer according to the embodiment of the present invention may have a structure containing one or more other phosphonium group-containing amino acid residues as the phosphonium group-containing amino acid residue in formula (I) and formula (II). In such a structure, the total number of phosphonium group-containing amino acid residues can be m.
  • the block copolymer according to the embodiment of the present invention may contain one or more other cationic amino acid residues in formula (I) and formula (II). In this case, the total number of cationic amino acid residues can be n.
  • the block copolymer according to the embodiment of the present invention may contain one or more hydrophobic amino acid residues in formula (I) and formula (II).
  • the content ratio of hydrophobic amino acid residues can be 20% or less, 10% or less, 5% or less, or 2% or less of the total number of amino acid residues.
  • the cationic polymer of the second embodiment is a so-called homopolycation that does not have two or more polymer segments with different hydrophilicities that are capable of forming micelles, and is composed only of cationic polymer segments having phosphonium groups in their side chains.
  • the cationic polymer segment constituting the cationic polymer of the second embodiment can be described in the same manner as the cationic polymer segment that is one of the block components of the cationic block copolymer described in A-1.
  • the cationic polymer in the second embodiment is, for example, the cationic polyamino acid described in A-1.
  • the N-terminus and C-terminus of the cationic polyamino acid may each be optionally modified within the range in which the effects of the present invention can be obtained.
  • the N-terminus and C-terminus may each be, for example, the same groups as R 9 in the above formula (I) and R 11 in the above formula (II).
  • the cationic polyamino acid can be represented by the following formula (III): (Wherein, R 4a , R 4b , R 5a , R 5b , R 6a , R 6b , R 6c , R 7 , R 9 , R 10 , R 13a , R 13b , R 14a , R 14b , [P + ], ml, m2, m3, n1, n2 and n3 are as defined in relation to formula (iv) and (I) or (II); R 12 represents a hydroxyl group, an oxybenzyl group, an -O-R 12a group, or an -NH-R 12b group, where R 12a and R 12b each independently represent an optionally substituted linear or branched alkyl group having 1 to 12 carbon atoms.
  • Examples of the linear or branched alkyl group having 1 to 12 carbon atoms defined by R 12a and R 12b include a methyl group, an ethyl group, an n-propyl group, an isopropyl group, an n-butyl group, a sec-butyl group, a tert-butyl group, an n-hexyl group, a decyl group, and an undecyl group, etc.
  • examples of the substituent include the same groups as the substituents when the alkyl group R 1 , R 2 , or R 3 is substituted.
  • polymer particle comprising the cationic polymer described in Section A, more specifically, a polymer particle comprising the cationic block copolymer described in Section A-1 and/or the cationic polyamino acid (hereinafter also referred to as homopolycation) described in Section A-2.
  • the polymer particle may further comprise a drug.
  • the drug may be encapsulated in the polymer particle.
  • drugs Any appropriate drug can be used as the drug depending on the purpose.
  • drugs include nucleic acids, proteins (antibodies, hormones, enzymes, etc.), other physiologically active substances, fluorescent dyes, contrast agents, etc.
  • anionic drugs e.g., nucleic acids
  • anionic drugs that have a negative charge at physiological pH are preferably used.
  • Nucleic acid refers to poly- or oligonucleotides whose basic units are nucleotides consisting of purine or pyrimidine bases, pentose, and phosphate, and examples thereof include oligo- or poly-double-stranded RNA, oligo- or poly-double-stranded DNA, oligo- or poly-single-stranded DNA, and oligo- or poly-single-stranded RNA. Examples also include oligo- or poly-double-stranded nucleic acids and oligo- or poly-single-stranded nucleic acids in which RNA and DNA are mixed in one strand.
  • the nucleotides contained in the nucleic acid may be natural or chemically modified non-natural, and may also have molecules such as amino groups, thiol groups, and fluorescent compounds added to them.
  • the base length of the nucleic acid (in the case of a double-stranded nucleic acid, the base length of the portion forming the double strand) is not particularly limited, and may be a relatively short-chain nucleic acid of less than 100 bases, for example, 10 to 80 bases, and preferably about 15 to 50 bases, or a relatively long-chain nucleic acid of 100 bases or more, preferably 100 to 20,000 bases, and more preferably about 200 to 10,000 bases.
  • nucleic acids examples include plasmid DNA, donor DNA, mRNA, sgRNA, crRNA, siRNA, micro RNA, shRNA, antisense nucleic acid, decoy nucleic acid, aptamer, ribozyme, etc.
  • Nucleic acids can be used alone or in combination of two or more types.
  • the polymer particles are micelles containing the cationic block copolymer described in A-1.
  • the cationic block copolymer is typically aggregated with the hydrophilic polymer segments facing outward and the cationic polymer segments facing inward.
  • the drug is preferably an anionic drug.
  • Anionic drugs can be stably held within the micelle by electrostatic interactions with the cationic polymer segments that are aligned toward the inside of the micelle.
  • the particle size of the micelles can be, for example, 10 nm to 500 nm, preferably 20 nm to 300 nm.
  • the micelles can be prepared by any suitable method.
  • the micelles can be obtained by adding the cationic block copolymer to an aqueous solution, which may be buffered as necessary, and stirring the mixture.
  • the micelles encapsulating a drug can be obtained by mixing the cationic block copolymer and a drug in an aqueous solution, which may be buffered as necessary.
  • the ratio (C/A) of the molar concentration (C) of the cationic groups in the cationic block copolymer that are protonated in the aqueous solution to the molar concentration (A) of the anionic groups in the anionic drug is, for example, 1 or more and 10 or less, preferably 1.2 or more and 7 or less, and more preferably 1.5 or more and 5 or less.
  • the micelles can have target binding sites, if desired.
  • the number of target binding sites per micelle can be, for example, one or more, and can range from 1 to 100.
  • the target binding sites can be, for example, introduced at the ends of hydrophilic polymer segments of the cationic block copolymer, making them exposed on the outer surface of the micelle.
  • Introduction of the target binding site into the cationic block copolymer can be carried out before the formation of the micelle.
  • a cationic block copolymer having a target binding site introduced at the end of a hydrophilic polymer segment is prepared, and the cationic block copolymer having the target binding site introduced is used to form a micelle.
  • a cationic block copolymer having a target binding site introduced and a cationic block copolymer having no target binding site introduced may be used in combination. By using these in combination, the number of target binding sites per micelle can be suitably adjusted.
  • the blending ratio of the cationic block copolymer having a target binding site introduced and the cationic block copolymer having no target binding site introduced can be appropriately set according to the purpose, and can be, for example, 1:99 to 100:0, preferably 5:95 to 95:5.
  • the target binding site can be introduced into the cationic block copolymer after the formation of the micelle.
  • a cationic block copolymer having a functional group C at the end of the hydrophilic polymer segment is prepared, and after forming a micelle using the cationic block copolymer, a compound having a target binding site and a functional group D is brought into contact with the micelle to react the functional group C with the functional group D.
  • a cationic block copolymer having a functional group C and a cationic block copolymer not having the functional group C may be used in combination.
  • the polymer particles are vesicles (also called PICsomes) containing the cationic block copolymers described in A-1 or the homopolycations described in A-2.
  • Vesicles are hollow structures formed by a closed bilayer membrane.
  • Vesicles are hollow microparticles formed by, for example, PIC of the cationic block copolymer described in section A-1 and a homopolyanion. Specifically, in an aqueous medium, a PIC layer is formed between the cationic polymer segment of the cationic block copolymer and the homopolyanion, and a hydrophilic polymer segment is disposed so as to cover the PIC layer, thereby forming a vesicle.
  • homopolyanions that can be used include polyaspartic acid and polyglutamic acid.
  • the vesicle is a hollow microparticle formed by PIC of the homopolycation and anionic block copolymer described in section A-2.
  • the anionic block copolymer contains an anionic polymer segment and a hydrophilic polymer segment.
  • a layer of PIC is formed between the anionic polymer segment of the anionic block copolymer and the homopolycation, and a hydrophilic polymer segment is arranged so as to cover the layer of PIC, thereby forming a vesicle.
  • the anionic block copolymer a polyethylene glycol-polyaspartic acid block copolymer, a polyethylene glycol-polyglutamic acid block copolymer, etc. can be used.
  • the particle size of the vesicle can be, for example, 10 nm to 500 nm, preferably 20 nm to 300 nm.
  • the vesicles can be prepared by any suitable method.
  • the vesicles can be obtained by adding the above combination of polymer components to an aqueous solution, which is buffered as necessary, and stirring the mixture.
  • the vesicles containing a drug can be obtained by mixing the above combination of polymer components and a drug in an aqueous solution, which is buffered as necessary, and the drug can be encapsulated in the vesicles.
  • the ratio (C/A) of the molar concentration (C) of the cationic groups in the polymer components that are protonated in the aqueous solution to the molar concentration (A) of the anionic groups is, for example, 0.6 to 1.4, preferably 0.8 to 1.2, and more preferably 0.95 to 1.05.
  • the vesicle may have a target binding site, if necessary.
  • the number of target binding sites per vesicle may be, for example, one or more, and may range from 1 to 100.
  • the target binding site may be introduced, for example, at the end of a hydrophilic polymer segment of a block copolymer, such that it can be exposed on the outer surface of the vesicle. The introduction of the target binding site into the block copolymer is as described above.
  • the polymer particles are complexes (PIC) of homopolycations and anionic drugs as described in A-2.
  • the particle size of the complex can be, for example, 10 nm to 500 nm, preferably 20 nm to 300 nm.
  • the complex can be prepared by any suitable method.
  • the complex can be obtained by mixing the homopolycation and the anionic drug in an aqueous solution, which is buffered as necessary.
  • the ratio (C/A) of the molar concentration (C) of the cationic groups in the homopolycation that are protonated in the aqueous solution to the molar concentration (A) of the anionic groups in the anionic drug is, for example, 1 or more and 10 or less, preferably 1.2 or more and 7 or less, and more preferably 1.5 or more and 5 or less.
  • composition comprising a cationic polymer as described in Section A, more specifically a cationic block copolymer as described in Section A-1 and/or a homopolycation as described in Section A-2, and a drug.
  • the pharmaceutical composition may further comprise an additional polymer component (e.g., an anionic block copolymer, a homopolyanion) for forming the polymer particles as described in Section B.
  • the additional polymer component and the drug are as described in Section B.
  • the dosage form of the pharmaceutical composition may be any dosage form depending on the purpose, for example, subcutaneous injection, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, intracerebral injection, etc.
  • Additives such as isotonicity agents, buffers, stabilizers, pH adjusters, etc. are appropriately blended into the pharmaceutical composition depending on the dosage form.
  • PEG-poly(L-lysine) a block copolymer having a polyethylene glycol segment and a polylysine segment
  • PEG-PLL a synthesis method similar to that of the block copolymer described in the examples of WO2013/162041
  • PEG-poly(L-lysine) may be referred to as PEG-PLL.
  • the mass of the polyethylene glycol (PEG) constituting PEG-PLL was 12 kDa, and the degree of polymerization of polylysine was 68.
  • TPP triphenylphosphonium
  • the TPP introduction rate (m/(m+n) x 100) was 26%, 45%, 75%, and 97%.
  • the TPP introduction rate can correspond to the ratio of the number of phosphonium group-containing amino acid residues to the degree of polymerization of the cationic polyamino acid.
  • the polymer solution (PEG-PLL or PEG-PLL (TPP)) and the mRNA solution (50 ng/ ⁇ L) were mixed in a volume ratio of 1:2 under a vortex so that the molar ratio (C:P) of the cationic functional group (C) of the polymer to the phosphate group (P) of the mRNA was 3:1, and the mixture was allowed to stand on ice for 10 minutes.
  • C:P molar ratio
  • C cationic functional group
  • P phosphate group
  • mRNA micelles encapsulating mRNA
  • the particle size and polydispersity index (PDI) of the obtained mRNA-encapsulated micelles were measured by dynamic light scattering (DLS). DLS measurements were performed using a Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) at 25°C and a detection angle of 90°. The results are shown in Table 1.
  • PEG-PLL can produce small-sized mRNA-encapsulated PIC micelles with a narrow particle size distribution.
  • PEG-PLL (TPP) can produce small-sized micelles even for long-chain mRNA, for which it is difficult to form small-sized micelles using PEG-PLL.
  • FRET ratio Cy5 (680 nm) fluorescence intensity / (Cy3 (570 nm) fluorescence intensity + Cy5 (680 nm) fluorescence intensity)
  • RNA-to-cDNA Kit Applied Biosystems, Foster City, CA, USA
  • Quantitative PCR was performed using Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
  • TaqMan assay was used for PCR, and the following primer and probe set was used for the target (EGFP).
  • the FBS resistance of mRNA-encapsulated micelles increases depending on the TPP introduction rate.
  • TPP PEG-PLL
  • TPP introduction rate 26%, 45%, 75%, or 97%
  • PEG-PLL and Gluc mRNA intracellular protein expression of mRNA-encapsulating micelles prepared in the same manner as in Test Example 4 was evaluated in vitro. Specifically, the procedure is as follows. HuH-7 cells were cultured in RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) containing 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) or Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM, Sigma-Aldrich).
  • HuH-7 cells were seeded in a 96-well plate at 10,000 cells/well and incubated for 2 days, after which mRNA-encapsulated micelles or free mRNA was added to the wells at 400 ng mRNA/well.
  • the medium was collected 24 and 48 hours after the addition, and the amount of luminescence in the medium was measured using a Renilla Luciferase Assay system (Promega) and a GloMax 96 Microplate Luminometer.
  • the results are shown in Figure 4 (in Figure 4, the left column shows the amount of luminescence (RLU) in the medium 24 hours after the addition of mRNA, and the right column shows the amount of luminescence (RLU) in the medium 48 hours after the addition of mRNA).
  • mRNA-encapsulated micelles showed higher protein expression than mRNA alone (free mRNA), and the amount of protein expression increased in a TPP introduction rate-dependent manner in the case of mRNA-encapsulated micelles.
  • TPP PEG-PLL
  • Fluc mRNA PEG-PLL
  • the mRNA-encapsulated micelles dissolved in 10 mM HEPES solution containing 150 mM NaCl were intravenously administered to BALB/c mice (female, 7 weeks old, Charles River Laboratories Japan Inc., Kanagawa, Japan) (20 ⁇ g mRNA/mouse).
  • the mRNA-encapsulated micelles prepared using PEG-PLL showed significantly higher blood retention than the mRNA-encapsulated micelles prepared using PEG-PLL.
  • ASOs antisense nucleic acids
  • Alexa647-mouse MALAT1 ASO (5'- GGGTC AGCTGCCAATGCTAG -3') (SEQ ID NO: 4)
  • LNA locked nucleic acid
  • ASO and polymer PEG-PLL or PEG-PLL (TPP) with a TPP introduction rate of 97%) were each dissolved in 10 mM HEPES buffer (pH 7.3).
  • the polymer solution (PEG-PLL or PEG-PLL (TPP)) and ASO solution (50 ng/ ⁇ L) were mixed in a volume ratio of 1:2 under a vortex so that the molar ratio (C:P) of the cationic functional group of the polymer to the phosphate group of the ASO was 3:1, and the mixture was allowed to stand for 10 minutes.
  • C:P molar ratio
  • micelles encapsulating ASO ASO-encapsulating micelles
  • the particle size and polydispersity index (PDI) of the resulting ASO-encapsulated micelles were measured by dynamic light scattering (DLS). DLS measurements were performed using a Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) at 25°C and a detection angle of 173°. The results are shown in Table 2.
  • Table 2 shows that whether PEG-PLL or PEG-PLL(TPP) is used, small-sized PIC micelles with a narrow particle size distribution can be obtained. It can also be seen that PEG-PLL(TPP) produces PIC micelles that are smaller in size and have a narrower particle size distribution than PEG-PLL.
  • Test Example 10 Stability Evaluation 1 of ASO-Encapsulated Micelles
  • the stability of the ASO-encapsulating micelles prepared in Test Example 9 under high salt concentrations was evaluated as follows. The ASO-encapsulated micelles were added to 10 mM HEPES (pH 7.3) containing 0 M or 2 M NaCl so that the final ASO concentration was 34.8 ng/ ⁇ L, and incubated at 37° C. for 15 minutes. The particle size distribution of the ASO-encapsulated micelles was then measured by DLS. The results are shown in FIG.
  • micellar structure of ASO-encapsulated micelles prepared using PEG-PLL collapsed, whereas the micellar structure of ASO-encapsulated micelles prepared using PEG-PLL(TPP) was maintained.
  • Test Example 11 Stability evaluation 2 of ASO-encapsulated micelles
  • the polyanion resistance of the ASO-encapsulating micelles prepared in Test Example 9 was evaluated as follows.
  • the ASO-encapsulated micelles were mixed with dextran sulfate having a molecular weight of 5000 (Wako Pure Chemical Industrial Ltd., Osaka, Japan) so that the S/P ratio ([molar concentration of sulfate group in dextran sulfate]/[molar concentration of phosphate group in ASO]) was 2 (final ASO concentration was 34.8 ng/ ⁇ L) and incubated at 37° C. for 15 minutes.
  • the particle size distribution of the ASO-encapsulated micelles was then measured by DLS. The results are shown in FIG. 7 together with the measurement results of a sample incubated in the same manner in the absence of dextran sulfate.
  • micellar structure of ASO-encapsulated micelles prepared using PEG-PLL collapsed, whereas the micellar structure was maintained in ASO-encapsulated micelles prepared using PEG-PLL (TPP).
  • PEG-PLL PEG-PLL
  • TPP Triphenylphosphonium
  • N3-PEG-PLL PEG molecular weight 12 kDa, lysine polymerization degree 70
  • DMT-MM 4-(4,6-dimethyl-1,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorpholinium chloride n-hydrate
  • DMT-MM 4-(Carboxybutyl)triphenylphosphonium bromide
  • N3-PEG-PLL (20 mg) and 4-(Carboxybutyl)triphenylphosphonium Bromide (43.7 mg) were dissolved in 50 mM NaHCO 3 /MeOH (3 ml/9 ml), and DMT-MM (90 mg) was added every 2 hours for a total of three times, and the mixture was allowed to react overnight at 4°C. After the reaction, the mixture was dialyzed (MWCO: 6-8 kDa) against distilled water to remove unreacted materials. The solution after dialysis was freeze-dried to obtain white powder N3-PEG-PLL (TPP). The TPP introduction rate in the obtained N3-PEG-PLL (TPP) was 90%.
  • cRGD-PEG4-DBCO was synthesized. 6 mg of Cyclo RGDfK (ChemScene, Monmouth Junction, NJ, USA) and 1.3 mg of DBCO-PEG4-NHS (Broadpharm, San Diego, CA, USA) were mixed in 1.5 mL of DMSO and reacted overnight at room temperature. Then, 6 mL of distilled water was added and the mixture was reacted for 24 hours. Finally, N3-PEG-PLL (TPP) (20 mg) and DMSO (2.4 mL) were added to the cRGD-PEG4-DBCO solution (4 mL) obtained as described above, and the mixture was allowed to react at room temperature overnight.
  • TPP N3-PEG-PLL
  • DMSO 2.4 mL
  • the mixture was dialyzed (MWCO: 6-8 kDa) against distilled water to remove unreacted materials.
  • the dialyzed solution was freeze-dried to obtain cRGD-PEG-PLL (TPP) as a white powder.
  • the polymer mixture (cRGD-PEG-PLL(TPP)/PEG-PLL(TPP)) and the mRNA solution (50 ng/ ⁇ L) were mixed in a volume ratio of 1:2 under a vortex so that the molar ratio of the cationic functional group of the polymer mixture to the phosphate group of the mRNA was 3:1, and the mixture was allowed to stand on ice for 10 minutes.
  • the particle size and polydispersity index (PDI) of the resulting cRGD-modified mRNA-encapsulating micelles (cRGD modification rate ([cRGD-PEG-PLL(TPP)]/([cRGD-PEG-PLL(TPP)]+[PEG-PLL(TPP)]) ⁇ 100): 0, 10, 25, 50, 100%) were measured by dynamic light scattering (DLS). DLS measurements were performed using a Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) at 25° C. and a detection angle of 90°. The results are shown in Table 3.
  • Table 3 shows that micelles can be formed using cRGD-modified cationic block copolymers.
  • cRGD modification rate e.g., cRGD modification rate > 50%.
  • U87 cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Sigma-Aldrich) containing 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). U87 cells were seeded in an 8-well cover glass chamber (IWAKI AGC Techno Glass Co. Ltd., Shizuoka, Japan), and after 24 hours of incubation, Cy5-labeled mRNA-encapsulated micelles (cRGD modification rate: 0, 10, 25, 50%) were added to 300 ng mRNA/well.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS penicillin/streptomycin
  • cRGD modification rate 10%, 25%, 50%
  • cRGD modification rate 0%
  • mRNA-encapsulated micelles with cRGD modification rates of 10% and 25% showed increased cellular uptake compared to mRNA-encapsulated micelles with a cRGD modification rate of 50%.
  • cRGD-modified mRNA-encapsulated micelles can decrease with increasing cRGD modification rate (for example, the stability of cRGD-modified mRNA-encapsulated micelles in 50% FBS is 0%>10%>25%>50% (cRGD modification rate)), the above results are considered to indicate the effect of increased uptake due to cRGD modification and decreased micelle stability due to increased cRGD modification rate.
  • mRNA-encapsulated micelles with a cRGD modification rate of 10% showed higher Fluc expression than mRNA-encapsulated micelles with a cRGD modification rate of 0%.
  • Test Example 16 Evaluation of blood retention of mRNA-encapsulated micelles
  • the cRGD-modified FLuc mRNA-encapsulated micelles (cRGD modification rate: 10%) prepared in Test Example 13 were dissolved in 10 mM HEPES solution containing 150 mM NaCl, and intravenously administered to BALB/c mice (female, 7 weeks old; Charles River Laboratories Japan Inc., Kanagawa, Japan) (20 ⁇ g mRNA/mouse). 2 ⁇ L of blood was collected from the tail vein 5, 10, 15, 30, and 60 minutes after administration, and added to RLT buffer (Qiagen, Hilden, Germany) containing 1% 2-mercaptoethanol.
  • RLT buffer Qiagen, Hilden, Germany
  • RNA was purified using RNeasy Mini Preparation Kit (Qiagen) and reverse transcribed into single-stranded cDNA using High Capacity RNA-to-cDNA Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Quantitative PCR was performed using Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). The results are shown in FIG. 11 together with the evaluation of blood retention of mRNA-encapsulating micelles formed using PEG-PLL (TPP) or PEG-PLL with a TPP introduction rate of 97% in Test Example 8.
  • TPP PEG-PLL
  • the cRGD-modified mRNA-encapsulating micelles (indicated by "C” in the figure) and non-cRGD-modified mRNA-encapsulating micelles (indicated by “B” in the figure) formed using cationic block copolymers having TPP in the side chains (PEG-PLL (TPP), cRGD-PEG-PLL (TPP)) have significantly improved blood retention compared to the mRNA-encapsulating micelles (indicated by "A” in the figure) formed using PEG-PLL.
  • the cRGD-modified mRNA-encapsulating micelles have slightly inferior blood retention compared to the non-cRGD-modified mRNA-encapsulating micelles. This is thought to be due to the rapid tissue migration of micelles due to the cRGD modification and the reduced stability of micelles due to the cRGD modification.
  • Fluc mRNA-encapsulated micelles As the Fluc mRNA-encapsulated micelles, Fluc mRNA-encapsulated micelles (cRGD modification rate: 0%) formed by PEG-PLL (97% TPP) with a TPP introduction rate of 97% and Fluc mRNA-encapsulated micelles (cRGD modification rate: 0%) formed by PEG-PLL were used. Tumors were sampled 24 hours after administration. Four equivalent amounts of Cell Culture Lysis Reagent (Promega, Madison, WI, USA) were added to the tumor weight, and the beads were crushed to obtain tumor lysates. The amount of FLuc luminescence in the tumor lysate was measured using a Luciferase Assay System (Promega) and a GloMax 96 Microplate Luminometer (Promega). The results are shown in FIG.
  • Fluc mRNA-encapsulated micelles formed with PEG-PLL (97% TPP) resulted in higher Fluc expression in the tumor than Fluc mRNA-encapsulated micelles formed with PEG-PLL.
  • mRNA-encapsulated micelles were prepared using Cy3/Cy5 double-labeled Fluc mRNA and various PEG-PLL (TPP) or PEG-PLL with different TPP introduction rates. The presence or absence of mRNA release from the micelles was evaluated using FRET that occurs when Cy3/Cy5-labeled mRNA is in close proximity (e.g., encapsulated in a micelle).
  • DSS Dextran sodium sulfate
  • the mRNA-encapsulated micelles prepared using PEG-PLL showed higher resistance to polyanions than the mRNA-encapsulated micelles prepared using PEG-PLL.
  • the mass of PEG constituting PEG-PAsp(DET) was 12 kDa, and the degree of polymerization of PAsp(DET) was 68.
  • PEG-PAsp(DET) (20 mg) and 4-(Carboxybutyl)triphenylphosphonium bromide (2 equivalent moles relative to the side chain primary amine) were dissolved in 50 mM NaHCO 3 /MeOH (3 ml/9 ml), and DMT-MM (90 mg) was added every 2 hours for a total of three times, and the mixture was reacted at 4° C. for 6 hours.
  • both PEG-PLL and PEG-PLL(TPP) showed inflection points at pH>7, with PEG-PLL(TPP) showing a more obvious inflection point.
  • PEG-PLL(TPP) shows a more obvious inflection point.
  • the titration curve of PEG-PAsp(DET(TPP)) also showed an inflection point at acidic pH, with an estimated pKa value of 5.919.
  • the secondary amines in the side chains of PEG-PAsp(DET(TPP)) can contribute to the buffering capacity at acidic pH. Since the pH of endosomes changes from about 7 to about 5.5 during maturation, it is speculated that polymers with pKa values within this pH range can promote escape from endosomes by ionization.
  • Cy5-labeled mRNA-encapsulating micelles were prepared in the same manner as above using each polymer and Cy5-labeled mRNA prepared using Label IT Cy5 Labeling Kit (Mirus Bio LLC., Madison, WI). B16F10 cells were seeded in an 8-well chamber (IWAKI AGC Techno Glass Co. Ltd., Shizuoka, Japan) at 12,500 cells/ well and incubated for 24 hours at 37°C under 5% CO2 using RPMI-1640 containing 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin.
  • Cy5-labeled mRNA-encapsulated micelles were then added to each well at 300 ng Fluc mRNA/well and incubated for 4 hours. The cells were then washed three times with D-PBS. Cell nuclei and lysosomes were stained with Hoechst 33342 (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) and LysoTracker TM Green DND-26 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA), respectively. Stained cells were observed using an LSM 880 (Carl Zeiss, Germany). The excitation wavelengths were 405 nm for Hoechst 33342, 488 nm for LysoTracker, and 633 nm for Cy5. The observed images are shown in FIG.
  • FIG. 16(a) data in the figure show the mean ⁇ S.D. for 15 cells.
  • Pearson's coefficient value was calculated for each cell using ImageJ software. The results are shown in FIG. 16(b) (data in the figure show the mean ⁇ s.e.m. for 20 cells). Significance tests were performed by one-way ANOVA and Bonferroni post-hoc test.
  • the mRNA-encapsulated micelles prepared using PEG-PLL(TPP) and the mRNA-encapsulated micelles prepared using PEG-PAsp(DET(TPP)) showed a higher amount of mRNA uptake into the cells than the mRNA-encapsulated micelles prepared using PEG-PLL, and as shown in Figure 16(b), the mRNA-encapsulated micelles prepared using PEG-PAsp(DET(TPP)) showed a reduced co-localization of mRNA with late endosomes/lysosomes.
  • TPP PEG-PLL
  • DET PEG-PAsp
  • mRNA Fluc mRNA was purchased from Trilink Biotechnologies (San Diego, CA, USA). NanoLuc (Nluc) mRNA was prepared by in vitro transcription using Nluc plasmid (Promega, Madison, WI, USA) as a template. mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Kit (Ambion, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) was used for in vitro transcription, and RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) was used for mRNA purification.
  • Fab'-PEG4-DBCO Fab' was prepared by fragmenting the antibody InVivoMAb anti-mouse CD71 (Bio X Cell, Lebanon, NH) against transferrin receptor 1 (TfR1). The Fc portion of the antibody was digested with pepsin in 200 mM acetate buffer (pH 4.4) at 37 degrees for 24 hours to obtain (Fab') 2 . The buffer was replaced with 10 mM phosphate buffer (PB) (pH 7.4) containing 500 mM NaCl by ultrafiltration (MWCO: 30 kDa), and (Fab') 2 was purified by size exclusion chromatography (SEC).
  • PB mM phosphate buffer
  • SEC size exclusion chromatography
  • Fab' was prepared by reducing (Fab') 2.
  • (Fab') 2 (1 mg/mL) was incubated with 0.2 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) in 10 mM PB containing 500 mM NaCl at room temperature for 2 hours.
  • TCEP tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride
  • mRNA-encapsulated micelles mRNA (Fluc mRNA or NLuc mRNA) and polymer (Azide-PEG-PAsp (DET (TPP)) or Azide-PEG-PLL (TPP)) were each dissolved in 10 mM HEPES buffer (pH 7.3).
  • the PEG mass of Azide-PEG-PLL (TPP) was 12 kDa, the degree of polymerization was 68, and the TPP introduction rate was 100%.
  • the polymer solution (Azide-PEG-PAsp (DET (TPP)) or Azide-PEG-PLL (TPP)) and the mRNA solution (50 ng/ ⁇ L) were mixed in a volume ratio of 1:2 under a vortex mixer so that the molar ratio of the cationic groups of the polymer to the phosphate groups of the mRNA was 3:1, and the mixture was allowed to stand on ice for 10 minutes.
  • the particle size and polydispersity index (PDI) of the obtained Fluc mRNA-encapsulated micelles were measured by dynamic light scattering (DLS). DLS measurements were performed using a Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) at 25°C and a detection angle of 90°. The results are shown in Table 4.
  • Fab' Modification to the Surface of mRNA-Encapsulating Micelle 0.05, 0.1, or 0.2 equivalents of Fab'-PEG4-DBCO were added to the azide groups on the surface of the mRNA-encapsulating micelles prepared in 4 above, and incubated at 4°C for 1 hour.
  • the particle size and polydispersity index (PDI) of the Fab'-modified Fluc mRNA-encapsulating micelles obtained as described above were measured by dynamic light scattering (DLS) using a Zetasizer Nano ZS90 (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) at 25°C and a detection angle of 90°.
  • the number of Fab' bonds per micelle was measured by fluorescence correlation spectroscopy (FCS).
  • B16F10 cells were cultured in RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) containing 10% FBS and 1% penicillin/streptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). B16F10 cells are TfR1-positive cells. Specifically, B16F10 cells were seeded (15,000 cells/well) in a 96-well plate, and after 24 hours of incubation, the Fab'-modified NLuc mRNA-encapsulating micelles prepared in Test Example 20 were added to the plate at 165 ng mRNA/well.
  • Test Example 22 Evaluation of in vivo protein expression of Fab′-modified mRNA-encapsulating micelles
  • 0.05 eq of the Fab'-modified NLuc mRNA-encapsulated micelles and non-Fab'-modified NLuc mRNA-encapsulated micelles prepared in Test Example 20 were added to a 10 mM HEPES solution containing 150 mM NaCl, and the solution was intravenously administered to a BALB/c mouse (female, 7 weeks old; Charles River Laboratories Japan Inc., Kanagawa, Japan) (10 ⁇ g Nluc mRNA/mouse). 24 hours after administration, organs (brain, liver, spleen, kidney, lung, heart) were collected.
  • DET(TPP)/m was delivered to the brain in vivo and was able to express NLuc in the brain, and the expression level was superior in DET(TPP)/m modified with Fab' of anti-TfR1 antibody.
  • the cationic polymer of the present invention can be suitably used as a DDS carrier for anionic drugs such as nucleic acids and proteins.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

