WO2024024955A1 - 迷走神経様副交感神経細胞およびその作製方法 - Google Patents

迷走神経様副交感神経細胞およびその作製方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2024024955A1
WO2024024955A1 PCT/JP2023/027801 JP2023027801W WO2024024955A1 WO 2024024955 A1 WO2024024955 A1 WO 2024024955A1 JP 2023027801 W JP2023027801 W JP 2023027801W WO 2024024955 A1 WO2024024955 A1 WO 2024024955A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cells
parasympathetic
nerve
gastrointestinal hormone
expressing
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/JP2023/027801
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
泰之 木田
祐三 ▲高▼山
赤木 祐香 二宮
梓 山下
理紗 吉門
靖久 宮本
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Asahi Group Holdings Ltd
Original Assignee
National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Asahi Group Holdings Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST, Asahi Group Holdings Ltd filed Critical National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority to JP2024537267A priority Critical patent/JPWO2024024955A1/ja
Publication of WO2024024955A1 publication Critical patent/WO2024024955A1/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing

Definitions

  • the present invention relates to vagus nerve-like parasympathetic nerve cells and methods for producing the same.
  • gastrointestinal secretory cells present in the gastrointestinal epithelium sense nutrients and secrete gastrointestinal hormones.
  • vagal afferents signals are transmitted to the central nervous system. From the central nervous system, the efferent vagal pathway regulates peristalsis of the gastrointestinal tract and the secretion of digestive fluids and gastrointestinal hormones.
  • the present inventors have already reported a method for efficiently inducing autonomic nerves from human pluripotent stem cells and a method for selectively inducing parasympathetic nerve cells from human pluripotent stem cells (Patent Documents 1 and 2).
  • the parasympathetic nerve cells produced by the above method do not endogenously express or have low expression of gastrointestinal hormone receptors, which are indicators of gastrointestinal vagus nerves.
  • analysis of mice and the like has shown that more than 10 gastrointestinal vagus nerve cell types exist in vivo, with different expression patterns of gastrointestinal hormone receptors.
  • the purpose of the present invention is to provide vagus nerve-like parasympathetic neurons that constitutively express gastrointestinal hormone receptors and are responsive to gastrointestinal hormones and can be used in an in vitro test system for brain-gut correlation. It is something that
  • vagus nerve-like parasympathetic neurons expressing glucagon-like peptide 1 receptors, neuropeptide Y2 type receptors, glucagon-like peptide 2 receptors, serotonin 3 receptors, or cholecystokinin 1 receptors succeeded in creating nerve cells.
  • the present invention provides a step of (a) inducing differentiation of pluripotent stem cells into parasympathetic nerve cells, and (b1) prior to step (a), (b2) introducing an exogenous nucleic acid encoding a gastrointestinal hormone receptor into the parasympathetic neurons or their progenitor cells obtained in step (a);
  • the present invention provides a method for producing vagus nerve-like parasympathetic nerve cells, the method comprising the step of introducing vagus nerve-like parasympathetic nerve cells.
  • the present invention also provides vagus nerve-like parasympathetic nerve cells produced by the above method.
  • the present invention also provides pluripotent stem cells comprising an exogenous nucleic acid encoding a gastrointestinal hormone receptor.
  • the present invention also provides a vagus nerve-like parasympathetic nerve cell comprising an exogenous nucleic acid encoding a gastrointestinal hormone receptor.
  • the present invention also provides the steps of: (1) bringing a sample into contact with the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells; and (2) analyzing neural activity of the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells.
  • a method of detecting a gastrointestinal hormone receptor agonist in a sample is provided.
  • the gastrointestinal hormone receptor is selected from the group consisting of glucagon-like peptide 1 receptor, neuropeptide Y type 2 receptor, glucagon-like peptide 2 receptor, serotonin 3 receptor and cholecystokinin 1 receptor. .
  • the present invention also provides the steps of: (1) culturing the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells in the presence of a candidate substance; and (2) culturing the neural activity of the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells.
  • the present invention provides a method for screening for substances that control brain-gut correlation, including a step of analyzing.
  • the present invention also provides a step of (1) culturing gastrointestinal hormone-secreting cells in the presence of a candidate substance, (2) a culture supernatant from the culture obtained in step (1). (3) bringing the culture supernatant into contact with the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells; and (4) analyzing the neural activity of the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells.
  • the present invention provides a method for screening substances that control
  • the present invention also provides the steps of: (1) co-culturing the gastrointestinal hormone-secreting cells and the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells in the presence of a candidate substance;
  • the present invention provides a method for screening for substances that control the brain-gut correlation, which includes the step of analyzing neural activity of parasympathetic nerve cells.
  • the present invention provides a brain-gut correlation model comprising co-culture of gastrointestinal hormone-secreting cells and the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells.
  • the gastrointestinal hormone-secreting cells are enteroendocrine cells.
  • the present invention also provides the use of the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells or the brain-gut correlation model for screening for substances that control the brain-gut correlation.
  • vagus nerve-like parasympathetic neurons that can be used in an in vitro test system for brain-gut correlation can be produced with high efficiency and at low cost. Furthermore, the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells according to the present invention can mimic the gastrointestinal hormonal response of the gastrointestinal vagal nerve afferent pathway. Therefore, the vagus nerve-like parasympathetic neurons according to the present invention can be used, for example, to develop an in vitro test system for brain-gut correlation, to detect agonists for gastrointestinal hormone receptors or to search for new agonists, and to detect gastrointestinal hormones from gastrointestinal endocrine cells. Useful for detecting release or searching for substances that induce gastrointestinal hormone release.
  • FIG. 1 is a graph showing the expression level of hGLP1R mRNA in wild-type iPS cells and iPS cells into which exogenous hGLP1R gene has been introduced.
  • FIG. 2 shows a Hoechst staining image (top) and a fluorescent immunostaining image using an anti-GLP1R antibody (bottom) of iPS cells into which an exogenous hGLP1R gene has been introduced.
  • FIG. 3 is a diagram showing a microscopic image (bright field) of hGLP1R-expressing iPS cells.
  • FIG. 4 is a graph showing the expression level of hNANOG mRNA in wild-type iPS cells and hGLP1R-expressing iPS cells.
  • FIG. 1 is a graph showing the expression level of hGLP1R mRNA in wild-type iPS cells and iPS cells into which exogenous hGLP1R gene has been introduced.
  • FIG. 2 shows a Hoechs
  • FIG. 5 is a graph showing the expression levels of hPAX6, hNCAM1, or hSOX17 mRNA in undifferentiated hGLP1R-expressing iPS cells and hGLP1R-expressing iPS cells induced to differentiate into ectoderm, mesoderm, or endoderm. .
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of analyzing the chromosomes of hGLP1R-expressing iPS cells by the G-staining method.
  • FIG. 7 is a diagram showing microscopic images (bright field) of EBs prepared from hGLP1R-expressing iPS cells on day 0 of induction and cells on day 13 of induction.
  • FIG. 8 is a graph showing the expression levels of hNANOG, hSOX10, and hPHOX2B mRNA in cells prepared from hGLP1R-expressing iPS cells on day 13 of induction.
  • FIG. 9 is a graph showing the expression levels of hPRPH, hCHAT, and hGLP1R mRNA in cells prepared from hGLP1R-expressing iPS cells on day 40 of induction.
  • Figure 10 shows a Hoechst staining image (top) of cells prepared from hGLP1R-expressing iPS cells on day 45 of induction (top), a fluorescent immunostaining image using an anti-GLP1R antibody (center), and an image using an anti-GLP1R antibody + anti-MAP2 antibody.
  • FIG. 11 is a diagram showing an extracellular potential heat map of cells prepared from hGLP1R-expressing iPS cells on day 27 of induction, with or without the addition of GLP1.
  • FIG. 12 is a graph showing the rate of change in firing frequency of cells prepared from hGLP1R-expressing iPS cells on day 27 of induction under conditions with and without the addition of GLP1.
  • FIG. 13 is a diagram showing the results of calcium imaging of cells prepared from hGLP1R-expressing iPS cells on day 40 of induction.
  • FIG. 14 is a graph showing the number of Ca 2+ spikes in cells prepared from hGLP1R-expressing iPS cells at day 40 of induction under conditions with and without the addition of GLP1.
  • FIG. 15 is a graph showing the amplitude of Ca 2+ spikes in cells prepared from hGLP1R-expressing iPS cells at day 40 of induction, with or without the addition of GLP1.
  • FIG. 16 is a graph showing the expression level of hNPY2R mRNA in wild-type iPS cells and iPS cells into which exogenous hNPY2R gene has been introduced.
  • FIG. 17 shows a Hoechst staining image (top) and a fluorescent immunostaining image using an anti-NPY2R antibody (bottom) of iPS cells into which exogenous hNPY2R gene has been introduced.
  • FIG. 18 is a diagram showing a microscopic image (bright field) of hNPY2R-expressing iPS cells.
  • FIG. 19 is a graph showing the expression level of hNANOG mRNA in wild-type iPS cells and hNPY2R-expressing iPS cells.
  • FIG. 20 is a graph showing the expression levels of hPAX6, hNCAM1, or hSOX17 mRNA in undifferentiated hNPY2R-expressing iPS cells and hNPY2R-expressing iPS cells induced to differentiate into ectoderm, mesoderm, or endoderm. .
  • FIG. 21 is a diagram showing the results of analyzing the chromosomes of hNPY2R-expressing iPS cells by the G-staining method.
  • FIG. 22 is a diagram showing microscopic images (bright field) of EBs prepared from hNPY2R-expressing iPS cells on day 0 of induction and cells on day 13 of induction.
  • FIG. 23 is a graph showing the expression levels of hNANOG, hSOX10, and hPHOX2B mRNA in cells prepared from hNPY2R-expressing iPS cells on day 13 of induction.
  • FIG. 24 is a graph showing the expression levels of hPRPH, hCHAT, and hNPY2R mRNA in cells prepared from hNPY2R-expressing iPS cells on day 40 of induction.
  • Figure 25 shows a Hoechst staining image (top) of cells prepared from hNPY2R-expressing iPS cells on day 45 of induction, a fluorescent immunostaining image using an anti-NPY2R antibody (center), and an image using an anti-NPY2R antibody + anti-MAP2 antibody.
  • FIG. 26 is a diagram showing an extracellular potential heat map of cells prepared from hNPY2R-expressing iPS cells on day 27 of induction, with or without the addition of PYY.
  • FIG. 27 is a graph showing the rate of change in firing frequency of cells prepared from hNPY2R-expressing iPS cells on day 27 of induction under conditions with or without the addition of PYY.
  • FIG. 28 is a diagram showing the results of calcium imaging of cells prepared from hNPY2R-expressing iPS cells on day 40 of induction.
  • FIG. 29 is a graph showing the number of Ca 2+ spikes in cells prepared from hNPY2R-expressing iPS cells at day 40 of induction under conditions with and without the addition of PYY.
  • FIG. 30 is a graph showing the amplitude of Ca 2+ spikes in cells prepared from hNPY2R-expressing iPS cells at day 40 of induction under conditions with and without the addition of PYY.
  • FIG. 31 is a graph showing the expression level of hGLP2R mRNA in wild-type iPS cells and iPS cells into which exogenous hGLP2R gene has been introduced.
  • FIG. 32 shows a Hoechst staining image (top) and a fluorescent immunostaining image using an anti-GLP2R antibody (bottom) of iPS cells into which exogenous hGLP2R gene has been introduced.
  • FIG. 33 is a diagram showing a microscopic image (bright field) of hGLP2R-expressing iPS cells.
  • FIG. 34 is a graph showing the expression level of hNANOG mRNA in wild-type iPS cells and hGLP2R-expressing iPS cells.
  • FIG. 35 is a graph showing the expression levels of hNES, hNCAM1, or hSOX17 mRNA in undifferentiated hGLP2R-expressing iPS cells and hGLP2R-expressing iPS cells induced to differentiate into ectoderm, mesoderm, or endoderm. .
  • FIG. 36 is a diagram showing the results of analyzing the chromosomes of hGLP2R-expressing iPS cells by G-staining method.
  • FIG. 37 is a diagram showing microscopic images (bright field) of EBs prepared from hGLP2R-expressing iPS cells on day 0 of induction and cells on day 13 of induction.
  • FIG. 38 is a graph showing the expression levels of hNANOG, hSOX10, and hPHOX2B mRNA in cells prepared from hGLP2R-expressing iPS cells on day 13 of induction.
  • FIG. 39 is a graph showing the expression levels of hPRPH, hCHAT, and hGLP2R mRNA in cells prepared from hGLP2R-expressing iPS cells on day 40 of induction.
  • Figure 40 shows a Hoechst staining image (top) of cells prepared from hGLP2R-expressing iPS cells on day 40 of induction, a fluorescent immunostaining image using an anti-GLP2R antibody (center), and an image using an anti-GLP2R antibody + anti-MAP2 antibody.
  • FIG. 41 is a graph showing the expression level of hHTR3A mRNA in wild-type iPS cells and iPS cells into which exogenous hHTR3A gene has been introduced.
  • FIG. 42 shows a Hoechst staining image (top) and a fluorescent immunostaining image using an anti-HTR3A antibody (bottom) of iPS cells into which exogenous hHTR3A gene has been introduced.
  • FIG. 43 is a diagram showing a microscopic image (bright field) of hHTR3A-expressing iPS cells.
  • FIG. 41 is a graph showing the expression level of hHTR3A mRNA in wild-type iPS cells and iPS cells into which exogenous hHTR3A gene has been introduced.
  • FIG. 42 shows a Hoechst staining image (top) and a fluorescent immunostaining image using an anti-HTR3A antibody (bottom) of iPS cells into which exogenous hHTR3A
  • FIG. 44 is a graph showing the expression level of hNANOG mRNA in wild-type iPS cells and hHTR3A-expressing iPS cells.
  • FIG. 45 is a graph showing the expression levels of hNES, hNCAM1, or hSOX17 mRNA in undifferentiated hHTR3A-expressing iPS cells and hHTR3A-expressing iPS cells induced to differentiate into ectoderm, mesoderm, or endoderm. .
  • FIG. 46 is a diagram showing the results of analyzing the chromosomes of hHTR3A-expressing iPS cells by the G-staining method.
  • FIG. 45 is a graph showing the expression levels of hNES, hNCAM1, or hSOX17 mRNA in undifferentiated hHTR3A-expressing iPS cells and hHTR3A-expressing iPS cells induced to differentiate into ectoderm, mesoderm, or endoderm
  • FIG. 47 is a diagram showing microscopic images (bright field) of EBs prepared from hHTR3A-expressing iPS cells on day 0 of induction and cells on day 13 of induction.
  • FIG. 48 is a graph showing the expression levels of hNANOG, hSOX10, and hPHOX2B mRNA in cells prepared from hHTR3A-expressing iPS cells on day 13 of induction.
  • FIG. 49 is a graph showing the expression levels of hPRPH, hCHAT, and hHTR3A mRNA in cells prepared from hHTR3A-expressing iPS cells on day 40 of induction.
  • FIG. 51 shows a Hoechst staining image (top) of cells prepared from hHTR3A-expressing iPS cells on day 40 of induction, a fluorescent immunostaining image using an anti-HTR3A antibody (center), and an image using an anti-HTR3A antibody + anti-MAP2 antibody. It is a figure showing a fluorescent immunostaining image (bottom).
  • FIG. 51 is a graph showing the expression level of hCCKAR mRNA in wild-type iPS cells and iPS cells into which exogenous hCCKAR gene has been introduced.
  • FIG. 52 is a diagram showing a Hoechst staining image (top) and a fluorescent immunostaining image using an anti-CCKAR antibody (bottom) of iPS cells into which an exogenous hCCKAR gene has been introduced.
  • FIG. 53 is a diagram showing a microscopic image (bright field) of hCCKAR-expressing iPS cells.
  • FIG. 54 is a graph showing the expression level of hNANOG mRNA in wild-type iPS cells and hCCKAR-expressing iPS cells.
  • FIG. 55 is a graph showing the expression levels of hNES, hNCAM1, or hSOX17 mRNA in undifferentiated hCCKAR-expressing iPS cells and hCCKAR-expressing iPS cells induced to differentiate into ectoderm, mesoderm, or endoderm. .
  • FIG. 56 is a diagram showing the results of analyzing the chromosomes of hCCKAR-expressing iPS cells by the G-staining method.
  • FIG. 57 is a diagram showing microscopic images (bright field) of EBs prepared from hCCKAR-expressing iPS cells on day 0 of induction and cells on day 13 of induction.
  • FIG. 58 is a graph showing the expression levels of hNANOG, hSOX10, and hPHOX2B mRNA in cells prepared from hCCKAR-expressing iPS cells on day 13 of induction.
  • FIG. 59 is a graph showing the expression levels of hPRPH, hCHAT, and hCCKAR mRNA in cells prepared from hCCKAR-expressing iPS cells on day 40 of induction.
  • Figure 60 shows a Hoechst staining image (top) of cells prepared from hCCKAR-expressing iPS cells on day 40 of induction, a fluorescent immunostaining image using an anti-CCKAR antibody (center), and an image using an anti-CCKAR antibody + anti-MAP2 antibody.
  • FIG. 61 shows an extracellular potential heat map of cells prepared from hCCKAR-expressing iPS cells on day 27 of induction, with or without the addition of CCK-33.
  • FIG. 62 is a graph showing the rate of change in firing frequency of cells prepared from hCCKAR-expressing iPS cells on day 27 of induction under conditions with or without the addition of CCK-33.
  • FIG. 63 is a diagram showing the results of calcium imaging of cells prepared from hCCKAR-expressing iPS cells on day 40 of induction.
  • FIG. 64 is a graph showing the rate of change in fluorescence intensity in calcium imaging of cells prepared from hCCKAR-expressing iPS cells on day 34 of induction under conditions with or without the addition of CCK-33.
  • Figure 65 shows a Hoechst staining image (top) of parasympathetic neurons in which the hGLP1R gene was forcibly expressed after differentiation (day 40 of induction), a fluorescent immunostaining image using an anti-ChAT antibody (center), and an image using an anti-GLP1R antibody. It is a figure showing a fluorescent immunostaining image (bottom).
  • FIG. 66 shows the results of calcium imaging of parasympathetic nerve cells (30th day of induction) in which hGLP1R was forcibly expressed after differentiation.
  • FIG. 67 shows a Hoechst staining image (top) of parasympathetic neurons in which the hNPY2R gene was forcibly expressed after differentiation (day 40 of induction), a fluorescent immunostaining image using an anti-ChAT antibody (center), and an image using an anti-NPY2R antibody. It is a figure showing a fluorescent immunostaining image (bottom).
  • FIG. 67 shows a Hoechst staining image (top) of parasympathetic neurons in which the hNPY2R gene was forcibly expressed after differentiation (day 40 of induction), a fluorescent immunostaining image using an anti-ChAT antibody (center), and an image using an anti-NPY2R antibody. It is a figure showing a fluorescent immunostaining image (bottom).
  • FIG. 69 is a graph showing the expression levels of hPRPH, hCHAT, and hGLP2R mRNA in parasympathetic neurons in which the hGLP2R gene was forcibly expressed after differentiation (40th day of induction).
  • Figure 70 shows a Hoechst staining image (top) of parasympathetic neurons in which the hGLP2R gene was forcibly expressed after differentiation (day 40 of induction), a fluorescent immunostaining image using an anti-GLP2R antibody (center), and an anti-MAP2 antibody using an anti-MAP2 antibody. It is a figure showing a fluorescent immunostaining image (bottom).
  • FIG. 71 is a diagram showing the results of calcium imaging of parasympathetic nerve cells in which hGLP2R was forcibly expressed after differentiation (37th day of induction).
  • FIG. 72 is a graph showing the rate of change in firing intensity of parasympathetic neurons in which the hGLP2R gene was forcibly expressed after differentiation (37th day of induction) under conditions with and without the addition of GLP2.
  • FIG. 73 is a graph showing the expression levels of hPRPH, hCHAT, and hHTR3A mRNA in parasympathetic neurons in which the hHTR3A gene was forcibly expressed after differentiation (40th day of induction).
  • Figure 74 shows a Hoechst staining image (top) of parasympathetic neurons in which hHTR3A gene was forcibly expressed after differentiation (day 40 of induction), a fluorescent immunostaining image using anti-HTR3A antibody (center), and an anti-MAP2 antibody using anti-MAP2 antibody. It is a figure showing a fluorescent immunostaining image (bottom).
  • FIG. 75 is a diagram showing the results of calcium imaging of parasympathetic neurons in which hHTR3A was forcibly expressed after differentiation (37th day of induction).
  • FIG. 76 is a graph showing the rate of change in the firing intensity of parasympathetic neurons in which the hHTR3A gene was forcibly expressed after differentiation (37th day of induction) under conditions with or without the addition of 5-HT.
  • FIG. 77 is a graph showing the expression levels of hPRPH, hCHAT, and hCCKAR mRNA in parasympathetic neurons in which the hCCKAR gene was forcibly expressed after differentiation (40th day of induction).
  • Figure 78 shows a Hoechst staining image (top) of parasympathetic neurons in which the hCCKAR gene was forcibly expressed after differentiation (day 40 of induction), a fluorescent immunostaining image using an anti-CCKAR antibody (center), and an image using an anti-MAP2 antibody. It is a figure showing a fluorescent immunostaining image (bottom).
  • FIG. 79 is a diagram showing the results of calcium imaging of parasympathetic neurons (37th day of induction) in which hCCKAR was forcibly expressed after differentiation.
  • FIG. 80 is a graph showing the rate of change in firing intensity of parasympathetic neurons in which the hCCKAR gene was forcibly expressed after differentiation (37th day of induction) under conditions with or without the addition of CCK-33.
  • FIG. 81 shows a fluorescent immunostaining image using an anti-MAP2 antibody (top), a MemGlow fluorescence image (center), and an overlapping image (bottom) of co-culture of hGLP1R-expressing parasympathetic neurons and NCI-H716 cells.
  • FIG. FIG. 82 shows the results of calcium imaging of co-culture of hGLP1R-expressing parasympathetic neurons (induction day 38) and NCI-H716 cells supplemented with glucose.
  • Bottom Time-dependent changes in fluorescence intensity (Intensity ( ⁇ F/F0)) of three hGLP1R-expressing parasympathetic neurons (cells 1 to 3).
  • FIG. 83 is a graph showing the rate of change in firing intensity of hGLP1R-expressing parasympathetic neurons in co-culture of hGLP1R-expressing parasympathetic neurons and NCI-H716 cells under conditions with or without glucose addition.
  • FIG. 84 shows the results of calcium imaging of co-culture of hGLP1R-expressing parasympathetic neurons (induction day 44) and NCI-H716 cells supplemented with ALA.
  • Bottom Changes in fluorescence intensity (Intensity ( ⁇ F/F0)) of three hGLP1R-expressing parasympathetic neurons (cells 1 to 3) over time.
  • FIG. ⁇ F/F0 Changes in fluorescence intensity
  • FIG. 85 is a graph showing the rate of change in the firing intensity of hGLP1R-expressing parasympathetic neurons in co-culture of hGLP1R-expressing parasympathetic neurons and NCI-H716 cells under conditions with or without the addition of ALA.
  • FIG. 86 shows the results of calcium imaging of hGLP1R-expressing parasympathetic neurons (day 44 of induction) to which culture supernatant from glucose-loaded NCI-H716 cells was added.
  • FIG. 87 is a graph showing the rate of change in firing intensity of hGLP1R-expressing parasympathetic neurons under conditions with and without addition of culture supernatant of NCI-H716 cells loaded with glucose.
  • FIG. 88 shows the results of calcium imaging of hGLP1R-expressing parasympathetic neurons (34th day of induction) to which culture supernatant from NCI-H716 cells loaded with ALA was added.
  • FIG. 89 is a graph showing the rate of change in firing intensity of hGLP1R-expressing parasympathetic neurons under conditions with and without addition of culture supernatant of NCI-H716 cells loaded with ALA or glucose.
  • step (a) inducing differentiation of pluripotent stem cells into parasympathetic nerve cells, and (b1) prior to step (a), the pluripotent stem cells (b2) introducing an exogenous nucleic acid encoding a gastrointestinal hormone receptor into the parasympathetic neurons or their progenitor cells obtained in step (a);
