WO2024075662A1 - 脳卒中の検査方法、及び脳卒中の改善剤 - Google Patents

脳卒中の検査方法、及び脳卒中の改善剤 Download PDF

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WO2024075662A1
WO2024075662A1 PCT/JP2023/035817 JP2023035817W WO2024075662A1 WO 2024075662 A1 WO2024075662 A1 WO 2024075662A1 JP 2023035817 W JP2023035817 W JP 2023035817W WO 2024075662 A1 WO2024075662 A1 WO 2024075662A1
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streptococcus
stroke
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良和 中岡
匡史 猪原
▲頼▼都 服部
修一 殿村
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国立研究開発法人国立循環器病研究センター
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Definitions

  • the present disclosure relates to a method for testing the presence or absence of stroke or the type of stroke, a method for testing the severity of stroke, a method for testing the risk of stroke recurrence, and a testing method for predicting the prognosis of stroke.
  • the present disclosure also relates to a stroke improving agent and a screening method thereof.
  • Stroke is a disease in which blood circulation in the brain is impaired due to the sudden rupture or blockage of blood vessels in the brain, and is one of the major causes of death and disability worldwide. Strokes are broadly classified into hemorrhagic strokes (cerebral hemorrhage), in which blood vessels rupture, and ischemic strokes (cerebral infarction), in which blood vessels become blocked. Cerebral hemorrhage includes intracerebral hemorrhage (intracerebral hemorrhage), in which bleeding occurs in the brain tissue itself, and subarachnoid hemorrhage, in which bleeding occurs in the subarachnoid space mainly due to the rupture of a cerebral aneurysm.
  • Cerebral hemorrhage includes intracerebral hemorrhage (intracerebral hemorrhage), in which bleeding occurs in the brain tissue itself, and subarachnoid hemorrhage, in which bleeding occurs in the subarachnoid space mainly due to
  • cerebral infarction There are various clinical disease types of cerebral infarction, such as cardiogenic cerebral embolism, atherothrombotic cerebral infarction, and lacunar infarction, based on the cause of blood vessel blockage. It is also known that strokes have a high recurrence rate.
  • strokes have been diagnosed using imaging tests such as CT scans and MRI scans, but such a diagnosis is not necessarily easy even for stroke specialists. Therefore, if it were possible to test for strokes using biomarkers that change in response to biological reactions, it is expected that the accuracy of diagnoses using imaging tests will be improved and optimal personalized medical care will be realized according to each case.
  • Patent Document 1 describes that an increase in the content of vesicles derived from Collinsella and Flavobacterium bacteria and a decrease in the content of vesicles derived from Lactobacillus and Propionibacterium bacteria was observed in the blood of stroke patients, and that stroke can be diagnosed by analyzing the increase or decrease in the content of extracellular vesicles derived from these bacteria through metagenomic analysis of blood.
  • Non-Patent Document 1 describes that a high proportion of patients with intracerebral hemorrhage and stroke patients accompanied by cerebral microbleeds have CNM-positive Streptococcus mutans in their oral bacterial flora.
  • one object of the present disclosure is to provide a method for testing for the presence or absence of stroke or the type of stroke using the intestinal microflora or oral microflora. Another object of the present disclosure is to provide a method for testing the severity of stroke using the intestinal microflora. Yet another object of the present disclosure is to provide a method for testing the risk of stroke recurrence using the intestinal microflora. Yet another object of the present disclosure is to provide a method for testing for predicting the prognosis of stroke using the intestinal microflora. Yet another object of the present disclosure is to provide a method for screening stroke improving agents and ingredients effective in improving stroke.
  • the present inventors have focused on the gut flora and oral flora of stroke patients and conducted various studies, finding that stroke patients have a disturbance in the oral flora (increase in periodontal disease bacteria and dental caries bacteria) and a shift of oral bacteria to the gut flora, causing gut microbial oralization, etc.
  • the present inventors have obtained the following findings through a stroke cohort study.
  • Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, and Streptococcus salivalius are bacteria that are normally present in the oral cavity and are not normally present in the intestinal flora.
  • Lactobacillus fermentum is not normally present in the intestinal flora, but is found in the intestinal flora of stroke patients.
  • the presence or absence of Lactobacillus fermentum in the intestinal flora can be a diagnostic indicator for stroke.
  • stroke patients have increased relative abundance of Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivarius, Lactobacillus fermentum, Clostridium perfringens, Alistispes putredinis, Bacteroides fragilis, Streptococcus, Lactobacillus, Alistispes, and Streptococcaceae bacteria in the intestinal microbiota, and the relative abundance of these bacteria in the intestinal microbiota may be a diagnostic indicator for stroke.
  • stroke patients had a higher abundance of Bacteroides plebeius, Anaerostipes hadrus, Ruminococcus bicirculans, Bacteroides vulgatus, Prevotella copri, Sutterella wadsworthensis, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium longum, Eubacterium rectale, and Dialister invissus in the intestinal flora.
  • the relative abundance of bacteria from the genera Fusicatenibacter, Faecalibacterium, Dorea, Anaerostipes, Ruminococcus, Butyricoccus, Bifidobacterium, Bifidobacteriaceae, and Prevotellaceae in the gut microbiota is decreased, and the relative abundance of these bacteria in the gut microbiota may be a diagnostic indicator for stroke.
  • patients with cardiogenic cerebral embolism have an increased relative abundance of Bacteroides flagellis, Lactobacillus fermentum, Streptococcus mutans, and Streptococci family bacteria in the intestinal flora, and a decreased relative abundance of Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium genus bacteria, and Bifidobacteriaceae bacteria in the intestinal flora.
  • the relative abundance of these bacteria in the intestinal flora may be a diagnostic indicator for cardiogenic cerebral embolism.
  • the relative abundance of these bacteria in the intestinal microbiota may be a test indicator of sarcopenia in stroke patients.
  • Stroke patients who have Streptococcus anginosus in their intestinal flora have a high risk of death or recurrence of vascular disease (ischemic stroke, hemorrhagic stroke, myocardial infarction, worsening heart failure, or peripheral vascular occlusion) within two years, and the presence or absence of Streptococcus anginosus in the intestinal flora may be a test indicator for predicting the prognosis of stroke.
  • ischemic stroke hemorrhagic stroke, myocardial infarction, worsening heart failure, or peripheral vascular occlusion
  • stroke patients had a higher abundance of Streptococcus anginosus, Treponema denticola, Streptococcus cristatus, Prevotella loescheii, Lactobacillus fermentum, Streptococcus gordonii, Streptococcus constellatus, Campylobacter gracilis, Selenomonas sproda, Tannerella forsythia, and other oral flora.
  • the relative abundance of bacteria in the oral microbiota may be an indicator of stroke.
  • the present inventors analyzed serum equol concentrations in healthy subjects and stroke patients and found that serum equol concentrations in stroke patients correlate with the risk of onset of each type of stroke, the risk of stroke severity, and functional prognosis of stroke. Specifically, the present inventors obtained the following findings by investigating serum equol concentrations in stroke patients. (16) Compared to healthy subjects, patients with cardiogenic cerebral embolism have a significantly lower proportion of equol producers (those with serum equol concentration of 1 ng/mL or higher). Serum equol concentration may therefore be a useful test indicator for determining the risk of developing cardiogenic cerebral embolism.
  • the present inventors have found, through experiments using stroke-prone spontaneously hypertensive rat models, that antibiotics are useful as drugs for improving stroke. Specifically, the present inventors have found the following through experiments using stroke-prone spontaneously hypertensive rat models.
  • the composition of the intestinal flora was different in salt-sensitive, stroke-prone spontaneously hypertensive rat models when they were orally administered water alone, salt alone, or salt plus antibiotics. As with the aforementioned results in humans, the onset of stroke symptoms in these model rats led to changes in the intestinal flora.
  • Item 1 A method for testing for the presence or absence of stroke, comprising: The method includes a step of determining the presence or absence of at least one bacterium selected from the group consisting of Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivalius, and Lactobacillus fermentum in the intestinal bacterial flora collected from the subject.
  • Item 1 A method for testing for the presence or absence of stroke, comprising: The method includes a step of determining the presence or absence of at least one bacterium selected from the group consisting of Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivalius, and Lactobacillus fermentum in the intestinal bacterial flora collected from the subject.
  • kits for testing the presence or absence of stroke comprising: The kit further comprises a primer capable of specifically detecting at least one bacterium selected from the group consisting of Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivalius, and Lactobacillus fermentum. Item 3.
  • a method for testing the presence or absence of stroke or its type comprising: In the gut microbiota collected from the subjects, Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivalius, Lactobacillus fermentum, Clostridium perfringens, Alistispes putredinis, Bacteroides fragilis, Streptococcus bacteria, Lactobacillus bacteria, Alistispes bacteria, Streptococcus plebeius, Bacteroides ...
  • Item 4 A method for testing whether a patient has suffered from sarcopenia-associated stroke, Item 4.
  • the bacterium is at least one bacterium selected from the group consisting of Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Clostridium perfringens, Alistispes putredinis, Bacteroides vulgatus, Prevotella copri, and Butyricoccus bacteria.
  • Item 5 A method for testing for the presence or absence of cardiogenic cerebral embolism, Item 4.
  • the bacterium is at least one selected from the group consisting of Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium longum, Bacteroides fragilis, Lactobacillus fermentum, Streptococcus mutans, Bifidobacterium, bacteria of the family Streptococcaceae, and bacteria of the family Bifidobacteriaceae.
  • Item 6. A method for testing the presence or absence of lacunar infarction, Item 4.
  • the method according to item 3, wherein the bacterium is at least one selected from the group consisting of Sutterella wadsworthensis, bacteria of the family Streptococcaceae, and bacteria of the family Prevotellaceae.
  • a method for testing for the presence or absence of atherothrombotic cerebral embolism comprising: Item 4. The method according to Item 3, wherein the bacterium is at least one selected from the group consisting of Streptococcus mutans and bacteria of the family Streptococcaceae.
  • Item 8. A method for testing for the presence or absence of intracerebral hemorrhage, Item 4. The method according to Item 3, wherein the bacterium is at least one selected from the group consisting of Eubacterium rectale, Dialister invisus, and Prevotellaceae bacteria.
  • a kit for testing the presence or absence of stroke or the type of stroke comprising: In the gut microbiota collected from the subjects, Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivalius, Lactobacillus fermentum, Clostridium perfringens, Alistispes putredinis, Bacteroides fragilis, Streptococcus bacteria, Lactobacillus bacteria, Alistispes bacteria, Streptococcus plebeius, Bacteroides ...
  • a method for examining the severity of a stroke comprising: The method includes a step of measuring the relative abundance of at least one bacterium selected from the group consisting of Streptococcus anginosus, Anaerostipes hadrus, Bacteroides plebeius, Eubacterium rectale, Prevotella copri, and Lactobacillus fermentum in the intestinal flora collected from the subject. Item 11.
  • a kit for testing the severity of a stroke comprising: The kit further comprises a primer capable of specifically detecting at least one bacterium selected from the group consisting of Streptococcus anginosus, Anaerostipes hadrus, Bacteroides plebeius, Eubacterium rectale, Prevotella copri, and Lactobacillus fermentum.
  • a method for examining a risk of recurrent stroke comprising: The method further comprises a step of measuring the relative abundance of Streptococcus anginosus in the intestinal flora collected from the subject.
  • a kit for testing a risk of recurrent stroke comprising: The above kit further comprises a primer capable of specifically detecting Streptococcus anginosus.
  • Item 14 A method for predicting the prognosis of stroke, comprising: The method, which comprises a step of determining the presence or absence of Streptococcus anginosus in the intestinal bacterial flora collected from the subject.
  • Item 15 A test kit for predicting the prognosis of stroke, comprising: The above kit further comprises a primer capable of specifically detecting Streptococcus anginosus.
  • Item 16 A method for testing the presence or absence of sarcopenia in a stroke patient, comprising: The method includes a step of measuring the relative abundance of at least one bacterium selected from the group consisting of Ruminococcus torques and Veillonella in the intestinal bacterial flora collected from the subject.
  • a kit for testing the presence or absence of sarcopenia in a stroke patient comprising: The above kit further comprises a primer capable of specifically detecting at least one bacterium selected from the group consisting of Ruminococcus torques and Veillonella. Item 18.
  • a method for testing for the presence or absence of stroke comprising: The oral microbiota samples collected from subjects included Streptococcus anginosus, Treponema denticola, Streptococcus cristatus, Prevotella loescheii, Lactobacillus fermentum, Streptococcus gordonii, Streptococcus constellatus, Campylobacter gracilis, Selenomonas sproda, Tannerella forsythia, and others.
  • Porphyromonas bacteria forsythia, Porphyromonas bacteria, Fusobacterium bacteria, Streptococcus bacteria, Capnocytophaga bacteria, Campylobacter bacteria, Streptococcus family bacteria, Eubacterium sulci, Streptococcus infantis, Haemophilus parainfluenzae, Prevotella nanceiensis, Lancefieldella parvula, Neisseria bacteria, Saccharimonadaceae TM7x TM7x bacteria, Hemophilus bacteria, Alloprevotella bacteria, Prevotellaceae bacteria, and Veillonellaceae bacteria. Item 19.
  • a kit for testing the presence or absence of stroke comprising: Streptococcus anginosus, Treponema denticola, Streptococcus cristatus, Prevotella loescheii, Lactobacillus fermentum, Streptococcus gordonii, Streptococcus constellatus, Campylobacter gracilis, Selenomonas sproda, Tannerella forsythia forsythia, Porphyromonas bacteria, Fusobacterium bacteria, Streptococcus bacteria, Capnocytophaga bacteria, Campylobacter bacteria, Streptococcus family bacteria, Eubacterium sulci, Streptococcus infantis, Haemophilus parainfluenzae, Prevotella nanceiensis, Lancefieldella parvula, Neisseria bacteria, Saccharimonadaceae TM7x
  • the kit further comprises a primer capable of specifically detecting at least one type of bacteria
  • Item 20 An agent for improving stroke, comprising as an active ingredient a substance that normalizes the intestinal flora or oral flora of a stroke patient.
  • the active ingredient is capable of suppressing the proliferation and proliferation of Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivalius, Lactobacillus fermentum, Clostridium perfringens, Alistispes putredinis, Bacteroides flagellis, and the like in intestinal flora.
  • the active ingredient is capable of suppressing the proliferation and proliferation of Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivalius, Lactobacillus fermentum, Clostridium perfringens, Alistispes putredinis, Bacteroides flagellis, and the like in intestinal flora.
  • the stroke improving agent according to item 20 which is a substance that reduces the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Bacillus fragilis, Streptococcus bacteria, Lactobacillus bacteria, Alistispes bacteria, Streptococcaceae bacteria, and Veillonella bacteria.
  • Item 22 The improving agent according to Item 21, wherein the active ingredient is an antibiotic or an antibody that exhibits binding to the bacteria.
  • the active ingredient is capable of suppressing the intestinal flora of Bacteroides plebeius, Anaerostipes hadrus, Ruminococcus bicirculans, Bacteroides vulgatus, Prevotella copri, Sutterella wadsworthensis, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium longum, Eubacterium rectale, Dialister invisus, Ruminococcus torcu, and the like. Item 21.
  • the stroke improving agent according to Item 20 which is a substance that increases the relative abundance of at least one bacterium selected from the group consisting of bacteria of the genus Fusicatenibacter, bacteria of the genus Faecalibacterium, bacteria of the genus Dorea, bacteria of the genus Anaerostipes, bacteria of the genus Ruminococcus, bacteria of the genus Butyricoccus, bacteria of the genus Bifidobacterium, bacteria of the family Bifidobacteriaceae, and bacteria of the family Prevotellaceae.
  • Item 24 which is a substance that increases the relative abundance of at least one bacterium selected from the group consisting of bacteria of the genus Fusicatenibacter, bacteria of the genus Faecalibacterium, bacteria of the genus Dorea, bacteria of the genus Anaerostipes, bacteria of the genus Ruminococcus, bacteria of the genus Butyricoccus, bacteria of the genus Bifi
  • the active ingredient is capable of suppressing the activity of Streptococcus anginosus, Treponema denticola, Streptococcus cristatus, Prevotella loescheii, Lactobacillus fermentum, Streptococcus gordonii, Streptococcus constellatus, Campylobacter gracilis, Selenomonas sproda, Tannerella forsythia, and/or other microorganisms in the oral cavity. Item 21.
  • the agent for improving stroke according to Item 20 which is a substance that reduces the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Porphyromonas bacteria, Fusobacterium bacteria, Streptococcus bacteria, Capnocytophaga bacteria, Campylobacter bacteria, and Streptococcaceae bacteria.
  • Item 25 is a substance that reduces the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Porphyromonas bacteria, Fusobacterium bacteria, Streptococcus bacteria, Capnocytophaga bacteria, Campylobacter bacteria, and Streptococcaceae bacteria.
  • Item 26. Use of a substance that normalizes the intestinal flora or oral flora of a stroke patient for the manufacture of an agent for improving stroke.
  • Item 27 Use of a substance that normalizes the intestinal flora or oral flora of a stroke patient for the manufacture of an agent for improving stroke.
  • the substance is capable of suppressing the proliferation and proliferation of Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivalius, Lactobacillus fermentum, Clostridium perfringens, Alistispes putredinis, Bacteroides flagellis, and the like in intestinal flora.
  • Item 27 The use according to Item 26, wherein the substance reduces the relative abundance of at least one bacterium selected from the group consisting of Bacillus fragilis, Streptococcus bacteria, Lactobacillus bacteria, Alistispes bacteria, Streptococcaceae bacteria, and Veillonella bacteria.
  • Item 26 wherein the substance is an antibiotic or an antibody that exhibits binding to the bacterium.
  • Item 29 The substance is capable of inhibiting the intestinal flora of Bacteroides plebeius, Anaerostipes hadrus, Ruminococcus bicirculans, Bacteroides vulgatus, Prevotella copri, Sutterella wadsworthensis, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium longum, Eubacterium rectale, Dialister invisus, Ruminococcus torcu, and the like.
  • Item 27 Item 27.
  • the substance increases the relative abundance of at least one bacterium selected from the group consisting of: Fusicatenibacter bacteria, Faecalibacterium bacteria, Dorea bacteria, Anaerostipes bacteria, Ruminococcus bacteria, Butyricoccus bacteria, Bifidobacterium bacteria, Bifidobacteriaceae bacteria, and Prevotellaceae bacteria.
  • bacterium selected from the group consisting of: Fusicatenibacter bacteria, Faecalibacterium bacteria, Dorea bacteria, Anaerostipes bacteria, Ruminococcus bacteria, Butyricoccus bacteria, Bifidobacterium bacteria, Bifidobacteriaceae bacteria, and Prevotellaceae bacteria.
  • the substance is capable of inhibiting the activity of Streptococcus anginosus, Treponema denticola, Streptococcus cristatus, Prevotella loescheii, Lactobacillus fermentum, Streptococcus gordonii, Streptococcus constellatus, Campylobacter gracilis, Selenomonas sproda, Tannerella forsythia, or a combination thereof in oral bacterial flora. Item 27.
  • Item 26 wherein the substance increases the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Eubacterium sulci, Streptococcus infantis, Haemophilus parainfluenzae, Prevotella nanceiensis, Lancefieldella parvula, Neisseria bacteria, Saccharimonadaceae TM7x bacteria, Hemophilus bacteria, Alloprevotella bacteria, Prevotellaceae bacteria, and Veillonellaceae bacteria in the oral microflora.
  • Item 32 A method for improving stroke, comprising administering to a stroke patient a substance that normalizes intestinal flora or oral flora in an amount effective for improving stroke.
  • Item 33 A method for improving stroke, comprising administering to a stroke patient a substance that normalizes intestinal flora or oral flora in an amount effective for improving stroke.
  • the substance is capable of suppressing the proliferation and proliferation of Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivalius, Lactobacillus fermentum, Clostridium perfringens, Alistispes putredinis, Bacteroides flagellis, and the like in intestinal flora.
  • Item 33 The method according to Item 32, wherein the substance reduces the relative abundance of at least one bacterium selected from the group consisting of Bacillus fragilis, Streptococcus bacteria, Lactobacillus bacteria, Alistispes bacteria, Streptococcaceae bacteria, and Veillonella bacteria.
  • the substance is capable of inhibiting the intestinal flora of Bacteroides plebeius, Anaerostipes hadrus, Ruminococcus bicirculans, Bacteroides vulgatus, Prevotella copri, Sutterella wadsworthensis, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium longum, Eubacterium rectale, Dialister invisus, Ruminococcus torcu, and the like.
  • Item 33 is the intestinal flora of Bacteroides plebeius, Anaerostipes hadrus, Ruminococcus bicirculans, Bacteroides vulgatus, Prevotella copri, Sutterella wadsworthensis, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium longum, Eubacterium rectale, Dialister invisus, Rum
  • the method of item 32 wherein the substance increases the relative abundance of at least one bacterium selected from the group consisting of bacteria of the genus Fusicatenibacter, bacteria of the genus Faecalibacterium, bacteria of the genus Dorea, bacteria of the genus Anaerostipes, bacteria of the genus Ruminococcus, bacteria of the genus Butyricoccus, bacteria of the genus Bifidobacterium, bacteria of the family Bifidobacteriaceae, and bacteria of the family Prevotellaceae.
  • the substance increases the relative abundance of at least one bacterium selected from the group consisting of bacteria of the genus Fusicatenibacter, bacteria of the genus Faecalibacterium, bacteria of the genus Dorea, bacteria of the genus Anaerostipes, bacteria of the genus Ruminococcus, bacteria of the genus Butyricoccus, bacteria of the genus Bifidobacterium, bacteria of the family Bifid
  • the substance is capable of inhibiting the activity of Streptococcus anginosus, Treponema denticola, Streptococcus cristatus, Prevotella loescheii, Lactobacillus fermentum, Streptococcus gordonii, Streptococcus constellatus, Campylobacter gracilis, Selenomonas sproda, Tannerella forsythia, or a combination thereof in oral bacterial flora. 33.
  • the method according to claim 32 wherein the substance reduces the relative abundance of at least one bacterium selected from the group consisting of bacteria of the genus Porphyromonas, bacteria of the genus Fusobacterium, bacteria of the genus Streptococcus, bacteria of the genus Capnocytophaga, bacteria of the genus Campylobacter, and bacteria of the family Streptococcaceae. Item 37.
  • the method according to Item 32 wherein the substance increases the relative abundance of at least one bacterium selected from the group consisting of Eubacterium sulci, Streptococcus infantis, Haemophilus parainfluenzae, Prevotella nanceiensis, Lancefieldella parvula, Neisseria bacteria, Saccharimonadaceae TM7x bacteria, Hemophilus bacteria, Alloprevotella bacteria, Prevotellaceae bacteria, and Veillonellaceae bacteria in the oral microflora.
  • Item 38 A substance that normalizes intestinal or oral flora, used in the treatment of improving stroke.
  • Item 39 A substance that normalizes intestinal or oral flora, used in the treatment of improving stroke.
  • the substance is capable of suppressing the proliferation and proliferation of Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivalius, Lactobacillus fermentum, Clostridium perfringens, Alistispes putredinis, Bacteroides flagellis, and the like in intestinal flora.
  • the substance according to Item 38 which is a substance that reduces the relative abundance of at least one bacterium selected from the group consisting of Bacillus fragilis, Streptococcus bacteria, Lactobacillus bacteria, Alistispes bacteria, Streptococcaceae bacteria, and Veillonella bacteria.
  • Item 40 which is a substance that reduces the relative abundance of at least one bacterium selected from the group consisting of Bacillus fragilis, Streptococcus bacteria, Lactobacillus bacteria, Alistispes bacteria, Streptococcaceae bacteria, and Veillonella bacteria.
  • the substance is capable of inhibiting the intestinal flora of Bacteroides plebeius, Anaerostipes hadrus, Ruminococcus bicirculans, Bacteroides vulgatus, Prevotella copri, Sutterella wadsworthensis, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium longum, Eubacterium rectale, Dialister invisus, Ruminococcus torcu, and the like.
  • the substance according to Item 38 which is a substance that increases the relative abundance of at least one bacterium selected from the group consisting of: Fusicatenibacter bacteria, Faecalibacterium bacteria, Dorea bacteria, Anaerostipes bacteria, Ruminococcus bacteria, Butyricoccus bacteria, Bifidobacterium bacteria, Bifidobacteriaceae bacteria, and Prevotellaceae bacteria.
  • Fusicatenibacter bacteria Faecalibacterium bacteria
  • Dorea bacteria Anaerostipes bacteria
  • Ruminococcus bacteria Ruminococcus bacteria
  • Butyricoccus bacteria Butyricoccus bacteria
  • Bifidobacterium bacteria Bifidobacteriaceae bacteria
  • Prevotellaceae bacteria Prevotellaceae bacteria.
  • the substance is capable of inhibiting the activity of Streptococcus anginosus, Treponema denticola, Streptococcus cristatus, Prevotella loescheii, Lactobacillus fermentum, Streptococcus gordonii, Streptococcus constellatus, Campylobacter gracilis, Selenomonas sproda, Tannerella forsythia, or a combination thereof in oral bacterial flora. Item 39.
  • the substance according to Item 38 which is a substance that reduces the relative abundance of at least one bacterium selected from the group consisting of Porphyromonas bacteria, Fusobacterium bacteria, Streptococcus bacteria, Capnocytophaga bacteria, Campylobacter bacteria, and Streptococcus family bacteria.
  • Item 43 is a substance that reduces the relative abundance of at least one bacterium selected from the group consisting of Porphyromonas bacteria, Fusobacterium bacteria, Streptococcus bacteria, Capnocytophaga bacteria, Campylobacter bacteria, and Streptococcus family bacteria.
  • the substance according to Item 38 which is a substance that increases the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Eubacterium sulci, Streptococcus infantis, Haemophilus parainfluenzae, Prevotella nanceiensis, Lancefieldella parvula, Neisseria bacteria, Saccharimonadaceae TM7x bacteria, Haemophilus bacteria, Alloprevotella bacteria, Prevotellaceae bacteria, and Veillonellaceae bacteria in the oral microflora.
  • Item 44 is a substance that increases the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Eubacterium sulci, Streptococcus infantis, Haemophilus parainfluenzae, Prevotella nanceiensis, Lancefieldella parvula, Neisseria bacteria, Saccharimonadaceae TM7x bacteria, Haemophilus bacteria, Alloprevotella bacteria, Prevotellaceae bacteria, and
  • a method for screening a candidate substance that may be effective in improving stroke from among test substances comprising the steps of: Regarding the test substance, the following bacteria in the intestinal flora were detected: Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivalius, Lactobacillus fermentum, Clostridium perfringens, Alistispes putredinis, Bacteroides flagellis, and Bacteroides spp.
  • the screening method comprising the steps of: Item 45.
  • a method for screening a candidate substance that may be effective in improving stroke from among test substances comprising the steps of: Regarding the test substance, the following bacteria in the intestinal flora were detected: Bacteroides plebeius, Anaerostipes hadrus, Ruminococcus bicirculans, Bacteroides vulgatus, Prevotella copri, Sutterella wadsworthensis, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium longum, Eubacterium rectale, Dialister invisus, Ruminococcus torque, and torques), Fusicatenibacter bacteria, Faecalibacterium bacteria, Dorea bacteria, Anaerostipes bacteria, Ruminococcus bacteria, Butyricoccus bacteria, Bifidobacterium bacteria, Bifidobacteriaceae bacteria, and Prevotellaceae bacteria; and selecting a test substance having the above-mentioned effect as the candidate substance;
  • the screening method comprising the steps of: Item 46.
  • a method for screening a candidate substance that may be effective in improving stroke from among test substances comprising the steps of: Regarding the test substance, the oral flora of Streptococcus anginosus, Treponema denticola, Streptococcus cristatus, Prevotella loescheii, Lactobacillus fermentum, Streptococcus gordonii, Streptococcus constellatus, Campylobacter gracilis, Selenomonas sproda, Tannerella forsythia, and a step of evaluating the effect of reducing the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Porphyromonas bacteria, Fusobacterium bacteria, Streptococcus bacteria, Capnocytophaga bacteria, Campylobacter bacteria, and Streptococcus family bacteria; and a step of selecting a test substance having the effect as the candidate substance;
  • the screening method comprising the steps of: Item 47.
  • a method for screening a candidate substance that may be effective in improving stroke from among test substances comprising the steps of: evaluating the effect of the test substance on increasing the relative abundance of at least one bacterium selected from the group consisting of Eubacterium sulci, Streptococcus infantis, Haemophilus parainfluenzae, Prevotella nanceiensis, Lancefieldella parvula, Neisseria bacteria, Saccharimonadaceae TM7x bacteria, Hemophilus bacteria, Alloprevotella bacteria, Prevotellaceae bacteria, and Veillonellaceae bacteria in the oral microflora; and selecting the test substance having the effect as the candidate substance;
  • the screening method comprising the steps of: Item 48.
  • a method for examining a risk of developing a stroke by disease type comprising: The method comprises the step of measuring the equol concentration in a blood sample taken from the subject.
  • the method according to Item 48 which is a method for examining the risk of developing cardiogenic cerebral embolism, atherothrombotic cerebral infarction, or atrial fibrillation.
  • a method for examining the severity of a stroke comprising: The method comprises the step of measuring the equol concentration in a blood sample taken from the subject.
  • a method for examining functional prognosis of stroke comprising: The method comprises the step of measuring the equol concentration in a blood sample taken from the subject.
  • An agent for improving stroke comprising equol or an equol production promoter.
  • the simple method of measuring bacteria in the intestinal or oral flora makes it possible to test for the presence or absence of stroke, the type of stroke, the presence or absence of sarcopenia associated with stroke, the severity of stroke, the risk of stroke recurrence, etc. Furthermore, according to the present disclosure, by measuring the equol concentration in a blood sample from a stroke patient, it becomes possible to test the risk of stroke onset by type of stroke, the functional prognosis of stroke, and the severity of stroke. Furthermore, according to the present disclosure, a stroke improving agent and a screening method for a stroke improving agent are provided.
  • FIG. 1 shows an overview of the study methodology for investigating the oral and intestinal microbiota of stroke patients and non-stroke subjects.
  • FIG. 1 shows a flowchart from the selection of stroke patients and non-stroke subjects to sample acquisition.
  • C shows the principal coordinate analysis (PCoA) plot based on the Bray-Curtis distance for the whole gut and oral microbiota of acute stroke patients and non-stroke subjects.
  • D shows the median Bray-Curtis distance between the oral microbiota and the gut microbiota.
  • **** indicates a p-value ⁇ 0.001 by Mann-Whitney test, and the center line of the box, the box border, and the whiskers indicate the median, 25-75%, and 10-90%, respectively.
  • A shows the alpha diversity of species in the oral microbiota of acute stroke patients and non-stroke patients divided by disease type (left panel) and the alpha diversity of Faith's phylogenetic diversity (right panel).
  • CE cardiogenic cerebral embolism
  • SVO lacunar infarction
  • ICH intracerebral hemorrhage
  • CE cardiogenic cerebral embolism
  • SVO lacunar infarction
  • ICH intracerebral hemorrhage
  • CE cardiogenic cerebral embolism
  • SVO lacunar infarction
  • ICH intracerebral hemorrhage
  • SVO lacunar infarction
  • a to D are volcano plots of gut microbiota composition analysis (ANCOM) performed to compare acute stroke patients and non-stroke patients.
  • A shows the results of gut microbiota analysis at the genus level
  • B shows the results of gut microbiota analysis at the species level
  • C shows the results of oral microbiota analysis at the genus level
  • D shows the results of oral microbiota analysis at the species level.
  • A is a diagram showing a principal coordinate analysis plot based on the Bray-Curtis distance between the intestinal and oral flora of acute stroke patients and non-stroke patients, with acute stroke patients and non-stroke patients colored.
  • B is a diagram showing the principal coordinate analysis plot colored according to the presence or absence of Streptococcus anginosus.
  • Principal coordinate analysis plots based on the Bray-Curtis distance between the intestinal and oral flora of acute stroke patients and non-stroke patients are color-coded according to the presence or absence of acute stroke (A), the presence or absence of Streptococcus anginosus (B), the presence or absence of Anaerotepes hadras (C), the presence or absence of Bacteroides plebeius (D), the presence or absence of Eubacterium salci (E), the presence or absence of Haemophilus parainfluenzae (F), the presence or absence of Lancefieldella parvula (G), the presence or absence of Prevotella roescheii (H), the presence or absence of Prevotella nanseiensis (I), the presence or absence of Streptococcus cristatus (J), the presence or absence of Streptococcus infantis (K), and the presence or absence of Treponema denticola (L).
  • A the presence or absence of Streptococcus
  • the oval regions surrounded by dotted lines are the regions of interest set when comparing the positive rates of bacteria.
  • sPLS-DA sparse partial least squares discriminant analysis
  • Box plots showing the relative abundance of each bacterium in the intestinal or oral flora, divided into the presence or absence of Streptococcus anginosus Box plots showing the relative abundance of each bacterium in the intestinal flora, a, Anaerotepes hadras in the intestinal flora, b, Bacteroides plebeius in the intestinal flora, c, Eubacterium salci in the oral flora, d, Haemophilus parainfluenzae in the oral flora, e, Lancefieldella parvula in the oral flora, f, Prevotella nanseiensis in the oral flora, g, Prevotella roescheii in the oral flora, h, Streptococcus cristatus in the oral flora, i, Streptococcus infantis in the oral flora, and j, Treponema denticola in the oral
  • A shows the results of principal coordinate analysis based on the Bray-Curtis distance of the MetaCyc pathway abundance of oral and gut microbiota.
  • the gut microbiota of acute stroke patients 109
  • the oral microbiota of acute stroke patients 151
  • the oral microbiota of non-stroke patients 53
  • B is a box plot showing the Bray-Curtis distance of the MetaCyc pathway between the oral microbiota and gut microbiota for acute stroke patients and non-stroke patients.
  • C is a heat map showing the top 50 MetaCyc pathways that can distinguish the four groups of oral and gut microbiota in acute stroke and non-stroke patients, respectively. In C, high abundance is shown in red and low abundance in blue, and the intensity of relative abundance ranges from -1.0 to 1.0 on the z-scale.
  • D–F are box plots showing the relative abundance of the homolactic acid fermentation pathway (D), sugar pathway (E), and gluconeogenesis pathway (F) in the four groups of microbiota.
  • Linear regression models showing the association between the relative abundance (log10 transformed) of Streptococcus anginosus in the gut microbiota of acute stroke patients and age (A), mean blood pressure (B), heart rate (C), body mass index (D), triglycerides (E), total cholesterol (F), HDL cholesterol (G), LDL cholesterol (H), and hemoglobin A1c (I).
  • A shows receiver operating characteristic curves for distinguishing acute stroke patients from non-stroke patients using vascular risk factors (age, sex, smoking, hypertension, diabetes, hyperlipidemia) and the relative abundance of S. anginosus, Anaerotepes hadras, and B. plebeius in the gut microbiota.
  • B shows linear regression models showing the association between the relative abundance (log10 transformed) of S. anginosus in the gut microbiota of acute stroke patients and the NIHSS score at admission.
  • the box center line, box borders, and whiskers indicate the median, 25-75%, and 10-90%, respectively.
  • This figure shows Kaplan-Meire curves depicting the results of 2-year composite events (all-cause mortality or major vascular events) in acute stroke patients divided into those with or without Streptococcus anginosus in their intestinal flora.
  • CLR centered log ratio
  • Bacteroides flagellis Lactobacillus fermentum, Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Anaerotepes hadras
  • Bacteroides plebeius Dialister invissus, Eubacterium rectal, Prevotella copri, and Saterella wadsworthensis in the gut microbiota of patients with acute stroke, and each clinical indicator (NIHSS severity score, age, BMI, mean blood pressure, LDL cholesterol, HgbA1c, CRP, and BNP).
  • VH periventricular hemorrhage
  • DWMH deep subcortical white matter hemorrhage
  • CMB cerebral microbleeds
  • lacunar lacunar
  • a-d *, **, and *** indicate p-values ⁇ 0.05, p-values ⁇ 0.01, and p-values ⁇ 0.001, respectively, by chi-square test.
  • *, **, and *** indicate p-values ⁇ 0.05, ⁇ 0.01, and ⁇ 0.001 by Mann-Whitney test, and the center line, border, and whiskers of the box indicate the median, 25-75%, and 10-90%, respectively.
  • the results of an experiment were obtained by measuring the survival time of stroke-prone spontaneously hypertensive rats (SHRSP) that were given free access to standard rat diet along with water (1%NaCl- ⁇ ABXs-), 1 w/v% saline (1%NaCl+ ⁇ ABXs-), or 1 w/v% saline containing antibiotics (1%NaCl+ ⁇ ABXs+).
  • A is the experimental protocol.
  • B is a Kaplan-Meire curve showing the results of measuring the survival time of each group.
  • the results of an experiment were obtained by giving SHRSP free access to water (1% NaCl- ABXs-), 1 w/v% saline (1% NaCl+ ABXs-), or 1 w/v% saline containing antibiotics (1% NaCl+ ABXs+) together with a standard rat diet, and measuring body weight, evaluating neuroparalytic symptoms, and performing pathological examinations of the brain.
  • A is the experimental protocol.
  • B is the result of measuring the change in body weight over time from 49 to 84 days of age.
  • C is a Kaplan-Meire curve showing the cumulative incidence of paralytic symptoms.
  • D is a diagram showing the detection frequency of HE stained images (low-power images of brain tissue) and cerebral hemorrhage (ICH) when brain pathological analysis was performed at 105 days of age. Each HE stained image in D also shows a high-power image within a square box.
  • SHRSP were given ad libitum access to water (NaCl- ⁇ ABXs-), saline containing antibiotics (NaCl- ⁇ ABXs+), saline (NaCl+ ⁇ ABXs-), or saline containing antibiotics (NaCl+ ⁇ ABXs+) along with a standard rat diet, and the cerebral and cardiac vascular structures were analyzed.
  • the top row in A shows the measurement results of cerebral vascular wall thickness (median ⁇ IQR; ** p ⁇ 0.01, *** p ⁇ 0.001; Holm-Sidak's multiple comparison test).
  • the bottom row in A shows cross-sectional images of typical cerebral arterioles in each group (Bar: 100 ⁇ m).
  • B is a scatter plot of vascular diameter (minor axis) versus vascular wall thickness.
  • C shows Masson's trichrome stained images from cardiac pathological analysis (Bar: 100 ⁇ m).
  • the areas marked with a ⁇ indicate areas where vascular medial thickening was observed, and the areas marked with an * indicate areas where significant narrowing of the lumen was observed.
  • the upper row in D shows the measurement results of the degree of vascular stenosis (vascular lumen area/vascular external diameter area*100) (median ⁇ IQR; *p ⁇ 0.05, Holm-Sidak's multiple comparison test.).
  • the lower row in D shows cross-sectional images of typical arterioles in the heart in each group (Bar: 100 ⁇ m).
  • SHRSP were given ad libitum access to water (NaCl- ⁇ ABXs-), saline containing antibiotics (NaCl- ⁇ ABXs+), saline (NaCl+ ⁇ ABXs-), or saline containing antibiotics (NaCl+ ⁇ ABXs+) along with a standard rat diet, and the renal arteriole structure and small intestine structure were analyzed.
  • the image on the left in A is a Masson's trichrome stained image (low-magnification image of renal tissue) obtained during renal pathology analysis.
  • the Masson's trichrome stained image in A also shows a high-magnification image within a square.
  • the right panel in A shows the frequency of obstructed vessels, severe vessels, and mild-moderate stenosis vessels.
  • the top image in B is a Masson's trichrome stained image obtained during small intestine pathology analysis (Bar: 100 ⁇ m).
  • the lower figure in B shows the measurement results of the cross-sectional length of the small intestinal villi, small intestinal fibrosis, and small intestinal muscularis submucosalis (median ⁇ IQR; ** p ⁇ 0.01, Holm-Sidak's multiple comparison test.).
  • A shows the alpha diversity (observed taxonomic features) of the intestinal flora of each group at 84 days of age.
  • B shows the results of clustering the intestinal flora of each group at 84 days of age using partial least squares regression (sPLS-DA) analysis.
  • C shows a volcano plot created by analyzing the composition of the intestinal flora of the group given water (NaCl-, ABXs-) and the group given saline (NaCl+, ABXs-) using the -log 10 of the significant difference test (p value) between the two groups by t-test and the log 2 (FC) of the fold change (FC).
  • D is a volcano plot of the gut microbiota composition of the group that ingested saline (NaCl+ ⁇ ABXs-) and the group that ingested saline containing antibiotics (NaCl+ ⁇ ABXs+), using the -log 10 of the significance test (p value) between the two groups by t-test and the log 2 (FC) of the fold change (FC).
  • E is a Venn diagram created for the gut bacterial species that significantly changed between the group that ingested water (NaCl- ⁇ ABXs-) and the group that ingested saline (NaCl+ ⁇ ABXs-), and the gut bacterial species that significantly changed between the group that ingested saline (NaCl+ ⁇ ABXs-) and the group that ingested saline containing antibiotics (NaCl+ ⁇ ABXs+).
  • the results of an experiment were obtained by measuring survival time in SHRSPs that were given 1% NaCl+, 1% NaCl+ABXs+, 1% NaCl+Ampicillin, 1% NaCl+Metronidazole, or 1% NaCl+Vancomycin along with a standard rat diet.
  • A is the experimental protocol.
  • B is a Kaplan-Meire curve showing the results of measuring survival time for each group.
  • a "subject” refers to a human or non-human animal that is the subject of a test for the presence or absence of stroke, the type of stroke, the presence or absence of stroke complicated by sarcopenia, the severity of stroke, or the risk of stroke recurrence.
  • non-human animals include non-human mammals such as primates, rats, mice, gerbils, guinea pigs, hamsters, ferrets, rabbits, cows, horses, pigs, goats, dogs, and cats.
  • stroke refers to a disease in which blood vessels in the brain suddenly rupture or become blocked, causing disruption to blood circulation in the brain. Stroke is broadly divided into two types: ischemic stroke (cerebral infarction) and hemorrhagic stroke (cerebral hemorrhage). Ischemic stroke is further divided into types such as primary cerebral embolism, atherothrombotic cerebral infarction, and lacunar infarction, while hemorrhagic stroke is further divided into two types: intracerebral hemorrhage (intracerebral hemorrhage) and subarachnoid hemorrhage.
  • severity of stroke refers to the degree of stroke symptoms.
  • the severity of stroke is determined by the National Institutes of Health Stroke Scale (NIHSS) score or the Modified Rankin Scale (mRS) score.
  • the NIHSS score is determined on a scale of 0 to 42 points, with the higher the score, the more severe the stroke.
  • the mRS score is determined on a scale of 0 to 5, with the higher the grade, the more severe the stroke.
  • sarcopenia refers to a condition in which muscle mass decreases throughout the body, resulting in reduced muscle strength and physical function.
  • the "relative abundance of a specific family, genus, or species of enterobacteria in the intestinal microbiota” refers to the relative ratio (%) of the number of bacteria belonging to a specific family, genus, or species present in the intestinal microbiota when the total number of bacteria present in the intestinal microbiota is taken as 100%.
  • the "relative abundance of a specific family, genus, or species of enterobacteria in the oral microbiota” refers to the relative ratio (%) of the number of bacteria belonging to a specific family, genus, or species present in the oral microbiota when the total number of bacteria present in the oral microbiota is taken as 100%.
  • the relative abundance of Streptococcus family bacteria in the intestinal microbiota refers to the relative ratio of the number of bacteria belonging to Streptococcus family present in the intestinal microbiota when the total number of enterobacteria present in the intestinal microbiota is taken as 100%.
  • the relative abundance of Streptococcus genus bacteria in the intestinal microbiota refers to the relative ratio of the number of bacteria belonging to Streptococcus genus present in the intestinal microbiota when the total number of enterobacteria present in the intestinal microbiota is taken as 100%.
  • the relative abundance of Streptococcus anginosus in the intestinal flora is the relative ratio of the number of bacteria belonging to Streptococcus anginosus present in the intestinal flora when the total number of intestinal bacteria present in the intestinal flora is taken as 100%.
  • a "stroke improving agent” is a drug used for the purposes of suppressing the onset of stroke; curing, alleviating, or inhibiting the progression of stroke pathology; preventing, curing, alleviating, or inhibiting the progression of stroke complications; or preventing the recurrence of stroke.
  • test substance is a substance that is the subject of a screening method to confirm whether or not it has a desired effect.
  • Test method 1 includes a step of measuring the presence or absence of at least one bacterium selected from the group consisting of Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivarius, and Lactobacillus fermentum in the intestinal flora collected from a subject.
  • Streptococcus anginosus, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivarius, and Streptococcus mutans are bacteria that are normally present in the oral cavity and are not usually present in the intestinal flora, but the present inventors have found that these bacteria are transferred from the oral cavity to the intestinal flora in stroke patients.
  • Lactobacillus fermentum is not usually present in the intestinal flora, but is found in the intestinal flora of stroke patients. Therefore, by confirming the presence or absence of the above bacteria in the intestinal flora, the presence or absence of stroke can be examined.
  • the subject may be any person who needs to be tested for the presence or absence of stroke.
  • the bacteria to be measured may be one or more of Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivarius, and Lactobacillus fermentum.
  • DNA can be extracted from a sample containing the intestinal flora and the DNA can be subjected to metagenomic analysis or PCR analysis.
  • Samples containing intestinal flora may be feces, digestive tract contents collected from the digestive tract, etc., but feces is preferred because it can be collected non-invasively.
  • DNA can be extracted from samples containing intestinal flora by known methods.
  • Metagenomic analysis may be either 16SrRNA metagenomic analysis or full metagenomic analysis, and can be performed by known methods.
  • PCR analysis can be performed by a known method using primers capable of specifically detecting the bacteria, and DNA extracted from a sample containing the intestinal flora as a template.
  • Primers capable of specifically detecting the bacteria are known or can be designed by those skilled in the art using their ordinary creative abilities, and examples thereof include the following primers.
  • Primer F capable of specifically detecting Streptococcus anginosus CAAGTAGGACGCACAGTTTA (SEQ ID NO: 1)
  • R: TGTGTTACATACTGTTATGCGGT SEQ ID NO: 2
  • Primer capable of specifically detecting Streptococcus mutans F: AGCCATGCGCAATCAACAGGTT (SEQ ID NO: 3)
  • R: CGCAACGCGAACATCTTGATCAG SEQ ID NO: 4
  • Primer F capable of specifically detecting Streptococcus parasanguinis AACAATGCGATYCCAGTATCRAG (SEQ ID NO: 5)
  • R: CTACGACATTAAAGGTACCDCGG SEQ ID NO: 6)
  • R: GATTCTGTCAAAGAAGCCAC SEQ ID NO: 8
  • Primer F capable of specifically detecting Lactobacillus fermentum
  • test method 1 of the present disclosure a subject in whom at least one type of bacteria, Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivarius, and Lactobacillus fermentum, is detected in the intestinal flora is determined to be highly likely to have a stroke.
  • test method 2 Method for testing the presence or absence of stroke or its type using intestinal flora
  • test method 4 Method for testing the severity of stroke using Streptococcus anginosus in the intestinal flora as an indicator
  • one embodiment of the test method 1 of the present disclosure includes detecting at least one of Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivarius, and Streptococcus mutans from the intestinal flora in addition to Streptococcus anginosus.
  • testing method 1 disclosed herein can be performed as a test to assist in the diagnosis of stroke, subjects who are determined to have a high probability of having a stroke by the testing method 1 disclosed herein can undergo further tests such as imaging tests and blood tests.
