WO2024041961A2 - Process for the production of (1r,2s)-2,6-dimethyl-1-indanamine - Google Patents

Process for the production of (1r,2s)-2,6-dimethyl-1-indanamine Download PDF

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WO2024041961A2
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different
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dimethyl
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PCT/EP2023/072654
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Alba HERNANDEZ MARTIN
Mark James Ford
Dirk Brohm
Arne Gerlach
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Bayer Aktiengesellschaft
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Definitions

  • the present invention relates to a process for producing almost enantiomerically pure (lR,2S)-2,6-dimethyl-l-indanamine, which is a valuable building block for the synthesis of the herbicidal active ingredient indaziflam.
  • the present invention relates to a process for the preparation of almost enantiomerically pure (IR,2S)-2,6-dimethyl-l-indanamine by enzyme-catalyzed, stereoselective acylation of racemic 2,6-dimethyl-l-indanamine.
  • Racemic 1,6-dimethylindan-l-one is converted into the corresponding (1S,2S)-2,6-dimethylindan-l using a chiral ruthenium catalyst both diastereoselectively (96:4 d.r.) and enantioselectively (98:2 e.r.). -ol reduced in a yield of 80%.
  • the object of the present invention was to provide a process for producing almost enantiomerically pure (IR,2S)-2,6-dimethyl-l-indanamine, which overcomes the disadvantages known from the prior art.
  • the subject of the present invention is a process for the production of almost enantiomerically pure (IR,2S)-2,6-dimethyl-l-indanamine, characterized in that
  • Proteins which have at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97%, particularly preferably 98%, most preferably 99% identity to the one below SEQ ID No. 1 have the amino acid sequence shown,
  • Proteins which have at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97%, particularly preferably 98%, most preferably 99% identity to the one below SEQ ID No. 1 have the amino acid sequence shown apart from the fact that the amino acid sequence is at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97%, particularly preferably 98%, most preferably 99% identity to that under SEQ ID No. 1 has a modification selected from the group consisting of i. the amino acid at position 186 is different from L; ii. the amino acid at position 280 is different from L; iii.
  • the amino acid at position 312 is different from P; iv. the amino acid at position 3 is different from M; v. the amino acid at position 29 is different from N; vi. the amino acid at position 17 is different from L; vii. the amino acid at position 4 is different from S; viii. the amino acid at position 18 is different from V; ix. the amino acid at position 202 is different from A; x. the amino acid at position 301 is different from D; xi. the amino acid at position 309 is different from P; xii. the amino acid at position 31 is different from Q; xiii. the amino acid at position 111 is different from Q; xiv. the amino acid at position 85 is different from W; xv.
  • the amino acid at position 8 is different from K; xvi. the amino acid at position 79 is different from E; xvii. the amino acid at position 40 is different from K; that in a second step the amide or carbamate (II) is separated from the remaining 2,6-dimethyl-l-indanamines (III) and secondary components by crystallization, and that in a third step the amide or carbamate (II) is separated using a Acid or a base is converted to the almost enantiomerically pure (l ⁇ ,2>S)-2,6-dimethyl-l-indanamine (IV), wherein R represents a residue from the group CH2OCH3, CH2OCH2CH3, CH3, OCH3, OCH2CH3, OCH(CH 3 )2, OCH2CH2CH2CH3, OCH2CHCH2 and OCH 2 (C6H 5 ), and wherein R 1 represents a residue from the group OCH3, OCH2CH3, OCH (CH3)2, OCH2CH2CH2CH3, O
  • the mixture of the four stereoisomers of 2,6-dimethyl-l-indanamine (I) required as starting material for the process according to the invention is known and can be prepared, for example, as described in WO 2004/69814.
  • R preferably means a radical from the group OCH3 and OCH2CH3, and
  • R 1 means a residue from the group OCH3 and OCH2CH3.
  • proteins with the activity of a lipolytic enzyme or a lipase are used.
  • SEQ ID No. 1 represents the amino acid sequence of a wild-type lipolytic protein.
  • the wild-type lipase is derived from an uncultured bacterium from an environmental sample that can be derived from GenPept (PDB) under accession no. QRD81023 (version ORD81023.1).
  • PDB GenPept
  • QRD81023 version ORD81023.1
  • proteins with the activity of a lipolytic enzyme or a lipase the amino acid sequences of these proteins representing variants of a known protein that has the activity of a lipolytic enzyme or a lipase.
  • amino acid sequences of proteins with the activity of a lipase described herein represent variants of those described in SEQ ID no. 1 amino acid sequence shown, whereby in the under SEQ ID No.
  • amino acid sequence at least the amino acid at position 186, the amino acid at position 280, the amino acid at position 312, the amino acid at position 3, the Amino acid at position 29, the amino acid at position 17, the amino acid at position 4, the amino acid at position 18, the amino acid at position 202, the amino acid at position 301, the amino acid at position 309, the amino acid at position 31, the amino acid at Position 111, the amino acid at position 85, the amino acid at position 8, the amino acid at position 79 or the amino acid at position 40 is different from the amino acid at the corresponding amino acid position in the SEQ ID no. 1 sequence shown is present.
  • variant means an item that is different from an item known in the art.
  • variants are understood to mean a nucleic acid sequence or an amino acid sequence that differs from corresponding known sequences, but which codes for a protein that has the same function or catalyzes the same reaction, e.g. B. the function of encoding a protein with the activity of an eipase.
  • “Divergence” of nucleic acid molecule sequences and amino acid sequences from known nucleic acid sequences and protein sequences means that the sequences include substitutions (replacements) and/or deletions and/or insertions of nucleotides or amino acids in comparison to the corresponding known nucleic acid sequences or amino acid sequences.
  • Proteins with the activity of an eipase are usually used, the proteins being encoded by an amino acid sequence which is at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97%. , particularly preferably 98%, most preferably 99% identity to that under SEQ ID No. 1 have amino acid sequence shown.
  • Proteins with the activity of a lipase are also used, the proteins being encoded by an amino acid sequence which is at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97 %, particularly preferably 98%, most preferably 99% identity to that under SEQ ID No. 1, except that the amino acid sequence is at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97%, particularly preferably 98% strongest preferred 99% identity to that under SEQ ID No. 1 has a modification selected from the group consisting of i.
  • the amino acid at position 186 is different from L, preferably the amino acid at position 186 is F, W, Y, E, D, Q, T, H, P, C, K, S, N, I or V, more preferably the amino acid at position 186 F, W, Y, E, D or K, particularly preferred is the amino acid at position 186 W or Y, most preferred is the amino acid at position 186 Y; ii.the amino acid at position 280 is different from L, preferably the amino acid at position 280 is E, S, K, D or A, more preferably the amino acid at position 280 is A; iii.
  • the amino acid at position 312 is different from P, preferably the amino acid at position 312 is N, F, D, Q or K, more preferably the amino acid at position 312 is N; iv. the amino acid at position 3 is different from M, preferably the amino acid at position 3 is L, Q or C, more preferably the amino acid at position 3 is Q; v.the amino acid at position 29 is different from N, preferably the amino acid at position 29 is H, W or Y, more preferably the amino acid at position 29 is H or W, most preferably the amino acid at position 29 is H; vi. the amino acid at position 17 is different from L, preferably the amino acid at position 17 is P or T, more preferably the amino acid at position 17 is P; vii.
  • the amino acid at position 4 is different from S, preferably the amino acid at position 4 is P or L, more preferably the amino acid at position 4 is P; viii. the amino acid at position 18 is different from V, preferably the amino acid at position 18 is A, T, C or S, more preferably the amino acid at position 18 is A or C; ix. the amino acid at position 202 is different from A, preferably the amino acid at position 202 is Q or N. More preferably the amino acid at position 202 is N; x.the amino acid at position 301 is different from D, preferably the amino acid at position 301 is A; xi. the amino acid at position 309 is different from P, preferably the amino acid at position 309 is C; xii.
  • the amino acid at position 31 is different from Q, preferably the amino acid at position 31 is W; xiii. the amino acid at position 111 is different from Q, preferably the amino acid at position 111 is E; xiv. the amino acid at position 85 is different from W, preferably the amino acid at position 85 is H; xv. the amino acid at position 8 is different from K, preferably the amino acid at position 8 is E; xvi. the amino acid at position 79 is different from K, preferably the amino acid at position 79 is S, I or W, more preferably the amino acid at position 79 is S; xvii. the amino acid at position 40 is different from K, preferably the amino acid at position 40 is M.
  • a further embodiment according to the invention relates to proteins with the activity of a lipase, the proteins being selected from the group consisting of a) proteins which are those in SEQ ID No. 1, except that the amino acid at position 186 is different from L; b) proteins with an amino acid sequence with at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97%, particularly preferably 98%, most preferably 99% identity the amino acid sequence shown under a), provided that the amino acid at position 186 is different from L.
  • the amino acid in the proteins according to a) or b) at position 186 is F, W, Y, E, D, Q, T, H, P, C, K, S, N, I or V. More preferred is Amino acid at position 186 F, W, Y, E, D or K. Particularly preferred is the amino acid at position 186 W or Y. Most preferred is the amino acid at position 186 Y.
  • amino acid corresponding to position a pairwise sequence alignment of the first amino acid sequence with the second amino acid sequence appears if the Numbering of the amino acids of the second amino acid sequence differs from the amino acid numbering of the first amino acid sequence.
  • identity in relation to sequence identity or identical sequences is to be understood as meaning the number of identical amino acids or nucleotides that are shared with another (second) nucleic or amino acid sequence over the entire sequence length of a first nucleic or amino acid sequence. Amino acid sequence in common, expressed as a percentage.
  • Sequence alignments and percent sequence identity scores can be determined, for example, using software such as EMBOSS, available on the EBI website (ebi.ac.uk/Tools/emboss/).
  • sequence similarity or identity can be determined by searching databases (e.g. EMBL, GenBank) using well-known algorithms and output formats such as FASTA, BLAST, etc., but preferably hits should be retrieved and matched pairwise to conclude sequence identity to determine.
  • the identity must be determined by determining the identity as a percentage of the number of amino acids or nucleotides that the shorter sequence has in common with the longer sequence.
  • the identity is preferably determined using the known and publicly available computer program ClustalW (Thompson et al. Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680).
  • ClustalW is publicly available from Julie Thompson (Thompson® EMBL-Heidelberg.DE) and Toby Gibson (Gibson@EMBL-Heidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory, Meyerhof No 1, D 69117 Heidelberg, Germany.
  • ClustalW can also be downloaded from various websites, such as IGBMC (Institut de Genetique et de Biology Moleisme et Cellulaire, BP163, 67404 Illkirch Cedex, France; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) as well from EBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/) and from the mirrored websites of EBI (European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK).
  • the computer program ClustalW version 1.8 is used to determine the identity between proteins described in the context of the present invention and other proteins.
  • the computer program ClustalW version 1.8 is preferably used to determine the identity, for example, between the nucleotide sequence of the nucleic acid molecules described in connection with the present invention and the nucleotide sequence of other nucleic acid molecules.
  • the parameters must be set as follows:
  • “Identity” also means that there is functional and/or structural equivalence between the relevant nucleic acid molecules or the proteins they encode.
  • Functional equivalence means that the nucleic acid molecule sequences or the amino acid sequences code for a protein with the activity of a lipase.
  • the nucleic acid molecules that are homologous to the molecules described above and are derivatives of these molecules are generally variants of these molecules that represent modifications that have the same biological function or catalyze the same reaction, i.e. H. code for a protein with the activity of an eipase.
  • H. code for a protein with the activity of an eipase can either be naturally occurring variants, for example sequences from other species, or mutations, where these mutations may have occurred naturally or were introduced through targeted mutagenesis.
  • variants can be synthetically produced sequences.
  • allelic variants can be either naturally occurring variants or synthetically produced variants or variants generated by recombinant DNA techniques. What is crucial for the present invention, however, is that these variants code for proteins with lipase activity and include the amino acid substitutions (replacements), deletions or insertions described here with respect to the proteins according to the invention.
  • a special type of derivatives are, for example, nucleic acid molecules, which differ from the nucleic acid molecules described in the context of the present invention by the degeneration of the genetic code.
  • lipases belong to the class of hydrolases (EC 3).
  • Hydrolase is a class of enzymes that commonly act as biochemical catalysts and use water to break a chemical bond, typically resulting in the division of a larger molecule into smaller molecules.
  • the group of hydrolases includes enzymes acting on ester bonds (EC 3.1), such as carboxylic acid ester hydrolases (EC 3.1.1) and, as a subgroup, lipases (EC 3.1.1.3).
  • EC 3.1 ester bonds
  • Lipases have been identified from plants, mammals and microorganisms, e.g. B.
  • Pseudomonas Vibrio, Acinetobacter, Burkholderia, Chromobacterium, cutinase of Fusarium solani (FSC), Candida antarctica A (CalA), Rhizopus oryzae (ROL), Thermomyces lanuginosus (TLL), Rhizomucor miehei (RML), Aspergillus Niger, Fusarium heterosporum , Fusarium oxysporum or Fusarium culmorum.
  • a protein has the activity of a lipase, this can be detected using methods known and described in the art. It is not crucial which method is used to demonstrate whether a protein according to the invention has the activity of a lipase. Preferably, in connection with the present invention, the method is described in the “Example” section.
  • Lipase variant proteins according to the invention can have further amino acid modifications (amino acid substitutions, deletions or insertions) compared to the amino acid sequences described above in relation to those under SEQ ID No. 1 have amino acid sequence shown.
  • the lipase variants described in the amino acid sequences shown in FIG. 1 can have at least one, two, three, four, five, six, seven further amino acid substitutions at positions 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 or 111.
  • the protein according to the invention with the activity of a lipase is selected from the group consisting of a) proteins which are those in SEQ ID No.
  • amino acid at position 186 is different from L and that they have at least one, two, three, four, five, six, seven or more other amino acid substitutions selected from the group consisting of (i) the amino acid at position 79 is different from E; (ii) the amino acid at position 202 is different from A; (iii) the amino acid at position 280 is different from L; (iv) the amino acid at position 301 is different from D; (v) the amino acid at position 3 is different from M; (vi) the amino acid at position 11 is different from C; (vii) the amino acid at position 17 is different from L; (viii) the amino acid at position 40 is different from K; (ix) the amino acid at position 111 is different from Q; and b) proteins having an amino acid sequence with at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97%, particularly preferably 98%, most preferably 99% identity to the amino acid sequence shown directly above under a), provided
  • the amino acid at position 79 is S, W or I, more preferably S; preferably the amino acid at position 202 is N; preferably the amino acid at position 280 is A; preferably the amino acid at position 301 is A; preferably is the amino acid at position 3 Q; preferably the amino acid at position 11 is A; preferably the amino acid at position 17 is P; preferably the amino acid at position 40 is M; preferably the amino acid at position 111 is E.
  • lipase variant proteins according to the invention can contain additional amino acid substitutions compared to the amino acid sequences described above in relation to those under SEQ ID No. 1 have amino acid sequence shown.
  • additional amino acid substitutions refer to positions of the amino acid sequence that are different from position(s) 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 or 111, which relate to the further amino acid modifications.
  • the information contained herein above under point a) in relation to those under SEQ ID No. 1 shown amino acid sequences may have at least one, two, three, four, five, six, seven or more additional amino acid substitutions at positions 4, 8, 18, 29, 31, 42, 84, 85, 192, 217, 309 or 312 exhibit.
  • the amino acid at position 4 is different from S, preferably the amino acid at this position is P.
  • the amino acid at position 8 is different from K, preferably the amino acid at this position is E.
  • the amino acid at position 18 is different from V, preferably is the amino acid at this position is C.
  • the amino acid at position 29 is different from N, preferably the amino acid at this position is W or H.
  • the amino acid at position 31 is different from Q, preferably the amino acid at this position is W.
  • the amino acid at Position 42 is different from L, preferably the amino acid at this position is D.
  • the amino acid at position 84 is different from N, preferably the amino acid at this position is T.
  • the amino acid at position 85 is different from W, preferably the amino acid is at this position is H.
  • the amino acid at position 192 is different from F, preferably the amino acid at this position is A or V.
  • the amino acid at position 217 is different from Q, preferably the amino acid at this position is M.
  • the amino acid at position 309 is different from P, preferably the amino acid at this position is C.
  • the amino acid at position 312 is different from P, preferably the amino acid at this position is N.
  • a further embodiment according to the invention therefore relates to proteins according to the invention which have further amino acid modifications, preferably these embodiments are proteins with the activity of a lipase, the proteins being selected from the group consisting of:
  • Proteins that are in SEQ ID No. 1 have the amino acid sequence shown, except that
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, more preferably Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S , W or I, more preferably S; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 3 is preferably Q;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 11 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y and that the amino acid at position 17 is preferably P;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • Proteins with an amino acid sequence that is at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97%, particularly preferably 98%, most preferably 99% identical are with the amino acid sequence shown under a), provided that the amino acid at position 186 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and wherein the proteins have at least one further amino acid substitution selected from the group , which is shown below the listed characters directly above this.
  • those described above under point a) can be referred to under SEQ ID No. 1 have at least two further amino acid substitutions at positions 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 or 111.
  • the amino acid at position 79 is S, W or I, more preferably S; preferably the amino acid at position 202 is N; preferably the amino acid at position 280 is A; preferably the amino acid at position 301 is A; preferably the amino acid at position 3 is Q; preferably the amino acid at position 11 is A; preferably the amino acid at position 17 is P; preferably the amino acid at position 40 is M; preferably the amino acid at position 111 is E.
  • a further embodiment according to the invention therefore relates to proteins according to the invention which have further amino acid modifications, preferably these embodiments are proteins with the activity of a lipase, the proteins being selected from the group consisting of proteins with the in SEQ ID No. 1 amino acid sequence shown, except that
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 202 is different from A, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and the amino acid at position 202 is preferably N;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 280 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and the amino acid at position 280 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 301 is different from D, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and the amino acid at position 301 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 3 is different from M, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and the amino acid at position 3 is preferably Q; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and the amino acid at position 11 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and the amino acid at position 17 is preferably P;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 280 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 202 is preferably N and the amino acid at position 280 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 301 is different from D, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 202 is preferably N and the amino acid at position 301 is preferably A; the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 from
  • A is different and the amino acid at position 3 is different from M, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 202 is preferably N and the amino acid at position 3 is preferably Q;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 202 is preferably N, and the amino acid at position 11 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 202 is preferably N and the amino acid at position 17 is preferably P;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 202 is preferably N and the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 202 is preferably N and the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 280 is preferably A, and the amino acid at position 301 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 280 is preferably A and the amino acid at position 3 is preferably Q; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 280 is preferably A, and the amino acid at position 11 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 280 is preferably A and the amino acid at position 17 is preferably P;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 280 is preferably A and the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 280 is preferably A and the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 3 is different from M, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 301 is preferably A and the amino acid at position 3 is preferably Q;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 301 is preferably A, and the amino acid at position 11 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 301 is preferably A and the amino acid at position 17 is preferably P;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 301 is preferably A and the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 301 is preferably A and the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 3 is preferably Q and the amino acid at position 11 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 3 is preferably Q and the amino acid at position 17 is preferably P;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 3 is preferably Q and the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 3 is preferably Q and the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred, that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 11 is preferably A and the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 11 is preferably A, and the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 17 is preferably P and the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 17 is preferably P, and the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 40 is preferably M, and the amino acid at position 111 is preferably E;
  • Proteins with an amino acid sequence that is at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97%, particularly preferably 98%, most preferably 99% identical are with the amino acid sequence shown under a), provided that the amino acid at position 186 is different from L, it being preferred that it is amino acid at position 186, preferably W or Y, and wherein the proteins have at least two additional amino acid substitutions selected from the group shown under the listed characters immediately above.
  • those described above under point a) can be referred to under SEQ ID No. 1 have at least three further amino acid substitutions at positions 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 or 111.
  • the amino acid at position 79 is S, W or I, more preferably S; preferably the amino acid at position 202 is N; preferably the amino acid at position 280 is A; preferably the amino acid at position 301 is A; preferably the amino acid at position 3 is Q; preferably the amino acid at position 11 is A; preferably the amino acid at position 17 is P; preferably the amino acid at position 40 is M; preferably the amino acid at position 111 is E.
  • a further embodiment according to the invention therefore relates to proteins according to the invention which have further amino acid modifications, preferably these embodiments are proteins with the activity of a lipase, the proteins being selected from the group consisting of proteins with the in SEQ ID No. 1 amino acid sequence shown, except that
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 280 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 280 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 301 is different from D, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 301 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 3 is different from M, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 3 is preferably Q; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 11 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D
  • the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 301 is preferably A
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M
  • the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 3 is different from M, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 40 is different from K
  • the amino acid at position 186 is preferably W or Y, more preferably Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 301 is preferably A
  • the amino acid at position 40 is preferably M is, it being particularly preferred that the amino acid at position 186 is Y and that the amino acid at position 79 is S and that the amino acid at position 301 is A and that the amino acid at position 40 is M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 11 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M; the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 40 is different from K and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 40 is preferably M, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 301 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 3 is different from M, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q; the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 from
  • A is different and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 11 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 17 is preferably P; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 111 is preferably E; the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 from
  • A is different and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 40 is different from K and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 40 is preferably M, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 3 is different from M, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 11 is preferably A;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 40 is preferably M; the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 111 is preferably E; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position
  • I I is preferably A
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position
  • I I I is preferably E; the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 from
  • D is different and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 40 is different from K and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M, and that the amino acid at position 111 is preferably E; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 111 is preferably E; the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 40 is different from K and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 40 is preferably M, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 40 is different from K and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 40 is preferably M, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
  • Proteins with an amino acid sequence that is at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97%, particularly preferably 98%, most preferably 99% identical are with the amino acid sequence shown under a), provided that the amino acid at position 186 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, more preferably Y, and wherein the proteins are at least three more Have amino acid substitutions selected from the group shown below the listed characters immediately above.
  • the lipase variants described in the amino acid sequences shown in FIG. 1 may have at least four additional amino acid substitutions at positions 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 or 111.
  • the amino acid at position 79 is S, W or I, more preferably S; preferably the amino acid at position 202 is N; preferably the amino acid at position 280 is A; preferably the amino acid at position 301 is A; preferably the amino acid at position 3 is Q; preferably the amino acid at position 11 is A; preferably the amino acid at position 17 is P; preferably the amino acid at position 40 is M; preferably the amino acid at position 111 is E.
  • the lipase variants described in the amino acid sequences shown in FIG. 1 may have at least five additional amino acid substitutions at positions 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 or 111.
  • the amino acid at position 79 is S, W or I, more preferably S; preferably the amino acid at position 202 is N; preferably the amino acid at position 280 is A; preferably the amino acid at position 301 is A; preferably the amino acid at position 3 is Q; preferably the amino acid at position 11 is A; preferably the amino acid at position 17 is P; preferably the amino acid at position 40 is M; preferably the amino acid at position 111 is E.
  • the lipase variants described in the amino acid sequences shown in FIG. 1 may have at least six additional amino acid substitutions at positions 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 or 111.
  • the amino acid at position 79 is S, W or I, more preferably S; preferably the amino acid at position 202 is N; preferably the amino acid at position 280 is A; preferably the amino acid at position 301 is A; preferably the amino acid at position 3 is Q; preferably the amino acid at position 11 is A; preferably the amino acid at position 17 is P; preferably the amino acid at position 40 is M; preferably the amino acid at position 111 is E.
  • the lipase variants described in the amino acid sequences shown in FIG. 1 may have at least seven additional amino acid substitutions at positions 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 or 111.
  • the amino acid at position 79 is S, W or I, more preferably S; preferably the amino acid at position 202 is N; preferably the amino acid at position 280 is A; preferably the amino acid at position 301 is A; preferably the amino acid at position 3 is Q; preferably the amino acid at position 11 is A; preferably the amino acid at position 17 is P; preferably the amino acid at position 40 is M; preferably the amino acid at position 111 is E.
  • Preferred embodiments according to the invention are proteins that are responsible for lipases with the ones listed under SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149 ,
  • Particularly preferred embodiments according to the invention are proteins that are responsible for lipases with the ones listed under SEQ ID Nos. 233 and 399 amino acid sequences shown, respectively.
  • SEQ ID No. 1 under SEQ ID No. 1 are the two amino acids at positions 40 and 79 of the amino acids at the corresponding amino acid positions in the SEQ ID no. 1 shown sequence are different.
  • amino acid at position 40 M is the amino acid at position 40 M and is the amino acid at position 79 S,
  • amino acids at positions 40 and 186 of the amino acids at the corresponding amino acid positions in the SEQ ID no. 1 shown sequence are different.
  • amino acid at position 40 is M and the amino acid at position 186 is Y;
  • SEQ ID No. 1 under SEQ ID No. 1 are the two amino acids at positions 40 and 301 of the amino acids at the corresponding amino acid positions in the SEQ ID no. 1 shown sequence are different.
  • amino acid at position 40M In a specific tested variant in relation to the SEQ ID no. 1 is the amino acid at position 40M and is the amino acid at position 301A;
  • the two amino acids at positions 79 and 186 are among the amino acids at the corresponding amino acid positions in which under SEQ ID No. 1 shown sequence are different.
  • the amino acid at position 79 is S and the amino acid at position 186 is Y;
  • SEQ ID No. 1 under SEQ ID No. 1 are the two amino acids at positions 79 and 301 of the amino acids at the corresponding amino acid positions in the SEQ ID no. 1 shown sequence are different.
  • amino acid at position 79 S and is the amino acid at position 301 A;
  • SEQ ID No. 1 under SEQ ID No. 1 are the two amino acids at positions 186 and 301 of the amino acids at the corresponding amino acid positions in the SEQ ID no. 1 shown sequence are different.
  • amino acid at position 186 Y In a specific tested variant in relation to the SEQ ID no. 1 is the amino acid at position 186 Y and is the amino acid at position 301 A.
  • SEQ ID No. 1 under SEQ ID No. 1 are the three amino acids at positions 40, 79 and 186 of the amino acids at the corresponding amino acid positions in the SEQ ID no. 1 shown sequence are different.
  • amino acid at position 40M is the amino acid at position 79S and is the amino acid at position 186Y;
  • SEQ ID No. 1 under SEQ ID No. 1 are the three amino acids at positions 40, 79 and 301 from the amino acids at the corresponding amino acid positions in the SEQ ID no. 1 shown sequence are different.
  • amino acid at position 40M is the amino acid at position 79S and is the amino acid at position 301A;
  • SEQ ID No. 1 under SEQ ID No. 1 are the three amino acids at positions 40, 186 and 301 from the amino acids at the corresponding amino acid positions in the SEQ ID no. 1 shown sequence are different.
  • Amino acid sequence shown is the amino acid at position 40M and is the amino acid at position 186Y and is the amino acid at position 301A;
  • SEQ ID No. 1 under SEQ ID No. 1 are the three amino acids at positions 79, 186 and 301 from the amino acids at the corresponding amino acid positions in the SEQ ID no. 1 shown sequence are different.
  • amino acid at position 79 S is the amino acid at position 186 Y and is the amino acid at position 301 A;
  • the lipases and lipase variants according to the invention have a high selectivity and/or a high specific activity with regard to the stereoselective acylation or carboxylation of 2,6-dimethyl-l-indanamine (DMAI) and are capable of producing enantiomerically enriched or almost pure methyl -[(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-lH-inden-l-yl] to produce carbamate.
  • Methyl-[(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-lH-inden-l-yl] carbamate is an important intermediate for the synthesis of the herbicidal compound indaziflam.
  • Enantiomerically enriched herein means that one of two enantiomers in a composition is present in greater amounts than the other enantiomer, preferably one enantiomer is at least 60% present in the composition, more preferably one enantiomer is at least at least 65% present in the composition %, even more preferably an enantiomer is present in the composition to at least at least 70%, even more preferably an enantiomer is present in the composition to at least at least 75%, even more preferably an enantiomer is present in the composition to at least at least 80%, particularly preferably an enantiomer is present in the composition to at least 85%, most preferably an enantiomer is present in the composition to at least 90% or very particularly preferably an enantiomer is present in the composition to at least at least 94% ahead.
  • Enantiomerically nearly pure herein means that one of two enantiomers is present in a composition in amounts of at least 95.0%, preferably one of two enantiomers is present in a composition in amounts of at least 95.5%, more preferably one is present of two enantiomers is present in a composition in amounts of at least 96.0%, even more preferably one of two enantiomers is present in a composition in amounts of at least 96.5%, even more preferably one of two enantiomers is present in a composition in amounts of at least 96.5% of at least 97.0%, even more preferably one of two enantiomers is present in a composition in amounts of at least 98.0%, particularly preferably one of two enantiomers is present in a composition in amounts of at least 98.5%, most preferably one of two enantiomers is present in a composition in amounts of at least 99.0% or most preferably one of two enantiomers is present in a composition in amounts of at least
  • a further embodiment according to the invention relates to nucleic acid molecules which code for a protein according to the invention.
