WO2024071433A1 - 管腔構造体，及び管腔構造体の製造方法 - Google Patents

管腔構造体，及び管腔構造体の製造方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2024071433A1
WO2024071433A1 PCT/JP2023/035893 JP2023035893W WO2024071433A1 WO 2024071433 A1 WO2024071433 A1 WO 2024071433A1 JP 2023035893 W JP2023035893 W JP 2023035893W WO 2024071433 A1 WO2024071433 A1 WO 2024071433A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mold
core
tubular structure
forming member
luminal structure
Prior art date
Application number
PCT/JP2023/035893
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
尾上弘晃
田中秀磨
板井駿
豊原敬文
Original Assignee
慶應義塾
国立大学法人東北大学
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 慶應義塾, 国立大学法人東北大学 filed Critical 慶應義塾
Publication of WO2024071433A1 publication Critical patent/WO2024071433A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues

Definitions

  • This invention relates to a tubular structure such as an artificial intestine and a method for manufacturing a tubular structure. More specifically, it relates to a method for manufacturing a tubular structure that can adjust three-dimensional irregularities using air bubbles.
  • Japanese Patent Publication No. 2020-500018 describes artificial intestinal tissue. Technology for producing artificial intestines in this way is known.
  • This invention aims to produce luminal structures such as artificial intestines with appropriate structures by adjusting the internal irregularities of the luminal structure in three dimensions.
  • This invention provides a method for manufacturing a tubular structure and a tubular structure that can adjust the internal irregularities of the tubular structure in three dimensions.
  • This invention is based on the findings from the examples that the irregularities inside a tubular structure can be adjusted three-dimensionally by using bubbles.
  • the method for producing a luminal structure of the present invention includes a step of obtaining a temporary fixative in a mold and a step of solidifying the temporary fixative in a mold.
  • An example of the luminal structure is an artificial intestine.
  • the intra-mold temporary fixative obtaining step is a step for obtaining an intra-mold temporary fixative.
  • the intra-mold temporary fixative is a temporary fixative contained in a mold having a recess corresponding to the outer shape of the luminal structure, and into which a core-forming member corresponding to the lumen main body of the luminal structure is inserted.
  • An example of the temporary fixative is a pre-gel solution.
  • the in-mold temporary fixative solidification step is a step of solidifying the in-mold temporary fixative while generating bubbles inside the in-mold temporary fixative using a core-forming member.
  • the core-forming member may function as an electrode.
  • the method may include an electrolysis step of generating bubbles on the surface of the core-forming member by electrolysis using the core-forming member as an electrode.
  • the shape of the projections and recesses inside the obtained tubular structure can be adjusted by adjusting the value and application time of the voltage applied to the core-forming member.
  • a tubular structure may be obtained by removing the solidified intra-mold temporary fixative from the mold and washing the intra-mold temporary fixative removed from the mold.
  • the luminal structure of the present invention may be obtained by the above-mentioned manufacturing method.
  • the luminal structure of the present invention is a tubular luminal structure having a lumen portion, and the lumen portion has a depth of 10 ⁇ m to 200 ⁇ m and a plurality of depressions with a maximum width of 20 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • the luminal structure of the present invention preferably has 102 or more depressions.
  • This invention provides a method for manufacturing a tubular structure that can adjust the irregularities inside the tubular structure in three dimensions by generating bubbles using a rod-shaped mold to form the body cavity inside the tubular structure.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram for explaining a luminal structure.
  • Figure 2 shows an example of a manufacturing system in the examples.
  • Figure 2(a) is a schematic diagram of a casting mold and a rod-shaped mold used in the examples.
  • Figure 2(b) is a schematic diagram of the system used in the examples.
  • FIG. 3 is a conceptual diagram showing how electrolysis progresses.
  • FIG. 4 is a photograph, instead of a drawing, showing the progress of electrolysis.
  • FIG. 5 is a photograph, instead of a drawing, showing the artificial intestine obtained in the example.
  • FIG. 6 is a photograph, instead of a drawing, showing the experimental system used in the cell culture experiment.
  • FIG. 7 is a photograph, instead of a drawing, showing Caco-2 cells in an artificial intestine.
  • FIG. 8 is a graph in place of a drawing showing the diameter of the artificial intestine tube, the depth of the depression formed in the lumen, and the diameter of the opening.
  • FIG. 9 is a photograph, instead of a drawing, showing the co-culture system.
  • FIG. 10 is a fluorescent photograph, instead of a drawing, showing the results of co-culture.
  • FIG. 11 shows images taken with a phase-contrast microscope in place of drawings showing the inspection results.
  • the method for manufacturing a tubular structure of the present invention includes a process for obtaining a temporary fixative in a mold and a process for solidifying the temporary fixative in a mold.
  • FIG. 1 is a conceptual diagram for explaining a luminal structure.
  • FIG. 1(a) shows an example of a side view of a luminal structure
  • FIG. 1(b) shows an example of a front view (end portion) of a luminal structure
  • FIG. 1(c) shows an example of a cross-sectional view taken along line A-A of FIG. 1(a)
  • FIG. 1(d) shows an example of a cross-sectional view of FIG. 1(a).
  • FIG. 1(e) is a conceptual diagram for explaining a luminal structure and an embodiment.
  • a luminal structure 1 has a main body portion 3 of the luminal structure and a lumen portion 5 formed inside the main body portion 3.
  • the external shape of the luminal structure is a so-called tubular shape.
  • the lumen portion 5 has a cylindrical lumen main body portion 7 and a plurality of depressions 9 formed in the region of the main body portion 3 of the luminal structure.
  • the lumen structure of this invention may have depressions 9 in the lumen portion 5 in the end region.
  • the luminal structure may be flexible.
  • the luminal structure preferably has a size and physical properties similar to those of a part of the intestine of a human or mammal.
