WO2024048661A1 - 窒素分子を由来とするｌ－グルタミン酸の発酵製造方法 - Google Patents

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klebsiella
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glutamic acid
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大輔 吉留
有亮 伊藤
湖奈 山下
真誠 日▲高▼
さおり 松田
真 西山
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キッコーマン株式会社
国立大学法人 東京大学
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    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine

Definitions

  • the present invention provides a medium that can maximize the nitrogen-fixing ability of nitrogen-fixing bacteria, a culture method using such a medium, and a method for producing L-glutamic acid using nitrogen molecules in the atmosphere using such a medium and culture method.
  • the present invention relates to microorganisms that are capable of fermentation production of L-glutamic acid, as well as fermentation of L-glutamic acid using nitrogen molecules in the atmosphere.
  • Some microorganisms have the ability to convert nitrogen molecules in the atmosphere into ammonia. This ability is called nitrogen fixation ability. To date, various microorganisms with nitrogen-fixing ability have been searched for, and several hundred species have been discovered, but all of these belong to either the bacterial domain (eubacteria) or the archaeal domain (archaea). These microorganisms are collectively called nitrogen-fixing bacteria. Nitrogen-fixing bacteria can grow using nitrogen molecules as their sole nitrogen source.
  • Nitrogenase is a complex enzyme consisting of dinitrogenase, which reduces nitrogen molecules, and dinitrogenase reductase, which transfers electrons to dinitrogenase.
  • dinitrogenase There are three types of dinitrogenase: Mo type, V type, and Fe type, but dinitrogenase possessed by all nitrogen-fixing bacteria is Mo type and has an iron-molybdenum cofactor in its active center.
  • nitrogen-fixing bacteria cannot exhibit their nitrogen-fixing ability unless molybdenum and iron are present in sufficient amounts in the environment surrounding them. Furthermore, nitrogen-fixing bacteria do not exhibit nitrogen-fixing ability when available nitrogen sources (ammonium salts, nitrates, protein decomposition products such as peptone) are present in the environment surrounding them; and multiply. In other words, nitrogen-fixing bacteria fix nitrogen only when their surrounding environment is depleted of nitrogen sources.
  • nitrogen sources ammonium salts, nitrates, protein decomposition products such as peptone
  • nitrogen-fixing bacteria cyanobacteria can perform nitrogen fixation independently because they produce electrons and ATP used by dinitrogenase reductase through photosynthesis.
  • heterotrophic nitrogen-fixing bacteria produce electrons and ATP that are used by dinitrogenase reductase by catabolizing carbon sources supplied from plants.
  • Nitrogen-fixing bacteria can be classified based on their relationship with plants: nodule-forming, rhizosphere-dwelling, and endophytic. Some nodulation-forming nitrogen-fixing bacteria can only exhibit nitrogen-fixing ability within root nodules, but other nitrogen-fixing bacteria can be used on a nitrogen-free medium (synthetic minimal medium containing no nitrogen element).
  • each nitrogen-fixing bacterium differs in which sugar or organic acid it prefers as a carbon source.
  • the conditions under which nitrogen fixation is carried out - anaerobic, microaerophilic, or aerobic - vary depending on the nitrogen-fixing bacteria, reflecting the route through which electrons are transferred to dinitrogenase reductase. Since these factors are combined, there are a wide variety of methods for culturing nitrogen-fixing bacteria in a state where they exhibit nitrogen-fixing ability.
  • Klebsiella oxytoca can only be cultivated in anaerobic cultures supplied with sugar
  • Azospirillum lipoferum can only be grown in microaerobic cultures supplied with organic acids
  • Azotobacter vinelandii can only be cultured in microaerobic cultures supplied with organic acids.
  • nitrogen-fixing bacteria When nitrogen-fixing bacteria are inoculated into a liquid nitrogen-free medium (e.g., at about 10 6 cells/mL) and culture is started, growth due to nitrogen-fixing ability begins only after a long lag time. Several weeks of culture are required to observe various phenomena that depend on nitrogen fixation ability. On the other hand, it is known that when nitrogen-fixing bacteria are applied to a nitrogen-limited medium prepared by adding yeast extract at 100 mg/L to a nitrogen-free medium and solidified with agar, rapid colony formation occurs depending on the nitrogen-fixing ability. . Moreover, depending on the nitrogen-fixing bacteria, colonies that exhibit nitrogen-fixing ability may be obtained even when a solid medium is cultured in the atmosphere.
  • nitrogen-fixing bacteria is a nitrogen-fixing bacterium of the genus Klebsiella (Non-Patent Document 1: Rennie, Can. J. Microbiol. 27 8-14 1981). Therefore, we applied this addition of yeast extract at 100 mg/L to a liquid nitrogen-free medium, and when culturing Klebsiella oxytoca statically under the atmosphere in a nitrogen-limited liquid medium in an open container, nitrogen He came up with the idea that it might be possible to stably demonstrate the fixation ability, and completed a culture method to do so. With this culture method, nitrogen-fixing bacteria begin to proliferate with almost no lag time, and exhibit nitrogen-fixing ability by 24 hours after the start of culture. Various phenomena that depend on nitrogen-fixing ability can be observed within one week of culturing. It can be completed within a period.
  • the acetylene reduction method is a simple method for measuring the nitrogen-fixing ability of cultured nitrogen-fixing bacteria. Since nitrogenase has low substrate specificity, in addition to nitrogen fixation activity, it also has an activity to reduce acetylene to ethylene (acetylene reduction activity).
  • acetylene reduction activity When nitrogen-fixing bacteria are cultivated in an incubator containing a nitrogen-limited medium filled with a gaseous mixture of nitrogen molecules and acetylene, the nitrogen-fixing bacteria reduce both to produce ammonia and ethylene at the same time. Since ammonia is consumed during nitrogen assimilation, nitrogen fixation activity cannot be measured in real time. On the other hand, ethylene is released into the atmosphere without being further metabolized. Therefore, the acetylene reduction activity of nitrogenase is determined by measuring the amount of ethylene accumulated in the gaseous layer. Usually, the value of acetylene reduction activity represents the nitrogen fixing ability of nitrogen fixing bacteria.
  • L-glutamic acid is an important amino acid as a food or medicine.
  • Microorganisms have the ability to produce L-glutamic acid from ammonium ions and 2-oxoglutaric acid using L-glutamate dehydrogenase or a glutamine synthetase/glutamate synthase complex system. This metabolism is called nitrogen assimilation.
  • methods have been developed for genetically modifying various microorganisms and then fermenting and producing L-glutamic acid using the modified microorganisms.
  • the basis of the genetic modification is a modification that enhances the production of 2-oxoglutarate, which is a recipient of ammonium ions in nitrogen assimilation.
  • Patent Document 1 Japanese Patent No.
  • Klebsiella bacteria are modified to highly express citrate synthase (CS) derived from coryneform bacteria, and this microorganism is treated with a large amount of ammonium ions (20 g/L ammonium sulfate).
  • L-glutamic acid is fermented and produced by aerobic culture in a medium containing L-glutamic acid.
  • MCS methyl citrate synthase
  • a method for fermentative production of L-glutamic acid by anaerobic culture in a medium containing 10 g/L ammonium sulfate is disclosed.
  • ammonium ions for nitrogen assimilation are supplied by injecting large quantities into the culture medium.
  • the Haber-Bosch method is the most popular method for producing ammonia. This method is a process of producing ammonia by reacting hydrogen molecules produced by steam reforming of fossil fuels (coal, oil, methane gas) with nitrogen molecules in the atmosphere, and it is quite costly to operate. It takes.
  • the culture conditions for maximizing nitrogen-fixing ability vary greatly between nitrogen-fixing bacteria, so we investigated the culture medium composition and culture method for microorganisms of the genus Klebsiella.
  • the nitrogen-fixing ability of microorganisms of the genus Klebsiella was enhanced in a nitrogen-limited medium supplemented with organic acids such as citric acid. Therefore, we further introduced the citrate synthase (CS) gene and 2-methylcitrate synthase (2-MCS) gene into Klebsiella microorganisms, and cultured them in a nitrogen-limited medium supplemented with organic acids such as citric acid. It was discovered that L-glutamic acid or its salts can be produced from nitrogen molecules in the atmosphere.
  • CS citrate synthase
  • 2-MCS 2-methylcitrate synthase
  • a method for fermentatively producing L-glutamic acid or a salt thereof from nitrogen molecules in the atmosphere comprising the step of culturing in a nitrogen-limited medium containing L-glutamic acid or a salt thereof.
  • the nitrogen-limited medium contains a nitrogen source of 3 mg/L to 1500 mg/L in terms of yeast extract and/or 0.02 to 15 mM in terms of ammonium ion.
  • the organic acid or its salt has a concentration of 0.5 g/L to 100 g/L.
  • a nitrogen-fixing bacterium selected from the group consisting of the genera Klebsiella, Rahnella, Cosaconia, and Raultella, into which a citric acid transporter gene has been introduced.
  • Nitrogen-fixing bacteria of the genus Klebsiella were selected from the group consisting of Klebsiella oxytoca, Klebsiella michiganensis, Klebsiella grimonti, Klebsiella pasteuli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella variicola, Klebsiella indica, and Item 7, wherein the nitrogen-fixing bacterium is Rahnella aquatilis, or the nitrogen-fixing bacterium of the genus Raultella is selected from the group consisting of Raultella terrigena, Raultella ornithinolytica, and Raultella planticola.
  • the microorganism produced by the production method of the present invention produces L-glutamic acid while fixing atmospheric nitrogen. It enables fermentation of L-glutamic acid without relying on ammonia produced by the Haber-Bosch method.
  • FIG. 1 is a diagram showing an overall picture of the metabolic pathway for producing L-glutamic acid from nitrogen molecules resulting from the genetic modification of the NG13 strain carried out in the present invention.
  • FIG. 2 shows the results of LC-MS analysis of the molecular weight of L-glutamic acid accumulated in the medium when the NG13-pCCS strain was cultured in a mixed gas of 15 N 2 and O 2 or air.
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence of the cloned citrate synthase gene of strain NG13.
  • FIG. 4 shows the nucleotide sequence of the cloned citrate:Na + symporter gene of strain NG13.
  • FIG. 1 is a diagram showing an overall picture of the metabolic pathway for producing L-glutamic acid from nitrogen molecules resulting from the genetic modification of the NG13 strain carried out in the present invention.
  • FIG. 2 shows the results of LC-MS analysis of the molecular weight of L-glutamic acid accumulated in
  • FIG. 5 shows the nucleotide sequence of the citrate synthase gene of Corynebacterium glutamicum ATCC13869 strain.
  • FIG. 6 shows the nucleotide sequence of the 2-methylcitrate synthase gene of Corynebacterium glutamicum strain ATCC13869.
  • FIG. 7 shows the nucleotide sequence of the 2-methylcitrate synthase gene of Escherichia coli strain W3110.
  • FIG. 8 shows the nucleotide sequence of the cloned glutamate-pyruvate aminotransferase gene of the NG13 strain.
  • FIG. 9 shows the nucleotide sequence of the cloned L-alanine transporter gene of strain NG13.
  • FIG. 10 shows the base sequence of the glutamate-oxaloacetate aminotransferase gene of Escherichia coli MG1655 strain.
  • FIG. 11 shows the base sequence of the glutamic acid decarboxylase gene of Escherichia coli MG1655 strain.
  • FIG. 12 shows the analysis results of the molecular weight of L-glutamic acid accumulated in the culture medium after culturing the Rahnera pCCS-pKCT strain in a mixed gas of 15 N 2 and O 2 .
  • One aspect of the present invention relates to a method for culturing nitrogen-fixing bacteria in the atmosphere while exhibiting nitrogen-fixing ability, and a culture medium that allows nitrogen-fixing bacteria to exhibit the maximum nitrogen-fixing ability.
  • Another aspect of the present invention relates to nitrogen-fixing bacteria genetically introduced to promote the production of L-glutamic acid, and further relates to nitrogen-fixing bacteria genetically introduced to promote the production of L-glutamic acid. It also relates to a method for fermentatively producing L-glutamic acid from nitrogen molecules in the atmosphere, which comprises culturing in a nitrogen-limited medium containing an organic acid such as.
  • nitrogen-limited medium refers to a culture medium in which the nitrogen content is adjusted in order to allow nitrogen-fixing bacteria to exhibit nitrogen-fixing ability.
  • the nitrogen-limited medium can contain a nitrogen source at a concentration that promotes the initial growth of nitrogen-fixing bacteria and does not inhibit nitrogen-fixing activity.
  • the nitrogen concentration of the nitrogen-limited medium can vary depending on the type of nitrogen-fixing bacteria and the type of nitrogen source, but can be expressed in terms of yeast extract as an example.
  • the nitrogen-limited medium of the present invention contains an organic acid such as citric acid or a salt thereof, and a nitrogen source of 50 mg/L to 300 mg/L, preferably 50 mg/L to 200 mg/L in terms of yeast extract, Furthermore, a carbon source may be included in addition to an organic acid such as citric acid or a salt thereof.
  • the nitrogen-limited medium according to the present invention is suitable for culturing nitrogen-fixing bacteria that fix nitrogen molecules in the atmosphere, and by containing citric acid or a salt thereof, the nitrogen-fixing ability can be enhanced.
  • the amount of nitrogen source contained in the nitrogen-limited medium may vary depending on the nitrogen-fixing bacteria used.
  • a nitrogen-limited medium can be defined by the amount of nitrogen source in terms of yeast extract and/or ammonium ion.
  • a nitrogen-limited medium may be prepared to contain a nitrogen source of 3 mg/L to 1500 mg/L in terms of yeast extract.
  • a more preferable amount of nitrogen source is 25 mg/L to 500 mg/L in terms of yeast extract.
  • the most preferable amount of nitrogen source is 50 mg/L to 300 mg/L in terms of yeast extract.
  • the ammonium ion concentration may be adjusted to be 0.02 mM to 15 mM.
  • the ammonium ion concentration as a nitrogen source in a nitrogen-limited medium is preferably 0.2mM to 5mM, and the most preferred nitrogen source amount is 0.35mM to 3mM.
  • the nitrogen contained in the nitrogen-limiting medium is taken up by the bacterial cells and consumed during the initial growth of nitrogen-fixing bacteria, and when the nitrogen concentration in the medium drops below a certain level, the nitrogen-fixing bacteria begin to fix atmospheric nitrogen.
  • L-glutamic acid or its salt derived from nitrogen molecules in the atmosphere is produced. That is, the nitrogen atoms constituting the L-glutamic acid produced by fermentation in the present invention are characterized by containing those derived from nitrogen molecules in the atmosphere.
  • extracts including yeast extract, mixtures of various amino acids including casamino acids, peptones, etc., ammonium salts such as ammonium chloride and ammonium sulfate, etc. can be used.
  • concentration of the nitrogen source used in the nitrogen-limited medium can be expressed as a concentration converted to yeast extract. Since yeast extract contains about 10% total Kjeldahl nitrogen, the concentration in terms of yeast extract can be calculated based on the total Kjeldahl nitrogen content of the nitrogen source used.
  • the nitrogen-limited medium according to the present invention can normally contain a nitrogen source of 3 mg/L to 1500 mg/L in terms of yeast extract, that is, 0.3 mg/L to 150 mg/L as a total Kjeldahl nitrogen amount, at the start of culture. From the viewpoint of maximizing the nitrogen fixing ability, it is preferable to contain a nitrogen source of 25 mg/L or more in terms of yeast extract, that is, 2.5 mg/L or more as a total Kjeldahl nitrogen amount, and 50 mg/L or more in terms of yeast extract.
  • the total Kjeldahl nitrogen content is more preferably 5 mg/L or more, and the yeast extract equivalent is 500 mg/L or less, that is, the total Kjeldahl nitrogen content is preferably 50 mg/L or less, and the yeast extract is 300 mg/L or less, that is, It is even more preferable that the nitrogen source contains a total amount of Kjeldahl nitrogen of 30 mg/L or less.
  • Nitrogen-fixing bacteria sense the intracellular 2-oxoglutarate/L-glutamine ratio, and when this ratio is large, they enhance their nitrogen-fixing ability, and when this ratio is small, they suppress their nitrogen-fixing ability.
  • Nitrogen fixation ability may be enhanced by taking in organic acids from the culture medium and producing 2-oxoglutaric acid, thereby maintaining a high intracellular 2-oxoglutaric acid/L-glutamine ratio. .
  • the concentration of the organic acid or its salt contained in the nitrogen-limited medium is 0.5 g/L to 100 g/L, and from the viewpoint of maximizing nitrogen fixation ability, it is 1 g/L or more and 2.5 g/L or more. , 5 g/L or more, 6 g/L or more, or 7 g/L or more may be used, and 15 g/L or less, 12 g/L or less, 10 g/L or less, 9 g/L or less, or 8 g/L or less is used. may be done. Any salt can be used as the organic acid salt, and examples include potassium salt, sodium salt, and magnesium salt.
  • organic acids included in the TCA cycle such as oxaloacetic acid, citric acid, isocitric acid, 2-oxoglutaric acid, succinic acid, fumaric acid, malic acid, or salts thereof, can be added to the nitrogen-limited medium. can.
  • a nitrogen-limited medium to which a combination of sugars such as glucose and organic acids or salts thereof are added as a carbon source can also be used.
  • the amount of carbon source contained in the nitrogen-limited medium may be 0.5 g/L to 300 g/L in terms of glucose, preferably 5 g/L to 100 g/L.
  • the blending ratio of saccharides such as glucose and organic acids or their salts can be selected as appropriate depending on the experimental conditions, but as an example, a weight ratio of glucose to citric acid or its salts of 1:5 to 5:1 is used. It can be used preferably in a ratio of 1:4 to 4:1, more preferably 1:3 to 3:1, even more preferably 1:2 to 2:1.
  • the amount of glutamic acid produced can be increased.
  • glucose and citric acid or its salt are added to a nitrogen-limited medium, glucose is added in a range of 0.5 g/L to 100 g/L, and citric acid or its salt is added in a range of 0.5 g/L to 50 g/L.
  • Glucose and citric acid or a salt thereof may be used in an amount of 2.5 g/L or more, 5 g/L or more, 6 g/L or more, or 7 g/L or more so that the above-mentioned mixing ratio is achieved, and 15 g/L or more may be used.