  • test kit for use in carrying out the test method 1 of the present disclosure.
  • the test kit may include a primer capable of specifically detecting the bacteria.
  • the test kit may further include a reagent for extracting DNA from a sample containing the intestinal microflora, as necessary.
  • Test method 2 Method for testing the presence or absence of stroke or its type using intestinal flora
  • the method includes a step of measuring the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Bacteroides vulgatus, Prevotella copri, Saterella wadsworthensis, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium longum, Eubacterium rectal, Dialister invissus, Fusicateni
  • the relative abundance of these bacteria in the intestinal flora varies depending on the presence or absence of stroke or the presence or absence of a specific type of stroke, so that the relative abundance of these bacteria in the intestinal flora can be used as an indicator to test the presence or absence of stroke or the type of stroke.
  • the subject may be any person who needs to be tested for the presence or absence of stroke, or for the type of stroke.
  • the subject of measurement of relative abundance in the intestinal bacterial flora may be one or more of the above bacteria.
  • DNA can be extracted from a sample containing the gut microbiota and the DNA can be subjected to metagenomic or PCR analysis.
  • Samples containing intestinal flora may be feces, digestive tract contents collected from the digestive tract, etc., but feces is preferred because it can be collected non-invasively.
  • DNA can be extracted from samples containing intestinal flora by known methods.
  • Metagenomic analysis may be either 16SrRNA metagenomic analysis or full metagenomic analysis, and can be performed by known methods.
  • PCR analysis can be performed by a known method using a primer capable of detecting all bacteria and a primer capable of specifically detecting the bacteria of the specific family, genus or species, and using DNA extracted from a sample containing intestinal flora as a template.
  • the primer capable of detecting all bacteria and the primer capable of specifically detecting the bacteria of the specific family, genus or species are known or can be designed by a person skilled in the art by exerting normal creative ability, and for example, the primer capable of specifically detecting Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivarius, and Lactobacillus fermentum can be exemplified by those exemplified in the column of the test method 1.
  • the primer capable of detecting bacteria other than these can be, for example, the following.
  • Primer capable of detecting all bacteria F: AGRGTTTGATYMTGGCTCAG (SEQ ID NO: 11) R: TGCTGCCTCCCGTAGGAGT (SEQ ID NO: 12) -Primer capable of detecting Clostridium perfringens F: AAAGATGGCARCARCARRCAAC (SEQ ID NO: 13) R: TACCGTCATTATCTTCCCCAAA (SEQ ID NO: 14) Primer capable of detecting Streptococcus bacteria F: AGCTTAGAAGCAGCTATTCATTC (SEQ ID NO: 15) R: GGATACACCTTTCGGTCTCTC (SEQ ID NO: 16) Primer capable of detecting Lactobacillus bacteria F: CTTGTACACACCGCCCGTCA (SEQ ID NO: 17) R: CTCAAAACTAAACAAAGTTTC (SEQ ID NO: 18) Primer capable of detecting Streptococcus bacteria F: AGCTTAGAAGCAGCTATTCATTC (SEQ ID NO: 19) R: GGATACACC
  • a subject having a high relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivarius, Lactobacillus fermentum, Clostridium perfringens, Alistipes putrediense, Streptococcus genus bacteria, Lactobacillus genus bacteria, and Alistipes genus bacteria in the intestinal flora is determined to be highly likely to have a stroke.
  • the relative abundance (reference value) of the bacteria in the intestinal flora of healthy subjects and/or stroke patients can be determined in advance and compared with the reference value. For example, when the relative abundance of the bacteria in the subject is high compared to the relative abundance of the bacteria in healthy subjects, it can be determined that the subject is highly likely to have a stroke.
  • the possibility of a subject suffering from stroke can be determined from the cutoff values obtained from the test data shown in the Examples section according to the following criteria: when the relative abundance of Streptococcus anginosus in the intestinal flora of the subject is 0.17% (cutoff value) or more, when the relative abundance of Streptococcus mutans is 0.11% (cutoff value) or more, when the relative abundance of Streptococcus parasanguinis is 0.45% (cutoff value) or more, when the relative abundance of Streptococcus salivarius is 0.69% (cutoff value) or more, when the relative abundance of Lactobacillus fermentum is 0.17% (cutoff value) or more.
  • cutoff value indicates the intermediate value between the average value of the relative abundance of the acute stroke patient group and the average value of the relative abundance of the non-stroke patient group based on the test data shown in the Examples column, and the cutoff value is merely an example and can be set appropriately depending on the sample, test conditions, etc.
  • subjects with high relative abundances of Bacteroides flagellis and Lactobacillus fermentum in the intestinal flora are determined to be highly likely to suffer from cardiogenic cerebral embolism.
  • the relative abundance of Bacteroides flagellis in the intestinal flora can be determined by comparing the relative abundance (reference value) of Streptococcus bacteria in the intestinal flora of healthy subjects and/or patients with cardiogenic cerebral embolism with the reference value obtained in advance.
  • subjects with a high relative abundance of Streptococcus mutans in their intestinal flora are determined to be highly likely to suffer from cardiogenic cerebral embolism or atherothrombotic cerebral embolism.
  • the relative abundance of Streptococcus mutans in the intestinal flora can be determined in advance by determining the relative abundance (reference value) of Streptococcus mutans in the intestinal flora of healthy individuals and/or patients with cardiogenic cerebral embolism or atherothrombotic cerebral embolism and comparing the relative abundance with the reference value.
  • the relative abundance of Saterella wadsworthensis in the intestinal flora can be determined by previously determining the relative abundance (reference value) of Saterella wadsworthensis in the intestinal flora of healthy individuals and/or patients with lacunar infarction, and comparing the relative abundance with the reference value.
  • a subject having a low relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Eubacterium rectal and Dialister invissus in the intestinal flora is determined to be highly likely to have intracerebral hemorrhage.
  • the relative abundance (reference value) of these bacteria in the intestinal flora of healthy subjects and/or patients with intracerebral hemorrhage can be determined in advance and compared with the reference value.
  • a subject with a high relative abundance of Streptococcus bacteria in the intestinal flora is determined to be highly likely to suffer from cardiogenic cerebral embolism, lacunar infarction, or atherothrombotic cerebral embolism.
  • the relative abundance of Streptococcus bacteria in the intestinal flora can be determined by, specifically, determining the relative abundance (reference value) of Streptococcus bacteria in the intestinal flora of healthy subjects and/or patients with cardiogenic cerebral embolism, lacunar infarction, or atherothrombotic cerebral embolism in advance, and comparing the relative abundance with the reference value.
  • the cutoff value indicates the median value between the groups of the average relative abundance based on the test data shown in the Examples section, and the cutoff value is merely an example and can be set appropriately depending on the specimen, test conditions, etc.
  • the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Clostridium perfringens, and Alistipes putredidis in the intestinal flora is higher. Therefore, in the test method 2 disclosed herein, the higher the relative abundance of the bacteria in the intestinal flora, the higher the possibility of the patient suffering from stroke accompanied by sarcopenia.
  • the relative abundance (reference value) of the bacteria in the intestinal flora of a stroke patient accompanied by sarcopenia and/or a stroke patient without sarcopenia is determined in advance, and the judgment can be made by comparing with the reference value. For example, when the relative abundance of the bacteria in the subject is higher than the relative abundance of the bacteria in a stroke patient without sarcopenia, it can be determined that the subject is highly likely to suffer from stroke accompanied by sarcopenia.
  • cutoff value indicates the intermediate value between the average value of the relative abundance of the stroke patient group accompanied by sarcopenia and the average value of the relative abundance of the stroke patient group without sarcopenia based on the test data shown in the Examples section, and the cutoff value is merely an example and can be set appropriately depending on the sample, test conditions, etc.
  • a subject having a low relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Bacteroides plebeius, Anaerotepes hadras, Ruminococcus biscirculans, Bacteroides vulgatus, Prevotella copri, Saterella wadsworthensis, Fusicatenibacter, Faecalibacterium, Dorea, Anaerotipes, Ruminococcus, and Butyricoccus in the intestinal flora is determined to be highly likely to have suffered from a stroke.
  • the relative abundance (reference value) of the bacteria in the intestinal flora of healthy subjects and/or stroke patients can be determined in advance and compared with the reference value.
  • the relative abundance of the bacteria in a subject when the relative abundance of the bacteria in a subject is low compared to the relative abundance of the bacteria in a healthy subject, it can be determined that the subject is highly likely to suffer from a stroke. Specifically, the possibility of a subject suffering from a stroke can be determined based on the cutoff value obtained from the test data shown in the Examples section, using the following criteria: In the subject's intestinal flora, when the relative abundance of Bacteroides plebeius is less than 1.05% (cutoff value), when the relative abundance of Anaerotepes hadras is less than 1.47% (cutoff value), when the relative abundance of Ruminococcus biscirculans is less than 1.03% (cutoff value), when the relative abundance of Bacteroides vulgatus is less than 4.51% (cutoff value), when the relative abundance of Prevotella copri is less than 1.81% (cutoff value), and when the relative abundance of Saterella wadsworthensis is less than 0.19% (cutoff value).
  • cutoff value indicates the intermediate value between the average value of the relative abundance of the acute stroke patient group and the average value of the relative abundance of the non-stroke patient group based on the test data shown in the Examples column, and the cutoff value is merely an example and can be set appropriately depending on the sample, test conditions, etc.
  • a subject having a low relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium longum, Bifidobacteria, and Bifidobacteriaceae in the intestinal flora is determined to be highly likely to have cardiogenic cerebral embolism.
  • the relative abundance (reference value) of the bacteria in the intestinal flora of healthy subjects and/or patients with cardiogenic cerebral embolism can be determined in advance by comparing with the reference value.
  • the cutoff value indicates the median value between the average relative abundances of each group based on the test data shown in the Examples section, and the cutoff value is merely an example and can be set appropriately depending on the
  • a subject with a low relative abundance of Prevotellaceae bacteria in the intestinal flora is determined to be highly likely to suffer from lacunar infarction or intracerebral hemorrhage.
  • the relative abundance of Prevotellaceae bacteria in the intestinal flora can be determined by, specifically, determining the relative abundance (reference value) of Prevotellaceae bacteria in the intestinal flora of a healthy subject and/or a subject with lacunar infarction or intracerebral hemorrhage in advance and comparing it with the reference value.
  • the relative abundance of Prevotellaceae bacteria in a subject is low compared to the relative abundance of Prevotellaceae bacteria in a healthy subject, it can be determined that the subject is highly likely to suffer from lacunar infarction or intracerebral hemorrhage.
  • the relative abundance of Prevotellaceae bacteria in the intestinal flora of a subject is less than 2.07% (cutoff value)
  • the cutoff value is based on the test data shown in the Examples section and indicates the median value between the groups of the average relative abundance. This cutoff value is merely an example and can be set appropriately depending on the specimen, test conditions, etc.
  • the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Bacteroides vulgatus, Prevotella copri, and Butyricoccus bacteria in the intestinal flora is lower. Therefore, in the test method 2 disclosed herein, the lower the relative abundance of the bacteria in the intestinal flora, the higher the possibility of the patient suffering from stroke accompanied by sarcopenia. Specifically, the relative abundance (reference value) of the bacteria in the intestinal flora of a stroke patient accompanied by sarcopenia and/or a stroke patient without sarcopenia is determined in advance, and the judgment can be made by comparing with the reference value.
  • the relative abundance of the bacteria in a subject is lower than the relative abundance of the bacteria in a stroke patient without sarcopenia, it can be determined that the subject is highly likely to suffer from stroke accompanied by sarcopenia.
  • the cutoff value obtained from the test data shown in the Examples section if the relative abundance of Bacteroides vulgatus in the intestinal flora of the subject is less than 2.82% (cutoff value), if the relative abundance of Prevotella copri is less than 0.37% (cutoff value), or if the relative abundance of Butyricoccus bacteria is less than 0.05% (cutoff value), it can be determined that the subject is highly likely to have suffered from sarcopenia-associated stroke.
  • cutoff value indicates the intermediate value between the average relative abundance of the stroke patient group with sarcopenia and the average relative abundance of the stroke patient group without sarcopenia based on the test data shown in the Examples section, and the cutoff value is merely an example and can be set appropriately depending on the sample, test conditions, etc.
  • test method 2 disclosed herein can be performed as a test to assist in the diagnosis of stroke, subjects who are determined to have a high probability of having a stroke by the test method 2 disclosed herein can undergo further tests such as imaging tests and blood tests.
  • test kit for use in carrying out the test method 2 of the present disclosure.
  • the test kit may include a primer capable of specifically detecting the bacteria.
  • the test kit may further include a reagent for extracting DNA from a sample containing the intestinal microflora, as necessary.
  • Test Method 3 includes a step of measuring the relative abundance of at least one bacterium selected from the group consisting of Streptococcus anginosus, Anaerotepes hadras, Bacteroides plebius, Eubacterium rectal, Prevotella copri, and Lactobacillus fermentum in the intestinal flora collected from a subject. Since the relative abundance of these bacteria in the intestinal flora correlates with the severity of stroke, it is possible to test the severity of stroke by using the relative abundance of Streptococcus anginosus in the intestinal flora as an index.
  • the subject may be anyone who requires testing for the severity of a stroke, and may be not only a stroke patient, but also anyone who requires testing for the presence or absence of a stroke.
  • DNA can be extracted from a sample containing the gut microbiota and the DNA can be subjected to metagenomic or PCR analysis.
  • Samples containing intestinal flora may be feces, digestive tract contents collected from the digestive tract, etc., but feces is preferred because it can be collected non-invasively.
  • DNA can be extracted from samples containing intestinal flora by known methods.
  • Metagenomic analysis may be either 16SrRNA metagenomic analysis or full metagenomic analysis, and can be performed by known methods.
  • PCR analysis can be performed by a known method using primers capable of detecting all bacteria and primers capable of specifically detecting the bacteria, and DNA extracted from a sample containing the intestinal flora as a template.
  • Primers capable of detecting all bacteria and primers capable of specifically detecting the bacteria are known or can be designed by a person skilled in the art using their normal creative abilities, and specific examples of such primers include those exemplified in the columns for Test Methods 1 and 2 above.
  • the relative abundance (reference value) of these bacteria in the intestinal flora of stroke patients with different degrees of severity is determined in advance, and the severity can be judged by comparing with the reference value.
  • the relative abundance (reference value) of these bacteria in the intestinal flora of stroke patients with different degrees of severity is determined in advance, and the severity can be judged by comparing with the reference value.
  • test kit for use in carrying out the test method 3 of the present disclosure.
  • the test kit may include a primer capable of specifically detecting the bacteria.
  • the test kit may further include, as necessary, a primer capable of detecting all bacteria in the intestinal flora, and/or a reagent for extracting DNA from a sample containing the intestinal flora.
  • Test 4 Method for assessing risk of stroke recurrence using Streptococcus anginosus in the intestinal flora as an indicator.
  • Testing Method 4 includes a step of measuring the relative abundance of Streptococcus anginosus in the intestinal microbiota collected from a subject.
  • the subject may be any person who requires testing for the risk of stroke recurrence, and may be any of acute stroke patients, convalescent stroke patients, those who are left with aftereffects after stroke recovery, and those who have recovered from stroke.
  • DNA can be extracted from a sample containing the gut microbiota and subjected to metagenomic or PCR analysis.
  • Samples containing intestinal flora may be feces, digestive tract contents collected from the digestive tract, etc., but feces is preferred because it can be collected non-invasively.
  • DNA can be extracted from samples containing intestinal flora by known methods.
  • Metagenomic analysis may be either 16SrRNA metagenomic analysis or full metagenomic analysis, and can be performed by known methods.
  • PCR analysis can be performed by a known method using primers capable of detecting all bacteria and primers capable of specifically detecting Streptococcus anginosus, and DNA extracted from a sample containing intestinal flora as a template.
  • Primers capable of detecting all bacteria and primers capable of specifically detecting Streptococcus anginosus are known or can be designed by a person skilled in the art using their normal creative abilities, and specific examples of such primers include those exemplified in the columns for Test Methods 1 and 2 above.
  • the higher the relative abundance of Streptococcus anginosus in the intestinal flora the higher the risk of stroke recurrence is determined to be.
  • the relative abundance (reference value) of Streptococcus anginosus in the intestinal flora of acute stroke first-time patients and/or acute stroke recurrence patients is obtained in advance, and the risk of stroke recurrence can be determined by comparing with the reference value. For example, when the relative abundance of Streptococcus anginosus in the subject is higher than the relative abundance of Streptococcus anginosus in acute stroke first-time patients, the risk of stroke recurrence can be determined to be high.
  • the cutoff value is based on the test data shown in the Examples section and indicates the intermediate value between the average relative abundance in the group of patients with first acute stroke and the average relative abundance in the group of patients with recurrent acute stroke. This cutoff value is merely an example and can be set appropriately depending on the specimen, test conditions, etc.
  • prognosis can be monitored by carefully administering medication and increasing the frequency of imaging tests so that early intervention and early treatment can be performed for predicted stroke recurrence.
  • test kit for use in carrying out the test method 4 of the present disclosure.
  • the test kit may include a primer capable of specifically detecting Streptococcus anginosus.
  • the test kit may further include, as necessary, a primer capable of detecting all bacteria in the intestinal flora, and/or a reagent for extracting DNA from a sample containing the intestinal flora.
  • Test method for predicting the prognosis of stroke using Streptococcus anginosus in the intestinal flora as an indicator (Test method 5)
  • a test method for predicting the prognosis of stroke (hereinafter, sometimes referred to as "Test Method 5") is provided.
  • Test Method 5 of the present disclosure includes a step of measuring the presence or absence of Streptococcus anginosus in the intestinal flora collected from a subject.
  • Stroke patients who have Streptococcus anginosus in their intestinal flora have a higher risk of death or recurrence of vascular disease within two years than patients who do not have Streptococcus anginosus in their intestinal flora, so that a test for predicting the prognosis of stroke can be performed by using the presence or absence of Streptococcus anginosus in the intestinal flora as an indicator.
  • the subject may be any person who requires testing to predict the prognosis of a stroke, and may be any of the following: an acute stroke patient, a convalescent stroke patient, a person who is left with aftereffects after recovery from a stroke, or a person who has recovered from a stroke.
  • DNA can be extracted from a sample containing the intestinal flora and the DNA can be subjected to metagenomic or PCR analysis.
  • Samples containing intestinal flora may be feces, digestive tract contents collected from the digestive tract, etc., but feces is preferred because it can be collected non-invasively.
  • DNA can be extracted from samples containing intestinal flora by known methods.
  • Metagenomic analysis may be either 16SrRNA metagenomic analysis or full metagenomic analysis, and can be performed by known methods.
  • PCR analysis can be performed by a known method using primers capable of specifically detecting Streptococcus anginosus and DNA extracted from a sample containing intestinal flora as a template.
  • Primers capable of specifically detecting Streptococcus anginosus are known or can be designed by a person skilled in the art using their normal creative abilities, and specific examples of such primers include those exemplified in the section on Test Method 1 above.
  • subjects in whom Streptococcus anginosus is detected in the intestinal flora are determined to be at high risk of death or recurrence of vascular disease (ischemic stroke, hemorrhagic stroke, myocardial infarction, worsening heart failure, or peripheral vascular occlusion) within two years and are likely to have a poor prognosis.
  • vascular disease ischemic stroke, hemorrhagic stroke, myocardial infarction, worsening heart failure, or peripheral vascular occlusion
  • prognosis can be monitored by carefully administering medication and increasing the frequency of imaging tests so that early intervention and early treatment can be performed for the predicted poor prognosis.
  • test kit for use in carrying out the test method 5 of the present disclosure.
  • the test kit may include a primer capable of specifically detecting Streptococcus anginosus.
  • the test kit may further include, as necessary, a primer capable of detecting all bacteria in the intestinal flora, and/or a reagent for extracting DNA from a sample containing the intestinal flora.
  • Test Method 6 Method for examining the presence or absence of sarcopenia in stroke patients using intestinal flora.
  • Test Method 6 includes a step of measuring the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Ruminococcus torx and Veionella spp. bacteria in the intestinal flora collected from a subject.
  • the subject may be any stroke patient who requires testing for sarcopenia.
  • DNA can be extracted from a sample containing the gut microbiota and the DNA can be subjected to metagenomic or PCR analysis.
  • Samples containing intestinal flora may be feces, digestive tract contents collected from the digestive tract, etc., but feces is preferred because it can be collected non-invasively.
  • DNA can be extracted from samples containing intestinal flora by known methods.
  • Metagenomic analysis may be either 16SrRNA metagenomic analysis or full metagenomic analysis, and can be performed by known methods.
  • PCR analysis can be performed by a known method using primers capable of detecting all bacteria and primers capable of specifically detecting the bacteria, and DNA extracted from a sample containing intestinal flora as a template.
  • Primers capable of detecting all bacteria and primers capable of specifically detecting Streptococcus anginosus are known or can be designed by a person skilled in the art using their normal creative abilities, and specific examples of primers capable of detecting all bacteria include those exemplified in the Testing Method 2 column above.
  • the relative abundance of Ruminococcus torque in the intestinal flora the higher the possibility of the patient having a stroke accompanied by sarcopenia.
  • the relative abundance (reference value) of Ruminococcus torque in the intestinal flora of stroke patients accompanied by sarcopenia and stroke patients without sarcopenia is determined in advance, and the judgment can be made by comparing with the reference value. For example, when the relative abundance of Ruminococcus torque in a subject is lower than the relative abundance of Ruminococcus torque in stroke patients without sarcopenia, it can be determined that the subject is highly likely to have a stroke accompanied by sarcopenia.
  • cutoff value when the relative abundance of Ruminococcus torque in the intestinal flora of a subject is less than 1.16% (cutoff value), it can be determined that the subject is highly likely to have a stroke accompanied by sarcopenia. Note that the above cutoff value is an example and can be set appropriately depending on the sample, test conditions, etc.
  • the higher the relative abundance of Bayonella bacteria in the intestinal flora the higher the possibility of the subject suffering from stroke accompanied by sarcopenia.
  • the relative abundance (reference value) of Bayonella bacteria in the intestinal flora of stroke patients accompanied by sarcopenia and stroke patients without sarcopenia is obtained in advance, and the subject can be judged by comparing with the reference value. For example, when the relative abundance of Bayonella bacteria in a subject is higher than the relative abundance of Bayonella bacteria in stroke patients without sarcopenia, it can be judged that the subject is likely to suffer from stroke accompanied by sarcopenia.
  • cutoff value obtained from the test data shown in the Examples section, when the relative abundance of Bayonella bacteria in the intestinal flora of a subject is 0.11% (cutoff value) or more, it can be judged that the subject is likely to suffer from stroke accompanied by sarcopenia.
  • cutoff value is an example and can be set appropriately depending on the sample, test conditions, etc.
  • test kit for use in carrying out the test method 6 of the present disclosure.
  • the test kit may include a primer capable of specifically detecting the bacteria.
  • the test kit may further include, as necessary, a primer capable of detecting all bacteria in the intestinal flora, and/or a reagent for extracting DNA from a sample containing the intestinal flora.
  • Test Method 7 a method for testing the presence or absence of stroke.
  • the method includes a step of measuring the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of bacteria, Capnocytophaga bacteria, Campylobacter bacteria, Streptococcus family bacteria, Eubacterium salci, Streptococcus infantis, Haemophilus parainfluenzae, Prevotella nantheiensis, Lancefieldella parvula, Neisseria bacteria, Saccharimonada TM7x bacteria, Haemophilus bacteria, Alloprevotella bacteria, Prevotellaceae bacteria, and Veillonellaceae bacteria.
  • the relative abundance of these bacteria in the oral flora changes depending on the presence or absence of stroke, so that the relative abundance of these bacteria in the oral flora can be used as an indicator to test for the presence or absence of stroke.
  • the subject may be any person who needs to be tested for the presence or absence of stroke.
  • the subject of measurement of relative abundance in the oral bacterial flora may be one or more of the above bacteria.
  • DNA can be extracted from a sample containing the oral flora and the DNA can be subjected to metagenomic analysis or PCR analysis.
  • the sample containing the oral flora is preferably saliva, but may be a sample collected from the tooth surface, periodontal pocket, tongue surface, buccal mucosa, etc. Furthermore, it is preferable to collect the sample containing the oral flora before eating, brushing teeth, gargling, etc. DNA can be extracted from the sample containing the oral flora by known methods.
  • Metagenomic analysis may be either 16SrRNA metagenomic analysis or full metagenomic analysis, and can be performed by known methods.
  • PCR analysis can be performed by a known method using a primer capable of detecting all bacteria and a primer capable of specifically detecting the bacteria of the specific family, genus or species, and using DNA extracted from a sample containing oral flora as a template.
  • the primer capable of detecting all bacteria and the primer capable of specifically detecting the bacteria of the specific family, genus or species are known or can be designed by a person skilled in the art by exerting normal creative ability.
  • the primer capable of detecting all bacteria and the primer capable of specifically detecting Streptococcus anginosus, Lactobacillus fermentum, Streptococcus bacteria, Streptococcus family bacteria, and Prevotellaceae bacteria are exemplified in the columns of the test method 1 and 2.
  • the primer capable of detecting bacteria other than these can be, for example, the following.
  • F KGGGCTCAACMCMGTATTG (SEQ ID NO: 51)
  • R TCGCGTTAGCTTGGGCGC (SEQ ID NO:52)
  • Primer capable of detecting Campylobacter bacteria F: GGATGACACTTTTCGGAGC (SEQ ID NO: 53)
  • Primer capable of detecting Haemophilus parainfluenza GATGAAAGTGTGGGACCTTCG (SEQ ID NO: 55)
  • Primer capable of detecting Saccharimonada TM7x bacteria F: AYTGGGCGTAAAGAGTTGC (SEQ ID NO: 57)
  • R: GTCCCCGTCAATTCCTTTATG SEQ ID NO: 58
  • a subject having a high relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Streptococcus anginosus, Treponema denticola, Streptococcus cristatus, Prevotella roescheii, Lactobacillus fermentum, Streptococcus gordonii, Streptococcus constellatus, Campylovitor gracilis, Selenomonas sproda, Tannerella forsythia, Porphyromonas spp., Fusobacterium spp., Streptococcus spp., Capnocytophaga spp., Campylobacter spp., and Streptococcus spp.
  • the relative abundance of the bacteria in the oral flora can be determined by comparing the relative abundance (reference value) of the bacteria in the oral flora of healthy subjects and/or stroke patients with the reference value obtained in advance. For example, when the relative abundance of the bacteria in a subject is higher than that in a healthy subject, it can be determined that the subject is likely to have a stroke. Specifically, the possibility of a subject having a stroke can be determined based on the cutoff value obtained from the test data shown in the Examples section, according to the following criteria.
  • the relative abundance of Streptococcus anginosus was 0.13% (cutoff value) or more
  • the relative abundance of Treponema denticola was 0.13% (cutoff value) or more
  • the relative abundance of Streptococcus cristatus was 0.12% (cutoff value) or more
  • the relative abundance of Prevotella roescheii was 0.15% (cutoff value) or more
  • the relative abundance of Lactobacillus fermentum was 0.08% (cutoff value) or more
  • the relative abundance of Streptococcus gordonii was 0.22% (cutoff value) or more
  • the relative abundance of Streptococcus constellatus was 0.17% (cutoff value) or more
  • the relative abundance of Campylovater gracilis was 0.13% (cutoff value).
  • the cutoff value is based on the test data shown in the Examples section and indicates the intermediate value between the average relative abundance in the acute stroke patient group and the average relative abundance in the non-stroke patient group. This cutoff value is merely an example and can be set appropriately depending on the sample, test conditions, etc.
  • a subject having a low relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Eubacterium salci, Streptococcus infantis, Haemophilus parainfluenzae, Prevotella nanseiense, Lancefieldella parvula, Neisseria genus bacteria, Saccharimonada TM7x genus bacteria, Haemophilus genus bacteria, Alloprevotella genus bacteria, Prevotellaceae family bacteria, and Veillonellaceae family bacteria in the oral bacterial flora is determined to be highly likely to have a stroke.
  • the relative abundance (reference value) of the bacteria in the oral bacterial flora of healthy subjects and/or stroke patients can be determined in advance and compared with the reference value. For example, when the relative abundance of the bacteria in the subject is low compared to the relative abundance of the bacteria in healthy subjects, it can be determined that the subject is highly likely to have a stroke.
  • the possibility of a subject suffering from stroke can be determined from the cutoff values obtained from the test data shown in the Examples section, according to the following criteria: when the relative abundance of Ubacterium salci in the oral flora of the subject is less than 0.40% (cutoff value), when the relative abundance of Streptococcus infantis is less than 1.05% (cutoff value), when the relative abundance of Haemophilus parainfluenzae is less than 1.49% (cutoff value), when the relative abundance of Prevotella nanseiensis is less than 1.01% (cutoff value), when the relative abundance of Lancefieldella parvula is less than 0.11% (cutoff value), when the relative abundance of Neisseria bacteria is less than 1.0 ...
  • the cutoff value indicates the intermediate value between the average value of the relative abundance of the acute stroke patient group and the average value of the relative abundance of the non-stroke patient group based on the test data shown in the Examples column, and the cutoff value is merely an example and can be set appropriately depending on the sample, test conditions, etc.
  • testing method 7 disclosed herein can be performed as a test to assist in the diagnosis of stroke, subjects who are determined to have a high probability of having a stroke by the testing method 7 disclosed herein can undergo further tests such as imaging tests and blood tests.
  • test kit for use in carrying out the test method 7 of the present disclosure.
  • the test kit may include a primer capable of specifically detecting the bacteria.
  • the test kit may further include a reagent for extracting DNA from a sample containing oral bacterial flora, as necessary.
  • a stroke improving agent (hereinafter, sometimes referred to as “improving agent 1") is provided, which contains as an active ingredient a substance that normalizes the intestinal flora or oral flora of a stroke patient.
  • improving agent 1 contains as an active ingredient a substance that normalizes the intestinal flora or oral flora of a stroke patient.
  • the present inventors have found that the bacterial composition in the intestinal flora or oral flora changes between stroke patients and healthy subjects, between first-time stroke patients and recurrent stroke patients, between stroke patients with poor prognosis and those without, and between stroke patients with sarcopenia and those without.
  • a substance that normalizes the intestinal flora of a stroke patient is a substance that reduces the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivarius, Lactobacillus fermentum, Clostridium perfringens, Alistipes putredines, Bacteroides flagellis, Streptococcus, Lactobacillus, Alistipes, Streptococcus family, and Veillonella.
  • the relative abundance of Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivarius, Lactobacillus fermentum, Clostridium perfringens, Alistipes putrediense, Streptococcus spp. bacteria, Lactobacillus spp. bacteria, and Alistipes spp. bacteria in the intestinal flora of stroke patients is increased compared to that of healthy subjects, so by reducing the relative abundance of at least one of these bacteria, it is possible to prevent stroke, alleviate the pathology, or inhibit the progression.
  • the relative abundance of Bacteroides flagellis and Lactobacillus fermentum in the intestinal flora of cardiogenic cerebral embolism patients is increased compared to that of healthy subjects, so by reducing the relative abundance of at least one of these bacteria, it is possible to prevent cardiogenic cerebral embolism, alleviate the pathology, or inhibit the progression.
  • the relative abundance of Streptococcus mutans in the intestinal flora of patients with cardiogenic cerebral embolism or atherothrombotic cerebral embolism is increased compared to healthy subjects, so by reducing the relative abundance of at least one of these bacteria, it is possible to prevent cardiogenic cerebral embolism or atherothrombotic cerebral embolism, alleviate the pathology, or inhibit the progression.
  • the relative abundance of Streptococcus family bacteria in the intestinal flora of patients with cardiogenic cerebral embolism, lacunar infarction, or atherothrombotic cerebral embolism is increased compared to healthy subjects, so by reducing the relative abundance of Streptococcus family bacteria, it is possible to prevent cardiogenic cerebral embolism, lacunar infarction, or atherothrombotic cerebral embolism, alleviate the pathology, or inhibit the progression.
  • the relative abundance of Streptococcus anginosus in the intestinal flora of patients with recurrent stroke is increased compared to patients with a first stroke, so stroke recurrence can be suppressed by decreasing the relative abundance of Streptococcus anginosus in the intestinal flora.
  • Streptococcus anginosus is present in the intestinal flora of stroke patients who are at high risk of death or recurrence of vascular disease (ischemic stroke, hemorrhagic stroke, myocardial infarction, aggravation of heart failure, or peripheral vascular occlusion) within two years, poor prognosis of stroke can be improved by reducing the relative abundance of Streptococcus anginosus in the intestinal flora.
  • the relative abundance of Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Clostridium perfringens, Alistipes putredines, and Bayonella spp. in the intestinal flora of stroke patients with sarcopenia is increased compared to stroke patients without sarcopenia. Therefore, by decreasing the relative abundance of at least one of the above bacteria in the intestinal flora, it is possible to reduce the risk of stroke patients developing sarcopenia, or to cure, alleviate, or suppress the worsening of sarcopenia occurring in stroke patients.
  • a substance that normalizes the intestinal flora of stroke patients is a substance that increases the relative abundance of at least one type of intestinal bacteria selected from the group consisting of Bacteroides plebeius, Anaerotepes hadras, Ruminococcus biscirculans, Bacteroides vulgatus, Prevotella copri, Saterella wadsworthensis, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium longum, Eubacterium rectal, Dialister invissus, Ruminococcus torx, Fusicatenibacter, Faecalibacterium, Dorea, Anaerotipes, Ruminococcus, Butyricoccus, Bifidobacterium, Bifidobacteriaceae, and Prevotellaceae.
  • the relative abundance of Bacteroides plebeius, Anaerotepes hadras, Ruminococcus biscirculans, Bacteroides vulgatus, Prevotella copri, Saterella wadsworthensis, Fusicatenibacter, Faecalibacterium, Dorea, Anaerotipes, Ruminococcus, and Butyricoccus in the intestinal flora of stroke patients is reduced compared to healthy individuals, and therefore, by increasing the relative abundance of at least one of these bacteria, it is possible to prevent stroke, alleviate the pathology, or inhibit progression.
  • the relative abundance of Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium longum, Bifidobacteria, and Bifidobacteriaceae in the intestinal flora of patients with cardiogenic cerebral embolism is lower than that of healthy subjects, so increasing the relative abundance of at least one of these bacteria can prevent cardiogenic cerebral embolism, alleviate pathology, or inhibit progression.
  • the relative abundance of Saterella wadsworthensis in the intestinal flora of patients with lacunar infarction is lower than that of healthy subjects, so increasing the relative abundance of Saterella wadsworthensis can prevent lacunar infarction, alleviate pathology, or inhibit progression.
  • the relative abundance of Eubacterium rectal and Dialister invissus in the intestinal flora of patients with intracerebral hemorrhage is lower than that of healthy subjects, so increasing the relative abundance of at least one of these bacteria can prevent cerebral hemorrhage, alleviate pathology, or inhibit progression.
  • the relative abundance of Prevotellaceae bacteria in the intestinal flora of patients with lacunar infarction or intracerebral hemorrhage is lower than that of healthy individuals, so by increasing the relative abundance of Prevotellaceae bacteria, it is possible to prevent lacunar infarction or intracerebral hemorrhage, alleviate the pathology, or inhibit the progression of the disease.
  • a substance that normalizes the oral bacterial flora of stroke patients is a substance that reduces the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Streptococcus anginosus, Treponema denticola, Streptococcus cristatus, Prevotella roescheii, Lactobacillus fermentum, Streptococcus gordonii, Streptococcus constellatus, Campylovitor gracilis, Selenomonas sproda, Tannerella forsythia, Porphyromonas bacteria, Fusobacterium bacteria, Streptococcus bacteria, Capnocytophaga bacteria, Campylobacter bacteria, and Streptococcus family bacteria in the oral bacterial flora.
  • the relative abundance of these bacteria in the oral cavity of stroke patients is increased compared to that of healthy individuals, so by reducing the relative abundance of at least one of these bacteria, it is possible to prevent stroke, alleviat
  • a substance that normalizes the oral flora of stroke patients is a substance that increases the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Eubacterium salci, Streptococcus infantis, Haemophilus parainfluenzae, Prevotella nanseiense, Lancefieldella parvula, Neisseria bacteria, Saccharimonada TM7x bacteria, Haemophilus bacteria, Alloprevotella bacteria, Prevotellaceae bacteria, and Veillonellaceae bacteria in the oral flora.
  • the relative abundance of these bacteria is reduced in the oral cavity of stroke patients compared to healthy individuals, so increasing the relative abundance of at least one type of these bacteria makes it possible to prevent stroke, alleviate the pathology, or inhibit progression.
  • the "substance that normalizes the intestinal flora or oral flora of stroke patients" used as an active ingredient may be appropriately selected depending on the type of bacteria to be targeted for increasing or decreasing the relative abundance in the intestinal flora or oral flora, and examples thereof include antibiotics, antibodies, phages, intestinal bacteria (probiotics), prebiotics, etc.
  • antibiotics used as the active ingredient may be any that exhibit antibacterial properties against the intestinal bacteria whose relative abundance is to be reduced.
  • antibiotics used as the active ingredient include penicillin antibiotics such as methicillin, oxacillin, nafcillin, cloxacillin, dicloxacillin, flucloxacillin, timocillin, amoxicillin, piperacillin, talampicillin, bacampicillin, ampicillin, ticarcillin, benzylpenicillin, and carbenicillin; nitroimidazole antibiotics such as metronidazole; glycopeptide antibiotics such as vancomycin and teicoplanin; neomycin, amikacin, gentamicin, kanamycin, capreomycin, and the like.
  • Aminoglycoside antibiotics such as mycobacterium purpura, netilmicin, streptomycin, and tobramycin; cephalothin, cefazolin, cefotiam, cefmetazole, cefotaxime, cefmenoxime, cefodizime, ceftriaxone, ceftazidime, cefoperazone, cefminox, latamoxef, flomoxef, cefpirome, cefepime, cefozopran, and cephalexin; penem antibacterial compounds such as faropenem; imipenem, panipenem, meropenem, biapenem, doripenem, ertapenem, tebinen, Carbapenem antibiotics such as penem; macrolide antibiotics such as azithromycin, clarithromycin, dirithromycin, erythromycin, troleandomycin; lincomycin antibiotics such as lincomycin, clindamycin,
  • antibiotics a suitable example is a combination of one or more, preferably two or more, more preferably three of the following: penicillin antibiotics, nitroimidazole antibiotics, and glycopeptide antibiotics.
  • Another suitable example of antibiotics is a combination of penicillin antibiotics, nitroimidazole antibiotics, glycopeptide antibiotics, and aminoglycoside antibiotics.
  • antibiotics used as active ingredients include one or more of ampicillin, metronidazole, and vancomycin, preferably two or more of these, and more preferably a combination of these three.
  • a suitable antibiotic is a combination of ampicillin, metronidazole, vancomycin, and neomycin.
  • the ratios are not particularly limited, but examples include 10 to 1000 parts by weight of nitroimidazole antibiotics and 5 to 500 parts by weight of glycopeptide antibiotics per 100 parts by weight of penicillin antibiotics; preferably, 50 to 500 parts by weight of nitroimidazole antibiotics and 10 to 250 parts by weight of glycopeptide antibiotics per 100 parts by weight of penicillin antibiotics; and more preferably, 75 to 150 parts by weight of nitroimidazole antibiotics and 25 to 75 parts by weight of glycopeptide antibiotics per 100 parts by weight of penicillin antibiotics.
  • the ratio of these is not particularly limited, but for example, 10 to 1,000 parts by weight of nitroimidazole antibiotics, 5 to 500 parts by weight of glycopeptide antibiotics, and 100 parts by weight of aminoglycoside antibiotics per 100 parts by weight of penicillin antibiotics may be used.
  • 10 to 1000 parts by weight of antibiotics preferably, 50 to 500 parts by weight of nitroimidazole antibiotics, 10 to 250 parts by weight of glycopeptide antibiotics, and 50 to 500 parts by weight of aminoglycoside antibiotics per 100 parts by weight of penicillin antibiotics; more preferably, 75 to 150 parts by weight of nitroimidazole antibiotics, 25 to 75 parts by weight of glycopeptide antibiotics, and 75 to 150 parts by weight of aminoglycoside antibiotics per 100 parts by weight of penicillin antibiotics.
  • the antibody used as the active ingredient may be any antibody capable of binding to the intestinal bacteria whose relative abundance in the intestinal flora is to be reduced.
  • the antibody isotype is not particularly limited and may be any of IgA, IgM, IgD, IgG, or IgE, or two or more isotypes may be used in combination. Among these isotypes, IgA is a suitable example.
  • the phage used as the active ingredient may be one that exhibits bacteriolytic activity against the intestinal bacteria whose relative abundance is to be reduced.
  • Phages that exhibit bacteriolytic activity against specific bacteria are known to be obtained by genetic engineering techniques or methods of isolating and culturing them from the environment (Trends Biotechnol. 2010 Dec;28(12):591-595. doi:10.1016/j.tibtech.2010.08.001. Epub 2010 Aug 31, Bacteriophage. 2011 Mar-Apr;1(2):111-114. doi:10.4161/bact.1.2.14590), and the improvement agent 1 disclosed herein can use phages produced or obtained by known techniques.
  • the intestinal bacteria used as an active ingredient may be any bacteria whose relative abundance is to be increased.
  • the bacteria may be live bacteria or attenuated or inactivated bacteria.
  • the intestinal bacteria used as an active ingredient may be intestinal flora (e.g., feces) collected from a healthy individual, and a method for administering intestinal flora collected from a healthy individual (e.g., fecal transplant method) is publicly known or can be easily conceived by a person skilled in the art from publicly known techniques.
  • the prebiotics used as active ingredients may be any that can promote the growth of the bacteria whose relative abundance is to be increased.
  • prebiotics There are no particular limitations on the type of prebiotics, but examples include oligosaccharides such as galactooligosaccharides, fructooligosaccharides, soybean oligosaccharides, lactose oligosaccharides, xylooligosaccharides, isomaltulose oligosaccharides, raffinose, and lactulose; dietary fibers such as polydextrose and inulin; and the like. These prebiotics may be used alone or in combination of two or more types.
  • the improving agent 1 disclosed herein can be provided in the form of a medicine or food.
  • the active ingredient may be mixed with a pharma- ceutically acceptable carrier or additive to prepare a desired dosage form.
  • pharma- ceutically acceptable carriers or additives include sterile water, physiological saline, stabilizers, excipients, antioxidants, buffers, preservatives, surfactants, chelating agents, binders, and the like.
  • dosage forms of pharmaceutical products include oral preparations such as capsules, tablets, pills, sachets, liquids, powders, granules, fine granules, film coatings, pellets, lozenges, sublingual preparations, chewable preparations, buccal preparations, pastes, syrups, suspensions, elixirs, or emulsions; suppositories, enemas, and the like.
  • the content of the active ingredient in the pharmaceutical product may be appropriately set according to the dosage amount, dosage form, and the like.
  • the active ingredient may be mixed with food ingredients to prepare the desired form.
  • the food form include supplements, health foods, functional foods, foods for specified health uses, and foods for the sick, but general foods may also be used.
  • the content of the active ingredient in the food product may be appropriately set according to the intake amount, form, etc.
  • the target of the improving agent 1 of the present disclosure is a person who is seeking prevention of stroke or a stroke patient.
  • the improving agent 1 of the present disclosure in a person who is seeking prevention of stroke, it is possible to reduce the risk of stroke.
  • the route of administration of the improving agent 1 of the present disclosure is not particularly limited and may be set appropriately depending on the type of active ingredient used, but examples include oral administration, rectal administration, and oral ingestion.
  • the dosage of the improving agent 1 of the present disclosure may be any amount effective for preventing or treating stroke, and may be set appropriately depending on the type of active ingredient used, the age, weight, and severity of symptoms of the subject, etc.
  • the total amount of the antibiotic administered per day should be set at about 1-300 mg/kg body weight, preferably about 10-200 mg/kg body weight, and should be administered 1-3 times a day for about 3-20 days, preferably about 5-16 days. More specifically, if a penicillin antibiotic (such as ampicillin) is used alone or in combination with other antibiotics, the total amount of the penicillin antibiotic administered per day should be set at about 10-80 mg/kg body weight, preferably about 20-40 mg/kg body weight, and should be administered 1-3 times a day for about 4-10 days, preferably about 7 days.
  • a penicillin antibiotic such as ampicillin
  • nitroimidazole antibiotics e.g., metronidazole
  • the total amount of nitroimidazole antibiotics administered per day should be set at about 7-120 mg/kg body weight, preferably about 15-60 mg/kg body weight, and should be administered 1-3 times a day for about 5-20 days, preferably about 14 days.
  • glycopeptide antibiotics e.g., vancomycin
  • the total amount of glycopeptide antibiotics administered per day should be set at about 5-30 mg/kg body weight, preferably about 10-15 mg/kg body weight, and should be administered 1-3 times a day for about 4-10 days, preferably about 7 days.
  • the total amount of aminoglycoside antibiotics administered per day should be set at about 10-60 mg/kg of body weight, preferably about 20-30 mg/kg of body weight, and should be administered 1-3 times a day for about 4-10 days, preferably about 7 days.
  • the total amount of antibody administered per day should be set at about 1-100 mg/kg body weight, preferably about 5-20 mg/kg body weight, and should be administered 1-3 times a day for about 3-14 days, preferably about 5-10 days.
  • Method for screening stroke improving agents (1) in another embodiment of the present disclosure, there is provided a method for screening test substances for a candidate substance that may be effective in improving stroke, the screening method including the following steps (hereinafter, also referred to as "screening method 1"): A step of evaluating the effect of the test substance on reducing the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivarius, Lactobacillus fermentum, Clostridium perfringens, Alistipes putredines, Bacteroides flagellis, Streptococcus, Lactobacillus, Alistipes, Streptococcus, and Veillonella in the intestinal flora; and A step of selecting a test substance having the effect as the candidate substance.
  • test substances include antibiotics, antibodies, phages, bacteria, peptides, proteins, dietary fiber, oligosaccharides, organic compounds, inorganic compounds, cell extracts, cell culture supernatants, plant extracts, culture products, and mixtures of these.
  • the method for evaluating the effect of reducing the relative abundance of the bacteria in the intestinal flora is not particularly limited, and a person skilled in the art can set appropriate conditions within the scope of normal creative ability.
  • the method can be performed in vivo or in vitro by adding an appropriate amount of a test substance to a sample containing an intestinal flora containing the bacteria, and measuring the change in the relative abundance of the bacteria.
  • a test substance that has been shown to have an effect of reducing the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Streptococcus anginosus, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivarius, Clostridium perfringens, Alistipes putredines, Streptococcus bacteria, Lactobacillus bacteria, and Alistipes bacteria in the intestinal flora can also be selected as a candidate substance for a stroke recurrence prevention agent.
  • a test substance that has been shown to have an effect of reducing the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Bacteroides flagellis and Lactobacillus fermentum in the intestinal flora can be selected as a candidate substance for a cardiogenic cerebral embolism improvement agent.
  • a test substance that has been shown to have the effect of reducing the relative abundance of Streptococcus mutans in the intestinal flora can be selected as a candidate substance for an improving agent for cardiogenic cerebral embolism or atherothrombotic cerebral embolism.
  • a test substance that has been shown to have the effect of reducing the relative abundance of Streptococcus bacteria in the intestinal flora can be selected as a candidate substance for an improving agent for cardiogenic cerebral embolism, lacunar infarction, or atherothrombotic cerebral embolism.