  • Nucleic acid molecules according to the invention can be any type of nucleic acid, provided that the nucleic acid codes for a protein according to the invention.
  • the nucleic acids may be ribonucleic acid molecules (e.g., RNA, mRNA) or deoxyribonucleic acid molecules (DNA, including genomic DNA, which may or may not include introns and coding DNA).
  • nucleic acid molecules that code for proteins that have the activity of a lipase, comprising those under SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149 , 151, 153, 155, 157, 159, 161,
  • the invention further relates to nucleic acid molecules which code for a protein with the activity of a lipase, selected from the group consisting of a) nucleic acid molecules which are those under SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150 , 152, 154, 156, 158,
  • nucleic acid sequences shown include nucleic acid sequences shown; b) nucleic acid molecules which are at least 60%, preferably 70%, more preferably 80%, even more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, particularly preferably 97%, most preferably 98% or very particularly preferred Have 99% identity to the nucleic acid sequences shown under a).
  • hybridize with means hybridization under conventional hybridization conditions, preferably under strict conditions, such as those described in Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773) or in Ausubel et al. (Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons; 5th edition (2002), ISBN: 0471250929). “Hybridization” particularly preferably means hybridization under the following conditions:
  • 2xSSC 2xSSC; lOxDenhardt solution (Fikoll 400+PEG+BSA; ratio 1:1:1); 0.1% SDS; 5mM EDTA; 50 mM Na2HPO4; 250 pg/ml herring sperm DNA; 50 pg/ml tRNA; or
  • Nucleic acid molecules that hybridize with nucleic acid molecules encoding a protein with the activity of a lipase can come from any organism; accordingly, they can come from bacteria, fungi, animals, humans, plants or viruses.
  • Nucleic acid molecules that hybridize with nucleic acid molecules encoding a protein with the activity of a lipase are preferably derived from microorganisms, more preferably from fungi or bacteria, most preferably from bacteria.
  • Nucleic acid molecules that hybridize with the molecules mentioned can be isolated, for example, from genomic or cDNA libraries. These nucleic acid molecules can be identified and isolated using the nucleic acid molecules described herein or they can be identified and isolated using portions of these molecules or the reverse complements of these molecules, for example by hybridization according to standard procedures (see, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons; 5th edition (2002), ISBN: 0471250929) or by amplification using PCR.
  • the fragments used as hybridization samples can also be synthetic fragments or oligonucleotides produced using conventional synthesis techniques, the sequence of which is essentially identical to the nucleic acid molecule described in the context of the present invention.
  • the sequence should be determined and the properties of the proteins encoded by that sequence should be analyzed to determine whether they are Proteins with the activity of a lipase are. Methods for determining whether a protein has the activity of a protein with the activity of a lipase are known to those of ordinary skill in the art.
  • the molecules that hybridize with the nucleic acid molecules described in the context of the present invention include in particular fragments, derivatives and allelic variants of the nucleic acid molecules mentioned.
  • the term “derivative” in the context of the present invention means that the sequences of these molecules differ in one or more positions from the sequences of the nucleic acid molecules described above and are highly identical to these sequences. The differences from the nucleic acid molecules described above can be due, for example, to deletion, addition, substitution, insertion or recombination.
  • Preferred nucleic acid molecules according to the invention are those under SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150 , 152, 154, 156, 158, 160,
  • nucleotide abbreviations a, c, g, t as well as the abbreviations for degenerate nucleotides r, y, s, w, k, m, b, d, h, v, n can be found hereinafter from Table 1 in the section entitled “Description of the sequences” can be derived.
  • the amino acids encoded by degenerate nucleotides can be derived hereinafter from Table 3 in the section entitled “Description of Sequences”.
  • nucleic acid molecules which comprise a nucleic acid molecule suitable for the method according to the invention.
  • nucleic acid molecule is to be understood as meaning a nucleic acid molecule which, in addition to the nucleic acid molecules suitable for the method according to the invention, contains further sequences which do not occur naturally in the combination in which they occur in the nucleic acids recombinant for the method according to the invention.
  • the additional sequences mentioned above can be any sequences, preferably functional or regulatory sequences (promoters, termination signals, enhancers, ribosome binding sites (rbs), leader sequences that increase transcription, translation or RNA stability , subcellular targeting sequences, etc.), particularly preferably they are functional or regulatory sequences that are active in microorganisms, and very particularly preferably they are regulatory sequences that are active in fungi, in particular in yeast or in bacteria.
  • Methods for producing the recombinant nucleic acid molecules suitable for the method according to the invention are known to those of ordinary skill in the art. These include genetic processes such as binding of nucleic acid molecules through ligation, genetic recombination or new synthesis of nucleic acid molecules. These procedures are z. B.
  • the recombinant nucleic acid molecule usable for the method according to the invention comprises a suitable nucleic acid molecule which is linked to regulatory sequences which initiate transcription in prokaryotic or eukaryotic cells.
  • Regulatory sequences that initiate transcription in a cell are also known as promoters.
  • Information relating to regulatory sequences and plasmids is well known to those of ordinary skill in the art and is e.g. B. described in the Registry of Standard Biological Parts, supported by The International Genetically Engineered Machine (iGEM) Foundation (One Kendall Square, Suite B6104, Cambridge, MA 02139, USA) on the Internet (http://parts.gem.org/Catalog ).
  • Regulatory sequences that enable transcription in prokaryotic organisms such as BE coli, as well as in eukaryotic organisms, are extensively described in the literature, in particular those are described in relation to expression in yeast, e.g. B. Saccharomyces cerevisiae.
  • yeast e.g. B. Saccharomyces cerevisiae.
  • An overview of different systems for the expression of proteins in different host organisms can be found, for example, in Methods in Enzymology 153 (1987), 383-516 and in Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544) or in Gomes et al. (2016, Advances in Animal and Veterinary Sciences, 4(4), 346) and Baghban et al. (2018, Current Pharmaceutical Biotechnology, 19(6)).
  • Common yeast promoters are pAOXl, pHIS4, pGAL, pScADH2 (Baghban et al., 2018, see above).
  • Common bacterial promoters are T5, T7, rhamnose-inducible, arabinose-inducible, PhoA, artificial trc(trp-lac) promoter, as described by Marschall et al. (2017, Appl Microbiol Biotechnol 101, 501-512) and Tegel et al. (2011, FEBS Journal 278, 729-739).
  • a further embodiment of recombinant nucleic acid molecules that can be used for the method according to the invention are vectors of plasmids which comprise the suitable nucleic acid molecules.
  • Vectors are well known in the field of molecular biology and herein represent a nucleic acid sequence or a vehicle comprising a nucleic acid sequence that is used to transfer genetic material (DNA or RNA) into a target cell.
  • Vectors can be plasmids, e.g. B. T-DNA or binary vectors for generating transgenic plants, expression vectors for the expression of nucleic acid sequences in a host cell, shuttle vectors that are able to reproduce in different hosts, or vectors can be virus particles or bacteriophages that have been modified to deliver foreign genetic material into a host.
  • “Plasmids” are well known in the field of molecular biology and herein represent an autonomously self-replicating, often circular DNA molecule which, when present in a host cell, is separated from the chromosomal DNA.
  • Suitable nucleic acid molecules, recombinant nucleic acid molecules, vectors or plasmids can be used to produce proteins for the method according to the invention, e.g. B. by expressing the appropriate nucleic acid molecule in host cells.
  • hosts or host cells which comprise or express a nucleic acid molecule suitable for the method according to the invention or which comprise suitable proteins with the activity of a lipase or which comprise a recombinant nucleic acid molecule suitable for the method according to the invention or which comprise a vector which is suitable for the method according to the invention or which Methods according to the invention include a suitable plasmid.
  • Suitable nucleic acid molecules encoding a protein with the activity of a lipase can be expressed in host cells, e.g. B. for their reproduction or for the production of proteins with the Activity of a lipase.
  • suitable nucleic acid molecules can be contained on vectors or plasmids or can be stably integrated into the genome of a respective host cell.
  • the appropriate nucleic acid molecules may also be contained in vectors that assist in their introduction into host cells.
  • a host or a host cell suitable for the method according to the invention comprising a nucleic acid molecule suitable for the method according to the invention or comprising a recombinant nucleic acid molecule suitable for the method according to the invention or comprising a vector suitable for the method according to the invention or comprising a plasmid suitable for the method according to the invention and each comprising a protein suitable for the method according to the invention.
  • a host or a host cell suitable for the method according to the invention comprising a nucleic acid molecule suitable for the method according to the invention or comprising a recombinant nucleic acid molecule suitable for the method according to the invention or comprising a vector suitable for the method according to the invention or comprising a plasmid suitable for the method according to the invention and each expressing a protein suitable for the method according to the invention, the protein preferably having the activity of a lipase.
  • “Expressing a nucleic acid molecule” is meant herein to mean that if the nucleic acid molecule is RNA or mRNA, the nucleic acid molecule is translated into a protein, preferably a protein with the activity of a lipase, or if the nucleic acid molecule is DNA or cDNA, it is translated into mRNA is transcribed (and in the case of intron-containing genomic DNA processed), preferably into an mRNA which codes for a protein with the activity of a lipase, and is subsequently translated into a protein, preferably translated into a protein with the activity of a lipase.
  • Transcription of a particular nucleic acid molecule in a host can be detected by methods known to those of ordinary skill in the art, for example by detecting specific transcripts (mRNA) of foreign nucleic acid molecules by Northern blot analysis or by RT-PCR.
  • mRNA specific transcripts
  • hosts or host cells comprise a particular protein or comprise a protein derived from the expression of a nucleic acid molecule can be determined by methods known to those skilled in the art, for example by immunological methods such as Western blot analysis, ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). or RIA (Radio Immune Assay).
  • ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
  • RIA Radio Immune Assay
  • Those of ordinary skill in the art are familiar with methods for producing antibodies that react specifically with a particular protein, that is, that bind specifically to a particular protein (see, for example, Lottspeich and Zorbas (eds.), 1998, Bioanalytik, Spektrum akad, Verlag, Heidelberg , Berlin, ISBN 3-8274-0041-4).
  • Some companies (Thermo Fisher Scientific, 168 Third Avenue, Waltham, MA USA 0245; GenScript, 60 Centennial Ave., Piscataway, NJ 08854, USA) offer production of these antibodies as a made
  • a host or a host cell comprises a protein suitable for the method according to the invention by detecting the (additional) activity of proteins with the activity of a lipase in a corresponding host cell.
  • the activity of proteins with additional activity of a lipase in a corresponding host cell is preferably detected by comparing the activities of lipases in a host cell used for the method according to the invention with the corresponding activity of host cells which do not contain a protein suitable for the method according to the invention. Testing whether a protein has the activity of a lipase can be carried out using methods known in the art.
  • Hosts or host cells used for the method of the invention can be prepared by those skilled in the art using known methods for genetically modifying or transforming organisms.
  • a host or host cell suitable for the method according to the invention in particular a prokaryotic or eukaryotic host or a host cell, genetically modified (or transformed) with a suitable nucleic acid molecule or with a suitable recombinant nucleic acid molecule or with a suitable vector or with a suitable plasmid .
  • the genetically modified (transformed) host or host cell used for the method according to the invention expresses a protein with the activity of a lipase, more preferably the genetically modified (transformed) host or host cell expresses a protein suitable for the method according to the invention.
  • Genetically modified with a nucleic acid molecule or “transformed with a nucleic acid molecule” is to be understood herein to mean that a nucleic acid molecule is or has been introduced into a host or into a host cell by technical and/or non-naturally occurring means, preferably by technical methods from the Areas of molecular biology, biotechnology or genetic engineering.
  • Descendants or descendants of hosts or host cells used for the method according to the invention are also open, preferably these descendants or descendants comprise a nucleic acid molecule suitable for the method according to the invention or comprise a suitable recombinant nucleic acid molecule or comprise a suitable vector or comprise a suitable plasmid or comprise a suitable protein , more preferably these descendants or descendants comprise a suitable nucleic acid molecule or comprise a suitable recombinant nucleic acid molecule or comprise a suitable vector or comprise a suitable plasmid and in each case they express a protein, the protein having the activity of a lipase, even more preferably these descendants or descendants comprise a suitable nucleic acid molecule or comprise a suitable recombinant nucleic acid molecule or comprise a suitable vector or comprise a suitable plasmid and in each case they express a protein, the protein having the activity of a lipase which can be used in the method according to the invention.
  • the host or host cell for the method according to the invention may be a host or host cell from a prokaryotic or a eukaryotic organism.
  • the host or host cells can be bacteria or bacterial cells (e.g. E. coli, bacteria of the genus Bacillus, in particular Bacillus subtilis, Agrobacterium, in particular Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes, Pseudomonas, in particular Pseudomonas fluorescens, Streptomyces spp, Rhodococcus spp, in particular Rhodococcus rhodochrous, Vibrio natrigens, Corynebacterium, in particular Corynebacterium glutamicum) or fungi or fungal cells (e.g.
  • Agaricus in particular Agaricus bisporus, Aspergillus, Trichoderma or yeasts, in particular .8. cerevisiae, Pichia ssp. such as P. pastoris
  • Preferred host cells are cells of microorganisms.
  • bacteria and protists e.g. fungi, in particular yeasts and algae
  • Schlegel "General Microbiology” Schlegel "General Microbiology” (Georg Thieme Verlag (1985), 1-2) , are included.
  • the hosts or host cells used for the method according to the invention are preferably bacteria/bacterial cells or yeasts/yeast cells, more preferably bacteria/bacterial cells, even more preferably Bacillus species/BacZZZus species cells or Escherichia coli/Escherichia coli cells, the strongest prefers Escherichia coli/Escherichia coli cells.
  • Pseudomonas in particular Pseudomonas fluorescens, Streptomyces spp, Rhodococcus spp, in particular Rhodococcus rhodochrous, Vibrio spp, in particular Vibrio natrigens, Corynebacterium, in particular Corynebacterium glutamicum or other hosts or host cells can be used for the method according to the invention.
  • Preferred hosts or host cells for the method according to the invention comprise a suitable nucleic acid molecule, the suitable nucleic acid molecule being characterized in that the codons of the nucleic acid molecule are modified in such a way that they are adapted to the frequency of use of the codons of the host or a host cell. Description of the sequences
  • nucleotide codes capitalized in the table above are capitalized here.
  • the protein with the activity of a lipase is preferably used in an amount of 0.1-50% by weight based on the mixture (I). An amount of 0.5-10% by weight is preferred. An amount of 1-5% by weight is particularly preferred.
  • Step 1 of the method according to the invention can be carried out in the absence of a solvent or in one.
  • Solvents from the group consisting of methyl t-butyl ether, heptane, toluene, xylenes, mesitylene, anisole, chlorobenzene, n-butanol, z-propanol, n-propanol and ethanol and mixtures thereof are preferred.
  • Solvents from the group toluene, xylenes, mesitylene, n-butanol and ethanol and mixtures thereof are particularly preferred.
  • the reaction is also particularly preferably carried out in the absence of a solvent.
  • the reaction according to step 1 is usually carried out at temperatures of 20-130 ° C.
  • the reaction is preferably carried out at 70-130 °C.
  • the reaction is particularly preferably carried out at 80-120°C.
  • step 2 of the process according to the invention takes place by crystallization known to those skilled in the art.
  • the bases mentioned in step 3 of the process according to the invention usually come from the group consisting of lithium hydroxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide, lithium carbonate, Sodium carbonate, potassium carbonate, lithium methoxide, sodium methoxide, potassium methoxide, lithium ethoxide, sodium ethoxide and potassium ethoxide.
  • the bases lithium hydroxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide, lithium ethoxide, sodium ethoxide and potassium ethoxide are particularly preferably used.
  • the bases lithium hydroxide, sodium hydroxide and potassium hydroxide are particularly preferably used.
  • the base is usually used in a stoichiometry of 1.00-3.00 equivalents based on the amount of component (II) used.
  • the base is preferably used in an amount of 1.50-2.50 equivalents.
  • the base is particularly preferably used in an amount of 1.75 to 2.25 equivalents.
  • the preferred solvents used are ethanol, z-propanol, z-propanol, n-butanol, i-butanoI, sec-butanol, tert-butanol and l-methoxypropan-2-ol, as well as toluene, xylenes and veratrol. Particular preference is given to using ethanol, n-butanol, z-propanol, l-methoxypropan-2-ol, toluene, xylenes and veratrol. Ethanol, n-butanol and xylenes are particularly preferred.
  • the reaction according to step 3 is usually carried out at temperatures of 60-140 °C.
  • the reaction is preferably carried out at 80-120 °C.
  • the reaction is particularly preferably carried out at 90-110 ° C.
  • Another advantage of the process according to the invention is that the mixture of 2,6-dimethyl-l-indanamines (III) remaining in step 1 or step 2 is metal-catalyzed again in a resource-saving manner to form a mixture of the four stereoisomers of 2,6-dimethyl- l-indanamine (I) can be isomerized.
  • This isomerization can be carried out as follows:
  • the metal catalyst used is preferably a palladium on carbon (Pd/C), a palladium on calcium carbonate (Pd/CaCCL) or a palladium on aluminum oxide (Pd/AhOi) catalyst with a palladium loading of 1-20% by weight.
  • the Shvo catalyst with the lUPAC name 1-hydroxytetraphenylcyclopentadienyl-(tetraphenyl-2,4-cyclopentadien-1-one)-p-hydrotetracarbonyldiruthenium(II) is also preferably used in a stoichiometry of 1-10 mol%.
  • a palladium on carbon (Pd/C) or a palladium on aluminum oxide (Pd/AhOi) catalyst with a palladium loading of 1-20% by weight.
  • a palladium on aluminum oxide (Pd/AhCL) catalyst with a palladium loading of 1-20% by weight.
  • the supported catalysts are used in an amount of 0.1-10% by weight in relation to Compounds of the formula (III) are used; 0.5-5% by weight is preferably used. The amount of catalysts used is calculated based on the dry mass of the catalysts.
  • Piperidine and sodium ethoxide or no base are particularly preferably used.
  • the preferred solvents used are toluene, xylenes, mesitylene, anisole, chlorobenzene, n-butanol, i-propanol, n-propanol and ethanol, or the reaction is carried out in the absence of a solvent.
  • Toluene, xylenes, mesitylene, n-butanol and ethanol are particularly preferred as solvents, or the reaction is carried out in the absence of a solvent.
  • the reaction is particularly preferably carried out in the absence of a solvent.
  • the reaction is preferably carried out between 0-20 bar excess pressure.
  • the reaction is particularly preferably carried out between 0-10 bar excess pressure.
  • the reaction is particularly preferably carried out between 1-6 bar excess pressure.
  • the reaction pressure is largely achieved by pressing on a gas/gas mixture. Hydrogen, nitrogen or argon or a mixture of hydrogen and nitrogen or hydrogen and argon is preferably pressed on. Hydrogen or a mixture of nitrogen and hydrogen is particularly preferably injected. Pure hydrogen is particularly preferably injected.
  • the reaction is preferably carried out at temperatures of 80-150 °C. The reaction is particularly preferably operated at 100-130 ° C. The reaction is particularly preferably operated at 110-125 ° C.
  • a further subject of the present invention is therefore also a process for producing a mixture of all four stereoisomers of 2,6-dimethyl-l-indanamine (I) by metal-catalyzed isomerization of a mixture of the three stereoisomers of (1R,2R)-, (1S,2R) - and (lS,2S)-2,6-dimethyl-1-indanamine:
  • TB culture media were prepared in demineralized water using 47.6 g/l granular medium and 4 ml/l glycerol and sterilized at 121°C for 20 min.
  • Nucleotide sequences encoding lipases and lipase variants as described herein can be synthesized as known in the art, e.g. B. as offered by relevant service providers, such as Eurofins Genomics GmbH (Eurofins Genomics GmbH, Anzinger Str. 7a, 85560 Ebersberg, Germany). Briefly, nucleic acid sequences of wild-type lipase (SEQ ID No. 2) or related variants as described herein were cloned into an expression vector based on the vector pKA81a. Genetic elements were introduced into the modified pKA81a vector using well-known methods. To express wild-type lipase or lipase variants, the expression vectors were introduced into electrocompetent Escherichia coli MG1655 cells.
  • Nucleotide substitutions have been introduced into the nucleic acid stem sequences, e.g. B. to achieve an amino acid exchange into other amino acids.
  • a useful method for producing a mutant nucleic acid and the corresponding mutant protein of the invention is site-directed mutagenesis at codons encoding one or more amino acids which are selected in advance.
  • the methods for achieving these site-directed mutations are well known to those of ordinary skill in the art and are well described in the literature (in particular: Directed Mutagenesis: A Practical Approach, 1991, edited by M.J. McPHERSON, IRL PRESS) or are methods for which commercial kits (e.g. the QUIKCHANGETM Lightning Mutagenesis Kit from Qiagen or Stratagene) can be used.
  • QUIKCHANGETM Lightning Mutagenesis Kit from Qiagen or Stratagene
  • Transformed cells were tested in appropriate biotransformation reactions to determine product yield and selectivity. Suitable biotransformation reactions are described below. Sequence verification was performed as known in the art.
  • Glycerol stocks of the E. coZZ cultures transformed with the respective expression plasmids were prepared by adding a volume of a 40% glycerol solution to a volume of an E. coZZ culture. To isolate individual bacterial colonies, appropriate dilutions of E. coZz cultures were plated on LB agar plates containing appropriate concentrations of kanamycin and incubated at 37 °C until individual colonies were obtained.
  • the stereoisomeric purity was determined to be 98.5% using a chiral HPLC measurement. This corresponds to a yield of 34% pure ethyl [(1R,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-yl]carbamate.
  • the filter cake was washed with 1 x 100 mL of toluene and then dried at 40 ° C and 10 mbar vacuum and 40 g of (lR,2S)-2,6-dimethylindane-l-amine hydrochloride in the form of a white solid and a chemical purity of 99%, determined by a quantitative 'H-NMR measurement, was obtained, which corresponds to a yield of 95%.
  • the stereoisomeric purity was determined to be 98% using chiral GC measurement.
  • a 6 mL Wheaton screw cap vial was filled with 1.0 g (lR,2S)-2,6-dimethylindan-l-amine, 39.6 mg palladium catalyst (5% Pd/AhCh). 1.47 g of diethyl carbonate and 10-20 mol% of a base. The vial was then closed with a screw cap and shaken at 90-110 °C for 6 hours at 400 rpm. It was then cooled to 21 °C and analyzed using chiral GC analysis and achiral HPLC measurement. The results are listed in tabular form.
  • the activity determines the isomerization progress starting from an isomer ratio of 0:0:0:100 up to an equilibrium ratio of 9:9:41:41 and is primarily measured by the degradation progress of the 1R,2S isomer from 100% to 41%. The activity is therefore determined from the measured proportion of a maximum of 59% degradation.
  • Chemoselectivity describes the degree of the desired components (all DMAI educt isomers and all DMAI carbamate product isomers) in relation to the sum of all components formed in the isomerization, including the secondary components. The associated data can be seen in the following Table 6:

Abstract

Described is a process for producing nearly enantiomerically pure (1R,2S)-2,6-dimethyl-1-indanamine, said process being characterized by the reaction of a mixture of the four stereoisomers of 2,6-dimethyl-1-indanamine with an acylating or carboxylating agent in the presence of a protein with lipase activity.

Description

Verfahren zur Herstellung von (lR,2S)-2,6-Dimethyl-l-indanamin Process for the preparation of (IR,2S)-2,6-dimethyl-l-indanamine
Beschreibung Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von nahezu enantiomerenreinem (lR,2S)-2,6-Dimethyl-l -indanamin, das ein wertvoller Baustein für die Synthese des herbiziden Wirkstoffs Indaziflam ist. Im speziellen betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von nahezu enantiomerenreinem (lR,2S)-2,6-Dimethyl-l-indanamin durch enzymkatalysierte, stereoselektive Acylierung racemischen 2,6-Dimethyl-l-indanamins. The present invention relates to a process for producing almost enantiomerically pure (lR,2S)-2,6-dimethyl-l-indanamine, which is a valuable building block for the synthesis of the herbicidal active ingredient indaziflam. In particular, the present invention relates to a process for the preparation of almost enantiomerically pure (IR,2S)-2,6-dimethyl-l-indanamine by enzyme-catalyzed, stereoselective acylation of racemic 2,6-dimethyl-l-indanamine.
Aus dem Stand der Technik sind bislang nur Verfahren zur Herstellung von nahezu enantiomerenreinem (lR,2S)-2,6-Dimethyl-l-indanamin bekannt, die aufgrund der Verwendung teurer Reaktionskomponenten und Katalysatoren sich nur für den Labormaßstab, nicht jedoch für einen industriellen Einsatz eignen. So offenbart WO 2004/69814 Al ein Verfahren, das durch die fünf folgenden Reaktionsschritte gekennzeichnet ist: So far, only processes for producing almost enantiomerically pure (lR,2S)-2,6-dimethyl-l-indanamine are known from the prior art, which, due to the use of expensive reaction components and catalysts, are only suitable for laboratory scale, but not for industrial scale suitable for use. WO 2004/69814 A1 discloses a process that is characterized by the following five reaction steps:
1. Herstellung einer Mischung der vier Stereoisomeren von 2,6-Dimethyl-l-aminoindan durch Palladium-katalysierte Reduktion des entsprechenden Oxims. 1. Preparation of a mixture of the four stereoisomers of 2,6-dimethyl-l-aminoindane by palladium-catalyzed reduction of the corresponding oxime.
2. Säulenchromatographische Trennung dieser vier Stereoisomeren in die cis- und trans-isomeren. 2. Column chromatographic separation of these four stereoisomers into the cis and trans isomers.
3. Umsetzung des trans-Isomerengemischs mit Methyl-2-methoxyacetat in Anwesenheit des Enzyms Novozym 435® zu dem entsprechenden acetylierten (lR,2S)-2,6-Dimethyl-l- indanamin. 3. Reaction of the trans-isomer mixture with methyl 2-methoxyacetate in the presence of the enzyme Novozym 435® to give the corresponding acetylated (lR,2S)-2,6-dimethyl-l-indanamine.
4. Isolierung des acetylierten (1 R,2S)-2,6-Dimethyl-l -indanamins. 4. Isolation of the acetylated (1 R,2S)-2,6-dimethyl-l-indanamine.
5. Saure Hydrolyse des acetylierten (lR,2S)-2,6-Dimethyl-l-indanamin zum freien (lR,2S)-2,6- Dimethyl- 1 -indanamin. 5. Acid hydrolysis of the acetylated (lR,2S)-2,6-dimethyl-l-indanamine to the free (lR,2S)-2,6-dimethyl-1-indanamine.
Tetrahedron 2007, 63 (29), 6755-6763 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von ( \ R.2S)-2.6- Dimethyl-1 -indanamin, das durch die folgenden zwei Reaktionsschritte gekennzeichnet ist: Tetrahedron 2007, 63 (29), 6755-6763 describes a process for the preparation of (\R.2S)-2.6-dimethyl-1-indanamine, which is characterized by the following two reaction steps:
1. Racemisches 1,6-Dimethylindan-l-on wird mittels eines chiralen Rutheniumkatalysators sowohl diastereoselektiv (96:4 d. r.), als auch enantioselektiv (98:2 e.r.) zum entsprechenden (1S,2S)- 2,6-Dimethylindan-l-ol in einer Ausbeute von 80% reduziert. 1. Racemic 1,6-dimethylindan-l-one is converted into the corresponding (1S,2S)-2,6-dimethylindan-l using a chiral ruthenium catalyst both diastereoselectively (96:4 d.r.) and enantioselectively (98:2 e.r.). -ol reduced in a yield of 80%.
2. Die Umsetzung des so erhaltenen ( I .S'.2.S')-2,6-Dimcthylindan- l -ol mit Diphenylphosphorylazid und anschließende Reduktion mit Lithiumaluminium-hydrid führt zu ( l /?,2.S')-2,6-Dimcthyl- l - indanamin mit einer Ausbeute von 76%. Als Nachteil dieses Verfahrens ist neben der Verwendung von teuren Reagenzien die lange Reaktionszeit von insgesamt acht Tagen anzusehen. 2. The reaction of the resulting ( I .S'.2.S')-2,6-dimcthylindan-l-ol with diphenylphosphoryl azide and subsequent reduction with lithium aluminum hydride leads to ( l /?,2.S')- 2,6-Dimcthyl- l -indanamine with a yield of 76%. A disadvantage of this process, in addition to the use of expensive reagents, is the long reaction time of a total of eight days.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von nahezu enantiomerenreinem (lR,2S)-2,6-Dimethyl-l-indanamin, das die aus dem Stand der Technik bekannten Nachteile überwindet. The object of the present invention was to provide a process for producing almost enantiomerically pure (IR,2S)-2,6-dimethyl-l-indanamine, which overcomes the disadvantages known from the prior art.
