WO2023223870A1 - 抗腫瘍剤、細菌、及び製造方法 - Google Patents
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Classifications
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- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
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- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
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- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
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- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
Definitions
- the present invention relates to antitumor agents, bacteria, and manufacturing methods.
- the present invention relates to an antitumor agent containing bacteria isolated from a tumor, a bacteria isolated from a tumor, and a method for producing bacteria that includes a step of isolating bacteria from a tumor.
- Various treatment methods are used to treat cancer, such as surgical therapy, drug therapy, and radiation therapy. These may be used alone or in combination depending on the type and condition of the disease.
- drugs such as anticancer drugs are used.
- Anticancer drugs used in drug therapy can also have an adverse effect on normal cells, which can place a heavy burden on patients. For example, anticancer drugs often accumulate in patients when administered over a long period of time, causing major side effects to the patients.
- cancer testing for example, various tumor markers, MRI, CT, etc. are used. Tumor marker values alone cannot determine the presence or location of cancer. MRI and CT are very useful for determining the presence or absence of cancer, but these devices are relatively large and have a large cost burden.
- Patent Document 1 discloses the use of photosynthetic bacteria for the treatment or diagnosis of cancer. This document describes, for example, administering photosynthetic bacteria to a subject, allowing the photosynthetic bacteria to accumulate in the affected area where cancer is present, and then irradiating the affected area with light.
- the present invention aims to provide a technique useful for treating or diagnosing cancer.
- the present inventors isolated bacteria present within a tumor from the tumor and found that the isolated bacteria are useful for cancer treatment or diagnosis, or both.
- the present invention provides the following.
- An antitumor agent containing bacteria isolated from a tumor [2] The anti-inflammatory agent according to [1], wherein the bacteria are Proteus, Lactococcus, Enterococcus, Acinetobacter, Bacillus, or Cutibacterium. Tumor agents. [3] The antitumor agent according to [1] or [2], wherein the antitumor agent is administered parenterally. [4] The anti-tumor agent according to any one of [1] to [3], wherein the bacteria contained in the anti-tumor agent have immune cell activation properties.
- the mouse survival rate of [1] to [5] is 90% or more for 40 days after the administration when the bacteria is administered once through the mouse tail vein in an amount of 1 x 10 8 CFU.
- the bacterium is a Proteus bacterium, a Lactococcus bacterium, an Enterococcus bacterium, an Acinetobacter bacterium, a Bacillus bacterium, or a Cutibacterium bacterium.
- the mouse survival rate for 40 days after the administration is 90% or more when the bacteria is administered once through the mouse tail vein in an amount of 1 x 10 8 CFU.
- Bacteria described. A separation step of separating bacteria from the tumor, and a culturing step of culturing the bacteria isolated in the separation step in a medium, including, A method for producing bacteria having antitumor activity.
- Bacteria isolated from tumors are very useful for tumor treatment.
- tumors can be treated with anti-tumor agents according to the invention.
- the antitumor agent according to the present invention can also be used to treat cancers of various organs or tissues.
- Bacteria isolated from tumors are also very useful for tumor diagnosis.
- a method according to the invention particularly an image generation method
- a bacterium according to the invention is useful for determining the presence or absence of a tumor, and also for determining the location or shape of a tumor.
- tumor treatment and diagnosis can be performed simultaneously. For example, by administering an antitumor agent according to the invention, in addition to treating a tumor, it is also possible to localize the tumor.
- the effects of the present invention are not limited to the effects described herein, and may be any of the effects described within this specification.
- FIG. 2 is a diagram for explaining isolation and culture of intratumoral bacteria.
- FIG. 2 is a diagram for explaining an in vivo anticancer experiment. Photographs of mice after intravenous administration of each bacterium.
- FIG. 3 is a diagram showing the evaluation results of antitumor activity of each bacterium.
- FIG. 4 is a diagram showing the mouse survival rate for 40 days after cancer cell transplantation in each case of bacterial administration.
- FIG. 3 is a diagram showing the complete response rate of each experimental group.
- FIG. 2 is a diagram showing an experimental method for investigating acquisition of cancer immunity. Photographs showing the observation results of mice after reimplantation of Colon-26 are shown.
- FIG. 7 is a diagram showing the measurement results of tumor volume in each treatment group. It is a figure showing the measurement result of an absorption spectrum.
- FIG. 3 is a diagram showing measurement results of fluorescence spectra.
- FIG. 3 shows images obtained by in vivo fluorescence bioimaging. It is a figure showing the staining result of immune cells. It is a figure showing the staining result of an anti-tumor biomarker. It is a figure showing the result of colony assay when i-R.P. was administered. It is a figure showing the result of colony assay when i-P.M. was administered.
- FIG. 4 is a diagram showing the results of H&E tissue staining of the various organs when i-P.M., i-R.P., or PBS was administered.
- FIG. 2 is a diagram for explaining a method for creating a sarcoma model mouse.
- FIG. 2 is a diagram showing changes over time of tumors in sarcoma model mice.
- FIG. 2 is a diagram for explaining a method for creating a metastatic lung cancer model mouse. This is a photograph of the lungs removed from each mouse. It is a figure which shows the result of the weight measurement of the lung extracted from the mouse.
- FIG. 3 is a diagram showing changes in mouse body weight.
- FIG. 3 is a diagram showing measurement results of absorption spectra and fluorescence spectra. It is a figure showing a photograph of a mouse and a fluorescence observation image obtained by in vivo fluorescence bioimaging.
- FIG. 2 is a diagram for explaining isolation and culture of intratumoral bacteria.
- FIG. 2 is a diagram for explaining an in vivo anticancer experiment.
- FIG. 3 is a diagram showing the evaluation results of antitumor activity of each bacterium.
- FIG. 3 is a diagram showing the evaluation results of antitumor activity of each bacterium. It is a figure showing mouse survival rate.
- FIG. 3 is a diagram showing changes in mouse body weight.
- Embodiment 2.1 First embodiment (antitumor agent) 2.1.1 Anti-tumor agent containing purple non-sulfur bacteria isolated from tumor 2.1.2 Anti-tumor agent containing Proteus genus bacteria isolated from tumor 2.1.3 Lactococcus genus isolated from tumor Antitumor agent containing bacteria 2.1.4 Antitumor agent containing Enterococcus bacteria isolated from a tumor 2.1.5 Antitumor agent containing Acinetobacter bacteria isolated from a tumor 2.1.6 Antitumor agent containing bacteria of the genus Acinetobacter isolated from a tumor 2.1.7 Anti-tumor agent containing Bacillus bacteria isolated from tumor 2.1.8 Examples of other bacteria 2.1.9 Composition of anti-tumor agent 2.1.10 Method for producing antitumor agent 2.2 Second embodiment (bacteria) 2.2.1
- cancer treatment methods are used to treat cancer, such as surgical therapy, drug therapy, and radiation therapy.
- Various proposals have also been made regarding cancer treatment methods.
- nanomedicine has been proposed as a method for cancer treatment.
- An example of such nanomedicine is one that utilizes the EPR effect.
- EPR effect Enhanced Permeation and Retention Effect
- the EPR effect Enhanced Permeation and Retention Effect
- anticancer treatments using nanotechnology are close to their performance limits because they rely on this EPR effect.
- Antibody therapy has also been proposed as a method for cancer treatment.
- strategies have been proposed to load drug carriers with cancer cell-specific antibodies to improve tumor targeting performance (e.g., Hisataka Kobayashi, Drug Delivery System, 29 (4), p. 274 -284 (2014).).
- large antibodies have difficulty penetrating the interstitial barrier that surrounds cancer, resulting in insufficient selectivity and efficacy.
- antibodies cannot penetrate the cancer stromal barrier (they bind only to the surface of the tumor), so although immune cells are used, it is difficult to eliminate cancer cells deep within the tumor.
- bacterial therapy has recently been proposed as a method for cancer treatment, and in particular, cancer therapy using anaerobic microorganisms that can selectively accumulate, grow, and multiply inside tumors in hypoxic conditions has been proposed.
- Targeted therapy is attracting attention (Shibin Zhou et al. Nature Reviews Cancer, 18, p.727-743 (2016).).
- conventional cancer bacterial therapy is basically based on the concept of a so-called drug delivery system, which is the delivery of anticancer drugs.
- drug delivery system which is the delivery of anticancer drugs.
- it is necessary to manipulate or modify microorganisms using genetic engineering. As a result, unpredictable and uncontrollable problems such as bacteria acquiring drug resistance may occur, making it difficult to apply to medical applications.
- the bacteria used are often Salmonella enterica or Escherichia coli that have been weakened through genetic modification, and there is always a risk that they will become highly virulent again in the body.
- Salmonella enterica, Listeria monocytogenes, or E. coli that have been weakened through genetic modification have the risk of becoming highly virulent (reverse mutation) again in the body.
- E. coli have been weakened through genetic modification
- they have poor tumor specificity and can also accumulate in normal organs or tissues.
- the above-mentioned bacterial therapy is passive drug delivery and requires complicated genetic design.
- the present inventors discovered that by separating bacteria present within a tumor from the tumor, the bacteria exhibits excellent antitumor activity.
- the present invention provides an antitumor agent containing bacteria isolated from a tumor.
- the bacteria isolated from the tumor are purple non-sulfur bacteria.
- Purple non-sulfur bacteria isolated from tumors have excellent antitumor activity.
- purple non-sulfur bacteria isolated from tumors and cultured in culture exhibit excellent antitumor activity.
- the purple non-sulfur bacteria may be, for example, Rhodopseudomonas bacteria, Blastchloris bacteria, or both. The antitumor activity is very excellent and is effective against tumors in various organs or tissues.
- the purple non-sulfur bacterium may be used in combination with other bacteria isolated from a tumor.
- a combination of purple non-sulfur bacteria isolated from tumors and other bacteria isolated from tumors exhibits particularly excellent antitumor activity.
- the other bacterium may be, for example, a bacterium of the genus Proteus.
- the two or more bacteria constituting the combination are preferably isolated from the same tumor and may be cultured together (co-culture) in the same medium.
- the bacterium isolated from the tumor is a bacterium of the genus Proteus.
- Proteus bacteria isolated from tumors may be used in combination with purple non-sulfur bacteria as described above, or may be used alone.
- Proteus bacteria isolated from tumors have excellent antitumor activity. The antitumor activity is very excellent and is effective against tumors in various organs or tissues.
- the bacteria isolated from the tumor is a Lactococcus bacterium. Lactococcus bacteria isolated from tumors have excellent antitumor activity. In yet another embodiment, the bacterium isolated from the tumor is a bacterium of the genus Enterococcus. Enterococcus bacteria isolated from tumors have excellent antitumor activity. In yet other embodiments, the bacteria isolated from the tumor is a bacterium of the genus Acinetobacter. Acinetobacter bacteria isolated from tumors have excellent antitumor activity. In yet another embodiment, the bacteria isolated from the tumor is a bacterium of the genus Bacillus. Bacillus bacteria isolated from tumors have excellent antitumor activity. In yet other embodiments, the bacteria isolated from the tumor are of the genus Cutibacterium. Bacteria of the genus Cutibacterium isolated from tumors have excellent antitumor activity. The antitumor activity of these bacteria is also very good.
- bacteria isolated from the tumor described above have the property of gathering at the tumor site.
- bacteria isolated from the tumor collect at the tumor site when administered parenterally to an animal. Therefore, for example, performing an analysis using the optical properties of the bacteria is useful for determining the presence or absence of a tumor or for specifying the position or shape of a tumor.
- information obtained by imaging the animal using the optical properties of the bacteria is useful for the determination or identification.
- bacteria isolated from the tumor are useful not only for tumor treatment but also for tumor diagnosis, and can be used, for example, as a diagnostic drug.
- bacteria isolated from the tumor can be used for both tumor treatment and tumor diagnosis.
- the bacteria isolated from the tumor may be purple non-sulfur bacteria.
- Purple non-sulfur bacteria isolated from tumors have different optical properties from normal purple non-sulfur bacteria (such as commercially available purple non-sulfur bacteria).
- optical properties by utilizing the above-mentioned properties that gather at the tumor site, it becomes possible to determine the presence or absence of a tumor or specify the position or shape of the tumor.
- the bacteria isolated from the tumors described above are also excellent in terms of toxicity.
- the bacterium when a bacterium is administered to an animal (particularly parenterally), the bacterium often exhibits toxicity to the animal.
- these bacteria can be toxic to the animals.
- the above-mentioned bacteria isolated from tumors are administered to animals (particularly parenterally), they do not exhibit toxicity to the animals, or even if they do, they do not exhibit toxicity. is considered to be low.
- purple non-sulfur bacteria and Proteus bacteria isolated from tumors are particularly good. That is, particularly preferably from the viewpoint of toxicity, the antitumor agent of the present disclosure may contain at least one of a purple non-sulfur bacterium and a Proteus genus bacterium isolated from a tumor.
- the present inventors have discovered that the bacteria isolated from the tumor mentioned above exists in the animal's body for a while after administration, but after a certain period of time, it continues to exist in the animal's body. It was also found that confirmation was no longer possible. That is, the bacteria isolated from the tumor is not expected to remain in the animal's body for a long period of time, thereby reducing concerns regarding the adverse effects of the bacteria.
- the bacteria isolated from tumors described above confer or enhance immunity to tumors.
- the bacteria isolated from the tumor have antitumor activity as described above, administering the bacteria to an animal having a tumor can cause the tumor in the animal to disappear. They have also found that even if the animal is treated to generate a tumor after the tumor has disappeared, the animal will not develop a tumor.
- the anti-tumor agent particularly bacteria isolated from the tumor may be used to prevent recurrence of the tumor.
- the antitumor agent according to the present invention can also address the problems related to the treatment methods described above.
- nanomedicines rely on EPR effects with unclear mechanisms and have low selectivity for cancer.
- the antitumor agents (particularly bacterial) according to the invention can exhibit high selectivity against tumors. This high selectivity is thought to be due to, for example, hypoxia, immune evasion, and chemotaxis, ie, it is exerted by distinct mechanisms.
- nanomedicine uses anticancer drugs that have strong side effects
- the antitumor agent according to the present invention does not use anticancer drugs that have strong side effects, and the bacteria used in the present invention have low toxicity.
- nanomedicine requires a great deal of time and effort to synthesize, the bacteria contained in the antitumor agent of the present invention can self-replicate indefinitely, are cheap to feed, and are easy to manage.
- the bacteria contained in the antitumor agent according to the present invention can accumulate with high selectivity in the microenvironment that is common to solid tumors, and can grow and proliferate in the microenvironment. Therefore, it is not necessary to produce antibodies as described above.
- the active ingredients of antibody therapy cannot penetrate the cancer stromal barrier and mainly bind only to the tumor surface, so although immune cells are used, cancer cells deep in the tumor are eliminated. It is difficult.
- the bacteria contained in the antitumor agent according to the present invention can accumulate deep in the tumor and grow and proliferate there.
- the bacteria contained in the antitumor agent according to the present invention can self-replicate indefinitely, are cheap to feed, and are easy to manage.
- bacteria enterica, Listeria monocytogenes, or Escherichia coli that have been weakened through genetic modification are used, but these bacteria run the risk of becoming highly virulent again in the body (reverse mutation), and genetic modification can lead to drug resistance. There is also a possibility. Furthermore, these bacteria also have poor tumor specificity and can accumulate, for example, in normal organs or tissues.
- the bacteria included in the antitumor agent according to the present invention do not need to be genetically modified and can also exhibit high selectivity against tumors. Furthermore, the bacteria used are of low toxicity.
- conventional bacterial therapy is based on passive drug delivery and requires complicated genetic design.
- the bacteria contained in the antitumor agent according to the present invention do not require genetic modification, and furthermore, tumors can be eliminated with only a single administration of bacteria.
- the present invention provides an antitumor agent containing bacteria isolated from a tumor.
- the anti-tumor agent may include, for example, one or more types of bacteria isolated from a tumor; for example, the anti-tumor agent may include one type of bacteria or two types of bacteria isolated from a tumor.
- bacteria isolated from the tumor may be used as an active ingredient that exhibits antitumor activity.
- the bacteria isolated from tumor comprises purple non-sulfur bacteria isolated from tumor.
- purple non-sulfur bacteria isolated from tumors can exhibit excellent antitumor activity. Furthermore, when the purple non-sulfur bacteria are administered to animals (particularly when administered parenterally), they gather in tumors. Therefore, the antitumor agent does not need to be administered directly to the tumor site, but may be administered directly to the tumor site.
- the purple non-sulfur bacteria also have specific optical properties.
- the antitumor agent may be administered for the treatment of a tumor based on the antitumor activity, but in addition to the treatment of the tumor, it may also be used to determine the presence or absence of a tumor or to identify the shape or location of a tumor. may be used.
- Examples of the purple non-sulfur bacteria include: - Bacteria of the genus Rhodopseudomonas, such as Rhodopseudomonas palustris and Rhodopseudomonas pseudopalustris; - Bacteria of the genus Blastochloris, such as Blastochloris viridis and Blastochloris sulfoviridis; - Bacteria of the genus Afifella, such as Afifella marina; - Bacteria of the genus Rhodobacter, such as Rhodobacter blasticus, Rhodobacter capsulatus, and Rhodobacter sphaeroides; - Bacteria of the genus Rubrivivax, such as Rubrivivax gelatinosus; - Bacteria of the genus Pararhodospirillum, such as Pararhodospirillum oryzae and Pararhodo
- the purple non-sulfur bacteria isolated from tumors contained in the antitumor agent according to the present invention may be, for example, any one of the bacteria of the genera listed above or a combination of two or more. good. Furthermore, the purple non-sulfur bacteria isolated from tumors contained in the antitumor agent according to the present invention may be, for example, any one of the types of bacteria listed above or a combination of two or more. Good too.
- the purple non-sulfur bacteria contained in the antitumor agent according to the present invention may be Rhodopseudomonas bacteria, Blastochloris bacteria, or both. These bacteria isolated from tumors can exhibit particularly good antitumor activity. In addition, these bacteria isolated from tumors have the property of gathering in tumors when administered to animals (particularly parenterally), and these bacteria have specific optical properties, making it difficult to use images for tumor diagnosis. It is also useful for generation.
- the red non-sulfur bacteria isolated from the tumor contained in the antitumor agent are any one, two, three, or four of Rhodopseudomonas palustris, Rhodopseudomonas pseudopalustris, Blastochloris viridis, and Blastochloris sulfoviridis. It may be.
- the purple non-sulfur bacteria contained in the antitumor agent according to the invention may at least contain Rhodopseudomonas Palustris isolated from a tumor.
- the purple non-sulfur bacteria contained in the antitumor agent according to the present invention may include only Rhodopseudomonas Palustris isolated from a tumor.
- the purple non-sulfur bacteria contained in the antitumor agent according to the invention are Rhodopseudomonas bacteria.
- Rhodopseudomonas bacteria isolated from tumors can exhibit particularly excellent antitumor activity.
- the purple non-sulfur bacteria included in the antitumor agent according to the invention may be Rhodopseudomonas palustris or Rhodopseudomonas pseudopalustris or both.
- the purple non-sulfur bacteria contained in the antitumor agent according to the invention may at least contain Rhodopseudomonas Palustris isolated from a tumor.
- the antitumor agent according to the present invention further contains other bacteria in addition to the purple non-sulfur bacteria.
- a combination of purple non-sulfur bacteria isolated from tumors and other bacteria isolated from tumors exhibits particularly excellent antitumor activity.
- the other bacterium may be, for example, a bacterium of the genus Proteus.
- the two or more bacteria constituting the combination are preferably isolated together from the same tumor and may be cultured together (co-culture). That is, the antitumor agent according to the present invention may include a combination of the purple non-sulfur bacteria (eg, the Rhodopseudomonas bacteria) and the other bacteria (eg, Proteus bacteria) isolated together from a tumor.
- the Proteus bacteria as the other bacteria may be, for example, any one, two, or three of Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, and Proteus myxofaciens, and preferably Proteus mirabilis.
- the combination of the purple non-sulfur bacterium isolated from tumors and Proteus mirabilis isolated from tumors exhibits particularly excellent antitumor effects.
- the anti-tumor agent may comprise a combination of Rhodopseudomonas palustris and Proteus mirabilis isolated from a tumor. These two types of combined bacteria exhibit particularly excellent antitumor activity.
- the complex bacterium may be, for example, a complex bacterium deposited under accession number: NITE BP-03627.
- the complex bacterium was deposited on March 23, 2022 at the National Institute of Technology and Evaluation (NPMD), 2-Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, 292-0818. 5-8 Room 122).
- NPMD National Institute of Technology and Evaluation
- one of the complex bacteria may be used after being separated from the other.
- the composition ratio of the purple non-sulfur bacteria and the other bacteria in the antitumor agent may be, for example, 99:1 to 1:99, but preferably the content ratio of the purple non-sulfur bacteria is higher.
- the composition ratio of the purple non-sulfur bacteria and the other bacteria in the antitumor agent is, for example, 99:1 to 50:50, more preferably 99:1 to 55:45. good.
- the composition ratio may be, for example, 80:20 to 55:45 or 70:30 to 60:40.
- These composition ratios may be composition ratios based on the CFU of each bacterium. With such a composition ratio, particularly when the content ratio of the purple non-sulfur bacteria is higher than the content ratio of the other bacteria, excellent antitumor activity is exhibited.
- the composition ratio based on the CFU can be determined by inoculating the bacteria in the antitumor agent onto a medium in a petri dish and counting the number of colonies produced by culturing for a predetermined period of time. For example, Proteus mirabilis mentioned above forms colonies within 2 to 3 days after the start of culture, while Rhodopseudomonas palustris, one of the purple non-sulfur bacteria mentioned above, forms colonies within 7 to 10 days after the start of culture. Form.
- the composition ratio may be determined based on the number of colonies. In this way, when the antitumor agent contains the purple non-sulfur bacteria and the other bacteria, in order to determine the composition ratio of these bacteria, the difference in the period for each bacteria to form a colony is determined. used.
- the number of colonies may alternatively be counted based on the optical characteristics of the purple non-sulfur bacteria and the other bacteria.
- the purple non-sulfur bacteria have certain optical properties, while the other bacteria do not have the same optical properties. Therefore, it is possible to determine which bacteria the colonies formed on the medium in the petri dish are based on the presence or absence of the optical characteristics, and then count the number of colonies of each bacteria.
- the bacteria isolated from said tumor may have optical properties as described below.
- Bacteria isolated from tumors for example, have different optical properties than commercially available bacteria of the same species. It is thought that having such optical properties is involved in exhibiting antitumor activity.
- Bacteria isolated from tumors contained in the antitumor agent of the present invention may exhibit the following characteristics regarding the absorption spectrum. Bacteria isolated from the tumor (particularly the purple non-sulfur bacteria) have higher light absorption properties than normal bacteria of the same species (eg commercially available). It is believed that having this higher light absorption property is related to the fact that the bacteria (particularly the purple non-sulfur bacteria) have antitumor activity.
- the absorption spectrum at 808 nm was measured.
- the absorbance is preferably 0.029 or more, more preferably 0.030 or more, even more preferably 0.031 or more, 0.032 or more, 0.033 or more, 0.034 or more, or 0.035. It may be more than that.
- This high absorbance is considered to be related to the fact that the bacteria (particularly the purple non-sulfur bacteria) have antitumor activity.
- the upper limit value of the absorbance at 808 nm does not need to be set in particular, but may be, for example, 0.10 or less, 0.9 or less, or 0.8 or less.
- the absorption spectrum is measured as described in the Examples below.
- the absorption spectrum at 865 nm was measured.
- the absorbance is preferably 0.032 or more, more preferably 0.033 or more, even more preferably 0.034 or more, 0.035 or more, 0.036 or more, 0.037 or more, or 0.038. It may be more than that.
- This high absorbance is considered to be related to the fact that the bacteria (particularly the purple non-sulfur bacteria) have antitumor activity.
- the upper limit value of the absorbance at 865 nm does not need to be set in particular, but may be, for example, 0.11 or less, 0.10 or less, or 0.09 or less.
- the absorbance at 808 nm is preferably 0.029 or more, more preferably 0.030 or more, even more preferably 0.031 or more, 0. .032 or more, 0.033 or more, 0.034 or more, or 0.035 or more
- the absorbance at 865 nm is preferably 0.032 or more, more preferably 0.033 or more, and even more
- it is 0.034 or more, 0.035 or more, 0.036 or more, 0.037 or more, or 0.038 or more. It is believed that both such high absorbances at these two wavelengths are associated with the antitumor activity of said bacteria, especially said purple non-sulfur bacteria.
- Bacteria isolated from tumors contained in the antitumor agent of the present invention may exhibit the following characteristics regarding fluorescence spectra. Bacteria isolated from the tumor (particularly the purple non-sulfur bacteria) have higher fluorescence properties than normal bacteria of the same species (eg commercially available). It is believed that having the higher fluorescence properties is associated with the bacteria (particularly the purple non-sulfur bacteria) having antitumor activity.
- the fluorescence at 888 nm The strength is preferably 4.4 or more, more preferably 4.5 or more, and even more preferably 5.0 or more, 7.0 or more, or 9.0 or more.
- the upper limit value of the fluorescence intensity does not need to be set in particular, but may be, for example, 30 or less, 25 or less, or 20 or less. It is believed that such a high fluorescence intensity is related to the fact that the bacteria (particularly the purple non-sulfur bacteria) have antitumor activity.
- the fluorescence spectra are measured as described in the Examples below.
- the bacteria isolated from the tumor contained in the antitumor agent of the present invention have no or very low toxicity, as explained below.
- Bacteria isolated from the tumor may have such virulence properties that are different from, for example, commercially available bacteria of the same species. The fact that the bacteria isolated from the tumor have such virulence properties further enhances the usefulness of the anti-tumor agent.
- the survival rate of the mouse for 40 days after the administration is preferably 90% or more, more preferably may be 95% or more, for example 100%.
- the bacteria included in the antitumor agent of the invention may have such toxicity properties, in particular extremely low toxicity properties.
- Various conditions for specifying the mouse survival rate are as described in the Examples below.
- the bacteria isolated from the tumor included in the antitumor agent of the present invention may be bacteria that have immunostimulatory properties.
- the anti-tumor agent may treat tumors through its immunostimulatory properties.
- the immunostimulatory property may be, for example, a property that activates immune cells.
- the immune cells include innate immune cells, and examples of the innate immune cells include macrophages, NK cells, and neutrophils. That is, the bacteria isolated from the tumor may have properties that activate innate immune cells, such as one, two, or two of macrophages, NK cells, and neutrophils. It may be a bacterium that has properties that activate all three.
- examples of the immune cells include acquired immune cells, and examples of the acquired immune cells include T cells and B cells. That is, the bacteria isolated from the tumor may have the property of activating acquired immune cells, for example, the bacterium may have the property of activating T cells, B cells, or both. It's fine. It is thought that such immune cell activation properties contribute to the bacteria isolated from the tumor exhibiting antitumor activity.
- the immunostimulatory property may be, for example, a property that enhances the expression of an anti-tumor marker.
- the anti-tumor marker include necrosis markers and apoptosis markers, and specific examples of each include TNF- ⁇ and Caspase-3. That is, the bacteria isolated from the tumor may have the property of enhancing the expression of an anti-tumor marker, for example, the bacterium may have the property of enhancing the expression of a necrosis marker or an apoptosis marker macrophage, or both of these. It's fine. It is thought that such anti-tumor marker expression enhancement properties also contribute to the bacteria isolated from the tumor exhibiting anti-tumor activity.
- the bacteria isolated from the tumor since it has such immunostimulatory properties, it may be used as an active ingredient of an immunostimulatory agent. That is, the present invention also provides an immunostimulant containing bacteria isolated from the tumor.
- the immunostimulatory agent may be referred to as an immunostimulatory composition.
- the structure related to the antitumor agent described herein may be adopted as the structure of the immunostimulant.
- the bacteria isolated from a tumor contained in the anti-tumor agent of the present invention comprises a bacterium of the genus Proteus.
- Bacteria of the genus Proteus isolated from tumors were prepared in 1. above. As mentioned above, it can exhibit excellent antitumor activity.
- the bacteria of the genus Proteus gather in tumors when administered to animals, especially when administered parenterally, so it is not necessary to administer them directly to the tumor site; good.
- the Proteus bacterium may be administered for the treatment of tumors based on the antitumor activity.
- the Proteus bacterium may be a bacterium isolated from a tumor. That is, the antitumor agent may contain only isolated Proteus bacteria.
- the Proteus bacterium may be, for example, any one, two, or three of Proteus mirabilis, Proteus vulgaris, and Proteus myxofaciens, and preferably Proteus mirabilis. Proteus mirabilis isolated (especially isolated) from tumors exhibits particularly good antitumor activity.
- the Proteus mirabilis may be, for example, a bacterium deposited with accession number: NITE BP-03626. The bacterium was deposited on March 23, 2022 at the National Institute of Technology and Evaluation (NPMD), 2-5 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, 292-0818. -8 Room 122).
- the Proteus bacterium isolated from the tumor contained in the antitumor agent of the present invention has no or very low toxicity, as explained below.
- Bacteria isolated from the tumor may have such virulence properties that are different from, for example, commercially available bacteria of the same species. The fact that the bacteria isolated from the tumor have such virulence properties further enhances the usefulness of the anti-tumor agent.
- the survival rate of the mouse for 40 days after the administration is preferably 90% or more. , more preferably 95% or more, for example 100%.
- the Proteus bacterium contained in the antitumor agent of the present invention may have such toxicity characteristics, particularly extremely low toxicity characteristics.
- Various conditions for specifying the mouse survival rate (for example, the medium in which the administered bacteria are suspended, the preparation method thereof, etc.) are as described in the Examples below.
- the Proteus bacterium isolated from the tumor may be a bacterium with immunostimulatory properties.
- the anti-tumor agent may treat tumors through its immunostimulatory properties.
- the immunostimulatory property may be, for example, a property that activates immune cells.
- the immune cells include innate immune cells, and examples of the innate immune cells include macrophages, NK cells, and neutrophils. That is, the Proteus bacterium isolated from the tumor may have the property of activating innate immune cells, for example, one or two of macrophages, NK cells, and neutrophils. , or a bacterium that has properties that activate all three.
- examples of the immune cells include acquired immune cells, and examples of the acquired immune cells include T cells and B cells. That is, the Proteus bacterium isolated from the tumor may have the property of activating adaptive immune cells, such as bacteria having the property of activating T cells, B cells, or both. It may be. It is thought that such immune cell activation properties contribute to the antitumor activity of Proteus bacteria isolated from the tumor.
- the immunostimulatory property may be, for example, a property that enhances the expression of an anti-tumor marker.
- the anti-tumor marker include necrosis markers and apoptosis markers, and specific examples of each include TNF- ⁇ and Caspase-3. That is, the Proteus bacterium isolated from the tumor may have the property of enhancing the expression of an anti-tumor marker, for example, a bacterium having the property of enhancing the expression of a necrosis marker, an apoptotic marker macrophage, or both of these. It may be. It is thought that such anti-tumor marker expression enhancement properties also contribute to the anti-tumor activity of Proteus bacteria isolated from the tumor.
- the Proteus bacteria isolated from the tumor since the Proteus bacteria isolated from the tumor has such immunostimulatory properties, it may be used as an active ingredient of an immunostimulatory agent. That is, the present invention also provides an immunostimulant containing a Proteus bacterium isolated from the tumor.
- the immunostimulatory agent may be referred to as an immunostimulatory composition.
- the structure related to the antitumor agent described herein may be adopted as the structure of the immunostimulant.
- the anti-tumor agent of the present invention contains Lactococcus bacteria from the tumor.
- the bacteria of the genus Lactococcus isolated from the tumor were prepared in 1. above. As mentioned above, it can exhibit excellent antitumor activity.
- the bacteria of the genus Lactococcus gather in tumors when administered to animals, especially when administered parenterally, so it is not necessary to administer them directly to the tumor site; Good too.
- the Lactococcus bacterium may be administered for the treatment of tumors based on its antitumor activity.
- the Lactococcus bacterium may be a bacterium isolated from a tumor. That is, the antitumor agent may contain only isolated Proteus bacteria as bacteria.
- the Lactococcus bacterium has, for example, sequence ID No. described below.
- a lactobacillus having a 16S ribosomal RNA gene having a sequence homology of 95% or more, preferably 96%, more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, particularly preferably 99% or more with the base sequence of No. 3. It may be a Coccus bacterium.
- the Lactococcus bacterium may have a spherical or oval cell-like shape.
- the Lactococcus bacteria can be grown individually, in pairs, or in chains. Furthermore, the Lactococcus bacterium may not form spores or be motile.
- Lactococcus bacteria having such sequence homology examples include Lactococcus formosensis, Lactococcus garvieae, and Lactococcus garvieae subsp. Garvieae.
- the Lactococcus bacterium has the sequence ID No. described below. It may be a Lactococcus bacterium that has 100% homology with the base sequence of No. 3, for example, it may be a Lactococcus bacterium that has 100% sequence identity.
- the Lactococcus bacterium may be, for example, a bacterium deposited with accession number: NITE BP-03694. The said bacterium was deposited on August 2, 2022, at the National Institute of Technology and Evaluation (NPMD), 2-5 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, 292-0818. -8 Room 122).
- the Lactococcus bacterium isolated from the tumor contained in the antitumor agent of the present invention may have antitumor activity as described below.
- the Lactococcus bacteria contained in the antitumor agent is administered in an amount of 2 ⁇ 10 8 CFU in a single dose through the tail vein of a colon cancer model mouse prepared as described in 3.2 below.
- the bacteria may have the property of maintaining or reducing the size (approximately 100 mm 3 ) of the solid tumor formed in the mouse model, especially if the solid tumor grows within 5 days after the single administration.
- the bacteria may have the property of reducing the size of the bacteria to, for example, 50 mm 3 or less, 40 mm 3 or less, 30 mm 3 or less, 20 mm 3 or less, or 10 mm 3 or less.
- the Lactococcus bacterium contained in the antitumor agent of the present invention may have such antitumor activity.
- Various conditions for specifying the degree of reduction in the size of the solid tumor are as described in 3.2 below.
- the Lactococcus bacterium isolated from the tumor may be a bacterium with immunostimulatory properties.
- the anti-tumor agent may treat tumors through its immunostimulatory properties.
- the immunostimulatory properties may be those described above for purple non-sulfur bacteria or Proteus bacteria, and these descriptions also apply for said Lactococcus bacteria.
- the Lactococcus bacteria isolated from the tumor may be used as an active ingredient of an immunostimulant. That is, the present invention also provides an immunostimulant containing a Lactococcus bacterium isolated from the tumor.
- the immunostimulatory agent may be referred to as an immunostimulatory composition.
- the configuration regarding the antitumor agent described herein may be employed as the configuration of the immunostimulant.
- the anti-tumor agent of the present invention contains Enterococcus bacteria from the tumor.
- Bacteria of the genus Enterococcus isolated from the tumor were prepared in 1. above. As mentioned above, it can exhibit excellent antitumor activity.
- the bacteria of the genus Enterococcus gather in tumors when administered to animals, especially when administered parenterally, so it is not necessary to administer them directly to the tumor site; good.
- the Enterococcus bacterium may be administered for the treatment of tumors based on the antitumor activity.
- the Enterococcus bacterium may be a bacterium isolated from a tumor. That is, the antitumor agent may contain only isolated Enterococcus bacteria as bacteria.
- the Enterococcus bacteria include, for example, any one or two of Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus alcedinis, Enterococcus bulliens, Enterococcus caccae, Enterococcus devriesei, Enterococcus eurekensis, Enterococcus rivorum, Enterococcus saccharolyticus, and Enterococcus termitis, or 3 and preferably Enterococcus faecalis.
- Enterococcus faecalis isolated (especially isolated) from tumors exhibits particularly good antitumor activity.
- the Enterococcus faecalis may be, for example, a bacterium deposited with accession number: NITE BP-03690. The bacterium was deposited on July 19, 2022 at the National Institute of Technology and Evaluation (NPMD), 2-5 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture, 292-0818. -8 Room 122).
- NPMD National Institute of Technology and Evaluation
- the Enterococcus bacterium isolated from the tumor contained in the antitumor agent of the present invention may have antitumor activity as described below.
- the Enterococcus bacterium contained in the antitumor agent is administered once in an amount of 2 ⁇ 10 8 CFU through the tail vein of a colon cancer model mouse prepared as described in 3.2 below.
- the bacteria may have the property of maintaining or reducing the size (approximately 100 mm 3 ) of a solid tumor formed in the mouse model, particularly within 5 days after the single administration.
- the bacteria may have the property of reducing the size of, for example, to 50 mm 3 or less, 40 mm 3 or less, 30 mm 3 or less, 20 mm 3 or less, or 10 mm 3 or less.
- the Enterococcus bacterium contained in the antitumor agent of the present invention may have such antitumor activity.
- Various conditions for specifying the degree of reduction in the size of the solid tumor are as described in 3.2 below.
- the Enterococcus bacterium isolated from the tumor may be a bacterium with immunostimulatory properties.
- the anti-tumor agent may treat tumors through its immunostimulatory properties.
- the immunostimulatory properties may be those described above with respect to purple non-sulfur bacteria or Proteus bacteria, and these descriptions also apply to said Enterococcus bacteria.
- the Enterococcus bacteria isolated from the tumor may be used as an active ingredient of an immunostimulant. That is, the present invention also provides an immunostimulant containing an Enterococcus bacterium isolated from the tumor.
- the immunostimulatory agent may be referred to as an immunostimulatory composition.
- the configuration regarding the antitumor agent described herein may be employed as the configuration of the immunostimulant.
- the anti-tumor agent of the present invention contains a bacterium of the genus Acinetobacter from the tumor.
- Bacteria of the genus Acinetobacter isolated from the tumor were prepared in 1. above. As mentioned above, it can exhibit excellent antitumor activity.
- the bacteria of the genus Acinetobacter gather in tumors when administered to animals, especially when administered parenterally, so it is not necessary to administer them directly to the tumor site; good.
- the Acinetobacter bacterium may be administered for the treatment of tumors based on the antitumor activity.
- the Acinetobacter bacterium may be a bacterium isolated from a tumor. That is, the antitumor agent may contain only isolated bacteria of the genus Acinetobacter.
- the bacteria of the genus Acinetobacter may be, for example, any one, two, or three of Acinetobacter radioresistens, Acinetobacter albensis, and Acinetobacter baumannii, and preferably Acinetobacter radioresistens.
- Acinetobacter radioresistens isolated (especially isolated) from tumors exhibits particularly good antitumor activity.
- the Acinetobacter bacteria isolated from the tumor contained in the antitumor agent of the present invention may have antitumor activity as described below.
- the Acinetobacter bacteria contained in the antitumor agent is administered in an amount of 2 ⁇ 10 6 CFU/head once from the tail vein of a colon cancer model mouse prepared as described in 3.3 below.
- the bacteria may have the property of suppressing the increase in the size (approximately 100 mm 3 ) of solid tumors formed in the model mouse when administered, or the bacteria may have the property of maintaining or reducing the size. It may be.
- the Acinetobacter bacteria contained in the antitumor agent of the present invention may have such antitumor activity.
- Various conditions for specifying the degree of reduction in the size of the solid tumor are as described in 3.3 below.
- the Acinetobacter bacterium isolated from the tumor may be a bacterium with immunostimulatory properties.
- the anti-tumor agent may treat tumors through its immunostimulatory properties.
- the immunostimulatory properties may be those described above with respect to purple non-sulfur bacteria or Proteus bacteria, and these descriptions also apply to said Enterococcus bacteria.
- the Acinetobacter bacteria isolated from the tumor may be used as an active ingredient of an immunostimulant. That is, the present invention also provides an immunostimulant containing Acinetobacter bacteria isolated from the tumor.
- the immunostimulatory agent may be referred to as an immunostimulatory composition.
- the configuration regarding the antitumor agent described herein may be employed as the configuration of the immunostimulant.
- the anti-tumor agent of the present invention contains a bacterium of the genus Bacillus from the tumor.
- Bacillus bacteria isolated from the tumor were prepared in 1. above. As mentioned above, it can exhibit excellent antitumor activity.
- the bacteria of the genus Bacillus gather in tumors when administered to animals, especially when administered parenterally, so it is not necessary to administer them directly to the tumor site; good. Additionally, the Bacillus bacterium may be administered for the treatment of tumors based on the antitumor activity.
- the Bacillus bacterium may be a bacterium isolated from a tumor. That is, the antitumor agent may contain only isolated Bacillus bacteria as bacteria.
- the Bacillus bacteria may be, for example, any one, two, or three of Bacillus thuringiensis, Bacillus agri, and Bacillus badius, and preferably Bacillus thuringiensis.
- Bacillus bacterium isolated from the tumor contained in the antitumor agent of the present invention may have antitumor activity as described below.
- the Bacillus bacteria contained in the antitumor agent is administered in an amount of 2 ⁇ 10 8 CFU/head once from the tail vein of a colon cancer model mouse prepared as described in 3.3 below.