  • the luminal structure is, for example, tubular.
  • the length of the luminal structure may be adjusted appropriately depending on the application.
  • the thickness of the wall forming the main body portion 3 of the luminal structure may also be adjusted appropriately depending on the application. If the length of the tube is l t , it may be 1 mm ⁇ l t ⁇ 1 m, 1 mm ⁇ l t ⁇ 10 cm, 1 mm ⁇ l t ⁇ 1 cm, 5 mm ⁇ l t ⁇ 1 cm, 5 mm ⁇ l t ⁇ 50 cm, or 5 mm ⁇ l t ⁇ 10 cm.
  • the average radius of the outer circumference of the tube is r t , it may be 0.1 mm ⁇ r t ⁇ 3 cm, 0.6 mm ⁇ r t ⁇ 1 cm, 0.6 mm ⁇ r t ⁇ 5 mm, or 0.6 mm ⁇ r t ⁇ 3 mm. If the average diameter of the lumen of the tube (lumen main body 7) is dt , then 0.1rt ⁇ dt ⁇ 1.8rt may be satisfied, 0.1rt ⁇ dt ⁇ 0.8rt, 0.2rt ⁇ dt ⁇ 0.8rt , 0.2rt ⁇ dt ⁇ 0.6rt , or 0.3rt ⁇ dt ⁇ 0.6rt .
  • the luminal structure may be made of a known resin having biocompatibility as appropriate. Since artificial intestines are known, the luminal structure may be manufactured using known materials.
  • the depression 9 is an intentionally formed unevenness, and a further depression may be formed on the depression.
  • An example of the depression 9 is a substantially hemispherical depression with a depth of 10 ⁇ m to 200 ⁇ m and a maximum width of 20 ⁇ m to 500 ⁇ m.
  • the tubular structure may have a plurality of depressions 9 within this range.
  • the depth and width of the depression 9 can be regarded as the radius and diameter of the bubble.
  • an example of the depth of the depression 9 is 10 ⁇ m to 200 ⁇ m, 20 ⁇ m to 150 ⁇ m, 20 ⁇ m to 100 ⁇ m, 50 ⁇ m to 150 ⁇ m, or 50 ⁇ m to 100 ⁇ m.
  • the luminal structure of the present invention preferably has 1 ⁇ 102 or more recesses 9 corresponding to any of the above ranges.
  • the number of recesses 9 may be 1 ⁇ 102 or more and 1 ⁇ 1020 or less, 2 ⁇ 102 or more and 1 ⁇ 1010 or less, 1 ⁇ 103 or more and 1 ⁇ 109 or less, or 1 ⁇ 103 or more and 1 ⁇ 108 or less.
  • An example of a luminal structure is an artificial intestine.
  • the intestine are the small intestine and the large intestine.
  • Examples of the small intestine are the duodenum, jejunum, and ileum.
  • Examples of the large intestine are the cecum, colon, and rectum.
  • Examples of the colon are the ascending colon, transverse colon, descending colon, and sigmoid colon.
  • the artificial intestine may be an artificial organ that replaces any part or the entire length of these. Therefore, the size and thickness may be adjusted appropriately depending on the application.
  • the intestine is preferably a human artificial intestine. In other words, a preferred example of an artificial intestine is a medical device for human treatment.
  • the in-mold temporary fixative obtaining process is a process for obtaining an in-mold temporary fixative.
  • the in-mold temporary fixative is a temporary fixative contained in a mold having a recess corresponding to the outer shape of the luminal structure, and a core forming member corresponding to the lumen main body of the luminal structure is inserted into the temporary fixative.
  • the temporary fixative means an agent in a state before being hardened by a later process.
  • the temporary fixative may be liquid or semi-solid.
  • Examples of the temporary fixative are a thermosetting resin, a photocurable resin, an adhesive, an impression material, and a pre-gel solution.
  • the thermosetting resin is a resin that hardens when heat is applied.
  • the photocurable resin is a resin that hardens when light is irradiated.
  • the adhesive is a resin that hardens when water evaporates.
  • the pre-gel solution is a semi-solid liquid that contains a specific resin component and gels by applying heat or air drying, as described in, for example, Japanese Patent Publication No. 7129668, Japanese Patent Application Laid-Open No. 2020-180239, and Japanese Patent Publication No. 2022-513229.
  • the core portion may be removed and a core-forming member may be inserted.
  • the core-forming member may be inserted and the core portion may be removed.
  • the core-forming member may be inserted into the mold in advance, and the temporary fixative in the mold may be obtained with the core portion (corresponding to the lumen main body portion 7) removed.
  • the in-mold temporary fixative is solidified in a state in which bubbles are generated inside the in-mold temporary fixative using a core-forming member.
  • the bubbles are generated intentionally or artificially.
  • the core-forming member may function as an electrode.
  • the process may include an electrolysis process in which bubbles are generated on the surface of the core-forming member by electrolysis using the core-forming member as an electrode.
  • the shape of the unevenness inside the obtained tubular structure can be adjusted by adjusting the value and application time of the voltage applied to the core-forming member.
  • the core-forming member may have a plurality of minute holes (large enough that the in-mold temporary fixative does not easily penetrate inside) on its surface, and bubbles may be formed by releasing a fluid (e.g., air or oil) from inside the core-forming member.
  • a fluid e.g., air or oil
  • the fluid is oil
  • the part where the oil was present will not solidify and will become a depression 9.
  • a tubular structure may be obtained by removing the solidified intra-mold temporary fixative from the mold and washing the intra-mold temporary fixative removed from the mold.
  • the tubular structure of the present invention may be obtained by the above manufacturing method.
  • the artificial intestine can be used in various medical procedures and medical-related experiments. Below, the present invention will be explained using the artificial intestine as an example. However, the present invention is not limited to the following examples, and also includes those that appropriately adopt known technologies.
  • FIG. 2 is a diagram showing an example of a manufacturing system in the embodiment.
  • FIG. 2(a) is a conceptual diagram of the mold and rod-shaped mold used in the embodiment.
  • FIG. 2(b) is a conceptual diagram of the system used in the embodiment.
  • the rod-shaped mold corresponds to the hollow core part.
  • the mold was made of a 10 ⁇ 25 ⁇ 3 aluminum piece with a groove carved for injecting the collagen pregel solution.
  • the mold is not limited to aluminum as long as it is made of a conductive material. Tungsten with a diameter of 0.5 mm was used as the rod-shaped mold.
  • the rod-shaped mold is not limited to tungsten as long as it is made of a conductive material.