Es wurde ein Verfahren zur Herstellung von nahezu enantiomerenreinem (lR,2S)-2,6-Dimethyl-l- indanamin gefunden, das durch Umsetzung eines Gemisches der vier Stereoisomeren von 2,6-Dimethyl- 1-indanamin mit einem Acylierungs- oder Carboxy lierungsmittel in Anwesenheit eines Enzyms gekennzeichnet ist. A process for the preparation of almost enantiomerically pure (IR,2S)-2,6-dimethyl-l-indanamine has been found, which is achieved by reacting a mixture of the four stereoisomers of 2,6-dimethyl-1-indanamine with an acylation or carboxy lation agent in the presence of an enzyme.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von nahezu enantiomerenreinem (lR,2S)-2,6-Dimethyl-l-indanamin, dadurch gekennzeichnet, The subject of the present invention is a process for the production of almost enantiomerically pure (IR,2S)-2,6-dimethyl-l-indanamine, characterized in that
1. dass in einem ersten Schritt ein Gemisch der vier Stereoisomeren von 2,6-Dimethyl-l- indanamin (I) mit einem Acylierungs- oder Carboxylierungsmittel R-C(=O)R’ in Anwesenheit eines Proteins mit der Aktivität einer Lipase zu dem entsprechenden Amid oder Carbamat (II) und einem Gemisch (III) der nicht abreagierten Stereoisomeren von 2,6-Dimethyl-l-indanamine umgesetzt wird:
Figure imgf000003_0001
wobei das Protein durch eine Aminosäuresequenz kodiert wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1. that in a first step, a mixture of the four stereoisomers of 2,6-dimethyl-l-indanamine (I) with an acylating or carboxylating agent RC(=O)R' in the presence of a protein with the activity of a lipase to the corresponding Amide or carbamate (II) and a mixture (III) of the unreacted stereoisomers of 2,6-dimethyl-l-indanamine is reacted:
Figure imgf000003_0001
wherein the protein is encoded by an amino acid sequence selected from the group consisting of
I. Proteinen, die mindestens 80 %, vorzugsweise 85 %, stärker bevorzugt 90 %, noch stärker bevorzugt 95 %, noch stärker bevorzugt 96 %, noch stärker bevorzugt 97 %, besonders bevorzugt 98 %, am stärksten bevorzugt 99 % Identität zu der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz aufweisen, I. Proteins which have at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97%, particularly preferably 98%, most preferably 99% identity to the one below SEQ ID No. 1 have the amino acid sequence shown,
II. Proteinen, die mindestens 80 %, vorzugsweise 85 %, stärker bevorzugt 90 %, noch stärker bevorzugt 95 %, noch stärker bevorzugt 96 %, noch stärker bevorzugt 97 %, besonders bevorzugt 98 %, am stärksten bevorzugt 99 % Identität zu der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz aufweisen abgesehen davon, dass die Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, vorzugsweise 85 %, stärker bevorzugt 90 %, noch stärker bevorzugt 95 %, noch stärker bevorzugt 96 %, noch stärker bevorzugt 97 %, besonders bevorzugt 98 %, am stärksten bevorzugt 99 % Identität zu der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz aufweist, eine Modifizierung aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i. die Aminosäure an Position 186 ist von L verschieden; ii. die Aminosäure an Position 280 ist von L verschieden; iii. die Aminosäure an Position 312 ist von P verschieden; iv. die Aminosäure an Position 3 ist von M verschieden; v. die Aminosäure an Position 29 ist von N verschieden; vi. die Aminosäure an Position 17 ist von L verschieden; vii. die Aminosäure an Position 4 ist von S verschieden; viii. die Aminosäure an Position 18 ist von V verschieden; ix. die Aminosäure an Position 202 ist von A verschieden; x. die Aminosäure an Position 301 ist von D verschieden; xi. die Aminosäure an Position 309 ist von P verschieden; xii. die Aminosäure an Position 31 ist von Q verschieden; xiii. die Aminosäure an Position 111 ist von Q verschieden; xiv. die Aminosäure an Position 85 ist von W verschieden; xv. die Aminosäure an Position 8 ist von K verschieden; xvi. die Aminosäure an Position 79 ist von E verschieden; xvii. die Aminosäure an Position 40 ist von K verschieden; dass in einem zweiten Schritt das Amid oder Carbamat (II) durch Kristallisation von den verbliebenen 2,6-Dimethyl-l-indanaminen (III) und Nebenkomponenten getrennt wird, und dass in einem dritten Schritt das Amid oder Carbamat (II) unter Verwendung einer Säure oder einer Base zum nahezu enantiomerenreinen (lÄ,2>S)-2,6-Dimethyl-l-indanamin (IV) umgesetzt wird,
Figure imgf000005_0001
worin R einen Rest aus der Gruppe CH2OCH3, CH2OCH2CH3, CH3, OCH3, OCH2CH3, OCH(CH3)2, OCH2CH2CH2CH3 , OCH2CHCH2 und OCH2(C6H5) bedeutet, und worin R1 einen Rest aus der Gruppe OCH3, OCH2CH3, OCH(CH3)2, OCH2CH2CH2CH3, OCH2CHCH2und OCH2(C6H5) bedeutet. II. Proteins which have at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97%, particularly preferably 98%, most preferably 99% identity to the one below SEQ ID No. 1 have the amino acid sequence shown apart from the fact that the amino acid sequence is at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97%, particularly preferably 98%, most preferably 99% identity to that under SEQ ID No. 1 has a modification selected from the group consisting of i. the amino acid at position 186 is different from L; ii. the amino acid at position 280 is different from L; iii. the amino acid at position 312 is different from P; iv. the amino acid at position 3 is different from M; v. the amino acid at position 29 is different from N; vi. the amino acid at position 17 is different from L; vii. the amino acid at position 4 is different from S; viii. the amino acid at position 18 is different from V; ix. the amino acid at position 202 is different from A; x. the amino acid at position 301 is different from D; xi. the amino acid at position 309 is different from P; xii. the amino acid at position 31 is different from Q; xiii. the amino acid at position 111 is different from Q; xiv. the amino acid at position 85 is different from W; xv. the amino acid at position 8 is different from K; xvi. the amino acid at position 79 is different from E; xvii. the amino acid at position 40 is different from K; that in a second step the amide or carbamate (II) is separated from the remaining 2,6-dimethyl-l-indanamines (III) and secondary components by crystallization, and that in a third step the amide or carbamate (II) is separated using a Acid or a base is converted to the almost enantiomerically pure (lÄ,2>S)-2,6-dimethyl-l-indanamine (IV),
Figure imgf000005_0001
wherein R represents a residue from the group CH2OCH3, CH2OCH2CH3, CH3, OCH3, OCH2CH3, OCH(CH 3 )2, OCH2CH2CH2CH3, OCH2CHCH2 and OCH 2 (C6H 5 ), and wherein R 1 represents a residue from the group OCH3, OCH2CH3, OCH (CH3)2, OCH2CH2CH2CH3, OCH 2 CHCH2 and OCH 2 (C6H 5 ).
Das für das erfindungsgemäße Verfahren als Ausgangsmaterial notwendige Gemisch der vier Stereoisomeren von 2,6-Dimethyl-l-indanamin (I) ist bekannt und kann beispielsweise wie in WO 2004/69814 beschrieben hergestellt werden. The mixture of the four stereoisomers of 2,6-dimethyl-l-indanamine (I) required as starting material for the process according to the invention is known and can be prepared, for example, as described in WO 2004/69814.
Bevorzugt bedeutet R einen Rest aus der Gruppe OCH3 und OCH2CH3, und R preferably means a radical from the group OCH3 and OCH2CH3, and
R1 bedeutet einen Rest aus der Gruppe OCH3 und OCH2CH3. R 1 means a residue from the group OCH3 and OCH2CH3.
Im erfindungsgemäßen Verfahren werden Proteine mit der Aktivität eines lipolytischen Enzyms bzw. einer Lipase eingesetzt. In the process according to the invention, proteins with the activity of a lipolytic enzyme or a lipase are used.
SEQ ID No. 1 stellt die Aminosäuresequenz eines lipolytischen Wildtyp-Proteins dar. Die Wildtyp- Lipase ist abgeleitet von einem nicht kultivierten Bakterium aus einer Umweltprobe, die abgeleitet werden kann von GenPept (PDB) unter der Zugangsnr. QRD81023 (Version ORD81023.1). Im Zweifelsfall zwischen der in SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz und der in dem obigen Datenbankeintrag gezeigten Sequenz hat SEQ ID No. 1 Vorrang. SEQ ID No. 1 represents the amino acid sequence of a wild-type lipolytic protein. The wild-type lipase is derived from an uncultured bacterium from an environmental sample that can be derived from GenPept (PDB) under accession no. QRD81023 (version ORD81023.1). In case of doubt between the one in SEQ ID No. 1 and the sequence shown in the database entry above has SEQ ID No. 1 priority.
Weiterhin beschrieben sind Proteine mit der Aktivität eines lipolytischen Enzyms bzw. einer Lipase, wobei die Aminosäuresequenzen dieser Proteine Varianten eines bekannten Proteins darstellen, das die Aktivität eines lipolytischen Enzyms bzw. einer Lipase aufweist. Insbesondere stellen die hierin beschriebenen Aminosäuresequenzen von Proteinen mit der Aktivität einer Lipase Varianten der durch die in SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäure dargestellten Aminosäuresequenz dar, wobei in der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz mindestens die Aminosäure an Position 186, die Aminosäure an Position 280, die Aminosäure an Position 312, die Aminosäure an Position 3, die Aminosäure an Position 29, die Aminosäure an Position 17, die Aminosäure an Position 4, die Aminosäure an Position 18, die Aminosäure an Position 202, die Aminosäure an Position 301, die Aminosäure an Position 309, die Aminosäure an Position 31, die Aminosäure an Position 111, die Aminosäure an Position 85, die Aminosäure an Position 8, die Aminosäure an Position 79 oder die Aminosäure an Position 40 von der Aminosäure verschieden ist, die an der entsprechenden Aminosäureposition in der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Sequenz vorliegt. Also described are proteins with the activity of a lipolytic enzyme or a lipase, the amino acid sequences of these proteins representing variants of a known protein that has the activity of a lipolytic enzyme or a lipase. In particular, the amino acid sequences of proteins with the activity of a lipase described herein represent variants of those described in SEQ ID no. 1 amino acid sequence shown, whereby in the under SEQ ID No. 1 shown amino acid sequence at least the amino acid at position 186, the amino acid at position 280, the amino acid at position 312, the amino acid at position 3, the Amino acid at position 29, the amino acid at position 17, the amino acid at position 4, the amino acid at position 18, the amino acid at position 202, the amino acid at position 301, the amino acid at position 309, the amino acid at position 31, the amino acid at Position 111, the amino acid at position 85, the amino acid at position 8, the amino acid at position 79 or the amino acid at position 40 is different from the amino acid at the corresponding amino acid position in the SEQ ID no. 1 sequence shown is present.
Der Begriff „Variante”, wie er hier verwendet wird, bedeutet einen Gegenstand, der von einem nach dem Stand der Technik bekannten Gegenstand verschieden ist. In Bezug auf Nukleinsäuremoleküle und Proteine wird unter Varianten eine Nukleinsäuresequenz bzw. eine Aminosäuresequenz verstanden, die von entsprechend bekannten Sequenzen abweicht, die aber für ein Protein kodiert, das die gleiche Funktion hat oder die gleiche Reaktion katalysiert, z. B. die Funktion, für ein Protein mit der Aktivität einer Eipase zu kodieren. „Abweichung“ von Nukleinsäuremolekülsequenzen und Aminosäuresequenzen von bekannten Nukleinsäuresequenzen und Proteinsequenzen bedeutet, dass die Sequenzen Substitutionen (Ersetzungen) und/oder Deletionen und/oder Insertionen von Nukleotiden bzw. Aminosäuren im Vergleich zu den entsprechenden bekannten Nukleinsäuresequenzen oder Aminosäuresequenzen umfassen. The term “variant” as used herein means an item that is different from an item known in the art. With regard to nucleic acid molecules and proteins, variants are understood to mean a nucleic acid sequence or an amino acid sequence that differs from corresponding known sequences, but which codes for a protein that has the same function or catalyzes the same reaction, e.g. B. the function of encoding a protein with the activity of an eipase. “Divergence” of nucleic acid molecule sequences and amino acid sequences from known nucleic acid sequences and protein sequences means that the sequences include substitutions (replacements) and/or deletions and/or insertions of nucleotides or amino acids in comparison to the corresponding known nucleic acid sequences or amino acid sequences.
Üblicherweise werden Proteine mit der Aktivität einer Eipase eingesetzt, wobei die Proteine durch eine Aminosäuresequenz kodiert sind, die mindestens 80 %, vorzugsweise 85 %, stärker bevorzugt 90 %, noch stärker bevorzugt 95 %, noch stärker bevorzugt 96 %, noch stärker bevorzugt 97 %, besonders bevorzugt 98 %, am stärksten bevorzugt 99 % Identität zu der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz aufweisen. Proteins with the activity of an eipase are usually used, the proteins being encoded by an amino acid sequence which is at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97%. , particularly preferably 98%, most preferably 99% identity to that under SEQ ID No. 1 have amino acid sequence shown.
Ebenfalls eingesetzt werden Proteine mit der Aktivität einer Lipase eingesetzt, wobei die Proteine durch eine Aminosäuresequenz kodiert sind, die mindestens 80 %, vorzugsweise 85 %, stärker bevorzugt 90 %, noch stärker bevorzugt 95 %, noch stärker bevorzugt 96 %, noch stärker bevorzugt 97 %, besonders bevorzugt 98 %, am stärksten bevorzugt 99 % Identität zu der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz aufweist, abgesehen davon, dass die Aminosäuresequenz, die mindestens 80 %, vorzugsweise 85 %, stärker bevorzugt 90 %, noch stärker bevorzugt 95 %, noch stärker bevorzugt 96 %, noch stärker bevorzugt 97 %, besonders bevorzugt 98 %, am stärksten bevorzugt 99 % Identität zu der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz aufweist, eine Modifizierung aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i. die Aminosäure an Position 186 ist von L verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 186 F, W, Y, E, D, Q, T, H, P, C, K, S, N, I oder V, stärker bevorzugt ist die Aminosäure an Position 186 F, W, Y, E, D oder K, besonders bevorzugt ist die Aminosäure an Position 186 W oder Y, am stärksten bevorzugt ist die Aminosäure an Position 186 Y; ii.die Aminosäure an Position 280 ist von L verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 280 E, S, K, D oder A, stärker bevorzugt ist die Aminosäure an Position 280 A; iii. die Aminosäure an Position 312 ist von P verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 312 N, F, D, Q oder K, stärker bevorzugt ist die Aminosäure an Position 312 N; iv. die Aminosäure an Position 3 ist von M verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 3 L, Q oder C, stärker bevorzugt ist die Aminosäure an Position 3 Q; v.die Aminosäure an Position 29 ist von N verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 29 H, W oder Y, stärker bevorzugt ist die Aminosäure an Position 29 H oder W, am stärksten bevorzugt ist die Aminosäure an Position 29 H; vi. die Aminosäure an Position 17 ist von L verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 17 P oder T, stärker bevorzugt ist die Aminosäure an Position 17 P; vii. die Aminosäure an Position 4 ist von S verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 4 P oder L, stärker bevorzugt ist die Aminosäure an Position 4 P; viii. die Aminosäure an Position 18 ist von V verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 18 A, T, C oder S, stärker bevorzugt ist die Aminosäure an Position 18 A oder C; ix. die Aminosäure an Position 202 ist von A verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 202 Q oder N. Stärker bevorzugt ist die Aminosäure an Position 202 N; x.die Aminosäure an Position 301 ist von D verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 301 A; xi. die Aminosäure an Position 309 ist von P verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 309 C; xii. die Aminosäure an Position 31 ist von Q verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 31 W; xiii. die Aminosäure an Position 111 ist von Q verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 111 E; xiv. die Aminosäure an Position 85 ist von W verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 85 H; xv. die Aminosäure an Position 8 ist von K verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 8 E; xvi. die Aminosäure an Position 79 ist von K verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 79 S, I oder W, stärker bevorzugt ist die Aminosäure an Position 79 S; xvii. die Aminosäure an Position 40 ist von K verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 40 M. Proteins with the activity of a lipase are also used, the proteins being encoded by an amino acid sequence which is at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97 %, particularly preferably 98%, most preferably 99% identity to that under SEQ ID No. 1, except that the amino acid sequence is at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97%, particularly preferably 98% strongest preferred 99% identity to that under SEQ ID No. 1 has a modification selected from the group consisting of i. the amino acid at position 186 is different from L, preferably the amino acid at position 186 is F, W, Y, E, D, Q, T, H, P, C, K, S, N, I or V, more preferably the amino acid at position 186 F, W, Y, E, D or K, particularly preferred is the amino acid at position 186 W or Y, most preferred is the amino acid at position 186 Y; ii.the amino acid at position 280 is different from L, preferably the amino acid at position 280 is E, S, K, D or A, more preferably the amino acid at position 280 is A; iii. the amino acid at position 312 is different from P, preferably the amino acid at position 312 is N, F, D, Q or K, more preferably the amino acid at position 312 is N; iv. the amino acid at position 3 is different from M, preferably the amino acid at position 3 is L, Q or C, more preferably the amino acid at position 3 is Q; v.the amino acid at position 29 is different from N, preferably the amino acid at position 29 is H, W or Y, more preferably the amino acid at position 29 is H or W, most preferably the amino acid at position 29 is H; vi. the amino acid at position 17 is different from L, preferably the amino acid at position 17 is P or T, more preferably the amino acid at position 17 is P; vii. the amino acid at position 4 is different from S, preferably the amino acid at position 4 is P or L, more preferably the amino acid at position 4 is P; viii. the amino acid at position 18 is different from V, preferably the amino acid at position 18 is A, T, C or S, more preferably the amino acid at position 18 is A or C; ix. the amino acid at position 202 is different from A, preferably the amino acid at position 202 is Q or N. More preferably the amino acid at position 202 is N; x.the amino acid at position 301 is different from D, preferably the amino acid at position 301 is A; xi. the amino acid at position 309 is different from P, preferably the amino acid at position 309 is C; xii. the amino acid at position 31 is different from Q, preferably the amino acid at position 31 is W; xiii. the amino acid at position 111 is different from Q, preferably the amino acid at position 111 is E; xiv. the amino acid at position 85 is different from W, preferably the amino acid at position 85 is H; xv. the amino acid at position 8 is different from K, preferably the amino acid at position 8 is E; xvi. the amino acid at position 79 is different from K, preferably the amino acid at position 79 is S, I or W, more preferably the amino acid at position 79 is S; xvii. the amino acid at position 40 is different from K, preferably the amino acid at position 40 is M.
Die Bedeutung der Aminosäureabkürzungen A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T V, W, Y kann hierin nachfolgend in der Tabelle 2 im Abschnitt mit dem Titel „Beschreibung der Sequenzen“ abgeleitet werden. The meaning of the amino acid abbreviations A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, TV, W, Y can be found below in Table 2 in Section entitled “Description of the sequences”.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform bezieht sich auf Proteine mit der Aktivität einer Lipase, wobei die Proteine ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus a) Proteinen, die die in SEQ ID No. 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfassen, abgesehen davon, dass die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist; b) Proteinen mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 80 %, vorzugsweise 85 %, stärker bevorzugt 90 %, noch stärker bevorzugt 95 %, noch stärker bevorzugt 96 %, noch stärker bevorzugt 97 %, besonders bevorzugt 98 %, am stärksten bevorzugt 99 % Identität zu der unter a) gezeigten Aminosäuresequenz, sofern die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist. A further embodiment according to the invention relates to proteins with the activity of a lipase, the proteins being selected from the group consisting of a) proteins which are those in SEQ ID No. 1, except that the amino acid at position 186 is different from L; b) proteins with an amino acid sequence with at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97%, particularly preferably 98%, most preferably 99% identity the amino acid sequence shown under a), provided that the amino acid at position 186 is different from L.
Vorzugsweise ist die Aminosäure in den Proteinen gemäß a) oder b) an Position 186 F, W, Y, E, D, Q, T, H, P, C, K, S, N, I oder V. Stärker bevorzugt ist die Aminosäure an Position 186 F, W, Y, E, D oder K. Besonders bevorzugt ist die Aminosäure an Position 186 W oder Y. Am stärksten bevorzugt ist die Aminosäure an Position 186 Y. Preferably, the amino acid in the proteins according to a) or b) at position 186 is F, W, Y, E, D, Q, T, H, P, C, K, S, N, I or V. More preferred is Amino acid at position 186 F, W, Y, E, D or K. Particularly preferred is the amino acid at position 186 W or Y. Most preferred is the amino acid at position 186 Y.
Eine „Aminosäure, die Position X entspricht“ in einer ersten Aminosäuresequenz (z. B. Position 3 in SEQ ID No. 1) bedeutet hierin, dass eine Aminosäure einer zweiten Aminosäuresequenz, verglichen mit der ersten Aminosäuresequenz, an Position x der ersten Aminosäuresequenz in einem paarweisen Sequenzabgleich der ersten Aminosäuresequenz mit der zweiten Aminosäuresequenz erscheint, falls die Nummerierung der Aminosäuren der zweiten Aminosäuresequenz von der Aminosäurenummerierung der ersten Aminosäuresequenz abweicht. As used herein, an “amino acid corresponding to position a pairwise sequence alignment of the first amino acid sequence with the second amino acid sequence appears if the Numbering of the amino acids of the second amino acid sequence differs from the amino acid numbering of the first amino acid sequence.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ist unter dem Begriff „Identität“ in Bezug auf Sequenzidentität oder identische Sequenzen die Anzahl identischer Aminosäuren oder Nukleotide zu verstehen, die über die gesamte Sequenzlänge einer ersten Nuklein- oder Aminosäuresequenz mit einer anderen (zweiten) Nuklein- bzw. Aminosäuresequenz gemeinsam hat, ausgedrückt in Prozent. In the context of the present invention, the term “identity” in relation to sequence identity or identical sequences is to be understood as meaning the number of identical amino acids or nucleotides that are shared with another (second) nucleic or amino acid sequence over the entire sequence length of a first nucleic or amino acid sequence. Amino acid sequence in common, expressed as a percentage.
„Sequenzidentität“ kann durch Abgleich von zwei Aminosäure- oder zwei Nukleotidsequenzen unter Verwendung globaler oder lokaler Abgleichalgorithmen bestimmt werden, wie beispielsweise enthalten in bekannter Software wie GAP oder BESTFIT oder dem Emboss-Programm „Needle“. Diese Software verwendet den globalen Abgleichalgorithmus von Needleman und Wunsch, um zwei Sequenzen über ihre gesamte Länge abzugleichen, die Anzahl der Übereinstimmungen zu maximieren und die Anzahl der Lücken zu minimieren. Im Allgemeinen werden die Standardparameter verwendet, mit einem Gap Creation Penalty = 10 und einem Gap Extension Penalty = 0,5 (sowohl für Nukleotid- als auch für Proteinabgleich). Für Nukleotide ist die verwendete standardmäßige Bewertungsmatrix DNAFULL und für Proteine ist die standardmäßige Bewertungsmatrix Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 10915-10919). Sequenzabgleiche und Bewertungen für die prozentuale Sequenzidentität können zum Beispiel unter Verwendung von Software wie EMBOSS bestimmt werden, verfügbar auf der Website des EBI (ebi.ac.uk/Tools/emboss/). Alternativ dazu kann die Sequenzähnlichkeit oder -Identität durch Suche in Datenbanken (z. B. EMBL, GenBank) unter Verwendung allgemein bekannter Algorithmen und Ausgabeformate wie FASTA, BLAST usw. bestimmt werden, aber vorzugsweise sollten Treffer abgerufen und paarweise abgeglichen werden, um Sequenzidentität abschließend zu bestimmen. “Sequence identity” can be determined by aligning two amino acid or two nucleotide sequences using global or local alignment algorithms, such as those contained in well-known software such as GAP or BESTFIT or the emboss program “Needle”. This software uses the Needleman and Wunsch global matching algorithm to match two sequences over their entire length, maximizing the number of matches and minimizing the number of gaps. In general, the default parameters are used, with a gap creation penalty = 10 and a gap extension penalty = 0.5 (for both nucleotide and protein matching). For nucleotides, the default scoring matrix used is DNAFULL and for proteins, the default scoring matrix is Blosum62 (Henikoff & Henikoff, 1992, PNAS 89, 10915-10919). Sequence alignments and percent sequence identity scores can be determined, for example, using software such as EMBOSS, available on the EBI website (ebi.ac.uk/Tools/emboss/). Alternatively, sequence similarity or identity can be determined by searching databases (e.g. EMBL, GenBank) using well-known algorithms and output formats such as FASTA, BLAST, etc., but preferably hits should be retrieved and matched pairwise to conclude sequence identity to determine.
Sind miteinander zu vergleichende Sequenzen unterschiedlich lang, so ist die Identität durch Bestimmung der Identität in Prozent der Anzahl der Aminosäuren bzw. Nukleotide zu bestimmen, die die kürzere Sequenz mit der längeren Sequenz gemeinsam hat. Vorzugsweise wird die Identität mithilfe des bekannten und öffentlich verfügbaren Computerprogramms ClustalW (Thompson et al„ Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680) bestimmt. ClustalW ist öffentlich verfügbar von Julie Thompson (Thompson® EMBL-Heidelberg.DE) und Toby Gibson (Gibson@EMBL-Heidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstraße 1, D 69117 Heidelberg, Deutschland. ClustalW kann ferner von verschiedenen Internetseiten heruntergeladen werden, wie etwa von IGBMC (Institut de Genetique et de Biologie Moleculaire et Cellulaire, B.P.163, 67404 Illkirch Cedex, Frankreich; ftp://ftp- igbmc.u-strasbg.fr/pub/) sowie von EBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/) sowie von den gespiegelten Internetseiten des EBI (European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK). Vorzugsweise wird das Computerprogramm ClustalW in der Version 1.8 verwendet, um die Identität zwischen im Kontext der vorliegenden Erfindung beschriebenen Proteinen und anderen Proteinen zu bestimmen. Hierbei müssen die Parameter folgendermaßen eingestellt werden: KTUPLE=1, T0PDIAG=5, WIND0W=5, PAIRGAP=3, GAPOPEN=10, GAPEXTEND=0.05, GAPDIST=8, MAXDIV=40, MATRIX=GONNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP, NOHGAP. If sequences to be compared are of different lengths, the identity must be determined by determining the identity as a percentage of the number of amino acids or nucleotides that the shorter sequence has in common with the longer sequence. The identity is preferably determined using the known and publicly available computer program ClustalW (Thompson et al. Nucleic Acids Research 22 (1994), 4673-4680). ClustalW is publicly available from Julie Thompson (Thompson® EMBL-Heidelberg.DE) and Toby Gibson (Gibson@EMBL-Heidelberg.DE), European Molecular Biology Laboratory, Meyerhofstraße 1, D 69117 Heidelberg, Germany. ClustalW can also be downloaded from various websites, such as IGBMC (Institut de Genetique et de Biology Moleculaire et Cellulaire, BP163, 67404 Illkirch Cedex, France; ftp://ftp-igbmc.u-strasbg.fr/pub/) as well from EBI (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/software/) and from the mirrored websites of EBI (European Bioinformatics Institute, Wellcome Trust Genome Campus, Hinxton, Cambridge CB10 1SD, UK). Preferably, the computer program ClustalW version 1.8 is used to determine the identity between proteins described in the context of the present invention and other proteins. The parameters must be set as follows: KTUPLE=1, T0PDIAG=5, WIND0W=5, PAIRGAP=3, GAPOPEN=10, GAPEXTEND=0.05, GAPDIST=8, MAXDIV=40, MATRIX=GONNET, ENDGAPS(OFF), NOPGAP , NOHGAP.
Vorzugsweise wird das Computerprogramm ClustalW in der Version 1.8 verwendet, um die Identität beispielsweise zwischen der Nukleotidsequenz der im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung beschriebenen Nukleinsäuremoleküle und der Nukleotidsequenz anderer Nukleinsäuremoleküle zu bestimmen. Hierbei müssen die Parameter folgendermaßen eingestellt werden: The computer program ClustalW version 1.8 is preferably used to determine the identity, for example, between the nucleotide sequence of the nucleic acid molecules described in connection with the present invention and the nucleotide sequence of other nucleic acid molecules. The parameters must be set as follows:
KTUPLE=2, TOPDIAGS=4, PAIRGAP=5, DNAMATRIX :IUB, GAPOPEN=10, GAPEXT=5, MAXDIV=40, TRANSITIONS: ungewichtet. KTUPLE=2, TOPDIAGS=4, PAIRGAP=5, DNAMATRIX :IUB, GAPOPEN=10, GAPEXT=5, MAXDIV=40, TRANSITIONS: unweighted.