- the bacterium may have the property of suppressing the increase in the size (approximately 100 mm 3 ) of a solid tumor formed in the model mouse when administered, or the bacterium may have the property of maintaining or reducing the size of the solid tumor formed in the model mouse. It can be bacteria.
- the Bacillus bacteria contained in the antitumor agent of the present invention may have such antitumor activity.
- Various conditions for specifying the degree of reduction in the size of the solid tumor are as described in 3.3 below.
- the Bacillus bacterium isolated from the tumor may be a bacterium with immunostimulatory properties.
- the anti-tumor agent may treat tumors through its immunostimulatory properties.
- the immunostimulatory properties may be those described above for purple non-sulfur bacteria or Proteus bacteria, and these descriptions also apply for said Bacillus bacteria.
- the Bacillus bacteria isolated from the tumor may be used as an active ingredient of an immunostimulant. That is, the present invention also provides an immunostimulant containing a Bacillus bacterium isolated from the tumor.
- the immunostimulatory agent may be referred to as an immunostimulatory composition.
- the configuration regarding the antitumor agent described herein may be employed as the configuration of the immunostimulant.
- the anti-tumor agent of the present invention contains bacteria of the genus Cutibacterium from the tumor.
- Bacteria of the genus Cutibacterium isolated from the tumor were prepared in 1. above. As mentioned above, it can exhibit excellent antitumor activity.
- the bacteria of the genus Cutibacterium gather in tumors when administered to animals, especially when administered parenterally, so it is not necessary to administer them directly to the tumor site; It's okay.
- the Cutibacterium bacterium may be administered for the treatment of tumors based on the antitumor activity.
- the Cutibacterium bacterium may be a bacterium isolated from a tumor. That is, the antitumor agent may include only isolated Cutibacterium bacteria.
- the Cutibacterium genus bacteria may be, for example, any one, two, or three of Cutibacterium acnes, Cutibacterium avidum, and Cutibacterium granulosum, and preferably Cutibacterium acnes. Cutibacterium acnes isolated (especially isolated) from tumors exhibits particularly good antitumor activity.
- the Cutibacterium bacteria isolated from the tumor contained in the antitumor agent of the present invention may have antitumor activity as described below.
- the Cutibacterium bacteria contained in the anti-tumor agent are extracted from the tail vein of a colon cancer model mouse prepared as described in 3.3 below in an amount of 2 ⁇ 10 8 CFU/head.
- the bacterium may have the property of suppressing the increase in the size (approximately 100 mm 3 ) of solid tumors formed in the model mouse when administered once, or the bacterium may have the property of maintaining or reducing the size. It may be a bacterium that has The Cutibacterium bacteria contained in the antitumor agent of the present invention may have such antitumor activity.
- Various conditions for specifying the degree of reduction in the size of the solid tumor are as described in 3.3 below.
- the Cutibacterium bacteria isolated from the tumor may be bacteria with immunostimulatory properties.
- the anti-tumor agent may treat tumors through its immunostimulatory properties.
- the immunostimulatory properties may be those described above with respect to purple non-sulfur bacteria or Proteus bacteria, and these descriptions also apply to said Cutibacterium bacteria.
- Cutibacterium bacteria isolated from the tumor may be used as an active ingredient of an immunostimulant. That is, the present invention also provides an immunostimulant containing Cutibacterium bacteria isolated from the tumor.
- the immunostimulatory agent may be referred to as an immunostimulatory composition.
- the configuration regarding the antitumor agent described herein may be employed as the configuration of the immunostimulant.
- the bacteria isolated from said tumor may be other bacteria present within the tumor, in particular tumor-resident bacteria. It's good to be there.
- examples of such bacteria include bacteria belonging to the order Enterobacteriales, bacteria belonging to the order Pseudomonadales, bacteria belonging to the order Burkholderiales, bacteria belonging to the order Rhodobacterales, bacteria belonging to the order Aeromonadales ( Bacteria belonging to the order Aeromonadales, bacteria belonging to the order Bacillales, bacteria belonging to the order Clostridiales, bacteria belonging to the order Lactobacillales, bacteria belonging to the order Actinomycetes, bacteria belonging to the order Bifidobacterales ( Bifidobacteriales, Bacteroidales, Flavobacteriales, Fusobacteriales, Streptophyta, Corynebacterales ( Examples include bacteria belonging to the order Corynebacteriales, bacteria belonging to the order Rhodospirillales, and bacteria belonging to the order
- Bacteria of the order Enterobacteriales for example bacteria of the family Enterobacteriaceae, in particular bacteria of the genus Proteus, bacteria of the genus Enterobacter, bacteria of the genus Klebsiella and bacteria of the genus Citrobacter, more particularly as described in 2.1.
- Bacteria of the order Pseudomonadales such as bacteria of the family Pseudomonadaceae and bacteria of the family Moraxellaceae, in particular bacteria of the genus Pseudomonas and bacteria of the genus Acinetobacter, more particularly Pseudomonas argentinensis, and Acinetobacter US_424; Bacteria of the order Rhodobacterales, such as bacteria of the family Rhodobacteriaceae, in particular bacteria of the genus Paracoccus, more particularly Paracoccus marcusii; Bacteria of the order Sphingomonadales, such as bacteria of the family Sphingomadaceae, in particular bacteria of the genus Sphingomonas, more particularly Sphingomonas;
- any one type of bacteria or a combination of two or more types of bacteria belonging to the families or genera listed above may be isolated from the tumor. That is, in the present invention, one type of bacteria or a combination of two or more types may be used as the bacteria isolated from the tumor.
- the antitumor agent according to the present invention may contain bacteria isolated from the tumor in a viable state. That is, the bacteria isolated from the tumor may be administered to an animal in a viable state. It is thought that this makes it easier for the bacteria to reach the tumor site, and that the antitumor activity of the bacteria is more effectively exerted. Reaching the tumor site is also useful for diagnosis as described below. Note that the antitumor agent according to the present invention may contain bacteria isolated from the tumor in a dead state.
- anti-tumor agent may mean an agent, particularly a drug, used to treat tumors occurring in animals.
- Treatment of a tumor includes, for example, reducing the size of a tumor, suppressing tumor growth, killing or reducing tumor cells, or suppressing tumor cell proliferation. It can mean something.
- Antineoplastic agent may refer to an agent used to treat or prevent animals having tumors.
- the animal is, for example, a mammal, in particular a human, but may also be a non-human animal.
- the non-human animal may be, for example, an agricultural animal or a companion animal, such as a cow, horse, sheep, goat, pig, dog, cat, or rabbit.
- the above-mentioned “agent” may be an agent consisting of one type of component, but may also be an agent containing two or more components. At least one of these components is a bacterium isolated from the tumor described above. Since the agent may contain two or more components, in this case, the antitumor agent of the present invention may be referred to as an antitumor composition, or even as an antitumor pharmaceutical composition. good. That is, the antitumor agent of the present invention may contain other components in addition to bacteria isolated from a tumor. The other components may be appropriately selected by those skilled in the art depending on factors such as the method or site of administration of the antitumor agent.
- the antitumor agent of the present invention may be used particularly to treat malignant tumors or benign tumors, and is particularly preferably used to treat malignant tumors.
- the malignant tumor is also called "cancer".
- Cancer can be classified into solid cancers and blood cancers. Solid cancers can be further classified into carcinomas and sarcomas.
- the anti-tumor agent may be referred to as an anti-cancer agent or a composition for treating cancer or a composition for treating cancer.
- the anti-tumor agents of the invention may be used to treat solid cancers or hematological cancers, in particular solid cancers, such as to treat carcinomas or to treat sarcomas. may be used to
- the antitumor agents of the present invention can be used to treat various cancers.
- One of the mechanisms of the antitumor activity of the antitumor agent of the present invention is thought to be activation of immune cells, as described below. That is, the antitumor agent is considered to exert antitumor activity via the activated immune cells. Therefore, the antitumor agent of the present invention is considered to be effective not only against one specific type of cancer but also against various cancers, and its effectiveness against various cancers was demonstrated in the Examples below. It is shown.
- the antitumor agent of the present invention may be used to treat cancer.
- the antitumor agent of the present invention can be used for, for example, head and neck cancer (e.g., pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, etc.), esophageal cancer, stomach cancer, duodenal cancer, colorectal cancer (e.g., colon cancer, rectal cancer, etc.). (e.g.), liver cancer, gallbladder cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer, anal cancer, kidney cancer, bladder cancer, prostate cancer, uterine cancer (e.g. cervical cancer, endometrial cancer) ), and ovarian cancer.
- head and neck cancer e.g., pharyngeal cancer, laryngeal cancer, tongue cancer, etc.
- esophageal cancer e.g., stomach cancer, duodenal cancer, colorectal cancer (e.g., colon cancer, rectal cancer, etc.).
- the antitumor agent of the present invention may be used to treat sarcoma.
- the antitumor agent of the present invention is, for example, an agent used to treat any one of osteosarcoma, chondrosarcoma, rhabdomyosarcoma, leiomyosarcoma, fibrosarcoma, liposarcoma, and angiosarcoma. It's good to be there.
- the antitumor agent of the present invention may be formulated as a liquid preparation. That is, the liquid preparation may be a liquid preparation (particularly the bacterial dispersion) containing bacteria isolated from a tumor according to the present invention.
- the liquid component other than the bacteria in the liquid preparation may be, for example, an injection solution or an infusion solution used in the pharmaceutical field, and more specifically, it may be an isotonic solution, a hypotonic solution, or a hypertonic solution. It's fine.
- the liquid may be a saline solution (physiological saline), a sugar solution, a buffer solution, or the like. Further, the liquid may be phosphate buffered saline. Liquid dosage forms are particularly suitable for delivering the antitumor agent of the invention to the tumor while maintaining its antitumor activity.
- the antitumor agent of the present invention is preferably administered parenterally.
- the antitumor agent of the present invention may be administered intravascularly (for example, intravenously or intraarterially), subcutaneously, or intramuscularly.
- the drug may be administered intrathecally or intrathecally.
- the antitumor agent of the present invention is administered intravascularly (eg, intravenously or intraarterially).
- Bacteria isolated from tumors contained in the antitumor agent of the present invention have the property of gathering at the tumor site as described above, so when administered intravascularly, the bacteria can easily reach the tumor site. Intravascular administration is also relatively less invasive.
- bacteria when bacteria are administered intravascularly, they often exhibit toxicity and adversely affect patients.
- the bacteria isolated from tumors contained in the antitumor agent of the present invention do not exhibit such toxicity, or even if they do, the degree of toxicity is very low.
- the antitumor agent of the present invention may also be administered directly to or near the tumor site using, for example, a syringe or other tube. Furthermore, the antitumor agent of the present invention may be administered orally depending on the location of the tumor.
- the amount of bacteria isolated from the tumor per administration is, for example, 10 4 CFU/kg body weight to 10 11 CFU/kg body weight, preferably 10 5 CFU/kg body weight to 10 11 body weight. CFU/kg body weight, more preferably 10 6 CFU/kg body weight to 10 11 CFU/kg body weight. If the amount of bacteria administered is too low, the antitumor effect may be reduced. Furthermore, it is undesirable from a cost standpoint if the amount of bacteria administered is too large.
- the anti-tumor agent of the present invention may contain bacteria isolated from the tumor at a concentration of, for example, 10 5 CFU/ml to 10 12 CFU/ml, preferably 10 6 CFU/ml to 10 6 CFU/ml.
- the content may be 10 12 CFU/ml, more preferably 10 7 CFU/ml to 10 12 CFU/ml.
- the antitumor agent of the present invention may be administered only once, or may be administered two or more times.
- the antitumor agent of the present invention can exhibit its effect with a single administration, but may be administered two or more times as necessary.
- the antitumor agent of the present invention may be administered once in a day, or may be administered two or more times (for example, two or three times) in a day.
- the antitumor agent of the present invention may be administered daily, or every other day or every two days. Further, the antitumor agent may be administered every week, every two weeks, every three weeks, or every four weeks.
- the antitumor agent of the present invention may contain additives used in formulation in the pharmaceutical field, and may contain various components such as a pH adjuster and a coloring agent. Furthermore, the antitumor agent of the present invention may contain known or future-discovered pharmaceutical ingredients for tumor treatment, as long as the effects of the present invention are not impaired.
- the antitumor agent of the present invention may be formulated by any known method depending on the dosage form.
- the antitumor agent of the present invention is not only used for tumor treatment as described above, but may also be used for tumor diagnosis.
- the bacteria isolated from the tumor have the property of gathering in the tumor when administered. Therefore, by utilizing this characteristic, the site where the bacteria are concentrated can be identified as a tumor. For the diagnosis, please refer to the explanation below.
- bacteria as described above are used.
- the bacteria may be produced, for example, as follows.
- tumor recovery step S11 In the tumor recovery step, the tumor is recovered from the tumor-bearing animal. Such retrieval may be performed, for example, by biopsy.
- the tumor may be, for example, a tumor formed from mammalian tumor cells, in particular a tumor formed from human tumor cells.
- the tumor-bearing animal may for example be a mammal, especially a rodent, but also a primate, especially a human.
- the tumor-bearing animal may be administered purple non-sulfur bacteria prior to the collection.
- the purple non-sulfur bacteria to be administered may be any of the purple non-sulfur bacteria listed in 2.1.1 above, preferably Rhodopseudomonas bacteria or Blastochloris bacteria, and more preferably Rhodopseudomonas bacteria or Blastochloris bacteria. It may be a Pseudomonas bacterium. Specific species of these bacteria are as described in 2.1.1 above, and any one or more species of bacteria may be administered.
- the bacteria administered may be commercially available.
- the administration is, for example, parenterally, particularly intravenously. After a predetermined period of time after said administration, for example 1 to 10 days, particularly 2 to 5 days, the above-mentioned tumor recovery is performed. It is thought that the administered purple non-sulfur bacteria reach the tumor after such a period of time has elapsed.
- bacteria originally present within the tumor may be recovered.
- bacteria that originally exist within the tumor may be recovered, or bacteria that have been administered and have reached the tumor through the above-mentioned bacterial administration may be recovered.
- Bacteria isolation step S12 bacteria are separated from the tumor recovered in the tumor recovery step.
- the tumor obtained by the biopsy is added to a predetermined liquid (eg, a buffer) and homogenized.
- the homogenization results in a liquid in which tumor cells and bacteria are suspended.
- the tumor cells are precipitated and the bacteria are present in the supernatant.
- the isolation technique is not limited thereto. Separation may also be accomplished by other techniques known in the art. It is thought that the presence of bacteria in a tumor and the isolation of the bacteria from the tumor contribute to the acquisition of antitumor activity by the bacteria.
- Bacterial culture step S13 Bacterial culture step S13
- the bacteria isolated from the tumor in the bacteria isolation step are cultured. Cultivation of bacteria isolated from tumors is also thought to contribute to the acquisition of antitumor activity by the bacteria.
- the supernatant may be added to, for example, a general-purpose agar medium in a Petri dish, and then cultured. Colonies are thereby formed on the medium. The colony may be used as the bacteria isolated from the tumor in the present invention.
- the general-purpose agar medium may be, for example, a peptone-containing medium or a peptone-free medium.
- the peptone contained in the peptone-containing medium may be, for example, one or more of casein peptone, meat peptone, gelatin peptone, and soybean peptone.
- the peptone-containing medium may be, for example, LB medium or polypeptone medium.
- the peptone-containing medium may further contain an extract in addition to the peptone.
- the extract may be, for example, a yeast extract or a meat extract (especially beef extract) or a combination thereof.
- the peptone-free medium includes, for example, an extract.
- the extract may be a yeast extract or a meat extract (especially beef extract) or a combination thereof, as described above.
- the peptone-free medium may be, for example, ATCC543 medium.
- the general-purpose agar medium may be appropriately selected by those skilled in the art depending on the bacteria to be isolated.
- the colonies (particularly the bacteria of the colonies) formed on the agar medium are further cultured in a liquid medium.
- the liquid medium may be a liquid general purpose medium.
- the liquid general-purpose medium may also be, for example, a peptone-containing medium or a peptone-free medium, as described above.
- the peptones and extracts contained in these media are as explained above, and the same explanation also applies to the liquid media.
- the liquid medium may be appropriately selected by those skilled in the art depending on the bacteria to be isolated.
- the liquid medium may be a liquid medium to which cysteine is not added.
- the liquid medium may be, for example, a liquid medium to which no cysteine is added, which contains peptone, and which contains an extract (particularly a yeast extract).
- the liquid medium may be, for example, LB medium or polypeptone medium to which cysteine is not added.
- the liquid medium may be a liquid medium without added cysteine and without peptone and containing an extract, in particular a yeast extract.
- An example of such a medium is ATCC543 medium to which cysteine is not added.
- the bacteria cultured in the liquid medium may be further cultured on a general-purpose agar medium to form colonies.
- the general-purpose agar medium may be, for example, a general-purpose agar medium to which deoxycholic acid is added.
- the ratio (%) of the content (g) of deoxycholic acid in the agar medium to the amount (g) of the agar medium may be, for example, 0.01% to 1%, preferably 0.03% to 1%. It may be 0.5%, more preferably 0.05% to 0.3%.
- the general-purpose agar medium may be the same agar medium (fresh medium) as the general-purpose agar medium described at the beginning of this step, except that deoxycholic acid is added. Colonies are formed on the medium by the culture. The formed colonies may be further cultured in a liquid medium.
- the liquid medium may be the same medium (fresh medium) used in the previous liquid medium culture.
- bacteria cultured in a medium to which cysteine is not added may be used as an active ingredient of the antitumor agent of the present invention.
- This embodiment can be applied, for example, to purple non-sulfur bacteria (especially Rhodopseudomonas sp.) having anti-tumor activity or purple non-sulfur bacteria (especially Rhodopseudomonas sp.) having anti-tumor activity and other bacteria (especially Proteus sp. bacteria) and is suitable for obtaining complex bacteria.
- This embodiment is also suitable, for example, for obtaining Lactococcus bacteria with antitumor activity and Enterococcus bacteria with antitumor activity.
- the liquid medium may be a cysteine-added liquid medium.
- the liquid medium may be, for example, a liquid medium to which cysteine is added, contains peptone, and contains an extract (particularly yeast extract).
- the liquid medium may be, for example, LB medium or polypeptone medium to which cysteine is added.
- the liquid medium may be a liquid medium supplemented with cysteine and free of peptone and containing an extract, in particular a yeast extract.
- ATCC 543 medium supplemented with cysteine mention may be made of ATCC 543 medium supplemented with cysteine.
- the cysteine content ratio in the liquid medium to which cysteine has been added is, for example, 0.1% to 10% when expressed as the ratio (%) of the amount (g) of cysteine to the amount (g) of the medium. It may be more preferably 1% to 5%, and even more preferably 2% to 4%.
- the bacteria cultured in the liquid medium may be further cultured on a general-purpose agar medium to form colonies.
- the general-purpose agar medium may be, for example, a general-purpose agar medium to which deoxycholic acid and cysteine are added.
- the ratio (%) of the content (g) of deoxycholic acid in the agar medium to the amount (g) of the agar medium may be, for example, 0.01% to 1%, preferably 0.03% to 1%. It may be 0.5%, more preferably 0.05% to 0.3%. Further, the ratio (%) of the cysteine content (g) in the agar medium to the amount (g) of the agar medium is, for example, 0.1% to 10%, more preferably 1% to 5%. It may even more preferably be from 2% to 4%.
- the general-purpose agar medium may be the same agar medium (fresh medium) as the general-purpose agar medium described at the beginning of this step, except that deoxycholic acid and cysteine are added.
- Colonies are formed on the medium by the culture.
- the formed colonies may be further cultured in a liquid medium.
- the liquid medium may be the same medium (fresh medium) used in the previous liquid medium culture.
- the bacteria cultured as described above may be used as an active ingredient of the antitumor agent of the present invention. This embodiment is suitable for example for obtaining Proteus bacteria with antitumor activity.
- the antitumor agent is obtained by formulating a formulation using the bacteria cultured in the bacteria culturing step.
- the anti-tumor agent may be, for example, a liquid formulation as described above.
- the liquid preparation may be manufactured by mixing the bacteria with a predetermined liquid.
- the formulation method may be appropriately selected by those skilled in the art based on, for example, the dosage form or the ingredients contained.
- the invention also provides bacteria isolated from tumors.
- the bacterium has antitumor activity as described above.
- the bacteria may be purple non-sulfur bacteria, Proteus bacteria, Lactococcus bacteria, or Enterococcus bacteria.
- Bacteria according to the invention may be used, for example, to produce anti-tumor agents.
- the bacteria have the property of gathering in tumors as described above. As such, the bacteria may be used, for example, for the generation of images for tumor identification, and may be used, for example, for the production of diagnostic medicaments.
- the bacteria isolated from the tumor comprises at least one type of purple non-sulfur bacteria isolated from the tumor.
- the purple non-sulfur bacteria are as explained in 2.1.1 above, and the explanations (eg, type of bacteria, optical properties of bacteria, toxicity of bacteria) also apply to this embodiment.
- the bacteria isolated from the tumor includes a Rhodopseudomonas bacterium or a Blastochloris bacterium, or both thereof, particularly preferably a Rhodopseudomonas bacterium isolated from a tumor.
- Species of bacteria belonging to these genera may be as described in 2.1.1 above.
- the bacteria isolated from the tumor may include other bacteria isolated from the tumor.
- the other bacterium may be, for example, a bacterium of the genus Proteus. That is, the bacteria isolated from the tumor may be a combination of the purple non-sulfur bacteria and other bacteria, for example, a combination of the purple non-sulfur bacteria (especially Rhodopseudomonas bacteria) and the Proteus bacteria. It may be. This combination exhibits particularly excellent antitumor activity, as described in 2.1.1 above.
- the bacteria isolated from the tumor comprises at least one Proteus bacteria isolated from the tumor.
- the Proteus bacterium is as described in 2.1.2 above, and the explanation (for example, the type of bacteria and the toxicity of the bacteria) also applies to this embodiment.
- the bacteria isolated from the tumor comprises at least one Lactococcus bacteria isolated from the tumor.
- the bacteria isolated from the tumor may be a Lactococcus bacterium isolated from the tumor.
- the bacteria belonging to the genus Lactococcus are as described in 2.1.3 above, and the explanations thereof (eg, the type of bacteria and the antitumor activity of the bacteria) also apply to this embodiment.
- the bacteria isolated from the tumor comprises at least one type of Enterococcus bacteria isolated from the tumor.
- the bacterium isolated from the tumor may be an Enterococcus bacterium isolated from the tumor.
- the Enterococcus bacterium is as described in 2.1.4 above, and the description thereof (eg, the type of bacteria and the antitumor activity of the bacteria) also applies to this embodiment.
- the bacteria isolated from the tumor includes at least one bacterium of the genus Acinetobacter isolated from the tumor.
- the bacteria isolated from the tumor may be Acinetobacter bacteria isolated from the tumor.
- the bacteria belonging to the genus Acinetobacter are as described in 2.1.5 above, and the description thereof (for example, the type of bacteria and the antitumor activity of the bacteria) also applies to this embodiment.
- the bacteria isolated from the tumor comprises at least one Bacillus bacteria isolated from the tumor.
- the bacteria isolated from the tumor may be a Bacillus bacterium isolated from the tumor.
- the Bacillus bacterium is as explained in 2.1.6 above, and the explanation (eg, type of bacteria and antitumor activity of the bacterium) also applies to this embodiment.
- the bacteria isolated from the tumor comprises at least one bacterium of the genus Cutibacterium isolated from the tumor.
- the bacteria isolated from the tumor may be a Cutibacterium bacterium isolated from the tumor.
- the bacteria of the genus Cutibacterium are as explained in 2.1.7 above, and the explanations (eg, the type of bacteria and the antitumor activity of the bacteria) also apply to this embodiment.
- the present invention also provides an image generation method.
- the method includes, for example, an administration step of administering bacteria isolated from a tumor to an animal, and, after the administration, imaging the animal under irradiation with light in a predetermined wavelength range to identify the presence of bacteria in the animal.
- the method may include an image generation step of generating an image to identify the tumor.
- Bacteria isolated from tumors according to the invention have specific optical properties and also have the property of collecting at the tumor site when administered to an animal. Therefore, by utilizing these characteristics, it is possible to determine the presence or absence of a tumor or to specify the position or shape of a tumor. Note that the image generated in this manner may be used not only to identify the tumor but also to identify the location where the administered bacteria are gathered. Each step included in the method will be explained below.
- bacteria isolated from the tumor are administered to the animal.
- the bacteria isolated from the tumor preferably include purple non-sulfur bacteria.
- the purple non-sulfur bacteria are as described in 2.1.1 above, and the explanation also applies to this embodiment.
- the bacteria may also include other bacteria described in 2.1.1 above (particularly Proteus bacteria).
- the purple non-sulfur bacteria preferably have the optical properties described in 2.1.1 above.
- the purple non-sulfur bacteria preferably have the toxicity characteristics described in 2.1.1 above.
- the bacteria isolated from the tumor is preferably administered parenterally.
- the bacteria may be administered intravascularly (eg, intravenously or intraarterially), subcutaneously, intramuscularly, or intrathecally.
- the bacteria are administered intravascularly (eg intravenously or intraarterially), particularly intravenously.
- Bacteria isolated from tumors contained in the antitumor agent of the present invention have the property of gathering at the tumor site as described above, so when administered intravascularly, the bacteria can easily reach the tumor site. Intravascular administration is also relatively less invasive.
- bacteria when bacteria are administered intravascularly, they usually exhibit toxicity and adversely affect patients.
- the bacteria isolated from tumors contained in the antitumor agent of the present invention do not exhibit such toxicity, or even if they do, the degree of toxicity is very low.
- the bacteria may be formulated as a solution.
- the liquid formulation may be constructed in the same way as the liquid formulation described in 2.1.4 above, and the description also applies to this embodiment.
- the amount of bacteria contained in the liquid preparation may also be the same as the bacteria content ratio in the liquid preparation explained in 2.1.4 above.
- Imaging process S22 After the administration step, the animal is imaged while being irradiated with light in a predetermined wavelength range.
- the imaging generates an image for identifying a tumor that may be present in the animal.
- the wavelength range of the light may be selected depending on the optical properties of the administered bacteria.
- the light may be, for example, infrared light, in particular near-infrared light, mid-infrared light or far-infrared light.
- the infrared light has little effect on the irradiated animal.
- the purple non-sulfur bacteria isolated from the tumor emit fluorescence when irradiated with infrared light (particularly near-infrared light), and furthermore, the intensity of the fluorescence is strong. Therefore, images obtained by imaging the animal while irradiating the animal with infrared light are suitable for identifying tumors.
- an apparatus capable of observing fluorescence generated from the bacteria may be used.
- the device may be, for example, a device capable of acquiring a fluorescence image of the imaging target, and more specific examples of the device include, but are not limited to, a fluorescence imaging system, an in vivo fluorescence imaging system, and a fluorescence imager. Not done.
- the imaging Based on the image obtained by the imaging, it is possible to specify, for example, a site where fluorescence derived from the bacteria is occurring.
- the bacteria have the property of congregating into tumors. Therefore, if there is a site emitting fluorescence in the image, the site may be identified as a site containing a tumor.
- the position or shape of the tumor may be specified based on the image. Further, if there is no part emitting fluorescence in the image, it may be specified that no tumor exists in the imaging target. In this way, the image obtained by the imaging is useful for identifying the presence or absence of a tumor, or for identifying the position or shape of a tumor.
- the present invention also provides a method for producing useful bacteria.
- the bacteria produced by the production method may be bacteria that have antitumor activity.
- the bacteria produced by the production method may be bacteria having the optical properties described in 2.1.1 above.
- the production method of the present invention may include, for example, a bacterial isolation step of separating bacteria from a tumor, and a bacterial culturing step of culturing the bacteria isolated in the separation step.
- a bacterial isolation step of separating bacteria from a tumor and a bacterial culturing step of culturing the bacteria isolated in the separation step.
- bacteria present within a tumor acquire anti-tumor activity or optical properties or both when isolated from the tumor and cultured.
- the bacteria isolation step and the bacteria cultivation step are as explained in 2.1.7 above, and the explanations also apply to this embodiment.
- the manufacturing method may further include a tumor recovery step of recovering a tumor containing bacteria, which is performed before the bacteria isolation step.
- the tumor recovery step is also as explained in 2.1.7 above, and the explanation also applies to this embodiment.
- the present invention provides a method for treating a tumor using bacteria isolated from the tumor.
- bacteria isolated from the tumor may be used as described for anti-tumor agents in 2.1 above. That is, the treatment method may include administering the antitumor agent to an animal. The administration may also be carried out as described in 2.1 above.
- the present invention also provides a method for diagnosing a tumor using bacteria isolated from the tumor.
- the bacteria may be used as described for the image generation method in 2.3 above. Then, a tumor diagnosis may be performed based on the image obtained by the image generation method.
- the bacterium may be used for both tumor treatment and diagnosis. That is, the present invention also provides methods for treating and diagnosing tumors using bacteria isolated from tumors.
- the bacteria are administered to an animal, particularly a human, for the treatment of a tumor.
- the administered bacteria reach the tumor, exert their antitumor activity, and are utilized for image generation methods based on their optical properties. That is, in the method, the bacteria may be administered for the treatment of a tumor, and after the administration, the image generation method may be performed. Then, a tumor diagnosis may be performed based on the image obtained by the image generation method.
- Mouse colon cancer cells (Colon26) were obtained from the Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank.
- NBRC 16661 Rhodopseudomonas Palustris
- PM Proteus mirabilis
- the sample (100 ⁇ L) was plated on an agar medium consisting of 543 ATCC medium and cultured anaerobically for 7 days (E in the same figure). Bacterial colonies were formed on the agar medium by the anaerobic culture. Several of the formed red bacterial colonies were picked up using a loop ( Figure F) and cultured anaerobically in 543 ATCC medium at a temperature of 26-30°C under irradiation with a tungsten lamp ( Figure G). The culture solution obtained by the anaerobic culture was divided into two parts and used for the next culture.
- one of the culture solutions was cultured in normal 543 ATCC medium supplemented with cysteine (Cys) (H1 in the same figure, the culture obtained by this culture is also referred to as "Culture 1" hereinafter).
- the content ratio of the cysteine was 3% when expressed as the ratio (%) of the amount (g) of the cysteine to the amount (g) of the 543 ATCC medium.
- the cysteine content ratio in other cysteine-added media that will be introduced later was also 3% in both cases where the medium was a liquid medium and an agar medium.
- the other one was cultured in Cys-free 543 ATCC medium (H2 in the same figure, the culture obtained by this culture is also referred to as "culture 2" hereinafter).
- Culture 1 was anaerobically cultured at a temperature of 26-30° C. on an agar medium consisting of Cys-supplemented 543 ATCC medium supplemented with 0.1% deoxycholic acid and irradiated with a tungsten lamp (I1 in the same figure).
- the content ratio of the deoxycholic acid is the ratio (%) of the amount (g) of the deoxycholic acid to the amount (g) of the agar medium.
- the deoxycholic acid content ratio in all other deoxycholic acid-added media that will appear later, including the agar medium used for culturing Culture 2 was 0.1%.
- Culture 2 was anaerobically cultured at a temperature of 26-30° C. on an agar medium consisting of Cys-free 543 ATCC medium supplemented with 0.1% deoxycholic acid and irradiated with a tungsten lamp (I2 in the same figure).
- the complex bacterium is also referred to herein as "iR.P.”
- the complex bacterium was deposited on March 23, 2022, with accession number: NITE BP-03627, and was submitted to the National Institute of Technology and Evaluation (NPMD), Patent Microorganism Depositary (NPMD, 292-0818). Internationally deposited at Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture).
- i-R.P. was further cultured on an agar medium consisting of 543 ATCC medium without Cys and supplemented with 0.1% deoxycholic acid.
- red colonies were carefully picked up with a needle under microscopic observation (K2 in the same figure) and subsequently cultured in 543 ATCC medium without addition of Cys (L2 in the same figure).
- K2 needle under microscopic observation
- L2 Cys
- a bacterium isolated only to Rhodopseudomonas Palustris was obtained from the complex bacteria. This bacterium is also referred to herein as "isp-R.P.”.
- a mixed solution v/v, 1:1
- Colon26 cell dispersion (1 ⁇ 10 6 cells) (100 ⁇ L) and culture medium/matrigel (Corning) was administered subcutaneously to one site on the lateral abdomen of a mouse to create a colon cancer model. Created a mouse.
- RP (1 ⁇ 10 9 CFU
- P.M. (1 ⁇ 10 8 CFU
- iR.P iR.P.
- RP was cultured anaerobically in ATCC543 medium supplemented with Cys at a temperature of 26°C-30°C for 3 days under tungsten lamp irradiation.
- the culture solution obtained by the anaerobic culture was centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes.
- the bacteria precipitated by the centrifugation were suspended in fresh ATCC543 medium supplemented with Cys to obtain a suspension.
- the number of bacteria in the suspension was measured using a microorganism counter (Panasonic, model number NP-BCM01-A), and based on the measurement results, Cys was added to achieve a predetermined bacterial concentration.
- Fresh ATCC543 medium was added to the suspension accordingly to obtain bacterial samples of RP. The iP.M.
- bacterial sample was obtained by the same method as the RP bacterial sample described above. That is, anaerobic culture in ATCC543 medium supplemented with Cys, centrifugation of the culture solution obtained by the anaerobic culture, preparation of a suspension using the precipitate obtained by the centrifugation, and Bacterial samples of iP.M. were obtained by adjusting the concentration of bacteria.
- PM was cultured anaerobically in 802 NBRC medium at a temperature of 30°C for 3 days.
- the culture solution obtained by the anaerobic culture was centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes.
- the bacteria precipitated by the centrifugation were suspended in fresh 802 NBRC medium to obtain a suspension.
- the number of bacteria in the suspension was measured using a microorganism counter (Panasonic, model number NP-BCM01-A), and based on the measurement results, fresh 802 NBRC medium was added to a predetermined bacterial concentration. were added appropriately to the suspension to obtain bacterial samples of PM.
- the CFU value described for each bacterial sample above is the CFU value of bacteria in 200 ⁇ L of the bacterial sample administered in the single dose.
- each bacterial sample administered to mice was prepared in the same manner.
- the PBS buffer solution is a product of Fujifilm Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2355.html) and has the following composition. . pH: 7.1-7.3 NaCl: 9000mg/L KH2PO4 : 144mg /L Na 2 HPO 4 (anhydrous): 421mg/L
- the same PBS buffer was used in subsequent experiments.
- Figure 2B shows photographs of mice after intravenous administration of each bacterium.
- the tumor size of mice administered with iR.P. or iP.M. decreased over time, and the tumors had disappeared 30 days after the treatment.
- mice administered with commercially available RP or PBS buffer the tumor size did not decrease, but the tumor size increased over time, and the tumor volume exceeded 2000 mm 3 . Therefore, experiments with these mice were stopped from the perspective of humane endpoints. Accordingly, no photographs were taken 30 days after the treatment.
- the figure shows the change in solid tumor volume in each group.
- the volume of solid tumors increases when PBS or R.P. is administered.
- i-R.P. or i-P.M. was administered, the volume of solid tumors decreased and reached 0 4 to 5 days after administration.
- Figure 2E shows the complete response (CR) rate for each experimental group.
- the group receiving i-P.M. or i-R.P. had a high CR rate. Furthermore, when administering commercially available P.M., extreme weakness and gait disturbance were observed in the mice, so the experiment was immediately stopped from the perspective of humane endpoints. Therefore, no data were available for commercially available P.M.
- FIG. 2F is a diagram showing an experimental method for investigating acquisition of cancer immunity.
- Colon-26 was reimplanted into mice that had achieved CR by administration of bacteria (i-P.M. or i-R.P.) 120 days after achieving CR. The progress was observed for 20 days after the retransplantation.
- bacteria i-P.M. or i-R.P.
- FIG. 2G A photograph showing the results of the above observation is shown in FIG. 2G.
- the black arrow indicates the cancer cell transplant site, and the black dashed line indicates the site where the tumor was formed.
- re-implanted Colon-26 did not take hold and no tumors were formed.
- bacteria isolated from tumors have excellent antitumor activity and are considered to be very useful for treating tumors.
- the bacteria isolated from the tumor has an antitumor activity that causes the tumor formed in the colon cancer model mouse to shrink or disappear within 30 days after administration of the bacteria to the colon cancer model mouse. may have anti-tumor activity that causes the tumor to shrink or disappear within 10 days after its administration.
- the toxicity of iP.M. and iR.P. is considered to be very low.
- the bacteria isolated from the tumor has low toxicity, and the mouse survival rate for 40 days after administration of the bacteria to the colon cancer model mouse is, for example, 90% or more, 95% or more, Or it may be 100%.
- cancer immunity can be acquired by administering bacterial therapy using iP.M. or iR.P. That is, it is thought that by administering bacteria isolated from tumors, it is possible not only to treat the tumor but also to acquire immunity against the tumor.
- FIG. 3A The staining results for immune cells are shown in Figure 3A.
- iP.M. was found to significantly activate both innate immunity (macrophages, NK cells, neutrophils) and acquired immunity (T cells, B cells).
- iR.P. does not have as high an immune activation ability as iP.M.
- significant activation of macrophages, T cells, and B cells is observed.
- no such activation was observed for PBS and RP.
- bacteria isolated from tumors have an immune cell activating effect, and this effect is considered to be one of the factors contributing to the excellent antitumor activity.
- Bacteria isolated from tumors may also be used to activate immune cells, particularly in tissues where tumors are present. That is, the present invention also provides an immune cell activator containing bacteria isolated from a tumor.
- FIG. 3B the staining results for anti-tumor biomarkers are shown in FIG. 3B.
- both iP.M. and iR.P. result in the expression of the necrosis marker TNF- ⁇ and the apoptosis marker Caspase-3, and furthermore, significant tissue damage is observed.
- iP.M. has particularly strong expression of TNF- ⁇ and Caspase-3. That is, bacteria isolated from tumors have an effect of enhancing the expression of anti-tumor biomarkers, and this effect is considered to be one of the factors contributing to the excellent anti-tumor activity.
- Bacteria isolated from tumors may also be used to enhance the expression of anti-tumor biomarkers, particularly in tissues where tumors reside. . That is, the present invention also provides an anti-tumor biomarker expression enhancer containing bacteria isolated from a tumor.
- Tables 1 and 2 below show the results of blood tests when i-R.P. and i-P.M. were administered.
- FIG. 3E shows the results of H&E tissue staining of the various organs when i-P.M., i-R.P., or PBS was administered. As shown in the figure, no damage to organ tissues was observed due to bacterial administration.
- Each tissue was homogenized in PBS buffer at a temperature of 4°C using a pestle.
- the mixture obtained by the homogenization was shaken for 20 minutes at 15° C. and at a speed of 380 rpm/min. After the shaking, the supernatant of the mixture was diluted 10 times with PBS buffer to obtain a sample.
- Each sample 100 ⁇ L was plated on an agar medium and cultured anaerobically for 7 days to form bacterial colonies on the agar medium. Bacterial colony numbers were determined visually (manually).
- Figure 3C shows the results of the colony assay when i-R.P. was administered. From the same figure, it was confirmed that i-R.P. does not remain in the organ at all after cancer treatment.
- Figure 3D shows the results of the colony assay when i-P.M. was administered. From the same figure, it was confirmed that i-P.M. does not remain in the organ at all after cancer treatment.
- the sarcoma model mouse was produced using the same method as the colon cancer model mouse.
- bacterial samples of various bacteria iR.P., iP.M.
- iR.P. 5 ⁇ 10 9 CFU/mL
- iP.M. 5 ⁇ 10 8 CFU/mL
- 200 ⁇ L of PBS buffer was administered into the tail vein of metastatic lung cancer model mice. Seven days after the administration, the lungs were removed, photographed, and weighed.
- untreated mice healthy mice to which mouse melanoma cells and various bacteria were not administered were also prepared.
- FIG. 4D A photograph of the excised lung is shown in Figure 4D.
- the lungs of untreated mice and mice administered with iR.P. or iP.M. are comparable in size.
- tumors were observed in mice administered PBS.
- the lungs of the iR.P. or iP.M.-administered group showed the same weight as the healthy lungs of untreated mice, but the PBS-administered group showed an increase in lung weight due to tumor formation.
- the arrows in the figure indicate the timing of administration of PBS or bacteria.
- Untreated mice can be observed to gain weight over time, but the PBS-treated group shows a significant weight loss from around day 10.
- a slight decrease in body weight was observed the day after administration, but a healthy weight gain was observed thereafter.
- ⁇ Optical property analysis of bacteria> The absorption spectra of bacterial dispersions containing iR.P. isolated from tumors or commercially available RP were measured at room temperature using a UV-Vis-NIR spectrophotometer (V-730 BIO; Jasco).
- the bacterial dispersion was a dispersion in which each bacteria was dispersed in PBS buffer at a concentration of 2 ⁇ 10 7 CFU/mL.