  • L or less 12 g/L or less, 10 g/L or less, 9 g/L or less, or 8 g/L or less may be used.
  • a medium containing 5 to 10 g/L of citric acid or its salt and double the amount of sugar such as glucose can be used.
  • saccharides such as monosaccharides, disaccharides, sugar alcohols, polysaccharides, organic acids, etc. can also be used.
  • sugars glucose, mannose, galactose, fructose, xylose, sucrose, maltose, cellobiose, trehalose, mannitol, inositol, sorbitol, glycerol, starch hydrolyzate, etc.
  • glucose is usually used.
  • organic acid any organic acid can be used as long as it is usable by bacteria.
  • an organic acid included in the TCA cycle such as oxaloacetic acid, citric acid, isocitric acid, 2-oxoglutaric acid, succinic acid, fumaric acid, malic acid, etc.
  • the concentration of the carbon source can be set from 0.5 g/L to 300 g/L in terms of glucose, and from the viewpoint of maximizing nitrogen fixation ability, it is preferably 10 g/L or more, and more preferably 15 g/L or more. , more preferably 22.5 g/L or more.
  • the organic acid such as citric acid added in the nitrogen-limited medium of the present invention is blended as one of the carbon sources, and the total of the organic acid such as citric acid and other carbon sources, such as glucose, is used as the concentration of the carbon source. do.
  • nitrogen-fixing bacteria In culturing nitrogen-fixing bacteria, the presence of nitrogen, especially inorganic nitrogen, in the culture medium strongly suppresses the nitrogen-fixing reaction. On the other hand, at the initial stage of culture, a certain amount of nitrogen is required for the growth of nitrogen-fixing bacteria and the production of nitrogenase. Therefore, in a nitrogen-limited medium for culturing nitrogen-fixing bacteria to produce L-glutamic acid or its salts by fixing nitrogen molecules in the atmosphere, a nitrogen source is added while culturing is carried out. When the nitrogen source in the medium is consumed and the nitrogen source concentration drops below a certain level, nitrogen molecules in the atmosphere are fixed. Therefore, when culturing is performed using the nitrogen-limited medium according to the present invention, no additional nitrogen source other than gaseous nitrogen, such as atmospheric nitrogen molecules, is usually added.
  • a synthetic minimal medium containing necessary components depending on the type of nitrogen-fixing bacteria can be used as the nitrogen-limited medium.
  • such components include inorganic salts, buffer substances, and vitamins.
  • inorganic salts phosphates, sodium salts, magnesium salts, calcium salts, iron salts, manganese salts, molybdenum salts, etc. are added, and more specifically, sodium chloride, magnesium sulfate, calcium chloride, molybdate salts,
  • inorganic salts such as Na 2 MoO 4 .2H 2 O can be added.
  • buffer substances include potassium dihydrogen phosphate and dipotassium hydrogen phosphate.
  • the pH of the nitrogen-limited medium can be arbitrarily selected within a range that does not inhibit the growth of nitrogen-fixing bacteria, and can be adjusted to, for example, pH 6.8 to 7.5.
  • nitrogen-fixing bacteria examples include microorganisms belonging to the family Enterobacteriaceae.
  • a microorganism of a genus selected from the group consisting of the genus Klebsiella, the genus Rahnella, the genus Raoultella, and the genus Kosakonia can be used.
  • Klebsiella oxytoca Klebsiella michiganensis, Klebsiella grimontii, Klebsiella pasteurii, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella variicola, Microorganisms such as Klebsiella indica, Rahnella aquatilis, Raoultella terrigena, Raoultella ornithinolytica, Raoultella planticola are preferred.
  • Klebsiella oxytoca a nitrogen-fixing bacterium isolated from rice roots, especially the NG13 strain (accession number: NITE BP-03721, receipt number: NITE ABP-03721, date of receipt of application: 2023) July 21) can be used.
  • Strain NG13 has been deposited at the Patent Microorganism Depositary of the National Institute of Technology and Evaluation. Furthermore, as the nitrogen-fixing bacteria, microorganisms such as Escherichia coli into which genes related to nitrogen fixation have been introduced may be used. Further, as nitrogen-fixing bacteria belonging to other than Enterobacteriaceae, microorganisms such as the genus Xanthobacter and the genus Azorhizobium can be used. Among these microorganisms, microorganisms belonging to the genera Klebsiella, Rahnella, and Raoultella are particularly preferred. High production of L-glutamic acid can be achieved by specifically introducing genes for glutamate synthase and citrate transporter into these microorganisms.
  • nitrogen-fixing bacteria can be genetically introduced to promote the production of L-glutamic acid.
  • Nitrogen-fixing bacteria into which genes have been introduced to promote the production of L-glutamic acid are referred to as nitrogen-fixing bacteria according to the present invention.
  • the introduced gene is a gene encoding a protein selected from citrate synthase, 2-methylcitrate synthase, and citrate transporter. It is preferable to introduce both a citrate synthase gene and a citrate transporter gene, or to introduce both a 2-methylcitrate synthase gene and a citrate transporter gene.
  • Citrate synthase, 2-methylcitrate synthase, or citrate transporter is introduced into nitrogen-fixing bacteria for the purpose of increasing intracellular citrate concentration.
  • the citrate transporter functions independently for citrate synthase and 2-methylcitrate synthase.
  • the amount of 2-oxoglutaric acid produced increases as the citric acid concentration within the cells of nitrogen-fixing bacteria increases, and ammonia fixed from nitrogen molecules in the atmosphere is reduced to L by the nitrogen assimilation pathway.
  • Citrate synthase is an enzyme possessed by almost all living organisms that plays a central role in the sugar oxidation process and contributes to the first step of the TCA cycle. Specifically, it is an enzyme that catalyzes a reaction that produces citric acid and CoA from acetyl-CoA, which is obtained by converting pyruvate produced in glycolysis, oxaloacetic acid, and water ( Figure 1).
  • the CS gene introduced into nitrogen-fixing bacteria may be derived from any bacteria.
  • Bacterial CS includes "small" CS possessed by Gram-positive bacteria and "large" CS possessed by Gram-negative bacteria.
  • CS gene to be introduced into nitrogen-fixing bacteria a CS gene obtained from a Gram-positive bacterium is preferable.
  • CS genes obtained from bacteria of the genus Arthrobacter, Corynebacterium, Bacillus, Mycobacterium, and Streptomyces. be.
  • the CS gene of Corynebacterium glutamicum can be used.
  • the CS gene (SEQ ID NO: 3, amino acid sequence: SEQ ID NO: 30) of Corynebacterium glutamicum ATCC13869 can be used.
  • these CS genes are also preferable as CS genes to be introduced into nitrogen-fixing bacteria. Examples include CS genes obtained from bacteria of the genus Acetobacter, bacteria of the genus Halobacterium, bacteria of the genus Thermus, and bacteria of the genus Thiobacillus.
  • the CS gene of Thermus aquaticus can be used.
  • a CS gene obtained from the introduced bacterium may be used.
  • the CS of Klebsiella oxytoca strain NG13 is encoded by the base sequence of SEQ ID NO: 1 (amino acid sequence: SEQ ID NO: 28).
  • SEQ ID NO: 1 amino acid sequence: SEQ ID NO: 28.
  • L-glutamic acid or a salt thereof can be produced by culturing nitrogen-fixing bacteria into which a citrate synthase gene has been introduced in a citric acid-containing nitrogen-limited medium.
  • 2-Methylcitrate synthase (2-MCS) is an enzyme possessed by many bacteria, and is an enzyme that catalyzes the reaction that produces 2-methylcitrate and CoA from propionyl-CoA, oxaloacetate, and water. .
  • 2-MCS catalyzes the same reaction as CS as a side activity.
  • 2-MCS may also be simply referred to as methylcitrate synthase (MCS).
  • the 2-MCS gene introduced into nitrogen-fixing bacteria may be derived from any bacterium as long as the 2-MCS encoded by the gene catalyzes the same reaction as CS. .
  • the 2-MCS genes of Escherichia coli and Corynebacterium glutamicum can be used.
  • the 2-MCS gene (SEQ ID NO: 5, amino acid sequence: SEQ ID NO: 32) derived from E. coli strain W3110, or the 2-MCS gene (SEQ ID NO: 4, amino acid sequence: SEQ ID NO: 32) of Corynebacterium glutamicum ATCC13869 No. 31) can be used.
  • bacteria of the genus Citrobacter, Serratia, Stenotrophomonas, and Chromobacterium which have more than 73% homology in amino acid sequence with Escherichia coli 2-MCS.
  • Corynebacterium comes, Corynebacterium humireducens, Corynebacterium marinum, Corynebacterium -
  • the 2-MCS genes of Corynebacterium testudinoris and Brevibacterium flavum can also be used.
  • the 2-MCS gene obtained from the introduced bacterium may also be used.
  • L-glutamic acid or a salt thereof can be produced by culturing nitrogen-fixing bacteria into which the 2-MCS gene has been introduced in a nitrogen-limited medium containing citric acid.
  • the citric acid transporter is a transporter that takes citric acid present outside the microbial cell into the microbial cell.
  • Bacterial citrate transporters are designated by the Transporter Classification (TC) system number 2.
  • TC Transporter Classification
  • Non-patent document 4 Saier, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64 354-411 2000
  • Non-patent document 5 Soares-Silva et al., FEMS Microbiol. Letter. 367 1 -15 2020).
  • the transporter No. 1.6 is a citric acid:H + symporter represented by CitH of Klebsiella pneumoniae. This transporter is possessed by many bacteria.
  • the 11 transporters include citric acid/divalent metal ion: H + cotransporter represented by CitM of Bacillus subtilis, and citric acid/divalent metal ion: H + cotransporter represented by CitH of Bacillus subtilis.
  • Metal ion: H + symporter, citric acid represented by YRAO of Bacillus subtilis: H + symporter, and citric acid 2 represented by CitH of Corynebacterium glutamicum Includes valent metal ion transporters.
  • the 24 transporters include the citric acid:Na + cotransporter represented by CitS of Klebsiella pneumoniae, and the citric acid:Na + cotransporter represented by MleP of Lactococcus lactis.
  • electrogenic citric acid represented by CitP of Lactococcus lactis: L - Includes lactate exchange transporter and citric acid:lactate antiporter represented by CitP of Leuconostoc mesenteroides.
  • A. Transporter No. 47 is a citric acid:succinate antiporter represented by CitT of Escherichia coli. TC No. 2.
  • the citrate transporter gene introduced into nitrogen-fixing bacteria may be any bacterial-derived gene encoding the various citrate transporters described above.
  • a citrate transporter gene obtained from the introduced bacterium may be used.
  • the citrate:Na + cotransporter gene and the citric acid:H + cotransporter gene possessed by Klebsiella oxytoca can be introduced.
  • Klebsiella oxytoca possesses a gene homologous to the citrate:acetate exchange transporter gene (citW) (Non-Patent Document 6: Kaestner et al., Arch. Microbiol.
  • the citrate/Na + symporter of Klebsiella oxytoca NG13 strain is encoded by the base sequence of SEQ ID NO: 2 (amino acid sequence: SEQ ID NO: 29).
  • Nitrogen-fixing bacteria often have reduced nitrogen-fixing ability when the genes of each metabolic pathway are modified. Therefore, even in nitrogen-fixing bacteria whose metabolic pathway has been genetically modified, there is a need for a culture medium that can exhibit a high level of nitrogen-fixing ability.
  • a nitrogen-limiting medium containing an organic acid or its salt can enhance nitrogen-fixing ability, and by culturing nitrogen-fixing bacteria genetically introduced to be able to produce L-glutamic acid using such a medium, It becomes possible to ferment and produce L-glutamic acid or its salt from nitrogen molecules.
  • a gene encoding a protein selected from the group consisting of citrate synthase, 2-methylcitrate synthase, and citrate transporter may be provided with a promoter and terminator sequence to control expression. More preferably, a promoter that allows transient expression is used. As a promoter that enables transient expression, a trc promoter that can be controlled by addition of IPTG can be used. A vector containing a gene equipped with a promoter and a terminator can be used for gene introduction using a conventional method.
  • Amino acids other than L-glutamic acid are introduced into nitrogen-fixing bacteria into which at least one gene selected from the group consisting of citrate synthase, 2-methylcitrate synthase, and citrate transporter is introduced. Genes can also be introduced for the purpose of producing .
  • Amino acids other than L-glutamic acid include essential amino acids such as histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, and valine, arginine, aspartic acid, glutamine, asparagine, alanine, glycine, cysteine, aspartic acid, and proline.
  • L-aminobutyric acid which are usually L-amino acids.
  • Amino acids other than L-glutamic acid can be produced by appropriately selecting a transgene based on well-known techniques in this technical field. As an example, by introducing the glutamate-pyruvate aminotransferase gene (SEQ ID NO: 33, amino acid sequence: SEQ ID NO: 37) and the L-alanine transporter gene (SEQ ID NO: 34, amino acid sequence: SEQ ID NO: 38). , L-alanine and L-valine can be produced.
  • Non-patent Document 7 Son HF et al., PLoS ONE. 11(6): e0158402.
  • SEQ ID NO: 36 amino acid sequence: SEQ ID NO: 40
  • ⁇ -aminobutyric acid Non-patent Document 8: Choi, J.W. et al., Microb Cell Fact 14, 21 2015).
  • At least one gene selected from the group consisting of citrate synthase, 2-methylcitrate synthase, and citrate transporter is used for the purpose of producing amino acids other than L-glutamic acid.
  • nitrogen-fixing bacteria into which additional genes have been introduced may also be used.
  • an amino acid other than L-glutamic acid such as L-alanine and/or L-valine, comprising the step of culturing such nitrogen-fixing bacteria in a nitrogen-limited medium containing an organic acid or a salt thereof, is provided. It may also be related to a method of fermentation production.
  • the nitrogen-limited medium used in the method of fermenting and producing amino acids other than L-glutamic acid such as L-alanine and/or L-valine
  • the same medium as the medium used in the method of fermenting and producing L-glutamic acid can be used.
  • Glutamic acid-pyruvate aminotransferase is an enzyme that catalyzes the reaction that produces L-alanine and 2-oxoglutaric acid from L-glutamic acid and pyruvate, and contributes to the biosynthesis of L-alanine.
  • the glutamate-pyruvate aminotransferase gene may be derived from any bacterium, and it can be produced using nitrogen molecules in the atmosphere by introducing the glutamate-pyruvate aminotransferase gene into nitrogen-fixing bacteria. It is believed that the amino group of L-glutamic acid can be transferred to pyruvate, thereby producing L-alanine or a salt thereof.
  • the L-alanine transporter has the function of excreting L-alanine out of cells.
  • the L-alanine transporter gene may be derived from any bacterium, and by introducing the L-alanine transporter gene together with the glutamate-pyruvate aminotransferase gene into nitrogen-fixing bacteria, the produced L-alanine can be produced in cells. It is thought that external transport is promoted and productivity of L-alanine or its salt is improved.
  • Glutamic acid-oxaloacetate aminotransferase is an enzyme that catalyzes the reaction that produces L-aspartic acid and 2-oxoglutaric acid from L-glutamic acid and oxaloacetic acid, and contributes to the biosynthesis of L-aspartic acid.
  • the glutamate-oxaloacetate aminotransferase gene can be derived from any bacteria, and it can be produced by introducing the glutamate-oxaloacetate aminotransferase gene into nitrogen-fixing bacteria, using nitrogen molecules in the atmosphere. It is believed that the amino group of L-glutamic acid can be transferred to oxaloacetate, thereby producing L-aspartic acid or a salt thereof.
  • Glutamate decarboxylase is an enzyme that catalyzes the reaction that produces ⁇ -aminobutyric acid from L-glutamic acid, and contributes to the biosynthesis of ⁇ -aminobutyric acid.
  • the glutamate decarboxylase gene may be derived from any bacteria; by introducing the glutamate decarboxylase gene into nitrogen-fixing bacteria, L-glutamate produced using nitrogen molecules in the atmosphere is decarboxylated. It is believed that ⁇ -aminobutyric acid or a salt thereof can be produced thereby.
  • the genes introduced in the present invention each have at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% of the sequence possessed by the original gene. % sequence homology or sequence identity and which have the same or similar enzymatic activity when expressed. Homology can be determined using NCBI's blastn program using NCBI registered databases. Specifically, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% of the CS gene sequences of SEQ ID NOs: 1 and 3. Genes can be introduced that have sequence identity and have citrate synthase activity when expressed.
  • at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, Genes can be introduced that have at least 98%, or at least 99% sequence identity and that, when expressed, have 2-methylcitrate synthase activity.
  • the gene introduced in the present invention is at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% of the amino acid sequence of the original gene, respectively. % sequence homology or sequence identity, and which encode amino acid sequences that have the same or similar enzymatic activity when expressed. Homology can be determined using NCBI's blastp program using NCBI registered databases. Specifically, at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least 98%, or at least 99% of the amino acid sequences of CS of SEQ ID NOs: 28 and 30.
  • a gene encoding an amino acid sequence that has sequence identity and has citrate synthase activity can be introduced.
  • at least 75%, at least 80%, at least 85%, at least 90%, at least 95%, at least 97%, at least A gene can be introduced that encodes an amino acid sequence that has 98%, or at least 99%, sequence identity and has 2-methylcitrate synthase activity.
  • Another aspect of the present invention is a method for producing L-glutamic acid or its salt from nitrogen molecules in the atmosphere by fermentation, in which a nitrogen-fixing bacterium that has been genetically introduced to promote the production of L-glutamic acid is used according to the present invention. It includes culturing in a nitrogen-limited medium, ie, a nitrogen-limited medium containing an organic acid.
  • a nitrogen-limiting medium containing organic acids we can increase nitrogen-fixing ability and cultivate nitrogen-fixing bacteria that have been genetically introduced to promote the production of L-glutamic acid. can enhance the fermentation of L-glutamic acid or its salt.
  • culture conditions can be appropriately selected depending on the nitrogen-fixing bacteria used.
  • a nitrogen-limited medium and air can be placed in a closed container, and the culture can be performed in such a way that the dissolved oxygen contained at the start of the culture is consumed during the culture process, thereby increasing the anaerobic state.
  • more aerobic culture can be performed by increasing the contact area between the culture solution and air during static culture in the atmosphere in an open container.
  • a culture temperature of 20°C to 37°C, more preferably 20 to 30°C can be used.