  • This is a method for producing vagus nerve-like parasympathetic nerve cells, including the step of introducing them.
  • parasympathetic nerve cells are induced from pluripotent stem cells.
  • pluripotent stem cells include, for example, embryonic stem (ES) cells, induced pluripotent stem (iPS) cells, embryonic germ (EG) cells, pluripotent germ stem (mGS) cells, Muse cells, etc. These include, but are not limited to: In the method of this embodiment, any pluripotent stem cell may be used, but it is preferable to use ES cells or iPS cells, and more preferably to use iPS cells.
  • the pluripotent stem cells in this embodiment may be derived from any vertebrate, preferably from a mammal such as a mouse, rat, rabbit, sheep, goat, pig, cow, monkey, or human, Particularly preferred is human origin.
  • pluripotent stem cells can be prepared from any tissue or cell according to methods known in the art.
  • iPS cell lines or ES cell lines can be obtained from cell banks such as Kyoto University iPS Cell Research Foundation (CiRA_F), RIKEN BioResource Research Center (RIKEN BRC), American Type Culture Collection (ATCC), etc. You may.
  • parasympathetic nerve cells can be prepared according to methods known in the art. can do. Specifically, for example, DMEM/HAM's F-12 medium, human stem cell (hES) medium, N2 medium, or a mixture thereof is used as a basal medium, and a BMP signal pathway inhibitor such as dorsomorphin, SB431542, etc.
  • TGF signal pathway inhibitors such as CHIR99021, Wnt signal pathway activators such as CHIR99021, FGF signal pathway activators such as fibroblast growth factor (bFGF), and EGF signal pathway activators such as epidermal growth factor (EGF).
  • Neural crest cells are prepared by culturing pluripotent stem cells under conditions in which agents are added as appropriate, and then cAMP production promoters such as forskolin and BDNF signals such as brain-derived neurotrophic factor (BDNF) are added.
  • BDNF brain-derived neurotrophic factor
  • GDNF signal pathway activators such as glial cell line-derived neurotrophic factor (GDNF), NGF signal pathway activators such as NGF- ⁇ , NT-3 signal pathway such as neurotrophin 3 Conditions in which an activator, vitamin C such as ascorbic acid, a protein kinase C activator such as phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), a retinoic acid receptor agonist such as retinoic acid, etc. are appropriately added.
  • Parasympathetic nerve cells can be prepared by culturing neural crest cells.
  • the pluripotent stem cells and neural crest cells are preferably preconditioned before the differentiation induction, and the pluripotent stem cells are placed in a medium containing a Rho kinase (ROCK) inhibitor such as Y-27632.
  • a Rho kinase (ROCK) inhibitor such as Y-27632.
  • the neural crest cells are cultured for 2 to 3 days, and the neural crest cells are treated with a BMP signal pathway activator such as BMP4, a SHH signal pathway inhibitor such as SANT-1, or a Wnt signal pathway inhibitor such as IWR-1. It is preferable to culture for 2 to 3 days in a medium containing the following (International Publication No. 2020/040286, International Publication No. 2016/194522).
  • an exogenous nucleic acid encoding a gastrointestinal hormone receptor is introduced into cells.
  • the "gastrointestinal hormone receptor” in this embodiment may be any gastrointestinal hormone receptor expressed in vagus nerve cells. Therefore, in the method of this embodiment, for example, glucagon-like peptide 1 receptor (GLP1R), neuropeptide Y2 type receptor (NPY2R), glucagon-like peptide 2 receptor (GLP2R), serotonin 3 receptor (5-HT3R)
  • GLP1R glucagon-like peptide 1 receptor
  • NPY2R neuropeptide Y2 type receptor
  • GLP2R glucagon-like peptide 2 receptor
  • serotonin 3 receptor 5-HT3R
  • Exogenous nucleic acids can be used that encode gastrointestinal hormone receptors such as, but not limited to, and cholecystokinin 1 receptor (CCKAR).
  • exogenous nucleic acids encoding one or more types of gastrointestinal hormone receptors selected from the above may be
  • Exogenous nucleic acids encoding gastrointestinal hormone receptors may be introduced into cells at any time.
  • an exogenous nucleic acid encoding a gastrointestinal hormone receptor may be introduced into pluripotent stem cells before induction of differentiation, into parasympathetic nerve cells obtained by induction of differentiation, or into parasympathetic nerve cells obtained by induction of differentiation. It may also be introduced into progenitor cells that are differentiating into cells.
  • exogenous nucleic acids encoding GLP1R, NPY2R and CCKAR may be introduced into pluripotent stem cells prior to induction of differentiation;
  • exogenous nucleic acids encoding GLP2R and 5-HT3R may be introduced into parasympathetic stem cells obtained by induction of differentiation. may be introduced into nerve cells.
  • the exogenous nucleic acid encoding the gastrointestinal hormone receptor in this embodiment may be derived from any vertebrate, preferably mouse, rat, rabbit, sheep, goat, pig, cow, monkey, human, etc. of mammalian origin, particularly preferably human origin.
  • NM_002062.5 for the human glucagon-like peptide 1 receptor (hGLP1R) gene
  • NM_000910.4 for the human neuropeptide Y2 receptor (hNPY2R) gene
  • NM_000910.4 for the human glucagon-like peptide 2 receptor (hGLP2R) gene.
  • NM_004246.3, NM_213621.4 for the human serotonin 3 receptor (hHTR3A) gene, and NM_000730.3 for the human cholecystokinin 1 receptor (hCCKAR) gene are available. be.
  • the gastrointestinal hormone receptors in this embodiment may also include variants and homologues thereof that have equivalent activity.
  • the gastrointestinal hormone receptor in this embodiment has an amino acid sequence registered in the database, for example, 80% or more, preferably 90% or more, as long as the receptor activity is maintained. Proteins consisting of amino acid sequences having an identity of more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, and most preferably 99% or more may be included. Amino acid sequence identity can be calculated using sequence analysis software or using programs commonly used in the art (FASTA, BLAST, etc.).
  • the gastrointestinal hormone receptor in this embodiment may have one to several amino acids substituted or deleted in the amino acid sequence registered in the database, as long as the receptor activity is maintained. Proteins consisting of inserted and/or added amino acid sequences may be included.
  • “1 to several” may be, for example, 1 to 30, preferably 1 to 10, particularly preferably 1 to 5.
  • Exogenous nucleic acids encoding gastrointestinal hormone receptors can be introduced into cells by methods well known in the art, for example, by cloning those nucleic acids into expression vectors and introducing them into cells.
  • expression vectors include, but are not limited to, viral vectors such as retrovirus, lentivirus, adenovirus, and Sendai virus, and plasmid vectors such as pCMV.
  • the expression vector can be introduced into cells by methods well known in the art depending on the type.
  • Non-viral vectors can be introduced, for example, by lipofection, electroporation, microinjection, and the like.
  • Viral vectors can be introduced by infecting cells at an appropriate titer or multiplicity of infection (MOI).
  • the present invention is a vagus nerve-like parasympathetic nerve cell produced by the above method.
  • vagus nerve-like parasympathetic nerve cells refer to parasympathetic nerve cells that can mimic the gastrointestinal hormone response of vagus nerve cells.
  • the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells in this embodiment may be defined by any combination of well-known parasympathetic nerve cell markers, autonomic nerve cell markers, peripheral nerve cell markers, mature nerve cell markers, and gastrointestinal hormone receptors, e.g.
  • ChAT choline acetyltransferase
  • PHOX2B paired-like homeobox 2B
  • PRPH peripherin
  • MAP2 microtubule-associated protein 2
  • VAChT also known as SLC18A3, vesicular acetylcholine transporter
  • CHT also known as SLC5A7, high based on the expression of gastrointestinal hormone receptors such as the affinity choline transporter
  • STMN2 stathmin 2
  • PHOX2A paired-like homeobox 2A
  • ASCL1 also known as MASH1, Achaete-scute homolog1 or as defined above. May be defined.
  • vagus nerve-like parasympathetic nerve cells in this embodiment preferably express nicotinic acetylcholine receptors in addition to the above markers.
  • Expression of markers and gastrointestinal hormone receptors can be analyzed by known techniques such as RT-PCR, Western blotting, and flow cytometry.
  • vagus nerve-like parasympathetic nerve cells in this embodiment may be defined based on gastrointestinal hormone responsiveness, for example, by confirming reactivity to gastrointestinal hormones by calcium imaging or membrane potential measurement. .
  • the present invention is a pluripotent stem cell comprising an exogenous nucleic acid encoding a gastrointestinal hormone receptor.
  • the present invention is a vagus nerve-like parasympathetic nerve cell comprising an exogenous nucleic acid encoding a gastrointestinal hormone receptor.
  • Exogenous nucleic acid encoding a gastrointestinal hormone receptor "pluripotent stem cell” and “vagus nerve-like parasympathetic nerve cell” in the third and fourth embodiments are defined in the first and second embodiments. It is similar to what was done.
  • the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells of the fourth embodiment may be produced by the method of the first embodiment, and the pluripotent stem cells of the third embodiment may be an intermediate product thereof.
  • vagus nerve-like parasympathetic neurons of the second and fourth embodiments are useful for creating an in vitro evaluation model of brain-gut correlation. Furthermore, the pluripotent stem cells of the third embodiment are useful for stably producing vagus nerve-like parasympathetic nerve cells.
  • the present invention includes (1) bringing a sample into contact with the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells, and (2) analyzing the neural activity of the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells.
  • a method for detecting a gastrointestinal hormone receptor agonist in a sample comprising:
  • the “sample” in this embodiment may be any material that can contain a gastrointestinal hormone receptor agonist.
  • the "gastrointestinal hormone receptor agonist” in this embodiment may be any substance that acts on and activates the gastrointestinal hormone receptor defined in the first embodiment, and may be any substance that acts on and activates the gastrointestinal hormone receptor defined in the first embodiment. In addition, it may be a new or known low-molecular compound, nucleic acid, protein, peptide, antibody, lipid, etc.
  • the gastrointestinal hormone receptor agonist in this embodiment may include not only a full agonist but also a partial agonist.
  • the sample in the method of the present embodiment may be prepared from, for example, an animal-derived body fluid, an extract from a cell or tissue, a culture supernatant of a cell or tissue, a plant extract, or the like.
  • the sample used in the method of the present embodiment is preferably prepared from body fluids such as human blood, plasma, and serum, or culture supernatants of human gastrointestinal tract-derived cells or intestinal epithelial tissue.
  • the sample may be added to a culture of vagus nerve-like parasympathetic nerve cells and incubated for a certain period of time. Incubation time may be, for example, 0.01 seconds to 2 hours.
  • Neural activity may be analyzed by methods well known in the art, for example, by calcium imaging or membrane potential measurement.
  • calcium imaging for example, vagus nerve-like parasympathetic nerve cells may be loaded with a fluorescent calcium indicator, and changes in cellular calcium concentration may be measured based on changes in fluorescence intensity.
  • Membrane potential can be analyzed, for example, by measuring extracellular potential by measuring local field potential, measuring intracellular potential by patch clamping, and measuring changes in membrane potential using a membrane potential sensitive dye.
  • the present invention provides the steps of: (1) culturing the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells in the presence of a candidate substance; and (2) culturing the neural activity of the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells.
  • This is a method of screening for substances that control brain-gut correlation, including the step of analyzing.
  • Candidate substances may be ions, nanoparticles, low molecular weight compounds, nucleic acids, proteins, peptides, antibodies, lipids, animal or plant cells, tissues or extracts thereof, bacterial cells or crushed products or extracts thereof, etc. These candidate substances may be new or known.
  • Vagus nerve-like parasympathetic nerve cells are cultured for a certain period of time in a medium supplemented with a candidate substance.
  • concentration of the candidate substance to be added varies depending on the type of candidate substance, but for example, in the case of a low molecular weight compound, it can be appropriately selected within the range of 0.001 nM to 10 mM.
  • the culture period may be, for example, 0.01 seconds to 2 hours.
  • neural activity can be analyzed, for example, by calcium imaging or membrane potential measurement.
  • calcium imaging for example, vagus nerve-like parasympathetic nerve cells may be loaded with a fluorescent calcium indicator, and changes in cellular calcium concentration may be measured based on changes in fluorescence intensity.
  • Membrane potential can be analyzed, for example, by measuring extracellular potential by measuring local field potential, measuring intracellular potential by patch clamping, and measuring changes in membrane potential using a membrane potential sensitive dye.
  • the neural activity of vagus nerve-like parasympathetic neurons in a medium supplemented with a candidate substance is significantly enhanced compared to that of vagus nerve-like parasympathetic nerve cells in a medium without a candidate substance.
  • the candidate substance can be evaluated as a gastrointestinal hormone receptor agonist, that is, as a promising substance that controls the brain-gut relationship.
  • brain-gut correlation refers to bidirectional communication between the central nervous system and the gastrointestinal tract.
  • Brain-gut relationships are already known to be involved in a wide variety of symptoms or disorders.
  • Symptoms or disorders that are closely related to brain-gut correlation abnormalities include, for example, abnormal eating behavior; gastrointestinal disorders such as nausea, abdominal pain, diarrhea, and constipation; psychological stress symptoms such as anxiety behavior and depression; Alzheimer's disease and Parkinson's disease.
  • disease neurodegenerative diseases such as multiple sclerosis; abnormal immune responses such as inflammation and allergies; and metabolic diseases such as obesity, dyslipidemia, and diabetes, but are not limited to these.
  • a substance that regulates the brain-gut correlation may be determined to be capable of normalizing the brain-gut correlation and, as a result, prevent or treat the symptoms or disorders described above, and may be considered capable of preventing or treating the symptoms or disorders described above. It may be useful for the development of preventive or therapeutic drugs, supplements, foods for specified health uses, and foods with functional claims.
  • a seventh embodiment of the present invention (1) culturing gastrointestinal hormone-secreting cells in the presence of a candidate substance; (2) a culture supernatant from the culture obtained in step (1); (3) bringing the culture supernatant into contact with the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells; and (4) analyzing the neural activity of the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells.
  • This is a screening method for substances that control
  • the "vagus nerve-like parasympathetic nerve cells" in this embodiment are the same as those defined in the first and second embodiments, and the "candidate substances" and "brain-gut correlation” are defined in the sixth embodiment. It is similar to what was done.
  • the "gastrointestinal hormone-secreting cell” in this embodiment may be any cell derived from any tissue as long as it can secrete a gastrointestinal hormone.
  • Gastrointestinal hormone-secreting cells are scattered in the gastrointestinal epithelium from the stomach to the rectum and in the islets of Langerhans of the pancreas, and are classified into L cells, K cells, I cells, S cells, It is classified into enterochromaffin (EC) cells, G cells, D cells, N cells, M cells, etc.
  • the gastrointestinal hormone-secreting cells selected from the above can be used alone or in an appropriate combination of two or more types.
  • the gastrointestinal hormone-secreting cells in this embodiment are preferably enteroendocrine cells, and may be, for example, L cells, K cells, I cells, S cells, EC cells, N cells, M cells, etc. but not limited to.
  • the gastrointestinal hormone-secreting cells in this embodiment may be derived from any vertebrate, preferably from a mammal such as a mouse, rat, rabbit, sheep, goat, pig, cow, monkey, or human. , particularly preferably of human origin.
  • the gastrointestinal hormone-secreting cells in the method of this embodiment may be derived from the same animal as the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells, or may be derived from a different animal. Therefore, in the method of this embodiment, for example, human gastrointestinal hormone secreting cells and human vagus nerve-like parasympathetic nerve cells may be used in combination, or mouse gastrointestinal hormone secreting cells and human vagus nerve-like parasympathetic nerve cells may be used in combination. It may also be used.
  • gastrointestinal hormone secreting cells and vagus nerve-like parasympathetic nerve cells derived from the same species of mammal can be used, particularly preferably human gastrointestinal hormone secreting cells and human vagus nerve-like parasympathetic nerve cells. Nerve cells can be used.
  • Gastrointestinal hormone-secreting cells can be prepared by already established and known methods (for example, Sinagoga K.L. et al., Development, 2018, 145(19): dev165795). Specifically, for example, in the process of inducing intestinal organoids and colon organoids from human pluripotent stem cells, by forcibly expressing the transcription factor NEUROG3, gastrointestinal hormones such as GIP, ghrelin, GLP-1, and oxyntomodulin can be expressed. Enteroendocrine cells that secrete can be prepared. Alternatively, an already established gastrointestinal hormone-secreting cell line may be obtained from a cell bank such as ATCC. Examples of gastrointestinal hormone-secreting cell lines include human L cell line NCI-H716, mouse L cell line STC-1, mouse L cell line GLUTag, and enteroendocrine cells collected from mouse and human gastrointestinal tracts.
  • Gastrointestinal hormone-secreting cells are grown in a basal medium such as DMEM, HAM's F-12 medium, RPMI1640 medium, or a mixture thereof, supplemented with fetal bovine serum (FBS), non-essential amino acid solution, penicillin/streptomycin, etc. can be used for stable subculture.
  • a basal medium such as DMEM, HAM's F-12 medium, RPMI1640 medium, or a mixture thereof, supplemented with fetal bovine serum (FBS), non-essential amino acid solution, penicillin/streptomycin, etc.
  • Gastrointestinal hormone-secreting cells are cultured for a certain period of time in a medium supplemented with candidate substances.
  • concentration of the candidate substance to be added varies depending on the type of candidate substance, but for example, in the case of a low molecular weight compound, it can be appropriately selected within the range of 0.001 nM to 10 mM.
  • the addition period may be, for example, from 1 second to 72 hours.
  • the culture supernatant is collected from the above culture.
  • the collected culture supernatant may optionally be purified or concentrated by dialysis, ultrafiltration, or the like.
  • the above culture supernatant is brought into contact with the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells.
  • the culture supernatant may be added to the culture medium of the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells and incubated for a certain period of time.
  • the culture supernatant may be added in an amount of 1 to 10 times the amount of the culture medium for vagus nerve-like parasympathetic nerve cells. Incubation time may be, for example, 0.01 seconds to 2 hours.
  • neural activity can be analyzed, for example, by calcium imaging or membrane potential measurement.
  • calcium imaging for example, vagus nerve-like parasympathetic nerve cells may be loaded with a fluorescent calcium indicator, and changes in cellular calcium concentration may be measured based on changes in fluorescence intensity.
  • Membrane potential can be analyzed, for example, by measuring extracellular potential by measuring local field potential, measuring intracellular potential by patch clamping, and measuring changes in membrane potential using a membrane potential sensitive dye. The method of this embodiment can be carried out using a culture supernatant of gastrointestinal hormone-secreting cells prepared without adding a candidate substance as a control.
  • the neural activity of vagus nerve-like parasympathetic neurons that came into contact with the culture supernatant of gastrointestinal hormone-secreting cells prepared by adding a candidate substance was compared with the neural activity of vagus nerve-like parasympathetic nerve cells that came into contact with the control culture supernatant. If the candidate substance is significantly enhanced in comparison, the candidate substance is evaluated to be capable of promoting gastrointestinal hormone secretion from gastrointestinal hormone-secreting cells, that is, to be promising as a substance that controls the brain-gut relationship. Can be done.
  • the present invention provides the steps of: (1) co-culturing the gastrointestinal hormone secreting cells and the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells in the presence of a candidate substance, and (2) the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells.
  • This is a method of screening for substances that control the brain-gut correlation, including the step of analyzing the neural activity of parasympathetic nerve cells.
  • the "candidate substance” and “brain-gut correlation” in this embodiment are the same as those defined in the sixth and seventh embodiments.
  • "Gastrointestinal hormone-secreting cells” are the same as those defined in the seventh embodiment.
  • gastrointestinal hormone secreting cells and vagus nerve-like parasympathetic nerve cells are co-cultured.
  • "Co-culture” in this embodiment may be any type of culture as long as both cells share the same medium. Therefore, the co-culture in this embodiment may be either direct (contact) co-culture or indirect (non-contact) co-culture.
  • gastrointestinal hormone-secreting cells and vagus nerve-like parasympathetic nerve cells may be directly mixed and co-cultured, or gastrointestinal hormone-secreting cells and vagus nerve-like parasympathetic nerve cells may be cultured using a filter or the like. They may be separated and co-cultured.
  • gastrointestinal hormone-secreting cells may be seeded onto the culture of vagus nerve-like parasympathetic nerve cells.
  • the ratio of gastrointestinal hormone-secreting cells to vagus nerve-like parasympathetic nerve cells may be, for example, 1:3 to 3:1, preferably 1:1 to 2:1.
  • the seeding concentrations of gastrointestinal hormone-secreting cells and vagus nerve-like parasympathetic nerve cells range from 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 6 cells/cm 2 and from 1 ⁇ 10 5 to 5 ⁇ 10 5 cells/cm 2 , respectively. good.
  • the medium used here may be a mixture of a medium for culturing gastrointestinal hormone secreting cells and a medium for culturing vagus nerve-like parasympathetic nerve cells.
  • it may be a mixed medium of DMEM, HAM's F-12 medium and RPMI1640 medium to which fetal bovine serum (FBS), non-essential amino acid solution, N2 supplement, B-27 supplement, etc. are added as appropriate.
  • FBS fetal bovine serum
  • Gastrointestinal hormone secreting cells and vagus nerve-like parasympathetic nerve cells are cultured for a certain period of time in a medium supplemented with a candidate substance.
  • concentration of the candidate substance to be added varies depending on the type of candidate substance, but for example, in the case of a low molecular weight compound, it can be appropriately selected within the range of 0.001 nM to 10 mM.
  • the culture period may be, for example, 0.01 seconds to 2 hours.
  • neural activity can be analyzed, for example, by calcium imaging or membrane potential measurement.
