WO2023210908A1 - T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측 방법 - Google Patents

T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측 방법 Download PDF

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    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Definitions

  • the present invention provides a method for predicting the effectiveness of glioblastoma treatment effect by T cells; Composition for predicting the effectiveness of glioblastoma treatment effect by T cells; and a kit for predicting the effectiveness of glioblastoma treatment effect comprising the same.
  • Glioblastoma is a type of glioma and is known to be the most common and severe type of tumor that occurs in the brain (Journal of Neuro-Oncology, 108(1):11 ⁇ 27). Symptoms of glioblastoma include headaches, personality changes, or nausea, and as symptoms worsen, unconsciousness may occur. Glioblastoma is a representative tumor that is difficult to overcome. The median age of the disease is about 12 to 15 months, and only about 3 to 5% of patients survive for more than 5 years.
  • glioblastoma The cause of glioblastoma is not well known, but rare causes include neurofibromatosis or Li-Fraumeni syndrome, and exposure to radiation is also mentioned as a cause.
  • Glioblastoma accounts for 15% of all brain tumors and is diagnosed through imaging tests such as CT and MRI and surgical biopsy.
  • Treatment of glioblastoma consists of surgery, standard chemotherapy and radiation treatment (temozolomide-radiation combination treatment), and standard chemotherapy. Depending on the patient's condition and detailed diagnosis, additional surgery, chemotherapy, or radiation treatment may be considered.
  • Patent Document 1 Korean Patent No. 10-1692044
  • the purpose of the present invention is to provide a method for predicting the effectiveness of glioblastoma treatment by T cells, which includes measuring the expression level of the PVR (poliovirus receptor) protein or the gene encoding it from a biological sample.
  • PVR poliovirus receptor
  • Another object of the present invention is to provide a composition for predicting the effectiveness of glioblastoma treatment by T cells, which includes an agent that measures the expression level of the PVR (poliovirus receptor) protein or the gene encoding it.
  • PVR poliovirus receptor
  • Another object of the present invention is to provide a kit for predicting the effectiveness of the glioblastoma treatment effect by T cells, including the composition for predicting the effectiveness of the effect of the treatment of glioblastoma by T cells.
  • the present invention provides a method for predicting the effectiveness of glioblastoma treatment by T cells, which includes measuring the expression level of the PVR (poliovirus receptor) protein or the gene encoding it from a biological sample.
  • PVR poliovirus receptor
  • the present invention provides a composition for predicting the effectiveness of glioblastoma treatment by T cells, which includes an agent for measuring the expression level of the PVR (poliovirus receptor) protein or the gene encoding it.
  • PVR poliovirus receptor
  • the present invention provides a kit for predicting the effectiveness of the glioblastoma treatment effect by T cells, including the composition for predicting the effectiveness of the effect of the treatment of glioblastoma by T cells.
  • the present invention provides a method for predicting and treating the effectiveness of glioblastoma treatment using the above method.
  • the present invention provides a method of measuring the expression level of the PVR (poliovirus receptor) protein or the gene encoding it from a biological sample isolated from a glioblastoma patient and administering T cells if the expression level is higher than that of the normal control group. Provides a method of treating blastoma.
  • PVR poliovirus receptor
  • the method according to the present invention measures the expression level of the PVR (poliovirus receptor) protein or the gene encoding it, and when the expression level of the protein or the gene encoding it is higher than the control group, treatment with T cells It can be predicted that the effect may be effective, so it can be useful in personalized treatment of glioblastoma.
  • PVR poliovirus receptor
  • Figure 1 shows the results of measuring the expression levels (expression %) of MICA, ULBP, PVR, and Nectin in patient-derived glioblastoma cell lines using flow cytometry.
  • Figure 2 shows the results of measuring the degree of lysis (specific lysis %) after treating patient-derived glioblastoma cell lines with ⁇ T cells at a ratio of 20:1 and co-culturing them for 4 hours.
  • Figure 3 shows the results of analyzing the correlation between the degree of lysis (specific lysis %) and the expression level (expression %) of MICA, ULBP, PVR, and Nectin in patient-derived glioblastoma cell lines.
  • Figure 4 shows the results of ROC curve analysis.