  • the nitrogen source contained in the nitrogen-limited medium is required for the initial growth of nitrogen-fixing bacteria.
  • the nitrogen source contained in a nitrogen-limited medium is taken up and consumed by bacterial cells during initial growth, and when the nitrogen concentration in the medium falls below a certain level during the culture process, nitrogen-fixing bacteria absorb nitrogen from the atmosphere. It becomes fixed.
  • nitrogen-fixing bacteria into which genes have been introduced to promote the production of L-glutamic acid have an increased concentration of citric acid in their cells, and the fixed ammonia nitrogen is converted into L-glutamic acid through the nitrogen assimilation pathway. or a salt thereof, thereby producing L-glutamic acid or a salt thereof.
  • Example 1 Examination of culture conditions Strain NG13 (accession number: NITE BP-03721, receipt number: NITE ABP-03721, date of application receipt: July 21, 2023) has conventionally achieved nitrogen fixation ability only through anaerobic culture. It was thought that it would work. Anaerobic culture is a complicated culture method that involves many steps, such as sealing a culture container and filling the air layer with nitrogen gas or a mixture of nitrogen gas and argon gas. Therefore, we aimed to establish a completely new culture method that uses open culture vessels to freely utilize nitrogen molecules in the atmosphere and exhibit nitrogen fixation ability.
  • the medium used was a nitrogen-limited medium in which yeast extract was added at 100 mg/L to a nitrogen-free medium.
  • the NG13 strain started to proliferate after a short lag time after the start of culture, and exhibited a nitrogen fixing ability of 0.63 ⁇ mol/4-h/tube (see Table 2) 24 hours after the start of culture.
  • the strength of this nitrogen fixing ability was equivalent to that exhibited in anaerobic culture in which the mouth of the test tube was sealed with a butyl double stopper and the air layer was filled with nitrogen gas. Note that even when the glucose in the KD medium was replaced with the same amount of fructose or sucrose, the maximum nitrogen fixation ability was the same. As a result of the above, a completely new and simple culture method for NG13 strain to exhibit nitrogen fixation ability was established.
  • the steps of the acetylene reduction method are as follows. First, the mouth of the test tube was sealed with a butyl double stopper. At that time, the air layer was air. Thereafter, 15% of the air layer was replaced with acetylene, and static culture was performed at 25° C. for 4 hours. After culturing, 0.5 mL of the air layer was extracted with a syringe, the amount of ethylene was measured using a gas chromatograph, and the amount was converted to the amount of ethylene produced per test tube, which was taken as the value of nitrogen fixation ability.
  • KDD medium which is made by adding 7.5 g/L glucose to KD medium to double the amount of glucose (15 g/L)
  • KDP medium which is made by adding sodium pyruvate (7.5 g/L) to KD medium.
  • the nitrogen fixation ability was variously enhanced in other media in which sodium salts of various organic acids (7.5 g/L) were added to the KD medium.
  • KDC medium the combination with sodium citrate (KDC medium) had the greatest effect (2.6-fold increase).
  • no accumulation of L-glutamic acid in the medium was observed in any of the cultures.
  • a nitrogen-limited medium was prepared in which the sodium citrate composition of the KDC medium was changed as shown in Table 3. Both strains were statically cultured in each medium at 25° C. for 24 hours, and the nitrogen fixation ability was measured by the acetylene reduction method. The results are shown in Table 3. When the sodium citrate concentration in the medium was 2.5 g/L to 15 g/L, the maximum nitrogen fixation ability when using the NG13 strain was enhanced compared to when sodium citrate was 0 g/L.
  • the sodium citrate concentration in the medium is 1 g/L to 15 g/L
  • the maximum nitrogen fixation ability when using the NG13-pCCS strain is enhanced compared to the case where sodium citrate is 0 g/L, especially when the NG13-pCCS strain is used.
  • the highest value was shown at .5 g/L.
  • Example 2 Preparation of NG13 strain transfected with citrate synthase, 2-methylcitrate synthase, or citrate:Na + cotransporter gene (1) Preparation of each plasmid NG13 strain, Corynebacterium spp.
  • Genomic DNA was extracted using The gene fragments encoding citrate synthase (CS, ATCC13869: BBD29_04605) and 2-methylcitrate synthase (2-MCS, ATCC13869 strain: BBD29_03720, and W3110 strain: PrpC) are created using the genomic DNA of each bacterium as a template. They were prepared by performing PCR using the primers shown in Table 4 below in the combinations shown in Table 5.
  • the citrate:Na + cotransporter gene of strain NG13 was cloned based on the genome information of Klebsiella oxytoca M5a1 strain to obtain sequence information, and then a gene fragment was prepared by PCR. Approximately 20 bp sequences homologous to the vector to be introduced were attached to both ends of each primer, and the gene to be introduced was designed to be expressed using the expression promoter and ribosome binding site (RBS) derived from the vector (Table 4 ). The vector side fragment was prepared by PCR. The sequences and combinations of primers used are shown below. The gene fragment of interest and the vector fragment were combined using Gibson Assembly.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed using 10 ⁇ L of the reaction solution, and colonies were selected using the drug selection marker contained in the plasmid. Plasmids were extracted from the colonies that appeared, and it was confirmed by sequence analysis whether the plasmids as designed were produced (Table 5).
  • the competent cells after introduction were mixed with 1 mL of antibiotic-free LB liquid medium and cultured at 30°C for 1 hour with shaking at 300 rpm.Then, the competent cells were mixed with 1 mL of antibiotic-free LB liquid medium and incubated at 30°C for 1 hour with shaking at 300 rpm. Mycin: 100 ⁇ g/mL, tetracycline: 15 ⁇ g/mL) and cultured overnight at 30°C. Plasmids were extracted from the colonies that appeared, and it was confirmed by agarose gel electrophoresis after treatment with restriction enzymes whether the target plasmid was properly retained. The desired transformant was stored at -80°C as a 25% glycerol suspension.
  • Example 3 Fermentative production of L-glutamic acid by strain NG13 into which the 2-methylcitrate synthase gene has been introduced Since the nitrogen fixing ability of strain NG13 is exhibited under anaerobic conditions, Patent Document 2 (Patent Document 2) NG13 strain (NG13-pCMCS) into which a plasmid pCMCS expressing the 2-MCS gene of Corynebacterium glutamicum was introduced according to the description in Publication No. 2009-254323) and a plasmid expressing the 2-MCS gene of E.
  • coli NG13 strain introduced with pEMCS was created, and both modified strains were statically cultured at 25°C for 4 days in KDC medium supplemented with IPTG at a final concentration of 0.1 mM to examine L-glutamic acid productivity. .
  • the results are shown in Table 6.
  • Patent Document 1 Fermentative production of L-glutamic acid by strain NG13 into which a citrate synthase gene has been introduced
  • Patent Document 1 Patent No. 4144131 describes that when a microorganism of the genus Klebsiella into which a CS gene derived from a coryneform bacterium is aerobically cultured, 2. It is stated that 85 g/L of L-glutamic acid is produced by fermentation. Therefore, in the same manner as disclosed in Patent Document 1, the NG13 strain (NG13-pCCS strain) into which the plasmid pCCS expressing the CS gene of Corynebacterium glutamicum was introduced was created.
  • this modified strain was cultured with shaking at 30°C in a KDC medium supplemented with 10 g/L ammonium chloride and a final concentration of 0.1 mM IPTG, and the number of bacteria reached was 8 x 10 10 cells/tube 28 hours after the start of culture. 1.4 g/L of L-glutamic acid was accumulated in it.
  • an NG13 strain (NG13-pKCS strain) into which a plasmid pKCS expressing the CS gene of the NG13 strain was introduced was prepared.
  • the NG13-pCCS strain and the NG13-pKCS strain were statically cultured at 25° C. for 5 days in a KDC medium supplemented with IPTG at a final concentration of 0.1 mM to examine the productivity of L-glutamic acid.
  • the results are shown in Table 7.
  • the NG13-pCCS strain accumulated L-glutamic acid in the medium, and the amount exceeded that of the NG13 strain into which the 2-MCS gene was introduced. Considering the number of bacteria reached, it can be concluded that the NG13-pCCS strain produces L-glutamic acid equivalently either by taking in ammonia from outside the bacterial body or by producing ammonia by nitrogen fixation. On the other hand, the amount of L-glutamic acid accumulated in the NG13-pKCS strain was smaller than that in the NG13-pCCS strain.
  • the NG13-pCCS strain was cultured in KDC medium excluding Na 2 MoO 4 .2H 2 O. Nitrogen fixation ability disappeared. Although the number of bacteria reached in the culture solution was the same as when cultured in a normal KDC medium, no accumulation of L-glutamic acid was observed in the medium.
  • the NG13-pCCS strain was statically cultured in KD medium, KDD medium, KDC medium, KDM medium, KDS medium, and KDO medium at 25°C for 6 days to determine the presence or absence of organic acids other than citric acid in the nitrogen-limited medium. We examined whether this would affect the production amount of L-glutamic acid. The results are shown in Table 8.
  • Example 5 Fermentative production of L-glutamic acid by strain NG13 into which a citric acid transporter gene has been introduced
  • strain NG13 When strain NG13 is statically cultured in KDC medium, it first assimilates glucose, and during this period only a small amount of citric acid is assimilated. After glucose has been consumed, citric acid assimilation begins.
  • the NG13 strain has a citrate:Na + cotransporter gene and a gene for a two-component regulatory system (composed of CitA, a sensor kinase, and CitB, a response regulator) that senses the presence of citric acid on its genome.
  • Non-Patent Document 2 Bott, Mol. Microbiol. 18 533-546 1995.
  • CitA senses a high concentration of citric acid in the medium and phosphorylates CitB, which promotes the expression of the citrate:Na + cotransporter gene. Without intending to be limited by theory, it is believed that this causes a slight assimilation of citric acid in the presence of glucose.
  • the expression of the citric acid:Na + cotransporter gene is also promoted by cyclic AMP receptor protein (CRP).
  • the citrate:Na + cotransporter gene of the NG13 strain was cloned, and a plasmid pKCT was created to highly express it in the NG13 strain.
  • the NG13 strain (NG13-pKCT strain) into which this plasmid had been introduced was statically cultured in KDC medium at 25° C. for 5 days to examine the productivity of L-glutamic acid. The results are shown in Table 9.
  • the maximum nitrogen fixing ability and the number of bacteria reached by the NG13-pKCT strain are not significantly different from those of the NG13 strain, and the enhancement of the maximum nitrogen fixing ability due to the presence of citric acid is due to the original citric acid:Na + symporter. The amount present is sufficient.
  • focusing on the accumulation of L-glutamic acid in order for citric acid uptake to result in the accumulation of L-glutamic acid, it is necessary to promote the expression of the citric acid:Na + cotransporter.
  • Example 6 Fermentative production of L-glutamic acid by the NG13 strain into which both the citrate synthase gene and the citrate transporter gene have been introduced.
  • the NG13-pKCT strain and the NG13-pCCS strain were cultured in a KDC medium containing 13 C-labeled glucose.
  • LC-MS analysis of L-glutamic acid accumulated in the culture medium revealed that all of the L-glutamic acid accumulated by the NG13-pCCS strain contained 13C , whereas the L-glutamic acid accumulated by the NG13-pKCT strain contained 13C. All contained 12C . That is, it is thought that L-glutamic acid produced by the NG13-pKCT strain is converted from citric acid taken in from the KDC medium.
  • the NG13-pCCS-pKCT strain was created by introducing both plasmids pCCS and pKCT into the NG13 strain.
  • an NG13-pCCS-pCDF strain was prepared by introducing both plasmids pCCS and pCDFDuet-1 (empty vector) into the NG13 strain. Both strains were statically cultured in KDC medium at 25°C for 5 days, and the productivity of L-glutamic acid was examined. The results are shown in Table 10.
  • a medium with twice the amount of glucose and sodium citrate based on the KDC medium composition (KDDC medium containing 15 g/L glucose, KDCC medium containing 15 g/L sodium citrate, 15 g/L glucose and A KDDCC medium (containing 15 g/L of sodium citrate) was prepared, and 25 mL of each was placed in a sterilized petri dish of ⁇ 90 x 15 mm, and 10 7 cells of the NG13-pCCS-pKCT strain were inoculated therein.
  • the culture medium was statically cultured at 25° C. for 17 days in an environment where humidity was maintained to prevent evaporation, and the productivity of L-glutamic acid was examined. The results are shown in Table 11.
  • the method for producing L-glutamic acid by fermentation is an invention based on completely new knowledge.
  • the technical feature of promoting the expression of citric acid:Na + cotransporter to the well-known technology of L-glutamic acid production by promoting the expression of CS, L-glutamic acid productivity is enhanced by the additive effect of both.
  • the fermentative production method for L-glutamic acid, which involves fermentation, is also an invention based on completely new knowledge. Since citric acid is inexpensive among organic acids, the present invention can be a production method that can compete with the current fermentative production of L-glutamic acid that relies on the Haber-Bosch method.
  • Example 7 Enhancement of nitrogen-fixing ability in nitrogen-fixing bacteria other than NG13
  • a medium was prepared in which the glucose 7.5 g/L of the KD and KDC medium was changed to glucose 3.75 g/L and fructose 3.75 g/L, and the results are shown in Table 12.
  • Nitrogen-fixing bacteria of the Proteobacteria phylum shown below were cultured. After static culture at 25° C. for 24 hours, acetylene was sealed, and nitrogen fixation ability was calculated from the amount of ethylene produced after 168 hours of culture. The results are shown in Table 12.
  • Example 8 Fermentative production of L-glutamic acid by Raoultella terrigena JCM1687 strain into which a citrate synthase gene and a citric acid transporter gene have been introduced
  • Raoultella terrigena strain JCM1687 (R. terrigena-pCCS strain) into which plasmid pCCS was introduced was prepared.
  • This modified strain was statically cultured at 25° C. for 6 days in KD medium and KDC medium supplemented with IPTG at a final concentration of 0.02 mM, and the productivity of L-glutamic acid was examined. The results are shown in Table 13.
  • R. terrigena and R. terrigena. terrigena-pCCS strains were found to have enhanced nitrogen fixation ability when cultured in KDC medium. Also R. terrigena-pCCS strain produced L-glutamic acid when cultured in K
  • Raoultella terrigena strain JCM1687 (R. terrigena-pCCS-pKCT strain). This modified strain was statically cultured at 25° C. for 6 days in KDD medium and KDC medium supplemented with IPTG at a final concentration of 0.02 mM, and the productivity of L-glutamic acid was examined. The results are shown in Table 14. When pCCS-pKCT strain into which citrate synthase and citrate transporter were introduced was cultured in KDC medium, accumulation of L-glutamic acid was observed.
  • Example 9 Fermentative production of L-glutamic acid by Klebsiella variicola JCM12419 strain into which the citrate synthase gene and citric acid transporter gene have been introduced.Similar to the NG13 strain, plasmid pCCS expressing the CS gene of Corynebacterium glutamicum was used. Klebsiella variicola JCM12419 strain (K. variicola-pCCS) introduced, Klebsiella variicola JCM12419 strain (K. variicola-pKCT) introduced with plasmid pKCT expressing the citrate:Na + symporter gene of strain NG13, plasmid pCCS Klebsiella variicola JCM12419 strain (K.
  • variicola-pCCS-pKCT into which plasmid pKCT was introduced was prepared.
  • These modified strains were statically cultured at 25° C. for 6 days in KDD medium and KDC medium supplemented with IPTG at a final concentration of 0.02 mM, and the productivity of L-glutamic acid was examined. The results are shown in Table 16.
  • pCCS strain introduced with citrate synthase pKCT strain introduced with citrate transporter
  • pCCS-pKCT strain introduced with citrate synthase and citrate transporter are cultured in KDC medium, L-glutamic acid production is reduced. It was seen.
  • K. variicola-pCCS-pKCT strain was also able to significantly improve the productivity of L-glutamic acid by culturing in a petri dish.
  • Example 10 Klebsiella sp. into which both the citrate synthase gene and the citrate transporter gene were introduced.
  • NBRC109911 strain (Klebsiella sp. NBRC109911-pCCS-pKCT) was produced. These modified strains were statically cultured at 25° C. for 6 days in KDD medium and KDC medium supplemented with IPTG at a final concentration of 0.02 mM, and the productivity of L-glutamic acid was examined. The results are shown in Table 18. In both Klebsiella genus strains, when the pCCS-pKCT strain into which citrate synthase and citrate transporter are introduced is cultured in KDC medium, a large amount of L-glutamic acid is produced, similar to the above-mentioned Klebsiella oxytoca and Klebsiella variicola. was confirmed to accumulate.
  • Example 11 Fermentative production of L-glutamic acid by L-glutamic acid strain JCM1683 into which both the citrate synthase gene and the citrate transporter gene have been introduced Plasmid pCCS expressing the CS gene of Corynebacterium glutamicum and the citrate of strain NG13 A Rahnella aquatilis JCM1683 strain (R. aquatilis-pCCS-pKCT strain) into which a plasmid pKCT expressing an acid:Na + symporter gene was introduced was prepared. This modified strain was statically cultured at 25° C. for 6 days in KDC medium supplemented with IPTG at a final concentration of 0.02 mM, and the productivity of L-glutamic acid was examined. The results are shown in Table 19. When pCCS-pKCT strain into which citrate synthase and citrate transporter were introduced was cultured in KDC medium, production of L-glutamic acid was observed.
  • the method of the present invention for fermentative production of L-glutamic acid using nitrogen molecules in the atmosphere can be carried out using nitrogen-fixing bacteria belonging to the Enterobacteriaceae family other than the NG13 strain.
  • Example 12 Fermentative production of L-alanine and L-valine by strain NG13 into which citrate synthase gene, glutamate-pyruvate aminotransferase gene, and L-alanine transporter gene were introduced Glutamate-pyruvate aminotransferase is L- It is an enzyme that catalyzes the reaction that produces L-alanine and 2-oxoglutaric acid from glutamic acid and pyruvate, and contributes to the biosynthesis of L-alanine.
  • the glutamate-pyruvate aminotransferase gene By introducing the glutamate-pyruvate aminotransferase gene into the NG13-pCCS strain, the amino group of L-glutamic acid produced using nitrogen molecules in the atmosphere is transferred to pyruvate, resulting in L- It is believed that alanine or a salt thereof can be produced.