本発明は、側鎖にホスホニウム基を有するカチオン性ポリマーセグメントと、親水性ポリマーセグメントと、を有する、カチオン性ブロックコポリマー；側鎖にホスホニウム基を有するホスホニウム基含有アミノ酸残基を含む、カチオン性ポリアミノ酸；上記カチオン性ブロックコポリマーおよび／または上記カチオン性ポリアミノ酸を含む、ポリマー粒子；および、上記カチオン性ブロックコポリマーおよび／または上記カチオン性ポリアミノ酸と、薬剤と、を含む、医薬組成物；を提供する。

Description

ホスホニウム基を有するカチオン性ポリマーおよびこれを含むポリマー粒子または医薬組成物
　本発明は、ホスホニウム基を有するカチオン性ポリマー（例えば、カチオン性ブロックコポリマーまたはカチオン性ポリアミノ酸）、および、当該カチオン性ポリマーを含むポリマー粒子または医薬組成物に関する。
　近年、アンチセンス核酸、ｓｉＲＮＡ等の核酸医薬、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ等の治療用タンパク質の遺伝子をコードした核酸からなる遺伝子医薬、さらには、ｓｇＲＮＡ（ｓｉｎｇｌｅ　ｇｕｉｄｅ　ＲＮＡ）とＣａｓ９ヌクレアーゼとを用いたゲノム編集技術等が急速に発展している。また、抗体、ホルモン、酵素等のタンパク質医薬についても、関心が高まっている。
　アニオン性薬剤を目的の細胞、組織等に送達するための薬剤送達システム（ＤＤＳ）用キャリアとしては、静電相互作用を駆動力としてアニオン性薬剤と複合体（ポリイオンコンプレックス：ＰＩＣ）を形成可能なカチオン性ポリマーが提案されている。例えば、特許文献１には、カチオン性ポリマーセグメントと親水性ポリマーセグメントとを含むカチオン性ブロックコポリマーと核酸とが、ミセル状のＰＩＣ（ＰＩＣミセル）を形成することが開示されている。
　しかしながら、従来技術で得られるＰＩＣミセルにおいては、生体内アニオン性物質によってミセルが崩壊する場合や分解酵素がミセル内部に侵入してアニオン性薬剤を分解する場合がある。
特開２０１７－００２２８０
　本発明の主たる目的は、ミセル等のポリマー粒子の構造安定性および／またはポリマー粒子に内包された物質の安定性を向上できるキャリアを提供することにある。
［１］本発明の実施形態によるカチオン性ブロックコポリマーは、側鎖にホスホニウム基を有するカチオン性ポリマーセグメントと、親水性ポリマーセグメントと、を有する。
［２］上記［１］に記載のカチオン性ブロックコポリマーにおいて、上記ホスホニウム基が、Ｎ－メチルペンタンアミドの５位の炭素に導入して得られるホスホニウムカチオンとして測定した場合に、－１以上のオクタノール／水分配係数を有するホスホニウム基であり得る。
［３］上記［１］または［２］に記載のカチオン性ブロックコポリマーにおいて、上記カチオン性ポリマーセグメントが有する上記ホスホニウム基の数が、５以上であり得る。
［４］上記［１］から［３］のいずれかに記載のカチオン性ブロックコポリマーにおいて、上記カチオン性ポリマーセグメントが、側鎖にホスホニウム基を有するホスホニウム基含有アミノ酸残基を含むカチオン性ポリアミノ酸で構成され得る。
［５］上記［４］に記載のカチオン性ブロックコポリマーにおいて、上記カチオン性ポリアミノ酸の重合度に対する上記ホスホニウム基含有アミノ酸残基数の割合が、５％以上であり得る。
［６］上記［１］から［５］のいずれかに記載のカチオン性ブロックコポリマーにおいて、上記親水性ポリマーセグメントが、ポリ（エチレングリコール）、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリアミノ酸、ポリ（リンゴ酸）、またはこれらの誘導体で構成され得る。
［７］本発明の実施形態によるカチオン性ポリアミノ酸は、側鎖にホスホニウム基を有するホスホニウム基含有アミノ酸残基を含む。
［８］上記［７］に記載のカチオン性ポリアミノ酸において、上記ホスホニウム基が、Ｎ－メチルペンタンアミドの５位の炭素に導入して得られるホスホニウムカチオンとして測定した場合に、－１以上のオクタノール／水分配係数を有するホスホニウム基であり得る。
［９］上記［７］または［８］に記載のカチオン性ポリアミノ酸の重合度に対する上記ホスホニウム基含有アミノ酸残基数の割合が、５％以上であり得る。
［１０］上記［７］から［９］のいずれかに記載のカチオン性ポリアミノ酸の重合度が５以上１５０以下であり得る。
［１１］本発明の実施形態によるポリマー粒子は、上記［１］から［６］のいずれかに記載のカチオン性ブロックコポリマーおよび／または上記［７］から［１０］のいずれかに記載のカチオン性ポリアミノ酸を含む。
［１２］上記［１１］に記載のポリマー粒子は、ミセルまたはベシクルであり得る。
［１３］上記［１１］または［１２］に記載のポリマー粒子は、薬剤をさらに含み得る。
［１４］上記［１３］に記載のポリマー粒子において、上記薬剤が、核酸およびタンパク質から選択される少なくとも一種であり得る。
［１５］本発明の実施形態による医薬組成物は、上記［１］から［６］のいずれかに記載のカチオン性ブロックコポリマーおよび／または上記［７］から［１０］のいずれかに記載の上記カチオン性ポリアミノ酸と、薬剤と、を含む。
　本発明によれば、カチオン性基としてホスホニウム基を有するカチオン性ポリマーをＤＤＳキャリアとして用いることにより、ポリマー粒子の構造安定性および／またはポリマー粒子に内包された物質の安定性を向上することができる。
図１Ａは、Ｎ－メチルペンタンアミドの５位の炭素に種々のホスホニウム基またはアミノ基が導入されたホスホニウムカチオンまたはアンモニウムカチオンのＣＬｏｇＰを示す。 図１Ｂは、Ｎ－メチルペンタンアミドの５位の炭素に種々のホスホニウム基が導入されたホスホニウムカチオンのＣＬｏｇＰを示す。 図２は、Ｃｙ３／Ｃｙ５でダブル標識したｍＲＮＡ内包ミセルを、５２０ｎｍで励起した際の蛍光スペクトルおよびＦＲＥＴ　ｒａｔｉｏを示す。 図３は、ｍＲＮＡ内包ミセルのＦＢＳ耐性評価の結果を示す。 図４は、ｍＲＮＡ内包ミセルの細胞内タンパク質発現評価の結果を示す。 図５は、ｍＲＮＡ内包ミセルの血中滞留性評価の結果を示す。 図６は、ＡＳＯ内包ミセルの安定性評価１の結果を示す。 図７は、ＡＳＯ内包ミセルの安定性評価２の結果を示す。 図８は、ｃＲＧＤ修飾ｍＲＮＡ内包ミセルの細胞取り込み評価におけるＵ８７細胞の蛍光観察画像を示す。 図９は、ｃＲＧＤ修飾ｍＲＮＡ内包ミセルの細胞取り込み評価で得られた蛍光観察画像における蛍光強度の解析結果を示す。 図１０は、ｃＲＧＤ修飾ｍＲＮＡ内包ミセルの細胞内タンパク質発現評価の結果を示す。 図１１は、ｃＲＧＤ修飾ｍＲＮＡ内包ミセルの血中滞留性評価の結果を示す。 図１２は、ｍＲＮＡ内包ミセルのｉｎ　ｖｉｖｏ発現評価の結果を示す。 図１３は、ｍＲＮＡ内包ミセルの安定性評価の結果を示す。 図１４は、ＰＥＧ－ＰＬＬ、ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）、およびＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ＴＰＰ））の滴定曲線を示す。 図１５は、種々のカチオン性ポリマーを用いて調製したＣｙ５標識ｍＲＮＡ内包ミセルとインキュベーションした細胞の蛍光観察画像を示す。 図１６（ａ）は、種々のカチオン性ポリマーを用いて調製したＣｙ５標識ｍＲＮＡ内包ミセルとインキュベーションした細胞におけるＣｙ５由来の蛍光強度を示し、図１６（ｂ）は、上記細胞におけるｍＲＮＡとリソソームの共局在を評価するために算出したピアソンの係数値を示す。 図１７は、Ｆａｂ’修飾ｍＲＮＡ内包ミセルの細胞内タンパク質発現評価の結果を示す。 図１８は、Ｆａｂ’修飾ｍＲＮＡ内包ミセルのｉｎ　ｖｉｖｏ発現評価の結果を示す。
　以下、本発明の好ましい実施形態について説明するが、本発明はこれらの実施形態には限定されない。各実施形態は、文脈からそのような理解が明らかに不適切である場合を除いて適宜組み合わせることができる。また、本明細書中で、数値範囲を表す「～」は、その上限および下限の数値を含む。
Ａ．カチオン性ポリマー
　本発明の１つの局面によれば、側鎖にホスホニウム基を有するカチオン性ポリマーが提供される。従来のＤＤＳキャリアにおいては、カチオン性基としてアミノ基を有するカチオン性ポリマーが用いられてきたが、本発明の実施形態によるカチオン性ポリマーは、カチオン性基としてホスホニウム基を有する。これにより、構造安定性に優れたポリマー粒子を形成することができるとともに、ポリマー粒子中に内包された物質を安定に保持することができる。このような効果が得られる理由としては、本発明を何ら限定するものではないが、ホスホニウム基を有することにより、静電相互作用、疎水性相互作用等の分子間相互作用が強化されることが挙げられる。
　本発明の実施形態において、「カチオン性ポリマー」は、塩の形態にあるものを含む。よって、本明細書において、「カチオン性ポリマー」との言及は、それが明らかに不適合である場合を除き、明示されていない場合にも、カチオン性ポリマーの薬理学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、マレイン酸塩、メシル酸塩、リン酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、酢酸塩、乳酸塩等、を含む。
　本発明の第１の実施形態において、カチオン性ポリマーは、側鎖にホスホニウム基を有するカチオン性ポリマーセグメントと、親水性ポリマーセグメントと、を有する、カチオン性ブロックコポリマーである。第１の実施形態のカチオン性ポリマー（カチオン性ブロックコポリマー）において、親水性ポリマーセグメントは、カチオン性ポリマーセグメントよりも高い親水性度を有する。親水性ポリマーセグメントの親水性度は、好ましくは、水、ＰＢＳ、血液等の水溶液中においてカチオン性ブロックコポリマーが親水性ポリマーセグメントを外側に向けるとともにカチオン性ポリマーセグメントを内側に向けた状態で凝集してミセルを形成し得る程度にカチオン性ポリマーセグメントよりも高い。
　本発明の第２の実施形態において、カチオン性ポリマーは、ミセルを形成し得るほど親水性度の異なる２つ以上のポリマーセグメントを有さず、側鎖にホスホニウム基を有するカチオン性ポリマーセグメントのみから構成される。よって、第２の実施形態のカチオン性ポリマーは、代表的には、水中において単独でミセルを形成しない。第２の実施形態のカチオン性ポリマーは、ホモポリカチオンとも称される。
Ａ－１．第１の実施形態
　第１の実施形態のカチオン性ポリマーは、側鎖にホスホニウム基を有するカチオン性ポリマーセグメントと、親水性ポリマーセグメントと、を有するカチオン性ブロックコポリマーであり、代表的には、式：Ａ－Ｌ－Ｂ（式中、Ａは親水性ポリマーセグメントを表し、Ｂはカチオン性ポリマーセグメントを表し、Ｌは、親水性ポリマーセグメントとカチオン性ポリマーセグメントとの連結部分であり、単結合または任意な適切な連結基を表す。）で表されるジブロック体である。
Ａ－１－１．カチオン性ポリマーセグメント
　カチオン性ポリマーセグメントが有するホスホニウム基は、代表的には４級ホスホニウム基である。当該ホスホニウム基としては、カチオン性ポリマーセグメントの疎水性度を高めることができるものが適宜用いられ得る。例えば、ホスホニウム基（［Ｐ＋］）としては、ポリリシンの側鎖（－（ＣＨ２）４－ＮＨ２）を４－ホスホニウムブチル基（－（ＣＨ２）４－［Ｐ＋］）に変えた場合に元のポリリシンよりも高い疎水性度を有するポリアミノ酸を与えるものを用いることができる。
　カチオン性ポリマーセグメントが有するホスホニウム基は、例えば下記式（ｉ）で表される。カチオン性ポリマーセグメントは、一種または二種以上のホスホニウム基を有することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
 （式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３はそれぞれ独立して、置換されていてもよい直鎖または分岐の炭素数１～１２のアルキル基、置換されていてもよい炭素数３～１２のシクロアルキル基、置換されていてもよい炭素数３～１２のシクロアルキルアルキル基、または置換されていてもよい炭素数６～２７の芳香族炭化水素基を表し、＊は結合手を表す。）
　上記Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３に関して、直鎖または分岐の炭素数１～１２のアルキル基は、好ましくは直鎖または分岐の炭素数１～６のアルキル基、より好ましくは直鎖または分岐の炭素数１～３のアルキル基である。炭素数３～１２のシクロアルキル基は、好ましくは炭素数３～８のシクロアルキル基、より好ましくは炭素数３～６のシクロアルキル基である。炭素数３～１２のシクロアルキルアルキル基は、好ましくは炭素数３～８のシクロアルキル基で置換された直鎖または分岐の炭素数１～３のアルキル基であり、より好ましくは炭素数３～６のシクロアルキル基で置換されたメチル基またはエチル基であり、例えば、シクロヘキシルメチル基、シクロヘキシルエチル基等を例示できる。炭素数６～２７の芳香族炭化水素基は、例えばアリール基またはアラルキル基であり、フェニル基、ナフチル基、ベンジル基、フェネチル基を好ましく例示することができ、フェニル基またはベンジル基がより好ましい。
　上記直鎖もしくは分岐アルキル基、シクロアルキル基、またはシクロアルキルアルキル基が置換されている場合の置換基としては、Ｃ１－６アルコキシ基（例えば、メトキシ基、エトキシ基）、アリールオキシ基（例えば、フェニルオキシ基、トリルオキシ基）、アリールＣ１－３オキシ基、ヒドロキシル基、Ｃ１－６ハロアルキル基（例えば、トリフルオロメチル基）、ハロゲン原子（例えば、塩素およびフッ素）等を挙げることができる。上記芳香族炭化水素基の芳香環が置換されている場合の置換基としては、これらに加えてＣ１－３アルキル基を挙げることができる。芳香環に導入される置換基の数は制限されず、芳香環は、例えばそれぞれ独立して選択される１～３の置換基で置換され得る。また、置換基の位置関係も制限されず、置換基は、オルト位、メタ位、パラ位の任意の位置に導入され得る。なお、Ｃ１－６のような記載は、炭素数１～６を意味する。
　１つの実施形態において、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の少なくとも１つがそれぞれ置換されていてもよいアリール基またはアラルキル基を表す。カチオン性ポリマーセグメントが芳香環を含むホスホニウム基を有することにより、π－πスタッキング相互作用によるポリマー粒子の構造安定化効果を得ることができる。これらのアリール基またはアラルキル基は、好ましくはそれぞれ置換されていてもよいフェニル基またはベンジル基である。Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３の２つまたは３つがアリール基またはアラルキル基である場合、これらは互いに同じ基であってもよく、異なる基であってもよい。
　１つの実施形態において、上記ホスホニウム基は、Ｎ－メチルペンタンアミド（ＣＨ３ＮＨＣＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）の５位の炭素に導入して得られるホスホニウムカチオンとして測定（算出）した場合に、－１以上のオクタノール／水分配係数を有するホスホニウム基であり得る。より具体的には、上記ホスホニウム基としては、Ｎ－メチルペンタンアミドの５位の炭素に導入されることにより、例えば－１以上、好ましくは－０．５以上、より好ましくは０以上のオクタノール／水分配係数を有するホスホニウムカチオンを形成するホスホニウム基が用いられ得る。当該ホスホニウムカチオンのオクタノール／水分配係数は、例えば１以上８以下であってよく、また例えば３以上７以下であってよい。カチオン性ポリマーセグメントがこのようなホスホニウム基を有することにより、カチオン性ブロックコポリマー間の疎水性相互作用が増大して、構造安定性に優れたポリマー粒子が形成され得る。本明細書中、上記オクタノール／水分配係数としては、ソフトウェア「ＣｈｅｍＤｒａｗ」を用いて化合物の構造から算出される予測値（ＣＬｏｇＰ）を用いる。図１Ａおよび１Ｂに、Ｎ－メチルペンタンアミドの５位の炭素に種々のホスホニウム基またはアミノ基が導入されたホスホニウムカチオンまたはアンモニウムカチオンのＣＬｏｇＰを示す。
　ホスホニウム基は、主鎖に直接結合していてもよく、連結基を介して結合していてもよい。連結基は、本発明の効果が得られる限りにおいて特に制限されない。連結基は、例えば、Ｃ１－Ｃ６直鎖または分岐アルキレン基、アミド結合（－ＮＨＣＯ－）、エステル結合（－ＣＯＯ－）、エーテル結合（－Ｏ－）、環境応答性の結合（ジスルフィド結合、ボロン酸エステル等）、２級または３級アミノ基、カルボニル基、およびこれらの任意の組み合わせであってよい。連結基の具体例としては、「－アルキレン基－アミド結合－アルキレン基－」、「－アルキレン基－エステル結合－アルキレン基－」、「－アルキレン基－アミド結合－アルキレン基－２級アミノ基－アルキレン基－アミド結合－アルキレン基－」等が挙げられる。連結基の長さ（主鎖の原子とホスホニウム基のリン原子との間を最短でつなぐ原子数）は、例えば１～３０、１～２５、１～２０、３～１８、または５～１５であり得る。１つの実施形態において、ホスホニウム基はポリマー側鎖に存在する反応点（アミノ基、カルボキシル基、ヒドロキシル基、チオール基、アミド結合、エステル結合等）を利用した反応によって当該側鎖に導入され、このようにして得られたカチオン性ポリマーは、導入前のポリマーよりも大きいＣＬｏｇＰを有し得る。
　カチオン性ポリマーセグメントは、側鎖にホスホニウム基以外のカチオン性基、例えば、１級～３級アミノ基、グアニジノ基、を有していてもよい。生理的ｐＨ（７．４）におけるカチオン性ブロックコポリマー１分子当たりの電荷量は、送達対象のアニオン性物質の電荷量等によって変化し得るが、例えば＋５以上＋１５０以下、好ましくは＋１０以上＋１２５以下、より好ましくは＋１５以上＋１００以下であり得る。
　１つの実施形態において、カチオン性ポリマーセグメントは、例えばｐＫａが５以上７．４未満、好ましくは５．５～７．２、より好ましくは６～７であるカチオン性基を有する。このようなカチオン性基は、生理的ｐＨ環境では脱プロトン化状態であることから細胞毒性を示さず、エンドソーム内酸性環境下でプロトン化し得る。よって、このようなカチオン性基を複数含むカチオン性ポリマーセグメントは、例えば５以上７．４未満、好ましくは５．５～７．２、より好ましくは６～７のｐＫａを有するカチオン性ポリマーを形成することができ、プロトンスポンジ効果によって好適にエンドソームを脱出可能なポリマー粒子を形成し得る。カチオン性ポリマーセグメントが有する上記ｐＫａを有するカチオン性基の数は、例えば５～２００、また例えば１０～１００であり得、１５以上、２０以上、または３０以上であってよい。カチオン性ポリマーセグメントは１つの側鎖に上記ｐＫａを有するカチオン性基を１つのみ有していてもよく、２つ以上有していてもよい。例えば、カチオン性ポリマーセグメントは１つの側鎖に１つまたは２つ以上の上記ｐＫａを有するカチオン性基および１つまたは２つ以上のホスホニウム基を有することができる。このとき、主鎖とホスホニウム基とを連結する連結基における炭素原子と上記ｐＫａを有するカチオン性基に含まれる窒素原子の比率（Ｃ：Ｎ）は、例えば１：１～５０：１、また例えば２：１～２５：１であり得る。カチオン性ポリマーセグメントの重合度に対する上記ｐＫａを有するカチオン性基の数の割合は、例えば１０％～３００％、また例えば２０％～１５０％であり得る。また、カチオン性ポリマーセグメントにおける上記ｐＫａを有するカチオン性基の数とホスホニウム基の数との比率（前者：後者）は例えば１：１００～１００：１、また例えば１：５０～５０：１であり得る。カチオン性ポリマーセグメントのｐＫａは、例えば酸塩基滴定法で測定することができる。
　カチオン性ポリマーセグメントの側鎖に存在するカチオン性基のｐＫａは、カチオン性ポリマーセグメントの鎖長、親水性ポリマーセグメントの構造、主鎖からカチオン性基までの構造等によって変化し得るが、上記ｐＫａを示し得るカチオン性基は、２級アミノ基または３級アミノ基であり得る。上記ｐＫａを示し得るカチオン性基を含む基の具体例としては、以下の基や後述の式（ｖ）～（ｖｉｉｉ）で表される基等が挙げられる。
　カチオン性ポリマーセグメントが有するホスホニウム基の数は、本発明の効果が得られる限りにおいて制限されず、例えば５以上である。カチオン性ポリマーセグメントが有するホスホニウム基の数は、好ましくは５以上１５０以下、より好ましくは１０以上１２５以下、さらに好ましくは１５以上１００以下であってよい。カチオン性ブロックコポリマー１分子当たりの側鎖に存在するカチオン性基の総数に対するホスホニウム基の数の割合は、例えば５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは１５％以上、さらに好ましくは２０％以上であり、さらにより好ましくは２５％以上であり、例えば１００％以下、８０％以下、または６０％以下であり得る。
　カチオン性ポリマーセグメントを構成するカチオン性ポリマーとしては、側鎖にホスホニウム基を有し得るものを適宜選択して用いることができ、例えば、ポリアミノ酸、多糖、アクリル系ポリマー、アミド系ポリマー、ビニル系ポリマー等を用いることができる。ホスホニウム基含有モノマーを用いてポリマー合成を行うこと、側鎖にアミノ基（好ましくは１級アミノ基）、カルボキシル基、ヒドロキシル基、チオール基等の官能基を有するポリマーを合成し、当該官能基を用いた反応によってホスホニウム基を側鎖に導入すること等により、側鎖にホスホニウム基を有するカチオン性ポリマーを得ることができる。カチオン性ポリマーの重合度は、例えば５～１５０、１０～１２５、または１５～１００であり得る。生体適合性が高く、また、合成が容易であることから、カチオン性ポリマーセグメントは、好ましくはカチオン性ポリアミノ酸で構成される。
　上記カチオン性ポリアミノ酸は、側鎖にホスホニウム基を有するホスホニウム基含有アミノ酸残基を含む。ホスホニウム基含有アミノ酸残基が有するホスホニウム基の数は、特に制限されず、例えば１であってよい。ホスホニウム基含有アミノ酸残基において、ホスホニウム基は、代表的には、主鎖の炭素に連結基を介して連結されている。連結基としては、上述のとおりである。ホスホニウム基は、例えば、側鎖に反応点を有するアミノ酸残基に対して、当該反応点を利用した反応によって導入され得る。また、このようにして得られるホスホニウム基含有アミノ酸のＣＬｏｇＰは、導入前のアミノ酸のＣＬｏｇＰ以上であり得、例えば導入前のアミノ酸のＣＬｏｇＰより１以上、１．５以上、２～１０、または３～８大きい。また例えば、このようにして得られるホスホニウム基含有アミノ酸のＣＬｏｇＰは、リシンのＣＬｏｇＰより１以上、１．５以上、２～１０、または３～８大きい。
　１つの実施形態において、ホスホニウム基含有アミノ酸残基は、アスパラギン酸、グルタミン酸等のカルボキシル基含有アミノ酸の誘導体残基、リシン、オルニチン等のアミノ基含有アミノ酸の誘導体残基である。ホスホニウム基含有アミノ酸残基の具体例を以下の式（ｉｉ）～（ｉｖ）に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
 （式中、
　Ｒ４ａおよびＲ４ｂは、相互に独立して、メチレン基またはエチレン基を表し、
　Ｒ５ａおよびＲ５ｂは、相互に独立して、－Ｏ－、－ＮＨ－、または－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ０－〔ＮＨ－（ＣＨ２）ｑ０－〕ｒ０ＮＨＣＯ－（ただし、ｐ０、ｑ０、およびｒ０は、相互に独立して、１～５の整数である）を表し、
　Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、およびＲ６ｃは、相互に独立して、置換されていてもよい炭素数１～８の直鎖または分岐アルキレン基を表し、