  • co-culture in a medium without a candidate substance and/or single culture of vagus nerve-like parasympathetic neurons in a medium to which a candidate substance is added can be carried out as a control. If the neural activity of vagus nerve-like parasympathetic neurons in the co-culture with the addition of a candidate substance is significantly enhanced compared to the neural activity of vagus nerve-like parasympathetic nerve cells in the control, then the candidate substance is effective in the gastrointestinal tract. It can be evaluated as a promising substance that can promote gastrointestinal hormone secretion from hormone-secreting cells, that is, as a substance that controls the brain-intestine relationship.
  • the present invention is a brain-gut correlation model comprising co-culture of gastrointestinal hormone-secreting cells and the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells.
  • the "vagus nerve-like parasympathetic nerve cells” in this embodiment are the same as those defined in the first and second embodiments, and the "gastrointestinal hormone secreting cells” and “brain-gut correlation” are defined in the seventh embodiment.
  • “Co-culture” is the same as defined in the eighth embodiment.
  • the brain-gut correlation model of this embodiment may be provided as a kit for screening substances that control the brain-gut correlation in combination with the above-described medium, co-culture container, and the like.
  • the kit may further include additional components as appropriate, such as a buffer, a calcium indicator, a compound library, an instruction manual describing a screening protocol, and the like.
  • the brain-gut correlation model of this embodiment can be created by co-culturing gastrointestinal hormone secreting cells and vagus nerve-like parasympathetic neurons according to the procedure described in the eighth embodiment, and It can be used to screen for substances that can promote gastrointestinal hormone secretion from cells, ie, substances that control brain-gut correlation.
  • the present invention is also the use of the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells or the brain-gut correlation model for screening for substances that control the brain-gut correlation.
  • the "vagus nerve-like parasympathetic nerve cells" in this embodiment are the same as those defined in the first and second embodiments, and the "brain-gut correlation” are the same as those defined in the seventh embodiment.
  • the "brain-gut correlation model” is the same as that defined in the ninth embodiment. According to the content described in the seventh, eighth, and ninth embodiments, the vagus nerve-like parasympathetic nerve cells or the brain-gut correlation model may be used for screening for substances that control the brain-gut correlation. can.
  • VectorBuilder was commissioned to synthesize the following plasmids containing sequences encoding gastrointestinal hormone receptors: pLV-hGLP1R (plasmid containing human GLP1R gene (NCBI RefSeq ID: NM_002062.5), vector ID: VB900123-1388xwv); pLV-hNPY2R (plasmid containing human NPY2R gene (NCBI RefSeq ID: NM_000910.4), vector ID: VB900123-1387bah); pLV-hGLP2R (plasmid containing human GLP2R gene (NCBI RefSeq ID: NM_004246.3), vector ID: VB210830-1115xup; pLV-hHTR3A (plasmid containing human HTR3A gene (NCBI RefSeq ID: NM_213621.4, vector ID: VB210823-1277qqk
  • pLV-mCherry vector ID: VB900084-0158zxv
  • HEK293T cells (1.5 ⁇ 10 6 /well) were seeded in 6-well plates coated with 0.1 w/v% gelatin.
  • the medium used was DMEM containing 10% FBS, 1% non-essential amino acids (NEAA), and 1% penicillin-streptomycin.
  • the above plasmids (4 ⁇ g each), package plasmid psPAX2 (addgene, #12260) (2 ⁇ g) and envelope plasmid (pMD2.G) (addgene, #12259) (2 ⁇ g) were added to 500 ⁇ l of Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific) and polyethylene.
  • HEK293T cells (2 wells) were transfected using imine (Polysciences inc.).
  • mTeSR1-cGMP ST-85850G
  • mTeSR1 ⁇ DMEM/Ham's F-12 (Fujifilm Wako Pure Chemical: 048-29785)
  • DMEM high-glucose
  • RPMI-1640 contains L-glutamine and phenol red
  • RPMI-1640 ⁇ Opti-MEM (Thermo Fisher Scientific: 31985062)
  • STEM-CELLBANKER (trademark) GMP grade) ZNQ: CB045)
  • FBS Fretal Bovine Serum Replacement
  • DMEM/Ham's F-12 supplemented with 20% KSR, 1% NEAA, 1% Monothioglycerol solution, and 1% P/S -N2 medium: DMEM/Ham's F-12 supplemented with 1% N2, 1% NEAA, and 1% P/S ⁇ NDM1: N2 medium supplemented with 10 ⁇ M FSK, 10 ng/mL GDNF, 10 ng/mL NT-3, 10 ng/mL NGF, and 50 ⁇ g/mL ascorbic acid ⁇ NDM2: 100 ng/mL BDNF, and NDM1 supplemented with 100 ng/mL CNTF ⁇ NDM3: NDM1 supplemented with 10 ng/mL BDNF, 1 ⁇ M RA, and 10 ng/mL PMA
  • Human iPS cells (201B7 strain) were obtained from RIKEN BRC. Six-well plates were coated with Lipidure and washed with PBS. Human iPS cells (201B7 strain) were seeded at a concentration of 1 x 10 cells/well using mTeSR1 supplemented with 10 ⁇ M Y-27632, and cultured on an orbital shaker (Wakenbee Tech: WB-101SRC). (95 rpm). 24 hours and 48 hours after seeding, mTeSR1 supplemented with 10 ⁇ M Y-27632 was added at 2 mL/well.
  • ⁇ Differentiation step 1 day 0: The medium was replaced with hESM supplemented with 2 ⁇ M DM, 10 ⁇ M SB, and 10 ng/ml bFGF (4 mL/well) and cultured on an orbital shaker for 2 days.
  • ⁇ Differentiation step 2 (2nd day): The medium was replaced with hESM supplemented with 3 ⁇ M CHIR, 20 ⁇ M SB, and 10 ng/ml bFGF (6 mL/well) and cultured on an orbital shaker for 3 days.
  • ⁇ Differentiation step 3 The medium was replaced with hESM:N2 (3:1) mixed medium supplemented with 3 ⁇ M CHIR and 10 ng/ml bFGF (4 mL/well), and cultured on an orbital shaker for 2 days.
  • ⁇ Differentiation step 4 (7th day): The medium was replaced with hESM:N2 (1:1) mixed medium supplemented with 10 ⁇ M IWR-1, 250 nM SANT-1, 25 ng/ml BMP4, and 10 ng/ml bFGF (3 mL/well), Culture was performed on an orbital shaker for 2 days.
  • ⁇ Differentiation step 5 (9th day): The medium was replaced with hESM:N2 (1:3) mixed medium supplemented with 10 ⁇ M IWR-1, 250 nM SANT-1, 25 ng/ml BMP4, and 10 ng/ml bFGF (3 mL/well), The cells were cultured on an orbital shaker for 3 days, replaced with the same fresh medium, and further cultured for 24 hours.
  • ⁇ Differentiation step 6 (13th day): The cells were coated with PLO and laminin by coating with a PLO solution (20 ⁇ g/ml) prepared in DW for 1 hour, washing once with DW, and coating with a laminin solution (5 ⁇ g/ml) prepared in PBS for 2 hours.
  • a 24-well plate was prepared.
  • the EB obtained in differentiation step 5 was collected, 2 mL of TrypLE express was added, and the mixture was incubated at 37°C for 10 minutes.
  • the enzyme reaction was stopped by adding DMEM (4 mL) containing 10% FBS, and the cells were suspended by pipetting.
  • the cells were collected by centrifugation at 200 ⁇ g for 4 minutes, suspended in NDM1, and the number of cells was counted.
  • a cell suspension was prepared using NDM2 (1 ⁇ 10 5 cells/mL) and added at 1 mL/well to a 24-well plate coated with PLO and laminin. Thereafter, the culture was continued while half of the medium was replaced with fresh NDM2 twice a week.
  • Puromycin selection was performed by culturing cells in mTeSR1 supplemented with 0.3 ⁇ g/mL puromycin for 10 days or more after virus addition.
  • the obtained cells (hereinafter referred to as "iPS cells expressing gastrointestinal hormone receptors") were cryopreserved.
  • Microscope (Olympus, IX71), Confocal scanner unit (Yokogawa, CSU-W1), LED light source (OPTO SCIENCE, X-Cite 120LED), and analysis software (MetaMorph) (Molecular Devices) 500-800 at 500ms/frame I took a frame photo. Gastrointestinal hormone receptor agonist stimulation was added midway (for example, at the 250th frame).
  • GLP1 human, 7-37
  • PYY human, 3-36
  • Peptide Institute, #4400-v PYY
  • GLP2 human
  • GLP2 Serotonin
  • 5-HT Serotonin hydrochloride
  • CCK-33 human) (peptide research #4201-s) (hereinafter referred to as "CCK-33") (10, 100, 1000 nM).
  • Membrane potential changes were measured in NDM3 or Ringer's solution. Using a 1000 ⁇ gain and a 200 Hz-3 kHz filter, potential values that changed six times or more relative to the measurement noise standard deviation were detected as nerve firings (spikes). After measuring the potential for 5 minutes, a gastrointestinal hormone receptor agonist was added at the same final concentration as in (4-2) above, and measurement was continued for an additional 5 minutes.
  • hGLP1R-expressing iPS cells A bright field image of hGLP1R-expressing iPS cells is shown in FIG. 3. In the figure, the scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • Figure 4 shows the results of confirming the expression of the stem cell marker hNANOG gene in hGLP1R-expressing iPS cells by qPCR according to the procedure (3-1) above.
  • GLP1R indicates hGLP1R-expressing iPS cells
  • Control indicates wild-type iPS cells.
  • Figure 6 shows the results of chromosome testing using the G differential staining method. It was confirmed that there were no abnormalities in the chromosomes of hGLP1R-expressing iPS cells.
  • the ligand responsiveness of cells prepared from hGLP1R-expressing iPS cells according to the procedure (2-7) above was analyzed by measuring extracellular potential according to the procedure (4-3) above.
  • the extracellular potential heat map is shown in FIG. 11.
  • the ligand responsiveness of cells prepared from hGLP1R-expressing iPS cells according to the procedure (2-7) above was analyzed by intracellular calcium imaging according to the procedure (4-2) above.
  • the measurement results are shown in FIG.
  • the horizontal axis shows time (seconds), and the vertical axis shows the rate of change in fluorescence intensity ( ⁇ F/F0) when the average value (F0) of fluorescence intensity before addition of GLP1 is set to 1.
  • Addition of GLP1 increased intracellular Ca 2+ concentration.
  • the number of neural firings (spikes) per minute is shown in FIG.
  • hNPY2R-expressing iPS cells A bright field image of hNPY2R-expressing iPS cells is shown in FIG. 18. In the figure, the scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • FIG. 19 shows the results of confirming the expression of the stem cell marker NANOG in hNPY2R-expressing iPS cells by qPCR according to the procedure (3-1) above.
  • NPY2R indicates hNPY2R-expressing iPS cells
  • Control indicates wild-type iPS cells.
  • hNPY2R-expressing iPS cells According to the procedure (3-2) above, the ability of hNPY2R-expressing iPS cells to differentiate into three embryonic forms was evaluated. The results are shown in FIG. The hNPY2R-expressing iPS cells induced to differentiate into ectoderm, mesoderm, or endoderm strongly expressed the ectoderm marker hPAX6 gene, mesoderm marker hNCAM1 gene, or endoderm marker hSOX17 gene, respectively. From these results, it was confirmed that the hNPY2R-expressing iPS cells had the ability to differentiate into three embryo-like cells.
  • Figure 21 shows the results of chromosome testing using the G differential staining method. It was confirmed that there were no abnormalities in the chromosomes of hNPY2R-expressing iPS cells.
  • the ligand responsiveness of cells prepared from hNPY2R-expressing iPS cells according to the procedure (2-7) above was analyzed by measuring extracellular potential according to the procedure (4-3) above.
  • the extracellular potential heat map is shown in FIG. 26.
  • the measurement results are shown in FIG.
  • the horizontal axis shows time (seconds), and the vertical axis shows the rate of change in fluorescence intensity ( ⁇ F/F0) when the average value (F0) of fluorescence intensity before addition of PYY (0 to 125 seconds) is set to 1.
  • Addition of PYY increased intracellular Ca 2+ concentration.
  • the number of neural firings (spikes) per minute is shown in FIG. Addition of PYY increased the number of spikes (*P ⁇ 0.05, n 15 cells/3 samples, student-t).
  • hGLP2R-expressing iPS cells A bright field image of hGLP2R-expressing iPS cells is shown in FIG. 33. In the figure, the scale bar indicates 1 mm.
  • FIG. 34 shows the results of confirming the expression of the stem cell marker hNANOG gene in hGLP2R-expressing iPS cells by qPCR according to the procedure (3-1) above.
  • hGLP2R indicates hGLP2R-expressing iPS cells
  • Control indicates wild-type iPS cells. It was confirmed that hGLP2R-expressing iPS cells expressed the hNANOG gene to the same extent as wild-type iPS cells and were in an undifferentiated state.
  • the ability of hGLP2R-expressing iPS cells to differentiate into three embryo-like cells was evaluated.
  • the results are shown in FIG.
  • the hGLP2R-expressing iPS cells induced to differentiate into ectoderm, mesoderm, or endoderm strongly expressed the ectoderm marker hNES gene, mesoderm marker hNCAM1 gene, or endoderm marker hSOX17 gene, respectively. From these results, it was confirmed that the hGLP2R-expressing iPS cells had the ability to differentiate into three embryo-like cells.
  • Figure 36 shows the results of chromosome testing using the G differential staining method. It was confirmed that there were no abnormalities in the chromosomes of hGLP2R-expressing iPS cells.
  • FIG. 40 The results of immune cell staining are shown in Figure 40.
  • the scale bar indicates 100 ⁇ m.
  • hHTR3A-expressing iPS cells A bright field image of hHTR3A-expressing iPS cells is shown in FIG. 43. In the figure, the scale bar indicates 1 mm.
  • FIG. 44 shows the results of confirming the expression of the stem cell marker hNANOG gene in hHTR3A-expressing iPS cells by qPCR according to the procedure (3-1) above.
  • hHTR3A indicates hHTR3A-expressing iPS cells
  • Control indicates wild-type iPS cells. It was confirmed that hHTR3A-expressing iPS cells expressed the hNANOG gene to the same extent as wild-type iPS cells and were in an undifferentiated state.
  • FIG. 50 The results of immune cell staining are shown in Figure 50.
  • the scale bar indicates 100 ⁇ m. Expression of hHTR3A protein and mature neuron marker MAP2 protein was confirmed.
  • hCCKAR-expressing iPS cells A bright field image of hCCKAR-expressing iPS cells is shown in FIG. 53. In the figure, the scale bar indicates 1 mm.
  • FIG. 54 shows the results of confirming the expression of the stem cell marker hNANOG gene in hCCKAR-expressing iPS cells by qPCR according to the procedure (3-1) above.
  • hCCKAR indicates hCCKAR-expressing iPS cells
  • Control indicates wild-type iPS cells. It was confirmed that hCCKAR-expressing iPS cells expressed the hNANOG gene to the same extent as wild-type iPS cells and were in an undifferentiated state.
  • the ability of hCCKAR-expressing iPS cells to differentiate into three embryo-like cells was evaluated by the procedure described in (3-2) above. The results are shown in FIG.
  • the hCCKAR-expressing iPS cells induced to differentiate into ectoderm, mesoderm, or endoderm strongly expressed the ectoderm marker hNES gene, mesoderm marker hNCAM1 gene, or endoderm marker hSOX17 gene, respectively. From these results, it was confirmed that the hCCKAR-expressing iPS cells had the ability to differentiate into three embryo-like cells.
  • Figure 56 shows the results of chromosome testing using the G differential staining method. It was confirmed that there were no abnormalities in the chromosomes of hCCKAR-expressing iPS cells.
  • FIG. 60 The results of immune cell staining are shown in Figure 60.
  • the scale bar indicates 100 ⁇ m. Expression of hCCKAR protein and mature neuron marker MAP2 protein was confirmed.
  • the ligand responsiveness of cells prepared from hCCKAR-expressing iPS cells according to the procedure (2-7) above was analyzed by intracellular calcium imaging according to the procedure (4-2) above.
  • the measurement results are shown in FIG. 63.
  • the horizontal axis shows time (seconds), and the vertical axis shows the rate of change in fluorescence intensity ( ⁇ F/F0) when the average value (F0) of fluorescence intensity before addition of CCK-33 (0 to 199 seconds) is set to 1. show. Addition of CCK-33 increased intracellular Ca 2+ concentration.
  • step 1 Analysis of parasympathetic neurons forced to express hGLP1R after differentiation> Using pLV-hGLP1R as the lentiviral vector in step 1 above, expression of hGLP1R protein in parasympathetic nerve cells prepared by step (2-5) above was analyzed by step (3-1) above. The results of immune cell staining on day 40 of induction are shown in FIG. 65. In the figure, the scale bar indicates 100 ⁇ m. Strong expression of parasympathetic nerve cell markers hChAT protein and hGLP1R protein was confirmed.
  • the ligand responsiveness of parasympathetic nerve cells in which hGLP1R protein was forced to be expressed after differentiation according to the procedure (2-7) above was analyzed by intracellular calcium imaging according to the procedure (4-2) above.
  • the measurement results are shown in FIG.
  • the horizontal axis shows time (seconds), and the vertical axis shows the rate of change in fluorescence intensity ( ⁇ F/F0) when the average value (F0) of fluorescence intensity before the addition of GLP1 (0 to 124 seconds) is set to 1. Addition of GLP1 increased intracellular Ca 2+ concentration.
  • step 1 Analysis of parasympathetic neurons forced to express hNPY2R after differentiation> Using pLV-hNPY2R as the lentiviral vector in step 1 above, expression of hNPY2R protein in parasympathetic nerve cells prepared by step (2-5) above was analyzed by step (3-1) above. The results of immune cell staining on day 40 of induction are shown in FIG. 67. In the figure, the scale bar indicates 100 ⁇ m. Strong expression of parasympathetic nerve cell markers hChAT protein and hNPY2R protein was confirmed.
  • the ligand responsiveness of parasympathetic nerve cells in which hNPY2R protein was forced to be expressed after differentiation according to the procedure (2-7) above was analyzed by intracellular calcium imaging according to the procedure (4-2) above.
  • the measurement results are shown in FIG.
  • the horizontal axis shows time (seconds), and the vertical axis shows the rate of change in fluorescence intensity ( ⁇ F/F0) when the average value (F0) of fluorescence intensity before addition of PYY (0 to 124 seconds) is set to 1. Addition of PYY increased intracellular Ca 2+ concentration.
  • FIG. 70 The results of immune cell staining on day 40 of induction are shown in Figure 70.
  • the scale bar indicates 100 ⁇ m. Strong expression of mature neuron markers MAP2 protein and hGLP2R protein was confirmed.
  • the ligand responsiveness of parasympathetic nerve cells in which the hGLP2R protein was forcibly expressed after differentiation according to the procedure (2-7) above was analyzed by intracellular calcium imaging according to the procedure (4-2) above.
  • the measurement results are shown in FIG.
  • the horizontal axis shows time (seconds), and the vertical axis shows the rate of change in fluorescence intensity ( ⁇ F/F0) when the average value (F0) of fluorescence intensity before the addition of GLP2 (0 to 80 seconds) is set to 1. Addition of GLP2 increased intracellular Ca 2+ concentration.
  • the ligand responsiveness of parasympathetic nerve cells in which hHTR3A protein was forced to be expressed after differentiation according to the procedure (2-7) above was analyzed by intracellular calcium imaging according to the procedure (4-2) above.
  • the measurement results are shown in FIG. 75.
  • the horizontal axis shows time (seconds), and the vertical axis shows the rate of change in fluorescence intensity ( ⁇ F/F0) when the average value (F0) of fluorescence intensity before 5-HT addition (0 to 80 seconds) is set to 1. show. Addition of 5-HT increased intracellular Ca 2+ concentration.
  • Rate of change ( ⁇ F ave /F0) in the average value of fluorescence intensity ( ⁇ F ave ) after addition of 5-HT (240 to 400 seconds) to the average value (F0) of fluorescence intensity before addition of 5-HT (0 to 80 seconds) ) is shown in FIG.
  • Figure 78 shows the results of immune cell staining on day 40 of induction.
  • the scale bar indicates 100 ⁇ m. Strong expression of mature neuron markers MAP2 protein and hCCKAR protein was confirmed.
  • the ligand responsiveness of parasympathetic nerve cells in which the hCCKAR protein was forcibly expressed after differentiation according to the procedure (2-7) above was analyzed by intracellular calcium imaging according to the procedure (4-2) above.
  • the measurement results are shown in FIG.
  • the horizontal axis shows time (seconds), and the vertical axis shows the rate of change in fluorescence intensity ( ⁇ F/F0) when the average value (F0) of fluorescence intensity before addition of CCK-33 (0 to 80 seconds) is set to 1. show. Addition of CCK-33 increased intracellular Ca 2+ concentration.
  • H716 medium Human L cell-derived cell line NCI-H716 (ATCC: CCL-251) was grown in a 10 cm dish using RPMI-1640 (hereinafter referred to as "H716 medium") containing 10% FBS and 1% P/S. The cells were seeded (1-2 ⁇ 10 6 cells/dish) and cultured for 3-4 days. The cells and medium were collected into a 15 mL centrifuge tube, centrifuged at 200 xg for 5 minutes, and the supernatant was removed.
  • FBS-free H716 medium or Ringer's solution was added to the cells to adjust to 1 ⁇ 10 6 cells/mL.
  • 5 ⁇ L of 20 ⁇ M MemGlow/DMSO solution was added to 1 mL of the obtained cell suspension (final concentration 100 nM), and the mixture was incubated at room temperature for 10 minutes. Thereafter, the mixture was centrifuged at 200 ⁇ g for 5 minutes, and the supernatant was removed. After washing once with H716 medium, the cells were seeded in a 10 cm dish. It was confirmed that cell membrane staining with MemGlow was maintained for up to 10 days.
  • NCI-H716 cells stained with MemGlow will be referred to as "MemGlow-stained NCI-H716.”
  • hGLP1R-expressing parasympathetic neurons prepared from hGLP1R-expressing iPS cells by the procedure (2-7) above (37th day of induction) were injected with MemGlow-stained NCI-H716 (2 ⁇ 1 mL of 10 5 cells/mL) was added. As a result, co-culture was carried out in a 1:1 mixed medium of NDM2 and H716 medium. After 48 hours of culture, immune cell staining was performed using the same procedure as (3-1) (ii) above. Anti-MAP2 antibody (Abcam, ab11267) (1:1000 dilution) was used as the primary antibody.
  • FIG. The horizontal axis shows time (seconds), and the vertical axis shows the rate of change in fluorescence intensity ( ⁇ F/F0) when the average value (F0) of fluorescence intensity before glucose addition (0 to 199 seconds) is set to 1.
  • Addition of glucose to the co-culture increased the intracellular Ca 2+ concentration of hGLP1R-expressing parasympathetic neurons.
  • Figure 83 shows the rate of change ( ⁇ F ave /F0) of the average fluorescence intensity ( ⁇ F ave ) after glucose addition (200 to 400 seconds) to the average fluorescence intensity (F0) before glucose addition (0 to 199 seconds). Shown below.
  • ⁇ -linolenic acid Fujifilm Wako Pure Chemicals: 127-05901
  • ALA ⁇ -linolenic acid
  • Glucose-free Ringer's solution was used as the solution.
  • FIG. The results are shown in FIG.
  • the horizontal axis shows time (seconds), and the vertical axis shows the rate of change in fluorescence intensity ( ⁇ F/F0) when the average value (F0) of fluorescence intensity before addition of ALA (0 to 199 seconds) is set to 1.
  • Addition of ALA to co-culture increased the intracellular Ca 2+ concentration of hGLP1R-expressing parasympathetic neurons.
  • Figure 85 shows the rate of change ( ⁇ F ave /F0) in the average value of fluorescence intensity ( ⁇ F ave ) after addition of ALA (200 to 400 seconds) to the average value (F0) of fluorescence intensity before addition of ALA (0 to 199 seconds). Shown below.
  • glucose-loaded supernatant the supernatant prepared with Ringer's solution containing glucose
  • ALA-loaded supernatant the supernatant prepared with Ringer's solution containing ALA
  • the results of intracellular calcium imaging using the glucose-loaded supernatant are shown in FIG. 86.
  • the horizontal axis shows time (seconds), and the vertical axis shows the rate of change in fluorescence intensity ( ⁇ F/F0) when the average value (F0) of fluorescence intensity before addition of the supernatant (0 to 199 seconds) is set to 1.
  • Addition of the glucose-loaded supernatant increased the intracellular Ca 2+ concentration in hGLP1R-expressing parasympathetic neurons (44th day of induction).
  • the rate of change ( ⁇ F ave /F0) in the average fluorescence intensity ( ⁇ F ave ) after adding the supernatant (200 to 400 seconds) to the average fluorescence intensity (F0) before adding the supernatant (0 to 199 seconds) is Shown in FIG.
  • "Ctrl” indicates Ringer's solution that has not come into contact with NCI-H716 cells.
  • the results of intracellular calcium imaging using ALA-loaded supernatant are shown in FIG. 88.
  • the horizontal axis shows time (seconds), and the vertical axis shows the rate of change in fluorescence intensity ( ⁇ F/F0) when the average value (F0) of fluorescence intensity before addition of the supernatant (0 to 199 seconds) is set to 1. .
  • the intracellular Ca 2+ concentration of hGLP1R-expressing parasympathetic neurons 34th day of induction
  • the rate of change ( ⁇ F ave /F0) in the average fluorescence intensity ( ⁇ F ave ) after adding the supernatant (200 to 400 seconds) to the average fluorescence intensity (F0) before adding the supernatant (0 to 199 seconds) is Shown in FIG.
  • "Ctrl” indicates Ringer's solution that is not in contact with NCI-H716 cells.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