- the dispersion liquid was prepared as follows. iR.P. was cultured anaerobically in Cys-free 543 ATCC medium at a temperature of 26°C to 30°C for 3 days under irradiation with a tungsten lamp.
- the culture solution obtained by the anaerobic culture was centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes.
- the bacteria precipitated by the centrifugation were suspended in PBS buffer to obtain a bacterial suspension.
- the number of bacteria in the suspension is measured using a microorganism counter (Panasonic, model number NP-BCM01-A), and based on the measurement results, PBS buffer is added as appropriate to achieve a predetermined bacterial concentration. was added to the suspension to obtain a dispersion of iR.P. at the above concentration.
- RP was cultured anaerobically in 543 ATCC medium supplemented with Cys at a temperature of 26°C-30°C for 3 days under tungsten lamp irradiation.
- the culture solution obtained by the anaerobic culture is centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes in the same way as iR.P., and the bacteria precipitated by the centrifugation are suspended in PBS buffer to reach a predetermined bacterial concentration.
- PBS buffer was added as appropriate to obtain a dispersion of RP at the above concentration.
- the measurement conditions for the measurement using the UV-Vis-NIR spectrophotometer were as shown in Table 3 below.
- the fluorescence spectrum of the bacterial dispersion in which iR.P. isolated from the tumor or commercially available RP was dispersed was measured using fluorescence spectrometers (FP-8600 NIR Spectrofluorometer; Jasco). The excitation wavelength was 805 nm.
- the bacterial dispersion was a dispersion in which the bacteria were dispersed in a PBS buffer at a concentration of 2.5 ⁇ 10 7 CFU/mL. The dispersion was prepared as described above.
- the measurement conditions for the measurement using the fluorescence spectrometers were as shown in Table 4 below.
- FIG. 2I shows the measurement results of the absorption spectrum.
- i-R.P. has higher light absorption characteristics than R.P.
- the absorbance at 808 nm is, for example, 0.029 or more
- the absorbance at 865 nm is, for example, 0.032 or more.
- i-R.P. has particularly high absorbance at these wavelengths. Such differences in absorbance are thought to be due to differences in the expression status of light-absorbing substances (for example, light-absorbing proteins). Furthermore, based on the experimental results regarding antitumor activity described above, it is thought that such high absorbance can be used as an indicator that bacteria have antitumor activity.
- FIG. 2J shows the measurement results of the fluorescence spectrum.
- i-R.P. has higher fluorescence characteristics than R.P.
- the fluorescence intensity at 888 nm is 4.4 or more.
- i-R.P. has particularly high fluorescence intensity at this wavelength.
- Such differences in fluorescence intensity are thought to be due to differences in the expression status of fluorescent substances (for example, fluorescent proteins).
- fluorescent substances for example, fluorescent proteins
- absorption and fluorescence spectra of iP.M. isolated from tumors or bacterial dispersions containing commercially available PM were performed as described above.
- the bacterial concentration of the bacterial dispersions used to measure the absorption spectra was 2 ⁇ 10 7 CFU/mL.
- the bacterial concentrations of the bacterial dispersions used to measure the fluorescence spectra were all 2.5 ⁇ 10 7 CFU/mL, and the excitation wavelength was 805 nm.
- These dispersions were prepared as follows. iP.M. was cultured anaerobically in 543 ATCC medium supplemented with Cys at a temperature of 26°C-30°C for 3 days under tungsten lamp irradiation.
- the culture solution obtained by the anaerobic culture was centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes. Bacteria precipitated by the centrifugation were suspended in PBS buffer to obtain a bacterial suspension. The number of bacteria in the suspension is measured using a microorganism counter (Panasonic, model number NP-BCM01-A), and based on the measurement results, PBS buffer is added as appropriate to achieve a predetermined bacterial concentration. was added to the suspension to obtain a dispersion of iP.M. at the above concentration. PM was cultured anaerobically in 802 NBRC medium at a temperature of 30°C for 3 days.
- the culture solution obtained by the anaerobic culture is centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes in the same way as iP.M., and the bacteria precipitated by the centrifugation are suspended in PBS buffer to reach a predetermined bacterial concentration.
- PBS buffer was added as appropriate to obtain a dispersion of PM at the above concentration.
- NIR near-infrared
- ⁇ in the data indicates the standard deviation, and n indicates the number of samples used. Student's t-test was used for statistical analysis of the data. *, **, *** indicate p-values ⁇ 0.05, ⁇ 0.005, ⁇ 0.001, respectively.
- iR.P is a complex bacterium consisting of two species, Rhodopseudomonas palustris and Proteus mirabilis, isolated from tumors.
- isp-RP is only Rhodopseudomonas Palustris isolated from a tumor, that is, Rhodopseudomonas Palustris isolated from a tumor. Their antitumor activity and optical properties were evaluated.
- bacterial samples of PBS buffer and commercially available RP were also prepared.
- iR.P. bacterial samples and RP bacterial samples were prepared as described above.
- Bacterial samples of isp-RP were prepared by the same method as those of iR.P.
- a colon cancer model mouse was created, and the four types of samples mentioned above were placed in the tail vein of a mouse in which a solid tumor ( ⁇ 400 mm 3 ) had formed. Same single dose was given. Then, the state after administration was observed, and fluorescence was observed using the imaging system as described in ⁇ In vivo Fluorescence Bioimaging> above.
- FIG. The figure shows photographs and images obtained by fluorescence observation for each sample.
- both iR.P. and isp-RP have antitumor activity.
- anti-tumor activity like iR.P. and isp-RP could not be confirmed for commercially available RP.
- no antitumor activity was confirmed for PBS.
- fluorescence observation image in the same figure it was confirmed that both iR.P. and isp-RP gathered in the tumor.
- both iR.P. and isp-RP have the fluorescence characteristics described above.
- fluorescence was also confirmed for commercially available RP, but it was weaker than the fluorescence from iR.P. and isp-RP.
- no fluorescence could be confirmed for PBS.
- Rhodopseudomonas palustris is contained in a larger amount than Proteus mirabilis, and for example, the composition ratio based on CFU of Rhodopseudomonas palustris and Proteus mirabilis is 99:1 to 55:45. It has been found that a ratio of 99:1 to 60:40 is particularly preferable for exhibiting excellent antitumor activity.
- the nucleotide sequence had 100% homology and 100% sequence identity with the commercially available R.P. 16S ribosomal RNA gene. Therefore, at least in terms of said genes, isp-R.P. is identical to commercially available R.P.
- isp-RP is considered to be genetically identical to commercially available RP.
- the optical properties of isp-RP and iR.P. are different from those of commercially available RP, that is, they are different in their absorption spectra and fluorescence spectra.
- the optical properties of isp-RP and iR.P. which are different from commercially available RPs, are thought to have been obtained by being isolated from tumors and being cultured in a medium after the isolation.
- the optical properties are determined by the increase in the expression of light-absorbing substances and fluorescent substances (particularly light-absorbing proteins and fluorescent proteins) due to the separation process from the tumor (particularly the separation process and culturing process in a medium). It is thought that this was acquired by doing so.
- isp-R.P. and i-R.P. are thought to have acquired excellent antitumor activity as a result of acquiring the optical properties. Therefore, it is considered that having the optical properties can be used as an indicator of having excellent antitumor activity.
- the separation treatment from tumors (particularly the separation treatment and the culture treatment) performed to acquire the optical properties is considered to be a useful treatment for imparting antitumor activity to bacteria.
- the base sequence has the following sequence ID No. It was as shown in 2.
- the nucleotide sequence had 99.80% homology and 99% sequence identity with the commercially available 16S rRNA gene sequence of P.M. Therefore, the gene of i-P.M. is considered to be substantially the same as that of commercially available P.M. from a genetic point of view.
- iP.M. is also considered to be genetically identical to commercially available PM.
- iP.M. has superior antitumor activity compared to commercially available PM. This is considered to have been obtained by isolation treatment from the tumor (particularly the isolation treatment and culture treatment in a medium).
- the separation treatment from tumors (particularly the separation treatment and the culture treatment) performed to acquire the excellent antitumor activity optical properties is a treatment useful for imparting antitumor activity to bacteria. It is believed that there is.
- ⁇ Isolation and culture of intratumoral bacteria i-LS and i-EF>
- a mixed solution (v/v, 1:1) consisting of Colon26 cell dispersion (1 ⁇ 10 6 cells) (100 ⁇ L) and culture medium/matrigel (Corning) was administered subcutaneously to one site on the right flank of the mouse, and the colon A cancer model mouse was created. Approximately 2 weeks later, a tumor was removed from the mouse in which a solid tumor ( ⁇ 400 mm 3 ) had formed (Fig.
- the formed white bacterial colony was picked up with a needle ((d) in the same figure) and cultured anaerobically in an LB liquid medium at a temperature of 26-30°C while irradiated with a tungsten lamp ((e) in the same figure).
- Two cultures of bacteria isolated and purified from tumors were obtained in this way.
- the genes of each isolated and purified bacterium were identified (Bex Corporation).
- One of these two cultures was shown to be a Lactococcus bacterium, as shown by the nucleotide sequence analysis described below.
- the bacteria in the culture are called i-LS (intratumoral Lactococcus sp.).
- i-EF intramoral Enterococcus faecalis
- i-LS was subcultured in Pearl CoreTM E-MC64 medium (Eiken Chemical, Tokyo, Japan) at 32°C using a constant temperature bath (i-CUBE FCI-280HG; AS ONE). (disgusted)
- i-EF was subcultured (anaerobically) in LB medium at a temperature of 26-30°C while irradiated with a tungsten lamp.
- the E-MC64 medium is prepared by dissolving casein peptone (17.0 g), soy peptone (3.0 g), glucose (2.5 g), dipotassium phosphate (2.5 g), and sodium chloride (5.0 g) in 1 L of sterile water. This is the medium obtained by
- the base sequence has the following sequence ID No. It was as shown in 3.
- the nucleotide sequence of the 16S ribosomal RNA gene was also analyzed, and the nucleotide sequence was identified as the following sequence ID No. It was as shown in 4.
- BLAST Basic Local Alignment Search Tool
- the isolated i-EF had 100% homology and 100% sequence identity with the commercially available 16S ribosomal RNA gene of Enterococcus faecalis. Therefore, at least in terms of said genes, i-EF is identical to the commercially available Enterococcus faecalis.
- the i-LS has been deposited on August 2, 2022, with accession number: NITE BP-03694, and has been deposited with the National Institute of Technology and Evaluation (NPMD), Patent Microorganism Depositary (NPMD), 292- Internationally deposited at Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture 0818).
- the i-EF was deposited on July 19, 2022, with accession number: NITE BP-03690, and was submitted to the National Institute of Technology and Evaluation (NPMD), Patent Microorganism Depositary (NPMD, 292- Internationally deposited at Room 122, 2-5-8 Kazusa Kamatari, Kisarazu City, Chiba Prefecture 0818).
- a mixed solution v/v, 1:1
- Colon26 cell dispersion (1 ⁇ 10 6 cells) (100 ⁇ L)
- culture medium/matrigel (Corning) was administered subcutaneously to one site on the lateral abdomen of a mouse to create a colon cancer model. Created a mouse.
- i-LS was anaerobically cultured in Pearl Core (trademark) E-MC64 liquid medium at 32°C for 3 days using a constant temperature bath (i-CUBE FCI-280HG; AS ONE).
- the culture solution obtained by the anaerobic culture was centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes.
- the bacteria precipitated by the centrifugation were suspended in fresh E-MC64 liquid medium to obtain a suspension.
- the number of bacteria in the suspension is measured using a microbial counter (Panasonic, model number NP-BCM01-A), and based on the measurement results, the fresh E-MC64 liquid is adjusted to a predetermined bacterial concentration.
- the i-EF bacterial sample was obtained by the same method as the i-LS bacterial sample. That is, anaerobic culture of i-EF in LB liquid medium, centrifugation of the culture solution obtained by the anaerobic culture, preparation of a suspension using the precipitate obtained by the centrifugation, and Bacterial samples of i-EF were obtained by adjusting the concentration of bacteria.
- the figure shows the change in solid tumor volume in each group.
- PBS When PBS is administered, the volume of solid tumors increases.
- i-LS or i-EF when i-LS or i-EF was administered, the volume of solid tumors decreased and reached 0 4 to 5 days after administration.
- i-EF when i-EF was administered, the volume of solid tumors increased slightly after 7 days after administration, but when i-LS was administered, solid tumors increased slightly even after 7 days after administration.
- the volume of water remained at 0.
- bacteria isolated from tumors exhibit antitumor activity. It is also clear that bacteria that exhibit antitumor activity when isolated from tumors are not limited to the purple non-sulfur bacteria (Rhodopseudomonas bacteria) and Proteus bacteria mentioned in 3.1 above. . That is, it was confirmed that other bacteria present in tumors, such as Lactococcus bacteria and Enterococcus bacteria used in this example, also showed antitumor activity when isolated from the tumor.
- separating the bacteria present in the tumor from the tumor can improve antitumor activity. It also turns out to be a useful technique for producing bacteria with That is, the present disclosure also provides a method for producing bacteria with antitumor activity.
- the manufacturing method may include a separation step of separating bacteria present within the tumor from the tumor, as described above. More preferably, the production method may further include, in addition to the separation step, a culture step of culturing the bacteria separated in the separation step in a medium.
- tumors were removed from the mice that had formed solid tumors ( ⁇ 400 mm 3 ), and the tumors were cut into small pieces with a scalpel and placed in PBS buffer at 4°C using a pestle. homogenized with. The resulting mixture was shaken for 20 minutes at 15° C. at a speed of 380 rpm/min. After the shaking, the supernatant of the mixture was diluted 10 times with PBS buffer to obtain bacterial samples. The bacterial sample (100 ⁇ L) was plated on an LB agar medium and cultured anaerobically for 7 days. Bacterial colonies were formed on the agar medium by the anaerobic culture.
- the formed white bacterial colonies were picked up with a needle and cultured anaerobically in an LB liquid medium at a temperature of 26-30°C while being irradiated with a tungsten lamp.
- One culture of bacteria isolated and purified from the tumor was thus obtained.
- the isolated and purified bacteria were genetically identified (Bex Corporation). Base sequence analysis showed that the bacterium belonged to the genus Acinetobacter (particularly Acinetobacter radioresistens, hereinafter also referred to as "i-AR").
- i-AR was subcultured (anaerobically) in LB medium at a temperature of 26-30 °C under tungsten lamp irradiation.
- tumors were removed from the mice that had formed solid tumors ( ⁇ 400 mm 3 ), and the tumors were cut into small pieces with a scalpel and placed in PBS buffer at 4°C using a pestle. homogenized with. The resulting mixture was shaken for 20 minutes at 15° C. at a speed of 380 rpm/min. After the shaking, the supernatant of the mixture was diluted 10 times with PBS buffer to obtain bacterial samples. The bacterial samples (100 ⁇ L) were plated on Pearl CoreTM agar and cultured anaerobically for 7 days. Bacterial colonies were formed on the agar medium by the anaerobic culture.
- the formed white bacterial colonies were picked up with a needle and cultured anaerobically in Pearl CoreTM liquid medium at a temperature of 26-30°C under tungsten lamp irradiation.
- Two cultures of bacteria isolated and purified from tumors were obtained in this way.
- the isolated and purified bacteria were genetically identified (Bex Corporation). Based on base sequence analysis, the bacteria in question were found to be Bacillus bacteria (particularly Bacillus thuringiensis, hereinafter also referred to as "i-BT") and Cutibacterium bacteria (particularly Cutibacteriumacnes, hereinafter also referred to as "i-CA"). Shown.
- i-BT and i-CA were each subcultured (anaerobically) in Pearl CoreTM liquid medium at a temperature of 26-30°C under tungsten lamp irradiation.
- a mixed solution v/v, 1:1
- Colon26 cell dispersion (1 ⁇ 10 6 cells) (100 ⁇ L)
- culture medium/matrigel (Corning) was administered subcutaneously to one site on the lateral abdomen of a mouse to create a colon cancer model. Created a mouse.
- mice were prepared in the same manner as the i-LS bacterial samples described in 3.2 above.
- i-AR bacterial samples anaerobic culture of i-AR in LB liquid medium, centrifugation of the culture solution obtained by the anaerobic culture, and suspension using the precipitate obtained by the centrifugation are performed.
- a bacterial sample of i-AR was obtained by adjusting and adjusting the concentration of bacteria in the suspension.
- bacterial samples of i-BT and i-CA anaerobic culture of i-BT or i-CA in Pearl Core (trademark) liquid medium, centrifugation of the culture solution obtained by the anaerobic culture, and A bacterial sample of i-BT and a bacterial sample of i-CA were obtained by preparing a suspension using the obtained precipitate and adjusting the concentration of bacteria in the suspension.
- the figure shows the change in solid tumor volume in each group.
- PBS When PBS is administered, the volume of solid tumors increases.
- i-AR, i-BT, or i-CA was administered, the volume increase of solid tumors was suppressed compared to when PBS was administered.
- i-CA suppresses the volume increase of solid tumors over a longer period than i-AR and i-BT.
- Figure 8B shows the mouse survival rate for 40 days after administration of each bacteria. This result shows that a high survival rate is maintained for a longer period of time when i-AR, i-BT, or i-CA is administered compared to when PBS is administered.
- Figure 8C shows the changes in mouse body weight after each treatment. From the results shown in the figure, the arrows indicate the timing of administration of PBS or bacteria. Untreated mice can be observed to gain weight over time, but the PBS-treated group shows a significant weight loss from around day 10. In all of the bacteria-administered groups, a slight decrease in body weight was observed the day after administration, but a healthy weight gain was observed thereafter.
- bacteria isolated from tumors exhibit antitumor activity.
- bacteria that exhibit antitumor activity when isolated from tumors are not limited to the bacteria used in 3.1 and 3.2 above. It can be seen that bacteria present in tumors, including bacteria of the genus used in this example, come to exhibit antitumor activity when isolated from the tumor.
- separating bacteria present within a tumor from the tumor (particularly separating bacteria present within the tumor from the tumor, and culturing the isolated bacteria in a medium) It can also be confirmed that this is a useful technique for producing bacteria with antitumor activity.
- the present invention also provides the following uses, products, and methods.
- the components such as "antitumor agent” and “bacteria isolated from tumors” in these uses, products, and methods are as explained above, and the explanations are as follows. This also applies to [1] Use of bacteria isolated from tumors for the production of antitumor agents. [2] Bacteria isolated from tumors used for the production of antitumor agents. [3] A method for treating a tumor, comprising administering bacteria isolated from the tumor.
- Proteus mirabilis (Super Bac): NITE BP-03626 Complex bacteria of Rhodopseudomonas Palustris and Proteus mirabilis (Musashi): NITE BP-03627 i-LS (Super Lacto): NITE BP-03694 i-EF (Super Entero): NITE BP-03690
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Abstract
本発明は、がんの治療又は診断のために有用な技法を提供することを目的とする。 本発明は、腫瘍から分離された細菌を含む抗腫瘍剤を提供する。前記細菌は、例えばプロテウス属の細菌であってよい。前記抗腫瘍剤は、前記抗腫瘍剤は、非経口投与されるものであってよい。また、本発明は、腫瘍から細菌を分離する分離工程、及び前記分離工程において分離された細菌を培地で培養する培養工程、を含む、抗腫瘍活性を有する細菌の製造方法も提供する。
Description
本発明は、抗腫瘍剤、細菌、及び製造方法に関する。特には、本発明は、腫瘍から分離された細菌を含む抗腫瘍剤、腫瘍から分離された細菌、及び、腫瘍から細菌を分離する工程を含む細菌製造方法に関する。