„Identität“ bedeutet ferner, dass eine funktionelle und/oder strukturelle Äquivalenz zwischen den betreffenden Nukleinsäuremolekülen bzw. den Proteinen, für die sie kodieren, besteht. Funktionelle Äquivalenz bedeutet, dass die Nukleinsäuremolekülsequenzen oder die Aminosäuresequenzen für ein Protein mit der Aktivität einer Lipase kodieren. Die Nukleinsäuremoleküle, die homolog zu den oben beschriebenen Molekülen sind und Derivate dieser Moleküle darstellen, sind im Allgemeinen Varianten dieser Moleküle, die Modifikationen darstellen, welche dieselbe biologische Funktion haben oder dieselbe Reaktion katalysieren, d. h. für ein Protein mit der Aktivität einer Eipase kodieren. Diese können entweder natürlich auftretende Varianten sein, zum Beispiel Sequenzen von anderen Spezies, oder Mutationen, wobei diese Mutationen auf eine natürliche Weise aufgetreten sein können oder durch gezielte Mutagenese eingeführt wurden. Darüber hinaus können die Varianten synthetisch hergestellte Sequenzen sein. Die allelischen Varianten können entweder natürlich vorkommende Varianten oder synthetisch hergestellte Varianten oder durch rekombinante DNA-Techniken erzeugte Varianten sein. Entscheidend für die vorliegende Erfindung ist jedoch, dass diese Varianten für Proteine mit Lipaseaktivität kodieren und die hier beschriebenen Aminosäuresubstitutionen (Ersetzungen), Deletionen oder Insertionen bezüglich der erfindungsgemäßen Proteine umfassen. “Identity” also means that there is functional and/or structural equivalence between the relevant nucleic acid molecules or the proteins they encode. Functional equivalence means that the nucleic acid molecule sequences or the amino acid sequences code for a protein with the activity of a lipase. The nucleic acid molecules that are homologous to the molecules described above and are derivatives of these molecules are generally variants of these molecules that represent modifications that have the same biological function or catalyze the same reaction, i.e. H. code for a protein with the activity of an eipase. These can either be naturally occurring variants, for example sequences from other species, or mutations, where these mutations may have occurred naturally or were introduced through targeted mutagenesis. In addition, the variants can be synthetically produced sequences. The allelic variants can be either naturally occurring variants or synthetically produced variants or variants generated by recombinant DNA techniques. What is crucial for the present invention, however, is that these variants code for proteins with lipase activity and include the amino acid substitutions (replacements), deletions or insertions described here with respect to the proteins according to the invention.
Eine besondere Art von Derivaten sind beispielsweise Nukleinsäuremoleküle, die sich von den im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Nukleinsäuremolekülen durch die Degeneration des genetischen Codes unterscheiden. A special type of derivatives are, for example, nucleic acid molecules, which differ from the nucleic acid molecules described in the context of the present invention by the degeneration of the genetic code.
Laut NC-IUBMB (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology) gehören Lipasen zur Klasse der Hydrolasen (EC 3). Hydrolase ist eine Klasse von Enzymen, die üblicherweise als biochemische Katalysatoren fungieren und Wasser verwenden, um eine chemische Bindung aufzubrechen, was typischerweise zur Aufteilung eines größeren Moleküls in kleinere Moleküle führt. Die Gruppe der Hydrolasen umfasst auf Esterbindungen wirkende Enzyme (EC 3.1), wie etwa Carbonsäureesterhydrolasen (EC 3.1.1) und als Untergruppe Lipasen (EC 3.1.1.3). Lipasen sind von Pflanzen, Säugetieren und Mikroorganismen identifiziert worden, z. B. Pseudomonas, Vibrio, Acinetobacter, Burkholderia, Chromobacterium, Cutinase von Fusarium solani (FSC), Candida antarctica A (CalA), Rhizopus oryzae (ROL), Thermomyces lanuginosus (TLL), Rhizomucor miehei (RML), Aspergillus Niger, Fusarium heterosporum, Fusarium oxysporum oder Fusarium culmorum. According to NC-IUBMB (Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology), lipases belong to the class of hydrolases (EC 3). Hydrolase is a class of enzymes that commonly act as biochemical catalysts and use water to break a chemical bond, typically resulting in the division of a larger molecule into smaller molecules. The group of hydrolases includes enzymes acting on ester bonds (EC 3.1), such as carboxylic acid ester hydrolases (EC 3.1.1) and, as a subgroup, lipases (EC 3.1.1.3). Lipases have been identified from plants, mammals and microorganisms, e.g. B. Pseudomonas, Vibrio, Acinetobacter, Burkholderia, Chromobacterium, cutinase of Fusarium solani (FSC), Candida antarctica A (CalA), Rhizopus oryzae (ROL), Thermomyces lanuginosus (TLL), Rhizomucor miehei (RML), Aspergillus Niger, Fusarium heterosporum , Fusarium oxysporum or Fusarium culmorum.
Wenn ein Protein die Aktivität einer Lipase aufweist, kann dies mit nach dem Stand der Technik bekannten und beschriebenen Verfahren nachgewiesen werden. Es ist nicht entscheidend, welches Verfahren eingesetzt wird, um nachzuweisen, ob ein erfindungsgemäßes Protein die Aktivität einer Lipase aufweist. Vorzugsweise wird in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung das Verfahren im Abschnitt „Beispiel“ beschrieben. If a protein has the activity of a lipase, this can be detected using methods known and described in the art. It is not crucial which method is used to demonstrate whether a protein according to the invention has the activity of a lipase. Preferably, in connection with the present invention, the method is described in the “Example” section.
Erfindungsgemäße Lipasevariantenproteine können weitere Aminosäuremodifikationen (Aminosäuresubstitutionen, -deletionen oder -insertionen) im Vergleich zu den hierin oben beschriebenen Aminosäuresequenzen in Bezug auf die unter SEQ ID No. 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweisen. Lipase variant proteins according to the invention can have further amino acid modifications (amino acid substitutions, deletions or insertions) compared to the amino acid sequences described above in relation to those under SEQ ID No. 1 have amino acid sequence shown.
Zusätzlich zu den hierin oben unter Punkt a) in Bezug auf die unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenzen beschriebenen Lipasevarianten können mindestens eine, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben weitere Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 oder 111 aufweisen. Anders ausgedrückt ist das erfindungsgemäße Protein mit der Aktivität einer Lipase ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Proteinen, die die in SEQ ID No. 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfassen, abgesehen davon, dass die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und dass sie mindestens eine, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben oder mehr weitere Aminosäuresubstitutionen aufweisen, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (i) die Aminosäure an Position 79 ist von E verschieden; (ii) die Aminosäure an Position 202 ist von A verschieden; (iii) die Aminosäure an Position 280 ist von L verschieden; (iv) die Aminosäure an Position 301 ist von D verschieden; (v) die Aminosäure an Position 3 ist von M verschieden; (vi) die Aminosäure an Position 11 ist von C verschieden; (vii) die Aminosäure an Position 17 ist von L verschieden; (viii) die Aminosäure an Position 40 ist von K verschieden; (ix) die Aminosäure an Position 111 ist von Q verschieden; und b) Proteinen mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 80 %, vorzugsweise 85 %, stärker bevorzugt 90 %, noch stärker bevorzugt 95 %, noch stärker bevorzugt 96 %, noch stärker bevorzugt 97 %, besonders bevorzugt 98 %, am stärksten bevorzugt 99 % Identität zu der direkt hierüber unter a) gezeigten Aminosäuresequenz, sofern die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und mit mindestens einer weiteren Aminosäuresubstitution, ausgewählt aus den direkt hierüber erwähnten Gruppen (i) bis (ix). Vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 79 S, W oder I, stärker bevorzugt S; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 202 N; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 280 A; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 301 A; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 3 Q; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 11 A; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 17 P; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 40 M; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 111 E. In addition to the above under point a) with regard to those under SEQ ID No. The lipase variants described in the amino acid sequences shown in FIG. 1 can have at least one, two, three, four, five, six, seven further amino acid substitutions at positions 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 or 111. In other words, the protein according to the invention with the activity of a lipase is selected from the group consisting of a) proteins which are those in SEQ ID No. 1, except that the amino acid at position 186 is different from L and that they have at least one, two, three, four, five, six, seven or more other amino acid substitutions selected from the group consisting of (i) the amino acid at position 79 is different from E; (ii) the amino acid at position 202 is different from A; (iii) the amino acid at position 280 is different from L; (iv) the amino acid at position 301 is different from D; (v) the amino acid at position 3 is different from M; (vi) the amino acid at position 11 is different from C; (vii) the amino acid at position 17 is different from L; (viii) the amino acid at position 40 is different from K; (ix) the amino acid at position 111 is different from Q; and b) proteins having an amino acid sequence with at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97%, particularly preferably 98%, most preferably 99% identity to the amino acid sequence shown directly above under a), provided that the amino acid at position 186 is different from L and with at least one further amino acid substitution, selected from the groups (i) to (ix) mentioned directly above. Preferably the amino acid at position 79 is S, W or I, more preferably S; preferably the amino acid at position 202 is N; preferably the amino acid at position 280 is A; preferably the amino acid at position 301 is A; preferably is the amino acid at position 3 Q; preferably the amino acid at position 11 is A; preferably the amino acid at position 17 is P; preferably the amino acid at position 40 is M; preferably the amino acid at position 111 is E.
Darüber hinaus können erfindungsgemäße Lipasevariantenproteine abgesehen von den weiteren Aminosäuremodifizierungen zusätzliche Aminosäuresubstitutionen im Vergleich zu den hierin oben beschriebenen Aminosäuresequenzen in Bezug auf die unter SEQ ID No. 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweisen. Diese zusätzlichen Aminosäuresubstitutionen beziehen sich auf Positionen der Aminosäuresequenz, die von der Position / den Positionen 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 oder 111 verschieden sind, die sich auf die weiteren Aminosäuremodifizierungen beziehen. Die hierin oben unter Punkt a) in Bezug auf die unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenzen beschriebenen Lipasevarianten können mindestens eine, zwei, drei, vier, fünf, sechs, sieben oder mehr zusätzliche Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 4, 8, 18, 29, 31, 42, 84, 85, 192, 217, 309 oder 312 aufweisen. Die Aminosäure an Position 4 ist von S verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an dieser Position P. Die Aminosäure an Position 8 ist von K verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an dieser Position E. Die Aminosäure an Position 18 ist von V verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an dieser Position C. Die Aminosäure an Position 29 ist von N verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an dieser Position W oder H. Die Aminosäure an Position 31 ist von Q verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an dieser Position W. Die Aminosäure an Position 42 ist von L verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an dieser Position D. Die Aminosäure an Position 84 ist von N verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an dieser Position T. Die Aminosäure an Position 85 ist von W verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an dieser Position H. Die Aminosäure an Position 192 ist von F verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an dieser Position A oder V. Die Aminosäure an Position 217 ist von Q verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an dieser Position M. Die Aminosäure an Position 309 ist von P verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an dieser Position C. Die Aminosäure an Position 312 ist von P verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an dieser Position N. In addition, apart from the further amino acid modifications, lipase variant proteins according to the invention can contain additional amino acid substitutions compared to the amino acid sequences described above in relation to those under SEQ ID No. 1 have amino acid sequence shown. These additional amino acid substitutions refer to positions of the amino acid sequence that are different from position(s) 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 or 111, which relate to the further amino acid modifications. The information contained herein above under point a) in relation to those under SEQ ID No. 1 shown amino acid sequences may have at least one, two, three, four, five, six, seven or more additional amino acid substitutions at positions 4, 8, 18, 29, 31, 42, 84, 85, 192, 217, 309 or 312 exhibit. The amino acid at position 4 is different from S, preferably the amino acid at this position is P. The amino acid at position 8 is different from K, preferably the amino acid at this position is E. The amino acid at position 18 is different from V, preferably is the amino acid at this position is C. The amino acid at position 29 is different from N, preferably the amino acid at this position is W or H. The amino acid at position 31 is different from Q, preferably the amino acid at this position is W. The amino acid at Position 42 is different from L, preferably the amino acid at this position is D. The amino acid at position 84 is different from N, preferably the amino acid at this position is T. The amino acid at position 85 is different from W, preferably the amino acid is at this position is H. The amino acid at position 192 is different from F, preferably the amino acid at this position is A or V. The amino acid at position 217 is different from Q, preferably the amino acid at this position is M. The amino acid at position 309 is different from P, preferably the amino acid at this position is C. The amino acid at position 312 is different from P, preferably the amino acid at this position is N.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform bezieht sich demnach auf erfindungsgemäße Proteine, die weitere Aminosäuremodifizierungen aufweisen, vorzugsweise sind diese Ausführungsformen Proteine mit der Aktivität einer Lipase, wobei die Proteine ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus: A further embodiment according to the invention therefore relates to proteins according to the invention which have further amino acid modifications, preferably these embodiments are proteins with the activity of a lipase, the proteins being selected from the group consisting of:
Proteinen, die die in SEQ ID No. 1 gezeigte Aminosäuresequenz aufweisen, mit der Ausnahme, dass Proteins that are in SEQ ID No. 1 have the amino acid sequence shown, except that
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y, stärker bevorzugt Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist; - die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, more preferably Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S , W or I, more preferably S; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 3 is preferably Q;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 11 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y and that the amino acid at position 17 is preferably P;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- Proteine mit einer Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80 %, vorzugsweise 85 %, stärker bevorzugt 90 %, noch stärker bevorzugt 95 %, noch stärker bevorzugt 96 %, noch stärker bevorzugt 97 %, besonders bevorzugt 98 %, am stärksten bevorzugt 99 % identisch sind mit der unter a) gezeigten Aminosäuresequenz, sofern die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass sie Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und wobei die Proteine mindestens eine weitere Aminosäuresubstitution aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, die unter den aufgelisteten Zeichen direkt hierüber gezeigt ist. Vorzugsweise können die hierin oben unter Punkt a) in Bezug auf die unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenzen beschriebenen Lipasevarianten mindestens zwei weitere Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 oder 111 aufweisen. Vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 79 S, W oder I, stärker bevorzugt S; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 202 N; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 280 A; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 301 A; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 3 Q; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 11 A; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 17 P; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 40 M; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 111 E. - Proteins with an amino acid sequence that is at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97%, particularly preferably 98%, most preferably 99% identical are with the amino acid sequence shown under a), provided that the amino acid at position 186 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and wherein the proteins have at least one further amino acid substitution selected from the group , which is shown below the listed characters directly above this. Preferably, those described above under point a) can be referred to under SEQ ID No. 1 have at least two further amino acid substitutions at positions 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 or 111. Preferably the amino acid at position 79 is S, W or I, more preferably S; preferably the amino acid at position 202 is N; preferably the amino acid at position 280 is A; preferably the amino acid at position 301 is A; preferably the amino acid at position 3 is Q; preferably the amino acid at position 11 is A; preferably the amino acid at position 17 is P; preferably the amino acid at position 40 is M; preferably the amino acid at position 111 is E.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform bezieht sich demnach auf erfindungsgemäße Proteine, die weitere Aminosäuremodifizierungen aufweisen, vorzugsweise sind diese Ausführungsformen Proteine mit der Aktivität einer Lipase, wobei die Proteine ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Proteinen mit der in SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz, mit der Ausnahme, dass A further embodiment according to the invention therefore relates to proteins according to the invention which have further amino acid modifications, preferably these embodiments are proteins with the activity of a lipase, the proteins being selected from the group consisting of proteins with the in SEQ ID No. 1 amino acid sequence shown, except that
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 202 is different from A, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and the amino acid at position 202 is preferably N;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 280 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and the amino acid at position 280 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 301 is different from D, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and the amino acid at position 301 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist; - die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 3 is different from M, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and the amino acid at position 3 is preferably Q; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and the amino acid at position 11 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and the amino acid at position 17 is preferably P;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 280 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 202 is preferably N and the amino acid at position 280 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist; die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von- the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 301 is different from D, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 202 is preferably N and the amino acid at position 301 is preferably A; the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 from
A verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist; A is different and the amino acid at position 3 is different from M, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 202 is preferably N and the amino acid at position 3 is preferably Q;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 202 is preferably N, and the amino acid at position 11 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 202 is preferably N and the amino acid at position 17 is preferably P;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 202 is preferably N and the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 202 is preferably N and the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 280 is preferably A, and the amino acid at position 301 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist; - die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 280 is preferably A and the amino acid at position 3 is preferably Q; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 280 is preferably A, and the amino acid at position 11 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 280 is preferably A and the amino acid at position 17 is preferably P;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 280 is preferably A and the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 280 is preferably A and the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 3 is different from M, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 301 is preferably A and the amino acid at position 3 is preferably Q;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 301 is preferably A, and the amino acid at position 11 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 301 is preferably A and the amino acid at position 17 is preferably P;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 301 is preferably A and the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 301 is preferably A and the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 3 is preferably Q and the amino acid at position 11 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 3 is preferably Q and the amino acid at position 17 is preferably P;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 3 is preferably Q and the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 3 is preferably Q and the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred, that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 11 is preferably A and the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 11 is preferably A, and the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 17 is preferably P and the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 17 is preferably P, and the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the Amino acid at position 40 is preferably M, and the amino acid at position 111 is preferably E;
- Proteine mit einer Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80 %, vorzugsweise 85 %, stärker bevorzugt 90 %, noch stärker bevorzugt 95 %, noch stärker bevorzugt 96 %, noch stärker bevorzugt 97 %, besonders bevorzugt 98 %, am stärksten bevorzugt 99 % identisch sind mit der unter a) gezeigten Aminosäuresequenz, sofern die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass sie Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und wobei die Proteine mindestens zwei weitere Aminosäuresubstitutionen aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, die unter den aufgelisteten Zeichen direkt hierüber gezeigt ist. - Proteins with an amino acid sequence that is at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97%, particularly preferably 98%, most preferably 99% identical are with the amino acid sequence shown under a), provided that the amino acid at position 186 is different from L, it being preferred that it is amino acid at position 186, preferably W or Y, and wherein the proteins have at least two additional amino acid substitutions selected from the group shown under the listed characters immediately above.
Vorzugsweise können die hierin oben unter Punkt a) in Bezug auf die unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenzen beschriebenen Lipasevarianten mindestens drei weitere Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 oder 111 aufweisen. Preferably, those described above under point a) can be referred to under SEQ ID No. 1 have at least three further amino acid substitutions at positions 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 or 111.
Vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 79 S, W oder I, stärker bevorzugt S; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 202 N; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 280 A; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 301 A; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 3 Q; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 11 A; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 17 P; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 40 M; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 111 E. Preferably the amino acid at position 79 is S, W or I, more preferably S; preferably the amino acid at position 202 is N; preferably the amino acid at position 280 is A; preferably the amino acid at position 301 is A; preferably the amino acid at position 3 is Q; preferably the amino acid at position 11 is A; preferably the amino acid at position 17 is P; preferably the amino acid at position 40 is M; preferably the amino acid at position 111 is E.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform bezieht sich demnach auf erfindungsgemäße Proteine, die weitere Aminosäuremodifizierungen aufweisen, vorzugsweise sind diese Ausführungsformen Proteine mit der Aktivität einer Lipase, wobei die Proteine ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Proteinen mit der in SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz, mit der Ausnahme, dass A further embodiment according to the invention therefore relates to proteins according to the invention which have further amino acid modifications, preferably these embodiments are proteins with the activity of a lipase, the proteins being selected from the group consisting of proteins with the in SEQ ID No. 1 amino acid sequence shown, except that
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 280 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 280 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 301 is different from D, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 301 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist; - die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 3 is different from M, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 3 is preferably Q; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 11 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist; die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 301 is preferably A; the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist; - die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 3 is different from M, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y, stärker bevorzugt Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist, wobei besonders bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 Y ist und dass die Aminosäure an Position 79 S ist und dass die Aminosäure an Position 301 A ist und dass die Aminosäure an Position 40 M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, more preferably Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M is, it being particularly preferred that the amino acid at position 186 is Y and that the amino acid at position 79 is S and that the amino acid at position 301 is A and that the amino acid at position 40 is M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist; - die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 11 is preferably A; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M; the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 79 von E verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 79 vorzugsweise S, W oder I, stärker bevorzugt S ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 79 is different from E and the amino acid at position 40 is different from K and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 79 is preferably S, W or I, more preferably S, and that the amino acid at position 40 is preferably M, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 301 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist; - die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist; die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von- the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 3 is different from M, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q; the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 from
A verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist; A is different and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 11 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; - die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 17 is preferably P; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von- the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 111 is preferably E; the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 from
A verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; A is different and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 202 von A verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 202 vorzugsweise N ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 202 is different from A and the amino acid at position 40 is different from K and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 202 is preferably N, and that the amino acid at position 40 is preferably M, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 3 is different from M, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; - die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 11 is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 40 is preferably M; the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 280 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 280 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 111 is preferably E; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 280 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 280 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position- the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 11 is different from C, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position
I I vorzugsweise A ist; I I is preferably A;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position- the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position
I I I vorzugsweise E ist; die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 vonI I I is preferably E; the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 from
D verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; D is different and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 301 von D verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 301 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 301 is different from D and the amino acid at position 40 is different from K and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 301 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M, and that the amino acid at position 111 is preferably E; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 17 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 3 von M verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 3 vorzugsweise Q ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 111 is preferably E; the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 3 is different from M and the amino acid at position 40 is different from K and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 3 is preferably Q, and that the amino acid at position 40 is preferably M, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 40 is preferably M;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 11 von C verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 11 vorzugsweise A ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 11 is different from C and the amino acid at position 40 is different from K and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 11 is preferably A, and that the amino acid at position 40 is preferably M, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 17 von L verschieden ist und die Aminosäure an Position 40 von K verschieden ist und die Aminosäure an Position 111 von Q verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass die Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y ist, und dass die Aminosäure an Position 17 vorzugsweise P ist, und dass die Aminosäure an Position 40 vorzugsweise M ist, und dass die Aminosäure an Position 111 vorzugsweise E ist; - the amino acid at position 186 is different from L and the amino acid at position 17 is different from L and the amino acid at position 40 is different from K and the amino acid at position 111 is different from Q, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, and that the amino acid at position 17 is preferably P, and that the amino acid at position 40 is preferably M, and that the amino acid at position 111 is preferably E;
- Proteine mit einer Aminosäuresequenz, die zu mindestens 80 %, vorzugsweise 85 %, stärker bevorzugt 90 %, noch stärker bevorzugt 95 %, noch stärker bevorzugt 96 %, noch stärker bevorzugt 97 %, besonders bevorzugt 98 %, am stärksten bevorzugt 99 % identisch sind mit der unter a) gezeigten Aminosäuresequenz, sofern die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist, wobei bevorzugt wird, dass sie Aminosäure an Position 186 vorzugsweise W oder Y, stärker bevorzugt Y ist, und wobei die Proteine mindestens drei weitere Aminosäuresubstitutionen aufweisen, ausgewählt aus der Gruppe, die unter den aufgelisteten Zeichen direkt hierüber gezeigt ist. - Proteins with an amino acid sequence that is at least 80%, preferably 85%, more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, even more preferably 97%, particularly preferably 98%, most preferably 99% identical are with the amino acid sequence shown under a), provided that the amino acid at position 186 is different from L, it being preferred that the amino acid at position 186 is preferably W or Y, more preferably Y, and wherein the proteins are at least three more Have amino acid substitutions selected from the group shown below the listed characters immediately above.
Die hierin oben unter Punkt a) in Bezug auf die unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenzen beschriebenen Lipasevarianten können mindestens vier weitere Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 oder 111 aufweisen. Vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 79 S, W oder I, stärker bevorzugt S; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 202 N; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 280 A; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 301 A; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 3 Q; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 11 A; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 17 P; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 40 M; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 111 E. The information contained herein above under point a) in relation to those under SEQ ID No. The lipase variants described in the amino acid sequences shown in FIG. 1 may have at least four additional amino acid substitutions at positions 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 or 111. Preferably the amino acid at position 79 is S, W or I, more preferably S; preferably the amino acid at position 202 is N; preferably the amino acid at position 280 is A; preferably the amino acid at position 301 is A; preferably the amino acid at position 3 is Q; preferably the amino acid at position 11 is A; preferably the amino acid at position 17 is P; preferably the amino acid at position 40 is M; preferably the amino acid at position 111 is E.
Die hierin oben unter Punkt a) in Bezug auf die unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenzen beschriebenen Lipasevarianten können mindestens fünf weitere Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 oder 111 aufweisen. Vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 79 S, W oder I, stärker bevorzugt S; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 202 N; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 280 A; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 301 A; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 3 Q; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 11 A; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 17 P; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 40 M; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 111 E. The information contained herein above under point a) in relation to those under SEQ ID No. The lipase variants described in the amino acid sequences shown in FIG. 1 may have at least five additional amino acid substitutions at positions 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 or 111. Preferably the amino acid at position 79 is S, W or I, more preferably S; preferably the amino acid at position 202 is N; preferably the amino acid at position 280 is A; preferably the amino acid at position 301 is A; preferably the amino acid at position 3 is Q; preferably the amino acid at position 11 is A; preferably the amino acid at position 17 is P; preferably the amino acid at position 40 is M; preferably the amino acid at position 111 is E.
Die hierin oben unter Punkt a) in Bezug auf die unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenzen beschriebenen Lipasevarianten können mindestens sechs weitere Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 oder 111 aufweisen. Vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 79 S, W oder I, stärker bevorzugt S; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 202 N; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 280 A; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 301 A; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 3 Q; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 11 A; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 17 P; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 40 M; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 111 E. The information contained herein above under point a) in relation to those under SEQ ID No. The lipase variants described in the amino acid sequences shown in FIG. 1 may have at least six additional amino acid substitutions at positions 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 or 111. Preferably the amino acid at position 79 is S, W or I, more preferably S; preferably the amino acid at position 202 is N; preferably the amino acid at position 280 is A; preferably the amino acid at position 301 is A; preferably the amino acid at position 3 is Q; preferably the amino acid at position 11 is A; preferably the amino acid at position 17 is P; preferably the amino acid at position 40 is M; preferably the amino acid at position 111 is E.
Die hierin oben unter Punkt a) in Bezug auf die unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenzen beschriebenen Lipasevarianten können mindestens sieben weitere Aminosäuresubstitutionen an den Positionen 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 oder 111 aufweisen. Vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 79 S, W oder I, stärker bevorzugt S; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 202 N; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 280 A; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 301 A; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 3 Q; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 11 A; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 17 P; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 40 M; vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 111 E. Bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen sind Proteine, die für Lipasen mit den unter SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149,The information contained herein above under point a) in relation to those under SEQ ID No. The lipase variants described in the amino acid sequences shown in FIG. 1 may have at least seven additional amino acid substitutions at positions 79, 202, 280, 301, 3, 11, 17, 40 or 111. Preferably the amino acid at position 79 is S, W or I, more preferably S; preferably the amino acid at position 202 is N; preferably the amino acid at position 280 is A; preferably the amino acid at position 301 is A; preferably the amino acid at position 3 is Q; preferably the amino acid at position 11 is A; preferably the amino acid at position 17 is P; preferably the amino acid at position 40 is M; preferably the amino acid at position 111 is E. Preferred embodiments according to the invention are proteins that are responsible for lipases with the ones listed under SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149 ,
151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191,151, 153, 155, 157, 159, 161, 163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191,
193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233,193, 195, 197, 199, 201, 203, 205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233,
235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275,235, 237, 239, 241, 243, 245, 247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275,
277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317,277, 279, 281, 283, 285, 287, 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317,
319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 gezeigten Aminosäuresequenzen kodieren. 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367 , 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 encode amino acid sequences shown.
Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen sind Proteine, die für Lipasen mit den unter SEQ ID Nos. 233 bzw. 399 gezeigten Aminosäuresequenzen kodieren. Particularly preferred embodiments according to the invention are proteins that are responsible for lipases with the ones listed under SEQ ID Nos. 233 and 399 amino acid sequences shown, respectively.