  • the present invention provides a method for predicting the effectiveness of glioblastoma treatment by T cells, which includes measuring the expression level of the PVR (poliovirus receptor) protein or the gene encoding it from a biological sample.
  • PVR poliovirus receptor
  • PVR poliovirus receptor protein
  • CD155 cluster of differentiation 155
  • DNAM DNAM It is known to be one of the major ligands for the -1 receptor.
  • the biological sample may be selected from the group consisting of tissue, cells, blood, plasma, and serum, the tissue may be a tumor tissue, and the tumor tissue may be resected from a glioblastoma patient.
  • the biological sample may be a tumor tissue resected from a glioblastoma patient, and more preferably, it may be a glioblastoma cell line isolated from a tumor tissue resected from a glioblastoma patient.
  • the measurement is RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction), competitive RT-PCR, real-time quantitative RT-PCR, RNase protection method, northern blot, and DNA chip. It may be performed by a method selected from the group consisting of DNA chip technology assay (DNA chip technology assay), ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), western blot, immunoblot, and immunohistochemistry. It is not limited to this.
  • the step of comparing the measured expression level with a control group may be further included.
  • the control group at this time may mean normal people without glioblastoma.
  • the method may further include predicting or determining that the effect of treating glioblastoma by T cells will be effective.
  • the T cells may be ⁇ T cells (gamma delta T cells), but are not limited thereto.
  • the present invention provides a composition for predicting the effectiveness of glioblastoma treatment by T cells, which includes an agent for measuring the expression level of the PVR (poliovirus receptor) protein or the gene encoding it.
  • PVR poliovirus receptor
  • the agent may be selected from the group consisting of primers, probes, aptamers, and antibodies specific for PVR (poliovirus receptor), but is not limited thereto.
  • primer refers to a base sequence having a short free 3' hydroxyl group, capable of forming base pairs with a complementary template, and serving as a starting point for copying the template strand. It refers to a short base sequence that acts. Primers can initiate DNA synthesis in the presence of four different nucleoside triphosphates and a reagent for polymerization (i.e., DNA polymerase or reverse transcriptase) in an appropriate buffer solution and temperature. PCR conditions and lengths of sense and antisense primers can be appropriately selected according to techniques known in the art.
  • probe in the present invention refers to a nucleic acid fragment such as RNA or DNA that can specifically bind to a gene, and is labeled so that the presence or absence and expression level of a specific gene can be confirmed. Probes may be manufactured in the form of oligonucleotide probes, single strand DNA probes, double strand DNA probes, RNA probes, etc. Selection of appropriate probes and hybridization conditions can be appropriately selected according to techniques known in the art.
  • the primer or probe of the present invention can be chemically synthesized using phosphoramidite solid support synthesis or other well-known methods. These base sequences can also be modified through various methods known in the art. Examples of such modifications include methylation, capping, substitution of a native nucleotide with one or more homologs, and modifications between nucleotides, such as uncharged linkages (e.g., methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates, carbamates, etc.) ) or variations to charged linkages (e.g. phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.).
  • uncharged linkages e.g., methyl phosphonates, phosphotriesters, phosphoroamidates, carbamates, etc.
  • variations to charged linkages e.g. phosphorothioate, phosphorodithioate, etc.
  • aptamer in the present invention refers to an oligonucleotide or peptide molecule that specifically binds to a target molecule.
  • an oligonucleotide library called SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment) is used. By using evolutionary methods, oligomers that bind to specific chemical or biological molecules with high affinity and selectivity can be separated and obtained.
  • antibody in the present invention refers to a substance that reacts when an antigen, a foreign substance, invades while circulating in the blood or lymph in the body's immune system. It is a globulin-based protein formed in lymphoid tissue and is also called immunoglobulin. Antibodies are produced by B cells and bind specifically to antigens. One antibody molecule has two heavy chains and two light chains, and each heavy chain and light chain each contain a variable region at the N-terminus. Each variable region is composed of three complementarity determining regions (CDRs) and four framework regions (FRs). The complementarity determining regions determine the antigen-binding specificity of the antibody and determine the structure of the variable region. It exists as a relatively short peptide sequence held in forming sites.