　Ｒ７は、置換されていてもよい炭素数１～６の直鎖または分岐アルキレン基を表し、
　［Ｐ＋］は、ホスホニウム基を表す。）
　Ｒ５ａおよびＲ５ｂに関して規定するｐ０およびｑ０は、相互に独立して、好ましくは２または３であり、より好ましくは２である。また、ｒ０は、好ましくは１～３の整数である。１つの実施形態において、Ｒ５ａおよびＲ５ｂは、相互に独立して、－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨＣＯ－であり得る。
　Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、およびＲ６ｃは、相互に独立して、好ましくは置換されていてもよい炭素数１～６の直鎖または分岐アルキレン基であり、より好ましくは置換されていてもよい炭素数２～５の直鎖または分岐アルキレン基である。
　Ｒ７は、好ましくは置換されていてもよい炭素数２～５の直鎖または分岐アルキレン基であり、より好ましくは置換されていてもよい炭素数３～４の直鎖アルキレン基であり、さらに好ましくはｎ－ブチレン基である。
　Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ６ｃ、およびＲ７に関して、置換された場合の置換基としては、式（ｉ）においてアルキル基であるＲ１、Ｒ２、またはＲ３が置換された場合の置換基と同様の基が例示できる。
　［Ｐ＋］は、好ましくは式（ｉ）で表されるホスホニウム基である。
　カチオン性ポリアミノ酸は、本発明の効果が得られる限りにおいて、ホスホニウム基非含有アミノ酸残基を含むことができる。ホスホニウム基非含有アミノ酸残基としては、側鎖にホスホニウム基以外のカチオン性基を有するアミノ酸残基（以下、「その他のカチオン性アミノ酸残基」と称する場合がある）、側鎖にイオン性基を有さない非イオン性アミノ酸残基、側鎖にアニオン性基を有するアニオン性アミノ酸残基が挙げられる。
　その他のカチオン性アミノ酸残基としては、リシン残基、ホモリシン残基、オルニチン残基、アルギニン残基、ホモアルギニン残基、およびヒスチジン残基等が挙げられる。また、アスパラギン酸のα－カルボキシル基（－Ｃ（Ｏ）ＯＨ）もしくはβ－カルボキシル基またはグルタミン酸のα－カルボキシル基もしくはγ－カルボキシル基の－ＯＨ部が下記式（ｖ）～（ｖｉｉｉ）のいずれかの基、好ましくは下記式（ｖ）の基で置換されたカチオン性アミノ酸残基を用いることができる。これらのカチオン性アミノ酸残基はアミノ基を複数有し、エンドソーム内酸性環境においてプロトン化率が上昇し得ることから、プロトンスポンジ効果によってエンドソーム脱出に寄与し得る。
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ１－〔ＮＨ－（ＣＨ２）ｑ１－〕ｒ１ＮＨ２      （ｖ）；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ２－Ｎ〔－（ＣＨ２）ｑ２－ＮＨ２〕２      （ｖｉ）；
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ３－Ｎ｛〔－（ＣＨ２）ｑ３－ＮＨ２〕〔－（ＣＨ２）ｑ４－ＮＨ－〕ｒ２Ｈ｝      （ｖｉｉ）；および
－ＮＨ－（ＣＨ２）ｐ４－Ｎ｛－（ＣＨ２）ｑ５－Ｎ〔－（ＣＨ２）ｑ６－ＮＨ２〕２｝２      （ｖｉｉｉ）
（式（ｖ）～（ｖｉｉｉ）において、ｐ１～ｐ４、ｑ１～ｑ６、およびｒ１～ｒ２は、それぞれ相互に独立して、１～５の整数である。）
　上記式（ｖ）～（ｖｉｉｉ）において、ｐ１～ｐ４およびｑ１～ｑ６は、それぞれ相互に独立して、好ましくは２または３であり、より好ましくは２である。また、ｒ１～ｒ２は、それぞれ相互に独立して、好ましくは１～３の整数である。１つの実施形態において、式（ｖ）は－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ２である。
　非イオン性アミノ酸残基としては、疎水性側鎖を有する疎水性アミノ酸残基が挙げられる。疎水性アミノ酸残基としては、例えば、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン等の非極性天然アミノ酸残基や、天然アミノ酸の側鎖に疎水性基が導入されたアミノ酸誘導体残基が挙げられる。導入される疎水性基としては、炭素数６～２７の飽和もしくは不飽和の直鎖または分枝状の脂肪族炭化水素基、炭素数６～２７の芳香族炭化水素基あるいはステロール残基が好ましく例示され得る。このような疎水性アミノ酸残基の具体例としては、アスパラギン酸誘導体（例えば、アスパラギン酸１－ベンジル、アスパラギン酸４－ベンジル）、グルタミン酸誘導体（例えば、グルタミン酸１－ベンジル、グルタミン酸５－ベンジル）、リシン誘導体（Ｎ６－カルボベンジルオキシ－Ｌ－リシン）等の残基が挙げられる。アニオン性アミノ酸残基としては、アスパラギン酸残基、グルタミン酸残基等が挙げられる。
　カチオン性ポリアミノ酸は、ホスホニウム基含有アミノ酸残基、その他のカチオン性アミノ酸残基、アニオン性アミノ酸残基、または非イオン性アミノ酸残基として、それぞれ、１種または２種以上のアミノ酸残基を含むことができる。
　カチオン性ポリアミノ酸におけるホスホニウム基含有アミノ酸残基の含有割合（含有割合（％）＝カチオン性ポリアミノ酸におけるホスホニウム基含有アミノ酸残基数／カチオン性ポリアミノ酸の重合度×１００）は、例えば５％以上、好ましくは１０％以上、より好ましくは１５％以上、さらに好ましくは２０％以上であり、さらにより好ましくは２５％以上であり、例えば１００％以下である。カチオン性ポリアミノ酸に含まれるホスホニウム基含有アミノ酸残基数は、例えば５以上、好ましくは１０以上、より好ましくは１５以上であり、例えば１５０以下、好ましくは１２５以下、より好ましくは１００以下である。
　カチオン性ポリアミノ酸におけるカチオン性アミノ酸残基の含有割合、すなわち、カチオン性ポリアミノ酸におけるホスホニウム基含有アミノ酸残基およびその他のカチオン性アミノ酸残基の合計含有割合（合計含有割合（％）＝カチオン性ポリアミノ酸におけるホスホニウム基含有アミノ酸残基およびその他のカチオン性アミノ酸残基の総数／カチオン性ポリアミノ酸の重合度×１００）は、例えば８０％以上、９０％以上、９５％以上、または９８％以上であり、上限は１００％であってよい。
　カチオン性ポリアミノ酸の重合度は、例えば５以上１５０以下、１０以上１２５以下、または１５以上１００以下である。カチオン性ポリアミノ酸の生理的ｐＨ（７．４）における側鎖由来の電荷量は、例えば＋５以上＋１５０以下、好ましくは＋１０以上＋１２５以下、より好ましくは＋１５以上＋１００以下である。
Ａ－１－２．親水性ポリマーセグメント
　親水性ポリマーセグメントは、カチオン性ポリマーセグメントよりも高い親水性度を有する親水性ポリマーによって構成される。親水性ポリマーの具体例としては、ポリ（エチレングリコール）、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリアミノ酸（例えば、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリセリン等）、ポリ（リンゴ酸）、またはこれらの誘導体が挙げられる。これらのなかでも、非イオン性のポリマーが好ましく、ポリ（エチレングリコール）がより好ましい。末端に種々の官能基を有する種々の分子量の末端反応性ポリエチレングリコールが市販されており、容易に入手することができる。
　親水性ポリマーの数平均分子量は、例えば１×１０３～１×１０５であり、好ましくは５×１０３～８×１０４であり、より好ましくは１×１０４～５×１０４である。
　親水性ポリマーセグメントには、標的結合部位が結合していてもよい。標的結合部位とは、腫瘍細胞、新生血管細胞、炎症細胞、およびそれらの周辺細胞等の標的細胞、標的組織等を認識し、特異的に結合し得る部位である。標的結合部位としては、抗体またはその機能的断片、ホルモン、サイトカイン、成長因子、およびこれらのレセプター、糖鎖等のリガンドを用いることができる。
Ａ－１－３．カチオン性ブロックコポリマーの具体例
　本発明の１つの実施形態におけるカチオン性ブロックコポリマーは、下記式（Ｉ）または（ＩＩ）で表される。
（式中、
　Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ６ｃ、およびＲ７については、式（ｉｉ）～（ｉｖ）に関して規定したとおりであり、
　Ｒ８ａおよびＲ８ｂは、相互に独立して、水素原子あるいは置換されていてもよい炭素数１～１２の直鎖または分枝状のアルキル基を表し、
　Ｒ９は、水素原子、置換されていてもよい直鎖または分枝の炭素数１～１２のアルキル基あるいは置換されていてもよい直鎖または分枝の炭素数１～２４のアルキルカルボニル基を表し、
　Ｒ１０は、置換されていてもよい炭素数１～６の直鎖または分岐アルキレン基を表し、
　Ｒ１１は、水酸基、オキシベンジル基、－Ｏ－Ｒ１１ａ基または－ＮＨ－Ｒ１１ｂ基を表し、ここでＲ１１ａおよびＲ１１ｂは相互に独立して、置換されていてもよい直鎖または分枝の炭素数１～１２アルキル基を表し、
　Ｒ１３ａおよびＲ１３ｂは、相互に独立して、メチレン基またはエチレン基を表し、
　Ｒ１４ａおよびＲ１４ｂは、相互に独立して、上記式（ｖ）～（ｖｉｉｉ）から選択される基を表し、
　［Ｐ＋］は、ホスホニウム基を表し、
　Ｌ１およびＬ２は、連結基であり、
　ｋは、２０～２０，０００の整数であり、
　ｍ１、ｍ２、ｍ３、ｎ１、ｎ２、およびｎ３は、相互に独立して、０以上の整数であり、
　ｍ１＋ｍ２＋ｍ３＝ｍ、ｎ１＋ｎ２＋ｎ３＝ｎとしたとき、ｍおよびｎは、５≦ｍ／（ｍ＋ｎ）×１００≦１００の関係および５≦ｍ＋ｎ≦１５０の関係を満たす整数であり、ただし、ｎは、０であってよく、
　各アミノ酸残基はランダムに存在することができる。）
　上記式（Ｉ）または（ＩＩ）において、Ｒ８ａ、Ｒ８ｂ、Ｒ９、Ｒ１１ａ、およびＲ１１ｂで定義する、炭素数１～１２の直鎖または分枝状のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ヘキシル基、デシル基、およびウンデシル基等を挙げることができる。
　Ｒ９で定義する、炭素数１～２４の直鎖または分枝状のアルキルカルボニル基の内の炭素数１～１２の直鎖または分枝状のアルキル部分は上述した例示を参考にできる。炭素数１３以上のアルキル部分は、例えば、トリデシル基、テトラデシル基、ペンタデシル基、ノナデシル基、ドコサニル基およびテトラコシル基等を挙げることができる。
　Ｒ１０は、好ましくは置換されていてもよい炭素数２～５の直鎖または分岐アルキレン基であり、より好ましくは置換されていてもよい炭素数３～４の直鎖アルキレン基であり、さらに好ましくはｎ－ブチレン基である。
　Ｒ８ａ、Ｒ８ｂ、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１ａ、およびＲ１１ｂに関して、置換された場合の置換基としては、アルキル基であるＲ１、Ｒ２、またはＲ３が置換された場合の置換基と同様の基が例示できる。また、Ｒ８ａおよびＲ８ｂには、標的結合部位を含む基が導入されていてもよい。
　標的結合部位は、目的に応じて適切に選択され得る。標的結合部位の具体例としては、葉酸、ヒアルロン酸、糖（例えば、グルコース、ガラクトース、マンノース、ラクトース）、オリゴペプチド（例えば、ｃＲＧＤ等のＲＧＤモチーフ、ＮＧＲモチーフ）、モノクローナル抗体（例えば、ベバシズマブ、トラスツズマブ、インフリキシマブ、リツキシマブ）またはその機能的断片等が挙げられる。標的結合部位は、直接または任意の適切な連結基を介してＲ８ａおよびＲ８ｂに導入され得る。１つの実施形態において、標的結合部位は、短鎖のポリアルキレングリコールおよび／または炭素数１～６のアルキレン基を含む連結基を介してＲ８ａおよびＲ８ｂに導入される。ポリアルキレングリコールは、炭素数２または３のアルキレングリコール、好ましくはポリエチレングリコールであり、その重合度は、例えば１～１０、好ましくは２～７である。
　Ｒ１４ａおよびＲ１４ｂは、好ましくは式（ｖ）で表される基であり、より好ましくは－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ－（ＣＨ２）２－ＮＨ２である。
　［Ｐ＋］は、好ましくは式（ｉ）で表されるホスホニウム基である。
　Ｌ１およびＬ２はそれぞれ、ポリエチレングリコールセグメントとポリアミノ酸セグメントとの連結部分であり、任意な適切な連結基であってよい。
　Ｌ１で表される連結基は、例えば、－ＮＨ－、－Ｏ－、－Ｏ－Ｌ１ａ－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＨ２－、および－Ｏ－Ｌ１ａ－Ｓ－Ｌ１ａ－ＮＨ－（ここで、Ｌ１ａはそれぞれ独立して炭素数１～６のアルキレン基である）から選ばれる連結基である。
　Ｌ２で表される連結基は、例えば、－ＯＣＯ－Ｌ２ａ－ＣＯ－、および－ＮＨＣＯ－Ｌ２ａ－ＣＯ－（ただし、Ｌ２ａは炭素数１～６のアルキレン基である）から選ばれる連結基である。
　ｋは、エチレングリコール（またはオキシエチレン）の繰り返し数を表す。ｋは、好ましくは３０～２，０００、より好ましくは４０～１，５００、さらに好ましくは５０～１，０００の整数である。
　ｍとｎの和は、好ましくは１０～１２５、より好ましくは１５～１００の整数であり、例えば３０～１００、また例えば４０～１００であってよい。ｍは、例えば５～１５０、好ましくは１０～１２５、より好ましくは１５～１００である。
　ｍ／（ｍ＋ｎ）×１００は、好ましくは１０、より好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上であり、さらにより好ましくは２５以上である。
　（ｎ１＋ｎ２）／（ｍ＋ｎ）×１００は、例えば５～６０、１０～５０、または１５～４０であり得る。（ｎ１＋ｎ２）／（ｍ＋ｎ）×１００が当該範囲内であると、優れたエンドソーム脱出能を有するカチオン性ブロックコポリマーが得られ得る。
　式（Ｉ）および（ＩＩ）中、繰り返し数がｍ１、ｍ２、ｍ３、ｎ１、ｎ２、またはｎ３で表されるアミノ酸残基はそれぞれ、同じ構造を有していてもよく、異なる構造を有していてもよい。例えば、カチオン性ブロックコポリマーは、２種以上のホスホニウム基含有アミノ酸残基を有していてもよい。
Ａ－１－４．作製方法
　上記カチオン性ブロックコポリマーは、任意の適切な合成方法によって作製され得る。例えば、ｍ１＝ｍ２＝ｎ１＝ｎ２＝０である式（Ｉ）ブロックコポリマーは、Ｒ８ａを付与できる開始剤を用いてアニオンリビング重合を行うことによりポリエチレングリコールを合成すること；当該ポリエチレングリコールの成長末端側にアミノ基を導入すること；当該成長末端からＮＣＡ－Ｌｙｓ（ＴＦＡ）等のアミノ基が保護されたリシン誘導体を重合させてポリリシン誘導体を合成すること；ポリリシン誘導体を脱保護してアミノ基を露出させること；および、当該露出したアミノ基とホスホニウム基含有カルボン酸化合物のカルボキシル基とを反応させて、アミド結合によりホスホニウム基をポリリシンの側鎖に導入すること；によって作製され得る。
　また例えば、ｍ３＝ｎ３＝０である上記カチオン性ブロックコポリマーは、Ｒ８ａを付与できる開始剤を用いてアニオンリビング重合を行うことによりポリエチレングリコールを合成すること；当該ポリエチレングリコールの成長末端側にアミノ基等の官能基を導入すること；当該成長末端からβ－ベンジル－Ｌ－アスパルテート、γ－ベンジル－Ｌ－グルタメート等のエステル化によりカルボキシル基が保護されたアミノ酸のＮ－カルボン酸無水物を重合させてポリアミノ酸を合成すること；および、当該ポリアミノ酸とホスホニウム基含有アミン化合物を用いて、エステルアミド交換反応によりホスホニウム基をポリアミノ酸の側鎖に導入すること；によって作製され得る。また、上記ポリアミノ酸の合成後、エステルアミド交換反応によりポリアルキレンポリアミンを側鎖に導入し、これにより生じた側鎖末端のアミノ基とホスホニウム基含有化合物とを反応させることでホスホニウム基を導入することもできる。具体例としては、ｄｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｒｉａｍｉｎｅ（ＤＥＴ）を上記ポリアミノ酸の側鎖に導入してＡｓｐ（ＤＥＴ）残基またはＧｌｕ（ＤＥＴ）残基を生成させ、これらの残基の側鎖末端のアミノ基とホスホニウム基含有カルボン酸化合物とを反応させることでホスホニウム基を導入することができる。このとき、β－ベンジル－Ｌ－アスパルテートとγ－ベンジル－Ｌ－グルタメートとを併用してポリアミノ酸を形成すると、その後のエステルアミド交換反応がβ－ベンジル－Ｌ－アスパルテートに対して優先的に生じる。その結果、γ－ベンジル－Ｌ－グルタメート由来のアミノ酸残基を疎水性アミノ酸残基として含むブロックコポリマーが得られ得る。
　標的結合部位を含む基が導入されたブロックコポリマーは、例えば、Ｒ８ａに官能基Ａを有するブロックコポリマーを準備すること；標的結合部位と官能基Ｂとを有する化合物を準備すること；および、官能基Ａと官能基Ｂとを反応させること；によって作製され得る。官能基Ａと官能基Ｂとの反応は、クリックケミストリーによって行われてよく、例えば、アジドとアルキンとの反応が挙げられる。
　言うまでもないが、本発明の実施形態によるブロックコポリマーは、式（Ｉ）および式（ＩＩ）に示す実施形態に限定されない。例えば、本発明の実施形態によるブロックコポリマーは、式（Ｉ）および式（ＩＩ）において、ホスホニウム基含有アミノ酸残基として、一種または二種以上の他のホスホニウム基含有アミノ酸残基を含む構造であり得る。このような構造においては、ホスホニウム基含有アミノ酸残基の合計数をｍとすることができる。また、本発明の実施形態によるブロックコポリマーは、式（Ｉ）および式（ＩＩ）において、一種類または二種以上の他のカチオン性アミノ酸残基を含んでいてもよい。この場合、カチオン性アミノ酸残基の合計数をｎとすることができる。さらにまた、本発明の実施形態によるブロックコポリマーは、式（Ｉ）および式（ＩＩ）において、一種類または二種以上の疎水性アミノ酸残基を含んでいてもよい。この場合、疎水性アミノ酸残基の含有割合は、全アミノ酸残基数の２０％以下、１０％以下、５％以下、または２％以下であり得る。
Ａ－２．第２の実施形態
　第２の実施形態のカチオン性ポリマーは、ミセルを形成し得るほど親水性度の異なる２つ以上のポリマーセグメントを有さず、側鎖にホスホニウム基を有するカチオン性ポリマーセグメントのみから構成される、いわゆるホモポリカチオンである。
　第２の実施形態のカチオン性ポリマーを構成するカチオン性ポリマーセグメントとしては、Ａ－１項に記載のカチオン性ブロックコポリマーの一方のブロック成分であるカチオン性ポリマーセグメントと同様の説明を適用することができる。第２の実施形態におけるカチオン性ポリマーは、例えば、Ａ－１項に記載のカチオン性ポリアミノ酸である。カチオン性ポリアミノ酸のＮ末端およびＣ末端はそれぞれ、本発明の効果が得られる範囲で任意に改変されていてよい。Ｎ末端およびＣ末端はそれぞれ、例えば、上記式（Ｉ）のＲ９および式（ＩＩ）のＲ１１と同様の基であり得る。
　１つの実施形態において、上記カチオン性ポリアミノ酸は、下記式（ＩＩＩ）で表され得る。
（式中、
　Ｒ４ａ、Ｒ４ｂ、Ｒ５ａ、Ｒ５ｂ、Ｒ６ａ、Ｒ６ｂ、Ｒ６ｃ、Ｒ７、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１３ａ、Ｒ１３ｂ、Ｒ１４ａ、Ｒ１４ｂ、［Ｐ＋］、ｍ１、ｍ２、ｍ３、ｎ１、ｎ２、およびｎ３については、式（ｉｖ）および（Ｉ）または（ＩＩ）に関して規定したとおりであり、
　Ｒ１２は、水酸基、オキシベンジル基、－Ｏ－Ｒ１２ａ基または－ＮＨ－Ｒ１２ｂ基を表し、ここでＲ１２ａおよびＲ１２ｂは相互に独立して、置換されていてもよい直鎖または分枝の炭素数１～１２アルキル基を表す。）
　Ｒ１２ａおよびＲ１２ｂで定義する、炭素数１～１２の直鎖または分枝状のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、ｎ－プロピル基、イソプロピル基、ｎ－ブチル基、ｓｅｃ－ブチル基、ｔｅｒｔ－ブチル基、ｎ－ヘキシル基、デシル基、およびウンデシル基等を挙げることができる。Ｒ１２ａおよびＲ１２ｂが置換された場合の置換基としては、アルキル基であるＲ１、Ｒ２、またはＲ３が置換された場合の置換基と同様の基が例示できる。
Ｂ．ポリマー粒子
　本発明の別の局面によれば、Ａ項に記載のカチオン性ポリマーを含むポリマー粒子、より具体的には、Ａ－１項に記載のカチオン性ブロックコポリマーおよび／またはＡ－２項に記載のカチオン性ポリアミノ酸（以下、ホモポリカチオンとも称する）を含むポリマー粒子が提供される。ポリマー粒子は、薬剤をさらに含んでいてもよい。薬剤は、ポリマー粒子に内包され得る。
Ｂ－１．薬剤
　薬剤としては、目的に応じて任意の適切な薬剤を用いることができる。薬剤としては、例えば、核酸、タンパク質（抗体、ホルモン、酵素等）、その他の生理活性物質、蛍光色素、造影剤等が挙げられる。ポリマー粒子の形成において、カチオン性ポリマーとの間の静電的相互作用を利用する観点から、生理的ｐＨで負電荷を有するアニオン性の薬剤（例えば、核酸）が好ましく用いられる。
　核酸は、プリンまたはピリミジン塩基、ペントース、リン酸からなるヌクレオチドを基本単位とするポリもしくはオリゴヌクレオチドを意味し、オリゴもしくはポリ二本鎖ＲＮＡ、オリゴもしくはポリ二本鎖ＤＮＡ、オリゴもしくはポリ一本鎖ＤＮＡおよびオリゴもしくはポリ一本鎖ＲＮＡを例示することができる。また、１つの鎖にＲＮＡとＤＮＡが混在したオリゴもしくはポリ二本鎖核酸、オリゴもしくはポリ一本鎖核酸も例示に含まれる。当該核酸に含有されるヌクレオチドは天然型であっても、化学修飾された非天然型のものであっても良く、また、これらにアミノ基、チオール基、蛍光化合物等の分子が付加されたものであっても良い。
　核酸の塩基長（二本鎖核酸の場合は、二本鎖を形成している部分の塩基長）は特に限定されず、１００塩基未満、例えば１０塩基～８０塩基、好ましくは１５塩基～５０塩基程度の比較的短鎖の核酸であってもよく、あるいは、１００塩基以上、好ましくは１００塩基～２０，０００塩基、より好ましくは２００塩基～１０，０００塩基程度の比較的長鎖の核酸であってもよい。
　核酸としては、その機能または作用を考慮すると、プラスミドＤＮＡ、ドナーＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｇＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏ　ＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス核酸、デコイ核酸、アプタマー、リボザイム等を挙げることができる。核酸は、単独で、または、２種以上を組み合わせて用いることができる。
Ｂ－２．ミセル
　１つの実施形態において、ポリマー粒子は、Ａ－１項に記載のカチオン性ブロックコポリマーを含むミセルである。当該ミセルにおいて、カチオン性ブロックコポリマーは、代表的には、親水性ポリマーセグメントを外側に向けるとともにカチオン性ポリマーセグメントを内側に向けた状態で凝集している。
　ミセルが薬剤を含む場合、当該薬剤は好ましくはアニオン性の薬剤である。アニオン性の薬剤は、ミセルの内側に向いて配列しているカチオン性ポリマーセグメントとの静電的相互作用により、ミセル内に安定に保持され得る。
　ミセルの粒子径は、例えば１０ｎｍ～５００ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ～３００ｎｍであり得る。