  • a test substance that has been shown to have the effect of reducing the relative abundance of Streptococcus anginosus can also be selected as a candidate substance for a preventive agent for stroke recurrence.
  • a test substance that has been shown to have the effect of reducing the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, Clostridium perfringens, Alistipes putredines, and Bayonella genus bacteria can also be selected as a candidate substance for an agent for improving sarcopenia that occurs concomitantly in stroke patients.
  • Screening method for stroke improving agents In another embodiment of the present disclosure, there is provided a method for screening test substances for a candidate substance that may be effective in improving stroke, the screening method including the following steps (hereinafter, also referred to as "screening method 2"): A step of evaluating the effect of the test substance on increasing the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Bacteroides plebeius, Anaerotepes hadras, Ruminococcus biscirculans, Bacteroides vulgatus, Prevotella copri, Saterella wadsworthensis, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium longum, Eubacterium rectal, Dialister invissus, Ruminococcus torx, Fusicatenibacter, Faecalibacterium, Dorea, Anaerotipes, Ruminococcus, Butyricoccus, Bifidobacterium, Fibromyaceae, and Prevotellaceae in the group
  • test substance used in screening method 2 of the present disclosure is as described in the section for screening method 1 above.
  • the method for evaluating the effect of increasing the relative abundance of the bacteria in the intestinal flora is not particularly limited, and a person skilled in the art can set appropriate conditions within the scope of normal creative ability.
  • the method can be performed in vivo or in vitro by adding an appropriate amount of a test substance to a sample containing an intestinal flora containing the bacteria, and measuring the change in the relative abundance of the bacteria.
  • a test substance evaluated to have the effect of increasing the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Bacteroides plebeius, Anaerotepes hadras, Ruminococcus biscirculans, Bacteroides vulgatus, Prevotella copri, Saterella wadsworthensis, Fusicatenibacter, Faecalibacterium, Dorea, Anaerotipes, Ruminococcus, and Butyricoccus in the intestinal flora is selected as a candidate substance for a stroke improving agent.
  • a test substance evaluated to have an effect of increasing the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium longum, Bifidobacteria genus bacteria, and Bifidobacteriaceae family bacteria in the intestinal flora is selected as a candidate substance for a cardiogenic cerebral embolism improving agent.
  • a test substance evaluated to have an effect of increasing the relative abundance of Saterella wadsworthensis in the intestinal flora is selected as a candidate substance for a lacunar infarction improving agent.
  • a test substance evaluated to have an effect of increasing the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Eubacterium rectal and Dialister invissus in the intestinal flora is selected as a candidate substance for a cerebral hemorrhage improving agent.
  • a test substance evaluated to have the effect of increasing the relative abundance of Prevotellaceae bacteria in the intestinal flora is selected as a candidate substance for an agent for improving lacunar infarction or cerebral hemorrhage.
  • Method for screening stroke improving agents in another embodiment of the present disclosure, there is provided a method for screening test substances for a candidate substance that may be effective in improving stroke, the screening method including the following steps (hereinafter, also referred to as "screening method 3"): A step of evaluating the effect of the test substance on reducing the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Streptococcus anginosus, Treponema denticola, Streptococcus cristatus, Prevotella roescheii, Lactobacillus fermentum, Streptococcus gordonii, Streptococcus constellatus, Campylovitor gracilis, Selenomonas sproda, Tannerella forsythia, Porphyromonas bacteria, Fusobacterium bacteria, Streptococcus bacteria, Capnocytophaga bacteria, Campylobacter bacteria, and Streptococcus family bacteria in the oral bacterial f
  • test substance used in Screening Method 3 of the present disclosure is as described in the Screening Method 1 section above.
  • the method for evaluating the effect of reducing the relative abundance of the bacteria in the oral flora is not particularly limited, and a person skilled in the art can set appropriate conditions within the scope of normal creative ability.
  • the evaluation can be performed in vivo or in vitro by adding an appropriate amount of a test substance to a sample containing an oral flora containing the bacteria, and measuring the change in the relative abundance of the bacteria.
  • test substance that has been confirmed to have the above-mentioned effect can also be selected as a candidate substance for a preventive agent for stroke recurrence.
  • Screening method for stroke improving agents (4)
  • a method for screening test substances for a candidate substance that may be effective in improving stroke including the following steps (hereinafter, also referred to as "Screening Method 4"): A step of evaluating the effect of the test substance on increasing the relative abundance of at least one type of bacteria selected from the group consisting of Eubacterium salci, Streptococcus infantis, Haemophilus parainfluenzae, Prevotella nanseiense, Lancefieldella parvula, Neisseria bacteria, Saccharimonada TM7x bacteria, Haemophilus bacteria, Alloprevotella bacteria, Prevotellaceae bacteria, and Veillonellaceae bacteria in the oral bacterial flora; and A step of selecting a test substance having the above effect as the candidate substance.
  • test substance used in Screening Method 4 of the present disclosure is as described in the Screening Method 1 section above.
  • the method for evaluating the effect of increasing the relative abundance of the bacteria in the oral flora is not particularly limited, and a person skilled in the art can set appropriate conditions within the scope of normal creative ability.
  • the method can be performed in vivo or in vitro by adding an appropriate amount of a test substance to a sample containing an oral flora containing the bacteria, and measuring the change in the relative abundance of the bacteria.
  • test substance that has been confirmed to have the above-mentioned effect can also be selected as a candidate substance for a preventive agent for stroke recurrence.
  • Test Method 8 Another embodiment of the present disclosure provides a method for testing the risk of developing stroke by disease type (hereinafter, also referred to as "Testing Method 8").
  • Testing Method 8 of the present disclosure includes a step of measuring the equol concentration in a blood sample collected from a subject. Since the equol concentration in the blood of a stroke patient correlates with the type of stroke, it is possible to test the risk of developing stroke by disease type by using the equol concentration in a blood sample collected from a subject as an indicator.
  • the subject may be any person who requires testing for the risk of developing a specific type of stroke, such as a healthy individual or a person suspected of developing a stroke.
  • a "blood sample” refers to a sample derived from blood, and includes whole blood, serum, and plasma.
  • the blood sample used in the testing method 8 of the present disclosure may be any of whole blood, serum, or plasma, with serum being a preferred example.
  • the concentration of equol in a blood sample can be measured using a known equol measurement method such as liquid chromatography mass spectrometry.
  • the lower the equol concentration in the blood sample the higher the risk of developing cardiogenic cerebral embolism, atherothrombotic cerebral infarction, or atrial fibrillation is judged to be.
  • the equol concentration in the subject's serum is less than 1 ng/mL, it can be judged that there is a risk of developing cardiogenic cerebral embolism (particularly cardiogenic cerebral embolism accompanied by atrial fibrillation), atherothrombotic cerebral infarction, or atrial fibrillation.
  • the reference value for the equol concentration in serum is one example, and can be set appropriately depending on the specimen, testing conditions, etc.
  • the testing method 8 of the present disclosure For subjects who are determined to be at risk of developing cardiogenic cerebral embolism, atherothrombotic cerebral infarction, or atrial fibrillation by the testing method 8 of the present disclosure, it is desirable to carry out preventive measures for these diseases and careful follow-up monitoring through diagnosis so that cardiogenic cerebral embolism, atherothrombotic cerebral infarction, or atrial fibrillation can be prevented or treated early.
  • Test Method 9 includes a step of measuring the equol concentration in a blood sample collected from a subject. Since the equol concentration in the blood of a stroke patient correlates with the severity of stroke, it is possible to test the severity of stroke by using the equol concentration in a blood sample collected from a subject as an indicator.
  • the subject may be anyone who requires testing for the severity of a stroke, and may be not only a stroke patient, but also anyone who requires testing for the presence or absence of a stroke.
  • the blood sample used and the method for measuring the equol concentration in the blood sample are the same as those in the test method 8.
  • the lower the equol concentration in the blood sample the higher the severity of the stroke is judged to be.
  • the severity of the stroke can be judged to be high.
  • the reference value for the equol concentration in serum is one example, and can be set appropriately depending on the sample, testing conditions, etc.
  • testing method 10 includes a step of measuring the equol concentration in a blood sample collected from a subject. Since the equol concentration in the blood of a stroke patient correlates with the functional prognosis of stroke, it is possible to test the functional prognosis of stroke by using the equol concentration in a blood sample collected from a subject as an indicator.
  • the subject may be anyone who requires testing for functional prognosis of stroke, and may be not only a stroke patient, but also anyone who requires testing for the presence or absence of stroke.
  • the blood sample used and the method for measuring the equol concentration in the blood sample are the same as those in the test method 8 described above.
  • the testing method 10 disclosed herein it is determined that the lower the equol concentration in a blood sample, the more likely the functional prognosis is to be poor. Specifically, from the test data shown in the Examples section, it can be determined that when the equol concentration in the subject's serum is less than 1 ng/mL, the functional prognosis is likely to be poor. Note that the reference value for the equol concentration in serum is one example, and can be set appropriately depending on the specimen, testing conditions, etc.
  • prognosis can be monitored by carefully administering medication and increasing the frequency of imaging tests so that early intervention and early treatment can be performed for the predicted poor functional prognosis.
  • a stroke improving agent (hereinafter sometimes referred to as “improving agent 2”) is provided that contains equol or an equol production promoter as an active ingredient.
  • improving agent 2 a stroke improving agent
  • the present inventors have found that when blood equol concentrations in stroke patients are low, the severity of the condition is high and functional prognosis is likely to be poor, and therefore increasing equol concentrations in the body can be effective in preventing and improving stroke.
  • administration or ingestion of equol or an equol production promoter can suppress the onset of stroke, cure, alleviate, or suppress the worsening of stroke pathology; or prevent recurrence in stroke patients.
  • the active ingredient is equol itself or an equol production promoter.
  • an equol production promoter is a substance that can promote equol production in the body.
  • An example of an equol production promoter is equol-producing bacteria.
  • Equol-producing bacteria are bacteria that have the activity of converting daidzein, daidzin, dihydrodaidzein, genistein, glycitein, and at least one of their derivatives into equol.
  • Examples of equol-producing microorganisms used as equol production promoters include Bifidobacterium bacteria and Lactococcus bacteria. Suitable examples of Bifidobacterium bacteria include Bifidobacterium pseudocatenulatum and Bifidobacterium longum.
  • isoflavone Another example of an equol production promoter is isoflavone, which is used as a substrate in the production of equol.
  • isoflavones include daidzein, daidzin, dihydrodaidzein, genistein, glycitein, and derivatives thereof.
  • black soybean seed coat extract JP Patent Publication No. 2021-155374
  • yeast mannan WO Publication No. 2020/004568
  • these substances can also be used in the improving agent 2 disclosed herein.
  • the improving agent 2 disclosed herein can be provided in the form of a medicine or food.
  • the active ingredient may be mixed with a pharma- ceutically acceptable carrier, additive, etc. to prepare a desired dosage form.
  • a pharma-ceutically acceptable carrier or additive is the same as in the case of improving agent 1 of the present disclosure.
  • the active ingredient and food ingredients may be mixed together to prepare the desired form.
  • the form of the food product is the same as that of improvement agent 1 of the present disclosure.
  • the target of the improving agent 2 of the present disclosure is a person who is required to prevent stroke or a stroke patient.
  • the improving agent 2 of the present disclosure for a person who is required to prevent stroke, it is possible to reduce the risk of stroke.
  • the improving agent 2 of the present disclosure is used for a stroke patient, it is possible to cure, alleviate, or inhibit the progression of stroke pathology; prevent, cure, alleviate, or inhibit the progression of sarcopenic complications in stroke patients; or prevent recurrence in stroke patients, depending on the type of active ingredient used.
  • the type of stroke to which the improving agent 2 of the present disclosure is applied is not particularly limited and may be any type, but suitable examples include cerebral infarction, more preferably cardiogenic cerebral embolism and atherothrombotic cerebral infarction, and even more preferably cardiogenic cerebral embolism.
  • the route of administration of the improving agent 2 of the present disclosure is not particularly limited and may be set appropriately depending on the type of active ingredient used, but examples include oral administration, rectal administration, and oral ingestion.
  • the dosage of the improving agent 2 of the present disclosure may be an amount effective for preventing or treating stroke, and may be appropriately set depending on the type of active ingredient used, the age, weight, and severity of symptoms of the subject.
  • the daily dosage of equol for an adult may be set to about 1 to 100 mg, preferably about 5 to 30 mg, and administered in 1 to 3 divided doses per day.
  • the daily dosage of equol-producing bacteria for an adult may be set to about 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 15 cfu, preferably about 1 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 12 cfu, and administered in 1 to 3 divided doses per day.
  • the daily dosage of the equol production promoter (other than equol-producing bacteria) for an adult may be set to about 0.1 to 20 g, preferably about 1 to 10 g, and administered in 1 to 3 divided doses per day.
  • Stroke cohort study Acute stroke patients were diagnosed based on clinical symptoms of acute neuroparalysis and findings from CT or MRI brain images (Nishimura, K. et al., J Atheroscler Thromb 21, 784-798, doi:10.5551/jat.19356 (2014)). Patient selection criteria were (i) patients aged 20 years or older, (ii) patients hospitalized within 7 days of onset, and (iii) patients who could provide written informed consent from the patient or their relatives. Patients were excluded if they had received or taken antibiotics within the past 3 months, or (ii) had a bowel movement after hospitalization and before screening sampling.
  • Patients were defined as having "diabetes” if they met any of the following criteria: (i) fasting plasma glucose ⁇ 126 mg/dL and (ii) HgbA1c value ⁇ 6.5%, or (iii) taking antidiabetic drugs or insulin.
  • "Hypercholesterolemia” was defined as (i) low-density lipoprotein cholesterol level ⁇ 140 mg/dL, (ii) high-density lipoprotein cholesterol level ⁇ 40 mg/dL, (iii) triglyceride level ⁇ 150 mg/dL, or (iv) taking lipid-lowering drugs.
  • "Atrial fibrillation” was defined based on the findings of 12-lead electrocardiogram or the underlying disease if there was a history of anticoagulant use.
  • Brain magnetic resonance imaging was performed using a 3.0 Tesla scanner (Magneton Verio or Spectra; Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany). Diffusion-weighted, FLAIR, T2-weighted, T2*-weighted, and magnetic resonance vascular images were obtained according to a standard clinical protocol. Cerebral microbleeds (CMBs) were assessed using T2*-weighted images. Anatomical extent and severity were classified according to the Microbleed Anatomical Rating Scale (MARS) (Gregoire, S. M. et al., Neurology 73, 1759-1766, doi:10.1212/WNL.0b013e3181c34a7d (2009)).
  • MARS Microbleed Anatomical Rating Scale
  • Lacunar infarcts and white matter hyperintensities were assessed using FLAIR images. Lacunar infarcts were defined as hypointense lesions with a hyperintense rim, 3–15 mm in diameter. Cerebral white matter lesions were scored according to the Fazekas scale for periventricular hyperdensity (PVH) and deep white matter hyperdensity (DWMH) (Fazekas, F. et al., AJR Am J Roentgenol 149, 351-356, doi:10.2214/ajr.149.2.351 (1987)). The presence or absence of CMB, lacunar lesions, and severe cerebral white matter lesions was verified by multiple neurologists.
  • PVH periventricular hyperdensity
  • DWMH deep white matter hyperdensity
  • Sample collection In the acute stroke cohort, saliva and stool samples were collected within a few days after admission. Saliva samples were collected in the morning (before brushing teeth or eating) using a self-collection kit (OMNIgene-ORAL, OM-501, DNA Geneotek, Canada) or an alternative collection kit (Salimetric Children's Swab, Salimetrics, LLC.USA) according to the protocol provided by the product manufacturer. Fecal samples were collected immediately after defecation using a stool collection container (SARSTEDT AG & Co.KG, Germany) and a guanidine thiocyanate solution kit (Techno Suruga Laboratory Co., Ltd., Shizuoka Prefecture, Japan).
  • Acute stroke samples were frozen in a freezer at -20°C immediately after collection, and then aliquoted and frozen for storage in a deep freezer at -80°C.
  • saliva samples were collected in the morning (before brushing teeth or eating) using a self-collection kit (OMNIgene-ORAL OM501), and fecal samples were collected using a guanidine thiocyanate solution kit (Techno Suruga Laboratories, Shizuoka Prefecture, Japan). All samples were transported to the laboratory at room temperature within one week of collection, and after aliquoting, were frozen and stored in a deep freezer at -80°C.
  • Alpha and beta diversity analysis The alpha and beta diversity of the bacterial flora were analyzed. Alpha diversity is an index of the abundance of bacterial species within a sample, and beta diversity is an index of the difference in bacteria between samples.
  • the alpha diversity of the bacterial flora was evaluated by species-based diversity and Faith's phylogenetic diversity, and statistically compared between groups using the Kruskal-Wallis pairwise test.
  • the beta diversity of the bacterial flora was evaluated by investigating the association between the composition of the bacterial flora and the pathway abundance ratio of the bacterial flora by PERMANOVA (Permutational multivariate analysis of variance) using 10,000 p-values. The median distance of the bacterial flora composition or pathway abundance ratio was calculated based on the Bray-Curtis distance, and compared using the Mann-Whitney test.
  • ANCOM central log ratio
  • W value which shows the regression coefficient to the null hypothesis
  • sPLS-DA was used to improve the discrimination of bacteria. Relative abundance at species level was normalized (log10 scale transformation and autoscaling) before sPLS-DA.
  • the 3D scores were ranked by the top 10 bacterial species (loading taxonomies) contributing to each dimension (comports 1–3).
  • the top 50 metabolic pathways distinguishable based on Ward's clustering were extracted to generate a heatmap. High relative abundance is depicted in red, and low relative abundance in blue.
  • the intensity of relative abundance ranges from 0 to 3 on the Z-scale.
  • sPLS-DA and heatmap clustering were calculated using the MetaboAnalyst tool in the R package (Chong, J. et al., Bioinformatics 34, 4313-4314, doi:10.1093/bioinformatics/bty528 (2016); KA, L. C. et al., BMC Bioinformatics 12, 253, doi:10.1186/1471-2105-12-253 (2011)).
  • Acute stroke patients were classified according to disease type (atherothrombotic cerebral infarction, cardiogenic cerebral embolism, lacunar infarction, and intracerebral hemorrhage), and the relative abundance of bacteria at the family level in the oral and intestinal flora was displayed using stacked bar graphs.
  • the relative abundance of Streptococci was increased in patients with atherothrombotic cerebral embolism; the relative abundance of Streptococci and the relative abundance of Bifidobacteria were increased in patients with cardiogenic cerebral embolism; the relative abundance of Streptococci and the relative abundance of Prevotellaceae were increased in patients with lacunar infarction; and the relative abundance of Prevotellaceae was decreased in patients with intracerebral hemorrhage (Fig. 5 and Table 3). From these results, it became clear that the relative abundance of Streptococci in the intestinal flora can be a test indicator for atherothrombotic cerebral embolism.
  • carrier rate refers to the proportion of people carrying a particular bacterium relative to the total number of people in each group.
  • the intestinal flora contains Alistipes, Streptococcus, Lactobacillus, Alistipes, Fusicatenibacter, Faecalibacterium, Dorea, Anaerotipes, Ruminococcus, Butyricoccus, Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Streptococcus parasanguinis, and Streptomyces.
  • the oral flora contains Porphyromonas, Fusobacterium, Streptococcus, Capnocytophaga, Campylobacter, Neisseria, Saccharimonada TM7x, Haemophilus, Alloprevotella, Treponema denticola, Streptococcus cristatus, Prevotella roescheii, Streptococcus anginosus, and Eubacterium saponaria.
  • Streptococcus anginosus, Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivarius, and Streptococcus mutans are bacteria that normally reside in the oral cavity and are not normally present in the intestinal flora of healthy individuals. Therefore, it was found that in stroke patients, these bacteria migrate from the oral cavity to the intestinal flora, resulting in a change in the intestinal flora. In addition, Lactobacillus fermentum is not normally present in the intestinal flora of healthy individuals.
  • Streptococcus anginosus is a microaerophilic Gram-positive coccus that constitutes the normal oral flora.
  • the detection of Streptococcus anginosus in the gut microbiota of acute stroke patients is consistent with recent microbiome studies that have reported Streptococcus anginosus as a candidate for gastrointestinal carcinogenesis and atherosclerosis (Coker, O. O. et al., Gut 67, 1024-1032, doi:10.1136/gutjnl-2017-314281 (2016); Jie, Z. et al., Nat Commun 8, 845, doi:10.1038/s41467-017-00900-1 (2017)).
  • a principal coordinate analysis (PCoA) plot based on the Bray-Curtis distance of the intestinal and oral flora of acute stroke patients and non-stroke patients was colored separately for carriers and non-carriers of each bacterial species.
  • PCoA principal coordinate analysis
  • sPLS-DA sparse partial least squares discriminant analysis
  • Streptococcus anginosus is originally a normal bacterium in the oral cavity, and it was found that in stroke patients, Streptococcus anginosus migrates from the oral cavity to the intestine and contributes to the transformation of the gut microbiota.
  • Streptococcus anginosus Analysis of the relative abundance of oral and intestinal flora in the presence or absence of Streptococcus anginosus revealed that the presence of Streptococcus anginosus suppresses Bacteroides plebeius in the intestine, and suppresses Eubacterium salci, Streptococcus infantis, and Prevotella nanseiensis in the oral cavity, while increasing Streptococcus cristatus and Treponema denticola.
  • the oral microbiota of acute stroke patients contained 11 species, namely Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Lactobacillus fermentum, Streptococcus gordonii, Streptococcus constellatus, Treponema denticola, Prevotella roescheii, Campylovitor gracilis, Selenomonas sproda, Streptococcus cristatus, and Tannerella forsythia;
  • the oral microbiota of non-stroke patients contained 11 species, namely Streptococcus infantis, Eubacterium purpuratum, and Lactobacillus subtilis.
  • Streptococcus anginosus three species of bacteria, Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, and Lactobacillus fermentum, were found to form the core of the communities in both the oral and gut microbiota of acute stroke patients. Furthermore, in the gut microbiota, Streptococcus anginosus was found to be in a promoting relationship with these acute stroke-related bacterial species, while being in an inhibitory relationship with non-stroke-related bacterial species, and to be a hub between the communities ( Figure 14, Tables 13 and 14).
  • a heat map was created showing the top 50 MetaCyc pathways that could distinguish between the four groups of oral and intestinal microbiota in acute stroke patients and non-stroke patients (Figure 15C).
  • the proportion of glycolysis and lactate fermentation pathways was increased, and the proportion of gluconeogenesis pathways was decreased, in the oral and intestinal microbiota of acute stroke patients compared to non-stroke patients ( Figure 16D-F).
  • the lactate fermentation pathway is a metabolic pathway that is widely seen not only in Streptococcus bacteria but also in Lactobacillus, Lactococcus, and Bifidobacterium bacteria.
  • the results of the predictive metagenomic analysis showed that the relative abundance of Streptococcus anginosus was high in the gut microbiota of acute stroke patients, which was associated with an increase in the gut microbiota of Streptococcus parasanguinis, Streptococcus salivarius, and Streptococcus mutans, as well as Lactobacillus fermentum.
  • the decrease in the biosynthetic pathway of branched chain fatty acids in the gut reflects the suppression of bacteria such as Prevotella copri, Anaerotepes hadras, and Eubaikuterium rectal, which are involved in the breakdown of dietary fiber and the production of butyric acid.
  • Streptococcus anginosus in the gut microbiota was associated with stroke even after adjusting for age, sex, and vascular risk factors (smoking, hypertension, diabetes, and hyperlipidemia) (adjusted odds ratio (95% confidence interval: CI) 3.66 (1.44-9.76), p ⁇ 0.01) (Model 2 in Table 14).
  • the presence of Streptococcus anginosus in the gut microbiota was associated with stroke even after adjusting for age, sex, vascular risk factors, and major bacteria (Anaerotepes hadras, Bacteroides plebeius) (adjusted odds ratio (95% CI) 4.48 (1.51-14.78), p ⁇ 0.01) (Model 3 in Table 16).
  • ROC curves were created to distinguish between acute stroke patients and non-stroke patients using vascular risk factors (age, sex, smoking, hypertension, diabetes, and hyperlipidemia) and the relative abundances of Streptococcus anginosus, Anaerotepes hadras, and Bacteroides plebius in the gut microbiota.
  • the areas under the receiver operating characteristic curves (95% CI) were 0.87 (0.80 - 0.93) for vascular risk factors alone, 0.89 (0.83 - 0.95) for vascular risk factors and the relative abundance of Streptococcus anginosus in the gut microbiota, and 0.93 (0.88 - 0.98) for vascular risk factors and the three bacterial species.
  • Stroke patients were divided into those with and without detection of Streptococcus anginosus in the intestinal flora during the acute stroke phase (at the time of registration), and the results of composite events over a two-year period were plotted using Kaplan-Meire curves and compared using the log-rank test.
  • these results indicate that stroke patients who have Streptococcus anginosus in their intestinal flora have a relatively poor prognosis and a relatively high risk of all-cause mortality or major vascular events.
  • NIHSS score based on the relative abundance of bacterial species in the intestinal microbiota related to stroke and non-stroke as revealed by network analysis, standardized values using CLR (centered log ratio) were calculated and a comprehensive analysis was conducted on the correlation between NIHSS score at admission and vascular risk factors (age, BMI, mean blood pressure, LDL cholesterol, hemoglobin A1c, CRP, BNP) and important bacterial species in the intestine.It was found that there was a significant inverse correlation between a decrease in the standardized relative abundance of Anaerotepes hadras, Bacteroides plebeius, Prevotella copri, and Eubacterium rectale and an increase in NIHSS.
  • Acute stroke patients were classified according to disease type (atherothrombotic cerebral infarction, cardiogenic cerebral embolism lacunar infarction, intracerebral hemorrhage) and the relative abundance of Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Lactobacillus fermentum, Bacteroides flagellis, Anaerotepes hadras, Bacteroides plebeius, Saterella wadsworthensis, Prevotella copri, Eubacterium rectal, and Diaryster invissus in the gut microbiota was analyzed (Figure 23 and Table 21).
  • patients with cardiogenic cerebral embolism showed increased relative abundance of Bacteroides flagellis, Lactobacillus fermentum, and Streptococcus mutans
  • patients with intracerebral hemorrhage showed decreased relative abundance of Eubacterium rectal and Dialister invissus
  • patients with lacunar infarction showed decreased relative abundance of Saterella wadsworthensis
  • patients with atherothrombotic cerebral embolism showed increased relative abundance of Streptococcus mutans.
  • biomarkers of microvascular disease based on brain MRI findings and the prevalence of Streptococcus anginosus, Streptococcus mutans, Lactobacillus fermentum, Bacteroides flagellis, Anaerotepes hadras, Bacteroides plebeius, Saterella wadsworthensis, Prevotella copri, Eubacterium rectal, and Diaryster invissus in the gut microbiota (Table 22).
  • stroke patients with severe cerebral white matter lesions had significantly higher rates of Lactobacillus fermentum and Streptococcus anginosus in the gut microbiota.
  • Stroke patients with lacunar lesions tended to have a lower rate of Bacteroides flagellis and a higher rate of Dialister invissus in the gut microbiota.
  • stroke patients with cerebral microbleeds had significantly higher rates of Eubacterium rectale and Streptococcus anginosus in the gut microbiota (Table 22).
  • Streptococcus anginosus and Lactobacillus fermentum which are commonly increased in the oral and intestinal flora of stroke patients, may also be related to the severity of cerebral white matter lesions, which are biomarkers of cerebral small vessel disease in brain MRI.
  • the inclusion criteria for stroke patients were (i) patients whose serum was stored in the National Cerebral and Cardiovascular Center Biobank with their consent, and (ii) stroke patients who were hospitalized due to lacunar infarction, atherothrombotic cerebral infarction, cardiogenic cerebral embolism, cerebral embolism of unknown embolic source, intracerebral hemorrhage, or cerebral infarction due to other causes.
  • the exclusion criteria were: (i) patients with malignant tumors, (ii) patients who had a fasting period of 24 hours or more at the time of biobank blood collection, and (iii) patients whose biobank blood collection took place more than 6 months after the onset of stroke.
  • NIHSS National Institute of Health Stroke Scale
  • cerebral infarction patients cardiac cerebral embolism, atherothrombotic cerebral infarction, cardiogenic cerebral embolism, and cerebral embolism of unknown origin
  • equol producers had a significantly milder functional prognosis at the time of discharge.
  • the concentration of equol in blood samples can be used as a testing indicator for the risk of developing different types of stroke, and in particular, being a non-equol producer can be used as a testing indicator for the risk of developing cardiogenic cerebral embolism, atherothrombotic cerebral infarction, and atrial fibrillation. It has also been shown that the concentration of equol in blood samples can be used as a testing indicator for the risk of stroke becoming severe, and furthermore, it has been shown that it can be used as a testing indicator for the functional prognosis of stroke.
  • Equol-producing bacteria are known to produce equol using soy isoflavones such as daidzein and genistein as substrates. It is said that 30-50% of Japanese people possess equol-producing bacteria, and not everyone is able to produce equol in their bodies.
  • this Example confirmed that, among acute stroke patients, cardiogenic cerebral embolism patients had a low relative abundance of Bifidobacterium bacteria, which are known to produce equol.
  • Bifidobacterium bacteria Bifidobacterium pseudocatenulatum and Bifidobacterium longum may have a major impact on cardiogenic cerebral embolism.
  • this Example confirmed that in the group of patients with cardiogenic cerebral embolism, there were significantly more equol non-producers than equol producers.
  • the results shown in this disclosure indicate that equol itself, or equol production-promoting substances such as Bifidobacterium bacteria, may be used as a preventive or therapeutic agent for cardiogenic cerebral embolism.
  • SHRSP Stroke prone spontaneously hypertensive rats
  • CLEA Tokyo, Japan
  • SP-SHR/Izm is a rat model that develops hypertension and spontaneously develops stroke due to salt loading. This test was conducted in an SPF environment under the approval of the animal experiment plan (Approval number 21068) of the National Cerebral and Cardiovascular Center (NCVC; Suita, Japan).
  • 70-day-old SHRSP were divided into three groups as shown in Table 36 and reared under the conditions shown in Table 36.
  • the outcome was death events, and the survival time was observed (Figure 28A).
  • Table 37 shows the median survival time (IQR) for each group.
  • IQR median survival time
  • 70-day-old SHRSP were divided into three groups as shown in Table 38 and kept under the conditions shown in Table 38.
  • Body weights and neurological symptoms were measured over time, and the animals were euthanized at 105 days of age (35 days after breeding) (Figure 29A).
  • 70-day-old SHRSP were divided into four groups as shown in Table 39 and reared under the conditions shown in Table 39, and euthanized at 105 days of age (35 days after rearing).
  • kidneys were sampled and fixed in 4% formaldehyde for 2 days, after which short-axis cross sections of the kidneys were cut out, embedded in paraffin, and thin sections were prepared.
  • the renal glomerular structure and afferent arterioles were identified by microscopic examination using hematoxylin-eosin and Masson's trichrome staining.
  • SHRSPs aged 63 days were fed standard rat diet (Funahashi SP diet) and water ad libitum for 7 days. After that, SHRSPs aged 70 days were divided into 3 groups as shown in Table 43 and kept for 14 days under the conditions shown in Table 43.
  • 16SrRNA data was prepared from 84-day-old fecal samples from each group, and clustering was performed using partial least squares regression (sPLS-DA) analysis based on Level 7 (species level) information. As a result, it was found that the characteristics of the bacterial flora in each group were differentiated by clustering using sPLS-DA ( Figure 32B).
  • sPLS-DA partial least squares regression
  • the 84-day-old fecal samples were compared between the group that ingested water (group A) and the group that ingested saline (group B).
  • the "relative amount of each bacterium in group B/relative amount in group A” was calculated as Fold change (FC), and the value of the ANOVA test between each group was calculated as a p-value.
  • a volcano plot showing the difference in the relative amount of bacterial species was created using the -log10 value of p-value and the log2 (FC) value of Fold change (FC).
  • bacteria of the genus Lactobacillus Alistipes, Frisingicoccus, Corynebacterium steathonis, Streptococcus, Monoglobus, Eubacterium siraelum, Butyricoccus, and Blautia were identified as bacteria that increased in the group that ingested saline (group B) (Table 45, Figure 32C).
  • Clostridium, Lactospiracae UCG001, Richenellacea, and Lachnospiracae NK4A136 were identified as bacteria that decreased in the group that ingested saline (group B) (Table 45, Figure 32C).
  • a Venn diagram was created to identify the bacterial species that increased or decreased in common between the two groups, focusing on the intestinal bacterial species that changed significantly between groups A and B, and between groups B and C.
  • bacteria of the genus Lactobacillus, Alistipes, Frisingicoccus, Streptococcus, and Monoglobus were identified ( Figure 32E).
  • 70-day-old SHRSP were divided into 5 groups as shown in Table 47 and reared under the conditions shown in Table 47.
  • the outcome was death events, and the survival time was observed ( Figure 33A).
  • Reference Test Example A By conducting the tests described below, the effects of oral administration of antibiotics to stroke-prone spontaneously hypertensive rat models on the intestinal flora, as well as the effects on the brain, heart, kidneys, and small intestine, can be verified, and the preventive or therapeutic effects of antibiotics on stroke can be confirmed.
  • SHRSP Male, CLEA, Tokyo, Japan
  • SHRSP Male, CLEA, Tokyo, Japan
  • a standard rat diet Fenahashi SP diet
  • the SHRSP will be divided into 6 groups as shown in Table 48 and kept under the conditions shown in Table 48 ( Figure 34) when they reach 70 days of age.
  • feces will be collected and intestinal flora analysis will be performed (Figure 34).
  • the animals will be euthanized and tissues of the brain, heart, kidney and small intestine will be sampled and stained with hematoxylin-eosin and Masson's trichrome to compare and analyze the state of blood vessels and the degree of fibrosis in each tissue.
  • Reference Test Example B By conducting the tests described below, the effects of oral administration of IgA antibody to stroke-prone spontaneously hypertensive rat models on the intestinal flora, as well as the effects on the brain, heart, kidneys, and small intestine, can be verified, and the preventive or therapeutic effects of antibiotics on stroke can be confirmed.
  • SHRSP Male, CLEA, Tokyo, Japan
  • SHRSP Male, CLEA, Tokyo, Japan
  • a standard rat diet Fenahashi SP diet
  • the SHRSP will be divided into 4 groups as shown in Table 49 and kept under the conditions shown in Table 49 ( Figure 35) when they reach 70 days of age.
  • feces will be collected and intestinal flora analysis will be performed (Figure 35).
  • the animals will be euthanized and tissues of the brain, heart, kidney and small intestine will be sampled and stained with hematoxylin-eosin and Masson's trichrome to compare and analyze the state of blood vessels and the degree of fibrosis in each tissue.

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Abstract

本開示の一つの目的は、脳卒中の罹患の有無を検査する方法を提供することである。　被験者から採取された腸内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivalius）、及びラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の有無を測定する工程を含む、脳卒中の罹患の有無を検査する方法。

Description

脳卒中の検査方法、及び脳卒中の改善剤
　本開示は、脳卒中の罹患の有無又はその病型を検査する方法、脳卒中の重症度を検査する方法、脳卒中の再発リスクを検査する方法、及び脳卒中の予後予測のための検査方法に関する。また、本開示は、脳卒中の改善剤、及びそのスクリーニング方法に関する。
　脳卒中は、脳の血管が急に破れたり，詰まったりして脳の血液の循環に障害をきたす病気であり、世界中で主要な死因及び障害の主な原因の一つになっている。脳卒中は、血管が破れる出血性脳卒中（脳出血）と、血管が詰まる虚血性脳卒中（脳梗塞）に大別される。脳出血には、脳の組織自体に出血が起こる脳内出血（実質内出血）と、脳動脈瘤が破裂することが主な原因となってクモ膜下腔に出血が起こるクモ膜下出血がある。脳梗塞には、血管が詰まる原因に基づいて、心原性脳塞栓症、アテローム血栓性脳梗塞、ラクナ梗塞等の臨床病型がある。また、脳卒中は、再発率が高いことも知られている。
　脳卒中は、病型に応じた薬物治療や外科治療が確立されており、早期に専門医による診断を受けて適切な処置を受けることができれば、発症若しくは再発の予防、症状の進行の抑制、又は後遺症の軽減が可能になる。そのため、脳卒中の兆候をいち早く把握し、適切なケア又は治療を行うことが重要である。
　従来、脳卒中の診断は、CT検査やMRI検査等の画像検査によって行われているが、その診断は脳卒中専門医であっても必ずしも容易とはいえない。そこで、生体反応によって変化するバイオマーカーによって脳卒中を検査できれば、画像検査による診断精度を高めたり、症例に応じた最適な個別化医療を実現したりすることが期待される。
　近年、生体内の細菌叢変化が疾患と関連している場合があることが報告されており、脳卒中でもバイオマーカーとなり得る生体内細菌が報告されている。例えば、特許文献１には、脳卒中患者の血液では、コリンセラ属細菌及びフラボバクテリウム属細菌由来小胞の含量の増加、ラクトバシラス属細菌及びプロピオニバクテリウム属細菌由来小胞の含量の減少が認められ、血液のメタゲノム解析によってこれらの細菌由来の細胞外小胞の含有量増減を分析することにより脳卒中を判定できることが記載されている。また、非特許文献１には、脳内出血患者、及び脳微小出血を伴う脳卒中患者は、口腔内細菌叢にcnm陽性ストレプトコッカス・ミュータンスが存在している割合が高いことが記載されている。
Tonomura, S. et al. Intracerebral hemorrhage and deep microbleeds associated with cnm-positive Streptococcus mutans; a hospital cohort study. Sci Rep 6, 20074, doi:10.1038/srep20074 (2016).