  • an L-alanine transporter gene that has the function of excreting L-alanine out of cells, the extracellular transport of the generated L-alanine is promoted, and the production of L-alanine or its salts is promoted. This is thought to improve performance. Therefore, we created a strain into which both genes had been introduced, and examined the L-amino acids present in the culture solution of the strain.
  • Each primer was given a sequence of approximately 20 bp homologous to the vector to be introduced, and was designed to express the gene to be introduced using the expression promoter and ribosome binding site (RBS) derived from the vector.
  • the gene fragment of interest and the vector fragment were combined using Gibson Assembly.
  • Escherichia coli DH5 ⁇ strain was transformed using 10 ⁇ L of the reaction solution, and colonies were selected using the drug selection marker contained in the plasmid. Plasmids were extracted from the colonies that appeared, and sequence analysis confirmed that the plasmids were as designed.
  • NG13-pCCS strain was transformed with plasmid pKACE by electroporation, and transformants were isolated based on chloramphenicol resistance.
  • a plasmid was prepared from this strain, and it was confirmed by agarose gel electrophoresis after restriction enzyme treatment that it contained the desired plasmid.
  • the target substance L-alanine was detected in addition to L-glutamic acid. Ta. Furthermore, L-valine was also detected.
  • nitrogen-fixing bacteria of the genus Klebsiella grow by nitrogen fixation, they produce L-alanine from L-glutamic acid derived from atmospheric nitrogen using glutamic acid-pyruvate aminotransferase, and then produce L-valine-pyruvate from this L-alanine.
  • the production of L-valine by aminotransferases is a constant practice.
  • the method of fermentatively producing L-glutamic acid using nitrogen molecules in the atmosphere of the present invention can also be used for fermentatively producing amino acids other than L-glutamic acid.
  • the microorganism according to the present invention is also used in the field of fermentative production of L-glutamic acid or its salt.
  • nitrogen from the atmosphere it is possible to move away from the use of nitrogen compounds that were previously fixed using the Haber-Bosch process, consuming a large amount of energy.
  • NITE BP-03721 (Receipt number: NITE ABP-03721, Date of receipt of application: July 21, 2023, Name and address of depositary institution: National Institute of Technology and Evaluation, Patent Microorganism Depositary (NPMD) Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, Japan 292-0818)

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Abstract

窒素固定細菌を用いた大気中の窒素分子を基とするＬ－グルタミン酸発酵生産方法の開発を目的とする。窒素固定細菌に窒素固定能が亢進した状態を維持させる培養方法を開発した。この培養方法は、開放系容器に入れた窒素制限培地にクエン酸等の有機酸を混在させることが特徴である。この培養方法で、クエン酸合成酵素遺伝子及びクエン酸輸送体遺伝子を高発現する遺伝子改変株を培養することで、窒素固定に依存したＬ－グルタミン酸の発酵製造方法を開発できた。ここに至る過程で、クエン酸合成酵素遺伝子あるいは２－メチルクエン酸合成酵素遺伝子を高発現する改変株を用いることによる窒素固定に依存したＬ－グルタミン酸の発酵製造方法を開発できた。本発明は、かかる微生物の製造方法ならびに培養方法に関する。

Description

窒素分子を由来とするＬ－グルタミン酸の発酵製造方法
　本発明は、窒素固定細菌の窒素固定能を最大限に発揮可能な培地、及びかかる培地を用いた培養方法、さらにはかかる培地及び培養方法を用いた大気中の窒素分子を用いたＬ－グルタミン酸の発酵製造、並びに大気中の窒素分子を用いたＬ－グルタミン酸の発酵を可能な微生物に関する。
　微生物の中には、大気中の窒素分子をアンモニアに変換する能力を有するものがいる。この能力を窒素固定能という。現在までに窒素固定能を有する微生物が様々に探索されてきており、数百種の微生物が見出されているが、これらはすべてバクテリア・ドメイン（真正細菌）かアーキア・ドメイン（古細菌）に属する微生物であるため、これらを総称して窒素固定細菌という。窒素固定細菌は、窒素分子を唯一の窒素源として生育することができる。
　窒素固定能にかかわる酵素がニトロゲナーゼであり、ニトロゲナーゼは試験管内の理想的反応条件では下記の反応を行う。
　Ｎ2＋８Ｈ+＋８ｅ-＋１６ＡＴＰ　→　２ＮＨ3＋Ｈ2＋１６ＡＤＰ＋１６Ｐｉ
　ニトロゲナーゼは、窒素分子の還元を行うジニトロゲナーゼと、ジニトロゲナーゼに電子を渡すジニトロゲナーゼレダクターゼからなる複合酵素である。ジニトロゲナーゼにはＭｏ型、Ｖ型、Ｆｅ型の３種類があるが、すべての窒素固定細菌が有するジニトロゲナーゼはＭｏ型であり、活性中心に鉄モリブデン・コファクターを有する。したがって、窒素固定細菌は自身を取り囲む環境中にモリブデンと鉄が十分量存在しないと窒素固定能を発揮できない。さらに、窒素固定細菌は自身を取り囲む環境中に利用可能な窒素源（アンモニウム塩、硝酸塩、ペプトンなどのタンパク質分解物）が存在する場合には窒素固定能を発揮せず、それらの窒素源を資化して増殖する。すなわち、窒素固定細菌が窒素固定を行うのは、自身を取り囲む環境中から窒素源が枯渇した場合のみである。
　窒素固定細菌のうち、シアノバクテリアは、光合成によってジニトロゲナーゼレダクターゼが利用する電子とＡＴＰを生産するので、単独で窒素固定を行うことができる。これに対し、従属栄養型の窒素固定細菌は、自然界では植物から供給される炭素源を異化代謝することでジニトロゲナーゼレダクターゼが利用する電子とＡＴＰを生産する。この植物との関係性をもとに窒素固定細菌を分類すると、根粒（茎粒）形成型、根圏棲息型、エンドファイト型に分かれる。一部の根粒形成型窒素固定細菌は、根粒の中でしか窒素固定能を発揮することができないが、その他の窒素固定細菌は無窒素培地（窒素元素を全く含まない合成最少培地）を用いることで窒素固定能を発揮させた状態で試験管培養することが可能である。ただし、炭素源としてどのような糖あるいは有機酸を最も好むかは窒素固定細菌ごとに異なっている。また、電子をどのような経路でジニトロゲナーゼレダクターゼに渡すかを反映して、窒素固定を嫌気条件、微好気条件、好気条件のどの条件で行うかも、窒素固定細菌ごとに異なっている。これらが組み合わさるので、窒素固定細菌を窒素固定能発揮状態で培養する方法は千差万別となる。例えば、通常の場合、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）は糖を供給した嫌気培養でしか、アゾスピリルム・リポフェルム（Azospirillum lipoferum）は有機酸を供給した微好気培養でしか、アゾトバクター・ヴィネランディ（Azotobacter vinelandii）は糖を供給した好気培養でしか窒素固定能を発揮しない。
　窒素固定細菌を液体無窒素培地に植菌（例えば、１０6細胞／ｍＬ程度で）して培養を開始すると、窒素固定能の発揮に伴う増殖が始まるのは長時間のラグタイムを経た後であり、窒素固定能に依存した様々な現象を観察するには数週間の培養期間が必要となる。一方、無窒素培地に１００ｍｇ／Ｌで酵母エキスを添加した窒素制限培地を寒天で固化したものに窒素固定細菌を塗布すると、窒素固定能に依存した速やかなコロニー形成が起きることが知られている。しかも、窒素固定細菌によっては、固体培地を大気下で培養しても窒素固定能を発揮するコロニーが得られる場合がある。その窒素固定細菌の一つが、クレブシエラ属の窒素固定細菌である（非特許文献１：Rennie, Can. J. Microbiol. 27 8-14 1981）。そこでこの１００ｍｇ／Ｌで酵母エキスを添加することを液体無窒素培地にも応用し、クレブシエラ・オキシトカを開放型容器に入れた窒素制限液体培地にて大気下で静置培養することにおいても、窒素固定能を安定に発揮させうるのではないかと着想し、その培養方法を完成した。この培養方法では、窒素固定細菌はほぼラグタイム無く増殖を開始し、培養開始２４時間後までには窒素固定能を発揮し、窒素固定能に依存した様々な現象の観察を一週間以内の培養期間で終えることができる。
　培養している窒素固定細菌がどの程度の窒素固定能を発揮しているかを計測する簡便な方法がアセチレン還元法である。ニトロゲナーゼは基質特異性が低いため、窒素固定活性に加えて、アセチレンをエチレンに還元する活性（アセチレン還元活性）も有する。窒素制限培地を入れた培養器の気層を窒素分子とアセチレンの混合気体で満たして窒素固定細菌を培養すると、窒素固定細菌はその両者を還元してアンモニアとエチレンを同時に生成する。アンモニアは窒素同化にて消費されるので、窒素固定活性をリアルタイムに測定することはできない。一方、エチレンはそれ以上代謝されることなく気層に放出される。したがって、気層に蓄積されるエチレン量を計測することでニトロゲナーゼのアセチレン還元活性が決定される。通常、アセチレン還元活性の値で窒素固定細菌の窒素固定能を表す。
　一方、Ｌ－グルタミン酸は食品あるいは医薬品として重要なアミノ酸である。微生物は、Ｌ－グルタミン酸脱水素酵素あるいはグルタミン合成酵素・グルタミン酸合成酵素複合系によってアンモニウムイオンと２－オキソグルタル酸からＬ－グルタミン酸を生成する能力を有する。この代謝を窒素同化という。現在までに、様々な微生物を遺伝子改変したうえで、その改変微生物を用いてＬ－グルタミン酸を発酵製造する方法が開発されている。その遺伝子改変の基本は、窒素同化におけるアンモニウムイオンの受け手である２－オキソグルタル酸の生産を強化する改変である。例えば、特許文献１：特許第４１４４１３１号公報では、クレブシエラ属細菌にコリネ型細菌由来のクエン酸合成酵素（ＣＳ）を高発現させる改変を行い、この微生物を大量のアンモニウムイオン（２０ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム）を含有する培地で好気培養することでＬ－グルタミン酸の発酵生産を行っている。また、特許文献２：特開２００９－２５４３２３号公報では、クレブシエラ属細菌に大腸菌あるいはコリネ型細菌由来のメチルクエン酸合成酵素（ＭＣＳ）を高発現させる改変を行い、この微生物を大量のアンモニウムイオン（１０ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム）を含有する培地で嫌気培養することでＬ－グルタミン酸を発酵生産する方法が開示されている。これらの例では、窒素同化のためのアンモニウムイオンを、培地に大量に投入することで供給している。現在、アンモニアの製造方法として最も普及しているのがハーバーボッシュ法である。この方法は、化石燃料（石炭、石油、メタンガス）の水蒸気改質によって製造した水素分子と大気中の窒素分子を反応させてアンモニアを製造するプロセスで、これを稼働させることにはかなりのコストがかかる。
特許第４１４４１３１号公報 特開２００９－２５４３２３号公報
Rennie, Can. J. Microbiol. 27 8-14 1981 Bott, Mol. Microbiol. 18 533-546 1995 Weitzman, Adv. Microb. Physiol. 22 185-244 1981 Saier, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64 354-411 2000 Soares-Silva et al., FEMS Microbiol. Letter. 367 1-15 2020 Kaestner et al., Arch. Microbiol. 177 500-506 2002 Son HF et al., PLoS ONE. 11(6): e0158402 Choi, J.W. et al., Microb Cell Fact 14, 21 2015
　以上のことを勘案し、窒素固定細菌に最大級の窒素固定能を発揮させる培養条件を見つけ出したうえで、そこで培養する窒素固定細菌を特許文献１及び特許文献２（特許第４１４４１３１号公報及び特開２００９－２５４３２３号公報）のように２－オキソグルタル酸の生産を強化した改変株とした新規の発酵生産方法を着想するに至った。これにより、最大級の窒素固定能で生成されたアンモニアを効率よくＬ－グルタミン酸に変換するＬ－グルタミン酸の新規の発酵生産方法を提供することを目的とする。
　前述したように、最大級の窒素固定能を発揮させるための培養条件は窒素固定細菌ごとに大きく異なることから、クレブシエラ属微生物における培地組成ならびに培養方法を検討した。クエン酸等の有機酸が添加された窒素制限培地において、クレブシエラ属微生物の窒素固定能が亢進することを見出した。そこで、さらにクレブシエラ属微生物に、クエン酸合成酵素（ＣＳ）遺伝子及び２－メチルクエン酸合成酵素（２－ＭＣＳ）遺伝子を導入し、クエン酸等の有機酸が添加された窒素制限培地で培養することで大気中の窒素分子からＬ－グルタミン酸又はその塩を生産することを見出した。また、クレブシエラ属微生物に導入することで、クエン酸等の有機酸を添加した窒素制限培地で培養した際に大気中の窒素分子からＬ－グルタミン酸又はその塩を生産させうる新たな遺伝子として、クエン酸輸送体遺伝子を見出した。さらに、クエン酸合成酵素遺伝子及びクエン酸輸送体遺伝子の両方を導入したクレブシエラ属微生物は、片方の遺伝子を導入したものより多量のＬ－グルタミン酸を生産した。これにより、最終的には特許文献１及び２（特許第４１４４１３１号公報、特開２００９－２５４３２３号公報）とは異なる改変株を用いることで窒素固定細菌の窒素固定能に基づくＬ－グルタミン酸の発酵生産方法を確立し、本発明を完成するに至った。
　そこで、本発明は以下に関する：
［１］　クエン酸輸送体、クエン酸合成酵素、及び２－メチルクエン酸合成酵素からなる群から選ばれる少なくとも１の遺伝子を導入された窒素固定細菌を、ＴＣＡ回路を構成する有機酸又はその塩を含有する窒素制限培地で培養する工程を含む、大気中の窒素分子からＬ－グルタミン酸又はその塩を発酵生成する方法。
［２］　前記窒素制限培地が、酵母エキス換算で３ｍｇ／Ｌ～１５００ｍｇ／Ｌ、及び／又はアンモニウムイオン換算で０．０２ｍＭ～１５ｍＭの窒素源を含む、項目１に記載の方法。
［３］　前記有機酸又はその塩が、０．５ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌの濃度である、項目１又は２に記載の方法。
［４］　前記有機酸がクエン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、２－オキソグルタル酸である項目１～３のいずれか一項に記載の方法。
［５］　前記窒素固定細菌が、腸内細菌科の微生物である、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