　ミセルは、任意の適切な方法で調製することができる。例えば、ミセルは、必要により緩衝化された水溶液中に上記カチオン性ブロックコポリマーを添加し、撹拌することによって得ることができる。薬剤を内包するミセルは、必要により緩衝化された水溶液中で上記カチオン性ブロックコポリマーと薬剤とを混合することによって得ることができる。このとき、カチオン性ブロックコポリマーが有するカチオン性基であって、上記水溶液中でプロトン化するカチオン性基のモル濃度（Ｃ）とアニオン性の薬剤が有するアニオン性基のモル濃度（Ａ）との比（Ｃ／Ａ）は、例えば１以上１０以下であり、好ましくは１．２以上７以下であり、より好ましくは１．５以上５以下である。
　ミセルは、必要に応じて、標的結合部位を有することができる。ミセルあたりの標的結合部位の数は、例えば１以上であり、１～１００であってよい。標的結合部位は、例えば、カチオン性ブロックコポリマーの親水性ポリマーセグメントの端部に導入され、これにより、ミセルの外表面に露出可能とされている。
　標的結合部位のカチオン性ブロックコポリマーへの導入は、ミセルの形成前に行われ得る。この場合、親水性ポリマーセグメントの端部に標的結合部位が導入されたカチオン性ブロックコポリマーを作製し、標的結合部位が導入されたカチオン性ブロックコポリマーを用いてミセルを形成する。標的結合部位が導入されたカチオン性ブロックコポリマーと導入されていないカチオン性ブロックコポリマーとを併用してもよい。これらを併用することにより、ミセルあたりの標的結合部位の数を好適に調整することができる。標的結合部位が導入されたカチオン性ブロックコポリマーと導入されていないカチオン性ブロックコポリマーとの配合比（前者：後者、モル基準）は、目的に応じて適切に設定でき、例えば１：９９～１００：０、好ましくは５：９５～９５：５であり得る。
　あるいは、標的結合部位のカチオン性ブロックコポリマーへの導入は、ミセルの形成後に行われ得る。この場合、親水性ポリマーセグメントの端部に官能基Ｃを有するカチオン性ブロックコポリマーを作製し、当該カチオン性ブロックコポリマーを用いてミセルを形成した後に、標的結合部位と官能基Ｄとを有する化合物をミセルに接触させて、官能基Ｃと官能基Ｄとを反応させる。官能基Ｃを有するカチオン性ブロックコポリマーと有さないカチオン性ブロックコポリマーとを併用してもよい。ミセルの形成後に標的結合部位を導入することにより、標的結合部位がミセルの形成に影響することを回避できる。よって、嵩高い標的結合部位を用いる場合であっても、粒子径が小さいミセルを簡便に得ることができる。
Ｂ－３．ベシクル
　別の実施形態において、ポリマー粒子は、Ａ－１項に記載のカチオン性ブロックコポリマーまたはＡ－２項に記載のホモポリカチオンを含むベシクル（ＰＩＣｓｏｍｅとも称される）である。ベシクルは、閉じた二分子膜によって構成される中空構造体である。
　ベシクルは、例えば、Ａ－１項に記載のカチオン性ブロックコポリマーとホモポリアニオンとのＰＩＣによって形成される中空の微粒子である。具体的には、水性媒体中、カチオン性ブロックコポリマーのカチオン性ポリマーセグメントとホモポリアニオンとの間でＰＩＣの層が形成されるとともに、当該ＰＩＣの層を覆うように親水性ポリマーセグメントが配置されることによりベシクルが形成される。ホモポリアニオンとしては、例えば、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸等を用いることができる。
　また例えば、ベシクルは、Ａ－２項に記載のホモポリカチオンとアニオン性ブロックコポリマーとのＰＩＣによって形成される中空の微粒子である。アニオン性ブロックコポリマーは、アニオン性ポリマーセグメントと親水性ポリマーセグメントとを含む。水性媒体中、アニオン性ブロックコポリマーのアニオン性ポリマーセグメントとホモポリカチオンとの間でＰＩＣの層が形成されるとともに、当該ＰＩＣの層を覆うように親水性ポリマーセグメントが配置されることによりベシクルが形成される。アニオン性ブロックコポリマーとしては、ポリエチレングリコール－ポリアスパラギン酸ブロックコポリマー、ポリエチレングリコール－ポリグルタミン酸ブロックコポリマー等を用いることができる。
　ベシクルの粒子径は、例えば１０ｎｍ～５００ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ～３００ｎｍであり得る。
　ベシクルは、任意の適切な方法で調製することができる。例えば、ベシクルは、必要により緩衝化された水溶液中に上記組み合わせのポリマー成分を添加し、撹拌することによって得ることができる。薬剤を含むベシクルは、必要により緩衝化された水溶液中で上記組み合わせのポリマー成分と薬剤とを混合することによって得ることができ、薬剤はベシクルに内包され得る。このとき、ポリマー成分中のカチオン性基であって、上記水溶液中でプロトン化するカチオン性基のモル濃度（Ｃ）とアニオン性基のモル濃度（Ａ）との比（Ｃ／Ａ）は、例えば０．６以上１．４以下であり、好ましくは０．８以上１．２以下であり、より好ましくは０．９５以上１．０５以下である。
　ベシクルは、必要に応じて、標的結合部位を有することができる。ベシクルあたりの標的結合部位の数は、例えば１以上であり、１～１００であってよい。標的結合部位は、例えば、ブロックコポリマーの親水性ポリマーセグメントの端部に導入され、これにより、ベシクルの外表面に露出可能とされている。標的結合部位のブロックコポリマーへの導入については、上述のとおりである。
Ｂ－４．複合体
　別の実施形態において、ポリマー粒子は、Ａ－２項に記載のホモポリカチオンとアニオン性の薬剤との複合体（ＰＩＣ）である。
　複合体の粒子径は、例えば１０ｎｍ～５００ｎｍ、好ましくは２０ｎｍ～３００ｎｍであり得る。
　複合体は、任意の適切な方法で調製することができる。例えば、複合体は、必要により緩衝化された水溶液中に上記ホモポリカチオンとアニオン性の薬剤を混合することによって得ることができる。このとき、ホモポリカチオンが有するカチオン性基であって、上記水溶液中でプロトン化するカチオン性基のモル濃度（Ｃ）とアニオン性の薬剤が有するアニオン性基のモル濃度（Ａ）との比（Ｃ／Ａ）は、例えば１以上１０以下であり、好ましくは１．２以上７以下であり、より好ましくは１．５以上５以下である。
Ｃ．医薬組成物
　本発明の別の局面によれば、Ａ項に記載のカチオン性ポリマー、より具体的には、Ａ－１項に記載のカチオン性ブロックコポリマーおよび／またはＡ－２項に記載のホモポリカチオンと、薬剤と、を含む、医薬組成物が提供される。医薬組成物は、Ｂ項に記載のポリマー粒子を形成するための追加のポリマー成分（例えば、アニオン性ブロックコポリマー、ホモポリアニオン）をさらに含んでいてもよい。追加のポリマー成分および薬剤については、Ｂ項において記載したとおりである。
　医薬組成物の剤形は、目的に応じて任意の剤形であってよく、例えば、皮下注射剤、静脈内注射剤、筋肉内注射剤、腹腔内注射剤、脳内注射剤等の注射剤である。医薬組成物には、剤形に応じて、等張化剤、緩衝剤、安定化剤、ｐＨ調整剤等の添加物が適宜配合される。
　医薬組成物は、液剤であってもよく、乾燥品であってもよい。液剤の医薬組成物は、水性媒体を含み、好ましくは、当該水性媒体中で、上記ポリマー成分と薬剤とがポリマー粒子を形成している。一方、乾燥品の医薬組成物を生理食塩水等の溶解用溶液で溶解することにより、得られた溶液中で上記ポリマー成分と薬剤とがポリマー粒子を形成することができる。
　以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例になんら限定されるものではない。
［試験例１：ＰＥＧ－ｐｏｌｙ（Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）の合成］
　ＷＯ２０１３／１６２０４１の実施例に記載されるブロックコポリマーの合成方法と同様の合成方法によって、ポリエチレングリコールセグメントとポリリシンセグメントとを有するブロックコポリマーであるＰＥＧ－ｐｏｌｙ（Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）を合成した（以下、ＰＥＧ－ｐｏｌｙ（Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）をＰＥＧ－ＰＬＬと称する場合がある）。ＰＥＧ－ＰＬＬを構成するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の質量は１２ｋＤａであり、ポリリシンの重合度は６８であった。
［試験例２：ＰＥＧ－ｐｏｌｙ（Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）側鎖へのＴＰＰ導入］
　ＰＥＧ－ＰＬＬ側鎖へのｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ（ＴＰＰ）の導入は、上記ＰＥＧ－ＰＬＬ、４－（４，６－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－１，３，５－ｔｒｉａｚｉｎ－２－ｙｌ）－４－ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｎ－ｈｙｄｒａｔｅ　（ＤＭＴ－ＭＭ，　Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）、４－（Ｃａｒｂｏｘｙｂｕｔｙｌ）ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ　Ｂｒｏｍｉｄｅ　（Ｔｏｋｙｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて行った。ＰＥＧ－ＰＬＬ（２０ｍｇ）と、４－（Ｃａｒｂｏｘｙｂｕｔｙｌ）ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ　Ｂｒｏｍｉｄｅ（８．７ｍｇ，１４．６ｍｇ，２９．１ｍｇ，４３．７ｍｇ）を５０ｍＭ　ＮａＨＣＯ３／ＭｅＯＨ（３ｍｌ／９ｍｌ）に溶解後、ＤＭＴ－ＭＭ（９０ｍｇ）を２時間ごとに計３回添加し、４℃下で終夜反応させた。反応後、蒸留水に対する透析（ＭＷＣＯ：６－８ｋＤａ）を行い、未反応物を除去した。透析後の溶液を凍結乾燥することで、白色粉末として、種々のＴＰＰ導入率のＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）を得た。得られたＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）の構造を下記に示す。式中、ｍ＋ｎ＝６８であり、各アミノ酸残基はランダムに位置する。
　ＰＥＧ－ＰＬＬ側鎖へのＴＰＰ導入率は、１Ｈ－ＮＭＲスペクトル［Ｄ２Ｏ　ａｔ　８０℃，δ＝３．４－３．６ｐｐｍ（４Ｈ：－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－），δ＝７．６－８．０ｐｐｍ（１５Ｈ：Ｐｈ３Ｐ－）］から算出した。その結果、ＴＰＰ導入率（ｍ／（ｍ＋ｎ）×１００）は、２６％、４５％、７５％、および９７％であった。なお、ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）に関して、ＴＰＰ導入率は、カチオン性ポリアミノ酸の重合度に対するホスホニウム基含有アミノ酸残基数の割合に対応し得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
［試験例３：ｍＲＮＡの調製］
　ＥＧＦＰ　ｍＲＮＡおよびＦｌｕｃ　ｍＲＮＡは、Ｔｒｉｌｉｎｋ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）より購入した。
　ＧＬｕｃ　ｍＲＮＡについては、ＧＬｕｃのｃｏｄｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅと１２０ｂｐのｐｏｌｙ　Ａ／Ｔが挿入されたｐＳＰ７３　ｖｅｃｔｏｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）をテンプレートとしてｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写することにより調製した。Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写にはｍＭＥＳＳＡＧＥ　ｍＭＡＣＨＩＮＥ　Ｔ７　Ｕｌｔｒａ　Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、ｍＲＮＡ精製にはＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。
　ＶＥＥ－ＧＦＰ　ｍＲＮＡは、Ｔ７－ＶＥＥ－ＧＦＰ　ｐｌａｓｍｉｄ（Ａｄｄｇｅｎｅ　＃５８９７７，Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ，ＭＡ）をｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写することで調製した。
［試験例４：ｍＲＮＡ内包ミセルの調製］
　塩基長の異なる３種のｍＲＮＡ（ＥＧＦＰ　ｍＲＮＡ、ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ、またはＶＥＥ－ＧＦＰ　ｍＲＮＡ）とポリマー（ＰＥＧ－ＰＬＬまたはＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ））をそれぞれ１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３）に溶解した。ポリマーのカチオン性官能基（Ｃ）とｍＲＮＡのリン酸基（Ｐ）とのモル比（Ｃ：Ｐ）が３：１となるように、ポリマー溶液（ＰＥＧ－ＰＬＬまたはＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ））とｍＲＮＡ溶液（５０ｎｇ／μＬ）をボルテックス下で１：２のボリューム比で混合し、氷上で１０分間静置した。これにより、ｍＲＮＡを内包するミセル（ｍＲＮＡ内包ミセル）を得た。
　得られたｍＲＮＡ内包ミセルの粒子径および多分散度（ＰＤＩ）を動的光散乱法（ＤＬＳ）で測定した。ＤＬＳ測定には、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ．，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用し、２５℃、９０°の検出角度で測定した。結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表１から、ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）によれば、小サイズで粒子径分布の狭いｍＲＮＡ内包ＰＩＣミセルが得られることがわかる。また、ＰＥＧ－ＰＬＬでは小サイズのミセル形成が困難とされている長鎖ｍＲＮＡに対しても、ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）によれば小サイズのミセル化が可能と考えられる。
［試験例５：ｍＲＮＡ内包ミセルコアの凝集度評価］
　Ｌａｂｅｌ　ＩＴ　Ｔｒａｃｋｅｒ　Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ　Ｂｉｏ　ＬＬＣ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によりＦＬｕｃ　ｍＲＮＡをＣｙ３／Ｃｙ５でダブル標識した。試験例４と同様にして、標識ｍＲＮＡ溶液とポリマー溶液（ＰＥＧ－ＰＬＬまたはＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ））をボルテックス下で混合することで、ｍＲＮＡ内包ミセルを調製した。ＳＰＡＲＫ（Ｔｅｃａｎ　Ｇｒｏｕｐ　Ｌｔｄ．，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、５２０ｎｍで励起した際の蛍光スペクトル（５５０－７００ｎｍ）を測定した。ｍＲＮＡの凝集度の指標として、Ｃｙ３／Ｃｙ５ペアによるＦＲＥＴ　ｒａｔｉｏを以下の計算式で算出した。得られたＦＲＥＴ　ｒａｔｉｏを図２に示す。
　　　ＦＲＥＴ　ｒａｔｉｏ＝Ｃｙ５（６８０ｎｍ）蛍光強度／（Ｃｙ３（５７０ｎｍ）蛍光強度＋Ｃｙ５（６８０ｎｍ）蛍光強度）
　上記評価において、ＦＲＥＴ　ｒａｔｉｏが高いことはミセルコアにおけるｍＲＮＡの凝集度が高いことを意味する。よって、図２によれば、ＴＰＰの導入により、ｍＲＮＡ内包ミセルのコア凝集度が増大していることがわかる。このような現象は、ポリマーとｍＲＮＡとの相互作用および／またはポリマー同士の相互作用が強化されたことに起因すると推測される。
［試験例６：ｍＲＮＡ内包ミセルのＦＢＳ耐性評価］
　ウシ胎児血清（ＦＢＳ）と共にインキュベーションされたｍＲＮＡ内包ミセルからｍＲＮＡを抽出し、逆転写および定量ＰＣＲを行うことによりインタクトなｍＲＮＡ量を定量して、ｍＲＮＡ内包ミセルのＦＢＳ耐性を評価した（ｎ＝３）。具体的には、以下のとおりである。
　ＴＰＰ導入率が２６％、４５％、７５％、もしくは９７％のＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）またはＰＥＧ－ＰＬＬとＥＧＦＰ　ｍＲＮＡとを用い、試験例４と同様の方法でｍＲＮＡ内包ミセルを調製した。ＦＢＳ（ＧＥ　ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，ＵＳＡ）とダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（Ｄ－ＰＢＳ，Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｌｔｄ．）で調製した５０％ＦＢＳ溶液中で、ｍＲＮＡ内包ミセル（最終ｍＲＮＡ濃度１．６７ｎｇ／μＬ）を３７℃下で１５分間インキュベーションした。ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてｍＲＮＡを精製し、Ｈｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）により一本鎖ｃＤＮＡへ逆転写した。Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　７５００　Ｆａｓｔ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、定量ＰＣＲを実施した。ＰＣＲにはＴａｑＭａｎ　ａｓｓａｙを使用し、ターゲット（ＥＧＦＰ）に対して以下のｐｒｉｍｅｒおよびｐｒｏｂｅセットを用いた。定量ＰＣＲの結果から算出されたインタクトなｍＲＮＡの残存率（ＦＢＳ含有Ｄ－ＰＢＳ中でインキュベーションしなかったこと以外は同様の処理を行ったコントロールを基準とする残存率）を図３に示す。
・Ｆｏｒｗａｒｄ：ＧＡＡＣＣＧＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＡ（配列番号：１）
・Ｒｅｖｅｒｓｅ：ＴＧＣＴＴＧＴＣＧＧＣＣＡＴＧＡＴＡＴＡＧ（配列番号：２）
・Ｐｒｏｂｅ：ＡＴＣＧＡＣＴＴＣＡＡＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣ（配列番号：３）
　図３によれば、ＴＰＰ導入率依存的にｍＲＮＡ内包ミセルのＦＢＳ耐性が高くなることがわかる。
［試験例７：ｍＲＮＡ内包ミセルの細胞内タンパク質発現評価］
　ＴＰＰ導入率が２６％、４５％、７５％、もしくは９７％のＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）またはＰＥＧ－ＰＬＬとＧｌｕｃ　ｍＲＮＡとを用い、試験例４と同様の方法で調製したｍＲＮＡ内包ミセルの細胞内タンパク質発現をｉｎ　ｖｉｔｒｏで評価した。具体的には、以下のとおりである。
　１０％ＦＢＳと１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．　Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含有したＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中でＨｕＨ－７細胞を培養した。９６－ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅにＨｕＨ－７細胞を１００００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌで播種して２日間インキュベーション後、ｍＲＮＡ内包ミセルまたはＦｒｅｅ　ｍＲＮＡを４００ｎｇ　ｍＲＮＡ／ｗｅｌｌとなるように添加した。添加から２４時間後および４８時間後に培地を回収し、Ｒｅｎｉｌｌａ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とＧｌｏＭａｘ　９６　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒで培地中の発光量を測定した。結果を図４に示す（図４中、左側のカラムがｍＲＮＡ添加から２４時間後の培地の発光量（ＲＬＵ）であり、右側のカラムがｍＲＮＡ添加から４８時間後の培地の発光量（ＲＬＵ）を示す）。
　図４に示されるとおり、ｍＲＮＡ内包ミセルはｍＲＮＡ単体（Ｆｒｅｅ　ｍＲＮＡ）よりも高いタンパク質発現を示し、ｍＲＮＡ内包ミセルに関しては、ＴＰＰ導入率依存的にタンパク質発現量が増加した。
［試験例８：ｍＲＮＡ内包ミセルの血中滞留性評価］
　ＴＰＰ導入率が９７％のＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）またはＰＥＧ－ＰＬＬとＦｌｕｃ　ｍＲＮＡとを用い、試験例４と同様の方法で調製したｍＲＮＡ内包ミセルをマウスにｉｖ投与し、その血中滞留性を評価した（ｎ＝４）。具体的には、以下のとおりである。
　１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ溶液に溶解したｍＲＮＡ内包ミセルをＢＡＬＢ／ｃマウス（雌，７週齢，Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｊａｐａｎ　Ｉｎｃ．，Ｋａｎａｇａｗａ，Ｊａｐａｎ）に静脈内投与した（２０μｇ　ｍＲＮＡ／ｍｏｕｓｅ）。投与して５、１０、１５、３０、または６０分後に尾静脈から血液２μＬを採取し、１％　２－メルカプトエタノールを含有するＲＬＴ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に添加した。ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを精製し、Ｈｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）により一本鎖ｃＤＮＡへ逆転写した。Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　７５００　Ｆａｓｔ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、定量ＰＣＲを実施した。結果を図５に示す。
　図５に示されるとおり、ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）を用いて調製したｍＲＮＡ内包ミセルは、ＰＥＧ－ＰＬＬを用いて調製したｍＲＮＡ内包ミセルに比べて有意に高い血中滞留性を示した。
［試験例９：ＡＳＯ内包ミセル調製］
　アンチセンス核酸（ＡＳＯ）として、ＧｅｎｅＤｅｓｉｇｎ，　Ｉｎｃ．（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）で受託合成された以下のものを使用した。
　Ａｌｅｘａ６４７－ｍｏｕｓｅ　ＭＡＬＡＴ１　ＡＳＯ　（５′－ＧＧＧＴＣＡＧＣＴＧＣＣＡＡＴＧＣＴＡＧ－３′）　（配列番号：４）
　（下線部分はＬｏｃｋｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ（ＬＮＡ），３’末端にＡｌｅｘａ６４７修飾）