  • CDRs complementarity determining regions
  • FRs framework regions
  • the expression level of the PVR (poliovirus receptor) protein or the gene encoding it may be measured in a glioblastoma cell line isolated from tumor tissue resected from a glioblastoma patient.
  • the present invention provides a kit for predicting the effectiveness of the glioblastoma treatment effect by T cells, including a composition for predicting the effectiveness of the glioblastoma treatment effect by T cells.
  • the kit may be selected from the group consisting of microarray, gene amplification kit, immunoassay kit, protein microarray kit, and ELISA kit.
  • the present invention includes the steps of (a) measuring the expression level of a PVR (poliovirus receptor) protein or a gene encoding it from a biological sample isolated from a patient; (b) comparing the measured expression level with a normal control group;
  • biological samples, tissues, measurement methods, and T cells can be applied in the same manner as described above, so their description is omitted.
  • the present invention provides a method of measuring the expression level of the PVR (poliovirus receptor) protein or the gene encoding it from a biological sample isolated from a glioblastoma patient and administering T cells if the expression level is higher than that of the normal control group. Provides a method of treating blastoma.
  • PVR poliovirus receptor
  • glioblastoma treatment method biological samples, tissues, measurement methods, and T cells can be applied in the same manner as described above, so their description is omitted.
  • Example 1 Preparation and culture of patient-derived glioblastoma cell lines
  • glioblastoma cell lines were isolated from the tumor tissues. Briefly, glioblastoma tissue isolated from the patient was washed with cold phosphate buffer saline (PBS), and after washing, 1% Glutamax (Gibco), 1% Penicillin/streptomycin (Gibco), and 2.5 ⁇ g/ml of amphotericin B (Gibco) were added. The tissue was cut into small pieces of 0.5 to 1 mm in size with surgical scissors while applying cold Hibernate-A medium containing this.
  • PBS cold phosphate buffer saline
  • the cut tumor tissue pieces were collected in a conical tube, washed three times with room temperature PBS, and then applied with RBC (red blood cell) lysis buffer for 5-10 minutes. Afterwards, only the patient-derived glioblastoma cell line was isolated by centrifugation.
  • RBC red blood cell
  • ⁇ T cells were obtained from peripheral blood from normal individuals or glioblastoma patients. Briefly, peripheral blood was added onto Ficoll-Hypaque at a ratio of 1:1 and then centrifuged at 2500 rpm for 20 minutes. Afterwards, peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in the buffy coat layer were collected and washed with RPMI medium. Washing was performed four times, at 1800 rpm for 15 minutes, 1600 rpm for 10 minutes, 1400 rpm for 5 minutes, and 1400 rpm for 5 minutes, respectively. Afterwards, the separated PBMCs were suspended in freezing media, placed in a freezing bottle containing isopropyl alcohol, stored in a -80°C freezer for 16 hours, and then stored in a liquid nitrogen tank.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the stored PBMCs were quickly dissolved in a 37°C bath, suspended in RPMI containing 10% FBS, and washed. Washed PBMCs were treated with 5 ⁇ M zoledronic acid and 1000 U/mL IL-2, and then dispensed into 24 well-plates. On the 3rd day, 1000 U/mL of IL-2 was additionally treated, and on the 7th day, the cells were harvested and washed. Afterwards, the cells were treated with 1000 U/mL of IL-2 and cultured, or K562 cells expressing CD32, CD80, CD83, 4-1BBL, CD40L, and CD70 as artificial antigen-presenting cells were irradiated (100 Gy) and co-cultured. . The cultured ⁇ T cells were harvested on day 14 or on day 21 by repeating the same process once more, suspended in freezing media, frozen using a CRF (controlled-rate-freezer), and stored in liquid nitrogen until the experiment.
  • CRF controlled-rate-freezer
  • the present inventors performed an experiment to evaluate the effectiveness of glioblastoma treatment effect by T cells.
  • ligands such as MICA (MHC class I polypeptide-related sequence A), ULBP (UL16 binding protein 1), PVR (Poliovirus receptor, CD155), and Nectin in patient-derived glioblastoma cell lines was measured using flow cytometry.