  • the mold was filled with a collagen pregel solution (Atelocell). Using the rod-shaped mold as an electrode, a direct current voltage of 5 V was applied via a tungsten wire for 200 ms, electrolyzing the pregel to generate bubbles. The gel was allowed to harden by leaving it to stand for 2 hours at 37°C. After the gel had hardened, the collagen tube obtained was removed from the mold, and an artificial intestine was obtained.
  • a collagen pregel solution Atelocell
  • Figure 3 is a conceptual diagram showing how electrolysis progresses.
  • the top image shows the state before electrolysis.
  • the middle image shows the start of electrolysis and the generation of microbubbles (tiny bubbles).
  • the bottom image shows the progress of electrolysis, with numerous microbubbles generated around the tungsten wire in the collagen pre-gel solution.
  • Figure 4 is a photograph in lieu of a drawing showing the progress of electrolysis.
  • the upper image shows the state before electrolysis, and the lower image shows the progress of electrolysis, with numerous microbubbles generated around the tungsten wire in the collagen pre-gel solution.
  • Figure 5 is a photograph in lieu of a drawing showing the artificial intestine obtained in the embodiment.
  • the upper image shows a phase contrast image
  • the lower image shows a fluorescence microscope photograph.
  • the external and internal diameters (mean ⁇ standard deviation) of the artificial intestine obtained using a mold with a groove of 1.2 mm radius and a rod-shaped mold of 0.5 mm diameter were 2454 ⁇ 24 ⁇ m and 538 ⁇ 22 ⁇ m, respectively.
  • an artificial intestine of the desired size can be obtained.
  • An excessively large outer diameter will cause a deterioration in medium permeability, and an excessively large inner diameter will increase the number of culture days required for cells to become confluent. Therefore, it is desirable for the inner diameter to be 500 ⁇ m or less.
  • the shape of the depressions can be controlled by processing the surface of the rod-shaped mold.
  • the contact angle of the air bubbles can be changed.
  • the opening of the depressions becomes wider, which has the advantage of making it easier to seed cells later.
  • the size of the pits can be controlled by the voltage application time for electrolysis.
  • the diameters (average ⁇ standard deviation) of the generated bubbles increase to 64.5 ⁇ 22.3 ⁇ m, 76.5 ⁇ 26.2 ⁇ m, 116.6 ⁇ 28.7 ⁇ m, and 131.2 ⁇ 33.8 ⁇ m when the application time is increased to 25 ms, 100 ms, 200 ms, and 1000 ms, respectively.
  • the depth is preferably 100 ⁇ m or more, taking into consideration the deformation of the depression due to the traction force of the cells. If the depth is less than this, the depression may become flat.
  • the hardness of the tube can be increased by increasing the concentration of collagen gel or by using gelatin. In that case, there is no problem even if the depth is less than 100 ⁇ m.
  • FIG. 6 shows the experimental system used in the cell culture experiment.
  • a Caco-2 cell suspension (1.0 x 107 cells/mL) purchased from the Institute of Physical and Chemical Research was placed in a syringe (250 ⁇ L, Hamilton) and injected into the collagen gel lumen from which the rod-shaped mold had been removed.
  • Figure 6-2 the mixture was incubated at 37°C in 5% CO2 .
  • Figure 6-3 human cells (Caco-2 cells) were seeded again.
  • Figure 6-4 the mixture was incubated upside down. The artificial intestine was removed from the mold.
  • Figure 7 is a photograph instead of a drawing showing Caco-2 cells in an artificial intestine.
  • Figure 8 is a graph in lieu of a drawing showing the diameter of the artificial intestine tube and the depth and opening diameter of the depressions formed in the lumen. As shown in Figure 8, after 4 days of culture, the traction force of the cells caused the tube diameter to shorten by 14%, the depth of the depressions to shorten by 61%, and the opening diameter of the depressions to lengthen by 34%.
  • Figure 10 is a fluorescent photograph in lieu of a drawing showing the results of the co-culture.
  • the upper and lower figures show photographs of intestinal bacteria (bifidobacteria) and human cells (Caco-2 cells), respectively. As shown in Figure 10, it was confirmed that bifidobacteria remained in the lumen of the artificial intestine.
  • F-hiSIEC culture procedure Culture method Cell seeding was performed by suspending F-hiSIECTM (FUJIFILM human iPS cell-derived small intestinal epithelial-like cells) in a dedicated seeding medium at a concentration of 4.0 x 10 6 cells/mL and delivering the suspension to the formed tube in multiple batches. The culture medium was changed to a dedicated medium from the day after cell seeding, and was replaced every two days thereafter. When replacing the medium, the liquid was also pumped into the lumen of the tube to remove dead cells at the same time. The tubes were cultured for 9 days.
  • Figure 11 shows images taken with a phase contrast microscope.
  • the top left of Figure 11 shows the state immediately after the membrane seeding.
  • the top right of Figure 11 shows the state after 9 days.
  • the bottom left of Figure 11 shows a partially enlarged view of the top right of Figure 11.
  • the bottom right of Figure 11 shows a partially enlarged view of the bottom left of Figure 11.
  • Observation with a phase contrast microscope confirmed cell proliferation within the lumen and the formation of intestinal epithelium-like tissue. Furthermore, a phenomenon was observed in which the inner diameter of the tube was reduced by the traction force of the cells acting in conjunction with the formation of intestinal epithelium-like tissue, which pulled the inner wall of the tube in the direction of contraction.
  • the key point of this invention is that it can instantaneously create countless 100 ⁇ m-order irregularities, as observed on the intestinal wall in vivo, in three dimensions.
  • the only equipment required for creation is a general arbitrary waveform generator, and no special equipment is required, making it easy to introduce.
  • the material of the tube is not limited to gel. It can be made as long as it satisfies two conditions: the depression can be created by bubbles, and the depression can be maintained even after the bubbles are removed.
  • the method of generating bubbles is not limited to electrolysis. For example, there are methods such as using a rod-shaped mold that is tubular and capable of delivering air and has an air outlet on its surface, or generating dissolved gas by heating a rod-shaped mold.
  • this invention relates to an artificial intestine, it can be used in the fields of medical equipment and biological experiment equipment.