　ＡＳＯとポリマー（ＰＥＧ－ＰＬＬまたはＴＰＰ導入率が９７％のＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ））をそれぞれ１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３）に溶解した。ポリマーのカチオン性官能基とＡＳＯのリン酸基とのモル比（Ｃ：Ｐ）が３：１となるように、ポリマー溶液（ＰＥＧ－ＰＬＬまたはＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ））とＡＳＯ溶液（５０ｎｇ／μＬ）とをボルテックス下で１：２のボリューム比で混合し、１０分間静置した。これにより、ＡＳＯを内包するミセル（ＡＳＯ内包ミセル）を得た。
　得られたＡＳＯ内包ミセルの粒子径および多分散度（ＰＤＩ）を動的光散乱法（ＤＬＳ）で測定した。ＤＬＳ測定には、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ　（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ．，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用し、２５℃、１７３°の検出角度で測定した。結果を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　表２から、ＰＥＧ－ＰＬＬおよびＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）のいずれを用いた場合であっても、小サイズで粒子径分布の狭いＰＩＣミセルが得られることがわかる。また、ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）によれば、ＰＥＧ－ＰＬＬに比べてより小サイズで粒子径分布の狭いＰＩＣミセルが得られることがわかる。
［試験例１０：ＡＳＯ内包ミセルの安定性評価１］
　試験例９で調製したＡＳＯ内包ミセルの高塩濃度下での安定性を次のようにして評価した。
　０Ｍまたは２Ｍ　ＮａＣｌを含有した１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）にＡＳＯ内包ミセルを最終ＡＳＯ濃度３４．８ｎｇ／μＬとなるように添加し、１５分間３７℃下でインキュベートした。その後、ＤＬＳによりＡＳＯ内包ミセルの粒子径分布を測定した。結果を図６に示す。
　図６に示されるとおり、静電相互作用が抑制される高イオン強度下において、ＰＥＧ－ＰＬＬを用いて調製されたＡＳＯ内包ミセルではミセル構造が崩壊したのに対し、ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）を用いて調製されたＡＳＯ内包ミセルではミセル構造が維持された。
［試験例１１：ＡＳＯ内包ミセルの安定性評価２］
　試験例９で調製したＡＳＯ内包ミセルのポリアニオン耐性を次のようにして評価した。
　ＡＳＯ内包ミセルを分子量５０００のデキストラン硫酸塩（Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）とＳ／Ｐ比（［デキストラン硫酸塩の硫酸基モル濃度］／［ＡＳＯのリン酸基モル濃度］）が２となるように混合し（最終ＡＳＯ濃度は３４．８ｎｇ／μＬ）、１５分間３７℃下でインキュベートした。その後、ＤＬＳによりＡＳＯ内包ミセルの粒子径分布を測定した。結果をデキストラン硫酸塩非存在下で同様にインキュベートしたサンプルの測定結果と併せて図７に示す。
　図７に示されるとおり、高濃度のポリアニオン存在下において、ＰＥＧ－ＰＬＬを用いて調製されたＡＳＯ内包ミセルではミセル構造が崩壊したのに対し、ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）を用いて調製されたＡＳＯ内包ミセルではミセル構造が維持された。生体内には様々なポリアニオンが存在し、ＰＩＣの安定性に影響し得るところ、ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）を用いて調製されたＰＩＣミセルは生体内でのポリアニオン耐性に優れると考えられる。
［試験例１２：ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）ポリマーへのｃＲＧＤ修飾］
　Ａｚｉｄｅ－ＰＥＧ－ｐｏｌｙ（Ｌ－ｌｙｓｉｎｅ）（以下、「Ｎ３－ＰＥＧ－ＰＬＬ」と称する）側鎖へｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ（ＴＰＰ）導入を行った。反応は、Ｎ３－ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＰＥＧ分子量１２－ｋＤａ，ｌｙｓｉｎｅ重合度７０）、４－（４，６－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－１，３，５－ｔｒｉａｚｉｎ－２－ｙｌ）－４－ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｎ－ｈｙｄｒａｔｅ（ＤＭＴ－ＭＭ，Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）、４－（Ｃａｒｂｏｘｙｂｕｔｙｌ）ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ　Ｂｒｏｍｉｄｅ（Ｔｏｋｙｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて行った。Ｎ３－ＰＥＧ－ＰＬＬ（２０ｍｇ）と、４－（Ｃａｒｂｏｘｙｂｕｔｙｌ）ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ　Ｂｒｏｍｉｄｅ（４３．７ｍｇ）を５０ｍＭ　ＮａＨＣＯ３／ＭｅＯＨ（３ｍｌ／９ｍｌ）に溶解後、ＤＭＴ－ＭＭ（９０ｍｇ）を２時間ごとに計３回添加し、４℃下で終夜反応させた。反応後、蒸留水に対する透析（ＭＷＣＯ：６－８ｋＤａ）を行い、未反応物を除去した。透析後の溶液を凍結乾燥することで、白色粉末のＮ３－ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）を得た。得られたＮ３－ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）におけるＴＰＰ導入率は、９０％であった。
　次に、ｃＲＧＤ－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯの合成を行った。６ｍｇのＣｙｃｌｏ　ＲＧＤｆＫ（ＣｈｅｍＳｃｅｎｅ，Ｍｏｎｍｏｕｔｈ　Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＮＪ，ＵＳＡ）と１．３ｍｇのＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ（Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）をＤＭＳＯ１．５ｍＬ中で混合し、室温で終夜反応させた。その後、蒸留水６ｍＬを添加し、２４時間反応させた。
　最後に、上記のようにして得られたｃＲＧＤ－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯ溶液（４ｍＬ）にＮ３－ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）（２０ｍｇ）とＤＭＳＯ（２．４ｍＬ）を添加し、室温で終夜反応させた。反応後、蒸留水に対する透析（ＭＷＣＯ：６－８ｋＤａ）を行い、未反応物を除去した。透析後の溶液を凍結乾燥することで、白色粉末のｃＲＧＤ－ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）を得た。
［試験例１３：ｃＲＧＤ修飾ｍＲＮＡ内包ミセル調製］
　ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡとポリマー（ｃＲＧＤ－ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ），ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ），いずれもＴＰＰ導入率は９０％であり、以下の試験例１４～１７においても同様である）をそれぞれ１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３）に溶解した。ポリマーについては、ｃＲＧＤ－ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）とＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）のモル比がそれぞれ０：１００，１０：９０，２５：７５，５０：５０，１００：０となるように混合溶液を調製した。ポリマー混合溶液のカチオン性官能基とｍＲＮＡのリン酸基のモル比が３：１となるように、ポリマー混合溶液（ｃＲＧＤ－ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）／ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ））とｍＲＮＡ溶液（５０ｎｇ／μＬ）をボルテックス下で１：２のボリューム比で混合し、氷上で１０分間静置した。得られたｃＲＧＤ修飾ｍＲＮＡ内包ミセル（ｃＲＧＤ修飾率（［ｃＲＧＤ－ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）］／（［ｃＲＧＤ－ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）］＋［ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）］）×１００）：０，１０，２５，５０，１００％）の粒子径および多分散度（ＰＤＩ）を動的光散乱法（ＤＬＳ）で測定した。ＤＬＳ測定には、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ．，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用し、２５℃、９０°の検出角度で測定した。結果を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　表３からｃＲＧＤ修飾カチオン性ブロックコポリマーを用いてミセルを形成できることがわかる。また、ｃＲＧＤ修飾率の上昇（例えば、ｃＲＧＤ修飾率＞５０％）に伴って、ＰＤＩが増大する傾向がみられた。
［試験例１４：ｃＲＧＤ修飾ｍＲＮＡ内包ミセルの細胞取り込み評価］
　Ｌａｂｅｌ　ＩＴ　Ｔｒａｃｋｅｒ　Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ　Ｂｉｏ　ＬＬＣ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によりＦＬｕｃ　ｍＲＮＡをＣｙ５標識した。上記の方法と同様に、Ｃｙ５標識ｍＲＮＡ溶液とポリマー混合溶液（ｃＲＧＤ－ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）／ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ））をボルテックス下で混合することで、Ｃｙ５標識ｍＲＮＡ内包ミセル（ｃＲＧＤ修飾率：０，１０，２５，５０％）を調製した。
　細胞としては、ｃＲＧＤの標的であるｉｎｔｅｇｒｉｎαｖβ３陽性であるＵ８７細胞を用いた。Ｕ８７細胞の培養は、１０％ＦＢＳと１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含有したＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中で行った。８ｗｅｌｌのｃｏｖｅｒ　ｇｌａｓｓ　ｃｈａｍｂｅｒ（ＩＷＡＫＩ　ＡＧＣ　Ｔｅｃｈｎｏ　Ｇｌａｓｓ　Ｃｏ．Ｌｔｄ．，Ｓｈｉｚｕｏｋａ，Ｊａｐａｎ）にＵ８７細胞を播種し、２４時間インキュベーション後にＣｙ５標識ｍＲＮＡ内包ミセル（ｃＲＧＤ修飾率：０，１０，２５，５０％）を３００ｎｇ　ｍＲＮＡ／ｗｅｌｌとなるように添加した。３時間後に培地を除去しＰＢＳで３回ｗａｓｈ後、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２（Ｄｏｊｉｎｄｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）で細胞核を染色した。細胞の観察はＬｅｉｃａ　ＤＭｉ８（Ｌｅｉｃａ　Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行い、画像の定量解析はＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いた。蛍光観察画像を図８に示し、蛍光強度の解析結果を図９に示す。
　図８および図９に示されるとおり、ｃＲＧＤ修飾ｍＲＮＡ内包ミセル（ｃＲＧＤ修飾率：１０％、２５％、５０％）を用いると、非ｃＲＧＤ修飾ｍＲＮＡ内包ミセル（ｃＲＧＤ修飾率：０％）を用いた場合よりも細胞取り込みが増加した。また、ｃＲＧＤ修飾率が１０％および２５％のｍＲＮＡ内包ミセルは、ｃＲＧＤ修飾率が５０％のｍＲＮＡ内包ミセルよりも細胞取り込みが増加していた。ｃＲＧＤ修飾ｍＲＮＡ内包ミセルの安定性は、ｃＲＧＤ修飾率が増大すると低下し得る（例えば、５０％ＦＢＳ中におけるｃＲＧＤ修飾ｍＲＮＡ内包ミセルの安定性は、０％＞１０％＞２５％＞５０％（ｃＲＧＤ修飾率）である）ことから、上記結果は、ｃＲＧＤ修飾による取り込み増加およびｃＲＧＤ修飾率の増大によるミセルの安定性の低下の影響を示すと考えられる。
［試験例１５：ｃＲＧＤ修飾ｍＲＮＡ内包ミセルの細胞内タンパク質発現評価］
　９６－ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅにＵ８７細胞を播種（１５０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）し、２４時間インキュベーション後に試験例１３で調製したｃＲＧＤ修飾ｍＲＮＡ内包ミセル（ｃＲＧＤ修飾率：０，１０％）を２６７ｎｇ　ｍＲＮＡ／ｗｅｌｌとなるように添加した。添加して２４時間後に培地を除去し、Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，　Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）で細胞を溶解した。細胞溶解液中のＦＬｕｃ発光量をＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ　（Ｐｒｏｍｅｇａ）とＧｌｏＭａｘ　９６　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。結果を図１０に示す（ｎ＝５，ｍｅａｎ±ｓ．ｅ．ｍ）。
　図１０に示されるとおり、ｃＲＧＤ修飾率１０％のｍＲＮＡ内包ミセルは、ｃＲＧＤ修飾率０％のｍＲＮＡ内包ミセルよりも高いＦｌｕｃ発現を示した。
［試験例１６：ｍＲＮＡ内包ミセルの血中滞留性評価］
　試験例１３で調製したｃＲＧＤ修飾ＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ内包ミセル（ｃＲＧＤ修飾率：１０％）を１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ溶液に溶解し、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｆｅｍａｌｅ，７ｗｅｅｋｓ　ｏｌｄ；Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｊａｐａｎ　Ｉｎｃ．，Ｋａｎａｇａｗａ，Ｊａｐａｎ）に静脈内投与した（２０μｇ　ｍＲＮＡ／ｍｏｕｓｅ）。投与して５、１０、１５、３０、６０分後に尾静脈から血液２μＬを採取し、１％　２－ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌを含有するＲＬＴ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に添加した。ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてＲＮＡを精製し、Ｈｉｇｈ　Ｃａｐａｃｉｔｙ　ＲＮＡ－ｔｏ－ｃＤＮＡ　Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）により一本鎖ｃＤＮＡへ逆転写した。Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ　７５００　Ｆａｓｔ　Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ　ＰＣＲ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ　Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて、定量ＰＣＲを実施した。結果を、試験例８におけるＴＰＰ導入率９７％のＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）またはＰＥＧ－ＰＬＬを用いて形成したｍＲＮＡ内包ミセルの血中滞留性評価と併せて図１１に示す。
　図１１に示されるとおり、側鎖にＴＰＰを有するカチオン性ブロックコポリマー（ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）、ｃＲＧＤ－ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ））を用いて形成されたｃＲＧＤ修飾ｍＲＮＡ内包ミセル（図中、「Ｃ」で示される）および非ｃＲＧＤ修飾ｍＲＮＡ内包ミセル（図中、「Ｂ」で示される）は、ＰＥＧ－ＰＬＬを用いて形成されたｍＲＮＡ内包ミセル（図中、「Ａ」で示される）よりも血中滞留性が顕著に向上されている。一方、ｃＲＧＤ修飾ｍＲＮＡ内包ミセルは非ｃＲＧＤ修飾ｍＲＮＡ内包ミセルよりも血中滞留性がわずかに劣っている。これは、ｃＲＧＤ修飾によるミセルの素早い組織移行、ｃＲＧＤ修飾によるミセルの安定性低下等の影響と考えられる。
［試験例１７：ｍＲＮＡ内包ミセルのｉｎ　ｖｉｖｏ発現評価］
　ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕｄｅマウス（ｆｅｍａｌｅ，７ｗｅｅｋｓ　ｏｌｄ；Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｊａｐａｎ　Ｉｎｃ．，　Ｋａｎａｇａｗａ，　Ｊａｐａｎ）にＵ８７細胞（５×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｏｕｓｅ）を皮下移植した。３－４週間後、担癌マウス（腫瘍サイズ：４００ｍｍ３程度）にＦｌｕｃ　ｍＲＮＡ内包ミセルを静脈内投与した（２０μｇ　ｍＲＮＡ／ｍｏｕｓｅ）。Ｆｌｕｃ　ｍＲＮＡ内包ミセルとしては、ＴＰＰ導入率が９７％であるＰＥＧ－ＰＬＬ（９７％ＴＰＰ）によって形成したＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ内包ミセル（ｃＲＧＤ修飾率：０％）およびＰＥＧ－ＰＬＬで形成したＦｌｕｃ　ｍＲＮＡ内包ミセル（ｃＲＧＤ修飾率：０％）を用いた。投与して２４時間後に腫瘍を採材した。腫瘍の重量に対し４等量のＣｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ　（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を添加し、ビーズ破砕することで、腫瘍溶解物（ｌｙｓａｔｅ）を得た。腫瘍溶解物中のＦＬｕｃ発光量をＬｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とＧｌｏＭａｘ　９６　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。結果を図１２に示す。
　図１２に示されるとおり、ＰＥＧ－ＰＬＬ（９７％ＴＰＰ）によって形成したＦＬｕｃ　ｍＲＮＡ内包ミセルによれば、ＰＥＧ－ＰＬＬで形成したＦｌｕｃ　ｍＲＮＡ内包ミセルよりも高い腫瘍中でのＦｌｕｃ発現が得られた。
［試験例１８：ｍＲＮＡ内包ミセルの安定性評価］
　ｍＲＮＡ内包ミセルのポリアニオン耐性を次のようにして評価した。
　Ｃｙ３／Ｃｙ５でダブル標識したＦｌｕｃ　ｍＲＮＡとＴＰＰ導入率が異なる種々のＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）またはＰＥＧ－ＰＬＬとを用いてｍＲＮＡ内包ミセルを調製した。Ｃｙ３／Ｃｙ５標識ｍＲＮＡが近接した状態（例えばミセルに内包された状態）で起きるＦＲＥＴを指標に、ミセルからのｍＲＮＡ放出の有無を評価した。平均分子量５ｋＤａのデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）をポリアニオンのモデルとして、ｍＲＮＡ内包ミセル溶液に添加した（最終ｍＲＮＡ濃度：１．６７ｎｇ／μＬ）。この際、ｍＲＮＡのリン酸基に対し、ＤＳＳ由来の硫酸イオンが０、１、２、または３等量のモル比となるようにＤＳＳを添加した。３７度下で１５分間インキュベーション後、ＳＰＡＲＫ（Ｔｅｃａｎ　Ｇｒｏｕｐ　Ｌｔｄ．，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を用いて、５２０ｎｍで励起した際のＣｙ３とＣｙ５の蛍光強度（それぞれ５７０，６８０ｎｍ）を測定した。その後、以下の計算式でＦＲＥＴ　ｒａｔｉｏを算出した。結果を図１３に示す。
　　ＦＲＥＴ　ｒａｔｉｏ＝［Ｃｙ５（６８０ｎｍ）蛍光強度］／［Ｃｙ３（５７０ｎｍ）蛍光強度＋Ｃｙ５（６８０ｎｍ）蛍光強度］
　図１３に示されるとおり、ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）を用いて調製されたｍＲＮＡ内包ミセルは、ＰＥＧ－ＰＬＬを用いて調製されたｍＲＮＡ内包ミセルよりもポリアニオンに対して高い耐性を示した。
［試験例１９：ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ＴＰＰ））ポリマーの合成］
　ＰＥＧ－ｂ－ｐｏｌｙ｛Ｎ－［Ｎ－（２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ）－２－ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ］ａｓｐａｒｔａｍｉｄｅ｝（ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ））、４－（４，６－ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ－１，３，５－ｔｒｉａｚｉｎ－２－ｙｌ）－４－ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｉｕｍ　ｃｈｌｏｒｉｄｅ　ｎ－ｈｙｄｒａｔｅ（ＤＭＴ－ＭＭ，Ｗａｋｏ　Ｐｕｒｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｌｔｄ．，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）、４－（Ｃａｒｂｏｘｙｂｕｔｙｌ）ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ　Ｂｒｏｍｉｄｅ（Ｔｏｋｙｏ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｙ　Ｃｏ．，　Ｌｔｄ．，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて、下記スキームでＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）の側鎖にｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ（ＴＰＰ）を導入した。ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を構成するＰＥＧの質量は１２ｋＤａであり、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）重合度は６８であった。