がんを治療するために、例えば手術療法、薬物療法、及び放射線療法など、様々な治療方法が用いられている。これらは疾患の種類や状態に応じて、単独で用いられたり又は組み合わせて用いられたりもする。薬物療法においては、例えば抗がん剤などの薬剤が用いられる。薬物療法において用いられる抗がん剤は、正常細胞にも悪影響を及ぼすことがあり、患者にとって大きな負担にもなりうる。例えば抗がん剤は、長期投与によって患者に蓄積し、患者に大きな副作用をもたらすことがしばしばある。
また、検査によってがんを早期に発見することも、患者の予後を改善するために重要な要素の一つである。がんの検査のために、例えば各種腫瘍マーカー、MRI、及びCTなどが利用されている。腫瘍マーカーの値だけでは、がんの有無又は位置を確定することはできない。MRIやCTは、がんの有無を特定するために非常に有用であるが、それら装置は比較的大きく、費用負担も大きい。
下記特許文献1には、がんの治療又は診断のために光合成細菌を利用することが開示されている。同文献には、例えば、光合成細菌を対象に投与し、がんが存在する患部に光合成細菌を集積させた後に、患部に光を照射することが記載されている。
本発明は、がんの治療又は診断のために有用な技法を提供することを目的とする。
腫瘍内には、種々の細菌が存在している。本発明者らは、腫瘍内に存在する細菌を、腫瘍から分離したところ、当該分離された細菌が、がんの治療若しくは診断又はこれら両方のために有用であることを見出した。
すなわち、本発明は以下を提供する。
[1]腫瘍から分離された細菌を含む抗腫瘍剤。
[2]前記細菌は、プロテウス属の細菌、ラクトコッカス属の細菌、エンテロコッカス属の細菌、アシネトバクター属の細菌、バチルス属の細菌、又はキューティバクテリウム属の細菌である、[1]に記載の抗腫瘍剤。
[3]前記抗腫瘍剤は、非経口投与されるものである、[1]又は[2]に記載の抗腫瘍剤。
[4]前記抗腫瘍剤に含まれる細菌は、免疫細胞賦活化特性を有する、[1]~[3]のいずれか一つに記載の抗腫瘍剤。
[5]前記抗腫瘍剤に含まれる細菌は、腫瘍内における抗腫瘍バイオマーカー発現を増強する発現増強特性を有する、[1]~[4]のいずれか一つに記載の抗腫瘍剤。
[6]前記細菌が1×108CFUの量でマウス尾部静脈から単回投与された場合において、当該投与後40日間のマウス生存率が90%以上である、[1]~[5]のいずれか一つに記載の抗腫瘍剤。
[7]腫瘍から分離された、抗腫瘍活性を有する細菌。
[8]前記細菌は、プロテウス属細菌、ラクトコッカス属細菌、エンテロコッカス属細菌、アシネトバクター属細菌、バチルス属細菌、又はキューティバクテリウム属細菌である、[7]に記載の細菌。
[9]当該細菌が1×108CFUの量でマウス尾部静脈から単回投与された場合において、当該投与後40日間のマウス生存率が90%以上である、[7]又は[8]に記載の細菌。
[10]腫瘍から細菌を分離する分離工程、及び
前記分離工程において分離された細菌を培地で培養する培養工程、
を含む、
抗腫瘍活性を有する細菌の製造方法。
[1]腫瘍から分離された細菌を含む抗腫瘍剤。
[2]前記細菌は、プロテウス属の細菌、ラクトコッカス属の細菌、エンテロコッカス属の細菌、アシネトバクター属の細菌、バチルス属の細菌、又はキューティバクテリウム属の細菌である、[1]に記載の抗腫瘍剤。
[3]前記抗腫瘍剤は、非経口投与されるものである、[1]又は[2]に記載の抗腫瘍剤。
[4]前記抗腫瘍剤に含まれる細菌は、免疫細胞賦活化特性を有する、[1]~[3]のいずれか一つに記載の抗腫瘍剤。
[5]前記抗腫瘍剤に含まれる細菌は、腫瘍内における抗腫瘍バイオマーカー発現を増強する発現増強特性を有する、[1]~[4]のいずれか一つに記載の抗腫瘍剤。
[6]前記細菌が1×108CFUの量でマウス尾部静脈から単回投与された場合において、当該投与後40日間のマウス生存率が90%以上である、[1]~[5]のいずれか一つに記載の抗腫瘍剤。
[7]腫瘍から分離された、抗腫瘍活性を有する細菌。
[8]前記細菌は、プロテウス属細菌、ラクトコッカス属細菌、エンテロコッカス属細菌、アシネトバクター属細菌、バチルス属細菌、又はキューティバクテリウム属細菌である、[7]に記載の細菌。
[9]当該細菌が1×108CFUの量でマウス尾部静脈から単回投与された場合において、当該投与後40日間のマウス生存率が90%以上である、[7]又は[8]に記載の細菌。
[10]腫瘍から細菌を分離する分離工程、及び
前記分離工程において分離された細菌を培地で培養する培養工程、
を含む、
抗腫瘍活性を有する細菌の製造方法。
腫瘍から分離された細菌は、腫瘍の処置のために非常に有用である。例えば本発明に従う抗腫瘍剤によって、腫瘍を処置することができる。また、本発明に従う抗腫瘍剤は、様々な臓器又は組織のがんを処置するために用いることもできる。
また、腫瘍から分離された細菌は、腫瘍の診断のためにも非常に有用である。例えば、本発明に従う方法(特には画像生成方法)又は本発明に従う細菌は、腫瘍の有無を特定するために有用であり、さらに、腫瘍の位置又は形状を特定するためにも有用である。
また、本発明によって、腫瘍の治療と診断を同時に行うこともできる。例えば、本発明に従う抗腫瘍剤を投与することで、腫瘍を処置することに加え、当該腫瘍の位置を特定することも可能である。
なお、本発明の効果は、ここに記載された効果に限定されず、本明細書内に記載されたいずれかの効果であってもよい。
また、腫瘍から分離された細菌は、腫瘍の診断のためにも非常に有用である。例えば、本発明に従う方法(特には画像生成方法)又は本発明に従う細菌は、腫瘍の有無を特定するために有用であり、さらに、腫瘍の位置又は形状を特定するためにも有用である。
また、本発明によって、腫瘍の治療と診断を同時に行うこともできる。例えば、本発明に従う抗腫瘍剤を投与することで、腫瘍を処置することに加え、当該腫瘍の位置を特定することも可能である。
なお、本発明の効果は、ここに記載された効果に限定されず、本明細書内に記載されたいずれかの効果であってもよい。
本発明について、以下の順で説明する。
1.本発明の概要
1.1 抗腫瘍活性
1.2 診断における有用性
1.3 毒性の観点における有用性
1.4 がん免疫の付与の観点における有用性
1.5 提案されている治療方法が有する問題点への対処
2.実施態様
2.1 第一の実施態様(抗腫瘍剤)
2.1.1 腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌を含む抗腫瘍剤
2.1.2 腫瘍から分離されたプロテウス属細菌を含む抗腫瘍剤
2.1.3 腫瘍から分離されたラクトコッカス属細菌を含む抗腫瘍剤
2.1.4 腫瘍から分離されたエンテロコッカス属細菌を含む抗腫瘍剤
2.1.5 腫瘍から分離されたアシネトバクター属細菌を含む抗腫瘍剤
2.1.6 腫瘍から分離されたバチルス属細菌を含む抗腫瘍剤
2.1.7 腫瘍から分離されたキューティバクテリウム属細菌を含む抗腫瘍剤
2.1.8 他の細菌の例
2.1.9 抗腫瘍剤の構成
2.1.10 抗腫瘍剤の製造方法
2.2 第二の実施態様(細菌)
2.2.1 紅色非硫黄細菌
2.2.2 プロテウス属細菌
2.2.3 ラクトコッカス属細菌
2.2.4 エンテロコッカス属細菌
2.2.5 アシネトバクター属細菌
2.2.6 バチルス属細菌
2.2.7 キューティバクテリウム属細菌
2.3 第三の実施態様(画像生成方法)
2.4 第四の実施態様(細菌の製造方法)
2.5 第五の実施態様(処置方法及び診断方法)
3.実施例
3.1 腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌及びプロテウス属細菌
3.2 腫瘍から分離されたラクトコッカス属細菌及びエンテロコッカス属細菌
3.3 腫瘍から分離されたアシネトバクター属細菌、バチルス属細菌、及びキューティバクテリウム属細菌
なお、本発明はこれらの実施態様のみに限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができる。
1.本発明の概要
1.1 抗腫瘍活性
1.2 診断における有用性
1.3 毒性の観点における有用性
1.4 がん免疫の付与の観点における有用性
1.5 提案されている治療方法が有する問題点への対処
2.実施態様
2.1 第一の実施態様(抗腫瘍剤)
2.1.1 腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌を含む抗腫瘍剤
2.1.2 腫瘍から分離されたプロテウス属細菌を含む抗腫瘍剤
2.1.3 腫瘍から分離されたラクトコッカス属細菌を含む抗腫瘍剤
2.1.4 腫瘍から分離されたエンテロコッカス属細菌を含む抗腫瘍剤
2.1.5 腫瘍から分離されたアシネトバクター属細菌を含む抗腫瘍剤
2.1.6 腫瘍から分離されたバチルス属細菌を含む抗腫瘍剤
2.1.7 腫瘍から分離されたキューティバクテリウム属細菌を含む抗腫瘍剤
2.1.8 他の細菌の例
2.1.9 抗腫瘍剤の構成
2.1.10 抗腫瘍剤の製造方法
2.2 第二の実施態様(細菌)
2.2.1 紅色非硫黄細菌
2.2.2 プロテウス属細菌
2.2.3 ラクトコッカス属細菌
2.2.4 エンテロコッカス属細菌
2.2.5 アシネトバクター属細菌
2.2.6 バチルス属細菌
2.2.7 キューティバクテリウム属細菌
2.3 第三の実施態様(画像生成方法)
2.4 第四の実施態様(細菌の製造方法)
2.5 第五の実施態様(処置方法及び診断方法)
3.実施例
3.1 腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌及びプロテウス属細菌
3.2 腫瘍から分離されたラクトコッカス属細菌及びエンテロコッカス属細菌
3.3 腫瘍から分離されたアシネトバクター属細菌、バチルス属細菌、及びキューティバクテリウム属細菌
なお、本発明はこれらの実施態様のみに限定されず、本発明の範囲内で自由に変更することができる。
1.本発明の概要
上記で述べたとおり、がんを治療するために、例えば手術療法、薬物療法、及び放射線療法など、様々な治療方法が用いられている。また、がんの治療方法に関して、種々の提案も行われている。
がん治療のための手法として、例えばナノメディシンが提案されている。当該ナノメディシンの例として、EPR効果を利用するものが挙げられる。正常な血管内皮細胞とは異なり、がん組織や炎症部位の血管内皮細胞間には200 nm程度の広い隙間が開口しており、10~100 nm程度にサイズが制御されたナノ粒子ががん組織に特異的に集積するEPR効果(Enhanced Permeation and Retention Effect)が知られている。多くの場合、ナノテクノロジーを利用した抗がん治療は、このEPR効果に依存しているため性能限界に近い。実際、固形がんに対しては阻害する環境要因がいくつもあり、EPR効果そのものが有用ではないということも報告されている(例えば、横山昌幸、Drug Delivery System, 33 (2),p.89-97 (2018).)。また、EPR効果を利用した薬物担持体は、ヒト臨床試験での成功は納めていない。
このように、ナノメディシンは、不明瞭なメカニズムのEPR効果に依存しており、がんに対する選択性は低い。また、ナノメディシンは、強い副作用のある抗がん剤を利用するという問題点もある。また、ナノメディシンは、合成に多大な手間暇とコストが掛かる。また、腫瘍内部は酸素が欠乏した状態のため、酸素を利用する光線力学療法型のナノメディシンは低効果である。
このように、ナノメディシンは、不明瞭なメカニズムのEPR効果に依存しており、がんに対する選択性は低い。また、ナノメディシンは、強い副作用のある抗がん剤を利用するという問題点もある。また、ナノメディシンは、合成に多大な手間暇とコストが掛かる。また、腫瘍内部は酸素が欠乏した状態のため、酸素を利用する光線力学療法型のナノメディシンは低効果である。
また、がん治療のための手法として、抗体療法も提案されている。例えば、腫瘍ターゲット性能を改善するためにがん細胞に特異的な抗体などを薬物担持体に搭載する戦略が提案されている(例えば、小林久隆、Drug Delivery System, 29 (4), p. 274-284 (2014).)。しかしながら、サイズの大きな抗体はがんを取り囲む間質バリアを透過することが難しく、十分な選択性と薬効が得られていない。
このように、抗体は、がん間質バリアを透過することができない(腫瘍の表面のみに結合)ため、免疫細胞を利用しているものの、腫瘍深部のがん細胞の排除は困難である。また、抗体療法に関しては、がん患者間で異なる発現量のバイオマーカーに対してOrder (Owner) madeで抗体を作る必要性もある。また、抗体が搭載された薬物単自体の作製に多大な手間暇とコストが掛かる。
このように、抗体は、がん間質バリアを透過することができない(腫瘍の表面のみに結合)ため、免疫細胞を利用しているものの、腫瘍深部のがん細胞の排除は困難である。また、抗体療法に関しては、がん患者間で異なる発現量のバイオマーカーに対してOrder (Owner) madeで抗体を作る必要性もある。また、抗体が搭載された薬物単自体の作製に多大な手間暇とコストが掛かる。
また、がん治療のための手法として、近年、細菌療法も提案されており、特には、低酸素状態の腫瘍内部で選択的に集積、生育、及び増殖可能な嫌気性微生物を利用したがん標的治療に注目が集まっている(Shibin Zhou et al. Nature Reviews Cancer, 18, p.727-743 (2018).)。しかし、従来のがん細菌療法は、基本的には抗がん剤の運搬という、いわゆるドラッグデリバリーシステムの概念である。また、抗がん活性を発現するためには、遺伝子工学を用いた微生物の操作又は改変が必要である。この結果、細菌が薬物耐性を獲得するといった予想不可能で、かつ制御不能な問題が生じる可能性があり、医療への応用は難しいと言われている。また、使用される細菌は、多くの場合、遺伝子改変によって弱毒化したサルモネラ菌や大腸菌であり、体内で再び強毒化するリスクを常に伴っている。
このように、細菌療法に関しては、例えば遺伝子改変によって弱毒化したサルモネラ菌、リステリア菌、又は大腸菌の利用が提案されているが、これらは、体内で再び強毒化(復帰変異)するリスクがある。また、遺伝子改変により薬物耐性獲得の可能性もある。さらに、腫瘍特異性が不十分であり、正常な臓器又は組織にも蓄積しうる。また、上記細菌療法は、受動的なドラッグデリバリーであり、煩雑な遺伝子設計が必要である。
このように、細菌療法に関しては、例えば遺伝子改変によって弱毒化したサルモネラ菌、リステリア菌、又は大腸菌の利用が提案されているが、これらは、体内で再び強毒化(復帰変異)するリスクがある。また、遺伝子改変により薬物耐性獲得の可能性もある。さらに、腫瘍特異性が不十分であり、正常な臓器又は組織にも蓄積しうる。また、上記細菌療法は、受動的なドラッグデリバリーであり、煩雑な遺伝子設計が必要である。
1.1 抗腫瘍活性
本発明者らは、腫瘍内に存在する細菌を当該腫瘍から分離することによって、当該細菌が優れた抗腫瘍活性を示すことを見出した。
本発明者らは、腫瘍内に存在する細菌を当該腫瘍から分離することによって、当該細菌が優れた抗腫瘍活性を示すことを見出した。
腫瘍内には、種々の細菌が存在している。これら細菌は、腫瘍内に存在している場合には、当該腫瘍を攻撃することはないと考えられる。しかしながら、本発明者らは、このように腫瘍内に存在している細菌が、腫瘍から分離されることによって抗腫瘍活性を発揮するようになることを見出した。すなわち、本発明は、腫瘍から分離された細菌を含む抗腫瘍剤を提供する。
一実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌は紅色非硫黄細菌である。腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌は、優れた抗腫瘍活性を有する。特には、腫瘍から分離されそして培地中で培養された紅色非硫黄細菌が、優れた抗腫瘍活性を発揮する。前記紅色非硫黄細菌は、例えばRhodopseudomonas属細菌若しくはBlastchloris属細菌又はこれらの両方であってよい。当該抗腫瘍活性は、非常に優れたものであり、種々の臓器又は組織における腫瘍に対して有効である。
前記実施態様において、好ましくは、前記紅色非硫黄細菌は、腫瘍から分離された他の細菌と組み合わせて用いられてよい。腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌と腫瘍から分離された他の細菌との組合せは、特に優れた抗腫瘍活性を発揮する。当該他の細菌は、例えばProteus属の細菌であってよい。当該組合せを構成する2種類以上の細菌は、好ましくは同じ腫瘍から分離され、そして、同じ培地中で一緒に培養(共培養)されたものであってよい。
他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌はProteus属の細菌である。腫瘍から分離されたProteus属細菌は、上記のとおり、紅色非硫黄細菌と組み合わせて用いられてよいが、単独で用いられてもよい。腫瘍から分離されたProteus属細菌は、優れた抗腫瘍活性を有する。当該抗腫瘍活性は、非常に優れたものであり、種々の臓器又は組織における腫瘍に対して有効である。
さらに他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌はLactococcus属の細菌である。腫瘍から分離されたLactococcus属細菌は、優れた抗腫瘍活性を有する。
さらに他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌はEnterococcus属の細菌である。腫瘍から分離されたEnterococcus属細菌は、優れた抗腫瘍活性を有する。
さらに他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌はAcinetobacter属の細菌である。腫瘍から分離されたAcinetobacter属細菌は、優れた抗腫瘍活性を有する。
さらに他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌はBacillus属の細菌である。腫瘍から分離されたBacillus属細菌は、優れた抗腫瘍活性を有する。
さらに他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌はCutibacterium属の細菌である。腫瘍から分離されたCutibacterium属細菌は、優れた抗腫瘍活性を有する。
これらの細菌の抗腫瘍活性も、非常に優れたものである。
さらに他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌はEnterococcus属の細菌である。腫瘍から分離されたEnterococcus属細菌は、優れた抗腫瘍活性を有する。
さらに他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌はAcinetobacter属の細菌である。腫瘍から分離されたAcinetobacter属細菌は、優れた抗腫瘍活性を有する。
さらに他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌はBacillus属の細菌である。腫瘍から分離されたBacillus属細菌は、優れた抗腫瘍活性を有する。
さらに他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌はCutibacterium属の細菌である。腫瘍から分離されたCutibacterium属細菌は、優れた抗腫瘍活性を有する。
これらの細菌の抗腫瘍活性も、非常に優れたものである。
1.2 診断における有用性
また、本発明者らは、上記で述べた腫瘍から分離された細菌が、腫瘍部位に集まる特性を有することも見出した。例えば、当該腫瘍から分離された細菌は、動物に非経口的に投与された場合に、腫瘍部位に集まる。そのため、例えば当該細菌の光学特性を利用した分析を行うことは、腫瘍の有無の判定のために又は腫瘍の位置若しくは形状の特定のために有用である。例えば、当該細菌の光学特性を利用して当該動物を撮像することで得られた情報(特には画像情報)が、前記判定又は前記特定のために有用である。このように、当該腫瘍から分離された細菌は、腫瘍の処置だけでなく、腫瘍の診断のためにも有用であり、例えば診断用医薬としても利用できる。さらには、当該腫瘍から分離された細菌は、腫瘍の処置及び腫瘍の診断の両方のために利用できる。
また、本発明者らは、上記で述べた腫瘍から分離された細菌が、腫瘍部位に集まる特性を有することも見出した。例えば、当該腫瘍から分離された細菌は、動物に非経口的に投与された場合に、腫瘍部位に集まる。そのため、例えば当該細菌の光学特性を利用した分析を行うことは、腫瘍の有無の判定のために又は腫瘍の位置若しくは形状の特定のために有用である。例えば、当該細菌の光学特性を利用して当該動物を撮像することで得られた情報(特には画像情報)が、前記判定又は前記特定のために有用である。このように、当該腫瘍から分離された細菌は、腫瘍の処置だけでなく、腫瘍の診断のためにも有用であり、例えば診断用医薬としても利用できる。さらには、当該腫瘍から分離された細菌は、腫瘍の処置及び腫瘍の診断の両方のために利用できる。
一実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌は、紅色非硫黄細菌であってよい。腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌は、通常の紅色非硫黄細菌(例えば市販の紅色非硫黄細菌など)と異なる光学特性を有する。当該光学特性に加え、上記で述べた腫瘍部位に集まる特性を利用することで、腫瘍の有無の判定又は腫瘍の位置若しくは形状の特定が可能となる。
1.3 毒性の観点における有用性
また、本発明者らは、上記で述べた腫瘍から分離された細菌が、毒性という観点からも優れていることを見出した。
一般的には、細菌が動物に投与(特には非経口投与)された場合、当該細菌は当該動物に対して毒性を発揮することがしばしばある。例えば市販されている紅色非硫黄細菌やProteus属細菌を動物に投与すると、これら細菌は、当該動物に対して毒性を発揮しうる。
しかしながら、上記で述べた腫瘍から分離された細菌は、動物に投与(特には非経口投与)された場合において、当該動物への毒性を発揮せず、又は、毒性を発揮したとしても、その毒性は低いと考えられる。
毒性の観点から、腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌及びProteus属細菌は特に優れている。すなわち、毒性の観点から特に好ましくは、本開示の抗腫瘍剤は、腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌及びProteus属細菌の少なくとも一方を含んでよい。
また、本発明者らは、上記で述べた腫瘍から分離された細菌が、毒性という観点からも優れていることを見出した。
一般的には、細菌が動物に投与(特には非経口投与)された場合、当該細菌は当該動物に対して毒性を発揮することがしばしばある。例えば市販されている紅色非硫黄細菌やProteus属細菌を動物に投与すると、これら細菌は、当該動物に対して毒性を発揮しうる。
しかしながら、上記で述べた腫瘍から分離された細菌は、動物に投与(特には非経口投与)された場合において、当該動物への毒性を発揮せず、又は、毒性を発揮したとしても、その毒性は低いと考えられる。
毒性の観点から、腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌及びProteus属細菌は特に優れている。すなわち、毒性の観点から特に好ましくは、本開示の抗腫瘍剤は、腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌及びProteus属細菌の少なくとも一方を含んでよい。
また、本発明者らは、上記で述べた腫瘍から分離された細菌は、投与された後しばらくの間は、動物の体内に存在するが、さらに或る程度の期間が経過すると動物の体内に確認できなくなることも見出した。すなわち、当該腫瘍から分離された細菌は、長期間にわたって動物の体内に存在することはないと考えられ、これにより、当該細菌による悪影響に関する懸念が低減される。
1.4 がん免疫の付与の観点における有用性
また、本発明者らは、上記で述べた腫瘍から分離された細菌は、腫瘍に対する免疫を付与する又は増強することも見出した。
例えば、当該腫瘍から分離された細菌は、上記のとおり抗腫瘍活性を有するので、当該細菌を、腫瘍を有する動物に投与することで、当該動物における腫瘍を消失させることができる。そして、当該腫瘍消失の後に、当該動物に腫瘍を生じさせる処置を行ったとしても、当該動物に腫瘍は生じないことを見出した。そのため、例えば、前記抗腫瘍剤(特には前記腫瘍から分離された細菌)は、腫瘍の再発を防ぐために用いられてもよい。
また、本発明者らは、上記で述べた腫瘍から分離された細菌は、腫瘍に対する免疫を付与する又は増強することも見出した。
例えば、当該腫瘍から分離された細菌は、上記のとおり抗腫瘍活性を有するので、当該細菌を、腫瘍を有する動物に投与することで、当該動物における腫瘍を消失させることができる。そして、当該腫瘍消失の後に、当該動物に腫瘍を生じさせる処置を行ったとしても、当該動物に腫瘍は生じないことを見出した。そのため、例えば、前記抗腫瘍剤(特には前記腫瘍から分離された細菌)は、腫瘍の再発を防ぐために用いられてもよい。
1.5 提案されている治療方法が有する問題点への対処
本発明に従う抗腫瘍剤は、上記で述べた治療方法に関する問題点についても対処できる。
例えばナノメディシンは、上記のとおり、不明瞭な機構のEPR効果に依存しており、がんに対する低い選択性を有する。一方で、本発明に従う抗腫瘍剤(特には細菌)は、腫瘍に対する高い選択性を発現することができる。この高い選択性は、例えば低酸素、免疫回避、及び化学走性に起因すると考えられ、すなわち明確な機構により発揮される。
また、ナノメディシンは、強い副作用のある抗がん剤を利用するが、本発明に従う抗腫瘍剤は、副作用の強い抗がん剤を利用せず、本発明において用いられる細菌は低毒性である。
また、ナノメディシンは、合成のために多大な手間暇とコストが掛かるが、本発明の抗腫瘍剤に含まれる細菌は、無限に自己複製可能であり、餌も安く、管理も容易である。
また、ナノメディシンは、強い副作用のある抗がん剤を利用するが、本発明に従う抗腫瘍剤は、副作用の強い抗がん剤を利用せず、本発明において用いられる細菌は低毒性である。
また、ナノメディシンは、合成のために多大な手間暇とコストが掛かるが、本発明の抗腫瘍剤に含まれる細菌は、無限に自己複製可能であり、餌も安く、管理も容易である。
抗体療法を行うためには、上記のとおり、がん患者間で異なる発現量を有するバイオマーカーに対して、Order (Owner) madeで抗体を作る必要性がある。一方で、本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる細菌は、固形がんに普遍的な微小環境に高選択的に集積し、さらに当該微小環境において生育及び増殖が可能である。そのため、上記のように抗体を作る必要はない。
また、抗体療法の有効成分は、がん間質バリアを透過することができず、主に腫瘍の表面のみに結合するため、免疫細胞を利用しているものの、腫瘍深部のがん細胞の排除は困難である。一方で、本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる細菌は、腫瘍深部に集積し、そこで生育及び増殖することもできる。そのため、がん深部からがん細胞を根こそぎ排除することが可能である。
また、抗体療法の有効成分は、作製に多大な手間暇とコストが掛かる。一方で、本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる細菌は、無限に自己複製可能であり、餌も安く、管理も容易である。
また、抗体療法の有効成分は、がん間質バリアを透過することができず、主に腫瘍の表面のみに結合するため、免疫細胞を利用しているものの、腫瘍深部のがん細胞の排除は困難である。一方で、本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる細菌は、腫瘍深部に集積し、そこで生育及び増殖することもできる。そのため、がん深部からがん細胞を根こそぎ排除することが可能である。
また、抗体療法の有効成分は、作製に多大な手間暇とコストが掛かる。一方で、本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる細菌は、無限に自己複製可能であり、餌も安く、管理も容易である。
従来の細菌療法では、例えば遺伝子改変によって弱毒化したサルモネラ菌、リステリア菌、又は大腸菌が利用されるところ、これら細菌は、体内で再び強毒化(復帰変異)するリスクがあり、遺伝子改変により薬物耐性獲得の可能性もある。さらに、これら細菌は、腫瘍特異性も不十分であり、例えば正常な臓器又は組織にも蓄積しうる。一方で、本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる細菌は、遺伝子組み換えの必要はなく、さらに、腫瘍に対する高選択性を発現することもできる。さらに、使用する細菌は低毒性である。
また、従来の細菌療法は、受動的なドラッグデリバリーに基づくものであり、煩雑な遺伝子設計が必要である。一方で、本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる細菌は、遺伝子組み換えの必要がなく、さらに、細菌の単回投与のみで腫瘍を排除することができる。
また、従来の細菌療法は、受動的なドラッグデリバリーに基づくものであり、煩雑な遺伝子設計が必要である。一方で、本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる細菌は、遺伝子組み換えの必要がなく、さらに、細菌の単回投与のみで腫瘍を排除することができる。
以下で、本発明の実施態様をより詳細に説明する。
2.実施態様
2.1 第一の実施態様(抗腫瘍剤)
本発明は、腫瘍から分離された細菌を含む抗腫瘍剤を提供する。前記抗腫瘍剤は、例えば腫瘍から分離された1種類以上の細菌を含んでよく、例えば前記抗腫瘍剤は、腫瘍から分離された1種の細菌又は2種の細菌を含んでもよい。前記抗腫瘍剤において、前記腫瘍から分離された細菌は、抗腫瘍活性を発揮する有効成分として用いられてよい。
2.1.1 腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌を含む抗腫瘍剤
本発明の一実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌は、腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌を含む。腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌は、上記で述べたとおり、優れた抗腫瘍活性を発揮することができる。
また、当該紅色非硫黄細菌は動物に投与された場合(特には非経口投与された場合)に、腫瘍に集まる。そのため、前記抗腫瘍剤は、腫瘍部位に直接投与されなくてよいが、腫瘍部位へ直接投与されてもよい。
また、当該紅色非硫黄細菌は、特定の光学特性を有する。そのため、前記抗腫瘍剤は、当該抗腫瘍活性に基づく腫瘍の処置のために投与されてよいが、当該腫瘍の処置に加えて、腫瘍の有無の判定又は腫瘍の形状若しくは位置の特定のために用いられてもよい。
本発明の一実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌は、腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌を含む。腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌は、上記で述べたとおり、優れた抗腫瘍活性を発揮することができる。
また、当該紅色非硫黄細菌は動物に投与された場合(特には非経口投与された場合)に、腫瘍に集まる。そのため、前記抗腫瘍剤は、腫瘍部位に直接投与されなくてよいが、腫瘍部位へ直接投与されてもよい。
また、当該紅色非硫黄細菌は、特定の光学特性を有する。そのため、前記抗腫瘍剤は、当該抗腫瘍活性に基づく腫瘍の処置のために投与されてよいが、当該腫瘍の処置に加えて、腫瘍の有無の判定又は腫瘍の形状若しくは位置の特定のために用いられてもよい。
(細菌の種類)
前記紅色非硫黄細菌の例として以下を挙げることができる:
・ロドシュードモナス属(Rhodopseudomonas)細菌、例えばRhodopseudomonas Palustris及びRhodopseudomonas pseudopalustrisなど;
・ブラストクロリス属(Blastochloris)細菌、例えばBlastochloris viridis及びBlastochloris sulfoviridisなど;
・アフィフェラ属(Afifella)細菌、例えばAfifella marinaなど;
・ロドバクター属(Rhodobacter)細菌、例えばRhodobacter blasticus、Rhodobacter capsulatus、及びRhodobacter sphaeroidesなど;
・ルブリビバックス属(Rubrivivax)細菌、例えばRubrivivax gelatinosusなど;
・パラロドスピリラム属(Pararhodospirillum)細菌、例えばPararhodospirillum oryzae及びPararhodospirillum sulfurexigensなど;
・ロドシスタ属(Rhodocista)細菌、例えばRhodocista centenariaなど;
・マリクロマチウム属(Marichromatium)細菌、例えばMarichromatium litoris;
・ファエオクロマチウム属(Phaeochromatium)細菌、例えばPhaeochromatium fluminisなど;
・ロドフェラックス属(Rhodoferax)細菌、例えばRhodoferax fermentansなど;
・ロドミクロビウム属(Rhodomicrobium)細菌、例えばRhodomicrobium udaipurense 及びRhodomicrobium vannieliiなど;及び
・ロドブラム属(Rhodovulum)細菌、例えばRhodovulum sulfidophilumなど。
本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる、腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌は、例えば、上記で列挙された属の細菌のいずれか1つであってよく又は2つ以上の組合せであってもよい。
また、本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌は、例えば、上記で列挙された種の細菌のいずれか1つであってよく又は2つ以上の組合せであってもよい。
前記紅色非硫黄細菌の例として以下を挙げることができる:
・ロドシュードモナス属(Rhodopseudomonas)細菌、例えばRhodopseudomonas Palustris及びRhodopseudomonas pseudopalustrisなど;
・ブラストクロリス属(Blastochloris)細菌、例えばBlastochloris viridis及びBlastochloris sulfoviridisなど;
・アフィフェラ属(Afifella)細菌、例えばAfifella marinaなど;
・ロドバクター属(Rhodobacter)細菌、例えばRhodobacter blasticus、Rhodobacter capsulatus、及びRhodobacter sphaeroidesなど;
・ルブリビバックス属(Rubrivivax)細菌、例えばRubrivivax gelatinosusなど;
・パラロドスピリラム属(Pararhodospirillum)細菌、例えばPararhodospirillum oryzae及びPararhodospirillum sulfurexigensなど;
・ロドシスタ属(Rhodocista)細菌、例えばRhodocista centenariaなど;
・マリクロマチウム属(Marichromatium)細菌、例えばMarichromatium litoris;
・ファエオクロマチウム属(Phaeochromatium)細菌、例えばPhaeochromatium fluminisなど;
・ロドフェラックス属(Rhodoferax)細菌、例えばRhodoferax fermentansなど;
・ロドミクロビウム属(Rhodomicrobium)細菌、例えばRhodomicrobium udaipurense 及びRhodomicrobium vannieliiなど;及び
・ロドブラム属(Rhodovulum)細菌、例えばRhodovulum sulfidophilumなど。
本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる、腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌は、例えば、上記で列挙された属の細菌のいずれか1つであってよく又は2つ以上の組合せであってもよい。
また、本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌は、例えば、上記で列挙された種の細菌のいずれか1つであってよく又は2つ以上の組合せであってもよい。
好ましい実施態様において、本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる紅色非硫黄細菌は、ロドシュードモナス属細菌若しくはブラストクロリス属細菌又はこれらの両方であってよい。腫瘍から分離されたこれらの細菌は、特に優れた抗腫瘍活性を発揮することができる。また、腫瘍から分離されたこれらの細菌は、動物に投与(特には非経口投与)された場合に腫瘍に集まる特性を有し且つこれら細菌は特定の光学特性を有するので、腫瘍診断用画像を生成のためにも有用である。
例えば、前記抗腫瘍剤に含まれる、腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌は、Rhodopseudomonas Palustris、Rhodopseudomonas pseudopalustris、Blastochloris viridis、及びBlastochloris sulfoviridisのうちのいずれか1つ、2つ、3つ、又は4つであってよい。特に好ましくは、本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる紅色非硫黄細菌は、腫瘍から分離されたRhodopseudomonas Palustrisを少なくとも含んでよい。例えば、本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる紅色非硫黄細菌は、腫瘍から分離されたRhodopseudomonas Palustrisのみを含んでもよい。
例えば、前記抗腫瘍剤に含まれる、腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌は、Rhodopseudomonas Palustris、Rhodopseudomonas pseudopalustris、Blastochloris viridis、及びBlastochloris sulfoviridisのうちのいずれか1つ、2つ、3つ、又は4つであってよい。特に好ましくは、本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる紅色非硫黄細菌は、腫瘍から分離されたRhodopseudomonas Palustrisを少なくとも含んでよい。例えば、本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる紅色非硫黄細菌は、腫瘍から分離されたRhodopseudomonas Palustrisのみを含んでもよい。
特に好ましい実施態様において、本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる紅色非硫黄細菌は、ロドシュードモナス属細菌である。腫瘍から分離されたロドシュードモナス属細菌は、特に優れた抗腫瘍活性を発揮することができる。
例えば、本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる紅色非硫黄細菌は、Rhodopseudomonas Palustris若しくはRhodopseudomonas pseudopalustris又はこれらの両方であってよい。特に好ましくは、本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる紅色非硫黄細菌は、腫瘍から分離されたRhodopseudomonas Palustrisを少なくとも含んでよい。
例えば、本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる紅色非硫黄細菌は、Rhodopseudomonas Palustris若しくはRhodopseudomonas pseudopalustris又はこれらの両方であってよい。特に好ましくは、本発明に従う抗腫瘍剤に含まれる紅色非硫黄細菌は、腫瘍から分離されたRhodopseudomonas Palustrisを少なくとも含んでよい。
特に好ましい実施態様において、本発明に従う抗腫瘍剤は、前記紅色非硫黄細菌に加えて、他の細菌をさらに含む。腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌と腫瘍から分離された他の細菌との組合せは、特に優れた抗腫瘍活性を発揮する。当該他の細菌は、例えばプロテウス(Proteus)属の細菌であってよい。当該組合せを構成する2種類以上の細菌は、好ましくは同じ腫瘍から一緒に分離され、そして、一緒に培養(共培養)されたものであってよい。すなわち、本発明に従う抗腫瘍剤は、腫瘍から一緒に分離された前記紅色非硫黄細菌(例えば前記ロドシュードモナス属細菌)及び前記他の細菌(例えばプロテウス属細菌)の組合せを含んでよい。
前記他の細菌としてのプロテウス属細菌は、例えばProteus mirabilis、Proteus vulgaris、及びProteus myxofaciensのうちのいずれか1つ、2つ、又は3つであってよく、好ましくはProteus mirabilisであってよい。腫瘍から分離された前記紅色非硫黄細菌と腫瘍から分離されたProteus mirabilisとの組合せは、特に優れた抗腫瘍効果を発揮する。
特に好ましい実施態様において、前記抗腫瘍剤は、腫瘍から分離されたRhodopseudomonas Palustris及びProteus mirabilisの組合せを含んでよい。これら2種の複合細菌は、特に優れた抗腫瘍活性を発揮する。当該複合細菌は、例えば、受託番号:NITE BP-03627で寄託された複合細菌であってよい。当該複合細菌は、寄託日を令和4年(2022年)3月23日として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NPMD、〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に国際寄託された。また、本発明において、当該複合細菌のうちの、一方が他方から分離されて用いられてもよい。
特に好ましい実施態様において、前記抗腫瘍剤は、腫瘍から分離されたRhodopseudomonas Palustris及びProteus mirabilisの組合せを含んでよい。これら2種の複合細菌は、特に優れた抗腫瘍活性を発揮する。当該複合細菌は、例えば、受託番号:NITE BP-03627で寄託された複合細菌であってよい。当該複合細菌は、寄託日を令和4年(2022年)3月23日として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NPMD、〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に国際寄託された。また、本発明において、当該複合細菌のうちの、一方が他方から分離されて用いられてもよい。
前記抗腫瘍剤中の前記紅色非硫黄細菌及び前記他の細菌の構成比率は、例えば99:1~1:99であってよいが、好ましくは前記紅色非硫黄細菌の含有比率がより高い。好ましい実施態様において、前記抗腫瘍剤中の前記紅色非硫黄細菌及び前記他の細菌の構成比率は、例えば99:1~50:50であり、より好ましくは99:1~55:45であってよい。前記構成比率は、例えば80:20~55:45であってもよく、又は、70:30~60:40であってもよい。これら構成比率は、各細菌のCFUに基づく構成比率であってよい。
このような構成比率によって、特には前記紅色非硫黄細菌の含有比率が前記他の細菌の含有比率よりも高いことによって、優れた抗腫瘍活性が発揮される。
このような構成比率によって、特には前記紅色非硫黄細菌の含有比率が前記他の細菌の含有比率よりも高いことによって、優れた抗腫瘍活性が発揮される。
前記CFUに基づく構成比率は、前記抗腫瘍剤中の細菌を、シャーレ中の培地上に播種し、そして、所定期間の培養によって生じたコロニーの数をカウントすることによって決定することができる。
例えば、前記他の細菌として挙げたProteus mirabilisは培養開始後2日~3日でコロニーを形成する一方で、前記紅色非硫黄細菌のうちのRhodopseudomonas Palustrisは培養開始後7日~10日でコロニーを形成する。そのため、培養開始後2日~3日で形成されたコロニー数をカウントし、そして次に、培養開始後7日~10日で形成されたコロニーの数をカウントすることで、Proteus mirabilis及びRhodopseudomonas Palustrisのコロニー数がそれぞれ得られる。これらコロニー数に基づき前記構成比率が決定されてよい。
このように、前記抗腫瘍剤中に前記紅色非硫黄細菌及び前記他の細菌が含まれる場合において、これら細菌の構成比率を決定するために、各細菌がコロニーを形成するための期間の差が用いられる。
例えば、前記他の細菌として挙げたProteus mirabilisは培養開始後2日~3日でコロニーを形成する一方で、前記紅色非硫黄細菌のうちのRhodopseudomonas Palustrisは培養開始後7日~10日でコロニーを形成する。そのため、培養開始後2日~3日で形成されたコロニー数をカウントし、そして次に、培養開始後7日~10日で形成されたコロニーの数をカウントすることで、Proteus mirabilis及びRhodopseudomonas Palustrisのコロニー数がそれぞれ得られる。これらコロニー数に基づき前記構成比率が決定されてよい。
このように、前記抗腫瘍剤中に前記紅色非硫黄細菌及び前記他の細菌が含まれる場合において、これら細菌の構成比率を決定するために、各細菌がコロニーを形成するための期間の差が用いられる。
なお、コロニーを形成するための期間が同程度である場合は、代替的に、前記紅色非硫黄細菌及び前記他の細菌の光学特性に基づきコロニー数がカウントされてもよい。前記紅色非硫黄細菌は特定の光学特性を有するが、前記他の細菌は当該光学特性を有さない。そのため、シャーレ中の培地上に形成されたコロニーを、当該光学特性の有無に基づき、いずれの細菌であるかを判定し、そして、各細菌のコロニー数をカウントしてもよい。
(細菌の光学特性)
好ましくは、前記腫瘍から分離された細菌は、以下で説明する光学特性を有するものであってよい。腫瘍から分離された細菌は、例えば同じ種の市販されている細菌と異なる光学特性を有する。当該光学特性を有することが、抗腫瘍活性を発揮することに関与していると考えられる。
好ましくは、前記腫瘍から分離された細菌は、以下で説明する光学特性を有するものであってよい。腫瘍から分離された細菌は、例えば同じ種の市販されている細菌と異なる光学特性を有する。当該光学特性を有することが、抗腫瘍活性を発揮することに関与していると考えられる。
本発明の抗腫瘍剤に含まれる腫瘍から分離された細菌は、吸光スペクトルに関する以下の特性を示すものであってよい。当該腫瘍から分離された細菌(特には前記紅色非硫黄細菌)は、同じ種の通常の細菌(例えば市販されているもの)よりも、より高い吸光特性を有する。当該より高い吸光特性を有することが、前記細菌(特には前記紅色非硫黄細菌)が抗腫瘍活性を有することに関連していると考えられる。
例えば、前記抗腫瘍剤に含まれる細菌(特には前記紅色非硫黄細菌)が2×107CFU/mLの濃度でPBS緩衝液に分散された分散液の吸光スペクトルを測定したときに、808nmにおける吸光度は、好ましくは0.029以上であり、より好ましくは0.030以上であり、さらにより好ましくは0.031以上、0.032以上、0.033以上、0.034以上、又は0.035以上であってもよい。当該吸光度がこのように高いことが、前記細菌(特には前記紅色非硫黄細菌)が抗腫瘍活性を有することに関連していると考えられる。