Landscapes

  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Prostheses (AREA)

Abstract

【解決課題】　管腔構造体内部の凹凸を三次元的に調整し，適切な構造を有する管腔構造体の製造方法を提供する。 【解決手段】　管腔構造体の外形に対応した凹部を有する鋳型に収容された仮固定剤であって，管腔構造体の内腔本体部に対応した芯形成部材が挿入された仮固定剤である鋳型内仮固定剤を得る鋳型内仮固定剤取得工程と，　芯形成部材を用いて鋳型内仮固定剤の内部に泡を生じさせた状態で鋳型内仮固定剤を固化させる鋳型内仮固定剤固化工程とを含む，　管腔構造体の製造方法。

Description

管腔構造体，及び管腔構造体の製造方法
　この発明は，人工腸などの管腔構造体や管腔構造体を製造する方法に関する。より詳しく説明すると，気泡により三次元的な凹凸を調整できる管腔構造体を製造する方法などに関する。
　特表２０２０－５０００１８号公報には，人工腸組織が記載されている。このように人工的に腸を製造する技術は知られている。
　この発明は，人工腸などの管腔構造体では，管腔構造体内部の凹凸を三次元的に調整し，適切な構造を有する管腔構造体を製造することが望まれた。
特表２０２０－５０００１８号公報
　この発明は，管腔構造体内部の凹凸を三次元的に調整できる管腔構造体の製造方法や管腔構造体を提供する。
　この発明は，基本的には泡を用いることで管腔構造体内部の凹凸を三次元的に調整できるという実施例による知見に基づく。
　この発明の管腔構造体の製造方法は，鋳型内仮固定剤取得工程と，鋳型内仮固定剤固化工程とを含む。管腔構造体の例は，人工腸である。
　鋳型内仮固定剤取得工程は，鋳型内仮固定剤を得るための工程である。鋳型内仮固定剤は，管腔構造体の外形に対応した凹部を有する鋳型に収容された仮固定剤であって，前記管腔構造体の内腔本体部に対応した芯形成部材が挿入された仮固定剤である。仮固定剤の例は，プレゲル溶液である。
　鋳型内仮固定剤固化工程は，芯形成部材を用いて鋳型内仮固定剤の内部に泡を生じさせた状態で鋳型内仮固定剤を固化させる工程である。芯形成部材は，電極として機能するものであってもよい。そして，芯形成部材を電極として用いた電気分解により芯形成部材表面に泡を生じさせる電気分解工程を含んでもよい。芯形成部材に印加する電圧の値及び印加時間を調整することで，得られる管腔構造体内部の凹凸の形状を調整できる。
　この工程の後に，固化した鋳型内仮固定剤を鋳型から取り出す工程や，鋳型から取り出した鋳型内仮固定剤を洗浄するなどして，管腔構造体を得てもよい。
　この発明の管腔構造体は，上記の製造方法により得られるものであってもよい。この発明の管腔構造体は，内腔部分を有する管状の管腔構造体であって，内腔部分は，深さが１０μｍ以上２００μｍ以下であり，最大幅が２０μｍ以上５００μｍ以下の窪みを複数有する。この発明の管腔構造体は，窪みを１０２個以上有するものが好ましい。
　この発明は，管腔構造体内部の体腔本体を形成するための棒状モールドにより泡を発生させることで，管腔構造体内部の凹凸を三次元的に調整できる管腔構造体の製造方法を提供できる。
図１は，管腔構造体を説明するための概念図である。 図２は，実施例における製造系の例を示す図である。図２（ａ）は，実施例において用いた鋳型，及び棒状モールドの概念図である。図２（ｂ）は実施例で用いたシステムの概念図である。 図３は，電気分解が進行する様子を示す概念図である。 図４は，電気分解が進行する様子を示す図面に代わる写真である。 図５は，実施例により得られた人工腸を示す図面に代わる写真である。 図６は，細胞培養実験に用いた実験系を示す図面に代わる写真である。 図７は，人工腸内のＣａｃｏ－２細胞を示す図面に代わる写真である。 図８は，人工腸の管の直径と，内腔に形成された窪みの深さと開口部の直径を示す図面に代わるグラフである。 図９は，共培養系を示す図面に代わる写真である。 図１０は，共培養の結果を示す図面に代わる蛍光写真である。 図１１は，監察結果を示す図面に代わる位相差顕微鏡の撮影画像である。
　以下，図面を用いて本発明を実施するための形態について説明する。本発明は，以下に説明する形態に限定されるものではなく，以下の形態から当業者が自明な範囲で適宜修正したものも含む。
　この発明の管腔構造体の製造方法は，鋳型内仮固定剤取得工程と，鋳型内仮固定剤固化工程とを含む。
　管腔構造体