　具体的には、ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）（２０ｍｇ）と、４－（Ｃａｒｂｏｘｙｂｕｔｙｌ）ｔｒｉｐｈｅｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎｉｕｍ　Ｂｒｏｍｉｄｅ（側鎖第１級アミンに対し２等量ｍｏｌ）とを、５０ｍＭ　ＮａＨＣＯ３／ＭｅＯＨ（３ｍｌ／９ｍｌ）に溶解後、ＤＭＴ－ＭＭ（９０ｍｇ）を２時間ごとに計３回添加し、４℃下で６時間反応させた。反応後、蒸留水とメタノールに対する透析（ＭＷＣＯ：１２－１４ｋＤａ）を行い、未反応物を除去した。７日後に溶液を凍結乾燥することで、白色粉末のＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ＴＰＰ））を得た。
　側鎖へのＴＰＰ導入率は１Ｈ－ＮＭＲスペクトル［Ｄ２Ｏ　ａｔ　８０℃，δ＝３．４－３．６ｐｐｍ（４Ｈ：－ＣＨ２－ＣＨ２－Ｏ－），δ＝７．６－８．０ｐｐｍ（１５Ｈ：Ｐｈ３Ｐ－）］から算出し、側鎖導入率が１００％であることを確認した。
　ＨＣｌ溶液中の各ポリマー（ＰＥＧ－ＰＬＬ、ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）、およびＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ＴＰＰ）））にＮａＯＨ溶液を添加して滴定実験を行うことにより、種々のｐＨにおけるイオン化性を評価した。各ポリマーのＰＥＧの質量は１２ｋＤａであり、ポリアミノ酸セグメントの重合度は６８であり、ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）およびＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ＴＰＰ））におけるＴＰＰの側鎖導入率は１００％であった。結果を図１４に示す。
　図１４に示されるとおり、ＰＥＧ－ＰＬＬおよびＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）はいずれもｐＨ＞７で屈曲点を示し、ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）の方がより明らかな屈曲点を示した。このことから、ポリマー側鎖における一級アミンはアルカリ性ｐＨで緩衝効果を発揮することができ、ＴＰＰの導入によって当該緩衝能が変化し得ると推測される。また、ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ＴＰＰ））の滴定曲線は、酸性ｐＨで変曲点を示し、推定ｐＫａ値は５．９１９であった。このことから、ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ＴＰＰ））の側鎖における第二級アミンは、酸性ｐＨでの緩衝能に寄与し得ると推測される。エンドソームのｐＨは成熟中に約７から約５．５に変化することから、このようなｐＨ範囲内のｐＫａ値を有するポリマーは、イオン化によってエンドソームからの脱出を促進し得ると推測される。
　上記と同様のポリマー（ＰＥＧ－ＰＬＬ、ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）、またはＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ＴＰＰ）））に関して、エンドソーム脱出能を評価した。具体的には、各ポリマーとＬａｂｅｌ　ＩＴ　Ｃｙ５　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ（Ｍｉｒｕｓ　Ｂｉｏ　ＬＬＣ．，　Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて調製したＣｙ５標識ｍＲＮＡとを用いて、上記と同様にしてＣｙ５標識ｍＲＮＡ内包ミセルを調製した。Ｂ１６Ｆ１０細胞を８ウェルチャンバー（ＩＷＡＫＩ　ＡＧＣ　Ｔｅｃｈｎｏ　Ｇｌａｓｓ　Ｃｏ．　Ｌｔｄ．，Ｓｈｉｚｕｏｋａ，Ｊａｐａｎ）に１２５００ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように播種し、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン含有ＲＰＭＩ－１６４０を用いて５％ＣＯ２下で３７°Ｃで２４時間インキュベートした。次いで、Ｃｙ５標識ｍＲＮＡ内包ミセルを３００ｎｇＦｌｕｃ　ｍＲＮＡ／ウェルとなるように各ウェルに添加し、４時間インキュベートした。その後、細胞をＤ－ＰＢＳで３回洗浄した。細胞核およびリソソームを、それぞれＨｏｅｃｈｓｔ　３３３４２（Ｄｏｊｉｎｄｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｋｕｍａｍｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）およびＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒＴＭ　Ｇｒｅｅｎ　ＤＮＤ－２６（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ，ＵＳＡ）で染色した。染色した細胞は、ＬＳＭ　８８０（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて観察した。励起波長は、Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２で４０５ｎｍ、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒで４８８ｎｍ、Ｃｙ５で６３３ｎｍであった。観察画像を図１５に示すとともに（図中、青：核（Ｈｏｅｃｈｓｔ　３３３４２）、緑：後期エンド／リソソーム（ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ）、赤：Ｃｙ５標識ｍＲＮＡ）、観察画像におけるＣｙ５由来の蛍光強度を図１６（ａ）に示す（図のデータは、１５個の細胞についての平均±Ｓ．Ｄ．を示す）。また、ｍＲＮＡとリソソームの共局在を評価するために、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して各細胞に関してピアソンの係数値（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｖａｌｕｅ）を計算した。結果を図１６（ｂ）に示す（図のデータは、２０個の細胞についての平均±ｓ．ｅ．ｍを示す）。有意差検定は、ｏｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡおよびＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ事後検定によって行った。
　図１５に示されるとおり、ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ＴＰＰ））を用いて調製したｍＲＮＡ内包ミセルを用いた場合において、細胞質中で多くのＣｙ５シグナル（結果としてＣｙ５標識ｍＲＮＡの存在）が観察された。また、図１６（ａ）に示されるとおり、ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）を用いて調製したｍＲＮＡ内包ミセルおよびＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ＴＰＰ））を用いて調製したｍＲＮＡ内包ミセルによれば、ＰＥＧ－ＰＬＬを用いて調製したｍＲＮＡ内包ミセルよりもｍＲＮＡの細胞取り込み量が多く、図１６（ｂ）に示されるとおり、ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ＴＰＰ））を用いて調製したｍＲＮＡ内包ミセルでは、ｍＲＮＡの後期エンド／リソソームとの共局在の減少が確認された。このことから、ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）およびＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ＴＰＰ））を用いて調製したｍＲＮＡ内包ミセルはいずれも細胞取り込み性が向上されており、さらに、ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ＴＰＰ））を用いて調製したｍＲＮＡ内包ミセルはエンドソーム脱出能がより向上されていることがわかる。このような優れたエンドソーム脱出能は側鎖における第二級アミンのプロトン化に起因すると推測される。また、ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）を用いて調製したｍＲＮＡ内包ミセルおよびＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ＴＰＰ））を用いて調製したｍＲＮＡ内包ミセルの細胞取り込み量の増大効果は、ＴＰＰ導入によりミセルの安定性が向上したためと考えられる。
［試験例２０：Ｆａｂ’修飾ｍＲＮＡ内包ミセルの調製］
１．ポリマーの調製
　アジド基末端ＰＥＧを有するＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ）を用いたこと以外は試験例１９と同様の方法でＡｚｉｄｅ－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ＴＰＰ））を得た。Ａｚｉｄｅ－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ＴＰＰ））を構成するＰＥＧの質量は１２ｋＤａ、ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ＴＰＰ））の重合度は６８、ＴＰＰの側鎖導入率は１００％であった。
２．ｍＲＮＡの調製
　Ｆｌｕｃ　ｍＲＮＡはＴｒｉｌｉｎｋ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）より購入した。ＮａｎｏＬｕｃ（Ｎｌｕｃ）ｍＲＮＡについては、Ｎｌｕｃ　ｐｌａｓｍｉｄ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）をテンプレートとしてｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写することにより調製した。Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写にはｍＭＥＳＳＡＧＥ　ｍＭＡＣＨＩＮＥ　Ｔ７　Ｕｌｔｒａ　Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用し、ｍＲＮＡ精製にはＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。
３．Ｆａｂ’－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯ調製
　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　１（ＴｆＲ１）に対する抗体ＩｎＶｉｖｏＭＡｂ　ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ　ＣＤ７１（Ｂｉｏ　Ｘ　Ｃｅｌｌ，Ｌｅｂａｎｏｎ，ＮＨ）を断片化することでＦａｂ’の調製を行った。抗体のＦｃ部分を２００ｍＭ　ａｃｅｔａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ４．４）中２４時間３７度下でｐｅｐｓｉｎ消化することで（Ｆａｂ’）２を得た。限外濾過（ＭＷＣＯ：３０ｋＤａ）によりｂｕｆｆｅｒを５００ｍＭ　ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ　ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ＰＢ）（ｐＨ７．４）に置換し、ｓｉｚｅ　ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　（ＳＥＣ）により（Ｆａｂ’）２を精製した。ＳＥＣはＥｘｔｒｅｍａ　４５００　Ｍｏｄｅｌ（ＪＡＳＣＯ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）を用いて行った（ｃｏｌｕｍｎ：Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００　Ｉｎｃｒｅａｓｅ１０／３００ｇｌ；ｅｌｕｅｎｔ：１０　ｍＭ　ＰＢ（５００ｍＭ　ＮａＣｌ），ｐＨ７．４；室温；流速：０．５ｍＬ／ｍｉｎ；ｄｅｔｅｃｔｏｒ：ＵＶ２２０ｎｍ）。
　次に（Ｆａｂ’）２を還元することでＦａｂ’を調製した。５００ｍＭ　ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ　ＰＢ中で（Ｆａｂ’）２（１ｍｇ／ｍＬ）を０．２ｍＭのｔｒｉｓ（２－ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ）ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ（ＴＣＥＰ）と室温で２時間インキュベーションした。続いて（Ｆａｂ’）２に対し５等量のＤＢＣＯ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ（Ｂｒｏａｄｐｈａｒｍ，Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を添加し、室温で２時間インキュベーションした。その後、限外濾過（ＭＷＣＯ：３０ｋＤａ）によりｂｕｆｆｅｒを５００ｍＭ　ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ　ＰＢ（ｐＨ７．４）に置換し、ＳＥＣによりＦａｂ’－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯを取得した。
４．ｍＲＮＡ内包ミセルの調製
　ｍＲＮＡ（Ｆｌｕｃ　ｍＲＮＡまたはＮＬｕｃ　ｍＲＮＡ）およびポリマー（Ａｚｉｄｅ－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ＴＰＰ））またはＡｚｉｄｅ－ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ））をそれぞれ１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．３）に溶解した。Ａｚｉｄｅ－ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ）のＰＥＧ質量は１２ｋＤａであり、重合度は６８であり、ＴＰＰ導入率は１００％であった。
　ポリマーのカチオン性基とｍＲＮＡのリン酸基のモル比が３：１となるように、ポリマー溶液（Ａｚｉｄｅ－ＰＥＧ－ＰＡｓｐ（ＤＥＴ（ＴＰＰ））またはＡｚｉｄｅ－ＰＥＧ－ＰＬＬ（ＴＰＰ））とｍＲＮＡ溶液（５０ｎｇ／μＬ）とをボルテックス下で１：２のボリューム比で混合し、氷上で１０分間静置した。これにより、表面にＡｚｉｄｅ基が配置されたｍＲＮＡ内包ミセルを調製した。
　上記で得られたＦｌｕｃ　ｍＲＮＡ内包ミセルの粒子径および多分散度（ＰＤＩ）を動的光散乱法（ＤＬＳ）で測定した。ＤＬＳ測定には、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ９０（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ．，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用し、２５℃、９０°の検出角度で測定した。結果を表４に示す。
５．ｍＲＮＡ内包ミセル表面へのＦａｂ’修飾
　上記４．で調製したｍＲＮＡ内包ミセル表面のＡｚｉｄｅ基に対し、０．０５、０．１、または０．２等量のＦａｂ’－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯを添加し、４℃で１時間インキュベーションした。
　上記のようにして得られたＦａｂ’修飾Ｆｌｕｃ　ｍＲＮＡ内包ミセルの粒子径および多分散度（ＰＤＩ）を動的光散乱法（ＤＬＳ）で測定した。ＤＬＳ測定には、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ　Ｎａｎｏ　ＺＳ９０　（Ｍａｌｖｅｒｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　Ｌｔｄ．，　Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，　ＵＫ）を使用し、２５　℃、９０°の検出角度で測定した。
　また、ミセル当たりのＦａｂ’結合数を蛍光相関分光法（ＦＣＳ）によって測定した。具体的には、（Ｆａｂ’）２に４等量モルのｓｕｌｆｏ－ｃｙ３－ＮＨＳ　ｅｓｔｅｒを添加し、一晩インキュベーションした。限外濾過（ＭＷＣＯ：３０ｋＤａ）により未反応のｃｙ３を除去し、上記と同様の方法でＦａｂ’への還元およびＰＥＧ４－ＤＢＣＯの修飾を行うことで、ｃｙ３標識Ｆａｂ’－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯを得た。ｃｙ３標識Ｆａｂ’－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯを用いたこと以外は上記と同様にしてＦａｂ’修飾Ｆｌｕｃ　ｍＲＮＡ内包ミセルを調製し、ＦＣＳ測定によりＣｙ３由来の各種パラメータ（拡散時間、ｃｏｕｎｔ　ｐｅｒ　ｍｏｌｅｃｕｌｅ（ＣＰＭ））を評価した。ＦＣＳ測定にはＬＳＭ　７８０（Ｃａｒｌ　Ｚｅｉｓｓ，　Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、蛍光励起波長として５４３ｎｍを使用した。Ｆａｂ’修飾Ｆｌｕｃ　ｍＲＮＡ内包ミセル（Ｆａｂ’－ｍＲＮＡ／ＰＭ）におけるミセル当たりのＦａｂ’結合数は以下の数式で算出した。
　　　ミセル当たりのＦａｂ’結合数＝［ＣＰＭ　ｏｆ　Ｆａｂ’－ｍＲＮＡ／ＰＭ］　／　［ＣＰＭ　ｏｆ　ｆｒｅｅ　Ｆａｂ’－ＰＥＧ４－ＤＢＣＯ］
　結果を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
［試験例２１：Ｆａｂ’修飾ｍＲＮＡ内包ミセルの細胞内タンパク質発現評価］
　１０％ＦＢＳと１％ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ／ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）を含有したＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）中でＢ１６Ｆ１０細胞の培養を行った。Ｂ１６Ｆ１０細胞は、ＴｆＲ１陽性細胞である。具体的には、９６－ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅにＢ１６Ｆ１０細胞を播種（１５０００ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌ）し、２４時間インキュベーション後に試験例２０で調製したＦａｂ’修飾ＮＬｕｃ　ｍＲＮＡ内包ミセルを１６５ｎｇ　ｍＲＮＡ／ｗｅｌｌとなるように添加した。添加して２４時間後に培地を除去し、Ｃｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）で細胞を溶解した。細胞溶解液中の発光量をＮａｎｏ－Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）およびＧｌｏＭａｘ　９６　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。結果を図１７に示す。
　図１７に示されるとおり、ＤＥＴ（ＴＰＰ）／ｍおよびＰＬＬ（ＴＰＰ）／ｍはいずれも、Ｆａｂ’修飾量の増大に伴ってＮｌｕｃの発現量が増大し、ＤＥＴ（ＴＰＰ）／ｍはＰＬＬ（ＴＰＰ）／ｍよりも高い増大率を示した。このような結果は、Ｆａｂ’修飾されることでミセルの細胞内への取り込み量または取り込み速度が向上されたこと、ＤＥＴ（ＴＰＰ）／ｍが優れたエンドソーム脱出能を発揮したこと等に依ると推測され得る。
［試験例２２：Ｆａｂ’修飾ｍＲＮＡ内包ミセルのｉｎ　ｖｉｖｏタンパク質発現評価］
　試験例２０で調製した０．０５ｅｑのＦａｂ’修飾ＮＬｕｃ　ｍＲＮＡ内包ミセルおよびＦａｂ’修飾していないＮＬｕｃ　ｍＲＮＡ内包ミセルを１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含有する１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ溶液に添加し、ＢＡＬＢ／ｃマウス（ｆｅｍａｌｅ，７ｗｅｅｋｓ　ｏｌｄ；Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｊａｐａｎ　Ｉｎｃ．，Ｋａｎａｇａｗａ，Ｊａｐａｎ）に静脈内投与した（１０μｇ　Ｎｌｕｃ　ｍＲＮＡ／ｍｏｕｓｅ）。投与して２４時間後に臓器（脳、肝臓、脾臓、腎臓、肺、心臓）を採材した。各臓器の重量に対し４等量のＣｅｌｌ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｌｙｓｉｓ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）を添加し、ビーズ破砕することで、臓器ｌｙｓａｔｅを得た。各臓器ｌｙｓａｔｅ中のＮｌｕｃ発光量をＮａｎｏ－Ｇｌｏ　Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ　Ａｓｓａｙ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）とＧｌｏＭａｘ　９６　Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ　Ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で測定した。結果を図１８に示す。
　図１８に示されるとおり、ＤＥＴ（ＴＰＰ）／ｍは、ｉｎ　ｖｉｖｏで脳に送達されて、脳内でＮＬｕｃを発現することができ、その発現量は抗ＴｆＲ１抗体のＦａｂ’で修飾されたＤＥＴ（ＴＰＰ）／ｍの方が優れていた。
　本発明のカチオン性ポリマーは、核酸、タンパク質等のアニオン性薬剤のＤＤＳキャリアとして好適に用いられ得る。

