WO2024020657A1 - Compostos de complexos metálicos, processo de síntese dos compostos, filmes poliméricos compreendendo os compostos e seus usos - Google Patents

Compostos de complexos metálicos, processo de síntese dos compostos, filmes poliméricos compreendendo os compostos e seus usos Download PDF

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phenanthroline
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Rose MARIA CARLOS
Rafael CAVALIERI MARCHI
Maria FÁTIMA DAS GRAÇAS FERNANDES DA SILVA
João BATISTA FERNANDES
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Gs Partners Administração E Participações Ltda.
Fundação Universidade Federal De São Carlos – Ufscar
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    • C08K3/00—Use of inorganic substances as compounding ingredients
    • C08K3/10—Metal compounds
    • C08K3/14—Carbides

Definitions

  • the present invention falls within the field of alkaline earth metal compounds, specifically magnesium compounds, more specifically magnesium metal complex compounds with antioxidant activity, the synthesis process of the compounds thus obtained, polymer films comprising the These compounds and their uses in agriculture and the food, cosmetics, sanitizing and chemical and pharmaceutical industries.
  • Radicals are defined as reactive chemical species that have one or more unpaired electrons and do not show selectivity, and can attack DNA, proteins x xxxxxxxxx xxxx xx be associated with various diseases such as cancer and atherosclerosis, degenerative processes of the central nervous system such as Alzheimer's and aging.
  • Antioxidants are chemical substances that, in low concentrations, when compared to that of the oxidizable substrate, are capable of delaying or preventing the oxidation of these substrates. Antioxidants must react quickly with radicals, preventing the molecules from being oxidized ( Figure 37). When the antioxidant oxidizes, it becomes a radical as it will have an unpaired electron, however, this molecule must form stable species to prevent the formation of radicals.
  • Antioxidant barriers are divided into enzymatic defense consisting of enzymes such as superoxide dismutase, catalase and glutathione reductase and present in living organisms. There is also natural non-enzymatic defense in which antioxidants are obtained from foods, such as flavonoids, phenolic acids, vitamins, among others.
  • antioxidants such as butylated hydroxyanisole (BHA), butylated hydroxytoluene (BHT) and propyl gallate (PG), but it has been demonstrated that these present toxicological risks and are being used less and less. Scientific and market research has been directed globally towards the use of natural or synthetic antioxidants with low toxicity.
  • Antioxidants are compounds that play an important role in delaying/preventing auto-oxidation, inhibiting the formation of free radicals or interrupting the propagation of free radicals through various mechanisms, one of them being the chelation of metals (which can lead to the formation of complexes).
  • phenolic acids act as antioxidants, capturing free radicals and can chelate metals.
  • flavonoids have the ability to eliminate free radicals and chelate metals, thus slowing down the auto-oxidation process.
  • Patent document CN101755649 discloses a fertilizer consisting of a mixture of magnesium salts, such as magnesium sulfate, magnesium nitrate and other magnesium salts for growing apples.
  • Document US2007/0077308 refers to the production of microcapsules and a water-in-oil-in-water microencapsulation process through in situ and interfacial polymerization of the emulsion.
  • materials that can be encapsulated in microcapsules are: Minerals and trace elements, especially those involved in redox processes in vivo such as selenium, zinc, magnesium; Flavonoids in general and their derivatives, which can be isoflavones, catechin and quercetin; Phenolic acids in general and derivatives, including ferulic acid; Structurally combined amides comprising hydroxycinnamic acids; Various oxidizing agents.
  • the aforementioned document does not mention the formulation of metal complexes, so that the precursors are inserted into the microcapsule without such chemical interaction.
  • the formation of metal complexes in the present invention demonstrated that, in addition to the high antioxidant activity, said molecule has an exclusive ability to regenerate itself in the presence of radicals, in order to maintain its performance/protection against radicals for longer.
  • compositions comprising an inorganic particulate mineral and an antimicrobial metal, methods of manufacturing the said compositions, use of said compositions in a coating composition or in a polymeric article, use of said compositions to inhibit the growth of one or more microbes and use of said compositions to eliminate one or more microbes, for example, from a liquid.
  • the antimicrobial metal may be magnesium.
  • the present invention refers to the use of these compositions in polymeric articles, in coating compositions, in mineralized surface substrates, in purification systems and in animal feed.
  • the metal can be in the form of a compound, adsorbed or not on the surfaces of inorganic particles, there is no mention of the formation of a metallic complex, so that the properties of the aforementioned compounds/compositions can differ greatly. This is revealed, mainly, in the ability to regenerate the metal complex, and this property was not mentioned in the aforementioned, indicating that such exclusive ability to regenerate in the presence of radicals is not present in said composition.
  • Patent document CN09874930 discloses a type of additive compound to improve live pork meat, which is characterized by: every 1000 parts in mass ratio are grouped: 150-300 parts of small peptide chelated zinc, 50 -80 parts small peptide chelated manganese, 100-180 parts small peptide chelated iron, 20-30 parts small peptide chelated copper, 2-3 parts selenium nanoprotein, 0.5-0.8 parts selenium picolinate chromium, 20-40 parts of 1-carnitine, and the remainder is magnesium aminosuccinate.
  • every 1000 parts in mass ratio are grouped: 150-300 parts of small peptide chelated zinc, 50 -80 parts small peptide chelated manganese, 100-180 parts small peptide chelated iron, 20-30 parts small peptide chelated copper, 2-3 parts selenium nanoprotein, 0.5-0.8 parts selenium picolinate chromium, 20-40 parts of 1-carnitine, and the remainder is magnesium aminosuccinate.
  • every 1000 parts in mass ratio
  • the oxi-reductive processes of the Mg-phen-fer complex are pH dependent.
  • the processes that are most affected by pH are waves Ilia' and IIIc', so that in acidic pH these processes do not appear while in basic pH they are quite evident.
  • This type of behavior is characteristic of electron transfer processes coupled with proton transfer.
  • a stabilized secondary carbocation is formed at pH 9.0 because in the process a hydroxyl associates with this cation while at pH 7.4 this path is little favored, which leads to the transient state of this process.
  • magnesium complexes which are the compounds subject to this invention, through a mechanism involving the transfer of electrons and hydrogen, are able to inactivate free radicals and regenerate later, as can be seen using the voltammetry technique. cycle, which illustrates the oxidation and reduction processes that occur with these species, without a decrease in their concentration.
  • the present invention appears as an alternative solution in obtaining new compounds from metal complexes with active antioxidant, antimicrobial and bactericidal for application in agriculture, the food industry, cosmetics, sanitizing products and chemical and pharmaceutical products, with regenerative capacity.
  • the present invention refers to a PROCESS for the synthesis of metal complex compounds, to the metal complex COMPOUNDS thus obtained, to POLYMERIC FILMS comprising said compounds and their USES.
  • the invention refers to metal complex compounds obtained from the formation of metal complexes and have the general formula [M(LL)(L'L')n] + , for which:
  • - M is the metal Magnesium (Mg (II));
  • - LL is an antioxidant agent comprised of flavonoids; or flavones; or phenolic acids; or hydroxycinnamic acids; or catechols; or catechins; or quercetins; or curcumins; or xanthones; or cytokines;
  • - L'L' is a chelating agent comprised of 1,10-phenanthroline; or 4,7-Dihydroxy-1,10-phenanthroline; or 1,10-phenanthroline-5,6-dione; or 4-Methyl-1,10-phenanthroline; or 5,6-Dimethyl-1,10-phenanthroline; or 4,7-Dichloro-1,10-phenanthroline; or 4,7-Dimethoxy-1,10-phenanthroline; or 5-Nitro-1,10-phenanthroline; or 1,10-phenanthroline-5-amine; or 2,2'- bipyridine; or 2,2'-bipyridine-3,3'-diol; or 4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridine; or 4,4'-Di-tert-butyl-2,2'-bipyridine; or ethylenediamine; or N,N,N',N'-Tetrakis(2-hydroxyethyl) ethylenediamine
  • Said compounds regardless of the choice of oxidizing and chelating agents, are prepared, preferably, by the equimolar reaction between a suitable salt of Mg(II), and the ligands LL and L'L' in the presence or absence of triethylamine depending of the pKa values of the ligands.
  • Compounds obtained from metal complexes are used for the preservation of perishable or non-perishable food, for application in cosmetic products that delay the destruction of the skin, for use as a food supplement for animals and plants, for the increased stability of animal feed and for use as fertilizers and/or insecticides.
  • the present invention refers to the synthesis of compounds from metal complexes, which comprises the following steps: a. Mix for each 1 to 5 equivalent of a magnesium salt; 0.5 to 5 LL equivalents; from 0.5 to 5 equivalents of L'L'; and a volume of organic solvent equivalent to 10% to 90% of the total volume of the container where the reaction will take place, forming a solution; B. Keep the solution with constant stirring and gentle heating for 1 to 4 hours or irradiate the solution for 10 to 25 minutes under microwaves, in which N2 gas is optionally provided in a controlled atmosphere or purged from the solution; w. Separate the precipitate obtained in step (b), preferably by filtration; d.
  • the precipitate with at least one means for removing organic contaminants, preferably ethanol or methanol or a mixture thereof, the ethanol or methanol or said mixture preferably being at a temperature of 4 °C to 15 °C; It is. Dry preferably in a vacuum.
  • at least one means for removing organic contaminants preferably ethanol or methanol or a mixture thereof, the ethanol or methanol or said mixture preferably being at a temperature of 4 °C to 15 °C; It is. Dry preferably in a vacuum.
  • step "a)" of the synthesis of the compounds triethylamine is optionally added under equimolar conditions of LL and L'L'.
  • step "b) of the synthesis of compounds, it is carried out by reaction in chemical reactors.
  • step "b) " of the synthesis of the compounds it is carried out by reaction under microwaves.
  • the present invention also refers to the USE of said compounds in the preparation of polymeric films of natural origin for preserving foods and beverages rich in riboflavin; the use of said compounds in the preparation of an insecticide, preferably for leaf-cutter ants (Atta sexdens); and also for use in the preparation of fungicides and bactericides, preferably against the symbiotic fungus (Leucoagaricus gongylophoru) of the leaf-cutter ant.
  • the use of the compound in the preparation of a cosmetic composition preferably aimed at anti-aging was also demonstrated.
  • the present invention relates to polymeric films comprising metallic compounds of general formula [M(LL)(L'L')n]+, for which;
  • [043] - LL understand among flavonoids; or flavones; or phenolic acids; or hydroxycinnamic acids; or catechols; or catechins; or quercetins; or curcumins; or xanthones; or cytokines;
  • - L'L' comprises 1,10-phenanthroline; or 4,7-Dihydroxy-1,10-phenanthroline; or 1,10-phenanthroline-5,6-dione; or 4-Methyl-1,10-phenanthroline; or 5,6-Dimethyl-1,10-phenanthroline; or 4,7-Dichloro-1,10-phenanthroline; or 4.7- Dimethoxy-1,10-phenanthroline; or 5-Nitro-1,10-phenanthroline; or 1,10-phenanthroline-5-amine; or 2,2'-bipyridine; or 2,2'-bipyridine-3,3'-diol; or 4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridine; or 4,4'-Di-tert-butyl-2,2'-bipyridine; or ethylenediamine; or N,N,N',N'-Tetrakis (2-hydroxyethyl) ethylenediamine; or N,N,N'
  • [045] - n 1 or 2, and are prepared, preferably, by the equimolar reaction between a suitable salt of Mg(II), and the ligands LL and L'L' in the presence or absence of triethylamine depending on the pKa values of the binders.
  • the polymeric films have a choice of biopolymers from proteins such as soy, wheat, corn, gelatin, casein; of polysaccharides such as cellulose, starch, pectin, chitosan, alginate, sugar; of lipids such as wax, triglycerides, fatty acids.
  • biopolymers of choice are tapioca starch and gelatin.
  • Polymeric films are prepared by casting the polymeric solution on a surface (casting) or by coating (coating).
  • Polymeric films have antioxidant, bactericidal and fungicidal activity.
  • Polymeric films are applied to make perishable or non-perishable food packaging.
  • Polymeric films for food packaging made from such polymeric films have antioxidant, bactericidal and fungicidal activity.
  • FIGURE 1 Infrared spectrum of ferulic acid (black) and the Mg-phen-fer complex (blue)
  • FIGURE 2 - 1 H-NMR of the Mg-phen-fer complex at 298 K in D2O blue
  • spectra of ferulic acid green
  • 1,10-phenanthroline red
  • FIGURE 3 Variable temperature 1H-NMR spectra of the Mg-phen-fer complex in D2O.
  • FIGURE 4 1H-DOSY-NMR map obtained for the Mg-phen-fer complex in D2O at 298 K (left panel) and 278 K (right panel).
  • FIGURE 5 1H-DOSY-NMR maps obtained for the Mg-phen-fer complex, at 283 K (top left side), at 293 K (top right side), at 303 K (bottom left side) and at 313 K (bottom right side).
  • FIGURE 6 ESI(+)-MS spectrum of a freshly prepared aqueous solution of the Mg-phen-fer complex.
  • FIGURE 7 - ESI(+)-MS/MS of the ion m/z 577.17 (bottom panel) and ion m/z 987.25 (top panel) in water.
  • FIGURE 9 Absorption spectra of the Mg-phen-fer complex in the pH range 3-10.
  • FIGURE 15 - DPPH radical decolorization reaction
  • FIGURE 16 - Obtaining the IC50 of DPPH radical inhibition» for the Mg-phen-fer complex (left) and for BHT (right).
  • FIGURE 17 Reaction scheme between the ABTS*+ radical and the antioxidant.
  • FIGURE 18 - Obtaining the IC50 of inhibition of the ABTS*+ radical for the Mg-phen-fer complex (left) and for BHT (right).
  • FIGURE 20 Obtaining the IC50 of peroxyl radical inhibition for the Mg-phen-fer complex.
  • FIGURE 21 Mechanism of superoxide radical formation through the Type II mechanism of photosensitized oxidation reactions, using riboflavin (structure in the middle of the cycle) as a photosensitizer.
  • FIGURE 23 RPE spectra of TEMPO generated in situ TEMPO (black, control) and T Ü2 inhibition after addition of the Mg-phen-fer complex ranging from 0.165 pg/mL to 4.95 pg/mL.
  • FIGURE 24 Irradiation with continuous light (450 nm) of an Rf solution (10 pmol/1) in different atmospheres: air, O2 and N2. Instet: absorption decay in the region between 300 nm and 550 nm. Irradiation times: 0 minutes (black), 3 min (red), 6 min (blue), 9 min (green), 12 min (purple), 15 min (yellow), 20 min (cyan).
  • FIGURE 25 Irradiation with continuous light (450 nm) of a solution of rf (10 pmol/L) and mg-phen-fer (11 pg/L) in different atmospheres: air, O2 and N2.
  • instet absorption decay in the region between 325 nm and 550 nm. Irradiation times: 0 minutes (black), 3 min (red), 6 min (blue), 9 min (green), 12 min (purple) and 15 min (yellow).
  • FIGURE 27 Infrared-ATR of starch films: control (black) and containing the Mg-phen-fer complex (red).
  • FIGURE 28 Evaluation through IV-ATR of the modification of the structure of control starch films and those containing the complexes when they are exposed to the presence and absence of air at 30 °C and 40 °C and stored in the dark.
  • FIGURE 29 Infrared-ATR of gelatin films as control (blue), and of the film containing the Mg-phen-fer complex (red).
  • FIGURE 30 Kinetic release of the Mg-phen-fer complex from starch films produced by casting over time in different food simulants.
  • FIGURE 31 Release kinetics of the Mg-phen-fer complex from gelatin films produced by casting over time in different food simulants.
  • FIGURE 32 Evaluation of the color variation of the apple when covered with a starch film containing the Mg-phen-fer complex and without film (A) and when covered only with the control film without complex and without film (B).
  • FIGURE 33 Fungicidal activity of the Mg-phen-fer complex in the range of 0.001 mg/mL to 2.0 mg/mL.
  • FIGURE 34 Fungicidal activity of ferulic acid in the range of 0.09 mg/mL to 2.10 mg/mL.
  • FIGURE 35 Inhibition of the Mg-phen-fer complex in relation to the AChE enzyme.
  • FIGURE 36 Cellular viability of cells from the human neuroblastoma lineage SH-SY5Y in the presence of the Mg-phen-fer complex.
  • FIGURE 37 Scheme showing the action of an antioxidant.
  • FIGURE 38 Schematic of the oxi-reductive process of the Mg-phen-fer complex.
  • the present invention refers to metal complex compounds, antioxidants, obtained from the formation of metal complexes that have the general formula [M(LL)(L'L'n] + , for which:
  • - LL is an antioxidant agent comprised of flavonoids; flavones; phenolic acids; hydroxycinnamic acids; catechols; catechins; quercetins; curcumins; xanthones; cytokines;
  • - L'L' is a chelating agent comprised of 1,10-phenanthroline; or 4,7-Dihydroxy-1,10-phenanthroline; or 1,10-phenanthroline-5,6-dione; or 4-Methyl-1,10-phenanthroline; or 5,6-Dimethyl-1,10-phenanthroline; or 4,7-Dichloro-1,10-phenanthroline; or 4,7-Dimethoxy-1,10-phenanthroline; or 5-Nitro-1,10-phenanthroline; or 1,10-phenanthroline-5-amine; or 2,2'- bipyridine; or 2,2'-bipyridine-3,3'-diol; or 4,4'-Dimethyl-2,2'-bipyridine; or 4,4'-Di-tert-butyl-2,2'-bipyridine; or ethylenediamine; or N,N,N',N'-Tetrakis(2-hydroxyethyl) ethylenediamine
  • the proposed invention differs from those found in the state of the art by using substances and elements essential to our organism, available and low cost, for the production, through a simple methodology, of stable complexes that, as a consequence of the synergism of the actions of its separate components have high antioxidant, antimicrobial, bactericidal activities, and also an exclusive ability to regenerate in the presence of radicals, with its action/protection against radicals being continuous and prolonged.
  • the compounds produced in this invention present advantages in relation to the prior art as they present great stability under the action of sunlight or artificial light, are convenient for transport, storage and application in different forms (solid in powder form, packaging active in polymeric films or in solution), have high reaction efficiency (yield), from 70% to 95%, when included in the concentration range of 10 ng/mL to 1 mg/mL, in inhibiting reactive oxygen species and in stabilization of riboflavin (vitamin B2) even in the absence of molecular oxygen, in addition to maintaining antioxidant activity in a CO2 atmosphere, and not have cytotoxic effects on human neuroblast cells.
  • the metal complex compounds of the General Formula mentioned above are synthesized by the process comprising the following steps: a) Mixing 1 to 5 equivalents of a magnesium salt, 0.5 to 5 equivalents of LL, 0.5 to 5 equivalents of L'L', and optionally 0.5 to 5 equivalents of triethylamine, with 15 to 1000 mL of organic solvent, forming a solution; b) Keep the solution with constant stirring and gentle heating for 1 to 4 hours or irradiate it for 10 to 25 minutes in a microwave oven with a power of 125 to 175 W, in which N2 gas is optionally provided in a controlled atmosphere or purged in the solution; c) Filter the precipitate; d) Wash the precipitate with ethanol or methanol, the ethanol or methane being preferably at a temperature of 4 °C to 15 °C; e) Dry preferably under vacuum.
  • step "a)" should preferably be carried out in a three-neck volumetric flask comprising said organic solvent.
  • the final yield of said process is between 60% and 80% when triethylamine is used, between 60% and 80% when purging and microwave application is used in step "b)", and between 70% and 90% when the aforementioned substance is not used in the synthesis route. Furthermore, it is highlighted that the aforementioned reaction that occurs in step “b) " can take place in chemical reactors without procedural changes.
  • the present invention also relates to polymeric films with a composition
  • a composition comprising: an amount of 1 ng/cm 2 to 100 mg/cm 2 of the compound, in relation to the area of the finished film, the compound as defined above; an amount of 1% to 5% (m/m), in relation to an aqueous phase (95% to 99%), of a polymeric matrix selected from biopolymers, polysaccharides and thermoplastic polymers; in which the compound is distributed throughout the matrix volume in a homogeneous manner, after processing to form the film.
  • the present invention also covers polymeric films comprising said compounds of general formula [M(LL)(L'L')n] + , preferably made with a base of biopolymers from proteins such as soy, wheat, corn, gelatin, casein; or polysaccharides such as cellulose, starch, pectin, chitosan, alginate, sugar; or lipids such as wax, triglycerides, fatty acids.
  • biopolymers are formed from tapioca starch or gelatin with the addition of a specific amount of said compound, in order to balance mechanical properties and biological properties.
  • Said films can also be made from thermoplastic polymers such as polyamides, acetals, polyethylene, polypropylene, ABS, polyphenylene oxide, polystyrene, SAN, polycarbonate, PVC, PET and PS.
  • thermoplastic polymers such as polyamides, acetals, polyethylene, polypropylene, ABS, polyphenylene oxide, polystyrene, SAN, polycarbonate, PVC, PET and PS.
  • Polymeric films are preferably applied and consolidated by the method of casting the polymeric solution on a surface (casting) or by coating (coating). These films can be used to make perishable and non-perishable food packaging due to their antioxidant, bactericidal and fungicidal properties.
  • the present invention also relates to the use of said compounds in the formation of polymeric films for preserving food and beverages, preferably those rich in riboflavin, to the use of said compounds in the preparation of an insecticide, preferably for leaf-cutter ants.