  • the patient-derived glioblastoma cell line was labeled with Calcein-AM, and the patient-derived glioblastoma cell line labeled with Calcein-AM was treated with ⁇ T cells at an E(effector):T(target) ratio of 20:1. Co-cultured for 4 hours.
  • the degree of degradation by T cells was low in cell lines 5 and 8, the degree of degradation by T cells was low in cell lines 7 and 9, and the degree of degradation was about 20-30% in cell lines 7 and 9, and in the remaining cell lines, the degree of degradation by T cells was low.
  • the degree of degradation by T cells was low.
  • the correlation between the expression level (expression %) of MICA, ULBP, PVR, and Nectin and the degree of lysis by T cells (specific lysis %) was analyzed.
  • the correlation between PVR expression and the degree of degradation by T cells was found to be significant.
  • the degree of degradation by T cells is high, and it was confirmed that the effectiveness of treatment by T cells can be predicted or evaluated by measuring the PVR expression level.
  • the expression of the remaining MICA, ULBP, and Nectin was not related to the degree of degradation by T cells.
  • the present inventors performed ROC curve analysis to evaluate the accuracy of predicting the effectiveness of glioblastoma treatment effect by T cells from the presence or absence of PVR expression. As a result, sensitivity of 71.4% and specificity of 100% were confirmed in more than 89.2% of patient-derived glioblastoma cell lines expressing PVR ( Figure 4).
  • the present invention can predict or determine whether the therapeutic effect by T cells is effective in the treatment of glioblastoma by measuring the expression level of the PVR protein or the gene encoding it in the patient-derived glioblastoma cell line. was confirmed.

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Abstract

본 발명은 생물학적 시료로부터 PVR(poliovirus receptor) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측 방법에 관한 것으로서, 교모세포종의 치료에 있어 PVR(poliovirus receptor) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함으로써 T 세포에 의한 치료 효과의 유효성을 예측할 수 있어, 개인 맞춤형 교모세포종의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측 방법
본 발명은 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측 방법; T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측용 조성물; 및 이를 포함하는 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측용 키트에 관한 것이다.
한편, 본 출원은 하기 국가연구개발사업에 의해 지원받았다.
[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]
[과제고유번호] 1345352191
[과제번호] 2021R1I1A1A01055575
[부처명] 교육부
[과제관리(전문)기관명] 한국연구재단
[연구사업명] 이공학학술연구기반구축
[연구과제명] 교모세포종 치료를 위한 γδ T 세포치료제 개발 연구
[기여율] 1/1
[과제수행기관명] 가톨릭대학교(성의교정)
[연구기간] 2022-03-01~2023-02-28
교모세포종(glioblastoma)은 신경교종의 일종으로서, 뇌에서 발생하는 가장 흔하고 심한 형태의 종양으로 알려져 있다 (Journal of Neuro-Oncology, 108(1):11~27). 교모세포종의 증상은 투통, 성격 변화 또는 구역질 등이 있고, 증상이 악화되면 의식불명이 나타날 수 있다. 교모세포종은 극복이 어려운 대표적인 종양으로서, 발병자의 중간값은 약 12~15개월이며, 5년을 넘긴 환자는 약 3~5%에 불과하다.
교모세포종의 발생 원인은 잘 알려져 있지 않으며, 다만 희귀한 원인으로 신경섬유종증이나 리 프라우메니 증후군이 있으며, 방사선에 노출되는 것도 원인으로 거론되고 있다. 교모세포종은 전체 뇌종양의 15%를 차지하며, CT, MRI 등 영상검사와 수술적 조직검사 등으로 진단된다. 교모세포종의 치료는 수술치료, 표준요법 항암방사선 동시치료(테모졸로마이드-방사선 복합치료) 및 표준요법 항암치료의 순서로 이뤄지게 된다. 환자의 상태와 세부 진단에 따라 추가적으로 수술, 항암치료 또는 방사선 치료 등을 고려할 수 있다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 한국등록특허 제10-1692044호
본 발명의 목적은 생물학적 시료로부터 PVR(poliovirus receptor) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PVR(poliovirus receptor) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측용 조성물을 포함하는 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측용 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 생물학적 시료로부터 PVR(poliovirus receptor) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 PVR(poliovirus receptor) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측용 조성물을 포함하는 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법을 이용한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측 및 치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 교모세포종 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 PVR(poliovirus receptor) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 발현 수준이 정상 대조군에 비해 높을 경우 T세포를 투여하는 단계를 포함하는 교모세포종 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법은 교모세포종의 치료에 있어 PVR(poliovirus receptor) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 상기 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군에 비해 높을 경우 T 세포에 의한 치료 효과가 유효할 수 있다고 예측할 수 있어, 개인 맞춤형 교모세포종의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 환자 유래 교모세포종 세포주에서 MICA, ULBP, PVR, Nectin의 발현량(expression %)을 유세포분석기로 측정한 결과이다.