Claims (15)

  1. 　側鎖にホスホニウム基を有するカチオン性ポリマーセグメントと、親水性ポリマーセグメントと、を有する、カチオン性ブロックコポリマー。
  2. 　前記ホスホニウム基が、Ｎ－メチルペンタンアミドの５位の炭素に導入して得られるホスホニウムカチオンとして測定した場合に、－１以上のオクタノール／水分配係数を有するホスホニウム基である、請求項１に記載のカチオン性ブロックコポリマー。
  3. 　前記カチオン性ポリマーセグメントが有する前記ホスホニウム基の数が、５以上である、請求項１に記載のカチオン性ブロックコポリマー。
  4. 　前記カチオン性ポリマーセグメントが、側鎖にホスホニウム基を有するホスホニウム基含有アミノ酸残基を含むカチオン性ポリアミノ酸で構成されている、請求項１に記載のカチオン性ブロックコポリマー。
  5. 　前記カチオン性ポリアミノ酸の重合度に対する前記ホスホニウム基含有アミノ酸残基数の割合が、５％以上である、請求項４に記載のカチオン性ブロックコポリマー。
  6. 　前記親水性ポリマーセグメントが、ポリ（エチレングリコール）、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリ（アクリルアミド）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリルアミド）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ（メタクリル酸エステル）、ポリ（アクリル酸エステル）、ポリアミノ酸、ポリ（リンゴ酸）、またはこれらの誘導体で構成されている、請求項１に記載のカチオン性ブロックコポリマー。
  7. 　側鎖にホスホニウム基を有するホスホニウム基含有アミノ酸残基を含む、カチオン性ポリアミノ酸。
  8. 　前記ホスホニウム基が、Ｎ－メチルペンタンアミドの５位の炭素に導入して得られるホスホニウムカチオンとして測定した場合に、－１以上のオクタノール／水分配係数を有するホスホニウム基である、請求項７に記載のカチオン性ポリアミノ酸。
  9. 　重合度に対する前記ホスホニウム基含有アミノ酸残基数の割合が、５％以上である、請求項７に記載のカチオン性ポリアミノ酸。
  10. 　重合度が５以上１５０以下である、請求項７に記載のカチオン性ポリアミノ酸。
  11. 　請求項１から６のいずれかに記載のカチオン性ブロックコポリマーおよび／または請求項７から１０のいずれかに記載のカチオン性ポリアミノ酸を含む、ポリマー粒子。
  12. 　ミセルまたはベシクルである、請求項１１に記載のポリマー粒子。
  13. 　薬剤をさらに含む、請求項１１に記載のポリマー粒子。
  14. 　前記薬剤が、核酸およびタンパク質から選択される少なくとも一種である、請求項１３に記載のポリマー粒子。
  15. 　請求項１から６のいずれかに記載のカチオン性ブロックコポリマーおよび／または請求項７から１０のいずれかに記載のカチオン性ポリアミノ酸と、薬剤と、を含む、医薬組成物。
PCT/JP2024/013965 2023-04-14 2024-04-04 ホスホニウム基を有するカチオン性ポリマーおよびこれを含むポリマー粒子または医薬組成物 Ceased WO2024214632A1 (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2023066279 2023-04-14
JP2023-066279 2023-04-14
JP2024004164A JP2024152597A (ja) 2023-04-14 2024-01-15 ホスホニウム基を有するカチオン性ポリマーおよびこれを含むポリマー粒子または医薬組成物
JP2024-004164 2024-01-15