  • an insecticide preferably for leaf-cutter ants.
  • leaf-cutter ants preferably for leaf-cutter ants.
  • fungicidal and bactericidal compositions preferably against the symbiotic fungus (Leucoagaricus gongylophoru) of the leaf-cutter ant.
  • the use of the compound in the preparation of a cosmetic composition preferably aimed at anti-aging.
  • this compound as a stabilizer in insulin formulations has also been tested with promising data.
  • the preservation of foods especially those rich in riboflavin (Vitamin B2) such as meat and dairy products, presents a challenge for the food industry because riboflavin in the presence of light generates radicals such as lipid radicals and singlet oxygen that deteriorate the quality of the food. . Therefore, the use of antioxidant molecules ends up being inevitable because the generation of radicals is a problem from the moment production begins until the food is displayed on shelves in the supermarket.
  • the antioxidant molecules object of this invention can be applied to the preservation of foods, especially those rich in riboflavin.
  • the main methods of use are: (1) added directly to food and (2) supported on polymeric films. In common, both methods are capable of neutralizing riboflavin by reducing and sequestering the radicals formed by it.
  • the compounds developed here can be used to control pests, as they have insecticidal activity against leaf-cutter ants (Atta sexdens). Pest control, especially leaf-cutter ants, is especially essential in regions with a high degree of agricultural development.
  • Leaf-cutter ants build nests with millions of workers to provide organic material to their symbiotic fungus, generating agricultural and economic losses. This pest is controlled through the use of synthetic insecticides, such as sulfluramide and fipronil, which are toxic to all living organisms and continue to be used until a viable alternative is found. Several studies indicate that the toxicity of these insecticides involves toxicity to the mitochondria in order to inhibit the release of radicals from the cellular respiratory chain.
  • synthetic insecticides such as sulfluramide and fipronil
  • antioxidant molecules often also have a high tendency to be good bactericidal and fungicidal agents against the most diverse pathogens.
  • oregano and garlic oils free or incorporated into films were effective against the microorganisms S. aureus, S. enteritidis, L. monocytogenes, E. Coll and Lactobacillus plantarum.
  • the leaf-cutter ant has its symbiotic fungus, Leucoagaricus gongylophorus, as its food source, so fungicides that act against this type of fungus are also necessary.
  • antioxidant compounds of this patent present significant antioxidant activity, when comprised between a concentration of 10 ng/mL to 1 mg/mL, and are non-toxic in relation to the human neuroblastoma cell line SH-SY5Y and important enzymes of the central nervous system such as the enzyme acetylcholinesterase (AChE).
  • Anti-aging properties can, among other things, stimulate collagen synthesis.
  • insulin formulations generally contain antioxidants such as phenols and Zn (II) ions that increase the stability, solubility and absorption of insulin in the form of hexamers but which lead to slow absorption.
  • antioxidants such as phenols and Zn (II) ions that increase the stability, solubility and absorption of insulin in the form of hexamers but which lead to slow absorption.
  • Vibrational spectra in the infrared region were obtained in the solid state using a Fourier transform spectrophotometer, in the region between 4000 and 200 cm -1 .
  • the solid state samples were diluted in KBr in the proportion 1/100 (sample/KBr).
  • the 1H-NMR-DOSY map collected at 298 K shows two distinguishable diffusion coefficients (FIGURE 4, left side), however unlike the Mg-phen-iso complex, for the complex containing ferulic acid as ligand the two diffusions are close and some of them overlap.
  • ESI-QTOF-MS electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry
  • ESI-QTOF-MS electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry
  • the rapid equilibrium between the two structures may be responsible for the two different diffusions observed by DOSY, and this pattern is consistent with the equilibrium between the Mg-hex and Mg-tet complexes and may be associated with a rapid 1,10-phenanthroline ligand exchange process for the case of the Mg-phenfer complex.
  • the presence of a free phenanthroline signal at m/ z 181.08 reinforces the hypothesis of a dynamic exchange process of the 1,10-phenanthroline ligand.
  • the emission and excitation spectra were obtained using a Shimadzu model RF-5301 PC spectrofluorimeter (150W xenon high pressure lamp and an R928 type photomultiplier).
  • the solutions prepared were at a concentration of 1.0 mg of the complex in 10 mL of water, which were subsequently diluted to end up with a concentration equal to 7.5 pg/mL.
  • Meats in general, have a pH range that varies between 4.8 and 7.2. Dairy products have a pH in this range as well, as shown in TABLE 1. These two products They are especially rich in riboflavin, which makes them susceptible to the presence of free radicals. Therefore, it is important to understand the stability of the complex at different pH, so that it does not lose its characteristics under the most varied conditions. The complex proved to be stable in the pH range of these foods, where Mg-phen-fer has an ionizable hydrogen that is responsible for the antioxidant activity of the complex.
  • Cyclic voltammetry was performed with a pStat400 bipotentiostat/galvanostat.
  • the first oxidative scan shows two anodic waves at +0.40 V (Ia) and +0.58 V (lia).
  • the appearance of two anodic waves may be associated with the presence of adsorbed compound on the electrode surface.
  • the complex at other pH levels and for free ferulic acid FIGURES 12 and 13
  • the presence of two signs of oxidation is not observed, so these two processes are not related to the adsorption of the complexes, but rather two oxidations that occur a lot nearby.
  • the oxi-reductive processes of the Mg-phen-fer complex are pH dependent.
  • the processes that are most affected by pH are waves Ilia' and IIIc', where in acidic pH these processes do not appear while in basic pH they are quite evident.
  • This type of behavior is characteristic of electron transfer processes coupled with proton transfer.
  • a secondary carbocation is formed stabilized at pH 9.0 because in the process a hydroxyl associates with this cation while at pH 7.4 this path is little favored, which leads to the transient state of this process.
  • the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical assay was developed in the 1950s and was one of the first used to evaluate antioxidant capacity.
  • the DPPH radical is stable and has a delocalized electron that guarantees its purple color with maximum absorption at a wavelength of 517 nm.
  • a limitation of this method is the steric factor between DPPH and the antioxidant molecules. As the radical site is in the center of the molecule, smaller antioxidant molecules have an easier time accessing this point, resulting in greater activities when compared to larger molecules.
  • Equation 16 The IC50 value related to the percentage of inhibition of the DPPH radical was obtained by Equation 16: Eq. 16;
  • %I is percentage of inhibition
  • Ao is the absorbance of the standard sample without analyte at a wavelength of 517 nm
  • A is the absorbance of the sample with analyte at a wavelength of 517 nm.
  • BHT is considered a standard because it is one of the first antioxidants that the food industry used in addition to being an analogue of vitamin E.
  • the Mg-phen-fer complex proved to be about 1.5 times better at scavenging the DPPH radical than BHT.
  • the IC50 value of the free ligand was 31.4 ⁇ 0.82 pM, close to the value found in the literature.
  • its IC50 value is approximately 2.0 times lower than that determined for the complex, showing that the complexation of ferulic acid to Mg (II) increases antioxidant activity.
  • the ABTS -+ radical was generated from the reaction between 5.2 mL of an aqueous solution of ABTS salt with a concentration of 7 mmol/L and 92 pL of an aqueous solution of potassium persulfate (K2S2O8) of concentration equal to 140 mmol/L, then this solution was kept at rest in the dark for 16 hours to form the radical.
  • K2S2O8 potassium persulfate
  • %I is percentage of inhibition
  • Ao is the absorbance of the standard sample without analyte at a wavelength of 630 nm
  • A is the absorbance of the sample with analyte at a wavelength of 630 nm.
  • the ABTS' + radical in solution shows absorption at 660 nm, 730 nm and 820 nm.
  • the colorimetric detection method is based on the antiradical capacity of the Mg-phenfer complex to act as an antioxidant in the reduction of the ABTS*+ radical, leading to a change in the color of the solution from green to colorless, the reaction scheme is seen in FIGURE 17
  • the ABTS*+ radical scavenging reaction is accompanied by the decay of the band with a maximum at 730 nm. This band is normally selected due to the fact that the color of most antioxidants does not influence the absorbance value in this region. However, for the Mg-phenfer complex any of the other bands could be chosen since the complex does not absorb beyond 500 nm.
  • Mg-phen-fer complex proved to be about 3 times better at neutralizing the ABTS*+ radical than BHT.
  • Mg (II) is not a transition series metal, it potentiates the electron transfer between ferulic acid and the radical, since the mechanism of action is SET.
  • the antioxidant activity of free ferulic acid against the ABTS*+ radical is reported to be very weak due to the steric hindrance of the methoxyl group close to the -OH.
  • the IC50 value of the free ligand is reported in the millimolar scale, a value much higher than that determined for them after complexation.
  • the peroxyl radical (ROO*) is formed by the electrophilic addition of molecular oxygen to carbon-centered radicals, this reaction being frequently observed in the propagation stage of lipid peroxidation.
  • the half-life of this radical in biological systems is 17 s, and it can spread moderate distances.
  • 0 ROO* is a good oxidizing agent with a reduction potential equal to +1.OV (H+/ROO*), being able to abstract a hydrogen atom from other molecules with a lower standard reduction potential.
  • the peroxyl radical (ROO*) was generated by the continuous formation of this radical by thermal decomposition at 37°C for 30 minutes of AAPH. Peroxyl radical formation was monitored with the spin scavenger a-(4-pyridyl-l-oxide)-N-tert-butylnitrone (POBN). Solutions of volume of 100 pL containing: 20 pL AAPH (50 mmol/L), 20 pL POBN (50 mmol/L) and for the Mg-phen-fer complex, the concentration varied from 0.8 pg/mL to 16 pg/mL. After heating each sample for 30 minutes, it was transferred to a quartz capillary and measured from the RPE cavity. RPE spectra were recorded every 30 s.
  • ORAC oxygen radical absorbance capacity
  • the measurement conditions at the RPE were as follows: microwave frequency 9.5 GHz, modulation frequency 100 kHz, microwave power 5.0 mW, modulation amplitude 2G, scan width 200 G, time constant 0.128 s and temperature 298 K.
  • %I is percentage of inhibition
  • Ao is the intensity of the RPE spectrum of the standard sample without analyte
  • Ao is the intensity of the RPE spectrum of the sample with analyte
  • the antioxidant activity in relation to the peroxyl radical was evaluated by electron paramagnetic resonance (RPE) using the spin scavenger 4-POBN (a-(4-pyridyl-l-oxide)-N-tert-butylnitrone).
  • ROO* radicals form stable spin ducts with 4-POBN (4-POBNOOR), originating the detected signal that corresponds to three doublets.
  • the simulated RPE spectrum of the 4-POBN-OOR adduct is shown in FIGURE 19. The RPE spectrum was simulated using the EasySpin package.
  • Singlet oxygen (102) was generated by continuous irradiation of riboflavin with 420 nm light for a period of 30 min.73 The formation of singlet oxygen was monitored with the spin scavenger 2,2,6,6-tetramethyl- 4- piperidinol (TEMP). 1 mL volume solutions were prepared containing: 130 pL TEMP (1.15 mol/L), 150 pL riboflavin (3 mol/L) and for the Mg-phen-fer complex the concentration varied from 165 ng/mL up to 4 .95 pg/mL and final volume completed with PBS buffer pH 7.4. After 30 minutes of irradiation, each sample was transferred to a quartz capillary and measured from the RPE cavity. RPE spectra were recorded every 30 s.
  • TEMP spin scavenger 2,2,6,6-tetramethyl- 4- piperidinol
  • the measurement conditions at the RPE were as follows: microwave frequency 9.5 GHz, modulation frequency 100 kHz, microwave power 20 mW, modulation amplitude 2G, scan width 200 G, constant time 0.128 s and temperature 298 K.
  • %I is percentage of inhibition
  • Ao is the intensity of the RPE spectrum of the standard sample without analyte
  • Ao is the intensity of the RPE spectrum of the sample with analyte
  • 1 O 2 is not a radical, but represents an electronically excited form of molecular oxygen and is a strong oxidizing agent, capable of oxidizing biological molecules such as lipids, proteins and nucleic acids and triggering cytotoxic damage.
  • 1 O2 is highly reactive and can be formed from the energy transfer reaction of a molecule in the triplet excited state to molecular oxygen (FIGURE 21) and, in biological systems, through the disproportionation reaction of the superoxide radical.
  • the mode of action of 1 O2 differs in part from other radicals, as, depending on the substrate present, it can react with molecules containing double bonds or transferring the energy of its excited state to molecules present in the medium.
  • Singlet oxygen was generated by continuous irradiation of the mixture containing riboflavin (Rf) with a light source of wavelength close to 420 nm.
  • TEMP 2,2,6,6-tetramethylpiperidine
  • the RPE assay shown in FIGURE 23 is based on the competition between the spin trap (TEMP) and the Mg-phenfer complex for the singlet oxygen generated by riboflavin in the presence of light.
  • FIGURE 23 shows that inhibition occurs in a concentration-dependent manner with complete inhibition at a concentration of 1.65 pg/mL for complex.
  • the free ligand which exhibits a sequestration of 1 O2 at a concentration of 97 pg/mL, it is clear that when the complex is formed, this inhibition is significantly more efficient.
  • Riboflavin is a molecule whose photophysical properties are modulated by the ionic strength of the medium, pH value of the solution, aerobic and anaerobic conditions, among others.
  • the Rf electronic absorption spectrum is characterized by two absorptions at 375 nm and 450 nm, and emission arising from a singlet-singlet electronic transition with a maximum at 525 nm.
  • the photobleaching of Rf is a process that occurs markedly in an N2 atmosphere, while in an O2 and air atmosphere the photochemical process is cyclical. This occurs because the photoproducts are formed in the triplet excited state where the absence of O2 means that the intermediates formed are not deactivated.
  • the main product of photolysis is a compound called lumicrome.
  • several radicals are generated in phosphate buffer, all with short lifetimes. The presence of lumicrome is confirmed by the emission spectrum (FIGURE 24), by the appearance of a band at 450 nm concomitant with the decrease in the 525 nm band, giving rise to the emission spectrum characteristic of this molecule.
  • starch is made up of two polysaccharides: amylase and amylopectin. Starch films are easy to form and have a good protective oxygen barrier. On the other hand, due to the strong intermolecular forces, the film is brittle, requiring the addition of a plasticizer. Another issue that must be evaluated when making starch films is the ease of hydration, as starch hydrates and swells easily.
  • Gelatin is a soluble protein compound obtained by partial hydrolysis of collagen, which is the main fibrous constituent of bones, cartilage and skin. This biopolymer consists of proteins (85-92%), mineral salts and water.
  • glycerol was used as a plasticizing agent, mainly because it is authorized for use in the food industry, that is, contact between it and the food is possible. Films containing different concentrations of glycerol were made, and the ones that showed the best results were the formulations with 25% glycerol for starch and 20% glycerol for gelatin. Regarding the complexes, 10 mg of them was always used to prepare the solutions. Regardless of the biopolymer used containing or not the complexes, the films were always transparent.
  • Gelatin films containing the complexes were obtained by the casting process.
  • 0.5 g of the polymer (5% m g eiatin/m g eiatin ), 100 mg (20% m g ii C eroi/m g eiatin) of glycerol and 7 mL of water were mixed and this solution was heated and stirred until gelatinization at 90°C in a hot bath.
  • the film was dried for 16-18 hours at 23 °C inside a ventilated oven.
  • the standard films followed the same procedure, but 10 mL of water was added at once. Thickness was measured using a Mitutoyo digital micrometer.
  • the films were stored in a dissector.
  • Black body is a device to prevent light scattering.
  • FTIR Fourier transform infrared
  • FIGURE 27 shows the spectra of films made with starch containing the Mg-phen-fer complex.
  • FIGURE 28 With the addition of the complex, FIGURE 28, the stretching due to the CH2 of the starch was shifted, varying from 1335 cm -1 to 1260 cm -1 for the film with the complex. This fact is due to the interaction between the CH bonds of starch through hydrogen bonds between the hydroxyl group of ferulic acid. To understand how the complexes behave thermally in the starch film, the spectral changes that would occur when the films are placed at higher temperatures (30 °C and 40 °C) and in the presence and absence of oxygen were monitored for 144 hours. .
  • FIGURE 28 In the situations presented below, FIGURE 28, all films without or with complex presented thermal stability, as no spectral changes occurred. Furthermore, the presence or absence of oxygen does not affect the interactions formed between the starch and the complex, as it does not present significant changes between the spectra at time zero and after 144 hours.
  • gelatin films produced by casting were also characterized by IR-ATR, as shown in FIGURE 29.
  • the peak at 1550 cirr 1 is due to bending of the N- groups.
  • the peak at 1240 cirr 1 refers to the vibration of the CN and NH groups of the amide.
  • the stretching at 1041 cirr 1 is due to the interaction between glycerol and gelatin.
  • the peak at 3300 cm -1 is NH stretching.
  • TPO2 is a fundamental characteristic of flexible films with gas barrier properties, mainly related to the protection of oxygen-sensitive products.
  • TABLE 6 presents the oxygen permeability rate values for starch films produced by casting, measured at an ambient temperature of 23 °C and conditions of relative humidity equal to 40%.
  • the increase in TPO2 is due to the influence of the complex that interfered with the properties of the blend by modifying the crystallinity of the film, that is, the insertion of the complexes into the blend led to an increase in the amorphous phase and, therefore, increased the diffusion of oxygen.
  • the oxygen permeability values of gelatin films are normally lower than films made from synthetic polymers and other biopolymers, where the addition of the complexes barely changed their properties.
  • the film containing the Mg-phen-fer complex showed a delay in the browning process of the apple, with a gradual increase in it. While for the control film and without any film, they presented a high relative AE value due to rapid darkening.
  • Atta sexdens workers used in the bioassays were randomly collected in adult artificial nests.
  • the leafcutter workers were kept in Petri dishes (isolated from the anthills) at 25 ⁇ 1 °C, with daily mortality readings.
  • the ants were maintained in the laboratory on a solid diet consisting of 0.25 g of bacteriological peptone, 0.25 g of bacteriological agar, 0.025 g of yeast extract and 1.25 g of glucose, dissolved in 25 mL of distilled water.
  • Mg (II) complexes containing natural products in their coordination sphere has already been used.
  • the complex [Mg (phen)2(iso)] + (where phen is 1,10-phenanthroline and iso is isovanylic acid) was added to the diet for leaf-cutter ants, a significant increase in insecticidal activity was observed. in relation to the control and the free ligand and inhibited the growth of the symbiotic fungus.
  • Table 8 TABLE 8: Accumulated mortality and median survival
  • the bacterial strains Staphylococcus aureus, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens S8, Pseudomonas fluorescens S9 were cultivated in trypticasein soy broth (TSB) medium at 30 °C for 24 hours, while the other strains were cultivated in the same culture medium , but at 37 °C. With the microorganisms grown, they were suspended in water to be inoculated.
  • TTB trypticasein soy broth
  • TSB medium After preparing the TSB medium with 8 g/L of agar, it was sterilized at 118 °C for 20 minutes. 13 mL of the previously prepared medium was added to petri dishes and 300 pL of the bacterial suspension was inoculated. After solidification of the medium, 5 pL of solution with different concentrations of the complexes and ligand were inoculated onto the surface of the solidified medium. After 24 hours of incubation at a temperature of 30 °C or 37 °C, depending on the pathogen, it was checked whether there was bacterial growth.
  • Control cultures (negative control) were always prepared for bacteria in trypticasein soy broth medium with agar, but without the complexes and binder, only the solvent used (water).
  • Mg-phen-fer complex in general, showed activity against all bacteria within this concentration range. In this way, it was decided decrease the amount of Mg-phen-fer complex ranging from 2 mg/mL to 0.1 mg/mL in order to determine the minimum bactericidal concentration.
  • the minimum bactericidal concentration was 1 mg/mL. So that for Ps. bitch Ps. fluorine. S9 and Ps. fluorine. S8 the minimum bactericidal concentration was 1.50 mg/mL.
  • Table 10 represents the data evaluating the bactericidal activity of the Mg-phrn-fer complex in the range from 0.1 mg/mL to 5.0 mg/mL.
  • the molds were cultivated on agar medium with malt extract with the following composition: 8 g/L of agar, 20 g/L of malt extract, 2 g/L of soy peptone, 20 g/L of glucose, the pH was adjusted to pH 5.8 and the medium was sterilized at 118 °C for 20 min. Fungal cultures were incubated at 30°C for up to 14 days in this growth medium. With the microorganisms grown, they were suspended in water to be inoculated.
  • FIGURE 33 shows the variation in Mg-phen-fer concentration between 0.001 mg/mL to 2.00 mg/mL. A minimum fungicidal concentration value of 0.05 mg/mL was observed, and for concentrations greater than this value, the Mg-phen-fer complex was able to inhibit the growth of fungi, growing only in the negative control. This value is two orders of magnitude lower than that observed for bacteria, indicating that the complex has a greater potential to be a fungicide.
  • FIGURE 34 The ferulic acid ligand was tested, as shown in FIGURE 34. No antibacterial activity associated with the free ligand was observed using an amount similar to that amount of ferulic acid ligand found in the complex. Even with the increase in the concentration of the free ligand, FIGURE 31, ferulic acid was not able to inhibit the pathogens, leading to a 30% reduction in relation to the size of the negative control, in accordance with the literature where a reduction in 20%.
  • Acetylcholinesterase enzyme activity [278] Since the development of the Mg-phenfer complex aims at its application as an active compound with antioxidant properties in films, understanding whether this compound interacts with biomolecules is of fundamental importance.