　図１は，管腔構造体を説明するための概念図である。図１（ａ）は管腔構造体の側面図の例を示し，図１（ｂ）は管腔構造体の正面図（端部）の例を示し，図１（ｃ）は，図１（ａ）のＡ－Ａ断面図の例を示し，図１（ｄ）は図１（ａ）の断面図の例を示す。図１（ｅ）は，管腔構造体や実施例を説明するための概念図である。図１に示されるように，管腔構造体１は，管腔構造体の本体部分３と，本体部分３の内側に形成された内腔部分５とを有する。管腔構造体の外形は，いわゆる管状である。内腔部分５は，円筒状の内腔本体部７と，管腔構造体の本体部分３の領域に形成された複数の窪み９とを有する。図１（ｂ）に示す例では，管腔構造体の端部領域の内腔部分５には，内腔本体部７のみが存在し，窪み９が存在していない。しかしながら，この発明の管腔構造体は，その端部領域の内腔部分５にも窪み９が存在してもよい。管腔構造体は，柔軟性のあるものであってもよい。
　管腔構造体は，例えば，ヒト又は哺乳動物の腸の一部と類似した大きさや物性を有するものであることが好ましい。管腔構造体は，例えば，管状である。管腔構造体の長さは，用途に応じて適宜調整すればよい。また，管腔構造体の本体部分３を形成する壁の厚さも用途に応じて適宜調整すればよい。管の長さをｌｔとすると１ｍｍ≦ｌｔ≦１ｍでもよく，１ｍｍ≦ｌｔ≦１０ｃｍでもよく，１ｍｍ≦ｌｔ≦１ｃｍでもよく，５ｍｍ≦ｌｔ≦１ｍでもよく，５ｍｍ≦ｌｔ≦５０ｃｍでもよく，５ｍｍ≦ｌｔ≦１０ｃｍでもよい。管の外周の平均半径をｒｔとすると，０．１ｍｍ≦ｒｔ≦３ｃｍでもよく，０．６ｍｍ≦ｒｔ≦１ｃｍでもよく，０．６ｍｍ≦ｒｔ≦５ｍｍでもよく，０．６ｍｍ≦ｒｔ≦３ｍｍでもよい。管の内腔（内腔本体部７）の平均直径をｄｔとすると，０．１ｒｔ≦ｄｔ≦１．８ｒｔでもよく，０．１ｒｔ≦ｄｔ≦０．８ｒｔでもよく，０．２ｒｔ≦ｄｔ≦０．８ｒｔでもよく，０．２ｒｔ≦ｄｔ≦０．６ｒｔでもよく，０．３ｒｔ≦ｄｔ≦０．６ｒｔでもよい。管腔構造体は，公知の生体親和性のある樹脂を適宜用いればよい。人工腸は，公知なので，公知の素材を用いて管腔構造体を製造できる。
　窪み９は，意図的に形成された凹凸であり，窪みの上にさらに窪みが形成されてもよい。窪み９の例は，略半球状のものであり，深さが１０μｍ以上２００μｍ以下であり，最大幅が２０μｍ以上５００μｍ以下である。管腔構造体は，この範囲に含まれる窪み９が，複数存在すればよい。窪み９を形成する深さ及び幅は，泡の半径及び直径と同視できる。すると，窪み９の深さの例は，１０μｍ以上２００μｍ以下であり，２０μｍ以上１５０μｍ以下でもよく，２０μｍ以上１００μｍ以下でもよく，５０μｍ以上１５０μｍ以下でもよく，５０μｍ以上１００μｍ以下でもよい。窪み９の幅の例は，上記の窪み９の深さの１倍以上４倍以下であり，１．２倍以上３倍以下でもよく，１．３倍以上２．５倍以下でもよい。この発明の管腔構造体は，上記のいずれかの範囲に相当する窪み９を１×１０２個以上有するものが好ましい。窪み９の数は，１×１０２個以上１×１０２０個以下でもよいし，２×１０２個以上１×１０１０個以下でもよいし，１×１０３個以上１×１０９個以下でもよいし，１×１０３個以上１×１０８個以下でもよい。
　管腔構造体の例は，人工腸である。腸の例は，小腸及び大腸である。小腸の例は，十二指腸，空腸及び回腸である。大腸の例は，盲腸，結腸及び直腸である。結腸は，上行結腸，横行結腸，下行結腸及びＳ状結腸である。人工腸は，これらの何れかの部分又は全長に置換する人工臓器であってよい。このため，その大きさや太さは用途に応じて適宜調整すればよい。腸は，ヒトの人工腸であることが好ましい。つまり，好ましい人工腸の例は，ヒトの治療用の医療機器である。
　鋳型内仮固定剤取得工程
　鋳型内仮固定剤取得工程は，鋳型内仮固定剤を得るための工程である。鋳型内仮固定剤は，管腔構造体の外形に対応した凹部を有する鋳型に収容された仮固定剤であって，前記管腔構造体の内腔本体部に対応した芯形成部材が挿入された仮固定剤である。仮固定剤は，後の処理により硬化する前の状態の剤を意味する。仮固定剤は，液状であってもよいし，半固体状であってもよい。仮固定剤の例は，熱硬化性樹脂，光硬化性樹脂，接着剤，印象材，及びプレゲル溶液である。熱硬化性樹脂は，熱を加えることで固化する樹脂である。光硬化性樹脂は，光を照射することで固化する樹脂である。接着剤は，水分が蒸発すると固化する樹脂である。プレゲル溶液は，例えば，特許７１２９６６８号公報，特開２０２０－１８０２３９号公報や特表２０２２－５１３２２９号公報に記載されるように，所定の樹脂成分を含み，熱を加えたり，風乾することでゲル化する半固体の液である。この工程は，管腔構造体の外形である円柱状のものを製造した後に，芯部分を取り除き，芯形成部材を挿入してもよい。この工程は，管腔構造体の外形である円柱状のものを製造した後に，芯形成部材を挿入し，芯部分を排除してもよい。この工程は，あらかじめ芯形成部材を鋳型内に挿入しておいて，芯部分（内腔本体部７に対応する）を除いた状態で，鋳型内仮固定剤を得てもよい。