［６］　前記窒素固定細菌が、クレブシエラ属、ラーネラ属、及びラウルテラ属、コサコニア属からなる群から選ばれる微生物である、項目５に記載の方法。
［７］　クレブシエラ属、ラーネラ属、コサコニア属及びラウルテラ属からなる群から選ばれ、クエン酸輸送体の遺伝子が導入された窒素固定細菌。
［８］　クレブシエラ属の窒素固定細菌が、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・ミシガネンシス、クレブシエラ・グリモンティ、クレブシエラ・パスツリ、クレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・ヴァリイコラ、クレブシエラ・インディカ、からなる群から選ばれ、ラーネラ属の窒素固定細菌が、ラーネラ・アクアティリスであり、又はラウルテラ属の窒素固定細菌が、ラウルテラ・テリゲナ及びラウルテラ・オルニチノリティカ、及びラウルテラ・プランティコラからなる群から選ばれる、項目７に記載の窒素固定細菌。
［９］　前記窒素固定細菌が、クレブシエラ・オキシトカＮＧ１３株（受託番号：NITE BP-03721）、クレブシエラ・インディカ（ＪＣＭ３３７１８）、クレブシエラ・ヴァリイコラ（ＪＣＭ１２４１９）、クレブシエラ・ｓｐ.（ＮＢＲＣ１０００４８、ＮＢＲＣ１００４４１、ＮＢＲＣ１０９９１１）、ラウルテラ・テリゲナ（ＪＣＭ１６８７＝ＡＴＣＣ３３２５７）、ラーネラ・アクアティリス（ＪＣＭ１６８３＝ＡＴＣＣ３３０７１）、クレブシエラ・プランティコラ（ＪＣＭ２００６９＝ＡＴＣＣ８３２９）である、項目７に記載の窒素固定細菌。
［１０］　前記窒素固定細菌が、窒素制限下において、大気中の窒素分子をＬ－グルタミン酸又はその塩を発酵生成する、項目７～９のいずれか一項に記載の窒素固定細菌。
　本発明の製造方法により製造された微生物は、大気中の窒素を固定しつつ、Ｌ－グルタミン酸を生成する。ハーバーボッシュ法で製造されるアンモニアに依存せず、Ｌ－グルタミン酸の発酵を可能にする。
図１は、本発明において行ったＮＧ１３株における遺伝子改変がもたらした窒素分子からＬ－グルタミン酸を生成する代謝経路の全体像を示した図である。 図２は、ＮＧ１３－ｐＣＣＳ株を15Ｎ2とＯ2の混合ガスあるいは空気で培養したときに培地に蓄積したＬ－グルタミン酸の分子量をＬＣ－ＭＳで分析した結果を示す。 図３は、ＮＧ１３株のクローン化したクエン酸合成酵素遺伝子の塩基配列を示す。 図４は、ＮＧ１３株のクローン化したクエン酸：Ｎａ+共輸送体遺伝子の塩基配列を示す。 図５は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC13869株のクエン酸合成酵素遺伝子の塩基配列を示す。 図６は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC13869株の２－メチルクエン酸合成酵素遺伝子の塩基配列を示す。 図７は、大腸菌（Escherichia coli）W3110株の２－メチルクエン酸合成酵素遺伝子の塩基配列を示す。 図８は、ＮＧ１３株のクローン化したグルタミン酸－ピルビン酸アミノ基転移酵素遺伝子の塩基配列を示す。 図９は、ＮＧ１３株のクローン化したＬ－アラニン輸送体遺伝子の塩基配列を示す。 図１０は、大腸菌（Escherichia coli）ＭＧ１６５５株のグルタミン酸－オキサロ酢酸アミノ基転移酵素の遺伝子の塩基配列を示す。 図１１は、大腸菌（Escherichia coli）ＭＧ１６５５株のグルタミン酸脱炭酸酵素の遺伝子の塩基配列を示す。 図１２は、ラーネラ－ｐＣＣＳ－ｐＫＣＴ株を１５Ｎ2とＯ2の混合ガスで培養して培地中に蓄積したＬ－グルタミン酸の分子量の分析結果を示す。
　本発明の一の態様は、窒素固定細菌を大気下で窒素固定能を発揮させつつ培養する方法並びに窒素固定細菌に最大級の窒素固定能を発揮させる培養培地に関する。本発明の別の態様は、Ｌ－グルタミン酸の生成を促進するように遺伝子導入された窒素固定細菌に関し、さらにはＬ－グルタミン酸の生成を促進するように遺伝子導入された窒素固定細菌を、クエン酸等の有機酸を含有する窒素制限培地で培養する工程を含む、大気中の窒素分子からＬ－グルタミン酸を発酵生成する方法にも関する。
［窒素制限培地］
　本発明において、窒素制限培地とは、窒素固定細菌に窒素固定能を発揮させるために、窒素含有量を調整した培養培地に関する。窒素制限培地には窒素固定細菌の初期増殖を促し、かつ窒素固定活性を阻害しない濃度の窒素源を含むことができる。窒素制限培地の窒素濃度は、窒素固定細菌の種類及び窒素源の種類に応じて変化しうるが、一例として酵母エキス換算で表すことができる。一方、窒素固定細菌の種類及び窒素源の種類、並びに炭素源の濃度に応じて必要とされる窒素量が変化しうるため、当業者であれば、個別の培養条件に応じて、窒素固定細菌の初期増殖を促し、かつ窒素固定活性を阻害しない量を適宜決定することができる。一例として、本発明の窒素制限培地は、クエン酸等の有機酸又はその塩と、酵母エキス換算で５０ｍｇ／Ｌ～３００ｍｇ／Ｌ、好ましくは５０ｍｇ／Ｌ～２００ｍｇ／Ｌの窒素源とを含み、さらにクエン酸等の有機酸又はその塩とは別に炭素源とを含んでもよい。本発明に係る窒素制限培地は、大気中の窒素分子を固定する窒素固定細菌の培養に適しており、クエン酸又はその塩を含有することにより、窒素固定能を亢進することが可能になる。
　窒素制限培地に含まれる窒素源量は使用する窒素固定細菌によって変化しうる。窒素制限培地は、酵母エキス換算及び／又はアンモニウムイオン換算の窒素源の量により規定することができる。一例として、窒素制限培地は、酵母エキス換算で３ｍｇ／Ｌ～１５００ｍｇ／Ｌの窒素源を含むように調製されうる。より好ましい窒素源量としては、酵母エキス換算で２５ｍｇ／Ｌ～５００ｍｇ／Ｌの窒素源を含むように調製されうる。最も好ましい窒素源量としては、酵母エキス換算で５０ｍｇ／Ｌ～３００ｍｇ／Ｌの窒素源を含むように調製されうる。また、一例として、窒素制限培地の窒素源としてアンモニウム塩を使用する場合は、アンモニウムイオン濃度として０．０２ｍＭ～１５ｍＭ含まれるように調製されうる。窒素制限培地の窒素源としてのアンモニウムイオン濃度は、好ましくは０．２ｍＭ～５ｍＭであり、最も好ましい窒素源量は０．３５ｍＭ～３ｍＭである。 窒素制限培地に含まれる窒素は、窒素固定細菌の初期増殖において菌体に取り込まれて消費され、培地中の窒素濃度が一定以下の濃度になると、 窒素固定細菌は大気中の窒素を固定するようになり、それにより大気中の窒素分子由来のＬ－グルタミン酸又はその塩が生成する。つまり、本発明で発酵生産されるＬ－グルタミン酸を構成する窒素原子には大気中の窒素分子由来のものが含まれることが特徴である。
　窒素源としては、酵母エキス等を含むエキス類、カザミノ酸やペプトン等を含む各種アミノ酸の混合物、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウムなどのアンモニウム塩などを使用することができる。窒素制限培地に使用する窒素源の濃度は、酵母エキスに換算した濃度で表すことができる。酵母エキスは、約１０％の総ケルダール窒素を含むことから、使用する窒素源の総ケルダール窒素量に基づいて、酵母エキス換算の濃度を計算することができる。本発明に係る窒素制限培地は、通常、培養開始時に酵母エキス換算で３ｍｇ／Ｌ～１５００ｍｇ／Ｌ、つまり、総ケルダール窒素量として０．３ｍｇ／Ｌ～１５０ｍｇ／Ｌの窒素源を含みうる。窒素固定能を最大限とする観点から、酵母エキス換算で２５ｍｇ／Ｌ以上、つまり、総ケルダール窒素量として２．５ｍｇ／Ｌ以上の窒素源を含むことが好ましく、酵母エキス換算で５０ｍｇ／Ｌ以上、つまり、総ケルダール窒素量として５ｍｇ／Ｌ以上がさらに好ましく、酵母エキス換算で５００ｍｇ／Ｌ以下、つまり、総ケルダール窒素量として５０ｍｇ／Ｌ以下が好ましく、酵母エキス換算で３００ｍｇ／Ｌ以下、つまり、総ケルダール窒素量として３０ｍｇ／Ｌ以下の窒素源を含むことがさらにより好ましい。
　有機酸又はその塩が添加された窒素制限培地で培養することにより、窒素固定細菌の窒素固定能が亢進される作用機序は解明されていないが、以下のことが考えうる。窒素固定細菌は、細胞内における２－オキソグルタル酸／Ｌ－グルタミン比を感知して、この比が大きいと窒素固定能を亢進し、この比が小さいと窒素固定能を抑制する。培地中の有機酸を取り込んで２－オキソグルタル酸を生成することにより、細胞内の２－オキソグルタル酸／Ｌ－グルタミン比を大きい状態に保つことで、窒素固定能が亢進されている可能性がある。窒素制限培地に含まれる有機酸又はその塩の濃度としては、０．５ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌが使用され、窒素固定能を最大化する観点から、１ｇ／Ｌ以上、２．５ｇ／Ｌ以上、５ｇ／Ｌ以上、６ｇ／Ｌ以上、又は７ｇ／Ｌ以上が使用されてもよく、１５ｇ／Ｌ以下、１２ｇ／Ｌ以下、１０ｇ／Ｌ以下、９ｇ／Ｌ以下、又は８ｇ／Ｌ以下が使用されてもよい。有機酸の塩としては、任意の塩が使用されうるが、一例として、カリウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩などが用いられうる。有機酸として、ＴＣＡ回路に含まれる有機酸、例えばオキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、２－オキソグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、又はそれらの塩などを窒素制限培地に添加することができる。
　炭素源として、グルコース等の糖類と有機酸又はその塩とを組み合わせて添加された窒素制限培地を用いることもできる。一例として、窒素制限培地に含まれる炭素源量はグルコース換算で０．５ｇ／Ｌ～３００ｇ／Ｌであれば良く、好ましくは５ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌである。グルコース等の糖類と有機酸又はその塩の配合比は、実験条件に合わせて適宜選択することができるが、一例としてグルコースとクエン酸又はその塩の重量比で１：５～５：１で用いることができ、好ましくは１：４～４：１、より好ましくは１：３～３：１、さらにより好ましくは１：２～２：１で使用することができる。また、クエン酸又はその塩の量の２倍程度のグルコース等の糖量を用いることで、グルタミン酸産生量を増大することができる。一例として、グルコースと、クエン酸又はその塩とを窒素制限培地に添加する場合、グルコースを０．５ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌ、クエン酸又はその塩を０．５ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌの範囲で使用しうる。グルコースとクエン酸又はその塩は、上述の配合比となるように、それぞれ２．５ｇ／Ｌ以上、５ｇ／Ｌ以上、６ｇ／Ｌ以上、又は７ｇ／Ｌ以上が使用されてもよく、１５ｇ／Ｌ以下、１２ｇ／Ｌ以下、１０ｇ／Ｌ以下、９ｇ／Ｌ以下、又は８ｇ／Ｌ以下が使用されてもよい。クエン酸輸送体遺伝子を導入した窒素固定細菌を用いる観点では、５～１０ｇ／Ｌのクエン酸又はその塩に対し、倍量のグルコース等の糖類を配合した培地を使用することができる。
　　炭素源としては、糖類、例えば単糖、二糖、糖アルコール、多糖類、有機酸等を使用することもできる。かかる糖類としては、グルコース、マンノース、ガラクトース、フルクトース、キシロース、スクロース、マルトース、セロビオース、トレハロース、マンニトール、イノシトール、ソルビトール、グリセロール、澱粉加水分解物などが使用されうるが、グルコースが通常用いられる。有機酸としては、細菌が利用可能な有機酸であれば任意の有機酸を使用することができる。有機酸の一例として、ＴＣＡ回路に含まれる有機酸、例えばオキサロ酢酸、クエン酸、イソクエン酸、２－オキソグルタル酸、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸などを炭素源として使用しうる。炭素源の濃度として、グルコース換算で０．５ｇ／Ｌ～３００ｇ／Ｌを設定することができ、窒素固定能を最大限とする観点から、１０ｇ／Ｌ以上が好ましく、１５ｇ／Ｌ以上がより好ましく、２２．５ｇ／Ｌ以上がさらに好ましい。本発明の窒素制限培地において添加されるクエン酸等の有機酸は炭素源の一つとして配合され、クエン酸等の有機酸とその他の炭素源、例えばグルコースとの合計を炭素源の濃度として使用する。
　窒素固定細菌の培養においては、窒素、特に無機窒素が培地中に存在すると、窒素固定反応が強力に抑制される。一方で、培養の初期段階では、窒素固定細菌の増殖並びにニトロゲナーゼの生成にある程度の窒素が必要とされる。したがって、大気中の窒素分子を固定することによりＬ－グルタミン酸又はその塩を生産するための窒素固定細菌の培養用の窒素制限培地には、窒素源が添加されている一方、培養が行われることで、培地中の窒素源が消費され、窒素源濃度が一定以下になると、大気中の窒素分子が固定される。したがって、本発明にかかる窒素制限培地を用いて培養を行う場合には、通常、気体の窒素、例えば大気中窒素分子以外の窒素源が追加的に添加されることはない。
　窒素制限培地には、その他、窒素固定細菌の種類に応じて必要とされる成分を含めた合成最少培地を使用することができる。腸内細菌科の微生物を培養する観点からは、そのような成分として、無機塩類、緩衝物質、ビタミン類が挙げられる。無機塩類としては、リン酸塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、カルシウム塩、鉄塩、マンガン塩、モリブデン塩などが添加され、より具体的には、塩化ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化カルシウム、モリブデン酸塩、例えばＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏなどの無機塩類が添加されうる。緩衝物質としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウムが挙げられる。ビタミン類としては、ｐ-アミノ安息香酸、ビオチンなどが用いられる。窒素制限培地のｐＨは、窒素固定細菌の増殖を阻害しない範囲で任意に選択することができ、例えばｐＨ６．８～７．５に調整されうる。
［窒素固定細菌］
　本発明において使用されうる窒素固定細菌としては、腸内細菌科に属する微生物が挙げられる。例えば、腸内細菌科に属する微生物としては、クレブシエラ（Klebsiella）属、ラーネラ（Rahnella）属、及びラウルテラ（Raoultella）属、コサコニア（Kosakonia）属からなる群から選ばれる属の微生物が使用されうる。例えばクレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca)、クレブシエラ・ミシガネンシス（Klebsiella michiganensis）、クレブシエラ・グリモンティ（Klebsiella grimontii）、クレブシエラ・パスツリ（Klebsiella pasteurii）、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae)、クレブシエラ・ヴァリイコラ（Klebsiella variicola）、クレブシエラ・インディカ（Klebsiella indica）、ラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis）、ラウルテラ・テリゲナ（Raoultella terrigena）、ラウルテラ・オルニチノリティカ（Raoultella ornithinolytica）、ラウルテラ・プランティコラ（Raoultella planticola）等の微生物が好ましい。より具体的には、稲の根から単離された窒素固定細菌であるクレブシエラ・オキシトカ、特にＮＧ１３株（受託番号：NITE BP-03721、受領番号：NITE ABP-03721、申請の受領日：２０２３年７月２１日）を使用することができる。ＮＧ１３株は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに寄託されている。また、窒素固定細菌としては窒素固定に関わる遺伝子群を導入したエシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等の微生物を使用してもよい。また、腸内細菌科以外に属する窒素固定細菌としては、ザントバクター（Xanthobacter）属、アゾリゾビウム（Azorhizobium）属等の微生物が使用されうる。これらの微生物の中で、特にクレブシエラ（Klebsiella）属、ラーネラ（Rahnella）属、及びラウルテラ（Raoultella）属に属する微生物が好ましい。これらの微生物に、特にグルタミン酸合成酵素の遺伝子とクエン酸輸送体の遺伝子を導入することでＬ－グルタミン酸の高生産を達成しうる。
　本発明において窒素固定細菌は、Ｌ－グルタミン酸の生成を促進するように遺伝子導入されうる。Ｌ－グルタミン酸の生成を促進するように遺伝子導入された窒素固定細菌を本発明に係る窒素固定細菌という。一例として、導入される遺伝子は、クエン酸合成酵素、２－メチルクエン酸合成酵素、及びクエン酸輸送体から選択されるタンパク質をコードする遺伝子である。そして、クエン酸合成酵素遺伝子及びクエン酸輸送体遺伝子の両方を導入すること、あるいは２－メチルクエン酸合成酵素遺伝子及びクエン酸輸送体遺伝子の両方を導入することが好ましい。クエン酸合成酵素、２-メチルクエン酸合成酵素、又はクエン酸輸送体は、細胞内のクエン酸濃度を増大させることを目的として窒素固定細菌に導入される。そして、クエン酸輸送体は、クエン酸合成酵素及び２-メチルクエン酸合成酵素に対して独立して機能する。これにより、窒素固定細菌の細胞内のクエン酸濃度が増大することに伴って２－オキソグルタル酸の生成量も増大することで、大気中の窒素分子から固定されたアンモニアが、窒素同化経路によりＬ－グルタミン酸又はその塩へと変換され、これによりＬ－グルタミン酸又はその塩を生成することができる。