国際公開第2019/160284号
　従来、脳卒中における腸内細菌叢と口腔内細菌叢の変容や機能については十分に解明されていない。腸内細菌叢又は口腔内細菌叢から、脳卒中の罹患、重症度、再発リスク、予後予測等に関するバイオマーカーを見出すことができれば、脳卒中の早期介入や適切な治療方針の策定、発症リスクに応じた栄養療法（プロバイオティクス等）の適用や、重症化を予防するための治療方法等の開発が期待される。
　そこで、本開示の一つの目的は、腸内細菌叢又は口腔内菌叢を使用して、脳卒中の罹患の有無又はその病型を検査する方法を提供することである。また、本開示の他の目的は、腸内細菌叢を使用して、脳卒中の重症度を検査する方法を提供することである。また、本開示の更に他の目的は、腸内細菌叢を使用して、脳卒中の再発リスクを検査する方法を提供することである。また、本開示の更に他の目的は、腸内細菌叢を使用して、脳卒中の予後予測予測のための検査する方法を提供することである。また、本開示の更に別の目的は、脳卒中の改善剤、及び脳卒中の改善に有効な成分をスクリーニングする方法を提供することである。
　本発明者等は、前記課題を解決すべく、脳卒中の腸内細菌叢及び口腔内菌叢に着目し、種々検討を行ったところ、脳卒中患者では、口腔内細菌叢の乱れ（歯周病菌と虫歯菌の増加）と口腔内細菌の腸内細菌叢への移行が認められ、腸内細菌叢の口腔化（gut microbial oralization）を引き起こしていること等を見出した。具体的には、本発明者等は、脳卒中コホート研究により、以下に知見を得た。
(1) ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、及びストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivalius）は、口腔内に常在する細菌であり、通常は腸内細菌叢に存在していないが、脳卒中患者では、これらの細菌が口腔内から腸内細菌叢に移行して腸内細菌叢の変容を生じさせており、腸内細菌叢におけるこれらの細菌の存在の有無は、脳卒中の検査指標になり得る。
(2) ラクトバシラス・ファーメンタムは、通常は腸内細菌叢に存在していないが、脳卒中患者の腸内細菌叢では認められ、腸内細菌叢におけるラクトバシラス・ファーメンタムの存在の有無は、脳卒中の検査指標になり得る。
(3) 脳卒中患者は、健常者に比べて、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・パラサングイニス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ラクトバシラス・ファーメンタム、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、アリスティペス・プトレディネス（Alistispes putredinis）、バクテロイデス・フラジェリス（Bacteroides fragilis）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、ラクトバシラス属（Lactobacillus）細菌、アリスティペス属（Alistispes）細菌、レンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌の相対的存在量が増加しており、腸内細菌叢におけるこれらの細菌の相対的存在量は脳卒中の検査指標になり得る。
(4) 脳卒中患者は、健常者に比べて、腸内細菌叢におけるバクテロイデス・プレビウス（Bacteroides plebeius）、アナエロテペス・ハドラス（Anaerostipes hadrus）、ルミノコッカス・ビサーキュランス（Ruminococcus bicirculans）、バクテロイデス・ブルガータス（Bacteroides vulgatus）、プレボテラ・コプリ（Prevotella copri）、サテレラ・ワズワーステンシス（Sutterella wadsworthensis）、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ユウバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、ダイアリスター・インビサス（Dialister invisus）、フシカテニバクター属（Fusicatenibacter）細菌、フィーカリバクテリウム属（Faecalibacterium）細菌、ドレア属（Dorea）細菌、アナエロティペス属（Anaerostipes）細菌、ルミノコッカス属（Ruminococcus）細菌、ブチリコッカス属（Butyricoccus）細菌、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）細菌、ビフィドバクテリア科（Bifidobacteriaceae）細菌、及びプレボテラ科（Prevotellaceae）細菌の相対的存在量が低下しており、腸内細菌叢におけるこれらの細菌の相対的存在量は脳卒中の検査指標になり得る。
(5) 心原性脳塞栓症の患者は、健常者に比べて、腸内細菌叢において、バクテロイデス・フラジェリス、ラクトバシラス・ファーメンタム、ストレプトコッカス・ミュータンス、及びレンサ球菌科細菌の相対的存在量が増加し、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）細菌、及びビフィドバクテリア科細菌の相対的存在量が低下しており、腸内細菌叢におけるこれらの細菌の相対的存在量は心原性脳塞栓症の検査指標になり得る。
(6) ラクナ梗塞の患者は、健常者に比べて、腸内細菌叢において、レンサ球菌科細菌の相対的存在量が増加し、サテレラ・ワズワーステンシス及びプレボテラ科細菌の相対的存在量が低下しており、腸内細菌叢におけるこれらの細菌の相対的存在量はラクナ梗塞の検査指標になり得る。
(7) アテローム血栓性脳塞栓症の患者は、健常者に比べて、腸内細菌叢において、ストレプトコッカス・ミュータンス及びレンサ球菌科細菌の相対的存在量が増加しており、腸内細菌叢におけるレンサ球菌科細菌の相対的存在量はアテローム血栓性脳塞栓症の検査指標になり得る。
(8) 脳内出血の患者は、健常者に比べて、腸内細菌叢において、ユウバクテリウム・レクタル、ダイアリスター・インビサス、及びプレボテラ科細菌の相対的存在量が低下しており、腸内細菌叢におけるこれらの細菌の相対的存在量は脳内出血の検査指標になり得る。
(9) サルコペニアを併発している脳卒中患者は、そうでない脳卒中患者に比べて、腸内細菌叢において、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・パラサングイニス、クロストリジウム・パーフリンゲンス、アリスティペス・プトレディネス、及びベイオネラ属細菌の相対的存在量が増加し、バクテロイデス・ブルガータス、ルミノコッカス・トルク、プレボテラ・コプリ、及びブチリコッカス属細菌の相対的存在量が低下しており、腸内細菌叢におけるこれらの細菌の相対的存在量は脳卒中でのサルコペニア併発の検査指標になり得る。
(10) 脳卒中患者の腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス及びラクトバシラス・ファーメンタムの相対的存在量が多い程、脳卒中の重症度が高く、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量は脳卒中の重症度の検査指標になり得る。
(11) 脳卒中患者の腸内細菌叢におけるアナエロテペス・ハドラス、バクテロイデス・プレビウス、ユウバクテリウム・レクタル、及びプレボテラ・コプリの相対的存在量が少ない程、脳卒中の重症度が高く、腸内細菌叢におけるこれらの細菌の相対的存在量は脳卒中の重症度の検査指標になり得る。
(12) 再発の脳卒中患者は、初発の脳卒中患者に比べて、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量が増加しており、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量は脳卒中の再発リスクの検査指標になり得る。
(13) 腸内細菌叢においてストレプトコッカス・アンギノーサスを保有している脳卒中患者は、2年以内での死亡又は血管病（虚血性脳卒中、出血性脳卒中、心筋梗塞、心不全増悪、又は末梢血管閉塞）再発のリスクが高く、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの存在の有無は、脳卒中の予後予測のための検査指標になり得る。
(14) 脳卒中患者は、健常者に比べて、口腔内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、ストレプトコッカス・クリスタタス（Streptococcus cristatus）、プレボテラ・ロエッシェイイ（Prevotella loescheii）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・コンステラータス（Streptococcus constellatus）、カンピロバイター・グラシリス（Campylobacter gracilis）、セレノモナス・スプチゲナ（Selenomonas sputigena）、タンネレラ・フォーサイシア（Tannerella forsythia）、ポルフィロモナス属（Porphyromonas）細菌、フソバクテリウム属（Fusobacterium）細菌、ストレプトコッカス属細菌、カプノサイトファーガ属（Capnocytophaga）細菌、カンピロバクター属（Campylobacter）細菌、及びレンサ球菌科細菌の相対的存在量が増加しており、口腔内細菌叢におけるこれらの細菌の相対的存在量は脳卒中の検査指標になり得る。
(15) 脳卒中患者は、健常者に比べて、口腔内細菌叢におけるユウバクテリウム・サルシ（Eubacterium sulci）、ストレプトコッカス・インファンティス（Streptococcus infantis）、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ（Haemophilus parainfluenzae）、プレボテラ・ナンセイエンシッス（Prevotella nanceiensis）、ランセフィールデラ・パルブラ（Lancefieldella parvula）、ナイセリア属（Neisseria）細菌、サッカリモナダTM7x属（Saccharimonadaceae TM7x）細菌、ヘモフィルス属（Hemophilus）細菌、アロプレボテラ属（Alloprevotella）細菌、プレボテラ科細菌、及びベイロネラ科（Veillonellaceae）細菌の相対的存在量が低下しており、口腔内細菌叢におけるこれらの細菌の相対的存在量は脳卒中の検査指標になり得る。
　更に、本発明者等は、健常者と脳卒中患者の血清エクオール濃度を分析したところ、脳卒中患者の血清エクオール濃度は、脳卒中病型別の発症リスク、脳卒中の重症化リスク、及び脳卒中の機能予後と相関があること等を見出した。具体的には、本発明者等は、脳卒中患者の血清エクオール濃度を調査することにより、以下に知見を得た。
(16) 心原性脳塞栓症患者は、健常者と比較して、エクオール産生者（血清エクオール濃度が1 ng/mL以上の者）の割合が有意に低下しており、血清エクオール濃度は、特に心原性脳塞栓症の発症リスクの検査指標になり得る。
(17) 心原性脳塞栓症患者は、ラクナ梗塞、アテローム血栓性脳梗塞、塞栓源不明脳塞栓症、脳内出血、その他の原因による脳卒中患者と比較して、エクオール産生者（血清エクオール濃度が1 ng/mL以上の者）の割合が有意に低下しており、血清エクオール濃度は、脳卒中病型別の発症リスク、特に心原性脳塞栓症の発症リスクの検査指標になり得る。
(18) 脳梗塞患者（心原性脳塞栓症、アテローム血栓性脳梗塞、心原性脳塞栓症、塞栓源不明脳塞栓症）の中で、心原性脳塞栓症の原因の1つである心房細動保有者は、エクオール産生者（血清エクオール濃度が1 ng/mL以上の者）の割合が有意に低下しており、心房細動を伴う心原性脳塞栓症の発症リスクの検査指標になり得る。
(19) 脳卒中患者の中でエクオール産生者は、脳卒中発症時の重症度（National Institute of Health Stroke Scale [NIHSS]）が、エクオール産非産生者（血清エクオール濃度が1 ng/mL未満の者）と比較して有意に低く、血清エクオール濃度は、脳卒中の重症化リスクの検査指標になり得る。
(20) 脳梗塞患者（心原性脳塞栓症、アテローム血栓性脳梗塞、塞栓源不明脳塞栓症）の中で、エクオール産生者の退院時の機能予後は有意に軽症であり、血清エクオール濃度は、脳卒中の機能予後の検査指標になり得る。
(21) 前記(16)～(20)の知見に基づいて、エクオール又はエクオール産生促進物質が、脳卒中の改善薬として利用できる可能性がある。
　更に、本発明者等は、脳卒中易発症性自然高血圧発症モデルラットを使用した実験により、抗生物質が脳卒中の改善薬として有用であること等を見出した。具体的には、本発明者等は、脳卒中易発症性自然高血圧発症モデルラットを使用した実験により、以下に知見を得た。
(20) 食塩感受性の脳卒中易発症性自然高血圧発症モデルラットに、食塩と共に抗生物質を経口投与したところ、生存期間の延長、神経麻痺症状の改善、脳出血の発症抑制、脳血管の機能低下の抑制、心臓内血管構造の機能低下の抑制、腎細動脈構造の機能低下の抑制、及び小腸構造の機能低下の抑制が図られる。
(21) 食塩感受性の脳卒中易発症性自然高血圧発症モデルラットに対して、水のみを経口投与した場合、食塩のみを経口投与した場合、及び食塩と共に抗生物質を経口投与した場合では、腸内菌叢の組成が異なっており、前述するヒトでの結果と同様に、当該モデルラットにおける脳卒中の症状発現により腸内菌叢の変容が生じている。
　本開示は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。即ち、本開示は、以下に掲げる態様の発明を提供する。
項１．　脳卒中の罹患の有無を検査する方法であって、
　被験者から採取された腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivalius）、及びラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の有無を測定する工程を含む、前記方法。
項２．　脳卒中の罹患の有無の検査用キットであって、
　ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivalius）、及びラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌を特異的に検出可能なプライマーを含む、前記キット。
項３．　脳卒中の罹患の有無又はその病型を検査する方法であって、
　被験者から採取された腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivalius）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、アリスティペス・プトレディネス（Alistispes putredinis）、バクテロイデス・フラジェリス（Bacteroides fragilis）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、ラクトバシラス属（Lactobacillus）細菌、アリスティペス属（Alistispes）細菌、レンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌、バクテロイデス・プレビウス（Bacteroides plebeius）、アナエロテペス・ハドラス（Anaerostipes hadrus）、ルミノコッカス・ビサーキュランス（Ruminococcus bicirculans）、バクテロイデス・ブルガータス（Bacteroides vulgatus）、プレボテラ・コプリ（Prevotella copri）、サテレラ・ワズワーステンシス（Sutterella wadsworthensis）、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ユウバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、ダイアリスター・インビサス（Dialister invisus）、フシカテニバクター属（Fusicatenibacter）細菌、フィーカリバクテリウム属（Faecalibacterium）細菌、ドレア属（Dorea）細菌、アナエロティペス属（Anaerostipes）細菌、ルミノコッカス属（Ruminococcus）細菌、ブチリコッカス属（Butyricoccus）細菌、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）細菌、ビフィドバクテリア科（Bifidobacteriaceae）細菌、及びプレボテラ科（Prevotellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を測定する工程を含む、前記方法。
項４．　サルコペニアを伴う脳卒中に罹患しているかを検査する方法であり、
　前記細菌が、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、アリスティペス・プトレディネス（Alistispes putredinis）、バクテロイデス・ブルガータス（Bacteroides vulgatus）、プレボテラ・コプリ（Prevotella copri）、及びブチリコッカス属（Butyricoccus）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌である、項３に記載の方法。
項５．　心原性脳塞栓症の罹患の有無を検査する方法であり、
　前記細菌が、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、バクテロイデス・フラジェリス（Bacteroides fragilis）、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、レンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌、及びビフィドバクテリア科（Bifidobacteriaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種である、項３に記載の方法。
項６．　ラクナ梗塞の罹患の有無を検査する方法であり、
　前記細菌が、サテレラ・ワズワーステンシス（Sutterella wadsworthensis）、レンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌、及びプレボテラ科（Prevotellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種である、項３に記載の方法。
項７．　アテローム血栓性脳塞栓症の罹患の有無検査する方法であり、
　前記細菌が、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、及びレンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種である、項３に記載の方法。
項８．　脳内出血の有無を検査する方法であり、
　前記細菌が、ユウバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、ダイアリスター・インビサス（Dialister invisus）、及びプレボテラ科（Prevotellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種である、項３に記載の方法。
項９．　脳卒中の罹患の有無又はその病型の検査用キットであって、
　被験者から採取された腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivalius）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、アリスティペス・プトレディネス（Alistispes putredinis）、バクテロイデス・フラジェリス（Bacteroides fragilis）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、ラクトバシラス属（Lactobacillus）細菌、アリスティペス属（Alistispes）細菌、レンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌、バクテロイデス・プレビウス（Bacteroides plebeius）、アナエロテペス・ハドラス（Anaerostipes hadrus）、ルミノコッカス・ビサーキュランス（Ruminococcus bicirculans）、バクテロイデス・ブルガータス（Bacteroides vulgatus）、プレボテラ・コプリ（Prevotella copri）、サテレラ・ワズワーステンシス（Sutterella wadsworthensis）、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ユウバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、ダイアリスター・インビサス（Dialister invisus）、フシカテニバクター属（Fusicatenibacter）細菌、フィーカリバクテリウム属（Faecalibacterium）細菌、ドレア属（Dorea）細菌、アナエロティペス属（Anaerostipes）細菌、ルミノコッカス属（Ruminococcus）細菌、ブチリコッカス属（Butyricoccus）細菌、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）細菌、ビフィドバクテリア科（Bifidobacteriaceae）細菌、及びプレボテラ科（Prevotellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌を特異的に検出可能なプライマーを含む、前記キット。
項１０．　脳卒中の重症度を検査する方法であって、
　被験者から採取された腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、アナエロテペス・ハドラス（Anaerostipes hadrus）、バクテロイデス・プレビウス（Bacteroides plebeius）、ユウバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、プレボテラ・コプリ（Prevotella copri）、及びラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を測定する工程を含む、前記方法。
項１１．　脳卒中の重症度の検査用キットであって、
　ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、アナエロテペス・ハドラス（Anaerostipes hadrus）、バクテロイデス・プレビウス（Bacteroides plebeius）、ユウバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、プレボテラ・コプリ（Prevotella copri）及びラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌を特異的に検出可能なプライマーを含む、前記キット。
項１２．　脳卒中の再発リスクを検査する方法であって、
　被験者から採取された腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）の相対的存在量を測定する工程を含む、前記方法。
項１３．　脳卒中の再発リスクの検査用キットであって、
　ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）を特異的に検出可能なプライマーを含む、前記キット。
項１４．　脳卒中の予後を予測するための検査する方法であって、
　被験者から採取された腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）の有無を測定する工程を含む、前記方法。
項１５．　脳卒中の予後を予測するための検査用キットであって、
　ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）を特異的に検出可能なプライマーを含む、前記キット。
項１６．　脳卒中患者におけるサルコペニアの併発の有無を検査する方法であって、
　被験者から採取された腸内細菌叢におけるルミノコッカス・トルク（Ruminococcus torques）及びベイオネラ属細菌（Veillonella）よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を測定する工程を含む、前記方法。
項１７．　脳卒中患者におけるサルコペニアの併発の有無の検査用キットであって、
　ルミノコッカス・トルク（Ruminococcus torques）及びベイオネラ属細菌（Veillonella）よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌を特異的に検出可能なプライマーを含む、前記キット。
項１８．　脳卒中の罹患の有無を検査する方法であって、
　被験者から採取された口腔内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、ストレプトコッカス・クリスタタス（Streptococcus cristatus）、プレボテラ・ロエッシェイイ（Prevotella loescheii）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・コンステラータス（Streptococcus constellatus）、カンピロバイター・グラシリス（Campylobacter gracilis）、セレノモナス・スプチゲナ（Selenomonas sputigena）、タンネレラ・フォーサイシア（Tannerella forsythia）、ポルフィロモナス属（Porphyromonas）細菌、フソバクテリウム属（Fusobacterium）細菌、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、カプノサイトファーガ属（Capnocytophaga）細菌、カンピロバクター属（Campylobacter）細菌、レンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌、ユウバクテリウム・サルシ（Eubacterium sulci）、ストレプトコッカス・インファンティス（Streptococcus infantis）、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ（Haemophilus parainfluenzae）、プレボテラ・ナンセイエンシッス（Prevotella nanceiensis）、ランセフィールデラ・パルブラ（Lancefieldella parvula）、ナイセリア属（Neisseria）細菌、サッカリモナダTM7x属（Saccharimonadaceae TM7x）細菌、ヘモフィルス属（Hemophilus）細菌、アロプレボテラ属（Alloprevotella）細菌、プレボテラ科（Prevotellaceae）細菌、及びベイロネラ科（Veillonellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を測定する工程を含む、前記方法。
項１９．　脳卒中の罹患の有無の検査用キットであって、
　ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、ストレプトコッカス・クリスタタス（Streptococcus cristatus）、プレボテラ・ロエッシェイイ（Prevotella loescheii）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・コンステラータス（Streptococcus constellatus）、カンピロバイター・グラシリス（Campylobacter gracilis）、セレノモナス・スプチゲナ（Selenomonas sputigena）、タンネレラ・フォーサイシア（Tannerella forsythia）、ポルフィロモナス属（Porphyromonas）細菌、フソバクテリウム属（Fusobacterium）細菌、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、カプノサイトファーガ属（Capnocytophaga）細菌、カンピロバクター属（Campylobacter）細菌、レンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌、ユウバクテリウム・サルシ（Eubacterium sulci）、ストレプトコッカス・インファンティス（Streptococcus infantis）、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ（Haemophilus parainfluenzae）、プレボテラ・ナンセイエンシッス（Prevotella nanceiensis）、ランセフィールデラ・パルブラ（Lancefieldella parvula）、ナイセリア属（Neisseria）細菌、サッカリモナダTM7x属（Saccharimonadaceae TM7x）細菌、ヘモフィルス属（Hemophilus）細菌、アロプレボテラ属（Alloprevotella）細菌、プレボテラ科（Prevotellaceae）細菌、及びベイロネラ科（Veillonellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌を特異的に検出可能なプライマーを含む、前記キット。
項２０．　脳卒中患者の腸内細菌叢又は口腔内菌叢を正常化させる物質を有効成分として含む脳卒中の改善剤。
項２１．　前記有効成分が、腸内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivalius）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、アリスティペス・プトレディネス（Alistispes putredinis）、バクテロイデス・フラジェリス（Bacteroides fragilis）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、ラクトバシラス属（Lactobacillus）細菌、アリスティペス属（Alistispes）細菌、レンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌、及びベイオネラ属細菌（Veillonella）よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を低下させる物質である、項２０に記載の脳卒中の改善剤。
項２２．　前記有効成分が、抗生物質、又は前記細菌に対して結合性を示す抗体である、項２１に記載の改善剤。
項２３．　前記有効成分が、腸内細菌叢において、バクテロイデス・プレビウス（Bacteroides plebeius）、アナエロテペス・ハドラス（Anaerostipes hadrus）、ルミノコッカス・ビサーキュランス（Ruminococcus bicirculans）、バクテロイデス・ブルガータス（Bacteroides vulgatus）、プレボテラ・コプリ（Prevotella copri）、サテレラ・ワズワーステンシス（Sutterella wadsworthensis）、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ユウバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、ダイアリスター・インビサス（Dialister invisus）、ルミノコッカス・トルク（Ruminococcus torques）、フシカテニバクター属（Fusicatenibacter）細菌、フィーカリバクテリウム属（Faecalibacterium）細菌、ドレア属（Dorea）細菌、アナエロティペス属（Anaerostipes）細菌、ルミノコッカス属（Ruminococcus）細菌、ブチリコッカス属（Butyricoccus）細菌、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）細菌、ビフィドバクテリア科（Bifidobacteriaceae）細菌、及びプレボテラ科（Prevotellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を増加させる物質である、項２０に記載の脳卒中の改善剤。
項２４．　前記有効成分が、口腔内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、ストレプトコッカス・クリスタタス（Streptococcus cristatus）、プレボテラ・ロエッシェイイ（Prevotella loescheii）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・コンステラータス（Streptococcus constellatus）、カンピロバイター・グラシリス（Campylobacter gracilis）、セレノモナス・スプチゲナ（Selenomonas sputigena）、タンネレラ・フォーサイシア（Tannerella forsythia）、ポルフィロモナス属（Porphyromonas）細菌、フソバクテリウム属（Fusobacterium）細菌、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、カプノサイトファーガ属（Capnocytophaga）細菌、カンピロバクター属（Campylobacter）細菌、及びレンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を低下させる物質である、項２０に記載の脳卒中の改善剤。
項２５．　前記有効成分が、口腔内細菌叢において、ユウバクテリウム・サルシ（Eubacterium sulci）、ストレプトコッカス・インファンティス（Streptococcus infantis）、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ（Haemophilus parainfluenzae）、プレボテラ・ナンセイエンシッス（Prevotella nanceiensis）、ランセフィールデラ・パルブラ（Lancefieldella parvula）、ナイセリア属（Neisseria）細菌、サッカリモナダTM7x属（Saccharimonadaceae TM7x）細菌、ヘモフィルス属（Hemophilus）細菌、アロプレボテラ属（Alloprevotella）細菌、プレボテラ科（Prevotellaceae）細菌、及びベイロネラ科（Veillonellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を増加させる物質である、項２０に記載の脳卒中の改善剤。
項２６．　脳卒中患者の腸内細菌叢又は口腔内菌叢を正常化させる物質の、脳卒中の改善剤の製造のための使用。
項２７．　前記物質が、腸内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivalius）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、アリスティペス・プトレディネス（Alistispes putredinis）、バクテロイデス・フラジェリス（Bacteroides fragilis）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、ラクトバシラス属（Lactobacillus）細菌、アリスティペス属（Alistispes）細菌、レンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌、及びベイオネラ属細菌（Veillonella）よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を低下させる物質である、項２６に記載の使用。
項２８．　前記物質が、抗生物質、又は前記細菌に対して結合性を示す抗体である、項２６に記載の使用。
項２９．　前記物質が、腸内細菌叢において、バクテロイデス・プレビウス（Bacteroides plebeius）、アナエロテペス・ハドラス（Anaerostipes hadrus）、ルミノコッカス・ビサーキュランス（Ruminococcus bicirculans）、バクテロイデス・ブルガータス（Bacteroides vulgatus）、プレボテラ・コプリ（Prevotella copri）、サテレラ・ワズワーステンシス（Sutterella wadsworthensis）、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ユウバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、ダイアリスター・インビサス（Dialister invisus）、ルミノコッカス・トルク（Ruminococcus torques）、フシカテニバクター属（Fusicatenibacter）細菌、フィーカリバクテリウム属（Faecalibacterium）細菌、ドレア属（Dorea）細菌、アナエロティペス属（Anaerostipes）細菌、ルミノコッカス属（Ruminococcus）細菌、ブチリコッカス属（Butyricoccus）細菌、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）細菌、ビフィドバクテリア科（Bifidobacteriaceae）細菌、及びプレボテラ科（Prevotellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を増加させる物質である、項２６に記載の使用。
項３０．　前記物質が、口腔内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、ストレプトコッカス・クリスタタス（Streptococcus cristatus）、プレボテラ・ロエッシェイイ（Prevotella loescheii）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・コンステラータス（Streptococcus constellatus）、カンピロバイター・グラシリス（Campylobacter gracilis）、セレノモナス・スプチゲナ（Selenomonas sputigena）、タンネレラ・フォーサイシア（Tannerella forsythia）、ポルフィロモナス属（Porphyromonas）細菌、フソバクテリウム属（Fusobacterium）細菌、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、カプノサイトファーガ属（Capnocytophaga）細菌、カンピロバクター属（Campylobacter）細菌、及びレンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を低下させる物質である、項２６に記載の使用。
項３１．　前記物質が、口腔内細菌叢において、ユウバクテリウム・サルシ（Eubacterium sulci）、ストレプトコッカス・インファンティス（Streptococcus infantis）、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ（Haemophilus parainfluenzae）、プレボテラ・ナンセイエンシッス（Prevotella nanceiensis）、ランセフィールデラ・パルブラ（Lancefieldella parvula）、ナイセリア属（Neisseria）細菌、サッカリモナダTM7x属（Saccharimonadaceae TM7x）細菌、ヘモフィルス属（Hemophilus）細菌、アロプレボテラ属（Alloprevotella）細菌、プレボテラ科（Prevotellaceae）細菌、及びベイロネラ科（Veillonellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を増加させる物質である、項２６に記載の使用。
項３２．　脳卒中患者に、腸内細菌叢又は口腔内菌叢を正常化させる物質を、脳卒中の改善に有効な量を投与する、脳卒中の改善方法。
項３３．　前記物質が、腸内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivalius）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、アリスティペス・プトレディネス（Alistispes putredinis）、バクテロイデス・フラジェリス（Bacteroides fragilis）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、ラクトバシラス属（Lactobacillus）細菌、アリスティペス属（Alistispes）細菌、レンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌、及びベイオネラ属細菌（Veillonella）よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を低下させる物質である、項３２に記載の方法。
項３４．　前記物質が、抗生物質、又は前記細菌に対して結合性を示す抗体である、項３２に記載の方法。
項３５．　前記物質が、腸内細菌叢において、バクテロイデス・プレビウス（Bacteroides plebeius）、アナエロテペス・ハドラス（Anaerostipes hadrus）、ルミノコッカス・ビサーキュランス（Ruminococcus bicirculans）、バクテロイデス・ブルガータス（Bacteroides vulgatus）、プレボテラ・コプリ（Prevotella copri）、サテレラ・ワズワーステンシス（Sutterella wadsworthensis）、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ユウバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、ダイアリスター・インビサス（Dialister invisus）、ルミノコッカス・トルク（Ruminococcus torques）、フシカテニバクター属（Fusicatenibacter）細菌、フィーカリバクテリウム属（Faecalibacterium）細菌、ドレア属（Dorea）細菌、アナエロティペス属（Anaerostipes）細菌、ルミノコッカス属（Ruminococcus）細菌、ブチリコッカス属（Butyricoccus）細菌、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）細菌、ビフィドバクテリア科（Bifidobacteriaceae）細菌、及びプレボテラ科（Prevotellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を増加させる物質である、項３２に記載の方法。
項３６．　前記物質が、口腔内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、ストレプトコッカス・クリスタタス（Streptococcus cristatus）、プレボテラ・ロエッシェイイ（Prevotella loescheii）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・コンステラータス（Streptococcus constellatus）、カンピロバイター・グラシリス（Campylobacter gracilis）、セレノモナス・スプチゲナ（Selenomonas sputigena）、タンネレラ・フォーサイシア（Tannerella forsythia）、ポルフィロモナス属（Porphyromonas）細菌、フソバクテリウム属（Fusobacterium）細菌、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、カプノサイトファーガ属（Capnocytophaga）細菌、カンピロバクター属（Campylobacter）細菌、及びレンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を低下させる物質である、項３２に記載の方法。
項３７．　前記物質が、口腔内細菌叢において、ユウバクテリウム・サルシ（Eubacterium sulci）、ストレプトコッカス・インファンティス（Streptococcus infantis）、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ（Haemophilus parainfluenzae）、プレボテラ・ナンセイエンシッス（Prevotella nanceiensis）、ランセフィールデラ・パルブラ（Lancefieldella parvula）、ナイセリア属（Neisseria）細菌、サッカリモナダTM7x属（Saccharimonadaceae TM7x）細菌、ヘモフィルス属（Hemophilus）細菌、アロプレボテラ属（Alloprevotella）細菌、プレボテラ科（Prevotellaceae）細菌、及びベイロネラ科（Veillonellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を増加させる物質である、項３２に記載の方法。
項３８．　脳卒中の改善するための処置に使用される、腸内細菌叢又は口腔内菌叢を正常化させる物質。
項３９．　前記物質が、腸内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivalius）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、アリスティペス・プトレディネス（Alistispes putredinis）、バクテロイデス・フラジェリス（Bacteroides fragilis）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、ラクトバシラス属（Lactobacillus）細菌、アリスティペス属（Alistispes）細菌、レンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌、及びベイオネラ属細菌（Veillonella）よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を低下させる物質である、項３８に記載の物質。
項４０．　前記物質が、抗生物質、又は前記細菌に対して結合性を示す抗体である、項３８に記載の物質。
項４１．　前記物質が、腸内細菌叢において、バクテロイデス・プレビウス（Bacteroides plebeius）、アナエロテペス・ハドラス（Anaerostipes hadrus）、ルミノコッカス・ビサーキュランス（Ruminococcus bicirculans）、バクテロイデス・ブルガータス（Bacteroides vulgatus）、プレボテラ・コプリ（Prevotella copri）、サテレラ・ワズワーステンシス（Sutterella wadsworthensis）、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ユウバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、ダイアリスター・インビサス（Dialister invisus）、ルミノコッカス・トルク（Ruminococcus torques）、フシカテニバクター属（Fusicatenibacter）細菌、フィーカリバクテリウム属（Faecalibacterium）細菌、ドレア属（Dorea）細菌、アナエロティペス属（Anaerostipes）細菌、ルミノコッカス属（Ruminococcus）細菌、ブチリコッカス属（Butyricoccus）細菌、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）細菌、ビフィドバクテリア科（Bifidobacteriaceae）細菌、及びプレボテラ科（Prevotellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を増加させる物質である、項３８に記載の物質。
項４２．　前記物質が、口腔内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、ストレプトコッカス・クリスタタス（Streptococcus cristatus）、プレボテラ・ロエッシェイイ（Prevotella loescheii）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・コンステラータス（Streptococcus constellatus）、カンピロバイター・グラシリス（Campylobacter gracilis）、セレノモナス・スプチゲナ（Selenomonas sputigena）、タンネレラ・フォーサイシア（Tannerella forsythia）、ポルフィロモナス属（Porphyromonas）細菌、フソバクテリウム属（Fusobacterium）細菌、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、カプノサイトファーガ属（Capnocytophaga）細菌、カンピロバクター属（Campylobacter）細菌、及びレンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を低下させる物質である、項３８に記載の物質。
項４３．　前記物質が、口腔内細菌叢において、ユウバクテリウム・サルシ（Eubacterium sulci）、ストレプトコッカス・インファンティス（Streptococcus infantis）、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ（Haemophilus parainfluenzae）、プレボテラ・ナンセイエンシッス（Prevotella nanceiensis）、ランセフィールデラ・パルブラ（Lancefieldella parvula）、ナイセリア属（Neisseria）細菌、サッカリモナダTM7x属（Saccharimonadaceae TM7x）細菌、ヘモフィルス属（Hemophilus）細菌、アロプレボテラ属（Alloprevotella）細菌、プレボテラ科（Prevotellaceae）細菌、及びベイロネラ科（Veillonellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を増加させる物質である、項３８に記載の物質。
項４４．　被験物質の中から、脳卒中の改善に有効である可能性がある候補物質をスクリーニングする方法であって、
　被験物質について、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivalius）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、アリスティペス・プトレディネス（Alistispes putredinis）、バクテロイデス・フラジェリス（Bacteroides fragilis）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、ラクトバシラス属（Lactobacillus）細菌、アリスティペス属（Alistispes）細菌、レンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌、及びベイオネラ属細菌（Veillonella）よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を低下させる作用を評価する工程；及び
　前記作用を有する被験物質を、前記候補物質として選択する工程；
を含む、前記スクリーニング方法。
項４５．　被験物質の中から、脳卒中の改善に有効である可能性がある候補物質をスクリーニングする方法であって、
　被験物質について、腸内細菌叢におけるバクテロイデス・プレビウス（Bacteroides plebeius）、アナエロテペス・ハドラス（Anaerostipes hadrus）、ルミノコッカス・ビサーキュランス（Ruminococcus bicirculans）、バクテロイデス・ブルガータス（Bacteroides vulgatus）、プレボテラ・コプリ（Prevotella copri）、サテレラ・ワズワーステンシス（Sutterella wadsworthensis）、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ユウバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、ダイアリスター・インビサス（Dialister invisus）、ルミノコッカス・トルク（Ruminococcus torques）、フシカテニバクター属（Fusicatenibacter）細菌、フィーカリバクテリウム属（Faecalibacterium）細菌、ドレア属（Dorea）細菌、アナエロティペス属（Anaerostipes）細菌、ルミノコッカス属（Ruminococcus）細菌、ブチリコッカス属（Butyricoccus）細菌、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）細菌、ビフィドバクテリア科（Bifidobacteriaceae）細菌、及びプレボテラ科（Prevotellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を増加させる作用を評価する工程；及び
　前記作用を有する被験物質を、前記候補物質として選択する工程；
を含む、前記スクリーニング方法。
項４６．　被験物質の中から、脳卒中の改善に有効である可能性がある候補物質をスクリーニングする方法であって、
　被験物質について、口腔内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、ストレプトコッカス・クリスタタス（Streptococcus cristatus）、プレボテラ・ロエッシェイイ（Prevotella loescheii）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・コンステラータス（Streptococcus constellatus）、カンピロバイター・グラシリス（Campylobacter gracilis）、セレノモナス・スプチゲナ（Selenomonas sputigena）、タンネレラ・フォーサイシア（Tannerella forsythia）、ポルフィロモナス属（Porphyromonas）細菌、フソバクテリウム属（Fusobacterium）細菌、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、カプノサイトファーガ属（Capnocytophaga）細菌、カンピロバクター属（Campylobacter）細菌、及びレンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を低下させる作用を評価する工程；及び
　前記作用を有する被験物質を、前記候補物質として選択する工程；
を含む、前記スクリーニング方法。
項４７．　被験物質の中から、脳卒中の改善に有効である可能性がある候補物質をスクリーニングする方法であって、
　被験物質について、口腔内細菌叢におけるユウバクテリウム・サルシ（Eubacterium sulci）、ストレプトコッカス・インファンティス（Streptococcus infantis）、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ（Haemophilus parainfluenzae）、プレボテラ・ナンセイエンシッス（Prevotella nanceiensis）、ランセフィールデラ・パルブラ（Lancefieldella parvula）、ナイセリア属（Neisseria）細菌、サッカリモナダTM7x属（Saccharimonadaceae TM7x）細菌、ヘモフィルス属（Hemophilus）細菌、アロプレボテラ属（Alloprevotella）細菌、プレボテラ科（Prevotellaceae）細菌、及びベイロネラ科（Veillonellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を増加させる作用を評価する工程；及び
　前記作用を有する被験物質を、前記候補物質として選択する工程；
を含む、前記スクリーニング方法。
項４８．　脳卒中の病型別発症リスクを検査する方法であって、
　被験者から採取された血液サンプル中のエクオール濃度を測定する工程を含む、前記方法。
項４９．　心原性脳塞栓症、アテローム血栓性脳梗塞、又は心房細動の発症リスクを検査する方法である、項４８に記載の方法。
項５０．　脳卒中の重症度を検査する方法であって、
　被験者から採取された血液サンプル中のエクオール濃度を測定する工程を含む、前記方法。
項５１．　脳卒中の機能予後を検査する方法であって、
　被験者から採取された血液サンプル中のエクオール濃度を測定する工程を含む、前記方法。
項５２．　エクオール、又はエクオール産生促進物質を含む、脳卒中の改善剤。
　本開示によれば、腸内細菌叢又は口腔内細菌叢中の細菌を測定するという簡易な手法で、脳卒中の罹患の有無、脳卒中の病型、脳卒中におけるサルコペニアの併発の有無、脳卒中の重症度、脳卒中の再発リスク等を検査することが可能になる。また、本開示によれば、脳卒中患者の血液サンプル中のエクオール濃度を測定することにより、脳卒中の病型別発症リスク、脳卒中の機能予後、脳卒中の重症度を検査することが可能になる。また、本開示によれば、脳卒中の改善剤、及び脳卒中の改善剤のスクリーニング方法が提供される。