Weitere Proteine mit der Aktivität eines lipolytischen Enzyms beziehungsweise einer Lipase sind getestet worden. Die Aminosäuresequenzen dieser weiteren Proteine stellen Varianten der durch die Aminosäure in SEQ ID No. 1 dargestellten Aminosäuresequenz dar, wobei gilt: Other proteins with the activity of a lipolytic enzyme or lipase have been tested. The amino acid sequences of these additional proteins represent variants of the amino acid in SEQ ID No. 1 amino acid sequence shown, whereby:
- bei der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz sind die zwei Aminosäuren an den Positionen 40 und 79 von den Aminosäuren, die an den entsprechenden Aminosäurepositionen in der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Sequenz angegeben sind, verschieden. In einer bestimmten getesteten Variante in Bezug auf die unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz ist die Aminosäure an Position 40 M und ist die Aminosäure an Position 79 S, - under SEQ ID No. 1 are the two amino acids at positions 40 and 79 of the amino acids at the corresponding amino acid positions in the SEQ ID no. 1 shown sequence are different. In a specific tested variant in relation to the SEQ ID no. 1 is the amino acid at position 40 M and is the amino acid at position 79 S,
- bei der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz sind die zwei Aminosäuren an den Positionen 40 und 186 von den Aminosäuren, die an den entsprechenden Aminosäurepositionen in der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Sequenz angegeben sind, verschieden. In einer bestimmten getesteten Variante in Bezug auf die unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz ist die Aminosäure an Position 40 M und ist die Aminosäure an Position 186 Y; - under SEQ ID No. 1 are the two amino acids at positions 40 and 186 of the amino acids at the corresponding amino acid positions in the SEQ ID no. 1 shown sequence are different. In a specific tested variant in relation to the SEQ ID no. 1, the amino acid at position 40 is M and the amino acid at position 186 is Y;
- bei der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz sind die zwei Aminosäuren an den Positionen 40 und 301 von den Aminosäuren, die an den entsprechenden Aminosäurepositionen in der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Sequenz angegeben sind, verschieden. In einer bestimmten getesteten Variante in Bezug auf die unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz ist die Aminosäure an Position 40 M und ist die Aminosäure an Position 301 A; - under SEQ ID No. 1 are the two amino acids at positions 40 and 301 of the amino acids at the corresponding amino acid positions in the SEQ ID no. 1 shown sequence are different. In a specific tested variant in relation to the SEQ ID no. 1 is the amino acid at position 40M and is the amino acid at position 301A;
- bei der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz sind die zwei Aminosäuren an den Positionen 79 und 186 von den Aminosäuren, die an den entsprechenden Aminosäurepositionen in der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Sequenz angegeben sind, verschieden. In einer bestimmten getesteten Variante in Bezug auf die unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz ist die Aminosäure an Position 79 S und ist die Aminosäure an Position 186 Y; - under SEQ ID No. 1, the two amino acids at positions 79 and 186 are among the amino acids at the corresponding amino acid positions in which under SEQ ID No. 1 shown sequence are different. In a specific tested variant in relation to the SEQ ID no. 1, the amino acid at position 79 is S and the amino acid at position 186 is Y;
- bei der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz sind die zwei Aminosäuren an den Positionen 79 und 301 von den Aminosäuren, die an den entsprechenden Aminosäurepositionen in der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Sequenz angegeben sind, verschieden. In einer bestimmten getesteten Variante in Bezug auf die unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz ist die Aminosäure an Position 79 S und ist die Aminosäure an Position 301 A; - under SEQ ID No. 1 are the two amino acids at positions 79 and 301 of the amino acids at the corresponding amino acid positions in the SEQ ID no. 1 shown sequence are different. In a specific tested variant in relation to the SEQ ID no. 1 is the amino acid at position 79 S and is the amino acid at position 301 A;
- bei der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz sind die zwei Aminosäuren an den Positionen 186 und 301 von den Aminosäuren, die an den entsprechenden Aminosäurepositionen in der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Sequenz angegeben sind, verschieden. In einer bestimmten getesteten Variante in Bezug auf die unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz ist die Aminosäure an Position 186 Y und ist die Aminosäure an Position 301 A. - under SEQ ID No. 1 are the two amino acids at positions 186 and 301 of the amino acids at the corresponding amino acid positions in the SEQ ID no. 1 shown sequence are different. In a specific tested variant in relation to the SEQ ID no. 1 is the amino acid at position 186 Y and is the amino acid at position 301 A.
Noch weitere Proteine mit der Aktivität eines lipolytischen Enzyms beziehungsweise einer Lipase sind getestet worden. Die Aminosäuresequenzen dieser weiteren Proteine stellen Varianten der durch die Aminosäure in SEQ ID No. 1 dargestellten Aminosäuresequenz dar, wobei gilt: Other proteins with the activity of a lipolytic enzyme or lipase have been tested. The amino acid sequences of these additional proteins represent variants of the amino acid in SEQ ID No. 1 amino acid sequence shown, whereby:
- bei der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz sind die drei Aminosäuren an den Positionen 40, 79 und 186 von den Aminosäuren, die an den entsprechenden Aminosäurepositionen in der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Sequenz angegeben sind, verschieden. In einer bestimmten getesteten Variante in Bezug auf die unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz ist die Aminosäure an Position 40 M und ist die Aminosäure an Position 79 S und ist die Aminosäure an Position 186 Y; - under SEQ ID No. 1 are the three amino acids at positions 40, 79 and 186 of the amino acids at the corresponding amino acid positions in the SEQ ID no. 1 shown sequence are different. In a specific tested variant in relation to the SEQ ID no. 1 is the amino acid at position 40M and is the amino acid at position 79S and is the amino acid at position 186Y;
- bei der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz sind die drei Aminosäuren an den Positionen 40, 79 und 301 von den Aminosäuren, die an den entsprechenden Aminosäurepositionen in der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Sequenz angegeben sind, verschieden. In einer bestimmten getesteten Variante in Bezug auf die unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz ist die Aminosäure an Position 40 M und ist die Aminosäure an Position 79 S und ist die Aminosäure an Position 301 A; - under SEQ ID No. 1 are the three amino acids at positions 40, 79 and 301 from the amino acids at the corresponding amino acid positions in the SEQ ID no. 1 shown sequence are different. In a specific tested variant in relation to the SEQ ID no. 1 is the amino acid at position 40M and is the amino acid at position 79S and is the amino acid at position 301A;
- bei der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz sind die drei Aminosäuren an den Positionen 40, 186 und 301 von den Aminosäuren, die an den entsprechenden Aminosäurepositionen in der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Sequenz angegeben sind, verschieden. In einer bestimmten getesteten Variante in Bezug auf die unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz ist die Aminosäure an Position 40 M und ist die Aminosäure an Position 186 Y und ist die Aminosäure an Position 301 A; - under SEQ ID No. 1 are the three amino acids at positions 40, 186 and 301 from the amino acids at the corresponding amino acid positions in the SEQ ID no. 1 shown sequence are different. In a specific tested variant in relation to the SEQ ID no. 1 Amino acid sequence shown is the amino acid at position 40M and is the amino acid at position 186Y and is the amino acid at position 301A;
- bei der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz sind die drei Aminosäuren an den Positionen 79, 186 und 301 von den Aminosäuren, die an den entsprechenden Aminosäurepositionen in der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Sequenz angegeben sind, verschieden. In einer bestimmten getesteten Variante in Bezug auf die unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz ist die Aminosäure an Position 79 S und ist die Aminosäure an Position 186 Y und ist die Aminosäure an Position 301 A; - under SEQ ID No. 1 are the three amino acids at positions 79, 186 and 301 from the amino acids at the corresponding amino acid positions in the SEQ ID no. 1 shown sequence are different. In a specific tested variant in relation to the SEQ ID no. 1 is the amino acid at position 79 S and is the amino acid at position 186 Y and is the amino acid at position 301 A;
Die erfindungsgemäßen Lipasen und Lipasevarianten weisen eine hohe Selektivität und/oder eine hohe spezifische Aktivität in Bezug auf die stereoselektive Acylierung oder Carboxylierung von 2,6- Dimethyl-l-indanamin (DMAI) auf und sind in der Lage, enantiomerisch angereichertes oder nahezu reines Methyl-[(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-lH-inden-l-yl] carbamat zu erzeugen. Methyl- [(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-lH-inden-l-yl] carbamat ist ein wichtiges Zwischenprodukt für die Synthese der Verbindung Indaziflam mit herbizider Wirkung. The lipases and lipase variants according to the invention have a high selectivity and/or a high specific activity with regard to the stereoselective acylation or carboxylation of 2,6-dimethyl-l-indanamine (DMAI) and are capable of producing enantiomerically enriched or almost pure methyl -[(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-lH-inden-l-yl] to produce carbamate. Methyl-[(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-lH-inden-l-yl] carbamate is an important intermediate for the synthesis of the herbicidal compound indaziflam.
„Enantiomerisch angereichert“ bedeutet hierin, dass eines von zwei Enantiomeren in einer Zusammensetzung in größeren Mengen vorliegt als das andere Enantiomer, vorzugsweise liegt ein Enantiomer in der Zusammensetzung zu mindestens 60 % vor, stärker bevorzugt liegt ein Enantiomer in der Zusammensetzung zu mindestens zu mindestens 65 % vor, noch stärker bevorzugt liegt ein Enantiomer in der Zusammensetzung zu mindestens zu mindestens 70 % vor, noch stärker bevorzugt liegt ein Enantiomer in der Zusammensetzung zu mindestens zu mindestens 75 % vor, noch stärker bevorzugt liegt ein Enantiomer in der Zusammensetzung zu mindestens zu mindestens 80 % vor, besonders bevorzugt liegt ein Enantiomer in der Zusammensetzung zu mindestens zu mindestens 85 % vor, am stärksten bevorzugt liegt ein Enantiomer in der Zusammensetzung zu mindestens zu mindestens 90 % vor oder ganz besonders bevorzugt liegt ein Enantiomer in der Zusammensetzung zu mindestens zu mindestens 94 % vor. “Enantiomerically enriched” herein means that one of two enantiomers in a composition is present in greater amounts than the other enantiomer, preferably one enantiomer is at least 60% present in the composition, more preferably one enantiomer is at least at least 65% present in the composition %, even more preferably an enantiomer is present in the composition to at least at least 70%, even more preferably an enantiomer is present in the composition to at least at least 75%, even more preferably an enantiomer is present in the composition to at least at least 80%, particularly preferably an enantiomer is present in the composition to at least 85%, most preferably an enantiomer is present in the composition to at least 90% or very particularly preferably an enantiomer is present in the composition to at least at least 94% ahead.
„Enantiomerisch nahezu rein“ bedeutet hierin, dass eines von zwei Enantiomeren in einer Zusammensetzung in Mengen von mindestens 95,0 % vor liegt, vorzugsweise liegt eines von zwei Enantiomeren in einer Zusammensetzung in Mengen von mindestens 95,5 % vor, stärker bevorzugt liegt eines von zwei Enantiomeren in einer Zusammensetzung in Mengen von mindestens 96,0 % vor, noch stärker bevorzugt liegt eines von zwei Enantiomeren in einer Zusammensetzung in Mengen von mindestens 96,5 % vor, noch stärker bevorzugt liegt eines von zwei Enantiomeren in einer Zusammensetzung in Mengen von mindestens 97,0 % vor, noch stärker bevorzugt liegt eines von zwei Enantiomeren in einer Zusammensetzung in Mengen von mindestens 98,0 % vor, besonders bevorzugt liegt eines von zwei Enantiomeren in einer Zusammensetzung in Mengen von mindestens 98,5 % vor, am stärksten bevorzugt liegt eines von zwei Enantiomeren in einer Zusammensetzung in Mengen von mindestens 99,0 % vor oder ganz besonders bevorzugt liegt eines von zwei Enantiomeren in einer Zusammensetzung in Mengen von mindestens 99,5 % vor. “Enantiomerically nearly pure” herein means that one of two enantiomers is present in a composition in amounts of at least 95.0%, preferably one of two enantiomers is present in a composition in amounts of at least 95.5%, more preferably one is present of two enantiomers is present in a composition in amounts of at least 96.0%, even more preferably one of two enantiomers is present in a composition in amounts of at least 96.5%, even more preferably one of two enantiomers is present in a composition in amounts of at least 96.5% of at least 97.0%, even more preferably one of two enantiomers is present in a composition in amounts of at least 98.0%, particularly preferably one of two enantiomers is present in a composition in amounts of at least 98.5%, most preferably one of two enantiomers is present in a composition in amounts of at least 99.0% or most preferably one of two enantiomers is present in a composition in amounts of at least 99.5%.
Eine weitere erfindungsgemäße Ausführungsform bezieht sich auf Nukleinsäuremoleküle, die für ein erfindungsgemäßes Protein kodieren. A further embodiment according to the invention relates to nucleic acid molecules which code for a protein according to the invention.
Erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle können eine beliebige Art von Nukleinsäure sein, sofern die Nukleinsäure für ein erfindungsgemäßes Protein kodiert. Die Nukleinsäuren können Ribonukleinsäuremoleküle (z. B. RNA, mRNA) oder Desoxyribonukleinsäuremoleküle (DNA, einschließlich genomische DNA, die Introns und kodierende DNA einschließen kann oder auch nicht) sein. Nucleic acid molecules according to the invention can be any type of nucleic acid, provided that the nucleic acid codes for a protein according to the invention. The nucleic acids may be ribonucleic acid molecules (e.g., RNA, mRNA) or deoxyribonucleic acid molecules (DNA, including genomic DNA, which may or may not include introns and coding DNA).
Von besonderem Interesse für die Erfindung sind Nukleinsäuremoleküle, die für Proteine kodieren, welche die Aktivität einer Lipase aufweisen, umfassend die unter SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149, 151, 153, 155, 157, 159, 161,Of particular interest to the invention are nucleic acid molecules that code for proteins that have the activity of a lipase, comprising those under SEQ ID Nos. 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79, 81, 83, 85, 87, 89, 91, 93, 95, 97, 99, 101, 103, 105, 107, 109, 111, 113, 115, 117, 119, 121, 123, 125, 127, 129, 131, 133, 135, 137, 139, 141, 143, 145, 147, 149 , 151, 153, 155, 157, 159, 161,
163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203,163, 165, 167, 169, 171, 173, 175, 177, 179, 181, 183, 185, 187, 189, 191, 193, 195, 197, 199, 201, 203,
205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245,205, 207, 209, 211, 213, 215, 217, 219, 221, 223, 225, 227, 229, 231, 233, 235, 237, 239, 241, 243, 245,
247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287,247, 249, 251, 253, 255, 257, 259, 261, 263, 265, 267, 269, 271, 273, 275, 277, 279, 281, 283, 285, 287,
289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337, 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387, 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 gezeigten Aminosäuresequenzen. 289, 291, 293, 295, 297, 299, 301, 303, 305, 307, 309, 311, 313, 315, 317, 319, 321, 323, 325, 327, 329, 331, 333, 335, 337 , 339, 341, 343, 345, 347, 349, 351, 353, 355, 357, 359, 361, 363, 365, 367, 369, 371, 373, 375, 377, 379, 381, 383, 385, 387 , 389, 391, 393, 395, 397, 399, 401 amino acid sequences shown.
Die Erfindung bezieht sich ferner auf Nukleinsäuremoleküle, welche für ein Protein mit der Aktivität einer Lipase kodieren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuremolekülen, die die unter SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158,The invention further relates to nucleic acid molecules which code for a protein with the activity of a lipase, selected from the group consisting of a) nucleic acid molecules which are those under SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150 , 152, 154, 156, 158,
160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196,160, 162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196,
198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234,198, 200, 202, 204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234,
236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272,236, 238, 240, 242, 244, 246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272,
274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310,274, 276, 278, 280, 282, 284, 286, 288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310,
312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402 gezeigten Nukleinsäuresequenzen umfassen; b) Nukleinsäuremolekülen, die mindestens 60 %, vorzugsweise 70 %, stärker bevorzugt 80 %, noch stärker bevorzugt 90 %, noch stärker bevorzugt 95 %, noch stärker bevorzugt 96 %, besonders bevorzugt 97 %, am stärksten bevorzugt 98 % oder ganz besonders bevorzugt 99 % Identität zu den unter a) gezeigten Nukleinsäuresequenzen aufweisen. 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328, 330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370, 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398 , 400, 402 include nucleic acid sequences shown; b) nucleic acid molecules which are at least 60%, preferably 70%, more preferably 80%, even more preferably 90%, even more preferably 95%, even more preferably 96%, particularly preferably 97%, most preferably 98% or very particularly preferred Have 99% identity to the nucleic acid sequences shown under a).
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung steht „hybridisieren mit“ für Hybridisierung unter herkömmlichen Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise unter strengen Bedingungen, wie zum Beispiel beschrieben in Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3. Auflage (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773) oder in Ausubel et al. (Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5. Auflage (2002), ISBN: 0471250929). Besonders bevorzugt steht „Hybridisierung“ für eine Hybridisierung unter den folgenden Bedingungen: In the context of the present invention, “hybridize with” means hybridization under conventional hybridization conditions, preferably under strict conditions, such as those described in Sambrook et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773) or in Ausubel et al. (Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons; 5th edition (2002), ISBN: 0471250929). “Hybridization” particularly preferably means hybridization under the following conditions:
Hybridisierungspuffer: Hybridization buffer:
2xSSC; lOxDenhardt-Lösung (Fikoll 400+PEG+BSA; Verhältnis 1:1:1); 0,1 % SDS; 5 mM EDTA; 50 mM Na2HPO4; 250 pg/ml Heringssperma-DNA; 50 pg/ml tRNA; oder 2xSSC; lOxDenhardt solution (Fikoll 400+PEG+BSA; ratio 1:1:1); 0.1% SDS; 5mM EDTA; 50 mM Na2HPO4; 250 pg/ml herring sperm DNA; 50 pg/ml tRNA; or
25 M Natriumphosphatpuffer, pH-Wert 7,2; 1 mM EDTA; 7 % SDS 25 M sodium phosphate buffer, pH 7.2; 1mM EDTA; 7% SDS
Hybridisierungstemperatur: T = 65 bis 68 °C Hybridization temperature: T = 65 to 68 °C
Waschpuffer: 0,lxSSC; 0,1 % SDS Wash buffer: 0.lxSSC; 0.1% SDS
Waschtemperatur: T = 65 bis 68 °C. Washing temperature: T = 65 to 68 °C.
Nukleinsäuremoleküle, die mit Nukleinsäuremolekülen hybridisieren, welche für ein Protein mit der Aktivität einer Lipase kodieren, können aus jedem Organismus stammen; dementsprechend können sie von Bakterien, Pilzen, Tieren, Menschen, Pflanzen oder Viren stammen. Nucleic acid molecules that hybridize with nucleic acid molecules encoding a protein with the activity of a lipase can come from any organism; accordingly, they can come from bacteria, fungi, animals, humans, plants or viruses.
Nukleinsäuremoleküle, die mit Nukleinsäuremolekülen hybridisieren, welche für ein Protein mit der Aktivität einer Lipase kodieren, stammen vorzugsweise aus Mikroorganismen, stärker bevorzugt aus Pilzen oder Bakterien, am stärksten bevorzugt aus Bakterien. Nucleic acid molecules that hybridize with nucleic acid molecules encoding a protein with the activity of a lipase are preferably derived from microorganisms, more preferably from fungi or bacteria, most preferably from bacteria.
Nukleinsäuremoleküle, die mit den genannten Molekülen hybridisieren, können beispielsweise aus genomischen oder aus cDNA-Bibliotheken isoliert werden. Diese Nukleinsäuremoleküle können unter Verwendung der hierin beschriebenen Nukleinsäuremoleküle identifiziert und isoliert werden oder sie können unter Verwendung von Teilen dieser Moleküle oder der reversen Komplemente dieser Moleküle identifiziert und isoliert werden, beispielsweise durch Hybridisierung gemäß Standardverfahren (siehe, zum Beispiel, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3. Auflage (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5. Auflage (2002), ISBN: 0471250929) oder durch Amplifizierung mithilfe von PCR. Nucleic acid molecules that hybridize with the molecules mentioned can be isolated, for example, from genomic or cDNA libraries. These nucleic acid molecules can be identified and isolated using the nucleic acid molecules described herein or they can be identified and isolated using portions of these molecules or the reverse complements of these molecules, for example by hybridization according to standard procedures (see, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773; Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons; 5th edition (2002), ISBN: 0471250929) or by amplification using PCR.
Bei den als Hybridisierungsproben verwendeten Fragmenten kann es sich auch um synthetische Fragmente oder mit üblichen Synthesetechniken hergestellte Oligonukleotide handeln, deren Sequenz im Wesentlichen identisch ist mit dem im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Nukleinsäuremolekül. Wenn Gene, die mit den im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung beschriebenen Nukleinsäuresequenzen hybridisieren, identifiziert und isoliert werden, sollte die Sequenz bestimmt werden und sollten die Eigenschaften der Proteine, für die durch diese Sequenz kodiert wird, analysiert werden, um zu bestimmen, ob sie Proteine mit der Aktivität einer Lipase sind. Verfahren zum Bestimmen, ob ein Protein die Aktivität eines Proteins mit der Aktivität einer Lipase aufweist, sind Durchschnittsfachleuten bekannt. The fragments used as hybridization samples can also be synthetic fragments or oligonucleotides produced using conventional synthesis techniques, the sequence of which is essentially identical to the nucleic acid molecule described in the context of the present invention. When genes that hybridize to the nucleic acid sequences described in connection with the present invention are identified and isolated, the sequence should be determined and the properties of the proteins encoded by that sequence should be analyzed to determine whether they are Proteins with the activity of a lipase are. Methods for determining whether a protein has the activity of a protein with the activity of a lipase are known to those of ordinary skill in the art.
Die mit den im Rahmen der vorliegenden Erfindung beschriebenen Nukleinsäuremoleküle hybridisierenden Moleküle umfassen insbesondere Fragmente, Derivate und allelische Varianten der genannten Nukleinsäuremoleküle. Der Begriff „Derivat“ bedeutet im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung, dass sich die Sequenzen dieser Moleküle in einer oder mehreren Positionen von den Sequenzen der oben beschriebenen Nukleinsäuremoleküle unterscheiden und mit diesen Sequenzen hochgradig identisch sind. Die Unterschiede zu den oben beschriebenen Nukleinsäuremolekülen können beispielsweise auf Deletion, Addition, Substitution, Insertion oder Rekombination zurückzuführen sein. The molecules that hybridize with the nucleic acid molecules described in the context of the present invention include in particular fragments, derivatives and allelic variants of the nucleic acid molecules mentioned. The term “derivative” in the context of the present invention means that the sequences of these molecules differ in one or more positions from the sequences of the nucleic acid molecules described above and are highly identical to these sequences. The differences from the nucleic acid molecules described above can be due, for example, to deletion, addition, substitution, insertion or recombination.
Bevorzugte erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle sind die unter SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150, 152, 154, 156, 158, 160,Preferred nucleic acid molecules according to the invention are those under SEQ ID Nos. 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120, 122, 124, 126, 128, 130, 132, 134, 136, 138, 140, 142, 144, 146, 148, 150 , 152, 154, 156, 158, 160,
162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202,162, 164, 166, 168, 170, 172, 174, 176, 178, 180, 182, 184, 186, 188, 190, 192, 194, 196, 198, 200, 202,
204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244,204, 206, 208, 210, 212, 214, 216, 218, 220, 222, 224, 226, 228, 230, 232, 234, 236, 238, 240, 242, 244,
246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286,246, 248, 250, 252, 254, 256, 258, 260, 262, 264, 266, 268, 270, 272, 274, 276, 278, 280, 282, 284, 286,
288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328,288, 290, 292, 294, 296, 298, 300, 302, 304, 306, 308, 310, 312, 314, 316, 318, 320, 322, 324, 326, 328,
330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370,330, 332, 334, 336, 338, 340, 342, 344, 346, 348, 350, 352, 354, 356, 358, 360, 362, 364, 366, 368, 370,
372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402 gezeigten Nukleinsäuremoleküle. Die Bedeutung der Nukleotidabkürzungen a, c, g, t sowie der Abkürzungen für degenerierte Nukleotide r, y, s, w, k, m, b, d, h, v, n kann hierin nachfolgend aus der Tabelle 1 im Abschnitt mit dem Titel „Beschreibung der Sequenzen“ abgeleitet werden. Die Aminosäuren, für die durch degenerierte Nukleotide kodiert wird, können hierin nachfolgend aus der Tabelle 3 im Abschnitt mit dem Titel „Beschreibung der Sequenzen“ abgeleitet werden. 372, 374, 376, 378, 380, 382, 384, 386, 388, 390, 392, 394, 396, 398, 400, 402 nucleic acid molecules shown. The meaning of the nucleotide abbreviations a, c, g, t as well as the abbreviations for degenerate nucleotides r, y, s, w, k, m, b, d, h, v, n can be found hereinafter from Table 1 in the section entitled “Description of the sequences” can be derived. The amino acids encoded by degenerate nucleotides can be derived hereinafter from Table 3 in the section entitled “Description of Sequences”.
Ferner offenbart sind rekombinante Nukleinsäuremoleküle, die ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeignetes Nukleinsäuremolekül umfassen. Also disclosed are recombinant nucleic acid molecules which comprise a nucleic acid molecule suitable for the method according to the invention.
Unter dem Begriff „rekombinantes Nukleinsäuremolekül“ ist ein Nukleinsäuremolekül zu verstehen, das neben den für das erfindungsgemäße Verfahren geeignete Nukleinsäuremolekül weitere Sequenzen enthält, die in der Kombination, in der sie in den für das erfindungsgemäße Verfahren rekombinanten Nukleinsäuren vorkommen, nicht natürlich vorkommen. Dabei kann es sich bei den oben genannten zusätzlichen Sequenzen um beliebige Sequenzen handeln, vorzugsweise handelt es sich um funktionelle oder regulatorische Sequenzen (Promotoren, Terminationssignale, Enhancer, Ribosomenbindungsstellen (rbs), Leader-Sequenzen, die die Transkription, Translation oder RNA-Stabilität erhöhen, subzelluläre Targeting-Sequenzen usw.), besonders bevorzugt handelt es sich um funktionelle oder regulatorische Sequenzen, die in Mikroorganismen aktiv sind, und ganz besonders bevorzugt handelt es sich um regulatorische Sequenzen, die in Pilzen, insbesondere in Hefen oder in Bakterien aktiv sind. Verfahren zur Herstellung der für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten rekombinanten Nukleinsäuremoleküle sind Durchschnittsfachleuten bekannt. Hierzu zählen genetische Verfahren, wie etwa Bindung von Nukleinsäuremolekülen durch Ligation, genetische Rekombination oder Neusynthese von Nukleinsäuremolekülen. Diese Verfahren werden z. B. beschrieben in Sambrok et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3. Auflage (2001) Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. ISBN: 0879695773) oder in Ausubel et al. (Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons; 5. Auflage (2002), ISBN: 0471250929). The term “recombinant nucleic acid molecule” is to be understood as meaning a nucleic acid molecule which, in addition to the nucleic acid molecules suitable for the method according to the invention, contains further sequences which do not occur naturally in the combination in which they occur in the nucleic acids recombinant for the method according to the invention. The additional sequences mentioned above can be any sequences, preferably functional or regulatory sequences (promoters, termination signals, enhancers, ribosome binding sites (rbs), leader sequences that increase transcription, translation or RNA stability , subcellular targeting sequences, etc.), particularly preferably they are functional or regulatory sequences that are active in microorganisms, and very particularly preferably they are regulatory sequences that are active in fungi, in particular in yeast or in bacteria. Methods for producing the recombinant nucleic acid molecules suitable for the method according to the invention are known to those of ordinary skill in the art. These include genetic processes such as binding of nucleic acid molecules through ligation, genetic recombination or new synthesis of nucleic acid molecules. These procedures are z. B. described in Sambrok et al. (Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 3rd edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. ISBN: 0879695773) or in Ausubel et al. (Short Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons; 5th edition (2002), ISBN: 0471250929).
Das für das erfindungsgemäße Verfahren nutzbare rekombinante Nukleinsäuremolekül umfasst ein geeignetes Nukleinsäuremolekül, das mit regulatorischen Sequenzen verknüpft ist, die eine Transkription in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen einleiten. The recombinant nucleic acid molecule usable for the method according to the invention comprises a suitable nucleic acid molecule which is linked to regulatory sequences which initiate transcription in prokaryotic or eukaryotic cells.
Regulatorische Sequenzen, die eine Transkription in einer Zelle einleiten, sind auch als Promotoren bekannt. Informationen in Bezug auf regulatorische Sequenzen und Plasmiden sind Durchschnittsfachleuten gut bekannt und sind z. B. beschrieben im Registry of Standard Biological Parts, unterstützt durch The International Genetically Engineered Machine (iGEM) Foundation (One Kendall Square, Suite B6104, Cambridge, MA 02139, USA) im Internet (http://parts.igem.org/Catalog). Regulatory sequences that initiate transcription in a cell are also known as promoters. Information relating to regulatory sequences and plasmids is well known to those of ordinary skill in the art and is e.g. B. described in the Registry of Standard Biological Parts, supported by The International Genetically Engineered Machine (iGEM) Foundation (One Kendall Square, Suite B6104, Cambridge, MA 02139, USA) on the Internet (http://parts.gem.org/Catalog ).
