WO2024052571A1 - Procede d'identification d'epitopes conformationnels - Google Patents

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WO2024052571A1
WO2024052571A1 PCT/EP2023/074814 EP2023074814W WO2024052571A1 WO 2024052571 A1 WO2024052571 A1 WO 2024052571A1 EP 2023074814 W EP2023074814 W EP 2023074814W WO 2024052571 A1 WO2024052571 A1 WO 2024052571A1
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WO
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peptides
peptide
protein antigen
antibodies
protein
Prior art date
Application number
PCT/EP2023/074814
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Jean-François ZAGURY
Gabriel MOREAU
Original Assignee
Peptinov
Conservatoire National des Arts et Métiers
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    • G16B15/00—ICT specially adapted for analysing two-dimensional or three-dimensional molecular structures, e.g. structural or functional relations or structure alignment
    • G16B15/30—Drug targeting using structural data; Docking or binding prediction

Definitions

  • the present invention relates to a method for identifying conformational epitopes, as well as a method for preparing antibodies directed against said conformational epitopes.
  • B Lymphocytes from which monoclonal antibodies are derived is often done by screening among all the antibodies recognizing all or part of the three-dimensional structure of the targeted protein antigen, and this screening with numerous steps remains complex.
  • Conformational antibodies correspond to epitopes resulting from the three-dimensional, tertiary or quaternary structure of proteins which most often make it possible to obtain the best affinity for the antibodies and thus to best ensure their biological functions, in particular the neutralization of their target.
  • This neutralization by the monoclonal antibody produced can be done by direct blocking of the protein in question by the antibody or by opsonization of the microorganism targeted by this antibody.
  • the constant region of the antibodies may in particular contain particular peptide sequences allowing recognition by receptors of cells of the immune system or recognition by the complement system.
  • Immunotherapy 11:1 1 -127 propose to prepare monoclonal antibodies directed against conformational epitopes of an antigen by immunizing mice using DNA molecules encoding the antigen, to isolate the B lymphocytes then to fuse them with myeloma cells expressing this antigen to obtain hybridomas producing monoclonal antibodies specific for the three-dimensional structure of the antigen.
  • the present invention arises from the unexpected demonstration, by the inventors, that it was possible to identify conformational epitopes of a protein antigen by combining the screening of peptides from the protein antigen against serum of individuals immunized against the protein antigen and the location of the peptides relative to each other in the three-dimensional structure of the protein antigen.
  • the present invention relates to a method for identifying a conformational epitope of a protein antigen formed of at least two distinct peptides comprising sequences originating from the protein antigen, comprising:
  • the present invention also relates to a plurality of distinct peptides whose respective sequences are derived from the sequence of the protein antigen, each of the distinct peptides being linked to a fluorophore having a distinct fluorescence emission wavelength.
  • the present invention also relates to a plurality, in particular all, of first peptides and second peptides obtained by implementing the method for identifying a conformational epitope as defined above for a protein antigen, in which the first peptides and the second peptides are respectively linked to fluorophores having a distinct fluorescence emission wavelength.
  • the present invention also relates to a method for selecting lymphocytes recognizing a protein antigen from a population of cells, comprising a step of identifying at least one lymphocyte binding to at least two distinct peptides comprising sequences derived from the protein antigen forming a conformational epitope of the protein antigen, in which the conformational epitope is identified by implementing the method for identifying a conformational epitope as defined above.
  • the present invention also relates to a process for preparing at least one antibody, or antibody fragment, directed against a protein antigen, in which the antibody, or the antibody fragment, is prepared from at least one B lymphocyte obtained by implementing the lymphocyte selection process as defined above.
  • the term “comprising” is synonymous with “including”, “containing” or “encompassing” that is to say that when an object “understands” one or more characteristics, other Characteristics other than those mentioned may also be included in the object.
  • the expression “consisting of” means “consisting of”, that is, when an object “consists of” one or more characteristics, the object cannot include other characteristics than those mentioned.
  • the at least one composition comprising antibodies or antibody-carrying B lymphocytes is of any type capable of comprising B lymphocytes or antibodies.
  • the at least one composition may come from a single individual or from several individuals.
  • the at least one composition is obtained from a sample or a biological sample from one or more individuals, such as a sample or a sample of whole blood, serum, ascites, or bone marrow.
  • the at least one composition is a population of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs).
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the at least one composition may comprise only B lymphocytes or be enriched in B lymphocytes. This selection may in particular be carried out using ligands, in particular antibodies, targeting specific membrane markers of B lymphocytes, the antibodies being able to be coupled to magnetic beads or to phosphors, in particular fluorophores, to facilitate the detection, selection, isolation or purification of lymphocyte-antibody complexes.
  • ligands in particular antibodies, targeting specific membrane markers of B lymphocytes, the antibodies being able to be coupled to magnetic beads or to phosphors, in particular fluorophores, to facilitate the detection, selection, isolation or purification of lymphocyte-antibody complexes.
  • B lymphocyte is meant any cell of the B lineage, such as for example, a naive B lymphocyte, an activated B lymphocyte, a memory B lymphocyte, a plasmablast or a plasma cell, particularly long-lived.
  • B lymphocytes recognize the protein antigen via the antibodies they carry.
  • the term “antibody” encompasses antibodies in their entirety as well as antibody fragments comprising at least one antigen-binding portion, such as VL and/or VH, Fab, F fragments ( ab')2, and scFv.
  • the antibody according to the invention can come from a single species, be chimeric, humanized or even human.
  • the antibody according to the invention can be monospecific or bispecific.
  • the antibody according to the invention can be monomeric or multimeric, in particular dimeric or pentameric.
  • the antibody according to the invention can be of isotype A, D, E, G or M, preferably G.
  • the antibody directed against a protein antigen is preferably an antibody, recognizing a conformational epitope of the protein antigen.
  • the antibody directed against a protein antigen is preferably an antibody specific for a three-dimensional structure of the protein antigen.
  • the antibody directed against a protein antigen is preferably a monoclonal antibody.
  • the antibody directed against a protein antigen can be prepared from a purified B lymphocyte, by numerous techniques well known to those skilled in the art.
  • the B lymphocyte possibly after clonal multiplication, can be fused with a myeloma cell to give a hybridoma producing monoclonal antibodies.
  • the DNA sequences coding for all or part of the antibody, in particular its variable parts can be cloned, in particular from the messenger RNAs of the lymphocyte, then be expressed, by recombinant means, by culture cells, possibly after insertion into a humanized antibody structure.
  • the individual immunized against the protein antigen is a non-human mammal or a human.
  • Immunization against the protein antigen can be natural, due to an infectious agent, such as a virus, a bacteria or a eukaryote, which carries and/or expresses the protein antigen in the individual. Immunization against the protein antigen can also be induced artificially, in particular by active immunization using a vaccine comprising the protein antigen or part thereof or inducing the production of the protein antigen in the individual, in particular a live vaccine, in particular attenuated, an inactivated vaccine, a subunit vaccine, a viral vector vaccine or a DNA or RNA vaccine.
  • a vaccine comprising the protein antigen or part thereof or inducing the production of the protein antigen in the individual, in particular a live vaccine, in particular attenuated, an inactivated vaccine, a subunit vaccine, a viral vector vaccine or a DNA or RNA vaccine.
  • a “strong responder” is an individual whose immune response against a peptide or protein antigen is strong compared to that of other individuals belonging to the same population of individuals.
  • sequences derived from the protein antigen are portions or fragments of contiguous amino acid residue sequences of the total amino acid residue sequence of the protein antigen.
  • sequence of the protein antigen is fragmented into at least 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300 , 400 or 500 distinct peptide sequences.
  • sequence of the protein antigen is fragmented into at most 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15 , 10 or 5 distinct peptide sequences.
  • the at least two distinct peptides are at least three, four or five distinct peptides.
  • the at least two distinct peptides are at most six, five or four distinct peptides.
  • the at least two distinct peptides respectively comprise from 6 to 50 amino acid residues, 6 to 40 amino acid residues, 6 to 30 amino acid residues, 6 to 25 amino acid residues, 6 to 20 amino acid residues, 6 to 15 amino acid residues, 10 to 30 amino acid residues, 10 to 20 amino acid residues, 12 to 20 amino acid residues, 10 to 18 acid residues amino, or 10 to 15 amino acid residues.
  • the at least two distinct peptides respectively comprise at least 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 or 12 amino acid residues.
  • the at least two distinct peptides respectively comprise at most 50, 40, 30, 25, 20 or 15 amino acid residues.
  • the at least two peptides comprise non-overlapping sequences from the protein antigen.
  • non-overlapping sequences are such that they do not overlap within the primary structure of the antigen, they are disjoint peptides.
  • the at least two peptides are at a distance between them of 3.10 -9 m (30 Angstrom), 2.5.10 -9 (25 Angstrom) 2.10 -9 m (20 Angstrom), 10 -9 m (10 Angstrom) or less in the three-dimensional structure of the protein antigen.
  • the three-dimensional structure of the protein antigen can be obtained by ray crystallography, by nuclear magnetic resonance (NMR), microscopy or by computer prediction of three-dimensional structure, by example using the Alphafold 2 software (Jumper et al. (2021) Nature 596:583-589; URL: alphafold.ebi.ac.uk).
  • the distance between the at least two distinct peptides can be calculated in numerous ways well known to those skilled in the art. It may be the average of the distances between each amino acid residue of one of the peptides with respect to each amino acid residue of the other or other peptides. Preferably, this is the minimum distance among the respective distances between each amino acid residue of one of the peptides with respect to each amino acid residue of the other peptide(s).
  • the distance between two amino acid residues is the distance between the respective alpha carbon centers of each residue.
  • the protein antigen according to the invention can be a protein or a protein complex of any type. It may in particular be a monomeric or multimeric protein, in particular homomultimeric or heteromultimeric.
  • the protein antigen is composed of one or more proteins comprising at most 10000, 5000, 2500, 1000 or 500 amino acid residues.
  • the protein antigen is composed of a protein or several proteins comprising at least 25, 50, 75, 100 or 200 amino acid residues.
  • the protein antigen is composed of a protein or several proteins comprising from 25 to 10,000 or 25 to 5,000, more preferably from 50 to 2,500, even more preferably from 75 to 2,000 amino acid residues.
  • the protein antigen may consist of only amino acid residues or may include aprotein components in addition to amino acid residues.
  • the protein can be substituted by at least polysaccharide and/or at least lipid.
  • the protein may include one or more prosthetic groups, such as a heme group, a cofactor, a nucleic acid or an iron-sulfur cluster.
  • the protein antigen can come from any type of organism.
  • the protein antigen comes from an infectious agent or a human or animal protein.
  • the protein antigen can in particular be obtained by purification from the organism producing it naturally or by recombinant means, from cell cultures of any type (eukaryotes or prokaryotes).