前記808nmにおける吸光度の上限値は、特に設定されなくてもよいが、例えば0.10以下、0.9以下、又は0.8以下であってよい。
前記吸光スペクトルは、後述の実施例において記載されたとおりに測定される。
前記808nmにおける吸光度の上限値は、特に設定されなくてもよいが、例えば0.10以下、0.9以下、又は0.8以下であってよい。
前記吸光スペクトルは、後述の実施例において記載されたとおりに測定される。
また、前記抗腫瘍剤に含まれる細菌(特には前記紅色非硫黄細菌)が2×107CFU/mLの濃度でPBS緩衝液に分散された分散液の吸光スペクトルを測定したときに、865nmにおける吸光度は、好ましくは0.032以上であり、より好ましくは0.033以上であり、さらにより好ましくは0.034以上、0.035以上、0.036以上、0.037以上、又は0.038以上であってもよい。当該吸光度がこのように高いことが、前記細菌(特には前記紅色非硫黄細菌)が抗腫瘍活性を有することに関連していると考えられる。
前記865nmにおける吸光度の上限値は、特に設定されなくてもよいが、例えば0.11以下、0.10以下、又は0.09以下であってよい。
前記865nmにおける吸光度の上限値は、特に設定されなくてもよいが、例えば0.11以下、0.10以下、又は0.09以下であってよい。
特に好ましくは、前記分散液の吸光スペクトルを測定したときに、808nmにおける吸光度は、好ましくは0.029以上であり、より好ましくは0.030以上であり、さらにより好ましくは0.031以上、0.032以上、0.033以上、0.034以上、又は0.035以上であり、且つ、865nmにおける吸光度は、好ましくは0.032以上であり、より好ましくは0.033以上であり、さらにより好ましくは0.034以上、0.035以上、0.036以上、0.037以上、又は0.038以上である。これら2つの波長における吸光度の両方がこのように高いことが、前記細菌(特には前記紅色非硫黄細菌)が抗腫瘍活性を有することに関連していると考えられる。
本発明の抗腫瘍剤に含まれる腫瘍から分離された細菌は、蛍光スペクトルに関する以下の特性を示すものであってよい。当該腫瘍から分離された細菌(特には前記紅色非硫黄細菌)は、同じ種の通常の細菌(例えば市販されているもの)よりも、より高い蛍光特性を有する。当該より高い蛍光特性を有することが、前記細菌(特には前記紅色非硫黄細菌)が抗腫瘍活性を有することに関連していると考えられる。
例えば、前記抗腫瘍剤に含まれる細菌が2.5×107CFU/mLの濃度でPBS緩衝液に分散された分散液の蛍光スペクトル(励起波長は805nm)を測定したときに、888nmにおける蛍光強度が、好ましくは4.4以上であり、より好ましくは4.5以上であり、さらにより好ましくは5.0以上、7.0以上、又は9.0以上であってもよい。
前記蛍光強度の上限値は、特に設定されなくてもよいが、例えば30以下、25以下、又は20以下であってよい。
前記蛍光強度がこのように高いことが、前記細菌(特には前記紅色非硫黄細菌)が抗腫瘍活性を有することに関連していると考えられる。
前記蛍光スペクトルは、後述の実施例において記載されたとおりに測定される。
前記蛍光強度の上限値は、特に設定されなくてもよいが、例えば30以下、25以下、又は20以下であってよい。
前記蛍光強度がこのように高いことが、前記細菌(特には前記紅色非硫黄細菌)が抗腫瘍活性を有することに関連していると考えられる。
前記蛍光スペクトルは、後述の実施例において記載されたとおりに測定される。
(細菌の毒性)
好ましくは、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍から分離された細菌は、以下で説明するとおり毒性が無く、又は、有ったとしても非常に低い。前記腫瘍から分離された細菌は、例えば同じ種の市販されている細菌と異なり、このような毒性特性を有しうる。前記腫瘍から分離された細菌が当該毒性特性を有することが、前記抗腫瘍剤の有用性をさらに高める。
好ましくは、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍から分離された細菌は、以下で説明するとおり毒性が無く、又は、有ったとしても非常に低い。前記腫瘍から分離された細菌は、例えば同じ種の市販されている細菌と異なり、このような毒性特性を有しうる。前記腫瘍から分離された細菌が当該毒性特性を有することが、前記抗腫瘍剤の有用性をさらに高める。
例えば、前記抗腫瘍剤に含まれる細菌が1×109CFUの量でマウス尾部静脈から単回投与された場合において、当該投与後40日間のマウス生存率が、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上であってよく、例えば100%であってもよい。本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記細菌は、このような毒性特性、特には極めて低い毒性特性を有するものであってよい。当該マウス生存率を特定するための各種条件(例えば投与される細菌が懸濁される培地やその調製方法など)は、後述の実施例において記載されたとおりである。
(免疫賦活化特性)
本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍から分離された細菌は、免疫賦活化特性を有する細菌であってよい。前記抗腫瘍剤は、前記免疫賦活化特性によって腫瘍を処置するものであってよい。
本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍から分離された細菌は、免疫賦活化特性を有する細菌であってよい。前記抗腫瘍剤は、前記免疫賦活化特性によって腫瘍を処置するものであってよい。
当該免疫賦活化特性は、例えば免疫細胞を賦活化する特性であってよい。
前記免疫細胞として、例えば自然免疫細胞が挙げられ、前記自然免疫細胞として、マクロファージ、NK細胞、及び好中球を挙げることができる。すなわち、前記腫瘍から分離された細菌は、自然免疫細胞を賦活化する特性を有しているものであってよく、例えばマクロファージ、NK細胞、及び好中球のうちの1つ、2つ、又は3つ全てを賦活化する特性を有する細菌であってよい。
また、前記免疫細胞として、例えば獲得免疫細胞が挙げられ、前記獲得免疫細胞として、T細胞及びB細胞が挙げられる。すなわち、前記腫瘍から分離された細菌は、獲得免疫細胞を賦活化する特性を有しているものであってよく、例えばT細胞若しくはB細胞又はこれらの両方を賦活化する特性を有する細菌であってよい。
このような免疫細胞賦活化特性が、前記腫瘍から分離された細菌が抗腫瘍活性を発揮することに貢献していると考えられる。
前記免疫細胞として、例えば自然免疫細胞が挙げられ、前記自然免疫細胞として、マクロファージ、NK細胞、及び好中球を挙げることができる。すなわち、前記腫瘍から分離された細菌は、自然免疫細胞を賦活化する特性を有しているものであってよく、例えばマクロファージ、NK細胞、及び好中球のうちの1つ、2つ、又は3つ全てを賦活化する特性を有する細菌であってよい。
また、前記免疫細胞として、例えば獲得免疫細胞が挙げられ、前記獲得免疫細胞として、T細胞及びB細胞が挙げられる。すなわち、前記腫瘍から分離された細菌は、獲得免疫細胞を賦活化する特性を有しているものであってよく、例えばT細胞若しくはB細胞又はこれらの両方を賦活化する特性を有する細菌であってよい。
このような免疫細胞賦活化特性が、前記腫瘍から分離された細菌が抗腫瘍活性を発揮することに貢献していると考えられる。
また、当該免疫賦活化特性は、例えば抗腫瘍マーカーの発現を増強する特性であってもよい。前記抗腫瘍マーカーとして、ネクローシスマーカー及びアポトーシスマーカーが挙げられ、それぞれの具体例としてTNF-α及びCaspase-3が挙げられる。すなわち、前記腫瘍から分離された細菌は、抗腫瘍マーカー発現増強特性を有しているものであってよく、例えばネクローシスマーカー若しくはアポトーシスマーカーマクロファージ又はこれらの両方の発現を増強する特性を有する細菌であってよい。
このような抗腫瘍マーカー発現増強特性も、前記腫瘍から分離された細菌が抗腫瘍活性を発揮するために貢献していると考えられる。
このような抗腫瘍マーカー発現増強特性も、前記腫瘍から分離された細菌が抗腫瘍活性を発揮するために貢献していると考えられる。
なお、前記腫瘍から分離された細菌は、このような免疫賦活化特性を有するので、免疫賦活化剤の有効成分として用いられてもよい。すなわち、本発明は、前記腫瘍から分離された細菌を含む免疫賦活化剤も提供する。前記免疫賦活化剤は、免疫賦活化用組成物と呼ばれてもよい。本明細書内において記載されている前記抗腫瘍剤に関する構成が、前記免疫賦活化剤の構成として採用されてよい。
2.1.2 腫瘍から分離されたプロテウス属細菌を含む抗腫瘍剤
本発明の他の実施態様において、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍から分離された細菌は、プロテウス属の細菌を含む。腫瘍から分離されたプロテウス属の細菌は、上記1.において述べたとおり、優れた抗腫瘍活性を発揮することができる。また、当該プロテウス属の細菌は、動物に投与された場合、特には非経口投与された場合に腫瘍に集まるので、腫瘍部位に直接投与されなくてもよいが、腫瘍部位へ直接投与されてもよい。また、当該プロテウス属の細菌は、当該抗腫瘍活性に基づく腫瘍の処置のために投与されてよい。
本発明の他の実施態様において、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍から分離された細菌は、プロテウス属の細菌を含む。腫瘍から分離されたプロテウス属の細菌は、上記1.において述べたとおり、優れた抗腫瘍活性を発揮することができる。また、当該プロテウス属の細菌は、動物に投与された場合、特には非経口投与された場合に腫瘍に集まるので、腫瘍部位に直接投与されなくてもよいが、腫瘍部位へ直接投与されてもよい。また、当該プロテウス属の細菌は、当該抗腫瘍活性に基づく腫瘍の処置のために投与されてよい。
好ましい実施態様において、当該プロテウス属の細菌は、腫瘍から単離された細菌であってよい。すなわち、前記抗腫瘍剤は、細菌として単離されたプロテウス属の細菌だけを含んでよい。
(細菌の種類)
前記プロテウス属細菌は、例えばProteus mirabilis、Proteus vulgaris、及びProteus myxofaciensのうちのいずれか1つ、2つ、又は3つであってよく、好ましくはProteus mirabilisであってよい。腫瘍から分離された(特には単離された)Proteus mirabilisは、特に優れた抗腫瘍活性を発揮する。当該Proteus mirabilisは、例えば、受託番号:NITE BP-03626で寄託された細菌であってよい。当該細菌は、寄託日を令和4年(2022年)3月23日として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NPMD、〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に国際寄託された。
前記プロテウス属細菌は、例えばProteus mirabilis、Proteus vulgaris、及びProteus myxofaciensのうちのいずれか1つ、2つ、又は3つであってよく、好ましくはProteus mirabilisであってよい。腫瘍から分離された(特には単離された)Proteus mirabilisは、特に優れた抗腫瘍活性を発揮する。当該Proteus mirabilisは、例えば、受託番号:NITE BP-03626で寄託された細菌であってよい。当該細菌は、寄託日を令和4年(2022年)3月23日として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NPMD、〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に国際寄託された。
(細菌の毒性)
好ましくは、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍から分離された前記プロテウス属細菌は、以下で説明するとおり毒性が無く、又は、有ったとしても非常に低い。前記腫瘍から分離された細菌は、例えば同じ種の市販されている細菌と異なり、このような毒性特性を有しうる。前記腫瘍から分離された細菌が当該毒性特性を有することが、前記抗腫瘍剤の有用性をさらに高める。
好ましくは、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍から分離された前記プロテウス属細菌は、以下で説明するとおり毒性が無く、又は、有ったとしても非常に低い。前記腫瘍から分離された細菌は、例えば同じ種の市販されている細菌と異なり、このような毒性特性を有しうる。前記腫瘍から分離された細菌が当該毒性特性を有することが、前記抗腫瘍剤の有用性をさらに高める。
例えば、前記抗腫瘍剤に含まれる前記プロテウス属細菌が1×108CFUの量でマウス尾部静脈から単回投与された場合において、当該投与後40日間のマウス生存率が、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上であってよく、例えば100%であってもよい。本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記プロテウス属細菌は、このような毒性特性、特には極めて低い毒性特性を有するものであってよい。当該マウス生存率を特定するための各種条件(例えば投与される細菌が懸濁される培地やその調製方法など)は、後述の実施例において記載されたとおりである。
(免疫賦活化特性)
前記腫瘍から分離されたプロテウス属細菌は、免疫賦活化特性を有する細菌であってよい。前記抗腫瘍剤は、前記免疫賦活化特性によって腫瘍を処置するものであってよい。
前記腫瘍から分離されたプロテウス属細菌は、免疫賦活化特性を有する細菌であってよい。前記抗腫瘍剤は、前記免疫賦活化特性によって腫瘍を処置するものであってよい。
当該免疫賦活化特性は、例えば免疫細胞を賦活化する特性であってよい。
前記免疫細胞として、例えば自然免疫細胞が挙げられ、前記自然免疫細胞として、マクロファージ、NK細胞、及び好中球を挙げることができる。すなわち、前記腫瘍から分離されたプロテウス属細菌は、自然免疫細胞を賦活化する特性を有しているものであってよく、例えばマクロファージ、NK細胞、及び好中球のうちの1つ、2つ、又は3つ全てを賦活化する特性を有する細菌であってよい。
また、前記免疫細胞として、例えば獲得免疫細胞が挙げられ、前記獲得免疫細胞として、T細胞及びB細胞が挙げられる。すなわち、前記腫瘍から分離されたプロテウス属細菌は、獲得免疫細胞を賦活化する特性を有しているものであってよく、例えばT細胞若しくはB細胞又はこれらの両方を賦活化する特性を有する細菌であってよい。
このような免疫細胞賦活化特性が、前記腫瘍から分離されたプロテウス属細菌が抗腫瘍活性を発揮することに貢献していると考えられる。
前記免疫細胞として、例えば自然免疫細胞が挙げられ、前記自然免疫細胞として、マクロファージ、NK細胞、及び好中球を挙げることができる。すなわち、前記腫瘍から分離されたプロテウス属細菌は、自然免疫細胞を賦活化する特性を有しているものであってよく、例えばマクロファージ、NK細胞、及び好中球のうちの1つ、2つ、又は3つ全てを賦活化する特性を有する細菌であってよい。
また、前記免疫細胞として、例えば獲得免疫細胞が挙げられ、前記獲得免疫細胞として、T細胞及びB細胞が挙げられる。すなわち、前記腫瘍から分離されたプロテウス属細菌は、獲得免疫細胞を賦活化する特性を有しているものであってよく、例えばT細胞若しくはB細胞又はこれらの両方を賦活化する特性を有する細菌であってよい。
このような免疫細胞賦活化特性が、前記腫瘍から分離されたプロテウス属細菌が抗腫瘍活性を発揮することに貢献していると考えられる。
また、当該免疫賦活化特性は、例えば抗腫瘍マーカーの発現を増強する特性であってもよい。前記抗腫瘍マーカーとして、ネクローシスマーカー及びアポトーシスマーカーが挙げられ、それぞれの具体例としてTNF-α及びCaspase-3が挙げられる。すなわち、前記腫瘍から分離されたプロテウス属細菌は、抗腫瘍マーカー発現増強特性を有しているものであってよく、例えばネクローシスマーカー若しくはアポトーシスマーカーマクロファージ又はこれらの両方の発現を増強する特性を有する細菌であってよい。
このような抗腫瘍マーカー発現増強特性も、前記腫瘍から分離されたプロテウス属細菌が抗腫瘍活性を発揮するために貢献していると考えられる。
このような抗腫瘍マーカー発現増強特性も、前記腫瘍から分離されたプロテウス属細菌が抗腫瘍活性を発揮するために貢献していると考えられる。
なお、前記腫瘍から分離されたプロテウス属細菌は、このような免疫賦活化特性を有するので、免疫賦活化剤の有効成分として用いられてもよい。すなわち、本発明は、前記腫瘍から分離されたプロテウス属細菌を含む免疫賦活化剤も提供する。前記免疫賦活化剤は、免疫賦活化用組成物と呼ばれてもよい。本明細書内において記載されている前記抗腫瘍剤に関する構成が、前記免疫賦活化剤の構成として採用されてよい。
2.1.3 腫瘍から分離されたラクトコッカス属細菌を含む抗腫瘍剤
本発明のさらに他の実施態様において、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍からラクトコッカス属の細菌を含む。腫瘍から分離されたラクトコッカス属の細菌は、上記1.において述べたとおり、優れた抗腫瘍活性を発揮することができる。また、当該ラクトコッカス属の細菌は、動物に投与された場合、特には非経口投与された場合に腫瘍に集まるので、腫瘍部位に直接投与されなくてもよいが、腫瘍部位へ直接投与されてもよい。また、当該ラクトコッカス属の細菌は、当該抗腫瘍活性に基づく腫瘍の処置のために投与されてよい。
本発明のさらに他の実施態様において、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍からラクトコッカス属の細菌を含む。腫瘍から分離されたラクトコッカス属の細菌は、上記1.において述べたとおり、優れた抗腫瘍活性を発揮することができる。また、当該ラクトコッカス属の細菌は、動物に投与された場合、特には非経口投与された場合に腫瘍に集まるので、腫瘍部位に直接投与されなくてもよいが、腫瘍部位へ直接投与されてもよい。また、当該ラクトコッカス属の細菌は、当該抗腫瘍活性に基づく腫瘍の処置のために投与されてよい。
好ましい実施態様において、当該ラクトコッカス属の細菌は、腫瘍から単離された細菌であってよい。すなわち、前記抗腫瘍剤は、細菌として、単離されたプロテウス属の細菌だけを含んでよい。
(細菌の種類)
前記ラクトコッカス属細菌は、例えば後述の配列ID No.3の塩基配列との配列相同性が95%以上、好ましくは96%硫黄、より好ましくは97%以上、さらにより好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上である16S ribosomal RNA遺伝子を有するラクトコッカス属細菌であってよい。
前記ラクトコッカス属細菌は、球形または卵形の細胞のような形を有してよい。前記ラクトコッカス属細菌は、個々に、対で、または鎖で成長することができる。また、前記ラクトコッカス属細菌は、芽胞を形成せず、運動性を持たないものであってよい。
このような配列相同性を有するラクトコッカス属細菌として、例えばLactococcus formosensis、Lactococcus garvieae、及びLactococcus garvieae subsp. Garvieaeを挙げることができる。
前記ラクトコッカス属細菌は、後述の配列ID No.3の塩基配列との相同性が100%であるラクトコッカス属細菌であってよく、例えば配列同一性が100%であるラクトコッカス属細菌であってもよい。当該ラクトコッカス属細菌は、例えば、受託番号:NITE BP-03694で寄託された細菌であってよい。当該細菌は、寄託日を令和4年(2022年)8月2日として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NPMD、〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に国際寄託された。
前記ラクトコッカス属細菌は、例えば後述の配列ID No.3の塩基配列との配列相同性が95%以上、好ましくは96%硫黄、より好ましくは97%以上、さらにより好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上である16S ribosomal RNA遺伝子を有するラクトコッカス属細菌であってよい。
前記ラクトコッカス属細菌は、球形または卵形の細胞のような形を有してよい。前記ラクトコッカス属細菌は、個々に、対で、または鎖で成長することができる。また、前記ラクトコッカス属細菌は、芽胞を形成せず、運動性を持たないものであってよい。
このような配列相同性を有するラクトコッカス属細菌として、例えばLactococcus formosensis、Lactococcus garvieae、及びLactococcus garvieae subsp. Garvieaeを挙げることができる。
前記ラクトコッカス属細菌は、後述の配列ID No.3の塩基配列との相同性が100%であるラクトコッカス属細菌であってよく、例えば配列同一性が100%であるラクトコッカス属細菌であってもよい。当該ラクトコッカス属細菌は、例えば、受託番号:NITE BP-03694で寄託された細菌であってよい。当該細菌は、寄託日を令和4年(2022年)8月2日として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NPMD、〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に国際寄託された。
(細菌の抗腫瘍活性)
好ましくは、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍から分離された前記ラクトコッカス属細菌は、以下で説明するとおりの抗腫瘍活性を有するものであってよい。
好ましくは、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍から分離された前記ラクトコッカス属細菌は、以下で説明するとおりの抗腫瘍活性を有するものであってよい。
例えば、前記抗腫瘍剤に含まれる前記ラクトコッカス属細菌が、2×108CFUの量で、後述の3.2に記載されたとおりに用意された結腸がんモデルマウス尾部静脈から単回投与された場合において、当該モデルマウスに形成された固形がんのサイズ(約100mm3)を維持又は減少させる特性を有する細菌であってよく、特には当該単回投与後5日以内に当該固形がんのサイズを、例えば50mm3以下、40mm3以下、30mm3以下、20mm3以下、又は10mm3以下へと減少させる特性を有する細菌であってよい。
本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記ラクトコッカス属細菌は、このような抗腫瘍活性を有するものであってよい。当該固形がんのサイズの縮小の程度を特定するための各種条件(例えば投与される細菌が懸濁される培地やその調製方法など)は、後述の3.2において記載されたとおりである。
本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記ラクトコッカス属細菌は、このような抗腫瘍活性を有するものであってよい。当該固形がんのサイズの縮小の程度を特定するための各種条件(例えば投与される細菌が懸濁される培地やその調製方法など)は、後述の3.2において記載されたとおりである。
(免疫賦活化特性)
前記腫瘍から分離されたラクトコッカス属細菌は、免疫賦活化特性を有する細菌であってよい。前記抗腫瘍剤は、前記免疫賦活化特性によって腫瘍を処置するものであってよい。当該免疫賦活化特性は、上記で紅色非硫黄細菌又はプロテウス属細菌に関して説明した特性であってよく、これらの説明が前記ラクトコッカス属細菌についても当てはまる。
なお、前記腫瘍から分離されたラクトコッカス属細菌は、免疫賦活化剤の有効成分として用いられてもよい。すなわち、本発明は、前記腫瘍から分離されたラクトコッカス属細菌を含む免疫賦活化剤も提供する。前記免疫賦活化剤は、免疫賦活化用組成物と呼ばれてもよい。本明細書内において記載されている前記抗腫瘍剤に関する構成が、前記免疫賦活化剤の構成として採用されてよい。
前記腫瘍から分離されたラクトコッカス属細菌は、免疫賦活化特性を有する細菌であってよい。前記抗腫瘍剤は、前記免疫賦活化特性によって腫瘍を処置するものであってよい。当該免疫賦活化特性は、上記で紅色非硫黄細菌又はプロテウス属細菌に関して説明した特性であってよく、これらの説明が前記ラクトコッカス属細菌についても当てはまる。
なお、前記腫瘍から分離されたラクトコッカス属細菌は、免疫賦活化剤の有効成分として用いられてもよい。すなわち、本発明は、前記腫瘍から分離されたラクトコッカス属細菌を含む免疫賦活化剤も提供する。前記免疫賦活化剤は、免疫賦活化用組成物と呼ばれてもよい。本明細書内において記載されている前記抗腫瘍剤に関する構成が、前記免疫賦活化剤の構成として採用されてよい。
2.1.4 腫瘍から分離されたエンテロコッカス属細菌を含む抗腫瘍剤
本発明のさらに他の実施態様において、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍からエンテロコッカス属の細菌を含む。腫瘍から分離されたエンテロコッカス属の細菌は、上記1.において述べたとおり、優れた抗腫瘍活性を発揮することができる。また、当該エンテロコッカス属の細菌は、動物に投与された場合、特には非経口投与された場合に腫瘍に集まるので、腫瘍部位に直接投与されなくてもよいが、腫瘍部位へ直接投与されてもよい。また、当該エンテロコッカス属の細菌は、当該抗腫瘍活性に基づく腫瘍の処置のために投与されてよい。
本発明のさらに他の実施態様において、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍からエンテロコッカス属の細菌を含む。腫瘍から分離されたエンテロコッカス属の細菌は、上記1.において述べたとおり、優れた抗腫瘍活性を発揮することができる。また、当該エンテロコッカス属の細菌は、動物に投与された場合、特には非経口投与された場合に腫瘍に集まるので、腫瘍部位に直接投与されなくてもよいが、腫瘍部位へ直接投与されてもよい。また、当該エンテロコッカス属の細菌は、当該抗腫瘍活性に基づく腫瘍の処置のために投与されてよい。
好ましい実施態様において、当該エンテロコッカス属の細菌は、腫瘍から単離された細菌であってよい。すなわち、前記抗腫瘍剤は、細菌として、単離されたエンテロコッカス属の細菌だけを含んでよい。
(細菌の種類)
前記エンテロコッカス属細菌は、例えばEnterococcus faecalis、Enterococcus faecium、Enterococcus alcedinis、Enterococcus bulliens、Enterococcus caccae、Enterococcus devriesei、Enterococcus eurekensis、Enterococcus rivorum、Enterococcus saccharolyticus、及びEnterococcus termitisのうちのいずれか1つ、2つ、又は3つであってよく、好ましくはEnterococcus faecalisであってよい。腫瘍から分離された(特には単離された)Enterococcus faecalisは、特に優れた抗腫瘍活性を発揮する。当該Enterococcus faecalisは、例えば、受託番号:NITE BP-03690で寄託された細菌であってよい。当該細菌は、寄託日を令和4年(2022年)7月19日として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NPMD、〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に国際寄託された。
前記エンテロコッカス属細菌は、例えばEnterococcus faecalis、Enterococcus faecium、Enterococcus alcedinis、Enterococcus bulliens、Enterococcus caccae、Enterococcus devriesei、Enterococcus eurekensis、Enterococcus rivorum、Enterococcus saccharolyticus、及びEnterococcus termitisのうちのいずれか1つ、2つ、又は3つであってよく、好ましくはEnterococcus faecalisであってよい。腫瘍から分離された(特には単離された)Enterococcus faecalisは、特に優れた抗腫瘍活性を発揮する。当該Enterococcus faecalisは、例えば、受託番号:NITE BP-03690で寄託された細菌であってよい。当該細菌は、寄託日を令和4年(2022年)7月19日として、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NPMD、〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に国際寄託された。
(細菌の抗腫瘍活性)
好ましくは、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍から分離された前記エンテロコッカス属細菌は、以下で説明するとおりの抗腫瘍活性を有するものであってよい。
好ましくは、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍から分離された前記エンテロコッカス属細菌は、以下で説明するとおりの抗腫瘍活性を有するものであってよい。
例えば、前記抗腫瘍剤に含まれる前記エンテロコッカス属細菌が、2×108CFUの量で、後述の3.2に記載されたとおりに用意された結腸がんモデルマウス尾部静脈から単回投与された場合において、当該モデルマウスに形成された固形がんのサイズ(約100mm3)を維持又は減少させる特性を有する細菌であってよく、特には当該単回投与後5日以内に当該固形がんのサイズを、例えば50mm3以下、40mm3以下、30mm3以下、20mm3以下、又は10mm3以下へと減少させる特性を有する細菌であってよい。
本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記エンテロコッカス属細菌は、このような抗腫瘍活性を有するものであってよい。当該固形がんのサイズの縮小の程度を特定するための各種条件(例えば投与される細菌が懸濁される培地やその調製方法など)は、後述の3.2において記載されたとおりである。
本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記エンテロコッカス属細菌は、このような抗腫瘍活性を有するものであってよい。当該固形がんのサイズの縮小の程度を特定するための各種条件(例えば投与される細菌が懸濁される培地やその調製方法など)は、後述の3.2において記載されたとおりである。
(免疫賦活化特性)
前記腫瘍から分離されたエンテロコッカス属細菌は、免疫賦活化特性を有する細菌であってよい。前記抗腫瘍剤は、前記免疫賦活化特性によって腫瘍を処置するものであってよい。当該免疫賦活化特性は、上記で紅色非硫黄細菌又はプロテウス属細菌に関して説明した特性であってよく、これらの説明が前記エンテロコッカス属細菌についても当てはまる。
なお、前記腫瘍から分離されたエンテロコッカス属細菌は、免疫賦活化剤の有効成分として用いられてもよい。すなわち、本発明は、前記腫瘍から分離されたエンテロコッカス属細菌を含む免疫賦活化剤も提供する。前記免疫賦活化剤は、免疫賦活化用組成物と呼ばれてもよい。本明細書内において記載されている前記抗腫瘍剤に関する構成が、前記免疫賦活化剤の構成として採用されてよい。
前記腫瘍から分離されたエンテロコッカス属細菌は、免疫賦活化特性を有する細菌であってよい。前記抗腫瘍剤は、前記免疫賦活化特性によって腫瘍を処置するものであってよい。当該免疫賦活化特性は、上記で紅色非硫黄細菌又はプロテウス属細菌に関して説明した特性であってよく、これらの説明が前記エンテロコッカス属細菌についても当てはまる。
なお、前記腫瘍から分離されたエンテロコッカス属細菌は、免疫賦活化剤の有効成分として用いられてもよい。すなわち、本発明は、前記腫瘍から分離されたエンテロコッカス属細菌を含む免疫賦活化剤も提供する。前記免疫賦活化剤は、免疫賦活化用組成物と呼ばれてもよい。本明細書内において記載されている前記抗腫瘍剤に関する構成が、前記免疫賦活化剤の構成として採用されてよい。
2.1.5 腫瘍から分離されたアシネトバクター属細菌を含む抗腫瘍剤
本発明のさらに他の実施態様において、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍からアシネトバクター属の細菌を含む。腫瘍から分離されたアシネトバクター属の細菌は、上記1.において述べたとおり、優れた抗腫瘍活性を発揮することができる。また、当該アシネトバクター属の細菌は、動物に投与された場合、特には非経口投与された場合に腫瘍に集まるので、腫瘍部位に直接投与されなくてもよいが、腫瘍部位へ直接投与されてもよい。また、当該アシネトバクター属の細菌は、当該抗腫瘍活性に基づく腫瘍の処置のために投与されてよい。
本発明のさらに他の実施態様において、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍からアシネトバクター属の細菌を含む。腫瘍から分離されたアシネトバクター属の細菌は、上記1.において述べたとおり、優れた抗腫瘍活性を発揮することができる。また、当該アシネトバクター属の細菌は、動物に投与された場合、特には非経口投与された場合に腫瘍に集まるので、腫瘍部位に直接投与されなくてもよいが、腫瘍部位へ直接投与されてもよい。また、当該アシネトバクター属の細菌は、当該抗腫瘍活性に基づく腫瘍の処置のために投与されてよい。
好ましい実施態様において、当該アシネトバクター属の細菌は、腫瘍から単離された細菌であってよい。すなわち、前記抗腫瘍剤は、細菌として、単離されたアシネトバクター属の細菌だけを含んでよい。
(細菌の種類)
前記アシネトバクター属細菌は、例えばAcinetobacter radioresistens、Acinetobacter albensis、及びAcinetobacter baumanniiのうちのいずれか1つ、2つ、又は3つであってよく、好ましくはAcinetobacter radioresistensであってよい。腫瘍から分離された(特には単離された)Acinetobacter radioresistensは、特に優れた抗腫瘍活性を発揮する。
前記アシネトバクター属細菌は、例えばAcinetobacter radioresistens、Acinetobacter albensis、及びAcinetobacter baumanniiのうちのいずれか1つ、2つ、又は3つであってよく、好ましくはAcinetobacter radioresistensであってよい。腫瘍から分離された(特には単離された)Acinetobacter radioresistensは、特に優れた抗腫瘍活性を発揮する。
(細菌の抗腫瘍活性)
好ましくは、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍から分離された前記アシネトバクター属細菌は、以下で説明するとおりの抗腫瘍活性を有するものであってよい。
好ましくは、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍から分離された前記アシネトバクター属細菌は、以下で説明するとおりの抗腫瘍活性を有するものであってよい。
例えば、前記抗腫瘍剤に含まれる前記アシネトバクター属細菌が、2×106CFU/headの量で、後述の3.3に記載されたとおりに用意された結腸がんモデルマウス尾部静脈から単回投与された場合において、当該モデルマウスに形成された固形がんのサイズ(約100mm3)の増加を抑制する特性を有する細菌であってよく、又は、当該サイズを維持又は減少させる特性を有する細菌であってよい。
本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記アシネトバクター属細菌は、このような抗腫瘍活性を有するものであってよい。当該固形がんのサイズの縮小の程度を特定するための各種条件(例えば投与される細菌が懸濁される培地やその調製方法など)は、後述の3.3において記載されたとおりである。
本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記アシネトバクター属細菌は、このような抗腫瘍活性を有するものであってよい。当該固形がんのサイズの縮小の程度を特定するための各種条件(例えば投与される細菌が懸濁される培地やその調製方法など)は、後述の3.3において記載されたとおりである。
(免疫賦活化特性)
前記腫瘍から分離されたアシネトバクター属細菌は、免疫賦活化特性を有する細菌であってよい。前記抗腫瘍剤は、前記免疫賦活化特性によって腫瘍を処置するものであってよい。当該免疫賦活化特性は、上記で紅色非硫黄細菌又はプロテウス属細菌に関して説明した特性であってよく、これらの説明が前記エンテロコッカス属細菌についても当てはまる。
なお、前記腫瘍から分離されたアシネトバクター属細菌は、免疫賦活化剤の有効成分として用いられてもよい。すなわち、本発明は、前記腫瘍から分離されたアシネトバクター属細菌を含む免疫賦活化剤も提供する。前記免疫賦活化剤は、免疫賦活化用組成物と呼ばれてもよい。本明細書内において記載されている前記抗腫瘍剤に関する構成が、前記免疫賦活化剤の構成として採用されてよい。
前記腫瘍から分離されたアシネトバクター属細菌は、免疫賦活化特性を有する細菌であってよい。前記抗腫瘍剤は、前記免疫賦活化特性によって腫瘍を処置するものであってよい。当該免疫賦活化特性は、上記で紅色非硫黄細菌又はプロテウス属細菌に関して説明した特性であってよく、これらの説明が前記エンテロコッカス属細菌についても当てはまる。
なお、前記腫瘍から分離されたアシネトバクター属細菌は、免疫賦活化剤の有効成分として用いられてもよい。すなわち、本発明は、前記腫瘍から分離されたアシネトバクター属細菌を含む免疫賦活化剤も提供する。前記免疫賦活化剤は、免疫賦活化用組成物と呼ばれてもよい。本明細書内において記載されている前記抗腫瘍剤に関する構成が、前記免疫賦活化剤の構成として採用されてよい。
2.1.6 腫瘍から分離されたバチルス属細菌を含む抗腫瘍剤
本発明のさらに他の実施態様において、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍からバチルス属の細菌を含む。腫瘍から分離されたバチルス属の細菌は、上記1.において述べたとおり、優れた抗腫瘍活性を発揮することができる。また、当該バチルス属の細菌は、動物に投与された場合、特には非経口投与された場合に腫瘍に集まるので、腫瘍部位に直接投与されなくてもよいが、腫瘍部位へ直接投与されてもよい。また、当該バチルス属の細菌は、当該抗腫瘍活性に基づく腫瘍の処置のために投与されてよい。
本発明のさらに他の実施態様において、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍からバチルス属の細菌を含む。腫瘍から分離されたバチルス属の細菌は、上記1.において述べたとおり、優れた抗腫瘍活性を発揮することができる。また、当該バチルス属の細菌は、動物に投与された場合、特には非経口投与された場合に腫瘍に集まるので、腫瘍部位に直接投与されなくてもよいが、腫瘍部位へ直接投与されてもよい。また、当該バチルス属の細菌は、当該抗腫瘍活性に基づく腫瘍の処置のために投与されてよい。
好ましい実施態様において、当該バチルス属の細菌は、腫瘍から単離された細菌であってよい。すなわち、前記抗腫瘍剤は、細菌として、単離されたバチルス属の細菌だけを含んでよい。
(細菌の種類)
前記バチルス属細菌は、例えばBacillus thuringiensis、Bacillus agri、及びBacillus badiusのうちのいずれか1つ、2つ、又は3つであってよく、好ましくはBacillus thuringiensisであってよい。
前記バチルス属細菌は、例えばBacillus thuringiensis、Bacillus agri、及びBacillus badiusのうちのいずれか1つ、2つ、又は3つであってよく、好ましくはBacillus thuringiensisであってよい。
(細菌の抗腫瘍活性)
好ましくは、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍から分離された前記バチルス属細菌は、以下で説明するとおりの抗腫瘍活性を有するものであってよい。
好ましくは、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍から分離された前記バチルス属細菌は、以下で説明するとおりの抗腫瘍活性を有するものであってよい。
例えば、前記抗腫瘍剤に含まれる前記バチルス属細菌が、2×108 CFU/headの量で、後述の3.3に記載されたとおりに用意された結腸がんモデルマウス尾部静脈から単回投与された場合において、当該モデルマウスに形成された固形がんのサイズ(約100mm3)の増加を抑制する特性を有する細菌であってよく、又は、当維サイズを維持又は減少させる特性を有する細菌であってよい。
本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記バチルス属細菌は、このような抗腫瘍活性を有するものであってよい。当該固形がんのサイズの縮小の程度を特定するための各種条件(例えば投与される細菌が懸濁される培地やその調製方法など)は、後述の3.3において記載されたとおりである。
本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記バチルス属細菌は、このような抗腫瘍活性を有するものであってよい。当該固形がんのサイズの縮小の程度を特定するための各種条件(例えば投与される細菌が懸濁される培地やその調製方法など)は、後述の3.3において記載されたとおりである。
(免疫賦活化特性)
前記腫瘍から分離されたバチルス属細菌は、免疫賦活化特性を有する細菌であってよい。前記抗腫瘍剤は、前記免疫賦活化特性によって腫瘍を処置するものであってよい。当該免疫賦活化特性は、上記で紅色非硫黄細菌又はプロテウス属細菌に関して説明した特性であってよく、これらの説明が前記バチルス属細菌についても当てはまる。
なお、前記腫瘍から分離されたバチルス属細菌は、免疫賦活化剤の有効成分として用いられてもよい。すなわち、本発明は、前記腫瘍から分離されたバチルス属細菌を含む免疫賦活化剤も提供する。前記免疫賦活化剤は、免疫賦活化用組成物と呼ばれてもよい。本明細書内において記載されている前記抗腫瘍剤に関する構成が、前記免疫賦活化剤の構成として採用されてよい。
前記腫瘍から分離されたバチルス属細菌は、免疫賦活化特性を有する細菌であってよい。前記抗腫瘍剤は、前記免疫賦活化特性によって腫瘍を処置するものであってよい。当該免疫賦活化特性は、上記で紅色非硫黄細菌又はプロテウス属細菌に関して説明した特性であってよく、これらの説明が前記バチルス属細菌についても当てはまる。
なお、前記腫瘍から分離されたバチルス属細菌は、免疫賦活化剤の有効成分として用いられてもよい。すなわち、本発明は、前記腫瘍から分離されたバチルス属細菌を含む免疫賦活化剤も提供する。前記免疫賦活化剤は、免疫賦活化用組成物と呼ばれてもよい。本明細書内において記載されている前記抗腫瘍剤に関する構成が、前記免疫賦活化剤の構成として採用されてよい。
2.1.7 腫瘍から分離されたキューティバクテリウム属細菌を含む抗腫瘍剤
本発明のさらに他の実施態様において、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍からキューティバクテリウム属の細菌を含む。腫瘍から分離されたキューティバクテリウム属の細菌は、上記1.において述べたとおり、優れた抗腫瘍活性を発揮することができる。また、当該キューティバクテリウム属の細菌は、動物に投与された場合、特には非経口投与された場合に腫瘍に集まるので、腫瘍部位に直接投与されなくてもよいが、腫瘍部位へ直接投与されてもよい。また、当該キューティバクテリウム属の細菌は、当該抗腫瘍活性に基づく腫瘍の処置のために投与されてよい。
本発明のさらに他の実施態様において、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍からキューティバクテリウム属の細菌を含む。腫瘍から分離されたキューティバクテリウム属の細菌は、上記1.において述べたとおり、優れた抗腫瘍活性を発揮することができる。また、当該キューティバクテリウム属の細菌は、動物に投与された場合、特には非経口投与された場合に腫瘍に集まるので、腫瘍部位に直接投与されなくてもよいが、腫瘍部位へ直接投与されてもよい。また、当該キューティバクテリウム属の細菌は、当該抗腫瘍活性に基づく腫瘍の処置のために投与されてよい。
好ましい実施態様において、当該キューティバクテリウム属の細菌は、腫瘍から単離された細菌であってよい。すなわち、前記抗腫瘍剤は、細菌として、単離されたキューティバクテリウム属の細菌だけを含んでよい。
(細菌の種類)
前記キューティバクテリウム属細菌は、例えばCutibacterium acnes、Cutibacterium avidum、及びCutibacterium granulosumのうちのいずれか1つ、2つ、又は3つであってよく、好ましくはCutibacterium acnesであってよい。腫瘍から分離された(特には単離された)Cutibacterium acnesは、特に優れた抗腫瘍活性を発揮する。
前記キューティバクテリウム属細菌は、例えばCutibacterium acnes、Cutibacterium avidum、及びCutibacterium granulosumのうちのいずれか1つ、2つ、又は3つであってよく、好ましくはCutibacterium acnesであってよい。腫瘍から分離された(特には単離された)Cutibacterium acnesは、特に優れた抗腫瘍活性を発揮する。
(細菌の抗腫瘍活性)
好ましくは、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍から分離された前記キューティバクテリウム属細菌は、以下で説明するとおりの抗腫瘍活性を有するものであってよい。
好ましくは、本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記腫瘍から分離された前記キューティバクテリウム属細菌は、以下で説明するとおりの抗腫瘍活性を有するものであってよい。
例えば、前記抗腫瘍剤に含まれる前記キューティバクテリウム属細菌が、2×108CFU/headの量で、後述の3.3に記載されたとおりに用意された結腸がんモデルマウス尾部静脈から単回投与された場合において、当該モデルマウスに形成された固形がんのサイズ(約100mm3)の増加を抑制する特性を有する細菌であってよく、又は、当該サイズを維持又は減少させる特性を有する細菌であってよい。
本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記キューティバクテリウム属細菌は、このような抗腫瘍活性を有するものであってよい。当該固形がんのサイズの縮小の程度を特定するための各種条件(例えば投与される細菌が懸濁される培地やその調製方法など)は、後述の3.3において記載されたとおりである。
本発明の抗腫瘍剤に含まれる前記キューティバクテリウム属細菌は、このような抗腫瘍活性を有するものであってよい。当該固形がんのサイズの縮小の程度を特定するための各種条件(例えば投与される細菌が懸濁される培地やその調製方法など)は、後述の3.3において記載されたとおりである。
(免疫賦活化特性)
前記腫瘍から分離されたキューティバクテリウム属細菌は、免疫賦活化特性を有する細菌であってよい。前記抗腫瘍剤は、前記免疫賦活化特性によって腫瘍を処置するものであってよい。当該免疫賦活化特性は、上記で紅色非硫黄細菌又はプロテウス属細菌に関して説明した特性であってよく、これらの説明が前記キューティバクテリウム属細菌についても当てはまる。