　鋳型内仮固定剤固化工程
　鋳型内仮固定剤固化工程は，芯形成部材を用いて鋳型内仮固定剤の内部に泡を生じさせた状態で鋳型内仮固定剤を固化させる工程である。この泡は，意図的又は人為的に発生させるものである。また，この泡の発生量や発生位置を制御するものが好ましい。芯形成部材は，電極として機能するものであってもよい。そして，芯形成部材を電極とした用いた電気分解により芯形成部材表面に気泡を生じさせる電気分解工程を含んでもよい。芯形成部材に印加する電圧の値及び印加時間を調整することで，得られる管腔構造体内部の凹凸の形状を調整できる。また，芯形成部材がその表面に微小な穴（鋳型内仮固定剤が内部に侵入しにくい程度の大きさ）を複数有しており，芯形成部材内部から流体（例えば，空気やオイル）を放出することで，泡を形成してもよい。例えば，流体がオイルの場合は，オイルが存在した部分が，固化せずに窪み９となる。この工程の後に，固化した鋳型内仮固定剤を鋳型から取り出す工程や，鋳型から取り出した鋳型内仮固定剤を洗浄するなどして，管腔構造体を得てもよい。
　この発明の管腔構造体は，上記の製造方法により得られるものであってもよい。人工腸は，各種医療行為や，医療関連の実験に用いることができる。以下，この発明を，人工腸を例にして説明する。しかしながら，この発明は以下の実施例に限定されるものではなく，公知の技術を適宜採用したものも含む。
　［実験例１］
　人工腸の製造
　人工腸を作成するにあたり，以下の鋳型，及び棒状モールドを準備した。図２は，実施例における製造系の例を示す図である。図２（ａ）は，実施例において用いた鋳型，及び棒状モールドの概念図である。図２（ｂ）は実施例で用いたシステムの概念図である。棒状モールドは，中空の芯部分に対応するものである。鋳型は１０×２５×３のアルミニウム片からコラーゲンプレゲル溶液注入用の溝を掘ったものを用いた。鋳型は導電性材料であれば，アルミニウムに限定されない。棒状モールドとして，直径０．５ｍｍのタングステンを用いた。棒状モールドは導電性材料であれば，タングステンに限定されない。
　鋳型にコラーゲンプレゲル溶液（Ａｔｅｌｏｃｅｌｌ）を充填した。棒状モールドを電極として用い，タングステンワイヤを介して，５Ｖの直流電圧を２００ｍ秒間印可し，プレゲルを電気分解することにより気泡を発生させた。３７℃の状態で，２時間静置することによりゲルを硬化させた。ゲルを硬化させた後に得られたコラーゲンチューブを鋳型から取出し，人工腸を得た。
　図３は，電気分解が進行する様子を示す概念図である。上図は，電気分解前の様子を示す。中図は，電気分解が始まり，マイクロバブル（微小な泡）が発生した様子を示す。下図は，電気分解が進み，コラーゲンプレゲル溶液内のタングステンワイヤ周辺に多数のマイクロバブルが生じている様子を示す。
　図４は，電気分解が進行する様子を示す図面に代わる写真である。上図は，電気分解前の様子を示し，下図は電気分解が進み，コラーゲンプレゲル溶液内のタングステンワイヤ周辺に多数のマイクロバブルが生じている様子を示す。
　図５は，実施例により得られた人工腸を示す図面に代わる写真である。上図は位相差像を示し，下図は蛍光顕微鏡写真を示す。
　半径１．２ｍｍの溝を持つ鋳型と直径０．５ｍｍの棒状モールドを用いて得られた，人工腸の外径および内径の寸法（平均値±標準偏差）はそれぞれ，２４５４±２４μｍ，５３８±２２μｍである。
鋳型および棒状モールドの寸法を変更することで所望の大きさの人工腸を得られる。過度に大きな外径は培地浸透性の悪化を，過度に大きな内径は細胞がコンフルエントになるまでに要する培養日数の増加を，それぞれ引き起こす。そのため，内径は５００μｍ以下が望ましい。
　窪みの形状は，棒状モールド表面を加工することで制御可能である。例えば，表面に撥水コーティング（ＯＰＴＯＯＬ　ＨＤ－１１００ＴＨ，　ＤＡＩＫＩＮ，　Ｊａｐａｎ）を施した場合，気泡の接触角を変更可能である。接触角を小さくすることで，窪みの開口部が広くなり，後の細胞播種が容易になる利点がある。
　窪みの大きさは，電気分解の電圧印加時間で制御可能である。５Ｖ電圧を用いた場合，印加時間を２５ｍ秒，１００ｍ秒，２００ｍ秒，１０００ｍ秒と長くすると，生成する気泡の直径（平均値±標準偏差）は，それぞれ６４．５±２２．３μｍ，７６．５±２６．２μｍ，１１６．６±２８．７μｍ，１３１．２±３３．８μｍと大きくなる。電圧印加時間が２００ｍ秒より大きくなると，生成した気泡が周囲の気泡と結合し，より大きな気泡を形成するため，結果的に窪みの数は少なくなる。