  • the recognition of peptides by at least one composition comprising antibodies or B lymphocytes carrying antibodies is determined using miniaturized plates (“micro-arrays” also called ELISA chips) of peptides, or by phage expression. (“phage display”) of peptides, or by ELISA against peptides. These techniques are well known to those skilled in the art implementing epitope mapping.
  • the peptides are labeled with different fluorophores and their recognition by at least one composition comprising antibody-carrying B lymphocytes is measured by fluorescence-assisted cell sorting (FACS).
  • FACS fluorescence-assisted cell sorting
  • the at least one first peptide and the at least one second peptide are selected from a plurality of distinct peptides comprising a sequence resulting from of the protein antigen due to their recognition by at least one composition comprising antibodies or B lymphocytes carrying antibodies from at least two distinct individuals immunized against the protein antigen.
  • the at least two distinct individuals are strong responders to the at least one first peptide and the at least one second peptide among a plurality of distinct individuals immunized against the protein antigen.
  • an epitope mapping is implemented by ELISA chip where the protein is cut into peptides, if possible overlapping, which cover it completely and the responses of a composition of antibodies against the peptides can be measured simultaneously.
  • a phage-display approach where the expressed sequences can correspond to the targeted proteins or can be random. In the latter case, we will only take into consideration the areas of the targeted proteins which sufficiently resemble the sequence of peptides presented by the phages and which are identified as “positive”.
  • the three-dimensional structure of the protein antigen is used to calculate the distances between the peptides.
  • This distance can correspond to the smallest distance that separates the amino acids of the two peptides, but other methods of calculating the distance can be used, for example example the distance between the central amino acids of peptides. If the three-dimensional structure of the protein is not available, we can predict it with very reliable prediction tools like Alphafold 2. Once these data are known, we thus have a distance matrix between all the peptides two by two. We can also proceed to 3x3 matrices if we want to refine the method by working directly at the three-dimensional level on triplets of disjoint peptides, even 4x4 or more, by identifying for example all the peptides at a distance less than 3.10 -9 m from each other.
  • any B cell selection method recognizing the identified conformational peptides can be used, here are two possible ones: a.
  • the transformation into the antibody-producing B line can also be done by fusion with transformed lines to obtain hybridomas, according to the method well known to those skilled in the art.
  • the monoclonal antibodies can be produced directly by traditional culture methods, or identified by sequencing, recloned by genetic engineering in cassettes which are used to reinsert the DNA corresponding to the sequenced antibody genes into the genome of lines adapted to the mass production of monoclonal antibodies.
  • the at least one first peptide and the at least one second peptide are selected from a plurality of distinct peptides comprising a sequence resulting from of the protein antigen due to their recognition by at least one composition comprising antibodies or B lymphocytes carrying antibodies from the same individual.
  • the at least one first peptide and the at least one second peptide are strongly recognized among the plurality of distinct peptides comprising a sequence originating from the protein antigen.
  • the first preceding embodiment may be less easy to apply on small numbers of individuals to be analyzed.
  • Another approach, according to the second embodiment is to look for peptides against which individuals respond significantly, for example taking peptides for which the response in an individual is greater than the median of all peptides plus a deviation. type, and project them directly onto the three-dimensional structure(s) of the protein antigen. If peptides thus defined as positive in antibody response in the same individual are found to be neighbors at a distance less than 30 Angstrom (/.e. 3.10 -9 m), we can assume that it is a three-dimensional epitope and attempt to purify cells from this individual that simultaneously recognize both peptides as described above.
  • thresholds are arbitrary and we can modify them according to the number of peptide tuples found to have more if there are not enough signals, or on the contrary less if there are too many tuples ( n>2). For example instead of taking the median plus one standard deviation, we can take the median plus two standard deviations, or the 75th percentile, or the 90th percentile of antibody responses against peptides, etc... We can also play on the size of the epitope by going from 30 to 25, or even to 20, 15, or 10 Angstrom. These approaches can be applied to small numbers of individuals by searching for n-tuples of neighboring peptides (n>2) found in all or some of the individuals tested.
  • n-tuples (n>2) of peptides Another way to identify good n-tuples (n>2) of peptides is to choose the peptides found for example in a group of protected individuals therefore potentially having neutralizing antibodies, and eliminate the n-tuples of peptides which are found in a group of sick individuals from whom it can be assumed that the antibodies would therefore not have been protective.
  • This discriminative approach can work effectively for small groups of subjects to try to select the best n-tuples (n>2) of peptides, i.e. the best conformational epitopes.
  • ELISA data may only be available on a limited number of peptides and individuals, or even a single peptide and a single individual.
  • the peptides are marked with different fluorophores and their recognition by at least one composition comprising B lymphocytes carrying antibodies is measured by FACS.
  • peptides marked with distinct fluorophores of maximum size 60, but of minimum size 10 residues, preferably of at least 15 residues, in particular of at least 20 residues, possibly at least 30 residues.
  • the protein antigen is large, it will be interesting to cover it with as many peptides as possible to identify the maximum number of peptides recognized by the individual's cells, and we can very well test a larger number of colored peptides to the extent of the possibilities of detecting fluorescence wavelengths distinct from the FACS available. This will make it possible to select the peptides recognized by the individual's cells according to their interest: level of response, location in the targeted protein, etc.).
  • Example 1 Identification of antibodies targeting a conformational epitope of the Spike (S) protein of the SARS-CoV2 virus.
  • Example 1 experimentally demonstrates the existence of conformational epitopes comprising at least two peptides, detected following epitope mapping against the E, M, N, and S proteins of SARS- CoV-2.
  • the inventors carried out, from the serum of patients infected with SARS-CoV-2 and controls, the epitope mapping of the E, M, N and S proteins of the SARS-CoV-2 virus using consecutive peptides of size 15 amino acids. overlapping on 1 1 amino acids and covering these 4 proteins. There were thus 16 peptides for E, 53 peptides for M, 102 peptides for N, and 316 peptides for S.
  • the epitope mapping was carried out on the sera of 41 uninfected controls, 27 asymptomatic subjects, 23 symptomatic subjects , and 32 subjects with severe disease.
  • the epitope mapping ELISA data were obtained from ELISA chips from the company JPT Technology, for the 3 types of immunoglobulins IgA, IgG, and IgM.
  • the inventors cleaned the data by treating the immunoglobulins separately, according to standard procedures based on the ELISA values of the negative controls (without serum), the possible presence of batch effects and over-reactivities of nonspecific sera. .
  • the inventors identified the number of identical strong responders between the peptides of each pair, for each group of patients. For the purposes of this example, high responders are chosen as subjects in the top 25% with the highest response. We could also take other values such as the 10% having the highest response, the 30%, or the 50%, these are choices to be made depending on the selection objectives of the peptide pairs.
  • We can also choose other threshold criteria to select strong responders for example an ELISA response threshold, a threshold which could possibly be adjustable depending on the peptides involved, or the protein involved, or the type of immunoglobulin. For the present example, we choose as strong responders against a peptide, the subjects who are simply in the 25% having the strongest ELISA response against this peptide.
  • the inventors also calculated the distance between these peptides.
  • the distances were obtained from the structure 3D of the S protein available in the Protein Data Bank (Reference 6VXX), and here, the distance measured between two peptides corresponds to the minimum distance between 2 amino acids of these peptides.
  • the inventors were then able to count the maximum value of the number of strong responder sera (in the strongest 25%) common to the peptides of each pair. This work is carried out separately for the data from each group of subjects: 41 uninfected controls, 27 asymptomatic subjects, 23 symptomatic subjects, and 32 subjects with severe disease. For the severe group, the maximum value of common subjects in the 8 strongest responders (25% of 32) obtained between peptides from different proteins was 6.
  • the inventors continue with the S protein because it is the largest and it makes it possible to demonstrate the validity of the approach undertaken to identify three-dimensional epitopes.
  • the inventors identified all the pairs of disjoint peptides for which the number of common strong responder sera was greater than the maximum Nmax-group value obtained in point 3 above.
  • the inventors thus obtained the table of pairs of peptides with a distance less than the chosen threshold of 20 Angstrom, having a number of common individuals greater than or equal to 6 (maximum value found in inter-proteins EM , EN, ES, MN, MS, NS), here with the severe group who had a good IgG response (see Table 2).
  • Table 2 Table 2
  • the inventors selected the pairs of peptides presenting a large number of common strong responder serums and evaluated on these pairs of peptides those which presented a distance greater than 20 Angstrom between the peptides, and those which presented a distance less than 20 Angstrom (described from extensively in the Table in the previous paragraph).
  • the inventors were able to compare the distribution of the number of pairs of peptides obtained with that of all the pairs of disjoint peptides from the S protein by a Fisher's exact test. Under the conditions described in the example, here are the results obtained for the different groups:
  • Pairs of S protein peptides selected because they are recognized by the same strong responders, and measurements of enrichment in spatially close peptides compared to all S protein peptide pairs (p value and RR).
  • N-max-group values we may want a less stringent search depending on the number of individuals present in the group and the chosen threshold.
  • Example 2 describes a systematic method for searching for conformational epitopes comprising at least 2 discontinuous peptides, thanks to knowledge of the 3D structure of the Spike (S) protein of SARS-CoV-2 and thanks to the flow cytometry (FACS) analysis of cells from subjects immunized against SARS-CoV-2, using a peptide known to be immunogenic by ELISA in this individual.
  • S Spike
  • FACS flow cytometry
  • the inventors took the cells of an individual who had manifested a prolonged form of Covid-19, so the inventors had sufficient samples of PBMCs taken at different times.
  • the approach used here to search for B lymphocytes recognizing a conformational epitope is different from the previous one because the inventors only knew that the individual had been infected, and that their antibodies recognized the Spike peptide S025 corresponding to residues 97 to 1 1 1
  • This last peptide was biotinylated using the recommendations of the supplier Thermo ScientificTM (EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotinylation kit) then coupled to a fluorescent conjugate, Streptavidin-BV510TM.
  • the inventors looked, using the structural data known for the Spike protein, to see which amino acids of the Spike protein were close in space to this peptide, and the inventors investigated whether peptides containing these amino acids could be recognized by FACS. at the same time as this peptide S025, from B lymphocytes originating from this individual.
  • Peptide S025 is in the NTD region of Spike which encompasses approximately the first 290 residues of Spike.
  • the Spike residues which are not part of the S025 peptide and which are located at a distance less than 20 Angstrom from this peptide (possible size of a conformational epitope)
  • we find in fact the entire NTD domain at except for a few residues.
  • the inventors had peptides of size 15 residues and overlapping on 11 residues covering the entire NTD region (peptides S001, S002,...S070).
  • the inventors were thus able to select the following 24 peptides, covering the NTD region well, to see if one of them also activated the patient's memory B lymphocytes in conjunction with S025: S001, S004, S007, S010, SO 13, SO 16, SOI 9, S021, S023, S028, S031, S034, S037, S040, S043, S046, S049, S05, S055, S058, S061, S064, S067, S070.