Regulatorische Sequenzen, die eine Transkription in prokaryotischen Organismen, wie z. B. E. coli, sowie in eukaryotischen Organismen einleiten, sind in der Literatur ausgiebig beschrieben, insbesondere sind solche in Bezug auf die Expression in Hefen beschrieben, z. B. Saccharomyces cerevisiae. Eine Übersicht über verschiedene Systeme für die Expression von Proteinen in verschiedenen Wirtsorganismen ist zum Beispiel zu finden in Methods in Enzymology 153 (1987), 383-516 sowie in Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544) oder in Gomes et al. (2016, Advances in Animal and Veterinary Sciences, 4(4), 346) und Baghban et al. (2018, Current Pharmaceutical Biotechnology, 19(6)). Übliche Hefe-Promotoren sind pAOXl, pHIS4, pGAL, pScADH2 (Baghban et al., 2018, siehe oben). Übliche bakterielle Promotoren sind T5, T7, Rhamnose-induzierbare, Arabinose- induzierbare, PhoA, künstlicher trc(trp-lac)-Promotor, wie beschrieben von Marschall et al. (2017, Appl Microbiol Biotechnol 101, 501-512) und Tegel et al. (2011, FEBS Journal 278, 729-739). Regulatory sequences that enable transcription in prokaryotic organisms such as BE coli, as well as in eukaryotic organisms, are extensively described in the literature, in particular those are described in relation to expression in yeast, e.g. B. Saccharomyces cerevisiae. An overview of different systems for the expression of proteins in different host organisms can be found, for example, in Methods in Enzymology 153 (1987), 383-516 and in Bitter et al. (Methods in Enzymology 153 (1987), 516-544) or in Gomes et al. (2016, Advances in Animal and Veterinary Sciences, 4(4), 346) and Baghban et al. (2018, Current Pharmaceutical Biotechnology, 19(6)). Common yeast promoters are pAOXl, pHIS4, pGAL, pScADH2 (Baghban et al., 2018, see above). Common bacterial promoters are T5, T7, rhamnose-inducible, arabinose-inducible, PhoA, artificial trc(trp-lac) promoter, as described by Marschall et al. (2017, Appl Microbiol Biotechnol 101, 501-512) and Tegel et al. (2011, FEBS Journal 278, 729-739).
Eine weitere Ausführungsform von für das erfindungsgemäße Verfahren nutzbare rekombinante Nukleinsäuremoleküle sind Vektoren von Plasmiden, die die geeigneten Nukleinsäuremoleküle umfassen. A further embodiment of recombinant nucleic acid molecules that can be used for the method according to the invention are vectors of plasmids which comprise the suitable nucleic acid molecules.
„Vektoren“ sind im Gebiet der Molekularbiologie hinreichend bekannt und stellen hierin eine Nukleinsäuresequenz oder ein Vehikel dar, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, die eingesetzt wird, um genetisches Material (DNA oder RNA) in eine Zielzelle zu transferieren. Vektoren können Plasmide sein, z. B. T-DNA oder binäre Vektoren zum Erzeugen von transgenen Pflanzen, Expressionsvektoren für die Expression von Nukleinsäuresequenzen in einer Wirtszelle, Shuttle-Vektoren, die in der Lage sind, sich in verschiedenen Wirten zu vermehren, oder Vektoren können Viruspartikel oder Bakteriophagen sein, die modifiziert worden sind, um fremdes genetisches Material in einen Wirt zu liefern. “Vectors” are well known in the field of molecular biology and herein represent a nucleic acid sequence or a vehicle comprising a nucleic acid sequence that is used to transfer genetic material (DNA or RNA) into a target cell. Vectors can be plasmids, e.g. B. T-DNA or binary vectors for generating transgenic plants, expression vectors for the expression of nucleic acid sequences in a host cell, shuttle vectors that are able to reproduce in different hosts, or vectors can be virus particles or bacteriophages that have been modified to deliver foreign genetic material into a host.
„Plasmide“ sind im Gebiet der Molekularbiologie hinreichend bekannt und stellen hierin ein autonom selbstreplizierendes, häufig zirkuläres DNA-Molekül dar, welches, wenn in einer Wirtszelle vorliegend, von der chromosomalen DNA getrennt ist. “Plasmids” are well known in the field of molecular biology and herein represent an autonomously self-replicating, often circular DNA molecule which, when present in a host cell, is separated from the chromosomal DNA.
Geeignete Nukleinsäuremoleküle, rekombinante Nukleinsäuremolekül, Vektoren oder Plasmide können eingesetzt werden, um Proteine für das erfindungsgemäße Verfahren herzustellen, z. B. durch Exprimieren des geeigneten Nukleinsäuremoleküls in Wirtszellen. Suitable nucleic acid molecules, recombinant nucleic acid molecules, vectors or plasmids can be used to produce proteins for the method according to the invention, e.g. B. by expressing the appropriate nucleic acid molecule in host cells.
Ferner offenbart sind Wirte oder Wirtszellen, die ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeignetes Nukleinsäuremolekül umfassen oder exprimieren oder geeignete Proteine mit der Aktivität einer Lipase umfassen oder ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeignetes rekombinantes Nukleinsäuremolekül umfassen oder einen für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Vektor umfassen oder ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeignetes Plasmid umfassen. Also disclosed are hosts or host cells which comprise or express a nucleic acid molecule suitable for the method according to the invention or which comprise suitable proteins with the activity of a lipase or which comprise a recombinant nucleic acid molecule suitable for the method according to the invention or which comprise a vector which is suitable for the method according to the invention or which Methods according to the invention include a suitable plasmid.
Geeignete Nukleinsäuremoleküle, die für ein Protein mit der Aktivität einer Lipase kodieren, können in Wirtszellen exprimiert werden, z. B. für deren Vermehrung oder zur Herstellung von Proteinen mit der Aktivität einer Lipase. Zur Expression in Wirtszellen können geeigente Nukleinsäuremoleküle auf Vektoren oder Plasmiden enthalten sein oder stabil in das Genom einer jeweiligen Wirtszelle integriert werden. Die geeigneten Nukleinsäuremoleküle können auch in Vektoren enthalten sein, die ihre Einführung in Wirtszellen unterstützen. Suitable nucleic acid molecules encoding a protein with the activity of a lipase can be expressed in host cells, e.g. B. for their reproduction or for the production of proteins with the Activity of a lipase. For expression in host cells, suitable nucleic acid molecules can be contained on vectors or plasmids or can be stably integrated into the genome of a respective host cell. The appropriate nucleic acid molecules may also be contained in vectors that assist in their introduction into host cells.
Ferner offenbart ist ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneter Wirt oder eine Wirtszelle, umfassend ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeignetes Nukleinsäuremolekül oder umfassend ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeignetes rekombinantes Nukleinsäuremolekül oder umfassend einen für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Vektor oder umfassend ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeignetes Plasmid und jeweils ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeignetes Protein umfassend. Ferner offenbart ist ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneter Wirt oder eine Wirtszelle, umfassend ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeignetes Nukleinsäuremolekül oder umfassend ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeignetes rekombinantes Nukleinsäuremolekül oder umfassend einen für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneten Vektor oder umfassend ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeignetes Plasmid und jeweils ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeignetes Protein exprimierend, wobei das Protein vorzugsweise die Aktivität einer Lipase aufweist. Also disclosed is a host or a host cell suitable for the method according to the invention, comprising a nucleic acid molecule suitable for the method according to the invention or comprising a recombinant nucleic acid molecule suitable for the method according to the invention or comprising a vector suitable for the method according to the invention or comprising a plasmid suitable for the method according to the invention and each comprising a protein suitable for the method according to the invention. Also disclosed is a host or a host cell suitable for the method according to the invention, comprising a nucleic acid molecule suitable for the method according to the invention or comprising a recombinant nucleic acid molecule suitable for the method according to the invention or comprising a vector suitable for the method according to the invention or comprising a plasmid suitable for the method according to the invention and each expressing a protein suitable for the method according to the invention, the protein preferably having the activity of a lipase.
„Exprimieren eines Nukleinsäuremoleküls“ soll hierin so verstanden werden, dass, falls das Nukleinsäuremolekül RNA oder mRNA ist, das Nukleinsäuremolekül in ein Protein translatiert wird, vorzugsweise in ein Protein mit der Aktivität einer Lipase oder falls das Nukleinsäuremolekül DNA oder cDNA ist, es in mRNA transkribiert (und im Fall von Introns enthaltender genomischer DNA prozessiert) wird, vorzugsweise in eine mRNA, die für ein Protein mit der Aktivität einer Lipase kodiert, und anschließend in ein Protein translatiert wird, vorzugsweise in ein Protein mit der Aktivität einer Lipase translatiert wird. “Expressing a nucleic acid molecule” is meant herein to mean that if the nucleic acid molecule is RNA or mRNA, the nucleic acid molecule is translated into a protein, preferably a protein with the activity of a lipase, or if the nucleic acid molecule is DNA or cDNA, it is translated into mRNA is transcribed (and in the case of intron-containing genomic DNA processed), preferably into an mRNA which codes for a protein with the activity of a lipase, and is subsequently translated into a protein, preferably translated into a protein with the activity of a lipase.
Die Transkription eines bestimmten Nukleinsäuremoleküls in einem Wirt kann durch Durchschnittsfachleuten bekannte Verfahren nachgewiesen werden, beispielsweise durch Nachweisen spezifischer Transkripte (mRNA) fremder Nukleinsäuremoleküle durch Northern-Blot-Analyse oder durch RT-PCR. Transcription of a particular nucleic acid molecule in a host can be detected by methods known to those of ordinary skill in the art, for example by detecting specific transcripts (mRNA) of foreign nucleic acid molecules by Northern blot analysis or by RT-PCR.
Ob Wirte oder Wirtszellen ein bestimmtes Protein umfassen oder ein Protein umfassen, das von der Expression eines Nukleinsäuremoleküls abgeleitet ist, kann durch Durchschnittsfachleuten bekannte Verfahren bestimmt werden, beispielsweise durch immunologische Verfahren, wie Western-Blot- Analyse, ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) oder RIA (Radio Immune Assay). Durchschnittsfachleute sind vertraut mit Verfahren zum Herstellen von Antikörpern, die spezifisch mit einem bestimmten Protein reagieren, d. h. die spezifisch an ein bestimmtes Protein binden (siehe, zum Beispiel, Lottspeich und Zorbas (Hrsg.), 1998, Bioanalytik, Spektrum akad, Verlag, Heidelberg, Berlin, ISBN 3-8274-0041-4). Manche Unternehmen (Thermo Fisher Scientific, 168 Third Avenue, Waltham, MA USA 0245; GenScript, 60 Centennial Ave., Piscataway, NJ 08854, USA) bieten die Herstellung dieser Antikörper als Dienstleistung auf Bestellung an. Whether hosts or host cells comprise a particular protein or comprise a protein derived from the expression of a nucleic acid molecule can be determined by methods known to those skilled in the art, for example by immunological methods such as Western blot analysis, ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay). or RIA (Radio Immune Assay). Those of ordinary skill in the art are familiar with methods for producing antibodies that react specifically with a particular protein, that is, that bind specifically to a particular protein (see, for example, Lottspeich and Zorbas (eds.), 1998, Bioanalytik, Spektrum akad, Verlag, Heidelberg , Berlin, ISBN 3-8274-0041-4). Some companies (Thermo Fisher Scientific, 168 Third Avenue, Waltham, MA USA 0245; GenScript, 60 Centennial Ave., Piscataway, NJ 08854, USA) offer production of these antibodies as a made-to-order service.
Ferner können Durchschnittsfachleute prüfen, ob ein Wirt oder eine Wirtszelle ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeignetes Protein umfasst, indem sie die (zusätzliche) Aktivität von Proteinen mit der Aktivität einer Lipase in einer entsprechenden Wirtszelle nachweisen. Vorzugsweise wird die Aktivität von Proteinen mit zusätzlicher Aktivität einer Lipase in einer entsprechenden Wirtszelle nachgewiesen, indem die Aktivitäten von Lipasen in einer für das erfindungsgemäße Verfahren verwendeten Wirtszelle mit der entsprechenden Aktivität von Wirtszellen verglichen wird, die kein für das erfindungsgemäße Verfahren geeignetes Protein umfassen. Das Prüfen, ob ein Protein die Aktivität einer Lipase aufweist, kann mit nach dem Stand der Technik bekannten Verfahren durchgeführt werden. Furthermore, those skilled in the art can check whether a host or a host cell comprises a protein suitable for the method according to the invention by detecting the (additional) activity of proteins with the activity of a lipase in a corresponding host cell. The activity of proteins with additional activity of a lipase in a corresponding host cell is preferably detected by comparing the activities of lipases in a host cell used for the method according to the invention with the corresponding activity of host cells which do not contain a protein suitable for the method according to the invention. Testing whether a protein has the activity of a lipase can be carried out using methods known in the art.
Für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete Wirte oder Wirtszelle können durch Durchschnittsfachleute mithilfe von bekannten Verfahren zum genetischen Modifizieren oder Transformieren von Organismen hergestellt werden. Hosts or host cells used for the method of the invention can be prepared by those skilled in the art using known methods for genetically modifying or transforming organisms.
Ferner offenbart sind demnach ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeigneter Wirt oder Wirtszelle, insbesondere ein prokaryotischer oder eukaryotischer Wirt oder eine Wirtszelle, genetisch modifiziert (oder transformiert) mit einem geeigneten Nukleinsäuremolekül oder mit einem geeigneten rekombinanten Nukleinsäuremolekül oder mit einem geeingeten Vektor oder mit einem geeingeten Plasmid. Vorzugsweise exprimiert der für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzte genetisch modifizierte (transformierte) Wirt oder die Wirtszelle ein Protein mit der Aktivität einer Lipase, stärker bevorzugt exprimiert der genetisch modifizierte (transformierte) Wirt oder die Wirtszelle ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeignetes Protein. „Genetisch mit einem Nukleinsäuremolekül modifiziert“ oder „mit einem Nukleinsäuremolekül transformiert“ soll hierin so verstanden werden, dass ein Nukleinsäuremolekül durch technische und/oder nicht natürlich vorkommende Mittel in einen Wirt oder in eine Wirtszelle eingeführt wird oder wurde, vorzugsweise durch technische Verfahren aus dem Bereich der Molekularbiologie, der Biotechnologie oder der Gentechnik. Also disclosed are a host or host cell suitable for the method according to the invention, in particular a prokaryotic or eukaryotic host or a host cell, genetically modified (or transformed) with a suitable nucleic acid molecule or with a suitable recombinant nucleic acid molecule or with a suitable vector or with a suitable plasmid . Preferably, the genetically modified (transformed) host or host cell used for the method according to the invention expresses a protein with the activity of a lipase, more preferably the genetically modified (transformed) host or host cell expresses a protein suitable for the method according to the invention. “Genetically modified with a nucleic acid molecule” or “transformed with a nucleic acid molecule” is to be understood herein to mean that a nucleic acid molecule is or has been introduced into a host or into a host cell by technical and/or non-naturally occurring means, preferably by technical methods from the Areas of molecular biology, biotechnology or genetic engineering.
Nachfahren oder Nachkommen von für das erfindungsgemäße Verfahren eingesetzte Wirte oder Wirtszellen sind ebenfalls offenabrt, vorzugsweise umfassen diese Nachfahren oder Nachkommen ein für das erfindungsgemäße Verfahren geeignetes Nukleinsäuremolekül oder umfassen ein geeignetes rekombinantes Nukleinsäuremolekül oder umfassen einen geeigneten Vektor oder umfassen ein geeignetes Plasmid oder umfassen ein geeignetes Protein, weiter bevorzugt umfassen diese Nachfahren oder Nachkommen ein geeignetes Nukleinsäuremolekül oder umfassen ein geeignetes rekombinantes Nukleinsäuremolekül oder umfassen einen geeigneten Vektor oder umfassen ein geeignetes Plasmid und sie exprimieren in jedem Fall ein Protein, wobei das Protein die Aktivität einer Lipase aufweist, noch weiter bevorzugt umfassen diese Nachfahren oder Nachkommen ein geeignetes Nukleinsäuremolekül oder umfassen ein geeignetes rekombinantes Nukleinsäuremolekül oder umfassen einen geeignete Vektor oder umfassen ein geeignetes Plasmid und sie exprimieren in jedem Fall ein Protein, wobei das Protein die Aktivität einer Lipase aufweist, die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann. Descendants or descendants of hosts or host cells used for the method according to the invention are also open, preferably these descendants or descendants comprise a nucleic acid molecule suitable for the method according to the invention or comprise a suitable recombinant nucleic acid molecule or comprise a suitable vector or comprise a suitable plasmid or comprise a suitable protein , more preferably these descendants or descendants comprise a suitable nucleic acid molecule or comprise a suitable recombinant nucleic acid molecule or comprise a suitable vector or comprise a suitable plasmid and in each case they express a protein, the protein having the activity of a lipase, even more preferably these descendants or descendants comprise a suitable nucleic acid molecule or comprise a suitable recombinant nucleic acid molecule or comprise a suitable vector or comprise a suitable plasmid and in each case they express a protein, the protein having the activity of a lipase which can be used in the method according to the invention.
Der Wirt oder die Wirtszelle für das erfindungsgemäße Verfahren kann ein Wirt oder eine Wirtszelle von einem prokaryotischen oder einem eukaryotischen Organismus sein. Der Wirt oder die Wirtszellen können Bakterien oder Bakterienzellen (z. B. E. coli, Bakterien der Gattung Bacillus, insbesondere Bacillus subtilis, Agrobacterium, insbesondere Agrobacterium tumefaciens oder Agrobacterium rhizogenes, Pseudomonas, insbesondere Pseudomonas fluorescens, Streptomyces spp, Rhodococcus spp, insbesondere Rhodococcus rhodochrous, Vibrio natrigens, Corynebacterium, insbesondere Corynebacterium glutamicum) oder Pilze oder Pilzzellen (z. B. Agaricus, insbesondere Agaricus bisporus, Aspergillus, Trichoderma oder Hefen, insbesondere .8. cerevisiae, Pichia ssp. wie etwa P. pastoris), sowie Pflanzen oder Pflanzenzellen sein oder sie können Tiere oder tierische Zellen sein. Bevorzugte Wirtszellen sind Zellen von Mikroorganismen. Im Rahmen der vorliegenden Patentanmeldung wird davon ausgegangen, dass alle Bakterien und Protisten (z. B. Pilze, insbesondere Hefen und Algen), wie zum, Beispiel definiert in Schlegel „General Microbiology“ (Georg Thieme Verlag (1985), 1-2), eingeschlossen sind. In Bezug auf Mikroorganismen sind die für das erfindungsgemäße Verfahren genutzten Wirte oder Wirtszellen vorzugsweise Bakterien/Bakterienzellen oder Hefen/Hefezellen, weiter bevorzugt Bakterien/Bakterienzellen, noch weiter bevorzugt Bacillus- Spezies/BacZZZus-Spezieszellen oder Escherichia coli/ Escherichia coli-Zellen, am stärksten bevorzugt Escherichia coli/Escherichia coli-Zellen. Alternativ dazu können Pseudomonas, insbesondere Pseudomonas fluorescens, Streptomyces spp, Rhodococcus spp, insbesondere Rhodococcus rhodochrous, Vibrio spp, insbesondere Vibrio natrigens, Corynebacterium, insbesondere Corynebacterium glutamicum oder andere Wirte oder Wirtszellen für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden. The host or host cell for the method according to the invention may be a host or host cell from a prokaryotic or a eukaryotic organism. The host or host cells can be bacteria or bacterial cells (e.g. E. coli, bacteria of the genus Bacillus, in particular Bacillus subtilis, Agrobacterium, in particular Agrobacterium tumefaciens or Agrobacterium rhizogenes, Pseudomonas, in particular Pseudomonas fluorescens, Streptomyces spp, Rhodococcus spp, in particular Rhodococcus rhodochrous, Vibrio natrigens, Corynebacterium, in particular Corynebacterium glutamicum) or fungi or fungal cells (e.g. Agaricus, in particular Agaricus bisporus, Aspergillus, Trichoderma or yeasts, in particular .8. cerevisiae, Pichia ssp. such as P. pastoris), as well as plants or plant cells or they can be animals or animal cells. Preferred host cells are cells of microorganisms. In the context of the present patent application, it is assumed that all bacteria and protists (e.g. fungi, in particular yeasts and algae), as defined, for example, in Schlegel "General Microbiology" (Georg Thieme Verlag (1985), 1-2) , are included. With regard to microorganisms, the hosts or host cells used for the method according to the invention are preferably bacteria/bacterial cells or yeasts/yeast cells, more preferably bacteria/bacterial cells, even more preferably Bacillus species/BacZZZus species cells or Escherichia coli/Escherichia coli cells, the strongest prefers Escherichia coli/Escherichia coli cells. Alternatively, Pseudomonas, in particular Pseudomonas fluorescens, Streptomyces spp, Rhodococcus spp, in particular Rhodococcus rhodochrous, Vibrio spp, in particular Vibrio natrigens, Corynebacterium, in particular Corynebacterium glutamicum or other hosts or host cells can be used for the method according to the invention.
Bevorzugte Wirte oder Wirtszellen für das erfindungsgemäße Verfahren umfassen ein geeignetes Nukleinsäuremolekül, wobei das geeignete Nukleinsäuremolekül dadurch gekennzeichnet ist, dass die Codons des Nukleinsäuremoleküls derart verändert sind, dass sie an die Nutzungshäufigkeit der Codons des Wirts bzw. einer Wirtszelle angepasst sind. Beschreibung der Sequenzen Preferred hosts or host cells for the method according to the invention comprise a suitable nucleic acid molecule, the suitable nucleic acid molecule being characterized in that the codons of the nucleic acid molecule are modified in such a way that they are adapted to the frequency of use of the codons of the host or a host cell. Description of the sequences
In der gesamten Anmeldung werden Abkürzungen für Nukleotide und Aminosäuren den folgenden lUPAC-Codes entsprechend eingesetzt: Throughout the application, abbreviations for nucleotides and amino acids are used according to the following lUPAC codes:
Tabelle 1
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Table 1
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Zum Unterscheiden zwischen Aminosäuren und Nukleotiden, werden die in der obigen Tabelle groß geschriebenen abgekürzten Nukleotidcodes hier klein geschrieben. To distinguish between amino acids and nucleotides, the abbreviated nucleotide codes capitalized in the table above are capitalized here.
Tabelle 2
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Table 2
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Die Verwendung von Codons hierin folgt dem sogenannten „allgemeinen genetischen Code“ der folgenden Tabelle entsprechend, wobei „t“ in Ribonukleotidsäure(RNA)-Sequenzen durch „u“ zu ersetzen ist. The use of codons herein follows the so-called “general genetic code” of the following table, replacing “t” with “u” in ribonucleotide acid (RNA) sequences.
Tabelle 3
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Table 3
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Tabelle 4 Table 4
Die mit dieser Anmeldung verknüpfte Sequenzliste wird in elektronischem Format eingereicht und hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit in diese Patentschrift aufgenommen. „PRT“ steht für „Protein“ und „NUC“ für „Nukleinsäure“.
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The sequence list associated with this application is filed in electronic format and is hereby incorporated by reference in its entirety into this specification. “PRT” stands for “protein” and “NUC” stands for “nucleic acid”.
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Das Protein mit der Aktivität einer Lipase wird bevorzugt in einer Menge von 0,1-50 Gew.-% bezogen auf das Gemisch (I) eingesetzt. Bevorzugt ist eine Menge von 0,5-10 Gew.-%. Insbesondere bevorzugt ist eine Menge von 1-5 Gew.-%. The protein with the activity of a lipase is preferably used in an amount of 0.1-50% by weight based on the mixture (I). An amount of 0.5-10% by weight is preferred. An amount of 1-5% by weight is particularly preferred.
Schritt 1 des erfindungsgemäßen Verfahrens kann in Abwesenheit eines Lösungsmittels oder in einem solchen durchgeführt werden. Bevorzugt sind Lösungsmittel aus der Gruppe Methyl- t-butylether, Heptan, Toluol, Xylole, Mesitylen, Anisol, Chlorbenzol, n-Butanol, z-Propanol, n-Propanol und Ethanol sowie Gemische davon. Besonders bevorzugt sind Lösungsmittel aus der Gruppe Toluol, Xylole, Mesitylen, n-Butanol und Ethanol sowie Gemische davon. Ebenfalls besonders bevorzugt wird die Reaktion in Abwesenheit eines Lösungsmittels durchgeführt. Step 1 of the method according to the invention can be carried out in the absence of a solvent or in one. Solvents from the group consisting of methyl t-butyl ether, heptane, toluene, xylenes, mesitylene, anisole, chlorobenzene, n-butanol, z-propanol, n-propanol and ethanol and mixtures thereof are preferred. Solvents from the group toluene, xylenes, mesitylene, n-butanol and ethanol and mixtures thereof are particularly preferred. The reaction is also particularly preferably carried out in the absence of a solvent.
Bezogen auf die eingesetzte Stoffmenge des Gemisches (I) wird das Acylierungs- oder Carboxylierungsmittel R-C(=O)R’ bevorzugt in einer Menge von 0,4-25 Äquivalenten eingesetzt. Besonders bevorzugt wird es in einer Menge von 0,6-10 Äquivalenten eingesetzt. Insbesondere bevorzugt wird es in einer Menge von 1-5 Äquivalenten eingesetzt. Based on the amount of mixture (I) used, the acylating or carboxylating agent R-C(=O)R' is preferably used in an amount of 0.4-25 equivalents. It is particularly preferably used in an amount of 0.6-10 equivalents. It is particularly preferably used in an amount of 1-5 equivalents.
Die Reaktion gemäß Schritt 1 wird üblicherweise bei Temperaturen von 20-130 °C durchgeführt. Bevorzugt wird die Reaktion bei 70-130 °C durchgeführt. Besondere bevorzugt wird die Reaktion bei 80-120°C durchgeführt. The reaction according to step 1 is usually carried out at temperatures of 20-130 ° C. The reaction is preferably carried out at 70-130 °C. The reaction is particularly preferably carried out at 80-120°C.
Die in Schritt 2 des erfindungsgemäßen Verfahrens genannte Trennung der Komponente (II) erfolgt durch eine dem Fachmann bekannte Kristallisation. The separation of component (II) mentioned in step 2 of the process according to the invention takes place by crystallization known to those skilled in the art.
Die in Schritt 3 des erfindungsgemäßen Verfahrens genannten Basen stammen üblicherweise aus der Gruppe bestehend aus Lithiumhydroxid, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumcarbonat, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Lithiummethanolat, Natriummethanolat, Kaliummethanolat, Lithiumethanolat, Natriumethanolat und Kaliumethanolat. Besonders bevorzugt werden die Basen Lithiumhydroxid, Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Lithiumethanolat, Natriumethanolat und Kaliumethanolat verwendet. The bases mentioned in step 3 of the process according to the invention usually come from the group consisting of lithium hydroxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide, lithium carbonate, Sodium carbonate, potassium carbonate, lithium methoxide, sodium methoxide, potassium methoxide, lithium ethoxide, sodium ethoxide and potassium ethoxide. The bases lithium hydroxide, sodium hydroxide, potassium hydroxide, lithium ethoxide, sodium ethoxide and potassium ethoxide are particularly preferably used.
Ganz besonders bevorzugt werden die Basen Lithiumhydroxid, Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid verwendet. The bases lithium hydroxide, sodium hydroxide and potassium hydroxide are particularly preferably used.
Üblicherweise wird die Base bezogen auf die Stoffmenge der eingesetzten Komponente (II) in einer Stöchiometrie von 1,00-3,00 Äquivalenten eingesetzt. Vorzugsweise wird die Base in einer Menge von 1,50-2,50 Äquivalenten eingesetzt. Insbesondere bevorzugt wird die Base in einer Menge von 1,75 bis 2,25 Äquivalenten eingesetzt. The base is usually used in a stoichiometry of 1.00-3.00 equivalents based on the amount of component (II) used. The base is preferably used in an amount of 1.50-2.50 equivalents. The base is particularly preferably used in an amount of 1.75 to 2.25 equivalents.
Als Lösungsmittel werden bevorzugt Ethanol, /z-Propanol, z-Propanol, n-Butanol, i-ButanoI, sec-Butanol tert-Butanol und l-Methoxypropan-2-ol, sowie Toluol, Xylole und Veratrol eingesetzt. Besonders bevorzugt werden Ethanol, n-Butanol, z-Propanol, l-Methoxypropan-2-ol, Toluol, Xylole und Veratrol eingesetzt. Insbesondere bevorzugt werden Ethanol, n-Butanol und Xylole eingesetzt. The preferred solvents used are ethanol, z-propanol, z-propanol, n-butanol, i-butanoI, sec-butanol, tert-butanol and l-methoxypropan-2-ol, as well as toluene, xylenes and veratrol. Particular preference is given to using ethanol, n-butanol, z-propanol, l-methoxypropan-2-ol, toluene, xylenes and veratrol. Ethanol, n-butanol and xylenes are particularly preferred.
Die Reaktion gemäß Schritt 3 wird üblicherweise bei Temperaturen von 60-140 °C durchgeführt. Bevorzugt wird die Reaktion bei 80-120 °C durchgeführt. Besondere bevorzugt wird die Reaktion bei 90-110 °C durchgeführt. The reaction according to step 3 is usually carried out at temperatures of 60-140 °C. The reaction is preferably carried out at 80-120 °C. The reaction is particularly preferably carried out at 90-110 ° C.
Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht auch darin, dass das in Schritt 1 bzw. Schritt 2 verbleibende Gemisch von 2,6-Dimethyl-l-indanaminen (III) metallkatalysiert Ressourcenschonend wieder zu einem Gemisch der vier Stereoisomeren von 2,6-Dimethyl-l-indanamin (I) isomerisiert werden kann. Another advantage of the process according to the invention is that the mixture of 2,6-dimethyl-l-indanamines (III) remaining in step 1 or step 2 is metal-catalyzed again in a resource-saving manner to form a mixture of the four stereoisomers of 2,6-dimethyl- l-indanamine (I) can be isomerized.
Diese Isomerisierung kann wie folgt durchgeführt werden: This isomerization can be carried out as follows:
Als Metallkatalysator wird bevorzugt ein Palladium auf Kohle (Pd/C), ein Palladium auf Calciumcarbonat (Pd/CaCCL) oder ein Palladium auf Aluminiumoxid (Pd/AhOi ) Katalysator mit einer Palladiumbeladung von 1-20 Gew.-% eingesetzt. Ebenfalls bevorzugt wird der Shvo-Katalysator mit dem lUPAC-Namen 1 -Hydroxytetraphenylcyclopentadienyl-(tetraphenyl-2,4-cyclopentadien- 1 -on)-p- hydrotetracarbonyldi-ruthenium(II) in einer Stöchiometrie von 1-10 mol% eingesetzt. Besonders bevorzugt wird ein Palladium auf Kohle (Pd/C) oder ein Palladium auf Aluminiumoxid (Pd/AhOi ) Katalysator mit einer Palladiumbeladung von 1-20 Gew.-% eingesetzt. Insbesondere bevorzugt wird ein Palladium auf Aluminiumoxid (Pd/AhCL) Katalysator mit einer Palladiumbeladung von 1-20 Gew.-% eingesetzt. Die geträgerten Katalysatoren werden mit einer Menge von 0,1-10 Gew.-% in Bezug auf die Verbindungen der Formel (III) eingesetzt; bevorzugt werden 0,5-5 Gew.-% eingesetzt. Die Menge der eingesetzten Katalysatoren wird auf die Trockenmasse der Katalysatoren berechnet. The metal catalyst used is preferably a palladium on carbon (Pd/C), a palladium on calcium carbonate (Pd/CaCCL) or a palladium on aluminum oxide (Pd/AhOi) catalyst with a palladium loading of 1-20% by weight. The Shvo catalyst with the lUPAC name 1-hydroxytetraphenylcyclopentadienyl-(tetraphenyl-2,4-cyclopentadien-1-one)-p-hydrotetracarbonyldiruthenium(II) is also preferably used in a stoichiometry of 1-10 mol%. Particular preference is given to using a palladium on carbon (Pd/C) or a palladium on aluminum oxide (Pd/AhOi) catalyst with a palladium loading of 1-20% by weight. Particular preference is given to using a palladium on aluminum oxide (Pd/AhCL) catalyst with a palladium loading of 1-20% by weight. The supported catalysts are used in an amount of 0.1-10% by weight in relation to Compounds of the formula (III) are used; 0.5-5% by weight is preferably used. The amount of catalysts used is calculated based on the dry mass of the catalysts.
Als Basen werden bevorzugt Pyridin, iV-Methylmorpholin, Morpholin, Cyclohexylamin, Di-/z- butylamin, Tri-n-butylamin, Triethylamin, Di-isopropylethylamin, Piperidin, Kaliumcarbonat, Natriumcarbonat, Lithiumcarbonat, Kaliumethoxid, Natriumethoxid und Lithiumethoxid oder keine Base verwendet. Besonders bevorzugt werden Piperidin, Morpholin, Diisopropylethylamin, Tri-n- butylamin, Kaliumcarbonat und Natriumethoxid oder keine Base eingesetzt. Insbesondere bevorzugt werden Piperidin und Natriumethoxid oder keine Base eingesetzt. Pyridine, IV-methylmorpholine, morpholine, cyclohexylamine, di-/z-butylamine, tri-n-butylamine, triethylamine, di-isopropylethylamine, piperidine, potassium carbonate, sodium carbonate, lithium carbonate, potassium ethoxide, sodium ethoxide and lithium ethoxide or no base are preferably used as bases . Particular preference is given to using piperidine, morpholine, diisopropylethylamine, tri-n-butylamine, potassium carbonate and sodium ethoxide or no base. Piperidine and sodium ethoxide or no base are particularly preferably used.
Als Lösungsmittel werden bevorzugt Toluol, Xylole, Mesitylen, Anisol, Chlorbenzol, n-Butanol, i- Propanol, n-Propanol und Ethanol eingesetzt oder die Reaktion in Abwesenheit eines Lösungsmittels durchgeführt. Besonders bevorzugt werden als Lösungsmittel Toluol, Xylole, Mesitylen, n-Butanol und Ethanol eingesetzt oder die Reaktion in Abwesenheit eines Lösungsmittels durchgeführt. Insbesondere bevorzugt wird die Reaktion in Abwesenheit eines Lösungsmittels durchgeführt. The preferred solvents used are toluene, xylenes, mesitylene, anisole, chlorobenzene, n-butanol, i-propanol, n-propanol and ethanol, or the reaction is carried out in the absence of a solvent. Toluene, xylenes, mesitylene, n-butanol and ethanol are particularly preferred as solvents, or the reaction is carried out in the absence of a solvent. The reaction is particularly preferably carried out in the absence of a solvent.
Die Reaktion wird bevorzugt zwischen 0-20 bar Überdruck durchgeführt. Besonders bevorzugt wird die Reaktion zwischen 0-10 bar Überdruck durchgeführt. Insbesondere bevorzugt wird die Reaktion zwischen 1-6 bar Überdruck durchgeführt. The reaction is preferably carried out between 0-20 bar excess pressure. The reaction is particularly preferably carried out between 0-10 bar excess pressure. The reaction is particularly preferably carried out between 1-6 bar excess pressure.
Der Reaktionsdruck wird maßgeblich durch das Aufpressen eines Gases / Gasgemisches erreicht. Bevorzugt wird Wasserstoff, Stickstoff oder Argon bzw. ein Gemisch aus Wasserstoff und Stickstoff oder Wasserstoff und Argon auf gedrückt. Besonders bevorzugt wird Wasserstoff oder ein Gemisch aus Stickstoff und Wasserstoff aufgedrückt. Insbesondere bevorzugt wird reiner Wasserstoff aufgedrückt. Die Reaktion wird bevorzugt bei Temperaturen von 80-150 °C betrieben. Besonders bevorzugt wird die Reaktion bei 100-130 °C betrieben. Insbesondere bevorzugt wird die Reaktion bei 110-125 °C betrieben. The reaction pressure is largely achieved by pressing on a gas/gas mixture. Hydrogen, nitrogen or argon or a mixture of hydrogen and nitrogen or hydrogen and argon is preferably pressed on. Hydrogen or a mixture of nitrogen and hydrogen is particularly preferably injected. Pure hydrogen is particularly preferably injected. The reaction is preferably carried out at temperatures of 80-150 °C. The reaction is particularly preferably operated at 100-130 ° C. The reaction is particularly preferably operated at 110-125 ° C.
Ein weiterer Gegenstand vorliegender Erfindung ist somit auch Verfahren zur Herstellung eines Gemisches aller vier Stereoisomeren von 2,6-Dimethyl-l-indanamin (I) durch metallkatalysierte Isomerisierung eines Gemisches der drei Stereoisomeren von (1R,2R)-, (1S,2R)- und (lS,2S)-2,6- Dimethyl- 1 -indanamin :
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A further subject of the present invention is therefore also a process for producing a mixture of all four stereoisomers of 2,6-dimethyl-l-indanamine (I) by metal-catalyzed isomerization of a mixture of the three stereoisomers of (1R,2R)-, (1S,2R) - and (lS,2S)-2,6-dimethyl-1-indanamine:
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Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher: Medien mit Terrific Broth(TB)-Kultur wurden in demineralisiertem Wasser unter Verwendung von 47,6 g/1 granuliertem Medium und 4 ml/1 Glycerol hergestellt und bei 121 °C 20 Minuten lang sterilisiert. The following examples explain the invention in more detail: Terrific Broth (TB) culture media were prepared in demineralized water using 47.6 g/l granular medium and 4 ml/l glycerol and sterilized at 121°C for 20 min.
Klonierung von Lipasen Cloning of lipases
Nukleotidsequenzen, die für Lipasen und Lipasevarianten wie hierin beschrieben kodieren, können wie nach dem Stand der Technik bekannt synthetisiert werden, z. B. wie angeboten von entsprechenden Dienstleistern, wie etwa Eurofins Genomics GmbH (Eurofins Genomics GmbH, Anzinger Str. 7a, 85560 Ebersberg, Deutschland). Kurz gesagt wurden Nukleinsäuresequenzen von Wildtyp-Lipase (SEQ ID No. 2) oder verwandten Varianten, wie hierin beschrieben, in einen Expressionsvektor kloniert, der auf dem Vektor pKA81a basiert. Genetische Elemente wurden mittels allgemein bekannter Verfahren in den modifizierten pKA81a-Vektor eingeführt. Zur Expression von Wildtyp-Lipase bzw. Lipasevarianten wurden die Expressionsvektoren in elektrokompetente MG1655-Zellen von Escherichia coli eingeführt. Nucleotide sequences encoding lipases and lipase variants as described herein can be synthesized as known in the art, e.g. B. as offered by relevant service providers, such as Eurofins Genomics GmbH (Eurofins Genomics GmbH, Anzinger Str. 7a, 85560 Ebersberg, Germany). Briefly, nucleic acid sequences of wild-type lipase (SEQ ID No. 2) or related variants as described herein were cloned into an expression vector based on the vector pKA81a. Genetic elements were introduced into the modified pKA81a vector using well-known methods. To express wild-type lipase or lipase variants, the expression vectors were introduced into electrocompetent Escherichia coli MG1655 cells.
Erzeugung von Enzymvarianten Generation of enzyme variants
Nukleotidsubstitutionen (Ersetzungen) wurden in die Nukleinsäure-Stammsequenzen eingeführt, z. B. um einen Aminosäureaustausch in andere Aminosäuren zu erzielen. Mehrere molekularbiologische Verfahren können eingesetzt werden, um diese Ersetzungen zu erzielen. Ein nützliches Verfahren zur Herstellung einer mutierten Nukleinsäure und des entsprechenden erfindungsgemäßen mutierten Proteins ist die ortsgerichtete Mutagenese an Codons, die für eine oder mehrere Aminosäuren kodieren, welche im Voraus ausgewählt werden. Die Verfahren zum Erzielen dieser ortsgerichteten Mutationen sind Durchschnittsfachleuten gut bekannt und in der Literatur hinreichend beschrieben (insbesondere: Directed Mutagenese: A Practical Approach, 1991, herausgegeben von M.J. McPHERSON, IRL PRESS) oder sind Verfahren, für die kommerzielle Kits (z. B. das QUIKCHANGE™ Lightning Mutagenesis Kit von Qiagen oder Stratagene) eingesetzt werden können. Nach ortsgerichteter Mutagenese wurden Nukleinsäuren in die MG1655-Zellen von Escherichia coli transformiert. Nucleotide substitutions (replacements) have been introduced into the nucleic acid stem sequences, e.g. B. to achieve an amino acid exchange into other amino acids. Several molecular biology techniques can be used to achieve these replacements. A useful method for producing a mutant nucleic acid and the corresponding mutant protein of the invention is site-directed mutagenesis at codons encoding one or more amino acids which are selected in advance. The methods for achieving these site-directed mutations are well known to those of ordinary skill in the art and are well described in the literature (in particular: Directed Mutagenesis: A Practical Approach, 1991, edited by M.J. McPHERSON, IRL PRESS) or are methods for which commercial kits (e.g. the QUIKCHANGE™ Lightning Mutagenesis Kit from Qiagen or Stratagene) can be used. After site-directed mutagenesis, nucleic acids were transformed into the MG1655 cells of Escherichia coli.
Transformierte Zellen wurden in geeigneten Biotransformationsreaktionen getestet, um die Produktausbeute und -Selektivität zu bestimmen. Geeignete Biotransformationsreaktionen sind nachfolgend beschrieben. Die Sequenzverifizierung wurde wie nach dem Stand der Technik bekannt durchgeführt. Transformed cells were tested in appropriate biotransformation reactions to determine product yield and selectivity. Suitable biotransformation reactions are described below. Sequence verification was performed as known in the art.
Glycerinvorräte der mit den jeweiligen Expressionsplasmiden transformierten E. coZZ-Kulturen wurden hergestellt, indem ein Volumen einer 40%igen Glycerinlösung zu einem Volumen einer E. coZZ-Kultur hinzugefügt wurde. Zur Isolierung einzelner Bakterienkolonien wurden geeignete Verdünnungen von E. coZz-Kulturen auf LB -Agarplatten ausplattiert, die geeignete Konzentrationen von Kanamycin enthielten, und bei 37 °C inkubiert, bis einzelne Kolonien erhalten wurden. Glycerol stocks of the E. coZZ cultures transformed with the respective expression plasmids were prepared by adding a volume of a 40% glycerol solution to a volume of an E. coZZ culture. To isolate individual bacterial colonies, appropriate dilutions of E. coZz cultures were plated on LB agar plates containing appropriate concentrations of kanamycin and incubated at 37 °C until individual colonies were obtained.
Synthese von Ethyl- [( 1 R,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro- 1 H-inden- 1 -yl] carbamat Synthesis of ethyl-[( 1 R,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro- 1 H-inden- 1 -yl] carbamate
Beispiel 1: Example 1:
In einem Vergleichsexperiment wurden drei verschiedene Proteine mit der Aktivität einer Lipase hinsichtlich ihrer Eignung untersucht: die Wildtyp-Lipase (SEQ ID No. 1) und die Lipasevarianten mit der SEQ ID No. 233 und SEQ ID No. 399. Hierzu wurden jeweils 9,25 g 2,6-Dimethylindan-l-amin (razemische Mischung aus 82% trans- und 18% cis-2,6-Dimethylindan-l-amin) in einem 25 mL Dreihalskolben mit Magnetrührer unter Argon vorgelegt und mit jeweils 13,6 g Diethylcarbonat verdünnt. Diese Lösung wurde auf eine Innentemperatur von 110 °C erhitzt und anschließend jeweils 250 mg Protein mit der Aktivität einer Lipase??? in einer Portion hinzugegeben. Die Umsetzungen wurden mittels HPLC-Messungen auf ihren Reaktionsfortschritt kontrolliert. Nach vollständiger Umsetzung des (lR,2S)-2,6-Dimethylindan-l-amin Isomers wurde die Reaktion mittels Zugabe von 5 mL Diethylcarbonat, Abkühlen auf 100 °C und Filtration dieser Reaktionsmischung über eine Glasfritte (Porosität 3) abgebrochen. Weitere 5 mL Diethylcarbonat wurden verwendet, um den Filterkuchen zu waschen. Das kombinierte, orange Filtrat wurde anschließend einer Destillation bei 50 °C und 35-10 mbar Vakuum unterworfen. Zum Destillationsrückstand wurden 50 mL n-Heptan hinzugegeben und die Lösung 20 Minuten bei 40 °C gerührt. Während der Abkühlung auf 2 °C bildete sich eine Suspension, welche mittels einer Glasfritte (Porosität 3) filtriert wurde. Der Filterkuchen wurde mit 5 mL n-Heptan gewaschen und anschließend im Vakuum getrocknet. Der erhaltene weiße Feststoff wurde anschließend mittels quantitativer ’H-NMR-Messung auf chemische Reinheit und mittels chiraler HPLC-Messung auf Stereoisomerenreinheit hin untersucht. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle 5 gegenübergestellt: In a comparison experiment, three different proteins with the activity of a lipase were examined for their suitability: the wild-type lipase (SEQ ID No. 1) and the lipase variants with SEQ ID No. 233 and SEQ ID No. 399. For this purpose, 9.25 g of 2,6-dimethylindan-l-amine (racemic mixture of 82% trans- and 18% cis-2,6-dimethylindan-l-amine) were placed in a 25 mL three-necked flask with a magnetic stirrer under argon submitted and diluted with 13.6 g of diethyl carbonate. This solution was heated to an internal temperature of 110 °C and then 250 mg of protein with the activity of a lipase??? added in one portion. The reactions were monitored for their reaction progress using HPLC measurements. After complete reaction of the (IR,2S)-2,6-dimethylindane-l-amine isomer, the reaction was stopped by adding 5 mL of diethyl carbonate, cooling to 100 ° C and filtering this reaction mixture through a glass frit (porosity 3). An additional 5 mL of diethyl carbonate was used to wash the filter cake. The combined orange filtrate was then subjected to distillation at 50 ° C and 35-10 mbar vacuum. 50 mL of n-heptane were added to the distillation residue and the solution was stirred at 40 °C for 20 minutes. During cooling to 2 °C, a suspension formed which was filtered using a glass frit (porosity 3). The filter cake was washed with 5 mL n-heptane and then dried under vacuum. The white solid obtained was then examined for chemical purity using quantitative 'H-NMR measurement and for stereoisomeric purity using chiral HPLC measurement. The results are compared in the following Table 5:
Tabelle 5
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Table 5
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Die Ausbeuten beziehen sich hier auf den Gehalt von reinem Ethyl-[(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro- 1 H-inden- 1 -yl] carbamat. Beispiel 2: The yields here refer to the content of pure ethyl [(1R,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-yl] carbamate. Example 2:
In einen 500 mL Vierhalsrundkolben, ausgestattet mit einem Innenthermometer, einem Magnetrührer, einem Inertgaseinlass und einem Blasenzähler, wurden 80,0 g 2,6-Dimethylindan-l-amin (racemische Mischung aus 82% trans- und 18% cis-2,6-Dimethylindan-l-amin) unter Argon in 130,0 g Diethylcarbonat gelöst. Diese Lösung wurde unter Rühren auf eine Innentemperatur von 110 °C erwärmt. Anschließend wurden 1,2 g mit SEQ ID No. 234 transformierte E.coli-Kultur in einer Portion hinzugegeben und die Reaktion bei 110 °C unter Rühren und Argon fortgeführt. Nach einer Reaktionszeit von 7 Stunden wurde mittels einer HPLC-Messung ein nahezu vollständiger Umsatz des (lR,2S)-2,6-Dimethylindan-l-amins festgestellt und die Reaktion mittels Abkühlen auf 80 °C und anschließender Filtration über eine Glasfritte (Porosität 3) abgebrochen. Der Filterkuchen wurde anschließend mit 2 x 40 mL Diethylcarbonat gewaschen und das kombinierte Filtrat einer Destillation bei 50 °C und 35-10 mbar Vakuum unterworfen. Dabei wurden von anfänglichen 264,2 g Filtrat insgesamt 157,4 g Destillat abgetrennt. Zu dem Destillationsrückstand wurden dann 120 mL Methylcyclohexan hinzugegeben und die erhaltene Mischung auf 2 °C abgekühlt, so dass eine Suspension entstand. Der Feststoff wurde mittels Filtration über eine Glasfritte (Porosität 3) abgetrennt und mit wenig Methylcyclohexan gewaschen. Nach Trocknung im Vakuum wurden 37,0 g eines weißen Feststoffs erhalten. Eine quantitative ’H-NMR-Messung bestätigte Ethyl-[(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3- dihydro-lH-inden-l-yl]carbamat in einer chemischen Reinheit von 85,4%. Mittels einer chiralen HPEC- Messung konnte die Stereoisomerenreinheit zu 98.5% bestimmt werden. Dies entspricht einer Ausbeute von 27% reinen Ethyl-[(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-lH-inden-l-yl]carbamats. ’H-NMR (400 MHz; CDCL) 5 = 7.08-7.01 (m, 3H), 4.81-4.71 (m, 2H), 4.19 (q, J = 8.0 Hz, 2H), 3.00 (dd, J = 8.0, 14.0 Hz, 1H), 2.51-2.45 (m, 1H), 2.33 (s, 3H), 2.16 (dt, J = 8.0, 14.0 Hz, 1H), 1.31-1.26 (m, 6H). Into a 500 mL four-necked round bottom flask equipped with an internal thermometer, a magnetic stirrer, an inert gas inlet and a bubble counter, 80.0 g of 2,6-dimethylindane-l-amine (racemic mixture of 82% trans- and 18% cis-2,6 -Dimethylindan-l-amine) dissolved under argon in 130.0 g of diethyl carbonate. This solution was heated to an internal temperature of 110 ° C while stirring. Subsequently, 1.2 g with SEQ ID No. 234 transformed E. coli culture was added in one portion and the reaction was continued at 110 ° C with stirring and argon. After a reaction time of 7 hours, an almost complete conversion of the (IR,2S)-2,6-dimethylindane-l-amine was determined using an HPLC measurement and the reaction was carried out by cooling to 80 ° C and subsequent filtration through a glass frit (porosity 3) canceled. The filter cake was then washed with 2 x 40 mL diethyl carbonate and the combined filtrate was subjected to distillation at 50 ° C and 35-10 mbar vacuum. A total of 157.4 g of distillate were separated from the initial 264.2 g of filtrate. 120 mL of methylcyclohexane were then added to the distillation residue and the resulting mixture was cooled to 2 °C so that a suspension was formed. The solid was separated by filtration through a glass frit (porosity 3) and washed with a little methylcyclohexane. After drying in vacuo, 37.0 g of a white solid were obtained. A quantitative 'H-NMR measurement confirmed ethyl [(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-lH-inden-l-yl]carbamate in a chemical purity of 85.4%. Using a chiral HPEC measurement, the stereoisomeric purity was determined to be 98.5%. This corresponds to a yield of 27% pure ethyl [(1R,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-yl]carbamate. 'H-NMR (400 MHz; CDCL) 5 = 7.08-7.01 (m, 3H), 4.81-4.71 (m, 2H), 4.19 (q, J = 8.0 Hz, 2H), 3.00 (dd, J = 8.0, 14.0 Hz, 1H), 2.51-2.45 (m, 1H), 2.33 (s, 3H), 2.16 (dt, J = 8.0, 14.0 Hz, 1H), 1.31-1.26 (m, 6H).
Das Derivat Methyl-[(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-lH-inden-l-yl]carbamat wurde in analoger Form unter Verwendung von Dimethylcarbonat hergestellt und wurde in Form eines weißen Feststoffs erhalten. 'H-NMR (400 MHz; CDCL) 5 = 7.08-7.01 (m, 3H), 4.79-4.78 (m, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.00 (dd, 7 = 8.0, 16.0 Hz, 1H), 2.51-2.45 (m, 1H), 2.32 (s, 3H), 2.20-2.10 (m, 1H), 1.27 (d, J = 8.0 Hz, 3H). The derivative methyl [(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-lH-inden-l-yl]carbamate was prepared in an analogous form using dimethyl carbonate and was obtained as a white solid. 'H-NMR (400 MHz; CDCL) 5 = 7.08-7.01 (m, 3H), 4.79-4.78 (m, 2H), 3.74 (s, 3H), 3.00 (dd, 7 = 8.0, 16.0 Hz, 1H) , 2.51-2.45 (m, 1H), 2.32 (s, 3H), 2.20-2.10 (m, 1H), 1.27 (d, J = 8.0 Hz, 3H).
Beispiel 3: Example 3:
In einen 25 mE Dreihalskolben, ausgestattet mit einem Innenthermometer, einem Inertgaseinlass, einem Blasenzähler und einem Magnetrührer, wurde 14,65 g Diethylcarbonat unter Argon auf 110 °C Innentemperatur erwärmt. Anschließend wurden sowohl 10,00 g 2,6-Dimethylindan-l-amin (racemische Mischung aus 82% trans- und 18% cis-2,6-Dimethylindan-l-amin) als auch 0,25 g mit SEQ ID No. 234 transformierte E.coli-Kultur in einer Portion hinzugegeben und die Reaktion unter Argon für 10 Stunden bei 110 °C unter Rühren fortgeführt, bis eine HPEC-Messung auf einen nahezu vollständigen Umsatz des (lR,2S)-2,6-Dimethylindan-l-amins hinwies. Die Reaktionsmischung wurde daraufhin mit weiteren 5 mE Diethylcarbonat verdünnt und anschließend bei 100 °C mittels einer Glasfritte (Porosität 3) filtriert. Der Filterkuchen wurde anschließend mit 5 mL, auf 80 °C temperiertem Diethylccarbonat gewaschen. Das kombinierte Filtrat wurde anschließend einer Destillation bei 50 °C und 35-10 mbar Vakuum unterworfen. Anschließend wurden zum Destillationsrückstand 50 mL n-Heptan hinzugegeben, was in einer dicken Suspension resultierte. Die Suspension wurde auf 40 °C erwärmt und für 20 Minuten bei dieser Temperatur gerührt. Anschließend wurde die Suspension innerhalb von 30 Minuten auf 21 °C abgekühlt. Daraufhin wurde die Suspension weiter auf 2 °C abgekühlt und mittels einer Glasfritte (Porosität 3) filtriert. Der Filterkuchen wurde mit 20 mL, auf 5 °C abgekühltem n-Heptan gewaschen und anschließend bei 40 °C und 10 mbar Vakuum getrocknet. Es wurden 5,1 g eines weißen Feststoffs erhalten. Eine quantitative ’H-NMR-Messung bestätigte Ethyl-[(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3- dihydro-lH-inden-l-yl]carbamat in einer chemischen Reinheit von 99%. Mittels einer chiralen HPLC- Messung konnte die Stereoisomerenreinheit zu 98,5% bestimmt werden. Dies entspricht einer Ausbeute von 34% reinen Ethyl-[(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-lH-inden-l-yl]carbamats. In a 25 mE three-necked flask equipped with an internal thermometer, an inert gas inlet, a bubble counter and a magnetic stirrer, 14.65 g of diethyl carbonate was heated under argon to an internal temperature of 110 ° C. Subsequently, both 10.00 g of 2,6-dimethylindan-l-amine (racemic mixture of 82% trans- and 18% cis-2,6-dimethylindan-l-amine) and 0.25 g with SEQ ID No. 234 transformed E. coli culture was added in one portion and the reaction was continued under argon for 10 hours at 110 ° C with stirring until an HPEC measurement showed almost complete conversion of the (IR,2S)-2,6-dimethylindane. l-amins pointed out. The reaction mixture was then diluted with a further 5 mE of diethyl carbonate and then heated to 100 °C using a glass frit (porosity 3). filtered. The filter cake was then washed with 5 mL of diethyl carbonate heated to 80 °C. The combined filtrate was then subjected to distillation at 50 ° C and 35-10 mbar vacuum. 50 mL of n-heptane were then added to the distillation residue, resulting in a thick suspension. The suspension was heated to 40 °C and stirred at this temperature for 20 minutes. The suspension was then cooled to 21 °C within 30 minutes. The suspension was then further cooled to 2 °C and filtered using a glass frit (porosity 3). The filter cake was washed with 20 mL of n-heptane cooled to 5 °C and then dried at 40 °C and 10 mbar vacuum. 5.1 g of a white solid was obtained. A quantitative 'H-NMR measurement confirmed ethyl [(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-lH-inden-l-yl]carbamate in a chemical purity of 99%. The stereoisomeric purity was determined to be 98.5% using a chiral HPLC measurement. This corresponds to a yield of 34% pure ethyl [(1R,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-yl]carbamate.