　コラーゲンゲル（４．０ｍｇ／ｍＬ）を用いて細胞を培養する場合，細胞のけん引力による窪みの変形を鑑みると，深さは１００μｍ以上あることが望ましい。深さがこれより小さいと窪みが平らになってしまう場合がある。
　管の硬度は，コラーゲンゲルの濃度を濃くしたり，ゼラチンを用いたりすることで，より硬くすることが可能である。その場合，深さが１００μｍより小さくても問題ない。
　［実験例２］
　ヒト細胞の培養
　図６は，細胞培養実験に用いた実験系を示す図である。図６の１のとおり，理化学研究所より購入したＣａｃｏ－２細胞懸濁液　（１．０　×　１０７　ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を注射器（２５０　μＬ，ハミルトン）に入れ，棒状モールドを取り除いたコラーゲンゲル内腔に注入した。図６の２のとおり，５％ＣＯ２中にて，３７℃にてインキュベートした。図６の３のとおり，ヒト細胞（Ｃａｃｏ－２細胞）を再び撒種した。図６の４のとおり，上下を逆にしてインキュベートした。鋳型から人工腸を取りはずした。
　図７は，人工腸内のＣａｃｏ－２細胞を示す図面に代わる写真である。
　図８は，人工腸の管の直径と，内腔に形成された窪みの深さと開口部の直径を示す図面に代わるグラフである。図８に示される通り，４日間の培養を行うと，細胞のけん引力により，管の直径は１４％短くなり，窪みの深さは６１％短くなり，窪みの開口部の直径は３４％長くなった。
　［実験例３］
　ヒト細胞及び腸内細菌の共培養
　次に，ビフィズス菌を用いて人工腸を共培養した。図９は，共培養系を示す図面に代わる写真である。得られた人工腸内部にビフィズス菌（５．０　×　１０８　ｃｅｌｌｓ／ｍＬ）を撒菌し，２４時間静置培養した。蛍光染色したビフィズス菌を観察した。この例では，人工腸をヒト細胞（Ｃａｃｏ－２細胞）を培養する培地内に設置するとともに，人工腸の両端部の開口から腸内細菌（ビフィズス菌）を培養する培地を流入及び流出させた。図１０は，共培養の結果を示す図面に代わる蛍光写真である。上図及び下図に腸内細菌（ビフィズス菌）とヒト細胞（Ｃａｃｏ－２細胞）の写真をそれぞれ示す。図１０に示される通り，結果，人工腸内腔にビフィズス菌が留まっていることを確認した。
　［実験例４］
　Ｆ－ｈｉＳＩＥＣ培養手順
　培養方法
　細胞の播種は、Ｆ－ｈｉＳＩＥＣＴＭ（ＦＵＪＩＦＩＬＭ　ｈｕｍａｎ　ｉＰＳ　ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｓｍａｌｌ　Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ　Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　ｌｉｋｅ　Ｃｅｌｌ）を専用播種培地に４．０×１０６ｃｅｌｌｓ／ｍＬ濃度で懸濁し、形成したチューブに複数回に分けて送液することで行った。
　細胞播種の翌日から、専用培養培地に切り替え、以後２日おきに培地交換を行った。培地交換の際は、チューブ内腔への送液も行うことで死細胞の除去も同時に行った。
チューブでの培養は９日間行った。
　観察結果
　図１１に、位相差顕微鏡の撮影画像を示す。図１１左上は、膜種直後の様子を示す。図１１右上は、９日後の様子を示す。図１１左下は、図１１右上の部分拡大図を示す。図１１右下は、図１１左下の拡大図を示す。位相差顕微鏡の観察により、管腔内での細胞の増殖および腸上皮様組織の形成を確認した。さらに、腸上皮様組織の形成に伴い細胞の牽引力が働き、チューブ内壁が収縮方向に引っ張られることで、チューブ内径が減少する現象が観察された。
　本発明のポイントは，生体内の腸管内壁で観察される，無数の１００μｍオーダーの凹凸を，３次元方向に，かつ瞬時に作製可能な点である。さらに，作製に必要な装置は一般的な任意波形発生器のみであり，特殊な装置を必要としないため導入障壁が低い。
　また，管の素材はゲルに限定されない。泡によって窪みが作製できること，泡を除去しても窪みが維持できること，の２つの条件を満たせば作製可能である。
　さらに，気泡の発生方法は電気分解に限らない。例えば，空気送達が可能な管状で，かつ表面に空気噴出口を設けた棒状モールドを用いる方法や，棒状モールドを加熱することで溶存気体を発生させる方法などが挙げられる。
　この発明は，人工腸などに関するので医療機器の分野や，生物学的実験装置の分野などで利用されうる。
 