  • the inventors thus identified 2 other peptides which marked B lymphocytes at the same time as S025: S021 (residues 81 to 95 of Spike) and S049 (residues 193 to 207 of Spike).
  • the approach developed in this example is very interesting because it easily allows conformational epitopes to be identified (here involving the amino acids of 3 disjoint peptides), even from cells of a single individual.
  • Example 3 describes a method for direct conformational epitope search by flow cytometry (FACS) based on the use of series of peptides marked with different fluorescence colors.
  • This example thus shows how we can directly find a conformational epitope by screening based on series of peptides marked with different fluorescence colors, coming from the same targeted protein.
  • the inventors took the cells of the individual from Example 2, who had manifested a prolonged form of Covid-19, for which the inventors had sufficient samples of PBMCs taken at different times.
  • the inventors produced 6 SARS-CoV2 Spike peptides of size 20 residues covering the NTD (N terminal domain) and RBD (receptor binding domain) domains of Spike:
  • Peptide 2 of residues 93-1 12 in NTD called P2
  • P3 Peptide 3 from residues 217-236 in NTD, called P3,
  • Peptide 4 from residues 438-457 in RBD, called P4, Peptide 5 of residues 458-477 in RBD, called P5, Peptide 6 of residues 501 -520 in RBD, called P6.
  • Peptide P2 contains peptide S025 from Example 2.
  • Peptide P4 corresponds to the RBM (Receptor Binding Motif) region also known to often induce the production of antibodies in infected subjects.
  • Example 2 In order to see if the results of Example 2 could be reproduced by this direct FACS approach, the inventors looked for peptides located at a distance of less than 10 Angstrom from the P2 peptide in the Spike structure. The inventors relied on the 15 mers (overlapping 1 1 residues) covering the entire Spike protein of Example 2. Bioinformatics analysis of the 3D structure of the Spike protein showed that there were 42 of these peptides , disjoint from the P2 peptide, located at a distance of less than 10 Angstrom from the P2 peptide in the 3D structure of Spike.
  • these 16 peptides were biotinylated using the recommendations of the supplier Thermo ScientificTM (EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotinylation kit) and coupled to colored fluorescent conjugates different emission levels for analysis by FACS, these colors also being different from the marking colors of the anti-CD 19 and anti-CD27 antibodies used to identify memory B lymphocytes, and from the marking color of the P2 peptide already produced.
  • Thermo ScientificTM EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotinylation kit
  • the inventors marked the first 8 out of 16 peptides (S5 to S42) with 8 fluorochromes, and the last 8 peptides (S45 to S66) with the same fluorochromes, and carried out the combined labeling experiments between the peptide P2 and each of these two. peptide groups.
  • Number of memory B lymphocytes 3750 out of 152,000 cells analyzed.
  • Number of memory B lymphocytes 3794 out of 165,000 cells analyzed.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'identification d'un épitope conformationnel d'un antigène protéique formé d'au moins deux peptides distincts comprenant des séquences issues de l'antigène protéique, comprenant : - une étape de sélection d'au moins un premier peptide comprenant une séquence issue de l'antigène protéique reconnu par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d'anticorps issue d'au moins un individu immunisé contre l'antigène protéique, et - une étape de sélection d'au moins un deuxième peptide comprenant une séquence issue de l'antigène protéique localisé à une distance de 3.10-9 m ou moins du premier peptide dans une structure tridimensionnelle de l'antigène protéique et reconnu par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d'anticorps issue d'au moins un individu immunisé contre l'antigène protéique de l'étape précédente, dans lequel l'au moins un premier peptide et l'au moins un deuxième peptide forment un épitope conformationnel de l'antigène protéique.

Description

PROCEDE D’IDENTIFICATION D’EPITOPES CONFORMATIONNELS
Domaine de l’invention
La présente invention concerne un procédé d’identification d’épitopes conformationnels, ainsi qu’un procédé de préparation d’anticorps dirigés contre lesdits épitopes conformationnels.
Arrière-plan techniaue
L'intérêt pour les anticorps monoclonaux thérapeutiques ne cesse de croître, année après année. En effet, leur affinité hautement spécifique des antigènes permet de fournir des traitements médicaux très efficaces. Ainsi, de 2005 à 2017 le nombre d’anticorps monoclonaux approuvés par l’agence américaine du médicament est passé de 2 à 64.
Toutefois, il reste un obstacle critique à surmonter pour préparer des anticorps monoclonaux efficaces.
En effet, la sélection des Lymphocytes B à partir desquels sont dérivés les anticorps monoclonaux se fait souvent par un criblage parmi tous les anticorps reconnaissant tout ou partie de la structure tridimensionnelle de l’antigène protéique ciblé, et ce criblage avec de nombreuses étapes reste complexe comme expliqué dans l’article de Saeed et al. (2017) Front. Microbiol. 8:495. On obtient aussi souvent des anticorps ciblant des épitopes linéaires qui présentent généralement une moins bonne affinité que les anticorps conformationnels qui reconnaissent simultanément des parties distinctes de la structure tridimensionnelle de l’antigène protéique. Ces anticorps conformationnels correspondent à des épitopes issus de la structure tridimensionnelle, tertiaire ou quaternaire des protéines qui permettent le plus souvent d’obtenir la meilleure affinité pour les anticorps et ainsi d’assurer au mieux leurs fonctions biologiques, notamment la neutralisation de leur cible. Cette neutralisation par l’anticorps monoclonal produit peut se faire par blocage direct de la protéine en question par l’anticorps ou encore par opsonisation du micro-organisme ciblé par cet anticorps. Dans ce dernier cas, la région constante des anticorps peut notamment contenir des séquences peptidiques particulières permettant la reconnaissance par des récepteurs de cellules du système immunitaire ou la reconnaissance par le système du complément. Ainsi, permettre l’obtention d’anticorps monoclonaux spécifiques d’épitopes conformationnels, reconnaissant donc la structure tridimensionnelle des antigènes cibles, devrait améliorer l’avidité de ces anticorps, et donc leur utilisation comme outils à usage expérimental, comme marqueurs à usage diagnostic, ou comme traitements immunothérapeutiques.
Dans ce cadre, Tsumoto et al. (2019) Immunotherapy 11 :1 1 -127 proposent de préparer des anticorps monoclonaux dirigés contre des épitopes conformationnels d’un antigène en immunisant des souris à l’aide de molécules d’ADN codant l’antigène, d’isoler les lymphocytes B puis de les fusionner avec des cellules de myélome exprimant cet antigène pour obtenir des hybridomes produisant des anticorps monoclonaux spécifiques de la structure tridimensionnelle de l’antigène.
Toutefois, si ce procédé permet bien d’obtenir des anticorps monoclonaux dirigés contre des épitopes conformationnels, il est relativement complexe à mettre en œuvre.
Il reste donc à fournir un procédé simple à mettre œuvre permettant d’identifier des épitopes conformationnels et d’obtenir des anticorps monoclonaux dirigés contre ces épitopes conformationnels.
Résumé de l’invention
La présente invention découle de la mise en évidence inattendue, par les inventeurs, qu’il était possible d’identifier des épitopes conformationnel d’un antigène protéique en combinant le criblage de peptides issus de l’antigène protéique vis-à-vis de sérum d’individus immunisés contre l’antigène protéique et la localisation des peptides les uns par rapport aux autres dans la structure tridimensionnelle de l’antigène protéique.
La présente invention concerne un procédé d’identification d’un épitope conformationnel d’un antigène protéique formé d’au moins deux peptides distincts comprenant des séquences issues de l’antigène protéique, comprenant :
- une étape de sélection d’au moins un premier peptide comprenant une séquence issue de l’antigène protéique reconnu par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps issue d’au moins un individu immunisé contre l’antigène protéique, et
- une étape de sélection d’au moins un deuxième peptide comprenant une séquence issue de l’antigène protéique localisé à une distance de 3.109 m ou moins du premier peptide dans une structure tridimensionnelle de l’antigène protéique et reconnu par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps issue d’au moins un individu immunisé contre l’antigène protéique de l’étape précédente, dans lequel l’au moins un premier peptide et l’au moins un deuxième peptide forment un épitope conformationnel de l’antigène protéique.
La présente invention concerne également une pluralité de peptides distincts dont les séquences respectives sont issues de la séquence de l’antigène protéique, chacun des peptides distincts étant lié à un fluorophore ayant une longueur d’onde d’émission de fluorescence distincte.
La présente invention concerne également une pluralité, notamment la totalité, de premiers peptides et de seconds peptides obtenus par la mise en œuvre du procédé d’identification d’un épitope conformationnel tel que défini ci-dessus pour un antigène protéique, dans laquelle les premiers peptides et les seconds peptides sont respectivement liés à des fluorophores ayant une longueur d’onde d’émission de fluorescence distincte.
La présente invention concerne également un procédé de sélection de lymphocytes reconnaissant un antigène protéique à partir d’une population de cellules, comprenant une étape d’identification d’au moins un lymphocyte se liant à au moins deux peptides distincts comprenant des séquences issues de l’antigène protéique formant un épitope conformationnel de l’antigène protéique, dans lequel l’épitope conformationnel est identifié par la mise en œuvre du procédé d’identification d’un épitope conformationnel tel que défini ci-dessus.
La présente invention concerne également un procédé de préparation d’au moins un anticorps, ou fragment d’anticorps, dirigé contre un antigène protéique, dans lequel l’anticorps, ou le fragment d’anticorps, est préparé à partir d’au moins un lymphocyte B obtenu par la mise en œuvre du procédé de sélection de lymphocytes tel que défini ci-dessus.
Description détaillée de l’invention
Comme on l’entend ici, le terme « comprenant » est synonyme « d’incluant », « contenant » ou « englobant » c’est-à-dire que lorsqu’un objet « comprend » une ou plusieurs caractéristiques, d’autres caractéristiques que celles mentionnées peuvent également être comprises dans l’objet. A l’inverse, l’expression « consistant en » signifie « constitué de », c’est-à-dire que lorsqu’un objet « consiste en » une ou plusieurs caractéristiques, l’objet ne peut pas comprendre d’autres caractéristiques que celles mentionnées.
Composition
L’au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps est de tout type susceptible de comprendre des lymphocytes B ou des anticorps.
L’au moins une composition peut provenir d’un seul individu ou de plusieurs individus. De préférence, l’au moins une composition est obtenue à partir d’un échantillon ou d’un prélèvement biologique d’un ou plusieurs individus, tel qu’un échantillon ou un prélèvement de sang total, de sérum, d’ascite, ou de moelle osseuse.
De préférence, l’au moins une composition est une population de cellules mononuclées du sang périphérique (PBMCs, « peripheral blood mononuclear cells »).