脳卒中患者と非脳卒中者の口内細菌叢及び腸内細菌叢を調べるための試験方法の概要を示す図である。 脳卒中患者と非脳卒中者の選定からサンプル取得までのフローチャートを示す図である。 Aは、急性期脳卒中患者（n=109）及び非脳卒中者（n=51）の腸内細菌叢及び口腔内菌叢について、種の種類に関するα多様性を示す図である。A中、*はp<0.05を示す。Bは、急性期脳卒中患者（n=109）及び非脳卒中者（n=51）の腸内細菌叢及び口腔内菌叢について、Faithの系統的多様性に関するα多様性を示す図である。B中、**はp<0.05を示す。Cは、急性期脳卒中患者及び非脳卒中者の腸内細菌叢と口腔内細菌叢全体について、Bray-Curtis距離に基づく主座標分析（PCoA）プロットである。Dは、口内細菌叢と腸内細菌叢とのBray-Curtis距離の中央値を示す図である。D中、****はMann-Whitney検定によるp値<0.001を示し、箱の中央の線、箱の境界線、及びひげは、それぞれ中央値、25-75％、及び10-90％を示す。 Aは、病型に分けた急性期脳卒中患者と非脳卒中者の口腔内菌叢について、種の種類に関するα多様性（左図）及びFaithの系統的多様性に関するα多様性（右図）を示す図である。Bは、病型に分けた急性期脳卒中患者と非脳卒中者（n = 51）の腸内細菌叢について、種の種類に関するα多様性（左図）及びFaithの系統的多様性に関するα多様性（右図）を示す図である。図4A中、HCは非脳卒中者（n = 53）、ATBIはアテローム性血栓性脳梗塞（n = 22）、CEは心原性脳塞栓症（n = 39）、SVOはラクナ梗塞（n = 23）、ICHは脳内出血（n = 26）である。図4B中、HCは非脳卒中者（n = 51）、ATBIはアテローム性血栓性脳梗塞（n = 20）、CEは心原性脳塞栓症（n = 21）、SVOはラクナ梗塞（n = 16）、ICHは脳内出血（n = 25）である。 急性期脳卒中患者を病型に分類して、腸内細菌叢における科レベルでの細菌の相対的存在量を分析した結果を示す。図5中、HCは非脳卒中者（n = 51）、ATBIはアテローム性血栓性脳梗塞（n = 20）、CEは心原性脳塞栓症（n = 21）、SVOはラクナ梗塞（n = 16）、ICHは脳内出血（n = 25）である。 急性期脳卒中患者を病型に分類して、口腔内細菌叢における科レベルでの細菌の相対的存在量を分析した結果を示す。図6中、HCは非脳卒中者（n = 53）、ATBIはアテローム性血栓性脳梗塞（n = 22）、CEは心原性脳塞栓症（n = 39）、SVOはラクナ梗塞（n = 23）、ICHは脳内出血（n = 26）である。 A～Dは、急性期脳卒中患者と非脳卒中者を比較するために行った腸内細菌叢の組成解析（ANCOM）のボルケーノプロットである。Aは腸内細菌叢について属レベルで解析した結果、Bは腸内細菌叢について種レベルで解析した結果、Cは口腔内菌叢について属レベルで解析した結果、Dは口腔内菌叢について種レベルで解析した結果である。A～Dにおいて、X軸はp値、Y軸は帰無仮説への回帰係数を示すW値、黒丸は非脳卒中者、白丸は急性期脳卒中患者を示している。Eは、急性期脳卒中患者と非脳卒中患者の口腔内細菌叢及び腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量を示す箱ひげ図である。E中、**及び****は、それぞれMann-Whitney検定によるp値<0.01及びp値<0.001を示し、箱の中央の線、箱の境界線、及びひげは、それぞれ中央値、25-75％、及び10-90％を示す。 急性期脳卒中患者と非脳卒中患者の口腔内細菌叢及び腸内細菌叢におけるアナエロテペス・ハドラス(a)、バクテロイデス・プレビウス(b)、ユウバクテリウム・サルシ(c)、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ(D)、ランセフィールデラ・パルブラ（E）、プレボテラ・ロエッシェイイ（F）、プレボテラ・ナンセイエンシッス（G）、ストレプトコッカス・クリスタタス(H)、ストレプトコッカス・インファンティス(I)、及びトレポネーマ・デンティコラ(L)の相対的存在量を示す箱ひげ図である。図8中、*、**及び***は、それぞれMann-Whitney検定によるp値<0.05、p値<0.01、及びp値<0.001を示し、箱の中央の線、箱の境界線、及びひげは、それぞれ中央値、25-75％、及び10-90％を示す。 腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの保有の有無を比較するために行った腸内細菌叢の組成解析（ANCOM）のボルケーノプロットである。X軸はp値、Y軸は帰無仮説への回帰係数を示すW値である。 Aは、急性期脳卒中患者及び非脳卒中者の腸内細菌叢と口腔内細菌叢のBray-Curtis距離に基づく主座標分析プロットに、急性期脳卒中患者と非脳卒中者を色分けした図である。Bは、前記主座標分析プロットに、ストレプトコッカス・アンギノーサス保有の有無で色分けした図である。 急性期脳卒中患者及び非脳卒中者の腸内細菌叢と口腔内細菌叢のBray-Curtis距離に基づく主座標分析プロットに、急性期脳卒中の有無(A)、ストレプトコッカス・アンギノーサス保有の有無（B）、アナエロテペス・ハドラス保有の有無(C)、バクテロイデス・プレビウス保有の有無(D)、ユウバクテリウム・サルシ保有の有無(E)、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ保有の有無(F)、ランセフィールデラ・パルブラ保有の有無（G）、プレボテラ・ロエッシェイイ保有の有無（H）、プレボテラ・ナンセイエンシッス保有の有無（I）、ストレプトコッカス・クリスタタス保有の有無(J)、ストレプトコッカス・インファンティス保有の有無(K)、及びトレポネーマ・デンティコラ保有の有無(L)で色分けした図である。A～Lにおいて、点線で囲む楕円領域は、細菌の陽性率を比較する際に設定した関心領域である。 スパース部分最小二乗法判別分析（sPLS-DA）により、急性期脳卒中患者の腸内細菌叢（n=109、黒四角）、非脳卒中者の腸内細菌叢（n=51、白丸）、急性期脳卒中患者の口腔内細菌叢（n=151、白四角）、非脳卒中者の口腔内細菌叢（n=53、黒丸）を3次元プロットした図、及び3種のcomponentsについて分類学的負荷効果を確認した結果である。 腸内細菌叢又は口腔内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサスの存在の有無に分けて各細菌の相対的存在量を示す箱ひげ図である。aは腸内細菌叢におけるアナエロテペス・ハドラス、bは腸内細菌叢におけるバクテロイデス・プレビウス、cは口腔内細菌叢におけるユウバクテリウム・サルシ、dは口腔内細菌叢におけるヘモフィルス・パラインフルエンゼ、eは口腔内細菌叢におけるランセフィールデラ・パルブラ、fは口腔内細菌叢におけるプレボテラ・ナンセイエンシッス、gは口腔内細菌叢におけるプレボテラ・ロエッシェイイ、hは口腔内細菌叢におけるストレプトコッカス・クリスタタス、iは口腔内細菌叢におけるストレプトコッカス・インファンティス、jは口腔内細菌叢におけるトレポネーマ・デンティコラの各相対的存在量を示す箱ひげ図である。図13中、**及び***は、それぞれMann-Whitney検定によるp値<0.01、及びp値<0.001を示し、箱の中央の線、箱の境界線、及びひげは、それぞれ中央値、25-75％、及び10-90％を示す。 急性期脳卒中患者及び非脳卒中者の腸内細菌叢と口腔内細菌叢の組成分析の結果を用いて作成したネットワーク解析図である。点（ノード）は夫々脳卒中・非脳卒中に関連する口腔内細菌及び腸内細菌を示す。脳卒中・非脳卒中における夫々の口腔内細菌・腸内細菌間には陽性の相関性が示される一方で、口内・腸内において脳卒中と非脳卒中に関連する細菌コミュニティ（モジュール）の間には相互に抑制性の関連性がみられる。 Aは、口腔内細菌叢と腸内細菌叢のMetaCycパスウェイ存在量のBray-Curtis距離に基づく主座標分析の結果を示す図である。Aにおいて、急性期脳卒中患者の腸内細菌叢（n=109）、非脳卒中者の腸内細菌叢（n=51）、急性期脳卒中患者の口内細菌叢（n=151）、及び非脳卒中者の口内細菌叢（n=53）を色分けしている。Bは、急性期脳卒中患者と非脳卒中者について、口腔内細菌叢と腸内細菌叢の間のMetaCycパスウェイのBray-Curtis距離を示す箱ひげ図である。***はMann-Whitney検定によるp値<0.001を示し、箱の中央の線、箱の境界線、及びひげは、それぞれ中央値、25-75%、及び10-90%を示す。Cは、急性期脳卒中患者と非脳卒中者のそれぞれ口腔内細菌叢と腸内細菌叢の4つのグループを区別できる上位50位のMetaCycパスウェイを示すヒートマップである。Cにおいて、存在度が高いものを赤、低いものを青で示しており、相対的存在量の強さは、zスケールで-1.0から1.0の範囲である。D～Fは、4群の細菌叢のホモ乳酸発酵パスウェイ（D）、糖パスウェイ（E）解、糖新生パスウェイ（F）の相対的存在量を示す箱ひげ図である。D～Fにおいて、*及び**は、それぞれMann-Whitney検定によるp値<0.05及び0.001をし、箱の中央の線、箱の境界線、及びひげは、それぞれ中央値、25-75％、及び10-90％を示す。 急性期脳卒中患者の腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量について、高血圧の有無（a）、糖尿病の有無（b）、高脂血症の有無(c)、高血圧の有無とその治療の有無(d)、糖尿病の有無とその治療の有無（e）、高脂血症の有無とその治療の有無（f）、及び喫煙の有無（g）で比較した箱ひげ図である。箱の中央の線、箱の境界線、及びひげは、それぞれ中央値、25-75％、及び10-90％を示す。 急性期脳卒中患者の腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量（log10変換）と、年齢（A）、平均血圧(B)、心拍数（C）、ボディマス指数（D）、トリグリセリド（E）、総コレステロール（F）、HDLコレステロール（G）、LDLコレステロール（H）、及びヘモグロビンA1c（I）との関連を示す線形回帰モデルである。 Aは、血管系危険因子（年齢、性別、喫煙、高血圧、糖尿病、高脂血症）、並びに腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス、アナエロテペス・ハドラス、及びバクテロイデス・プレビウスの相対的存在量を用いて、急性期脳卒中患者と非脳卒中者を区別するROC曲線を示す図である。Bは、急性期脳卒中患者の腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量（log10変換）と入院時のNIHSSスコアとの関連を示す線形回帰モデルである。Cは、脳卒中初発患者（n=33）の急性期（First-ever）及び追跡期間中（Follow-up）の腸内細菌叢におけるS. anginosusの相対的存在量を示す箱ひげ図である。Dは、急性期脳卒中初発患者（n=84）と急性期脳卒中再発患者（n=25）の腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量を示す箱ひげ図である。C及びDにおいて、箱の中央の線、箱の境界線、及びひげは、それぞれ中央値、25-75％、及び10-90％を示す。 急性期脳卒中患者を腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの保有の有無に分けて、2年間の複合イベント（全死亡又は主要血管イベント）の結果を描出したKaplan-Meire曲線を示す図である。 急性期脳卒中患者の腸内細菌叢におけるバクテロイデス・フラジェリス、ラクトバシラス・ファーメンタム、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ミュータンス、アナエロテペス・ハドラス、バクテロイデス・プレビウス、ダイアリスター・インビサス、ユウバクテリウム・レクタル、プレボテラ・コプリ、サテレラ・ワズワーステンシスの標準化相対比率であるCLR(centered log ratio)と各臨床指標(重症度スコアNIHSS、年齢、BMI、平均血圧、LDLコレステロール、HgbA1c、CRP、BNP)との相関を解析したヒートマップである．*.**,***,****はそれぞれPearson correlation 解析によるp値<0.1, <0.05, <0.01, <0.001を示し、赤は正の相関、青は負の相関を示す。相関係数にヒートマップの色が対応する。 病型に分けた急性期脳卒中患者のNIHSSの分布を示す箱ひげ図である．図中***はMann-Whitney検定によるp値<0.001を示し、箱の中央の線、箱の境界線、及びひげは、それぞれ中央値、25-75％、及び10-90％を示す．atbiはアテローム性血栓性脳梗塞（n = 20）、ceは心原性脳塞栓症（n = 21）、svoはラクナ梗塞（n = 29）、ichは脳内出血（n = 29）、otherはその他の病型である。 病型に分けた急性期脳卒中患者のNIHSSの分布を示すヒストグラムである．atbiはアテローム性血栓性脳梗塞（n = 20）、ceは心原性脳塞栓症（n = 21）、svoはラクナ梗塞（n = 29）、ichは脳内出血（n = 29）、otherはその他の病型である。 病型に分けた急性期脳卒中患者の腸内細菌叢における(A) アナエロテペス・ハドラス、(B) バクテロイデス・フラジェリス、(C) バクテロイデス・プレビウス、(D) ダイアリスター・インビサス、(E) ユウバクテリウム・レクタル、(F) ラクトバシラス・ファーメンタム、(G) プレボテラ・コプリ、(H) ストレプトコッカス・アンギノーサス、(I) ストレプトコッカス・ミュータンス、(J) サテレラ・ワズワーステンシスの相対存在量を非脳卒中者(n=51)と比較した箱ひげ図である。図中*, **, ***はMann-Whitney検定によるp値<0.05, <0.01, <0.001を示し、箱の中央の線、箱の境界線、及びひげは、それぞれ中央値、25-75％、及び10-90％を示す．ATBIはアテローム性血栓性脳梗塞（n = 20）、CEは心原性脳塞栓症（n = 21）、SVOはラクナ梗塞（n = 29）、ICHは脳内出血（n = 29）である。 急性期脳卒中患者の腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの存在（+）と非存在（-）に分けて、脳MRI所見に基づく小血管疾患の有病率を示す円グラフである。Aには、脳室周囲病変（PVH）について、当該病変が認められる患者割合を白、当該病変が認められない患者割合を黒で示す。Bには、深部皮質下白質病変（DSWMH）について、当該病変が認められる患者割合を白、当該病変が認められない患者割合を黒で示す。Cには、脳微小出血（CMB）について、当該病変が認められる患者割合を白、当該病変が認められない患者割合を黒で示す。Dには、ラクナ病変（lacunar）について、当該病変が認められる患者割合を白、当該病変が認められない患者割合を黒で示す。a～dにおいて、*、**、及び***は、それぞれカイ二乗検定によるp値<0.05、p値<0.01、及びp値<0.001を示す。 A、C、及びEは、脳卒中患者（MRIのデータあり）(n = 103)のうち、深部皮質下白質病変の重症群(n = 49)、軽症群(n = 54)、grade 0 (n = 26), 1(n = 28), 2(n = 25), 3(n = 24)に分けて、腸内細菌叢におけるラクトバシルス・ファーメンタム、ストレプトコッカス・アンギノーサス、及びストレプトコッカス・ミュータンスの相対的存在量を比較した箱ひげ図である。B、D、及びFは、脳室周囲高信号域の重症群(n = 39)、軽症群(n = 64)、grade 0 (n = 38), 1(n = 26), 2(n = 25), 3(n = 14)に分けて、腸内細菌叢におけるラクトバシルス・ファーメンタム、ストレプトコッカス・アンギノーサス、及びストレプトコッカス・ミュータンスの相対的存在量を比較した箱ひげ図である。*, **,***はMann-Whitney検定によるp値<0.05, <0.01, <0.001を示し、箱の中央の線、箱の境界線、及びひげは、それぞれ中央値、25-75%、及び10-90%を示す。 Aは、非脳卒中者（サルコペニアの罹患なし）（n = 51）、サルコペニアを併発している脳卒中者（n = 20）、及びサルコペニアを併発していない脳卒中者（n = 74）を対象として腸内細菌叢組成を分析し、t検定による二群間の有意差検定(p値)の-log10及びFold change (FC)のlog2(FC)を用いて作成したボルケーノプロットである。B～Jは、腸内細菌叢において、サルコペニアを併発している脳卒中者（n = 20）、及びサルコペニアを併発していない脳卒中者（n = 74）の各細菌の相対的存在量を示す箱ひげ図である。Bはストレプトコッカス・ミュータンス、Cはクロストリジウム・パーフリンゲンス、DはUCG 005a、Eはアリスティペス・プトレディネス、Fはストレプトコッカス・パラサングイニス、Fはベイオネラ属細菌、Hはブチリコッカス属細菌、Iはバクテロイデス・ブルガータス、Jはルミノコッカス・トルクの各相対的存在量を示す箱ひげ図である。箱の中央の線、箱の境界線、及びひげは、それぞれ中央値、25-75％、及び10-90％を示す。 脳卒中患者を脳卒中病型別に分けて、エクオール産生者（血清エクオール濃度が1 ng/mL以上）とエクオール非産生者（血清エクオール濃度が1 ng/mL未満）の割合を求めた結果である。 脳卒中易発症性自然高血圧発症モデルラット（SHRSP）に、ラット標準食と共に、水（1%NaCl-・ABXs-）、１w/v%食塩水（1%NaCl+・ABXs-）、又は抗生物質を含む１w/v%食塩水（1%NaCl+・ABXs+）を自由摂取させて、生存期間を測定した実験結果である。Aは、実験プロトコールである。Bは、各群の生存期間を測定した結果を示すKaplan-Meire曲線である。 SHRSPに、ラット標準食と共に、水（1%NaCl-・ABXs-）、１w/v%食塩水（1%NaCl+・ABXs-）、又は抗生物質を含む１w/v%食塩水（1%NaCl+・ABXs+）を自由摂取させて、体重の測定、神経麻痺症状の評価、及び脳の病理学的検査を行った実験結果である。Aは、実験プロトコールである。Bは、49日齢から84日齢までの体重の変化を経時的に測定した結果である。Cは、麻痺症状の累積出現率を示すKaplan-Meire曲線である。Dは、105日齢で脳病理解析を行った際のＨＥ染色像（脳組織弱拡像）及び脳出血（ICH）の検出頻度を示す図である。D中の各ＨＥ染色像には、四角の囲み内の強拡像も示している。 SHRSPに、ラット標準食と共に、水（NaCl-・ABXs-）、抗生物質を含む食塩水（NaCl-・ABXs+）、食塩水（NaCl+・ABXs-）、又は抗生物質を含む食塩水（NaCl+・ABXs+）を自由摂取させて、脳血管構造、及び心臓内血管構造を解析した結果である。Aの上段は、脳の血管壁厚の測定結果である（中央値±IQR  ; ** p < 0.01, *** p < 0.001; Holm-Sidak's multiple comparison test）。Aの下段は各群における脳の典型的な細動脈の断面像である（Bar: 100μm）。Bは、血管径（短径）と血管壁厚をプロットした散布図である。Cは、心臓病理解析を行った際のマッソントリクローム染色像である（Bar: 100μm）。C中の食塩水を摂取させた群（NaCl+・ABXs-）において、▽を付している部分は血管中膜肥厚が観察された部位であり、＊を付している部分は内腔の顕著な狭小化が認められる部分である。Dの上段は、血管狭窄度（血管内腔面積/血管外径面積*100）の測定結果である（中央値±IQR; * p < 0.05, Holm-Sidak's multiple comparison test.）。Dの下段は各群における心臓の典型的な細動脈の断面像である（Bar: 100μm）。 SHRSPに、ラット標準食と共に、水（NaCl-・ABXs-）、抗生物質を含む食塩水（NaCl-・ABXs+）、食塩水（NaCl+・ABXs-）、又は抗生物質を含む食塩水（NaCl+・ABXs+）を自由摂取させて、腎細動脈構造及び小腸構造を解析した結果である。Aの左の像は、腎病理解析を行った際のマッソントリクローム染色像（腎組織弱拡像）である。A中のマッソントリクローム染色像には、四角の囲み内の強拡像も示している。Aの右図は、閉塞血管(Occluded vessels)、高度狭窄血管(Severe vessels)、及び開存血管（Mild - moderate stenosis）の頻度を示す図である。Bの上の像は、小腸病理解析行った際のマッソントリクローム染色像である（Bar: 100μm）。Bの下図は、小腸絨毛（Villi）、小腸粘膜下線維層(Fibrosis)、及び小腸粘膜下筋層（Muscle Layer）の断面長の測定結果である（中央値±IQR； ** p < 0.01, Holm-Sidak's multiple comparison test.）。 SHRSPに、ラット標準食と共に、水（NaCl-・ABXs-）、食塩水（NaCl+・ABXs-）、又は抗生物質を含む食塩水（NaCl+・ABXs+）を自由摂取させて、腸内菌叢を解析した結果である。Aは、各群の84日齢における腸内細菌叢のα多様性(Observed taxonomic features)を示す図である。Bは、各群の84日齢における腸内細菌叢を部分的最小二乗回帰（sPLS-DA）解析によりクラスタリングした結果である。Cは、水を摂取させた群（NaCl-・ABXs-）と食塩水を摂取させた群（NaCl+・ABXs-）を対象として腸内細菌叢組成を分析し、t検定による二群間の有意差検定(p値)の-log10及びFold change (FC)のlog2(FC)を用いて作成したボルケーノプロットである。Dは、食塩水を摂取させた群（NaCl+・ABXs-）と抗生物質を含む食塩水を摂取させた群（NaCl+・ABXs+）を対象として腸内細菌叢組成を分析し、t検定による二群間の有意差検定(p値)の-log10及びFold change (FC)のlog2(FC)を用いて作成したボルケーノプロットである。Eは、水を摂取させた群（NaCl-・ABXs-）と食塩水を摂取させた群（NaCl+・ABXs-）との間で有意に変動する腸内細菌種、及び食塩水を摂取させた群（NaCl+・ABXs-）と抗生物質を含む食塩水を摂取させた群（NaCl+・ABXs+）との間で有意に変動する腸内細菌種を対象として作成したベン図である。 SHRSPに、ラット標準食と共に、１w/v%食塩水（1%NaCl+）、アンピシリン、メトロニダゾール、ネオマイシン、及びバンコマイシンを含む１w/v%食塩水（1%NaCl+ABXs+）、アンピシリンを含む１w/v%食塩水（1%NaCl+Ampicillin）、メトロニダゾールを含む１w/v%食塩水（1%NaCl+Metronidazole）、又はバンコマイシンを含む１w/v%食塩水（1%NaCl+Vancomycin）を自由摂取させて、生存期間を測定した実験結果である。Aは、実験プロトコールである。Bは、各群の生存期間を測定した結果を示すKaplan-Meire曲線である。 抗生物質のSHRSPへの経口投与による腸内菌叢への影響、並びに脳、心臓、腎臓及び小腸の各臓器への影響を検証するための実験プロトコールの一例である。 腸内細菌に結合性を有するIgA抗体のSHRSPへの経口投与による腸内菌叢への影響、並びに脳、心臓、腎臓及び小腸の各臓器への影響を検証するための実験プロトコールの一例である。
１．用語
　本明細書で使用される用語は、特に具体的な定めのない限り、医学、薬学、分子生物学、微生物学、有機化学等の分野における当業者に一般に理解される通りの意味を有する。本明細書において定義された用語は、一般的に理解されるのと同じ意味を有していない場合、本明細書の記載内容が優先する。
　本開示において、「被験者」とは、脳卒中の罹患の有無、脳卒中の病型、サルコペニア併発の脳卒中の罹患の有無、脳卒中の重症度、又は脳卒中の再発リスクの検査対象となるヒト又は非ヒト動物である。非ヒト動物としては、例えば、霊長類動物、ラット、マウス、スナネズミ、モルモット、ハムスター、フェレット、ウサギ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、イヌ、ネコ等の非ヒト哺乳動物が挙げられる。
　本開示において、「脳卒中」とは、脳の血管が急に破れたり，詰まったりして脳の血液の循環に障害をきたす病気を指す。脳卒中は、虚血性脳卒中（脳梗塞）と出血性脳卒中（脳出血）の２つの病型に大別される。また、虚血性脳卒中は、原性脳塞栓症、アテローム血栓性脳梗塞、ラクナ梗塞等の病型に分けられ、出血性脳卒中は、脳内出血（実質内出血）とくも膜下出血の２つ病型に分けられる。
　本開示において、「脳卒中の重症度」は、脳卒中の症状の程度である。本開示において、脳卒中の重症度は、National institutes of health stroke scale（NIHSS）スコア又はModified Rankin Scale(mRS)スコアで判定される。NIHSSスコアは、0～42点で判定され、当該スコアの値が高い程重症となる。mRSスコアは、グレード0～5で判定され、当該グレードが高い程重症となる。
　本開示において、「サルコペニア」とは、全身の筋肉量が減少し、筋力と身体機能が低下する病態を指す。
　本開示において、「腸内細菌叢における特定の科、属又は種の腸内細菌の相対的存在量」は、腸内細菌叢に存在する全細菌数を100％とした場合の、腸内細菌叢に存在する特定の科、属又は種に属する細菌の数の相対比率（%）である。また、本開示において、「口腔内細菌叢における特定の科、属又は種の腸内細菌の相対的存在量」は、口腔内細菌叢に存在する全細菌数を100％とした場合の、口腔内細菌叢に存在する特定の科、属又は種に属する細菌の数の相対比率（%）である。例えば、腸内細菌叢におけるレンサ球菌科細菌の相対的存在量は、腸内細菌叢に存在する全腸内細菌数を100％とした場合の、腸内細菌叢に存在するレンサ球菌科に属する細菌の数の相対比率である。また、例えば、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス属細菌の相対的存在量は、腸内細菌叢に存在する全腸内細菌数を100％とした場合の、腸内細菌叢に存在するストレプトコッカス属に属する細菌の数の相対比率である。また、例えば、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量は、腸内細菌叢に存在する全腸内細菌数を100％とした場合の、腸内細菌叢に存在するストレプトコッカス・アンギノーサスに属する細菌の数の相対比率である。
　本開示において、「脳卒中の改善剤」とは、脳卒中の発症抑制；脳卒中の病態の治癒、緩和又は増悪抑制；脳卒中の合併症の予防、治癒、緩和又は増悪抑制；或は、脳卒中の再発予防の目的で使用される薬剤である。
　本開示において、「被験物質」とは、スクリーニング方法において、所望の作用の存否の確認対象となる物質である。
２．腸内細菌叢を利用して脳卒中の罹患の有無を検査する方法（検査方法１）
　本開示の一実施形態では、脳卒中の罹患の有無を検査する方法（以下、「検査方法１」と表記することもある）が提供される。本開示の検査方法１では、被験者から採取された腸内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・パラサングイニス、ストレプトコッカス・サリバリウス、及びラクトバシラス・ファーメンタムよりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の有無を測定する工程を含む。ストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・パラサングイニス、ストレプトコッカス・サリバリウス、及びストレプトコッカス・ミュータンスは、口腔内に常在する細菌であり、通常は腸内細菌叢に存在していないが、本発明者等によって、脳卒中患者では、これらの細菌が口腔内から腸内細菌叢に移行していることを見出している。また、ラクトバシラス・ファーメンタムは、通常は腸内細菌叢に存在していないが、脳卒中患者の腸内細菌叢では認められることを見出している。従って、腸内細菌叢における前記細菌の存否を確認することにより、脳卒中の罹患の有無を検査することができる。
　本開示の検査方法１において、被験者は、脳卒中の罹患の有無の検査が必要なものであればよい。
　本開示の検査方法１において、測定対象となる細菌は、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・パラサングイニス、ストレプトコッカス・サリバリウス、及びラクトバシラス・ファーメンタムの中の１種又は２種以上であればよい。
　腸内細菌叢における前記細菌の存否を測定するには、腸内細菌叢を含むサンプルからDNAを抽出し、当該DNAをメタゲノム解析又はPCR分析に供すればよい。
　腸内細菌叢を含むサンプルとしては、糞便、消化管から採取した消化管内容物等であればよいが、糞便は非侵襲的に採取可能であることから好ましい。腸内細菌叢を含むサンプルからDNAの抽出は、公知の方法で行うことができる。
　メタゲノム解析は、16SrRNAメタゲノム解析又はフルメタゲノム解析のいずれであってもよく、公知の方法で行うことができる。
　また、PCR分析は、前記細菌を特異的に検出可能なプライマーを用いて、腸内細菌叢を含むサンプルから抽出されたDNAを鋳型として公知の方法で行うことができる。前記細菌を特異的に検出可能なプライマーは、公知又は当業者が通常の創作能力の発揮により設計可能であるが、例えば、以下のプライマーが挙げられる。
・ストレプトコッカス・アンギノーサスを特異的に検出可能なプライマー
　　F：CAAGTAGGACGCACAGTTTA（配列番号１）
　　R：TGTGTTACATACTGTTATGCGGT（配列番号2）
・ストレプトコッカス・ミュータンスを特異的に検出可能なプライマー
　　F：AGCCATGCGCAATCAACAGGTT（配列番号3）
　　R：CGCAACGCGAACATCTTGATCAG（配列番号4）
・ストレプトコッカス・パラサングイニスを特異的に検出可能なプライマー
　　F：AACAATGCGATYCCAGTATCRAG（配列番号5）
　　R：CTACGACATTAAAGGTACCDCGG（配列番号6）
・ストレプトコッカス・サリバリウスを特異的に検出可能なプライマー
　　F：AACGTTGACCTTACGCTAGC（配列番号7）
　　R：GATTCTGTCAAAGAAGCCAC（配列番号8）
・ラクトバシラス・ファーメンタムを特異的に検出可能なプライマー
　　F：AATACCGCATTACAACTTTG（配列番号9）
　　R：GGTTAAATACCGTCAACGTA（配列番号10）
　本開示の検査方法１において、腸内細菌叢から、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・パラサングイニスストレプトコッカス・サリバリウス、及びラクトバシラス・ファーメンタムの少なくとも１種の細菌が検出された被験者は、脳卒中に罹患している可能性が高いと判断される。また、「３．腸内細菌叢を利用して脳卒中の罹患の有無又はその病型を検査する方法（検査方法２）」の欄で述べるように、腸内細菌叢において、これらの細菌の相対的存在量が高い程、脳卒中に罹患している可能性がより高くなる。更に、「５．腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスを指標として脳卒中の重症度を検査する方法（検査方法４）」の欄で述べるように、腸内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量が高い被験者は、脳卒中の重症度が高い可能性があると判断される。
　また、脳卒中患者において、ストレプトコッカス・アンギノーサスが検出される腸内細菌叢には、ストレプトコッカス・パラサングイニス、ストレプトコッカス・サリバリウス、及びストレプトコッカス・ミュータンスの少なくとも１種が検出される傾向が強い。そのため、本開示の検査方法１の一実施形態として、腸内細菌叢から、ストレプトコッカス・アンギノーサスに加えて、ストレプトコッカス・パラサングイニス、ストレプトコッカス・サリバリウス、及びストレプトコッカス・ミュータンスの少なくとも１種の検出を行うことが挙げられる。
　本開示の検査方法１は、脳卒中の診断補助のための検査として行うことができるので、本開示の検査方法１によって脳卒中を罹患している可能性が高いと判断された被験者は対しては、画像検査、血液検査等の更なる検査を行うことができる。
　また、本開示の一態様では、本開示の検査方法１の実施に使用される検査キットが提供される。当該検査キットには、前記細菌を特異的に検出可能なプライマーが含まれていればよい。また、当該検査キットには、更に、必要に応じて、腸内細菌叢を含むサンプルからDNAを抽出するための試薬が含まれていてもよい。
３．腸内細菌叢を利用して脳卒中の罹患の有無又はその病型を検査する方法（検査方法２）
　本開示の他の一実施形態では、脳卒中の罹患の有無又はその病型を検査する方法（以下、「検査方法２」と表記することもある）が提供される。本開示の検査方法２では、被験者から採取された腸内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・パラサングイニス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ラクトバシラス・ファーメンタム、クロストリジウム・パーフリンゲンス、アリスティペス・プトレディネス、バクテロイデス・フラジェリス、ストレプトコッカス属細菌、ラクトバシラス属細菌、アリスティペス属細菌、レンサ球菌科細菌、バクテロイデス・プレビウス、アナエロテペス・ハドラス、ルミノコッカス・ビサーキュランス、バクテロイデス・ブルガータス、プレボテラ・コプリ、サテレラ・ワズワーステンシス、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ユウバクテリウム・レクタル、ダイアリスター・インビサス、フシカテニバクター属細菌、フィーカリバクテリウム属細菌、ドレア属細菌、アナエロティペス属細菌、ルミノコッカス属細菌、ブチリコッカス属細菌、ビフィドバクテリウム属細菌、ビフィドバクテリア科細菌、及びプレボテラ科細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を測定する工程を含む。これらの細菌の腸内細菌叢における相対的存在量は、脳卒中の罹患の有無又は特定の病型の脳卒中の罹患の有無によって変化しているので、これらの細菌の腸内細菌叢における相対的存在量を指標とすることにより、脳卒中の罹患の有無又はその病型を検査することが可能になる。
　本開示の検査方法２において、被験者は、脳卒中の罹患の有無の検査が必要なもの、又は脳卒中患の病型の検査が必要なものであればよい。
　本開示の検査方法２において、腸内細菌叢における相対的存在量の測定対象は、前記細菌の中の１種又は２種以上であればよい。
　腸内細菌叢における前記特定の科、属又は種の細菌の相対的存在量を測定するには、腸内細菌叢を含むサンプルからDNAを抽出し、当該DNAをメタゲノム解析又はPCR分析に供すればよい。
　腸内細菌叢を含むサンプルとしては、糞便、消化管から採取した消化管内容物等であればよいが、糞便は非侵襲的に採取可能であることから好ましい。腸内細菌叢を含むサンプルからDNAの抽出は、公知の方法で行うことができる。
　メタゲノム解析は、16SrRNAメタゲノム解析又はフルメタゲノム解析のいずれであってもよく、公知の方法で行うことができる。
　また、PCR分析は、全ての細菌を検出可能なプライマー及び前記特定の科、属又は種の細菌を特異的に検出可能なプライマーを用いて、腸内細菌叢を含むサンプルから抽出されたDNAを鋳型として公知の方法で行うことができる。全ての細菌を検出可能なプライマー及び前記特定の科、属又は種の細菌を特異的に検出可能なプライマーは、公知又は当業者が通常の創作能力の発揮により設計可能であるが、例えば、ストレプトコッカス・アンギノーサスストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・パラサングイニス、ストレプトコッカス・サリバリウス、及びラクトバシラス・ファーメンタムに特異的に検出可能なプライマーについては、前記検査方法１の欄で例示したものが挙げられる。また、これら以外の細菌を検出可能なプライマーとしては、例えば、以下のものが挙げられる。
・全ての細菌を検出可能なプライマー
　　F：AGRGTTTGATYMTGGCTCAG（配列番号11）
　　R：TGCTGCCTCCCGTAGGAGT（配列番号12）
・クロストリジウム・パーフリンゲンスを検出可能なプライマー
　　F：AAAGATGGCARCARCARRCAAC（配列番号13）
　　R：TACCGTCATTATCTTCCCCAAA（配列番号14）
・ストレプトコッカス属細菌を検出可能なプライマー
　　F：AGCTTAGAAGCAGCTATTCATTC（配列番号15）
　　R：GGATACACCTTTCGGTCTCTC（配列番号16）
・ラクトバシラス属細菌を検出可能なプライマー
　　F：CTTGTACACACCGCCCGTCA（配列番号17）
　　R：CTCAAAACTAAACAAAGTTTC（配列番号18）
・レンサ球菌科細菌を検出可能なプライマー
　　F：AGCTTAGAAGCAGCTATTCATTC （配列番号19）
　　R：GGATACACCTTTCGGTCTCTC （配列番号20）
・バクテロイデス・プレビウスを検出可能なプライマー
　　F：ATCATTAAAGATTTATCGGTGTACG（配列番号21）
　　R：ACTTTCACAGCTGACTTAACGAC（配列番号22）
・アナエロテペス・ハドラスを検出可能なプライマー
　　F：AGGGCTTAACTCTGGGAC（配列番号23）
　　R：GGTTAAGGACCGGTCAGAA（配列番号24）
・バクテロイデス・ブルガータスを検出可能なプライマー
　　F：GCAGATGAATTACGGTGAAAGC（配列番号25）
　　R：GTCAGAGTCCTCAGCGGAAC（配列番号26）
・プレボテラ・コプリを検出可能なプライマー
　　F：CCGGACTCCTGCCCCTGCAA （配列番号27）
　　R：GTTGCGCCAGGCACTGCGAT （配列番号28）
・ビフィドバクテリウム・ロンガムを検出可能なプライマー
　　F：TTCCAGTTGATCGCATGGTC（配列番号29）
　　R：GGAAACCCCATCGCATGGTC（配列番号30）
・ユウバクテリウム・レクタルを検出可能なプライマー
　　F：GCGGTRCGGCAAGTCTGA（配列番号61）
　　R：CCTCCGACACTCTAGTMCGAC（配列番号62）
・ダイアリスター・インビサスを検出可能なプライマー
　　F：GAGAAATGCGCAGTTCTTCTTCG（配列番号63）
　　R：CCCGGGAACGTARTCACCG（配列番号64）
・フィーカリバクテリウム属細菌を検出可能なプライマー
　　F：GAAGGCGGCCTACTGGGCAC（配列番号31）
　　R：GAAGGCGGCCTACTGGGCAC（配列番号32）
・ルミノコッカス属細菌を検出可能なプライマー
　　F：AGGCGGGACTGTAAGTCAGA（配列番号33）
　　R：ACGCATTTCACCGCTACACT（配列番号34）
・ブチリコッカス属細菌を検出可能なプライマー
　　F：TCGGGATGGAATCTTCCAACT（配列番号35）
　　R：TTGGTAAGGTTCTTGCGCGTT（配列番号36）
・ビフィドバクテリウム属細菌を検出可能なプライマー
　　F：GGGTGGTAATGCCGGATG（配列番号37）
　　R：TAAGCCATGGACTTTCACACC（配列番号38）
・ビフィドバクテリア科細菌を検出可能なプライマー
　　F：CTCCTGGAAACGGGTGG（配列番号39）
　　R：GGTGTTCTTCCCGATATCTACA（配列番号40）
・プレボテラ科細菌を検出可能なプライマー
　　F：CACRGTAAACGATGGATGCC（配列番号41）
　　R：GGTCGGGTTGCAGACC（配列番号42）
　本開示の検査方法２において、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・パラサングイニス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ラクトバシラス・ファーメンタム、クロストリジウム・パーフリンゲンス、アリスティペス・プトレディネス、ストレプトコッカス属細菌、ラクトバシラス属細菌、及びアリスティペス属細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量が高い被験者は、脳卒中を罹患している可能性が高いと判断される。腸内細菌叢における前記細菌の相対的存在量の高低は、具体的には、予め健常者及び／又は脳卒中患者の腸内細菌叢における前記細菌の相対的存在量（参照値）を求めておき、当該参照値との比較で判定することができる。例えば、健常者における前記細菌の相対的存在量と比較して、被験者における前記細菌の相対的存在量が高い場合には、脳卒中を罹患している可能性が高いと判断できる。具体的には、実施例の欄に示す試験データから得られたカットオフ値から、以下の基準で、被験者の脳卒中の罹患可能性を判定することもできる。被験者の腸内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量が0.17%（カットオフ値）以上の場合、ストレプトコッカス・ミュータンスの相対的存在量が0.11%（カットオフ値）以上の場合、ストレプトコッカス・パラサングイニスの相対的存在量が0.45%（カットオフ値）以上の場合、ストレプトコッカス・サリバリウスの相対的存在量が0.69%（カットオフ値）以上の場合、ラクトバシラス・ファーメンタムの相対的存在量が0.17%（カットオフ値）以上の場合、クロストリジウム・パーフリンゲンスの相対的存在量が0.57%（カットオフ値）以上の場合、アリスティペス・プトレディネスの相対的存在量が0.71%（カットオフ値）以上の場合、ストレプトコッカス属細菌の相対的存在量が6.15%（カットオフ値）以上の場合、ラクトバシラス属細菌の相対的存在量が4.97%（カットオフ値）以上の場合、又は、アリスティペス属細菌の相対的存在量が2.58%（カットオフ値）以上の場合には、脳卒中を罹患している可能性が高いと判断できる。なお、前記カットオフ値は、実施例の欄に示す試験データに基づいて、急性期脳卒中患者群の相対的存在量の平均値と非脳卒中者群の相対的存在量の平均値との間の中間値を示しており、当該カットオフ値はあくまで一例であり、検体、検査条件等に応じて適宜設定することが可能である。
　また、本開示の検査方法２において、腸内細菌叢におけるバクテロイデス・フラジェリス、及びラクトバシラス・ファーメンタムの相対的存在量が高い被験者は、心原性脳塞栓症を罹患している可能性が高いと判断される。腸内細菌叢におけるバクテロイデス・フラジェリスの相対的存在量の高低は、具体的には、予め健常者及び／又は原性脳塞栓症患者の腸内細菌叢におけるレンサ球菌科細菌の相対的存在量（参照値）を求めておき、当該参照値との比較で判定することができる。
　また、本開示の検査方法２において、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・ミュータンスの相対的存在量が高い被験者は、心原性脳塞栓症又はアテローム血栓性脳塞栓症を罹患している可能性が高いと判断される。腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・ミュータンスの相対的存在量の高低は、具体的には、予め健常者及び／又は心原性脳塞栓症又はアテローム血栓性脳塞栓症の患者の腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・ミュータンスの相対的存在量（参照値）を求めておき、当該参照値との比較で判定することができる。
　また、本開示の検査方法２において、腸内細菌叢におけるサテレラ・ワズワーステンシスの相対的存在量が低い被験者は、ラクナ梗塞を罹患している可能性が高いと判断される。腸内細菌叢におけるサテレラ・ワズワーステンシスの相対的存在量の高低は、具体的には、予め健常者及び／又はラクナ梗塞患者の腸内細菌叢におけるサテレラ・ワズワーステンシスの相対的存在量（参照値）を求めておき、当該参照値との比較で判定することができる。
　また、本開示の検査方法２において、腸内細菌叢におけるユウバクテリウム・レクタル及びダイアリスター・インビサスよりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量が低い被験者は、脳内出血を罹患している可能性が高いと判断される。腸内細菌叢におけるこれらの細菌の相対的存在量の高低は、具体的には、予め健常者及び／又は脳内出血患者の腸内細菌叢におけるこれらの細菌の相対的存在量（参照値）を求めておき、当該参照値との比較で判定することができる。
　また、本開示の検査方法２において、腸内細菌叢におけるレンサ球菌科細菌の相対的存在量が高い被験者は、心原性脳塞栓症、ラクナ梗塞、又はアテローム血栓性脳塞栓症を罹患している可能性が高いと判断される。腸内細菌叢におけるレンサ球菌科細菌の相対的存在量の高低は、具体的には、予め健常者及び／又は心原性脳塞栓症、ラクナ梗塞、又はアテローム血栓性脳塞栓症の患者の腸内細菌叢におけるレンサ球菌科細菌の相対的存在量（参照値）を求めておき、当該参照値との比較で判定することができる。例えば、健常者におけるレンサ球菌科細菌の相対的存在量と比較して、被験者におけるレンサ球菌科細菌の相対的存在量が高い場合には、心原性脳塞栓症を罹患している可能性が高いと判断できる。具体的には、実施例の欄に示す試験データから得られたカットオフ値から、被験者の腸内細菌叢において、レンサ球菌科細菌の相対的存在量が7.80%以上の場合、心原性脳塞栓症又はアテローム血栓性脳塞栓症を罹患している可能性が高いと判断でき、レンサ球菌科細菌の相対的存在量が5.29%以上7.80%未満の場合、ラクナ梗塞を罹患している可能性が高いと判断できる。なお、前記カットオフ値は、実施例の欄に示す試験データに基づいて、相対的存在量の平均値の各群間での中間値を示しており、当該カットオフ値はあくまで一例であり、検体、検査条件等に応じて適宜設定することが可能である。
　また、脳卒中患者がサルコペニアを併発している場合には、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・パラサングイニス、クロストリジウム・パーフリンゲンス、及びアリスティペス・プトレディネスよりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量がより高くなる。従って、本開示の検査方法２において、腸内細菌叢における前記細菌の相対的存在量がより高い程、サルコペニアを伴う脳卒中を罹患している可能性が高いと判断される。具体的には、予めサルコペニアを伴う脳卒中患者及び／又はサルコペニアを伴わない脳卒中患者の腸内細菌叢における前記細菌の相対的存在量（参照値）を求めておき、当該参照値との比較で判定することができる。例えば、サルコペニアを伴わない脳卒中患者における前記細菌の相対的存在量と比較して、被験者における前記細菌の相対的存在量が高い場合には、サルコペニアを伴う脳卒中患者を罹患している可能性が高いと判断できる。具体的には、実施例の欄に示す試験データから得られたカットオフ値から、被験者の腸内細菌叢において、ストレプトコッカス・ミュータンスの相対的存在量が0.21%（カットオフ値）以上の場合、ストレプトコッカス・パラサングイニスの相対的存在量が0.56%（カットオフ値）以上の場合、クロストリジウム・パーフリンゲンスの相対的存在量が0.59%（カットオフ値）以上の場合、又は、アリスティペス・プトレディネスの相対的存在量が1.07%（カットオフ値）以上の場合には、サルコペニアを伴う脳卒中を罹患している可能性が高いと判断できる。なお、前記カットオフ値は、実施例の欄に示す試験データに基づいて、サルコペニアを伴う脳卒中患者群の相対的存在量の平均値とサルコペニアを伴わない脳卒中患者群の相対的存在量の平均値との間の中間値を示しており、当該カットオフ値はあくまで一例であり、検体、検査条件等に応じて適宜設定することが可能である。
　また、本開示の検査方法２において、腸内細菌叢におけるバクテロイデス・プレビウス、アナエロテペス・ハドラス、ルミノコッカス・ビサーキュランス、バクテロイデス・ブルガータス、プレボテラ・コプリ、サテレラ・ワズワーステンシス、フシカテニバクター属細菌、フィーカリバクテリウム属細菌、ドレア属細菌、アナエロティペス属細菌、ルミノコッカス属細菌、及びブチリコッカス属細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量が低い被験者は、脳卒中を罹患している可能性が高いと判断される。腸内細菌叢における前記細菌の相対的存在量の高低は、具体的には、予め健常者及び／又は脳卒中患者の腸内細菌叢における前記細菌の相対的存在量（参照値）を求めておき、当該参照値との比較で判定することができる。例えば、健常者における前記細菌の相対的存在量と比較して、被験者における前記細菌の相対的存在量が低い場合には、脳卒中を罹患している可能性が高いと判断できる。具体的には、実施例の欄に示す試験データから得られたカットオフ値から、以下の基準で、被験者の脳卒中の罹患可能性を判定することもできる。被験者の腸内細菌叢において、バクテロイデス・プレビウスの相対的存在量が1.05%（カットオフ値）未満の場合、アナエロテペス・ハドラスの相対的存在量が1.47%（カットオフ値）未満の場合、ルミノコッカス・ビサーキュランスの相対的存在量が1.03%（カットオフ値）未満の場合、バクテロイデス・ブルガータスの相対的存在量が4.51%（カットオフ値）未満の場合、プレボテラ・コプリの相対的存在量が1.81%（カットオフ値）未満の場合、サテレラ・ワズワーステンシスの相対的存在量が0.19%（カットオフ値）未満の場合、フシカテニバクター属細菌の相対的存在量が2.79%（カットオフ値）未満の場合、フィーカリバクテリウム属細菌の相対的存在量が2.87%（カットオフ値）未満の場合、ドレア属細菌の相対的存在量が0.83%（カットオフ値）未満の場合、アナエロティペス属細菌の相対的存在量が2.44%（カットオフ値）未満の場合、ルミノコッカス属細菌の相対的存在量が2.16%（カットオフ値）未満の場合、又は、ブチリコッカス属細菌の相対的存在量が0.31%（カットオフ値）未満の場合には、脳卒中を罹患している可能性が高いと判断できる。なお、前記カットオフ値は、実施例の欄に示す試験データに基づいて、急性期脳卒中患者群の相対的存在量の平均値と非脳卒中者群の相対的存在量の平均値との間の中間値を示しており、当該カットオフ値はあくまで一例であり、検体、検査条件等に応じて適宜設定することが可能である。
　また、本開示の検査方法２において、腸内細菌叢におけるビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム属細菌、及びビフィドバクテリア科細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量が低い被験者は、心原性脳塞栓症を罹患している可能性が高いと判断される。腸内細菌叢における前記細菌の相対的存在量の高低は、具体的には、予め健常者及び／又は原性脳塞栓症患者の腸内細菌叢における前記細菌の相対的存在量（参照値）を求めておき、当該参照値との比較で判定することができる。例えば、健常者における前記細菌の相対的存在量と比較して、被験者における前記細菌の相対的存在量が低い場合には、心原性脳塞栓症を罹患している可能性が高いと判断できる。具体的には、実施例の欄に示す試験データに基づけば、被験者の腸内細菌叢において、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタムの相対的存在量が0.43%（カットオフ値）未満の場合、ビフィドバクテリウム・ロンガムの相対的存在量が0.29%（カットオフ値）未満の場合、ビフィドバクテリウム属細菌の相対的存在量が2.09%（カットオフ値）未満の場合、又は、ビフィドバクテリア科細菌の相対的存在量が2.14%（カットオフ値）未満の場合、心原性脳塞栓症を罹患している可能性が高いと判断できる。なお、前記カットオフ値は、実施例の欄に示す試験データに基づいて、相対的存在量の平均値の各群間での中間値を示しており、当該カットオフ値はあくまで一例であり、検体、検査条件等に応じて適宜設定することが可能である。
　また、本開示の検査方法２において、腸内細菌叢におけるプレボテラ科細菌の相対的存在量が低い被験者は、ラクナ梗塞又は脳内出血を罹患している可能性が高いと判断される。腸内細菌叢におけるプレボテラ科細菌の相対的存在量の高低は、具体的には、予め健常者及び／又はラクナ梗塞又は脳内出血の腸内細菌叢におけるプレボテラ科細菌の相対的存在量（参照値）を求めておき、当該参照値との比較で判定することができる。例えば、健常者におけるプレボテラ科細菌の相対的存在量と比較して、被験者におけるプレボテラ科細菌の相対的存在量が低い場合には、ラクナ梗塞又は脳内出血を罹患している可能性が高いと判断できる。具体的には、実施例の欄に示す試験データに基づけば、被験者の腸内細菌叢において、プレボテラ科細菌の相対的存在量が2.07%（カットオフ値）未満の場合、ラクナ梗塞又は脳内出血を罹患している可能性が高いと判断できる。なお、前記カットオフ値は、実施例の欄に示す試験データに基づいて、相対的存在量の平均値の各群間での中間値を示しており、当該カットオフ値はあくまで一例であり、検体、検査条件等に応じて適宜設定することが可能である。
　また、脳卒中患者がサルコペニアを併発している場合には、腸内細菌叢におけるバクテロイデス・ブルガータス、プレボテラ・コプリ、及びブチリコッカス属細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量がより低くなる。従って、本開示の検査方法２において、腸内細菌叢における前記細菌の相対的存在量がより低い程、サルコペニアを伴う脳卒中を罹患している可能性が高いと判断される。具体的には、予めサルコペニアを伴う脳卒中患者及び／又はサルコペニアを伴わない脳卒中患者の腸内細菌叢における前記細菌の相対的存在量（参照値）を求めておき、当該参照値との比較で判定することができる。例えば、サルコペニアを伴わない脳卒中患者における前記細菌の相対的存在量と比較して、被験者における前記細菌の相対的存在量が低い場合には、サルコペニアを伴う脳卒中患者を罹患している可能性が高いと判断できる。具体的には、実施例の欄に示す試験データから得られたカットオフ値から、被験者の腸内細菌叢において、バクテロイデス・ブルガータスの相対的存在量が2.82%（カットオフ値）未満の場合、プレボテラ・コプリの相対的存在量が0.37%（カットオフ値）未満の場合、又は、ブチリコッカス属細菌の相対的存在量が0.05%（カットオフ値）未満の場合には、サルコペニアを伴う脳卒中を罹患している可能性が高いと判断できる。なお、前記カットオフ値は、実施例の欄に示す試験データに基づいて、サルコペニアを伴う脳卒中患者群の相対的存在量の平均値とサルコペニアを伴わない脳卒中患者群の相対的存在量の平均値との間の中間値を示しており、当該カットオフ値はあくまで一例であり、検体、検査条件等に応じて適宜設定することが可能である。
　本開示の検査方法２は、脳卒中の診断補助のための検査として行うことができるので、本開示の検査方法２によって脳卒中を罹患している可能性が高いと判断された被験者は対しては、画像検査、血液検査等の更なる検査を行うことができる。
　また、本開示の一態様では、本開示の検査方法２の実施に使用される検査キットが提供される。当該検査キットには、前記細菌を特異的に検出可能なプライマーが含まれていればよい。また、当該検査キットには、更に、必要に応じて、腸内細菌叢を含むサンプルからDNAを抽出するための試薬が含まれていてもよい。
４．腸内細菌叢を利用して脳卒中の重症度を検査する方法（検査方法３）
　本開示の他の一実施形態では、脳卒中の重症度を検査する方法（以下、「検査方法３」と表記することもある）が提供される。本開示の検査方法３では、被験者から採取された腸内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサス、アナエロテペス・ハドラス、バクテロイデス・プレビウス、ユウバクテリウム・レクタル、プレボテラ・コプリ、及びラクトバシラス・ファーメンタムよりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を測定する工程を含む。これらの細菌の腸内細菌叢の相対的存在量は、脳卒中の重症度と相関しているので、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量を指標とすることにより、脳卒中の重症度を検査することが可能になる。
　本開示の検査方法３において、被験者は、脳卒中の重症度の検査が必要なものであればよく、脳卒中患者だけでなく、脳卒中の罹患の有無の検査が必要な者であってもよい。
　腸内細菌叢における前記細菌の相対的存在量を測定するには、腸内細菌叢を含むサンプルからDNAを抽出し、当該DNAをメタゲノム解析又はPCR分析に供すればよい。
　腸内細菌叢を含むサンプルとしては、糞便、消化管から採取した消化管内容物等であればよいが、糞便は非侵襲的に採取可能であることから好ましい。腸内細菌叢を含むサンプルからDNAの抽出は、公知の方法で行うことができる。
　メタゲノム解析は、16SrRNAメタゲノム解析又はフルメタゲノム解析のいずれであってもよく、公知の方法で行うことができる。
　また、PCR分析は、全ての細菌を検出可能なプライマー及び前記細菌を特異的に検出可能なプライマーを用いて、腸内細菌叢を含むサンプルから抽出されたDNAを鋳型として公知の方法で行うことができる。全ての細菌を検出可能なプライマー及び前記細菌を特異的に検出可能なプライマーは、公知又は当業者が通常の創作能力の発揮により設計可能であるが、当該プライマーの具体例としては、前記検査方法１及び２の欄で例示したものが挙げられる。
　本開示の検査方法３において、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス及びラクトバシラス・ファーメンタムよりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量が高い程、脳卒中の重症度が高いと判断される。具体的には、予め重症度が異なる脳卒中患者の腸内細菌叢におけるこれらの細菌の相対的存在量（参照値）を求めておき、当該参照値との比較で判定することができる。
　また、本開示の検査方法３において、腸内細菌叢におけるアナエロテペス・ハドラス、バクテロイデス・プレビウス、ユウバクテリウム・レクタル、及びプレボテラ・コプリよりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量が低い程、脳卒中の重症度が高いと判断される。具体的には、予め重症度が異なる脳卒中患者の腸内細菌叢におけるこれらの細菌の相対的存在量（参照値）を求めておき、当該参照値との比較で判定することができる。
　本開示の検査方法３によって脳卒中の重症度が高いが高いと判断された被験者に対しては、画像検査等により病態を慎重に観察し、薬物治療や外科治療を早期行えるようにしておくことが望ましい。
　また、本開示の一態様では、本開示の検査方法３の実施に使用される検査キットが提供される。当該検査キットには、前記細菌を特異的に検出可能なプライマーが含まれていればよい。また、当該検査キットには、更に、必要に応じて、腸内細菌叢中の全ての細菌を検出可能なプライマー、及び／又は腸内細菌叢を含むサンプルからDNAを抽出するための試薬が含まれていてもよい。
５．腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスを指標として脳卒中の再発リスクを検査する方法（検査方法４）
　本開示の他の一実施形態では、脳卒中の再発リスクを検査する方法（以下、「検査方法４」と表記することもある）が提供される。本開示の検査方法４では、被験者から採取された腸内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量を測定する工程を含む。腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量は、初発の脳卒中患者よりも再発の脳卒中患者で増大しているので、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量を指標とすることにより、脳卒中の再発リスクを検査することが可能になる。
　本開示の検査方法４において、被験者は、脳卒中の再発リスクの有無の検査が必要なものであればよく、急性期脳卒中患者、回復期脳卒中患者、脳卒中の治癒後に後遺症が残る者、又は脳卒中が治癒した者のいずれであってもよい。
　腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量を測定するには、腸内細菌叢を含むサンプルからDNAを抽出し、当該DNAをメタゲノム解析又はPCR分析に供すればよい。
　腸内細菌叢を含むサンプルとしては、糞便、消化管から採取した消化管内容物等であればよいが、糞便は非侵襲的に採取可能であることから好ましい。腸内細菌叢を含むサンプルからDNAの抽出は、公知の方法で行うことができる。
　メタゲノム解析は、16SrRNAメタゲノム解析又はフルメタゲノム解析のいずれであってもよく、公知の方法で行うことができる。