도 2는 환자 유래 교모세포종 세포주에 γδ T 세포를 20:1의 비율로 처리하여 4시간 동안 공배양한 후, 분해정도(specific lysis %)를 측정한 결과이다.
도 3은 환자 유래 교모세포종 세포주에서의 분해정도(specific lysis %)와 MICA, ULBP, PVR 및 Nectin의 발현량(expression %)의 상관관계를 분석한 결과이다.
도 4는 ROC 곡선 분석을 나타낸 결과이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 생물학적 시료로부터 PVR(poliovirus receptor) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측 방법을 제공한다.
본 발명의 용어, "PVR(poliovirus receptor) 단백질"은 CD155(cluster of differentiation 155)로도 알려진 PVR 유전자로 코딩된 단백질로서, 면역글로불린 패밀리에서 타입 I 막관통 당단백질(Type I transmembrane glycoprotein)이며, DNAM-1 수용체에 대한 주요 리간드 중 하나로 알려져 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈장 및 혈청으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있고, 상기 조직은 종양 조직인 것일 수 있으며, 상기 종양 조직은 교모세포종 환자에서 절제된 것일 수 있다. 바람직하게는 상기 생물학적 시료는 교모세포종 환자에서 절제된 종양 조직인 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는 교모세포종 환자에서 절제된 종양 조직으로부터 분리된 교모세포종 세포주인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 측정은 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), competitive RT-PCR, real-time quantitative RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던블럿(northern blot), DNA 칩 분석법(DNA chip technology assay), ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴블럿(western blot), 면역블럿(immunoblot) 및 면역조직화학법 (Immunohistochemistry)으로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 수행된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 측정된 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있다. 이 때의 대조군은 교모세포종이 없는 정상인을 의미하는 것일 수 있다.
또한, 상기 PVR(poliovirus receptor) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군에 비해 높을 경우 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과가 유효할 것으로 예측 또는 판단하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 T 세포는 γδ T 세포(gamma delta T cell)인 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 PVR(poliovirus receptor) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 제제는 PVR(poliovirus receptor)에 특이적인 프라이머, 프로브, 앱타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서의 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3-말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 염기서열로서, 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고, 템플레이트 가닥 복사을 위한 시작 지점으로서 작용하는 짧은 염기서열을 말한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(즉, DNA 폴리머레이트 또는 역전사효소) 및 상이한 4 가지의 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 기술에 따라 적절히 선택될 수 있다.
본 발명에서의 용어, "프로브"는 유전자에 특이적으로 결합을 이룰 수 있는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 표지되어 있어 특정 유전자의 존재 유무 및 발현양을 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single strand DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double strand DNA)프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 적절한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당해 기술 분야에 공지된 기술에 따라 적절히 선택할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포아미다이트(phosphoramidite) 고체 지지체 합성법이나 기타 널리 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 염기서열은 또한 당해 기술 분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
본 발명에서의 용어, "앱타머"는 목적 분자에 특이적으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 또는 펩티드 분자로서, 핵산 앱타머의 경우 SELEX(systematic evolution of ligands by exponential enrichment)라 불리는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 라이브러리를 이용한 진화적인 방법에 의해 특정 화학 분자나 생물학적 분자에 높은 친화력과 선별력을 갖고 결합하는 올리고머를 분리하여 수득할 수 있다.