L’au moins une composition peut comprendre uniquement des lymphocytes B ou être enrichie en lymphocytes B. Cette sélection peut notamment se faire à l’aide de ligands, notamment d’anticorps, ciblant des marqueurs membranaires spécifiques de lymphocytes B, les anticorps pouvant être couplés à des billes magnétiques ou à des luminophores, notamment des fluorophores, pour faciliter la détection, la sélection, l’isolement ou la purification des complexes lymphocyte-anticorps.
Par « lymphocyte B » on entend toute cellule de la lignée B, comme par exemple, un lymphocyte B naïf, un lymphocyte B activé, un lymphocyte B mémoire, un plasmoblaste ou un plasmocyte, notamment à longue durée.
Comme cela apparaitra clairement à la personne du métier, les lymphocytes B reconnaissent l’antigène protéique par l’intermédiaire des anticorps qu’ils portent.
Anticorps
Comme on l’entend ici, le terme « anticorps » englobe les anticorps en entier ainsi que les fragments d’anticorps comprenant au moins une partie de liaison à l’antigène, tels que les fragments VL et/ou VH, Fab, F(ab')2, et scFv. L’anticorps selon l’invention peut être issu d’une seule espèce, être chimérique, humanisé ou encore humain. L’anticorps selon l’invention peut être monospécifique ou bispécifique. Par ailleurs, l’anticorps selon l’invention peut être monomérique ou multimérique, notamment dimérique ou pentamérique. L’anticorps selon l’invention peut être d’isotype A, D, E, G ou M, de préférence G.
L’anticorps dirigé contre un antigène protéique est de préférence un anticorps, reconnaissant un épitope conformationnel de l’antigène protéique.
L’anticorps dirigé contre un antigène protéique est de préférence un anticorps spécifique d’une structure tridimensionnelle de l’antigène protéique.
L’anticorps dirigé contre un antigène protéique est de préférence un anticorps monoclonal.
L’anticorps dirigé contre un antigène protéique peut être préparé à partir d’un lymphocyte B purifié, par de nombreuses techniques bien connues de la personne du métier.
A titre d’exemple, le lymphocyte B, éventuellement après multiplication clonale, peut être fusionné avec une cellule de myélome pour donner un hybridome producteur d’anticorps monoclonal. A titre d’exemple également, les séquences d’ADN codant pour tout ou partie de l’anticorps, notamment ses parties variables, peuvent être clonées, notamment à partir des ARN messagers du lymphocyte, puis être exprimées, par voie recombinante, par des cellules de culture, éventuellement après insertion dans une structure d’anticorps humanisés.
Individu
De préférence, l’individu immunisé contre l’antigène protéique est un mammifère non humain ou un humain.
L’immunisation contre l’antigène protéiques peut être naturelle, due à un agent infectieux, tel qu’un virus, une bactérie ou un eucaryote, qui porte et/ou exprime l’antigène protéique chez l’individu. L’immunisation contre l’antigène protéique peut également être induite artificiellement, notamment par immunisation active à l’aide d’un vaccin comprenant l’antigène protéique ou une partie de celui- ci ou induisant la production de l’antigène protéique chez l’individu, en particulier un vaccin vivant, notamment atténué, un vaccin inactivé, un vaccin sous-unitaire, un vaccin à vecteur viral ou un vaccin à ADN ou à ARN.
Comme on l’entend ici un « fort répondeur » est un individu dont la réponse immunitaire à l’encontre d’un peptide ou de l’antigène protéique est forte par rapport à celle d’autres individus appartenant à une même population d’individus. Peptides
Comme on l’entend ici, des séquences issues de l’antigène protéique sont des portions ou des fragments de séquences de résidus d’acides aminés contigus de la séquence de résidus d’acide aminés totale de l’antigène protéique.
De préférence, la séquence de l’antigène protéique est fragmentée en au moins 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400 ou 500 séquences de peptide distinctes.
De préférence, la séquence de l’antigène protéique est fragmentée en au plus 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10 ou 5 séquences de peptide distinctes.
De préférence, les aux moins deux peptides distincts sont au moins trois, quatre ou cinq peptides distincts.
De préférence, les aux moins deux peptides distincts sont au plus six, cinq ou quatre peptides distincts.
De préférence, les au moins deux peptides distincts comprennent respectivement de 6 à 50 résidus d’acides aminés, 6 à 40 résidus d’acides aminés, 6 à 30 résidus d’acides aminés, 6 à 25 résidus d’acides aminés, 6 à 20 résidus d’acides aminés, 6 à 15 résidus d’acides aminés, 10 à 30 résidus d’acides aminés, 10 à 20 résidus d’acides aminés, 12 à 20 résidus d’acides aminés, 10 à 18 résidus d’acides aminés, ou 10 à 15 résidus d’acides aminés.
De préférence, les au moins deux peptides distincts comprennent respectivement au moins 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 ou 12 résidus d’acides aminés.
De préférence, les au moins deux peptides distincts comprennent respectivement au plus 50, 40, 30, 25, 20 ou 15 résidus d’acides aminés.
De préférence, les au moins deux peptides comprennent des séquences non chevauchantes issues de l’antigène protéique. Comme on l’entend ici, des séquences non chevauchantes sont telles qu’elles ne se recouvrent pas au sein de la structure primaire de l’antigène, il s’agit de peptides disjoints.
De préférence, les au moins deux peptides sont à une distance entre eux de 3.10-9 m (30 Angstrom), 2,5.10-9 (25 Angstrom) 2.10-9 m (20 Angstrom), 10-9 m (10 Angstrom) ou moins dans la structure tridimensionnelle de l’antigène protéique.
La structure tridimensionnelle de l’antigène protéique peut être obtenue par cristallographie aux rayons, par résonnance magnétique nucléaire (RMN), microscopie ou encore par prédiction informatique de structure tridimensionnelle, par exemple à l’aide du logiciel Alphafold 2 (Jumper et al. (2021 ) Nature 596:583-589 ; URL : alphafold.ebi.ac.uk).
La distance entre les au moins deux peptides distincts peut être calculées de nombreuses manières bien connues de la personne du métier. Il peut s’agir de la moyenne des distances entre chaque résidu d’acide aminé d’un des peptides vis-à- vis de chaque résidu d’acide aminé de l’autre ou des autres peptides. De préférence, il s’agit de la distance minimale parmi les distances respectives entre chaque résidu d’acide aminé d’un des peptides vis-à-vis de chaque résidu d’acide aminé de l’autre ou des autres peptides.
Comme on l’entend ici, la distance entre deux résidus acides aminés est la distance entre les centres respectifs de carbones en alpha de chaque résidu.
Antigène
L’antigène protéique selon l’invention peut être une protéine ou un complexe protéique de tout type. Il peut notamment s’agir d’une protéine monomérique ou multimérique, notamment homomultimérique ou hétéromultimérique.
De préférence, l’antigène protéique est composé d’une ou de plusieurs protéines comprenant au plus 10000, 5000, 2500, 1000 ou 500 résidus d’acides aminés.
De préférence, l’antigène protéique est composé d’une protéine ou de plusieurs protéines comprenant au moins 25, 50, 75, 100 ou 200 résidus d’acide aminés.
De préférence, l’antigène protéique est composé d’une protéine ou de plusieurs protéines comprenant de 25 à 10000 ou 25 à 5000, plus préférablement de 50 à 2500, encore plus préférablement de 75 à 2000 résidus d’acides aminés.
L’antigène protéique peut être constitué uniquement de résidus d’acides aminés ou comprendre des composants aprotéiques en plus des résidus d’acides aminés. La protéine peut être substituée par au moins polysaccharide et/ou au moins lipide. Par ailleurs, la protéine peut comprend un ou plusieurs groupements prosthétiques, tels qu’un groupement héminique, un cofacteur, un acide nucléique ou un cluster fer-souffre.
L’antigène protéique peut être issu de tout type d’organisme. De préférence, l’antigène protéique est issu d’un agent infectieux ou d’une protéine humaine ou animale. L’antigène protéique peut notamment être obtenu par purification à partir de l’organisme le produisant naturellement ou par voie recombinante, à partir de cultures cellulaires de tout type (eucaryotes ou procaryotes).
Reconnaissance
De préférence la reconnaissance des peptides par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps est déterminée à l’aide de plaques miniaturisées (« micro-arrays » aussi nommées puce ELISA) de peptides, ou par expression de phage (« phage display ») des peptides, ou par ELISA contre les peptides. Ces techniques sont bien connues de la personne du métier mettant en œuvre des cartographies d’épitopes (« epitope mapping »).
De préférence, les peptides sont marqués par des fluorophores différents et leur reconnaissance par au moins une composition comprenant des lymphocytes B porteurs d’anticorps est mesurée par triage de cellules assisté par fluorescence (FACS). On utilisera dans ce cas un FACS permettant la détection simultanée d’au moins 5, 10, 15, 20 ou 25 longueurs d’onde de fluorescence différentes.
Modes de réalisation préférés
Dans un premier mode de réalisation du procédé d’identification d’un épitope conformationnel tel que défini ci-dessus, l’au moins un premier peptide et l’au moins un deuxième peptide sont sélectionnés parmi une pluralité de peptides distincts comprenant une séquence issue de l’antigène protéique du fait de leur reconnaissance par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps issue d’au moins deux individus distincts immunisés contre l’antigène protéique.
De préférence, selon ce premier mode de réalisation, les au moins deux individus distincts sont des forts répondeurs à l’au moins un premier peptide et l’au moins un deuxième peptide parmi une pluralité d’individus distincts immunisés contre l’antigène protéique.
Selon ce premier mode de réalisation on met en œuvre un epitope mapping par puce ELISA où la protéine est découpée en peptides, si possible chevauchants, qui la recouvrent intégralement et on peut mesurer les réponses d’une composition d’anticorps contre les peptides simultanément. Alternativement, on peut utiliser une approche de phage-display, où les séquences exprimées peuvent correspondre aux protéines ciblées ou encore peuvent être aléatoires. Dans ce dernier cas, on ne prendra en considération que les zones des protéines ciblées qui ressemblent suffisamment à la séquence de peptides présentés par les phages et qui sont identifiés comme “positifs". La structure tridimensionnelle de l’antigène protéique (éventuellement plusieurs si l’antigène a plusieurs conformations possibles) est utilisée pour calculer les distances entre les peptides. Cette distance peut correspondre à la distance la plus petite qui sépare les acides aminés des deux peptides, mais d’autres modes de calcul de distance peuvent être utilisés, par exemple la distance entre les acides aminés centraux des peptides. Si la structure tridimensionnelle de la protéine n’est pas disponible, on peut la prédire avec des outils de prédictions très fiables comme Alphafold 2. Une fois ces données connues, on dispose ainsi d’une matrice de distance entre tous les peptides deux à deux. On peut aussi procéder à des matrice 3x3 si on veut affiner la méthode en travaillant directement au niveau tridimensionnel sur des triplets de peptides disjoints, voire 4x4 ou plus, en identifiant par exemple tous les peptides à une distance inférieure à 3.10-9 m les uns des autres.