なお、前記腫瘍から分離されたキューティバクテリウム属細菌は、免疫賦活化剤の有効成分として用いられてもよい。すなわち、本発明は、前記腫瘍から分離されたキューティバクテリウム属細菌を含む免疫賦活化剤も提供する。前記免疫賦活化剤は、免疫賦活化用組成物と呼ばれてもよい。本明細書内において記載されている前記抗腫瘍剤に関する構成が、前記免疫賦活化剤の構成として採用されてよい。
前記腫瘍から分離されたキューティバクテリウム属細菌は、免疫賦活化特性を有する細菌であってよい。前記抗腫瘍剤は、前記免疫賦活化特性によって腫瘍を処置するものであってよい。当該免疫賦活化特性は、上記で紅色非硫黄細菌又はプロテウス属細菌に関して説明した特性であってよく、これらの説明が前記キューティバクテリウム属細菌についても当てはまる。
なお、前記腫瘍から分離されたキューティバクテリウム属細菌は、免疫賦活化剤の有効成分として用いられてもよい。すなわち、本発明は、前記腫瘍から分離されたキューティバクテリウム属細菌を含む免疫賦活化剤も提供する。前記免疫賦活化剤は、免疫賦活化用組成物と呼ばれてもよい。本明細書内において記載されている前記抗腫瘍剤に関する構成が、前記免疫賦活化剤の構成として採用されてよい。
2.1.8 他の細菌の例
本発明のさらに他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌は、例えば腫瘍内に存在する他の細菌であってよく、特には腫瘍常在細菌であってよい。そのような細菌の例として、エンテロバクター目(Enterobacteriales)に属する細菌、シュードモナス目(Pseudomonadales)に属する細菌、バークホルデリア目(Burkholderiales)に属する細菌、 ロドバクター目(Rhodobacterales)に属する細菌、エアロモナス目(Aeromonadales)に属する細菌、バシラス目(Bacillales)に属する細菌、クロストリジウム目(Clostridiales)に属する細菌、ラクトバシラス目(Lactobacillales)に属する細菌、アクチノマイセス目(Actinomycetales)に属する細菌、ビフィドバクテリウム目(Bifidobacteriales)に属する細菌、バクテロイデス目(Bacteroidales)に属する細菌、フラボバクテリウム目(Flavobacteriales)に属する細菌、フソバクテリウム目(Fusobacteriales)に属する細菌、ストレプトフィタ目(Streptophyta)に属する細菌、コリネバクテリウム目(Corynebacteriales)に属する細菌、ロドスピリルム目(Rhodospirillales)に属する細菌、及びナイセリア目(Neisseriales)に属する細菌を挙げることができる。本発明において用いられる細菌は、これら列挙された目に属する細菌のいずれか1種又は2種以上の組合せであってよい。
本発明のさらに他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌は、例えば腫瘍内に存在する他の細菌であってよく、特には腫瘍常在細菌であってよい。そのような細菌の例として、エンテロバクター目(Enterobacteriales)に属する細菌、シュードモナス目(Pseudomonadales)に属する細菌、バークホルデリア目(Burkholderiales)に属する細菌、 ロドバクター目(Rhodobacterales)に属する細菌、エアロモナス目(Aeromonadales)に属する細菌、バシラス目(Bacillales)に属する細菌、クロストリジウム目(Clostridiales)に属する細菌、ラクトバシラス目(Lactobacillales)に属する細菌、アクチノマイセス目(Actinomycetales)に属する細菌、ビフィドバクテリウム目(Bifidobacteriales)に属する細菌、バクテロイデス目(Bacteroidales)に属する細菌、フラボバクテリウム目(Flavobacteriales)に属する細菌、フソバクテリウム目(Fusobacteriales)に属する細菌、ストレプトフィタ目(Streptophyta)に属する細菌、コリネバクテリウム目(Corynebacteriales)に属する細菌、ロドスピリルム目(Rhodospirillales)に属する細菌、及びナイセリア目(Neisseriales)に属する細菌を挙げることができる。本発明において用いられる細菌は、これら列挙された目に属する細菌のいずれか1種又は2種以上の組合せであってよい。
上記で挙げた各目の細菌のより具体的な例として、以下を挙げることができる。
エンテロバクター目(Enterobacteriales)の細菌:例えばエンテロバクター科の細菌、特にはプロテウス属の細菌、エンテロバクター属の細菌、クレブシエラ属の細菌、及びシトロバクター属の細菌など、より特には上記2.1.2において挙げたプロテウス属細菌の種並びにEnterobacter asburiae、Klebsiella pneumoniae、Citrobacter freundii、及びEnterobacter cloacaeなど;
シュードモナス目(Pseudomonadales)の細菌:例えばシュードモナス科の細菌及びモラクセラ科の細菌、特にはシュードモナス属の細菌及びアシネトバクター属の細菌など、より特にはPseudomonas argentinensis、及びAcinetobacter US_424など;
ロドバクター目(Rhodobacterales)の細菌:例えばロドバクター科の細菌、特にはパラコッカス属の細菌など、より特にはParacoccus marcusiiなど;
スフィンゴモナス目(Sphingomonadales)の細菌:例えばスフィンゴモナス科の細菌、特にはスフィンゴモナス属の細菌など、より特にはSphingomonas yunnanensis 、Sphingomonas US_602、及びSphingomonas yanoikuyaeなど;
バシラス目(Bacillales)の細菌:例えばスタフィロコッカス科の細菌、特にはスタフィロコッカス属の細菌など、より特にはStaphylococcus aureus、及びStaphylococcus cohniiなど;
ラクトバシラス目(Lactobacillales)の細菌:例えばストレプトコッカス科の細菌及びラクトバシラス科の細菌、特にはストレプトコッカス属の細菌及びラクトバシラス属の細菌など、より特にはStreptococcus infantis、及びLactobacillus inersなど;
アクチノマイセス目(Actinomycetales)の細菌:例えばアクチノマイセス科の細菌、特にはアクチノマイセス属の細菌など、より特にはActinomyces massiliensisなど;
フソバクテリウム目(Fusobacteriales)の細菌:例えばフソバクテリウム科の細菌、特にはフソバクテリウム属の細菌など、より特にはFusobacterium nucleatumなど;
コリネバクテリウム目(Corynebacteriales)の細菌:例えばコリネバクテリウム科の細菌、特にはコリネバクテリウム属の細菌など、より特にはCorynebacterium US_1715など;
ロドスピリルム目(Rhodospirillales)の細菌:例えばアセトバクター科の細菌、特にはロゼオモナス属の細菌など、より特にはRoseomonas mucosaなど;
ナイセリア目(Neisseriales)の細菌:例えばナイセリア科の細菌、特にはナイセリア属の細菌など、より特にはNeisseria macacaeなど。
本発明において、以上で列挙された科又は属に属する細菌のうちのいずれか1種の細菌又は2種以上の組合せが腫瘍から分離されてもよい。すなわち、本発明において、腫瘍から分離された細菌として、当該1種の細菌又は2種以上の組合せが本発明において用いられてもよい。
エンテロバクター目(Enterobacteriales)の細菌:例えばエンテロバクター科の細菌、特にはプロテウス属の細菌、エンテロバクター属の細菌、クレブシエラ属の細菌、及びシトロバクター属の細菌など、より特には上記2.1.2において挙げたプロテウス属細菌の種並びにEnterobacter asburiae、Klebsiella pneumoniae、Citrobacter freundii、及びEnterobacter cloacaeなど;
シュードモナス目(Pseudomonadales)の細菌:例えばシュードモナス科の細菌及びモラクセラ科の細菌、特にはシュードモナス属の細菌及びアシネトバクター属の細菌など、より特にはPseudomonas argentinensis、及びAcinetobacter US_424など;
ロドバクター目(Rhodobacterales)の細菌:例えばロドバクター科の細菌、特にはパラコッカス属の細菌など、より特にはParacoccus marcusiiなど;
スフィンゴモナス目(Sphingomonadales)の細菌:例えばスフィンゴモナス科の細菌、特にはスフィンゴモナス属の細菌など、より特にはSphingomonas yunnanensis 、Sphingomonas US_602、及びSphingomonas yanoikuyaeなど;
バシラス目(Bacillales)の細菌:例えばスタフィロコッカス科の細菌、特にはスタフィロコッカス属の細菌など、より特にはStaphylococcus aureus、及びStaphylococcus cohniiなど;
ラクトバシラス目(Lactobacillales)の細菌:例えばストレプトコッカス科の細菌及びラクトバシラス科の細菌、特にはストレプトコッカス属の細菌及びラクトバシラス属の細菌など、より特にはStreptococcus infantis、及びLactobacillus inersなど;
アクチノマイセス目(Actinomycetales)の細菌:例えばアクチノマイセス科の細菌、特にはアクチノマイセス属の細菌など、より特にはActinomyces massiliensisなど;
フソバクテリウム目(Fusobacteriales)の細菌:例えばフソバクテリウム科の細菌、特にはフソバクテリウム属の細菌など、より特にはFusobacterium nucleatumなど;
コリネバクテリウム目(Corynebacteriales)の細菌:例えばコリネバクテリウム科の細菌、特にはコリネバクテリウム属の細菌など、より特にはCorynebacterium US_1715など;
ロドスピリルム目(Rhodospirillales)の細菌:例えばアセトバクター科の細菌、特にはロゼオモナス属の細菌など、より特にはRoseomonas mucosaなど;
ナイセリア目(Neisseriales)の細菌:例えばナイセリア科の細菌、特にはナイセリア属の細菌など、より特にはNeisseria macacaeなど。
本発明において、以上で列挙された科又は属に属する細菌のうちのいずれか1種の細菌又は2種以上の組合せが腫瘍から分離されてもよい。すなわち、本発明において、腫瘍から分離された細菌として、当該1種の細菌又は2種以上の組合せが本発明において用いられてもよい。
2.1.9 抗腫瘍剤の構成
本発明に従う抗腫瘍剤は、前記腫瘍から分離された細菌を、生存している状態で含んでよい。すなわち、前記腫瘍から分離された細菌は、生存している状態で動物に投与されてよい。これにより、当該細菌が、腫瘍部位へ到達しやすくなると考えられ、また、当該細菌による抗腫瘍活性がより効果的に発揮されると考えられる。腫瘍部位への到達は、後述の診断のためにも有用である。
なお、本発明に従う抗腫瘍剤は、前記腫瘍から分離された細菌を、死んでいる状態で含んでいてもよい。
本発明に従う抗腫瘍剤は、前記腫瘍から分離された細菌を、生存している状態で含んでよい。すなわち、前記腫瘍から分離された細菌は、生存している状態で動物に投与されてよい。これにより、当該細菌が、腫瘍部位へ到達しやすくなると考えられ、また、当該細菌による抗腫瘍活性がより効果的に発揮されると考えられる。腫瘍部位への到達は、後述の診断のためにも有用である。
なお、本発明に従う抗腫瘍剤は、前記腫瘍から分離された細菌を、死んでいる状態で含んでいてもよい。
本発明において、「抗腫瘍剤」は、動物に生じた腫瘍を処置するために用いられる剤、特には薬剤を意味してよい。「腫瘍の処置」は、例えば、腫瘍のサイズを小さくすること、腫瘍の増大を抑制すること、腫瘍細胞を死滅若しくは減少させること、又は腫瘍細胞の増殖を抑制することのいずれか1つ以上を意味してよい。
「抗腫瘍剤」は、腫瘍を有する動物を治療又は予防するために用いられる剤を意味してもよい。当該動物は、例えば哺乳類であり、特にはヒトであるが、非ヒト動物であってもよい。当該非ヒト動物は、例えば農用動物又は愛玩動物であってよく、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、又はウサギなどであってよい。
「抗腫瘍剤」は、腫瘍を有する動物を治療又は予防するために用いられる剤を意味してもよい。当該動物は、例えば哺乳類であり、特にはヒトであるが、非ヒト動物であってもよい。当該非ヒト動物は、例えば農用動物又は愛玩動物であってよく、例えばウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、又はウサギなどであってよい。
前記「剤」は、1種の成分からなる剤であってもよいが、2以上の成分を含む剤であってもよい。これら成分のうちの少なくとも一つが、上記で述べた腫瘍から分離された細菌である。前記剤は、2以上の成分を含んでもよいので、この場合、本発明の抗腫瘍剤は、抗腫瘍用組成物と呼ばれてもよく、さらには抗腫瘍用医薬組成物と呼ばれてもよい。
すなわち、本発明の抗腫瘍剤は、腫瘍から分離された細菌に加え、他の成分を含んでもよい。当該他の成分は、例えば当該抗腫瘍剤の投与方法又は投与部位などの要因に応じて当業者により適宜選択されてよい。
すなわち、本発明の抗腫瘍剤は、腫瘍から分離された細菌に加え、他の成分を含んでもよい。当該他の成分は、例えば当該抗腫瘍剤の投与方法又は投与部位などの要因に応じて当業者により適宜選択されてよい。
本発明の抗腫瘍剤は、特には悪性腫瘍又は良性腫瘍を処置するために用いられてよく、特に好ましくは悪性腫瘍を処置するために用いられる。前記悪性腫瘍は「がん」とも呼ばれる。がんは、固形がん及び血液がんに分類されうる。固形がんはさらに、癌腫及び肉腫に分類されうる。前記抗腫瘍剤は、抗がん剤、又は、がんの処置用組成物若しくはがんの治療用組成物と呼ばれてもよい。
本発明の抗腫瘍剤は、固形がん又は血液がんを処置するために用いられてよく、特には固形がんを処置するために用いられてよく、例えば癌腫を処置するため又は肉腫を処置するために用いられてよい。
本発明の抗腫瘍剤は、種々のがんを処置するために用いられうる。本発明の抗腫瘍剤が有する抗腫瘍活性のメカニズムの一つは、後述のとおり免疫細胞の賦活化であると考えられる。すなわち、当該抗腫瘍剤は、当該賦活化された免疫細胞を介して、抗腫瘍活性を発揮していると考えられる。そのため、本発明の抗腫瘍剤は、特定の1種のがんだけでなく、種々のがんに対して有効であると考えられ、実際に種々のがんに対する有効性が後述の実施例において示されている。
本発明の抗腫瘍剤は、種々のがんを処置するために用いられうる。本発明の抗腫瘍剤が有する抗腫瘍活性のメカニズムの一つは、後述のとおり免疫細胞の賦活化であると考えられる。すなわち、当該抗腫瘍剤は、当該賦活化された免疫細胞を介して、抗腫瘍活性を発揮していると考えられる。そのため、本発明の抗腫瘍剤は、特定の1種のがんだけでなく、種々のがんに対して有効であると考えられ、実際に種々のがんに対する有効性が後述の実施例において示されている。
一実施態様において、本発明の抗腫瘍剤は、癌腫を処置するために用いられるものであってよい。本発明の抗腫瘍剤は、例えば頭頸部がん(例えば咽頭がん、喉頭がん、舌がんなど)、食道がん、胃がん、十二指腸がん、大腸がん(例えば結腸がん、直腸がんなど)、肝がん、胆嚢がん、胆管がん、膵がん、肛門がん、腎がん、膀胱がん、前立腺がん、子宮がん(例えば子宮頸がん、子宮体がん)、及び卵巣癌のうちのいずれか1つ又は2つ以上を処置するために用いられる剤であってよい。
他の実施態様において、本発明の抗腫瘍剤は、肉腫を処置するために用いられるものであってよい。本発明の抗腫瘍剤は、例えば、骨肉腫、軟骨肉腫、横紋筋肉腫、平滑筋肉腫、線維肉腫、脂肪肉腫、及び血管肉腫のうちのいずれか1つを処置するために用いられる剤であってよい。
一実施態様において、本発明の抗腫瘍剤は、液剤として構成されてよい。すなわち、当該液剤は、本発明に従う腫瘍から分離された細菌を含む液剤(特には当該細菌分散液)であってよい。当該液剤のうちの前記細菌以外の液体成分は、例えば医薬分野で用いられている注射液又は点滴液などであってよく、より具体的には等張液、低張液、又は高張液であってよい。例えば、前記液体は、食塩水(生理食塩水)、糖液、又は緩衝液などであってよい。また、当該液体は、リン酸緩衝生理食塩水であってもよい。液剤の剤形は、本発明の抗腫瘍剤を、抗腫瘍活性を維持したまま腫瘍に到達させるために特に適している。
本発明の抗腫瘍剤は、好ましくは非経口的に投与される。例えば、本発明の抗腫瘍剤は、血管内(例えば静脈内若しくは動脈内)に投与されるものであってよく、皮下に投与されるものであってよく、筋肉内に投与されるものであってよく、又は髄腔内に投与されるものであってよい。好ましくは、本発明の抗腫瘍剤は、血管内(例えば静脈内若しくは動脈内)に投与されるものである。
本発明の抗腫瘍剤に含まれる腫瘍から分離された細菌は、上記で述べたとおり腫瘍部位に集まる特性を有するので、血管内に投与されることで、細菌が腫瘍部位に到達しやすくなる。また、血管内投与は侵襲も比較的少ない。
また、細菌が血管内に投与された場合には、多くの場合は、当該細菌は毒性を発揮し、患者に悪影響を及ぼす。しかしながら、上記で述べたとおり本発明の抗腫瘍剤に含まれる腫瘍から分離された細菌は、そのような毒性を発揮しないか、又は、仮に発揮してもその程度は非常に低い。
本発明の抗腫瘍剤に含まれる腫瘍から分離された細菌は、上記で述べたとおり腫瘍部位に集まる特性を有するので、血管内に投与されることで、細菌が腫瘍部位に到達しやすくなる。また、血管内投与は侵襲も比較的少ない。
また、細菌が血管内に投与された場合には、多くの場合は、当該細菌は毒性を発揮し、患者に悪影響を及ぼす。しかしながら、上記で述べたとおり本発明の抗腫瘍剤に含まれる腫瘍から分離された細菌は、そのような毒性を発揮しないか、又は、仮に発揮してもその程度は非常に低い。
また、本発明の抗腫瘍剤は、腫瘍部位又は腫瘍部位付近に、例えば注射器又は他の管などを用いて、直接に投与されてもよい。また、本発明の抗腫瘍剤は、腫瘍の存在する位置によっては、経口投与されてもよい。
本発明の抗腫瘍剤は、前記腫瘍から分離された細菌が、1回の投与当たり、例えば、104CFU/kg体重~1011CFU/kg体重、好ましくは105CFU/kg体重~1011CFU/kg体重、より好ましくは106CFU/kg体重~1011CFU/kg体重となるように投与されてよい。投与される細菌の量が少なすぎる場合は、抗腫瘍効果が低下しうる。また、投与される細菌の量が多すぎる場合は、コストの観点から望ましくない。
本発明の抗腫瘍剤が液剤である場合、前記抗腫瘍剤は、例えば、前記腫瘍から分離された細菌を、例えば105CFU/ml~1012CFU/ml、好ましくは106CFU/ml~1012CFU/ml、より好ましくは107CFU/ml~1012CFU/mlの含有割合で含んでよい。
本発明の抗腫瘍剤は、1回だけ投与されてもよく、又は、2回以上投与されてもよい。本発明の抗腫瘍剤は、単回投与でその効果を発揮することができるが、必要に応じて2回以上投与されてもよい。
本発明の抗腫瘍剤は、1日のうちに1回投与されてよく、又は、1日のうちに2回以上(例えば2回又は3回)投与されてもよい。
本発明の抗腫瘍剤が複数回にわたって投与される場合には、当該抗腫瘍剤は、毎日投与されてよく、又は、1日おきに若しくは2日おきに投与されてもよい。また、当該抗腫瘍剤は、1週間ごとに、2週間ごとに、3週間ごとに、又は4週間ごとに投与されてもよい。
本発明の抗腫瘍剤は、1日のうちに1回投与されてよく、又は、1日のうちに2回以上(例えば2回又は3回)投与されてもよい。
本発明の抗腫瘍剤が複数回にわたって投与される場合には、当該抗腫瘍剤は、毎日投与されてよく、又は、1日おきに若しくは2日おきに投与されてもよい。また、当該抗腫瘍剤は、1週間ごとに、2週間ごとに、3週間ごとに、又は4週間ごとに投与されてもよい。
本発明の抗腫瘍剤には、医薬分野における製剤化において用いられる添加剤が含まれてよく、例えばpH調整剤及び着色剤などの種々の成分が含まれてもよい。また、本発明の効果を損なわない限り、本発明の抗腫瘍剤には、公知の又は将来的に見出される、腫瘍処置のための医薬成分が含まれてよい。本発明の抗腫瘍剤の製剤化は、剤形に応じて適宜公知の方法により実施されてよい。
本発明の抗腫瘍剤は、上記のとおり腫瘍の処置のために用いられるだけでなく、さらに腫瘍の診断のために用いられてもよい。後述のとおり、前記腫瘍から分離された細菌は、投与された場合に腫瘍に集まる特性を有する。そこで、当該特性を利用し、当該細菌が集まっている部位が腫瘍として特定されうる。当該診断については、後段の説明を参照されたい。
2.1.10 抗腫瘍剤の製造方法
前記抗腫瘍剤を製造するために、上記で述べたとおりの細菌が用いられる。当該細菌は、例えば以下のとおりに製造されてよい。
(腫瘍回収工程S11)
前記腫瘍回収工程において、腫瘍を有する動物から当該腫瘍が回収される。当該回収は、例えば生検によって行われてよい。当該腫瘍は、例えば哺乳類の腫瘍細胞から形成された腫瘍であってよく、特にはヒト腫瘍細胞から形成された腫瘍であってよい。前記腫瘍を有する動物は、例えば哺乳類であってよく、特にはげっ歯類であってよいが、霊長類、特にはヒトであってもよい。
前記腫瘍回収工程において、腫瘍を有する動物から当該腫瘍が回収される。当該回収は、例えば生検によって行われてよい。当該腫瘍は、例えば哺乳類の腫瘍細胞から形成された腫瘍であってよく、特にはヒト腫瘍細胞から形成された腫瘍であってよい。前記腫瘍を有する動物は、例えば哺乳類であってよく、特にはげっ歯類であってよいが、霊長類、特にはヒトであってもよい。
前記腫瘍を有する動物は、前記回収の前に、紅色非硫黄細菌が投与されてもよい。投与される紅色非硫黄細菌は、上記2.1.1において挙げた紅色非硫黄細菌のうちのいずれかであってよく、好ましくはロドシュードモナス属細菌若しくはブラストクロリス属細菌であり、より好ましくはロドシュードモナス属細菌であってよい。これら細菌の具体的な種は上記2.1.1において述べたとおりであり、それらのうちのいずれか1つ又は2つ以上の種の細菌が投与されてよい。投与される細菌は、市販入手可能なものであってよい。
上記のとおり紅色非硫黄細菌が投与される場合において、当該投与は、例えば非経口的に投与され、特には静脈投与される。当該投与後、所定の期間後に、例えば1日~10日後、特には2日~5日後に、上記で述べた腫瘍回収が行われる。このような期間が経過することによって、投与された紅色非硫黄細菌が腫瘍に到達すると考えられる。
前記細菌投与は行われなくてもよいが、行われてもよい。前記細菌投与が行われない場合は、元々腫瘍内に存在する細菌が回収されてよい。前記細菌投与が行われる場合は、元々腫瘍内に存在する細菌が回収されてよく、又は、前記細菌投与によって投与されて腫瘍に到達した細菌が回収されてもよい。
(細菌分離工程S12)
前記細菌分離工程において、前記腫瘍回収工程において回収された腫瘍から細菌が分離される。例えば、前記生検によって得られた腫瘍が、所定の液体(例えば緩衝液など)に添加され、そして、ホモジナイズされる。当該ホモジナイズによって、腫瘍細胞及び細菌が懸濁した液体が得られる。当該液体を、例えば所定の速度で振とうすることによって、腫瘍細胞が沈殿し、細菌は上清に存在する。このようにして、細菌が腫瘍細胞から分離されてよいが、分離の手法はこれに限定されない。当技術分野で既知の他の手法によって分離されてもよい。
腫瘍に細菌が存在していること及び当該腫瘍から当該細菌が分離されることが、当該細菌が抗腫瘍活性を獲得することに貢献していると考えられる。
前記細菌分離工程において、前記腫瘍回収工程において回収された腫瘍から細菌が分離される。例えば、前記生検によって得られた腫瘍が、所定の液体(例えば緩衝液など)に添加され、そして、ホモジナイズされる。当該ホモジナイズによって、腫瘍細胞及び細菌が懸濁した液体が得られる。当該液体を、例えば所定の速度で振とうすることによって、腫瘍細胞が沈殿し、細菌は上清に存在する。このようにして、細菌が腫瘍細胞から分離されてよいが、分離の手法はこれに限定されない。当技術分野で既知の他の手法によって分離されてもよい。
腫瘍に細菌が存在していること及び当該腫瘍から当該細菌が分離されることが、当該細菌が抗腫瘍活性を獲得することに貢献していると考えられる。
(細菌培養工程S13)
前記細菌培養工程において、前記細菌分離工程において腫瘍から分離された細菌が培養される。腫瘍から分離された細菌が培養されることも、当該細菌が抗腫瘍活性を獲得することに貢献していると考えられる。
例えば、前記細菌培養工程において、当該上清が、例えばシャーレ中の汎用寒天培地上に加えられ、そして、培養が行われてよい。これにより、当該培地上にコロニーが形成される。当該コロニーが、本発明における腫瘍から分離された細菌として用いられてよい。
前記細菌培養工程において、前記細菌分離工程において腫瘍から分離された細菌が培養される。腫瘍から分離された細菌が培養されることも、当該細菌が抗腫瘍活性を獲得することに貢献していると考えられる。
例えば、前記細菌培養工程において、当該上清が、例えばシャーレ中の汎用寒天培地上に加えられ、そして、培養が行われてよい。これにより、当該培地上にコロニーが形成される。当該コロニーが、本発明における腫瘍から分離された細菌として用いられてよい。
前記汎用寒天培地は、例えばペプトン含有培地であってよく、又は、ペプトン不含培地であってもよい。
前記ペプトン含有培地に含まれるペプトンは、例えばカゼインペプトン、獣肉ペプトン、ゼラチンペプトン、及び大豆ペプトンのうちの1つ又は2つ以上であってよい。前記ペプトン含有培地は、例えばLB培地又はポリペプトン培地であってもよい。前記ペプトン含有培地は、前記ペプトンに加えて、さらに抽出物を含んでもよい。当該抽出物は、例えば酵母エキス若しくは肉エキス(特には牛肉エキス)又はこれらの組合せであってよい。
前記ペプトン不含培地は、例えば抽出物を含む。当該抽出物は、上記のとおり、酵母エキス若しくは肉エキス(特には牛肉エキス)又はこれらの組合せであってよい。前記ペプトン不含培地は例えばATCC543培地であってよい。
前記汎用寒天培地は、分離される細菌に応じて当業者により適宜選択されてよい。
前記ペプトン含有培地に含まれるペプトンは、例えばカゼインペプトン、獣肉ペプトン、ゼラチンペプトン、及び大豆ペプトンのうちの1つ又は2つ以上であってよい。前記ペプトン含有培地は、例えばLB培地又はポリペプトン培地であってもよい。前記ペプトン含有培地は、前記ペプトンに加えて、さらに抽出物を含んでもよい。当該抽出物は、例えば酵母エキス若しくは肉エキス(特には牛肉エキス)又はこれらの組合せであってよい。
前記ペプトン不含培地は、例えば抽出物を含む。当該抽出物は、上記のとおり、酵母エキス若しくは肉エキス(特には牛肉エキス)又はこれらの組合せであってよい。前記ペプトン不含培地は例えばATCC543培地であってよい。
前記汎用寒天培地は、分離される細菌に応じて当業者により適宜選択されてよい。
好ましくは、前記寒天培地上に形成したコロニー(特にはコロニーの細菌)が、さらに液体培地中で培養される。
前記液体培地は、液体汎用培地であってよい。当該液体汎用培地も、上記のように、例えばペプトン含有培地であってよく、又は、ペプトン不含培地であってもよい。これら培地に含まれるペプトン及び抽出物は、上記で説明したとおりであり、その説明が前記液体培地についてもあてはまる。前記液体培地は、分離される細菌に応じて当業者により適宜選択されてよい。
前記液体培地は、液体汎用培地であってよい。当該液体汎用培地も、上記のように、例えばペプトン含有培地であってよく、又は、ペプトン不含培地であってもよい。これら培地に含まれるペプトン及び抽出物は、上記で説明したとおりであり、その説明が前記液体培地についてもあてはまる。前記液体培地は、分離される細菌に応じて当業者により適宜選択されてよい。
(システインが添加されていない培地における培養)
一実施態様において、前記液体培地は、システインが添加されていない液体培地であってよい。前記液体培地は、例えばシステインが添加されておらず且つペプトンを含み且つ抽出物(特には酵母抽出物)を含む液体培地であってよい。当該液体培地は、例えばシステインが添加されていないLB培地又はポリペプトン培地であってもよい。代替的には、前記液体培地は、システインを添加されておらず且つペプトンを含まず且つ抽出物(特には酵母抽出物)を含む液体培地であってよい。このような培地の例として、システインを添加されていないATCC543培地を挙げることができる。
前記液体培地中で培養された細菌を、さらに、汎用寒天培地上で培養してコロニーを形成させてもよい。当該汎用寒天培地は、例えばデオキシコール酸が添加された汎用寒天培地であってよい。前記寒天培地の量(g)に対する前記寒天培地中のデオキシコール酸の含有量(g)の割合(%)は、例えば0.01%~1%であってよく、好ましくは0.03%~0.5%であってよく、より好ましくは0.05%~0.3%であってよい。当該汎用寒天培地は、デオキシコール酸が加えられたこと以外は、本工程の最初で述べた汎用寒天培地と同じ寒天培地(新鮮培地)であってよい。当該培養によって、前記培地上にコロニーが形成される。
形成されたコロニーが、さらに液体培地中で培養されてよい。当該液体培地は、1つ前の液体培地培養において用いられたものと同じ培地(新鮮培地)であってよい。
以上のように、システインを添加されていない培地において培養された細菌が、本発明の抗腫瘍剤の有効成分として用いられてよい。
この実施態様は、例えば抗腫瘍活性を有する紅色非硫黄細菌(特にはロドシュードモナス属細菌)又は抗腫瘍活性を有する紅色非硫黄細菌(特にはロドシュードモナス属細菌)と他の細菌(特にはプロテウス属細菌)との複合細菌を得るために適している。
また、この実施態様は、例えば抗腫瘍活性を有するラクトコッカス属細菌及び抗腫瘍活性を有するエンテロコッカス属細菌を得るためにも適している。
一実施態様において、前記液体培地は、システインが添加されていない液体培地であってよい。前記液体培地は、例えばシステインが添加されておらず且つペプトンを含み且つ抽出物(特には酵母抽出物)を含む液体培地であってよい。当該液体培地は、例えばシステインが添加されていないLB培地又はポリペプトン培地であってもよい。代替的には、前記液体培地は、システインを添加されておらず且つペプトンを含まず且つ抽出物(特には酵母抽出物)を含む液体培地であってよい。このような培地の例として、システインを添加されていないATCC543培地を挙げることができる。
前記液体培地中で培養された細菌を、さらに、汎用寒天培地上で培養してコロニーを形成させてもよい。当該汎用寒天培地は、例えばデオキシコール酸が添加された汎用寒天培地であってよい。前記寒天培地の量(g)に対する前記寒天培地中のデオキシコール酸の含有量(g)の割合(%)は、例えば0.01%~1%であってよく、好ましくは0.03%~0.5%であってよく、より好ましくは0.05%~0.3%であってよい。当該汎用寒天培地は、デオキシコール酸が加えられたこと以外は、本工程の最初で述べた汎用寒天培地と同じ寒天培地(新鮮培地)であってよい。当該培養によって、前記培地上にコロニーが形成される。
形成されたコロニーが、さらに液体培地中で培養されてよい。当該液体培地は、1つ前の液体培地培養において用いられたものと同じ培地(新鮮培地)であってよい。
以上のように、システインを添加されていない培地において培養された細菌が、本発明の抗腫瘍剤の有効成分として用いられてよい。
この実施態様は、例えば抗腫瘍活性を有する紅色非硫黄細菌(特にはロドシュードモナス属細菌)又は抗腫瘍活性を有する紅色非硫黄細菌(特にはロドシュードモナス属細菌)と他の細菌(特にはプロテウス属細菌)との複合細菌を得るために適している。
また、この実施態様は、例えば抗腫瘍活性を有するラクトコッカス属細菌及び抗腫瘍活性を有するエンテロコッカス属細菌を得るためにも適している。
(システインを添加された培地における培養)
他の実施態様において、前記液体培地は、システインを添加された液体培地であってよい。前記液体培地は、例えばシステインが添加されており且つペプトンを含み且つ抽出物(特には酵母抽出物)を含む液体培地であってよい。当該液体培地は、例えばシステインが添加されたLB培地又はポリペプトン培地であってもよい。代替的には、前記液体培地は、システインが添加されており且つペプトンを含まず且つ抽出物(特には酵母抽出物)を含む液体培地であってよい。このような培地の例として、システインを添加されたATCC543培地を挙げることができる。
前記システインを添加された液体培地中のシステイン含有割合は、当該培地の量(g)に対する当該システインの量(g)の割合(%)として表された場合に、例えば0.1%~10%であり、より好ましくは1%~5%であり、さらにより好ましくは2%~4%であってよい。
前記液体培地中で培養された細菌を、さらに、汎用寒天培地上で培養してコロニーを形成させてもよい。当該汎用寒天培地は、例えばデオキシコール酸及びシステインが添加された汎用寒天培地であってよい。前記寒天培地の量(g)に対する前記寒天培地中のデオキシコール酸の含有量(g)の割合(%)は、例えば0.01%~1%であってよく、好ましくは0.03%~0.5%であってよく、より好ましくは0.05%~0.3%であってよい。また、前記寒天培地の量(g)に対する前記寒天培地中のシステインの含有量(g)の割合(%)は、例えば0.1%~10%であり、より好ましくは1%~5%であり、さらにより好ましくは2%~4%であってよい。当該汎用寒天培地は、デオキシコール酸及びシステインが加えられたこと以外は、本工程の最初で述べた汎用寒天培地と同じ寒天培地(新鮮培地)であってよい。当該培養によって、前記培地上にコロニーが形成される。
形成されたコロニーが、さらに液体培地中で培養されてよい。当該液体培地は、1つ前の液体培地培養において用いられたものと同じ培地(新鮮培地)であってよい。
以上のように培養された細菌が、本発明の抗腫瘍剤の有効成分として用いられてよい。
この実施態様は、例えば抗腫瘍活性を有するプロテウス属細菌を得るために適している。
他の実施態様において、前記液体培地は、システインを添加された液体培地であってよい。前記液体培地は、例えばシステインが添加されており且つペプトンを含み且つ抽出物(特には酵母抽出物)を含む液体培地であってよい。当該液体培地は、例えばシステインが添加されたLB培地又はポリペプトン培地であってもよい。代替的には、前記液体培地は、システインが添加されており且つペプトンを含まず且つ抽出物(特には酵母抽出物)を含む液体培地であってよい。このような培地の例として、システインを添加されたATCC543培地を挙げることができる。
前記システインを添加された液体培地中のシステイン含有割合は、当該培地の量(g)に対する当該システインの量(g)の割合(%)として表された場合に、例えば0.1%~10%であり、より好ましくは1%~5%であり、さらにより好ましくは2%~4%であってよい。
前記液体培地中で培養された細菌を、さらに、汎用寒天培地上で培養してコロニーを形成させてもよい。当該汎用寒天培地は、例えばデオキシコール酸及びシステインが添加された汎用寒天培地であってよい。前記寒天培地の量(g)に対する前記寒天培地中のデオキシコール酸の含有量(g)の割合(%)は、例えば0.01%~1%であってよく、好ましくは0.03%~0.5%であってよく、より好ましくは0.05%~0.3%であってよい。また、前記寒天培地の量(g)に対する前記寒天培地中のシステインの含有量(g)の割合(%)は、例えば0.1%~10%であり、より好ましくは1%~5%であり、さらにより好ましくは2%~4%であってよい。当該汎用寒天培地は、デオキシコール酸及びシステインが加えられたこと以外は、本工程の最初で述べた汎用寒天培地と同じ寒天培地(新鮮培地)であってよい。当該培養によって、前記培地上にコロニーが形成される。
形成されたコロニーが、さらに液体培地中で培養されてよい。当該液体培地は、1つ前の液体培地培養において用いられたものと同じ培地(新鮮培地)であってよい。
以上のように培養された細菌が、本発明の抗腫瘍剤の有効成分として用いられてよい。
この実施態様は、例えば抗腫瘍活性を有するプロテウス属細菌を得るために適している。
(製剤工程S14)
前記細菌培養工程において培養された細菌を用いて製剤化が行われて抗腫瘍剤が得られる。当該抗腫瘍剤は、例えば上記で述べた液剤であってよい。当該液剤は、前記細菌を所定の液体に混合することによって製造されてよい。製剤化の手法は、例えば剤形又は含有成分などに基づき、当業者により適宜選択されてよい。
前記細菌培養工程において培養された細菌を用いて製剤化が行われて抗腫瘍剤が得られる。当該抗腫瘍剤は、例えば上記で述べた液剤であってよい。当該液剤は、前記細菌を所定の液体に混合することによって製造されてよい。製剤化の手法は、例えば剤形又は含有成分などに基づき、当業者により適宜選択されてよい。
2.2 第二の実施態様(細菌)
本発明は、腫瘍から分離された細菌も提供する。前記細菌は、上記のとおり抗腫瘍活性を有する。前記細菌は、紅色非硫黄細菌、プロテウス属細菌、ラクトコッカス属細菌、又はエンテロコッカス属細菌であってよい。本発明に従う細菌は、例えば抗腫瘍剤を製造するために用いられてよい。
また、前記細菌は、上記のとおり腫瘍に集まる特性を有する。そのため、前記細菌は、例えば腫瘍特定用画像の生成のために用いられてよく、例えば診断用医薬を製造するために用いられてもよい。
また、前記細菌は、上記のとおり腫瘍に集まる特性を有する。そのため、前記細菌は、例えば腫瘍特定用画像の生成のために用いられてよく、例えば診断用医薬を製造するために用いられてもよい。
2.2.1 紅色非硫黄細菌
本発明の一実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌は、腫瘍から分離された少なくとも1種以上の紅色非硫黄細菌を含む。前記紅色非硫黄細菌は、上記2.1.1において説明したとおりであり、その説明(例えば細菌の種類、細菌の光学特性、細菌の毒性)が本実施態様においても当てはまる。
本発明の一実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌は、腫瘍から分離された少なくとも1種以上の紅色非硫黄細菌を含む。前記紅色非硫黄細菌は、上記2.1.1において説明したとおりであり、その説明(例えば細菌の種類、細菌の光学特性、細菌の毒性)が本実施態様においても当てはまる。
一実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌は、腫瘍から分離されたロドシュードモナス属細菌若しくはブラストクロリス属細菌又はこれらの両方を含み、特に好ましくは腫瘍から分離されたロドシュードモナス属細菌を含む。これら属に属する細菌の種は、上記2.1.1において述べたとおりであってよい。
前記腫瘍から分離された細菌は、前記紅色非硫黄細菌に加えて、前記腫瘍から分離された他の細菌を含んでもよい。当該他の細菌は、例えばプロテウス(Proteus)属の細菌であってよい。すなわち、前記腫瘍から分離された細菌は、前記紅色非硫黄細菌と他の細菌との組合せであってよく、例えば前記紅色非硫黄細菌(特にはロドシュードモナス属細菌)と前記プロテウス属細菌との組合せであってよい。当該組合せは、上記2.1.1において述べたとおり、特に優れた抗腫瘍活性を発揮する。
2.2.2 プロテウス属細菌
本発明の他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌は、腫瘍から分離された少なくとも1種以上のプロテウス属細菌を含む。前記プロテウス属細菌は、上記2.1.2において説明したとおりであり、その説明(例えば細菌の種類及び細菌の毒性)が本実施態様においても当てはまる。
本発明の他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌は、腫瘍から分離された少なくとも1種以上のプロテウス属細菌を含む。前記プロテウス属細菌は、上記2.1.2において説明したとおりであり、その説明(例えば細菌の種類及び細菌の毒性)が本実施態様においても当てはまる。
2.2.3 ラクトコッカス属細菌
本発明のさらに他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌は、腫瘍から分離された少なくとも1種以上のラクトコッカス属細菌を含む。例えば、前記腫瘍から分離された細菌は、前記腫瘍から単離されたラクトコッカス属細菌であってよい。前記ラクトコッカス属細菌は、上記2.1.3において説明したとおりであり、その説明(例えば細菌の種類及び細菌の抗腫瘍活性)が本実施態様においても当てはまる。
本発明のさらに他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌は、腫瘍から分離された少なくとも1種以上のラクトコッカス属細菌を含む。例えば、前記腫瘍から分離された細菌は、前記腫瘍から単離されたラクトコッカス属細菌であってよい。前記ラクトコッカス属細菌は、上記2.1.3において説明したとおりであり、その説明(例えば細菌の種類及び細菌の抗腫瘍活性)が本実施態様においても当てはまる。
2.2.4 エンテロコッカス属細菌
本発明のさらに他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌は、腫瘍から分離された少なくとも1種以上のエンテロコッカス属細菌を含む。例えば、前記腫瘍から分離された細菌は、前記腫瘍から単離されたエンテロコッカス属細菌であってよい。前記エンテロコッカス属細菌は、上記2.1.4において説明したとおりであり、その説明(例えば細菌の種類及び細菌の抗腫瘍活性)が本実施態様においても当てはまる。
本発明のさらに他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌は、腫瘍から分離された少なくとも1種以上のエンテロコッカス属細菌を含む。例えば、前記腫瘍から分離された細菌は、前記腫瘍から単離されたエンテロコッカス属細菌であってよい。前記エンテロコッカス属細菌は、上記2.1.4において説明したとおりであり、その説明(例えば細菌の種類及び細菌の抗腫瘍活性)が本実施態様においても当てはまる。
2.2.5 アシネトバクター属細菌
本発明のさらに他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌は、腫瘍から分離された少なくとも1種以上のアシネトバクター属細菌を含む。例えば、前記腫瘍から分離された細菌は、前記腫瘍から単離されたアシネトバクター属細菌であってよい。前記アシネトバクター属細菌は、上記2.1.5において説明したとおりであり、その説明(例えば細菌の種類及び細菌の抗腫瘍活性)が本実施態様においても当てはまる。
本発明のさらに他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌は、腫瘍から分離された少なくとも1種以上のアシネトバクター属細菌を含む。例えば、前記腫瘍から分離された細菌は、前記腫瘍から単離されたアシネトバクター属細菌であってよい。前記アシネトバクター属細菌は、上記2.1.5において説明したとおりであり、その説明(例えば細菌の種類及び細菌の抗腫瘍活性)が本実施態様においても当てはまる。
2.2.6 バチルス属細菌
本発明のさらに他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌は、腫瘍から分離された少なくとも1種以上のバチルス属細菌を含む。例えば、前記腫瘍から分離された細菌は、前記腫瘍から単離されたバチルス属細菌であってよい。前記バチルス属細菌は、上記2.1.6において説明したとおりであり、その説明(例えば細菌の種類及び細菌の抗腫瘍活性)が本実施態様においても当てはまる。
本発明のさらに他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌は、腫瘍から分離された少なくとも1種以上のバチルス属細菌を含む。例えば、前記腫瘍から分離された細菌は、前記腫瘍から単離されたバチルス属細菌であってよい。前記バチルス属細菌は、上記2.1.6において説明したとおりであり、その説明(例えば細菌の種類及び細菌の抗腫瘍活性)が本実施態様においても当てはまる。
2.2.7 キューティバクテリウム属細菌
本発明のさらに他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌は、腫瘍から分離された少なくとも1種以上のキューティバクテリウム属細菌を含む。例えば、前記腫瘍から分離された細菌は、前記腫瘍から単離されたキューティバクテリウム属細菌であってよい。前記キューティバクテリウム属細菌は、上記2.1.7において説明したとおりであり、その説明(例えば細菌の種類及び細菌の抗腫瘍活性)が本実施態様においても当てはまる。
本発明のさらに他の実施態様において、前記腫瘍から分離された細菌は、腫瘍から分離された少なくとも1種以上のキューティバクテリウム属細菌を含む。例えば、前記腫瘍から分離された細菌は、前記腫瘍から単離されたキューティバクテリウム属細菌であってよい。前記キューティバクテリウム属細菌は、上記2.1.7において説明したとおりであり、その説明(例えば細菌の種類及び細菌の抗腫瘍活性)が本実施態様においても当てはまる。
2.3 第三の実施態様(画像生成方法)
本発明は、画像生成方法も提供する。当該方法は、例えば、腫瘍から分離された細菌を動物に投与する投与工程、及び、前記投与後に、所定の波長範囲の光を照射した状態で前記動物を撮像して、前記動物に存在しうる腫瘍を特定するための画像を生成する画像生成工程を含んでよい。本発明に従う腫瘍から分離された細菌は、特定の光学特性を有し、且つ、動物に投与された場合に腫瘍部位に集まる特性も有する。そこで、これら特性を利用することで、腫瘍の有無の判定又は腫瘍の位置若しくは形状の特定を行うことができる。なお、このように生成された画像は、腫瘍特定のために用いられるだけでなく、投与された細菌の集合している位置を特定するために用いられてもよい。
以下で、当該方法に含まれる各工程について説明する。
以下で、当該方法に含まれる各工程について説明する。
(投与工程S21)
前記投与工程において、腫瘍から分離された細菌が動物に投与される。当該腫瘍から分離された細菌は、好ましくは紅色非硫黄細菌を含む。当該紅色非硫黄細菌は、上記2.1.1において述べたとおりであり、その説明が本実施態様においても当てはまる。また、当該細菌は、当該紅色非硫黄細菌に加えて、上記2.1.1において述べた他の細菌(特にはプロテウス属細菌)を含んでもよい。当該紅色非硫黄細菌は、好ましくは、上記2.1.1において述べた光学特性を有するものである。また、当該紅色非硫黄細菌は、好ましくは、上記2.1.1において述べた毒性特性を有するものである。
前記投与工程において、腫瘍から分離された細菌が動物に投与される。当該腫瘍から分離された細菌は、好ましくは紅色非硫黄細菌を含む。当該紅色非硫黄細菌は、上記2.1.1において述べたとおりであり、その説明が本実施態様においても当てはまる。また、当該細菌は、当該紅色非硫黄細菌に加えて、上記2.1.1において述べた他の細菌(特にはプロテウス属細菌)を含んでもよい。当該紅色非硫黄細菌は、好ましくは、上記2.1.1において述べた光学特性を有するものである。また、当該紅色非硫黄細菌は、好ましくは、上記2.1.1において述べた毒性特性を有するものである。
当該投与工程において、前記腫瘍から分離された細菌は、好ましくは非経口的に投与される。例えば、前記細菌は、血管内(例えば静脈内若しくは動脈内)に投与されてよく、皮下に投与されてよく、筋肉内に投与されてよく、又は髄腔内に投与されてもよい。好ましくは、前記細菌は、血管内(例えば静脈内若しくは動脈内)に投与され、特には静脈内に投与される。
本発明の抗腫瘍剤に含まれる腫瘍から分離された細菌は、上記で述べたとおり腫瘍部位に集まる特性を有するので、血管内に投与されることで、細菌が腫瘍部位に到達しやすくなる。また、血管内投与は侵襲も比較的少ない。
また、細菌を血管内に投与することによって、通常は当該細菌は毒性を発揮し、患者に悪影響を及ぼす。しかしながら、上記で述べたとおり本発明の抗腫瘍剤に含まれる腫瘍から分離された細菌は、そのような毒性を発揮しないか、又は、発揮してもその程度は非常に低い。
本発明の抗腫瘍剤に含まれる腫瘍から分離された細菌は、上記で述べたとおり腫瘍部位に集まる特性を有するので、血管内に投与されることで、細菌が腫瘍部位に到達しやすくなる。また、血管内投与は侵襲も比較的少ない。
また、細菌を血管内に投与することによって、通常は当該細菌は毒性を発揮し、患者に悪影響を及ぼす。しかしながら、上記で述べたとおり本発明の抗腫瘍剤に含まれる腫瘍から分離された細菌は、そのような毒性を発揮しないか、又は、発揮してもその程度は非常に低い。