본 발명에서의 용어, "항체"는 생체의 면역계에서 혈액이나 림프를 순환하면서 외부 물질인 항원이 침입한 경우 이에 반응하는 물질을 말하며, 림프조직에서 형성되는 글로불린계 단백질로 면역글로불린이라고도 불린다. 항체는 B 세포에 의해 생산되며, 항원과 특이적으로 결합한다. 하나의 항체 분자에는 두 개의 중사슬(heavy chain)과 두 개의 경사슬(light chain)이 있으며, 각각의 중사슬과 경사슬은 각각 N-말단에 가변영역을 포함하고 있다. 각각의 가변영역은 3 개의 상보성 결정부위 (Complementarity determining region: CDR)와 4 개의 구조 형성부위 (framework regions: FRs)로 구성되는데, 상보성 결정 부위들은 항체의 항원 결합 특이성을 결정하고, 가변영역의 구조형성 부위들로 유지되는 비교적 짧은 펩티드 서열로 존재한다.
본 발명에 있어서, 상기 PVR(poliovirus receptor) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준은 교모세포종 환자에서 절제된 종양 조직으로부터 분리된 교모세포종 세포주에서 측정한 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측용 조성물을 포함하는 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측용 키트를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 키트는 마이크로 어레이, 유전자 증폭 키트, 면역분석(immunoassay)용 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 및 ELISA 키트로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 (a) 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 PVR(poliovirus receptor) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; (b) 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계;
(c) 상기 발현 수준이 정상 대조군에 비해 높을 경우 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과가 유효할 것으로 예측 또는 판단하는 단계; 및 (d) 환자에게 교모세포종 치료를 위한 T세포를 투여하는 단계를 포함하는 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측 및 치료 방법을 제공한다.
교모세포종 치료 효과의 유효성 예측 및 치료 방법에 있어서, 생물학적 시료, 조직, 측정방법 및 T세포에 대해서는 전술한 바와 동일하게 적용이 가능한 바, 그 기재를 생략한다.
또한, 본 발명은 교모세포종 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 PVR(poliovirus receptor) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 발현 수준이 정상 대조군에 비해 높을 경우 T세포를 투여하는 단계를 포함하는 교모세포종 치료 방법을 제공한다.
교모세포종 치료 방법에 있어서, 생물학적 시료, 조직, 측정방법 및 T세포에 대해서는 전술한 바와 동일하게 적용이 가능한 바, 그 기재를 생략한다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 환자 유래 교모세포종 세포주의 준비 및 배양
총 10명의 교모세포종 환자로부터 종양 조직을 얻은 후, 종양 조직으로부터 교모세포종 세포주를 분리하였다. 간단히, 환자에서 분리된 교모세포종 조직은 차가운 PBS(phosphate buffer saline)로 세척하였으며, 세척 후, 1% Glutamax (Gibco), 1% Penicillin/streptomycin (Gibco) 및 2.5 μg/ml의 amphotericin B (Gibco)이 포함된 차가운 Hibernate-A 배지를 적용시킨 상태에서 조직을 외과용 가위와 0.5~1mm 크기로 잘게 조각내었다. 잘려진 종양조직 조각은 Conical tube에 모아 실온의 PBS로 3회 세척한 후, RBC(red blood cell) 용해 완충액(lysis buffer)로 5-10분간 적용시켰다. 이후, 원심분리하여 환자 유래 교모세포종 세포주만을 분리하였다.
실시예 2. γδ T 세포(gamma delta T cell)의 준비 및 배양
γδ T 세포는 정상인 또는 교모세포종 환자로부터 말초혈액을 얻은 후 말초혈액으로부터 수득하였다. 간단히, Ficoll-Hypaque 위에 말초혈액을 1:1의 비율로 넣은 후, 2500 rpm으로 20분간 원심분리하였다. 이후, Buffy coat층에 있는 말초혈액단핵구(PBMC)를 모은 후, RPMI 배지로 세척하였다. 세척은 4회로 이루어졌으며, 각각 1800 rpm에서 15분, 1600 rpm에서 10분, 1400 rpm에서 5분 및 1400 rpm에서 5분 동안 수행하였다. 이후, 분리된 PBMC를 freezing media에 부유시킨 후, 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol)이 담긴 freezing bottle에 넣어 -80℃ 냉동고에 16시간 보관하고, 이후 액체질소통에 보관하였다.