　また、PCR分析は、全ての細菌を検出可能なプライマー及びストレプトコッカス・アンギノーサスを特異的に検出可能なプライマーを用いて、腸内細菌叢を含むサンプルから抽出されたDNAを鋳型として公知の方法で行うことができる。全ての細菌を検出可能なプライマー及びストレプトコッカス・アンギノーサスを特異的に検出可能なプライマーは、公知又は当業者が通常の創作能力の発揮により設計可能であるが、当該プライマーの具体例としては、前記検査方法１及び２の欄で例示したものが挙げられる。
　本開示の検査方法４において、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量が高い程、脳卒中の再発リスクが高いと判断される。具体的には、予め急性期脳卒中初発患者及び／又は急性期脳卒中再発患者の腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量（参照値）を求めておき、当該参照値との比較で判定することができる。例えば、急性期脳卒中初発患者におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量と比較して、被験者におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量が高い場合には、脳卒中の再発リスクが高いと判断できる。具体的には、実施例の欄に示す試験データに基づけば、被験者の腸内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量が0.31%（カットオフ値）以上の場合には、脳卒中の再発リスクが高いと判断できる。なお、前記カットオフ値は、実施例の欄に示す試験データに基づいて、急性期脳卒中初発患者群の相対的存在量の平均値と急性期脳卒中再発患者群の相対的存在量の平均値との間の中間値を示しており、当該カットオフ値はあくまで一例であり、検体、検査条件等に応じて適宜設定することが可能である。
　本開示の検査方法４によって脳卒中の再発リスクが高いと判断された被験者に対しては、投薬を慎重に行ったり、画像検査の頻度を増やしたりすることで、予測される脳卒中の再発に対して早期介入及び早期治療を行えるように予後観察すればよい。
　また、本開示の一態様では、本開示の検査方法４の実施に使用される検査キットが提供される。当該検査キットには、ストレプトコッカス・アンギノーサスを特異的に検出可能なプライマーが含まれていればよい。また、当該検査キットには、更に、必要に応じて、腸内細菌叢中の全ての細菌を検出可能なプライマー、及び／又は腸内細菌叢を含むサンプルからDNAを抽出するための試薬が含まれていてもよい。
６．腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスを指標として脳卒中の予後を予測するための検査方法（検査方法５）
　本開示の他の一実施形態では、脳卒中の予後を予測するための検査方法（以下、「検査方法５」と表記することもある）が提供される。本開示の検査方法５では、被験者から採取された腸内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサスの有無を測定する工程を含む。腸内細菌叢においてストレプトコッカス・アンギノーサスを保有している脳卒中患者は、腸内細菌叢においてストレプトコッカス・アンギノーサスを保有していない患者に比べて、2年以内での死亡又は血管病再発のリスクが高いため、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの存否を指標とすることにより、脳卒中の予後予測のための検査が可能になる。
　本開示の検査方法５において、被験者は、脳卒中の予後予測のための検査が必要なものであればよく、急性期脳卒中患者、回復期脳卒中患者、脳卒中の治癒後に後遺症が残る者、又は脳卒中が治癒した者のいずれであってもよい。
　腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの有無を測定するには、腸内細菌叢を含むサンプルからDNAを抽出し、当該DNAをメタゲノム解析又はPCR分析に供すればよい。
　腸内細菌叢を含むサンプルとしては、糞便、消化管から採取した消化管内容物等であればよいが、糞便は非侵襲的に採取可能であることから好ましい。腸内細菌叢を含むサンプルからDNAの抽出は、公知の方法で行うことができる。
　メタゲノム解析は、16SrRNAメタゲノム解析又はフルメタゲノム解析のいずれであってもよく、公知の方法で行うことができる。
　また、PCR分析は、ストレプトコッカス・アンギノーサスを特異的に検出可能なプライマーを用いて、腸内細菌叢を含むサンプルから抽出されたDNAを鋳型として公知の方法で行うことができる。ストレプトコッカス・アンギノーサスを特異的に検出可能なプライマーは、公知又は当業者が通常の創作能力の発揮により設計可能であるが、当該プライマーの具体例としては、前記検査方法１の欄で例示したものが挙げられる。
　本開示の検査方法５において、腸内細菌叢からストレプトコッカス・アンギノーサスが検出された被験者は、2年以内での死亡又は血管病（虚血性脳卒中、出血性脳卒中、心筋梗塞、心不全増悪、又は末梢血管閉塞）再発のリスクが高く、予後不良になる可能性があると判断される。
　本開示の検査方法５によって予後不良になる可能性があると判断された被験者に対しては、投薬を慎重に行ったり、画像検査の頻度を増やしたりすることで、予測される予後不良に対して早期介入及び早期治療を行えるように予後観察すればよい。
　また、本開示の一態様では、本開示の検査方法５の実施に使用される検査キットが提供される。当該検査キットには、ストレプトコッカス・アンギノーサスを特異的に検出可能なプライマーが含まれていればよい。また、当該検査キットには、更に、必要に応じて、腸内細菌叢中の全ての細菌を検出可能なプライマー、及び／又は腸内細菌叢を含むサンプルからDNAを抽出するための試薬が含まれていてもよい。
７．腸内細菌叢を利用して脳卒中におけるサルコペニアの併発の有無を検査する方法（検査方法６）
　本開示の他の一実施形態では、脳卒中患者におけるサルコペニアの併発の有無を検査する方（以下、「検査方法６」と表記することもある）が提供される。本開示の検査方法６では、被験者から採取された腸内細菌叢において、ルミノコッカス・トルク及びベイオネラ属細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を測定する工程を含む。これらの細菌の腸内細菌叢における相対的存在量は、脳卒中患者におけるサルコペニアの併発の有無によって変化しているので、これらの細菌の腸内細菌叢における相対的存在量を指標とすることにより、脳卒中患者におけるサルコペニアの併発の有無を検査することが可能になる。
　本開示の検査方法６において、被験者は、サルコペニアの検査が必要な脳卒中患者であればよい。
　腸内細菌叢における前記細菌の相対的存在量を測定するには、腸内細菌叢を含むサンプルからDNAを抽出し、当該DNAをメタゲノム解析又はPCR分析に供すればよい。
　腸内細菌叢を含むサンプルとしては、糞便、消化管から採取した消化管内容物等であればよいが、糞便は非侵襲的に採取可能であることから好ましい。腸内細菌叢を含むサンプルからDNAの抽出は、公知の方法で行うことができる。
　メタゲノム解析は、16SrRNAメタゲノム解析又はフルメタゲノム解析のいずれであってもよく、公知の方法で行うことができる。
　また、PCR分析は、全ての細菌を検出可能なプライマー及び前記細菌を特異的に検出可能なプライマーを用いて、腸内細菌叢を含むサンプルから抽出されたDNAを鋳型として公知の方法で行うことができる。全ての細菌を検出可能なプライマー及びストレプトコッカス・アンギノーサスを特異的に検出可能なプライマーは、公知又は当業者が通常の創作能力の発揮により設計可能であるが、全ての細菌を検出可能なプライマーの具体例としては、前記検査方法２の欄で例示したものが挙げられる。
　本開示の検査方法６において、腸内細菌叢におけるルミノコッカス・トルクの相対的存在量が低い程、サルコペニアを伴う脳卒中を罹患している可能性が高いと判断される。具体的には、予めサルコペニアを伴う脳卒中患者及びサルコペニアを伴わない脳卒中患者の腸内細菌叢におけるルミノコッカス・トルクの相対的存在量（参照値）を求めておき、当該参照値との比較で判定することができる。例えば、サルコペニアを伴わない脳卒中患者におけるルミノコッカス・トルクの相対的存在量と比較して、被験者におけるルミノコッカス・トルクの相対的存在量が低い場合には、サルコペニアを伴う脳卒中患者を罹患している可能性が高いと判断できる。具体的には、実施例の欄に示す試験データから得られたカットオフ値から、被験者の腸内細菌叢において、ルミノコッカス・トルクの相対的存在量が1.16%（カットオフ値）未満の場合には、サルコペニアを伴う脳卒中を罹患している可能性が高いと判断できる。なお、前記カットオフ値は一例であり、検体、検査条件等に応じて適宜設定することが可能である。
　また、本開示の検査方法６において、腸内細菌叢におけるベイオネラ属細菌の相対的存在量が高い程、サルコペニアを伴う脳卒中を罹患している可能性が高いと判断される。具体的には、予めサルコペニアを伴う脳卒中患者及びサルコペニアを伴わない脳卒中患者の腸内細菌叢におけるベイオネラ属細菌の相対的存在量（参照値）を求めておき、当該参照値との比較で判定することができる。例えば、サルコペニアを伴わない脳卒中患者におけるベイオネラ属細菌の相対的存在量と比較して、被験者におけるベイオネラ属細菌の相対的存在量が高い場合には、サルコペニアを伴う脳卒中患者を罹患している可能性が高いと判断できる。具体的には、実施例の欄に示す試験データから得られたカットオフ値から、被験者の腸内細菌叢において、ベイオネラ属細菌の相対的存在量が0.11%（カットオフ値）以上の場合には、サルコペニアを伴う脳卒中を罹患している可能性が高いと判断できる。なお、前記カットオフ値は一例であり、検体、検査条件等に応じて適宜設定することが可能である。
　本開示の検査方法６によって脳卒中においてサルコペニアを併発している可能性が高いと判断された被験者に対しては、サルコペニアに対する適切な診断や処理を施せばよい。
　また、本開示の一態様では、本開示の検査方法６の実施に使用される検査キットが提供される。当該検査キットには、前記細菌を特異的に検出可能なプライマーが含まれていればよい。また、当該検査キットには、更に、必要に応じて、腸内細菌叢中の全ての細菌を検出可能なプライマー、及び／又は腸内細菌叢を含むサンプルからDNAを抽出するための試薬が含まれていてもよい。
８．口腔内細菌叢を利用して脳卒中の罹患の有無を検査する方法（検査方法７）
　本開示の更に他の一実施形態では、脳卒中の罹患の有無を検査する方法（以下、「検査方法７」と表記することもある）が提供される。本開示の検査方法７では、被験者から採取された口腔内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサス、トレポネーマ・デンティコラ、ストレプトコッカス・クリスタタス、プレボテラ・ロエッシェイイ、ラクトバシラス・ファーメンタム、ストレプトコッカス・ゴルドニ、ストレプトコッカス・コンステラータス、カンピロバイター・グラシリス、セレノモナス・スプチゲナ、タンネレラ・フォーサイシア、ポルフィロモナス属細菌、フソバクテリウム属細菌、ストレプトコッカス属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、カンピロバクター属細菌、レンサ球菌科細菌、ユウバクテリウム・サルシ、ストレプトコッカス・インファンティス、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ、プレボテラ・ナンセイエンシッス、ランセフィールデラ・パルブラ、ナイセリア属細菌、サッカリモナダTM7x属細菌、ヘモフィルス属細菌、アロプレボテラ属細菌、プレボテラ科細菌、及びベイロネラ科細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を測定する工程を含む。これらの細菌の口腔内細菌叢における相対的存在量は、脳卒中の罹患の有無によって変化しているので、これらの細菌の口腔内細菌叢における相対的存在量を指標とすることにより、脳卒中の罹患の有無を検査することが可能になる。
　本開示の検査方法７において、被験者は、脳卒中の罹患の有無の検査が必要なものであればよい。
　本開示の検査方法７において、口腔内細菌叢における相対的存在量の測定対象は、前記細菌の中の１種又は２種以上であればよい。
　口腔内細菌叢における前記特定の科、属又は種の細菌の相対的存在量を測定するには、口腔内細菌叢を含むサンプルからDNAを抽出し、当該DNAをメタゲノム解析又はPCR分析に供すればよい。
　口腔内細菌叢を含むサンプルとしては、唾液であることが好ましいいが、歯面、歯周ポケット、舌表面、頬粘膜等から採取されたサンプルであってもよい。また、口腔内細菌叢を含むサンプルは、食事、歯磨き、うがい等を行う前に採取することが好ましい。口腔内細菌叢を含むサンプルからDNAの抽出は、公知の方法で行うことができる。
　メタゲノム解析は、16SrRNAメタゲノム解析又はフルメタゲノム解析のいずれであってもよく、公知の方法で行うことができる。
　また、PCR分析は、全ての細菌を検出可能なプライマー及び前記特定の科、属又は種の細菌を特異的に検出可能なプライマーを用いて、口腔内細菌叢を含むサンプルから抽出されたDNAを鋳型として公知の方法で行うことができる。全ての細菌を検出可能なプライマー及び前記特定の科、属又は種の細菌を特異的に検出可能なプライマーは、公知又は当業者が通常の創作能力の発揮により設計可能であるが、例えば、全ての細菌を検出可能なプライマー、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ラクトバシラス・ファーメンタム、ストレプトコッカス属細菌、レンサ球菌科細菌、及びプレボテラ科細菌に特異的に検出可能なプライマーについては、前記検査方法１及び２の欄で例示したものが挙げられる。また、これら以外の細菌を検出可能なプライマーとしては、例えば、以下のものが挙げられる。
・トレポネーマ・デンティコラを検出可能なプライマー
　　F：AAAGGCTTTGGGCGACAG（配列番号43）
　　R：TCCCGTCCTCATACCACTTT（配列番号44）
・ストレプトコッカス・クリスタタスを検出可能なプライマー
　　F：TCCAATGCCAAACCTTTACT（配列番号45）
　　R：ATACGAGTATCTTCTTCACG（配列番号46）
・ストレプトコッカス・ゴルドニを検出可能なプライマー
　　F：GTCGATGGCGAGGATCTAGAGC（配列番号47）
　　R：TGCCGAGCGCTCTAACTCCA（配列番号48）
・ポルフィロモナス属細菌を検出可能なプライマー
　　F：GGTGTCGGGCTTAAGTGCCAT（配列番号49）
　　R：CGGACTGTAAGGGCCGTGC（配列番号50）
・フソバクテリウム属細菌を検出可能なプライマー
　　F：KGGGCTCAACMCMGTATTG（配列番号51）
　　R：TCGCGTTAGCTTGGGCGC（配列番号52）
・カンピロバクター属細菌を検出可能なプライマー
　　F：GGATGACACTTTTCGGAGC（配列番号53）
　　R：CATTGTAGCACGTGTGTC（配列番号54）
・ヘモフィルス・パラインフルエンゼを検出可能なプライマー
　　F：GATGAAAGTGTGGGACCTTCG（配列番号55）
　　R：AGTTCCCGAAGGCACCAATC（配列番号56）
・サッカリモナダTM7x属細菌を検出可能なプライマー
　　F：AYTGGGCGTAAAGAGTTGC（配列番号57）
　　R：GTCCCCGTCAATTCCTTTATG（配列番号58）
　本開示の検査方法７において、口腔内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス、トレポネーマ・デンティコラ、ストレプトコッカス・クリスタタス、プレボテラ・ロエッシェイイ、ラクトバシラス・ファーメンタム、ストレプトコッカス・ゴルドニ、ストレプトコッカス・コンステラータス、カンピロバイター・グラシリス、セレノモナス・スプチゲナ、タンネレラ・フォーサイシア、ポルフィロモナス属細菌、フソバクテリウム属細菌、ストレプトコッカス属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、カンピロバクター属細菌、及びレンサ球菌科細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量が高い被験者は、脳卒中を罹患している可能性が高いと判断される。口腔内細菌叢における前記細菌の相対的存在量の高低は、具体的には、予め健常者及び／又は脳卒中患者の口腔内細菌叢における前記細菌の相対的存在量（参照値）を求めておき、当該参照値との比較で判定することができる。例えば、健常者における前記細菌の相対的存在量と比較して、被験者における前記細菌の相対的存在量が高い場合には、脳卒中を罹患している可能性が高いと判断できる。具体的には、実施例の欄に示す試験データから得られたカットオフ値から、以下の基準で、被験者の脳卒中の罹患可能性を判定することもできる。被験者の口腔内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量が0.13%（カットオフ値）以上の場合、トレポネーマ・デンティコラの相対的存在量が0.13%（カットオフ値）以上の場合、ストレプトコッカス・クリスタタスの相対的存在量が0.12%（カットオフ値）以上の場合、プレボテラ・ロエッシェイイの相対的存在量が0.15%（カットオフ値）以上の場合、ラクトバシラス・ファーメンタムの相対的存在量が0.08%（カットオフ値）以上の場合、ストレプトコッカス・ゴルドニの相対的存在量が0.22%（カットオフ値）以上の場合、ストレプトコッカス・コンステラータスの相対的存在量が0.17%（カットオフ値）以上の場合、カンピロバイター・グラシリスの相対的存在量が0.13%（カットオフ値）以上の場合、セレノモナス・スプチゲナの相対的存在量が0.14%（カットオフ値）以上の場合、タンネレラ・フォーサイシアの相対的存在量が0.24%（カットオフ値）以上の場合、ポルフィロモナス属細菌の相対的存在量が4.80%（カットオフ値）以上の場合、フソバクテリウム属細菌の相対的存在量が4.12%（カットオフ値）以上の場合、ストレプトコッカス属細菌の相対的存在量が15.07%（カットオフ値）以上の場合、カプノサイトファーガ属細菌の相対的存在量が0.98%（カットオフ値）以上の場合、カンピロバクター属細菌の相対的存在量が1.63%（カットオフ値）以上の場合、又は、レンサ球菌科細菌の相対的存在量が14.80%（カットオフ値）以上の場合には、脳卒中を罹患している可能性が高いと判断できる。なお、前記カットオフ値は、実施例の欄に示す試験データに基づいて、急性期脳卒中患者群の相対的存在量の平均値と非脳卒中者群の相対的存在量の平均値との間の中間値等を示しており、当該カットオフ値はあくまで一例であり、検体、検査条件等に応じて適宜設定することが可能である。
　また、本開示の検査方法７において、口腔内細菌叢におけるユウバクテリウム・サルシ、ストレプトコッカス・インファンティス、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ、プレボテラ・ナンセイエンシッス、ランセフィールデラ・パルブラ、ナイセリア属細菌、サッカリモナダTM7x属細菌、ヘモフィルス属細菌、アロプレボテラ属細菌、プレボテラ科細菌、及びベイロネラ科細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量が低い被験者は、脳卒中を罹患している可能性が高いと判断される。口腔内細菌叢における前記細菌の相対的存在量の高低は、具体的には、予め健常者及び／又は脳卒中患者の口腔内細菌叢における前記細菌の相対的存在量（参照値）を求めておき、当該参照値との比較で判定することができる。例えば、健常者における前記細菌の相対的存在量と比較して、被験者における前記細菌の相対的存在量が低い場合には、脳卒中を罹患している可能性が高いと判断できる。具体的には、実施例の欄に示す試験データから得られたカットオフ値から、以下の基準で、被験者の脳卒中の罹患可能性を判定することもできる。被験者の口腔内細菌叢において、ウバクテリウム・サルシの相対的存在量が0.40%（カットオフ値）未満の場合、ストレプトコッカス・インファンティスの相対的存在量が1.05%（カットオフ値）未満の場合、ヘモフィルス・パラインフルエンゼの相対的存在量が1.49%（カットオフ値）未満の場合、プレボテラ・ナンセイエンシッスの相対的存在量が1.01%（カットオフ値）未満の場合、ランセフィールデラ・パルブラの相対的存在量が0.11%（カットオフ値）未満の場合、ナイセリア属細菌の相対的存在量が6.71%（カットオフ値）未満の場合、サッカリモナダTM7x属細菌の相対的存在量が1.44%（カットオフ値）未満の場合、ヘモフィルス属細菌の相対的存在量が3.20%（カットオフ値）未満の場合、アロプレボテラ属細菌の相対的存在量が3.36%（カットオフ値）未満の場合、プレボテラ科細菌の相対的存在量が23.71%（カットオフ値）未満の場合、又はベイロネラ科細菌の相対的存在量が9.45%（カットオフ値）未満の場合には、脳卒中を罹患している可能性が高いと判断できる。なお、前記カットオフ値は、実施例の欄に示す試験データに基づいて、急性期脳卒中患者群の相対的存在量の平均値と非脳卒中者群の相対的存在量の平均値との間の中間値等を示しており、当該カットオフ値はあくまで一例であり、検体、検査条件等に応じて適宜設定することが可能である。
　本開示の検査方法７は、脳卒中の診断補助のための検査として行うことができるので、本開示の検査方法７によって脳卒中を罹患している可能性が高いと判断された被験者は対しては、画像検査、血液検査等の更なる検査を行うことができる。
　また、本開示の一態様では、本開示の検査方法７の実施に使用される検査キットが提供される。当該検査キットには、前記細菌を特異的に検出可能なプライマーが含まれていればよい。また、当該検査キットには、更に、必要に応じて、口腔内細菌叢を含むサンプルからDNAを抽出するための試薬が含まれていてもよい。
９．脳卒中の改善剤（１）
　本開示の別の一実施形態では、脳卒中患者の腸内細菌叢又は口腔内菌叢を正常化させる物質を有効成分として含む脳卒中の改善剤（以下、「改善剤１」と表記することもある）を提供する。前述の通り、本発明者等によって、脳卒中患者と健常者との間、初発の脳卒中患者と再発の脳卒中患者との間、予後不良の脳卒中患者とそうでない脳卒中患者との間、及びサルコペニアを伴う脳卒中患者とそうでない脳卒中感はとの間で、腸内細菌叢又は口腔内菌叢における細菌組成が変化していることが見出されている。従って、腸内細菌叢又は口腔内菌叢を正常化させることにより、脳卒中の発症抑制；脳卒中の病態の治癒、緩和又は増悪抑制；脳卒中患者のサルコペニア合併症の予防、治癒、緩和又は増悪抑制；或は、脳卒中患者の再発予防が可能になる。
　脳卒中患者の腸内細菌叢を正常化させる物質の一態様として、腸内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・パラサングイニス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ラクトバシラス・ファーメンタム、クロストリジウム・パーフリンゲンス、アリスティペス・プトレディネス、バクテロイデス・フラジェリス、ストレプトコッカス属細菌、ラクトバシラス属細菌、アリスティペス属細菌、レンサ球菌科細菌、及びベイオネラ属細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を低下させる物質が挙げられる。
　脳卒中患者の腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・パラサングイニス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ラクトバシラス・ファーメンタム、クロストリジウム・パーフリンゲンス、アリスティペス・プトレディネス、ストレプトコッカス属細菌、ラクトバシラス属細菌、及びアリスティペス属細菌の相対的存在量は、健常者に比べて増加しているので、これらの細菌の少なくとも１種の相対的存在量を低下させることにより、脳卒中の予防、病態の緩和又は進行抑制が可能になる。また、心原性脳塞栓症の患者の腸内細菌叢におけるバクテロイデス・フラジェリス、及びラクトバシラス・ファーメンタムの相対的存在量は、健常者に比べて増加しているので、これらの細菌の少なくとも１種の相対的存在量を低下させることにより、心原性脳塞栓症の予防、病態の緩和又は進行抑制が可能になる。また、心原性脳塞栓症又はアテローム血栓性脳塞栓症の患者の腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・ミュータンスの相対的存在量は、健常者に比べて増加しているので、これらの細菌の少なくとも１種の相対的存在量を低下させることにより、心原性脳塞栓症又はアテローム血栓性脳塞栓症の予防、病態の緩和又は進行抑制が可能になる。また、心原性脳塞栓症、ラクナ梗塞、又はアテローム血栓性脳塞栓症の患者の腸内細菌叢におけるレンサ球菌科細菌の相対的存在量は、健常者に比べて増加しているので、レンサ球菌科細菌の相対的存在量を低下させることにより、心原性脳塞栓症、ラクナ梗塞、又はアテローム血栓性脳塞栓症の予防、病態の緩和又は進行抑制が可能になる。
　また、再発の脳卒中患者の腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量は、初発の脳卒中患者に比べて増加しているので、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量を低下させることにより、脳卒中の再発を抑制することができる。
　また、2年以内での死亡又は血管病（虚血性脳卒中、出血性脳卒中、心筋梗塞、心不全増悪、又は末梢血管閉塞）再発リスクが高い脳卒中患者の腸内細菌叢ではストレプトコッカス・アンギノーサスが存在しているので、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量を低下させることにより、脳卒中の予後不良を改善することができる。
　サルコペニアを伴う脳卒中患者の腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・パラサングイニス、クロストリジウム・パーフリンゲンス、アリスティペス・プトレディネス、及びベイオネラ属細菌の相対的存在量は、サルコペニアを伴わない脳卒中患者者に比べて増加しているので、腸内細菌叢における前記細菌の少なくとも１種の相対的存在量を低下させることにより、脳卒中患者がサルコペニアを併発するリスクを低減したり、脳卒中患者で併発しているサルコペニアを治癒、緩和又は増悪抑制したりすることができる。
　また、脳卒中患者の腸内細菌叢を正常化させる物質の他の一態様として、腸内細菌叢において、バクテロイデス・プレビウス、アナエロテペス・ハドラス、ルミノコッカス・ビサーキュランス、バクテロイデス・ブルガータス、プレボテラ・コプリ、サテレラ・ワズワーステンシス、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ユウバクテリウム・レクタル、ダイアリスター・インビサスルミノコッカス・トルク、フシカテニバクター属細菌、フィーカリバクテリウム属細菌、ドレア属細菌、アナエロティペス属細菌、ルミノコッカス属細菌、ブチリコッカス属細菌、ビフィドバクテリウム属細菌、ビフィドバクテリア科細菌、及びプレボテラ科細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の腸内細菌の相対的存在量を増加させる物質が挙げられる。
　脳卒中患者の腸内細菌叢におけるバクテロイデス・プレビウス、アナエロテペス・ハドラス、ルミノコッカス・ビサーキュランス、バクテロイデス・ブルガータス、プレボテラ・コプリ、サテレラ・ワズワーステンシス、フシカテニバクター属細菌、フィーカリバクテリウム属細菌、ドレア属細菌、アナエロティペス属細菌、ルミノコッカス属細菌、及びブチリコッカス属細菌の相対的存在量は、健常者に比べて低下しているので、これらの細菌の少なくとも１種の相対的存在量を増加させることにより、脳卒中の予防、病態の緩和又は進行抑制が可能になる。また、心原性脳塞栓症患者の腸内細菌叢におけるビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム属細菌、ビフィドバクテリア科細菌の相対的存在量は、健常者に比べて低下しているので、これらの細菌の少なくとも１種の相対的存在量を増加させることにより、心原性脳塞栓症の予防、病態の緩和又は進行抑制が可能になる。また、ラクナ梗塞の患者の腸内細菌叢におけるサテレラ・ワズワーステンシスの相対的存在量の相対的存在量は、健常者に比べて低下しているので、サテレラ・ワズワーステンシスの相対的存在量を増加させることにより、ラクナ梗塞の予防、病態の緩和又は進行抑制が可能になる。また、脳内出血の患者の腸内細菌叢におけるユウバクテリウム・レクタル及びダイアリスター・インビサスの相対的存在量は、健常者に比べて低下しているので、これらの細菌の少なくとも１種の相対的存在量を増加させることにより、脳内出血の予防、病態の緩和又は進行抑制が可能になる。また、ラクナ梗塞又は脳内出血の患者の腸内細菌叢におけるプレボテラ科細菌の相対的存在量は、健常者に比べて低下しているので、プレボテラ科細菌の相対的存在量を増加させることにより、ラクナ梗塞又は脳内出血の予防、病態の緩和又は進行抑制が可能になる。
　サルコペニアを伴う脳卒中患者の腸内細菌叢におけるバクテロイデス・ブルガータス、ルミノコッカス・トルク、プレボテラ・コプリ、及びブチリコッカス属細菌の相対的存在量は、サルコペニアを伴わない脳卒中患者者に比べて低下しているので、腸内細菌叢における前記細菌の少なくとも１種の相対的存在量を増加させることにより、脳卒中患者がサルコペニアを併発するリスクを低減したり、脳卒中患者で併発しているサルコペニアを治癒、緩和又は増悪抑制したりすることができる。
　脳卒中患者の口腔内細菌叢を正常化させる物質の一態様として、口腔内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサス、トレポネーマ・デンティコラ、ストレプトコッカス・クリスタタス、プレボテラ・ロエッシェイイ、ラクトバシラス・ファーメンタム、ストレプトコッカス・ゴルドニ、ストレプトコッカス・コンステラータス、カンピロバイター・グラシリス、セレノモナス・スプチゲナ、タンネレラ・フォーサイシア、ポルフィロモナス属細菌、フソバクテリウム属細菌、ストレプトコッカス属細菌、カプノサイトファーガ属）細菌、カンピロバクター属細菌、及びレンサ球菌科細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を低下させる物質が挙げられる。脳卒中患者の口腔内において、これらの細菌の相対的存在量は、健常者に比べて増加しているので、これらの細菌の少なくとも１種の相対的存在量を低下させることにより、脳卒中の予防、病態の緩和又は進行抑制が可能になる。
　また、脳卒中患者の口腔内細菌叢を正常化させる物質の他の一態様として、口腔内細菌叢において、ユウバクテリウム・サルシ、ストレプトコッカス・インファンティス、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ、プレボテラ・ナンセイエンシッス、ランセフィールデラ・パルブラ、ナイセリア属細菌、サッカリモナダTM7x属細菌、ヘモフィルス属細菌、アロプレボテラ属細菌、プレボテラ科細菌、及びベイロネラ科細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を増加させる物質が挙げられる。脳卒中患者の口腔内において、これらの細菌の相対的存在量は、健常者に比べて低下しているので、これらの細菌の少なくとも１種の相対的存在量を増加させることにより、脳卒中の予防、病態の緩和又は進行抑制が可能になる。
　本開示の改善剤１において、有効成分として使用される「脳卒中患者の腸内細菌叢又は口腔内菌叢を正常化させる物質」としては、腸内細菌叢又は口腔内菌叢における相対的存在量を増加又は低下させる対象となる細菌の種類に応じて適宜選定すればよいが、例えば、抗生物質、抗体、ファージ、腸内細菌（プロバイオティクス）、プレバイオティクス等が挙げられる。
　有効成分として使用される抗生物質としては、相対的存在量を低下させる対象となる腸内細菌に対して抗菌性を示すものであればよい。有効成分として使用される抗生物質として、例えば、メチシリン、オキサシリン、ナフシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、チモシリン、アモキシシリン、ピペラシリン、タランピシリン、バカンピシリン、アンピシリン、チカルシリン、ベンジルペニシリン、カルベニシリン等のペニシリン系抗生物質；メトロニダゾール等のニトロイミダゾール系抗生物質；バンコマイシン、テイコプラニン等のグリコペプチド系抗生物質；ネオマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、カプレオマイシン、ネチルマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン等のアミノグリコシド系抗生物質；セファロチン、セファゾリン、セフォチアム、セフメタゾール、セフォタキシム、セフメノキシム、セフォジジム、セフトリアキソン、セフタジジム、セフォペラゾン、セフミノクス、ラタモキセフ、フロモキセフ、セフピロム、セフェピム、セフォゾプラン、セファレキシン等のセフェム系抗生物質；ファロペネム等のペネム系抗菌化合物；イミペネム、パニペネム、メロペネム、ビアペネム、ドリペネム、エルタペネム、テビペネム等のカルバペネム系抗生物質；アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、トロレアンドマイシン等のマクロライド系抗生物質；リンコマイシン、クリンダマイシン、ピルリマイシン等のリンコマイシン系抗生物質；テリスロマイシン等のケトライド系抗生物質；シプロフロキサシン、オフロキサシン、シタフロキサシン等のニューキノロン系抗生物質；キヌプリスチン、ダルホプリスチン等のストレプトグラミン系抗生物質；デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、テトラサイクリン等のテトラサイクリン系抗生物質；クロラムフェニコール等のクロラムフェニコール系抗生物質；シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン等のキノロン系抗生物質；バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンＢ等のペプチド系抗生物質；アズトレオナム等のモノバクタム系抗生物質；ホスホマイシン等のホスホマイシン系抗生物質等が挙げられる。これらの抗生物質は、１種単独で使用してもよく、また2種以上組み合わせて使用してもよい。
　これらの抗生物質の中でも、好適な一例として、ペニシリン系抗生物質、ニトロイミダゾール系抗生物質、及びグリコペプチド系抗生物質の内、１種以上、好ましくは２種以上、より好ましくはこれらの３種の組み合わせが挙げられる。また、抗生物質の他の好適な例として、ペニシリン系抗生物質、ニトロイミダゾール系抗生物質、グリコペプチド系抗生物質、及びアミノグリコシド系抗生物質の組み合わせが挙げられる。
　また、有効成分として使用される抗生物質のより具体的な例としては、アンピシリン、メトロニダゾール、及びバンコマイシンの内、１種以上、好ましくは２種以上、より好ましくはこれらの３種の組み合わせが挙げられる。また、抗生物質の他の好適な具体例として、アンピシリン、メトロニダゾール、バンコマイシン、及びネオマイシンの組み合わせが挙げられる。
　抗生物質として、ペニシリン系抗生物質（アンピシリン等）、ニトロイミダゾール系抗生物質（メトロニダゾール等）、及びグリコペプチド系抗生物質（バンコマイシン等）を組み合わせて使用する場合、これらの比率については、特に制限されないが、例えば、ペニシリン系抗生物質100重量部当たり、ニトロイミダゾール系抗生物質が10～1000重量部且つグリコペプチド系抗生物質が5～500重量部；好ましくは、ペニシリン系抗生物質100重量部当たり、ニトロイミダゾール系抗生物質が50～500重量部且つグリコペプチド系抗生物質が10～250重量部；より好ましくは、ペニシリン系抗生物質100重量部当たり、ニトロイミダゾール系抗生物質が75～150重量部且つグリコペプチド系抗生物質が25～75重量部が挙げられる。
　また、抗生物質として、ペニシリン系抗生物質（アンピシリン等）、ニトロイミダゾール系抗生物質（メトロニダゾール等）、グリコペプチド系抗生物質（バンコマイシン等）、及びアミノグリコシド系抗生物質（ネオマイシン等）を組み合わせて使用する場合、これらの比率については、特に制限されないが、例えば、ペニシリン系抗生物質100重量部当たり、ニトロイミダゾール系抗生物質が10～1000重量部、グリコペプチド系抗生物質が5～500重量部、且つアミノグリコシド系抗生物質が10～1000重量部；好ましくは、ペニシリン系抗生物質100重量部当たり、ニトロイミダゾール系抗生物質が50～500重量部、グリコペプチド系抗生物質が10～250重量部、且つアミノグリコシド系抗生物質が50～500重量部；より好ましくは、ペニシリン系抗生物質100重量部当たり、ニトロイミダゾール系抗生物質が75～150重量部、グリコペプチド系抗生物質が25～75重量部、、且つアミノグリコシド系抗生物質が75～150重量部が挙げられる。
　有効成分として使用される抗体としては、腸内細菌叢における相対的存在量を低下させる対象となる腸内細菌に対して結合できるものであればよい。抗体のアイソタイプについては、特に限定されず、IgA、IgM、IgD、IgG、又はIgEのいずれであってもよく、2種以上のアイソタイプを組み合わせて使用してもよい。これらのアイソタイプの中でも、好適な一例としてIgAが挙げられる。
　有効成分として使用されるファージとしては、相対的存在量を低下させる対象となる腸内細菌に対して溶菌活性を示すものであればよい。特定の細菌に対して溶菌活性を示すファージは、遺伝子工学的手法又は環境より単離培養する手法により得られることが知られており（Trends Biotechnol. 2010 Dec;28(12):591-595. doi: 10.1016/j.tibtech.2010.08.001. Epub 2010 Aug 31、Bacteriophage. 2011 Mar-Apr; 1(2): 111-114. doi: 10.4161/bact.1.2.14590）、本開示の改善剤１では、公知の手法で作製又は取得したファージを使用することができる。
　有効成分として使用される腸内細菌としては、相対的存在量を増加させる対象となる細菌であればよい。また、当該細菌は、生菌であってもよく、弱毒化または不活化された細菌であってもよい。また、有効成分として使用される腸内細菌は、健常人から採取した腸内細菌叢（例えば、糞便）であってもよく、健常人から採取した腸内細菌叢を投与する手法（例えば、糞便移植法）について、公知又は当業者が公知技術より容易に想到できる。
　有効成分として使用されるプレバイオティクスとしては、相対的存在量を増加させる対象となる細菌の増殖を促進できるものであればよい。プレバイオティクスの種類については、特に限定されないが、例えば、ガラクトオリゴ糖、フラクトオリゴ糖、大豆オリゴ糖、乳果オリゴ糖、キシロオリゴ糖、イソマルオリゴ糖、ラフィノース、ラクチュロース等のオリゴ糖；ポリデキストロース、イヌリン等の食物繊維等が挙げられる。これらのプレバイオティクスは、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。
　本開示の改善剤１は、医薬品又は食品の形態で提供することができる。
　本開示の改善剤１を医薬品として提供する場合、前記有効成分と薬学的に許容される担体や添加剤等を配合して、所望の剤型に調製すればよい。薬学的に許容される担体又は添加剤としては、例えば、滅菌水、生理食塩水、安定剤、賦形剤、酸化防止剤、緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤、結合剤等が挙げられる。医薬品の剤型としては、例えば、カプセル剤、タブレット剤、丸剤、サシェ剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、チュアブル剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤またはエマルション剤等の経口投与製剤；坐剤、かん腸剤等が挙げられる。医薬品にける前記有効成分の含有量は、投与量、剤型等に応じて適宜設定すればよい。
　本開示の改善剤１を食品として提供する場合、前記有効成分と食品素材とを配合して所望の形態に調製すればよい。食品の形態としては、サプリメント、健康食品、機能性食品、特定保健用食品、病者用食品等が挙げられるが、その他一般食品であってもよい。食品にける前記有効成分の含有量は、摂取量、形態等に応じて適宜設定すればよい。
　また、本開示の改善剤１の対象者は、脳卒中の予防が求められる者又は脳卒中患者である。本開示の改善剤１を脳卒中の予防が求められる者に使用することにより、脳卒中の罹患リスクを低減することが可能になる。また、本開示の改善剤１を脳卒中患者に使用すると、使用する有効成分の種類に応じて、脳卒中の病態の治癒、緩和又は増悪抑制；脳卒中患者のサルコペニア合併症の予防、治癒、緩和又は増悪抑制；或は、脳卒中患者の再発予防又は予後不良の抑制が可能になる。
　本開示の改善剤１の投与経路については、特に制限されず、使用する有効成分の種類に応じて適宜設定すればよいが、例えば、経口投与、経直腸投与、経口摂取等が挙げられる。
　本開示の改善剤１の投与量については、脳卒中の予防又は治療に有効な量であればよく、使用する有効成分の種類、投与対象の年齢、体重、症状の程度等に応じて適宜設定すればよい。
　例えば、有効成分として抗生物質を使用する場合であれば、1日当たりに投与される抗生物質の総量を1～300 mg/kg-体重程度、好ましくは10～200 mg/kg-体重程度に設定し、１日に1～3回に分けて、3～20日間程度、好ましくは5～16日間程度投与すればよい。より具体的には、ペニシリン系抗生物質（アンピシリン等）を単独又は他の抗生物質と与わせて使用する場合であれば、1日当たりに投与されるペニシリン系抗生物質の総量を10～80 mg/kg-体重程度、好ましくは20～40 mg/kg-体重程度に設定し、１日に1～3回に分けて、4～10日間程度、好ましくは7日間程度投与すればよい。ニトロイミダゾール系抗生物質（メトロニダゾール等）を単独又は他の抗生物質と与わせて使用する場合であれば、1日当たりに投与されるニトロイミダゾール系抗生物質の総量を7～120 mg/kg-体重程度、好ましくは15～60mg/kg-体重程度に設定し、１日に1～3回に分けて、5～20日間程度、好ましくは14日間程度投与すればよい。グリコペプチド系抗生物質（バンコマイシン等）を単独又は他の抗生物質と与わせて使用する場合であれば、1日当たりに投与されるグリコペプチド系抗生物質の総量を5～30 mg/kg-体重程度、好ましくは10～15 mg/kg-体重程度に設定し、１日に1～3回に分けて、4～10日間程度、好ましくは7日間程度投与すればよい。アミノグリコシド系抗生物質（ネオマイシン等）を単独又は他の抗生物質と与わせて使用する場合であれば、1日当たりに投与されるアミノグリコシド系抗生物質の総量を10～60 mg/kg-体重程度、好ましくは20～30 mg/kg-体重程度に設定し、１日に1～3回に分けて、4～10日間程度、好ましくは7日間程度投与すればよい。
　また、例えば、有効成分として抗体を使用する場合であれば、1日当たりに投与される抗体の総量を1～100 mg/kg-体重程度、好ましくは5～20 mg/kg-体重程度に設定し、１日に1～3回に分けて、3～14日間程度、好ましくは5～10日間程度投与すればよい。
１０．脳卒中の改善剤のスクリーニング方法（１）
　本開示の他の一実施形態では、被験物質の中から、脳卒中の改善に有効である可能性がある候補物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含むスクリーニング方法（以下、「スクリーニング方法１」と表記することもある）を提供する：
　被験物質について、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・パラサングイニス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ラクトバシラス・ファーメンタム、クロストリジウム・パーフリンゲンス、アリスティペス・プトレディネス、バクテロイデス・フラジェリス、ストレプトコッカス属細菌、ラクトバシラス属細菌、アリスティペス属細菌、レンサ球菌科細菌、及びベイオネラ属細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を低下させる作用を評価する工程；及び
　前記作用を有する被験物質を、前記候補物質として選択する工程。
　被験物質としては、具体的には、抗生物質、抗体、ファージ、細菌、ペプチド、タンパク質、食物繊維、オリゴ糖、有機化合物、無機化合物、細胞抽出物、細胞培養上清、植物抽出物、培養産物、これらの混合物等が挙げられる。
　本開示のスクリーニング方法１において、腸内細菌叢における前記細菌の相対的存在量を低下させる作用の評価手法については、特に制限されず、当業者であれば、通常の創作能力の範囲内で適切に条件設定が可能であるが、例えば、in vivo又はin vitroにおいて、前記細菌を含有する腸内細菌叢を含むサンプルに、適量の被験物質を添加し、前記細菌の相対的存在量の変化を測定する方法によって行うことができる。
　本開示のスクリーニング方法１において、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・パラサングイニス、ストレプトコッカス・サリバリウス、クロストリジウム・パーフリンゲンス、アリスティペス・プトレディネス、ストレプトコッカス属細菌、ラクトバシラス属細菌、及びアリスティペス属細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を低下させる作用が認められた被験物質は、脳卒中の再発予防剤の候補物質としても選択することができる。また、本開示のスクリーニング方法１において、腸内細菌叢におけるバクテロイデス・フラジェリス、及びラクトバシラス・ファーメンタムよりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を低下させる作用が認められた被験物質は心原性脳塞栓の改善剤の候補物質として選択することができる。また、本開示のスクリーニング方法１において、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・ミュータンスの相対的存在量を低下させる作用が認められた被験物質は心原性脳塞栓症又はアテローム血栓性脳塞栓症の改善剤の候補物質として選択することができる。また、本開示のスクリーニング方法１において、腸内細菌叢におけるレンサ球菌科細菌の相対的存在量を低下させる作用が認められた被験物質は心原性脳塞栓症、ラクナ梗塞、又はアテローム血栓性脳塞栓症の改善剤の候補物質として選択することができる。
　また、本開示のスクリーニング方法１において、ストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量を低下させる作用が認められた被験物質は、脳卒中の再発予防剤の候補物質としても選択することができる。更に、本開示のスクリーニング方法１において、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・パラサングイニス、クロストリジウム・パーフリンゲンス、アリスティペス・プトレディネス、及びベイオネラ属細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を低下させる作用が認められた被験物質は、脳卒中患者で併発するサルコペニアの改善剤としての候補物質としても選択することができる。
　また、本開示のスクリーニング方法１で選択された候補物質は、動物試験等によって脳卒中の改善剤等としての有効性に関する検証に供し、臨床上の実用可能性を確認することが望ましい。
１１．脳卒中の改善剤のスクリーニング方法（２）
　本開示の他の一実施形態では、被験物質の中から、脳卒中の改善に有効である可能性がある候補物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含むスクリーニング方法（以下、「スクリーニング方法２」と表記することもある）を提供する：
　被験物質について、腸内細菌叢におけるバクテロイデス・プレビウス、アナエロテペス・ハドラス、ルミノコッカス・ビサーキュランス、バクテロイデス・ブルガータス、プレボテラ・コプリ、サテレラ・ワズワーステンシス、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ユウバクテリウム・レクタル、ダイアリスター・インビサス、ルミノコッカス・トルク、フシカテニバクター属細菌、フィーカリバクテリウム属細菌、ドレア属細菌、アナエロティペス属細菌、ルミノコッカス属細菌、ブチリコッカス属細菌、ビフィドバクテリウム属細菌、フィドバクテリア科細菌、及びプレボテラ科細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を増加させる作用を評価する工程；及び
　前記作用を有する被験物質を、前記候補物質として選択する工程。
　本開示のスクリーニング方法２において、使用される被験物質については、前記スクリーニング方法１の欄に記載の通りである。
　本開示のスクリーニング方法２において、腸内細菌叢における前記細菌の相対的存在量を増加させる作用の評価手法については、特に制限されず、当業者であれば、通常の創作能力の範囲内で適切に条件設定が可能であるが、例えば、in vivo又はin vitroにおいて、前記細菌を含有する腸内細菌叢を含むサンプルに、適量の被験物質を添加し、前記細菌の相対的存在量の変化を測定する方法によって行うことができる。
　本開示のスクリーニング方法２において、腸内細菌叢におけるバクテロイデス・プレビウス、アナエロテペス・ハドラス、ルミノコッカス・ビサーキュランス、バクテロイデス・ブルガータス、プレボテラ・コプリ、サテレラ・ワズワーステンシス、フシカテニバクター属細菌、フィーカリバクテリウム属細菌、ドレア属細菌、アナエロティペス属細菌、ルミノコッカス属細菌、及びブチリコッカス属細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を増加させる作用を有すると評価された被験物質は、脳卒中の改善剤の候補物質として選択される。また、本開示のスクリーニング方法２において、腸内細菌叢におけるビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリア属細菌、及びビフィドバクテリア科細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を増加させる作用を有すると評価された被験物質は、心原性脳塞栓症の改善剤の候補物質として選択される。また、本開示のスクリーニング方法２において、腸内細菌叢におけるサテレラ・ワズワーステンシスの相対的存在量の相対的存在量を増加させる作用を有すると評価された被験物質は、ラクナ梗塞の改善剤の候補物質として選択される。また、本開示のスクリーニング方法２において、腸内細菌叢におけるユウバクテリウム・レクタル、及びダイアリスター・インビサスよりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を増加させる作用を有すると評価された被験物質は、脳内出血の改善剤の候補物質として選択される。また、本開示のスクリーニング方法２において、腸内細菌叢におけるプレボテラ科細菌の相対的存在量の相対的存在量を増加させる作用を有すると評価された被験物質は、ラクナ梗塞又は脳内出血の改善剤の候補物質として選択される。
　また、本開示のスクリーニング方法２で選択された候補物質は、動物試験等によって脳卒中の改善剤等としての有効性に関する検証に供し、臨床上の実用可能性を確認することが望ましい。
１２．脳卒中の改善剤のスクリーニング方法（３）
　本開示の他の一実施形態では、被験物質の中から、脳卒中の改善に有効である可能性がある候補物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含むスクリーニング方法（以下、「スクリーニング方法３」と表記することもある）を提供する：
　被験物質について、口腔内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス、トレポネーマ・デンティコラ、ストレプトコッカス・クリスタタス、プレボテラ・ロエッシェイイ、ラクトバシラス・ファーメンタム、ストレプトコッカス・ゴルドニ、ストレプトコッカス・コンステラータス、カンピロバイター・グラシリス、セレノモナス・スプチゲナ、タンネレラ・フォーサイシア、ポルフィロモナス属細菌、フソバクテリウム属細菌、ストレプトコッカス属細菌、カプノサイトファーガ属）細菌、カンピロバクター属細菌、及びレンサ球菌科細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を低下させる作用を評価する工程；及び
　前記作用を有する被験物質を、前記候補物質として選択する工程。
　本開示のスクリーニング方法３において、使用される被験物質については、前記スクリーニング方法１の欄に記載の通りである。
　本開示のスクリーニング方法３において、口腔内細菌叢における前記細菌の相対的存在量を低下させる作用の評価手法については、特に制限されず、当業者であれば、通常の創作能力の範囲内で適切に条件設定が可能であるが、例えば、in vivo又はin vitroにおいて、前記細菌を含有する口腔内細菌叢を含むサンプルに、適量の被験物質を添加し、前記細菌の相対的存在量の変化を測定する方法によって行うことができる。
　本開示のスクリーニング方法３において、前記作用が認められた被験物質は、脳卒中の再発予防剤の候補物質としても選択することができる。
　また、本開示のスクリーニング方法３で選択された候補物質は、動物試験等によって脳卒中の改善剤等としての有効性に関する検証に供し、臨床上の実用可能性を確認することが望ましい。
１３．脳卒中の改善剤のスクリーニング方法（４）
　本開示の他の一実施形態では、被験物質の中から、脳卒中の改善に有効である可能性がある候補物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程を含むスクリーニング方法（以下、「スクリーニング方法４」と表記することもある）を提供する：
　被験物質について、口腔内細菌叢におけるユウバクテリウム・サルシ、ストレプトコッカス・インファンティス、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ、プレボテラ・ナンセイエンシッス、ランセフィールデラ・パルブラ、ナイセリア属細菌、サッカリモナダTM7x属細菌、ヘモフィルス属細菌、アロプレボテラ属細菌、プレボテラ科細菌、及びベイロネラ科細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を増加させる作用を評価する工程；及び
　前記作用を有する被験物質を、前記候補物質として選択する工程。
　本開示のスクリーニング方法４において、使用される被験物質については、前記スクリーニング方法１の欄に記載の通りである。
　本開示のスクリーニング方法４において、口腔内細菌叢における前記細菌の相対的存在量を増加させる作用の評価手法については、特に制限されず、当業者であれば、通常の創作能力の範囲内で適切に条件設定が可能であるが、例えば、in vivo又はin vitroにおいて、前記細菌を含有する口腔内細菌叢を含むサンプルに、適量の被験物質を添加し、前記細菌の相対的存在量の変化を測定する方法によって行うことができる。
　本開示のスクリーニング方法４において、前記作用が認められた被験物質は、脳卒中の再発予防剤の候補物質としても選択することができる。
　また、本開示のスクリーニング方法４で選択された候補物質は、動物試験等によって脳卒中の改善剤等としての有効性に関する検証に供し、臨床上の実用可能性を確認することが望ましい。
１４．血液サンプル中のエクオールを指標として、脳卒中の病型別発症リスクを検査する方法（検査方法８）
　本開示の他の一実施形態では、脳卒中の病型別発症リスクを検査する方法（以下、「検査方法８」と表記することもある）が提供される。本開示の検査方法８では、被験者から採取された血液サンプル中のエクオール濃度を測定する工程する工程を含む。脳卒中患者の血液中のエクオール濃度は、脳卒中の病型と相関しているので、被験者から採取された血液サンプル中のエクオール濃度を指標とすることにより、脳卒中の病型別の発症リスクを検査することが可能になる。
　本開示の検査方法８において、被験者は、脳卒中の病型別の発症リスクの検査が必要なものであればよく、例えば、健常者、脳卒中の発症が疑われている者等が挙げられる。
　本開示において、「血液サンプル」とは、血液由来のサンプルであり、全血、血清、及び血漿が包含される。本開示の検査方法８で使用される血液サンプルは、全血、血清または血漿のいずれであってもよいが、好適な一例として血清が挙げられる。
　血液サンプル中のエクオール濃度の測定は、液体クロマトグラフィー質量分析法等の公知のエクオール測定方法で行うことができる。
　本開示の検査方法８において、血液サンプル中のエクオール濃度が低い程、心原性脳塞栓症、アテローム血栓性脳梗塞、又は心房細動を発症するリスクが高いと判断される。具体的には、実施例の欄に示す試験データから、被験者の血清中のエクオール濃度が1 ng/mL未満の場合には、心原性脳塞栓症（特に、心房細動を伴う心原性脳塞栓症）、アテローム血栓性脳梗塞、又は心房細動を発症するリスクがあると判断できる。なお、前記血清中のエクオール濃度の基準値は一例であり、検体、検査条件等に応じて適宜設定することが可能である。
　本開示の検査方法８によって心原性脳塞栓症、アテローム血栓性脳梗塞、又は心房細動を発症するリスクがあると判断された被験者に対しては、これらの疾患の予防措置や診断による経過観察を慎重に行うことにより、心原性脳塞栓症、アテローム血栓性脳梗塞、又は心房細動の予防又は早期治療を行えるようにしておくことが望ましい。
１５．血液サンプル中のエクオールを指標として、脳卒中の重症度を検査する方法（検査方法９）
　本開示の更に他の一実施形態では、脳卒中の重症度を検査する方法（以下、「検査方法９」と表記することもある）が提供される。本開示の検査方法９では、被験者から採取された血液サンプル中のエクオール濃度を測定する工程する工程を含む。脳卒中患者の血液中のエクオール濃度は、脳卒中の重症度と相関しているので、被験者から採取された血液サンプル中のエクオール濃度を指標とすることにより、脳卒中の重症度を検査することが可能になる。
　本開示の検査方法９において、被験者は、脳卒中の重症度の検査が必要なものであればよく、脳卒中患者だけでなく、脳卒中の罹患の有無の検査が必要な者であってもよい。
　本開示の検査方法９において、使用する血液サンプル、及び血液サンプル中のエクオール濃度の測定方法等については、前記検査方法８の場合と同様である。
　本開示の検査方法９において、血液サンプル中のエクオール濃度が低い程、脳卒中の重症度が高いと判断される。具体的には、実施例の欄に示す試験データから、被験者の血清中のエクオール濃度が1 ng/mL未満の場合には、脳卒中の重症度が高いと判断できる。なお、前記血清中のエクオール濃度の基準値は一例であり、検体、検査条件等に応じて適宜設定することが可能である。
　本開示の検査方法９によって脳卒中の重症度が高いと判断された被験者に対しては、画像検査等により病態を慎重に観察し、薬物治療や外科治療を早期行えるようにしておくことが望ましい。
１６．血液サンプル中のエクオールを指標として、脳卒中の機能予後を検査する方法（検査方法１０）