　クエン酸合成酵素（ＣＳ）は、ほぼすべての生物が保有する、糖酸化過程において中心的な役割を果たす酵素であり、ＴＣＡ回路の最初の段階に寄与する。具体的には、解糖系で生成されるピルビン酸が変換されたアセチルＣｏＡと、オキサロ酢酸、及び水から、クエン酸とＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素である（図１）。本発明において、窒素固定細菌へ導入されるＣＳ遺伝子は、任意の細菌に由来してよい。細菌のＣＳには、グラム陽性細菌が保有する“スモール”ＣＳと、グラム陰性細菌が保有する“ラージ”ＣＳが存在する。“スモール”ＣＳの活性はＮＡＤＨによる阻害を受けないが、“ラージ”ＣＳの活性はＮＡＤＨによる阻害を受ける（非特許文献３：Weitzman, Adv. Microb. Physiol. 22 185-244 1981）。これより、窒素固定細菌に導入するＣＳ遺伝子としては、グラム陽性細菌より取得したＣＳ遺伝子が好ましい。例えば、アースロバクター（Arthrobacter）属細菌、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌、バチルス（Bacillus）属細菌、マイコバクテリウム（Mycobacterium）属細菌、ストレプトマイセス（Streptomyces）属細菌から取得したＣＳ遺伝子である。特に、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）のＣＳ遺伝子を使用することができる。一例として、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC13869のＣＳ遺伝子（配列番号３、アミノ酸配列：配列番号３０）を使用することができる。一方、グラム陰性細菌のＣＳであってもＮＡＤＨで活性阻害を受けないものもあり、それらのＣＳの遺伝子も窒素固定細菌に導入するＣＳ遺伝子として好ましい。例えば、アセトバクター（Acetobacter）属細菌、ハロバクテリウム（Halobacterium）属細菌、サーマス（Thermus）属細菌、チオバチルス（Thiobacillus）属細菌から取得したＣＳ遺伝子である。特に、サーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）のＣＳ遺伝子を使用することができる。導入先の細菌から取得されたＣＳ遺伝子が使用されてもよい。例えば、クレブシエラ・オキシトカＮＧ１３株のＣＳは、配列番号１の塩基配列にコードされる（アミノ酸配列：配列番号２８）。ＣＳ遺伝子を窒素固定細菌に導入することで微生物の細胞中のクエン酸濃度を増大することができる。クエン酸合成酵素の遺伝子を導入された窒素固定細菌を、クエン酸含有窒素制限培地中で培養することで、Ｌ－グルタミン酸又はその塩を生成することができる。
　２－メチルクエン酸合成酵素（２－ＭＣＳ）は、多数の細菌が保有する酵素であり、プロピオニルＣｏＡ、オキサロ酢酸及び水から、２－メチルクエン酸とＣｏＡを生成する反応を触媒する酵素である。一方で、２－ＭＣＳは、副活性としてＣＳと同じ反応を触媒する。２－ＭＣＳは、単にメチルクエン酸合成酵素（ＭＣＳ）とも呼ばれうる。本発明において、窒素固定細菌へ導入される２－ＭＣＳ遺伝子は、その遺伝子にコードされる２－ＭＣＳがＣＳと同じ反応を触媒する限りにおいて、任意の細菌由来の２－ＭＣＳ遺伝子であってよい。例えば、大腸菌（Escherichia coli）及びコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）の２－ＭＣＳ遺伝子を使用することができる。一例として、大腸菌Ｗ３１１０株由来の２－ＭＣＳ遺伝子（配列番号５、アミノ酸配列：配列番号３２）、又はコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC13869の２－ＭＣＳ遺伝子（配列番号４、アミノ酸配列：配列番号３１）を使用することができる。さらに、大腸菌（Escherichia coli）２－ＭＣＳと、アミノ酸配列上で７３％以上の相同性を示すシトロバクター（Citrobacter）属細菌、セラチア（Serratia）属細菌、ステントロホモナス（Stenotrophomonas）属細菌、クロモバクテリウム（Chromobacterium）属細菌、ラルストニア（Ralstonia）属細菌、カプリアビダス（Cupriavidus）属細菌、バークホルデリア（Burkholderia）属細菌、アクロモバクター（Achromobacter）属細菌、ハーバスピリラム（Herbaspirillum）属細菌の２－ＭＣＳ遺伝子も使用できる。また、コリネバクテリウム（Corynebacterium）属細菌の中では、コリネバクテリウム・コメス（Corynebacterium comes）、コリネバクテリウム・ヒュミレデュセンス（Corynebacterium humireducens）、コリネバクテリウム・マリヌム（Corynebacterium marinum）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Corynebacterium testudinoris）ならびにブレビバクテリウム・フラブム（Brevibacterium flavum）の２－ＭＣＳ遺伝子を使用することもできる。導入先の細菌から取得された２－ＭＣＳ遺伝子が使用されてもよい。２－メチルクエン酸合成酵素遺伝子を窒素固定細菌に導入することで、微生物の細胞中のクエン酸濃度を増大することができる。２－ＭＣＳ遺伝子を導入された窒素固定細菌を、クエン酸含有窒素制限培地中で培養することで、Ｌ－グルタミン酸又はその塩を生成することができる。
　クエン酸輸送体は、微生物の菌体外に存在するクエン酸を菌体内に取り込む輸送体である。細菌のクエン酸輸送体は、トランスポーター分類（TC: Transporter Classification）システムの番号で、２．Ａ．１．６、２．Ａ．１１、２．Ａ．２４、２．Ａ．４７、２．Ａ．８０の５種類に分類されている（非特許文献４：Saier, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 64 354-411 2000、非特許文献５：Soares-Silva et al., FEMS Microbiol. Letter. 367 1-15 2020）。ＴＣ　Ｎｏ．２．Ａ．１．６の輸送体は、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）のＣｉｔＨに代表されるクエン酸：Ｈ+共輸送体である。この輸送体は、多数の細菌が保有している。ＴＣ　Ｎｏ．２．Ａ．１１の輸送体には、枯草菌（Bacillus subtilis）のＣｉｔＭに代表されるクエン酸・２価金属イオン：Ｈ+共輸送体、枯草菌（Bacillus subtilis）のＣｉｔＨに代表されるクエン酸・２価金属イオン：Ｈ+共輸送体、枯草菌（Bacillus subtilis）のＹＲＡＯに代表されるクエン酸：Ｈ+共輸送体、ならびにコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）のＣｉｔＨに代表されるクエン酸・２価金属イオン輸送体が含まれる。ＴＣ　Ｎｏ．２．Ａ．２４の輸送体には、クレブシエラ・ニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）のＣｉｔＳに代表されるクエン酸：Ｎａ+共輸送体、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）のＭｌｅＰに代表されるクエン酸：Ｎａ+共輸送体、枯草菌（Bacillus subtilis）のＣｉｍＨに代表される電気的中性のクエン酸：Ｈ+共輸送体、ラクトコッカス・ラクティス（Lactococcus lactis）のＣｉｔＰに代表される起電性のクエン酸：Ｌ－乳酸交換輸送体、ならびにロイコノストック・メセンテロイデス（Leuconostoc mesenteroides）のＣｉｔＰに代表されるクエン酸：乳酸対向輸送体が含まれる。ＴＣ　Ｎｏ．２．Ａ．４７の輸送体は、大腸菌（Escherichia coli）のＣｉｔＴに代表されるクエン酸：コハク酸対向輸送体である。ＴＣ　Ｎｏ．２．Ａ．８０の輸送体は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）のＴｃｔＣＢＡに代表される三分子複合体型クエン酸輸送体である。本発明において、窒素固定細菌へ導入されるクエン酸輸送体の遺伝子は、上記の各種のクエン酸輸送体をコードする任意の細菌由来の遺伝子であってよい。導入先の細菌から取得されたクエン酸輸送体の遺伝子が使用されてもよい。特に好ましくは、クレブシエラ・オキシトカが保有するクエン酸：Ｎａ+共輸送体の遺伝子ならびにクエン酸：Ｈ+共輸送体の遺伝子を導入することができる。クレブシエラ・オキシトカは、クレブシエラ・ニューモニエが保有するクエン酸：酢酸交換輸送体の遺伝子（ｃｉｔＷ）（非特許文献６：Kaestner et al., Arch. Microbiol. 177 500-506 2002）に相同な遺伝子を保有するので、クレブシエラ・オキシトカが保有するクエン酸：酢酸交換輸送体の遺伝子を導入することもできる。クレブシエラ・オキシトカＮＧ１３株のクエン酸・Ｎａ+共輸送体は、配列番号２の塩基配列にコードされる（アミノ酸配列：配列番号２９）。クエン酸輸送体の遺伝子を高発現する窒素固定細菌をクエン酸含有窒素制限培地中で培養することで、菌体内のクエン酸濃度を増大することができ、Ｌ－グルタミン酸又はその塩を生成することができる。
　窒素固定細菌は、各代謝経路の遺伝子に改変を行うと、窒素固定能が低下することが多い。そこで、代謝経路の遺伝子改変を行った窒素固定細菌においても、高水準に窒素固定能を発揮可能な培養培地が必要とされる。有機酸又はその塩を含む窒素制限培地は、窒素固定能を亢進することができ、かかる培地を用いてＬ－グルタミン酸を生成可能なように遺伝子導入された窒素固定細菌を培養することで大気中の窒素分子からＬ－グルタミン酸又はその塩を発酵生成することが可能になる。
　クエン酸合成酵素、２－メチルクエン酸合成酵素、及びクエン酸輸送体からなる群から選ばれるタンパク質をコードする遺伝子は、発現を制御するプロモーター及びターミネーター配列を備えてもよい。より好ましくは、一過的発現を可能にするプロモーターを利用することが好ましい。一過的発現を可能にするプロモーターとしては、ＩＰＴＧ添加により制御可能なｔｒｃプロモーターが用いられうる。プロモーター及びターミネーターを備えた遺伝子を含むベクターを、定法に用いて遺伝子導入することができる。
 本発明で用いられる、クエン酸合成酵素、２－メチルクエン酸合成酵素、及びクエン酸輸送体からなる群から選ばれる少なくとも１の遺伝子が導入された窒素固定細菌に対し、Ｌ－グルタミン酸以外のアミノ酸の生成を目的として、さらに遺伝子を導入することもできる。Ｌ－グルタミン酸以外のアミノ酸として、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、トレオニン、トリプトファン、及びバリンなどの必須アミノ酸、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、アラニン、グリシン、システイン、アスパラギン酸、プロリン、グルタミン、チロシン、γ－アミノ酪酸などのアミノ酸が挙げられ、通常Ｌ体のアミノ酸である。Ｌ－グルタミン酸以外のアミノ酸については、本技術分野の周知技術に基づき、適宜導入遺伝子を選択することで、生成することが可能になる。一例として、グルタミン酸－ピルビン酸アミノ基転移酵素の遺伝子（配列番号３３、アミノ酸配列：配列番号３７）とＬ－アラニン輸送体の遺伝子（配列番号３４、アミノ酸配列：配列番号３８）を導入することにより、Ｌ－アラニン及びＬ－バリンの生成が可能になる。また、一例として、グルタミン酸－オキサロ酢酸アミノ基転移酵素の遺伝子（配列番号３５、アミノ酸配列：配列番号３９）を導入することにより、Ｌ－アスパラギン酸の生成が可能になると考えられる（非特許文献７：Son HF et al., PLoS ONE. 11(6): e0158402）。またさらに、一例として、グルタミン酸脱炭酸酵素の遺伝子（配列番号３６、アミノ酸配列：配列番号４０）を導入することにより、γ－アミノ酪酸の生成が可能になると考えられる（非特許文献８：Choi, J.W. et al., Microb Cell Fact 14, 21 2015）。したがって、本発明の別の態様では、Ｌ－グルタミン酸以外のアミノ酸の生成を目的として、クエン酸合成酵素、２－メチルクエン酸合成酵素、及びクエン酸輸送体からなる群から選ばれる少なくとも１の遺伝子以外にさらなる遺伝子が導入された窒素固定細菌に関してもよい。さらに本発明の別の態様では、かかる窒素固定細菌を、有機酸又はその塩を含有する窒素制限培地で培養する工程を含むＬ－アラニン及び／又はＬ－バリン等のＬ－グルタミン酸以外のアミノ酸を発酵生成する方法に関してもよい。Ｌ－アラニン及び／又はＬ－バリン等のＬ－グルタミン酸以外のアミノ酸を発酵生成する方法において用いる窒素制限培地は、Ｌ-グルタミン酸を発酵生成する方法において用いられる培地と同じ培地を使用することができる。
　グルタミン酸－ピルビン酸アミノ基転移酵素は、Ｌ－グルタミン酸とピルビン酸からＬ－アラニンと２－オキソグルタル酸を生成する反応を触媒する酵素であり、Ｌ－アラニンの生合成に寄与する。グルタミン酸－ピルビン酸アミノ基転移酵素遺伝子は任意の細菌に由来してよく、窒素固定細菌にグルタミン酸－ピルビン酸アミノ基転移酵素遺伝子を導入することで、大気中の窒素分子を利用して生産されたＬ－グルタミン酸のアミノ基がピルビン酸へ転移され、それによりＬ－アラニン又はその塩を生成することができると考えられる。
　Ｌ－アラニン輸送体は、Ｌ－アラニンを細胞外へ排出する機能を有する。Ｌ－アラニン輸送体遺伝子は任意の細菌に由来してよく、Ｌ－アラニン輸送体遺伝子をグルタミン酸－ピルビン酸アミノ基転移酵素遺伝子とともに窒素固定細菌に導入することで、生成されたＬ－アラニンの細胞外輸送が促進され、Ｌ－アラニン又はその塩の生産性が向上すると考えられる。
　グルタミン酸－オキサロ酢酸アミノ基転移酵素は、Ｌ－グルタミン酸とオキサロ酢酸からＬ－アスパラギン酸と２－オキソグルタル酸を生成する反応を触媒する酵素であり、Ｌ－アスパラギン酸の生合成に寄与する。グルタミン酸－オキサロ酢酸アミノ基転移酵素遺伝子は任意の細菌に由来してよく、窒素固定細菌にグルタミン酸－オキサロ酢酸アミノ基転移酵素遺伝子を導入することで、大気中の窒素分子を利用して生産されたＬ－グルタミン酸のアミノ基がオキサロ酢酸へ転移され、それによりＬ－アスパラギン酸又はその塩を生成することができると考えられる。
　グルタミン酸脱炭酸酵素は、Ｌ－グルタミン酸からγ－アミノ酪酸を生成する反応を触媒する酵素であり、γ－アミノ酪酸の生合成に寄与する。グルタミン酸脱炭酸酵素遺伝子は任意の細菌に由来してよく、窒素固定細菌にグルタミン酸脱炭酸酵素遺伝子を導入することで、大気中の窒素分子を利用して生産されたＬ－グルタミン酸が脱炭酸され、それによりγ－アミノ酪酸又はその塩を生成することができると考えられる。
　本発明において導入される遺伝子は、それぞれ元の遺伝子が有する配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列相同性又は配列同一性を有し、遺伝子発現された場合に同一又は同様の酵素活性する遺伝子を導入することができる。相同性は、ＮＣＢＩのｂｌａｓｔｎのプログラムを用いて、ＮＣＢＩに登録されたデータベースを用いて決定することができる。具体的に、配列番号１及び３のＣＳ遺伝子の配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、遺伝子発現された場合にクエン酸合成酵素活性を有する遺伝子を導入することができる。別の例では、配列番号２のクエン酸・Ｎａ+共輸送体の遺伝子の配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、遺伝子発現された場合にクエン酸・Ｎａ+共輸送活性を有する遺伝子を導入することができる。さらに別の態様では、配列番号４及び５の２－メチルクエン酸合成酵素の遺伝子の配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、遺伝子発現された場合に２－メチルクエン酸合成酵素活性を有する遺伝子を導入することができる。
　本発明において導入される遺伝子は、それぞれ元の遺伝子のアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列相同性又は配列同一性を有し、遺伝子発現された場合に同一又は同様の酵素活性するアミノ酸配列をコードする遺伝子を導入することができる。相同性は、ＮＣＢＩのｂｌａｓｔｐのプログラムを用いて、ＮＣＢＩに登録されたデータベースを用いて決定することができる。具体的に、配列番号２８及び３０のＣＳのアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、クエン酸合成酵素活性を有する、アミノ酸配列をコードする遺伝子を導入することができる。別の例では、配列番号２９のクエン酸・Ｎａ+共輸送体のアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、クエン酸・Ｎａ+共輸送活性を有する、アミノ酸配列をコードする遺伝子を導入することができる。さらに別の態様では、配列番号３１及び３２の２－メチルクエン酸合成酵素のアミノ酸配列に対し、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有し、２－メチルクエン酸合成酵素活性を有するアミノ酸配列をコードする遺伝子を導入することができる。
［Ｌ－グルタミン酸を発酵生成する方法］
　本発明の別の態様である大気中の窒素分子からＬ－グルタミン酸又はその塩を発酵生成する方法は、Ｌ－グルタミン酸の生成を促進するように遺伝子導入された窒素固定細菌を、本発明に係る窒素制限培地、すなわち有機酸を含有する窒素制限培地で培養する工程を含む。有機酸を含有する窒素制限培地を用いることにより、窒素固定能を亢進しつつ、Ｌ－グルタミン酸の生成を促進するように遺伝子導入された窒素固定細菌を培養することで、大気中の窒素分子からのＬ－グルタミン酸又はその塩の発酵を亢進することができる。