On recherche ensuite les peptides pour lesquels les compositions présentent des réponses parallèles ou corrélées, ce qui veut dire par exemple qu’on retrouve les mêmes sujets forts répondeurs contre ces peptides au sein d’un groupe. Comme en général, il n’y a qu’une fraction des sujets qui répondent de manière forte à un peptide donné (rarement plus de la moitié voire rarement plus du tiers), on va rechercher les peptides pour lesquels les « forts répondeurs du groupe » sont les mêmes. On va rechercher par exemple les peptides pour lesquels les sujets situés dans le percentile supérieur en terme des réponse anticorps (par exemple 25%, 30%, voire 50%) sont les mêmes à x individus près. Plus le nombre d’individus dans l’étude est faible plus x sera faible, plus le nombre d’individus étudiés sera élevé plus x pourra être élevé. Typiquement, si on étudie les réponses d’un groupe de 24 individus, on pourra prendre le 25% supérieur (6 individus) ou le 33% supérieur (8 individus) avec une flexibilité possible d’un individu différent dans la population supérieure choisie, aboutissant respectivement à 5 ou 7 individus forts répondeurs en commun sur les 6 ou 8 du percentile supérieur respectivement. Si on dispose de 60 compositions on pourra prendre par exemple le 25% supérieur ou le 30% supérieur, respectivement 15 ou 18 individus communs, avec une flexibilité de 1 , 2, ou 3 individus voire plus, respectivement 13, 14 ou 15 individus communs sur 15, ou 15, 16, 17, ou 18 individus sur 18. Pour faire ces calculs, on peut utiliser un logiciel de tests flexible qui permet de lister le nombre d’individus communs obtenus selon les couples, ou triplets, de peptides et les conditions choisies. Alternativement, on peut essayer d’utiliser des coefficients de corrélation entre les réponses contre les peptides, mais cela peut-être moins précis, à moins de se limiter aux groupes de patients à forte réponse, issus des percentiles de réponse anticorps élevés.
Suite aux opérations précédentes, on obtiendra un tableau de couples, ou triplets, de peptides avec les coefficients, à savoir nombres de forts répondeurs en communs ou bien coefficients de corrélation, pour chaque couple de peptide. A partir de ces résultats, nombre de compositions forts répondeurs communs ou fort coefficient de corrélation, on peut ainsi définir les meilleurs couples de peptides qui satisfont des critères suffisamment stringents en terme de nombres de forts répondeurs en commun ou en terme de coefficients de corrélation élevés. Si on travaille sur les réponses anticorps contre plusieurs protéines en même temps, une façon de différencier les meilleures corrélations de couples de peptides issus de la même protéine du bruit de fond sera de regarder les meilleures valeurs trouvées pour les couples de peptides situés sur des protéines différentes. Normalement ces couples ne correspondent pas à un épitope conformationnel sauf si les protéines forment un multimère, et on peut donc prendre comme nombre seuil à considérer la meilleure valeur trouvée en inter-protéines ou bien cette meilleure valeur moins un.
Comme on connaît les distances entre peptides, pour chaque protéine étudiée, on peut différencier les couples de peptides disjoints avec une distance inférieure à 30, 25 ou 20 Angstrom (/.e. 3.10-9, 2,5.10-9 ou 2.10-9 m), correspondant à la taille d’un épitope potentiel d’anticorps, et ceux avec une distance supérieure à 20, 25 ou 30 Angstrom. Comme on l’a vu, ce seuil de distance est important car des études ont montré qu’un épitope reconnu par un anticorps, épitope B, mesure en moyenne 10 à 15 Angstrom avec un maximum de 26-30 Angstrom (Cao ét al. (201 1 ) Immunome Research 7:3:1 ), mais on peut bien-sûr faire varier cette valeur pour prendre des distances plus petites par exemple 10, 15, ou 20 Angstrom, ou des distances plus grandes de 30 voire 35 Angstrom. Il a été observé par les inventeurs que le nombre de couples de peptides présentant une forte valeur de corrélation dans la matrice des couples de peptides est très significativement augmenté en proportion pour les couples ayant une distance inférieure à 25 Angstrom. La seule explication possible pour cet enrichissement en couples de peptides proches, par exemple pour un seuil de distance maximal de 25 Angstrom, est que ces couples de peptides correspondent à des peptides reconnus par les mêmes anticorps dans un sérum donné.
Une fois ces épitopes conformationnels identifiés, il est aisé de faire le clonage d’anticorps. On peut en effet identifier les sujets immunisés qui ont une réponse commune contre les deux, ou trois, peptides parce que ce sont ces sujets justement qui ont servi à sélectionner le couple, ou le triplet, de peptides formant un épitope conformationnel. Parmi tous les couples de peptides possibles, on pourra avoir une préférence pour les peptides présentant des valeurs ELISA plus élevées. Parmi les patients possibles, on pourra aussi choisir ceux qui présentent des valeurs ELISA les plus élevées. Une fois ces sujets producteurs d’anticorps conformationnels (et potentiellement neutralisants) identifiés, plusieurs méthodes expérimentales sont alors possibles pour cloner des lymphocytes B producteurs d’anticorps à partir de leurs PBMCs, et ce, grâce à la connaissance des peptides de l’épitope conformationnel. Toute méthode de sélection des lymphocytes B reconnaissant les peptides conformationnels identifiés est utilisable, en voici deux possibles : a. On peut par exemple transformer leur PBMCs par le virus EBV et sélectionner ensuite les clones producteurs d’anticorps par des cycles de dilution/sélection, en choisissant à chaque fois les groupes de cellules qui produisent des anticorps reconnaissant les deux, ou trois ou quatre peptides du couple, selon le nombre de peptides identifiés dans l’épitope conformationnel. Cette sélection peut se faire après avoir obtenu des clones en nombre suffisant. La transformation en lignée B productrice d’anticorps peut aussi se faire par fusion avec des lignées transformées pour obtenir hybridomes, selon la méthode bien connue de la personne du métier. b. On peut essayer de sélectionner directement des lymphocytes B reconnaissant les deux, trois, quatre ou cinq peptides, selon le nombre de peptides identifiés dans l’épitope conformationnel, par FACS à partir des PBMCs des individus après les avoir stimulés en culture le cas échéant. On essaiera alors de marquer les anticorps de surface des lymphocytes B d’intérêt par les peptides choisis marqués avec un fluorochrome, et de les sélectionner par FACS. On peut aussi essayer de sélectionner les lymphocytes B d’intérêt par un tapis de peptides accrochés à une plaque par des cycles d’adhésion/nettoyage pour éliminer les lymphocytes non adhérents.
Une fois le clonage des bons lymphocytes B effectué, les anticorps monoclonaux peuvent être produits directement par les méthodes de culture traditionnelles, ou bien identifiés par séquençage, reclonés par génie génétique dans des cassettes qui servent à réinsérer l’ADN correspondant aux gènes des anticorps séquencés dans le génome de lignées adaptées à la production en masse d’anticorps monoclonaux.
Dans un deuxième mode de réalisation du procédé d’identification d’un épitope conformationnel tel que défini ci-dessus, l’au moins un premier peptide et l’au moins un deuxième peptide sont sélectionnés parmi une pluralité de peptides distincts comprenant une séquence issue de l’antigène protéique du fait de leur reconnaissance par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps issue d’un même individu.
De préférence, selon ce deuxième mode de réalisation, l’au moins un premier peptide et l’au moins un deuxième peptide sont fortement reconnus parmi la pluralité de peptides distincts comprenant une séquence issue de l’antigène protéique.
Le premier mode de réalisation précédent peut être moins aisé à appliquer sur des effectifs faibles d’individus à analyser. Une autre approche, selon le deuxième mode de réalisation, est de rechercher les peptides contre lesquels les individus répondent de manière significative, par exemple prendre les peptides pour lesquels la réponse chez un individu est supérieure à la médiane de tous les peptides plus un écart-type, et de les projeter directement sur la ou les structure(s) tridimensionnelle(s) de l’antigène protéique. Si des peptides ainsi définis comme positifs en réponse anticorps chez un même individu se retrouvent voisins à une distance inférieure à 30 Angstrom (/.e. 3.10-9 m), on pourra supposer qu’il s’agit d’un épitope tridimensionnel et essayer de purifier les cellules de cet individu qui reconnaissent simultanément les deux peptides comme décrit ci-dessus. Ces seuils sont arbitraires et on peut les modifier selon le nombre de n-uplets de peptides trouvés pour en avoir plus s’il n’y a pas assez de signaux, ou au contraire moins s’il y a trop de n-uplets (n>2). Par exemple au lieu de prendre la médiane plus un écart-type, on peut prendre la médiane plus deux écart- types, ou le 75ème percentile, ou le 90ème percentile des réponses anticorps contre les peptides, etc... On peut aussi jouer sur la taille de l’épitope en passant de 30 à 25, voire à 20, 15, ou 10 Angstrom. Ces approches peuvent être appliquées sur des nombres réduits d’individus en cherchant des n-uplets de peptides voisins (n>2) retrouvés chez tous ou chez une partie de des individus testés.
La méthode de recherche de n-uplets (n>=2) de peptides répondeurs et proches spatialement du paragraphe précédent, s’applique aussi quand on dispose de beaucoup d’individus dans un groupe. On peut ainsi rechercher les peptides reconnus de manière significative par un nombre élevé de sujets (par exemple les répondeurs contre un peptide situés au-dessus du 75ème percentile, ou de la médiane + un écart-type, des réponses contre ce peptide etc...), et regarder les peptides du voisinage dans la structure tridimensionnelle de la protéine (à moins de 30 Angstrom de distance, ou 25, 20, 15, voire 10 Angstrom) : soit il y en a aussi qui sont bien reconnus et ils correspondent alors à des paires de peptides pouvant potentiellement former un épitope conformationnel, soit il n’y en a pas en apparence, mais on peut alors tester de manière systématique tous les peptides voisins pour voir si les peptides d’une paire ne sont pas reconnus simultanément par un lymphocyte B de l’individu.
Une autre façon d’identifier des bons n-uplets (n>2) de peptides, est de choisir les peptides retrouvés par exemple dans un groupe d’individus protégés ayant donc potentiellement des anticorps neutralisants, et éliminer les n-uplets de peptides qui sont trouvés dans un groupe d’individus malades dont on peut supposer que les anticorps n’auraient donc pas été protecteurs. Cette approche discriminante peut fonctionner de manière efficace pour des petits groupes de sujets pour essayer de sélectionner les meilleurs n-uplets (n>2) de peptides, c’est à dire les meilleurs épitopes conformationnels.