Claims (7)

  1. 　管腔構造体の外形に対応した凹部を有する鋳型に収容された仮固定剤であって，前記管腔構造体の内腔本体部に対応した芯形成部材が挿入された仮固定剤である鋳型内仮固定剤を得る鋳型内仮固定剤取得工程と，
    　前記芯形成部材を用いて前記鋳型内仮固定剤の内部に泡を生じさせた状態で前記鋳型内仮固定剤を固化させる鋳型内仮固定剤固化工程とを含む，
    　管腔構造体の製造方法。
  2. 　請求項１に記載の管腔構造体の製造方法であって，
    　前記管腔構造体は，人工腸である，方法。
  3. 　請求項１に記載の管腔構造体の製造方法であって，
    　前記仮固定剤は，プレゲル溶液である，方法。
  4. 　請求項３に記載の管腔構造体の製造方法であって，
    　前記芯形成部材は，電極であり，
    　前記鋳型内仮固定剤固化工程は，前記芯形成部材を電極として用いた電気分解により前記芯形成部材表面に前記泡を生じさせる電気分解工程を含む，方法。
  5. 　請求項４に記載の管腔構造体の製造方法であって，
    　前記電気分解工程は，前記芯形成部材に印加する電圧の値及び印加時間を調整することで，得られる管腔構造体内部の凹凸の形状を調整する，方法。
  6. 　内腔部分を有する管状の管腔構造体であって，
    　前記内腔部分は，深さが１０μｍ以上２００μｍ以下であり，最大幅が２０μｍ以上５００μｍ以下の窪みを複数有する管腔構造体。
  7. 　請求項６に記載の管腔構造体であって，
    　前記窪みを１０２個以上有する管腔構造体。
PCT/JP2023/035893 2022-09-30 2023-10-02 管腔構造体，及び管腔構造体の製造方法 WO2024071433A1 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022158455 2022-09-30
JP2022-158455 2022-09-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024071433A1 true WO2024071433A1 (ja) 2024-04-04

Family

ID=90478224

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2023/035893 WO2024071433A1 (ja) 2022-09-30 2023-10-02 管腔構造体，及び管腔構造体の製造方法

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2024071433A1 (ja)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020208094A1 (en) * 2019-04-09 2020-10-15 Cambridge Enterprise Limited Tissue equivalent tubular scaffold structure, and methods of production thereof

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020208094A1 (en) * 2019-04-09 2020-10-15 Cambridge Enterprise Limited Tissue equivalent tubular scaffold structure, and methods of production thereof

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KUN YAN: "Wire templated electrodeposition of vessel-like structured chitosan hydrogel by using a pulsed electrical signal", SOFT MATTER, ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY, GB, vol. 16, no. 41, 28 October 2020 (2020-10-28), GB , pages 9471 - 9478, XP093153440, ISSN: 1744-683X, DOI: 10.1039/D0SM01134G *
NIKOLAEV MIKHAIL; MITROFANOVA OLGA; BROGUIERE NICOLAS; GERALDO SARA; DUTTA DEVANJALI; TABATA YOJI; ELCI BILGE; BRANDENBERG NATHALI: "Homeostatic mini-intestines through scaffold-guided organoid morphogenesis", NATURE, vol. 585, no. 7826, 16 September 2020 (2020-09-16), pages 574 - 578, XP037254028, DOI: 10.1038/s41586-020-2724-8 *
TANAKA SHUMA; ITAI SHUN; ONOE HIROAKI: "A Three-Dimensional Artificial Intestinal Tissue With A Crypt-Like Inner Surface", 2023 IEEE 36TH INTERNATIONAL CONFERENCE ON MICRO ELECTRO MECHANICAL SYSTEMS (MEMS), IEEE, 15 January 2023 (2023-01-15), pages 456 - 459, XP034301989, DOI: 10.1109/MEMS49605.2023.10052541 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liao et al. A material odyssey for 3D nano/microstructures: two photon polymerization based nanolithography in bioapplications
Mao et al. Recent advances and challenges in materials for 3D bioprinting
JP6568299B2 (ja) バイオ印刷のための回転装置およびその使用方法
CN107320780B (zh) 一种中空管结构的多层水凝胶及其制备方法与应用
US8304228B2 (en) Method and device for the formation of biological cell material
US9452239B2 (en) Fabrication of interconnected model vasculature
Han et al. Optimized vascular network by stereolithography for tissue engineered skin
CN102198022A (zh) 一种活性细胞-水凝胶类器官结构体的立体成形方法
WO2024071433A1 (ja) 管腔構造体，及び管腔構造体の製造方法
KR101949846B1 (ko) 3d 프린팅을 이용한 인공혈관 제조를 위한 구조체의 제조방법, 그로부터 제조된 인공혈관 제조를 위한 구조체, 인공혈관 제조를 위한 구조체를 이용한 인공혈관의 제조방법 및 그로부터 제조된 인공혈관
WO2021080516A1 (en) Method of forming a vasculature structure and a vasculature structure thereof
US20130157360A1 (en) Biomimetic tissue scaffold and methods of making and using same
Taira et al. Electrodeposition-based rapid bioprinting of 3D-designed hydrogels with a pin art device
CN103120808B (zh) 一种三维软体支架的制备方法
Yadegari et al. Specific considerations in scaffold design for oral tissue engineering
CN109384952A (zh) 一种图案化的细菌纤维素膜及其制备方法与应用
Qi et al. A 3D bioprinted hydrogel multilevel arc vascular channel combined with an isomaltol core sacrificial process
JP2017055734A (ja) 血管様立体構造物およびその製造方法，血管様立体構造物製造装置，並びに血管様立体構造物製造用ニードル
WO2018207783A1 (ja) 多層構造体とその製造方法及び利用方法
WO2019012622A1 (ja) 任意形状の３次元細胞構造体の製造装置およびその製造方法
MODEL Sung JH, Yu J, Luo D, Shuler ML b, March JC (2011) Microscale 3-D hydrogel scaffold for biomimetic gastrointestinal (GI) tract model. Lab on a Chip 11: 389-392-Reproduced by permission of The Royal Society of Chemistry Biological and Environmental Engineering, Cornell University, USA. b Biomedical Engineering, Cornell University, USA
DE102009050498B4 (de) Perfundierbarer Bioreaktor zur Herstellung von menschlichen und tierischen Geweben
Lombardo Development of a Novel in vitro System for Biomedical Applications
CN118064368A (zh) 一种可视化仿生肺癌类器官芯片的制备方法
Abeta et al. Collagen Hollow Microbeads for Engineered Hollow Organ Model in Vitro

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23872652

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1