  • the enzyme acetylcholinesterase (AChE) was selected as a first interaction model because this enzyme is present in living beings and acts mainly in the brain and central nervous system (CNS). This enzyme hydrolyzes acetylcholine (ACh) (neurotransmitter) into choline and acetic acid. If AChE is inhibited, it leads to an accumulation of ACh that disrupts synaptic functions by excessive stimulation of the CNS:
  • a 0.1 mg/mL stock solution was prepared by dissolving the complex in tris-HCl buffer (pH 8.0). Dilutions at a concentration of 0-20 pg/mL were used for the inhibition studies. Mixtures containing 0-50 pL of complex; 2.64 mL of a solution containing 50 mmol/L tris-HCl buffer (pH 8.0), 100 pL of 10 mmol/L 5,5'-dithio-bis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB, reagent Ellman), varying volumes of 1.38 mmol/L of acetylthiocholine iodide were incubated at room temperature.
  • reaction was started with the addition of 50 pL of enzyme solution (5.0 U/mL of AChE). Hydrolysis of the substrate can be observed by the formation of a yellow compound (5-thio-nitrobenzoate). Absorbance was measured at 412 nm. Measurements were made for 15 minutes considering the initial speed for the first 5 minutes of the reaction.
  • the human neuroblastoma line SH-SY5Y was cultivated in DMEM/DMEM-F12 culture medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium - Gibco.) supplemented with 1% Pyruvate, amino acids 100a and 10% ATB (antibiotic). During growth, the cells were kept in cultivation bottles (75 mL) at 37 °C in an oven with an atmosphere of 5% CO 2 .
  • DMEM/DMEM-F12 culture medium Dulbecco's Modified Eagle Medium - Gibco.
  • ATB antibiotic
  • the culture medium was removed from the bottle and the cells were treated with 2 mL of a 10% trypsin/EDTA solution (an enzyme that breaks covalent bonds and releases cells from bottles) and allowed to react for 2 minutes. Trypsin was neutralized using 2 mL of the culture medium and the resulting suspension was transferred to a conical tube and centrifuged at 1200 RPM (revolutions per minute) for 5 minutes. The supernatant was discarded and the cell pellet was resuspended in a new DMEM/DMEM-F12 medium. Finally, the suspension was seeded in a 96-well plate with a final concentration of 2.0xl0 4 cells/well.
  • trypsin/EDTA solution an enzyme that breaks covalent bonds and releases cells from bottles
  • the SH-SY5Y strain was treated with a serial dilution of the Mg-phen-fer complex within a concentration range of 200 - 0.39 pM.
  • the plates treated with the complex were kept in an oven at 37 °C and a 5% CO2 atmosphere for 24 hours.
  • the complex did not show significant activity against this cell lineage, that is, the Mg-phen-fer complex did not promote cell apoptosis regardless of the concentration used, and for concentrations ⁇ 56 pmol/L a cell viability was 90% and for concentrations greater than this value, cell viability was 80%.

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Abstract

A presente invenção compreende o desenvolvimento de compostos obtidos a partir da formação de complexos metálicos de magnésio com atividade antioxidante, ao processo de síntese dos compostos assim obtidos, a filmes poliméricos compreendendo os referidos compostos e seus usos. Mais especificamente, os referidos compostos apresentam a fórmula geral [M(LL)(L'L')n]+, para os quais: M é o metal Magnésio (Mg(II)); LL é um agente antioxidante; L'L' é um agente quelante, em que n = 1 ou 2. Os referidos compostos, independentemente da escolha dos agentes oxidantes e quelantes, são preparados preferencialmente pela reação equimolar entre um sal adequado de Mg(II), e os ligantes LL e L'L' na presença ou ausência de trietilamina. A presente invenção reivindica ainda o uso dos referidos compostos na formação de filmes poliméricos de origem natural para conservação de alimentos e bebidas ricos em riboflavina, o uso dos referidos compostos na preparação de um inseticida, preferencialmente para formiga cortadeira (Atta sexdens), e ainda o uso na preparação de fungicidas e bactericidas, preferencialmente contra o fungo simbionte (Leucoagaricus gongylophoru) da formiga cortadeira. Além disso, o uso do composto na preparação de uma composição cosmética, preferencialmente visando o antienvelhecimento também foram demonstradas. Por fim, o uso do referido composto como estabilizante de formulações de insulina também foi evidenciado com dados promissores.

Description

COMPOSTOS DE COMPLEXOS METÁLICOS, PROCESSO DE SÍNTESE DOS COMPOSTOS, FILMES POLIMÉRICOS COMPREENDENDO OS COMPOSTOS E
SEUS USOS
CAMPO DA INVENÇÃO
[001] A presente invenção se insere no campo dos compostos de metais alcalinos terrosos, especificamente nos compostos de magnésio, mais especificamente a compostos de complexos metálicos de magnésio com atividade antioxidante, ao processo de sintese dos compostos assim obtidos, a filmes poliméricos compreendendo os referidos compostos e seus usos na agricultura e na indústria de alimentos, de cosméticos, de saneantes e de produtos químicos e farmacêuticos.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[002] A melhoria de vida, decorrente da nossa sociedade industrial, tem levado a um crescimento populacional significativo com projeções de um aumento de 50% da população mundial para 2050. Isso exigirá o dobro da demanda de alimentos atuais e implicará em vários desafios no que se refere à manutenção da segurança alimentar, saúde humana e sustentabilidade .
[003] Frente a esse cenário, parece inevitável o aumento do uso de pesticidas (inseticidas, fungicidas, herbicidas e outros) e fertilizantes nas áreas agrícolas bem como o uso de aditivos para garantir o transporte, a conservação e aumentar o tempo de vida útil de prateleira de alimentos em geral e perecíveis, assim como produtos industrializados em geral, em todas as suas aplicações.
[004] Os radicais são definidos como espécies químicas reativas que apresentam um ou mais elétrons desemparelhados e não apresentam seletividade, podendo atacar DNA, proteínas x xxxxxxxxx xxxx xx serem associados a várias doenças como câncer e aterosclerose, processos degenerativos do sistema nervoso central como Alzheimer e ao envelhecimento.
[005] Os antioxidantes são substâncias químicas que, em baixas concentrações, quando comparadas àquela do substrato oxidável, são capazes de retardar ou prevenir a oxidação desses substratos. Os antioxidantes devem reagir rapidamente com os radicais impedindo que as moléculas sejam oxidadas (Figura 37). Quando o antioxidante se oxida torna-se um radical pois ficará com um elétron desemparelhado, contudo, essa molécula deve formar espécies estáveis para não dar continuidade na formação de radicais.
[006] As barreiras antioxidantes são divididas em defesa enzimática constituída por enzimas como superóxido dismutase, catalase e glutationa redutase e presente em organismos vivos. Há também a defesa não enzimática natural em que os antioxidantes são obtidos a partir de alimentos, como os casos dos flavonoides, ácidos fenólicos, vitaminas, entre outros.
[007] Existem, ainda, os antioxidantes sintéticos como o hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT) e gaiato de propila (PG), porém foi demonstrado que estes apresentam riscos toxicológicos e vêm sendo cada vez menos empregados. As pesquisas científicas e de mercado vêm sendo direcionadas globalmente para o uso de antioxidantes naturais ou sintéticos de baixa toxicidade.
[008] De acordo com a revisão da literatura feita por Aziz e Salwa (2016) no artigo "Natural antlmlcroblal/antloxldant agents in meat and poultry products as well as fruits and vegetables: a review" verifica-se uma grande variabilidade de agentes e antibióticos e antimicrobianos naturais utilizados em carnes, frangos, frutas e vegetais.
[009] Antioxidantes são compostos que desempenham um papel importante em retardar/prevenir a auto-oxidação, inibindo a formação de radicais livres ou interrompendo a propagação do radical livre por variados mecanismos, sendo um deles a quelação de metais (que podem levar à formação de complexos).
[010] Normalmente, os ácidos fenólicos atuam como antioxidantes, capturando os radicais livres e podem se quelar a metais. Por outro lado, os flavonoides têm a capacidade de eliminar radicais livres e quelar metais, retardando assim o processo de auto-oxidação.
[011] Conforme detalhado por Ahmad et. al. (2013), diversos estudos utilizaram compostos obtidos a partir de frutas que podem atuar como agentes redutores, terminadores de radicais livres, quelantes de metais ou inibidores de oxigênio singleto. Devido ao seu alto teor de compostos fenólicos, frutas e outros materiais vegetais são uma boa fonte de antioxidantes naturais e fornecem uma boa alternativa aos antioxidantes convencionais atualmente utilizados. Diversas frutas e seus subprodutos na forma de pós, sucos e extratos têm se mostrado potenciais fontes antioxidantes .
[012] Apesar de alguns estudos citarem o uso de algumas substâncias naturalmente antioxidantes, não foram evidenciadas a formação de complexos metálicos, visto que na grande maioria dos casos as referidas moléculas são utilizadas em sua forma livre ou quelada. [013] Contudo, as moléculas presentes relativas à defesa não enzimática natural e a defesa não enzimática sintética apresentam um grande problema na sua aplicação: não são capazes de se regenerar, fazendo assim que sua atuação/proteção contra radicais seja limitada à quantidade inicial presente no meio. ESTADO DA TÉCNICA
[014] O Estado da técnica mais próximo apresenta alternativas à adição de fertilizantes convencionais, que na sua maioria ao longo de anos de consumo acarretam problemas à saúde da população. O documento de patente CN101755649, por exemplo, revela um fertilizante constituído de uma mistura de sais de magnésio, como o sulfato de magnésio, nitrato de magnésio e outros sais de magnésio para o cultivo de maçãs.
[015] Já o documento US 10590276 ensina o uso de partículas micrométricas de carbonato de metal alcalino- terroso, que pode ser magnésio ou wollastonita ou talco ou argila em solução com dimetiletanolamina para manter o pH estável e favorecer a atividade antimicrobiana em suspensão aquosa.
[016] Uma alternativa é o uso de óleos essenciais com ação antimicrobiana, como ensinado pelo documento US 10212946, que versa sobre a atividade antimicrobiana pelo sinergismo entre óleos essenciais e N-metil-1,2- benzisotiazolina-3-one . Já o documento US 10780173 propõe o enriquecimento de extratos de plantas com alcaloides e sais para o combate às bactérias.
[017] Uma alternativa seria a incorporação de antioxidantes sintéticos como o BHA, BHT, Tocoferol (vitamina E) em embalagens poliméricas, que ajudam a manter o apelo e as qualidades saudáveis dos alimentos, retardando o ranço em gorduras, salsichas e carnes secas, além de ajudar a proteger alguns dos nutrientes naturais dos alimentos, como a vitamina A. 0 documento US 10736324 propõe o uso de sais de magnésio com atividade microbiana em filmes poliméricos, para o uso no recobrimento de líquidos.
[018] O documento US2007/0077308 refere-se à produção de microcápsulas e um processo de microencapsulação água-em- óleo-em-água por meio da polimerização in situ e interfacial da emulsão. Dentre os materiais que podem ser encapsulados nas microcápsulas tem-se: Minerais e oligoelementos, especialmente aqueles envolvidos em processos redox in vivo como selênio, zinco, magnésio; Flavonoides em geral e seus derivados, que podem ser isoflavonas, catequina e quercetina; Ácidos fenólicos em geral e derivados, podendo ser ácido ferúlico; Amidas combinadas estruturalmente compreendendo ácidos hidroxicinâmicos; Diversos agentes oxidantes.
[019] Em contrapartida, o referido documento não cita a formulação de complexos metálicos, de modo que os precursores estão inseridos na microcápsula sem tal interação quimica. Diferentemente, a formação de complexos metálicos na presente invenção demonstrou que, além da alta atividade antioxidante, a referida molécula possui uma habilidade exclusiva de se regenerar na presença de radicais, de modo a manter sua atuação/proteção contra radicais por mais tempo.
[020] O documento de patente americano US10736324 revela composições compreendendo um mineral particulado inorgânico e um metal antimicrobiano, métodos de fabricação das referidas composições, uso das referidas composições em uma composição de revestimento ou em um artigo polimérico, uso das referidas composições para inibir o crescimento de um ou mais micróbios e uso das referidas composições para eliminar um ou mais micróbios, por exemplo, de um liquido. Salienta- se que o metal antimicrobiano pode ser o magnésio. A presente invenção, por sua vez, refere-se ao uso dessas composições em artigos poliméricos, em composições de revestimento, em substratos de superfície mineralizada, em sistemas de purificação e em ração animal.
[021] Da mesma forma, apesar de o documento supracitado citar que o metal pode estar na forma de um composto, adsorvido ou não nas superficies das partículas inorgânicas, não há menção à formação de um complexo metálico, de modo que as propriedades dos referidos compostos/composições podem diferir muito. Isso se revela, principalmente, na capacidade de regeneração do complexo metálico, sendo que esta propriedade não foi citada na referida anterioridade, indicando que tal habilidade exclusiva de se regenerar na presença de radicais não está presente na referida composição .
[022] O documento de patente CN09874930 revela um tipo de composto aditivo para melhorar a carne de suino vivo, que se caracteriza por: a cada 1000 partes em relação de massa são agrupados: 150-300 partes de zinco quelado de peptideos pequenos, 50-80 partes de manganês quelado de peptideo pequeno, 100-180 partes de ferro quelado de peptideo pequeno, 20-30 partes cobre quelado de peptideo pequeno, 2-3 partes de nanoproteina selênio, 0,5-0,8 partes de picolinato de cromo, 20-40 partes de 1-carnitina, e o restante é aminosuccinato de magnésio. Apesar de não ser uma composição para aplicação em filmes etc., verifica-se a importância de tais minerais quelados no processo tanto de obtenção quanto de conservação da referida carne.
[023] Uma das possibilidades de uso dos produtos proporcionados pela presente invenção se pauta na conservação de carne, de modo que filmes poliméricos podem ser aplicados à mesma para que a atividade antioxidante seja melhorada. Novamente, ressalta-se que o referido documento não apresenta uma possibilidade de regeneração do referido composto, enquanto, na presente invenção, um filme polimérico compreendendo compostos de complexos metálicos pode ter a sua atividade antioxidante renovada por determinado intervalo de tempo, devido à habilidade exclusiva de se regenerar na presença de radicais, que vão se formando naturalmente na superfície da carne.
[024] Em suma, a combinação de diferentes tipos de moléculas ligadas a um centro metálico de Mg(II), resultou em uma molécula que apresenta uma capacidade antioxidante igual ou melhor aos produtos que já existem no mercado (ou às tecnologias já reveladas na literatura patentária e não patentária), e principalmente, possui a habilidade exclusiva de se regenerar na presença de radicais tendo sua atuação/proteção contra radicais continua e prolongada.
[025] Conforme ilustrado na FIGURA 11, para o complexo Mg-phen-fer em pH 7,4, a primeira varredura oxidativa mostra duas ondas anódicas em +0,40 V (Ia) e +0,58 V (lia). A partir do segundo ciclo, dois sinais aparecem, sendo um na varredura anódica em 0,17 V (Ilia') e um na varredura catódica em - 0,71 V(IIIc'). [026] Além disso, esses processos parecem ser dependentes um do outro, uma vez que, diminuindo a janela de varredura as ondas Ilia' e IIIc' não aparecem mais, conforme pode ser verificado na referida FIGURA 11. Em varreduras subsequentes até atingir o equilíbrio, os sinais Ia e lia têm um aumento na diferença de potencial entre eles, deslocando a corrente de potencial para 0,35 V (IVa') e 0,59 V (Va') e um processo de redução que é observado em 0,04 V (IVc').
[027] Os processos oxi-redutivos do complexo Mg-phen-fer são dependentes do pH. De modo geral os processos que são mais afetados pelo pH são as ondas Ilia' e IIIc', de modo que em pH ácido esses processos não aparecem enquanto em pH básico eles são bastante evidentes. Esse tipo de comportamento é característico de processos de transferência de elétrons acoplado com transferência de prótons. Além disso, como é sugerido na figura 38 forma-se um carbocátion secundário estabilizado em pH 9,0 pois no processo uma hidroxila se associa a esse cátion enquanto em pH 7,4 esse caminho é pouco favorecido, o que leva ao estado transitório desse processo.
[028] A coordenação do ácido ferúlico ao centro metálico Mg (II) teve um efeito significativo na estabilidade e na oxidação do grupo hidroxila. A oxidação leva a um radical fenoxila. Essa estabilização se deve à interação eletrostática entre o metal e ligante fer que o torna mais estável e passível de sofrer processos de redução enquanto isso não é observado para este ligante livre. Com base nos dados de voltametria ciclica obtidos, o processo eletroquimico associado ao complexo é sugerido conforme mostrado na figura 38.
[029] Dessa forma, os complexos de magnésio, que são os compostos objeto dessa invenção, através de um mecanismo envolvendo a transferência de elétrons e de hidrogênio, conseguem inativar os radicais livres e se regenerarem posteriormente, conforme pode ser constatado pela técnica de voltametria ciclica, que ilustra os processos de oxidação e de redução que ocorrem com essas espécies, sem que ocorra diminuição na concentração delas.
[030] Desse modo, com intuito de resolver os problemas técnicos relativos à perda de propriedades especificas para atuação/proteção contra radicais ao longo do tempo, a presente invenção surge como uma solução alternativa na obtenção de novos compostos a partir de complexos metálicos com atividade antioxidante, antimicrobiana e bactericida para aplicação na agricultura, na indústria de alimentos, de cosméticos, de saneantes e de produtos químicos e farmacêuticos, com capacidade de regeneração.
BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO
[031] De forma abrangente, a presente invenção refere- se a um PROCESSO de sintese de compostos de complexos metálicos, aos COMPOSTOS de complexos metálicos assim obtidos, a FILMES POLIMÉRICOS compreendendo os referidos compostos e seus USOS.
[032] Mais especificamente e em um primeiro aspecto, a invenção refere-se a compostos de complexos metálicos obtidos a partir da formação de complexos metálicos e apresentam a fórmula geral [M(LL)(L'L')n]+, para os quais:
- M é o metal Magnésio (Mg (II)); - LL é um agente antioxidante compreendido dentre flavonoides; ou flavonas; ou ácidos fenólicos; ou ácidos hidroxicinâmicos; ou catecóis; ou catequinas; ou quercetinas; ou curcuminas; ou xantonas; ou citocainas;
- L'L' é um agente quelante compreendido dentre 1,10- fenantrolina; ou 4,7-Dihidroxi-l,10-fenantrolina; ou 1,10- fenantrolina-5,6-diona; ou 4-Metil-l,10-fenantrolina; ou 5,6-Dimetil-l,10-fenantrolina; ou 4,7-Dicloro-l,10- fenantrolina; ou 4,7-Dimetoxi-l,10-fenantrolina; ou 5-Nitro- 1,10-fenantrolina; ou 1,10-fenantrolina-5-amina; ou 2,2'- bipiridina; ou 2,2’-bipiridina-3,3’-diol; ou 4,4'-Dimetil- 2,2’-bipiridina; ou 4,4’-Di-tert-butil-2,2’-bipiridina; ou etilenodiamina; ou N,N,N' ,N'-Tetrakis(2-hidroxietil) etilenodiamina; ou N,N,N' ,N'-Tetrakis(2-piridilmethil) etilenodiamina; em que n = 1 ou 2.
[033] Os referidos compostos, independentemente da escolha dos agentes oxidantes e quelantes, são preparados, preferencialmente, pela reação equimolar entre um sal adequado de Mg(II), e os ligantes LL e L'L' na presença ou ausência de trietilamina dependendo dos valores de pKa dos ligantes.
[034] Os compostos obtidos a partir de complexos metálicos, conforme descritos acima, apresentam atividade antioxidante, bactericida e fungicida
[035] Os compostos obtidos a partir de complexos metálicos são utilizados para a conservação de alimento perecível ou não perecível, para aplicação em produtos cosméticos que retardam a destruição da pele, para o uso como suplemento alimentar a animais e vegetais, para o aumento da estabilidade de ração animal e para o uso como fertilizantes e/ou inseticidas.
[036] Em um segundo aspecto, a presente invenção refere- se à sintese dos compostos a partir de complexos metálicos, que compreende as seguintes etapas: a. Misturar para cada 1 a 5 equivalente de um sal de magnésio; 0,5 a 5 equivalentes de LL; de 0,5 a 5 equivalentes de L'L'; e um volume de solvente orgânico equivalente de 10% a 90% do volume total do recipiente onde se realizará a reação, formando uma solução; b. Manter a solução com agitação constante e aquecimento brando de 1 a 4 horas ou irradiar a solução por 10 a 25 minutos sob micro-ondas, em que opcionalmente gás N2 é provido em atmosfera controlada ou purgado na solução; c. Separar o precipitado obtido na etapa (b), preferencialmente por filtração; d. Contatar o precipitado com pelo menos um meio para remoção de contaminantes orgânicos, preferencialmente etanol ou metanol ou uma mistura dos mesmos, o etanol ou metanol ou a referida mistura estando preferencialmente na temperatura de 4 °C a 15 °C; e. Secar preferencialmente a vácuo.
[037] Na etapa "a)" da sintese dos compostos, é adicionado, opcionalmente, trietilamina nas condições equimolares de LL e L'L'.
[038] Na etapa "b) " da sintese dos compostos, é realizado por reação em reatores químicos.