　本発明に係る培養工程において、開放型容器による大気下での静置培養に代えて、使用する窒素固定細菌に応じた培養条件を適宜選択することができる。例えば、嫌気度を上げるには、密閉容器に窒素制限培地と空気を入れ、培養開始時に含まれた溶存酸素が培養工程において消費されて嫌気状態が強まるように培養することもできる。さらに、密閉容器に窒素ガスと窒素制限培地を入れて完全嫌気状態で培養することもできる。あるいは、開放型容器による大気下での静置培養の際に培養液と空気との接触面積を広げることにより、より好気的な培養をおこなうこともできる。腸内細菌科の微生物を培養する観点から、培養温度としては２０℃～３７℃、より好ましくは２０～３０℃を利用することができる。
　本発明に係る培養工程において、窒素制限下の培地に含まれる窒素源は、窒素固定細菌の初期増殖に必要とされる。窒素制限下の培地に含まれる窒素源は、初期増殖において菌体に取り込まれて消費され、培養工程において、培地中の窒素濃度が一定以下の濃度になると、窒素固定細菌は大気中の窒素を固定するようになる。その際に、Ｌ－グルタミン酸の生成を促進するように遺伝子導入された窒素固定細菌は、細胞内においてクエン酸濃度が亢進されており、固定されたアンモニア態窒素が、窒素同化経路でＬ－グルタミン酸又はその塩へと変換され、これによりＬ－グルタミン酸又はその塩を生成する。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
実施例１：培養条件の検討
　ＮＧ１３株（受託番号：NITE BP-03721、受領番号：NITE ABP-03721、申請の受領日：２０２３年７月２１日）は、従来嫌気培養のみで窒素固定能を発揮すると考えられていた。嫌気培養は、培養容器を密閉して、その気層を窒素ガス、あるいは窒素ガスとアルゴンガスの混合気体で満たして培養するという作業手順の多い煩雑な培養方法である。そこで、開放型の培養容器を用いて、大気中の窒素分子を自由に資化して窒素固定能を発揮させる全く新しい培養方法を確立することを目指した。なお、使用する培地としては、無窒素培地に１００ｍｇ／Ｌで酵母エキスを添加する窒素制限培地を用いた。
　φ１８×１８０ｍｍの試験管に５ｍＬの窒素制限培地（７．５ｇ／Ｌのグルコースのみを含有するＫＤ培地、表１参照）を入れ、そこに１０7細胞のＮＧ１３株を植菌して２５℃で静置培養した。試験管の口はアルミキャップを被せるだけであり、試験管外の空気が試験管とアルミキャップの隙間を通って自由に試験管内部に入ってこられる状態とした。培養中、培養液中の菌体密度を測定し、また培養液が発揮する窒素固定能についてアセチレン還元法（後述）による測定を行った。ＮＧ１３株は、培養開始後短時間のラグタイムを経て増殖を開始し、培養開始２４時間後には０．６３μｍｏｌ／４－ｈ／ｔｕｂｅ（表２参照）の窒素固定能を発揮した。この窒素固定能の強さは、試験管の口をブチルダブル栓で密閉して気層を窒素ガスで満たした嫌気培養において発揮された窒素固定能と同等であった。なお、ＫＤ培地のグルコースを同量のフルクトースあるいはスクロースと交換しても、最大窒素固定能は同等であった。以上により、ＮＧ１３株に窒素固定能を発揮させるための全く新しい簡便な培養方法を確立した。
　アセチレン還元法の手順は次のとおりである。まず試験管の口をブチルダブル栓により密閉した。その時、気層は空気とした。その後、気層の１５％をアセチレンで置換し、２５℃で静置培養を４時間行った。培養後、気層の０．５ｍＬをシリンジで抜き取り、ガスクロマト装置にてエチレン量を測定し、試験管当たりのエチレン生成量に換算して窒素固定能の値とした。
　次に、ＫＤ培地での培養よりＮＧ１３株の窒素固定能を亢進させる窒素制限培地を探索するために、ＫＤ培地の炭素源組成を表１に示すように改変した窒素制限培地を調製し、各培地でＮＧ１３株を２５℃２４時間静置培養して窒素固定能を測定した。その結果を表２に示す。
　ＫＤ培地に７．５ｇ／Ｌグルコースを配合してグルコース量を二倍（１５ｇ／Ｌ）にしたＫＤＤ培地、ならびにＫＤ培地にピルビン酸ナトリウム（７．５ｇ／Ｌ）を配合したＫＤＰ培地では窒素固定能は亢進しなかったが、ＫＤ培地に各種有機酸のナトリウム塩（７．５ｇ／Ｌ）を配合したその他の培地で窒素固定能は様々に亢進した。特にクエン酸ナトリウムとの組み合わせ（ＫＤＣ培地）の効果が最大（２．６倍に亢進）であった。ただし、いずれの培養においてもＬ－グルタミン酸の培地中での蓄積は認められなかった。
　ＫＤＣ培地においてＮＧ１３株およびＮＧ１３－ｐＣＣＳ株の窒素固定能を亢進させるクエン酸ナトリウム濃度を探索するために、ＫＤＣ培地のクエン酸ナトリウム組成を表３に示すように変更した窒素制限培地を調製し、各培地で両株を２５℃２４時間静置培養して、アセチレン還元法により窒素固定能を測定した。その結果を表３に示す。
　培地中のクエン酸ナトリウム濃度を２．５ｇ／Ｌ～１５ｇ／Ｌとすると、クエン酸ナトリウム０ｇ／Ｌの場合と比較して、ＮＧ１３株を用いた場合の最大窒素固定能は亢進した。培地中のクエン酸ナトリウム濃度を１ｇ／Ｌ～１５ｇ／Ｌとすると、クエン酸ナトリウム０ｇ／Ｌの場合と比較して、ＮＧ１３－ｐＣＣＳ株を用いた場合の最大窒素固定能は亢進し、特に７．５ｇ／Ｌの場合に最も高い値を示した。
実施例２：クエン酸合成酵素、２－メチルクエン酸合成酵素、又はクエン酸：Ｎａ + 共輸送体遺伝子を遺伝子導入されたＮＧ１３株の調製
（１）各プラスミドの作製
　ＮＧ１３株、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）ATCC13869（以下、ATCC13869株とする）、大腸菌（Escherichia coli）W3110（以下W3110株とする）の菌体よりWizard Genomic DNA Purification Kit（Promega社）又はInstaGene（Bio-Rad社）を用いてゲノムＤＮＡを抽出した。クエン酸合成酵素（CS, ATCC13869: BBD29_04605）、２－メチルクエン酸合成酵素（２－ＭＣＳ, ATCC13869株: BBD29_03720、ならびにW3110株: PrpC）それぞれをコードする遺伝子断片は、各細菌のゲノムＤＮＡをテンプレートにして、それぞれ下記表４のプライマーを、表５の記載の組み合わせで用いて、ＰＣＲを行うことで作製された。ＮＧ１３株のクエン酸：Ｎａ+共輸送体遺伝子はクレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）Ｍ５ａ１株のゲノム情報を基にクローン化して配列情報を取得した後、ＰＣＲで遺伝子断片の作製を行った。各プライマーの両端には導入するベクターに相同な約２０ｂｐの配列を付与しており、導入する遺伝子がベクター由来の発現用プロモーターおよびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を用いて発現するよう設計した（表４）。ベクター側断片の作製はＰＣＲで行った。使用したプライマーの配列及び組合せは以下に示す。目的の遺伝子断片およびベクター側の断片はGibson Assemblyで結合した。反応液１０μＬを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、プラスミドが有する薬剤選択マーカーを用いてコロニーを選抜した。現れたコロニーよりプラスミドを抽出し、シーケンス解析により設計通りのプラスミドができているかを確認した（表５）。
（２）ＮＧ１３株へのプラスミドの導入
　ＮＧ１３株をＬＢ液体培地（Bacto Tryptone １％,Bacto Yeast Extract 0.5%、NaCl 1%）でＯＤ６００＝０．５付近まで増殖させた後集菌し、氷冷した滅菌水４０ｍＬおよび１０％グリセロール４０ｍＬで各１回ずつ洗浄後、１０％グリセロールでＯＤ600＝１００付近となるよう懸濁し、６０μＬずつ分注したものをコンピテントセルとした。各プラスミド約２００ｎｇと混合後、GENE PULSER II（BioRad社）を用いて電場強度２５ｋＶ／ｃｍ、キャパシタンス２５μＦ、抵抗値２００Ωで導入した。導入後のコンピテントセルは抗生物質を含まないＬＢ液体培地１ｍＬと混合し、３０℃で１時間、３００ｒｐｍ振とう培養後、プラスミドが保持する薬剤選択マーカーの抗生物質を含むＬＢ寒天プレート（スペクチノマイシン：１００μｇ／ｍＬ，テトラサイクリン：１５μｇ／ｍＬ）に塗布し、３０℃で一晩静置培養した。現れたコロニーよりプラスミドを抽出し、制限酵素処理後のアガロースゲル電気泳動により目的のプラスミドがきちんと保持されているかを確認した。目的の形質転換体は、２５％グリセロール懸濁液として－８０℃で保存した。
実施例３：２－メチルクエン酸合成酵素遺伝子を導入したＮＧ１３株によるＬ－グルタミン酸の発酵生産
　ＮＧ１３株の窒素固定能が発揮されるのは嫌気的な条件であることから、特許文献２（特開２００９－２５４３２３号公報）の記載に従ってコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）の２－ＭＣＳ遺伝子を発現するプラスミドｐＣＭＣＳを導入したＮＧ１３株（ＮＧ１３－ｐＣＭＣＳ）及び大腸菌の２－ＭＣＳ遺伝子を発現するプラスミドｐＥＭＣＳを導入したＮＧ１３株（ＮＧ１３－ｐＥＭＣＳ）を作製し、両改変株を終濃度０．１ｍＭでＩＰＴＧを添加したＫＤＣ培地で２５℃４日間静置培養してＬ－グルタミン酸の生産性を調べた。その結果を表６に示す。
　両改変ＮＧ１３株において、培地中にＬ－グルタミン酸が蓄積された。
実施例４．クエン酸合成酵素遺伝子を導入したＮＧ１３株によるＬ－グルタミン酸の発酵生産
　特許文献１（特許第４１４４１３１号公報）には、コリネ型細菌由来のＣＳ遺伝子を導入したクレブシエラ属微生物を好気培養すると２．８５ｇ／ＬのＬ－グルタミン酸を発酵生産することが述べられている。そこで、特許文献１の開示と同様に、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）のＣＳ遺伝子を発現するプラスミドｐＣＣＳを導入したＮＧ１３株（ＮＧ１３－ｐＣＣＳ株）を作製した。まずこの改変株を１０ｇ／Ｌの塩化アンモニウムと終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＫＤＣ培地で３０℃振盪培養したところ、培養開始２８時間後に到達菌数は８×１０10ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅとなり培地中に１．４ｇ／ＬのＬ－グルタミン酸を蓄積した。また、ＮＧ１３株自身のＣＳ遺伝子を発現するプラスミドｐＫＣＳを導入したＮＧ１３株（ＮＧ１３－ｐＫＣＳ株）を作製した。この改変株を１ｇ／Ｌの塩化アンモニウムと終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＫＤＣ培地で３０℃振盪培養したところ、培養開始１８時間後に到達菌数は０．５×１０10ｃｅｌｌｓ／ｔｕｂｅとなり培地中に２０ｍｇ／ＬのＬ－グルタミン酸を蓄積した。
　次に、ＮＧ１３－ｐＣＣＳ株及びＮＧ１３－ｐＫＣＳ株を終濃度０．１ｍＭでＩＰＴＧを添加したＫＤＣ培地で２５℃５日間静置培養してＬ－グルタミン酸の生産性を調べた。その結果を表７に示す。
　ＮＧ１３－ｐＣＣＳ株は培地中にＬ－グルタミン酸を蓄積し、その量は上で述べた２－ＭＣＳ遺伝子を導入したＮＧ１３株での蓄積量を超えていた。到達菌数を考慮すると、ＮＧ１３－ｐＣＣＳ株は菌体外からアンモニアを取り込むことでも窒素固定によりアンモニアを生成することでも同等のＬ－グルタミン酸生成を行うと結論できる。一方、ＮＧ１３－ｐＫＣＳ株のＬ－グルタミン酸の蓄積量は、ＮＧ１３－ｐＣＣＳ株のそれより少なかった。
　生産されたＬ－グルタミン酸に取り込まれた窒素元素が大気中の窒素分子由来であることを確認するために、ＮＧ１３－ｐＣＣＳ株をＮａ2ＭｏＯ4・２Ｈ2Ｏを除いたＫＤＣ培地で培養して窒素固定能を消失させた。すると、培養液中の到達菌数は通常のＫＤＣ培地で培養した時と変わらなかったにも関わらず、培地中でのＬ－グルタミン酸の蓄積は全く認められなかった。また、ＮＧ１３－ｐＣＣＳ株をＫＤＣ培地で培養する際に、試験管の口をブチルダブル栓で密閉して気層を15Ｎ2とＯ2の混合ガス（15Ｎ2：Ｏ2＝８２：１８）で満たした培養を行ったところ、培養６日目の培地中に１２０ｍｇ／ＬのＬ－グルタミン酸が蓄積した。それをＬＣ－ＭＳ分析したところ、15Ｎを含む分子量１４９のＬ－グルタミン酸陽イオン（［Ｃ5Ｈ10 15ＮＯ4］+）が大部分を占めていた（図２）。これより、ＫＤＣ培地で生産されているＬ－グルタミン酸は、窒素固定能によって大気中の窒素分子からもたらされた窒素元素を取り込んで生成されていることが示された。
　次に、ＮＧ１３－ｐＣＣＳ株をＫＤ培地、ＫＤＤ培地、ＫＤＣ培地、ＫＤＭ培地、ＫＤＳ培地及びＫＤＯ培地で２５℃６日間静置培養して、窒素制限培地中のクエン酸以外の有機酸の有無がＬ－グルタミン酸の生産量に影響するかを検討した。その結果を表８に示す。
　最大窒素固定能、到達菌数、Ｌ－グルタミン酸生産性のいずれにおいても、ＫＤ培地及びＫＤＤ培地での培養には差が無く、６種の培地の中で最低である。一方、有機酸を含有するＫＤＣ培地、ＫＤＭ培地、ＫＤＳ培地及びＫＤＯ培地で培養すると、いずれの培地でもＫＤ培地での培養に比較して、最大窒素固定能が亢進し、Ｌ－グルタミン酸の生産性も大きく増大した。
実施例５．クエン酸輸送体遺伝子を導入したＮＧ１３株によるＬ－グルタミン酸の発酵生産
　ＮＧ１３株をＫＤＣ培地で静置培養すると、まずグルコースを資化し、この間クエン酸の資化はわずかである。そしてグルコースを消費し終わった後にクエン酸の資化が始まる。ＮＧ１３株は、ゲノム上にクエン酸：Ｎａ+共輸送体遺伝子とクエン酸の存在を感知する二成分制御系（センサーキナーゼであるＣｉｔＡとレスポンスレギュレーターであるＣｉｔＢにより構成される）の遺伝子を有しており、クエン酸：Ｎａ+共輸送体遺伝子の発現はリン酸化したＣｉｔＢにより促進されると考えられる（非特許文献２：Bott, Mol. Microbiol. 18 533-546 1995）。ＫＤＣ培地でＮＧ１３株を培養した場合、培地中の高濃度のクエン酸を感知したＣｉｔＡがＣｉｔＢをリン酸化し、それがクエン酸：Ｎａ+共輸送体遺伝子の発現を促す。理論に限定されることを意図するものではないが、このことが、グルコース存在時のクエン酸のわずかな資化を引き起こすと考えられる。一方、クエン酸：Ｎａ+共輸送体遺伝子の発現は、環状ＡＭＰ受容タンパク質（ＣＲＰ）による発現促進も受ける。このことがグルコース消費後のクエン酸の資化に関わると考えられる。
　そこで、ＮＧ１３株のクエン酸：Ｎａ+共輸送体遺伝子をクローン化し、それをＮＧ１３株の中で高発現させるためのプラスミドｐＫＣＴを作製した。このプラスミドを導入したＮＧ１３株（ＮＧ１３－ｐＫＣＴ株）をＫＤＣ培地で２５℃５日間静置培養してＬ－グルタミン酸の生産性を調べた。その結果を表９に示す。
　ＮＧ１３－ｐＫＣＴ株の示す最大窒素固定能と到達菌数は、ＮＧ１３株の示すそれらと大差はなく、クエン酸の存在による最大窒素固定能の亢進には本来のクエン酸：Ｎａ+共輸送体の存在量で十分である。一方でＬ－グルタミン酸の蓄積に着目すると、クエン酸の取り込みがＬ－グルタミン酸の蓄積をもたらすためには、クエン酸：Ｎａ+共輸送体の発現促進が必要である。
実施例６．クエン酸合成酵素遺伝子とクエン酸輸送体遺伝子を共に導入したＮＧ１３株によるＬ－グルタミン酸の発酵生産
　ＮＧ１３－ｐＫＣＴ株とＮＧ１３－ｐＣＣＳ株を、13Ｃでラベルしたグルコースを含むＫＤＣ培地で培養して、培地に蓄積されるＬ－グルタミン酸をＬＣ－ＭＳ分析したところ、ＮＧ１３－ｐＣＣＳ株が蓄積したＬ－グルタミン酸はすべてが13Ｃを含有していたのに対し、ＮＧ１３－ｐＫＣＴ株が蓄積したＬ－グルタミン酸はすべてが12Ｃを含有していた。すなわち、ＮＧ１３－ｐＫＣＴ株が生産するＬ－グルタミン酸は、ＫＤＣ培地から取り込んだクエン酸が変換されたものであると考えられる。
　以上の結果より、Ｌ－グルタミン酸の生産に対して、ＣＳとクエン酸：Ｎａ+共輸送体は独立に寄与するものと考えられる。そこで、ＮＧ１３株にプラスミドｐＣＣＳ及びｐＫＣＴの両方を導入したＮＧ１３－ｐＣＣＳ－ｐＫＣＴ株を作製した。また、コントロールとして、ＮＧ１３株にプラスミドｐＣＣＳ及びｐＣＤＦＤｕｅｔ－１（空ベクター）の両方を導入したＮＧ１３－ｐＣＣＳ－ｐＣＤＦ株を作製した。両株をＫＤＣ培地で２５℃５日間静置培養してＬ－グルタミン酸の生産性を調べた。その結果を表１０に示す。
　表８に示すＮＧ１３－ｐＣＣＳ株をＫＤＣ培地で培養した時の最大窒素固定能、到達菌数及びＬ－グルタミン酸生産性に対して、ＮＧ１３－ｐＣＣＳ－ｐＣＤＦ株をＫＤＣ培地で培養した時の最大窒素固定能はほぼ半分に低下しているものの、到達菌数には大差がない。そして、Ｌ－グルタミン酸生産性にも大きな変化はない。一方、ＮＧ１３－ｐＣＣＳ－ｐＫＣＴ株をＫＤＣ培地で培養した時の最大窒素固定能及び到達菌数はＮＧ１３－ｐＣＣＳ－ｐＣＤＦ株のそれらと同等であるのに対し、Ｌ－グルタミン酸生産性は大きく増加した。表９に示すクエン酸：Ｎａ+共輸送体のもたらすＬ－グルタミン酸生産性の値を勘案すると、ＣＳの効果とクエン酸：Ｎａ+共輸送体の効果は相加的に機能していると考えられる。
　ＫＤＣ培地組成をベースにグルコースやクエン酸ナトリウム量を２倍量にした培地（１５ｇ／Ｌのグルコースを含有するＫＤＤＣ培地、１５ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウムを含有するＫＤＣＣ培地、１５ｇ／Ｌのグルコースと１５ｇ／Ｌのクエン酸ナトリウムを含有するＫＤＤＣＣ培地）を作製し、各２５ｍＬをφ９０×１５ｍｍの滅菌済みシャーレに入れ、そこに１０7細胞のＮＧ１３－ｐＣＣＳ－ｐＫＣＴ株を植菌した。培地が蒸発しないよう湿度を保った環境で２５℃１７日間静置培養してＬ－グルタミン酸の生産性を調べた。その結果を表１１に示す。
Ｌ－グルタミン酸の生産量をＫＤ培地と比較すると、ＫＤＣ培地で約９．８倍、ＫＤＤＣ培地で約１７倍、ＫＤＣＣ培地で約８．８倍、ＫＤＤＣＣ培地で約１１倍となった。シャーレを用いた培養によって大気の供給量を増やすことで、Ｌ－グルタミン酸の生産性を大幅に向上させることができる。