（ａ）多能性幹細胞の副交感神経細胞への分化を誘導するステップ、および（ｂ１）前記ステップ（ａ）の前に、前記多能性幹細胞に消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸を導入するステップ、または（ｂ２）前記ステップ（ａ）により得られた副交感神経細胞またはその前駆細胞に消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸を導入するステップを含む、迷走神経様副交感神経細胞を作製する方法を提供する。また、前記方法により作製された迷走神経様副交感神経細胞と消化管ホルモン分泌細胞とを含んでなる、脳腸相関モデルを提供する。

Description

迷走神経様副交感神経細胞およびその作製方法
　本発明は、迷走神経様副交感神経細胞およびその作製方法に関する。
　脳と腸は相互作用していることが知られており、これらの双方向的な関係は「脳腸相関」または「脳腸軸」と呼ばれる。腸においては、消化管上皮に存在する胃腸内分泌細胞が栄養素を感知すると、消化管ホルモンを分泌する。消化管ホルモンが求心性迷走神経に作用すると、中枢神経系へとシグナルが伝達される。中枢神経系からは、遠心性迷走神経路により、消化管の蠕動、消化液や消化管ホルモンの分泌が調節される。
　従来、脳腸相関の研究では、ヒト以外の動物を使用した試験、例えば、迷走神経束を切断したマウスを用いた試験や、解剖により単離された臓器の解析などが行われてきた。しかし、近年では、動物福祉・愛護などの倫理上の観点から、動物を用いない代替試験系が強く望まれている。また、動物種差を考慮し、ヒトに近い試験系が求められている。脳腸相関の研究においても、インビトロ試験系の開発が求められている。しかし、消化管迷走神経細胞の培養方法や、ヒト多能性幹細胞から消化管迷走神経細胞を作製する方法は、今までに報告されていない。
　本発明者らは、ヒト多能性幹細胞から自律神経を効率的に誘導する方法およびヒト多能性幹細胞から副交感神経細胞を選択的に誘導する方法をすでに報告した（特許文献１および２）。しかし、上記方法により作製した副交感神経細胞は、消化管迷走神経の指標となる消化管ホルモン受容体を内在的に発現していないまたは低発現である。一方、マウスなどの解析により、生体内には消化管ホルモン受容体の発現様式が異なる１０を超える消化管迷走神経細胞型が存在することが知られている。
特許第６５９３８１１号 特許第６９４２３９８号
　本発明は、消化管ホルモン受容体を恒常的に発現し、かつ、消化管ホルモン応答性を有する、脳腸相関のインビトロ試験系に使用できる迷走神経様副交感神経細胞を提供することを目的としてなされたものである。
　本発明者らは、鋭意研究の結果、グルカゴン様ペプチド１受容体、ニューロペプチドＹ２型受容体、グルカゴン様ペプチド２受容体、セロトニン３受容体またはコレシストキニン１受容体を発現する迷走神経様副交感神経細胞を作出することに成功した。
　すなわち、本発明は、一実施形態によれば、（ａ）多能性幹細胞の副交感神経細胞への分化を誘導するステップ、および（ｂ１）前記ステップ（ａ）の前に、前記多能性幹細胞に消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸を導入するステップ、または（ｂ２）前記ステップ（ａ）により得られた副交感神経細胞またはその前駆細胞に消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸を導入するステップを含む、迷走神経様副交感神経細胞を作製する方法を提供するものである。
　また、本発明は、一実施形態によれば、上記方法により作製された、迷走神経様副交感神経細胞を提供するものである。
　また、本発明は、一実施形態によれば、消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸を含んでなる多能性幹細胞を提供するものである。
　また、本発明は、一実施形態によれば、消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸を含んでなる迷走神経様副交感神経細胞を提供するものである。
　また、本発明は、一実施形態によれば、（１）上記迷走神経様副交感神経細胞に試料を接触させるステップ、および、（２）前記迷走神経様副交感神経細胞の神経活動を解析するステップを含む、試料中の消化管ホルモン受容体アゴニストを検出する方法を提供するものである。
　上記消化管ホルモン受容体は、グルカゴン様ペプチド１受容体、ニューロペプチドＹ２型受容体、グルカゴン様ペプチド２受容体、セロトニン３受容体およびコレシストキニン１受容体からなる群から選択されることが好ましい。
　また、本発明は、一実施形態によれば、（１）候補物質の存在下で上記迷走神経様副交感神経細胞を培養するステップ、および、（２）前記迷走神経様副交感神経細胞の神経活動を解析するステップを含む、脳腸相関を制御する物質のスクリーニング方法を提供するものである。
　また、本発明は、一実施形態によれば、（１）候補物質の存在下で消化管ホルモン分泌細胞を培養するステップ、（２）前記ステップ（１）により得られた培養物から培養上清を回収するステップ、（３）上記迷走神経様副交感神経細胞に前記培養上清を接触させるステップ、および、（４）前記迷走神経様副交感神経細胞の神経活動を解析するステップを含む、脳腸相関を制御する物質のスクリーニング方法を提供するものである。
　また、本発明は、一実施形態によれば、（１）候補物質の存在下で消化管ホルモン分泌細胞と上記迷走神経様副交感神経細胞とを共培養するステップ、および（２）前記迷走神経様副交感神経細胞の神経活動を解析するステップを含む、脳腸相関を制御する物質のスクリーニング方法を提供するものである。
　また、本発明は、一実施形態によれば、消化管ホルモン分泌細胞と上記迷走神経様副交感神経細胞との共培養を含んでなる、脳腸相関モデルを提供するものである。
　上記消化管ホルモン分泌細胞は、腸内分泌細胞であることが好ましい。
　また、本発明は、一実施形態によれば、脳腸相関を制御する物質のスクリーニングのための、上記迷走神経様副交感神経細胞または上記脳腸相関モデルの使用を提供するものである。
　本発明に係る方法によれば、脳腸相関のインビトロ試験系に使用できる迷走神経様副交感神経細胞を、高効率かつ安価に作製することができる。また、本発明に係る迷走神経様副交感神経細胞は、消化管迷走神経求心路の消化管ホルモン応答を模倣することができる。そのため、本発明に係る迷走神経様副交感神経細胞は、例えば、脳腸相関のインビトロ試験系の開発、消化管ホルモン受容体に対するアゴニストの検出または新規アゴニストの探索、消化管内分泌細胞からの消化管ホルモン放出の検出または消化管ホルモン放出を誘導する物質の探索のために有用である。
図１は、野生型ｉＰＳ細胞および外因性ｈＧＬＰ１Ｒ遺伝子を導入したｉＰＳ細胞におけるｈＧＬＰ１ＲのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図２は、外因性ｈＧＬＰ１Ｒ遺伝子を導入したｉＰＳ細胞のＨｏｅｃｈｓｔ染色像（上）および抗ＧＬＰ１Ｒ抗体を用いた蛍光免疫染色像（下）を示す図である。 図３は、ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞の顕微鏡像（明視野）を示す図である。 図４は、野生型ｉＰＳ細胞およびｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞におけるｈＮＡＮＯＧのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図５は、未分化のｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞、および、外胚葉、中胚葉または内胚葉への分化を誘導されたｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞における、ｈＰＡＸ６、ｈＮＣＡＭ１またはｈＳＯＸ１７のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図６は、ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞の染色体をＧ分染法により解析した結果を示す図である。 図７は、ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導０日目のＥＢおよび誘導１３日目の細胞の顕微鏡像（明視野）を示す図である。 図８は、ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導１３日目の細胞におけるｈＮＡＮＯＧ、ｈＳＯＸ１０およびｈＰＨＯＸ２ＢのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図９は、ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導４０日目の細胞におけるｈＰＲＰＨ、ｈＣＨＡＴおよびｈＧＬＰ１ＲのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図１０は、ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導４５日目の細胞のＨｏｅｃｈｓｔ染色像（上）、抗ＧＬＰ１Ｒ抗体を用いた蛍光免疫染色像（中央）および抗ＧＬＰ１Ｒ抗体＋抗ＭＡＰ２抗体を用いた蛍光免疫染色像（下）を示す図である。 図１１は、ＧＬＰ１を添加したまたは添加しない条件下での、ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導２７日目の細胞の細胞外電位ヒートマップを示す図である。 図１２は、ＧＬＰ１を添加したまたは添加しない条件下での、ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導２７日目の細胞の発火頻度の変化率を示すグラフである。 図１３は、ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導４０日目の細胞のカルシウムイメージングの結果を示す図である。（上）ＧＬＰ１添加（測定開始から１２５秒時点）直後の細胞の蛍光像、および（下）３つの細胞（ｃｅｌｌ　１～３）の蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ΔＦ／Ｆ０））の経時的変化。 図１４は、ＧＬＰ１を添加したまたは添加しない条件下での、ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導４０日目の細胞のＣａ２＋スパイクの数を示すグラフである。 図１５は、ＧＬＰ１を添加したまたは添加しない条件下での、ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導４０日目の細胞のＣａ２＋スパイクの振幅を示すグラフである。 図１６は、野生型ｉＰＳ細胞および外因性ｈＮＰＹ２Ｒ遺伝子を導入したｉＰＳ細胞におけるｈＮＰＹ２ＲのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図１７は、外因性ｈＮＰＹ２Ｒ遺伝子を導入したｉＰＳ細胞のＨｏｅｃｈｓｔ染色像（上）および抗ＮＰＹ２Ｒ抗体を用いた蛍光免疫染色像（下）を示す図である。 図１８は、ｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞の顕微鏡像（明視野）を示す図である。 図１９は、野生型ｉＰＳ細胞およびｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞におけるｈＮＡＮＯＧのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図２０は、未分化のｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞、および、外胚葉、中胚葉または内胚葉への分化を誘導されたｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞における、ｈＰＡＸ６、ｈＮＣＡＭ１またはｈＳＯＸ１７のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図２１は、ｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞の染色体をＧ分染法により解析した結果を示す図である。 図２２は、ｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導０日目のＥＢおよび誘導１３日目の細胞の顕微鏡像（明視野）を示す図である。 図２３は、ｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導１３日目の細胞におけるｈＮＡＮＯＧ、ｈＳＯＸ１０およびｈＰＨＯＸ２ＢのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図２４は、ｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導４０日目の細胞におけるｈＰＲＰＨ、ｈＣＨＡＴおよびｈＮＰＹ２ＲのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図２５は、ｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導４５日目の細胞のＨｏｅｃｈｓｔ染色像（上）、抗ＮＰＹ２Ｒ抗体を用いた蛍光免疫染色像（中央）および抗ＮＰＹ２Ｒ抗体＋抗ＭＡＰ２抗体を用いた蛍光免疫染色像（下）を示す図である。 図２６は、ＰＹＹを添加したまたは添加しない条件下での、ｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導２７日目の細胞の細胞外電位ヒートマップを示す図である。 図２７は、ＰＹＹを添加したまたは添加しない条件下での、ｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導２７日目の細胞の発火頻度の変化率を示すグラフである。 図２８は、ｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導４０日目の細胞のカルシウムイメージングの結果を示す図である。（上）ＰＹＹ添加（測定開始から１２５秒時点）直後の細胞の蛍光像、および（下）３つの細胞（ｃｅｌｌ　１～３）の蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ΔＦ／Ｆ０））の経時的変化。 図２９は、ＰＹＹを添加したまたは添加しない条件下での、ｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導４０日目の細胞のＣａ２＋スパイクの数を示すグラフである。 図３０は、ＰＹＹを添加したまたは添加しない条件下での、ｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導４０日目の細胞のＣａ２＋スパイクの振幅を示すグラフである。 図３１は、野生型ｉＰＳ細胞および外因性ｈＧＬＰ２Ｒ遺伝子を導入したｉＰＳ細胞におけるｈＧＬＰ２ＲのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図３２は、外因性ｈＧＬＰ２Ｒ遺伝子を導入したｉＰＳ細胞のＨｏｅｃｈｓｔ染色像（上）および抗ＧＬＰ２Ｒ抗体を用いた蛍光免疫染色像（下）を示す図である。 図３３は、ｈＧＬＰ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞の顕微鏡像（明視野）を示す図である。 図３４は、野生型ｉＰＳ細胞およびｈＧＬＰ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞におけるｈＮＡＮＯＧのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図３５は、未分化のｈＧＬＰ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞、および、外胚葉、中胚葉または内胚葉への分化を誘導されたｈＧＬＰ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞における、ｈＮＥＳ、ｈＮＣＡＭ１またはｈＳＯＸ１７のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図３６は、ｈＧＬＰ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞の染色体をＧ分染法により解析した結果を示す図である。 図３７は、ｈＧＬＰ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導０日目のＥＢおよび誘導１３日目の細胞の顕微鏡像（明視野）を示す図である。 図３８は、ｈＧＬＰ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導１３日目の細胞におけるｈＮＡＮＯＧ、ｈＳＯＸ１０およびｈＰＨＯＸ２ＢのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図３９は、ｈＧＬＰ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導４０日目の細胞におけるｈＰＲＰＨ、ｈＣＨＡＴおよびｈＧＬＰ２ＲのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図４０は、ｈＧＬＰ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導４０日目の細胞のＨｏｅｃｈｓｔ染色像（上）、抗ＧＬＰ２Ｒ抗体を用いた蛍光免疫染色像（中央）および抗ＧＬＰ２Ｒ抗体＋抗ＭＡＰ２抗体を用いた蛍光免疫染色像（下）を示す図である。 図４１は、野生型ｉＰＳ細胞および外因性ｈＨＴＲ３Ａ遺伝子を導入したｉＰＳ細胞におけるｈＨＴＲ３ＡのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図４２は、外因性ｈＨＴＲ３Ａ遺伝子を導入したｉＰＳ細胞のＨｏｅｃｈｓｔ染色像（上）および抗ＨＴＲ３Ａ抗体を用いた蛍光免疫染色像（下）を示す図である。 図４３は、ｈＨＴＲ３Ａ発現ｉＰＳ細胞の顕微鏡像（明視野）を示す図である。 図４４は、野生型ｉＰＳ細胞およびｈＨＴＲ３Ａ発現ｉＰＳ細胞におけるｈＮＡＮＯＧのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図４５は、未分化のｈＨＴＲ３Ａ発現ｉＰＳ細胞、および、外胚葉、中胚葉または内胚葉への分化を誘導されたｈＨＴＲ３Ａ発現ｉＰＳ細胞における、ｈＮＥＳ、ｈＮＣＡＭ１またはｈＳＯＸ１７のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図４６は、ｈＨＴＲ３Ａ発現ｉＰＳ細胞の染色体をＧ分染法により解析した結果を示す図である。 図４７は、ｈＨＴＲ３Ａ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導０日目のＥＢおよび誘導１３日目の細胞の顕微鏡像（明視野）を示す図である。 図４８は、ｈＨＴＲ３Ａ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導１３日目の細胞におけるｈＮＡＮＯＧ、ｈＳＯＸ１０およびｈＰＨＯＸ２ＢのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図４９は、ｈＨＴＲ３Ａ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導４０日目の細胞におけるｈＰＲＰＨ、ｈＣＨＡＴおよびｈＨＴＲ３ＡのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図５０は、ｈＨＴＲ３Ａ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導４０日目の細胞のＨｏｅｃｈｓｔ染色像（上）、抗ＨＴＲ３Ａ抗体を用いた蛍光免疫染色像（中央）および抗ＨＴＲ３Ａ抗体＋抗ＭＡＰ２抗体を用いた蛍光免疫染色像（下）を示す図である。 図５１は、野生型ｉＰＳ細胞および外因性ｈＣＣＫＡＲ遺伝子を導入したｉＰＳ細胞におけるｈＣＣＫＡＲのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図５２は、外因性ｈＣＣＫＡＲ遺伝子を導入したｉＰＳ細胞のＨｏｅｃｈｓｔ染色像（上）および抗ＣＣＫＡＲ抗体を用いた蛍光免疫染色像（下）を示す図である。 図５３は、ｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞の顕微鏡像（明視野）を示す図である。 図５４は、野生型ｉＰＳ細胞およびｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞におけるｈＮＡＮＯＧのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図５５は、未分化のｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞、および、外胚葉、中胚葉または内胚葉への分化を誘導されたｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞における、ｈＮＥＳ、ｈＮＣＡＭ１またはｈＳＯＸ１７のｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図５６は、ｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞の染色体をＧ分染法により解析した結果を示す図である。 図５７は、ｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導０日目のＥＢおよび誘導１３日目の細胞の顕微鏡像（明視野）を示す図である。 図５８は、ｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導１３日目の細胞におけるｈＮＡＮＯＧ、ｈＳＯＸ１０およびｈＰＨＯＸ２ＢのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図５９は、ｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導４０日目の細胞におけるｈＰＲＰＨ、ｈＣＨＡＴおよびｈＣＣＫＡＲのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図６０は、ｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導４０日目の細胞のＨｏｅｃｈｓｔ染色像（上）、抗ＣＣＫＡＲ抗体を用いた蛍光免疫染色像（中央）および抗ＣＣＫＡＲ抗体＋抗ＭＡＰ２抗体を用いた蛍光免疫染色像（下）を示す図である。 図６１は、ＣＣＫ－３３を添加したまたは添加しない条件下での、ｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導２７日目の細胞の細胞外電位ヒートマップを示す図である。 図６２は、ＣＣＫ－３３を添加したまたは添加しない条件下での、ｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導２７日目の細胞の発火頻度の変化率を示すグラフである。 図６３は、ｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導４０日目の細胞のカルシウムイメージングの結果を示す図である。（上）ＣＣＫ－３３添加（測定開始から２００秒時点）直後の細胞の蛍光像、および（下）３つの細胞（ｃｅｌｌ　１～３）の蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ΔＦ／Ｆ０））の経時的変化。 図６４は、ＣＣＫ－３３を添加したまたは添加しない条件下での、ｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞から調製された誘導３４日目の細胞のカルシウムイメージングにおける蛍光強度の変化率を示すグラフである。 図６５は、ｈＧＬＰ１Ｒ遺伝子を分化後に強制発現させた副交感神経細胞（誘導４０日目）のＨｏｅｃｈｓｔ染色像（上）、抗ＣｈＡＴ抗体を用いた蛍光免疫染色像（中央）および抗ＧＬＰ１Ｒ抗体を用いた蛍光免疫染色像（下）を示す図である。 図６６は、ｈＧＬＰ１Ｒを分化後に強制発現させた副交感神経細胞（誘導３０日目）の細胞のカルシウムイメージングの結果を示す図である。（上）ＧＬＰ１添加（測定開始から１２５秒時点）直後の細胞の蛍光像、および（下）３つの細胞（ｃｅｌｌ　１～３）の蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ΔＦ／Ｆ０））の経時的変化。 図６７は、ｈＮＰＹ２Ｒ遺伝子を分化後に強制発現させた副交感神経細胞（誘導４０日目）のＨｏｅｃｈｓｔ染色像（上）、抗ＣｈＡＴ抗体を用いた蛍光免疫染色像（中央）および抗ＮＰＹ２Ｒ抗体を用いた蛍光免疫染色像（下）を示す図である。 図６８は、ｈＮＰＹ２Ｒを分化後に強制発現させた副交感神経細胞（誘導４５日目）の細胞のカルシウムイメージングの結果を示す図である。（上）ＰＹＹ添加（測定開始から１２５秒時点）直後の細胞の蛍光像、および（下）３つの細胞（ｃｅｌｌ　１～３）の蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ΔＦ／Ｆ０））の経時的変化。 図６９は、ｈＧＬＰ２Ｒ遺伝子を分化後に強制発現させた副交感神経細胞（誘導４０日目）におけるｈＰＲＰＨ、ｈＣＨＡＴおよびｈＧＬＰ２ＲのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図７０は、ｈＧＬＰ２Ｒ遺伝子を分化後に強制発現させた副交感神経細胞（誘導４０日目）のＨｏｅｃｈｓｔ染色像（上）、抗ＧＬＰ２Ｒ抗体を用いた蛍光免疫染色像（中央）および抗ＭＡＰ２抗体を用いた蛍光免疫染色像（下）を示す図である。 図７１は、ｈＧＬＰ２Ｒを分化後に強制発現させた副交感神経細胞（誘導３７日目）の細胞のカルシウムイメージングの結果を示す図である。（上）ＧＬＰ２添加（測定開始から２４０秒時点）直後の細胞の蛍光像、および（下）３つの細胞（ｃｅｌｌ　１～３）の蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ΔＦ／Ｆ０））の経時的変化。 図７２は、ＧＬＰ２を添加したまたは添加しない条件下での、ｈＧＬＰ２Ｒ遺伝子を分化後に強制発現させた副交感神経細胞（誘導３７日目）の発火強度の変化率を示すグラフである。 図７３は、ｈＨＴＲ３Ａ遺伝子を分化後に強制発現させた副交感神経細胞（誘導４０日目）におけるｈＰＲＰＨ、ｈＣＨＡＴおよびｈＨＴＲ３ＡのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図７４は、ｈＨＴＲ３Ａ遺伝子を分化後に強制発現させた副交感神経細胞（誘導４０日目）のＨｏｅｃｈｓｔ染色像（上）、抗ＨＴＲ３Ａ抗体を用いた蛍光免疫染色像（中央）および抗ＭＡＰ２抗体を用いた蛍光免疫染色像（下）を示す図である。 図７５は、ｈＨＴＲ３Ａを分化後に強制発現させた副交感神経細胞（誘導３７日目）のカルシウムイメージングの結果を示す図である。（上）５－ＨＴ添加（測定開始から２４０秒時点）直後の細胞の蛍光像、および（下）３つの細胞（ｃｅｌｌ　１～３）の蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ΔＦ／Ｆ０））の経時的変化。 図７６は、５－ＨＴを添加したまたは添加しない条件下での、ｈＨＴＲ３Ａ遺伝子を分化後に強制発現させた副交感神経細胞（誘導３７日目）の発火強度の変化率を示すグラフである。 図７７は、ｈＣＣＫＡＲ遺伝子を分化後に強制発現させた副交感神経細胞（誘導４０日目）におけるｈＰＲＰＨ、ｈＣＨＡＴおよびｈＣＣＫＡＲのｍＲＮＡの発現量を示すグラフである。 図７８は、ｈＣＣＫＡＲ遺伝子を分化後に強制発現させた副交感神経細胞（誘導４０日目）のＨｏｅｃｈｓｔ染色像（上）、抗ＣＣＫＡＲ抗体を用いた蛍光免疫染色像（中央）および抗ＭＡＰ２抗体を用いた蛍光免疫染色像（下）を示す図である。 図７９は、ｈＣＣＫＡＲを分化後に強制発現させた副交感神経細胞（誘導３７日目）のカルシウムイメージングの結果を示す図である。（上）ＣＣＫ－３３添加（測定開始から２４０秒時点）直後の細胞の蛍光像、および（下）３つの細胞（ｃｅｌｌ　１～３）の蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ΔＦ／Ｆ０））の経時的変化。 図８０は、ＣＣＫ－３３を添加したまたは添加しない条件下での、ｈＣＣＫＡＲ遺伝子を分化後に強制発現させた副交感神経細胞（誘導３７日目）の発火強度の変化率を示すグラフである。 図８１は、ｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞およびＮＣＩ－Ｈ７１６細胞の共培養の、抗ＭＡＰ２抗体を用いた蛍光免疫染色像（上）、ＭｅｍＧｌｏｗ蛍光像（中央）、およびそれらを重ねた画像（下）を示す図である。 図８２は、グルコースを添加したｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞（誘導３８日目）およびＮＣＩ－Ｈ７１６細胞の共培養のカルシウムイメージングの結果を示す図である。（上）グルコース添加（測定開始から２００秒時点）直後の蛍光像、（下）３つのｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞（ｃｅｌｌ　１～３）の蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ΔＦ／Ｆ０））の経時的変化。 図８３は、グルコースを添加したまたは添加しない条件下でのｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞およびＮＣＩ－Ｈ７１６細胞の共培養における、ｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞の発火強度の変化率を示すグラフである。 図８４は、ＡＬＡを添加したｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞（誘導４４日目）およびＮＣＩ－Ｈ７１６細胞の共培養のカルシウムイメージングの結果を示す図である。（上）ＡＬＡ添加（測定開始から２００秒時点）直後の蛍光像、（下）３つのｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞（ｃｅｌｌ　１～３）の蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ΔＦ／Ｆ０））の経時的変化。 図８５は、ＡＬＡを添加したまたは添加しない条件下でのｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞およびＮＣＩ－Ｈ７１６細胞の共培養における、ｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞の発火強度の変化率を示すグラフである。 図８６は、グルコースを負荷されたＮＣＩ－Ｈ７１６細胞からの培養上清を添加したｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞（誘導４４日目）のカルシウムイメージングの結果を示す図である。（上）培養上清添加（測定開始から２００秒時点）直後の蛍光像、（下）３つのｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞（ｃｅｌｌ　１～３）の蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ΔＦ／Ｆ０））の経時的変化。 図８７は、グルコースを負荷されたＮＣＩ－Ｈ７１６細胞の培養上清を添加したまたは添加しない条件下でのｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞の発火強度の変化率を示すグラフである。 図８８は、ＡＬＡを負荷されたＮＣＩ－Ｈ７１６細胞からの培養上清を添加したｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞（誘導３４日目）のカルシウムイメージングの結果を示す図である。（上）培養上清添加（測定開始から２００秒時点）直後の蛍光像、（下）３つのｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞（ｃｅｌｌ　１～３）の蛍光強度（Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ（ΔＦ／Ｆ０））の経時的変化。 図８９は、ＡＬＡまたはグルコースを負荷されたＮＣＩ－Ｈ７１６細胞の培養上清を添加したまたは添加しない条件下でのｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞の発火強度の変化率を示すグラフである。
　以下、本発明を詳細に説明するが、本発明は本明細書中に説明した実施形態に限定されるものではない。
　本発明は、第一の実施形態によれば、（ａ）多能性幹細胞の副交感神経細胞への分化を誘導するステップ、および（ｂ１）前記ステップ（ａ）の前に、前記多能性幹細胞に消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸を導入するステップ、または（ｂ２）前記ステップ（ａ）により得られた副交感神経細胞またはその前駆細胞に消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸を導入するステップを含む、迷走神経様副交感神経細胞を作製する方法である。
　本実施形態の方法では、多能性幹細胞から副交感神経細胞を誘導する。「多能性幹細胞」には、例えば、胚性幹（ＥＳ）細胞、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞、胚性生殖（ＥＧ）細胞、多能性生殖幹（ｍＧＳ）細胞、Ｍｕｓｅ細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。本実施形態の方法では、いずれの多能性幹細胞を用いてもよいが、ＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を用いることが好ましく、ｉＰＳ細胞を用いることがより好ましい。
　本実施形態における多能性幹細胞は、任意の脊椎動物由来のものであってよく、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、サル、ヒトなどの哺乳動物由来であり、特に好ましくはヒト由来である。