[039] Na etapa "b) " da sintese dos compostos, é realizado por reação sob micro-ondas. [040] Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se, ainda, ao USO dos referidos compostos na preparação de filmes poliméricos de origem natural para conservação de alimentos e bebidas ricos em riboflavina; ao uso dos referidos compostos na preparação de um inseticida, preferencialmente para formiga cortadeira (Atta sexdens); e ainda ao uso na preparação de fungicidas e bactericidas, preferencialmente contra o fungo simbionte (Leucoagaricus gongylophoru) da formiga cortadeira. Além disso, o uso do composto na preparação de uma composição cosmética, preferencialmente visando o antienvelhecimento também foram demonstradas. Por fim, o uso do referido composto como conservante e/ou estabilizante de formulações de insulina também foi testado com dados promissores, o que abre a perspectiva de ser utilizado em outros biofármacos baseados em proteínas (estabilizante) e moléculas em geral (conservante) .
[041] Consequentemente, em um quarto aspecto, a presente invenção refere-se aos filmes poliméricos que compreendem compostos metálicos de fórmula geral [M(LL)(L'L')n]+, para os quais;
[042] - M ser o metal Magnésio (Mg(II));
[043] - LL compreender dentre flavonoides; ou flavonas; ou ácidos fenólicos; ou ácidos hidroxicinâmicos ; ou catecóis; ou catequinas; ou quercetinas; ou curcuminas; ou xantonas; ou citocainas;
[044] - L'L' compreender dentre 1,10-fenantrolina; ou 4,7-Dihidroxi-l,10-fenantrolina; ou 1,10-fenantrolina-5,6- diona; ou 4-Metil-l,10-fenantrolina; ou 5,6-Dimetil-l,10- fenantrolina; ou 4,7-Dicloro-l, 10-fenantrolina; ou 4,7- Dimetoxi-1,10-fenantrolina; ou 5-Nitro-l,10-fenantrolina; ou 1,10-fenantrolina-5-amina; ou 2,2'-bipiridina; ou 2,2'- bipiridina-3,3’-diol; ou 4,4'-Dimetil-2,2'-bipiridina; ou 4,4’-Di-tert-butil-2,2’-bipiridina; ou etilenodiamina; ou N,N,N',N'-Tetrakis (2-hidroxietil) etilenodiamina; ou N,N,N',N'-Tetrakis (2-piridilmethil) etilenodiamina;
[045] - n = 1 ou 2, e são preparados, preferencialmente, pela reação equimolar entre um sal adequado de Mg(II), e os ligantes LL e L'L' na presença ou ausência de trietilamina dependendo dos valores de pKa dos ligantes.
[046] Os filmes poliméricos apresentam como escolha de biopolimeros provenientes de proteínas como de soja, de trigo, de milho, gelatina, caseína; de polissacarideos como celulose, amido, pectina, quitosana, alginato, açúcar; de lipídios como cera, triglicerideos, ácidos graxos.
[047] Os biopolimeros de escolha são o amido de tapioca e a gelatina.
[048] Os filmes poliméricos são preparados pelos métodos de versar a solução polimérica sobre uma superfície (casting) ou por recobrimento (coating).
[049] Os filmes poliméricos apresentam atividade antioxidante, bactericida e fungicida.
[050] Os filmes poliméricos são aplicados para a confecção de embalagens de alimentos perecíveis ou não perecíveis.
[051] Os filmes poliméricos embalagens de alimentos confeccionadas a partir de tais filmes poliméricos, apresentam atividade antioxidante, bactericida e fungicida. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[052] Para auxiliar na identificação das principais características da presente invenção, são apresentadas as figuras às quais se faz referências, conforme se segue:
[053] FIGURA 1 - Espectro de infravermelho do ácido ferúlico (preto) e do complexo Mg-phen-fer (azul)
[054] FIGURA 2 - 1H-RMN do complexo Mg-phen-fer a 298 K em D2O (azul) comparado com os espectros do ácido ferúlico (verde) e da 1,10-fenantrolina (vermelho).
[055] FIGURA 3 - Espectros de 1H-RMN de temperatura variável do complexo Mg-phen-fer em D2O.
[056] FIGURA 4 - Mapa 1H-DOSY-RMN obtido para o complexo Mg-phen-fer em D2O a 298 K (painel esquerdo) e 278 K (painel direito) .
[057] FIGURA 5 - Mapas 1H-DOSY-RMN obtidos para o complexo Mg-phen-fer, a 283 K (lado superior esquerdo), a 293 K (lado superior direito), a 303 K (lado inferior esquerdo) e a 313 K (lado inferior direito).
[058] FIGURA 6 - Espectro ESI(+)-MS de uma solução aquosa recém preparada do complexo Mg-phen-fer.
[059] FIGURA 7 - ESI(+)-MS/MS do íon m/z 577,17 (painel inferior) e íon m/z 987,25 (painel superior) em água.
[060] FIGURA 8 - Determinação colorimétrica do valor de pKa do complexo Mg-phen-fer acompanhando a absorção em À= 380 nm .
[061] FIGURA 9 - Espectros de absorção do complexo Mg- phen-fer na faixa de pH 3-10.
[062] FIGURA 10 - Espectros de emissão (ÀeXc= 310 nm) do complexo Mg-phen-fer na faixa de pH 4-11.
[063] FIGURA 11 - Voltamogramas cíclicos do ácido ferúlico em solução tamponada a pH 7,4 com KC1 0,1 M, v = 100 mv/s e na faixa de 1,0 V a -1,0 V, em uma matriz eletroquimica impressa em tela formada por uma cela eletroquímica com eletrodo de trabalho em carbono vítreo (d = 4 mm), contra eletrodo e eletrodo de referência de prata.
[064] FIGURA 12 - Voltamogramas cíclicos de ácido ferúlico em solução tamponada pH 4,0, pH 7,4 e pH 9,0 com O,1M KC1, v = 100 mV/s e na faixa de 1,0 V a -1,0 V (lado esquerdo) e de 1,0V a - 0,25 V (lado direito).
[065] FIGURA 13 - Voltamogramas cíclicos do complexo Mg- phen-fer em solução tamponada pH 4,0, pH 7,4 e pH 9,0 com 0,1m KC1, v = 100 mV/s e na faixa de 1,0 V a -1,0 V.
[066] FIGURA 14 - Voltamogramas cíclicos do complexo Mg- phen-fer em solução tamponada pH 4,0, pH 7,4 e pH 9,0 com 0,1m KC1, v = 100 mV/s e na faixa de 1,0V a -0,25V.
[067] FIGURA 15 - Reação de descoloração do radical DPPH».
[068] FIGURA 16 - Obtenção do IC50 da inibição do radical DPPH» para o complexo Mg-phen-fer (esquerda) e para o BHT (direita).
[069] FIGURA 17 - Esquema reacional entre o radical ABTS*+ e o antioxidante.
[070] FIGURA 18 - Obtenção do IC50 da inibição do radical ABTS*+ para o complexo Mg-phen-fer (esquerda) e para o BHT (direita).
[071] FIGURA 19 - Mecanismo de reação do spin trapping 4-POBN com radical peroxila (na parte superior). Espectro simulado do adutos de spin 4-POBN-OR usando um Hamiltoniano Zeeman efetivo com os seguintes parâmetros: = 15,5 G e = 2,7 G (na parte inferior).
[072] FIGURA 20 - Obtenção do IC50 da inibição do radical peroxila para o complexo Mg-phen-fer. [073] FIGURA 21 - Mecanismo formação do radical super oxido através do mecanismo Tipo II de reações de oxidações fotossensibilizadas, utilizando a riboflavina (estrutura no meio do ciclo) como fotosensibilizador.
[074] FIGURA 22 - Mecanismo de reação do spin TEMP com um oxigênio singleto (na parte superior). Espectro simulado dos adutos de spin TEMPO usando um Hamiltoniano Zeeman efetivo com os seguintes parâmetros: = 17,3 G e g = 2,0060.
[075] FIGURA 23 - Espectros de RPE do TEMPO gerado in situ TEMPO (preto, controle) e inibição do TÜ2 após adição do complexo Mg-phen-fer variando entre 0,165 pg/mL a 4,95 pg/mL.
[076] FIGURA 24 - Irradiação com luz continua (450 nm) de uma solução de Rf (10 pmol/1) em diferentes atmosferas: ar, O2 e N2. Instet: decaimento da absorção na região entre 300 nm e 550 nm. tempos de irradiação: 0 minutos (preto), 3 min (vermelho), 6 min (azul), 9 min (verde), 12 min (roxo), 15 min (amarelo), 20 min (ciano).
[077] FIGURA 25 - Irradiação com luz continua (450 nm) de uma solução de rf (10 pmol/L) e mg-phen-fer (11 pg/L) em diferentes atmosferas: ar, O2 e N2. instet: decaimento da absorção na região entre 325 nm e 550 nm. tempos de irradiação: 0 minutos (preto), 3 min (vermelho), 6 min (azul), 9 min (verde), 12 min (roxo) e 15 min (amarelo).
[078] FIGURA 26-Valores de opacidade e teste visual de transparência para os filmes de gelatina e de amido produzidos por casting.
[079] FIGURA 27 - Infravermelho-ATR dos filmes de amido: controle (preto) e contendo o complexo Mg-phen-fer (vermelho). [080] FIGURA 28 - Avaliação através de IV-ATR da modificação da estrutura dos filmes de amido controle e contendo os complexos quando são expostos a presença e ausência de ar a 30 °C e a 40°C e guardados no escuro.
[081] FIGURA 29 - Infravermelho-ATR dos filmes de gelatina sendo controle (azul), e do filme contendo o complexo Mg-phen-fer (vermelho).
[082] FIGURA 30 - Liberação cinética do complexo Mg- phen-fer a partir dos filmes de amido produzidos por casting no decorrer do tempo em diferentes simuladores alimentares.
[083] FIGURA 31 - Cinética de liberação do complexo Mg- phen-fer a partir dos filmes de gelatina produzidos por casting no decorrer do tempo em diferentes simuladores alimentares .
[084] FIGURA 32 -Avaliação da variação de coloração da maçã quando coberta com filme de amido contendo o complexo Mg-phen-fer e sem filme (A) e quando coberta apenas com o filme controle sem complexo e sem filme (B).
[085] FIGURA 33 - Atividade fungicida do complexo Mg- phen-fer na faixa de 0,001 mg/mL até 2,0 mg/mL.
[086] FIGURA 34 - Atividade fungicida do ácido ferúlico na faixa de 0,09 mg/mL até 2,10 mg/mL.
[087] FIGURA 35 - Inibição do complexo Mg-phen-fer em relação a enzima AChE.
[088] FIGURA 36 - Viabilidade celular das células da linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y na presença do complexo Mg-phen-fer.
[089] FIGURA 37 - Esquema exemplificando a atuação de um antioxidante . [090] FIGURA 38 - Esquema do processo oxi-redutivo do complexo Mg-phen-fer.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[091] Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar o escopo da mesma.
[092] A presente invenção se refere a compostos de complexos metálicos, antioxidantes, obtidos a partir da formação de complexos metálicos que apresentam a fórmula geral [M(LL)(L'L'n]+, para os quais:
- M é o metal Magnésio (Mg (II));
- LL é um agente antioxidante compreendido dentre flavonoides; flavonas; ácidos fenólicos; ácidos hidroxicinâmicos; catecóis; catequinas; quercetinas; curcuminas; xantonas; citocainas;
- L'L' é um agente quelante compreendido dentre 1,10- fenantrolina; ou 4,7-Dihidroxi-l,10-fenantrolina; ou 1,10- fenantrolina-5,6-diona; ou 4-Metil-l,10-fenantrolina; ou 5,6-Dimetil-l,10-fenantrolina; ou 4,7-Dicloro-l,10- fenantrolina; ou 4,7-Dimetoxi-l,10-fenantrolina; ou 5-Nitro- 1,10-fenantrolina; ou 1,10-fenantrolina-5-amina; ou 2,2'- bipiridina; ou 2,2’-bipiridina-3,3’-diol; ou 4,4'-Dimetil- 2,2’-bipiridina; ou 4,4’-Di-tert-butil-2,2'-bipiridina; ou etilenodiamina; ou N,N,N' ,N'-Tetrakis(2-hidroxietil) etilenodiamina; ou N,N,N' ,N'-Tetrakis(2-piridilmethil) etilenodiamina; em que n = 1 ou 2.
[093] A estrutura quimica do referido composto também pode ser representada a partir de sua fórmula estrutural, de acordo com o número de coordenação (n), de modo que a reação utilizada levou à formação de uma mistura de formas hexacoordenadas e tetracoordenadas dos complexos:
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[094] O invento proposto difere dos encontrados no estado da técnica por utilizar substâncias e elementos essenciais ao nosso organismo, disponíveis e de baixo custo, para a produção, através de metodologia simples, de complexos estáveis que, como consequência do sinergismo das ações de seus componentes separados, apresentam elevadas atividades antioxidantes, antimicrobiana, bactericida, e ainda uma habilidade exclusiva de se regenerar na presença de radicais, tendo sua atuação/proteção contra radicais continua e prolongada .
[095] Além disso, os compostos produzidos nesta invenção apresentam vantagens em relação ao estado da técnica por apresentarem grande estabilidade sob ação da luz solar ou artificial, serem convenientes para transporte, armazenamento e aplicação em diferentes formas (sólido na forma de pó, embalagem ativa em filmes poliméricos ou em solução), terem alta eficiência reacional (rendimento), de 70% a 95%, quando compreendidos na faixa de concentração de 10 ng/mL a 1 mg/mL, na inibição das espécies reativas do oxigênio e na estabilização da riboflavina (vitamina B2) mesmo na ausência de oxigênio molecular, além de manterem a atividade antioxidante em atmosfera de CO2, e não apresentarem efeitos citotóxicos para células de neuroblasto humano.
[096] Em uma das concretizações da presente invenção, os compostos de complexos metálicos da Fórmula Geral acima citada são sintetizados pelo processo que compreende as seguintes etapas: a) Misturar 1 a 5 equivalente de um sal de magnésio, 0,5 a 5 equivalentes de LL, 0,5 a 5 equivalentes de L'L', e opcionalmente 0,5 a 5 equivalentes de trietilamina, com 15 a 1000 mL de solvente orgânico, formando uma solução; b) Manter a solução com agitação constante e aquecimento brando de 1 a 4 horas ou irradiar por 10 a 25 minutos em um forno micro-ondas com potência de 125 a 175 W, em que opcionalmente gás N2 é provido em atmosfera controlada ou purgado na solução; c) Filtrar o precipitado; d) Lavar o precipitado com etanol ou metanol, o etanol ou metano estando preferencialmente na temperatura de 4 °C a 15 °C; e) Secar preferencialmente a vácuo.
[097] A mistura da etapa "a)" deve ser realizada preferencialmente em um balão volumétrico de três bocas que compreende o referido solvente orgânico.
[098] O rendimento final do referido processo está entre 60% e 80% quando se utiliza trietilamina, entre 60% e 80% quando se utiliza a purgação e aplicação de micro-ondas na etapa "b) ", e entre 70% e 90% quando não se utiliza a referida substância na rota de sintese. Além disso, salienta-se que a referida reação que ocorre na etapa "b) " pode se dar em reatores químicos sem alteração processual.
[099] A presente invenção se refere, ainda, a filmes poliméricos de composição que compreendem: uma quantidade de 1 ng/cm2 a 100 mg/cm2 do composto, em relação a área do filme pronto, o composto conforme definido acima; uma quantidade de 1% a 5% (m/m), em relação à uma fase aquosa (95% a 99%), de uma matriz polimérica selecionada dentre biopolímeros, polissacarídeos e polímeros termoplásticos; em que o composto é disposto em todo volume da matriz de maneira homogênea, após o processamento para formação do filme.
[100] A presente invenção abrange, ainda, filmes poliméricos compreendendo os referidos compostos de fórmula geral [M(LL)(L'L')n]+, feitos preferencialmente com uma base de biopolímeros provenientes de proteínas como soja, de trigo, de milho, gelatina, caseína; ou de polissacarídeos como celulose, amido, pectina, quitosana, alginato, açúcar; ou de lipídios como cera, triglicerídeos, ácidos graxos. De maneira preferencial os biopolímeros são formados a partir de amido de tapioca ou gelatina com a adição de uma quantidade específica do referido composto, de modo a equilibrar as propriedades mecânicas e as propriedades biológicas. Os referidos filmes podem ser feitos ainda a partir de polímeros termoplásticos tais como poliamidas, acetais, polietileno, polipropileno, ABS, polióxido de fenileno, poliestireno, SAN, policarbonato, PVC, PET e PS. [101] Os filmes poliméricos são preferencialmente aplicados e consolidados pelo método de versar a solução polimérica sobre uma superfície (casting) ou por recobrimento (coating). Os referidos filmes podem ser utilizados na confecção de embalagens de alimentos perecíveis e não perecíveis devido a suas propriedades antioxidante, bactericida e fungicida.
[102] A presente invenção refere-se, ainda, ao uso dos referidos compostos na formação de filmes poliméricos para conservação de alimentos e bebidas, preferencialmente os ricos em riboflavina, ao uso dos referidos compostos na preparação de um inseticida, preferencialmente para formiga cortadeira (Atta sexdens)r e ainda ao uso na preparação de composições fungicidas e bacteridas, preferencialmente contra o fungo simbionte (Leucoagaricus gongylophoru) da formiga cortadeira. Além disso, o uso do composto na preparação de uma composição cosmética, preferencialmente visando o antienvelhecimento. Por fim, o uso do referido composto como estabilizante de formulações de insulina também foi testado com dados promissores.
[103] A conservação de alimentos principalmente aqueles ricos em riboflavina (Vitamina B2) como carnes e laticínios se apresenta um desafio para a indústria de alimentos pois a riboflavina na presença de luz gera radicais como radical lipidico e oxigênio singleto que deterioram a qualidade do alimento. Dessa forma, a utilização de moléculas antioxidantes acaba sendo inevitável por ser um problema a geração de radicais desde o momento do inicio da produção até a exposição do alimento em gôndolas no supermercado. [104] As moléculas antioxidantes objetos desta invenção podem ser aplicadas na conservação de alimentos, principalmente aqueles ricos em riboflavina. Os métodos de utilização principal são: (1) adicionados diretamente ao alimento e (2) suportados em filmes poliméricos. Em comum, ambos os métodos são capazes de neutralizar a riboflavina diminuindo e sequestrando os radicais formados por ela.
[105] Além disso, os compostos aqui desenvolvidos podem ser usados no controle de pragas, visto que apresentam atividade inseticida frente a formiga cortadeira (Atta sexdens). O controle de pragas, em especial da formiga cortadeira, é especialmente fundamental em regiões com alto grau de desenvolvimento agrícola.
[106] Formigas cortadeiras constroem ninhos com milhões de operárias para fornecer material orgânico ao seu fungo simbionte gerando prejuízos a agricultura e econômicos. O controle dessa praga é feito através do uso de inseticidas sintéticos, como sulfluramida e fipronil que são tóxicos para todos serves vivos e continuam em uso até que se encontre uma alternativa viável. Vários estudos indicam que a toxicidade destes inseticidas envolve toxicidade a mitocôndria de forma a inibir a liberação de radicais a partir da cadeia respiratória celular.
[107] Ainda no campo do controle microbiológico, sabe- se que moléculas antioxidantes por muitas vezes também apresentam alta tendência em serem bons agentes bactericidas e fungicidas frente aos mais diversos patógenos. Por exemplo, óleos de orégano e alho livres ou incorporados em filmes foram eficazes contra os microrganismos S. aureus, S. enteritidis, L. monocytogenes, E. Coll e Lactobacillus plantarum. Além disso, a formiga cortadeira tem em seu fungo simbionte, Leucoagaricus gongylophorus , sua fonte de alimentação logo fungicidas que agem contra esse tipo de fungo também são necessários. A combinação de moléculas LL e L'L' na presença de um centro metálico, que formam o composto da presente invenção, apresentaram também altas atividades bactericidas e fungicidas, principalmente contra o fungo Leucoagaricus gongylophorus.
[108] No campo das composições cosméticas, mais especificamente na proteção da pele, sabe-se que a geração de radicais em excesso pela exposição ao estresse oxidativo e radiação solar são fatores que provocam danos à pele. O uso de antioxidantes como citocaina é uma estratégia que apresenta bons resultados relacionados aos efeitos fotoinduzidos de envelhecimento da pele pois estimula a geração de novas células da epiderme.
[109] A utilização de antioxidantes seletivos aos efeitos da luz solar sobre a pele de modo a minimizar os processos oxidativos com menor toxicidade é o principal alvo de investigação hoje em dia. Os compostos antioxidantes desta patente apresentam atividade antioxidante expressiva, quando compreendidos entre concentração de 10 ng/mL a 1 mg/mL, e são não tóxicos em relação à linhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y e enzimas importantes do sistema nervoso central como a enzima acetilcolinesterase (AChE). As propriedades antienvelhecimento podem, entre outras coisas, estimular a sintese de colágeno.
[110] Por fim, no campo das formulações farmacêuticas, especificamente na estabilização de formação de insulina, os referidos compostos obtidos na presente invenção também têm papel importante.
[111] 0 processo de agregação da insulina in vitro tem implicações tanto na fabricação quanto no armazenamento e aplicação terapêutica. Por isso as formulações de insulina contêm geralmente antioxidantes como fenóis e ions Zn (II) que aumentam a estabilidade, solubilidade e absorção da insulina na forma de hexâmeros mas que levam a absorção lenta.