　以上で示した、窒素固定能を発揮しているＮＧ１３株においてクエン酸：Ｎａ+共輸送体の存在量を増大させることで、大気中の窒素分子と培地中のクエン酸を直接に利用してＬ－グルタミン酸を発酵製造する方法は、全く新しい知見に基づく発明である。また、ＣＳの発現促進によるＬ－グルタミン酸産生という周知技術にクエン酸：Ｎａ+共輸送体の発現促進という技術的特徴を付け加えることで、両者の相加的な効果によってＬ－グルタミン酸生産性を増強させるというＬ－グルタミン酸の発酵製造方法も、全く新しい知見に基づく発明である。クエン酸は有機酸の中でも安価なので、本発明はハーバーボッシュ法に依存した現在のＬ－グルタミン酸発酵生産に対抗しうる製造法となりうる。
実施例７．ＮＧ１３以外の窒素固定細菌における窒素固定能の亢進
　ＫＤ及びＫＤＣ培地のグルコース７．５ｇ／Ｌを、グルコース３．７５ｇ／Ｌとフルクトース３．７５ｇ／Ｌとに変更した培地を作製し、表１２に示すプロテオバクテリア門の窒素固定細菌を培養した。２５℃２４時間の静置培養後にアセチレンを封入し、培養１６８時間後のエチレン生成量から窒素固定能を算出した。その結果を表１２に示す。
　ＮＧ１３株と同じγプロテリオバクテリア綱に属するラーネラ・アクアティリス（Rahnella aquatilis)ＪＣＭ１６８３、ラウルテラ・テリゲナ(Raoultella terrigena)ＪＣＭ１６８７、コサコニアｓｐ．(Kosakonia sp.)ＨＢ９２に加え、ＮＧ１３株とは綱が異なるザントバクターｓｐ.(Xanthobacter sp.)ＨＢ６１およびアゾリゾビウム・カウリノダンス(Azorhizobium caulinodans)ＪＣＭ　２０９６６においてもクエン酸を培地に添加することで窒素固定能の亢進が見られた。この結果より、クエン酸添加によって窒素固定能を亢進させる方法はＮＧ１３株だけでなく幅広いプロテオバクテリア門の窒素固定細菌に適用可能と考えられる。
実施例８．クエン酸合成酵素遺伝子、クエン酸輸送体遺伝子を導入したラウルテラ・テリゲナ（Raoultella terrigena)　ＪＣＭ１６８７株によるＬ－グルタミン酸の発酵生産
　ＮＧ１３株と同様に、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）のＣＳ遺伝子を発現するプラスミドｐＣＣＳを導入したラウルテラ・テリゲナ(Raoultella terrigena)ＪＣＭ１６８７株（Ｒ．ｔｅｒｒｉｇｅｎａ－ｐＣＣＳ株）を作製した。この改変株を終濃度０．０２ｍＭでＩＰＴＧを添加したＫＤ培地およびＫＤＣ培地で２５℃６日間静置培養してＬ－グルタミン酸の生産性を調べた。その結果を表１３に示す。
　Ｒ．ｔｅｒｒｉｇｅｎａおよびＲ．ｔｅｒｒｉｇｅｎａ－ｐＣＣＳ両株においてＫＤＣ培地での培養時に窒素固定能の亢進が見られた。またＲ．ｔｅｒｒｉｇｅｎａ－ｐＣＣＳ株はＫＤＣ培地での培養でＬ－グルタミン酸を生産した。
　コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）のＣＳ遺伝子を発現するプラスミドｐＣＣＳ及びＮＧ１３株のクエン酸：Ｎａ+共輸送体遺伝子を発現するプラスミドｐＫＣＴを導入したラウルテラ・テリゲナ(Raoultella terrigena)ＪＣＭ１６８７株（Ｒ．ｔｅｒｒｉｇｅｎａ－ｐＣＣＳ－ｐＫＣＴ株）を作製した。この改変株を終濃度０．０２ｍＭでＩＰＴＧを添加したＫＤＤ培地およびＫＤＣ培地で２５℃６日間静置培養してＬ－グルタミン酸の生産性を調べた。その結果を表１４に示す。
　クエン酸合成酵素とクエン酸輸送体を導入したｐＣＣＳ－ｐＫＣＴ株をＫＤＣ培地で培養した場合にＬ－グルタミン酸の蓄積が見られた。
　ＫＤＣ培地及びＫＤＤＣ培地を作製し、各２５ｍＬをφ９０×１５ｍｍの滅菌済みシャーレに入れ、そこにＲ．ｔｅｒｒｉｇｅｎａ－ｐＣＣＳ－ｐＫＣＴ株を植菌した。培地が蒸発しないよう湿度を保った環境で２５℃６日間静置培養してＬ－グルタミン酸の生産性を調べた。その結果を表１５に示す。
　Ｒ．ｔｅｒｒｉｇｅｎａ－ｐＣＣＳ－ｐＫＣＴ株においてもシャーレを用いた培養によって多量のＬ－グルタミン酸を生産した。この結果より、本発明はクレブシエラ属に限らないＬ－グルタミン酸の生産方法であることが明らかとなった。
実施例９．クエン酸合成酵素遺伝子、クエン酸輸送体遺伝子を導入したクレブシエラ・ヴァリイコラＪＣＭ１２４１９株によるＬ－グルタミン酸の発酵生産
　ＮＧ１３株と同様に、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）のＣＳ遺伝子を発現するプラスミドｐＣＣＳを導入したクレブシエラ・ヴァリイコラＪＣＭ１２４１９株（K. variicola-pCCS）、ＮＧ１３株のクエン酸：Ｎａ+共輸送体遺伝子を発現するプラスミドｐＫＣＴを導入したクレブシエラ・ヴァリイコラＪＣＭ１２４１９株（K. variicola-pKCT）、プラスミドｐＣＣＳとプラスミドｐＫＣＴを導入したクレブシエラ・ヴァリイコラＪＣＭ１２４１９株（K. variicola-pCCS-pKCT）を作製した。これらの改変株を終濃度０．０２ｍＭでＩＰＴＧを添加したＫＤＤ培地およびＫＤＣ培地で２５℃６日間静置培養してＬ－グルタミン酸の生産性を調べた。その結果を表１６に示す。
　クエン酸合成酵素を導入したｐＣＣＳ株、クエン酸輸送体を導入したｐＫＣＴ株、クエン酸合成酵素とクエン酸輸送体を導入したｐＣＣＳ－ｐＫＣＴ株をＫＤＣ培地で培養した場合、Ｌ－グルタミン酸の生産が見られた。
　生産されたＬ－グルタミン酸に取り込まれた窒素元素が大気中の窒素分子由来であることを確認するために、Ｋ．ｖａｒｉｉｃｏｌａ－ｐＣＣＳ株をＫＤＣ培地で培養する際に、試験管の口をブチルダブル栓で密閉して気層を15Ｎ2とＯ2の混合ガス（15Ｎ2：Ｏ2＝８２：１８）で満たした培養を行ったところ、培養６日目の培地中に９２ｍｇ／ＬのL-グルタミン酸が蓄積した。それをＬＣ－ＭＳ分析したところ、15Ｎを含む分子量１４９のL-グルタミン酸陽イオン（［Ｃ5Ｈ10 15ＮＯ4］+）が大部分を占めていた。これより、ＫＤＣ培地で生産されているＬ－グルタミン酸は、ＮＧ１３株と同様に、窒素固定能によって大気中の窒素分子からもたらされた窒素元素を取り込んで生成されていることが示された。
　ＫＤＣ培地及びＫＤＤＣ培地を作製し、各２０ｍＬをφ９０×１５ｍｍの滅菌済みシャーレに入れ、そこにＫ．ｖａｒｉｉｃｏｌａ－ｐＣＣＳ－ｐＫＣＴ株を植菌した。培地が蒸発しないよう湿度を保った環境で２５℃１４日間静置培養してＬ－グルタミン酸の生産性を調べた。その結果を表１７に示す。
　Ｋ．ｖａｒｉｉｃｏｌａ－ｐＣＣＳ－ｐＫＣＴ株においてもシャーレを用いた培養によってＬ－グルタミン酸の生産性を大幅に向上させることができた。
実施例１０．クエン酸合成酵素遺伝子とクエン酸輸送体遺伝子を共に導入したクレブシエラｓｐ．ＮＢＲＣ１０００４８株及びクレブシエラｓｐ．ＮＢＲＣ１０９９１１株によるＬ－グルタミン酸の発酵生産
　コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）のＣＳ遺伝子を発現するプラスミドｐＣＣＳ及びＮＧ１３株のクエン酸：Ｎａ+共輸送体
遺伝子を発現するプラスミドｐＫＣＴを導入したクレブシエラ・ｓｐ．ＮＢＲＣ１０００４８株（Klebsiella sp. NBRC100048-pCCS-pKCT）、クレブシエラ・ｓｐ．ＮＢＲＣ１０９９１１株（Klebsiella sp. NBRC109911-pCCS-pKCT）を作製した。これらの改変株を終濃度０．０２ｍＭでＩＰＴＧを添加したＫＤＤ培地およびＫＤＣ培地で２５℃６日間静置培養してＬ－グルタミン酸の生産性を調べた。その結果を表１８に示す。
　どちらのクレブシエラ属菌株においても、クエン酸合成酵素とクエン酸輸送体を導入したｐＣＣＳ－ｐＫＣＴ株をＫＤＣ培地で培養した場合に、上述のクレブシエラ・オキシトカやクレブシエラ・ヴァリイコラと同様、多量のＬ－グルタミン酸が蓄積することを確認した。
実施例１１．クエン酸合成酵素遺伝子とクエン酸輸送体遺伝子を共に導入したラーネラ・アクアティリスＪＣＭ１６８３株によるＬ－グルタミン酸の発酵生産
　コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）のＣＳ遺伝子を発現するプラスミドｐＣＣＳ及びＮＧ１３株のクエン酸：Ｎａ+共輸送体遺伝子を発現するプラスミドｐＫＣＴを導入したラーネラ・アクアティリス(Rahnella aquatilis)ＪＣＭ１６８３株（Ｒ．ａｑｕａｔｉｌｉｓ－ｐＣＣＳ－ｐＫＣＴ株）を作製した。この改変株を終濃度０．０２ｍＭでＩＰＴＧを添加したＫＤＣ培地で２５℃６日間静置培養してＬ－グルタミン酸の生産性を調べた。その結果を表１９に示す。
　クエン酸合成酵素とクエン酸輸送体を導入したｐＣＣＳ－ｐＫＣＴ株をＫＤＣ培地で培養した場合、Ｌ－グルタミン酸の生産が見られた。
　生産されたＬ－グルタミン酸に取り込まれた窒素元素が大気中の窒素分子由来であることを確認するために、Ｒ．ａｑｕａｔｉｌｉｓ－ｐＣＣＳ－ｐＫＣＴ株をＫＤＣ培地で培養する際に、試験管の口をブチルダブル栓で密閉して気層を15Ｎ2とＯ2の混合ガス（15Ｎ2：Ｏ2＝８２：１８）で満たした培養を行ったところ、培養６日目の培地中に４１ｍｇ／ＬのＬ－グルタミン酸が蓄積した。それをＬＣ－ＭＳ分析したところ、15Ｎを含む分子量１４９のＬ－グルタミン酸陽イオン（［Ｃ5Ｈ10 15ＮＯ4］+）が大部分を占めていた（図１２）。これより、ＫＤＣ培地で生産されているＬ－グルタミン酸は、ＮＧ１３株と同様に、窒素固定能によって大気中の窒素分子からもたらされた窒素元素を取り込んで生成されていることが示された。
以上の結果より、本発明の大気中の窒素分子を利用してＬ－グルタミン酸を発酵生産する方法は、ＮＧ１３株以外の腸内細菌科に属する窒素固定細菌を用いても行うことができる。
実施例１２．クエン酸合成酵素遺伝子、グルタミン酸－ピルビン酸アミノ基転移酵素遺伝子、Ｌ－アラニン輸送体遺伝子を導入したＮＧ１３株によるＬ－アラニンおよびＬ－バリンの発酵生産
　グルタミン酸－ピルビン酸アミノ基転移酵素は、Ｌ－グルタミン酸とピルビン酸からＬ－アラニンと２－オキソグルタル酸を生成する反応を触媒する酵素であり、Ｌ－アラニンの生合成に寄与する。ＮＧ１３－ｐＣＣＳ株にグルタミン酸－ピルビン酸アミノ基転移酵素遺伝子を導入することで、大気中の窒素分子を利用して生産されたＬ－グルタミン酸のアミノ基がピルビン酸へ転移されることで、Ｌ－アラニン又はその塩を生成することができると考えられる。これに加え、Ｌ－アラニンを細胞外へ排出する機能を有するＬ－アラニン輸送体遺伝子も導入することで、生成されたＬ－アラニンの細胞外輸送が促進され、Ｌ－アラニン又はその塩の生産性が向上すると考えられる。そこで、両遺伝子を導入した株を作製し、その株の培養液中に存在するＬ－アミノ酸を調べた。
（１）プラスミドｐＫＡＣＥの作製
ＮＧ１３株のグルタミン酸－ピルビン酸アミノ基転移酵素の遺伝子とＬ－アラニン輸送体の遺伝子は、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）Ｍ５ａ１株のゲノム情報を基にクローン化して配列情報を取得した（配列番号３３及び配列番号３４）。グルタミン酸－ピルビン酸アミノ基転移酵素遺伝子とＬ－アラニン輸送体遺伝子を共に発現するプラスミドｐＫＡＣＥの作製手順は次のとおりである。表４に示すプライマーを用いて、表５に示すテンプレートとプライマーの組み合わせでＰＣＲを行い、両遺伝子断片の作製を行った。各プライマーには導入するベクターに相同な約２０ｂｐの配列を付与しており、導入する遺伝子がベクター由来の発現用プロモーターおよびリボソーム結合部位（ＲＢＳ）を用いて発現するよう設計した。目的の遺伝子断片およびベクター側の断片はGibson Assemblyで結合した。反応液１０μＬを用いて大腸菌ＤＨ５α株を形質転換し、プラスミドが有する薬剤選択マーカーを用いてコロニーを選抜した。現れたコロニーよりプラスミドを抽出し、シーケンス解析により設計通りのプラスミドであることを確認した。
（２）ＮＧ１３－ｐＣＣＳ株へのプラスミドｐＫＡＣＥの導入
　ＮＧ１３―ｐＣＣＳ株をエレクトロポレーション法によりプラスミドｐＫＡＣＥで形質転換し、クロラムフェニコール耐性で形質転換体を分離した。この株よりプラスミドを調整し、制限酵素処理後のアガロースゲル電気泳動により目的のプラスミドを保持していることを確認した。
（３）ＮＧ１３－ｐＣＣＳ－ｐＫＡＣＥ株の培養
　コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）のクエン酸合成酵素遺伝子を発現するプラスミドｐＣＣＳを導入したＮＧ１３株（NG13-pCCS）、ＮＧ１３株のグルタミン酸－ピルビン酸アミノ基転移酵素遺伝子とＬ－アラニン輸送体遺伝子を共に発現するプラスミドｐＫＡＣＥを導入したＮＧ１３－ｐＣＣＳ株（NG13-pCCS-pKACE）を終濃度０．１ｍＭのＩＰＴＧを添加したＫＤＣ培地で２５℃７日間静置培養してＬ－アミノ酸の生産性を調べた。その結果を表２０に示す。
　プラスミドｐＣＣＳと共にプラスミドｐＫＡＣＥを導入したＮＧ１３株（ＮＧ１３－ｐＣＣＳ－ｐＫＡＣＥ株）の培養液中に蓄積されたＬ－アミノ酸を分析したところ、Ｌ－グルタミン酸に加えて目的物質であるＬ－アラニンが検出された。さらに、Ｌ－バリンも検出された。クレブシエラ属細菌には、「3-methyl-2-oxobutanoate + L-alanine = L-valine + pyruvate」の反応を行うＬ－バリン－ピルビン酸アミノ基転移酵素が存在する。クレブシエラ属窒素固定細菌が窒素固定によって生育する場合、空中窒素に由来するＬ－グルタミン酸からグルタミン酸－ピルビン酸アミノ基転移酵素によりＬ－アラニンを生成し、さらにこのＬ－アラニンからＬ－バリン－ピルビン酸アミノ基転移酵素によりＬ－バリンを生成することは、常に行われている。したがって、ＮＧ１３－ｐＣＣＳ株でも、生成量が増加したＬ－グルタミン酸からのグルタミン酸－ピルビン酸アミノ基転移酵素によるＬ－アラニン生成の増加、Ｌ－バリン－ピルビン酸アミノ基転移酵素によるＬ－バリン生成の増加は起きているが、それは培地に排出されるまでの量には至っていないと考えられる。これに対し、ＮＧ１３－ｐＣＣＳ株においては、グルタミン酸－ピルビン酸アミノ基転移酵素を過剰生産することでＬ－アラニン生成が極度に亢進し、それに伴いＬ－バリン－ピルビン酸アミノ基転移酵素でのＬ－バリン生成も亢進し、両者とも培地に排出されるようになったと考えられる。以上より、ＮＧ１３－ｐＣＣＳ－ｐＫＡＣＥ株を用いることで、空中窒素からＬ－アラニンと共にＬ－バリンを発酵生産しうることを実証することができた。
　　以上の結果より、本発明の大気中の窒素分子を利用してＬ－グルタミン酸を発酵生産する方法は、Ｌ－グルタミン酸以外のアミノ酸の発酵生産に用いることもできる。
産業上利用性
　本発明に係る微生物は、Ｌ－グルタミン酸又はその塩の発酵製造分野でも使用される。大気中の窒素を用いることで、従前ハーバーボッシュ法によって多大なエネルギーを消費して固定された窒素化合物の使用から脱却することができる。
受託番号：NITE BP-03721（受領番号：NITE ABP-03721、申請の受領日：2023年7月21日、寄託機関の名称及び宛名：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター（NPMD）〒292-0818 日本国千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8　122号室）

Claims (10)

  1. 　クエン酸輸送体、クエン酸合成酵素、及び２－メチルクエン酸合成酵素からなる群から選ばれる少なくとも１の遺伝子を導入された窒素固定細菌を、ＴＣＡ回路を構成する有機酸又はその塩を含有する窒素制限培地で培養する工程を含む、大気中の窒素分子からＬ－グルタミン酸又はその塩を発酵生成する方法。
  2. 　前記窒素制限培地が、酵母エキス換算で３ｍｇ／Ｌ～１５００ｍｇ／Ｌ、及び／又はアンモニウムイオン換算で０．０２ｍＭ～１５ｍＭの窒素源を含む、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記有機酸又はその塩が、０．５ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌの濃度である、請求項１に記載の方法。
  4. 　前記有機酸がクエン酸、コハク酸、リンゴ酸、フマル酸、２－オキソグルタル酸である請求項３に記載の方法。
  5. 　前記窒素固定細菌が、腸内細菌科の微生物である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記窒素固定細菌が、クレブシエラ属、ラーネラ属、及びラウルテラ属、コサコニア属からなる群から選ばれる微生物である、請求項５に記載の方法。
  7. 　クレブシエラ属、ラーネラ属、コサコニア属及びラウルテラ属からなる群から選ばれ、クエン酸輸送体の遺伝子が導入された窒素固定細菌。
  8. 　クレブシエラ属の窒素固定細菌が、クレブシエラ・オキシトカ、クレブシエラ・ミシガネンシス、クレブシエラ・グリモンティ、クレブシエラ・パスツリ、クレブシエラ・ニューモニエ、クレブシエラ・ヴァリイコラ、クレブシエラ・インディカ、からなる群から選ばれ、ラーネラ属の窒素固定細菌が、ラーネラ・アクアティリスであり、又はラウルテラ属の窒素固定細菌が、ラウルテラ・テリゲナ及びラウルテラ・オルニチノリティカ、及びラウルテラ・プランティコラからなる群から選ばれる、請求項７に記載の窒素固定細菌。
  9. 　前記窒素固定細菌が、クレブシエラ・オキシトカＮＧ１３株（受託番号：NITE BP-03721）、クレブシエラ・インディカ（ＪＣＭ３３７１８）、クレブシエラ・ヴァリイコラ（ＪＣＭ１２４１９）、クレブシエラ・ｓｐ.（ＮＢＲＣ１０００４８、ＮＢＲＣ１００４４１、ＮＢＲＣ１０９９１１）、ラウルテラ・テリゲナ（ＪＣＭ１６８７＝ＡＴＣＣ３３２５７）、ラーネラ・アクアティリス（ＪＣＭ１６８３＝ＡＴＣＣ３３０７１）、クレブシエラ・プランティコラ（ＪＣＭ２００６９＝ＡＴＣＣ８３２９）である、請求項７に記載の窒素固定細菌。
  10. 　前記窒素固定細菌が、窒素制限下において、大気中の窒素分子をＬ－グルタミン酸又はその塩を発酵生成する、請求項７～９のいずれか一項に記載の窒素固定細菌。
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