　本開示の更に他の一実施形態では、脳卒中の機能予後を検査する方法（以下、「検査方法１０」と表記することもある）が提供される。本開示の検査方法１０では、被験者から採取された血液サンプル中のエクオール濃度を測定する工程を含む。脳卒中患者の血液中のエクオール濃度は、脳卒中の機能予後と相関しているので、被験者から採取された血液サンプル中のエクオール濃度を指標とすることにより、脳卒中の機能予後を検査することが可能になる。
　本開示の検査方法１０において、被験者は、脳卒中の機能予後の検査が必要なものであればよく、脳卒中患者だけでなく、脳卒中の罹患の有無の検査が必要な者であってもよい。
　本開示の検査方法１０において、使用する血液サンプル、及び血液サンプル中のエクオール濃度の測定方法等については、前記検査方法８の場合と同様である。
　本開示の検査方法１０において、血液サンプル中のエクオール濃度が低い程、機能予後が不良になり易いと判断される。具体的には、実施例の欄に示す試験データから、被験者の血清中のエクオール濃度が1 ng/mL未満の場合には、機能予後が不良になり易いと判断できる。なお、前記血清中のエクオール濃度の基準値は一例であり、検体、検査条件等に応じて適宜設定することが可能である。
　本開示の検査方法１０によって機能予後が不良になり易いと判断された被験者に対しては、投薬を慎重に行ったり、画像検査の頻度を増やしたりすることで、予測される機能予後不良に対して早期介入及び早期治療を行えるように予後観察すればよい。
１７．脳卒中の改善剤（２）
　本開示の別の一実施形態では、エクオール、又はエクオール産生促進物質を有効成分として含む脳卒中の改善剤（以下、「改善剤２」と表記することもある）を提供する。前述の通り、本発明者等によって、脳卒中患者の血中エクオール濃度が低い場合には、重症度が高く、機能予後が不良になり易いため、生体内でエクオール濃度を高めることが、脳卒中の予防改善に有効であり得ることが見出されている。従って、エクオール、又はエクオール産生促進物質の投与又は摂取により、脳卒中の発症抑制、脳卒中の病態の治癒、緩和又は増悪抑制；或は、脳卒中患者の再発予防が可能になる。
　本開示の改善剤２において、有効成分は、エクオール自体、又はエクオール産生促進物質である。本開示において、エクオール産生促進物質とは、生体内でのエクオール産生を促進できる物質である。
　エクオール産生促進物質の一例として、エクオール産生菌が挙げられる。エクオール産生菌とは、ダイゼイン、ダイジン、ジヒドロダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、及びこれらの誘導体の少なくとも１種を、エクオールに変換する活性を有する細菌である。エクオール産生促進物質として使用されるエクオール産生微生物としては、例えば、ビフィドバクテリウム属細菌、ラクトコッカス属細菌等を使用することができる。ビフィドバクテリウム属細菌の好適な例として、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム、及びビフィドバクテリウム・ロンガムが挙げられる。また、エクオール産生微生物として、アサッカロバクター・セラツス（Asaccharobacter celatus）、アドレクラウチア・エクオーリファシエンス（Adlercreutzia equolifaciens）、スラッキア・イソフラボニコンバーテンス（Slackia isoflavoniconvertens）（以上、国際公開第2012/033150号）、ラクトコッカス・ガルビエ(Lactococcus garvieae)（国際公開第2005/000042号）、バクテロイデス・オバタス（Bacteroides ovatus）、ストレプトコッカス・インターメディウス（Streptococcus intermedius）、ストレプトコッカス・コンステラータス（Streptococcus constellatus）（以上、国際公開第99/007392号）等が単離されており、本開示の改善剤２では、これらのエクオール産生菌を使用することもできる。
　また、エクオール産生促進物質の他の一例として、エクオール生成において基質として使用されるイソフラボンが挙げられる。当該イソフラボンとしては、具体的には、エクオール産生菌とは、ダイゼイン、ダイジン、ジヒドロダイゼイン、ゲニステイン、グリシテイン、及びこれらの誘導体等が挙げられる。
　また、エクオール産生促進物質として、黒大豆種皮抽出物（特開2021-155374）、酵母マンナン（国際公開第2020/004568）等も知られており、本開示の改善剤２では、これらの物質を使用することもできる。
　本開示の改善剤２は、医薬品又は食品の形態で提供することができる。
　本開示の改善剤を医薬品として提供する場合、前記有効成分と薬学的に許容される担体や添加剤等を配合して、所望の剤型に調製すればよい。薬学的に許容される担体又は添加剤の種類は、本開示の改善剤１の場合と同様である。
　本開示の改善剤を食品として提供する場合、前記有効成分と食品素材とを配合して所望の形態に調製すればよい。食品の形態は、本開示の改善剤１の場合と同様である。
　また、本開示の改善剤２の対象者は、脳卒中の予防が求められる者又は脳卒中患者である。本開示の改善剤２を脳卒中の予防が求められる者に使用することにより、脳卒中の罹患リスクを低減することが可能になる。また、本開示の改善剤２を脳卒中患者に使用すると、使用する有効成分の種類に応じて、脳卒中の病態の治癒、緩和又は増悪抑制；脳卒中患者のサルコペニア合併症の予防、治癒、緩和又は増悪抑制；或は、脳卒中患者の再発予防が可能になる。本開示の改善剤２の適用対象となる脳卒中の病型については、特に制限されず、いずれの病型であってもよいが、好適な一例として、脳梗塞、より好ましくは心原性脳塞栓症及びアテローム血栓性脳梗塞、更に好ましくは心原性脳塞栓症が挙げられる。
　本開示の改善剤２の投与経路については、特に制限されず、使用する有効成分の種類に応じて適宜設定すればよいが、例えば、経口投与、経直腸投与、経口摂取等が挙げられる。
　本開示の改善剤２の投与量については、脳卒中の予防又は治療に有効な量であればよく、使用する有効成分の種類、投与対象の年齢、体重、症状の程度等に応じて適宜設定すればよい。例えば、有効成分としてエクオールを使用する場合であれば、成人１日当たりのエクオールの投与量を1～100 mg程度、好ましくは5～30 mg程度に設定し、１日に1～3回に分けて投与すればよい。また、有効成分としてエクオール産生菌を使用する場合であれば、成人１日当たりのエクオール産生菌の投与量を、1×105～1×1015 cfu程度、好ましくは1×108～1×1012 cfu程度に設定し、１日に1～3回に分けて投与すればよい。また、有効成分としてエクオール産生菌以外のエクオール産生促進物質を使用する場合であれば、成人１日当たりのエクオール産生促進物質（エクオール産生菌以外）の投与量を0.1～20g程度、好ましくは1～10 g程度に設定し、１日に1～3回に分けて投与すればよい。
　以下に実施例を示してより具体的に説明するが、本開示はこれらの実施例に限定して解釈されるものではない。
1. 脳卒中患者の口腔内細菌叢及び腸内細菌叢の細菌組成の特徴
1-1.試験方法
(1)研究デザイン及び被験者
　本研究は、国立循環器病研究センター（NCVC；吹田市、日本）において、脳卒中患者、及び当該患者と年齢を適合させた非脳卒中者（健常者）を対象として、2020年7月29日から2021年12月31日までの間で単施設観察研究を実施した。研究は、ヘルシンキ宣言に基づいて、国立循環器病研究センターの研究倫理審査会の承認の下で行った（承認番号はR20029-3）。本研究において、全ての臨床プロファイルと検体は、書面によるインフォームド・コンセントを得て収集した。後述する基準に従ったスクリーニングの後、脳卒中患者201名及び非脳卒中者60名を無作為に選択し、最終的にインフォームド・コンセントを得た後、脳卒中患者189名と非脳卒中者（対照者）55名を登録した。
(2)脳卒中コホート研究
　急性期脳卒中患者は、臨床的な急性の神経麻痺症状とCT又はMRIによる脳画像による所見により診断した(Nishimura, K. et al., J Atheroscler Thromb 21, 784-798, doi:10.5551/jat.19356 (2014))。患者の選択基準は、(i)年齢20歳以上の患者、(ii)発症後7日以内に入院した患者、及び(iii)患者又はその親族によって文書によるインフォームド・コンセントが可能な患者とし、(i)過去3ヵ月以内に抗生物質の投与・服薬歴のある患者、及び(ii)入院後・スクリーニング抽出を行う前に排便があった患者を除外対象とした。
(3)集団ベースコホート研究
　日本における人口ベースの前向きコホート研究である吹田研究の参加者の中から、患者と年齢をマッチさせた非脳卒中者（健常者）を登録した。非脳卒中者の選択基準は、(i)文書によるインフォームド・コンセントが可能な参加者であり、非脳卒中者の除外基準は、(i)認知症、脳卒中、虚血性心疾患、又は腎臓病の既往歴がある者、及び(ii)過去3ヵ月以内に抗生物質の投与を受けた者とした。
(4)臨床プロファイル
(4-1)背景情報
　年齢、性別、喫煙、飲酒歴、生活習慣病（高血圧、糖尿病、高脂血症、心房細動）の罹患・治療歴、脳卒中及び心血管病（虚血性心疾患、脳卒中、腎臓病）の既往・治療歴を、カルテ情報又はスクリーニング質問票により収集した。脳卒中患者における生活習慣病の有無に関しては以下の基準に基づき情報の収集を行った。(i)収縮期血圧≧140（mmHg）且つ拡張期血圧≧90（mmHg）、又は(ii)降圧剤を服用中、のいずれかに該当する場合、「高血圧」と定義した。(i)空腹時血糖値≧126mg/dLかつ(ii)HgbA1c値≧6.5％、もしくは(iii)抗糖尿病薬の服用中・インスリン使用中、のいずれかに該当する場合、「糖尿病」と定義した。(i) 低密度リポ蛋白コレステロール値≧140mg/dL、(ii)高密度リポ蛋白コレステロール値≦40mg/dL、(iii)トリグリセリド値≧150mg/dL、又は(iv)脂質低下剤服用中、のいずれかに該当する場合、「高コレステロール血症」と定義した。12誘導心電図の所見、又は抗凝固薬の服薬歴のある場合にその原疾患、に基づいて「心房細動」と定義した。
(4-2)身体的及び神経学的所見
　身体的及び神経学的所見として、カルテから以下のデータを収集した。身体的所見については、入院時の収縮期及び拡張期血圧（mmHg）、心拍数（/min）、ボディマス指数（kg/m2）を収集した。神経学的所見については、入院時及び退院時のNIHSSスコア、及び脳卒中前と退院時のmodified Rankin scaleを収集した。
(4-3)血液検査
　血液検査は10時間以上の絶食期間をおいて採取された結果を参照し、下記のデータを収集した。空腹時血糖(mg/dL)、ヘモグロビンA1c(%)、トリグリセリド(mg/dL)、高密度リポ蛋白コレステロール (mg/dL)、低密度リポ蛋白コレステロール (mg/dL)、総コレステロール(mg/dL)、CRP（mg/dL）、及び白血球数(個/μL)。
(4-4)脳MRI所見
　脳の磁気共鳴画像（MRI）検査は3.0 Teslaスキャナー（Magneton Verio又はSpectra；Siemens Medical Solutions, Erlangen, Germany）を用いた。臨床上の標準プロトコールに基づき、拡散強調画像、FLAIR画像、T2強調画像、T2*強調画像、磁気共鳴血管画像を撮像した。脳微小出血（CMB）はT2*強調画像を用いて評価した。微小出血解剖学的評価尺度（MARS）（Gregoire, S. M. et al., Neurology 73, 1759-1766, doi:10.1212/WNL.0b013e3181c34a7d (2009)）に従い解剖学的な広がり・重篤度を分類した。ラクナ梗塞と大脳白質病変（white matter hyperintensities）はFLAIR画像を用いて評価した。ラクナ梗塞は、直径3～15mmの高輝度の縁取りを有する低輝度病変と定義した。大脳白質病変は、脳室周囲高濃度（PVH）と深部白質病変（DWMH）の夫々をFazekasスケールによってスコア化した（Fazekas, F. et al., AJR Am J Roentgenol 149, 351-356, doi:10.2214/ajr.149.2.351 (1987)）。CMB、ラクナ病変、及び重度の大脳白質病変の有無は、複数の神経科医で検証した。
(5)サンプルの取得
　急性期脳卒中コホートでは，入院後数日以内に唾液と便のサンプルを採取した。唾液サンプルは、朝（歯磨きや食事の前）に、自己採取キット（OMNIgene-ORAL, OM-501, DNA Geneotek, Canada）又は代替となる採取キット（Salimetric Children's Swab, Salimetrics, LLC.USA）を用いて、製品販売元の提供するプロトコールに従い採取した。糞便サンプルは、排便直後に、採便容器（SARSTEDT AG & Co.KG, Germany）とチオシアン酸グアニジン溶液キット（株式会社テクノスルガ・ラボラトリー、静岡県）を用いて採取した。脳卒中急性期のサンプルは、採取後直ちに-20℃の冷凍庫内で凍結し、その後分注後-80℃のディープフリーザー内で凍結保存した。急性期脳卒中コホートの追跡調査及び健診コホートでは、朝（歯磨きや食事の前）に、唾液サンプルは自己採取キット（OMNIgene-ORAL OM501）を用いて、糞便サンプルはチオシアン酸グアニジン溶液キット（株式会社テクノスルガ研究所，静岡県）を用いて採取した。いずれのサンプルも、採取から1週間以内に研究室まで室温で輸送し、分注後-80℃のディープフリーザー内で凍結保存した。
(6)サンプルからのDNA抽出
　唾液サンプル500 μLと便サンプル約200 mgを氷上で融解した。細菌DNAの抽出は、Qiagen QIAamp PowerFecal Pro DNA Stool Kit（Qiagen、Hilden、Germany）を用いて、製品のプロトコールに従って実施した。DNA抽出時には、RNAの汚染を除去するためにDNase-free RNaseで処理した。抽出した全サンプルから分光光度計（Q5000; Quawell Technology, USA）を用いてDNAを定量した。
(7)細菌DNAの作製
　16S rRNA遺伝子のV1-V2領域を標的とするプライマーセット（27F mod: 5'-AGR GTT TGATCM TGG CTC AG-3'（配列番号59）及び338R: 5'-TGC TGC CTC CCG TAG GAG T-3'（配列番号60）を用いて、イルミナ16Sメタゲノムシーケンスプロトコルに従い、DNAライブラリを作製した。MiSeq Reagent Kit v2 (Illumina)、MiSeqシステム(Illumina, San Diego, CA, USA)で、を用いて250bpペアエンドシーケンスを解析した。
(8)16S rRNAメタゲノム解析
　QIIME 2(version 2021.2及び2022.2)パイプラインを用いて、バイオインフォマティクスによる細菌叢の解析を行った(Callahan, B. J. et al., Nat Methods 13, 581-583, doi:10.1038/nmeth.3869 (2016))。250塩基のペアエンドを持つ61,541本のシーケンスリードの中央値をq2-demuxプラグインで多重化解除し、クオリティフィルタリングを行い、DADA2でノイズ除去を行った（Bolyen, E. et al., Nat Biotechnol 37, 852-857, doi:10.1038/s41587-019-0209-9 (2019)）。クオリティフィルタリング後に、32,953,796個（1サンプル当たり平均72,267個（最小33,481個、最大191,299個））の配列が得られた。全てのアンプリコン配列は、maff (via q2-alignment)でアラインメントし、fasttree2 (via q2-phylogeny)（Price, M. et al., PLoS One 5, e9490, doi:10.1371/journal.pone.0009490 (2010)）を用いて系統樹を構築した。1サンプル当たり10,000配列に希釈した後にq2-diversityを用いて、α多様性指数（種の種類（観察された分類学的特徴）と、Faithの系統的多様性（Faith, D. P. et al., Evol Bioinform Online 2, 121-128 (2007)））及びβ多様性指数（Bray-Curtis非類似度）を推定し、主座標分析（PCoA）を行った。q2-feature-classifierを使用して、Silva 138-参照データベース（Robeson, M. S., 2nd et al. PLoS Comput Biol 17, e1009581, doi:10.1371/journal.pcbi.1009581 (2021).）に登録されている配列に対する同一性99%をカットオフ値として、アンプリコン配列から菌叢解析を行った。PICRUSt2パイプライン（Douglas, G. M. et al., Nat Biotechnol 38, 685-688, doi:10.1038/s41587-020-0548-6 (2020)）におけるアンプリコン配列と存在比を用いて、MetaCycオントロジーに基づくパスウェイ存在比（pathway abundance）を予測した。
(9)α及びβ多様性解析
　細菌叢のα多様性及びβ多様性を解析した。α多様性は、サンプル内での細菌の種類の豊富さに関する指標であり、β多様性は、サンプル間での細菌の違いに関する指標である。細菌叢のα多様性は、種の種類に基づく多様性とFaithの系統的多様性によって評価し、Kruskal-Wallisペアワイズ検定を用いてグループ間で統計的に比較した。細菌叢のβ多様性は、10,000通りのp値を用いて、PERMANOVA(Permutational multivariate analysis of variance)により、細菌叢の構成と細菌叢のパスウェイ存在比の関連性を調査することにより評価した。Bray-Curtis距離に基づいて細菌叢の組成又はパスウェイ存在比の距離の中央値を算出し、Mann-Whitney検定を用いて比較した。
(10)細菌叢の菌組成解析
　以下に示す手法でANCOM（Analysis of composition of microbiomes）解析及びスパース部分最小二乗法判別分析（sPLS-DA）を行い、細菌叢の組成の解析を行った。ANCOM解析では、有病率>20%、属レベルでの存在比>1.0%、及び種レベルでの存在比>0.1%でフィルタリングした分類学的特徴を示すコアマイクロバイオームデータを作成した。コアマイクロバイオームデータを用い、q2-composition（Mandal, S. et al., Microb Ecol Health Dis 26, 27663, doi:10.3402/mehd.v26.27663 (2015).）を用いて脳卒中に関連する特定の微生物を属レベル及び種レベルで同定した。ANCOMの結果は、x軸に中心対数比（CLR）、y軸に帰無仮説への回帰係数を示すW値をとり，ボルケーノプロットで表現した。細菌の識別性を高めるためにsPLS-DAを使用した。種レベルでの相対的存在量は、sPLS-DAの前に正規化（log10スケールでの変換とオートスケーリング）した。三次元スコアは、次元毎（コンポート1～3）に寄与する細菌種を上位10種（loading taxonomies）配値した。MetaCyc オルソロジー用いて異なるサンプルをクラスタリングすることによって予測される機能を説明するために、Wardのクラスタリングに基づいて識別可能な上位50の代謝パスウェイを抽出してヒートマップを作成した。相対的存在量の高いものは赤で、相対的存在量が低いものは青で描かれている。相対的存在量の強度は、Zスケールで0～3までの範囲である。sPLS-DAとヒートマップクラスタリングは、RパッケージのMetaboAnalystツールを用いて計算した（Chong, J. et al., Bioinformatics 34, 4313-4314, doi:10.1093/bioinformatics/bty528 (2018); KA, L. C. et al., BMC Bioinformatics 12, 253, doi:10.1186/1471-2105-12-253 (2011)）。
(11)細菌叢共起ネットワーク解析
　細菌種の相対的存在量はLog10スケールに変換を行い、急性期脳卒中・非脳卒中群間で存在量の異なる細菌種を、Kruskal-Wallisテストに基づいて単変量解析した。存在比率＞20 (%)，平均存在量＞0.1 (%)のものを抽出した。抽出された細菌種間の相関性をSpearmann rank correlationテストを用いて解析し，相関を元にD3 R package (J. J. Allaire, P. Ellis, C. Grandrud, K. Kuo, B. W. Lewis. J. Owen, K. Russell, J. Rogers, C. Sese, C. J. Yetman. (2017) NetworkD3: D3 JavaScript network graphs from R. Last accessed 23 April, 2021.) を用いて計算した。
(12)統計解析
　カテゴリー変数は頻度カウントで記載し、グループ間の比較はカイ二乗検定で解析した。連続パラメトリックデータは、Student t-test又はDunnett t-testを用いて比較した。連続ノンパラメトリックデータは、Mann-Whitney-Wilcoxon検定又はKruskal-Wallis検定で比較した。分類因子としての特定細菌は、感度、特異度、精度、及びReceiver operating characteristic（受信者操作特性）曲線下面積（AUC）を算出することで検討した。単回帰モデルにより、log10（Streptococcus anginosusの相対量）と変数との関係を評価した。データベースの構築とデータ解析には、統計ソフトJMP 15.10 (SAS Institute Inc.,Cary, NC, USA), Graph Pad Prism software (version 9.0; San Diego, California USA)及び R version 4..1.1 を使用した。p値＜0.05を有意とした。
1-2.結果
(1)脳卒中患者と非脳卒中者の選定からサンプル取得
　脳卒中患者787例と非脳卒中者441例の中から、脳卒中患者201例と非脳卒中者60例を選び、それぞれ189例と55例から書面による同意を得て、本研究を実施した。その結果、204例（急性期脳卒中患者：n＝151、追跡期間中の脳卒中患者：n＝46、非脳卒中者：n＝53）から250個の唾液サンプル、160例（急性期脳卒中患者：n＝109、追跡期間中の脳卒中患者：n＝46、非脳卒中者：n＝51）から206個の糞便サンプルを得た（図1及び2）。脳卒中患者と非脳卒中者の統計学的特性について表１及び２に示す。脳卒中患者では、喫煙、高血圧、糖尿病、高脂血症、心房細動等の従来の血管系危険因子が非脳卒中患者に比べ有意に高かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
(2)脳卒中に関連する口腔内細菌叢及び腸内細菌叢の組成変化
　急性期脳卒中患者及び非脳卒中者の腸内細菌叢のα多様性を分析した。種の種類に関するα多様性に関し、急性期脳卒中患者の細菌の種類は、非脳卒中者より有意に少なかったが（p = 0.04）(図3A)、Faithの系統的多様性に関するα多様性については、両者の間で有意な差は認められなかった(p = 0.12)(図3B)。
　急性期脳卒中患者及び非脳卒中者の口腔内細菌叢のα多様性を分析した。Faithの系統的多様性に関するα多様性は、急性期脳卒中患者と非脳卒中者との間で有意な差は認められなかったが（p = 0.79）(図3A)、種の種類に関するα多様性では、急性期脳卒中患者は非脳卒中者よりも有意に高かった（p = 0.79）(図3B)。
　また、急性期脳卒中患者及び非脳卒中者の腸内細菌叢と口腔内細菌叢全体について、Bray-Curtis距離による主座標分析を行った。その結果、急性期脳卒中患者の口内細菌叢、非脳卒中者の口内細菌叢、急性期脳卒中患者の腸内細菌叢、及び非脳卒中者の腸内細菌叢の4つのグループは、統計的に有意な4つのクラスターに分けられた（p値<0.01）（図3C）。非脳卒中者の口内細菌叢及び腸内細菌叢は、急性期脳卒中患者のそれぞれと比較して、非類似であった（図3C）。また、口内細菌叢と腸内細菌叢とのBray-Curtis距離を計算したところ、急性期脳卒中患者における口内細菌叢と腸内細菌叢の非類似度は、急性期脳卒中患者に比べて有意に減少していた（図3D）。
(3)脳卒中患者の病型別での口腔内細菌叢及び腸内細菌叢のα多様性
　急性期脳卒中患者を病型（アテローム性血栓性脳梗塞（n = 20）、心原性脳塞栓症（n = 21）、ラクナ梗塞（n = 16）、脳内出血（n = 25））に分類して、口腔内菌叢及び腸内細菌叢のα多様性を、種の種類に関する指標 (OTU) とFaithの系統的多様性の指標において分析した。その結果、健常人と比較してアテローム血栓性脳梗塞・心原性脳塞栓症・ラクナ梗塞の患者では、口内細菌叢のFaith系統的なα多様性が増加し、OTUの指標においても同様の傾向がみられた（図4A）。また、健常者と比較してアテローム性血栓性脳梗塞の患者では、腸内細菌叢のα多様性がOTU・Faith系統学的な指標のいずれにおいても低下傾向にあったものの有意差はみられなかった（図4B)。
(4)脳卒中患者の病型別での口腔内細菌叢及び腸内細菌叢の解析
　急性期脳卒中患者を病型（アテローム性血栓性脳梗塞、心原性脳塞栓症、ラクナ梗塞、脳内出血）に分類して、口腔内菌叢及び腸内細菌叢における科レベルでの細菌の相対的存在量を、積み上げ棒グラフで表示した。
　腸内細菌叢については、アテローム血栓性脳塞栓症の患者では、レンサ球菌科細菌の相対的存在量の増大；心原性脳塞栓症の患者では、レンサ球菌科細菌の相対的存在量の増大、及びビフィドバクテリア科細菌の相対的存在量の低下；ラクナ梗塞の患者では、レンサ球菌科細菌の相対的存在量の増大、及びプレボテラ科細菌の相対的存在量の低下；脳内出血の患者ではプレボテラ科細菌の相対的存在量の低下が認められた（図5及び表3）。以上の結果から、腸内細菌叢におけるレンサ球菌科細菌の相対的存在量がアテローム血栓性脳塞栓症の検査指標になり得ることが明らかとなった。また、腸内細菌叢におけるレンサ球菌科細菌、及びビフィドバクテリア科細菌の相対的存在量が心原性脳塞栓症の検査指標になり得ることが明らかとなった。また、腸内細菌叢におけるレンサ球菌科細菌及びプレボテラ科細菌の相対的存在量がラクナ梗塞の検査指標になり得ることが明らかとなった。更に、腸内細菌叢におけるプレボテラ科細菌の相対的存在量が脳内出血の検査指標になり得ることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
(5)心原性脳塞栓症におけるビフィドバクテリア科細菌の影響
　腸内細菌叢解析を終了した109名の急性期脳卒中患者のうち心原性脳塞栓症患者21例と心原性脳塞栓症以外87例の2群間で、Student-t検定による二群間の有意差検定(p値)の-log10, 及びFold change (FC)のlog2(FC)を用いてvolcano plotを作成した細菌属の差を解析したところ、ビフィドバクテリウム属細菌の相対的存在量が少ないことが明らかになった。更に、非脳卒中患者51名を合わせた3群間での保有率・相対存在量を比較した結果、心原性脳塞栓症の脳卒中者の腸内細菌叢では、ビフィドバクテリウム属細菌、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム、及びビフィドバクテリウム・ロンガムの相対存在量が低下していることが明らかになった(表4及び5)。なお、本開示において「保有率」とは、各群の全体の人数に対して特定の細菌を保有している者の割合を指す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　なお、ビフィドバクテリウム・ロンガムなどのビフィドバクテリウム属細菌においては、ベータ・グルコシダーゼ依存的にイソフラボンからイヌリン・エクオールを産生する株が存在することが報告されている（Mustafa, S. E. et al., Heliyon 23; 6(10): e05298,(2020)）。
　一方、口腔内細菌叢については、いずれの病型でも、レンサ球菌科細菌の相対的存在量の増大、並びにプレボテラ科細菌及びベイロネラ科細菌の相対的存在量の低下が認められた（図6及び表6）。以上の結果から、口腔内細菌叢におけるレンサ球菌科細菌、プレボテラ科細菌、及びベイロネラ科細菌の相対的存在量が脳卒中の検査指標になり得ることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
(6)脳卒中患者の口腔細菌叢と腸内細菌叢の組成解析
　α多様性解析の結果から、急性期脳卒中患者において、口腔内細菌叢と腸内細菌叢が夫々異なるパターンで変容することが分かった一方、β多様性解析の結果からは、口腔内細菌組成と腸内細菌組成が共通の変容パターンを含む可能性が示唆された。そこで、急性期脳卒中患者の口腔内細菌叢及び腸内細菌叢から、非脳卒中患者と比較して顕著に変化する細菌を特定することを目的とし、細菌叢内におけるグループ間の細菌叢組成の違いを解析するために開発された細菌叢多変量解析（ANOCOM）を用いて検出を実施した。
　その結果、腸内細菌叢に含まれる細菌の属レベルでは、急性期脳卒中患者（n = 109）は、非脳卒中者（n = 51）に比べて、アリスティペス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、ラクトバシラス属細菌、及びアリスティペス属細菌の相対的存在量が多くなっており、フシカテニバクター属細菌、フィーカリバクテリウム属細菌、ドレア属細菌、アナエロティペス属細菌、ルミノコッカス属細菌、及びブチリコッカス属細菌の相対的存在量が少なくなっていた（図7A及び表7及び8）。
　また、腸内細菌叢に含まれる細菌の種レベルでは、急性期脳卒中患者（n = 109）は、非脳卒中者（n = 51）に比べて、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・パラサングイニス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ラクトバシラス・ファーメンタム、クロストリジウム・パーフリンゲンス、及びアリスティペス・プトレディネスの相対的存在量が多くなっており、アナエロテペス・ハドラス、バクテロイデス・プレビウス、アナエロテペス・ハドラス、ルミノコッカス・ビサーキュランス、バクテロイデス・ブルガータス、プレボテラ・コプリ、及びサテレラ・ワズワーステンシスの相対的存在量が少なくなっていた（図7B及び8、表7及び8）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　また、口腔内細菌叢に含まれる細菌の属レベルでは、急性期脳卒中患者（n = 151）は、非脳卒中者（n = 53）に比べて、ポルフィロモナス属細菌、フソバクテリウム属細菌、ストレプトコッカス属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、及びカンピロバクター属細菌の存在量が多くなっており、ナイセリア属細菌、サッカリモナダTM7x属細菌、ヘモフィルス属細菌、及びアロプレボテラ属細菌の存在量が少なくなっていた（図7C、表9及び10）。また、口腔内細菌叢に含まれる細菌の種レベルでは、トレポネーマ・デンティコラ、ストレプトコッカス・クリスタタス、プレボテラ・ロエッシェイイ、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ラクトバシラス・ファーメンタム、ストレプトコッカス・ゴルドニ、ストレプトコッカス・コンステラータス、カンピロバイター・グラシリス、セレノモナス・スプチゲナ、及びタンネレラ・フォーサイシアの存在量が多くなっており、ユウバクテリウム・サルシ、ストレプトコッカス・インファンティス、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ、プレボテラ・ナンセイエンシッス、及びランセフィールデラ・パルブラの存在量が少なくなっていた（図7D及び8、表9及び10）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　以上の結果から、腸内細菌叢におけるアリスティペス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、ラクトバシラス属細菌、アリスティペス属細菌、フシカテニバクター属細菌、フィーカリバクテリウム属細菌、ドレア属細菌、アナエロティペス属細菌、ルミノコッカス属細菌、ブチリコッカス属細菌、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・パラサングイニス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ラクトバシラス・ファーメンタム、クロストリジウム・パーフリンゲンス、アリスティペス・プトレディネス、アナエロテペス・ハドラス、バクテロイデス・プレビウス、アナエロテペス・ハドラス、ルミノコッカス・ビサーキュランス、バクテロイデス・ブルガータス、プレボテラ・コプリ、及びサテレラ・ワズワーステンシスの存在量が、脳卒中の検査指標になり得ることが明らかとなった。
　また、口腔内細菌叢におけるポルフィロモナス属細菌、フソバクテリウム属細菌、ストレプトコッカス属細菌、カプノサイトファーガ属細菌、カンピロバクター属細菌、ナイセリア属細菌、サッカリモナダTM7x属細菌、ヘモフィルス属細菌、アロプレボテラ属細菌、トレポネーマ・デンティコラ、ストレプトコッカス・クリスタタス、プレボテラ・ロエッシェイイ、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ユウバクテリウム・サルシ、ストレプトコッカス・インファンティス、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ、プレボテラ・ナンセイエンシッス、ランセフィールデラ・パルブラ、ラクトバシラス・ファーメンタム、ストレプトコッカス・ゴルドニ、ストレプトコッカス・コンステラータス、カンピロバイター・グラシリス、セレノモナス・スプチゲナ、及びタンネレラ・フォーサイシアの相対的存在量が、脳卒中の検査指標になり得ることが明らかとなった。
　前記の結果から、腸内細菌叢及び口腔内細菌叢の双方において、急性期脳卒中患者では、非脳卒中者に比べて、属レベルでストレプトコッカス属細菌の相対的存在量が多く、種レベルでストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量が多いという特徴が見出された。更に、単変量解析から、腸内細菌叢及び口腔内細菌叢の双方において、急性期脳卒中患者では、非脳卒中者に比べて、ストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量が有意に高かった（図7E）。
　そこで、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの保有の有無との関係から変化する細菌を特定することを目的とし、細菌叢組成の解析（ANOCOM）を行ったところ、ストレプトコッカス・アンギノーサスの保有者では、腸内細菌叢におけるラクトバシラス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、ストレプトコッカス・パラサングイニス、ストレプトコッカス・サリバリウス、及びストレプトコッカス・ミュータンスの存在量の増大が認められ、バクテロイデス・プレビウス及びブチリコッカス属細菌の存在量の低下が認められた（図9）。
　また、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・パラサングイニス、ストレプトコッカス・サリバリウス、及びストレプトコッカス・ミュータンスは、口腔内の常在細菌であり、通常、健常者の腸内細菌叢には存在していないため、脳卒中の患者では、これらの細菌が口腔内から腸内細菌叢に移行し、腸内細菌叢の変容が生じているという特徴が見出された。また、ラクトバシラス・ファーメンタムは、通常、健常者の腸内細菌叢には存在していない。従って、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・パラサングイニス、ストレプトコッカス・サリバリウス、ストレプトコッカス・ミュータンス、及び、ラクトバシラス・ファーメンタムの存在自体が、脳卒中の検査指標になり得ることが明らかとなった。
(7)脳卒中患者の腸内細菌叢と口腔内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの特徴
　ストレプトコッカス・アンギノーサスは、微好気性グラム陽性球菌で、口腔内の常在細菌叢を構成している。急性期脳卒中患者の腸内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサスが検出されたことは、ストレプトコッカス・アンギノーサスが、消化管発がんや動脈硬化の候補として報告された最近のマイクロバイオーム研究と一致する（Coker, O. O. et al., Gut 67, 1024-1032, doi:10.1136/gutjnl-2017-314281 (2018); Jie, Z. et al., Nat Commun 8, 845, doi:10.1038/s41467-017-00900-1 (2017)）。
　そこで、急性期脳卒中患者及び非脳卒中者の腸内細菌叢と口腔内細菌叢のBray-Curtis距離に基づく主座標分析（PCoA）プロットに対して、各細菌種の保有者と非保有者に分けて色付けを行った。その結果、ストレプトコッカス・アンギノーサス保有者の分布パターンのみが、急性期脳卒中患者と類似しており、その他の細菌種の保有者の分布パターンは急性期脳卒中患者と類似するものはなかった（図10及び図11）。定量的に評価を行うため、プロットの中央部に関心領域（図11において点線で囲む楕円領域）を設定し、夫々の細菌の陽性率を比較した(表11)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　次に、スパース部分最小二乗法判別分析（sPLS-DA）を行い、急性期脳卒中患者の口腔内細菌叢・腸内細菌叢、非脳卒中患者の口腔内細菌叢・腸内細菌叢の各4細菌叢のグループ分けに寄与する細菌の検討を行った。その結果、3次元のスコアプロットにより、急性期脳卒中患者と非脳卒中者のそれぞれの腸内細菌叢及び口腔内細菌叢を含む4つの群を分離することができた。更に、急性期脳卒中患者の腸内細菌叢は、Component 1の軸に沿って非脳卒中者のものから負の方向にシフトしており（図12）、その内、ストレプトコッカス・アンギノーサスのみが負の制御因子となっていた。一方、急性期脳卒中患者の口腔内細菌叢は、ストレプトコッカス・アンギノーサスが寄与していないComponent 3の軸に沿って、非脳卒中者のものから正の方向にシフトしていた（図12）。
　Bray-Curtis距離とsPLS-DAの2つの分析結果から、急性期脳卒中患者の腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの存在が、腸内細菌叢の口腔内細菌叢化に強く関連している可能性があることが確認された。更に、前述の通り、ストレプトコッカス・アンギノーサスは、本来、口腔内の常在細菌であることから、脳卒中患者では、ストレプトコッカス・アンギノーサスが口腔内から腸内に移行し、腸内細菌叢の変容に寄与することが分かった。
　そこで、ストレプトコッカス・アンギノーサスの有無によって、口内のアナエロテペス・ハドラス、バクテロイデス・プレビウスの相対的存在量、腸内のトレポネーマ・デンティコラ、ストレプトコッカス・クリスタタス、プレボテラ・ロエッシェイイ、ユウバクテリウム・サルシ、ストレプトコッカス・インファンティス、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ、プレボテラ・ナンセイエンシッス、及びランセフィールデラ・パルブラの相対的存在量が関連性をもって変動するかを2群間の単変量解析により検討した(図13及び表12)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　ストレプトコッカス・アンギノーサスの有無による夫々の口腔内・腸内細菌叢の相対的存在量の解析から、ストレプトコッカス・アンギノーサスが存在することで、腸内ではバクテロイデス・プレビウスが抑制され、口腔内では、ユウバクテリウム・サルシ、ストレプトコッカス・インファンティス、及びプレボテラ・ナンセイエンシッスが抑制される一方、ストレプトコッカス・クリスタタス及びトレポネーマ・デンティコラは増加する関係性にあることが分かった。
　このような異なる細菌種間の複雑な関連性を理解するためにネットワーク解析図を作成した結果、口腔内及び腸内細菌叢内において、急性期脳卒中及び非脳卒中の各グループ内で、複数の細菌種が相互に促進的なコミュニティを形成していることがわかった。具体的には、急性期脳卒中の口腔内細菌叢においてストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ラクトバシラス・ファーメンタム、ストレプトコッカス・ゴルドニ、ストレプトコッカス・コンステラータス、トレポネーマ・デンティコラ、プレボテラ・ロエッシェイイ、カンピロバイター・グラシリス、セレノモナス‐スプチゲナ、ストレプトコッカス・クリスタタス、及びタンネレラ・フォーサイシアの11菌種；非脳卒中の口腔内細菌叢において、ストレプトコッカス・インファンティス、ユウバクテリウム・サルシ、及びプレボテラ・ナンセイエンシッス、TM7の4菌種；急性期脳卒中の腸内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ラクトバシラス・ファーメンタム、及びバクテロイデス・フラジェリスの4菌種；非脳卒中の腸内細菌叢において、アナエロテペス・ハドラス、バクテロイデス・プレビウス、サテレラ・ワズワーステンシス、プレボテラ・コプリ、ユウバクテリウム・レクタル、及びダイアリスター・インビサスの4菌種がコミュニティを形成していることが分かった。特に、ストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ミュータンス、及びラクトバシラス・ファーメンタムの3菌種は、急性期脳卒中患者において、口腔内細菌叢及び腸内細菌叢のいずれにおいてもコミュニティの中枢を形成していることが分かった。更に、腸内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサスは、これらの急性期脳卒中関連の細菌種と促進的な関係にある一方で、非脳卒中に関連する細菌種とは抑制的な関係にあり、コミュニティ間のハブにあたることが分かった（図14、表13、及び表14）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
(8)脳卒中患者における口腔内細菌叢及び腸内細菌叢の機能的代謝プロファイル
　以上の結果から、ストレプトコッカス・アンギノーサスによって引き起こされる腸内細菌叢の変容が脳卒中に伴うディスバイオシスと関連していることが確認された。腸内細菌叢の変容に関連する代謝経路を予測するために、PICRUSt2による予測メタゲノム解析を行った。
　口腔内細菌叢と腸内細菌叢のMetaCycパスウェイ存在量のBray-Curtis距離に基づく主座標分析では、口腔内細菌叢と腸内細菌叢でそれぞれ特有のクラスターを示したが、急性期脳卒中患者では、非脳卒中者に比べて、口腔内細菌叢と腸内細菌叢が類似する方向にシフトすることが分かった（図15A及びB)。
　急性期脳卒中患者と非脳卒中者のそれぞれ口腔内細菌叢と腸内細菌叢の4つのグループを区別できる上位50位のMetaCycパスウェイを示すヒートマップを作成した（図15C）。急性期脳卒中患者の口腔内細菌叢及び腸内細菌叢では、非脳卒中患者と比較して、解糖系経路及び乳酸発酵経路の占める割合が増加、糖新生経路の占める割合は減少していた（図16D～F）。乳酸発酵経路は、ストレプトコッカス属細菌のみならずラクノバシルス属細菌、ラクノコッカス属細菌、ビフィドバクテリウム属細菌に広くみられる代謝経路であり、予測メタゲノム解析の結果は、急性期脳卒中患者の腸内細菌叢においてストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量が多く、それに伴うストレプトコッカス・パラサングイニス、ストレプトコッカス・サリバリウス、及びストレプトコッカス・ミュータンス等のストレプトコッカス属細菌種、ラクノバシルス・ファーメンタムの腸内細菌叢内での増加と関連する結果と考えた。また、腸内における分岐鎖脂肪酸の生合成経路が低下していることが、食物繊維の分解や酪酸産生に関わるプレボテラ・コプリ、アナエロテペス・ハドラス、ユウバイクテリウム・レクタル等の細菌群の抑制を反映する結果と考えた。急性期脳卒中患では、腸内細菌叢でホスファチジルグリセロール生合成経路が占める割合が低下、口腔内細菌叢でペプチドグリカン生合成経路が増加している点も細菌叢変容により生じる代謝経路の変化と考えられた（図15C及び表15）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
(9)腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量と脳卒中の重症度及び予後との関係
　次に、ストレプトコッカス・アンギノーサスによって調節される腸内細菌叢の変容の臨床的意義について検討した。先ず、ストレプトコッカス・アンギノーサスと生活習慣病の関係を評価した。その結果、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量には、喫煙、高血圧、糖尿病及び高脂血症の有無、併用薬の有無による有意差は認められなかった（図16a～g）。また、急性期脳卒中患者において、ボディマス指数、平均血圧、年齢、ヘモグロビンA1c、LDLコレステロール、トリグリセリド、HDLコレステロール、及び総コレステロールは、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量との相関は認められなかった（図17A～I）。
　また、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの存在は、年齢、性別、及び血管系危険因子（喫煙、高血圧、糖尿病、高脂血症）で調整しても、脳卒中と関連していた（調整オッズ比（95％信頼区間：CI）3.66 (1.44-9.76), p<0.01)(表14のモデル２)。更に、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの存在は、年齢、性別、血管系危険因子、及び主要細菌（アナエロテペス・ハドラス、バクテロイデス・プレビウス）で調整しても、脳卒中と関連性が認められた（調整オッズ比 (95% CI) 4.48(1.51-14.78), p<0.01)(表16のモデル３)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
　また、血管系危険因子（年齢、性別、喫煙、高血圧、糖尿病、高脂血症）、及び腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス、アナエロテペス・ハドラス、及びバクテロイデス・プレビウスの相対的存在量を用いて、急性期脳卒中患者と非脳卒中者を区別するROC曲線を作成した。その結果、血管系危険因子を単独で使用した場合に比べて、血管系危険因子と腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量を使用した場合、及び血管系危険因子と３種の細菌（腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスのアナエロテペス・ハドラス、バクテロイデス・プレビウス）の相対的存在量を使用した場合に、急性期脳卒中患者と非脳卒中者の識別性が向上することが確認された（図18A）。ROC曲線下面積（95％CI）は、血管系危険因子単独の場合で0.87（0.80 - 0.93）、血管系危険因子と腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量を使用した場合で0.89（0.83 - 0.95）、血管系危険因子と３種の細菌を使用した場合で0.93（0.88 - 0.98）であった。
　次に、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量が脳卒中の重症度に及ぼす影響を評価した。その結果、入院時のNIHSSスコアは、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量と有意な相関が認められた（p = 0.03）（図18B）。即ち、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量は、脳卒中患者の重症度の検査指標にもなり得ることが分かった。
　更に、脳卒中発症後の腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量の動的変化を評価した。その結果、初発患者では、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量は、急性期と慢性期（追跡期間中）との間に有意な変化は認められなかった（p = 0.77）（図18C、表17）。一方、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量は、急性期脳卒中の初発患者に比べ，急性期脳卒中の再発患者で僅かに多く検出された（p=0.11）（図18D、表18）。即ち、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量は、脳卒中患者の予後（再発リスク）の予測の指標にもなり得ることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
　次に、脳卒中急性期における腸内細菌叢のストレプトコッカス・アンギノーサスの保有の有無と予後の複合イベントとの関連について評価した。診療録の記載から2年間の外来診療記録を調べ、全死亡又は主要血管イベント（虚血性脳卒中、出血性脳卒中、心筋梗塞、心不全増悪、又は末梢血管閉塞）のいずれかを認めた時点を複合イベント有りとした。
　脳卒中患者を脳卒中急性期（登録時）の腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス検出の有無に分けて、2年間の複合イベントの結果をKaplan-Meire曲線で描出し、log-rankテストを用いて比較した。その結果、腸内細菌叢内にストレプトコッカス・アンギノーサスが検出された脳卒中患者では、検出されない群と比較して、有意に複合イベントの罹患率が高かった（p = 0.04; log rank試験）（図19）。即ち、本結果から、腸内細菌叢においてストレプトコッカス・アンギノーサスを保有している脳卒中患者は、相対的に予後が悪く、全死亡又は主要血管イベントが生じるリスクが相対的に高いことが分かった。
　次に、ネットワーク解析で明らかにした腸内細菌叢の脳卒中・非脳卒中に関連する細菌種の相対的存在量をもとに、CLR: centered log ratioによる標準化数値を算出し入院時NIHSSスコア及び血管危険因子(年齢・BMI・平均血圧値・LDLコレステロール・ヘモグロビンA1c・CRP・BNP)と、腸内で重要となる細菌種との相関性を網羅的に解析したところ、アナエロテペス・ハドラス、バクテロイデス・プレビウス、プレボテラ・コプリ、及びユウバクテリウム・レクタルの標準化した相対存在量の低下とNIHSSの増加が有意に逆相関の関係にあることが分かった。さらに、血管危険因子のうち、加齢とラクトバシラス・ファーメンタムが相関関係に、平均血圧とバクテロイデス・プレビウス、サテレラ・ワズワーステンシス相関関係に、HgA1cとラクトバシラス・ファーメンタムが相関関係に、CRPとラクトバシラス・ファーメンタムが相関関係・アナエロテペス・ハドラスが逆相関関係に、BNPとバクテロイデス・プレビウスに逆相関の関係にあることが分かった（図20及び表19）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000026
　脳卒中においては、病型によって重症度が異なることから急性期脳卒中患者の脳卒中病型（アテローム血栓性脳梗塞、心原性脳塞栓症、ラクナ梗塞、脳内出血）毎のNIHSSスコアの値を比較した結果（図21、22）、脳内出血に重症症例が多いことが分かった（表20）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000027
　そこで、急性期脳卒中患者を病型（アテローム血栓性脳梗塞、心原性脳塞栓症ラクナ梗塞、脳内出血）に分類して、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ラクトバシラス・ファーメンタム、バクテロイデス・フラジェリス、アナエロテペス・ハドラス、バクテロイデス・プレビウス、サテレラ・ワズワーステンシス、プレボテラ・コプリ、ユウバクテリウム・レクタル、及びダイアリスター・インビサスの相対的存在量を分析した（図23及び表21）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000028
　その結果、急性期脳卒中患者の各病型(アテローム性血栓性脳梗塞、心原性脳塞栓症、ラクナ梗塞、脳内出血)に共通して、腸内におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの相対的存在量の増加および、アナエロテペス・ハドラス、バクテロイデス・プレビウスの相対的存在量の減少を認め、その変動が特に脳内出血で顕著であった。
　一方で、非脳卒中者と比較し、心原性脳塞栓症の患者ではバクテロイデス・フラジェリス、ラクトバシラス・ファーメンタム及びストレプトコッカス・ミュータンスの相対的存在量の増加が、脳内出血ではユウバクテリウム・レクタル及びダイアリスター・インビサスの相対的存在量の低下が、ラクナ梗塞ではサテレラ・ワズワーステンシスの相対的存在量の低下、アテローム血栓性脳塞栓症ではストレプトコッカス・ミュータンスの相対的存在量の増加が見られた。
　また、脳卒中のバイオマーカーとして知られるMRI所見と腸内細菌叢中のストレプトコッカス・アンギノーサスとの関係について検討した。具体的には、急性期脳卒中患者の脳MRI所見に基づく脳小血管病のバイオマーカーと腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサスの陽性率を調べた。その結果、腸内細菌叢にストレプトコッカス・アンギノーサスが存在する急性期脳卒中患者は、腸内細菌叢にストレプトコッカス・アンギノーサスが存在しない患者に比べて、脳室周囲病変、深部皮質下白質病変、及び脳微小出血の検出率の割合が有意に高かったが、ラクナ病変の検出率には有意差がなかった（図24A～D）。
　さらに、同様に脳MRI所見に基づく微小血管病のバイオマーカーと腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ラクトバシラス・ファーメンタム、バクテロイデス・フラジェリス、アナエロテペス・ハドラス、バクテロイデス・プレビウス、サテレラ・ワズワーステンシス、プレボテラ・コプリ、ユウバクテリウム・レクタル、及びダイアリスター・インビサスの保有率を分析した（表22）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000029
　その結果、大脳白質病変(脳室周囲高信号域およ深部皮質下白質病変)が重度である脳卒中患者では、腸内細菌叢におけるラクトバシラス・ファーメンタムおよびストレプトコッカス・アンギノーサスの保有率が有意に高いことが分かった。ラクナ病巣を有する脳卒中患者では、腸内細菌叢におけるバクテロイデス・フラジェリスの保有率が低くダイアリスター・インビサスの保有率が高くなる傾向があることが分かった。また、脳微小出血を有する脳卒中患者では、腸内細菌叢におけるユウバクテリウム・レクタル及びストレプトコッカス・アンギノーサスの保有率が有意に高いことが分かった（表22）。
　この結果、脳卒中患者において口腔・腸内細菌叢において共通して増加するストレプトコッカス・アンギノーサス及びラクトバシラス・ファーメンタムは、脳MRIにおける脳小血管病バイオマーカーのうち大脳白質病変の重症度にも関連している可能性が示唆された。
　そこで、重症の大脳白質病変へのストレプトコッカス・アンギノーサス、ストレプトコッカス・ミュータンス、ラクトバシラス・ファーメンタム、バクテロイデス・フラジェリス、アナエロテペス・ハドラス、バクテロイデス・プレビウス、サテレラ・ワズワーステンシス、プレボテラ・コプリ、ユウバクテリウム・レクタル、及びダイアリスター・インビサス保有を多重ロジスティック回帰分析し調節オッズ比を分析し(表23)、さらに、年齢・性別での調節(モデル１)(表24)、年齢・性別・喫煙・高血圧・糖尿病・脂質異常症による調節（モデル２）(表25)を行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000030
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000031
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000032
　多重ロジスティック解析の結果、大脳白質病変の重篤化に、加齢・ストレプトコッカス・アンギノーサスの保有が有意に関連し、さらに深部皮質白質下病変ではラクトバシラス・ファーメンタムの保有も有意に関連することが分かった。その結果、これらの口内細菌の腸内移行が、脳卒中のみではなく慢性的な虚血性変化にも関連するバイオマーカーであることが示唆された。
　そこで、重症の大脳白質病変の有無及び段階的な大脳白質病変の変化と、腸内細菌叢へと移行する代表的な口内細菌であるラクトバシラス・ファーメンタム、ストレプトコッカス・アンギノーサス、及びストレプトコッカス・ミュータンスの相対的存在量との関連を、各群間のMann-Whiteny U test(図25、表26、表28)、Kruskal-Wallis rank sum test(表27)(表29)及びJonckheere Terpstra傾向検定で解析した(表30)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000033
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000034
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000037
　この結果、代表的な口内の常在細菌であるストレプトコッカス・アンギノーサスの腸内細菌叢への移行が、多変量解析において独立して重度の大脳白質病変に関連するのみではなく、腸内細菌叢に占めるストレプトコッカス・アンギノーサスの比率が白質病変の重症度と相関する傾向にあることが明らかになった。
(10)サルコペニアサルコペニア併発脳卒中と腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・ミュータンスの相対的存在量との関係