[112] As formulações de ação rápida por outro lado têm como desvantagem a tendência a agregar. Os estudos realizados até o momento mostram que a escolha dos excipientes na formulação define a conformação preferencial e a farmacocinética com implicações na absorção e no tempo de ação da insulina (inicio, pico e término). Os compostos objetos desta patente interagem com a insulina de maneira reversível por interações não covalentes que podem proporcionar uma dissociação mais rápida para a forma monomérica ativa além de possuírem atividade anti- inflamatória e antioxidantes que aumentam a estabilidade da insulina.
[113] As formulações de ação rápida, por outro lado, têm como desvantagem a tendencia a agregar. Os estudos realizados até o momento mostram que a escolha dos excipientes na formulação define a conformação preferencial e a farmacocinética com implicações na absorção e no tempo de ação da insulina (inicio, pico e término).
[114] A caracterização dos complexos de Mg (II) obtidos pela rota sintética 1 (com trietilamina) ou 2 (sem trietilamina) contendo LL e L'L' em sua esfera de coordenação é feita por infravermelho, RMN, espectrometria de massas, e por medição de propriedades óticas e voltametria ciclica. Como esses compostos seguem o mesmo protocolo, foi selecionado, como exemplo de concretização, o complexo que contêm LL= ácido ferúlico (fer) e 1/1/= 1,10-fenantrolina (phen), denominado Mg-phen-fer, de modo a demonstrar toda a parte de caracterização e aplicação dessa nova classe compostos inorgânicos.
EXEMPLOS DE CONCRETIZAÇÃO
Caracterização do composto - Espectroscopia vibracional na região do infravermelho
[115] Os espectros vibracionais na região do infravermelho foram obtidos no estado sólido utilizando-se um espectrofotômetro com transformada de Fourier, na região compreendida entre 4000 e 200 cm-1. As amostras no estado sólido foram diluídas em KBr na proporção 1/100 (amostra/KBr) .
[116] A coordenação dos ácidos fenólicos é proposta pela desprotonação do grupo ácido carboxilico presente na estrutura das moléculas.
[117] Um primeiro indicio que o ácido fenólico se coordenou ao Mg (II) formando um complexo é avaliado por infravermelho, onde o estiramento relativo ao grupo carboxilico tem sua intensidade deslocada e diminuída. Para o complexo Mg-phen-fer, a diferença entre o complexo formado e o ligante livre é mostrada na FIGURA 1.
[118] Pode-se observar que a coordenação do ácido ferúlico ao cátion Mg (II) leva a uma supressão do estiramento da carboxila (C=O). Os estiramentos em 1690 cm-1 e 1665 cm-1 observados no ligante livre não estão mais presentes no complexo. Esta diferença indica que com a coordenação o grupo C=0 perde sua característica de dupla ligação sendo suprimido ou deslocado para menores números de onda.
Ressonância Magnética Nuclear - RMN
[119] Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear foram obtidos em um espectrômetro BRUKER DRX 400 MHz e 600 MHz. Para os experimentos de RMN foi utilizado uma concentração igual a 4 mg/mL do complexo. Para aquisição e processamento dos dados foi utilizado o software Topspin (versão 3.5 pl 7).
[120] Os espectros de 1H-RMN para o complexo Mg-phen-fer e dos ligantes fenantrolina e do ácido ferúlico em D2O são mostrados na FIGURA 2. Como é visto, a coordenação desses ligantes ao centro metálico de Mg (II) levou uma alteração nos deslocamentos químicos em relação aos ligantes livres, indicando que houve a coordenação. Além disso, o espectro do complexo Mg-phen-fer é alargado a 298 K, o alargamento dos sinais da parte correspondente ao ligante fer (6,0-7,2 ppm) e da parte do ligante phen (7,4-9,0 ppm) dificulta a quantificação exata do número de prótons presente na molécula .
[121] Nesse contexto, foram realizados experimentos de 1H-RMN variando a temperatura entre 278 K a 313 K para Mg- phen-fer, FIGURA 3. No caso do complexo Mg-phen-fer, durante o decréscimo progressivo da temperatura, no espectro de 1H- RMN, não houve uma separação dos sinais do ligante fenantrolina e continuaram alargados. Os sinais referentes ao fer com a diminuição da temperatura tiveram um alargamento no sinal. Assim, para investigar o efeito da temperatura na dinâmica de complexação do Mg-phen-fer, experimentos de RMN- DOSY foram feitos.
[122] Para obter os mapas de DOSY-RMN uma sequência de pulso com minimização de correntes parasitas, empregando um comprimento de gradiente de 1400 ps (delta), 5 ms de atraso de corrente parasita longitudinal e 200 ps do tempo de recuperação entre gradientes foram aplicados. Foi utilizado um tempo de difusão total de 60 ms (grande delta). Dezesseis amplitudes de gradiente diferentes foram usadas; portanto, a força dos gradientes foi mantida variada entre 1,07 G.cim 1 e 53,5 G.cim1. Para uma boa relação sinal-ruido, 16 varreduras foram realizadas, separadas por 3 s de retardo de reciclagem. O sinal do FID foi adquirido por meio da coleta de 32k pontos de dados.
[123] O mapa 1H-RMN-DOSY coletado a 298 K mostra dois coeficientes de difusão distinguíveis (FIGURA 4, lado esquerdo), contudo ao contrário do complexo Mg-phen-iso, para o complexo contendo o ácido ferúlico como ligante as duas difusões são próximas e parte delas sobreponiveis. A componente com sinais associados a phen exibe difusão mais rápida (D = 5,01x10-4 mm2/s) em comparação com o segundo componente, que é atribuído ao ácido ferúlico (D=4,39 xlO-4 mm2/s).
[124] Por outro lado, no mapa coletado a 278 K (FIGURA 4, lado direito), há apenas uma difusão (D= 2,23 xlO-4 mm2/s). Nessa temperatura a única difusão está associada aos sinais de ambos os ligantes, isto é, associada aos sinais alargados da phen e aos sinais do ácido isovanilico, indicando que esses dois ligantes estão complexados no mesmo centro de magnésio. [125] Em temperaturas intermediárias (283-293 K, FIGURA 5), a dinâmica de equilíbrio é muito bem observada, isto é, apenas uma difusão está presente indicando que apenas uma estrutura é a favorecida. Em temperaturas >298 K (303-313 K, FIGURA 10), acontece uma separação das difusões, provando a existência de dois componentes individuais. Em temperatura ambiente o complexo Mg-phen-fer mostra possuir um equilíbrio dinâmico entre estruturas governado pela troca rápida do ligante fenantrolina. Assim, essa hipótese sobre o comportamento em solução dos complexos foi estudada por espectrometria de massas.
Espectrometria de massas
[126] ESI-QTOF-MS (espectrometria de massa de tempo de voo de quadrupolo de ionização por eletro pulverização) foram realizadas no modo positivo em um instrumento Xevo G2 (Waters Co). Os dados de MS de varredura completa foram produzidos na faixa de massa de 50-1200 Da. Para os experimentos de MS/ MS por dissociação induzida por colisão (CID), argônio foi usado como gás de colisão e a energia de colisão foi aumentada até que fosse observada fragmentação suficiente do precursor .
[127] As amostras foram dissolvidas em metanol ou em água e introduzidas na fonte de ESI via infusão direta através de uma seringa de vidro de 250 pL e foram purgadas com >1 mL de metanol puro entre cada amostra. As condições da fonte ESI foram as seguintes: voltagem capilar 1,5 kV, voltagem do cone da amostra 30 V, fluxo do gás do cone (N2) 50 L/h, fluxo do gás de dessolvatação 750 L/h, as temperaturas da fonte e da dessolvatação foram definidas em 100 °C e 300 °C, respectivamente. Os dados foram analisados com o uso do software MassLynx 4.1.
[128] Para melhor compreender o comportamento em solução dos complexos preparados, utilizou-se da espectrometria de massas para estudar as espécies presentes em solução uma vez que os espectros de RMN eram sempre alargados o que dificultava propor uma estrutura quimica justa para os compostos. A principal dificuldade se dava pela contagem de hidrogénios pois essa era sempre a mesma independente das mudanças observadas nos espectros.
[129] 0 espectro de massas de uma solução aquosa do complexo Mg-phen-fer que é preparada e medida em sequência, mostra a presença de três sinais em m/ z 577,1738 (hexa- coordenado, [Mg (phen)2 (fer)]+, Mg-hex-fer), m/ z 397,0995 (tetra-coordenado, [ Mg(phen)(fer)]+, Mg-tet-fer), e em m/ z 987,2664 (Mg-bi-fer) (pico de baixa intensidade). Esses sinais correspondem, respectivamente, a dois complexos mononucleares e um complexo binuclear, além de um sinal correspondendo a uma fenantrolina livre em m/ z 181,0757, FIGURA 6.
[130] O padrão de fragmentação do ion de m/ z 577,17 a 35 eV mostra a perda de um ligante phen (FIGURA 7), dando origem a um complexo tetracoordenado [Mg(phen)(fer)]+ (m/ z 371,08) e indicando que a interação do Mg (II) com o ácido ferúlico é mais forte do que com phen na fase gasosa. Ao aumentar a energia de colisão para >50 eV, nenhuma perda adicional de ligante ocorre; em vez disso, foi observada a formação de fragmentos a partir da clivagem de ligações covalentes (m/ z 382,08; 336,08 e 212,05). [131] 0 espectro de MS/ MS de m/ z 987,25 (Mg-bi-fer) em 20 eV mostra um pico de base em m/ z 807,19, correspondendo à perda de um ligante phen [(Mg-bi-fer)-Iphen]+, e dois baixos picos abundantes em m/ z 577,16 e 397,10, que foram atribuídos aos ions [Mg-hex-fer]+ e [Mg-tet-fer]+, respectivamente, FIGURA 7.
[132] Deve-se notar que quando a solução é mantida no escuro por três dias, apenas dois complexos estão presentes, Mg-hex e Mg-tet, além de phen livre, indicando a característica transitória das espécies de massas alta. Em concordância, o Mg (II) forma preferencialmente complexos octaédricos, embora complexos tetraédricos também tenham sido relatados dependendo da força do ligante.
[133] Assim, a temperatura ambiente, o rápido equilíbrio entre as duas estruturas pode ser responsável pelas duas difusões diferentes observadas pelo DOSY, sendo este padrão é consistente com o equilíbrio entre os complexos Mg-hex e Mg-tet e pode ser associado a um processo rápido de troca de ligante 1,10-fenantrolina para o caso do complexo Mg-phen- fer. Além disso, a presença de um sinal de fenantrolina livre em m/ z 181,08 reforça a hipótese de um processo dinâmico de troca do ligante 1,10-fenantrolina.
[134] O pequeno tamanho do ion Mg (II) facilita a repulsão estérica entre os ligantes phen, podendo ocorrer um controle estérico entre duas unidades phen, promovendo uma interconversão entre as duas estruturas identificadas no espectro de massa o que seria o principal fator de alargamento do sinal visto no 1H-RMN. No mais, há relatos na literatura onde complexos de Cu (I) contendo ligantes phen também é observado um equilíbrio entre as estruturas de Cu (I).
[135] Assim como feito para os experimentos de 1H-RMN, a partir do complexo Mg-phen-fer determinou-se protocolo de caracterização. Dessa forma, tanto o complexo 1 e o complexo 2 tiveram o mesmo comportamento, isto é, as duas estruturas (hexacoordenada e tetracoordenada) estão presentes em solução.
Espectroscopía de absorção eletrônica na região do Ultravioleta Visível e Luminescência
[136] Os espectros de absorção eletrônica na região do UV-Vis foram obtidos com o auxílio de um espectrofotômetro de feixe simples Agilent 8453A. Celas de quartzo puro de caminho óptico de 1,0 cm e 4,0 ml de capacidade foram usadas nos experimentos. Para os estudos utilizando a espectroscopía de absorção eletrônica na região do UV-vis, as soluções preparadas eram na concentração de 1,0 mg do complexo em 10 ml de água, sendo posteriormente diluída para se ter no final uma concentração igual a 7,5 pg/ml.
[137] Os espectros de emissão e de excitação foram obtidos por meio da utilização de um espectrofluorímetro Shimadzu modelo RF-5301 PC (lâmpada de alta pressão de xenônio de 150W e uma fotomultiplicadora do tipo R928). Para os estudos utilizando luminescência, as soluções preparadas eram na concentração de 1,0 mg do complexo em 10 mL de água, sendo posteriormente diluída para se ter no final uma concentração igual a 7,5 pg/mL.
[138] As carnes, em geral, apresentam uma faixa de pH que varia entre 4,8 e 7,2. Laticínios apresentam pH nessa faixa também, como mostrado na TABELA 1. Esses dois produtos são especialmente ricos nas quantidades de riboflavina, o que os torna suscetíveis a presença de radicais livres. Assim, é importante compreender a estabilidade do complexo em diferentes pH, para que ele não perca suas características nas mais variadas condições. 0 complexo se mostrou estável na faixa de pH desses alimentos, onde o Mg-phen-fer possui um hidrogênio ionizável que é responsável pela atividade antioxidante do complexo.
Tabela 1 - Faixa de pH de carnes e laticínios
Figure imgf000035_0001
[139] A estabilidade do complexo é determinada pelo seu valor de pKa, pois este valor indica qual é a faixa de pH onde o complexo Mg-phen-fer mantem unidade estrutural. Comparando o ácido ferúlico livre com ele coordenado ao Mg(II), a primeira observação é que ele passa de dois hidrogénios ionizáveis para apenas um. Como fica evidenciado na FIGURA 8, o complexo possui apenas um ponto de inflexão na curva de Abs versus pH qual equivale a pKa = 9,0. Enquanto o ligante livre apresenta pKai= 4,27 (referente ao próton do ácido carboxilico) e pKa2= 8,9 referentes ao próton do fenol), para o pKa do grupo fenol não houve uma grande diferença entre o ligante livre e coordenado. [140] O complexo a uma concentração de 13 pg/mL foi estudado numa faixa ampla de pH variando de 2 a 12. No espectro de UV-vis observou que com o aumento do pH houve um deslocamento da absorção para maiores comprimentos de onda, FIGURA 9. Em valores de pH entre 2 e 8 a forma neutra do complexo é mantida com pequenas alterações no comprimento de onda, isto é, o complexo absorve nos comprimentos de onda de 310 nm, 290 nm e 265 nm. A partir de pH 9, processo de desprotonação do grupo hidroxila da parte fenólica se inicia e tem uma alteração da banda a partir de pH 10 onde o complexo absorve em 350 nm, como mostrado na FIGURA 9.
[141] Vale ressaltar que a absorção do complexo em pH> 10 se assemelha a absorção do ligante livre. Isso indica que para valores básicos de pH o complexo deve estar sofrendo processos de deslocação de ligantes ou está perdendo a quelação pelo grupo ácido carboxilico, ficando coordenado apenas por um oxigênio.
[142] A estabilidade do complexo em diferentes valores de pH também foi avaliada pelas propriedades luminescentes do complexo a uma concentração de 13 pg/mL. Para o intervalo 4<pH< 9 o valor máximo de emissão do complexo é de 415 nm e para pH> 9 possui emissão em 465 nm.
[143] Como visto na FIGURA 10, para uma mesma concentração até pH < 9, praticamente a intensidade e o espectro de emissão pouco se altera, o que indica que a estrutura do complexo é preservada, isto é, o ácido ferúlico coordenado está em sua forma protonada mantendo a fração molar constante. Em pHs básicos a emissão passa a ser devido a forma desprotonada, o que causa um deslocamento do valor máximo de emissão para maiores comprimentos de onda, além de alterar a intensidade relativa.
[144] De modo geral, a luminescência do Mg-phen-fer corrobora com os dados de absorção que mostra a estabilidade do complexo independente dele estar em uma solução pH<9. Além disso, pelo espectro de emissão pode-se perceber que a diferença entre HOMO e LUMO da espécie protonada ou desprotonada é consideravelmente alterada, devido a variação de 50 nm no máximo de emissão. Esses processos podem ser visualizados nas equações 8-11.
Tabela 2 - Equação de luminescência
Figure imgf000037_0001
Análise da atividade antioxidante: Voltametria cíclica
[145] A voltametria ciclica demonstrou que o complexo Mg-phen-fer é um bom antioxidante. Além disso, existem outras técnicas analíticas para avaliar a capacidade de antioxidantes em neutralizar os radicais livres in vitro e in vivo, entre elas técnicas espectrofotométricas e por ressonância paramagnética de elétrons. Esses métodos envolvem a análise dos mecanismos de ação dos antioxidantes. Assim, o complexo foi testado frente a diversos radicais e a diferentes espécies reativas de oxigênio.
[146] A voltametria ciclica foi realizada com um bipotenciostato/galvanostato pStat400. Uma matriz eletroquimica impressa em plástico formada por um eletrodo de trabalho (d = 4 mm) e contra eletrodo feito de carbono vítreo e prata como eletrodo de referência foi usada para as medições. As medições foram feitas à temperatura ambiente em água pura e em uma solução tamponada (50 mM, pH 4,5, 7,4 e 10,0) contendo 0,1 M de KC1 como eletrólito de suporte e 5 mg do composto em 1 mL de solução.
[147] A voltametria cíclica do ácido ferúlico em solução aquosa, pH 7,4, no primeiro processo oxidativo mostrou apenas um único pico anódico em 0,50 V vs Ag/ AgCl e nenhuma resposta catódica reversa, conforme FIGURA 11.
[148] A voltametria cíclica do ácido ferúlico em solução aquosa em diferentes pHs teve um deslocamento do pico anódico para menores valores, variando de 0,58 V para pH 4,0; 0,5 V para pH 7,4; e 0,34 V para pH 9,0, sendo todos potenciais em referência a Ag/AgCl, como mostrado na FIGURA 12. Esse comportamento é esperado para ácidos fenólicos, pois com o aumento de pH, há uma alteração no estado de protonação, formando um ânion qual é mais fácil (menor potencial) se ser oxidado .
[149] Conforme ilustrado na FIGURA 13, para o complexo Mg-phen-fer em pH 7,4, a primeira varredura oxidativa mostra duas ondas anódicas em +0,40 V (Ia) e +0,58 V (lia). O surgimento de duas ondas anódicas pode estar associado com a presença de composto adsorvido na superfície do eletrodo. Contudo como para o complexo nos demais pH e para o ácido ferúlico livre (FIGURAS 12 e 13) a presença de dois sinais de oxidação não é observada, assim esses dois processos não estão relacionados com adsorção dos complexos, mas sim duas oxidações que acontecem muito próximas. [150] A partir do segundo ciclo, dois sinais aparecem sendo um na varredura anódica em 0,17 V (Ilia') e um na varredura catódica em -0,71 V(IIIc'), esses sinais desaparecem após o quarto ciclo indicando a característica transitória dessa espécie, FIGURA 13. Além disso, esses processos parecem ser um dependente do outro, uma vez que diminuindo a janela de varredura as ondas IIIa' e IIIc' não aparecem mais, FIGURA 14. Em varreduras subsequentes até atingir o equilíbrio, os sinais Ia e IIa tem um aumento na diferença de potencial entre eles, deslocando a corrente de potencial para 0,35 V (IVa') e 0,59 V (Va') e um processo de redução que é observado em 0,04 V (IVc').
[151] Os voltamogramas do complexo Mg-phen-fer (FIGURAS 13 e 14) e de fer (FIGURA 12) apresentam diferenças nos valores de potencial dos processos oxi-redutivos. Entretanto deve-se notar que a diminuição da corrente é proporcionalmente maior para o ligante livre do que quando ele complexado. Este fato pode ser devido a passivação do eletrodo para o ligante. Além de ser relacionado com as espécies eletroquimicamente ativas, uma vez que o ligante coordenado ao Mg (II) apresenta uma maior estabilidade o que não diminui a corrente.
[152] Conforme mostrado na FIGURA 13 e 14, os processos oxi-redutivos do complexo Mg-phen-fer é dependente do pH. De modo geral os processos que são mais afetados pelo pH são as ondas Ilia' e IIIc', onde em pH ácido esses processos não aparecem enquanto em pH básico eles são bastante evidentes. Esse tipo de comportamento é característico de processos de transferência de elétrons acoplado com transferência de prótons. Além disso, forma-se um carbocátion secundário estabilizado em pH 9,0 pois no processo uma hidroxila se associa a esse cátion enquanto em pH 7,4 esse caminho é pouco favorecido o que leva ao estado transitório desse processo.
[153] A coordenação do ácido ferúlico ao centro metálico Mg (II) teve um efeito significativo na estabilidade na oxidação do grupo hidroxila. A oxidação leva a formação de um fenolato que pode ser mais oxidado a um radical fenoxila. Essa estabilização se deve a interação eletrostática entre o metal e ligante fer que o torna mais estável e passível de sofrer processos de redução enquanto isso não é observado para este ligante livre.
Análise da atividade antioxidante: Procedimentos colorimétricos e Ressonância paramagnética de elétrons (RPE)
[154] A atividade antioxidante do complexo frente aos radicais estáveis e espécies reativas do oxigênio foi investigada in vitro por procedimentos colorimétricos e por ressonância paramagnética de elétrons (RPE). Os experimentos de RPE foram realizados utilizando-se de um espectrômetro Varian E109 operando em banda X, frequência de 9,32 GHz, potência micro-ondas de 20 mW e amplitude de modulação de 1 mT usando uma cavidade padrão retangular.