　多能性幹細胞の調製方法は十分に確立されており（例えば、ｉＰＳ細胞については、Ｃｅｌｌ，２００７；１３１（５）：８６１－８７２，ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２００７．１１．０１９）、当分野において公知の方法にしたがって、任意の組織または細胞から多能性幹細胞を調製することができる。あるいは、すでに樹立されたｉＰＳ細胞株やＥＳ細胞株を、例えば、京都大学ｉＰＳ細胞研究財団（ＣｉＲＡ＿Ｆ）、理化学研究所バイオリソース研究センター（ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣ）、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などのセルバンクから入手してもよい。
　多能性幹細胞を副交感神経細胞へと誘導する方法はすでに確立されており（例えば、国際公開第２０２０／０４０２８６、国際公開第２０１６／１９４５２２）、当分野において公知の方法にしたがって副交感神経細胞を調製することができる。具体的には、例えば、ＤＭＥＭ／ＨＡＭ’ｓ　Ｆ－１２培地、ヒト幹細胞（ｈＥＳ）培地、Ｎ２培地またはそれらの混合物などを基礎培地として、ドルソモルフィンのようなＢＭＰシグナル経路阻害剤、ＳＢ４３１５４２のようなＴＧＦシグナル経路阻害剤、ＣＨＩＲ９９０２１のようなＷｎｔシグナル経路活性化剤、線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）のようなＦＧＦシグナル経路活性化剤、上皮成長因子（ＥＧＦ）のようなＥＧＦシグナル経路活性化剤などを適宜添加した条件下で多能性幹細胞を培養することにより、神経堤細胞を調製し、次いで、フォルスコリンなどのｃＡＭＰ産生促進剤、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のようなＢＤＮＦシグナル経路活性化剤、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）のようなＧＤＮＦシグナル経路活性化剤、ＮＧＦ－βのようなＮＧＦシグナル経路活性化剤、ニューロトロフィン３のようなＮＴ－３シグナル経路活性化剤、アスコルビン酸のようなビタミンＣ、ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート（ＰＭＡ）のようなプロテインキナーゼＣ活性化剤、レチノイン酸のようなレチノイン酸受容体アゴニストなどを適宜添加した条件下で神経堤細胞を培養することにより、副交感神経細胞を調製することができる。この際、多能性幹細胞および神経堤細胞は、上記分化誘導前に事前調整されることが好ましく、多能性幹細胞は、Ｙ－２７６３２のようなＲｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む培地中で２～３日培養されることが好ましく、神経堤細胞は、ＢＭＰ４のようなＢＭＰシグナル経路活性化剤、ＳＡＮＴ－１のようなＳＨＨシグナル経路阻害剤、ＩＷＲ－１のようなＷｎｔシグナル経路阻害剤などを含む培地中で２～３日培養されることが好ましい（国際公開第２０２０／０４０２８６、国際公開第２０１６／１９４５２２）。
　本実施形態の方法では、消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸を細胞に導入する。本実施形態における「消化管ホルモン受容体」は、迷走神経細胞に発現する任意の消化管ホルモン受容体であってよい。したがって、本実施形態の方法では、例えば、グルカゴン様ペプチド１受容体（ＧＬＰ１Ｒ）、ニューロペプチドＹ２型受容体（ＮＰＹ２Ｒ）、グルカゴン様ペプチド２受容体（ＧＬＰ２Ｒ）、セロトニン３受容体（５－ＨＴ３Ｒ）およびコレシストキニン１受容体（ＣＣＫＡＲ）などから選択される消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸を用いることができるが、これらには限定されない。本実施形態の方法では、上記から選択される単独または２種類以上の消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸を適宜組み合わせて用いてよい。
　消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸は、任意の時点で細胞に導入されてよい。例えば、消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸は、分化誘導前の多能性幹細胞に導入されてもよいし、分化誘導によって得られた副交感神経細胞に導入されてもよいし、副交感神経細胞へと分化しつつある前駆細胞に導入されてもよい。好ましくは、ＧＬＰ１Ｒ、ＮＰＹ２ＲおよびＣＣＫＡＲをコードする外因性核酸は、分化誘導前の多能性幹細胞に導入されてよく；ＧＬＰ２Ｒおよび５－ＨＴ３Ｒをコードする外因性核酸は、分化誘導によって得られた副交感神経細胞に導入されてよい。
　本実施形態における消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸は、任意の脊椎動物由来のものであってよく、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、サル、ヒトなどの哺乳動物由来であり、特に好ましくはヒト由来である。
　消化管ホルモン受容体をコードする遺伝子はすでにクローニングされており、それらの核酸配列情報は、所定のデータベースから入手することができる。例えば、ヒトグルカゴン様ペプチド１受容体（ｈＧＬＰ１Ｒ）遺伝子であればＮＭ＿００２０６２．５、ヒトニューロペプチドＹ２型受容体（ｈＮＰＹ２Ｒ）遺伝子であればＮＭ＿０００９１０．４、ヒトグルカゴン様ペプチド２受容体（ｈＧＬＰ２Ｒ）遺伝子であればＮＭ＿００４２４６．３、ヒトセロトニン３受容体（ｈＨＴＲ３Ａ）遺伝子であればＮＭ＿２１３６２１．４、ヒトコレシストキニン１受容体（ｈＣＣＫＡＲ）遺伝子であればＮＭ＿０００７３０．３（いずれもＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ）が利用可能である。
　本実施形態における消化管ホルモン受容体には、同等の活性を有するそれらのバリアントやホモログなども含まれてよい。言い換えれば、本実施形態における消化管ホルモン受容体には、その受容体活性が維持されていることを限度として、データベースに登録されているアミノ酸配列と、例えば８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、一層好ましくは９７％以上、一層より好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が包含され得る。アミノ酸配列の同一性は、配列解析ソフトウェアを用いて、または、当分野で慣用のプログラム（ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴなど）を用いて算出することができる。また、本実施形態における消化管ホルモン受容体には、その受容体活性が維持されていることを限度として、データベースに登録されているアミノ酸配列において、１～数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質が包含され得る。ここで、「１～数個」とは、例えば１～３０個であってよく、好ましくは１～１０個であってよく、特に好ましくは１～５個であってよい。
　消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸は、当分野において周知の方法により細胞に導入することができ、例えば、それらの核酸を発現ベクターにクローニングして、細胞に導入すればよい。発現ベクターには、例えば、以下に限定されないが、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、センダイウイルスなどのウイルスベクターや、ｐＣＭＶなどのプラスミドベクターなどを用いることができる。
　本実施形態の方法において、発現ベクターは、その種類に応じて当分野において周知の方法により細胞に導入され得る。非ウイルスベクターであれば、例えば、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションなどにより導入することができる。ウイルスベクターであれば、適切な力価または多重感染度（ＭＯＩ）において細胞に感染させることにより導入することができる。
　本実施形態の方法によれば、迷走神経様副交感神経細胞を作製することが可能である。
　言い換えれば、本発明は、第二の実施形態によれば、上記方法により作製された迷走神経様副交感神経細胞である。
　ここで、「迷走神経様副交感神経細胞」とは、迷走神経細胞の消化管ホルモン応答を模倣することができる副交感神経細胞をいう。本実施形態における迷走神経様副交感神経細胞は、周知の副交感神経細胞マーカー、自律神経細胞マーカー、末梢神経細胞マーカー、成熟神経細胞マーカーおよび消化管ホルモン受容体の任意の組み合わせによって定義されてよく、例えば、ＣｈＡＴ（コリンアセチルトランスフェラーゼ）、ＰＨＯＸ２Ｂ（ｐａｉｒｅｄ－ｌｉｋｅホメオボックス２Ｂ）、ＰＲＰＨ（ペリフェリン）、ＭＡＰ２（微小管関連タンパク質２）、ＶＡＣｈＴ（別名ＳＬＣ１８Ａ３、小胞アセチルコリントランスポーター）、ＣＨＴ（別名ＳＬＣ５Ａ７、高親和性コリントランスポーター）、ＳＴＭＮ２（スタスミン２）、ＰＨＯＸ２Ａ（ｐａｉｒｅｄ－ｌｉｋｅホメオボックス２Ａ）、ＡＳＣＬ１（別名ＭＡＳＨ１、Ａｃｈａｅｔｅ－ｓｃｕｔｅ　ｈｏｍｏｌｏｇ１）または上で定義したような消化管ホルモン受容体の発現に基づいて定義されてよい。さらに、本実施形態における迷走神経様副交感神経細胞は、上記マーカーに加え、ニコチン性アセチルコリン受容体の発現していることが好ましい。マーカーおよび消化管ホルモン受容体の発現は、ＲＴ－ＰＣＲ、ウェスタンブロット、フローサイトメトリーなどの公知の手法により解析することができる。
　本実施形態における迷走神経様副交感神経細胞は、消化管ホルモン応答性に基づいて定義されてもよく、例えば、カルシウムイメージングや膜電位測定により、消化管ホルモンに対する反応性を確認することにより定義され得る。
　本発明は、第三の実施形態によれば、消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸を含んでなる多能性幹細胞である。
　本発明は、第四の実施形態によれば、消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸を含んでなる迷走神経様副交感神経細胞である。
　第三および第四の実施形態における「消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸」、「多能性幹細胞」および「迷走神経様副交感神経細胞」は、第一および第二の実施形態で定義したものと同様である。第四の実施形態の迷走神経様副交感神経細胞は、第一の実施形態の方法により製造されてよく、第三の実施形態の多能性幹細胞は、その中間産物であってよい。
　第二および第四の実施形態の迷走神経様副交感神経細胞は、脳腸相関のインビトロ評価モデルを作製するために有用である。また、第三の実施形態の多能性幹細胞は、迷走神経様副交感神経細胞を安定的に作製するために有用である。
　本発明は、第五の実施形態によれば、（１）上記迷走神経様副交感神経細胞に試料を接触させるステップ、および、（２）前記迷走神経様副交感神経細胞の神経活動を解析するステップを含む、試料中の消化管ホルモン受容体アゴニストを検出する方法である。
　本実施形態における「試料」は、消化管ホルモン受容体アゴニストを含み得る任意のものであってよい。本実施形態における「消化管ホルモン受容体アゴニスト」は、第一の実施形態において定義した消化管ホルモン受容体に作用し活性化する任意の物質であってよく、既知の内因性消化管ホルモンのみならず、新規または既知の低分子化合物、核酸、タンパク質、ペプチド、抗体、脂質などであってよい。また、本実施形態における消化管ホルモン受容体アゴニストには、フルアゴニストのみならず、パーシャルアゴニストも含まれてよい。したがって、本実施形態の方法における試料は、例えば、動物由来の体液、細胞または組織からの抽出物、細胞または組織の培養上清、植物抽出物などから調製されたものであり得る。本実施形態の方法における試料は、好ましくは、ヒト由来の血液、血漿、血清などの体液や、ヒト消化管由来細胞または腸管上皮組織の培養上清から調製されたものである。
　迷走神経様副交感神経細胞に試料を接触させるためには、迷走神経様副交感神経細胞の培養に試料を添加し、一定時間インキュベートすればよい。インキュベート時間は、例えば０．０１秒～２時間であってよい。
　次いで、迷走神経様副交感神経細胞の神経活動を解析する。神経活動は、当分野において周知の方法により解析すればよく、例えばカルシウムイメージングや膜電位測定により解析することができる。カルシウムイメージングは、例えば、迷走神経様副交感神経細胞に蛍光カルシウム指示薬を負荷し、蛍光強度の変化に基づいて細胞カルシウム濃度変化を測定すればよい。膜電位は、例えば、局所場電位を計測することによる細胞外電位の測定、パッチクランプ法による細胞内電位の測定、膜電位感受性色素を用いた膜電位変化の測定などにより解析することができる。試料の添加により神経活動が変化したかどうかを判定するためには、試料を添加しない培養を並行して解析して比較してもよいし、過去に実施した試料を添加しない培養についての解析結果と比較してもよい。本実施形態の方法において、試料を添加した培地中での迷走神経様副交感神経細胞の神経活動が、試料を添加しない培地中での迷走神経様副交感神経細胞と比較して有意に増強された場合には、試料中に消化管ホルモン受容体アゴニストが存在すると評価することができる。
　本発明は、第六の実施形態によれば、（１）候補物質の存在下で上記迷走神経様副交感神経細胞を培養するステップ、および、（２）前記迷走神経様副交感神経細胞の神経活動を解析するステップを含む、脳腸相関を制御する物質のスクリーニング方法である。
　候補物質は、イオン、ナノ粒子、低分子化合物、核酸、タンパク質、ペプチド、抗体、脂質、動物または植物の細胞、組織もしくはその抽出物、菌体またはその破砕物もしくは抽出物などであってよく、これらの候補物質は、新規なものであってもよいし、公知のものであってもよい。
　迷走神経様副交感神経細胞は、候補物質を添加した培地中で一定期間培養される。添加される候補物質の濃度は、候補物質の種類により異なるが、例えば、低分子化合物であれば、０．００１ｎＭ～１０ｍＭの範囲で適宜選択することができる。培養期間は、例えば、０．０１秒～２時間であってよい。
　次いで、迷走神経様副交感神経細胞の神経活動を解析する。神経活動は、第五の実施形態と同様に、例えばカルシウムイメージングや膜電位測定により解析することができる。カルシウムイメージングは、例えば、迷走神経様副交感神経細胞に蛍光カルシウム指示薬を負荷し、蛍光強度の変化に基づいて細胞カルシウム濃度変化を測定すればよい。膜電位は、例えば、局所場電位を計測することによる細胞外電位の測定、パッチクランプ法による細胞内電位の測定、膜電位感受性色素を用いた膜電位変化の測定などにより解析することができる。候補物質の添加により神経活動が変化したかどうかを判定するためには、候補物質を添加しない培養を並行して解析して比較してもよいし、過去に実施した候補物質を添加しない培養についての解析結果と比較してもよい。本実施形態の方法において、候補物質を添加した培地中での迷走神経様副交感神経細胞の神経活動が、候補物質を添加しない培地中での迷走神経様副交感神経細胞と比較して有意に増強された場合には、当該候補物質は消化管ホルモン受容体アゴニストであり、すなわち、脳腸相関を制御する物質として有望であると評価することができる。
　ここで、「脳腸相関」とは、中枢神経系と消化管との双方向的なコミュニケーションをいう。脳腸相関は、多種多様な症状または障害に関与することがすでに知られている。脳腸相関異常との関連が深い症状または障害としては、例えば、摂食行動異常；吐き気、腹痛、下痢、便秘などの消化管障害；不安行動、うつなどの精神的ストレス症状；アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症などの神経変性疾患；炎症、アレルギーなどの免疫応答異常；肥満、脂質異常症、糖尿病などの代謝性疾患などが挙げられるが、これらに限定されない。脳腸相関を制御する物質は、脳腸相関を正常化することができ、その結果、上記のような症状または障害を予防または処置し得ると判断されてよく、上記のような症状または障害を予防または処置し得る医薬品、サプリメント、特定保健用食品、機能性表示食品の開発に有用であり得る。
　本発明は、第七の実施形態によれば、（１）候補物質の存在下で消化管ホルモン分泌細胞を培養するステップ、（２）前記ステップ（１）により得られた培養物から培養上清を回収するステップ、（３）上記迷走神経様副交感神経細胞に前記培養上清を接触させるステップ、および、（４）前記迷走神経様副交感神経細胞の神経活動を解析するステップを含む、脳腸相関を制御する物質のスクリーニング方法である。本実施形態における「迷走神経様副交感神経細胞」は、第一および第二の実施形態で定義したものと同様であり、「候補物質」および「脳腸相関」は、第六の実施形態において定義したものと同様である。
　本実施形態における「消化管ホルモン分泌細胞」は、消化管ホルモンを分泌し得る細胞であれば、任意の組織に由来する任意の細胞であってよい。消化管ホルモン分泌細胞は、胃から直腸までの消化管上皮および膵臓のランゲルハンス島などに散在しており、その組織分布および分泌するホルモンに基づいて、Ｌ細胞、Ｋ細胞、Ｉ細胞、Ｓ細胞、腸クロム親和性（ＥＣ）細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、Ｎ細胞、Ｍ細胞などに分類される。本実施形態の方法では、上記から選択される単独または２種類以上の消化管ホルモン分泌細胞を適宜組み合わせて用いることができる。本実施形態における消化管ホルモン分泌細胞は、腸内分泌細胞であることが好ましく、例えば、Ｌ細胞、Ｋ細胞、Ｉ細胞、Ｓ細胞、ＥＣ細胞、Ｎ細胞、Ｍ細胞などであってよいが、これらに限定されない。
　本実施形態における消化管ホルモン分泌細胞は、任意の脊椎動物由来のものであってよく、好ましくは、マウス、ラット、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ、サル、ヒトなどの哺乳動物由来であり、特に好ましくはヒト由来である。
　また、本実施形態の方法における消化管ホルモン分泌細胞は、迷走神経様副交感神経細胞と同じ動物由来のものであってもよいし、異なる動物由来のものであってもよい。したがって、本実施形態の方法では、例えば、ヒト消化管ホルモン分泌細胞とヒト迷走神経様副交感神経細胞を組み合わせて用いてもよいし、マウス消化管ホルモン分泌細胞とヒト迷走神経様副交感神経細胞を組み合わせて用いてもよい。好ましくは、本実施形態の方法では、同種の哺乳動物由来の消化管ホルモン分泌細胞および迷走神経様副交感神経細胞を用いることができ、特に好ましくは、ヒト消化管ホルモン分泌細胞およびヒト迷走神経様副交感神経細胞を用いることができる。
　消化管ホルモン分泌細胞は、すでに確立された公知の方法により調製することができる（例えば、Ｓｉｎａｇｏｇａ Ｋ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０１８，１４５（１９）：ｄｅｖ１６５７９５）。具体的には、例えば、ヒト多能性幹細胞から腸管オルガノイドおよび大腸オルガノイドを誘導する過程において、転写因子ＮＥＵＲＯＧ３を強制発現させることにより、ＧＩＰ、グレリン、ＧＬＰ－１、オキシントモジュリンなどの消化管ホルモンを分泌する腸内分泌細胞を調製することができる。あるいは、すでに樹立された消化管ホルモン分泌細胞株を、ＡＴＣＣなどのセルバンクから入手してもよい。消化管ホルモン分泌細胞株には、例えば、ヒトＬ細胞株ＮＣＩ－Ｈ７１６、マウスＬ細胞株ＳＴＣ－１、マウスＬ細胞株ＧＬＵＴａｇ、マウスやヒト消化管から採取された腸内分泌細胞などが挙げられる。
　消化管ホルモン分泌細胞は、ＤＭＥＭ、ＨＡＭ’ｓ　Ｆ－１２培地、ＲＰＭＩ１６４０培地またはそれらの混合物などを基礎培地として、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、非必須アミノ酸溶液、ペニシリン・ストレプトマイシンなどを添加した培地を用いて、安定的に継代培養することができる。
　消化管ホルモン分泌細胞は、候補物質を添加した培地中で一定期間培養される。添加される候補物質の濃度は、候補物質の種類により異なるが、例えば、低分子化合物であれば、０．００１ｎＭ～１０ｍＭの範囲で適宜選択することができる。添加期間は、例えば、１秒～７２時間であってよい。
　次いで、上記培養物から培養上清を回収する。回収された培養上清は、任意選択的に、透析や限外ろ過などにより精製または濃縮されてよい。
　次いで、迷走神経様副交感神経細胞に上記培養上清を接触させる。迷走神経様副交感神経細胞に培養上清を接触させるためには、迷走神経様副交感神経細胞の培地に培養上清を添加し、一定時間インキュベートすればよい。培養上清は、迷走神経様副交感神経細胞の培養培地に対して１～１０倍の液量で添加されてよい。インキュベート時間は、例えば０．０１秒～２時間であってよい。
　次いで、迷走神経様副交感神経細胞の神経活動を解析する。神経活動は、第五および第六の実施形態と同様に、例えばカルシウムイメージングや膜電位測定により解析することができる。カルシウムイメージングは、例えば、迷走神経様副交感神経細胞に蛍光カルシウム指示薬を負荷し、蛍光強度の変化に基づいて細胞カルシウム濃度変化を測定すればよい。膜電位は、例えば、局所場電位を計測することによる細胞外電位の測定、パッチクランプ法による細胞内電位の測定、膜電位感受性色素を用いた膜電位変化の測定などにより解析することができる。本実施形態の方法では、候補物質を添加せずに調製された消化管ホルモン分泌細胞の培養上清を対照として実施することができる。候補物質を添加して調製された消化管ホルモン分泌細胞の培養上清と接触した迷走神経様副交感神経細胞の神経活動が、対照の培養上清と接触した迷走神経様副交感神経細胞の神経活動と比較して有意に増強された場合には、当該候補物質は、消化管ホルモン分泌細胞からの消化管ホルモン分泌を促進し得る、すなわち、脳腸相関を制御する物質として有望であると評価することができる。
　本発明は、第八の実施形態によれば、（１）候補物質の存在下で消化管ホルモン分泌細胞と上記迷走神経様副交感神経細胞とを共培養するステップ、および（２）前記迷走神経様副交感神経細胞の神経活動を解析するステップを含む、脳腸相関を制御する物質のスクリーニング方法である。本実施形態における「候補物質」および「脳腸相関」は、第六および第七の実施形態において定義したものと同様である。「消化管ホルモン分泌細胞」は、第七の実施形態において定義したものと同様である。
　本実施形態の方法では、消化管ホルモン分泌細胞と迷走神経様副交感神経細胞とを共培養する。本実施形態における「共培養」は、両細胞が同一の培地を共有している限り、任意の様式の培養であってよい。したがって、本実施形態における共培養は、直接（接触）共培養または間接（非接触）共培養のいずれであってもよい。具体的には、例えば、消化管ホルモン分泌細胞と迷走神経様副交感神経細胞とを直接混合して共培養してもよいし、消化管ホルモン分泌細胞と迷走神経様副交感神経細胞とをフィルターなどにより分離して共培養してもよい。
　本実施形態の方法では、消化管ホルモン分泌細胞と迷走神経様副交感神経細胞とを直接共培養することが好ましい。具体的には、迷走神経様副交感神経細胞の培養の上に、消化管ホルモン分泌細胞を播種すればよい。消化管ホルモン分泌細胞と迷走神経様副交感神経細胞との比率は、例えば１：３～３：１であってよく、好ましくは１：１～２：１であってよい。消化管ホルモン分泌細胞および迷走神経様副交感神経細胞の播種濃度は、それぞれ１×１０５～１×１０６細胞／ｃｍ２、１×１０５～５×１０５細胞／ｃｍ２の範囲であってよい。
　ここで用いられる培地は、消化管ホルモン分泌細胞を培養するための培地と迷走神経様副交感神経細胞を培養するための培地とを混合したものであってよい。例えば、ＤＭＥＭ、ＨＡＭ’ｓ　Ｆ－１２培地およびＲＰＭＩ１６４０培地の混合培地に、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、非必須アミノ酸溶液、Ｎ２サプリメント、Ｂ－２７サプリメントなどを適宜添加したものであってよい。
　消化管ホルモン分泌細胞および迷走神経様副交感神経細胞は、候補物質を添加した培地中で一定期間培養される。添加される候補物質の濃度は、候補物質の種類により異なるが、例えば、低分子化合物であれば、０．００１ｎＭ～１０ｍＭの範囲で適宜選択することができる。培養期間は、例えば、０．０１秒～２時間であってよい。
　次いで、迷走神経様副交感神経細胞の神経活動を解析する。神経活動は、第五～第七の実施形態と同様に、例えばカルシウムイメージングや膜電位測定により解析することができる。本実施形態の方法では、候補物質を添加しない培地中での共培養および／または候補物質を添加した培地中での迷走神経様副交感神経細胞の単独培養を、対照として実施することができる。候補物質を添加した共培養における迷走神経様副交感神経細胞の神経活動が、対照における迷走神経様副交感神経細胞の神経活動と比較して有意に増強された場合には、当該候補物質は、消化管ホルモン分泌細胞からの消化管ホルモン分泌を促進し得る、すなわち、脳腸相関を制御する物質として、有望であると評価することができる。
　本発明は、第九の実施形態によれば、消化管ホルモン分泌細胞と上記迷走神経様副交感神経細胞との共培養を含んでなる、脳腸相関モデルである。本実施形態における「迷走神経様副交感神経細胞」は、第一および第二の実施形態で定義したものと同様であり、「消化管ホルモン分泌細胞」および「脳腸相関」は、第七の実施形態において定義したものと同様であり、「共培養」は、第八の実施形態において定義したものと同様である。
　本実施形態の脳腸相関モデルは、上で記載した培地や共培養のための容器などと組み合わせて、脳腸相関を制御する物質のスクリーニングのためのキットとして提供されてもよい。キットには、適宜追加の構成、例えば、緩衝液、カルシウム指示薬、化合物ライブラリー、スクリーニングのプロトコールを記載した説明書などがさらに含まれてよい。
　本実施形態の脳腸相関モデルは、第八の実施形態において記載した手順により、消化管ホルモン分泌細胞と迷走神経様副交感神経細胞とを共培養することにより作製することができ、消化管ホルモン分泌細胞からの消化管ホルモン分泌を促進し得る物質、すなわち、脳腸相関を制御する物質のスクリーニングのために使用することができる。
　また、本発明は、第十の実施形態によれば、脳腸相関を制御する物質のスクリーニングのための、上記迷走神経様副交感神経細胞または上記脳腸相関モデルの使用である。本実施形態における「迷走神経様副交感神経細胞」は、第一および第二の実施形態で定義したものと同様であり、「脳腸相関」は、第七の実施形態において定義したものと同様であり、「脳腸相関モデル」は、第九の実施形態において定義したものと同様である。第七、第八および第九の実施形態において記載された内容にしたがって、上記迷走神経様副交感神経細胞または上記脳腸相関モデルを、脳腸相関を制御する物質のスクリーニングのために使用することができる。
　以下に実施例を挙げ、本発明についてさらに説明する。なお、これらは本発明を何ら限定するものではない。
＜１．消化管ホルモン受容体を発現するレンチウイルスベクターの作製＞
　ＶｅｃｔｏｒＢｕｉｌｄｅｒ社に依頼して、消化管ホルモン受容体をコードする配列を含む以下のプラスミドを合成した：
　ｐＬＶ－ｈＧＬＰ１Ｒ（ヒトＧＬＰ１Ｒ遺伝子（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＭ＿００２０６２．５）を含むプラスミド、ベクターＩＤ：ＶＢ９００１２３－１３８８ｘｗｖ）；
　ｐＬＶ－ｈＮＰＹ２Ｒ（ヒトＮＰＹ２Ｒ遺伝子（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＭ＿０００９１０．４）を含むプラスミド、ベクターＩＤ：ＶＢ９００１２３－１３８７ｂａｈ）；
　ｐＬＶ－ｈＧＬＰ２Ｒ（ヒトＧＬＰ２Ｒ遺伝子（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＭ＿００４２４６．３）を含むプラスミド、ベクターＩＤ：ＶＢ２１０８３０－１１１５ｘｕｐ；
　ｐＬＶ－ｈＨＴＲ３Ａ（ヒトＨＴＲ３Ａ遺伝子（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＭ＿２１３６２１．４を含むプラスミド、ベクターＩＤ：ＶＢ２１０８２３－１２７７ｑｑｋ；および
　ｐＬＶ－ｈＣＣＫＡＲ（ヒトＣＣＫＡＲ遺伝子（ＮＣＢＩ　ＲｅｆＳｅｑ　ＩＤ：ＮＭ＿０００７３０．３を含むプラスミド、ベクターＩＤ：ＶＢ９００１２３－１３８５ｇｘｍ。
　また、モック感染用のレンチウイルスベクターを調製するために、消化管ホルモン受容体に代えてｍＣｈｅｒｒｙ蛍光タンパク質をコードする配列を含む以下のプラスミドを用意した：
　ｐＬＶ－ｍＣｈｅｒｒｙ（ベクターＩＤ：ＶＢ９０００８４－０１５８ｚｘｖ）。
　０．１ｗ／ｖ％ゼラチンでコートされた６ウェルプレートにＨＥＫ２９３Ｔ細胞（１．５×１０６／ウェル）を播種した。培地には、１０％ＦＢＳ、１％非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１％ペニシリン－ストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭを用いた。上記プラスミド（各４μｇ）、パッケージプラスミドｐｓＰＡＸ２（ａｄｄｇｅｎｅ、＃１２２６０）（２μｇ）およびエンベローププラスミド（ｐＭＤ２．Ｇ）（ａｄｄｇｅｎｅ、＃１２２５９）（２μｇ）を、５００μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびポリエチレンイミン（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｉｎｃ．）を用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞（２ウェル）にトランスフェクションした。２４時間後に培地を全量交換し、さらに２４時間後に培養上清を回収して４℃で保管した。細胞に新たな培地を加え、２４時間後に培養上清を回収した。前日に回収した培養上清と混合してＰＶＤＦシリンジフィルター（０．４５μｍ）で濾過した後、１／３量のＬｅｎｔｉ－Ｘ　Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（クロンテック）を混合し、４℃で１時間インキュベートした。その後、１５００×ｇ、４℃で４５分間遠心分離を行い、ペレットを回収した。ペレットをその後使用する培地（８００μＬ）に懸濁し、ウイルス懸濁液を得た。ウイルス懸濁液を２００μＬずつ分注し、－８０℃で保管した。
＜２．消化管ホルモン受容体を強制発現させた副交感神経細胞およびｉＰＳ細胞の作製＞
（２－１）試薬
　本実施例において使用した試薬の情報（試薬名、製品番号、製造元、略称など）は以下の通りである。
・ｍＴｅＳＲ１－ｃＧＭＰ　（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：　ＳＴ－８５８５０Ｇ）　（以下、「ｍＴｅＳＲ１」と表記）
・ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２　（富士フイルム和光純薬：　０４８－２９７８５）
・ＤＭＥＭ　（ｈｉｇｈ－ｇｌｕｃｏｓｅ）　（富士フイルム和光純薬：　０４３－３００８５）
・ＲＰＭＩ－１６４０（Ｌ－グルタミン、フェノールレッド含有）　（富士フイルム和光純薬：　１８９－０２０２５）　（以下、「ＲＰＭＩ－１６４０」と表記）
・Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：　３１９８５０６２）
・ステムセルバンカー　（ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（商標）ＧＭＰ　ｇｒａｄｅ）（ＺＮＱ：　ＣＢ０４５）
・Ｆｅｔａｌ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　（Ｂｉｏｗｅｓｔ，　Ｎｕａｉｌｌｅ，　Ｆｒａｎｃｅ）　（以下、「ＦＢＳ」と表記）
・Ｋｎｏｃｋｏｕｔ　Ｓｅｒｕｍ　Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：　１０８２８－０２８）　（以下、「ＫＳＲ」と表記）
・Ｎ２　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　ｗｉｔｈ　ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ（Ａｐｏ）　（富士フイルム和光純薬：　１４１－０９０４１）　ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　（以下、「Ｎ２」と表記）
・ＭＥＭ　ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　（富士フイルム和光純薬：　１３９－１５６５１）　（以下、「ＮＥＡＡ」と表記）
・Ｍｏｎｏｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　（富士フイルム和光純薬：　１９５－１５７９１）
・Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ　（富士フイルム和光純薬：　１６８－２３１９１）　（以下、「Ｐ／Ｓ」と表記）
・エタノール（９９．５）　（富士フイルム和光純薬：　０５７－００４５６）
・Ｂｒａｉｎ　Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ，　Ｈｕｍａｎ，　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　（富士フイルム和光純薬：　０２０－１２９１３）　（以下、「ＢＤＮＦ」と表記）
・Ｇｌｉａｌ－ｃｅｌｌ　Ｄｅｒｉｖｅｄ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｌ　Ｆａｃｔｏｒ，　Ｈｕｍａｎ，　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　（富士フイルム和光純薬：　０７５－０４１５３）　（以下、「ＧＤＮＦ」と表記）
・Ｎｅｒｖｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　Ｆａｃｔｏｒ－β，　Ｈｕｍａｎ，　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　（富士フイルム和光純薬：　１４１－０７６０１）　（以下、「ＮＧＦ」と表記）
・Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ－３，　Ｈｕｍａｎ，　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　（富士フイルム和光純薬：　１４１－０６６４３）　（以下、「ＮＴ－３」と表記）
・Ｃｉｌｉａｒｙ　Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ　Ｆａｃｔｏｒ，　Ｈｕｍａｎ，　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　（富士フイルム和光純薬：　０３２－１８８５１）　（以下、「ＣＮＴＦ」と表記）