Dans certains cas, on peut ne disposer de données ELISA que sur un nombre limité de peptides et d’individus, voire un seul peptide et un seul individu. Dans ce cas, si on choisit un peptide prioritaire parce qu’on pense observer une réponse contre ce peptide chez un ou plusieurs individus, on peut simplement identifier les peptides présents à moins de 30 Angstrom de distance (ou 25, 20, 15, voire 10 Angstrom) de ce peptide dans la structure de l’antigène protéique, que ce soit un monomère ou un multimère, et rechercher de manière systématique si des paires de peptides comprenant le peptide prioritaire choisi et les peptides voisins dans la structure sont reconnues simultanément par des lymphocytes B de l’individu.
Dans un troisième mode de réalisation, les peptides sont marqués par des fluorophores différents et leur reconnaissance par au moins une composition comprenant des lymphocytes B porteurs d’anticorps est mesurée par FACS.
Dans ce cas on procède directement à la détection de l’épitope conformationnel sur les cellules d’un individu en 2 étapes par FACS : une première étape de sélection d’une série de peptides marqués de fluorophores ayant une longueur d’onde d’émission de fluorescence distincte dont les séquences sont issues de la séquence de l’antigène protéique qui seront testés par FACS sur les cellules de l’individu. Cette étape permettra d’identifier des peptides reconnus par les cellules de l’individu et d’en choisir certains comme prioritaires. On pourra ensuite dans une deuxième étape zoomer sur chacun de ces peptides prioritaires, en testant par FACS cette fois chacun de ces peptides marqués avec une série de peptides proches spatialement de ce peptide et marqués avec des fluorophores ayant des longueurs d’onde d’émission de fluorescence distinctes. Typiquement si on part d’un antigène protéique, on pourra tester dans un premier temps au moins 3 peptides marqués de fluorophores distincts de taille maximale 60, mais de taille minimale 10 résidus, préférentiellement d’au moins 15 résidus, notamment d’au moins 20 résidus, possiblement d’au moins 30 résidus. Bien entendu si l’antigène protéique est grand, il sera intéressant de le couvrir d’un maximum de peptides pour identifier le maximum de peptides reconnus par les cellules de l’individu, et on peut très bien tester un plus grand nombre de peptides colorés dans la mesure des possibilités de détection de longueurs d’onde de fluorescence distinctes du FACS dont on dispose. Cela va permettre de sélectionner les peptides reconnus par les cellules de l’individu en fonction de leurintérêt : niveau de réponse, localisation dans la protéine ciblée etc...). Pour chaque peptide sélectionné, on peut ensuite recommencer à tester par FACS en combinaison avec lui une série de peptides proches de lui spatialement, à moins de 25 ou 30 Angstrom par exemple, cette série comprenant typiquement au moins deux peptides mais cela peut aller jusqu’à plusieurs dizaines selon la zone protéique située autour du peptide sélectionné et le nombre de marquages par fluorophores distincts possibles, et on pourra ainsi sélectionner dans la série les peptides reconnus par des lymphocytes B de l’individu en combinaison avec ce peptide prioritaire, et qui forment donc avec ce peptide un épitope conformationnel.
Si on ne souhaite pas choisir de peptide prioritaire, on peut même essayer de tester de manière systématique la reconnaissance de tous les couples de peptides distincts présentant une distance spatiale inférieure à 30 Angstrom de distance, ou 25, 20, 15, voire 10 Angstrom, dans la structure de l’antigène protéique par les lymphocytes B de l’individu, de manière similaire au deuxième mode de réalisation sauf qu’on fait cela pour tous les peptides de l’antigène protéique ou pour des peptides choisis dans des zones spécifiques de l’antigène protéique. Cela peut se faire notamment par le choix d’une pluralité de peptides marqués par au moins deux fluorophores, comme mentionné ci-dessus. L’invention est davantage explicitée à l’aide des Exemples, non limitatifs, qui suivent.
EXEMPLES
Exemple 1 : Identification d'anticorps ciblant un épitope conformationnel de la protéine Spike (S) du virus SARS-CoV2.
L’Exemple 1 ci-dessous démontre expérimentalement l’existence d’épitopes conformationnels comprenant au moins deux peptides, détectés suite à une cartographie d’épitope (« epitope mapping ») contre les protéines E, M, N, et S de SARS-CoV-2.
Les inventeurs ont réalisé à partir du sérum de patients infectés par SARS-CoV-2 et de contrôles l’epitope mapping des protéines E, M, N et S du virus SARS-CoV-2 en utilisant des peptides consécutifs de taille 15 acides aminés se chevauchant sur 1 1 acides aminés et recouvrant ces 4 protéines. Il y avait ainsi 16 peptides pour E, 53 peptides pour M, 102 peptides pour N, et 316 peptides pour S. L’epitope mapping a été réalisé sur les sera de 41 contrôles non infectés, de 27 sujets asymptomatiques, de 23 sujets symptomatiques, et 32 sujets à évolution sévère.
Les données ELISA d’epitope mapping ont été obtenues à partir de puces ELISA de la société JPT Technology, pour les 3 types d’immunoglobulines IgA, IgG, et IgM. Les inventeurs ont nettoyé les données en traitant les immunoglobulines séparément, selon les procédures classiques basées sur les valeurs ELISA des contrôles négatifs (sans sérum), la présence éventuelle d’effets de lot (« batch ») et de sur-réactivités de sérums aspécifiques.
A partir des données ELISA nettoyées, les inventeurs ont recherché les épitopes spécifiques de SARS-CoV-2 reconnus par des IgG. Les inventeurs ont utilisé un t-test statistique et une correction de Bonferroni (sur le nombre de peptides testés), et avec ce test stringent, les inventeurs ont identifié une dizaine d’épitopes linéaires publics SARS-CoV-2 (voir le Tableau 1 ). Tableau 1
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Peptides correspondant à des épitopes linéaires, qui sont reconnus le plus fortement par epitope mapping.
Ensuite, les inventeurs ont cherché à déterminer les épitopes conformationnels en appliquant la procédure selon l’invention en procédant de la façon suivante :
A. Calculs bioinformatiques pour identifier des paires d’épitopes conformationnels.
J. Calcul du nombre de sujets forts répondeurs communs entre deux peptides.
Pour chaque paire des 483 peptides utilisés dans l’epitope mapping, les inventeurs identifié le nombre de forts répondeurs identiques entre les peptides de chaque paire, et ceci pour chaque groupe de patients. Dans le cadre de cet exemple, les forts répondeurs sont choisis comme étant des sujets dans les 25% ayant la réponse la plus élevée. On pourrait aussi prendre d’autres valeurs comme les 10% ayant la réponse la plus élevée, les 30%, ou bien les 50%, ce sont des choix à faire en fonction des objectifs de sélection des paires de peptides. On peut aussi choisir d’autres critères de seuil pour sélectionner les forts répondeurs, par exemple un seuil de réponse ELISA, seuil qui pourrait éventuellement être modulable selon les peptides en jeu, ou la protéine en jeu, ou le type d’immunoglobuline. Pour le présent exemple, on choisit comme forts répondeurs contre un peptide, les sujets qui sont simplement dans les 25% ayant la réponse ELISA la plus forte contre ce peptide.
2. Calcul des distances entre deux peptides.
Pour toutes les paires de peptides issus de la protéine S, les inventeurs ont aussi calculé la distance entre ces peptides. Les distances ont été obtenues à partir de la structure 3D de la protéine S disponible dans la Protein Data Bank (Référence 6VXX), et ici, la distance mesurée entre deux peptides correspond à la distance minimale entre 2 acides aminés de ces peptides. Il y avait 50086 paires de peptides testés pour S (pour 316 peptides recouvrant S), parmi eux 48827 paires de peptides disjoints, et parmi ces derniers, 7287 paires de peptides disjoints présentaient une distance inférieure à 20 Angstrom et 41540 paires de peptides disjoints une distance supérieure à 20 Angstrom.
3. Calcul du nombre maximal Nmax-groupe de sujets forts répondeurs communs entre deux peptides dans le cas des paires de peptides issus de protéines différentes, pour servir de contrôle de base.
Pour les paires de peptides issus de protéines différentes, les inventeurs ont ensuite pu comptabiliser la valeur maximale du nombre de sérums forts répondeurs (dans les 25% les plus forts) communs aux peptides de chaque paire. Ce travail est effectué séparément pour les données issues de chaque groupe de sujets : 41 contrôles non infectés, de 27 sujets asymptomatiques, de 23 sujets symptomatiques, et 32 sujets à évolution sévère. Pour le groupe sévère, la valeur maximale de sujets communs dans les 8 plus forts répondeurs (25% de 32) obtenue entre des peptides de protéines différentes était 6.
4. Pour chaque groupe, sélection des paires de peptides issus de la protéine S pour lesquels le nombre de sujets forts répondeurs communs est supérieur ou égal à Nmax- groupe.
Dans la suite de cet exemple, les inventeurs continuent avec la protéine S car c’est la plus grande et elle permet de démontrer la validité de l’approche entreprise pour identifier des épitopes tridimensionnels. Dans chacun des groupes de sujets, les inventeurs ont identifié toutes les paires de peptides disjoints pour lesquelles le nombre de sérums forts répondeurs communs était supérieur à la valeur maximale Nmax- groupe obtenue au point 3 précédent. Dans le cas de la protéine S, les inventeurs ont ainsi obtenu le tableau des paires de peptides de distance inférieure au seuil choisi de 20 Angstrom, ayant un nombre d’individus communs supérieur ou égal à 6 (valeur maximale trouvée en inter-protéines E-M, E-N, E-S, M-N, M-S, N-S), ici avec le groupe sévère qui avait une bonne réponse IgG (voir le Tableau 2). Tableau 2
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Couples d’épitopes conformationnels reconnus fortement par les mêmes individus. On remarque que les épitopes linéaires du Tableau J ne sont pas retrouvés dans la Table 2, suggérant un mécanisme de reconnaissance différent. De manière intéressante, on observe que les peptides identifiés dans les paires à faible distance, ne correspondent généralement pas aux épitopes linéaires très forts en ELISA identifiés dans le Tableau 1. Les réponses ne montent pas jusqu’à 60000 comme on peut voir pour le peptide épitope linéaire S du Tableau 1 chez les patients sévères, mais on peut trouver des répondeurs ayant un niveau quand même élevé d’anticorps contre les peptides identifiés de 5000 voire 10000.
5. Mesure de l’enrichissement des paires de peptides proches (distance inférieure à 20 Angstrom) parmi les paires sélectionnées au point précédent.