[155] Os ensaios que utilizam radicais estáveis (DPPH* e ABTS*+) indicam a atividade antiradical do complexo Mg- phen-fer, mas não necessariamente se o complexo terá atividade antioxidante contra os radicais livres. Assim, para obter a maior quantidade de informação a respeito do mecanismo de ação do complexo como antioxidante in vitro é fundamental testá-lo frente a diferentes radicais livres, para ter uma proteção próxima ou semelhante àquela observada in vivo. 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH»)
[156] 0 ensaio com o radical 1,1-difenil-2- picrilhidrazil (DPPH») foi desenvolvido na década de 1950 e foi um dos primeiros utilizados para avaliar a capacidade antioxidante . 0 radical DPPH» é estável e possui um elétron delocalizado que garante a ele a coloração roxa com máximo de absorção no comprimento de onda de 517 nm.
[157] Uma limitação desse método é o fator estérico entre o DPPH» e as moléculas do antioxidante. Como o sitio radicalar está no centro da molécula, moléculas antioxidantes menores têm mais facilidade para acessar este ponto, resultando em maiores atividades quando comparadas a moléculas maiores.
[158] Devido a esse fato, a solução reacional entre o complexo Mg-phen-fer e o DPPH» deve ficar mantida no escuro um determinado tempo para garantir que o processo ocorrerá. Contudo é um método simples, preciso e reprodutível. O mecanismo de ação dos antioxidantes frente ao radical DPPH» pode acontecer tanto por HAT (EQUAÇÃO) quanto por SET-PT (EQUAÇÕES 12-15):
Tabela 3 - Mecanismo de ação dos antioxidantes frente ao radical DPPH.
Figure imgf000041_0001
[159] Foram preparadas soluções estoque do radical DPPH» na concentração de 1,2 mmol/L em metanol, do complexo na concentração 1 mg/mL em água e do padrão BHT na concentração de 1,52 mmol/L em metanol. Em seguida variados volumes de complexo e BHT são adicionados em eppendorfs para variar a concentração, sendo adicionado metanol na sequência e por último um volume fixo 150 pL de DPPH» para todas as amostras. No final cada solução continha um volume final de 2 mL. A solução reação foi agitada em vórtex por 30 segundos e deixada no escuro por 1 hora. Após esse tempo, foram feitos espectros de UV-vis de cada amostra e acompanhou o decréscimo da banda em 517 nm.
[160] O valor de IC50 relacionado com a porcentagem de inibição do radical DPPH» foi obtido pela Equação 16: Eq. 16;
Figure imgf000042_0001
Onde: %I é porcentagem de inibição, Ao é a absorbância da amostra padrão sem analito no comprimento de onda de 517 nm, A é a absorbância da amostra com analito no comprimento de onda de 517 nm.
[161] A reação de neutralização do radical DPPH» pelo complexo Mg-phen-fer foi detectada por espectrometria de UV- Vis, monitorando o decréscimo da banda de absorção do DPPH» no comprimento de onda de 517 nm. Descoloração se dá através da reação de redução do radical DPPH» a uma hidrazina, alterando a coloração da solução de roxo para amarelo (FIGURA 15).
[162] Como o complexo é solúvel apenas em água, o uso de solução do complexo foi sempre mantido constante e de maneira minima pois a presença de água pode favorecer a agregação, sendo que até a proporção de 1:1 (etanol:água) não resulta em problemas de agregação.
[163] A atividade antirradical do complexo Mg-phen-fer foi comparada ao padrão BHT e ao ácido ferúlico livre. O BHT é tido como um padrão pois ele é um dos primeiros antioxidantes que a indústria alimenticia utilizou além de ser um análogo a vitamina E.
[164] 0 complexo Mg-phen-fer apresentou um valor de ICso= 15,6 ± 1,2 pM considerando a estrutura hexacoordenada, FIGURA 16. Essa consideração foi feita para que pudesse comparar com o padrão. Enquanto o BHT apresentou ICso= 26,7 ± 0,5 pM, FIGURA 16. Vale ressaltar que o valor de IC50 observado para o BHT é comparável a valores encontrados na literatura.
[165] O complexo Mg-phen-fer se mostrou cerca de 1,5 vezes melhor no sequestro do radical DPPH» do que o BHT. O valor de IC50 do ligante livre foi de 31,4 ± 0,82 pM próximo ao valor encontrado na literatura. Ao comparar o complexo com o ligante fer, tem-se que um valor do IC50 deste é cerca de 2,0 vezes inferior ao determinado para o complexo, mostrando que a complexação do ácido ferúlico ao Mg (II) aumenta a atividade antioxidante.
[166] Como todos os compostos testados (complexo, BHT e fer) possuem hidrogénios ionizáveis em suas estruturas moleculares, o modo de ação contra o radical DPPH» é possivelmente através do mecanismo SPLET. Há uma primeira etapa na qual acontece um equilíbrio quimico em solução. [056] A coordenação do ácido ferúlico ao Mg (II) deixou a ligação -OH do fenol mais polarizada o que aumenta a atividade antioxidante do complexo.
[167] Além disso, na literatura há diversos casos em que a coordenação de produtos naturais a diferentes centros metálicos como Mg (II), Cu (II) e Ce (IV) também tiveram o mesmo efeito aqui observado, a coordenação potencializou a atividade antioxidante em relação ao ligante livre e ao padrão. .,2.'-Azino-bis(3-ethilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico (ABTS*+)
[168] 0 radical ABTS-+ foi gerado a partir da reação entre 5,2 mL de uma solução aquosa o sal de ABTS com concentração de 7 mmol/L e 92 pL de uma solução aquosa de perssulfato de potássio (K2S2O8) de concentração igual a 140 mmol/L, em seguida, essa solução foi mantida em repouso no escuro por 16 horas para formação do radical.
[169] Variados volumes de complexo e BHT são adicionados em eppendorfs para variar a concentração, sendo adicionado água na sequência e por último um volume fixo 30 pL de da solução do radical ABTS-+ para todas as amostras. No final cada solução continha um volume final de 2 mL. A solução reação deixada no escuro por 10 minutos. Após esse tempo, foram feitos espectros de UV-vis de cada amostra e acompanhou o decréscimo da banda em 630 nm.
[170] O valor de IC50 relacionado com a porcentagem de inibição do radical ABTS-+ foi obtido pela equação 17:
Figure imgf000044_0001
Onde: %I é porcentagem de inibição, Ao é a absorbância da amostra padrão sem analito no comprimento de onda de 630 nm, A é a absorbância da amostra com analito no comprimento de onda de 630 nm.
[171] A oxidação do ABTS (2,2'-Azino-bis(3- ethilbenzotiazolina- 6-ácido sulfônico) pelo oxidante perssulfato de potássio (K2S2O8) após 12 horas de incubação levou a formação do radical ABTS-+. O radical ABTS-+ é estável e possui coloração verde, podendo ser detectado por espectrofotometria . Nesse método o radical ABTS-+ é reduzido pela transferência de um elétron do antioxidante, sendo um método baseado em SET. Esse método é simples, apresenta boa sensibilidade de detecção e é reprodutivo. Uma das principais vantagens é que pode ser aplicado a soluções aquosas com diferentes pH.
[172] 0 radical ABTS'+ em solução apresenta absorção em 660 nm, 730 nm e 820 nm. O método por detecção colorimétrica se baseia na capacidade antiradicalar do complexo Mg-phen- fer em atuar como um antioxidante na redução do radical ABTS*+, levando a mudança da coloração da solução de verde para incolor, esquema de reações é visto na FIGURA 17. A reação de sequestro do radical ABTS*+ é acompanhada pelo decaimento da banda com máximo em 730 nm. Essa banda é normalmente selecionada devido ao fato que a coloração da maior parte dos antioxidantes não influencia no valor de absorbância nesta região. Contudo para o complexo Mg-phen- fer poderia ser escolhido quaisquer das outras bandas uma vez que o complexo não absorve além de 500 nm.
[173] O complexo Mg-phen-fer apresentou um valor de IC50 = 5,44 ± 0,52 pM considerando a estrutura hexacoordenada, FIGURA 18. Essa consideração foi feita para que pudesse comparar com o padrão. Enquanto o BHT apresentou ICso= 16,75 ± 0,67 pM, FIGURA 18. Vale ressaltar que o valor de IC50 observado para o BHT é comparável a valores encontrados na literatura .
[174] O complexo Mg-phen-fer se mostrou cerca de 3 vezes melhor na neutralização do radical ABTS*+ do que o BHT. Embora o Mg (II) não sendo um metal das séries de transição, ele potencializou a transferência de elétron entre o ácido ferúlico e o radical, uma vez que o mecanismo de ação é o SET. [175] A atividade antioxidante do ácido ferúlico livre frente ao radical ABTS*+ é reportado como muito fraca devido ao impedimento estérico do grupo metoxila próximo ao -OH. 0 valor de IC50 do ligante livre é reportado na escala de milimolar, valor muito superior ao determinado para eles após a complexação.
[176] Além disso, na literatura há diversos casos em que a coordenação de produtos naturais a diferentes centros metálicos como Oxovanádio (IV) e Mn (II) também tiveram o mesmo efeito aqui observado, a coordenação potencializou a atividade antioxidante em relação ao ligante livre e ao padrão.
Radical Peroxila (ROO*)
[177] 0 radical peroxila (ROO*) é formado pela adição eletrofilica do oxigênio molecular em radicais centrados no carbono, sendo esta reação frequentemente observada no estágio de propagação da peroxidação lipidica. 0 tempo de meia vida desse radical em sistemas biológicos é de 17 s, podendo difundir distâncias moderadas. 0 ROO* é um bom agente oxidante com potencial de redução igual a +1,OV (H+/ROO*), podendo abstrair um átomo de hidrogênio de outras moléculas com menor potencial padrão de redução. Assim, a atuação do antioxidante no método ORAC ocorre pelo processo de HAT.
[178] No teste de concretização da invenção, o radical peroxila (ROO*) foi gerado pela formação continua desse radical pela decomposição térmica a 37°C por 30 minutos do AAPH. A formação do radical peroxila foi monitorada com o sequestrador de spin a- (4-piridil-l-óxido)-N-terc- butilnitrona (POBN). Foram preparadas soluções de volume de 100 pL contendo: 20 pL AAPH (50 mmol/L), 20 pL POBN (50 mmol/L) e para o complexo Mg-phen-fer variou a concentração de 0,8 pg/mL até 16 pg/mL. Após a 30 minutos de aquecimento de cada amostra, foi transferida para um capilar de quartzo e medido da cavidade do RPE. Os espectros de RPE foram gravados a cada 30 s.
[179] O método para determinar a atividade antioxidante contra o ROO* chama-se ORAC (oxygen radical absorbance capacity). Esse método é um bom modelo que mimetiza as reações entre antioxidantes e lipídios em sistemas alimentícios e biológicos por ser uma fonte continua de produção do radical ROO*. Neste ensaio, o radical peroxila foi gerado pela reação térmica a 37 °C entre o AAPH (2-2'- azobis- (2-amidinopropano)-dihidrocloreto) e o O2 atmosférico, em tampão fosfato pH=7,4.
[180] As condições das medições no RPE foram as seguintes: frequência de micro-ondas 9,5 GHz, frequência de modulação 100 kHz, potência de micro-ondas 5,0 mW, amplitude de modulação 2G, largura de varredura 200 G, constante de tempo 0,128 s e temperatura 298 K.
[181] O valor de IC50 relacionado com a porcentagem de inibição do oxigênio singleto foi obtido pela equação 18:
Figure imgf000047_0001
Onde: %I é porcentagem de inibição, Ao é a intensidade do espectro de RPE da amostra padrão sem analito, Ao é a intensidade do espectro de RPE da amostra com analito.
[182] A atividade antioxidante em relação ao radical peroxila foi avaliada por ressonância paramagnética de elétrons (RPE) utilizando o sequestrador de spin 4-POBN (a- (4-piridil-l-óxido)-N-tert-butilnitrona). Os radicais ROO* formam dutos de spin estáveis com o 4-POBN (4-POBNOOR), originando o sinal detectado que corresponde a três dubletos. Os parâmetros de acoplamento de hiperfinas do aduto formado são aN= 15,5 G e an= 2,7 G. 0 espectro de RPE simulado do aduto 4-POBN-OOR está mostrado na FIGURA 19. 0 espectro de RPE foi simulado utilizando o pacote EasySpin.
[183] 0 complexo Mg-phen-fer apresentou um valor de ICso= 5,44 ± 1,23 pg/mL, FIGURA 20. Comparando esse valor com o ácido ferúlico livre, vê-se que o complexo foi superior na neutralização do radical peroxila, o ligante livre apresenta inibição a esse radical a concentrações > 9,7 pg/mL.
[184] Analisando os três métodos empregados, conta que o complexo foi testado frente aos três mecanismos de ação que um antioxidante pode ter. Ao comparar os valores de IC50 do complexo Mg-phen-fer com o ácido ferúlico livre, tem-se que estes são parecidos para o radical ROO», contrastando com os valores obtidos para os radicais DPPH» e ABTS*+.
[185] Deste modo, comparando-se os três ensaios é possível sugerir que a coordenação do ácido ferúlico ao centro metálico modificou mais os processos relacionados à transferência de elétrons do que o processo de transferência de átomo de hidrogênio. Fato que está de acordo com a voltametria ciclica que mostra uma grande diferença nos processos que envolvem elétrons entre o fer e o Mg-phen-fer. Estabilização da ríboflavína
Oxigênio Singleto
[186] O oxigênio singleto (102) foi gerado pela irradiação continua da riboflavina com luz de 420 nm pelo periodo de 30 min.73 A formação de oxigênio singleto foi monitorada com o sequestrador de spin 2,2,6,6-tetrametil-4- piperidinol (TEMP). Foram preparadas soluções de volume de 1 mL contendo: 130 pL TEMP (1,15 mol/L), 150 pL riboflavina (3 mol/L) e para o complexo Mg-phen-fer variou a concentração de 165 ng/mL até 4,95 pg/mL e volume final completado com tampão PBS pH 7,4. Após a 30 minutos irradiação de cada amostra, foi transferido para um capilar de quartzo e medido da cavidade do RPE. Os espectros de RPE foram gravados a cada 30 s.
[187] As condições das medições no RPE foram as seguintes: frequência de micro-ondas 9,5 GHz, frequência de modulação 100 kHz, potência de micro-ondas 20 mW, amplitude de modulação 2G, largura de varredura 200 G, constante de tempo 0,128 s e temperatura 298 K.
[188] O valor de IC50 relacionado com a porcentagem de inibição do oxigênio singleto foi obtido pela equação 19:
Figure imgf000049_0001
Onde: %I é porcentagem de inibição, Ao é a intensidade do espectro de RPE da amostra padrão sem analito, Ao é a intensidade do espectro de RPE da amostra com analito.
[189] O 1O2 não é um radical, mas representa uma forma eletronicamente excitada do oxigênio molecular e é um agente oxidante forte, sendo capaz de oxidar moléculas biológicas como lipídeos, proteínas e ácidos nucleicos e desencadear danos citotóxicos. O 1O2 é altamente reativo e pode ser formado a partir da reação de transferência de energia de uma molécula no estado excitado tripleto para o oxigênio molecular (FIGURA 21) e, em sistemas biológicos, através da reação de desproporcionamento do radical superóxido. [190] O modo de ação do 1O2 se diferencia em parte dos demais radicais, pois, dependendo do substrato presente, pode reagir com moléculas contendo ligações duplas ou transferindo a energia de seu estado excitado para moléculas presentes no meio. O oxigênio singleto foi gerado pela irradiação continua da mistura que continha riboflavina (Rf) com uma fonte de luz de comprimento de onda próximo a 420 nm.
[191] O oxigênio singleto foi detectado através do sequestro desse radical com sequestrador de spin 2,2,6,6- tetrametilpiperidina (TEMP). O TEMP não apresenta sinal no RPE (spin silencioso), ao reagir com o 1O2 que não foi sequestrado pelo complexo Mg-phen-fer forma o aduto de spin TEMPO que é estável.
[192] O sinal detectado no espectro de RPE do aduto formado, tem como característica um sinal de tripleto com razão entre os picos de 1:1:1 e constante de acoplamento de hiperfina igual a = 17.3 G e g= 2.0060, como mostrado no espectro de RPE simulado nas FIGURAS 22 E 23.
[193] O ensaio de RPE mostrados na FIGURA 23 se baseia na competição entre o spin trap (TEMP) e o complexo Mg-phen- fer pelo oxigênio singleto gerado pela riboflavina na presença de luz. A FIGURA 23 mostra que a inibição ocorre de maneira dependente da concentração com inibição total a uma concentração de 1,65 pg/mL para complexo. Ao comparar com o ligante livre qual exibe um sequestro de 1O2 a uma concentração de 97 pg/mL, tem-se que quando o complexo é formado essa inibição é expressivamente mais eficiente. Ensaios de variação de pH e atmosfera utilizando riboflavina [194] A riboflavina (Rf) é uma molécula que tem suas propriedades fotofísicas moduladas pela força iônica do meio, valor de pH da solução, condições aeróbicas e anaeróbicas, entre outros. A Rf apresenta pKai= 1,7 e pKa2=10,2, assim a fotodescoloração da Rf é um processo que depende do estado aniônico ou não dessa molécula. 0 espectro de absorção eletrônica da Rf é caracterizado por duas absorções em 375 nm e 450 nm, e emissão proveniente de uma transição eletrônica singleto-singleto com máximo em 525 nm.
[195] Primeiramente, fez-se uma solução saturada de riboflavina (Rf) em tampão fosfato 7,4 e filtrou para retirar o sólido não dissolvido. Adicionou-se 170 pL da solução de Rf em 3 mL de solução de pH 3,0 obtendo-se uma concentração final da Rf igual a 9,5 pmol/L (A450nm= 0,1). Essa solução foi irradia (ÀIRR = 450 nm) de 3 em 3 minutos por 15 minutos e as mudanças foram acompanhadas por UV-vis e por luminescência (ÀEXC = 375 nm). As atmosferas utilizadas foram ar, O2 e N2. O mesmo procedimento foi realizado para soluções de pH 7,4 e pH 10,0.
[196] Fez-se uma solução saturada de riboflavina (Rf) em tampão fosfato 7,4 e filtrou para retirar o sólido não dissolvido. Preparou uma solução concentrada de complexo de concentração inicial de Img/mL em tampão pH 7,4. Em uma cubeta, adicionou-se 170 pL da solução de Rf (A450nm= 0,1), variou a concentração de complexo de 4, 7, 9, 11, 13 e 15 pg/mL e completou com tampão pH 7,4 para no final obter um volume final de 3mL. Cada solução foi irradia (ÀIRR = 450 nm) de 3 em 3 minutos por 15 minutos e as mudanças foram acompanhadas por UV-vis e por luminescência (ÀEXC = 375 nm). As atmosferas utilizadas foram ar, O2 e N2. [197] Como mostrado na FIGURA 24, a fotodescoloração da Rf é um processo que ocorre de maneira acentuada em atmosfera de N2enquanto em atmosfera de O2 e ar o processo fotoquimico é cíclico. Isto ocorre pois os fotoprodutos são formados no estado tripleto excitado onde a ausência de O2 faz com que os intermediários formados não sejam desativados. Como mostrado no espectro de UV-vís o principal produto da fotólise é um composto denominado lumicromo. Além dessa molécula, vários radicais são gerados em tampão fosfato todos com tempo de vida curtos. A presença de lumicromo é confirmada pelo espectro de emissão (FIGURA 24), pelo surgimento de uma banda em 450 nm concomitante com a diminuição da banda de 525 nm, dando origem ao espectro de emissão característico dessa molécula.
[198] Uma das técnicas mais utilizadas hoje em dia para a proteção de carnes são embalagens de atmosfera modificada onde se faz uma mistura de gases como CO, O2 e N2 sendo sempre majoritário em gases neutros. Logo, nesse tipo de embalagem de carne, o excesso de N2 pode causar degradação da riboflavina gerando mais radicais o que diminui o tempo de prateleira do alimento bem como acelera as mudanças organolépticas da carne.
[199] Uma vez que se determinou o comportamento da Rf em solução, decidiu-se analisar qual seria o comportamento da mesma na presença do complexo em diferentes concentrações e atmosferas. De modo geral o complexo Mg-phen-fer foi capaz de atuar com efeito protetivo da Rf em atmosfera de N2, onde a velocidade de formação do lumicromo diminuiu drasticamente. Como mostrado na FIGURA 25, em atmosfera de N2 na presença de 11 pg/mL do complexo a riboflavina foi estabilizada levando a uma menor fotodegradação.
[200] Como mostrado na FIGURA 22 e TABELA 4 a presença do complexo Mg-phen-fer alterou a velocidade de degradação. De maneira geral, com o aumento da concentração do complexo para atmosfera de N2, menor foi o processo de foto- embranquecimento . Em relação as constantes de velocidade, uma concentração de 11 pg/mL de complexo diminuiu em três vezes a constante em relação àquela sem complexo.
[201] Em ar, da menor concentração até a maior (4 e 15 pg/mL, respectivamente) não houve alteração aparente nos espectros de UV-vis e nem na emissão, de modo que não foi possível obter um valor de kobs pois não se observou nenhuma fotodegradação . De modo semelhante, em O2 na presença do complexo nenhuma alteração é observada.