Beispiel 4: Example 4:
In einen 600 mL Autoklaven wurden 100,0 g 2,6-Dimethylindan-l-amin (racemische Mischung aus 82% trans- und 18% cis-2,6-Dimethylindan-l-amin), 139,2 g Diethylcarbonat und 2 g Biomasse GÖ171- 7-032 unter Argon 7 h bei 110 °C gerührt. Nach Abkühlen auf 80 °C wurde über eine Glasfritte filtriert und der Filterkuchen mit Diethylcarbonat gewaschen. Das kombinierte Filtrat wurde unter reduziertem Druck bei 50 °C eingeengt und der Destillationsrückstand durch Zugabe von 150 mL Methylcyclohexan im Eisbad kristallisiert. Der Feststoff wurde über eine Glasfritte abfiltriert und mit wenig Methylcyclohexan gewaschen. Nach Trocknung im Vakuum wurden 47,6 g eines weißen Feststoffs erhalten. Eine quantitative ’H-NMR-Messung bestätigte Ethyl-[(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-lH- inden-l-yl]carbamat in einer chemischen Reinheit von 91,9%. Mittels einer chiralen HPLC-Messung konnte die Stereoisomerenreinheit von 96, 1 % bestimmt werden. Dies entspricht einer Ausbeute von 31,9% reinen Ethyl-[(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-lH-inden-l-yl]carbamats. Das Filtrat wurde unter reduziertem Druck bei 50 °C eingeengt und der Gehalt der 2,6-Dimethylindan-l-amin Isomere durch chirale GC auf ein Isomerenverhältnis von R,R : S,S : S,R : R,S = 6,0 : 16,2 : 77,2 : 0 bestimmt. 100.0 g of 2,6-dimethylindan-l-amine (racemic mixture of 82% trans- and 18% cis-2,6-dimethylindan-l-amine), 139.2 g of diethyl carbonate and 2 were placed in a 600 mL autoclave g biomass GÖ171-7-032 stirred under argon for 7 h at 110 °C. After cooling to 80 ° C, it was filtered through a glass frit and the filter cake was washed with diethyl carbonate. The combined filtrate was concentrated under reduced pressure at 50 °C and the distillation residue was crystallized by adding 150 mL of methylcyclohexane in an ice bath. The solid was filtered off through a glass frit and washed with a little methylcyclohexane. After drying in vacuo, 47.6 g of a white solid were obtained. A quantitative 'H-NMR measurement confirmed ethyl [(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-lH-inden-l-yl]carbamate in a chemical purity of 91.9%. The stereoisomeric purity of 96.1% was determined using a chiral HPLC measurement. This corresponds to a yield of 31.9% pure ethyl [(1R,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-1H-inden-1-yl]carbamate. The filtrate was concentrated under reduced pressure at 50 ° C and the content of the 2,6-dimethylindane-l-amine isomers was adjusted by chiral GC to an isomer ratio of R,R: S,S: S,R: R,S = 6, 0: 16.2: 77.2: 0 determined.
Synthese von (lR,2S)-2,6-Dimethylindan-l-amin aus Methyl-[(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-lH- inden- 1 -yl]carbamat Synthesis of (lR,2S)-2,6-dimethylindan-l-amine from methyl-[(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-lH-inden-1-yl]carbamate
Beispiel 5: Example 5:
In einem 250 mL Doppelmantelreaktor, mit Argon bei 21 °C inertisiert, wurden 25 g Methyl- [(1R,2S)- 2,6-dimethyl-2,3-dihydro-lH-inden-l-yl]carbamat (98% Stereomerenreinheit, 98% chemische Reinheit) in 80 mL n-Butanol suspendiert. Die Suspension wurde auf 65 °C Innentemperatur erwärmt und eine klare Lösung erhalten. Anschließend wurden 15 g Kaliumhydroxid (85% chemische Reinheit) in einer Portion hinzugegeben und die Lösung weiter auf 100 °C Innentemperatur erwärmt. Die Lösung wurde für eine Stunde bei dieser Temperatur weiter gerührt, während unlösliche Feststoffe präzipitierten. Eine HPLC Messung wies auf vollständigen Umsatz hin. Daraufhin wurde ein Unterdrück von 360 mbar angelegt und 55 mE Lösungsmittel abdestilliert. Anschließend wurden 100 mL p-Xylol hinzugegeben und die Reaktionsmischung auf 20 °C abgekühlt. Die Mischung wurde mit 1 x 50 mL deionisiertem Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde anschließend bei 40 °C bis auf ein Vakuum von 5 mbar destilliert und 17,8 g (lR,2S)-2,6-Dimethylindan-l-amin in Form eines blassgelben Öls und einer chemischen Reinheit von 95%, ermittelt durch eine quantitative ’H-NMR Messung, erhalten, was einer Ausbeute von 95% entspricht. Die Stereoisomerenreinheit wurde mittels chiraler GC Messung auf 98% bestimmt. >H NMR (500 MHz, CDC13): 5 7.12 (s, 1H), 7.05 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 3.74 (d, J= 8.5 Hz, 1H), 2.98 (dd, 7= 7.5, 15.5 Hz, 1H), 2.42 (dd, J= 9.5, 15.5 Hz, 1H), 2.34 (s, 3H), 1.98 (m, 1H), 1.72 (bs, 2H), 1.24 (d, J= 6.5 Hz, 3H). 25 g of methyl [(1R,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-lH-inden-l-yl] carbamate (98% Stereomer purity, 98% chemical purity) suspended in 80 mL n-butanol. The suspension was heated to an internal temperature of 65 °C and a clear solution was obtained. 15 g of potassium hydroxide (85% chemical purity) were then added in one portion and the solution was further heated to an internal temperature of 100 °C. The solution was continued stirring at this temperature for one hour while insoluble solids precipitated. An HPLC measurement indicated complete conversion. A negative pressure of 360 mbar was then applied and 55 mE of solvent was distilled off. 100 mL of p-xylene were then added and the reaction mixture was cooled to 20 °C. The mixture was washed with 1 × 50 mL deionized water. The organic phase was then distilled at 40 ° C to a vacuum of 5 mbar and 17.8 g of (IR,2S)-2,6-dimethylindan-l-amine in the form of a pale yellow oil and a chemical purity of 95%, determined by a quantitative 'H-NMR measurement, which corresponds to a yield of 95%. The stereoisomeric purity was determined to be 98% using chiral GC measurement. >H NMR (500 MHz, CDC1 3 ): 5 7.12 (s, 1H), 7.05 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 6.99 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 3.74 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 2.98 (dd, 7= 7.5, 15.5 Hz, 1H), 2.42 (dd, J= 9.5, 15.5 Hz, 1H), 2.34 (s, 3H), 1.98 (m, 1H), 1.72 (bs , 2H), 1.24 (d, J= 6.5 Hz, 3H).
Beispiel 6: Example 6:
Synthese von (lR,2S)-2,6-Dimethylindan-l-amin Hydrochlorid aus Ethyl-[(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3- dihydro- IH-inden- 1 -yl]carbamat Synthesis of (lR,2S)-2,6-dimethylindan-l-amine hydrochloride from ethyl [(lR,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-IH-inden-1-yl]carbamate
In einem 250 mL Doppelmantelreaktor, mit Argon bei 21 °C inertisiert, wurden 50 g Methyl- [(1R,2S)- 2,6-dimethyl-2,3-dihydro-lH-inden-l-yl]carbamat (98% Stereomerenreinheit, 98% chemische Reinheit) in 160 mL /z- Butanol suspendiert. Die Suspension wurde auf 65 °C Innentemperatur erwärmt und eine klare Lösung erhalten. Anschließend wurden 31,1 g Kaliumhydroxid (85% chemische Reinheit) in einer Portion hinzugegeben und die Lösung weiter auf 100 °C Innentemperatur erwärmt. Die Lösung wurde für eine Stunde bei dieser Temperatur weiter gerührt, während unlösliche Feststoffe präzipitierten. Eine HPLC Messung wies auf vollständigen Umsatz hin. Daraufhin wurde ein Unterdrück von 360 mbar angelegt und 110 mL Lösungsmittel abdestilliert. Anschließend wurden 200 mL p-Xylol hinzugegeben und die Reaktionsmischung auf 20 °C abgekühlt. Die Mischung wurde mit 1 x 100 mL deionisiertem Wasser gewaschen. Die organische Phase wurde anschließend auf 10 °C abgekühlt und mit 22,8 g konzentrierter Salzsäure (37 Gew.-% in Wasser) so versetzt, dass die Temperatur nicht über 25 °C anstieg. Von der erhaltenen Suspension wurden dann bei 50 °C 100 mL Lösungsmittel abdestilliert und der Feststoff mittels einer Glasfritte (Porosität 3) bei 20 °C abfiltriert. Der Filterkuchen wurde mit 1 x 100 mL Toluol gewaschen und anschließend bei 40 °C und 10 mbar Vakuum getrocknet und 40 g (lR,2S)-2,6-Dimethylindan-l-amin Hydrochlorid in Form eines weißen Feststoffs und einer chemischen Reinheit von 99%, ermittelt durch eine quantitative ’H-NMR Messung, erhalten, was einer Ausbeute von 95% entspricht. Die Stereoisomerenreinheit wurde mittels chiraler GC Messung auf 98% bestimmt. ’H-NMR (400 MHz; DMSO-d6) 5 = 8.66 (bs, 3H), 7.45 (s, 1H), 7.14 (dd, J = 8.0, 16.0 Hz, 2H), 4.20 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.18-3.12 (m, 1H), 2.50-2.40 (m, 1H), 2.30 (s, 3H), 1.22 (d, 7 = 8.0 Hz, 3H). 50 g of methyl [(1R,2S)-2,6-dimethyl-2,3-dihydro-lH-inden-l-yl]carbamate (98% Stereomeric purity, 98% chemical purity) suspended in 160 mL /z-butanol. The suspension was heated to an internal temperature of 65 °C and a clear solution was obtained. 31.1 g of potassium hydroxide (85% chemical purity) were then added in one portion and the solution was further heated to an internal temperature of 100 °C. The solution was further stirred at this temperature for one hour while insoluble solids precipitated. An HPLC measurement indicated complete conversion. A negative pressure of 360 mbar was then applied and 110 mL of solvent was distilled off. 200 mL of p-xylene were then added and the reaction mixture was cooled to 20 °C. The mixture was washed with 1 × 100 mL deionized water. The organic phase was then cooled to 10 °C and 22.8 g of concentrated hydrochloric acid (37% by weight in water) were added so that the temperature did not rise above 25 °C. 100 mL of solvent were then distilled off from the resulting suspension at 50 °C and the solid was filtered off using a glass frit (porosity 3) at 20 °C. The filter cake was washed with 1 x 100 mL of toluene and then dried at 40 ° C and 10 mbar vacuum and 40 g of (lR,2S)-2,6-dimethylindane-l-amine hydrochloride in the form of a white solid and a chemical purity of 99%, determined by a quantitative 'H-NMR measurement, was obtained, which corresponds to a yield of 95%. The stereoisomeric purity was determined to be 98% using chiral GC measurement. 'H-NMR (400 MHz; DMSO-d6) 5 = 8.66 (bs, 3H), 7.45 (s, 1H), 7.14 (dd, J = 8.0, 16.0 Hz, 2H), 4.20 (d, J = 8.0 Hz , 1H), 3.18-3.12 (m, 1H), 2.50-2.40 (m, 1H), 2.30 (s, 3H), 1.22 (d, 7 = 8.0 Hz, 3H).
Isomerisierung von 2,6-Dimethylindan-l-amin Gemisch (III) zu 2,6-Dimethylindan-l-amin Gemisch (I) Beispiel 7 : Isomerization of 2,6-dimethylindane-l-amine mixture (III) to 2,6-dimethylindane-l-amine mixture (I) Example 7:
In einem 25 ml Autoklaven wurden 10 g des erhaltenen 2,6-Dimethylindan-l-amin Gemischs (III) (eingeengtes Filtrat aus Beispiel 4) mit 396 mg Palladiumkatalysator (5% Pd/AhOi) versetzt. Der Autoklav wurde dreimal mit 5 bar Argon gespült, dann 3 bar Wasserstoff aufgedrückt und 10 h bei 120°C unter 3 bar Wasserstoffdruck gerührt. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur und entspannen des Autoklaven wurde der Gehalt der 2,6-Dimethylindan-l-amin Isomere der erhaltenen Mischung durch chirale GC auf ein Isomerenverhältnis von R,R : S,S : S,R : R,S = 9,2 : 8,9 : 43,0 : 39,0 bestimmt. 396 mg of palladium catalyst (5% Pd/AhOi) were added to 10 g of the resulting 2,6-dimethylindan-1-amine mixture (III) (concentrated filtrate from Example 4) in a 25 ml autoclave. The autoclave was flushed three times with 5 bar argon, then 3 bar hydrogen was injected and stirred for 10 h at 120 ° C under 3 bar hydrogen pressure. After cooling to room temperature and relaxing the autoclave, the content of the 2,6-dimethylindane-l-amine isomers of the resulting mixture was determined by chiral GC to an isomer ratio of R,R:S,S:S,R:R,S = 9, 2: 8.9: 43.0: 39.0 determined.
Isomerisierung von (lR,2S)-2,6-Dimethylindan-l-amin zu 2,6-Dimethylindan-l-amin (racemische Mischung aus 82% trans- und 18% cis-Isomeren) Isomerization of (lR,2S)-2,6-dimethylindane-l-amine to 2,6-dimethylindane-l-amine (racemic mixture of 82% trans and 18% cis isomers)
Beispiele 8-27: Examples 8-27:
Ein 6 mL Wheaton Schraubdeckelgläschen wurde befüllt mit 1,0 g (lR,2S)-2,6-Dimethylindan-l-amin, 39,6 mg Palladiumkatalysator (5% Pd/AhCh). 1,47 g Diethylcarbonat und 10-20 mol% einer Base. Daraufhin wurde das Gläschen mit einem Schraubdeckel verschlossen und bei 90-110 °C für 6 Stunden bei 400 rpm geschüttelt. Anschließend wurde auf 21 °C abgekühlt und mittels chiraler GC- Analytik, sowie achiraler HPLC-Messung analysiert. Die Ergebnisse sind tabellarisch aufgeführt. Die Aktivität bestimmt den Isomerisierungsfortschritt ausgehend von einem Isomerenverhältnis von 0 : 0 : 0 : 100 bis hin zu einem Gleichgewichtsverhältnis von 9 : 9 : 41 : 41 und bemisst sich vorranging am Abbaufortschritt des 1R,2S-Isomers von 100% auf 41%. Die Aktivität ermittelt sich also aus dem gemessenen Anteil von maximalen 59% Abbau. Die Chemoselektivität beschreibt den Grad der gewünschten Komponenten (alle DMAI-Eduktisomere und alle DMAI-Carbamat-Produktisomere) im Bezug zur Summe aller in der Isomerisierung gebildeten Komponenten, einschließlich der Nebenkomponenten. Die zugehörigen Daten werden aus folgender Tabelle 6 ersichtlich: A 6 mL Wheaton screw cap vial was filled with 1.0 g (lR,2S)-2,6-dimethylindan-l-amine, 39.6 mg palladium catalyst (5% Pd/AhCh). 1.47 g of diethyl carbonate and 10-20 mol% of a base. The vial was then closed with a screw cap and shaken at 90-110 °C for 6 hours at 400 rpm. It was then cooled to 21 °C and analyzed using chiral GC analysis and achiral HPLC measurement. The results are listed in tabular form. The activity determines the isomerization progress starting from an isomer ratio of 0:0:0:100 up to an equilibrium ratio of 9:9:41:41 and is primarily measured by the degradation progress of the 1R,2S isomer from 100% to 41%. The activity is therefore determined from the measured proportion of a maximum of 59% degradation. Chemoselectivity describes the degree of the desired components (all DMAI educt isomers and all DMAI carbamate product isomers) in relation to the sum of all components formed in the isomerization, including the secondary components. The associated data can be seen in the following Table 6:
Tabelle 6
Figure imgf000075_0001
Figure imgf000076_0001
Table 6
Figure imgf000075_0001
Figure imgf000076_0001

Claims

Patentansprüche : Patent claims:
1. Verfahren zur Herstellung von nahezu enantiomerenreinem (lR,25)-2,6-Dimethyl-l-indanamin, dadurch gekennzeichnet, 1. Process for the production of almost enantiomerically pure (IR,25)-2,6-dimethyl-l-indanamine, characterized in that
1. dass in einem ersten Schritt ein Gemisch der vier Stereoisomeren von 2,6-Dimethyl-l- indanamin (I) mit einem Acylierungs- oder Carboxylierungsmittel R-C(=O)R’ in Anwesenheit eines Proteins mit der Aktivität einer Lipase zu dem entsprechenden Amid oder Carbamat (II) und einem Gemisch (III) der nicht abreagierten Stereoisomeren von 2,6-Dimethyl-l-indanamin umgesetzt wird:
Figure imgf000077_0001
wobei das Protein durch eine Aminosäuresequenz kodiert wird, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 1. that in a first step, a mixture of the four stereoisomers of 2,6-dimethyl-l-indanamine (I) with an acylating or carboxylating agent RC(=O)R' in the presence of a protein with the activity of a lipase to the corresponding Amide or carbamate (II) and a mixture (III) of the unreacted stereoisomers of 2,6-dimethyl-l-indanamine are reacted:
Figure imgf000077_0001
wherein the protein is encoded by an amino acid sequence selected from the group consisting of
I. Proteinen, die mindestens 80 % Identität zu der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz aufweisen, I. Proteins that have at least 80% identity to that under SEQ ID No. 1 have the amino acid sequence shown,
II. Proteinen, die mindestens 80 % Identität zu der unter SEQ ID No. 1 gezeigten Aminosäuresequenz aufweisen abgesehen davon, dass die Aminosäuresequenz eine Modifizierung aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus i. die Aminosäure an Position 186 ist von L verschieden; ii. die Aminosäure an Position 280 ist von L verschieden; iii. die Aminosäure an Position 312 ist von P verschieden; iv. die Aminosäure an Position 3 ist von M verschieden; v. die Aminosäure an Position 29 ist von N verschieden; vi. die Aminosäure an Position 17 ist von L verschieden; vii. die Aminosäure an Position 4 ist von S verschieden; viii. die Aminosäure an Position 18 ist von V verschieden; ix. die Aminosäure an Position 202 ist von A verschieden; x. die Aminosäure an Position 301 ist von D verschieden; xi. die Aminosäure an Position 309 ist von P verschieden; xii. die Aminosäure an Position 31 ist von Q verschieden; xiii. die Aminosäure an Position 111 ist von Q verschieden; xiv. die Aminosäure an Position 85 ist von W verschieden; xv. die Aminosäure an Position 8 ist von K verschieden; xvi. die Aminosäure an Position 79 ist von E verschieden; xvii. die Aminosäure an Position 40 ist von K verschieden; II. Proteins that have at least 80% identity to that under SEQ ID No. 1 have the amino acid sequence shown, apart from the fact that the amino acid sequence has a modification selected from the group consisting of i. the amino acid at position 186 is different from L; ii. the amino acid at position 280 is different from L; iii. the amino acid at position 312 is different from P; iv. the amino acid at position 3 is different from M; v. the amino acid at position 29 is different from N; vi. the amino acid at position 17 is different from L; vii. the amino acid at position 4 is different from S; viii. the amino acid at position 18 is different from V; ix. the amino acid at position 202 is different from A; x. the amino acid at position 301 is different from D; xi. the amino acid at position 309 is different from P; xii. the amino acid at position 31 is different from Q; xiii. the amino acid at position 111 is different from Q; xiv. the amino acid at position 85 is different from W; xv. the amino acid at position 8 is different from K; xvi. the amino acid at position 79 is different from E; xvii. the amino acid at position 40 is different from K;
2. dass in einem zweiten Schritt das Amid oder Carbamat (II) durch Kristallisation von den verbliebenen 2,6-Dimethyl-l-indanaminen (III) und Nebenkomponenten getrennt wird, und 2. in a second step, the amide or carbamate (II) is separated from the remaining 2,6-dimethyl-l-indanamines (III) and secondary components by crystallization, and
3. dass in einem dritten Schritt das Amid oder Carbamat (II) unter Verwendung einer Säure oder einer Base zum nahezu enantiomerenreinen (lR,2S)-2,6-Dimethyl-l-indanamin (IV) umgesetzt wird,
Figure imgf000078_0001
worin R einen Rest aus der Gruppe CH2OCH3, CH2OCH2CH3, CH3, OCH3, OCH2CH3, OCH(CH3)2, OCH2CH2CH2CH3, OCH2CHCH2und OCH2(C6H5) bedeutet, und worin R1 einen Rest aus der Gruppe OCH3, OCH2CH3, OCH(CH3)2, OCH2CH2CH2CH3, OCH2CHCH2 und OCH2(CeH5) bedeutet. 3. in a third step, the amide or carbamate (II) is converted using an acid or a base to give the almost enantiomerically pure (lR,2S)-2,6-dimethyl-l-indanamine (IV),
Figure imgf000078_0001
wherein R represents a radical from the group CH2OCH3, CH2OCH2CH3, CH3, OCH3, OCH2CH3, OCH(CH3)2, OCH2CH2CH2CH3, OCH 2 CHCH2 and OCH 2 (C6H 5 ), and wherein R 1 represents a radical from the group OCH 3 , OCH2CH3, OCH(CH 3 )2, OCH2CH2CH2CH3, OCH2CHCH2 and OCH2(CeH5) means.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin 2. The method according to claim 1, wherein
R einen Rest aus der Gruppe OCH3 und OCH2CH3 bedeutet, und R represents a residue from the group OCH3 and OCH2CH3, and
R1 einen Rest aus der Gruppe OCH3 und OCH2CH3 bedeutet. R 1 represents a residue from the group OCH3 and OCH2CH3.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) Proteinen, die die in SEQ ID No. 1 gezeigte Aminosäuresequenz umfassen, abgesehen davon, dass die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist; b) Proteinen mit einer Aminosäuresequenz mit mindestens 80 % Identität zu der unter a) gezeigten Aminosäuresequenz, sofern die Aminosäure an Position 186 von L verschieden ist , wobei vorzugsweise die Aminosäure in den Proteinen gemäß a) oder b) an Position 186 F, W, Y, E, D, Q, T, H, P, C, K, S, N, I oder V ist. 3. The method according to claim 1 or 2, characterized in that the protein is selected from the group consisting of a) proteins which are those in SEQ ID No. 1, except that the amino acid at position 186 is different from L; b) proteins with an amino acid sequence with at least 80% identity to the amino acid sequence shown under a), provided that the amino acid at position 186 is different from L, preferably the amino acid in the proteins according to a) or b) at position 186 F, W, Y, E, D, Q, T, H, P, C, K, S, N, I or V.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein mindestens eine, vorzugsweise mindestens zwei, stärker bevorzugt mindestens drei weitere Aminosäuresubstitution aufweist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus 4. The method according to claim 3, characterized in that the protein has at least one, preferably at least two, more preferably at least three further amino acid substitutions, selected from the group consisting of
(i) die Aminosäure an Position 79 ist von E verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 79 S, W oder I, stärker bevorzugt ist die Aminosäure an Position 79 S; (i) the amino acid at position 79 is different from E, preferably the amino acid at position 79 is S, W or I, more preferably the amino acid at position 79 is S;
(ii) die Aminosäure an Position 202 ist von A verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 202 N; (ii) the amino acid at position 202 is different from A, preferably the amino acid at position 202 is N;
(iii) die Aminosäure an Position 280 ist von L verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 280 A; (iii) the amino acid at position 280 is different from L, preferably the amino acid at position 280 is A;
(iv) die Aminosäure an Position 301 ist von D verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 301 A; (iv) the amino acid at position 301 is different from D, preferably the amino acid at position 301 is A;
(v) die Aminosäure an Position 3 ist von M verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 3 Q; (v) the amino acid at position 3 is different from M, preferably the amino acid at position 3 is Q;
(vi) die Aminosäure an Position 11 ist von C verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 11 A; (vi) the amino acid at position 11 is different from C, preferably the amino acid at position 11 is A;
(vii) die Aminosäure an Position 17 ist von L verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 17 P; (vii) the amino acid at position 17 is different from L, preferably the amino acid at position 17 is P;
(viii) die Aminosäure an Position 40 ist von K verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 40 M; (viii) the amino acid at position 40 is different from K, preferably the amino acid at position 40 is M;
(ix) die Aminosäure an Position 111 ist von Q verschieden, vorzugsweise ist die Aminosäure an Position 111 E. (ix) the amino acid at position 111 is different from Q, preferably the amino acid at position 111 is E.
5. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein die Aminosäuresubstitutionen an Position 186 und an Position 79 und an Position 301 und an Position 40 aufweist, wobei vorzugsweise die Aminosäure an Position 186 Y ist und die Aminosäure an Position 79 S ist und die Aminosäure an Position 301 A ist und die Aminosäure an Position 40 M ist. 5. The method according to claim 3 or 4, characterized in that the protein has the amino acid substitutions at position 186 and at position 79 and at position 301 and at position 40, preferably the amino acid at position 186 being Y and the amino acid at position 79 being S and the amino acid at position 301 is A and the amino acid at position 40 is M.
6. Verfahren gemäß einer der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein in einer Menge von 0,1-50 Gew.-% bezogen auf das Gemisch (I) eingesetzt wird. 6. Process according to one of claims 1 to 5, characterized in that the protein is used in an amount of 0.1-50% by weight based on the mixture (I).
7. Verfahren gemäß einer der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein in einer Menge von 0,5-10 Gew.-% bezogen auf das Gemisch (I) eingesetzt wird. 7. The method according to any one of claims 1 to 6, characterized in that the protein is used in an amount of 0.5-10% by weight based on the mixture (I).
8. Verfahren gemäß einer der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein in einer Menge von 1-5 Gew.-% bezogen auf das Gemisch (I) eingesetzt wird. 8. The method according to any one of claims 1 to 7, characterized in that the protein is used in an amount of 1-5% by weight based on the mixture (I).
9. Verfahren gemäß einer der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt 1 ohne Lösungsmittel oder in Anwesenheit eines Lösungsmittels aus der Gruppe Toluol, Xylole, Mesitylen und n-Butanol durchgeführt wird. 9. The method according to any one of claims 1 to 8, characterized in that step 1 is carried out without a solvent or in the presence of a solvent from the group of toluene, xylenes, mesitylene and n-butanol.
10. Verfahren gemäß einer der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt 1 das Acylierungs- oder Carboxylierungsmittel R-C(=O)R’ bevorzugt in einer Menge von 0,4-25 Äquivalenten bezogen auf die eingesetzte Stoffmenge des Gemisches (I) eingesetzt wird. 10. The method according to any one of claims 1 to 9, characterized in that in step 1 the acylating or carboxylating agent R-C(=O)R' is preferably used in an amount of 0.4-25 equivalents based on the amount of the mixture (I ) is used.
11. Verfahren gemäß einer der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt 1 das Acylierungs- oder CarboCarboxylierungsmittel R-C(=O)R’ bevorzugt in einer Menge von 1, 0-5,0 Äquivalenten bezogen auf die eingesetzte Stoffmenge des Gemisches (I) eingesetzt wird. 11. The method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that in step 1 the acylating or carbocarboxylating agent R-C(=O)R' is preferably in an amount of 1.0-5.0 equivalents based on the amount of the mixture used (I) is used.
12. Verfahren gemäß einer der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt 1 die Reaktion bei Temperaturen von 20-130 °C durchgeführt wird. 12. The method according to any one of claims 1 to 11, characterized in that in step 1 the reaction is carried out at temperatures of 20-130 ° C.
13. Verfahren gemäß einer der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt 1 die Reaktion bei Temperaturen von 80-120 °C durchgeführt wird. 13. The method according to any one of claims 1 to 12, characterized in that in step 1 the reaction is carried out at temperatures of 80-120 ° C.
14. Verfahren gemäß einer der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt 3 eine Base aus der Gruppe Lithiumhydroxid, Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid verwendet wird. 14. The method according to any one of claims 1 to 13, characterized in that in step 3 a base from the group consisting of lithium hydroxide, sodium hydroxide and potassium hydroxide is used.
15. Verfahren gemäß einer der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt 3 die Base bezogen auf die Stoffmenge der Komponente (II) in einer Stöchiometrie von 1,00-3,00 Äquivalenten eingesetzt wird. 15. The method according to any one of claims 1 to 14, characterized in that in step 3 the base is used in a stoichiometry of 1.00-3.00 equivalents based on the amount of component (II).
16. Verfahren zur Herstellung eines Gemisches aller vier Stereoisomeren von 2,6-Dimethyl-l- indanamin (I) durch metallkatalysierte Isomerisierung eines Gemisches der drei Stereoisomeren von (1R,2R)-, (IS, 2R)- und (lS,2S)-2,6-Dimethyl-l-indanamin:
Figure imgf000080_0001
16. Process for preparing a mixture of all four stereoisomers of 2,6-dimethyl-l-indanamine (I) by metal-catalyzed isomerization of a mixture of the three stereoisomers of (1R,2R)-, (IS, 2R)- and (lS,2S )-2,6-Dimethyl-l-indanamine:
Figure imgf000080_0001
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass ein Palladium auf Kohle (Pd/C) oder ein Palladium auf Aluminiumoxid (Pd/AhCh) Katalysator mit einer Palladiumbeladung von 0,5-10 Gew.-% eingesetzt wird. 17. The method according to claim 16, characterized in that a palladium on carbon (Pd/C) or a palladium on aluminum oxide (Pd/AhCh) catalyst with a palladium loading of 0.5-10% by weight is used.
18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion zwischen 1-6 bar Überdruck unter Aufpressen eines Gasgemisches von Stickstoff und Wasserstoff durchgeführt wird. 18. The method according to claim 16 or 17, characterized in that the reaction is carried out between 1-6 bar excess pressure by pressing in a gas mixture of nitrogen and hydrogen.
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WO2004069814A1 (en) 2003-02-05 2004-08-19 Bayer Cropscience Gmbh Amino 1, 3, 5-triazines n-substituted with chiral bicyclic radicals, process for their preparation, compositions thereof and their use as herbicides and plant growth regulators

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