Les inventeurs ont sélectionné les paires de peptides présentant un nombre important de sérums forts répondeurs communs et ont évalué sur ces paires de peptides celles qui présentaient une distance supérieure 20 Angstrom entre les peptides, et celles qui présentaient une distance inférieure à 20 Angstrom (décrites de manière extensive dans le Tableau du paragraphe précédent). Les inventeurs ont pu comparer la répartition du nombre de paires de peptides obtenues avec celle de toutes les paires de peptides disjoints issus de la protéine S par un test exact de Fisher. Dans les conditions décrites dans l’exemple, voici les résultats obtenus pour les différents groupes :
Tableau 3
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Paires de peptides de la protéine S sélectionnées car reconnus par les mêmes forts répondeurs, et mesures de l’enrichissement en peptides spatialement proches par comparaison avec l’ensemble des paires de peptides de la protéine S (valeur p et RR).
On voit que l’enrichissement obtenu pour le groupe des patients sévères, celui qui développe le plus d’anticorps du fait d’une infection prolongée, est très important : Il y a 29 paires de peptides de distance inférieure à 20 Angstrom sur 85 paires de peptides reconnus par les mêmes patients (soit 34%), alors qu’il y a 7287 paires de peptides de distance inférieure à 20 Angstrom sur 48827 paires de peptides disjoints dans la protéine (soit 15%). Cet enrichissement en paires de peptides présentant une distance inférieure à 20 Angstrom est extrêmement significatif sur le plan statistique avec une valeur p=10’5. L’enrichissement en paires de peptides proches spatialement correspond à un rapport de 2,28 (rapport des fractions 29/85 et 7287/48827) au lieu de la valeur 1 attendue si c’était lié au hasard.
Si on ne dispose de données d’epitope mapping ne provenant que d’une seule protéine, on peut quand même calculer la valeur maximale de sujets communs sur toutes les paires de peptides et prendre cette valeur comme seuil du nombre de forts répondeurs communs, ou cette valeur moins 1 (voire -2 ou moins). Il suffit ensuite de regarder sur ces meilleures valeurs s’il y a un enrichissement en paires de peptides séparés d’une distance acceptable pour un épitope (par exemple moins de 10, 15, 20, ou 25 Angstrom).
Pour les valeurs N-max-groupe on peut souhaiter une recherche moins stringente en fonction du nombre d’individus présents dans le groupe et du seuil choisi.
On peut suivre la même approche avec cette fois les triplets de peptides pour trouver des épitopes impliquant non plus deux mais 3 peptides à la fois. Dans ce cas, on pourra calculer par exemple la distance des peptides deux à deux, voire on pourra vérifier leur présence au sein d’une même sphère de diamètre inférieur à la taille souhaitée d’un épitope (par exemple, 10, 15, 20 ou 25 Angstrom). B. Sélection des PBMCs des patients produisant des anticorps ciblant des épitopes conformationnels
Lorsque les inventeurs ont recherché les sujets forts répondeurs communs entre deux peptides dans les différents groupes, ces sujets étaient nominativement connus à partir des données qui ont justement permis de construire la matrice des couples de peptides ayant des forts répondeurs en commun.
Afin de trouver les épitopes conformationnels les plus intéressants, plusieurs paramètres peuvent être pris en compte. On peut essayer de cibler des patients ayant des fortes réponses contre les deux (ou plus) peptides identifiés dans l’épitope conformationnel. On peut aussi essayer de favoriser les peptides qui correspondent à des sites connus pour ne pas avoir muté au cours du temps (ici il s’agit de la protéine S du SARS-Cov-2 qui est connue pour muter au cours du temps). Comme autre exemple de paramètre pour sélectionner les peptides, on peut aussi privilégier les peptides reconnus par des patients présentant des caractéristiques biologiques ou cliniques particulières. Dans le présent exemple, on a choisi 3 peptides proches qui montrent un niveau de réponse assez élevé : les peptides S008, S021 , et S049 (voir Tableau 2). Il y a deux raisons pour le choix de ces peptides : ils sont trois ce qui peut suggérer une meilleure liaison pour les anticorps qui les reconnaissent en même temps, le niveau de réponse contre ces peptides est relativement fort par rapport à d’autres peptides du Tableau 2.
On aura donc tendance à préférer des paires de peptides exhibant des niveaux de réponse ELISA élevé, mais ce n’est pas une obligation bien-sûr car il peut aussi y avoir des épitopes reconnus moins fortement mais effectifs pour leur effet neutralisant.
Comme on connaît les individus répondeurs contre les 3 peptides (voir Tableau 2, colonne 4), on va choisir ceux qui présentent globalement la plus forte réponse contre ces peptides pour aller récupérer leur PBMCs qui seront utilisés pour la sélection de clones B dans l’étape suivante. Dans le cas présent il s’agissait des patients 40 et 41 .
C. Sélection des clones B à partir des PBMCs des sujets avant des anticorps reconnaissant l’épitope conformationnel
Il y a plusieurs protocoles de sélection de clones B reconnaissant les peptides. Dans le présent exemple, on a choisi un protocole basé sur une sélection par PACS. Les peptides ont été marqués par un fluorochrome, et les lymphocytes B mémoires reconnaissant les 3 peptides sont reconnus. Pour cela on utilise des anticorps marquant les lymphocytes B (anti-CD 19), et on ajoute les peptides marqués à plusieurs concentrations allant 10 ng/ml à 10 microgramme/ml. Le passage au FACS des cellules en présence de l’anticorps marqueur de lymphocytes B mémoire et des peptides a permis de voir d’une part qu’il y avait des clones B marqués par les 3 peptides à la concentration optimale de 1 microgramme/ml, d’autre part de purifier une par une les cellules B marquées par les 3 peptides dans un puits individuel sur microplaque. L’étape suivante a consisté en l’amplification de l'ARN cellulaire et le clonage des fragments variables de la chaîne lourde et de la chaîne légère des IgG dans une cassette d’expression spécifique pour les anticorps monoclonaux. Ces différentes étapes de purification par FACS et clonage sont bien connues de la personne du métier et notamment décrites dans la publication de Corsiero et al. (2016) Ann Rheum Dis. 75 (10): 1866-75.
Des tests d’expression ont ensuite permis de produire de petites quantités d’anticorps monoclonal sur douze lignées productrices d’anticorps monoclonaux. Sur 12 anticorps testés, 8 d’entre eux reconnaissaient bien les 3 peptides S008, S021 , et S049 utilisés pour leur sélection ainsi que la protéine Spike par ELISA, montrant que ces anticorps sont bien des anticorps conformationnels.
Exemple 2
L’exemple 2 ci-dessous décrit une méthode systématique de recherche d’épitopes conformationnels comprenant au moins 2 peptides discontinus, grâce à la connaissance de la structure 3D de la protéine Spike (S) du SARS-CoV-2 et grâce à l’analyse par cytométrie de flux (FACS) de cellules de sujets immunisés contre SARS- CoV-2, et ce, à partir d’un peptide connu pour être immunogène par ELISA chez cet individu.
Dans cet exemple, les inventeurs ont pris les cellules d’un individu ayant manifesté une forme prolongée de Covid-19, pour les inventeurs disposaient de suffisamment d’échantillons de PBMCs prélevés à des temps différents. L’approche utilisée ici pour rechercher des lymphocytes B reconnaissant un épitope conformationnel est différente de la précédente car les inventeurs savaient seulement que l’individu avait été infecté, et que ses anticorps reconnaissaient le peptide S025 de Spike correspondant aux résidus 97 à 1 1 1. Ce dernier peptide a été biotinylé en utilisant les recommandations du fournisseur Thermo ScientificTM (EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC- Biotinylation kit) puis couplé à un conjugué fluorescent, Streptavidin-BV510™. Les inventeurs ont regardé grâce aux données de structure connues pour la protéine Spike, quels étaient les acides aminés de la protéine Spike proches dans l’espace de ce peptide, et les inventeurs ont recherché si des peptides contenant ces acides aminés pouvaient être reconnus par FACS en même temps que ce peptide S025, à partir de lymphocytes B provenant de cet individu.
Le peptide S025 est dans la région NTD de Spike qui englobe environ les 290 premiers résidus de Spike. Quand on recherche tous les résidus de Spike qui ne font pas partie du peptide S025 et qui sont situés à une distance inférieure à 20 Angstrom de ce peptide (taille possible d’un épitope conformationnel), on retrouve en fait tout le domaine NTD (à l’exception de quelques résidus). Les inventeurs disposaient de peptides de taille 15 résidus et se chevauchant sur 1 1 résidus recouvrant toute la région NTD (les peptides S001 , S002,...S070). Les inventeurs ont ainsi pu sélectionner les 24 peptides suivants, couvrant bien la région NTD, pour voir si l’un d’eux allumait aussi des lymphocytes B mémoires du patient en conjonction avec S025 : S001 , S004, S007, S010, SO 13, SO 16, SOI 9, S021 , S023, S028, S031 , S034, S037, S040, S043, S046, S049, S05, S055, S058, S061 , S064, S067, S070.
Ces 24 peptides ont été biotinylés en utilisant les recommandations du fournisseur Thermo ScientificTM (EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotinilation kit) puis couplés au conjugué fluorescent Streptavidin-phycoérythrine (PE). Les inventeurs les ont ensuite testés un par un dans des expériences de marquage de cellules B mémoire (marqués par des anticorps anti-CD 19-APC et anti-CD27-BV71 1 ), pour voir ceux qui marquaient les lymphocytes B de l’individu en conjonction avec le peptide S025. Les inventeurs ont ainsi identifié 2 autres peptides qui marquaient les lymphocytes B en même temps que S025 : S021 (résidus 81 à 95 de Spike) et S049 (résidus 193 à 207 de Spike).
On pouvait se poser la question de savoir si des résidus de chacun de ces 3 peptides ne formaient pas un même épitope conformationnel (reconnus par le même anticorps). Les inventeurs ont donc biotinylé puis couplé le peptide S049 avec un troisième fluorochrome, le FITC, et recherché à nouveau par FACS dans les cellules du patient, si un lymphocyte B ne reconnaissait pas les 3 peptides en même temps. Les inventeurs ont réussi à identifier un lymphocyte B mémoire du patient présentant les 3 couleurs à la fois. Cela montre que ces 3 peptides disjoints contiennent des résidus formant un même épitope conformationnel. Il est alors aisé d’utiliser un trieur de cellule pour récupérer les clones B reconnaissant ces 3 peptides à la fois, et d’utiliser les outils bien connus de la personne du métier pour dériver un anticorps monoclonal ciblant cet épitope conformationnel.
La démarche développée dans cet exemple est très intéressante car elle permet facilement d’identifier des épitopes conformationnels (ici impliquant les acides aminés de 3 peptides disjoints), même à partir de cellules d’un seul individu.
Il est ensuite possible de dériver des anticorps monoclonaux reconnaissant un épitope conformationnel en purifiant par tri cellulaire en cytométrie de flux (FACS) les cellules B reconnaissant les peptides impliqués dans l’épitope conformationnel (tous ou une partie des peptides). Ces cellules B peuvent provenir du même individu, ou d’autres individus eux aussi immunisés (naturellement ou par vaccin) contre l’antigène ciblé. Ces cellules peuvent être cultivées pour obtenir des surnageants contenant des anticorps évaluables in vitro, puis les ARNm des parties variables des anticorps peuvent être par exemple clonés dans des cassettes de production sur lignée pour la production de grandes quantités d’anticorps monoclonal. On peut aussi cloner directement les ARNm des lymphocytes B qui ont été triés par FACS dans un système de cassette pour la production d’anticorps monoclonal en lignée.