Tabela 4 - Constantes de velocidade de primeira ordem (kobs) para a fotodescoloração da rf em condição anaeróbico com diferentes concentrações de complexo em tampão fosfato pH 7,4
Figure imgf000053_0001
[202] A partir desses dados fica evidenciado que o complexo Mg-phen-fer foi eficaz em atuar na riboflavina protegendo-a contra a degradação. A principal possibilidade de atuação do complexo é que este foi capaz de desativar o estado singleto excitado da Rf não permitindo que atingisse o tripleto, logo não permitiu a formação de radicais e lumicromo em excesso. Isso se deve ao fato que o complexo possui estado fundamental e excitado singleto uma vez que tanto o metal Mg (II) (por ser pequeno e camada de valência completa) e o ligante ácido ferúlico não atingem o tripleto. Ensaios: uso dos compostos suportados em matrizes poliméricas
[203] Por não apresentarem efeitos citotóxicos para células de seres humano, bem como apresentarem um grau de estabilidade seguro e serem eficientes na inibição das espécies reativas de oxigênio, os compostos de Fórmula Geral ensinados nesta invenção, reúnem as características primordiais para serem incorporados em filmes poliméricos para aplicação em embalagens de alimentos.
[204] Entre os materiais para confecção de filmes poliméricos para aplicação em embalagens a escolha por biopolimeros provenientes de açúcares, amidos, proteínas, lipídios são as mais difundidas. Os solventes escolhidos devem ser biocompativeis e de baixa toxidade para o contato alimentar, como é o caso de água e alguns álcoois. E por último, os aditivos, são substâncias adicionadas à mistura (blenda), a fim de melhorar as propriedades do filme como maleabilidade e diminuir processos de inchaço do filme pelo contato com o alimento.
[205] Para a sintese de filmes poliméricos foram selecionados os biopolimeros, amido de tapioca e gelatina e os métodos de casting e coating para a confecção dos filmes. [206] O amido é constituído por dois polissacarídeos: a amilase e amilopectina. Os filmes de amido são de fácil formação e possuem uma boa barreira de proteção para oxigênio. Por outro lado, devido as forças intermoleculares serem fortes o filme é quebradiço sendo necessário a adição de um plastificador. Outra questão que deve ser avaliada na confecção em filmes de amido é a facilidade de hidratação, já que o amido se hidrata e incha facilmente.
[207] A gelatina é um composto proteico solúvel obtido por hidrólise parcial de colágeno, que é o principal constituinte fibroso de ossos, cartilagens e peles. Esse biopolímero consiste em proteínas (85-92%), sais minerais e água.
[208] Para os dois biopolímeros, foi usado glicerol como agente plastificador, principalmente por possuir uso autorizado para aplicações na indústria alimentícia, ou seja, é possível o contato entre este e o alimento. Filmes contendo diferentes concentrações de glicerol foram feitos, sendo os que melhor mostraram resultados foram as formulações de 25% glicerol para o amido e de 20% glicerol para a gelatina. Em relação aos complexos, foi sempre utilizado 10 mg dos mesmos para preparar as soluções. Independente do biopolímero utilizado contendo ou não os complexos, os filmes foram sempre transparentes.
Síntese dos filmes de polímeros para aplicação em embalagens - Casting
[209] Os filmes de amido de tapioca contendo os complexos foram obtidos pelo processo de casting. 1 g do polímero (5% mamido/mSoivente), 250 mg (25% rngiiceroi/rnamido) de glicerol e 15 mL de água foram misturados, essa solução foi aquecida e agitada até a gelatinização à 75 °C em um banho quente. Em 5 mL de água foi adicionado 10 mg de complexo até total solubilização, essa solução foi então adicionada à solução polimérica formando a blenda final. Então essa blenda foi vertida em placa de petri plástica de área igual a 56,75 cm2 (0 = 8,5 cm). O filme foi seco por 24-27 horas em 37 °C e 60% de umidade relativa dentro de uma estufa com ventilação. Os filmes padrão seguiram o mesmo procedimento, porém os 20 mL de água foram adicionados de uma vez. A espessura foi medida usando um micrometre digital Mitutoyo. Os filmes foram guardados em dissecador.
[210] Os filmes de gelatina contendo os complexos foram obtidos pelo processo de casting. 0,5 g do polímero (5% mgeiatina/mSoivente), 100 mg (20% mgiiCeroi/mgeiatina) de glicerol e 7 mL de água foram misturados e essa solução foi aquecida e agitada até a gelatinização à 90°C em um banho quente. Em uma solução de 3 mL de água foi adicionado 10 mg de complexo até total solubilização, essa solução foi então adicionada à solução polimérica formando a blenda final. Então essa blenda foi vertida em placa de petri plástica de área igual a 56,75 cm2 (0 = 8,5 cm). O filme foi seco por 16-18 horas em 23 °C dentro de uma estufa com ventilação. Os filmes padrão seguiram o mesmo procedimento, porém os 10 mL de água foram adicionados de uma vez. A espessura foi medida usando um micrometre digital Mitutoyo. Os filmes foram guardados em dissecador .
Sintese dos filmes de polimeros para aplicação em embalagens - Coating
[211] Em relação ao coating, foi preparada a mesma solução do biopolimero de amido de tapioca e parte dessa solução é versada sobre PET-12 previamente tratado com tratamento corona. 0 tratamento corona é uma técnica de modificação da superfície que utiliza um plasma de descarga de corona a baixa temperatura para transmitir alterações nas propriedades de uma superfície, como criar diferentes cargas elétricas e formação de grupos funcionais. No caso deste trabalho, era usado aquele que continua ozônio como indutor de plasma. 0 filme foi deixado secando por três dias em temperatura ambiente. Os filmes contendo coating de solução de amido foram preparados com a deposição de uma monocamada desta solução sobre um filme plástico de PET-12 previamente tratado com corona sendo feito 18 corridas do tratamento e o filme foi deixado 3 dias em temperatura ambiente para secagem Caracterização dos filmes obtidos Massa seca e atividade da água (aw)
[212] A quantidade de água associada aos filmes de amido e de gelatina preparados por casting foi avaliado. Observou- se uma variação de massa de 12% para o filme de amido e 9% para os filmes de gelatina. Os valores obtidos estão de acordo com valores encontrados na literatura. Para o armazenamento correto de filmes, é desejável que estes possuam atividade da água (aw) abaixo de 60% para não favorecer crescimento de microrganismos como fungos. Os filmes de amido sem e com os complexos de Mg (II) apresentarem valores de atividade da água próximos a 40% e os filmes de gelatina, valores menores de 20%. Dessa forma, ambas as formulações se mostraram boas do ponto de vista prático, isto é, o armazenamento destes filmes com os complexos em lugares secos dificilmente propiciaria o crescimento de microrganismos indesejáveis, como fungos e leveduras. Opacidade e Transparência
[213] As medidas de transmitância da difusão óptica e a transparência foram realizadas com o espectrofotômetro UV- vis Lambda 650 (PerkínElmer) equipado com uma esfera integrativa de 150 mm. Para cada formulação dos filmes preparados foram medidos os valores de transmitância: Tl, T2, T3 e T4 (TABELA 5) os quais foram usados para definir o valor final de transparência-opacidade:
TABELA 5: Significado dos termos Tl, T2, T3 e T4 para o cálculo de opacidade dos filmes.
Figure imgf000058_0001
1Corpo negro é um dispositivo para evitar dispersão de luz.
[214] Em todos os casos, os filmes ficaram transparentes e não afetam a visualização de produtos através deles.
[215] Em relação aos filmes de gelatina, como mostrado na FIGURA 26, estes possuem o menor de grau de opacidade, sendo mais transparentes. Com a adição do complexo, o filme de gelatina apresentou valor inferior a 0,5%.
[216] Ao se comparar com poliestireno comercial que apresenta opacidade entre 0,1-3,0%, e polipropileno (25 pm) com 2,50% tem-se que os filmes de gelatina são tão transparentes quanto os filmes contento polímeros sintéticos e amplamente utilizados.
[217] As propriedades ópticas dos filmes de amido podem ser comparadas com o valor de opacidade de polietileno de baixa densidade (50 pm) comercial que é de 30% e equivale ao valor máximo para um filme ser considerado transparente. Análise por infravermelho
[218] Os espectros de Infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) dos filmes sem e com os complexos adicionados foram adquiridos com reflexão total atenuada (ATR) utilizando o espectrofotômetro FTIR Spectrum 100 (PerkinElmer) equipado com um acessório de ATR de cristal (Ge/Ge) à temperatura ambiente. Foram realizadas 64 varreduras para cada medida.
[219] A partir da análise de infravermelho com refletância total atenuada (IR-ATR) é possível inferir se houve alguma interação entre o polímero e o complexo. A FIGURA 27, mostra os espectros dos filmes feitos com amido contendo o complexo de Mg-phen-fer.
[220] No filme de amido sem o complexo, FIGURA 27, foi observado estiramentos em 3340 cm-1 devido ao estiramento - OH dos grupos presentes na estrutura do amido, 2945 cirr1 e 890 cirr1 devido ao estiramento C-H do anel da estrutura do amido, 1645 cm-1 reflexo do estiramento (OH) da água ligada a estrutura, 1420 cm-1 e 1360 cm-1 estiramento do CH2 do amido e 1145 cm-1,1080 cm-1 e 1025 cm-1 forte sinal devido ao estiramento C-O, valores próximos e condizentes com aqueles encontrados na literatura. [221] Com a adição do complexo, FIGURA 28, o estiramento devido ao CH2 do amido foi deslocado, variando de 1335 cm-1 para 1260 cm-1 para o filme com o complexo. Este fato é devido a interação entre as ligações C-H do amido através de ligações de hidrogênio entre o grupo hidroxilo do ácido ferúlico. Para entender como os complexos se comportam termicamente no filme de amido, foram acompanhadas, por 144 horas, as mudanças espectrais que aconteceriam quando os filmes são colocados em temperaturas mais elevadas (30 °C e 40 °C) e na presença e ausência de oxigênio.
[222] Nas situações apresentadas abaixo, FIGURA 28, todos os filmes sem ou com complexo apresentaram estabilidade térmica, visto que não aconteceram mudanças espectrais. Além disso, a presença ou ausência de oxigênio não afeta as interações formadas entre o amido e o complexo, por não apresentar mudanças significativas entre os espectros de tempo zero e depois de 144 horas.
[223] A passagem de oxigênio pelos filmes porosos não altera a blenda, deixando os complexos estáveis para atuarem contra as espécies reativas de oxigênio, como será demostrado pelo estudo com o escurecimento da maçã, que é um processo radicalar. A estabilidade térmica é desejável, pois qualquer filme polimérico deve ser estável nas mais diferentes situações de temperatura e condições de oxigênio para uma maior gama de aplicação variando desde proteção alimentícia até recobrimento de superficies.
[224] Além dos filmes de amido, os filmes de gelatina produzidos por casting também foram caracterizados pelo IR- ATR, como mostrados na FIGURA 29. [225] Na FIGURA 29, tanto o filme controle quanto o filme contendo o complexo Mg-phen-fer exibiram o estiramento principal em 1630 crr1, que é o pico característico da amida, representando o estiramento C=O. O pico em 1550 cirr1 é devido à flexão dos grupos N-. O pico em 1240 cirr1 refere-se à vibração dos grupos C-N e N-H da amida. O estiramento em 1041 cirr1 deve-se à interação entre o glicerol e a gelatina. O pico à 3300 cm-1 é alongamento de N-H.
[226] Além disso, a inserção do complexo na matriz polimérica não levou a uma alteração, como visto para os filmes de amido. Sabe-se que a inserção dos complexos ocorreu uma vez que as medidas de opacidade mostraram isso. A falta de alteração no espectro, relaciona-se, ao fato da estrutura da gelatina ser mais complexa que a do amido e possuir maiores interações intramoleculares do que intermoleculares Taxa de permeabilidade ao oxigênio (TPO2)
[227] A TPO2 é uma característica fundamental de filmes flexíveis com propriedades de barreira a gás, principalmente relacionada à proteção de produtos sensíveis ao oxigênio.
[228] Experimentalmente, a taxa de permeabilidade ao oxigênio permite quantificar a eficácia de um filme como barreira frente a penetração de oxigênio.
[229] A TABELA 6 apresenta os valores da taxa de permeabilidade ao oxigênio para os filmes de amido produzidos por casting, medidos à temperatura ambiente de 23 °C e condições de umidade relativa igual a 40%.
Tabela 6 - Valores de permeabilidade ao oxigênio e
Figure imgf000061_0001
Casting
Amido
Figure imgf000062_0001
[230] Com a adição do complexo na blenda de casting de amido, a permeabilidade ao oxigênio aumentou, diminuindo suas propriedades de barreia de gás. Esse aumento está relacionado com a diminuição da fase cristalina devido a incorporação do complexo Mg-phen-fer, como é reportado para a inserção de compostos ativos.
[231] Assim, o aumento na TPO2 deve-se à influência do complexo que interferiu nas propriedades da blenda pela modificação da cristalinidade do filme, ou seja, a inserção dos complexos na blenda levou a um aumento da fase amorfa e, portanto, aumentou a difusão de oxigênio.
[232] Além disso, como mostrado por Arvanitoyannis e colaboradores, mudanças na interação polimero-complexo na matriz do amido acarretam um aumento no valor de TPO2. Logo, a incorporação do complexo (concentração de 10 mg) levou a um enfraquecimento das interações intermoleculares das cadeias de amido, facilitando o movimento das cadeias e promovendo uma maior permeabilidade ao oxigênio.
[233] Da mesma maneira, foi estudado para os filmes de gelatina produzidos por casting. Na TABELA 7 são apresentados os valores da taxa de permeabilidade ao oxigênio para os filmes de gelatina contendo os complexos em sua formulação medidos à temperatura ambiente de 23 °C e condições de umidade relativa igual a 20%.
Tabela 7 - Valores de permeabilidade ao oxigênio e coeficiente de oxigênio para os filmes de casting de gelatina
Figure imgf000062_0002
Condição Amostra Espessura (mm) TPO2[cc/(m2 -24h)]
Figure imgf000063_0001
[234] De maneira geral, os valores de permeabilidade ao oxigênio de filmes de gelatina são normalmente menores que filmes feitos a partir de polímeros sintéticos e outros biopolimeros, onde a adição dos complexos pouco alterou suas propriedades .
[235] Nota-se, a partir da TABELA 6, a taxa de permeabilidade ao oxigênio dos filmes de gelatina contendo os complexos apresentou uma alteração pequena em relação ao controle. Os filmes de gelatina tiveram uma diminuição significantemente nos valores de TPO2 em relação aos filmes de casting de amido, como por exemplo variando de 1228 cc// (m2.24h) no filme de amido para 12,618 cc//(m2.24h) no filme de gelatina quando ambos contêm Mg-phen-fer em suas formulações .
[236] Assim como é visto para outros casos, a incorporação de compostos ativos pouco altera as propriedades de barreira ao oxigênio de filmes de gelatina, pois como o processo de casting foi feito com soluções quentes acima da temperatura vitrea da gelatina, levando diminuições das estruturas terciárias da proteína e da mobilidade molecular, dificultando a difusão do gás oxigênio o que reflete nos valores da TABELA 6.
Estudos de liberação
[237] A liberação do complexo dos filmes de amido e gelatina nos diferentes estimulantes está relacionada com fatores como a solubilidade dos complexos nos diferentes solventes, propriedades de inchamento do filme e interações intermoleculares entre complexo e biopolimero. [238] A influência e efeito do meio hidrofilico/lipofilico sobre a liberação dos complexos dos filmes em função do tempo foi avaliada com base na quantidade total de complexo liberado para as diferentes soluções em função do tempo. Os dados apresentados na FIGURA 30 são para os filmes de amido.
[239] Em água observou-se uma liberação rápida do complexo (100% em 30 min), em que o mesmo comportamento é visto para flavonoides em filmes de amido. Com o aumento do teor lipofilico observou-se uma retenção do complexo durante um maior periodo de tempo obtendo uma completa liberação de complexo para o meio (1:1; etanol:água) em 200 min.
[240] Quando o estimulante continha 95% etanol apenas 10% de liberação do complexo em 3000 min foi observada. Esses resultados estão de acordo com aqueles sobre a liberação de diferentes antioxidantes presentes no extrato de alecrim e ácido ascórbico para os mesmos estimulantes aqui estudados, ou seja, liberação rápida para sistemas com altos teores de água.
[241] Como mostrado na FIGURA 31, os filmes de gelatina tiveram o mesmo comportamento observado para a liberação do complexo a partir do filme de amido, ou seja, a liberação foi rápida.
[242] Outros trabalhos mostram que filmes de gelatina apresentam uma liberação rápida mesmo quando se é estudado a temperaturas de 4 °C para retardar sua liberação
[243] Para ambos os filmes de amido e gelatina, houve um inchaço em solução favorecendo a transferência continua e rápida do complexo Mg-phen-fer da matriz polimérica para os meios estimuladores (Figura 32). Uma liberação mais lenta a partir das matrizes poliméricas seria preferivel e vantajosa pois levaria a um prolongamento das atividades antioxidantes . Uma escolha seria a troca do biopolimeros por um polímero aniônico como pectina pois levaria a uma interação eletrostática entre o complexo e o polímero o que possivelmente retardaria a liberação dos compostos.
Proteção em relação a oxidação de frutas: Escurecimento da maçã
[244] Os experimentos de escurecimento de maçãs foram realizados a partir de medidas colorimétricas (colorimetro MINOLTA Chroma Meter mod. CR210) dos dois lados de fatias de maçã (corte triangular) em função do tempo (a cada 30 minutos por um periodo de 3 horas). O equipamento foi padronizado contra um ladrilho branco (L* = 97,63, a* = -0,68, b* = 2,77).
[245] Um dos lados da maçã foi recoberto com o filme de amido sem o complexo (controle) e o outro lado com o filme contendo o complexo, sendo as bandejas cobertas com filme plástico .
[246] O método utilizado para a quantificação da cor foi baseado na esfera colorida de Hunter, onde as coordenadas são representadas por L* que indica luminosidade; coordenada a* indica vermelho (+) ou verde (-); e coordenada b* que indica amarelo (+) ou azul (-). A partir dos valores de Hunter L*, a*, b*, a diferença de cor total (AE), Equação 20:
Figure imgf000065_0001
[247] O valor de AE* (Eq. 5) foi utilizado para verificar a alteração de coloração da maçã, indicando a magnitude da diferença de cor entre tempos distintos. [248] A escala abaixo é utilizada para dizer sobre a diferença entre duas cores:
AE*ab < 0.2: diferença não perceptível,
0.2 < AE*ab < 0.5: diferença muito pequena,
0.2 < AE*ab < 0.5: diferença pequena,
2< AE*ab < 3: diferença pouco perceptível,
3 < AE*ab < 6: diferença perceptível,
6 < AE*ab < 12: grande diferença,
AE*ab > 12: cores diferentes.
[249] A eficiência do filme de amido contendo o complexo para inibir a oxidação de frutas foi analisado pelo processo de escurecimento enzimático da maçã. Alterações nos valores de AE* estão relacionadas com as modificações na superfície da maçã causadas pela atividade de polifenol oxidases e fenol peroxidases. A FIGURA 32 mostra a variação da cor da maçã em termos de coloração absoluta.
[250] Como visto na FIGURA 32 o filme contendo o complexo Mg-phen-fer apresentou um atraso no processo de escurecimento da maçã, possuindo um aumento gradual deste. Enquanto para o caso do filme controle e sem nenhum filme, apresentaram um alto valor relativo de AE devido ao escurecimento rápido.
[251] Sistemas que usam polifenóis como antioxidantes suportados em filmes para combater essas espécies, aconteceu um gradual e lento escurecimento da maçã da mesma maneira que observado para o complexo.
[252] Nas situações que se têm a presença do complexo, o processo de escurecimento atinge um máximo seguido de uma queda, fato relacionado com o complexo que ao ser liberado do filme mantém suas propriedades antioxidantes pois o ácido ferúlico apresenta uma capacidade antioxidante maior do que 1.
Bíoensaíos : controle de pragas
[253] As operárias Atta sexdens utilizadas nos bioensaios foram coletadas aleatoriamente em ninhos artificiais adultos. As operárias de saúvas foram mantidas em placas de Petri (isoladas dos formigueiros) a 25 ± 1 °C, com leituras diárias de mortalidade.
[254] A manutenção das formigas no laboratório se deu pela dieta sólida constituída de 0,25 g de peptona bacteriológica, 0,25 g de ágar bacteriológico, 0,025 g de extrato de levedura e 1,25 g de glicose, dissolvidos em 25 mL de água destilada.
[255] Nas placas de tratamento, a essa mistura foi adicionado os compostos variando suas concentrações de 1, 10, 100 e 1000 ppm. Diariamente por 25 dias foi administrado um disco de 0,5 g com a dieta previamente preparada sendo os tratamentos divididos em controle (dieta pura) e amostra (dieta com inseticida). O ensaio consistia em cinco placas de Petri para cada tratamento com um lote equivalente a 50 formigas.