보관된 PBMC를 37℃bath에 빠르게 녹인 후 10% FBS가 포함된 RPMI에 부유하여 세척하였다. 세척이 끝난 PBMC에 5 μM의 zoledronic acid와 1000 U/mL의 IL-2을 처리한 후, 24 well-plate에 분주하였다. 3일 째에 1000 U/mL의 IL-2를 추가로 처리하였고, 7일 째에 세포를 수확하여 세척하였다. 이후, 1000 U/mL의 IL-2를 처리하여 배양하거나, 인공항원제시세포로서 CD32, CD80, CD83, 4-1BBL, CD40L, CD70을 발현하는 K562 세포를 방사선조사(100 Gy)하여 공동배양하였다. 이로부터 배양된 γδ T 세포는 14일째 또는 동일한 과정을 한번 더 반복하여 21일째 수확하여 freezing media에 부유시켜 CRF(Controlled-rate-freezer)를 이용하여 얼린 뒤, 실험 전까지 액체질소에 보관하였다.
실시예 3. T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 평가
본 발명자들은 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성을 평가하기 위한 실험을 수행하였다. 우선, 환자 유래 교모세포종 세포주에서 MICA(MHC class I polypeptide-related sequence A), ULBP(UL16 binding protein 1), PVR(Poliovirus receptor, CD155) 및 Nectin와 같은 리간드 발현 여부를 유세포분석기를 통해 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 총 10명의 환자에서 유래된 교모세포종 세포주에 γδ T 세포를 처리한 경우, 10개의 세포주 모두에서 MICA의 발현이 확인되지 않았다. 또한, 2개의 세포주에서 ULBP의 발현이 강하게 확인되었으나, 4개의 세포주에서는 약하게 발현이 확인되었으며, 나머지 4개의 세포주에서는 ULB의 발현이 나타나지 않았다. PVR의 경우에는 10개의 세포주 모두에서 발현이 확인되었고, 그 중 5번과 8번 세포에서는 약하게 발현되었다. Nectin 역시 10개의 세포주 모두에서 발현이 확인되었고, 그 중 5번, 6번, 8번 및 10번 세포에서는 약하게 발현되었다.
이후, 환자 유래 교모세포종 세포주에 γδ T 세포(gamma delta T cell)를 처리한 후, γδ T 세포에 의한 분해정도를 분석하는 실험을 수행하였다. 간단히, 환자 유래 교모세포종 세포주는 Calcein-AM로 표지하고, Calcein-AM으로 표지된 환자 유래 교모세포종 세포주에 γδ T 세포를 20:1의 E(effector):T(target) 비율로 처리한 후, 4시간 동안 공배양하였다. T 세포에 의한 분해정도(Specific lysis %)는 다음의 수식을 통해 계산하였다: Specific lysis % = [(Experimental Release - Spontaneous Release) / (Maximum Release - Spontaneous Release)] Х 100.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 5번과 8번 세포주에서는 T 세포에 의한 분해정도가 낮았고, 7번 세포주 및 9번 세포주에서는 약 20~30%의 분해정도를 보였으며, 나머지 세포주에서는 40% 이상의 분해정도를 보임으로써, T 세포에 의한 세포독성 효과가 환자 개인에 따라 다양하게 나타날 수 있음을 확인하였다.
이후, 상기 MICA, ULBP, PVR 및 Nectin의 발현량(expression %)과 T 세포에 의한 분해정도(specific lysis %)의 상관관계를 분석하였다. 그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, PVR 발현과 T 세포에 의한 분해정도의 상관관계에서 유의성이 있는 것으로 나타났다. 즉, PVR 발현 수준이 높은 경우에는 T 세포에 의한 분해정도가 높게 나타남으로써, PVR 발현량의 측정을 통해 T 세포에 의한 치료 유효성을 예측 또는 평가할 수 있음을 확인하였다. 다만, 나머지 MICA, ULBP 및 Nectin의 발현은 T 세포에 의한 분해정도와 관련성이 없었다.
실시예 4. 민감도 및 특이도 분석
본 발명자들은 PVR 발현 여부로부터 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측에 대한 정확도를 평가하기 위해 ROC 곡선 분석을 수행하였다. 그 결과, PVR가 발현하는 89.2% 이상의 환자 유래 교모세포종 세포주에서 민감도(sensitivity) 71.4% 및 특이도(specificity) 100% 로 확인되었다 (도 4).