　非脳卒中者（サルコペニアの罹患なし）（n = 51）、サルコペニアを併発している脳卒中者（n = 20）、及びサルコペニアを併発していない脳卒中者（n = 74）を対象として、腸内細菌叢組成を分析し、t検定による二群間の有意差検定(p値)の-log10, 及びFold change (FC)のlog2(FC)を用いてvolcano plotを作成した。その結果、サルコペニアを併発している脳卒中者では、非脳卒中者及びサルコペニアを併発していない脳卒中者に比べて、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・ミュータンス、及びクロストリジウム・パーフリンゲンスの保有率が高く、ブチリコッカス属細菌、バクテロイデス・ブルガータス、ルミノコッカス・トルク、及びプレボテラ・コプリの保有率が低いことが分かった(図26A、表31)。また、サルコペニアを併発している脳卒中者では、サルコペニアを併発していない脳卒中者に比べて、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・パラサングイニス、アリスティペス・プトレディネス及びベイオネラ属細菌の保有率が高いことが分かった(図26A、表31)。
　また、サルコペニアを併発している脳卒中者とサルコペニアを併発していない脳卒中者の腸内細菌叢において、サルコペニア併発との関係から変化する細菌を特定することを目的とし、細菌叢組成の解析（ANOCOM）を行った。その結果、サルコペニアを併発している脳卒中者では、非脳卒中者及びサルコペニアを併発していない脳卒中者に比べて、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・パラサングイニス、クロストリジウム・パーフリンゲンス、及びアリスティペス・プトレディネスの相対的存在量が高く、ブチリコッカス属細菌、バクテロイデス・ブルガータス、ルミノコッカス・トルク、及びプレボテラ・コプリの相対的存在量が低いことが分かった(図26B～F及びH～J、表32)。また、サルコペニアを併発している脳卒中者では、サルコペニアを併発していない脳卒中者に比べて、腸内細菌叢におけるベイオネラ属細菌の相対的存在量が高いことが分かった(図26G、表32)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000039
　以上の結果から、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・ミュータンス、ストレプトコッカス・パラサングイニス、クロストリジウム・パーフリンゲンス、アリスティペス・プトレディネス、ベイオネラ属細菌、ブチリコッカス属細菌、バクテロイデス・ブルガータス、ルミノコッカス・トルク、及びプレボテラ・コプリの相対的存在量が、脳卒中患者におけるサルコペニア併発の検査指標になり得ることが明らかとなった。
2. 腸内細菌叢による代謝物質であるエクオールに係る検討
2-1.試験方法
(1)エクオール産生者と非産生者の脳卒中病型別での検討
　NCVCにおいて、2019年9月から2021年10月までに入院診療を受けた脳卒中患者と、2016年11月から2018年9月までに血清エクオール濃度を測定した健常者を対象とし、単施設観察研究を実施した。研究は、ヘルシンキ宣言に基づいて、国立循環器病研究センターの研究倫理審査会の承認の下で行った（承認番号はR21044）。脳卒中患者の選択基準は、(i)国立循環器病研究センターバイオバンクで同意して血清が保存されている患者、(ii) ラクナ梗塞、アテローム血栓性脳梗塞、心原性脳塞栓症、塞栓源不明脳塞栓症、脳内出血、その他の原因による脳梗塞で入院した脳卒中患者とした。除外基準は、(i) 悪性腫瘍罹患患者、(ii) バイオバンク採血時に24時間以上の絶食期間があった患者、(iii) 脳卒中発症して6か月以上経過してからバイオバンク採血が行われた患者とした。また、退院時mRSが0～2の患者を予後良好として分類し、各群の全患者数に対する予後良好な患者の割合を予後良好割合(%)として算出した。
(2)血液検査
　本試験においては、脳卒中患者の血清中のエクオール、ダイゼイン、及びゲニステインの各濃度を液体クロマトグラフィー質量分析法（LC-MS）によって測定した。血清中エクオール濃度が1 ng/mL未満の患者を非産生者、血清中エクオール濃度が1 ng/mL以上の患者を産生者と定義した。
2-2.結果
　健常者及び脳卒中患者におけるエクオール産生者/非産生者の統計学的特性を表33に示す。なお、健常者のmRSは0とする。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
　健常者及び脳卒中病型別の脳卒中患者について、エクオール産生者の割合と、ダイゼイン、ゲニステインの血清含有量を表34及び図27に示す。脳梗塞患者におけるエクオール産生者/非産生者の統計学的特性を表35に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000042
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000043
　心原性脳塞栓症患者は、健常者と比較して、エクオール産生者は有意な割合で低下していた(p = 0.037)。さらに脳卒中病型別（心原性脳塞栓症、ラクナ梗塞、塞栓源不明脳塞栓症、脳内出血、その他の原因）で比較したところ、心原性脳塞栓症患者及びアテローム血栓性脳梗塞患者は、エクオール産生者は有意な割合で低下していた。また、エクオール産生者は、脳卒中発症時の重症度（National Institute of Health Stroke Scale [NIHSS]）が非産生者と比較して有意に軽症であった。更に、脳梗塞患者（心原性脳塞栓症、アテローム血栓性脳梗塞、心原性脳塞栓症、塞栓源不明脳塞栓症）の中で、エクオール産生者の退院時の機能予後は有意に軽症であった。
　さらに、心原性脳塞栓症の主な要因である心房細動保有者は、脳梗塞患者のなかでエクオール産生者は有意な割合で低下していた（心房細動保有者：26.7%、非保有者：47.3%、p = 0.043）。
　以上の結果から、血液サンプル中のエクオール濃度は、脳卒中病型別の発症リスクの検査指標、特に、エクオール非産生者であることは、心原性脳塞栓症、アテローム血栓性脳梗塞、及び心房細動の発症リスクの検査指標になり得ることが示された。また、血液サンプル中のエクオール濃度は、脳卒中の重症化リスクの検査指標になり得ることが示され、更に、脳卒中の機能予後の検査指標になり得ることが示された。
　上述の通り、血清エクオール濃度と脳卒中及び心房細動との関連性が示されたが、エクオールを体内で産生するためには、エクオール産生菌が必要である。エクオール産生菌は大豆イソフラボンの一種であるダイゼインやゲニステイン等を基質としてエクオールを産生することが知られている。エクオール産生菌の保有者は日本人では、30～50％と言われており、全ての者が体内でエクオールを産生できるわけではない。
　ここで、前記の通り、本実施例において、急性期脳卒中患者のうち、心原性脳塞栓症患者において、エクオール産生菌として知られるビフィドバクテリウム属細菌の相対的存在量が少ないことが確認されている。特に、ビフィドバクテリウム属細菌のうち、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム、ビフィドバクテリウム・ロンガムが心原性脳塞栓症に主に影響する可能性が示された。
　前記の通り、本実施例において、心原性脳塞栓症患者群では、エクオール産生者に比べ、エクオール非産生者が有意に多いことが確認されている。即ち、本開示に示す結果から、エクオール自体、又はビフィドバクテリウム属細菌等のエクオール産生促進物質が、心原性脳塞栓症の予防又治療剤として利用できる可能性が示された。
　本実施例において、エクオール非産生者で入院時NIHSSが有意に高値であることが確認されている。即ち、本開示に示す結果から、エクオール自体、又はビフィドバクテリウム属細菌等のエクオール産生促進物質が、脳卒中の重症化予防剤として利用できる可能性が示された。
　本実施例において、エクオール非産生者で退院時mRSが有意に高値であることが確認されている。即ち、本開示に示す結果から、エクオール自体、又はビフィドバクテリウム属細菌等のエクオール産生促進物質が、脳卒中（特に脳梗塞）の機能予後の悪化抑制剤として利用できる可能性が示された。
3. 脳卒中易発症性自然高血圧発症モデルラットを用いた抗菌薬の効果検討(1)
3-1.試験材料及び試験方法
　脳卒中易発症性自然高血圧発症モデルラット（Stroke prone spontaneously hypertensive rats； SP-SHR/Izm、雄)（以下、SHRSP）をCLEA（東京、日本）から購入した。SP-SHR/Izmは、食塩の負荷により高血圧症を発症し、脳卒中を自然発症するモデルラットである。本試験は、国立循環器病研究センター（NCVC；吹田市、日本）の動物実験計画承認（Approval number 21068）の下で、SPF環境で実施した。
　70日齢のSHRSPを表36に示す3群に分けて表36に示す条件で飼育し、アウトカムを死亡イベントとして、生存期間を観察した（図28A）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
3-2.結果
　各群における生存期間をKaplan-Meire曲線を描出し、結果をlog rank testにより評価した（図28B）。1%食塩水を摂取させた群（Ｂ群）では、水を摂取させた群（Ａ群）と比較して有意な生存期間の短縮（p<0.001; log rank試験）が確認された。一方、抗生物質を含む1%食塩水を摂取させた（Ｃ群）では、1%食塩水を摂取させた群（Ｂ群）に比較して有意な生存期間の延長効果が確認できた（p<0.001; log rank試験）。
　また、各群における生存期間の中央値（IQR）を表37に示す。各群の生存期間の中央値をDunn's多変量解析で比較した結果、Ａ群とＢ群との間では統計学的有意差が認められ(p<0.001)、Ａ群とＣ群との間並びにＢ群とＣ群との間では統計学的には差がある傾向が見られたものの、有意差は認められなかった(p=0.15)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
　以上の結果から、抗生物質の投与によってSHRSPの生存期間を延長できることが確認され、抗生物質の投与が脳卒中の予防又は治療に有効であることが示唆された。
4. 脳卒中易発症性自然高血圧発症モデルラットを用いた抗菌薬の効果検討(2)
4-1.試験材料及び試験方法
(1)飼育条件
　CLEA（東京、日本）から購入したSHRSP（雄）を使用した。本試験も、国立循環器病研究センター（NCVC；吹田市、日本）の動物実験計画承認（Approval number 21068）の下で、SPF環境で実施した。
　70日齢のSHRSPを表38に示す3群に分けて表38に示す条件で飼育し、経時的に体重の測定及び神経症状の観察を行い、105日齢（飼育から35日後）の時点で、安楽死処理した（図29A）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
(2)体重の測定
　49日齢から84日齢までの体重の変化を経時的に測定した。
(3)神経麻痺症状の評価
　既存のラットにおける神経麻痺症状の評価方法に従い、神経麻痺症状（運動量の減少、歩行、前肢の持ち上げ動作、横転、及び後肢麻痺）の有無を評価した(Nagaoka A, et al. Arch Gerontol Geriatr 8, 203-212 (1989))。
(4)脳出血の病理学的検査
　安楽死処理後の脳をサンプリングし、4% ホルムアルデヒドで2日固定した後、Bregma(十字縫合)、3mm(尾側)、3mm(尾側)、及び6mm(尾側)の計4断面を作成し、パラフィン包埋し、薄切切片を作成した。ヘマトキシリン・エオジン染色及びマッソントリクローム染色を行い、顕教により脳血管から脳実質内への赤血球の漏出（脳内出血）部位を同定した。
4-2.結果
(1)体重の測定結果
　49日齢から84日齢までの体重の変化を経時的に測定した結果、各群間では経時的な体重の増加に有意な差は見られなかった（図29B）。
(2)神経麻痺症状の評価結果
　脳卒中に関連してみられる神経脱落所見（麻痺症状）の累積出現率を評価し、各群間で比較した結果、Kaplan-Meire曲線において、1%食塩水を摂取させた群（Ｂ群）では、水を摂取させた群（Ａ群）と比較して麻痺症状出現率が高い傾向（p=0.16; log rank試験）が確認された（図29C）。一方、抗生物質を含む1%食塩水を摂取させた（Ｃ群）では、1%食塩水を摂取させた群（Ｂ群）に比較して麻痺症状出現率が高い傾向が確認できた（p=0.16; log rank）（図29C）。
(3)脳出血の病理学的検査の結果
　脳病理組織を用いて、各群間で、脳内出血を比較した結果、、1%食塩水を摂取させた群（Ｂ群）では、水を摂取させた群（Ａ群）と比較して脳出血の検出率が低い傾向（3/8 vs 0/4, p=0.16; カイ二乗検定）が確認された（図29D）。抗生物質を含む1%食塩水を摂取させた（Ｃ群）でも、1%食塩水を摂取させた群（Ｂ群）に比較して脳出血の検出率が低い傾向であった（3/8 vs 0/4; p=0.16; カイ二乗検定）（図29D）。
　以上の結果から、抗生物質の投与によってSHRSPの脳卒中の症状の発現を抑制できることが確認され、抗生物質の投与が脳卒中の予防又は治療に有効であることが示唆された。
5. 脳卒中易発症性自然高血圧発症モデルラットを用いた抗菌薬の効果検討(3)
5-1.試験材料及び試験方法
(1)飼育条件
　CLEA（東京、日本）から購入したSHRSP（雄）を使用した。本試験も、国立循環器病研究センター（NCVC；吹田市、日本）の動物実験計画承認（Approval number 21068）の下で、SPF環境で実施した。
　70日齢のSHRSPを表39に示す4群に分けて表39に示す条件で飼育し、105日齢（飼育から35日後）の時点で、安楽死処理した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000047
(2)脳血管構造の解析
　安楽死処理後の脳をサンプリングし、4% ホルムアルデヒドで2日固定した後、Bregma(十字縫合)、3mm(尾側)、3mm(尾側)、及び6mm(尾側)の計4断面を作成し、パラフィン包埋し、薄切切片を作成した。ヘマトキシリン・エオジン染色及びマッソントリクローム染色を行い、脳内細動脈における血管壁厚(μm)を計測した。血管壁厚は、１匹の脳病理スライドから50か所以上の血管壁厚を測定し平均値を算出することにより求めた。また、測定血管の血管径（短径）も求めた。
(3)心臓内血管構造の解析
　安楽死処理後の心臓をサンプリングし、4% ホルムアルデヒドで2日固定した後、心臓の短軸断面を切り出し、パラフィン包埋後、薄切切片を作成した。ヘマトキシリン・エオジン染色及びマッソントリクローム染色を行い、心臓実質内の血管径が50-100μmの細動脈を選択して撮像した。FIJI, Image Jを用いて、血管狭窄度（血管内腔面積/血管外径面積*100）を算出し、定量評価した。１匹毎4箇所以上の細動脈を評価し、各群における血管狭窄度の中央値を比較した。
(4)腎細動脈構造の解析
　安楽死処理後の腎臓をサンプリングし、4% ホルムアルデヒドで2日固定した後、腎臓の短軸断面を切り出し、パラフィン包埋し、薄切切片を作成した。ヘマトキシリン・エオジン染色及びマッソントリクローム染色を行って顕教することにより、腎糸球体構造・輸入細動脈を同定した。輸入細動脈及びボウマン嚢（近位尿細管）が200μmの正方形に収まる像を選択して、糸球体の断面積が7000～11000 μm2となる条件下で、可視的に、腎輸入細動脈について、閉塞血管、高度狭窄血管、又は開存血管（正常～中等度狭窄）に分類した。１匹につき50箇所以上の糸球体輸入細動脈を評価し、全体に占める閉塞血管・高度狭窄血管・開存血管の頻度を比較した。
(5)小腸構造の解析
　安楽死処理後の腎臓をサンプリングし、腸管(小腸)をサンプリングして腸管ロールを作成して4% ホルムアルデヒドで2日固定した後、パラフィン包埋し、薄切切片を作成した。ヘマトキシリン・エオジン染色及びマッソントリクローム染色を行った。Aperio Image Scope V12.4.6.5003を使用して、腸壁断面（横幅1000 μm）における小腸絨毛、小腸粘膜下線維層及び小腸粘膜下筋層の断面長を10箇所測定した。１匹毎3断面を測定し、平均を1 plotとして計測した。
5-2.結果
(1)脳血管構造の解析結果
　食塩水を摂取させた群（Ｃ群）では、水のみを摂取させた群（Ａ群）に比べて、動脈硬化を示唆する壁肥厚の傾向が見られた（A vs C p = 0.08, Holm Sidak multiple comparison test）（表40、図30A）。一方、抗生物質を含む食塩水を摂取させた（Ｄ群）では、食塩水を摂取させた群（Ｃ群）と比較して有意な壁肥厚の軽減が認められた（C vs B, p<0.01; C vs D; p<0.001）（表40、図30A）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000048
　また、血管径（短径）と血管壁厚を散分図にプロットしたところ、食塩水を摂取させた群（Ｃ群）のみで血管壁の肥厚が進行した血管が多く認められることが可視的に分かった（図30B）。さらに、血管壁の肥厚と血管拡張が相関して進行していることも確認できた（図30B）。
(2)心臓内血管構造の解析結果
　食塩水を摂取させた群（Ｃ群）では、血管狭窄度が高く、心臓内血管の求心性中膜肥厚を悪化させていた（表41、図30C,D）。一方、抗生物質を含む食塩水を摂取させた（Ｄ群）では、血管狭窄度が低く抑えられており、食塩水負荷群による心臓内血管の求心性肥厚を改善していた（表41、図30C,D）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000049
(3)腎細動脈構造の解析結果
　食塩水を摂取させた群（Ｃ群）では、腎臓において腎糸球体への輸入細動脈の閉塞率が増加していた（図31A）。一方、抗生物質を含む食塩水を摂取させた（Ｄ群）では、閉塞血管の比率が低下しており、食塩水負荷による輸入細動脈の閉塞が改善されていた（図31A）。
(4)小腸構造の解析結果
　食塩水を摂取させた群（Ｃ群）では、小腸壁内の線維化を悪化させていた（表42、図31B）。一方、抗生物質を含む食塩水を摂取させた（Ｄ群）では、食塩水負荷による小腸壁内の線維化を改善できていた（表42、図31B）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000050
6. 脳卒中易発症性自然高血圧発症モデルラットを用いた抗菌薬が腸内菌叢に及ぼす影響の検討
6-1.試験材料及び試験方法
(1)飼育条件
　CLEA（東京、日本）から購入したSHRSP（雄）を使用した。本試験も、国立循環器病研究センター（NCVC；吹田市、日本）の動物実験計画承認（Approval number 21068）の下で、SPF環境で実施した。
　63日齢のSHRSPに、ラット標準食（Funahashi SP diet）及び水を自由摂取させて7日間飼育した。その後、70日齢になったSHRSPを表43に示す3群に分けて表43に示す条件で14日間飼育した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000051
(2)腸内菌叢の解析
　63日齢(開始時)及び84日齢（終了時）に糞便を回収し、細菌由来のＤＮＡの抽出、16rRNA細菌叢解析を行った。
6-2.試験結果
　各群の84日齢の糞便サンプルを元に、16SrRNAのデータを作成し、腸内細菌叢のα多様性(Observed taxonomic features)の比較・解析を行った。その結果、各群間で、腸内細菌叢のα多様性に有意な差は認めなかった（表44、図32A）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000052
　各群の84日齢の糞便サンプルから16SrRNAのデータを作成し、Level7(種レベル)の情報を元に、部分的最小二乗回帰（sPLS-DA）解析によりクラスタリングを実施した。その結果、sPLS-DAによるクラスタリングでは各群における細菌叢の特徴が分かれることが分かった（図32B）。
　更に、水を摂取させた群（Ａ群）と食塩水を摂取させた群（Ｂ群）について、84日齢の糞便サンプルの比較を行った。「Ｂ群における各細菌の相対的保有量/Ａ群における相対的保有量」をFold change(FC)として算出し、各群間におけるANOVA検定の値をp値として算出した。p値の-log10の値及びFold change (FC)のlog2(FC)の値を用いて、細菌種の相対保有量の差を示すボルケーノプロットを作成した。その結果、食塩水を摂取させた群（Ｂ群）で増加する細菌として、ラクトバシルス属細菌、アリスティペス属細菌、フリシンジコッカス属細菌、コリネバクテリウム・ステアトニス、ストレプトコッカス属細菌、モノグロバス属細菌、ユーバクテリウム・シラエラム、ブチリコッカス属細菌、及びブラウチア属細菌が同定された（表45、図32C）。また、食塩水を摂取させた群（Ｂ群）で減少する細菌として、クロストリジウム属細菌、ラクトスピラカエ属細菌UCG001、リケネルラセア属細菌、ラクノスピラカエ属細菌NK4A136が同定された（表45、図32C）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000053
　更に、食塩水を摂取させた群（Ｂ群）と抗生物質を含む食塩水を摂取させた群（Ｃ群）
について、84日齢の糞便サンプルの比較を行った。「Ｂ群における各細菌の相対的保有量/Ｃ群における相対的保有量」をFold change(FC)として算出し、各群間におけるANOVA検定の値をp値として算出した。p値の-log10の値及びFold change (FC)のlog2(FC)の値を用いて、細菌種の相対保有量の差を示すボルケーノプロットを作成した。log2(FC)の絶対値が1.5以上で-log10(p値)が1以上で有意な変化を認める細菌種であり、且つ前述のＡ群とＢ群の間で有意に変動した細菌を調査したところ、Ｃ群とＢ群の間で、ラクトバシルス属細菌、アリスティペス属細菌、フリシンジコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、モノグロバス属細菌、リケネルラセア属細菌、及びラクノスピラカエ属細菌NK4A136が、相対保有量で有意に変化していた（表46、図32D）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000054
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000055
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000056
　更に、前記で確認されたＡ群とＢ群で有意に変動する腸内細菌種、及びＢ群とＣ群で有意に変動する腸内細菌種を対象として、双方の群間で共通して増加又は減少する細菌種を同定するためのベン図を作成した。この結果、ラクトバシルス属細菌、アリスティペス属細菌、フリシンジコッカス属細菌、ストレプトコッカス属細菌、モノグロバス属細菌が同定された（図32E）。
7. 脳卒中易発症性自然高血圧発症モデルラットを用いた抗菌薬の効果検討(3)
7-1.試験材料及び試験方法
(1)飼育条件
　CLEA（東京、日本）から購入したSHRSP（雄）を使用した。本試験も、国立循環器病研究センター（NCVC；吹田市、日本）の動物実験計画承認（Approval number 21068）の下で、SPF環境で実施した。
　70日齢のSHRSPを表47に示す5群に分けて表47に示す条件で飼育し、アウトカムを死亡イベントとして、生存期間を観察した（図33A）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000057
7-2.結果
　各群における生存期間をKaplan-Meire曲線を描出し、結果をlog rank testにより評価した。アンピシリン、メトロニダゾール、ネオマイシン、及びバンコマイシンを含む抗生物質を摂取させた場合、生存期間の延長効果が最も優れていたが、抗生物質を単独で摂取させても、な生存期間の延長効果が認められた（図33B）。これらの結果からも、抗生物質の投与によってSHRSPの生存期間を延長できることが確認され、抗生物質の投与が脳卒中の予防又は治療に有効であることが分かった。
8.参考試験例A
　以下に示す試験を行うことにより、脳卒中易発症性自然高血圧発症モデルラットへの抗生物質の経口投与による腸内菌叢への影響、並びに脳、心臓、腎臓及び小腸の各臓器への影響を検証でき、抗生物質による脳卒中の予防又は治療効果を確認できる。
　63日齢のSHRSP（雄、CLEA（東京、日本））に、ラット標準食（Funahashi SP diet）及び水を自由摂取させて7日間飼育する。その後、70日齢になったSHRSPを表48に示す6群に分けて表48に示す条件で間飼育する（図34）。84日齢の時点糞便を回収し、腸内細菌叢解析を行う（図34）。105日齢の時点で、安楽死処理し、脳、心臓、腎臓及び小腸の各組織をサンプリングし、ヘマトキシリン・エオジン染色及びマッソントリクローム染色を行って各組織における血管の状態及び線維化の程度の比較・解析を行う。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000058
9.参考試験例B
　以下に示す試験を行うことにより、脳卒中易発症性自然高血圧発症モデルラットへのIgA抗体の経口投与による腸内菌叢への影響、並びに脳、心臓、腎臓及び小腸の各臓器への影響を検証でき、抗生物質による脳卒中の予防又は治療効果を確認できる。
　63日齢のSHRSP（雄、CLEA（東京、日本））に、ラット標準食（Funahashi SP diet）及び水を自由摂取させて7日間飼育する。その後、70日齢になったSHRSPを表49に示す4群に分けて表49に示す条件で間飼育する（図35）。84日齢の時点糞便を回収し、腸内細菌叢解析を行う（図35）。105日齢の時点で、安楽死処理し、脳、心臓、腎臓及び小腸の各組織をサンプリングし、ヘマトキシリン・エオジン染色及びマッソントリクローム染色を行って各組織における血管の状態及び線維化の程度の比較・解析を行う。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000059

Claims (34)

  1. 　脳卒中の罹患の有無を検査する方法であって、
    　被験者から採取された腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivalius）、及びラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の有無を測定する工程を含む、前記方法。
  2. 　脳卒中の罹患の有無の検査用キットであって、
    　ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivalius）、及びラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌を特異的に検出可能なプライマーを含む、前記キット。
  3. 　脳卒中の罹患の有無又はその病型を検査する方法であって、
    　被験者から採取された腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivalius）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、アリスティペス・プトレディネス（Alistispes putredinis）、バクテロイデス・フラジェリス（Bacteroides fragilis）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、ラクトバシラス属（Lactobacillus）細菌、アリスティペス属（Alistispes）細菌、レンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌、バクテロイデス・プレビウス（Bacteroides plebeius）、アナエロテペス・ハドラス（Anaerostipes hadrus）、ルミノコッカス・ビサーキュランス（Ruminococcus bicirculans）、バクテロイデス・ブルガータス（Bacteroides vulgatus）、プレボテラ・コプリ（Prevotella copri）、サテレラ・ワズワーステンシス（Sutterella wadsworthensis）、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ユウバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、ダイアリスター・インビサス（Dialister invisus）、フシカテニバクター属（Fusicatenibacter）細菌、フィーカリバクテリウム属（Faecalibacterium）細菌、ドレア属（Dorea）細菌、アナエロティペス属（Anaerostipes）細菌、ルミノコッカス属（Ruminococcus）細菌、ブチリコッカス属（Butyricoccus）細菌、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）細菌、ビフィドバクテリア科（Bifidobacteriaceae）細菌、及びプレボテラ科（Prevotellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を測定する工程を含む、前記方法。
  4. 　サルコペニアを伴う脳卒中に罹患しているかを検査する方法であり、
    　前記細菌が、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、アリスティペス・プトレディネス（Alistispes putredinis）、バクテロイデス・ブルガータス（Bacteroides vulgatus）、プレボテラ・コプリ（Prevotella copri）、及びブチリコッカス属（Butyricoccus）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌である、請求項３に記載の方法。
  5. 　心原性脳塞栓症の罹患の有無を検査する方法であり、
    　前記細菌が、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、バクテロイデス・フラジェリス（Bacteroides fragilis）、ラクトバシラス・ファーメンタム（Lactobacillus fermentum）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、レンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌、及びビフィドバクテリア科（Bifidobacteriaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項３に記載の方法。
  6. 　ラクナ梗塞の罹患の有無を検査する方法であり、
    　前記細菌が、サテレラ・ワズワーステンシス（Sutterella wadsworthensis）、レンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌、及びプレボテラ科（Prevotellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項３に記載の方法。
  7. 　アテローム血栓性脳塞栓症の罹患の有無検査する方法であり、
    　前記細菌が、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、及びレンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項３に記載の方法。
  8. 　脳内出血の有無を検査する方法であり、
    　前記細菌が、ユウバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、ダイアリスター・インビサス（Dialister invisus）、及びプレボテラ科（Prevotellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種である、請求項３に記載の方法。
  9. 　脳卒中の罹患の有無又はその病型の検査用キットであって、
    　被験者から採取された腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivalius）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、アリスティペス・プトレディネス（Alistispes putredinis）、バクテロイデス・フラジェリス（Bacteroides fragilis）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、ラクトバシラス属（Lactobacillus）細菌、アリスティペス属（Alistispes）細菌、レンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌、バクテロイデス・プレビウス（Bacteroides plebeius）、アナエロテペス・ハドラス（Anaerostipes hadrus）、ルミノコッカス・ビサーキュランス（Ruminococcus bicirculans）、バクテロイデス・ブルガータス（Bacteroides vulgatus）、プレボテラ・コプリ（Prevotella copri）、サテレラ・ワズワーステンシス（Sutterella wadsworthensis）、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ユウバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、ダイアリスター・インビサス（Dialister invisus）、フシカテニバクター属（Fusicatenibacter）細菌、フィーカリバクテリウム属（Faecalibacterium）細菌、ドレア属（Dorea）細菌、アナエロティペス属（Anaerostipes）細菌、ルミノコッカス属（Ruminococcus）細菌、ブチリコッカス属（Butyricoccus）細菌、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）細菌、ビフィドバクテリア科（Bifidobacteriaceae）細菌、及びプレボテラ科（Prevotellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌を特異的に検出可能なプライマーを含む、前記キット。
  10. 　脳卒中の重症度を検査する方法であって、
    　被験者から採取された腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、アナエロテペス・ハドラス（Anaerostipes hadrus）、バクテロイデス・プレビウス（Bacteroides plebeius）、ユウバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、プレボテラ・コプリ（Prevotella copri）、及びラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を測定する工程を含む、前記方法。
  11. 　脳卒中の重症度の検査用キットであって、
    　ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、アナエロテペス・ハドラス（Anaerostipes hadrus）、バクテロイデス・プレビウス（Bacteroides plebeius）、ユウバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、プレボテラ・コプリ（Prevotella copri）及びラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌を特異的に検出可能なプライマーを含む、前記キット。
  12. 　脳卒中の再発リスクを検査する方法であって、
    　被験者から採取された腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）の相対的存在量を測定する工程を含む、前記方法。
  13. 　脳卒中の再発リスクの検査用キットであって、
    　ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）を特異的に検出可能なプライマーを含む、前記キット。
  14. 　脳卒中の予後を予測するための検査する方法であって、
    　被験者から採取された腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）の有無を測定する工程を含む、前記方法。
  15. 　脳卒中の予後を予測するための検査用キットであって、
    　ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）を特異的に検出可能なプライマーを含む、前記キット。
  16. 　脳卒中患者におけるサルコペニアの併発の有無を検査する方法であって、
    　被験者から採取された腸内細菌叢におけるルミノコッカス・トルク（Ruminococcus torques）及びベイオネラ属細菌（Veillonella）よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を測定する工程を含む、前記方法。
  17. 　脳卒中患者におけるサルコペニアの併発の有無の検査用キットであって、
    　ルミノコッカス・トルク（Ruminococcus torques）及びベイオネラ属細菌（Veillonella）よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌を特異的に検出可能なプライマーを含む、前記キット。
  18. 　脳卒中の罹患の有無を検査する方法であって、
    　被験者から採取された口腔内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、ストレプトコッカス・クリスタタス（Streptococcus cristatus）、プレボテラ・ロエッシェイイ（Prevotella loescheii）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・コンステラータス（Streptococcus constellatus）、カンピロバイター・グラシリス（Campylobacter gracilis）、セレノモナス・スプチゲナ（Selenomonas sputigena）、タンネレラ・フォーサイシア（Tannerella forsythia）、ポルフィロモナス属（Porphyromonas）細菌、フソバクテリウム属（Fusobacterium）細菌、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、カプノサイトファーガ属（Capnocytophaga）細菌、カンピロバクター属（Campylobacter）細菌、レンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌、ユウバクテリウム・サルシ（Eubacterium sulci）、ストレプトコッカス・インファンティス（Streptococcus infantis）、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ（Haemophilus parainfluenzae）、プレボテラ・ナンセイエンシッス（Prevotella nanceiensis）、ランセフィールデラ・パルブラ（Lancefieldella parvula）、ナイセリア属（Neisseria）細菌、サッカリモナダTM7x属（Saccharimonadaceae TM7x）細菌、ヘモフィルス属（Hemophilus）細菌、アロプレボテラ属（Alloprevotella）細菌、プレボテラ科（Prevotellaceae）細菌、及びベイロネラ科（Veillonellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を測定する工程を含む、前記方法。
  19. 　脳卒中の罹患の有無の検査用キットであって、
    　ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、ストレプトコッカス・クリスタタス（Streptococcus cristatus）、プレボテラ・ロエッシェイイ（Prevotella loescheii）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・コンステラータス（Streptococcus constellatus）、カンピロバイター・グラシリス（Campylobacter gracilis）、セレノモナス・スプチゲナ（Selenomonas sputigena）、タンネレラ・フォーサイシア（Tannerella forsythia）、ポルフィロモナス属（Porphyromonas）細菌、フソバクテリウム属（Fusobacterium）細菌、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、カプノサイトファーガ属（Capnocytophaga）細菌、カンピロバクター属（Campylobacter）細菌、レンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌、ユウバクテリウム・サルシ（Eubacterium sulci）、ストレプトコッカス・インファンティス（Streptococcus infantis）、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ（Haemophilus parainfluenzae）、プレボテラ・ナンセイエンシッス（Prevotella nanceiensis）、ランセフィールデラ・パルブラ（Lancefieldella parvula）、ナイセリア属（Neisseria）細菌、サッカリモナダTM7x属（Saccharimonadaceae TM7x）細菌、ヘモフィルス属（Hemophilus）細菌、アロプレボテラ属（Alloprevotella）細菌、プレボテラ科（Prevotellaceae）細菌、及びベイロネラ科（Veillonellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌を特異的に検出可能なプライマーを含む、前記キット。
  20. 　脳卒中患者の腸内細菌叢又は口腔内菌叢を正常化させる物質を有効成分として含む脳卒中の改善剤。
  21. 　前記有効成分が、腸内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivalius）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、アリスティペス・プトレディネス（Alistispes putredinis）、バクテロイデス・フラジェリス（Bacteroides fragilis）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、ラクトバシラス属（Lactobacillus）細菌、アリスティペス属（Alistispes）細菌、レンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌、及びベイオネラ属細菌（Veillonella）よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を低下させる物質である、請求項２０に記載の脳卒中の改善剤。
  22. 　前記有効成分が、抗生物質、又は前記細菌に対して結合性を示す抗体である、請求項２１に記載の改善剤。
  23. 　前記有効成分が、腸内細菌叢において、バクテロイデス・プレビウス（Bacteroides plebeius）、アナエロテペス・ハドラス（Anaerostipes hadrus）、ルミノコッカス・ビサーキュランス（Ruminococcus bicirculans）、バクテロイデス・ブルガータス（Bacteroides vulgatus）、プレボテラ・コプリ（Prevotella copri）、サテレラ・ワズワーステンシス（Sutterella wadsworthensis）、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ユウバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、ダイアリスター・インビサス（Dialister invisus）、ルミノコッカス・トルク（Ruminococcus torques）、フシカテニバクター属（Fusicatenibacter）細菌、フィーカリバクテリウム属（Faecalibacterium）細菌、ドレア属（Dorea）細菌、アナエロティペス属（Anaerostipes）細菌、ルミノコッカス属（Ruminococcus）細菌、ブチリコッカス属（Butyricoccus）細菌、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）細菌、ビフィドバクテリア科（Bifidobacteriaceae）細菌、及びプレボテラ科（Prevotellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を増加させる物質である、請求項２０に記載の脳卒中の改善剤。
  24. 　前記有効成分が、口腔内細菌叢において、ストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、ストレプトコッカス・クリスタタス（Streptococcus cristatus）、プレボテラ・ロエッシェイイ（Prevotella loescheii）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・コンステラータス（Streptococcus constellatus）、カンピロバイター・グラシリス（Campylobacter gracilis）、セレノモナス・スプチゲナ（Selenomonas sputigena）、タンネレラ・フォーサイシア（Tannerella forsythia）、ポルフィロモナス属（Porphyromonas）細菌、フソバクテリウム属（Fusobacterium）細菌、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、カプノサイトファーガ属（Capnocytophaga）細菌、カンピロバクター属（Campylobacter）細菌、及びレンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を低下させる物質である、請求項２０に記載の脳卒中の改善剤。
  25. 　前記有効成分が、口腔内細菌叢において、ユウバクテリウム・サルシ（Eubacterium sulci）、ストレプトコッカス・インファンティス（Streptococcus infantis）、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ（Haemophilus parainfluenzae）、プレボテラ・ナンセイエンシッス（Prevotella nanceiensis）、ランセフィールデラ・パルブラ（Lancefieldella parvula）、ナイセリア属（Neisseria）細菌、サッカリモナダTM7x属（Saccharimonadaceae TM7x）細菌、ヘモフィルス属（Hemophilus）細菌、アロプレボテラ属（Alloprevotella）細菌、プレボテラ科（Prevotellaceae）細菌、及びベイロネラ科（Veillonellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を増加させる物質である、請求項２０に記載の脳卒中の改善剤。
  26. 　被験物質の中から、脳卒中の改善に有効である可能性がある候補物質をスクリーニングする方法であって、
    　被験物質について、腸内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、ストレプトコッカス・ミュータンス（Streptococcus mutans）、ストレプトコッカス・パラサングイニス（Streptococcus parasanguinis）、ストレプトコッカス・サリバリウス（Streptococcus salivalius）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、クロストリジウム・パーフリンゲンス（Clostridium perfringens）、アリスティペス・プトレディネス（Alistispes putredinis）、バクテロイデス・フラジェリス（Bacteroides fragilis）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、ラクトバシラス属（Lactobacillus）細菌、アリスティペス属（Alistispes）細菌、レンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌、及びベイオネラ属細菌（Veillonella）よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を低下させる作用を評価する工程；及び
    　前記作用を有する被験物質を、前記候補物質として選択する工程；
    を含む、前記スクリーニング方法。
  27. 　被験物質の中から、脳卒中の改善に有効である可能性がある候補物質をスクリーニングする方法であって、
    　被験物質について、腸内細菌叢におけるバクテロイデス・プレビウス（Bacteroides plebeius）、アナエロテペス・ハドラス（Anaerostipes hadrus）、ルミノコッカス・ビサーキュランス（Ruminococcus bicirculans）、バクテロイデス・ブルガータス（Bacteroides vulgatus）、プレボテラ・コプリ（Prevotella copri）、サテレラ・ワズワーステンシス（Sutterella wadsworthensis）、ビフィドバクテリウム・シュードカテニュレイタム(Bifidobacterium pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム・ロンガム（Bifidobacterium longum）、ユウバクテリウム・レクタル（Eubacterium rectale）、ダイアリスター・インビサス（Dialister invisus）、ルミノコッカス・トルク（Ruminococcus torques）、フシカテニバクター属（Fusicatenibacter）細菌、フィーカリバクテリウム属（Faecalibacterium）細菌、ドレア属（Dorea）細菌、アナエロティペス属（Anaerostipes）細菌、ルミノコッカス属（Ruminococcus）細菌、ブチリコッカス属（Butyricoccus）細菌、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）細菌、ビフィドバクテリア科（Bifidobacteriaceae）細菌、及びプレボテラ科（Prevotellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を増加させる作用を評価する工程；及び
    　前記作用を有する被験物質を、前記候補物質として選択する工程；
    を含む、前記スクリーニング方法。
  28. 　被験物質の中から、脳卒中の改善に有効である可能性がある候補物質をスクリーニングする方法であって、
    　被験物質について、口腔内細菌叢におけるストレプトコッカス・アンギノーサス（Streptococcus anginosus）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、ストレプトコッカス・クリスタタス（Streptococcus cristatus）、プレボテラ・ロエッシェイイ（Prevotella loescheii）、ラクトバシラス・ファーメンタム(Lactobacillus fermentum)、ストレプトコッカス・ゴルドニ（Streptococcus gordonii）、ストレプトコッカス・コンステラータス（Streptococcus constellatus）、カンピロバイター・グラシリス（Campylobacter gracilis）、セレノモナス・スプチゲナ（Selenomonas sputigena）、タンネレラ・フォーサイシア（Tannerella forsythia）、ポルフィロモナス属（Porphyromonas）細菌、フソバクテリウム属（Fusobacterium）細菌、ストレプトコッカス属（Streptococcus）細菌、カプノサイトファーガ属（Capnocytophaga）細菌、カンピロバクター属（Campylobacter）細菌、及びレンサ球菌科（Streptococcaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を低下させる作用を評価する工程；及び
    　前記作用を有する被験物質を、前記候補物質として選択する工程；
    を含む、前記スクリーニング方法。
  29. 　被験物質の中から、脳卒中の改善に有効である可能性がある候補物質をスクリーニングする方法であって、
    　被験物質について、口腔内細菌叢におけるユウバクテリウム・サルシ（Eubacterium sulci）、ストレプトコッカス・インファンティス（Streptococcus infantis）、ヘモフィルス・パラインフルエンゼ（Haemophilus parainfluenzae）、プレボテラ・ナンセイエンシッス（Prevotella nanceiensis）、ランセフィールデラ・パルブラ（Lancefieldella parvula）、ナイセリア属（Neisseria）細菌、サッカリモナダTM7x属（Saccharimonadaceae TM7x）細菌、ヘモフィルス属（Hemophilus）細菌、アロプレボテラ属（Alloprevotella）細菌、プレボテラ科（Prevotellaceae）細菌、及びベイロネラ科（Veillonellaceae）細菌よりなる群から選択される少なくとも１種の細菌の相対的存在量を増加させる作用を評価する工程；及び
    　前記作用を有する被験物質を、前記候補物質として選択する工程；
    を含む、前記スクリーニング方法。
  30. 　脳卒中の病型別発症リスクを検査する方法であって、
    　被験者から採取された血液サンプル中のエクオール濃度を測定する工程を含む、前記方法。
  31. 　心原性脳塞栓症、アテローム血栓性脳梗塞、又は心房細動の発症リスクを検査する方法である、請求項３０に記載の方法。
  32. 　脳卒中の重症度を検査する方法であって、
    　被験者から採取された血液サンプル中のエクオール濃度を測定する工程を含む、前記方法。
  33. 　脳卒中の機能予後を検査する方法であって、
    　被験者から採取された血液サンプル中のエクオール濃度を測定する工程を含む、前記方法。
  34. 　エクオール、又はエクオール産生促進物質を含む、脳卒中の改善剤。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004537544A (ja) * 2001-07-13 2004-12-16 パラテック ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 標的治療活性を有するテトラサイクリン化合物
US20160055296A1 (en) * 2013-05-09 2016-02-25 The Procter & Gamble Company Method And System For Assessing A Health Condition
CN112553358A (zh) * 2020-09-19 2021-03-26 河北医科大学第二医院 微生物菌群在脑卒中中的应用
CN112708686A (zh) * 2021-01-25 2021-04-27 温州医科大学慈溪生物医药研究院 肠道菌群在神经损伤检测中的应用
KR20210129953A (ko) * 2020-04-21 2021-10-29 박선민 대사성 질환과 안질환의 예방 및 건강 유지를 위한 장내 미생물 검사 기반 맞춤형 프리바이오틱스 또는 프로바이오틱스 정보 제공방법

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004537544A (ja) * 2001-07-13 2004-12-16 パラテック ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 標的治療活性を有するテトラサイクリン化合物
US20160055296A1 (en) * 2013-05-09 2016-02-25 The Procter & Gamble Company Method And System For Assessing A Health Condition
KR20210129953A (ko) * 2020-04-21 2021-10-29 박선민 대사성 질환과 안질환의 예방 및 건강 유지를 위한 장내 미생물 검사 기반 맞춤형 프리바이오틱스 또는 프로바이오틱스 정보 제공방법
CN112553358A (zh) * 2020-09-19 2021-03-26 河北医科大学第二医院 微生物菌群在脑卒中中的应用
CN112708686A (zh) * 2021-01-25 2021-04-27 温州医科大学慈溪生物医药研究院 肠道菌群在神经损伤检测中的应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LIN HUANG: "Analysis of microbiota in elderly patients with Acute Cerebral Infarction", PEERJ, vol. 7, pages e6928, XP093156414, ISSN: 2167-8359, DOI: 10.7717/peerj.6928 *
YAMASHIRO, KAZUO, KURITA, NAOHIDE, URABE, TAKAO: "Brain-Gut Axis in Stroke. ", JOURNAL OF CLINICAL AND EXPERIMENTAL MEDICINE, BIOMEDICAL DRUGS PUBLICATION, JP, vol. 280, no. 10, 5 March 2022 (2022-03-05), JP , pages 1043 - 1048, XP009553783, ISSN: 0039-2359 *
YAMASHIRO, KAZUO; URABE, TAKAO: "Gut Microbiota and Stroke", BIO CLINICA, HOKURYUKAN, TOKYO, JP, vol. 36, no. 10, 1 January 2021 (2021-01-01), JP , pages 94 - 101, XP009554347, ISSN: 0919-8237 *
猪原 匡史, 脳卒中と口腔内細菌, 第６回日本心血管脳卒中学会学術集会プログラム・抄録集, 2019, p. 39, EL1-3, non-official translation (IHARA, Masafumi. Brain Stroke and Bacteria in the Oral Cavity. The 6th Annual Meeting of the Cardiovascular Stroke Society of Japan, Program and Abstracts) *

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