[256] O uso de complexos de Mg (II) contendo produtos naturais em sua esfera de coordenação já vem sendo empregado. Por exemplo, quando o complexo [Mg (phen)2(iso)]+ (onde phen é 1,10-fenantrolina e iso é ácido isovanilico) foi adicionado na dieta para alimentação das formigas cortadeiras observou- se um aumento significativo na atividade inseticida em relação ao controle e ao ligante livre e inibiu o crescimento do fungo simbionte. Os dados em relação a atividade inseticida dos complexos estão ilustrados na Tabela 8: TABELA 8: Mortalidade acumulada e sobrevivência mediana
(S50) de operárias Atta sexdens submetidas ao bioensaio de incorporação em dieta dos compostos
Tratamento % Mortalidade acumulada por dia
1 2 3 6 8 10 14 17 21 25 S50*
Dieta Pura 0 4 4 6 6 8 12 14 22 28 >25a
Ácido 0 0 6 15 18 26 30 32 39 44 >25 isovanilico (iso)
[Mg (phen)2(iso)]
+ 6 22 56 90 98 100100 100 100100 3b
Sulfluramida 0 8 20 70 98 100100 100 100100 5b
[257] Assim, verificou-se que 0 complexo de magnésio apresentou ação inseticida significativa com valores de sobrevivência média (S50) de 5 dias, equiparável com o inseticida suitluramida. Este fato sugere que os complexos de Mg (II) possuem um modo de ação lento, que é o melhor modo de controle de insetos. Dessa maneira, estes compostos apresentaram as características esperadas para um inseticida formulado.
Propriedades bacterícídas e fungicidas do complexo - Estudos de Microbiologia Alimentar
[258] Em relação a carne vermelha, os niveis de bactérias nos tecidos musculares de animais vivos e saudáveis são extremamente baixos. As bactérias se encontram presentes na pele, pelo, cascos, trato gastrointestinal, sendo a contaminação da carne por contaminação cruzada. A deterioração por microrganismos é tão prejudicial a carne quanto os processos oxidativos. [259] As bactérias selecionadas foram relacionadas a processos de deterioração da carne: Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Samonella ssp, Escherichia coll, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens S3, Pseudomonas fluorescens S9. 0 primeiro teste, como mostrado na TABELA 9, faz-se uma variação de 5mg/mL até 0,1 mg/mL.
Tabela 9: Atividade bactericida do complexo Mg-phen-fer na
Figure imgf000069_0001
Legenda:
- microrganismo não cresceu (complexo é capaz de suprimir o crescimento)
+ microrganismo cresceu (complexo não é capaz de suprimir o crescimento) [260] A atividade antimicrobiana dos complexos foi testada, empregando dois meios de culturas, em particular o caldo de soja tripticaseina para bactérias e caldo de extrato de malte para fungos. Os microrganismos que foram inoculados e tiveram sua dispersão na forma de uma suspensão de esporos, no mesmo meio de cultura, com densidade óptica (OD) a 600 nm entre 0,4< OD< 0,5.
[261] As cepas bacterianas Staphylococcus aureus, Pseudomonas putida, Pseudomonas fluorescens S8, Pseudomonas fluorescens S9 foram cultivadas em meio de caldo de soja tripticaseina (TSB) a 30 °C por 24 horas, enquanto as demais cepas foram cultivadas no mesmo meio de cultura, porém a 37 °C. Com os microrganismos crescidos, foram suspendidos em água para serem inoculados.
[262] Após o preparado do meio TSB com 8 g/L de ágar, foi esterilizado a 118 °C por 20 minutos. Em placas de petri foi adicionado 13 mL do meio preparado anteriormente e inoculado 300 pL da suspenção de bactérias. Após solidificação do meio, 5 pL de solução de diferentes concentrações dos complexos e ligante foram inoculados na superfície do meio solidificado. Após 24 horas de incubação na temperatura de 30 °C ou 37 °C, dependendo do patógeno, foi verificado se houve crescimento bacteriano.
[263] Para o ligante ácido ferúlico, foi dissolvido em 100 pL de etanol e completado a diferença com água esterilizada para obter a concentração desejada.
[264] As culturas de controle (controle negativo) foram sempre preparadas para as bactérias em meio de caldo de soja tripticaseina com ágar, porém sem os complexos e ligante somente o solvente utilizado (água).
[265] Observou-se que o complexo Mg-phen-fer, de modo geral, apresentou atividade frente todas as bactérias dentro dessa faixa de concentração. Dessa forma, decidiu-se diminuir a quantidade do complexo Mg-phen-fer variando entre 2 mg/mL até 0,1 mg/mL de modo a determinar a minima concentração bactericida.
[266] Mesmo com a diminuição da quantidade do complexo Mg-phen-fer, a minima concentração bactericida foi de 1 mg/mL. De modo que para Ps. putida Ps. fluor. S9 e Ps. fluor. S8 a minima concentração bactericida foi de 1,50 mg/mL.
[267] Além dos complexos, foi testado ácido ferúlico livre frente as bactérias. Nenhuma atividade antibactericida associada ao ligante livre foi observada na faixa de concentração estudada. Para o ácido ferúlico, na literatura, a concentração bactericida minima para E. coli é de 2,5 mg/mL. St. aureus e L. monocyt. possuem valores maiores que 5,0 mg/mL e para Pseudomona concentrações maiores que 0,5 mg/mL é que apresenta atividade bactericida.
[268] A tabela 10 representa os dados que avaliam a atividade bactericida do complexo Mg-phrn-fer na faixa de 0,1 mg/mL até 5,0 mg/mL.
Tabela 10: Atividade bactericada do complexo Mg-phen-fer
Figure imgf000071_0001
[269] Pode-se concluir que frente as essas bactérias o complexo Mg-phen-fer apresentou uma melhora na concentração bactericida minima em relação ao ligante livre, levando a uma diminuição da concentração em cerca de quatro vezes.
[270] Em relação a atividade antifúngica foram testados os seguintes patógenos: Aspergillus niger Penicillium notatum e Rhizopus oryzae.
[271] Os bolores foram cultivados em meio de ágar com extrato de malte com a seguinte composição: 8 g/L de ágar, 20 g/L de extrato de malte, 2 g/L de peptona de soja, 20 g/L de glicose, o pH foi ajustado para pH 5,8 e o meio foi esterilizado a 118 °C por 20 min. As culturas de fungos foram incubadas a 30 °C por até 14 dias nesse meio para crescimento. Com os microrganismos crescidos, foram suspendidos em água para serem inoculados.
[272] Em tubos falcon, diferentes massas dos complexos 1 e 2 foram solubilizadas e agitadas em 3 mL de água esterilizada sendo seguido pela adição de 7 mL de MEA esterilizado a 118 °C por 20 minutos. Está solução foi versada em placas de petri e após solidificação do meio 5 pL de solução dos esporos dos fungos foram inoculados na superfície do meio solidificado. Após 48 horas de incubação em 30 °C, foi verificado o crescimento ou dos fungos.
[273] Para o ligante ácido ferúlico, a massa foi dissolvida em 300 pL de etanol, seguida pela adição de 10 mL de MEA esterilizado a 118 °C por 20 minutos. Sendo o resto do procedimento o mesmo para os complexos.
[274] As culturas de controle (controle negativo) foram sempre preparadas tanto para os fungos em MEA sendo a mesma composição, porém sem os complexos ou ligante. [275] 0 ensaio com o fungo L. gongylophorus isolado foi mantido em laboratório em meio de cultura composto de extrato de malte (20 g/L), peptona (5 g/L), extrato de levedura (2 g/L) e ágar (20 g/L). Para o ensaio de determinação do nivel de inibição, os compostos foram testados em diferentes concentrações com quatro repetições para cada concentração dos compostos e incorporados ao meio de cultura. Na posição central de placa de Petri, foi inoculado discos de 0,8 mm oriundos das culturas puras do fungo L. gongylophorus, sendo mantidas a 25 °C e no escuro.
[276] A FIGURA 33 mostra a variação da concentração de Mg-phen-fer entre 0,001 mg/mL até 2,00 mg/mL. Foi observado um valor de concentração fungicida minima de 0,05 mg/mL, sendo que para concentrações maiores que esse valor o complexo Mg-phen-fer foi capaz de coibir o crescimento dos fungos, crescendo somente no controle negativo. Este valor é duas ordens de grandeza menor àquela observada para as bactérias, indicando que o complexo tem um maior potencial para ser um fungicida.
[277] Foi testado o ligante ácido ferúlico, como mostrado na FIGURA 34. Observou-se nenhuma atividade antibactericida associada ao ligante livre usando uma quantidade similar àquela quantidade de ligante ácido ferúlico encontrado no complexo. Mesmo com o aumento da concentração do ligante livre, FIGURA 31, o ácido ferúlico não foi capaz de inibir os patógenos, levando a uma redução de 30% em relação ao tamanho do controle negativo, de acordo com a literatura onde é visto uma redução de 20%.
Atividade da enzima acetílcolínesterase [278] Uma vez que o desenvolvimento do complexo Mg-phen- fer visa sua aplicação como composto ativo com propriedades antioxidantes em filmes, entender se esse composto interage com biomoléculas é de fundamental importância. A enzima acetilcolinesterase (AChE) foi selecionada como um primeiro modelo de interação pois essa enzima está presente nos seres vivos e atua principalmente no cérebro e sistema nervo central (SNC). Essa enzima hidrolisa a acetilcolina (ACh) (neurotransmissor) em colina e ácido acético, se a AChE é inibida acarreta um acúmulo de ACh que atrapalha as funções sinápticas pela estimulação excessiva do SNC:
Figure imgf000074_0001
[279] A cinética de Michaelis-Menten foi avaliada de acordo com o método espectrofotométrico desenvolvido por Ellman, sendo que a inibição dessa enzima pelo complexo Mg- phen-fer foi avaliado para a enzima acetilcolinesterase (AChE) da espécie electrophorus electrícus (eeAChE), que possui estrutura semelhante à da AChE humana podendo ser usada como modelo de estudo.
[280] Esse método se baseia na reação entre o ácido 5,5'- ditio-bis- (2-nitrobenzóico (reagente de Ellman, DTNB) com a base conjugada de um grupo sulfidrila livre (-R-S-), presente na colina. Essa reação leva a formação do ácido 5-mercapto- 2-nitrobenzóico (TBN) que é uma molécula com absorção máxima na região do visivel em 412 nm com alto coeficiente de extinção molar (reação entre colina e reagente de Ellman levando a formação do TNB):
Figure imgf000075_0001
[281] Uma solução estoque de 0,1 mg/mL foi preparada dissolvendo o complexo em tampão tris-HCl (pH 8,0). Diluições em uma concentração de 0-20 pg/mL foram usados para os estudos de inibição. Misturas contendo 0-50 pL de complexo; 2,64 mL de uma solução contendo 50 mmol/L de tampão tris-HCl (pH 8,0), 100 pL de 10 mmol/L ácido 5,5'-ditio-bis- (2- nitrobenzóico) (DTNB, reagente de Ellman), volumes variáveis de 1,38 mmol/L de iodeto de acetiltiocolina foram incubadas em temperatura ambientes. Posteriormente, a reação foi iniciada com adição de 50 pL de solução enzimática (5,0 U/mL de AChE). A hidrólise do substrato pode ser observada pela formação de um composto amarelo (5-tio-nitrobenzoato). A absorbância foi medida a 412 nm. As medições foram feitas por 15 minutos considerando a velocidade inicial referente aos primeiros 5 min da reação.
[282] Variando a concentração do complexo para que se obtivesse a concentração e modo de inibição do complexo Mg- phen-fer, observou-se que o complexo não inibiu a enzima AChE, FIGURA 34. Além disso, esse ensaio é um indicativo que o Mg-phen-fer pode ser usado como molécula antioxidante para contato alimentício uma vez que ele não inibiu a AChE e consequentemente não interferiria nas propriedades cognitivas dos seres vivos.
Ensaio de IC50 em células de neuroblastoma humano SH-SY5Y
[283] A linhagem de neuroblastoma humano SH-SY5Y foi cultivada em meio de cultura DMEM/DMEM-F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium - Gibco.) suplementado com 1 % Piruvato, aminoácidos 100a e 10 % ATB (antibiótico). Durante o crescimento as células foram mantidas em garrafas de cultivo (75 mL) à 37 °C em estufa com atmosfera de 5 % de CO2.
[284] Ao atingirem o crescimento necessário (80 % de confluência) o meio de cultura foi removido da garrafa e as células foram tratadas com 2 mL de uma solução 10 % de tripsina/EDTA (enzima que quebra ligações covalentes e solta as células das garrafas) e deixadas reagir por 2 minutos. A tripsina foi neutralizada utilizando 2 mL do meio de cultura e a suspensão resultante foi transferida para um tubo cônico e centrifugada à 1200 RPM (rotações por minuto) por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado de células foi suspendido novamente em um novo meio DMEM/DMEM- F12. Por fim, a suspensão foi semeada em uma placa de 96 poços com concentração final de 2,0xl04 células/poço.
[285] Após 24 horas em estufa para um processo de adesão à placa multipoços, a linhagem SH-SY5Y foi tratada com uma diluição em série do complexo Mg-phen-fer dentro de uma faixa de concentração de 200 - 0,39 pM. Para o ensaio de IC50 as placas tratadas com o complexo foram mantidas em estufa à 37 °C e atmosfera 5 % de CO2 por 24 horas.
[286] Ao fim do tempo de incubação as placas foram tratadas com uma solução 0,75 mg/mL de MTT (3— (4,5— dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio) e deixadas por no mínimo 3 horas em estufa. 0 meio de cultura foi então retirado dos poços e adicionou-se 100 pL de DMSO em cada poço. A leitura de absorbância da solução resultante foi realizada em um leitor de Elisa (Thermo Plate TP-READER) com filtro em 540nm e a porcentagem de viabilidade celular calculada de acordo com a Equação 21:
Figure imgf000077_0001
[287] Como o complexo Mg-phen-fer não apresentou atividade de inibição em relação a enzima AChE, outro indicativo que o complexo é seguro para aplicações alimentícias foi feito através do ensaio de viabilidade celular das células da linhagem de neuroblastoma humano SH- SY5Y. Essa linhagem de célula é associada a células do sistema nervoso simpático que controla funções como respiração, pressão arterial, batimento cardíaco e digestão.
[288] Como mostrado na FIGURA 35, o complexo não apresentou atividade significativa contra essa linhagem célular, ou seja, o complexo Mg-phen-fer não promoveu a apoptose das células independentemente da concentração utilizada sendo que para concentrações <56 pmol/L a viabilidade celular foi de 90 % e para concentrações maiores que esse valor a viabilidade celular foi de 80%.
[289] Uma vez que o complexo apresentou baixa interação com a enzima AChE que está presente no sistema nervoso central, sendo um indicativo que o complexo não afetaria as propriedades cognitivas. Similarmente, o ensaio com a célula, o complexo não promoveu a apoptose desta ou de qualquer outro componente celular como mitocôndria. Assim, esses dois ensaios biológicos mostram o potencial de aplicação do complexo Mg-phen-fer como um antioxidante de baixa toxicidade.
[290] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.

Claims

REIVINDICAÇÕES 1) COMPOSTO caracterizado por ser um complexo metálico de fórmula geral (I): [M(LL)(L'L' )n]+ em que M é preferencialmente, o metal Magnésio (Mg(II)); em que LL é um agente antioxidante selecionado do grupo compreendido dentre flavonoides; flavonas; ácidos fenólicos; ácidos hidroxicinâmicos; catecóis; catequinas; quercetinas; curcuminas; xantonas; citocainas; em que L'L' é um agente quelante selecionado do grupo compreendido dentre 1,10-fenantrolina; 4,7-Dihidroxi-l,10- fenantrolina; 1,10-fenantrolina-5,6-diona; 4-Metil-l,10- fenantrolina; 5,6-Dimetil-l, 10-fenantrolina; 4,7-Dicloro-
1.10-fenantrolina; 4,7-Dimetoxi-l,10-fenantrolina; 5-Nitro-
1.10-fenantrolina, ou 1,10-fenantrolina-5-amina, ou 2,2'- bipiridina, ou 2,2’-bipiridina-3,3’-diol; 4,4’-Dimetil- 2,2'-bipiridina; 4,4'-Di-tert-butil-2 ,2'-bipiridina; etilenodiamina; N,N,N' ,N'-Tetrakis(2-hidroxietil) etilenodiamina; N,N,N' ,N'-Tetrakis(2-piridilmethil) etilenodiamina; em que n = 1 ou 2.
2) COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por ser um complexo metálico de fórmula geral (I )
Figure imgf000079_0001
3) COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por compreender as formas hexacoordenadas e tetracoordenadas separadamente ou uma mistura destas.
4) COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por LL ser, preferencialmente, ácido ferúlico (fer) e L'L' ser, preferencialmente, 1,10-fenantrolina (phen).
5) COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se apresentar na forma de pó ou em solução liquida.
6) PROCESSO DE OBTENÇÃO DO COMPOSTO conforme definido nas reivindicações de 1 a 5 caracterizado por compreender as etapas de: a) Misturar para cada 1 a 5 equivalente de um sal de magnésio, 0,5 a 5 equivalentes de LL, 0,5 a 5 equivalentes de L'L', e um volume de solvente orgânico equivalente de 10% a 90% do volume total do recipiente onde se realizará a reação, formando uma solução; b) Manter a solução com agitação constante e aquecimento brando de 1 a 4 horas ou irradiar a solução por 10 a 25 minutos sob micro-ondas; c) Separar o precipitado obtido na etapa (b), preferencialmente por filtração; d) Contatar o precipitado com pelo menos um meio para remoção de contaminantes orgânicos; e) Secar preferencialmente a vácuo.
7) PROCESSO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de a referida reação que ocorre na etapa "b) " poder se dar em reatores químicos sem alteração processual . 8) PROCESSO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que, na etapa "b) ", opcionalmente gás N2 é provido em atmosfera controlada ou purgado na solução.
9) PROCESSO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de o referido pelo menos um meio para remoção de contaminantes orgânicos ser etanol ou metanol ou uma mistura dos mesmos.
10) PROCESSO, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de o referido pelo menos um meio estar preferencialmente na temperatura de 4 °C a 15 °C.
11) FILME POLIMÉRICO caracterizado por compreender: uma quantidade de 1 ng/cm2 a 100 mg/cm2 do composto, em relação a área do filme pronto, o composto conforme definido nas reivindicações de 1 a 5; uma quantidade de 1% a 5% (m/m), em relação à uma fase aquosa (95% a 99%), de uma matriz polimérica selecionada dentre biopolimeros, polissacarideos e polímeros termoplásticos; em que o composto é disposto em todo volume da matriz de maneira homogênea, após o processamento para formação do filme.
12) FILME POLIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de os referidos biopolimeros serem preferencialmente provenientes de proteínas selecionadas do grupo compreendido por soja; trigo; milho; gelatina; amido de tapioca; e caseina.
13) FILME POLIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de os referidos polissacarideos compreenderem, preferencialmente, celulose; amido; pectina; quitosana; alginato; e açúcares.
14) FILME POLIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado de os referidos lipídios compreenderem, preferencialmente, ceras; triglicerideos; e ácidos graxos.
15) FILME POLIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de os referidos polímeros termoplásticos compreenderem, preferencialmente, poliamidas; acetals; polietileno; polipropileno; ABS; polióxido de fenileno; poliestireno; SAN; policarbonato; PVC; PET; e PS.
16) FILME POLIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de a referida matriz polimérica ser, preferencialmente, feita de gelatina ou amido de tapioca.
17) FILME POLIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de o referido filme de matriz de amido de tapioca ser produzido, proporcionalmente, a partir de 1 g do polímero (5% mamido/msolvente), 250 mg (25% mglicerol/mamido) de gllcerol e 15 mL de água.
18) FILME POLIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de o referido filme de matriz de gelatina ser produzido, proporcionalmente, a partir de 5 g do polímero (5% mgelatina/msolvente), 100 mg (20% mglicerol /mgelatina) de gllcerol e 7 mL de água.
19) FILME POLIMÉRICO, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de serem produzidos e aplicados, preferencialmente, pelo método de versar a solução polimérica sobre uma superfície (casting) ou por recobrimento (coating). 20) USO do composto, conforme definido nas reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser na preparação de filmes poliméricos para conservação de alimentos perecíveis ou não perecíveis e/ou bebidas.
21) USO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de ser na formação de filmes poliméricos para conservação de alimentos e/ou bebidas ricos em riboflavina.
22) USO do composto conforme definido nas reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um inseticida.
23) USO, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de o referido inseticida ser preferencialmente para formiga cortadeira (Atta sexdens).
24) USO do composto conforme definido nas reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de ser na preparação de composições fungicidas e bactericidas.
25) USO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de ser, preferencialmente, na preparação de uma composição bactericida para alimentos, especificamente contra bactérias selecioanadas do grupo compreendido por Staphylococcus aureus; Pseudomonas putlda; Pseudomonas fluorescens S8; e Pseudomonas fluorescens S9.
26) USO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de ser, preferencialmente, na preparação de uma composição fungicida para alimentos, especificamente contra fungos selecionados do grupo compreendido por Aspergillus niger; Penicillium notatum; e Rhizopus oryzae.
27) USO, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de ser, preferencialmente, na preparação de um fungicida contra o fungo simbionte Leucoagaricus gongylophoru da formiga cortadeira.
28) USO do composto conforme definido nas reivindicações de
1 a 5, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição cosmética.
29) USO, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de a referida composição cosmética ser, preferencialmente, uma composição para antienvelhecimento da pele. 30) USO do composto conforme definido nas reivindicações de
1 a 5, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um estabilizante para uma formulação de biofármacos.
31) USO do composto conforme definido nas reivindicações de
1 a 5, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um conservante para uma formulação farmacêutica.
32) USO, de acordo com as reivindicações 30 e 31, caracterizado pelo fato de ser na preparação de um estabilizante e conservante para formulações de insulina.
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