・Ｌ－アスコルビン酸エステルマグネシウム塩ｎ水和物　（富士フイルム和光純薬：　０１３－１２０６１）　（以下、「アスコルビン酸」と表記）　
・Ｙ－２７６３２　（富士フイルム和光純薬：　０３６－２４０２３）
・Ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ（富士フイルム和光純薬：　０６７－０２１９１）　（以下、「ＦＳＫ」と表記）
・Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ　（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ：　Ｐ５４９９－５ＭＧ）　（以下、「ＤＭ」と表記）
・ＳＢ４３１５４２　ｈｙｄｒａｔｅ　（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ：　Ｓ４３１７－５ＭＧ）　（以下、「ＳＢ」と表記）
・ＣＨＩＲ９９０２１　（Ｃａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｍｐａｎｙ：　１３１２２）　（以下、「ＣＨＩＲ」と表記）
・ＩＷＲ－１　（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ：　Ｉ０１６１－５ＭＧ）
・ＳＡＮＴ１　（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ：　Ｓ４５７２－５ＭＧ）
・骨形成因子４（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）、ヒト、組換え体　（富士フイルム和光純薬：　０２２－１７０７１）　（以下、「ＢＭＰ４」と表記）
・線維芽細胞成長因子（塩基性）（ｂａｓｉｃ　ＦＧＦ）、ヒト、組換え体　（富士フイルム和光純薬：　０６４－０４５４１）　（以下、「ｂＦＧＦ」と表記）
・ホルボール１２－ミリスタート１３－アセタート　（富士フイルム和光純薬：　１６２－２３５９１）　（以下、「ＰＭＡ」と表記）
・レチノイン酸　（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ：　Ｒ２６２５－５０ＭＧ）　（以下、「ＲＡ」と表記）
・ｉＭａｔｒｉｘ－５１１　（ニッピ：　８９２０１２）
・Ｐｏｌｙ－Ｌ－ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ　ｈｙｄｒｏｂｒｏｍｉｄｅ　（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ：　Ｐ３６５５－１０ＭＧ）　（以下、「ＰＬＯ」と表記）
・Ｌａｍｉｎｉｎ　ｆｒｏｍ　Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ－Ｈｏｌｍ－Ｓｗａｒｍ　ｍｕｒｉｎｅ　ｓａｒｃｏｍａ　ｂａｓｅｍｅｎｔ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ：　Ｌ２０２０－１ＭＧ）　（以下、「ラミニン」と表記）
・Ｌｉｐｉｄｕｒｅ　（日油株式会社：　ＣＭ５２０６）
・マトリゲル（Ｓｔａｎｄａｒｄ　Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）　（コーニング：　２５６２３４）
・Ａｃｃｕｔａｓｅ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：　Ａ１１１０５－０１）
・ＴｒｙｐＬＥ　ｅｘｐｒｅｓｓ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：　１２６０４－０１３）
・Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ　ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ　ｗａｔｅｒ　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：　１０９７７－０１５）　（以下、「ＤＷ」と表記）
・Ｄ－ＰＢＳ（－）　（富士フイルム和光純薬：　０４５－２９７９５）　
・Ｔｒｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒ　Ｐｏｗｄｅｒ，　ｐＨ７．４　（タカラバイオ：　Ｔ９１５３）
・ＨＢＳＳ（＋）（フェノールレッド不含）　（富士フイルム和光純薬：　０８４－０８９６５）　（以下、「ＨＢＳＳ」と表記）
・塩酸　（富士フイルム和光純薬：　０８０－０１０６６）
・Ａｌｂｕｍｉｎ，　ｆｒｏｍ　Ｂｏｖｉｎｅ　Ｓｅｒｕｍ　（富士フイルム和光純薬：　０１７－２３２９４）　（以下、「ＢＳＡ」と表記）
・ジメチルスルホキシド　（富士フイルム和光純薬：　０４６－２１９８１）　（以下、「ＤＭＳＯ」と表記）
・フェニルメチルスルホニルフルオリド　（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ：　Ｐ７６２６－２５０ＭＧ）　（以下、「ＰＭＳＦ」と表記）
・ＭｅｍＧｌｏｗＴＭ　Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ　Ｐｌａｓｍａ　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　Ｐｒｏｂｅｓ　５９０　（Ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．：　ＭＧ０３－０２）　（以下、「ＭｅｍＧｌｏｗ」と表記）
（２－２）ストック溶液
・ＦＳＫ：　ＤＭＳＯを用いて１０ｍＭに調製
・ＤＭ：　ＤＭＳＯを用いて１ｍＭに調製
・ＳＢ：　ＤＭＳＯを用いて１０ｍＭに調製
・ＣＨＩＲ：　ＤＭＳＯを用いて３ｍＭに調製
・ＩＷＲ－１：　ＤＭＳＯを用いて１０ｍＭに調製
・ＳＡＮＴ１：　ＤＭＳＯを用いて２５０μＭに調製
・ＰＭＡ：　ＤＭＳＯを用いて１０μｇ／ｍＬに調製
・ＲＡ：　ＤＭＳＯを用いて１ｍＭに調製
・ＢＭＰ４：　０．１％ＢＳＡを添加した４ｍＭ塩酸溶液を用いて１００μｇ／ｍＬに調製
・ｂＦＧＦ：　１ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．４）で５００μｇ／ｍＬに調製後、ＤＭＥＭを用いて１０μｇ／ｍＬに調製
・ＢＤＮＦ、ＧＤＮＦ、ＮＧＦ、およびＮＴ－３：　ＰＢＳを用いて１０μｇ／ｍＬに調製
・アスコルビン酸：　ＰＢＳを用いて５０ｍｇ／ｍＬに調製
・Ｙ－２７６３２：　Ｏｐｔｉ－ＭＥＭを用いて１０ｍＭに調製
・ＰＬＯ：　ＤＷを用いて１ｍｇ／ｍＬに調製
・Ｌｉｐｉｄｕｒｅ：　エタノール（９９．５）を用いて０．５％に調製
（２－３）培地
・ヒト幹細胞培地（ｈＥＳＭ）：　２０％のＫＳＲ、１％のＮＥＡＡ、１％のＭｏｎｏｔｈｉｏｇｌｙｃｅｒｏｌ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ、および１％Ｐ／Ｓが添加されたＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２
・Ｎ２培地：　１％のＮ２、１％のＮＥＡＡ、および１％のＰ／Ｓが添加されたＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２
・ＮＤＭ１：　１０μＭのＦＳＫ、１０ｎｇ／ｍＬのＧＤＮＦ、１０ｎｇ／ｍＬのＮＴ－３、１０ｎｇ／ｍＬのＮＧＦ、および５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸が添加されたＮ２培地
・ＮＤＭ２：　１００ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、および１００ｎｇ／ｍＬのＣＮＴＦが添加されたＮＤＭ１
・ＮＤＭ３：　１０ｎｇ／ｍＬのＢＤＮＦ、１μＭのＲＡ、および１０ｎｇ／ｍＬのＰＭＡが添加されたＮＤＭ１
（２－４）ｉＰＳ細胞から副交感神経細胞への分化誘導
・胚様体の形成（－３日目）：
　ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株）は、ＲＩＫＥＮ　ＢＲＣより入手した。６ウェルプレートをＬｉｐｉｄｕｒｅによりコートし、ＰＢＳで洗浄した。ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株）を、１０μＭのＹ－２７６３２が添加されたｍＴｅＳＲ１を用いて１×１０６細胞／ウェルの濃度で播種し、オービタルシェイカー（ワケンビーテック：ＷＢ－１０１ＳＲＣ）上で培養した（９５ｒｐｍ）。播種後２４時間および４８時間に、１０μＭのＹ－２７６３２が添加されたｍＴｅＳＲ１を２ｍＬ／ウェルにて添加した。胚様体（ＥＢ）を形成されるまで３日間培養した。
・分化ステップ１（０日目）：
　培地を、２μＭのＤＭ、１０μＭのＳＢ、および１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦが添加されたｈＥＳＭに交換し（４ｍＬ／ウェル）、オービタルシェイカー上で２日間培養した。
・分化ステップ２（２日目）：
　培地を、３μＭのＣＨＩＲ、２０μＭのＳＢ、および１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦが添加されたｈＥＳＭに交換し（６ｍＬ／ウェル）、オービタルシェイカー上で３日間培養した。
・分化ステップ３（５日目）：
　培地を、３μＭのＣＨＩＲ、および１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦが添加されたｈＥＳＭ：Ｎ２（３：１）混合培地に交換し（４ｍＬ／ウェル）、オービタルシェイカー上で２日間培養した。
・分化ステップ４（７日目）：
　培地を、１０μＭのＩＷＲ－１、２５０ｎＭのＳＡＮＴ－１、２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、および１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦが添加されたｈＥＳＭ：Ｎ２（１：１）混合培地に交換し（３ｍＬ／ウェル）、オービタルシェイカー上で２日間培養した。
・分化ステップ５（９日目）：
　培地を、１０μＭのＩＷＲ－１、２５０ｎＭのＳＡＮＴ－１、２５ｎｇ／ｍｌのＢＭＰ４、および１０ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦが添加されたｈＥＳＭ：Ｎ２（１：３）混合培地に交換し（３ｍＬ／ウェル）、オービタルシェイカー上で３日間培養し、フレッシュな同培地に交換し、さらに２４時間培養した。
・分化ステップ６（１３日目）：
　ＤＷで調製したＰＬＯ溶液（２０μｇ／ｍｌ）により１時間コートした後、ＤＷで１回洗浄し、ＰＢＳで調製したラミニン溶液（５μｇ／ｍｌ）により２時間コートすることにより、ＰＬＯおよびラミニンによりコートされた２４ウェルプレートを準備した。分化ステップ５により得られたＥＢを回収し、２ｍＬのＴｒｙｐＬＥ　ｅｘｐｒｅｓｓを加え、３７℃で１０分間インキュベートした。１０％ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ（４ｍＬ）を加えて酵素反応を停止させ、ピペッティングにより細胞を懸濁した。２００×ｇ、４分間遠心分離して細胞を回収し、ＮＤＭ１により細胞を懸濁させ、細胞数をカウントした。ＮＤＭ２を用いて細胞懸濁液を調整し（１×１０５細胞／ｍＬ）、ＰＬＯおよびラミニンによりコートされた２４ウェルプレートに１ｍＬ／ウェルずつ添加した。以降、１週間に２度、フレッシュなＮＤＭ２により培地を半量交換しながら培養を継続した。
（２－５）消化管ホルモン受容体を分化後に強制発現させた副交感神経細胞の作製
　上記（２－４）の手順により、ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株）を副交感神経細胞へと誘導した。誘導２０日目の培養に、上記１で調製したウイルス懸濁液を１／１０希釈になるように添加した。２４時間後にＮＤＭ２により培地を全量交換した。以降、１週間に２度、フレッシュなＮＤＭ２により培地を半量交換しながら培養を継続し、誘導３０日目以降の細胞を解析した。
（２－６）消化管ホルモン受容体を強制発現させたｉＰＳ細胞の作製
　ｉＭａｔｒｉｘによりコートされた６ウェルプレートに、ヒトｉＰＳ細胞（２０１Ｂ７株）を、１０μＭのＹ－２７６３２が添加されたｍＴｅＳＲ１を用いて６×１０４細胞／ウェルの濃度で播種した（０日目）。翌日、培地をフレッシュなｍＴｅＳＲ１に交換し（２ｍＬ／ウェル）、上記１で調製した２００μＬ／ウェルのウイルス懸濁液を添加した（１日目）。その後、毎日培地をフレッシュなｍＴｅＳＲ１に交換し、ウイルスの添加から４日後に０．３μｇ／ｍＬのピューロマイシンを添加したｍＴｅＳＲ１に交換した（５日目）。ウイルスの添加から１０日以上、０．３μｇ／ｍＬのピューロマイシンを添加したｍＴｅＳＲ１中で細胞を培養することにより、ピューロマイシン選択を行った。得られた細胞（以下、「消化管ホルモン受容体発現ｉＰＳ細胞」と記載する）を凍結保存した。
（２－７）消化管ホルモン受容体を強制発現させたｉＰＳ細胞からの副交感神経細胞の作製
　上記（２－６）で作製した消化管ホルモン受容体発現ｉＰＳ細胞を、上記（２－４）の手順により副交感神経細胞へと誘導した。
＜３．消化管ホルモン受容体を強制発現させたｉＰＳ細胞の品質評価＞
（３－１）消化管ホルモン受容体遺伝子の発現
（ｉ）ｑＰＣＲ解析
　消化管ホルモン受容体遺伝子および幹細胞マーカーＮＡＮＯＧ遺伝子の発現をｑＰＣＲにより確認した。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ　ＲＮＡ（タカラバイオ、Ｕ０９５５Ｂ）を用いて、上記（２－６）で作製した消化管ホルモン受容体発現ｉＰＳ細胞から全ＲＮＡを抽出した。ＲｅｖｅｒＴｒａ　Ａｃｅ（商標）ｑＰＣＲ　ＲＴ　Ｍａｓｔｅｒ　Ｍｉｘ　ｗｉｔｈ　ｇＤＮＡ　Ｒｅｍｏｖｅｒ（東洋紡、ＦＳＱ－３０１）を用いてｃＤＮＡを調製した。ＴＨＵＮＤＥＲＢＩＲＤ（商標）ＳＹＢＲ（商標）ｑＰＣＲ　Ｍｉｘ（東洋紡、ＱＰＳ－２０１）を用いてｑＰＣＲを行った。内部コントロールとしてハウスキーピング遺伝子３６Ｂ４を用いた。反応および解析は３重に行った。
　表１．ｑＰＣＲに使用したプライマーセット（１）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（ｉｉ）免疫細胞染色
　細胞を４％パラホルムアルデヒドで固定後、ＰＢＳ（－）により２回洗浄した。０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ（－）溶液を加えて５分間室温でインキュベート後、上清を除去した。ブロッキング液（４％ブロックエース（ＤＳファーマバイオメディカル）／０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ（－））を加え、３０分間室温でインキュベートした。ブロッキング液を除去し、一次抗体を添加して１６～２４時間４℃でインキュベートした。０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００／ＰＢＳ（－）により２回洗浄した後、二次抗体およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２溶液（同仁化学、１／３０００希釈）を添加して１時間室温でインキュベートした。一次抗体および二次抗体の希釈には、Ｃａｎ　Ｇｅｔ　Ｓｉｇｎａｌ　ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｏｎ　Ｅｎｈａｎｃｅｒ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ　Ａ（東洋紡）を用いた。
（一次抗体）
・抗ＧＬＰ１Ｒ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＰＡ５－９７７８９）（１：５０希釈）
・抗ＮＰＹ２Ｒ抗体（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、ＳＡＢ４５０２０２９－１００ＵＧ）（１：１００希釈）
・抗ＧＬＰ２Ｒ抗体（Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ４２８５）（１：５０希釈）
・抗ＨＴＲ３Ａ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＭＡ５－３１７７１）（１：２５０希釈）
・抗ＣＣＫＡＲ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１５２８７）（１：１００希釈）
（二次抗体）
・Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ－５５５　（Ｆ（ａｂ’）２－Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）　Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ）　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ２１４３０）
・Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ－４８８　（Ｆ（ａｂ’）２－Ｇｏａｔ　ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　（Ｈ＋Ｌ）　Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ）　（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ１１０１７）
（３－２）三胚様への分化能
　ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）Ｔｒｉｌｉｎｅａｇｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ　ｋｉｔ（ＳＴＥＭＣＥＬＬ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、＃ＳＴ－０５２３０）を用いて、キットに付属のプロトコールにしたがって、消化管ホルモン受容体発現ｉＰＳ細胞を内胚葉または中胚葉へと分化させた。５日間の培養後の細胞をｑＰＣＲ解析に用いた。外胚葉への分化能の解析には、上記（２－７）における分化誘導１３日目の細胞を用いた。外胚葉マーカー遺伝子（ｈＰＡＸ６またはｈＮＥＳ）、中胚葉マーカー遺伝子（ｈＮＣＡＭ１）または内胚葉マーカー遺伝子（ｈＳＯＸ１７）の発現をｑＰＣＲにより解析した。ｑＰＣＲは、以下のプライマーを用いた以外は上記（３－１）と同様の手順により行った。
　表２．ｑＰＣＲに使用したプライマーセット（２）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（３－３）染色体検査
　消化管ホルモン受容体発現ｉＰＳ細胞の安全性を評価するために、Ｇ分染法による染色体検査を株式会社日本遺伝子研究所に委託した。
＜４．消化管ホルモン受容体を強制発現させた副交感神経細胞またはその自律神経系前駆細胞の解析＞
（４－１）マーカー発現
（ｉ）ｑＰＣＲ解析
　神経堤細胞マーカー遺伝子（ｈＳＯＸ１０）、自律神経細胞マーカー遺伝子（ｈＰＨＯＸ２Ｂ）、末梢神経細胞マーカー遺伝子（ｈＰＲＰＨ）および副交感神経細胞マーカー遺伝子（ｈＣＨＡＴ）の発現をｑＰＣＲにより解析した。ｑＰＣＲは、以下のプライマーセットを用いた以外は上記（３－１）と同様の手順により行った。
　表３．ｑＰＣＲに使用したプライマーセット（３）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（ｉｉ）免疫細胞染色
　消化管ホルモン受容体およびＭＡＰ２またはＣｈＡＴの発現を免疫細胞染色により解析した。免疫細胞染色は、上記（３－１）と同様の手順により行った。ＭＡＰ２およびＣｈＡＴの染色には、以下の抗体を用いた。
・抗ＭＡＰ２抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１２６７）（１：５００希釈）
・抗ＣｈＡＴ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１８１０２３）（１：１００希釈）
（４－２）細胞内カルシウムイメージング
　上記（２－５）および（２－７）で作製した細胞（誘導３０日目以降）に、終濃度１０μＭのＦｌｕｏ－８　ＡＭ（ＡＡＴ　Ｂｉｏｑｕｅｓｔ、２１０８３）を添加し、３７℃で２０～３０分間インキュベートした。培地を除去し、リンガー液（１４９ｍＭ　ＮａＣｌ、２．８ｍＭ　ＫＣｌ、２ｍＭ　ＣａＣｌ２、１ｍＭ　ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭ　Ｄ－（＋）－ｇｌｕｃｏｓｅ（ｐＨ７．２））に置換した後、細胞内カルシウム濃度変化を測定した。顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ、ＩＸ７１）、Ｃｏｎｆｏｃａｌ　ｓｃａｎｎｅｒ　ｕｎｉｔ（Ｙｏｋｏｇａｗａ、ＣＳＵ－Ｗ１）、ＬＥＤ光源（ＯＰＴＯ　ＳＣＩＥＮＣＥ、Ｘ－Ｃｉｔｅ　１２０ＬＥＤ）、および解析ソフト（ＭｅｔａＭｏｒｐｈ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用い、５００ｍｓ／フレームで５００～８００フレーム撮影した。途中（例えば２５０フレーム目）で消化管ホルモン受容体アゴニスト刺激を添加した。消化管ホルモン受容体アゴニストおよびその添加量（終濃度）は以下の通りである：ＧＬＰ１（ヒト、７－３７）（ペプチド研究所、＃４２８０－ｖ）（以下、「ＧＬＰ１」と記載する）（１０ｎＭ）；ＰＹＹ（ヒト、３－３６）（ペプチド研究所、＃４４００－ｖ）（以下、「ＰＹＹ」と記載する）（１００ｎＭ）；ＧＬＰ２（ヒト）（ペプチド研究所、＃４３７６－ｖ）（以下、「ＧＬＰ２」と記載する）（１００ｎＭ）；セロトニン（Ｓｅｒｏｔｏｎｉｎ　ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｈ９５２３）（以下、「５－ＨＴ」と記載する）（１００μＭ）；ＣＣＫ－３３（ヒト）（ペプチド研究所、＃４２０１－ｓ）（以下、「ＣＣＫ－３３」と記載する）（１０、１００、１０００ｎＭ）。
（４－３）細胞外電位測定
　上記（２－４）の分化ステップ６に記載の手順により、ＰＬＯおよびラミニンによりコートされたＭＥＡ測定用培養プレート（ＣｙｔｏＶｉｅｗ　ＭＥＡ　６（Ｍ３８４－ｔＭＥＡ－６Ｗ），　ＣｙｔｏＶｉｅｗ　ＭＥＡ　２４（Ｍ３８４－ｔＭＥＡ－２４Ｗ））（ＡＸＩＯＮ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用意した。培地にＮＤＭ３を用いて、上記（２－４）または（２－７）における誘導１３日目の細胞を播種した（１×１０５細胞／８μＬ）。以降、１週間に２度、フレッシュなＮＤＭ３により培地を半量交換しながら培養を継続した。
　ＮＤＭ３またはリンガー液中にて、膜電位変化を測定した。１０００×ゲイン、２００Ｈｚ－３ｋＨｚフィルターを用い、測定ノイズ標準偏差に対し６倍以上に変化した電位値を神経発火（スパイク）として検出した。電位を５分間測定した後、消化管ホルモン受容体アゴニストを上記（４－２）と同様の終濃度で添加し、さらに５分間測定した。
＜５．ｈＧＬＰ１Ｒを強制発現させたｉＰＳ細胞の品質評価＞
　上記１の手順においてレンチウイルスベクターとしてｐＬＶ－ｈＧＬＰ１Ｒを用い、上記（２－６）の手順により調製したｉＰＳ細胞におけるｈＧＬＰ１Ｒ遺伝子およびタンパク質の発現を、上記（３－１）の手順により解析した。ｑＰＣＲの結果を図１に示す。野生型ｉＰＳ細胞（対照）と比較して、外因性ｈＧＬＰ１Ｒ遺伝子を導入されたｉＰＳ細胞は、ｈＧＬＰ１Ｒ遺伝子を強く発現した（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。免疫細胞染色の結果を図２に示す。図中、スケールバーは１００μｍを示す。外因性ｈＧＬＰ１Ｒ遺伝子を導入されたｉＰＳ細胞は、ｈＧＬＰ１Ｒタンパク質を強く発現していることが確認された。これらの結果に基づき、この細胞を「ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞」とした。ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞の明視野像を図３に示す。図中、スケールバーは１００μｍを示す。
　上記（３－１）の手順により、ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞における幹細胞マーカーｈＮＡＮＯＧ遺伝子の発現をｑＰＣＲにより確認した結果を図４に示す。図中、「ＧＬＰ１Ｒ」はｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞を、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は野生型ｉＰＳ細胞を示す。ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞は、野生型ｉＰＳ細胞よりもｈＮＡＮＯＧ遺伝子を強く発現し（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）、未分化状態であることが確認された。
　上記（３－２）の手順により、ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞の三胚様への分化能を評価した。結果を図５に示す。外胚葉、中胚葉または内胚葉への分化を誘導されたｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞は、外胚葉マーカーｈＰＡＸ６遺伝子、中胚葉マーカーｈＮＣＡＭ１遺伝子または内胚葉マーカーｈＳＯＸ１７遺伝子をそれぞれ強く発現した。これらの結果から、ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞の三胚様への分化能を有していることが確認された。
　Ｇ分染法による染色体検査の結果を図６に示す。ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞の染色体には異常がないことが確認された。
＜６．ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された副交感神経細胞またはその自律神経系前駆細胞の解析＞
　上記（２－７）の手順により、ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞の副交感神経細胞への分化を誘導した。誘導０日目のＥＢおよび誘導１３日目の細胞の顕微鏡像（明視野）を図７に示す。スケールバーは１００μｍを示す。誘導１３日目の細胞についてのｑＰＣＲの結果を図８に示す。幹細胞マーカーｈＮＡＮＯＧ遺伝子の発現が顕著に減少し、神経堤細胞マーカーｈＳＯＸ１０遺伝子および自律神経細胞マーカーｈＰＨＯＸ２Ｂ遺伝子の発現が顕著に増加した（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。これらの結果から、誘導１３日目の細胞が自律神経系前駆細胞であることが確認された。
　誘導４０日目の細胞についてのｑＰＣＲの結果を図９に示す。末梢神経細胞マーカーｈＰＲＰＨ遺伝子、副交感神経細胞マーカーｈＣＨＡＴ遺伝子およびｈＧＬＰ１Ｒ遺伝子の強い発現が確認された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。免疫細胞染色の結果を図１０に示す。図中、スケールバーは１００μｍを示す。ｈＧＬＰ１Ｒタンパク質の発現に加え、成熟神経細胞マーカーＭＡＰ２タンパク質の発現が確認された。
　上記（２－７）の手順によりｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された細胞のリガンド応答性を、上記（４－３）の手順による細胞外電位測定により解析した。細胞外電位ヒートマップを図１１に示す。ＧＬＰ１を添加することにより、高い神経発火頻度を示す領域が見られた。神経発火頻度の変化率を図１２に示す。ＧＬＰ１を添加することにより、神経発火頻度が上昇した（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝７４電極／４ウェル、ｓｔｕｄｅｎｔ－ｔ）。
　上記（２－７）の手順によりｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された細胞のリガンド応答性を、上記（４－２）の手順による細胞内カルシウムイメージングにより解析した。測定結果を図１３に示す。横軸は時間（秒）を示し、縦軸はＧＬＰ１添加前の蛍光強度の平均値（Ｆ０）を１とした際の蛍光強度の変化率（ΔＦ／Ｆ０）を示す。ＧＬＰ１を添加することにより、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇した。１分間あたりの神経発火（スパイク）の数を図１４に示す。ＧＬＰ１を添加することにより、スパイク数が増加した（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝１５細胞／３サンプル、ｓｔｕｄｅｎｔ－ｔ）。神経発火のピークの振幅（ＧＬＰ１添加前の蛍光強度の平均値（Ｆ０）に対する蛍光強度の変化率（ΔＦ／Ｆ０－１）×１００）を図１５に示す。ＧＬＰ１を添加することにより、神経発火の強度が増強された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝１５細胞／３サンプル、ｓｔｕｄｅｎｔ－ｔ）。
　以上の結果から、ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された副交感神経細胞が、ＧＬＰ１応答性を有する迷走神経様副交感神経細胞であることが示された。
＜７．ｈＮＰＹ２Ｒを強制発現させたｉＰＳ細胞の品質評価＞
　上記１の手順においてレンチウイルスベクターとしてｐＬＶ－ｈＮＰＹ２Ｒを用い、上記（２－６）の手順により調製したｉＰＳ細胞におけるｈＮＰＹ２Ｒ遺伝子およびタンパク質の発現を、上記（３－１）の手順により解析した。ｑＰＣＲの結果を図１６に示す。野生型ｉＰＳ細胞（対照）と比較して、外因性ｈＮＰＹ２Ｒ遺伝子を導入されたｉＰＳ細胞は、ｈＮＰＹ２Ｒ遺伝子を強く発現した（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。免疫細胞染色の結果を図１７に示す。図中、スケールバーは１００μｍを示す。外因性ｈＮＰＹ２Ｒ遺伝子を導入されたｉＰＳ細胞は、ｈＮＰＹ２Ｒタンパク質を強く発現していることが確認された。これらの結果に基づき、この細胞を「ｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞」とした。ｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞の明視野像を図１８に示す。図中、スケールバーは１００μｍを示す。
　上記（３－１）の手順により、ｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞における幹細胞マーカーＮＡＮＯＧの発現をｑＰＣＲにより確認した結果を図１９に示す。図中、「ＮＰＹ２Ｒ」はｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞を、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は野生型ｉＰＳ細胞を示す。ｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞は、野生型ｉＰＳ細胞よりもＮＡＮＯＧ遺伝子を強く発現し（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）、未分化状態であることが確認された。
　上記（３－２）の手順により、ｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞の三胚様への分化能を評価した。結果を図２０に示す。外胚葉、中胚葉または内胚葉への分化を誘導されたｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞は、外胚葉マーカーｈＰＡＸ６遺伝子、中胚葉マーカーｈＮＣＡＭ１遺伝子または内胚葉マーカーｈＳＯＸ１７遺伝子をそれぞれ強く発現した。これらの結果から、ｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞の三胚様への分化能を有していることが確認された。
　Ｇ分染法による染色体検査の結果を図２１に示す。ｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞の染色体には異常がないことが確認された。
＜８．ｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された副交感神経細胞またはその自律神経系前駆細胞の解析＞
　上記（２－７）の手順により、ｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞の副交感神経細胞への分化を誘導した。誘導０日目のＥＢおよび誘導１３日目の細胞の顕微鏡像（明視野）を図２２に示す。スケールバーは１００μｍを示す。誘導１３日目の細胞についてのｑＰＣＲの結果を図２３に示す。幹細胞マーカーｈＮＡＮＯＧ遺伝子の発現が顕著に減少し、神経堤細胞マーカーｈＳＯＸ１０遺伝子および自律神経細胞マーカーｈＰＨＯＸ２Ｂ遺伝子の発現が顕著に増加した（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。これらの結果から、誘導１３日目の細胞が自律神経系前駆細胞であることが確認された。
　誘導４０日目の細胞についてのｑＰＣＲの結果を図２４に示す。末梢神経細胞マーカーｈＰＲＰＨ遺伝子、副交感神経細胞マーカーｈＣＨＡＴ遺伝子およびｈＮＰＹ２Ｒ遺伝子の強い発現が確認された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。免疫細胞染色の結果を図２５に示す。図中、スケールバーは１００μｍを示す。ｈＮＰＹ２Ｒタンパク質の発現に加え、成熟神経細胞マーカーＭＡＰ２タンパク質の発現が確認された。
　上記（２－７）の手順によりｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された細胞のリガンド応答性を、上記（４－３）の手順による細胞外電位測定により解析した。細胞外電位ヒートマップを図２６に示す。ＰＹＹを添加することにより、高い神経発火頻度を示す領域が見られた。神経発火頻度の変化率を図２７に示す。ＰＹＹを添加することにより、神経発火頻度が上昇した（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝７４電極／４ウェル、ｓｔｕｄｅｎｔ－ｔ）。