Exemple 3
L’exemple 3 ci-dessous décrit une méthode de recherche directe d’épitope conformationnel par cytométrie de flux (FACS) basée sur l’utilisation de séries de peptides marqués par des couleurs de fluorescence différentes.
Cet exemple montre ainsi comment on peut directement retrouver un épitope conformationnel par criblage basé sur des séries de peptides marqués de couleurs de fluorescence différentes, issus de la même protéine ciblée.
Les inventeurs ont repris les cellules de l’individu de l'Exemple 2, ayant manifesté une forme prolongée de Covid-19, pour lequel les inventeurs disposaient de suffisamment d’échantillons de PBMCs prélevés à des temps différents.
Les inventeurs ont produit 6 peptides de la Spike de SARS-CoV2 de taille 20 résidus recouvrant les domaines NTD (domaine N terminal) et RBD (domaine de liaison au récepteur) de Spike :
Peptide 1 de résidus 15-34 dans NTD, appelé PI ,
Peptide 2 de résidus 93-1 12 dans NTD, appelé P2,
Peptide 3 de résidus 217-236 dans NTD, appelé P3,
Peptide 4 de résidus 438-457 dans RBD, appelé P4, Peptide 5 de résidus 458-477 dans RBD, appelé P5, Peptide 6 de résidus 501 -520 dans RBD, appelé P6.
Ces 6 peptides ont été biotinylés en utilisant les recommandations du fournisseur Thermo ScientificTM (EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotinilation kit) et couplés à des fluorochromes de 6 couleurs d’émission différentes pour l’analyse par PACS.
Dans une première expérience, les inventeurs ont testé simultanément la liaison de ces 6 peptides sur des lymphocytes B mémoires (identifiés par des anticorps anti-CD19- APC et anti-CD27-BV71 1 , fluorochromes de couleurs d’émission différentes de celles des peptides).
Sur cette première expérience, les inventeurs ont obtenu 4254 lymphocytes B mémoire sur 181 000 PBMCs testés.
Cette expérience a montré que les lymphocytes B mémoires de l’individu reconnaissent bien 2 peptides en particulier :
Le peptide P2 qui est reconnu par 23 lymphocytes B mémoires, et le peptide P4 reconnu par 34 lymphocytes B mémoires, les autres peptides étant reconnus par moins de 5 lymphocytes B mémoires.
Le peptide P2 contient le peptide S025 de l’ Exemple 2. Le peptide P4 correspond à la région RBM (Motif de liaison au récepteur) connue elle aussi pour induire souvent la production d’anticorps chez les sujets infectés.
Afin de voir si les résultats de l’ Exemple 2 pouvaient être reproduits par cette approche directe par FACS, les inventeurs ont recherché des peptides situés à une distance de moins de 10 Angstrom du peptide P2 dans la structure de Spike. Les inventeurs se sont appuyés sur les 15 mers (chevauchants de 1 1 résidus) recouvrant toute la protéine Spike de l’Exemple 2. L’analyse bioinformatique de la structure 3D de la protéine Spike a montré qu’il y avait 42 de ces peptides, disjoints du peptide P2, situés à une distance de moins de 10 Angstrom du peptide P2 dans la structure 3D de Spike. Il s’agit des peptides S5, S6, SI 5, SI 6, SI 9, S20, S21 , S28, S29, S30, S31 , S32, S33, S34, S35, S39, S40, S41 , S42, S43, S44, S45, S46, S47, S48, S49, S50, S51 , S52, S53, S54, S56, S57, S58, S59, S60, S6L S63, S64, S65, S66, S67.
Comme beaucoup des 42 peptides étaient chevauchants, les inventeurs en ont choisi 16 représentant bien l’ensemble des zones de la protéine couvertes par ces 42 peptides : les peptides S5, S15, S19, S28, S31 , S34, S39, S42, S45, S48, S51 , S54, S57, S60, S63, S66. Comme cela a été fait précédemment pour les 6 peptides de la première série, ces 16 peptides ont été biotinylés en utilisant les recommandations du fournisseur Thermo ScientificTM (EZ-LinkTM Sulfo-NHS-LC-Biotinylation kit) et couplés à des conjugués fluorescents de couleurs d’émission différentes pour l’analyse par FACS, ces couleurs étant aussi différentes des couleurs de marquage des anticorps anti-CD 19 et anti- CD27 utilisés pour identifier les lymphocytes B mémoires, et de la couleur de marquage du peptide P2 déjà réalisé. Les inventeurs ont marqué les 8 premiers peptides sur 16 (S5 à S42) avec 8 fluorochromes, et les 8 derniers peptides (S45 à S66) avec les mêmes fluorochromes, et réalisé les expérimentations de marquage combiné entre le peptide P2 et chacun de ces deux groupes de peptides.
Les résultats du FACS ont été les suivants pour l’expérimentation avec les 8 premiers peptides S5 à S42 :
Nombre de lymphocytes B mémoire = 3750 sur 152000 cellules analysées.
Nombre de cellules B marquées par le peptide P2 seulement : 14
Nombre de cellules B marquées par le peptide P2 et le peptide S19 : 4
Il y avait 10 cellules B marquées par le peptide S19 seulement.
Pour les 7 autres peptides testés, on ne voyait aucune cellule marquée.
Les résultats du FACS ont été les suivants pour l’expérimentation avec les 8 autres peptides S45 à S66 :
Nombre de lymphocytes B mémoire = 3794 sur 165000 cellules analysées.
Nombre de cellules B marquées par le peptide P2 seulement : 19
Nombre de cellules B marquées par le peptide P2 et le peptide S48 : 2
Il y avait 5 cellules B marquées par le peptide S48 seulement.
Pour les 7 autres peptides testés, on ne voyait aucune cellule marquée sauf pour le peptide S66 marquant 2 cellules B.
Cette expérience confirme que les peptides SI 9 et S48 peuvent chacun former un épitope conformationnel avec le peptide P2. De manière intéressante SI 9 est très proche du peptide S21 identifié dans l'Exemple 2, de même S48 est très proche du peptide S49 aussi identifié dans l’Exemple 2. Les inventeurs ont tenté de vérifier par FACS si l’épitope S19/P2 et l’épitope S48/P2 étaient reconnus par le même anticorps. Lors d’une expérimentation similaire aux précédentes, mais impliquant les seuls peptides marqués P2, SI 9, et S48 (qui portaient des fluorochromes différents), les inventeurs ont pu identifier deux cellules marquées par les trois peptides en même temps indiquant qu’il s’agit du même épitope conformationnel. Cet exemple montre que l’approche basée sur l’analyse combinée de série de peptides marqués par différentes couleurs de fluorescence permet bien d’identifier des épitopes conformationnels.
Comme pour l’exemple 2, il est ensuite facile, grâce aux peptides identifiés, de purifier par FACS les lymphocytes B porteurs des anticorps reconnaissant les épitopes conformationnels souhaités, et de procéder à la production d’anticorps monoclonaux selon les bien méthodes connues de la personne du métier.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d’identification d’un épitope conformationnel d’un antigène protéique formé d’au moins deux peptides distincts comprenant des séquences issues de l’antigène protéique, comprenant :
- une étape de sélection d’au moins un premier peptide comprenant une séquence issue de l’antigène protéique reconnu par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps issue d’au moins un individu immunisé contre l’antigène protéique, et
- une étape de sélection d’au moins un deuxième peptide comprenant une séquence issue de l’antigène protéique localisé à une distance de 3.109 m ou moins du premier peptide dans une structure tridimensionnelle de l’antigène protéique et reconnu par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps issue d’au moins un individu immunisé contre l’antigène protéique de l’étape précédente, dans lequel l’au moins un premier peptide et l’au moins un deuxième peptide forment un épitope conformationnel de l’antigène protéique.
2. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’au moins un premier peptide et l’au moins un deuxième peptide sont sélectionnés parmi une pluralité de peptides distincts comprenant une séquence issue de l’antigène protéique du fait de leur reconnaissance par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps issue d’au moins deux individus distincts immunisés contre l’antigène protéique.
3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel les au moins deux individus distincts sont des forts répondeurs à l’au moins un premier peptide et l’au moins un deuxième peptide parmi une pluralité d’individus distincts immunisés contre l’antigène protéique.
4. Procédé selon la revendication 1 , dans lequel l’au moins un premier peptide et l’au moins un deuxième peptide sont sélectionnés parmi une pluralité de peptides distincts comprenant une séquence issue de l’antigène protéique du fait de leur reconnaissance par au moins une composition comprenant des anticorps ou des lymphocytes B porteurs d’anticorps issue d’un même individu.
5. Procédé selon la revendication 4, dans lequel l’au moins un premier peptide et l’au moins un deuxième peptide sont fortement reconnus parmi la pluralité de peptides distincts comprenant une séquence issue de l’antigène protéique.
6. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel les peptides comprennent respectivement de 6 à 30 résidus d’acides aminés.
7. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel les peptides comprennent des séquences non chevauchantes issues de l’antigène protéique.
8. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel l’antigène protéique est issu d’un agent infectieux ou d’une protéine humaine ou animale.
9. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel la reconnaissance des peptides par au moins une composition comprenant des lymphocytes B porteurs d’anticorps est déterminée par expression de phage (« phage display ») ou par ELISA.
10. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel les peptides sont marqués par des fluorophores différents et leur reconnaissance par au moins une composition comprenant des lymphocytes B porteurs d’anticorps est mesurée par PACS.
11. Procédé de sélection de lymphocytes reconnaissant un antigène protéique à partir d’une population de cellules, comprenant une étape d’identification d’au moins un lymphocyte se liant à au moins deux peptides distincts comprenant des séquences issues de l’antigène protéique formant un épitope conformationnel de l’antigène protéique, dans lequel l’épitope conformationnel est identifié par la mise en œuvre du procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 10.
12. Procédé de préparation d’au moins un anticorps, ou fragment d’anticorps, dirigé contre un antigène protéique, dans lequel l’anticorps, ou le fragment d’anticorps, est préparé à partir d’au moins un lymphocyte B obtenu par la mise en œuvre du procédé de sélection de lymphocytes tel que défini dans la revendication 1 1 .
13. Pluralité de premiers peptides et de seconds peptides obtenus par la mise en œuvre du procédé tel que défini dans l’une des revendications 1 à 10 pour un antigène protéique, dans laquelle les premiers peptides et les seconds peptides sont respectivement liés à des fluorophores ayant une longueur d’onde d’émission de fluorescence distincte.
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