상기 결과로부터, 본 발명은 환자 유래 교모세포종 세포주에서 PVR 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현량을 측정함으로써, 교모세포종의 치료에 있어 T 세포에 의한 치료 효과가 유효한지 여부를 예측 또는 판단할 수 있음을 확인하였다.

Claims (24)

  1. 생물학적 시료로부터 PVR(poliovirus receptor) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈장 및 혈청으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 조직은 종양 조직인 것인, 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 종양 조직은 교모세포종 환자에서 절제된 것인, 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 측정은 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), competitive RT-PCR, real-time quantitative RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던블럿(northern blot), DNA 칩 분석법(DNA chip technology assay), ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴블럿(western blot), 면역블럿(immunoblot), 면역조직화학법 (Immunohistochemistry) 및 유세포분석법(flow cytometry)으로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 수행된 것인, 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 측정된 발현 수준을 대조군과 비교하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것인, 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 PVR(poliovirus receptor) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군에 비해 높을 경우 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과가 유효할 것으로 예측 또는 판단하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것인, 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 T 세포는 γδ T 세포(gamma delta T cell)인 것인, 방법.
  9. PVR(poliovirus receptor) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측용 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 제제는 PVR(poliovirus receptor)에 특이적인 프라이머, 프로브, 앱타머 및 항체로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 조성물.
  11. 제 9 항에 있어서,
    상기 PVR(poliovirus receptor) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준은 교모세포종 환자에서 절제된 종양 조직으로부터 분리된 교모세포종 세포주에서 측정하는 것인, 조성물.
  12. 제 9 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측용 키트.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 키트는 마이크로 어레이, 유전자 증폭 키트, 면역분석(immunoassay)용 키트, 단백질 마이크로어레이 키트 및 ELISA 키트로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 키트.
  14. (a) 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 PVR(poliovirus receptor) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계;
    (b) 상기 측정된 발현 수준을 정상 대조군과 비교하는 단계;
    (c) 상기 발현 수준이 정상 대조군에 비해 높을 경우 T 세포에 의한 교모세포종 치료 효과가 유효할 것으로 예측 또는 판단하는 단계; 및
    (d) 환자에게 교모세포종 치료를 위한 T세포를 투여하는 단계를 포함하는 교모세포종 치료 효과의 유효성 예측 및 치료 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈장 및 혈청으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 조직은 종양 조직인 것인, 방법.
  17. 제 16 항에 있어서,
    상기 종양 조직은 교모세포종 환자에서 절제된 것인, 방법.
  18. 제 14 항에 있어서,
    상기 측정은 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), competitive RT-PCR, real-time quantitative RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던블럿(northern blot), DNA 칩 분석법(DNA chip technology assay), ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴블럿(western blot), 면역블럿(immunoblot), 면역조직화학법 (Immunohistochemistry) 및 유세포분석법(flow cytometry)으로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 수행된 것인, 방법.
  19. 제 14 항에 있어서,
    상기 T 세포는 γδ T 세포(gamma delta T cell)인 것인, 방법.
  20. 교모세포종 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 PVR(poliovirus receptor) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 발현 수준이 정상 대조군에 비해 높을 경우 T세포를 투여하는 단계를 포함하는 교모세포종 치료 방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 조직, 세포, 혈액, 혈장 및 혈청으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 조직은 종양 조직인 것인, 방법.
  23. 제 20 항에 있어서,
    상기 측정은 RT-PCR(reverse transcription polymerase chain reaction), competitive RT-PCR, real-time quantitative RT-PCR, RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던블럿(northern blot), DNA 칩 분석법(DNA chip technology assay), ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay), 웨스턴블럿(western blot), 면역블럿(immunoblot), 면역조직화학법 (Immunohistochemistry) 및 유세포분석법(flow cytometry)으로 이루어진 군에서 선택된 방법으로 수행된 것인, 방법.
  24. 제 20 항에 있어서,
    상기 T 세포는 γδ T 세포(gamma delta T cell)인 것인, 방법.
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