　上記（２－７）の手順によりｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された細胞のリガンド応答性を、上記（４－２）の手順による細胞内カルシウムイメージングにより解析した。測定結果を図２８に示す。横軸は時間（秒）を示し、縦軸はＰＹＹ添加前（０～１２５秒）の蛍光強度の平均値（Ｆ０）を１とした際の蛍光強度の変化率（ΔＦ／Ｆ０）を示す。ＰＹＹを添加することにより、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇した。１分間あたりの神経発火（スパイク）の数を図２９に示す。ＰＹＹを添加することにより、スパイク数が増加した（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝１５細胞／３サンプル、ｓｔｕｄｅｎｔ－ｔ）。神経発火のピークの振幅（ＰＹＹ添加前の蛍光強度の平均値（Ｆ０）に対する蛍光強度の変化率（ΔＦ／Ｆ０－１）×１００）を図３０に示す。ＰＹＹを添加することにより、神経発火の強度が増強された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝１５細胞／３サンプル、ｓｔｕｄｅｎｔ－ｔ）。
　以上の結果から、ｈＮＰＹ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された副交感神経細胞が、ＰＹＹ応答性を有する迷走神経様副交感神経細胞であることが示された。
＜９．ｈＧＬＰ２Ｒを強制発現させたｉＰＳ細胞の品質評価＞
　上記１の手順においてレンチウイルスベクターとしてｐＬＶ－ｈＧＬＰ２Ｒを用い、上記（２－６）の手順により調製したｉＰＳ細胞におけるｈＧＬＰ２Ｒ遺伝子およびタンパク質の発現を、上記（３－１）の手順により解析した。ｑＰＣＲの結果を図３１に示す。野生型ｉＰＳ細胞（対照）と比較して、外因性ｈＧＬＰ２Ｒ遺伝子を導入されたｉＰＳ細胞は、ｈＧＬＰ２Ｒ遺伝子を強く発現した（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。免疫細胞染色の結果を図３２に示す。図中、スケールバーは１００μｍを示す。外因性ｈＧＬＰ２Ｒ遺伝子を導入されたｉＰＳ細胞は、ｈＧＬＰ２Ｒタンパク質を発現していることが確認された。これらの結果に基づき、この細胞を「ｈＧＬＰ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞」とした。ｈＧＬＰ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞の明視野像を図３３に示す。図中、スケールバーは１ｍｍを示す。
　上記（３－１）の手順により、ｈＧＬＰ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞における幹細胞マーカーｈＮＡＮＯＧ遺伝子の発現をｑＰＣＲにより確認した結果を図３４に示す。図中、「ｈＧＬＰ２Ｒ」はｈＧＬＰ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞を、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は野生型ｉＰＳ細胞を示す。ｈＧＬＰ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞は、野生型ｉＰＳ細胞と同程度にｈＮＡＮＯＧ遺伝子を発現し、未分化状態であることが確認された。
　上記（３－２）の手順により、ｈＧＬＰ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞の三胚様への分化能を評価した。結果を図３５に示す。外胚葉、中胚葉または内胚葉への分化を誘導されたｈＧＬＰ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞は、外胚葉マーカーｈＮＥＳ遺伝子、中胚葉マーカーｈＮＣＡＭ１遺伝子または内胚葉マーカーｈＳＯＸ１７遺伝子をそれぞれ強く発現した。これらの結果から、ｈＧＬＰ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞の三胚様への分化能を有していることが確認された。
　Ｇ分染法による染色体検査の結果を図３６に示す。ｈＧＬＰ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞の染色体には異常がないことが確認された。
＜１０．ｈＧＬＰ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された副交感神経細胞またはその自律神経系前駆細胞の解析＞
　上記（２－７）の手順により、ｈＧＬＰ２Ｒ発現ｉＰＳ細胞の副交感神経細胞への分化を誘導した。誘導０日目のＥＢおよび誘導１３日目の細胞の顕微鏡像（明視野）を図３７に示す。スケールバーは１００μｍを示す。誘導１３日目の細胞についてのｑＰＣＲの結果を図３８に示す。幹細胞マーカーｈＮＡＮＯＧ遺伝子の発現が顕著に減少し、神経堤細胞マーカーｈＳＯＸ１０遺伝子および自律神経細胞マーカーｈＰＨＯＸ２Ｂ遺伝子の発現が顕著に増加した（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。これらの結果から、誘導１３日目の細胞が自律神経系前駆細胞であることが確認された。
　誘導４０日目の細胞についてのｑＰＣＲの結果を図３９に示す。末梢神経細胞マーカーｈＰＲＰＨ遺伝子および副交感神経細胞マーカーｈＣＨＡＴ遺伝子の強い発現が確認された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。また、誘導４０日目のモック感染副交感神経細胞（対照）と比較して、ｈＧＬＰ２Ｒ遺伝子の強い発現が確認された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
　免疫細胞染色の結果を図４０に示す。図中、スケールバーは１００μｍを示す。ｈＧＬＰ２Ｒタンパク質の弱い発現および成熟神経細胞マーカーＭＡＰ２タンパク質の発現が確認された。
＜１１．ｈＨＴＲ３Ａを強制発現させたｉＰＳ細胞の品質評価＞
　上記１の手順においてレンチウイルスベクターとしてｐＬＶ－ｈＨＴＲ３Ａを用い、上記（２－６）の手順により調製したｉＰＳ細胞におけるｈＨＴＲ３Ａ遺伝子およびタンパク質の発現を、上記（３－１）の手順により解析した。ｑＰＣＲの結果を図４１に示す。野生型ｉＰＳ細胞（対照）と比較して、外因性ｈＨＴＲ３Ａ遺伝子を導入されたｉＰＳ細胞は、ｈＨＴＲ３Ａ遺伝子を強く発現した（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。免疫細胞染色の結果を図４２に示す。図中、スケールバーは１００μｍを示す。外因性ｈＨＴＲ３Ａ遺伝子を導入されたｉＰＳ細胞は、ｈＨＴＲ３Ａタンパク質を強く発現していることが確認された。これらの結果に基づき、この細胞を「ｈＨＴＲ３Ａ発現ｉＰＳ細胞」とした。ｈＨＴＲ３Ａ発現ｉＰＳ細胞の明視野像を図４３に示す。図中、スケールバーは１ｍｍを示す。
　上記（３－１）の手順により、ｈＨＴＲ３Ａ発現ｉＰＳ細胞における幹細胞マーカーｈＮＡＮＯＧ遺伝子の発現をｑＰＣＲにより確認した結果を図４４に示す。図中、「ｈＨＴＲ３Ａ」はｈＨＴＲ３Ａ発現ｉＰＳ細胞を、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は野生型ｉＰＳ細胞を示す。ｈＨＴＲ３Ａ発現ｉＰＳ細胞は、野生型ｉＰＳ細胞と同程度にｈＮＡＮＯＧ遺伝子を発現し、未分化状態であることが確認された。
　上記（３－２）の手順により、ｈＨＴＲ３Ａ発現ｉＰＳ細胞の三胚様への分化能を評価した。結果を図４５に示す。外胚葉、中胚葉または内胚葉への分化を誘導されたｈＨＴＲ３Ａ発現ｉＰＳ細胞は、外胚葉マーカーｈＮＥＳ遺伝子、中胚葉マーカーｈＮＣＡＭ１遺伝子または内胚葉マーカーｈＳＯＸ１７遺伝子をそれぞれ強く発現した。これらの結果から、ｈＨＴＲ３Ａ発現ｉＰＳ細胞の三胚様への分化能を有していることが確認された。
　Ｇ分染法による染色体検査の結果を図４６に示す。ｈＨＴＲ３Ａ発現ｉＰＳ細胞の染色体には異常がないことが確認された。
＜１２．ｈＨＴＲ３Ａ発現ｉＰＳ細胞から調製された副交感神経細胞またはその自律神経系前駆細胞の解析＞
　上記（２－７）の手順により、ｈＨＴＲ３Ａ発現ｉＰＳ細胞の副交感神経細胞への分化を誘導した。誘導０日目のＥＢおよび誘導１３日目の細胞の顕微鏡像（明視野）を図４７に示す。スケールバーは１００μｍを示す。誘導１３日目の細胞についてのｑＰＣＲの結果を図４８に示す。幹細胞マーカーｈＮＡＮＯＧ遺伝子の発現が顕著に減少し、神経堤細胞マーカーｈＳＯＸ１０遺伝子および自律神経細胞マーカーｈＰＨＯＸ２Ｂ遺伝子の発現が顕著に増加した（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。これらの結果から、誘導１３日目の細胞が自律神経系前駆細胞であることが確認された。
　誘導４０日目の細胞についてのｑＰＣＲの結果を図４９に示す。末梢神経細胞マーカーｈＰＲＰＨ遺伝子および副交感神経細胞マーカーｈＣＨＡＴ遺伝子の強い発現が確認された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。また、誘導４０日目のモック感染副交感神経細胞（対照）と比較して、ｈＨＴＲ３Ａ遺伝子の同程度の発現が確認された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
　免疫細胞染色の結果を図５０に示す。図中、スケールバーは１００μｍを示す。ｈＨＴＲ３Ａタンパク質および成熟神経細胞マーカーＭＡＰ２タンパク質の発現が確認された。
＜１３．ｈＣＣＫＡＲを強制発現させたｉＰＳ細胞の品質評価＞
　上記１の手順においてレンチウイルスベクターとしてｐＬＶ－ｈＣＣＫＡＲを用い、上記（２－６）の手順により調製したｉＰＳ細胞におけるｈＣＣＫＡＲ遺伝子およびタンパク質の発現を、上記（３－１）の手順により解析した。ｑＰＣＲの結果を図５１に示す。野生型ｉＰＳ細胞（対照）と比較して、外因性ｈＣＣＫＡＲ遺伝子を導入されたｉＰＳ細胞は、ｈＣＣＫＡＲ遺伝子を強く発現した（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。免疫細胞染色の結果を図５２に示す。図中、スケールバーは１００μｍを示す。外因性ｈＣＣＫＡＲ遺伝子を導入されたｉＰＳ細胞は、ｈＣＣＫＡＲタンパク質を強く発現していることが確認された。これらの結果に基づき、この細胞を「ｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞」とした。ｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞の明視野像を図５３に示す。図中、スケールバーは１ｍｍを示す。
　上記（３－１）の手順により、ｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞における幹細胞マーカーｈＮＡＮＯＧ遺伝子の発現をｑＰＣＲにより確認した結果を図５４に示す。図中、「ｈＣＣＫＡＲ」はｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞を、「Ｃｏｎｔｒｏｌ」は野生型ｉＰＳ細胞を示す。ｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞は、野生型ｉＰＳ細胞と同程度にｈＮＡＮＯＧ遺伝子を発現し、未分化状態であることが確認された。
　上記（３－２）の手順により、ｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞の三胚様への分化能を評価した。結果を図５５に示す。外胚葉、中胚葉または内胚葉への分化を誘導されたｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞は、外胚葉マーカーｈＮＥＳ遺伝子、中胚葉マーカーｈＮＣＡＭ１遺伝子または内胚葉マーカーｈＳＯＸ１７遺伝子をそれぞれ強く発現した。これらの結果から、ｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞の三胚様への分化能を有していることが確認された。
　Ｇ分染法による染色体検査の結果を図５６に示す。ｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞の染色体には異常がないことが確認された。
＜１４．ｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞から調製された副交感神経細胞またはその自律神経系前駆細胞の解析＞
　上記（２－７）の手順により、ｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞の副交感神経細胞への分化を誘導した。誘導０日目のＥＢおよび誘導１３日目の細胞の顕微鏡像（明視野）を図５７に示す。スケールバーは１００μｍを示す。誘導１３日目の細胞についてのｑＰＣＲの結果を図５８に示す。幹細胞マーカーｈＮＡＮＯＧ遺伝子の発現が顕著に減少し、神経堤細胞マーカーｈＳＯＸ１０遺伝子および自律神経細胞マーカーｈＰＨＯＸ２Ｂ遺伝子の発現が顕著に増加した（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。これらの結果から、誘導１３日目の細胞が自律神経系前駆細胞であることが確認された。
　誘導４０日目の細胞についてのｑＰＣＲの結果を図５９に示す。末梢神経細胞マーカーｈＰＲＰＨ遺伝子および副交感神経細胞マーカーｈＣＨＡＴ遺伝子の強い発現が確認された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。また、誘導４０日目のモック感染副交感神経細胞（対照）と比較して、ｈＣＣＫＡＲ遺伝子の強い発現が確認された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
　免疫細胞染色の結果を図６０に示す。図中、スケールバーは１００μｍを示す。ｈＣＣＫＡＲタンパク質および成熟神経細胞マーカーＭＡＰ２タンパク質の発現が確認された。
　上記（２－７）の手順によりｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞から調製された細胞のリガンド応答性を、上記（４－３）の手順による細胞外電位測定により解析した。細胞外電位ヒートマップを図６１に示す。ＣＣＫ－３３を添加することにより、高い神経発火頻度を示す領域が見られた。神経発火頻度の変化率を図６２に示す。ＣＣＫ－３３を添加することにより、神経発火頻度が上昇した（＊Ｐ＜０．０５、０ｎＭ＝１２８電極、１０ｎＭ＝２３電極、１００ｎＭ＝５７電極、１０００ｎＭ＝２４電極／２～４ウェル、ｓｔｕｄｅｎｔ－ｔ）。
　上記（２－７）の手順によりｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞から調製された細胞のリガンド応答性を、上記（４－２）の手順による細胞内カルシウムイメージングにより解析した。測定結果を図６３に示す。横軸は時間（秒）を示し、縦軸はＣＣＫ－３３添加前（０～１９９秒）の蛍光強度の平均値（Ｆ０）を１とした際の蛍光強度の変化率（ΔＦ／Ｆ０）を示す。ＣＣＫ－３３を添加することにより、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇した。ＣＣＫ－３３添加前（０～１９９秒）の蛍光強度の平均値（Ｆ０）に対するＣＣＫ－３３添加後（２００～４００秒）の蛍光強度の平均値（ΔＦａｖｅ）の変化率（ΔＦａｖｅ／Ｆ０）を図６４に示す。ＣＣＫ－３３を添加することにより、神経発火の強度が増強された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝２０細胞／３サンプル、ｓｔｕｄｅｎｔ－ｔ）。
　以上の結果から、ｈＣＣＫＡＲ発現ｉＰＳ細胞から調製された副交感神経細胞が、ＣＣＫ－３３応答性を有する迷走神経様副交感神経細胞であることが示された。
＜１５．ｈＧＬＰ１Ｒを分化後に強制発現させた副交感神経細胞の解析＞
　上記１の手順においてレンチウイルスベクターとしてｐＬＶ－ｈＧＬＰ１Ｒを用い、上記（２－５）の手順により調製した副交感神経細胞におけるｈＧＬＰ１Ｒタンパク質の発現を、上記（３－１）の手順により解析した。誘導４０日目における免疫細胞染色の結果を図６５に示す。図中、スケールバーは１００μｍを示す。副交感神経細胞マーカーｈＣｈＡＴタンパク質およびｈＧＬＰ１Ｒタンパク質の強い発現が確認された。
　上記（２－７）の手順により、ｈＧＬＰ１Ｒタンパク質を分化後に強制発現させた副交感神経細胞のリガンド応答性を、上記（４－２）の手順による細胞内カルシウムイメージングにより解析した。測定結果を図６６に示す。横軸は時間（秒）を示し、縦軸はＧＬＰ１添加前（０～１２４秒）の蛍光強度の平均値（Ｆ０）を１とした際の蛍光強度の変化率（ΔＦ／Ｆ０）を示す。ＧＬＰ１を添加することにより、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇した。
＜１６．ｈＮＰＹ２Ｒを分化後に強制発現させた副交感神経細胞の解析＞
　上記１の手順においてレンチウイルスベクターとしてｐＬＶ－ｈＮＰＹ２Ｒを用い、上記（２－５）の手順により調製した副交感神経細胞におけるｈＮＰＹ２Ｒタンパク質の発現を、上記（３－１）の手順により解析した。誘導４０日目における免疫細胞染色の結果を図６７に示す。図中、スケールバーは１００μｍを示す。副交感神経細胞マーカーｈＣｈＡＴタンパク質およびｈＮＰＹ２Ｒタンパク質の強い発現が確認された。
　上記（２－７）の手順により、ｈＮＰＹ２Ｒタンパク質を分化後に強制発現させた副交感神経細胞のリガンド応答性を、上記（４－２）の手順による細胞内カルシウムイメージングにより解析した。測定結果を図６８に示す。横軸は時間（秒）を示し、縦軸はＰＹＹ添加前（０～１２４秒）の蛍光強度の平均値（Ｆ０）を１とした際の蛍光強度の変化率（ΔＦ／Ｆ０）を示す。ＰＹＹを添加することにより、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇した。
＜１７．ｈＧＬＰ２Ｒを分化後に強制発現させた副交感神経細胞の解析＞
　上記１の手順においてレンチウイルスベクターとしてｐＬＶ－ｈＧＬＰ２Ｒを用い、上記（２－５）の手順により調製した副交感神経細胞におけるｈＧＬＰ２Ｒ遺伝子およびタンパク質の発現を、上記（３－１）の手順により解析した。ｑＰＣＲの結果を図６９に示す。野生型ｉＰＳ細胞（図中、「未分化」）では末梢神経細胞マーカーｈＰＲＰＨ遺伝子および副交感神経細胞マーカーｈＣＨＡＴ遺伝子の発現が見られなかったのに対し、外因性ｈＧＬＰ２Ｒ遺伝子を導入された誘導４０日目の細胞（図中、「副交感神経細胞」）では、両マーカー遺伝子の強い発現が確認された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。また、誘導４０日目のモック感染副交感神経細胞（対照）と比較して、ｈＧＬＰ２Ｒ遺伝子の強い発現が確認された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
　誘導４０日目における免疫細胞染色の結果を図７０に示す。図中、スケールバーは１００μｍを示す。成熟神経細胞マーカーＭＡＰ２タンパク質およびｈＧＬＰ２Ｒタンパク質の強い発現が確認された。
　上記（２－７）の手順により、ｈＧＬＰ２Ｒタンパク質を分化後に強制発現させた副交感神経細胞のリガンド応答性を、上記（４－２）の手順による細胞内カルシウムイメージングにより解析した。測定結果を図７１に示す。横軸は時間（秒）を示し、縦軸はＧＬＰ２添加前（０～８０秒）の蛍光強度の平均値（Ｆ０）を１とした際の蛍光強度の変化率（ΔＦ／Ｆ０）を示す。ＧＬＰ２を添加することにより、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇した。ＧＬＰ２添加前（０～８０秒）の蛍光強度の平均値（Ｆ０）に対するＧＬＰ２添加後（２４０～４００秒）の蛍光強度の平均値（ΔＦａｖｅ）の変化率（ΔＦａｖｅ／Ｆ０）を図７２に示す。ＧＬＰ２を添加することにより、神経発火の強度が増強された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝２０細胞／３サンプル、ｓｔｕｄｅｎｔ－ｔ）。
＜１８．ｈＨＴＲ３Ａを分化後に強制発現させた副交感神経細胞の解析＞
　上記１の手順においてレンチウイルスベクターとしてｐＬＶ－ｈＨＴＲ３Ａを用い、上記（２－５）の手順により調製した副交感神経細胞におけるｈＨＴＲ３Ａ遺伝子およびタンパク質の発現を、上記（３－１）の手順により解析した。ｑＰＣＲの結果を図７３に示す。野生型ｉＰＳ細胞（図中、「未分化」）では末梢神経細胞マーカーｈＰＲＰＨ遺伝子および副交感神経細胞マーカーｈＣＨＡＴ遺伝子の発現が見られなかったのに対し、外因性ｈＨＴＲ３Ａ遺伝子を導入された誘導４０日目の細胞（図中、「副交感神経細胞」）では、両マーカー遺伝子の強い発現が確認された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。また、誘導４０日目のモック感染副交感神経細胞（対照）と比較して、ｈＨＴＲ３Ａ遺伝子の強い発現が確認された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
　誘導４０日目における免疫細胞染色の結果を図７４に示す。図中、スケールバーは１００μｍを示す。成熟神経細胞マーカーＭＡＰ２タンパク質およびｈＨＴＲ３Ａタンパク質の強い発現が確認された。
　上記（２－７）の手順により、ｈＨＴＲ３Ａタンパク質を分化後に強制発現させた副交感神経細胞のリガンド応答性を、上記（４－２）の手順による細胞内カルシウムイメージングにより解析した。測定結果を図７５に示す。横軸は時間（秒）を示し、縦軸は５－ＨＴ添加前（０～８０秒）の蛍光強度の平均値（Ｆ０）を１とした際の蛍光強度の変化率（ΔＦ／Ｆ０）を示す。５－ＨＴを添加することにより、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇した。５－ＨＴ添加前（０～８０秒）の蛍光強度の平均値（Ｆ０）に対する５－ＨＴ添加後（２４０～４００秒）の蛍光強度の平均値（ΔＦａｖｅ）の変化率（ΔＦａｖｅ／Ｆ０）を図７６に示す。５－ＨＴを添加することにより、神経発火の強度が増強された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝２０細胞／３サンプル、ｓｔｕｄｅｎｔ－ｔ）。
＜１９．ｈＣＣＫＡＲを分化後に強制発現させた副交感神経細胞の解析＞
　上記１の手順においてレンチウイルスベクターとしてｐＬＶ－ｈＣＣＫＡＲを用い、上記（２－５）の手順により調製した副交感神経細胞におけるｈＣＣＫＡＲ遺伝子およびタンパク質の発現を、上記（３－１）の手順により解析した。ｑＰＣＲの結果を図７７に示す。野生型ｉＰＳ細胞（図中、「未分化」）では末梢神経細胞マーカーｈＰＲＰＨ遺伝子および副交感神経細胞マーカーｈＣＨＡＴ遺伝子の発現が見られなかったのに対し、外因性ｈＣＣＫＡＲ遺伝子を導入された誘導４０日目の細胞（図中、「副交感神経細胞」）では、両マーカー遺伝子の強い発現が確認された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。また、誘導４０日目のモック感染副交感神経細胞（対照）と比較して、ｈＣＣＫＡＲ遺伝子の強い発現が確認された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定）。
　誘導４０日目における免疫細胞染色の結果を図７８に示す。図中、スケールバーは１００μｍを示す。成熟神経細胞マーカーＭＡＰ２タンパク質およびｈＣＣＫＡＲタンパク質の強い発現が確認された。
　上記（２－７）の手順により、ｈＣＣＫＡＲタンパク質を分化後に強制発現させた副交感神経細胞のリガンド応答性を、上記（４－２）の手順による細胞内カルシウムイメージングにより解析した。測定結果を図７９に示す。横軸は時間（秒）を示し、縦軸はＣＣＫ－３３添加前（０～８０秒）の蛍光強度の平均値（Ｆ０）を１とした際の蛍光強度の変化率（ΔＦ／Ｆ０）を示す。ＣＣＫ－３３を添加することにより、細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇した。ＣＣＫ－３３添加前（０～８０秒）の蛍光強度の平均値（Ｆ０）に対するＣＣＫ－３３添加後（２４０～４００秒）の蛍光強度の平均値（ΔＦａｖｅ）の変化率（ΔＦａｖｅ／Ｆ０）を図８０に示す。ＣＣＫ－３３を添加することにより、神経発火の強度が増強された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝２０細胞／３サンプル、ｓｔｕｄｅｎｔ－ｔ）。
＜２０．ｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された副交感神経細胞と腸内分泌細胞との共培養の作製＞
　ヒトＬ細胞由来細胞株ＮＣＩ－Ｈ７１６（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ－２５１）を、１０％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓを含有するＲＰＭＩ－１６４０（以下、「Ｈ７１６培地」と記載する）を用いて１０ｃｍディッシュに播種し（１～２×１０６細胞／ディッシュ）、３～４日間培養した。細胞および培地を１５ｍＬ遠沈管に回収し、２００×ｇ、５分間遠心分離し、上清を除去した。細胞にＦＢＳを含有しないＨ７１６培地またはリンガー液を加え、１×１０６細胞／ｍＬに調製した。得られた細胞懸濁液の１ｍＬに２０μＭのＭｅｍＧｌｏｗ／ＤＭＳＯ溶液を５μＬ加え（終濃度１００ｎＭ）、室温で１０分間インキュベートした。その後、２００×ｇ、５分間遠心分離し、上清を除去した。Ｈ７１６培地を用いて１回洗浄後、１０ｃｍディッシュに播種した。ＭｅｍＧｌｏｗによる細胞膜の染色は、最大１０日間維持されることを確認した。以下、ＭｅｍＧｌｏｗにより染色されたＮＣＩ－Ｈ７１６細胞を「ＭｅｍＧｌｏｗ染色ＮＣＩ－Ｈ７１６」と記載する。
　上記（２－７）の手順によりｈＧＬＰ１Ｒ発現ｉＰＳ細胞から調製された副交感神経細胞（以下、「ｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞」と記載する）（誘導３７日目）に、ＭｅｍＧｌｏｗ染色ＮＣＩ－Ｈ７１６（２×１０５細胞／ｍＬ）を１ｍＬ添加した。この結果、共培養は、ＮＤＭ２およびＨ７１６培地の１：１混合培地中で行われた。４８時間の培養後、上記（３－１）（ｉｉ）と同様の手順により、免疫細胞染色を行った。一次抗体には、抗ＭＡＰ２抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１２６７）（１：１０００希釈）を用いた。
　結果を図８１に示す。共培養において、ｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞の上にＭｅｍＧｌｏｗ染色ＮＣＩ－Ｈ７１６細胞が接着したことが確認された。ｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞およびＭｅｍＧｌｏｗ染色ＮＣＩ－Ｈ７１６のいずれにも形態異常は見られなかった。さらに、副交感神経のアゴニストであるニコチンを用いて、上記（４－２）の手順により細胞内カルシウムイメージングを行い、共培養におけるｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞のニコチン応答が正常であることを確認した（データは省略）。これらの結果から、ｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞とＮＣＩ－Ｈ７１６細胞とを直接共培養できることが示された。
＜２１．ＮＣＩ－Ｈ７１６細胞との共培養におけるｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞の解析＞
　上記（２－７）の手順により調製されたｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞（誘導３５日目）に、ＭｅｍＧｌｏｗ染色ＮＣＩ－Ｈ７１６（１×１０６細胞／ｍＬ）を１ｍＬ添加した。共培養は、ＮＤＭ２およびＨ７１６培地の１：１混合培地中で行われた。１時間の共培養後、培地をグルコース不含リンガー液に交換した。グルコース（腸内分泌細胞を刺激し、摂食制御にかかわる）に対する応答を、上記（４－２）の手順による細胞内カルシウムイメージングにより解析した。
　結果を図８２に示す。横軸は時間（秒）を示し、縦軸はグルコース添加前（０～１９９秒）の蛍光強度の平均値（Ｆ０）を１とした際の蛍光強度の変化率（ΔＦ／Ｆ０）を示す。共培養にグルコースを添加することにより、ｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇した。グルコース添加前（０～１９９秒）の蛍光強度の平均値（Ｆ０）に対するグルコース添加後（２００～４００秒）の蛍光強度の平均値（ΔＦａｖｅ）の変化率（ΔＦａｖｅ／Ｆ０）を図８３に示す。共培養にグルコースを添加することにより、ｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞の神経発火の強度が増強された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝２０細胞／サンプル、ｓｔｕｄｅｎｔ－ｔ）。一方、ｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞の単独培養はグルコースに応答しなかった（データは省略）。これらの結果から、ＮＣＩ－Ｈ７１６細胞がグルコースに応答してＧＬＰ１を分泌し、ｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞がＧＬＰ１に応答したことが示唆された。
　次に、上記共培養のα－リノレン酸に対する応答を、上記（４－２）の手順による細胞内カルシウムイメージングにより解析した。ＮＣＩ－Ｈ７１６細胞が発現する多価不飽和脂肪酸受容体のアゴニストであるα－リノレン酸（富士フイルム和光純薬：１２７－０５９０１）（以下、「ＡＬＡ」と記載する）（１００μＭ）を用い、測定溶液にはグルコース不含リンガー液を用いた。
　結果を図８４に示す。横軸は時間（秒）を示し、縦軸はＡＬＡ添加前（０～１９９秒）の蛍光強度の平均値（Ｆ０）を１とした際の蛍光強度の変化率（ΔＦ／Ｆ０）を示す。共培養にＡＬＡを添加することにより、ｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞の細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇した。ＡＬＡ添加前（０～１９９秒）の蛍光強度の平均値（Ｆ０）に対するＡＬＡ添加後（２００～４００秒）の蛍光強度の平均値（ΔＦａｖｅ）の変化率（ΔＦａｖｅ／Ｆ０）を図８５に示す。共培養にＡＬＡを添加することにより、ｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞の神経発火の強度が増強された（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝２０細胞／サンプル、ｓｔｕｄｅｎｔ－ｔ）。一方、ｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞の単独培養はＡＬＡに応答しなかった（データは省略）。これらの結果から、ＮＣＩ－Ｈ７１６細胞がＡＬＡに応答してＧＬＰ１を分泌し、ｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞がＧＬＰ１に応答したことが示唆された。
＜２２．ＮＣＩ－Ｈ７１６細胞の培養上清に対するｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞の応答性＞
　ＨＢＳＳにより希釈したマトリゲル（終濃度０．４～０．６ｍｇ／ｍＬ）を２４ウェルプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＨＢＳＳで２回洗浄し、乾燥させた後、Ｈ７１６培地を用いてＮＣＩ－Ｈ７１６細胞を播種した（２×１０５細胞／ウェル）。４８時間培養した後、リンガー液で１回洗浄し、グルコース（１０ｍＭ）またはＡＬＡ（１００μＭ）を含むリンガー液を添加した。室温で４分間インキュベートした後、上清を回収した。ＰＭＳＦを添加し（終濃度５０μｇ／ｍＬ）、測定に用いるまで上清を氷上で保存し、測定時には室温に戻して使用した。以下、グルコースを含むリンガー液により調製された上清を「グルコース負荷上清」、ＡＬＡを含むリンガー液により調製された上清を「ＡＬＡ負荷上清」と記載する。グルコース負荷上清またはＡＬＡ負荷上清を用い、上記（４－２）と同様の手順により細胞内カルシウムイメージングを行った。
　グルコース負荷上清を用いた細胞内カルシウムイメージングの結果を図８６に示す。横軸は時間（秒）を示し、縦軸は上清添加前（０～１９９秒）の蛍光強度の平均値（Ｆ０）を１とした際の蛍光強度の変化率（ΔＦ／Ｆ０）を示す。グルコース負荷上清を添加することにより、ｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞（誘導４４日目）の細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇した。上清添加前（０～１９９秒）の蛍光強度の平均値（Ｆ０）に対する上清添加後（２００～４００秒）の蛍光強度の平均値（ΔＦａｖｅ）の変化率（ΔＦａｖｅ／Ｆ０）を図８７に示す。図中、「Ｃｔｒｌ」はＮＣＩ－Ｈ７１６細胞と触れていないリンガー液を示す。ｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞はグルコース未負荷上清にも反応したが、グルコース負荷上清により強い反応を示した（＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝２０細胞／サンプル、Ｔｕｋｅｙ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡ）。
　ＡＬＡ負荷上清を用いた細胞内カルシウムイメージングの結果を図８８に示す。横軸は時間（秒）を示し、縦軸は上清添加前（０～１９９秒）の蛍光強度の平均値（Ｆ０）を１とした際の蛍光強度の変化率（ΔＦ／Ｆ０）を示す。ＡＬＡ負荷上清を添加することにより、ｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞（誘導３４日目）の細胞内Ｃａ２＋濃度が上昇した。上清添加前（０～１９９秒）の蛍光強度の平均値（Ｆ０）に対する上清添加後（２００～４００秒）の蛍光強度の平均値（ΔＦａｖｅ）の変化率（ΔＦａｖｅ／Ｆ０）を図８９に示す。図中、「Ｃｔｒｌ」はＮＣＩ－Ｈ７１６細胞と接触していないリンガー液を示す。ｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞は、グルコース負荷上清と同程度にＡＬＡ負荷上清にも強い反応を示した（＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎ＝２０細胞／サンプル、Ｔｕｋｅｙ事後検定を伴う二元配置ＡＮＯＶＡ）。
　以上の結果から、ＮＣＩ－Ｈ７１６細胞がグルコースおよびＡＬＡに応答してＧＬＰ１を分泌し、ｈＧＬＰ１Ｒ発現副交感神経細胞がＧＬＰ１に応答したことが確認された。　