当該非経口投与のために、前記細菌は、液剤として構成されてよい。当該液剤は、上記2.1.4において説明した液剤と同じように構成されてよく、その説明が本実施態様においても当てはまる。当該液剤に含まれる細菌の量も、上記2.1.4において説明した液剤中の細菌含有割合と同じであってよい。
(撮像工程S22)
前記投与工程後に、所定の波長範囲の光を照射した状態で前記動物が撮像される。当該撮像により、前記動物に存在しうる腫瘍を特定するための画像が生成される。前記光の波長範囲は、投与された前記細菌の光学特性に応じて選択されてよい。
前記投与工程後に、所定の波長範囲の光を照射した状態で前記動物が撮像される。当該撮像により、前記動物に存在しうる腫瘍を特定するための画像が生成される。前記光の波長範囲は、投与された前記細菌の光学特性に応じて選択されてよい。
前記光は、例えば赤外光であってよく、特には近赤外光、中赤外光、又は遠赤外光であってよい。前記赤外光は、照射された動物への影響が小さい。また、前記腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌は、赤外光(特には近赤外光)を照射された場合に蛍光を発し、さらに、当該蛍光の蛍光強度は強い。そのため、赤外光を当該動物へ照射した状態で撮像することにより得られた画像は、腫瘍を特定するために適している。
前記撮像のために、前記細菌から生じた蛍光を観察可能な装置が用いられてよい。当該装置は、例えば撮像対象の蛍光画像を取得可能な装置であってよく、当該装置のより具体的な例として蛍光イメージングシステム、in vivo蛍光イメージングシステム、及び蛍光イメージャが挙げられるが、これらに限定されない。
前記撮像によって得られた画像によって、例えば前記細菌由来の蛍光が生じている部位を特定することができる。
前記細菌は、腫瘍へと集まる特性を有する。そのため、当該画像内に蛍光を発している部位が存在する場合は、当該部位が腫瘍を有する部位として特定されてよい。また、当該画像に基づき、腫瘍の位置又は形状が特定されてもよい。
また、当該画像内に蛍光を発している部位が存在しない場合は、撮像対象内に腫瘍が存在しないと特定されてもよい。
このように、前記撮像によって得られた画像は、腫瘍の有無の特定又は腫瘍の位置若しくは形状の特定のために有用である。
前記細菌は、腫瘍へと集まる特性を有する。そのため、当該画像内に蛍光を発している部位が存在する場合は、当該部位が腫瘍を有する部位として特定されてよい。また、当該画像に基づき、腫瘍の位置又は形状が特定されてもよい。
また、当該画像内に蛍光を発している部位が存在しない場合は、撮像対象内に腫瘍が存在しないと特定されてもよい。
このように、前記撮像によって得られた画像は、腫瘍の有無の特定又は腫瘍の位置若しくは形状の特定のために有用である。
2.4 第四の実施態様(細菌の製造方法)
本発明は有用細菌の製造方法も提供する。例えば、一実施態様において、当該製造方法により製造される細菌は、抗腫瘍活性を有する細菌であってよい。また、当該製造方法により製造される細菌は、上記2.1.1において述べた光学特性を有する細菌であってもよい。
本発明の製造方法は、例えば、腫瘍から細菌を分離する細菌分離工程、及び、前記分離工程において分離された細菌を培養する細菌培養工程を含んでよい。上記1.で述べたように、腫瘍内に存在する細菌は、当該腫瘍から分離されそして培養されることで、抗腫瘍活性若しくは光学特性又はこれら両方を獲得する。前記細菌分離工程及び前記細菌培養工程は、上記2.1.7において説明されたとおりであり、その説明が本実施態様においても当てはまる。
前記製造方法はさらに、前記細菌分離工程の前に行われる、細菌を含む腫瘍を回収する腫瘍回収工程を含んでもよい。前記腫瘍回収工程も、上記2.1.7において説明されたとおりであり、その説明が本実施態様においても当てはまる。
2.5 第五の実施態様(処置方法及び診断方法)
本発明は、腫瘍から分離された細菌を用いた腫瘍の処置方法を提供する。前記処置方法において、前記腫瘍から分離された細菌は、上記2.1において抗腫瘍剤について述べたとおりに用いられてよい。すなわち、当該処置方法は、当該抗腫瘍剤を動物に投与することを含んでよい。当該投与についても、上記2.1において述べたとおりに実行されてよい。
また、本発明は、腫瘍から分離された細菌を用いた腫瘍の診断方法も提供する。前記診断方法において、前記細菌は、上記2.3において画像生成方法について述べたとおりに用いられてよい。そして、当該画像生成方法において得られた画像に基づき腫瘍についての診断が行われてよい。
また、当該細菌によって、腫瘍の処置と診断の両方が行われてもよい。すなわち、本発明は、腫瘍から分離された細菌を用いた腫瘍の処置及び診断を行う方法も提供する。当該方法において、前記細菌が、腫瘍の処置のために動物(特にはヒト)に投与される。当該投与された細菌は、腫瘍に到達し、その抗腫瘍活性を発揮するとともに、その光学特性に基づく画像生成方法のために利用される。すなわち、前記方法において、腫瘍の処置のために、前記細菌が投与され、そして、当該投与後に、前記画像生成方法が実行されてよい。そして、当該画像生成方法において得られた画像に基づき、腫瘍の診断が行われてよい。
3.実施例
3.1 腫瘍から分離された紅色非硫黄細菌及びプロテウス属細菌
<細胞培養と細胞毒性評価>
マウス結腸がん細胞(Colon26)は、the Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bankより入手した。マウス肉腫(サルコーマ)細胞(Meth-A)ならびにマウスメラノーマ細胞(B16-F10)は、東北大学加齢医学研究所(医用細胞資源センター・細胞バンク)より得た。Colon26、Meth-A、B16-F10の培養のために、10% fetal bovine serum、2-mM l-glutamine、1-mM sodium pyruvate、gentamycin、penicillin-streptomycin(100 IU ml-1)を含むRoswell Park Memorial Institute(RPMI)1640 Medium(Gibco)が使用された。細胞は、37℃、5%のCO2 雰囲気下の加湿チャンバー中で培養された。
マウス結腸がん細胞(Colon26)は、the Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bankより入手した。マウス肉腫(サルコーマ)細胞(Meth-A)ならびにマウスメラノーマ細胞(B16-F10)は、東北大学加齢医学研究所(医用細胞資源センター・細胞バンク)より得た。Colon26、Meth-A、B16-F10の培養のために、10% fetal bovine serum、2-mM l-glutamine、1-mM sodium pyruvate、gentamycin、penicillin-streptomycin(100 IU ml-1)を含むRoswell Park Memorial Institute(RPMI)1640 Medium(Gibco)が使用された。細胞は、37℃、5%のCO2 雰囲気下の加湿チャンバー中で培養された。
<細菌培養>
本実施例で使用した細菌は、National Institute of Technology and Evaluation Biological Resource Center(NBRC)より取得された。Rhodopseudomonas Palustris(以下「R.P.」ともいう)(NBRC 16661)は、543 ATCC medium中で タングステンランプを照射しながら26-30℃の温度で嫌気培養された。Proteus mirabilis(以下「P.M.」ともいう)(NBRC 3849)は、802 NBRC medium中で 30℃の温度で嫌気培養された。細菌培養に利用した試薬は、FUJIFILM Wako Pure Chemical、Nacalai Tesque、Tokyo Chemical Industryより入手された。
本実施例で使用した細菌は、National Institute of Technology and Evaluation Biological Resource Center(NBRC)より取得された。Rhodopseudomonas Palustris(以下「R.P.」ともいう)(NBRC 16661)は、543 ATCC medium中で タングステンランプを照射しながら26-30℃の温度で嫌気培養された。Proteus mirabilis(以下「P.M.」ともいう)(NBRC 3849)は、802 NBRC medium中で 30℃の温度で嫌気培養された。細菌培養に利用した試薬は、FUJIFILM Wako Pure Chemical、Nacalai Tesque、Tokyo Chemical Industryより入手された。
<腫瘍内細菌の分離と培養>
腫瘍内細菌の分離及び培養について、図1を参照しながら説明する。
全ての動物実験は、北陸先端科学技術大学院大学の動物実験委員会の承認を得て実施された。4週齢のメスの野生型マウス(n=10; average weight = 15g; BALB/cCrSlc)はJapan SLC, Incより購入され、一週間馴化させた。Colon26細胞分散液(1×106cells)(100μL)とculture medium/matrigel(Corning)から成る混合溶液(v/v, 1:1)が、マウス右側面腹部皮下1ヵ所に投与されて、結腸がんモデルマウスが作成された。約2週間後、固形がん(~400 mm3)を形成させたマウスの尾静脈内に、R.P.(5×109CFU/mL)200μLが投与された(同図A)。当該投与の2日後、腫瘍内のR.P.の存在(R.P.に由来する近赤外蛍光)が、VISQUE(商標)In Vivo Smart-LF(Vieworks)を用いて確認され(同図B)、そして、当該腫瘍が摘出された(同図C)。当該腫瘍は、メスで細かく切断され、その後、ペストルを使って4℃の温度下、PBS緩衝液中でホモジナイズされた(同図D)。得られた混合物は、20分間、15℃、380 rpm/minの速度で振とうされた。当該振とう後、前記混合物の上澄がPBS緩衝液で10倍希釈されて細菌サンプルが得られた。
腫瘍内細菌の分離及び培養について、図1を参照しながら説明する。
全ての動物実験は、北陸先端科学技術大学院大学の動物実験委員会の承認を得て実施された。4週齢のメスの野生型マウス(n=10; average weight = 15g; BALB/cCrSlc)はJapan SLC, Incより購入され、一週間馴化させた。Colon26細胞分散液(1×106cells)(100μL)とculture medium/matrigel(Corning)から成る混合溶液(v/v, 1:1)が、マウス右側面腹部皮下1ヵ所に投与されて、結腸がんモデルマウスが作成された。約2週間後、固形がん(~400 mm3)を形成させたマウスの尾静脈内に、R.P.(5×109CFU/mL)200μLが投与された(同図A)。当該投与の2日後、腫瘍内のR.P.の存在(R.P.に由来する近赤外蛍光)が、VISQUE(商標)In Vivo Smart-LF(Vieworks)を用いて確認され(同図B)、そして、当該腫瘍が摘出された(同図C)。当該腫瘍は、メスで細かく切断され、その後、ペストルを使って4℃の温度下、PBS緩衝液中でホモジナイズされた(同図D)。得られた混合物は、20分間、15℃、380 rpm/minの速度で振とうされた。当該振とう後、前記混合物の上澄がPBS緩衝液で10倍希釈されて細菌サンプルが得られた。
当該サンプル(100μL)が、543 ATCC mediumから成る寒天培地上に播種され、7日間嫌気培養された(同図E)。当該嫌気培養によって、寒天培地上に細菌コロニーが形成された。形成した赤色の細菌コロニーをいくつかループでピックアップし(同図F)、543 ATCC medium中でタングステンランプを照射しながら26-30℃の温度で嫌気培養した(同図G)。当該嫌気培養により得られた培養液が、2つに分けられ、次の培養に用いられた。
その後、前記培養液の一方が、システイン(Cys)を添加した通常の543 ATCC mediumで培養された(同図H1、当該培養により得られた培養物を以下「培養物1」ともいう)。当該システインの含有割合は、当該543 ATCC mediumの量(g)に対する当該システインの量(g)の割合(%)として表された場合に、3%であった。なお、以降で登場する他のシステイン添加培地中のシステイン含有割合も、当該培地が液体培地である場合及び寒天培地である場合のいずれにおいても、同じく3%であった。
また他方が、Cys無添加の543 ATCC mediumで培養された(同図H2、当該培養により得られた培養物を以下「培養物2」ともいう)。
また他方が、Cys無添加の543 ATCC mediumで培養された(同図H2、当該培養により得られた培養物を以下「培養物2」ともいう)。
培養物1は、0.1%デオキシコール酸を添加したCys添加の543 ATCC mediumから成る寒天培地上で、タングステンランプを照射しながら26-30℃の温度で嫌気培養された(同図I1)。当該デオキシコール酸の前記含有割合は、当該寒天培地の量(g)に対する当該デオキシコール酸の量(g)の割合(%)である。なお、次の培養物2の培養のために用いられた寒天培地も含め、以降で登場する他のデオキシコール酸添加培地中のデオキシコール酸含有割合はいずれも0.1%であった。
培養物2は、0.1%デオキシコール酸を添加したCys無添加の543 ATCC mediumから成る寒天培地上でタングステンランプを照射しながら26-30℃の温度で嫌気培養された(同図I2)。
培養物2は、0.1%デオキシコール酸を添加したCys無添加の543 ATCC mediumから成る寒天培地上でタングステンランプを照射しながら26-30℃の温度で嫌気培養された(同図I2)。
543 ATCC mediumから成る前記寒天培地上の白色コロニーを、ニードルで1個ピックアップし(同図I1)、543 ATCC mediumで引き続き培養した(同図J1)。このようにして、腫瘍から分離された細菌を得た。当該細菌を遺伝子同定(株式会社ベックス)したところ、当該細菌は、Proteus mirabilisであった。当該分離されたProteus mirabilisを、本明細書内において「i-P.M.」ともいう。
当該Proteus mirabilisは、寄託日を令和4年(2022年)3月23日として、受託番号:NITE BP-03626で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NPMD、〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に国際寄託された。
Cys無添加の543 ATCC mediumから成る寒天培地上の赤色コロニーをニードルで1個ピックアップし(同図I2)、Cys無添加の543 ATCC mediumで引き続き培養した(同図J2)。このようにして、腫瘍から分離された細菌を得た。当該細菌は、Rhodopseudomonas Palustris及びProteus mirabilisの2種を含むものであり、すなわち複合細菌であった。当該複合細菌中のRhodopseudomonas Palustris及びProteus mirabilisのCFUに基づく構成比率は97:3であった。当該複合細菌を、本明細書内において「i-R.P.」ともいう。
当該複合細菌は、寄託日を令和4年(2022年)3月23日として、受託番号:NITE BP-03627で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NPMD、〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に国際寄託された。
当該Proteus mirabilisは、寄託日を令和4年(2022年)3月23日として、受託番号:NITE BP-03626で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NPMD、〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に国際寄託された。
Cys無添加の543 ATCC mediumから成る寒天培地上の赤色コロニーをニードルで1個ピックアップし(同図I2)、Cys無添加の543 ATCC mediumで引き続き培養した(同図J2)。このようにして、腫瘍から分離された細菌を得た。当該細菌は、Rhodopseudomonas Palustris及びProteus mirabilisの2種を含むものであり、すなわち複合細菌であった。当該複合細菌中のRhodopseudomonas Palustris及びProteus mirabilisのCFUに基づく構成比率は97:3であった。当該複合細菌を、本明細書内において「i-R.P.」ともいう。
当該複合細菌は、寄託日を令和4年(2022年)3月23日として、受託番号:NITE BP-03627で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NPMD、〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に国際寄託された。
i-R.P.は、さらにCys無添加且つ0.1%デオキシコール酸を添加した543 ATCC mediumから成る寒天培地上でさらに培養された。当該寒天培地上に生じたコロニーのうちから、顕微鏡観察下で、ニードルによって赤色コロニーを注意深くピックアップし(同図K2)、Cys無添加の543 ATCC mediumで引き続き培養した(同図L2)。このようにして、前記複合細菌から、Rhodopseudomonas Palustrisだけに単離された細菌を得た。当該細菌を、本明細書内において「isp-R.P.」ともいう。
<In vivo抗がん実験>
図2Aに示されるように、4週齢のメスの野生型マウス(n=4; average weight=15g; BALB/cCrSlc)をJapan SLC, Incより購入し、一週間馴化させた。Colon26細胞分散液(1×106cells)(100μL)とculture medium/matrigel(Corning)から成る混合溶液(v/v, 1:1)をマウス側面腹部皮下1ヵ所に投与し、結腸がんモデルマウスを作成した。約2週間後、固形がん(~400 mm3)が形成されたマウスの尾静脈内に、R.P.(1×109CFU)、P. M.(1×108CFU)、i-R.P.(1×109CFU)、若しくはi-P.M.(1×108CFU)の細菌試料あるいはPBS緩衝液が、各200μL投与(単回投与)された。マウスの行動や性状、固形がんサイズ測定、マウス体重の推移は、毎日実施された。なお、固形がんのサイズは下式により算出した。
V=L×W2/2
当該式において、Vは固形がん体積、Lは固形がんの長さ、Wは固形がんの幅をそれぞれ示している。
また、マウスに投与された上記4種の細菌試料の調製方法について以下で説明する。
i-R.P.が、Cys無添加のATCC543 medium中でタングステンランプを照射しながら26℃-30℃の温度で3日間嫌気培養された。当該嫌気培養によって得られた培養液が、3000rpmで5分間遠心された。当該遠心によって沈殿した細菌が、Cys無添加の新鮮ATCC543 mediumに懸濁されて懸濁液が得られた。当該懸濁液中の細菌の数が、微生物カウンター(パナソニック、型番NP-BCM01-A)を用いて測定され、そして、測定結果に基づき、所定の細菌濃度となるように、Cys無添加の新鮮ATCC543 mediumが当該懸濁液に適宜添加されて、i-R.P.の細菌試料が得られた。
R.P.が、Cysを添加されたATCC543 medium中でタングステンランプを照射しながら26℃-30℃の温度で3日間嫌気培養された。当該嫌気培養によって得られた培養液が、3000rpmで5分間遠心された。当該遠心によって沈殿した細菌が、Cysを添加された新鮮ATCC543 mediumに懸濁されて懸濁液が得られた。当該懸濁液中の細菌の数が、微生物カウンター(パナソニック、型番NP-BCM01-A)を用いて測定され、そして、測定結果に基づき、所定の細菌濃度となるように、Cysを添加された新鮮ATCC543 mediumが当該懸濁液に適宜添加されて、R.P.の細菌試料が得られた。
i-P.M.の細菌試料は、前記R.P.の細菌試料と同じ方法によって得られた。すなわち、Cysを添加されたATCC543 medium中での嫌気培養、当該嫌気培養により得られた培養液の遠心、当該遠心により得られた沈殿を用いた懸濁液の調整、そして、当該懸濁液中の細菌の濃度の調整によってi-P.M.の細菌試料が得られた。
P.M.が、802 NBRC medium中で 30℃の温度で3日間嫌気培養された。当該嫌気培養によって得られた培養液が、3000rpmで5分間遠心された。当該遠心によって沈殿した細菌が、新鮮802 NBRC mediumに懸濁されて懸濁液が得られた。当該懸濁液中の細菌の数が、微生物カウンター(パナソニック、型番NP-BCM01-A)を用いて測定され、そして、測定結果に基づき、所定の細菌濃度となるように、新鮮802 NBRC mediumが当該懸濁液に適宜添加されて、P.M.の細菌試料が得られた。
なお、上記で各細菌試料について記載されたCFU値は、前記単回投与によって投与された細菌試料200μL中の細菌のCFU値である。
以降の実験においても、マウスに投与された各細菌試料は同じ方法で調製された。
また、前記PBS緩衝液は、富士フイルム和光純薬株式会社の製品(https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2355.html)であり、以下の組成を有する。
pH: 7.1~7.3
NaCl: 9000mg/L
KH2PO4: 144mg/L
Na2HPO4(無水): 421mg/L
以降の実験においても、同じPBS緩衝液が用いられた。
図2Aに示されるように、4週齢のメスの野生型マウス(n=4; average weight=15g; BALB/cCrSlc)をJapan SLC, Incより購入し、一週間馴化させた。Colon26細胞分散液(1×106cells)(100μL)とculture medium/matrigel(Corning)から成る混合溶液(v/v, 1:1)をマウス側面腹部皮下1ヵ所に投与し、結腸がんモデルマウスを作成した。約2週間後、固形がん(~400 mm3)が形成されたマウスの尾静脈内に、R.P.(1×109CFU)、P. M.(1×108CFU)、i-R.P.(1×109CFU)、若しくはi-P.M.(1×108CFU)の細菌試料あるいはPBS緩衝液が、各200μL投与(単回投与)された。マウスの行動や性状、固形がんサイズ測定、マウス体重の推移は、毎日実施された。なお、固形がんのサイズは下式により算出した。
V=L×W2/2
当該式において、Vは固形がん体積、Lは固形がんの長さ、Wは固形がんの幅をそれぞれ示している。
また、マウスに投与された上記4種の細菌試料の調製方法について以下で説明する。
i-R.P.が、Cys無添加のATCC543 medium中でタングステンランプを照射しながら26℃-30℃の温度で3日間嫌気培養された。当該嫌気培養によって得られた培養液が、3000rpmで5分間遠心された。当該遠心によって沈殿した細菌が、Cys無添加の新鮮ATCC543 mediumに懸濁されて懸濁液が得られた。当該懸濁液中の細菌の数が、微生物カウンター(パナソニック、型番NP-BCM01-A)を用いて測定され、そして、測定結果に基づき、所定の細菌濃度となるように、Cys無添加の新鮮ATCC543 mediumが当該懸濁液に適宜添加されて、i-R.P.の細菌試料が得られた。
R.P.が、Cysを添加されたATCC543 medium中でタングステンランプを照射しながら26℃-30℃の温度で3日間嫌気培養された。当該嫌気培養によって得られた培養液が、3000rpmで5分間遠心された。当該遠心によって沈殿した細菌が、Cysを添加された新鮮ATCC543 mediumに懸濁されて懸濁液が得られた。当該懸濁液中の細菌の数が、微生物カウンター(パナソニック、型番NP-BCM01-A)を用いて測定され、そして、測定結果に基づき、所定の細菌濃度となるように、Cysを添加された新鮮ATCC543 mediumが当該懸濁液に適宜添加されて、R.P.の細菌試料が得られた。
i-P.M.の細菌試料は、前記R.P.の細菌試料と同じ方法によって得られた。すなわち、Cysを添加されたATCC543 medium中での嫌気培養、当該嫌気培養により得られた培養液の遠心、当該遠心により得られた沈殿を用いた懸濁液の調整、そして、当該懸濁液中の細菌の濃度の調整によってi-P.M.の細菌試料が得られた。
P.M.が、802 NBRC medium中で 30℃の温度で3日間嫌気培養された。当該嫌気培養によって得られた培養液が、3000rpmで5分間遠心された。当該遠心によって沈殿した細菌が、新鮮802 NBRC mediumに懸濁されて懸濁液が得られた。当該懸濁液中の細菌の数が、微生物カウンター(パナソニック、型番NP-BCM01-A)を用いて測定され、そして、測定結果に基づき、所定の細菌濃度となるように、新鮮802 NBRC mediumが当該懸濁液に適宜添加されて、P.M.の細菌試料が得られた。
なお、上記で各細菌試料について記載されたCFU値は、前記単回投与によって投与された細菌試料200μL中の細菌のCFU値である。
以降の実験においても、マウスに投与された各細菌試料は同じ方法で調製された。
また、前記PBS緩衝液は、富士フイルム和光純薬株式会社の製品(https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2355.html)であり、以下の組成を有する。
pH: 7.1~7.3
NaCl: 9000mg/L
KH2PO4: 144mg/L
Na2HPO4(無水): 421mg/L
以降の実験においても、同じPBS緩衝液が用いられた。
図2Bに、各細菌の静脈投与後のマウスの写真が示されている。
同図に示されるとおり、i-R.P.又はi-P.M.が投与されたマウスは、日数が経過するにつれて腫瘍サイズが小さくなり、そして、処置の30日後においては、腫瘍は消失していた。
一方で、市販のR.P.又はPBS緩衝液が投与されたマウスは、腫瘍サイズが小さくなることはなく、日数の経過とともに腫瘍は大きくなり、腫瘍体積が2000 mm3を超えた。そのため、これらマウスに関しては、人道的エンドポイントの観点から実験を停止した。これに伴い、処置の30日後における写真は撮影されていない。
同図に示されるとおり、i-R.P.又はi-P.M.が投与されたマウスは、日数が経過するにつれて腫瘍サイズが小さくなり、そして、処置の30日後においては、腫瘍は消失していた。
一方で、市販のR.P.又はPBS緩衝液が投与されたマウスは、腫瘍サイズが小さくなることはなく、日数の経過とともに腫瘍は大きくなり、腫瘍体積が2000 mm3を超えた。そのため、これらマウスに関しては、人道的エンドポイントの観点から実験を停止した。これに伴い、処置の30日後における写真は撮影されていない。
図2Cに、各種細菌の抗腫瘍活性の評価結果が示されている(N=4)。同図は、各群の固形がん体積の推移を示すものである。PBS又はR.P.が投与された場合は、固形がんの体積は増加している。一方で、i-R.P.又はi-P.M.が投与された場合は、固形がんの体積は減少し、投与後4~5日で、当該体積は0になった。
図2Dに、各細菌投与におけるがん細胞移植後40日間のマウス生存率(N=4)が示されている。i-P.M.又はi-R.P.が投与された群は100%の生存が確認された。一方で、PBS又はR.P.が投与された群については40日以内に生存率は0%とあった。
図2Eに、各実験群の完全奏功(CR)達成率が示されている。i-P.M.又はi-R.P.が投与された群は、高いCR達成率を記録した。なお、市販のP.M.を投与するとマウスに極度の衰弱と歩行障害が認められたため、人道的エンドポイントの観点から実験を即座に停止した。そのため、市販のP.M.については、データは入手不可能であった。
図2Fは、がん免疫の獲得に関する調査の実験方法を示す図である。同図に示されるように、細菌(i-P.M.又はi-R.P.)投与によってCRを達成したマウスに、当該CR達成の120日経過後に、Colon-26を再移植した。当該再移植後20日間にわたって経過を観察した。
図2Gに、前記観察の結果を示す写真が示されている。当該写真において、黒色矢印はがん細胞移植部位を示し、黒色破線は腫瘍が形成していた部位を示す。i-P.M.及びi-R.P.を用いてCRを達成したマウスには、再移植したColon-26の生着が起きず、腫瘍が形成しなかった。一方で、PBSを投与した健常マウスにColon-26を移植すると腫瘍の形成が認められた。また、図2Hに、各処置群の腫瘍体積(N = 3)の測定結果が示されている。同図において、N.D.は、腫瘍形成が認められなかったことを意味する。
これらの結果から、i-P.M.又はi-R.P.による細菌療法は、腫瘍の処置のために非常に有用であると考えられる。すなわち、腫瘍から分離された細菌は、優れた抗腫瘍活性を有し、腫瘍を処置するために非常に有用であると考えられる。例えば、当該腫瘍から分離された細菌は、上記の結腸がんモデルマウスへの当該細菌の投与後30日以内に当該マウスに形成された腫瘍を縮小させ又は消失させる抗腫瘍活性を有し、特には当該投与後10日以内に当該腫瘍を縮小させ又は消失させる抗腫瘍活性を有してよい。
また、これらの結果から、i-P.M.及びi-R.P.の毒性は非常に低いと考えられる。例えば、当該腫瘍から分離された細菌は、毒性が低いものであり、例えば上記の結腸がんモデルマウスへの当該細菌の投与後40日間のマウス生存率は、例えば90%以上、95%以上、又は100%であってよい。
また、これらの結果から、i-P.M.又はi-R.P.による細菌療法を施すことによって、がん免疫を獲得することができると考えられる。すなわち、腫瘍から分離された細菌を投与することによって、腫瘍を処置するだけでなく、腫瘍に対する免疫を獲得できると考えられる。
また、これらの結果から、i-P.M.及びi-R.P.の毒性は非常に低いと考えられる。例えば、当該腫瘍から分離された細菌は、毒性が低いものであり、例えば上記の結腸がんモデルマウスへの当該細菌の投与後40日間のマウス生存率は、例えば90%以上、95%以上、又は100%であってよい。
また、これらの結果から、i-P.M.又はi-R.P.による細菌療法を施すことによって、がん免疫を獲得することができると考えられる。すなわち、腫瘍から分離された細菌を投与することによって、腫瘍を処置するだけでなく、腫瘍に対する免疫を獲得できると考えられる。
<組織染色>
各種細菌の抗腫瘍メカニズムは、細菌投与後の腫瘍塊切片の組織免疫染色により解析された。具体的には、Colon26を播種した結腸がんモデルマウス(female, 8 weeks; n=5; average weight=19g; average tumor size ~400 mm3; BALB/cCrSIc; Japan SLC)の尾静脈に、i-P.M.の細菌試料(5×108 CFU/mL)、i-R.P.の細菌試料(5×109CFU/mL)、又はPBS緩衝液がそれぞれ200μL投与された。当該投与の24時間後に、腫瘍が摘出され、当該腫瘍のパラフィン切片が作製された。当該パラフィン切片が、組織染色され、光学顕微鏡を用いて観察された。なお、組織染色は、株式会社バイオ病理研究所によって行われた。
各種細菌の抗腫瘍メカニズムは、細菌投与後の腫瘍塊切片の組織免疫染色により解析された。具体的には、Colon26を播種した結腸がんモデルマウス(female, 8 weeks; n=5; average weight=19g; average tumor size ~400 mm3; BALB/cCrSIc; Japan SLC)の尾静脈に、i-P.M.の細菌試料(5×108 CFU/mL)、i-R.P.の細菌試料(5×109CFU/mL)、又はPBS緩衝液がそれぞれ200μL投与された。当該投与の24時間後に、腫瘍が摘出され、当該腫瘍のパラフィン切片が作製された。当該パラフィン切片が、組織染色され、光学顕微鏡を用いて観察された。なお、組織染色は、株式会社バイオ病理研究所によって行われた。
免疫細胞の染色結果が、図3Aに示されている。同図に示されるとおり、i-P.M.は自然免疫(マクロファージ、NK細胞、好中球)及び獲得免疫(T細胞、B細胞)のいずれも著しく活性化していることが認められる。また、i-R.P.は、i-P.M.ほど免疫賦活化能は高くないが、マクロファージ、T細胞、B細胞の顕著な活性化が認められる。一方で、PBS及びRPについては、そのような活性化は認められない。
すなわち、腫瘍から分離された細菌は、免疫細胞賦活化作用を有し、当該作用が、優れた抗腫瘍活性をもたらす要因の一つと考えられる。
また、腫瘍から分離された細菌は、免疫細胞を賦活化するために用いられてよく、特には、腫瘍が存在する組織において免疫細胞を賦活化するために用いられてよい。すなわち、本発明は、腫瘍から分離された細菌を含む免疫細胞賦活化剤も提供する。
すなわち、腫瘍から分離された細菌は、免疫細胞賦活化作用を有し、当該作用が、優れた抗腫瘍活性をもたらす要因の一つと考えられる。
また、腫瘍から分離された細菌は、免疫細胞を賦活化するために用いられてよく、特には、腫瘍が存在する組織において免疫細胞を賦活化するために用いられてよい。すなわち、本発明は、腫瘍から分離された細菌を含む免疫細胞賦活化剤も提供する。
また、抗腫瘍バイオマーカーの染色結果が、図3Bに示されている。同図に示されるとおり、i-P.M.及びi-R.P.のいずれもが、ネクローシスマーカーTNF-α及びアポトーシスマーカーCaspase-3の発現をもたらしており、さらに、著しい組織損壊が認められる。i-P.M.は、TNF-α及びCaspase-3の特に強い発現をもたしている。
すなわち、腫瘍から分離された細菌は、抗腫瘍バイオマーカーの発現増強作用を有し、当該作用が、優れた抗腫瘍活性をもたらす要因の一つと考えられる。
また、腫瘍から分離された細菌は、抗腫瘍バイオマーカーの発現を増強するために用いられてよく、特には、腫瘍が存在する組織において抗腫瘍バイオマーカーの発現を増強するために用いられてよい。すなわち、本発明は、腫瘍から分離された細菌を含む抗腫瘍バイオマーカー発現増強剤も提供する。
すなわち、腫瘍から分離された細菌は、抗腫瘍バイオマーカーの発現増強作用を有し、当該作用が、優れた抗腫瘍活性をもたらす要因の一つと考えられる。
また、腫瘍から分離された細菌は、抗腫瘍バイオマーカーの発現を増強するために用いられてよく、特には、腫瘍が存在する組織において抗腫瘍バイオマーカーの発現を増強するために用いられてよい。すなわち、本発明は、腫瘍から分離された細菌を含む抗腫瘍バイオマーカー発現増強剤も提供する。
<in vivo毒性>
細菌(i-R.P.、i-P.M.)のin vivo毒性が、マウス血液検査ならびに各種臓器の組織鑑定を実施することで調査された。
マウス血液検査のために、各種細菌(i-R.P.、i-P.M.)の細菌試料(5×106CFU/mL)あるいはPBS緩衝液が、10週齢のメスのマウス(n=5; average weight = 21g、BALB/cCrSlc、Japan SLC)の尾静脈に各200 μL投与された。当該投与の30日後、腹部大動脈より血液採取した。全血球数(complete blood cell count:CBC)ならびに生化学検査は、Japan SLC, Inc.とOriental Yeast Co., Ltd.により解析された。
各種臓器の組織鑑定のために、各種細菌(i-R.P.、i-P.M.)の細菌試料(i-R.P.=5×109 CFU/mL、i-P.M.=5×108 CFU/mL)あるいはPBS緩衝液が、固形がん(~400 mm3)を形成させた結腸がんモデルマウスの尾静脈に各200 μL投与された。当該投与の30日(完全奏功(CR)達成)後に、マウスから各種臓器が摘出された。摘出された各種臓器のパラフィン切片が作製された。各パラフィン切片は、ヘマトキシリン&エオジン(H&E)組織染色され、そして、光学顕微鏡で観察された。なお、組織染色は、株式会社バイオ病理研究所によって行われた。
細菌(i-R.P.、i-P.M.)のin vivo毒性が、マウス血液検査ならびに各種臓器の組織鑑定を実施することで調査された。
マウス血液検査のために、各種細菌(i-R.P.、i-P.M.)の細菌試料(5×106CFU/mL)あるいはPBS緩衝液が、10週齢のメスのマウス(n=5; average weight = 21g、BALB/cCrSlc、Japan SLC)の尾静脈に各200 μL投与された。当該投与の30日後、腹部大動脈より血液採取した。全血球数(complete blood cell count:CBC)ならびに生化学検査は、Japan SLC, Inc.とOriental Yeast Co., Ltd.により解析された。
各種臓器の組織鑑定のために、各種細菌(i-R.P.、i-P.M.)の細菌試料(i-R.P.=5×109 CFU/mL、i-P.M.=5×108 CFU/mL)あるいはPBS緩衝液が、固形がん(~400 mm3)を形成させた結腸がんモデルマウスの尾静脈に各200 μL投与された。当該投与の30日(完全奏功(CR)達成)後に、マウスから各種臓器が摘出された。摘出された各種臓器のパラフィン切片が作製された。各パラフィン切片は、ヘマトキシリン&エオジン(H&E)組織染色され、そして、光学顕微鏡で観察された。なお、組織染色は、株式会社バイオ病理研究所によって行われた。
以下表1及び表2に、i-R.P.及びi-P.M.が投与された場合の血液検査の結果を示す。
これら表に示されるとおり、i-R.P.が投与された場合及びi-P.M.が投与された場合のいずれについても、血液検査結果は、PBS緩衝液が投与された場合との間で有意な差は無かった。すなわち、i-R.P.の投与及びi-P.M.の投与のいずれもが、血液の状態に対して悪影響を及ぼさないと考えられる。
図3Eに、i-P.M.、i-R.P.、又はPBSが投与された場合における前記各種臓器のH&E組織染色の結果が示されている。同図に示されるとおり、細菌投与による臓器組織の損壊は認められなかった。
これらの結果より、腫瘍から分離された細菌の投与は、血液状態の観点から及び各種臓器の状態の観点から、毒性を有さないと考えられる。
<コロニーアッセイ>
以下のコロニーアッセイにより、細菌投与後の各種組織内の細菌の残存状況を調査した。すなわち、Colon26を播種した結腸がんモデルマウス(female, 8 weeks; n=3; average weight = 19g; average tumor size ~400mm3; BALB/cCrSIc; Japan SLC)の尾静脈にi-P.M.の細菌試料(5×108 CFU/mL)、i-R.P.の細菌試料(5×109CFU/mL)又はPBS緩衝液が、それぞれ200μL投与された。当該投与の30日(CR達成)後に、各組織が摘出され、切断後、その重量が測定された。各組織は、ペストルを使って4℃の温度下で、PBS緩衝液中でホモジナイズされた。当該ホモジナイズにより得られた混合物が、20分間、15℃、380 rpm/minの速度で振とうされた。当該振とう後、前記混合物の上澄が、PBS緩衝液で10倍希釈されてサンプルが得られた。各サンプル(100μL)が寒天培地上に播種され、7日間嫌気培養されて、寒天培地上に生じた細菌コロニーが形成された。細菌コロニー数が、目視(マニュアル)で測定された。
以下のコロニーアッセイにより、細菌投与後の各種組織内の細菌の残存状況を調査した。すなわち、Colon26を播種した結腸がんモデルマウス(female, 8 weeks; n=3; average weight = 19g; average tumor size ~400mm3; BALB/cCrSIc; Japan SLC)の尾静脈にi-P.M.の細菌試料(5×108 CFU/mL)、i-R.P.の細菌試料(5×109CFU/mL)又はPBS緩衝液が、それぞれ200μL投与された。当該投与の30日(CR達成)後に、各組織が摘出され、切断後、その重量が測定された。各組織は、ペストルを使って4℃の温度下で、PBS緩衝液中でホモジナイズされた。当該ホモジナイズにより得られた混合物が、20分間、15℃、380 rpm/minの速度で振とうされた。当該振とう後、前記混合物の上澄が、PBS緩衝液で10倍希釈されてサンプルが得られた。各サンプル(100μL)が寒天培地上に播種され、7日間嫌気培養されて、寒天培地上に生じた細菌コロニーが形成された。細菌コロニー数が、目視(マニュアル)で測定された。
図3Cに、i-R.P.が投与された場合における前記コロニーアッセイの結果が示されている。同図より、がん治療後にi-R.P.は臓器内に全く残存しないことが確認された。
図3Dに、i-P.M.が投与された場合における前記コロニーアッセイの結果が示されている。同図より、がん治療後にi-P.M.は臓器内に全く残存しないことが確認された。
これらの結果より、腫瘍から分離された細菌は、投与された場合に各種組織内に残存しないことが分かる。
<他のがんに対する効果>
図4Aに示されるとおり、サルコーマモデルマウスは、結腸がんモデルマウスと同様の手法により作製した。サルコーマモデルマウスを作製するために、マウス肉腫(サルコーマ)由来細胞(Meth-A)が皮下移植された。当該移植の6~10日後に、固形がん(~100 mm3)を形成させたマウス(n=3)の尾静脈内にi-P.M.の細菌試料(1×108 CFU/mL)が200μL投与され、14日に渡って経時的に腫瘍が観察された。
図4Aに示されるとおり、サルコーマモデルマウスは、結腸がんモデルマウスと同様の手法により作製した。サルコーマモデルマウスを作製するために、マウス肉腫(サルコーマ)由来細胞(Meth-A)が皮下移植された。当該移植の6~10日後に、固形がん(~100 mm3)を形成させたマウス(n=3)の尾静脈内にi-P.M.の細菌試料(1×108 CFU/mL)が200μL投与され、14日に渡って経時的に腫瘍が観察された。
当該腫瘍の経時変化が図4Bに示されている。同図に示されるとおり、i-P.M.ならびにi-R.P.の静脈投与後にCRを達成していることが分かる。また、8日目以降において、がん再発も認められなかった。
この結果より、腫瘍から分離された細菌は、結腸がんだけでなく、サルコーマなどの肉腫に対しても抗腫瘍活性を示すことが分かる。
この結果より、腫瘍から分離された細菌は、結腸がんだけでなく、サルコーマなどの肉腫に対しても抗腫瘍活性を示すことが分かる。
図4Cに示されるとおりに、転移性肺がんモデルマウスを作製した。すなわち、4週齢のメスの野生型マウス(n=3; average weight = 15g; C57BL/6NCrSlc)をJapan SLC, Incより購入し、一週間馴化させた。マウスメラノーマ細胞(B16-F10細胞)分散液(5×106cells)(200μL)が、マウス尾静脈に投与された。これにより転移性肺がんモデルマウスが作製された。当該投与の1週間後に、各種細菌(i-R.P.、i-P.M.)の細菌試料(i-R.P.=5×109 CFU/mL、i-P.M.=5×108 CFU/mL)あるいはPBS緩衝液が、転移性肺がんモデルマウスの尾静脈に各200 μL投与された。当該投与の7日後に、肺が摘出され、写真撮影ならびに重量が測定された。また、マウスメラノーマ細胞が投与されておらず且つ各種細菌も投与されていない無処置マウス(健常マウス)も用意された。
図4Dに、摘出された肺の写真が示されている。同図に示されるとおり、無処置マウス及びi-R.P.又はi-P.M.が投与されたマウスの肺は、同程度のサイズである。一方で、PBSが投与されたマウスでは、腫瘍が確認された。すなわち、各種細菌投与により腫瘍が寛解していることが分かる。
図4Eに、各処置後のモデルマウス及び無処置群のマウスから摘出された肺の重量測定(N=3)の結果が示されている。i-R.P.又はi-P.M.が投与された群の肺は、無処置マウスの健常な肺と同じ重量を示しているが、PBS投与群は腫瘍形成に伴う肺重量の増加が認められる。
図4Fに、各処置後のモデルマウス及び無処置マウスの体重の推移が示されている(N=3)。同図中の矢印は、PBSもしくは細菌が投与されたタイミングを示している。無処置マウスは経時的に体重増加が観察できるが、PBS投与群は10日あたりから顕著な体重減少が認められる。細菌投与群はいずれも投与の翌日にわずかな体重の減少が見られるが、その後は健常な体重増加が認められる。
これらの結果より、腫瘍から分離された細菌は、結腸がんだけでなく、肺がんに対しても抗腫瘍活性を示すことが分かる。
図4Eに、各処置後のモデルマウス及び無処置群のマウスから摘出された肺の重量測定(N=3)の結果が示されている。i-R.P.又はi-P.M.が投与された群の肺は、無処置マウスの健常な肺と同じ重量を示しているが、PBS投与群は腫瘍形成に伴う肺重量の増加が認められる。
図4Fに、各処置後のモデルマウス及び無処置マウスの体重の推移が示されている(N=3)。同図中の矢印は、PBSもしくは細菌が投与されたタイミングを示している。無処置マウスは経時的に体重増加が観察できるが、PBS投与群は10日あたりから顕著な体重減少が認められる。細菌投与群はいずれも投与の翌日にわずかな体重の減少が見られるが、その後は健常な体重増加が認められる。
これらの結果より、腫瘍から分離された細菌は、結腸がんだけでなく、肺がんに対しても抗腫瘍活性を示すことが分かる。
<細菌の光学特性解析>
腫瘍から分離したi-R.P.又は市販のR.P.が分散された細菌分散液の吸光スペクトルが、室温でUV-Vis-NIR spectrophotometer(V-730 BIO; Jasco)を用いて測定された。当該細菌分散液は、各細菌が2×107CFU/mLの濃度でPBS緩衝液に分散された分散液であった。
当該分散液は、以下のとおりに調製された。
i-R.P.が、Cys無添加の543 ATCC medium中でタングステンランプを照射しながら26℃-30℃の温度で3日間嫌気培養された。当該嫌気培養によって得られた培養液が、3000rpmで5分間遠心された。当該遠心によって沈殿した細菌が、PBS緩衝液に懸濁されて細菌の懸濁液が得られた。当該懸濁液中の細菌の数が、微生物カウンター(パナソニック、型番NP-BCM01-A)を用いて測定され、そして、測定結果に基づき、所定の細菌濃度となるように、適宜PBS緩衝液が当該懸濁液に添加されて、上記濃度のi-R.P.の分散液が得られた。
R.P.が、Cysを添加された543 ATCC medium中でタングステンランプを照射しながら26℃-30℃の温度で3日間嫌気培養された。当該嫌気培養によって得られた培養液が、i-R.P.と同じように、3000rpmで5分間遠心され、当該遠心によって沈殿した細菌がPBS緩衝液に懸濁され、そして、所定の細菌濃度となるように適宜PBS緩衝液が添加されて、上記濃度のR.P.の分散液が得られた。
前記UV-Vis-NIR spectrophotometerによる測定における測定条件は以下の表3に示されるとおりであった。
腫瘍から分離したi-R.P.又は市販のR.P.が分散された細菌分散液の吸光スペクトルが、室温でUV-Vis-NIR spectrophotometer(V-730 BIO; Jasco)を用いて測定された。当該細菌分散液は、各細菌が2×107CFU/mLの濃度でPBS緩衝液に分散された分散液であった。
当該分散液は、以下のとおりに調製された。
i-R.P.が、Cys無添加の543 ATCC medium中でタングステンランプを照射しながら26℃-30℃の温度で3日間嫌気培養された。当該嫌気培養によって得られた培養液が、3000rpmで5分間遠心された。当該遠心によって沈殿した細菌が、PBS緩衝液に懸濁されて細菌の懸濁液が得られた。当該懸濁液中の細菌の数が、微生物カウンター(パナソニック、型番NP-BCM01-A)を用いて測定され、そして、測定結果に基づき、所定の細菌濃度となるように、適宜PBS緩衝液が当該懸濁液に添加されて、上記濃度のi-R.P.の分散液が得られた。
R.P.が、Cysを添加された543 ATCC medium中でタングステンランプを照射しながら26℃-30℃の温度で3日間嫌気培養された。当該嫌気培養によって得られた培養液が、i-R.P.と同じように、3000rpmで5分間遠心され、当該遠心によって沈殿した細菌がPBS緩衝液に懸濁され、そして、所定の細菌濃度となるように適宜PBS緩衝液が添加されて、上記濃度のR.P.の分散液が得られた。
前記UV-Vis-NIR spectrophotometerによる測定における測定条件は以下の表3に示されるとおりであった。