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024214632A1 true WO2024214632A1 (ja) 2024-10-17

Family

ID=93059201

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2024/013965 Ceased WO2024214632A1 (ja) 2023-04-14 2024-04-04 ホスホニウム基を有するカチオン性ポリマーおよびこれを含むポリマー粒子または医薬組成物

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2024214632A1 (ja)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2011173802A (ja) * 2010-02-23 2011-09-08 Nano Career Kk 短鎖のカチオン性ポリアミノ酸およびその使用
JP2012122075A (ja) * 1999-04-20 2012-06-28 Univ Of British Columbia カチオン性ｐｅｇ脂質および使用方法
CN107674210A (zh) * 2017-09-21 2018-02-09 浙江大学 三苯基膦‑壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束及制备与应用
WO2022191107A1 (ja) * 2021-03-10 2022-09-15 Ａｇｃ株式会社 含ハロゲン部位を有するポリマーおよび該ポリマーを用いた医薬組成物

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2012122075A (ja) * 1999-04-20 2012-06-28 Univ Of British Columbia カチオン性ｐｅｇ脂質および使用方法
JP2011173802A (ja) * 2010-02-23 2011-09-08 Nano Career Kk 短鎖のカチオン性ポリアミノ酸およびその使用
CN107674210A (zh) * 2017-09-21 2018-02-09 浙江大学 三苯基膦‑壳聚糖硬脂酸嫁接物载药胶束及制备与应用
WO2022191107A1 (ja) * 2021-03-10 2022-09-15 Ａｇｃ株式会社 含ハロゲン部位を有するポリマーおよび該ポリマーを用いた医薬組成物

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8153110B2 (en) Environment-responding siRNA carrier using disulfide-cross-linked polymeric micelle
JP5436779B2 (ja) 遺伝子送達用の生分解性架橋カチオン性マルチブロックコポリマーおよびそれを製造する方法
Kim et al. Comparison between arginine conjugated PAMAM dendrimers with structural diversity for gene delivery systems
CN104093768B (zh) 导入有苯基硼酸基的嵌段共聚物及其使用
Johnson et al. HPMA-oligolysine copolymers for gene delivery: optimization of peptide length and polymer molecular weight
ES2453317T3 (es) Poliaminoácido catiónico de cadena corta y uso del mismo
EA036400B1 (ru) Композиции для введения рнк в клетки
Kano et al. Grafting of poly (ethylene glycol) to poly-lysine augments its lifetime in blood circulation and accumulation in tumors without loss of the ability to associate with siRNA
Wang et al. Double click-functionalized siRNA polyplexes for gene silencing in epidermal growth factor receptor-positive tumor cells
US20160106673A1 (en) Amphiphilic block copolymers for nucleic acid delivery
Elsabahy et al. RETRACTED: Delivery of Nucleic Acids through the Controlled Disassembly of Multifunctional Nanocomplexes
Vlasova et al. Synthesis of ionizable lipopolymers using split-Ugi reaction for pulmonary delivery of various size RNAs and gene editing
Luo et al. Artificial peptides for antitumoral siRNA delivery
WO2020067142A1 (en) Amphiphilic poly(amino acid), block copolymer using the amphiphilic poly(amino acid), and complex including the amphiphilic poly(amino acid) or the block copolymer and nucleic acid
Aldawsari et al. Enhanced gene expression in tumors after intravenous administration of arginine-, lysine-and leucine-bearing polyethylenimine polyplex
CN115151278A (zh) 用于核酸疗法的靶向肿瘤的多肽纳米颗粒递送系统
US20250312466A1 (en) Nucleic acid closing polymeric micelle
JP2024152597A (ja) ホスホニウム基を有するカチオン性ポリマーおよびこれを含むポリマー粒子または医薬組成物
WO2024190929A1 (ja) タンパク質送達用ｐＨ応答性担体
Koyama et al. Effect of cholesteryl side chain and complexing with cholic acid on gene transfection by cationic poly (ethylene glycol) derivatives
CN117940484A (zh) 星形pAsp-低聚胺衍生物
US20040086481A1 (en) Cationic polymer-nucleic acid complexes and methods of making them
Wu et al. Galactosylated 2‐hydroxypropyl methacrylamide‐s‐3‐guanidinopropyl methacrylamide copolymer as a small hairpin RNA carrier for inhibiting human telomerase reverse transcriptase expression
Patel Development of Amino Acid-Modified Drug Delivery Systems for RNA Delivery in Cancer Therapeutics
CA3225129A1 (en) Non-covalent shielding polymers

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 24788657

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 24788657

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1