Claims (13)

  1. 　（ａ）多能性幹細胞の副交感神経細胞への分化を誘導するステップ、および
    　（ｂ１）前記ステップ（ａ）の前に、前記多能性幹細胞に消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸を導入するステップ、または
    　（ｂ２）前記ステップ（ａ）により得られた副交感神経細胞またはその前駆細胞に消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸を導入するステップ
    を含む、迷走神経様副交感神経細胞を作製する方法。
  2. 　前記消化管ホルモン受容体が、グルカゴン様ペプチド１受容体、ニューロペプチドＹ２型受容体、グルカゴン様ペプチド２受容体、セロトニン３受容体およびコレシストキニン１受容体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
  3. 　請求項１または２に記載の方法により作製された、迷走神経様副交感神経細胞。
  4. 　消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸を含んでなる多能性幹細胞。
  5. 　消化管ホルモン受容体をコードする外因性核酸を含んでなる迷走神経様副交感神経細胞。
  6. 　前記消化管ホルモン受容体が、グルカゴン様ペプチド１受容体、ニューロペプチドＹ２型受容体、グルカゴン様ペプチド２受容体、セロトニン３受容体およびコレシストキニン１受容体からなる群から選択される、請求項４または５に記載の細胞。
  7. 　（１）請求項３、５または６に記載の迷走神経様副交感神経細胞に試料を接触させるステップ、および、
    　（２）前記迷走神経様副交感神経細胞の神経活動を解析するステップ
    を含む、試料中の消化管ホルモン受容体アゴニストを検出する方法。
  8. 　（１）候補物質の存在下で請求項３、５または６に記載の迷走神経様副交感神経細胞を培養するステップ、および、
    　（２）前記迷走神経様副交感神経細胞の神経活動を解析するステップ
    を含む、脳腸相関を制御する物質のスクリーニング方法。
  9. 　（１）候補物質の存在下で消化管ホルモン分泌細胞を培養するステップ、
    　（２）前記ステップ（１）により得られた培養物から培養上清を回収するステップ、
    　（３）請求項３、５または６に記載の迷走神経様副交感神経細胞に前記培養上清を接触させるステップ、および、
    　（４）前記迷走神経様副交感神経細胞の神経活動を解析するステップ
    を含む、脳腸相関を制御する物質のスクリーニング方法。
  10. 　（１）候補物質の存在下で消化管ホルモン分泌細胞と請求項３、５または６に記載の迷走神経様副交感神経細胞とを共培養するステップ、および
    　（２）前記迷走神経様副交感神経細胞の神経活動を解析するステップ
    を含む、脳腸相関を制御する物質のスクリーニング方法。
  11. 　前記消化管ホルモン分泌細胞が腸内分泌細胞である、請求項９または１０に記載のスクリーニング方法。
  12. 　消化管ホルモン分泌細胞と請求項３、５または６に記載の迷走神経様副交感神経細胞との共培養を含んでなる、脳腸相関モデル。
  13. 　前記消化管ホルモン分泌細胞が腸内分泌細胞である、請求項１２に記載の脳腸相関モデル。
     
PCT/JP2023/027801 2022-07-29 2023-07-28 迷走神経様副交感神経細胞およびその作製方法 Ceased WO2024024955A1 (ja)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2024537267A JPWO2024024955A1 (ja) 2022-07-29 2023-07-28

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2022121608 2022-07-29
JP2022-121608 2022-07-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2024024955A1 true WO2024024955A1 (ja) 2024-02-01

Family

ID=89706684

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2023/027801 Ceased WO2024024955A1 (ja) 2022-07-29 2023-07-28 迷走神経様副交感神経細胞およびその作製方法

Country Status (3)

Country Link
JP (1) JPWO2024024955A1 (ja)
TW (1) TW202409273A (ja)
WO (1) WO2024024955A1 (ja)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016194522A1 (ja) * 2015-06-02 2016-12-08 国立研究開発法人産業技術総合研究所 神経堤細胞から自律神経系の細胞への分化誘導方法
WO2020040286A1 (ja) * 2018-08-24 2020-02-27 国立研究開発法人産業技術総合研究所 副交感神経細胞の作製方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016194522A1 (ja) * 2015-06-02 2016-12-08 国立研究開発法人産業技術総合研究所 神経堤細胞から自律神経系の細胞への分化誘導方法
WO2020040286A1 (ja) * 2018-08-24 2020-02-27 国立研究開発法人産業技術総合研究所 副交感神経細胞の作製方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BERTHOUD H.‐R.: "Vagal and hormonal gut–brain communication: from satiation to satisfaction", NEUROGASTROENTEROLOGY AND MOTILITY, BLACKWELL SCIENTIFIC PUBLICATIONS, OXFORD, GB, vol. 20, no. s1, 1 May 2008 (2008-05-01), GB , pages 64 - 72, XP093133520, ISSN: 1350-1925, DOI: 10.1111/j.1365-2982.2008.01104.x *
DATABASE Nucleotide 20210627; ANONYMOUS : "Homo sapiens cholecystokinin A receptor (CCKAR), mRNA ", XP093133534, retrieved from NCBI Database accession no. NM_000730.3 *
DATABASE Nucleotide 25 July 2022 (2022-07-25), ANONYMOUS : "Homo sapiens 5-hydroxytryptamine receptor 3A (HTR3A), transcript variant 1, mRNA", XP093133531, retrieved from NCBI Database accession no. NM_213621.4 *
DATABASE Nucleotide 26 June 2021 (2021-06-26), ANONYMOUS M : "Homo sapiens neuropeptide Y receptor Y2 (NPY2R), transcript variant 1, mRNA", XP093133525, retrieved from NCBI Database accession no. NM_000910.4 *
DATABASE Nucleotide 26 June 2022 (2022-06-26), ANONYMOUS : "Homo sapiens glucagon like peptide 1 receptor (GLP1R), transcript variant 1, mRNA", XP093133523, retrieved from NCBI Database accession no. NM_002062.5 *
DATABASE Nucleotide 9 August 2021 (2021-08-09), ANONYMOUS : "Homo sapiens glucagon like peptide 2 receptor (GLP2R), mRNA", XP093133529, retrieved from NCBI Database accession no. NM_004246.3 *
MINAGAWA ATSUTAKA; YOSHIKAWA TOSHIAKI; YASUKAWA MASAKI; HOTTA AKITSU; KUNITOMO MIHOKO; IRIGUCHI SHOICHI; TAKIGUCHI MAIKO; KASSAI Y: "Enhancing T Cell Receptor Stability in Rejuvenated iPSC-Derived T Cells Improves Their Use in Cancer Immunotherapy", CELL STEM CELL, ELSEVIER, CELL PRESS, AMSTERDAM, NL, vol. 23, no. 6, 6 December 2018 (2018-12-06), AMSTERDAM, NL , pages 850, XP085555973, ISSN: 1934-5909, DOI: 10.1016/j.stem.2018.10.005 *

Also Published As

Publication number Publication date
TW202409273A (zh) 2024-03-01
JPWO2024024955A1 (ja) 2024-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Trzaska et al. Brain‐derived neurotrophic factor facilitates maturation of mesenchymal stem cell‐derived dopamine progenitors to functional neurons
JP7023820B2 (ja) 多分化能細胞および多能性細胞の分化を方向付けることによって発生させる皮質介在ニューロンおよびその他のニューロン細胞
JP6756786B2 (ja) 移植用中脳ドーパミン（ｄａ）ニューロン
JP6367824B2 (ja) 三次元不均一分化組織培養
Henion et al. trkC-mediated NT-3 signaling is required for the early development of a subpopulation of neurogenic neural crest cells
CN108368486B (zh) 鉴定神经肌肉接头活动的调节剂的体外方法
US20210139849A1 (en) Methods for efficient derivation of human motor neurons from diverse spinal regions
Wu et al. Role of Sonic hedgehog signaling and the expression of its components in human embryonic stem cells
JP2020513823A (ja) 幹細胞由来星状細胞、作製方法および使用方法
US10494602B1 (en) Functional astrocytes and cortical neurons from induced pluripotent stem cells and methods of use thereof
JP2018531012A6 (ja) 神経筋接合活性のモジュレーターを同定するｉｎ ｖｉｔｒｏの方法
Poliandri et al. Generation of kisspeptin-responsive GnRH neurons from human pluripotent stem cells
US20250230405A1 (en) Generation of norepinephrine neurons from human stem cells
WO2024024955A1 (ja) 迷走神経様副交感神経細胞およびその作製方法
Tamaki et al. Overexpression of cyclin dependent kinase inhibitor P27/Kip1 increases oligodendrocyte differentiation from induced pluripotent stem cells: Tamaki and Tokumoto
CN118773135A (zh) 一种人类多能干细胞诱导为类听觉神经元的方法
US20230089966A1 (en) Method for differentiation of brain mural cells from human pluripotent stem cells
CA3155277A1 (en) Production method for induced dopaminergic neuronal progenitors, using direct reprogramming
Shirzad et al. Production of stable GFP-expressing neural cells from P19 embryonal carcinoma stem cells
Xie Modeling SCN1A Epilepsy with Dual Isogenic Pairs of Human iPSC-derived Neurons
Zhang A patient-specific stem cell model of neurovascular interaction for vascular dementia CADASIL
Alvandi c-Src Controls Mouse Embryonic Osteogenic Differentiation Through Regulation of Stat1 Stability
WO2021015245A1 (ja) 繊毛関連疾患モデルおよびその利用
Adnani TRANSCRIPTIONAL REGULATION OF NEURONAL MIGRATION AND CELL FATE SPECIFICATION IN THE NEOCORTEX
Brosenitsch Induction of the dopaminergic phenotype in primary sensory neurons: Activity-dependent signaling and lineage-related transcription factors

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23846685

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2024537267

Country of ref document: JP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 23846685

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1