また、腫瘍から分離したi-R.P.又は市販のR.P.が分散された細菌分散液の蛍光スペクトルが、fluorescence spectrometers(FP-8600 NIR Spectrofluorometer; Jasco)を用いて測定された。励起波長は805nmであった。前記細菌分散液は、前記細菌が2.5×107CFU/mLの濃度でPBS緩衝液に分散された分散液であった。当該分散液は、上記で説明したように調製された。前記fluorescence spectrometersによる測定における測定条件は以下の表4に示されるとおりであった。
図2Iに、前記吸光スペクトルの測定結果が示されている。同図に示されるとおり、i-R.P.は、R.P.と比べて、より高い光吸収特性を有することが分かる。i-R.P.に関して、例えば808nmでの吸光度は例えば0.029以上であり、例えば865nmにおける吸光度は例えば0.032以上である。i-R.P.は、これらの波長での吸光度が特に高い。このような吸光度における違いは、光吸収性物質(例えば光吸収性タンパク質など)の発現状況の違いに起因すると考えられる。また、上記で述べた抗腫瘍活性に関する実験結果を踏まえると、このように吸光度が高いことが、細菌が抗腫瘍活性を有することの指標として利用できると考えられる。
図2Jに、前記蛍光スペクトルの測定結果が示されている。同図に示されるとおり、i-R.P.は、R.P.と比べて、より高い蛍光特性を有することが分かる。i-R.P.に関して、例えば888nmにおける蛍光強度が4.4以上である。i-R.P.は、この波長での蛍光強度が特に高い。このような蛍光強度における違いは、蛍光物質(例えば蛍光タンパク質など)の発現状況の違いに起因すると考えられる。また、上記で述べた抗腫瘍活性に関する実験結果を踏まえると、このように蛍光強度が高いことが、細菌が抗腫瘍活性を有することの指標として利用できると考えられる。
これらの結果より、腫瘍から分離された細菌(特には紅色非硫黄細菌)は、腫瘍内に存在していなかった細菌(例えば市販の細菌)と異なる光学特性を有することが分かる。また、当該光学特性は、抗腫瘍活性を有することを示す指標として利用できる。また、当該光学特性は、腫瘍の有無の判定又は腫瘍の位置又は形状の特定などにおいても利用できると考えられる。
また、腫瘍から分離したi-P.M.又は市販のP.M.が分散された細菌分散液の吸光スペクトル及び蛍光スペクトルが、上記で述べたように行われた。吸光スペクトルを測定するために用いられた細菌分散液の細菌濃度は、いずれも2×107 CFU/mLであった。また、蛍光スペクトルを測定するために用いられた細菌分散液の細菌濃度は、いずれも2.5×107 CFU/mLであり、励起波長は805 nmであった。
これら分散液は、以下のとおりに調製された。
i-P.M.は、Cysを添加された543 ATCC medium中でタングステンランプを照射しながら26℃-30℃の温度で3日間嫌気培養された。当該嫌気培養によって得られた培養液が、3000rpmで5分間遠心された。当該遠心によって沈殿した細菌が、PBS緩衝液に懸濁されて細菌の懸濁液が得られた。当該懸濁液中の細菌の数が、微生物カウンター(パナソニック、型番NP-BCM01-A)を用いて測定され、そして、測定結果に基づき、所定の細菌濃度となるように、適宜PBS緩衝液が当該懸濁液に添加されて、上記濃度のi-P.M.の分散液が得られた。
P.M.は、802 NBRC medium中で 30℃の温度で3日間嫌気培養された。当該嫌気培養によって得られた培養液が、i-P.M.と同じように、3000rpmで5分間遠心され、当該遠心によって沈殿した細菌がPBS緩衝液に懸濁され、そして、所定の細菌濃度となるように適宜PBS緩衝液が添加されて、上記濃度のP.M.の分散液が得られた。
これら分散液は、以下のとおりに調製された。
i-P.M.は、Cysを添加された543 ATCC medium中でタングステンランプを照射しながら26℃-30℃の温度で3日間嫌気培養された。当該嫌気培養によって得られた培養液が、3000rpmで5分間遠心された。当該遠心によって沈殿した細菌が、PBS緩衝液に懸濁されて細菌の懸濁液が得られた。当該懸濁液中の細菌の数が、微生物カウンター(パナソニック、型番NP-BCM01-A)を用いて測定され、そして、測定結果に基づき、所定の細菌濃度となるように、適宜PBS緩衝液が当該懸濁液に添加されて、上記濃度のi-P.M.の分散液が得られた。
P.M.は、802 NBRC medium中で 30℃の温度で3日間嫌気培養された。当該嫌気培養によって得られた培養液が、i-P.M.と同じように、3000rpmで5分間遠心され、当該遠心によって沈殿した細菌がPBS緩衝液に懸濁され、そして、所定の細菌濃度となるように適宜PBS緩衝液が添加されて、上記濃度のP.M.の分散液が得られた。
測定結果が図5に示されており、同図の(a)が吸光スペクトルの測定結果であり、同図の(b)が蛍光スペクトルの測定結果である。これらの結果より、i-P.M.又は市販のP.M.の光吸収特性は同じであること、及び、i-P.M.又は市販のP.M.の蛍光特性も同じであることが分かる。
<In vivo蛍光バイオイメージング>
近赤外(NIR)蛍光を用いた細菌の生体内分布を測定するためにColon26から成るマウス結腸がんモデルマウス(female; 8 weeks; n=3; average weight=19g; average tumor size = 400 mm3; BALB/cCrSIc; Japan SLC)の尾静脈に、R.P.の細菌試料(5×109 CFU/mLの液を200μl, すなわち1×109CFU)もしくはi-R.P.の細菌試料(5×109CFU/mLの液を200μl, すなわち1×109 CFU)あるいは細菌を含まないPBS緩衝液が単回投与された。マウスの体全体の近赤外蛍光像が、イメージングシステム(VISQUE(商標)In Vivo Smart-LF、Vieworks社)を用いて観察された。当該観察のための励起波長及び蛍光波長はそれぞれλex=740-790nm及びλem=810-860 nmであった。また画像解析のために、CleVue(商標)software(Vieworks社)が用いられた。
近赤外(NIR)蛍光を用いた細菌の生体内分布を測定するためにColon26から成るマウス結腸がんモデルマウス(female; 8 weeks; n=3; average weight=19g; average tumor size = 400 mm3; BALB/cCrSIc; Japan SLC)の尾静脈に、R.P.の細菌試料(5×109 CFU/mLの液を200μl, すなわち1×109CFU)もしくはi-R.P.の細菌試料(5×109CFU/mLの液を200μl, すなわち1×109 CFU)あるいは細菌を含まないPBS緩衝液が単回投与された。マウスの体全体の近赤外蛍光像が、イメージングシステム(VISQUE(商標)In Vivo Smart-LF、Vieworks社)を用いて観察された。当該観察のための励起波長及び蛍光波長はそれぞれλex=740-790nm及びλem=810-860 nmであった。また画像解析のために、CleVue(商標)software(Vieworks社)が用いられた。
当該観察の結果が図2Kに示されている。同図に示されている画像は、前記投与の4日後に撮影された画像である。同図に示される画像より、i-R.P.は、R.P.と比べて、より高い腫瘍特異性及びより高い蛍光特性を発現することが分かる。
<データの統計解析>
データ中の±は標準偏差、nは使用したサンプル数を示している。データの統計解析は、Student’s t-testを用いた。*、**、***は、それぞれ< 0.05、< 0.005、< 0.001のp値を示している。
データ中の±は標準偏差、nは使用したサンプル数を示している。データの統計解析は、Student’s t-testを用いた。*、**、***は、それぞれ< 0.05、< 0.005、< 0.001のp値を示している。
<複合細菌と単離された細菌>
上記で述べたとおり「i-R.P.」は、腫瘍から分離されたRhodopseudomonas Palustris及びProteus mirabilisの2種からなる複合細菌である。また、「isp-R.P.」は、腫瘍から分離されたRhodopseudomonas Palustrisだけであり、すなわち腫瘍から単離されたRhodopseudomonas Palustrisである。これらの抗腫瘍活性及び光学特性を評価した。
上記で述べたとおり「i-R.P.」は、腫瘍から分離されたRhodopseudomonas Palustris及びProteus mirabilisの2種からなる複合細菌である。また、「isp-R.P.」は、腫瘍から分離されたRhodopseudomonas Palustrisだけであり、すなわち腫瘍から単離されたRhodopseudomonas Palustrisである。これらの抗腫瘍活性及び光学特性を評価した。
当該評価のために、isp-R.P.の細菌試料及びi-R.P.の細菌試料に加えて、PBS緩衝液及び市販のR.P.の細菌試料も用意された。i-R.P.の細菌試料及びR.P.の細菌試料は、上記で述べたように調製された。isp-R.P.の細菌試料は、i-R.P.の細菌試料と同じ方法により調製された。
上記<In vivo抗がん実験>において記載したように、結腸がんモデルマウスを作成し、固形がん(~400 mm3)が形成されたマウスの尾静脈内に、前記4種のサンプルが同じように単回投与された。そして、投与後の状態が観察されるとともに、上記<In vivo蛍光バイオイメージング> において記載したように前記イメージングシステムを用いて蛍光観察された。
上記<In vivo抗がん実験>において記載したように、結腸がんモデルマウスを作成し、固形がん(~400 mm3)が形成されたマウスの尾静脈内に、前記4種のサンプルが同じように単回投与された。そして、投与後の状態が観察されるとともに、上記<In vivo蛍光バイオイメージング> において記載したように前記イメージングシステムを用いて蛍光観察された。
これら観察結果が図6に示されている。同図には、各サンプルについて、写真及び蛍光観察により得られた画像が示されている。
同図の写真により示されるとおり、i-R.P.及びisp-R.P.のいずれもが、抗腫瘍活性を有する。一方で、市販R.P.については、i-R.P.及びisp-R.P.のような抗腫瘍活性は確認できなかった。また、PBSについても抗腫瘍活性は確認できなかった。
また、同図の蛍光観察画像により示されるとおり、i-R.P.及びisp-R.P.のいずれもが、腫瘍に集まることが確認された。また、i-R.P.及びisp-R.P.のいずれもが、上記で説明した蛍光特性を有することが確認された。一方で、市販R.P.についても蛍光が確認されたが、i-R.P.及びisp-R.P.による蛍光よりも弱かった。また、PBSについては、蛍光は確認できなかった。
同図の写真により示されるとおり、i-R.P.及びisp-R.P.のいずれもが、抗腫瘍活性を有する。一方で、市販R.P.については、i-R.P.及びisp-R.P.のような抗腫瘍活性は確認できなかった。また、PBSについても抗腫瘍活性は確認できなかった。
また、同図の蛍光観察画像により示されるとおり、i-R.P.及びisp-R.P.のいずれもが、腫瘍に集まることが確認された。また、i-R.P.及びisp-R.P.のいずれもが、上記で説明した蛍光特性を有することが確認された。一方で、市販R.P.についても蛍光が確認されたが、i-R.P.及びisp-R.P.による蛍光よりも弱かった。また、PBSについては、蛍光は確認できなかった。
なお、i-R.P.の抗腫瘍活性は、isp-R.P.よりも強かった。また、i-R.P.の蛍光強度は、isp-R.P.よりも強かった。そのため、単離された紅色非硫黄細菌よりも、紅色非硫黄細菌と他の細菌とからなる複合細菌のほうが、抗腫瘍活性の観点において及び光学特性の観点において優れていると考えられる。
また、当該複合細菌の比率についてさらに検証したところ、Rhodopseudomonas PalustrisがProteus mirabilisよりも多く含まれることが好ましく、例えばRhodopseudomonas Palustris及びProteus mirabilisのCFUに基づく構成比率が99:1~55:45であること、特には99:1~60:40であることが、優れた抗腫瘍活性の発揮のために好ましいことが分かった。
また、当該複合細菌の比率についてさらに検証したところ、Rhodopseudomonas PalustrisがProteus mirabilisよりも多く含まれることが好ましく、例えばRhodopseudomonas Palustris及びProteus mirabilisのCFUに基づく構成比率が99:1~55:45であること、特には99:1~60:40であることが、優れた抗腫瘍活性の発揮のために好ましいことが分かった。
<塩基配列解析>
isp-R.P.の16S ribosomal RNA遺伝子の塩基配列解析を行った。当該塩基配列は、以下の配列ID No.1に示されるとおりであった。
isp-R.P.の16S ribosomal RNA遺伝子の塩基配列解析を行った。当該塩基配列は、以下の配列ID No.1に示されるとおりであった。
当該塩基配列は、市販入手可能なR.P.の16S ribosomal RNA遺伝子との相同性が100%であり、配列同一性も100%であった。そのため、少なくとも前記遺伝子の観点において、isp-R.P.は、市販入手可能なR.P.と同一である。
遺伝子の突然変異は、上記で行われた腫瘍からの分離処理及び培地での培養処理においては発生しないと考えられる。そのため、isp-R.P.は、遺伝子においては、市販入手可能なR.P.と同一であると考えられる。
一方で、上記で述べたとおり、isp-R.P.及びi-R.P.の光学特性は、市販入手可能なR.P.と相違するものであり、すなわち吸光スペクトル及び蛍光スペクトルにおいて相違する。市販入手可能なR.P.と異なるisp-R.P.及びi-R.P.の光学特性は、腫瘍から分離されたこと、及び当該分離後に培地内で培養されたことによって獲得されたものと考えられる。例えば、当該光学特性は、当該腫瘍からの分離処理によって(特には当該分離処理及び培地内での培養処理)によって吸光性物質及び蛍光性物質(特には吸光性タンパク質及び蛍光タンパク質)の発現が増加したことによって獲得されたものと考えられる。
一方で、上記で述べたとおり、isp-R.P.及びi-R.P.の光学特性は、市販入手可能なR.P.と相違するものであり、すなわち吸光スペクトル及び蛍光スペクトルにおいて相違する。市販入手可能なR.P.と異なるisp-R.P.及びi-R.P.の光学特性は、腫瘍から分離されたこと、及び当該分離後に培地内で培養されたことによって獲得されたものと考えられる。例えば、当該光学特性は、当該腫瘍からの分離処理によって(特には当該分離処理及び培地内での培養処理)によって吸光性物質及び蛍光性物質(特には吸光性タンパク質及び蛍光タンパク質)の発現が増加したことによって獲得されたものと考えられる。
また、isp-R.P.及びi-R.P.は、当該光学特性を獲得したことに伴い、優れた抗腫瘍活性を獲得したと考えられる。そのため、当該光学特性を有することは、優れた抗腫瘍活性を有することの指標として利用できると考えられる。また、当該光学特性を獲得するために行われた腫瘍からの分離処理(特には前記分離処理及び前記培養処理)は、細菌に抗腫瘍活性を付与するために有用な処理であると考えられる。
i-P.M.の16S rRNA遺伝子配列の解析を行った。当該塩基配列は、以下の配列ID No.2に示されるとおりであった。
当該塩基配列は、市販入手可能なP.M.の16S rRNA遺伝子配列との相同性が99.80%であり、配列同一性も99%であった。そのため、i-P.M.の遺伝子は、市販入手可能なP.M.と、遺伝子の観点においては実質的に同一であると考えられる。
遺伝子の突然変異は、上記で行われた腫瘍からの分離処理及び培地での培養処理においては発生しないと考えられる。そのため、i-P.M.についても、遺伝子においては、市販入手可能なP.M.と同一であると考えられる。
一方で、上記で述べたとおり、i-P.M.は、市販入手可能なP.M.と比べて、優れた抗腫瘍活性を有する。これは、当該腫瘍からの分離処理によって(特には当該分離処理及び培地内での培養処理)によって獲得されたものと考えられる。また、当該優れた抗腫瘍活性光学特性を獲得するために行われた腫瘍からの分離処理(特には前記分離処理及び前記培養処理)は、細菌に抗腫瘍活性を付与するために有用な処理であると考えられる。
一方で、上記で述べたとおり、i-P.M.は、市販入手可能なP.M.と比べて、優れた抗腫瘍活性を有する。これは、当該腫瘍からの分離処理によって(特には当該分離処理及び培地内での培養処理)によって獲得されたものと考えられる。また、当該優れた抗腫瘍活性光学特性を獲得するために行われた腫瘍からの分離処理(特には前記分離処理及び前記培養処理)は、細菌に抗腫瘍活性を付与するために有用な処理であると考えられる。
3.2 腫瘍から分離されたラクトコッカス属細菌及びエンテロコッカス属細菌
<腫瘍内細菌(i-LSとi-EF)の分離と培養>
4週齢のメスの野生型マウス(n=10; average weight = 15g; BALB/cCrSlc)をJapan SLC, Incより購入し、一週間馴化させた。Colon26細胞分散液(1×106cells)(100μL)とculture medium/matrigel(Corning)から成る混合溶液(v/v, 1:1)が、マウス右側面腹部皮下1ヵ所に投与されて、結腸がんモデルマウスが作成された。約2週間後、固形がん(~400mm3)を形成させたマウスから腫瘍が摘出され(図7Aの(a))、当該腫瘍は、メスで細かく切断された後、ペストルを使って4℃の温度下、PBS緩衝液中でホモジナイズされた(同図の(b))。得られた混合物は、20分間、15℃、380 rpm/minの速度で振とうされた。当該振とう後、前記混合物の上澄がPBS緩衝液で10倍希釈されて細菌サンプルが得られた。
当該細菌サンプル(100 μL)が、LB寒天培地上に播種され、7日間嫌気培養された(同図の(c))。当該嫌気培養によって、当該寒天培地上に細菌コロニーが形成された。形成した白色の細菌コロニーをニードルでピックアップし(同図の(d))、LB液体培地中でタングステンランプを照射しながら26-30℃の温度で嫌気培養した(同図の(e))。
このようにして腫瘍から単離及び精製された細菌の培養物を2つ得た。単離及び精製した各細菌を遺伝子同定(株式会社ベックス)した。
これら2つの培養物のうちの一方は、後述の塩基配列解析に示されるとおり、ラクトコッカス属細菌であることが示された。当該培養物中の細菌は、i-LS(intratumoral Lactococcus sp.)と呼ばれる。他方は、後述の塩基配列解析によって、エンテロコッカス属細菌であることが示された。当該培養物中の細菌は、i-EF(intratumoral Enterococcusfaecalis)と呼ばれる。
さらなる実験を行うために、i-LSはPearl Core(商標)E-MC64培地(Eiken Chemical, Tokyo, Japan)で恒温槽(i-CUBE FCI-280HG; AS ONE)を用い32℃で継代培養(嫌気)された。また、i-EFはLB培地中でタングステンランプを照射しながら26-30℃の温度で継代培養(嫌気)された。なお、前記E-MC64培地は、滅菌水1Lにカゼイン製ペプトン(17.0 g)、 ソイペプトン(3.0 g) ブドウ糖(2.5 g)、リン酸二カリウム(2.5 g)、及び塩化ナトリウム(5.0g)を溶解させて得られた培地である。
4週齢のメスの野生型マウス(n=10; average weight = 15g; BALB/cCrSlc)をJapan SLC, Incより購入し、一週間馴化させた。Colon26細胞分散液(1×106cells)(100μL)とculture medium/matrigel(Corning)から成る混合溶液(v/v, 1:1)が、マウス右側面腹部皮下1ヵ所に投与されて、結腸がんモデルマウスが作成された。約2週間後、固形がん(~400mm3)を形成させたマウスから腫瘍が摘出され(図7Aの(a))、当該腫瘍は、メスで細かく切断された後、ペストルを使って4℃の温度下、PBS緩衝液中でホモジナイズされた(同図の(b))。得られた混合物は、20分間、15℃、380 rpm/minの速度で振とうされた。当該振とう後、前記混合物の上澄がPBS緩衝液で10倍希釈されて細菌サンプルが得られた。
当該細菌サンプル(100 μL)が、LB寒天培地上に播種され、7日間嫌気培養された(同図の(c))。当該嫌気培養によって、当該寒天培地上に細菌コロニーが形成された。形成した白色の細菌コロニーをニードルでピックアップし(同図の(d))、LB液体培地中でタングステンランプを照射しながら26-30℃の温度で嫌気培養した(同図の(e))。
このようにして腫瘍から単離及び精製された細菌の培養物を2つ得た。単離及び精製した各細菌を遺伝子同定(株式会社ベックス)した。
これら2つの培養物のうちの一方は、後述の塩基配列解析に示されるとおり、ラクトコッカス属細菌であることが示された。当該培養物中の細菌は、i-LS(intratumoral Lactococcus sp.)と呼ばれる。他方は、後述の塩基配列解析によって、エンテロコッカス属細菌であることが示された。当該培養物中の細菌は、i-EF(intratumoral Enterococcusfaecalis)と呼ばれる。
さらなる実験を行うために、i-LSはPearl Core(商標)E-MC64培地(Eiken Chemical, Tokyo, Japan)で恒温槽(i-CUBE FCI-280HG; AS ONE)を用い32℃で継代培養(嫌気)された。また、i-EFはLB培地中でタングステンランプを照射しながら26-30℃の温度で継代培養(嫌気)された。なお、前記E-MC64培地は、滅菌水1Lにカゼイン製ペプトン(17.0 g)、 ソイペプトン(3.0 g) ブドウ糖(2.5 g)、リン酸二カリウム(2.5 g)、及び塩化ナトリウム(5.0g)を溶解させて得られた培地である。
i-LS の16S ribosomal RNA遺伝子の塩基配列解析を行った。当該塩基配列は、以下の配列ID No.3に示されるとおりであった。i-EFについても16S ribosomal RNA遺伝子の塩基配列解析を行い、その塩基配列は、以下の配列ID No.4に示されるとおりであった。
単離されたi-LSの16S ribosomal RNA遺伝子の塩基配列に対するBasic Local Alignment Search Tool (BLAST)解析により、i-LSはラクトコッカス属の細菌であることが判明した。i-LSは、相同性が97%程度であるLactococcus formosensisなどとは近縁である。また、BLAST解析により16s rRNAの全長配列の類似度 が98.7%以上である細菌種は存在しない。そのため、i-LSは、これまでに知られていないラクトコッカス属細菌であると考えられる。
単離されたi-EFは、市販入手可能なEnterococcus faecalisの16S ribosomal RNA遺伝子との相同性が100%であり、配列同一性も100%であった。そのため、少なくとも前記遺伝子の観点において、i-EFは、市販入手可能なEnterococcus faecalisと同一である。
単離されたi-EFは、市販入手可能なEnterococcus faecalisの16S ribosomal RNA遺伝子との相同性が100%であり、配列同一性も100%であった。そのため、少なくとも前記遺伝子の観点において、i-EFは、市販入手可能なEnterococcus faecalisと同一である。
当該i-LSは、寄託日を令和4年(2022年)8月2日として、受託番号:NITE BP-03694で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NPMD、〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に国際寄託された。
当該i-EFは、寄託日を令和4年(2022年)7月19日として、受託番号:NITE BP-03690で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NPMD、〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に国際寄託された。
当該i-EFは、寄託日を令和4年(2022年)7月19日として、受託番号:NITE BP-03690で、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター(NPMD、〒292-0818千葉県木更津市かずさ鎌足2-5-8 122号室)に国際寄託された。
<In vivo抗がん実験>
4週齢のメスの野生型マウス(n=4; average weight=15g; BALB/cCrSlc)をJapan SLC, Incより購入し、一週間馴化させた。Colon26細胞分散液(1×106cells)(100μL)とculture medium/matrigel(Corning)から成る混合溶液(v/v, 1:1)をマウス側面腹部皮下1ヵ所に投与し、結腸がんモデルマウスを作成した。約10日後、固形がん(~100mm3)を形成させたマウスの尾静脈内にi-LS(1×109CFU/mL)の細菌試料、i-EF(1×109 CFU/mL)の細菌試料、あるいはPBS緩衝液が、各200μL投与された。マウスの行動や性状、固形がんサイズ測定、マウス体重の推移は、毎日実施された。なお、固形がんのサイズは下式により算出した。
V=L×W2/2
当該式において、Vは固形がん体積、Lは固形がんの長さ、Wは固形がんの幅をそれぞれ示している。
4週齢のメスの野生型マウス(n=4; average weight=15g; BALB/cCrSlc)をJapan SLC, Incより購入し、一週間馴化させた。Colon26細胞分散液(1×106cells)(100μL)とculture medium/matrigel(Corning)から成る混合溶液(v/v, 1:1)をマウス側面腹部皮下1ヵ所に投与し、結腸がんモデルマウスを作成した。約10日後、固形がん(~100mm3)を形成させたマウスの尾静脈内にi-LS(1×109CFU/mL)の細菌試料、i-EF(1×109 CFU/mL)の細菌試料、あるいはPBS緩衝液が、各200μL投与された。マウスの行動や性状、固形がんサイズ測定、マウス体重の推移は、毎日実施された。なお、固形がんのサイズは下式により算出した。
V=L×W2/2
当該式において、Vは固形がん体積、Lは固形がんの長さ、Wは固形がんの幅をそれぞれ示している。
また、マウスに投与された上記2種の細菌試料の調製方法は、以下のとおりであった。
i-LSが、Pearl Core(商標)E-MC64液体培地中で恒温槽(i-CUBE FCI-280HG; AS ONE)を用い32℃で3日間嫌気培養された。当該嫌気培養によって得られた培養液が、3000rpmで5分間遠心された。当該遠心によって沈殿した細菌が、新鮮E-MC64液体培地に懸濁されて懸濁液が得られた。当該懸濁液中の細菌の数が、微生物カウンター(パナソニック、型番NP-BCM01-A)を用いて測定され、そして、測定結果に基づき、所定の細菌濃度となるように、新鮮E-MC64液体培地が当該懸濁液に適宜添加されて、i-LSの細菌試料が得られた。
i-EFの細菌試料は、前記i-LSの細菌試料と同じ方法によって得られた。すなわち、i-EFのLB液体培地中での嫌気培養、当該嫌気培養により得られた培養液の遠心、当該遠心により得られた沈殿を用いた懸濁液の調整、そして、当該懸濁液中の細菌の濃度の調整によってi-EFの細菌試料が得られた。
i-LSが、Pearl Core(商標)E-MC64液体培地中で恒温槽(i-CUBE FCI-280HG; AS ONE)を用い32℃で3日間嫌気培養された。当該嫌気培養によって得られた培養液が、3000rpmで5分間遠心された。当該遠心によって沈殿した細菌が、新鮮E-MC64液体培地に懸濁されて懸濁液が得られた。当該懸濁液中の細菌の数が、微生物カウンター(パナソニック、型番NP-BCM01-A)を用いて測定され、そして、測定結果に基づき、所定の細菌濃度となるように、新鮮E-MC64液体培地が当該懸濁液に適宜添加されて、i-LSの細菌試料が得られた。
i-EFの細菌試料は、前記i-LSの細菌試料と同じ方法によって得られた。すなわち、i-EFのLB液体培地中での嫌気培養、当該嫌気培養により得られた培養液の遠心、当該遠心により得られた沈殿を用いた懸濁液の調整、そして、当該懸濁液中の細菌の濃度の調整によってi-EFの細菌試料が得られた。
図7Cに、各種細菌の抗腫瘍活性の評価結果が示されている(N=4)。同図は、各群の固形がん体積の推移を示すものである。PBSが投与された場合は、固形がんの体積は増加している。一方で、i-LS又はi-EFが投与された場合は、固形がんの体積は減少し、投与後4~5日で、当該体積は0になった。
また、i-EFが投与された場合は、投与後7日以降において、固形がんの体積がやや増加したが、i-LSが投与された場合は、投与後7日以降においても、固形がんの体積は0のままであった。
また、i-EFが投与された場合は、投与後7日以降において、固形がんの体積がやや増加したが、i-LSが投与された場合は、投与後7日以降においても、固形がんの体積は0のままであった。
これらの結果より、腫瘍から分離された細菌が抗腫瘍活性を示すことが分かる。
また、腫瘍から分離されることで抗腫瘍活性を示すようになる細菌は、上記3.1で述べた紅色非硫黄細菌(ロドシュードモナス属細菌)及びプロテウス属細菌だけに限られるものでないことも分かる。すなわち、本例において用いたラクトコッカス属細菌及びエンテロコッカス属細菌などの他の腫瘍内に存在する細菌も、腫瘍から分離されることで抗腫瘍活性を示すようになることが確認された。
また、腫瘍から分離されることで抗腫瘍活性を示すようになる細菌は、上記3.1で述べた紅色非硫黄細菌(ロドシュードモナス属細菌)及びプロテウス属細菌だけに限られるものでないことも分かる。すなわち、本例において用いたラクトコッカス属細菌及びエンテロコッカス属細菌などの他の腫瘍内に存在する細菌も、腫瘍から分離されることで抗腫瘍活性を示すようになることが確認された。
また、腫瘍内に存在する細菌を腫瘍から分離すること(特には腫瘍内に存在する細菌を腫瘍から分離し、そして、分離された当該細菌を培地中で培養すること)が、抗腫瘍活性を有する細菌を製造するために有用な手法であることも分かる。すなわち、本開示は、抗腫瘍活性を有する細菌の製造方法も提供する。当該製造方法は、上記のように、腫瘍内に存在する細菌を腫瘍から分離する分離工程を含んでよい。より好ましくは、当該製造方法は、当該分離工程に加え、当該分離工程において分離された細菌を培地中で培養する培養工程をさらに含んでよい。
3.3 腫瘍から分離されたアシネトバクター属細菌、バチルス属細菌、及びキューティバクテリウム属細菌
<腫瘍内アシネトバクター属細菌の分離と培養>
がんの種類及び細菌培養培地が異なること以外は、上記3.2において説明した方法と同様に、腫瘍内細菌の分離及び培養が行われた。
すなわち、4週齢のメスの野生型マウス(n=10; average weight = 15g; BALB/cCrSlc)をJapan SLC, Incより購入し、一週間馴化させた。EMT-6/AR1細胞分散液(1×106cells)(100μL)とculture medium/matrigel(Corning)から成る混合溶液(v/v, 1:1)が、マウス右側面腹部皮下1ヵ所に投与されて、乳がんモデルマウスが作成された。約2週間後、固形がん(~400mm3)を形成させたマウスから腫瘍が摘出され、当該腫瘍は、メスで細かく切断された後、ペストルを使って4℃の温度下、PBS緩衝液中でホモジナイズされた。得られた混合物は、20分間、15℃、380 rpm/minの速度で振とうされた。当該振とう後、前記混合物の上澄がPBS緩衝液で10倍希釈されて細菌サンプルが得られた。
当該細菌サンプル(100 μL)が、LB寒天培地上に播種され、7日間嫌気培養された。当該嫌気培養によって、当該寒天培地上に細菌コロニーが形成された。形成した白色の細菌コロニーをニードルでピックアップし、LB液体培地中でタングステンランプを照射しながら26-30℃の温度で嫌気培養した。
このようにして腫瘍から単離及び精製された細菌の培養物を1つ得た。単離及び精製した細菌を遺伝子同定(株式会社ベックス)した。
当該細菌は、塩基配列解析によって、アシネトバクター属細菌(特にはAcinetobacterradioresistens、以下「i-AR」ともいう)であることが示された。
さらなる実験を行うために、i-ARはLB培地中でタングステンランプを照射しながら26-30℃の温度で継代培養(嫌気)された。
がんの種類及び細菌培養培地が異なること以外は、上記3.2において説明した方法と同様に、腫瘍内細菌の分離及び培養が行われた。
すなわち、4週齢のメスの野生型マウス(n=10; average weight = 15g; BALB/cCrSlc)をJapan SLC, Incより購入し、一週間馴化させた。EMT-6/AR1細胞分散液(1×106cells)(100μL)とculture medium/matrigel(Corning)から成る混合溶液(v/v, 1:1)が、マウス右側面腹部皮下1ヵ所に投与されて、乳がんモデルマウスが作成された。約2週間後、固形がん(~400mm3)を形成させたマウスから腫瘍が摘出され、当該腫瘍は、メスで細かく切断された後、ペストルを使って4℃の温度下、PBS緩衝液中でホモジナイズされた。得られた混合物は、20分間、15℃、380 rpm/minの速度で振とうされた。当該振とう後、前記混合物の上澄がPBS緩衝液で10倍希釈されて細菌サンプルが得られた。
当該細菌サンプル(100 μL)が、LB寒天培地上に播種され、7日間嫌気培養された。当該嫌気培養によって、当該寒天培地上に細菌コロニーが形成された。形成した白色の細菌コロニーをニードルでピックアップし、LB液体培地中でタングステンランプを照射しながら26-30℃の温度で嫌気培養した。
このようにして腫瘍から単離及び精製された細菌の培養物を1つ得た。単離及び精製した細菌を遺伝子同定(株式会社ベックス)した。
当該細菌は、塩基配列解析によって、アシネトバクター属細菌(特にはAcinetobacterradioresistens、以下「i-AR」ともいう)であることが示された。
さらなる実験を行うために、i-ARはLB培地中でタングステンランプを照射しながら26-30℃の温度で継代培養(嫌気)された。
<腫瘍内バチルス属細菌及び腫瘍内キューティバクテリウム属細菌の分離と培養>
がんの種類及び細菌培養培地が異なること以外は、上記3.2において説明した方法と同様に、腫瘍内細菌の分離及び培養が行われた。
すなわち、4週齢のメスの野生型マウス(n=10; average weight = 15g; BALB/cCrSlc)をJapan SLC, Incより購入し、一週間馴化させた。サルコーマ細胞分散液(1×106cells)(100μL)とculture medium/matrigel(Corning)から成る混合溶液(v/v, 1:1)が、マウス右側面腹部皮下1ヵ所に投与されて、サルコーマモデルマウスが作成された。約2週間後、固形がん(~400mm3)を形成させたマウスから腫瘍が摘出され、当該腫瘍は、メスで細かく切断された後、ペストルを使って4℃の温度下、PBS緩衝液中でホモジナイズされた。得られた混合物は、20分間、15℃、380 rpm/minの速度で振とうされた。当該振とう後、前記混合物の上澄がPBS緩衝液で10倍希釈されて細菌サンプルが得られた。
当該細菌サンプル(100 μL)が、Pearl Core(商標)寒天培地上に播種され、7日間嫌気培養された。当該嫌気培養によって、当該寒天培地上に細菌コロニーが形成された。形成した白色の細菌コロニーをニードルでピックアップし、Pearl Core(商標)液体培地中でタングステンランプを照射しながら26-30℃の温度で嫌気培養した。
このようにして腫瘍から単離及び精製された細菌の培養物を2つ得た。単離及び精製した細菌を遺伝子同定(株式会社ベックス)した。
当該細菌は、塩基配列解析によって、バチルス属細菌(特にはBacillusthuringiensis、以下「i-BT」ともいう)及びキューティバクテリウム属細菌(特にはCutibacteriumacnes、以下「i-CA」ともいう)であることが示された。
さらなる実験を行うために、i-BT及びi-CAはそれぞれ、Pearl Core(商標)液体培地中でタングステンランプを照射しながら26-30℃の温度で継代培養(嫌気)された。
がんの種類及び細菌培養培地が異なること以外は、上記3.2において説明した方法と同様に、腫瘍内細菌の分離及び培養が行われた。
すなわち、4週齢のメスの野生型マウス(n=10; average weight = 15g; BALB/cCrSlc)をJapan SLC, Incより購入し、一週間馴化させた。サルコーマ細胞分散液(1×106cells)(100μL)とculture medium/matrigel(Corning)から成る混合溶液(v/v, 1:1)が、マウス右側面腹部皮下1ヵ所に投与されて、サルコーマモデルマウスが作成された。約2週間後、固形がん(~400mm3)を形成させたマウスから腫瘍が摘出され、当該腫瘍は、メスで細かく切断された後、ペストルを使って4℃の温度下、PBS緩衝液中でホモジナイズされた。得られた混合物は、20分間、15℃、380 rpm/minの速度で振とうされた。当該振とう後、前記混合物の上澄がPBS緩衝液で10倍希釈されて細菌サンプルが得られた。
当該細菌サンプル(100 μL)が、Pearl Core(商標)寒天培地上に播種され、7日間嫌気培養された。当該嫌気培養によって、当該寒天培地上に細菌コロニーが形成された。形成した白色の細菌コロニーをニードルでピックアップし、Pearl Core(商標)液体培地中でタングステンランプを照射しながら26-30℃の温度で嫌気培養した。
このようにして腫瘍から単離及び精製された細菌の培養物を2つ得た。単離及び精製した細菌を遺伝子同定(株式会社ベックス)した。
当該細菌は、塩基配列解析によって、バチルス属細菌(特にはBacillusthuringiensis、以下「i-BT」ともいう)及びキューティバクテリウム属細菌(特にはCutibacteriumacnes、以下「i-CA」ともいう)であることが示された。
さらなる実験を行うために、i-BT及びi-CAはそれぞれ、Pearl Core(商標)液体培地中でタングステンランプを照射しながら26-30℃の温度で継代培養(嫌気)された。
<In vivo抗がん実験>
4週齢のメスの野生型マウス(n=3or4; average weight=15g; BALB/cCrSlc)をJapan SLC, Incより購入し、一週間馴化させた。Colon26細胞分散液(1×106 cells)(100μL)とculture medium/matrigel(Corning)から成る混合溶液(v/v, 1:1)をマウス側面腹部皮下1ヵ所に投与し、結腸がんモデルマウスを作成した。約10日後、固形がん(~100mm3)を形成させたマウスの尾静脈内にi-AR(1×107 CFU/mL、2×106 CFU/head)の細菌試料、i-BT(1×109 CFU/mL、2×108CFU/head)の細菌試料、i-CA(1×109CFU/mL、2×108 CFU/head)の細菌試料、あるいはPBS緩衝液が、各200μL投与された。すなわち、各細菌溶液が単回投与された。マウスの行動や性状、固形がんサイズ測定、マウス体重の推移は、毎日実施された。なお、固形がんのサイズは下式により算出した。
V=L×W2/2
当該式において、Vは固形がん体積、Lは固形がんの長さ、Wは固形がんの幅をそれぞれ示している。
4週齢のメスの野生型マウス(n=3or4; average weight=15g; BALB/cCrSlc)をJapan SLC, Incより購入し、一週間馴化させた。Colon26細胞分散液(1×106 cells)(100μL)とculture medium/matrigel(Corning)から成る混合溶液(v/v, 1:1)をマウス側面腹部皮下1ヵ所に投与し、結腸がんモデルマウスを作成した。約10日後、固形がん(~100mm3)を形成させたマウスの尾静脈内にi-AR(1×107 CFU/mL、2×106 CFU/head)の細菌試料、i-BT(1×109 CFU/mL、2×108CFU/head)の細菌試料、i-CA(1×109CFU/mL、2×108 CFU/head)の細菌試料、あるいはPBS緩衝液が、各200μL投与された。すなわち、各細菌溶液が単回投与された。マウスの行動や性状、固形がんサイズ測定、マウス体重の推移は、毎日実施された。なお、固形がんのサイズは下式により算出した。
V=L×W2/2
当該式において、Vは固形がん体積、Lは固形がんの長さ、Wは固形がんの幅をそれぞれ示している。
また、マウスに投与された上記3種の細菌試料は、上記3.2において述べたi-LSの細菌試料と同様に調製された。
すなわち、i-ARの細菌試料に関しては、i-ARのLB液体培地中での嫌気培養、当該嫌気培養により得られた培養液の遠心、当該遠心により得られた沈殿を用いた懸濁液の調整、そして、当該懸濁液中の細菌の濃度の調整によってi-ARの細菌試料が得られた。
i-BT及びi-CAの細菌試料に関しては、i-BT又はi-CAのPearl Core(商標)液体培地中での嫌気培養、当該嫌気培養により得られた培養液の遠心、当該遠心により得られた沈殿を用いた懸濁液の調整、そして、当該懸濁液中の細菌の濃度の調整によってi-BTの細菌試料及びi-CAの細菌試料がそれぞれ得られた。
すなわち、i-ARの細菌試料に関しては、i-ARのLB液体培地中での嫌気培養、当該嫌気培養により得られた培養液の遠心、当該遠心により得られた沈殿を用いた懸濁液の調整、そして、当該懸濁液中の細菌の濃度の調整によってi-ARの細菌試料が得られた。
i-BT及びi-CAの細菌試料に関しては、i-BT又はi-CAのPearl Core(商標)液体培地中での嫌気培養、当該嫌気培養により得られた培養液の遠心、当該遠心により得られた沈殿を用いた懸濁液の調整、そして、当該懸濁液中の細菌の濃度の調整によってi-BTの細菌試料及びi-CAの細菌試料がそれぞれ得られた。
図8Aに、各種細菌の抗腫瘍活性の評価結果が示されている(N=3or4)。同図は、各群の固形がん体積の推移を示すものである。PBSが投与された場合は、固形がんの体積は増加している。一方で、i-AR、i-BT、又はi-CAが投与された場合は、PBSが投与された場合と比べて、固形がんの体積増加が抑制されている。特にi-CAは、i-AR及びi-BTと比べても、より長い期間にわたって、固形がんの体積増加を抑制している。
図8Bに、各細菌投与後40日間のマウス生存率が示されている。この結果より、PBSが投与された場合と比べて、i-AR、i-BT、又はi-CAが投与された場合は、より長く生存率が高い状態が維持されることが分かる。
図8Cに、各処置後のマウスの体重の推移が示されている。同図に示される結果より、の矢印は、PBSもしくは細菌が投与されたタイミングを示している。無処置マウスは経時的に体重増加が観察できるが、PBS投与群は10日あたりから顕著な体重減少が認められる。細菌投与群はいずれも投与の翌日にわずかな体重の減少が見られるが、その後は健常な体重増加が認められる。
これらの結果より、腫瘍から分離された細菌が抗腫瘍活性を示すことが分かる。
また、腫瘍から分離されることで抗腫瘍活性を示すようになる細菌は、上記3.1及び3.2で用いられた細菌に限られない。本例において用いられた属の細菌なども含め、腫瘍内に存在する細菌は、腫瘍から分離されることで抗腫瘍活性を示すようになることが分かる。
また、腫瘍から分離されることで抗腫瘍活性を示すようになる細菌は、上記3.1及び3.2で用いられた細菌に限られない。本例において用いられた属の細菌なども含め、腫瘍内に存在する細菌は、腫瘍から分離されることで抗腫瘍活性を示すようになることが分かる。
また、本例により、腫瘍内に存在する細菌を腫瘍から分離すること(特には腫瘍内に存在する細菌を腫瘍から分離し、そして、分離された当該細菌を培地中で培養すること)が、抗腫瘍活性を有する細菌を製造するために有用な手法であることも確認できる。
なお、本発明は、以下の使用、物、及び方法も提供する。これらの使用、物、及び方法における「抗腫瘍剤」及び「腫瘍から分離された細菌」などの各構成要素については、以上で説明したとおりであり、その説明がこれらの使用、物、及び方法についてもあてはまる。
[1]抗腫瘍剤の製造のための、腫瘍から分離された細菌の使用。
[2]抗腫瘍剤の製造のために用いられる、腫瘍から分離された細菌。
[3]腫瘍から分離された細菌を投与することを含む、腫瘍の処置方法。
[1]抗腫瘍剤の製造のための、腫瘍から分離された細菌の使用。
[2]抗腫瘍剤の製造のために用いられる、腫瘍から分離された細菌。
[3]腫瘍から分離された細菌を投与することを含む、腫瘍の処置方法。
Proteus mirabilis(Super Bac): NITE BP-03626
Rhodopseudomonas PalustrisとProteus mirabilisとの複合細菌(Musashi): NITE BP-03627
i-LS(Super Lacto):NITE BP-03694
i-EF(Super Entero):NITE BP-03690
Rhodopseudomonas PalustrisとProteus mirabilisとの複合細菌(Musashi): NITE BP-03627
i-LS(Super Lacto):NITE BP-03694
i-EF(Super Entero):NITE BP-03690
Claims (10)
- 腫瘍から分離された細菌を含む抗腫瘍剤。
- 前記細菌は、プロテウス属の細菌、ラクトコッカス属の細菌、エンテロコッカス属の細菌、アシネトバクター属の細菌、バチルス属の細菌、又はキューティバクテリウム属の細菌である、請求項1に記載の抗腫瘍剤。
- 前記抗腫瘍剤は、非経口投与されるものである、請求項1又は2に記載の抗腫瘍剤。
- 前記抗腫瘍剤に含まれる細菌は、免疫細胞賦活化特性を有する、請求項1又は2に記載の抗腫瘍剤。
- 前記抗腫瘍剤に含まれる細菌は、腫瘍内における抗腫瘍バイオマーカー発現を増強する発現増強特性を有する、請求項1又は2に記載の抗腫瘍剤。
- 前記細菌が1×108CFUの量でマウス尾部静脈から単回投与された場合において、当該投与後40日間のマウス生存率が90%以上である、請求項1又は2に記載の抗腫瘍剤。
- 腫瘍から分離された、抗腫瘍活性を有する細菌。
- 前記細菌は、プロテウス属細菌、ラクトコッカス属細菌、エンテロコッカス属細菌、アシネトバクター属細菌、バチルス属細菌、又はキューティバクテリウム属細菌である、請求項7に記載の細菌。
- 当該細菌が1×108CFUの量でマウス尾部静脈から単回投与された場合において、当該投与後40日間のマウス生存率が90%以上である、請求項7又は8に記載の細菌。
- 腫瘍から細菌を分離する分離工程、及び
前記分離工程において分離された細菌を培地で培養する培養工程、
を含む、
抗腫瘍活性を有する細菌の製造方法。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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WO2016079733A1 (en) * | 2014-11-18 | 2016-05-26 | Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. | Method for early diagnosis of cancer |
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2023
- 2023-05-08 WO PCT/JP2023/017325 patent/WO2023223870A1/ja unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2016079733A1 (en) * | 2014-11-18 | 2016-05-26 | Tel Hashomer Medical Research Infrastructure And Services Ltd. | Method for early diagnosis of cancer |
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Title |
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