WO2023210755A1 - 有用微生物のスクリーニング方法 - Google Patents

有用微生物のスクリーニング方法 Download PDF

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WO2023210755A1
WO2023210755A1 PCT/JP2023/016681 JP2023016681W WO2023210755A1 WO 2023210755 A1 WO2023210755 A1 WO 2023210755A1 JP 2023016681 W JP2023016681 W JP 2023016681W WO 2023210755 A1 WO2023210755 A1 WO 2023210755A1
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microorganisms
medium
culture system
microorganism
strain
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PCT/JP2023/016681
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English (en)
French (fr)
Inventor
泰範 市橋
成川 恵 奈良
Original Assignee
国立研究開発法人理化学研究所
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently screening microorganisms having desired characteristics, and microorganisms obtained by the method.
  • the limiting dilution method is mainly used as a method for screening useful microorganisms such as antagonistic microorganisms.
  • the limiting dilution method involves diluting a microorganism screening source to the 3rd to 9th power of 10 and inoculating it on an agar plate or a 96-well or 386-well microwell plate containing a culture medium. This is a method of separating and culturing. After culturing the individual isolated microorganisms for a certain period of time, microorganisms that are confirmed to be growing are manually picked up by checking for colony formation or by measuring the turbidity of the culture medium, and isolates with the desired characteristics are selected. can be obtained.
  • This series of operations using the limiting dilution method requires a huge amount of culture media, culture incubators, etc., and requires a great deal of human labor since it is done manually. (For example, manufacturing) is a major limiting factor.
  • Non-Patent Document 1 discloses that using an emulsion of micro aqueous phase droplets in which the surface of the aqueous phase is coated with a double membrane, candidates for useful microorganisms are encapsulated in each droplet, and the microorganisms are cultured within the droplets.
  • a method for screening useful microorganisms is disclosed, in which microorganisms having desired characteristics are selected.
  • a culture method using such microdroplets is called a microdroplet method, and is used as a high-throughput method in place of conventional methods using agar plates or microwell plates.
  • the microdroplets used in this method can be prepared using the method and apparatus described in Patent Document 1, for example.
  • the microdrops before and after culturing can be analyzed using the methods and devices described in Patent Documents 2 and 3, for example.
  • the microbial screening method using the microdroplet method is similar to the conventional screening method using an agar plate.
  • a microbial suspension is added until the number of microorganisms in one microdroplet reaches 0 to 1. It is characterized by comprising a limit dilution step of diluting. Therefore, in the prepared microdroplets, there may be many empty microdroplets in which no microorganisms are encapsulated. Therefore, when analyzing microdroplets, it may be necessary to irradiate fluorescence with two or more wavelengths: one to select the characteristics of useful microorganisms, and the other to eliminate empty microdroplets. In this case, the high throughput of the microdroplet method could not be fully utilized.
  • soil microorganisms are used as candidate microorganisms, some of them may include microorganisms that survive and grow in a symbiotic system, but such microorganisms cannot grow alone in microdroplets, making them useful. It was impossible to select it as a microorganism.
  • An object of the present invention is to provide a method for screening useful microorganisms that can efficiently obtain useful microorganisms. Another object of the present invention is to provide useful microorganisms obtained by this method.
  • the present invention provides the following.
  • a method for screening useful microorganisms comprising inoculating and culturing a suspension containing microorganisms in a culture system containing a selective medium, The method, wherein the concentration of microorganisms in the suspension is equivalent to two or more microorganisms per culture system.
  • microorganism is a soil microorganism.
  • selection medium is a medium containing pathogenic bacteria, and the useful microorganism is an antagonistic microorganism of the pathogenic bacteria.
  • a method for producing a microbial population which comprises inoculating and culturing a suspension containing microorganisms in a culture system containing a selective medium, The method, wherein the concentration of microorganisms in the suspension is equivalent to two or more microorganisms per culture system.
  • microorganisms obtained by inoculating and culturing a suspension containing two or more microorganisms per culture system in a culture system containing a selective medium. including microbial populations.
  • This specification includes the disclosure content of Japanese Patent Application No. 2022-074332, which is the basis of the priority of this application.
  • the present invention it is possible to provide a method for screening useful microorganisms that can efficiently obtain useful microorganisms. Furthermore, according to the present invention, it is possible to provide a microbial population containing useful microorganisms obtained by the method.
  • FIG. 2 is a schematic diagram showing the principle of microdroplet formation in the microdroplet method. This is a fluorescence micrograph ( ⁇ 400) showing the results of culturing bacterial wilt strain 8107 GFP using various media by the microdroplet method.
  • FIG. 2 is a fluorescence micrograph showing the results of culturing bacterial wilt fungus 8107 GFP and Pseudomonas #3-8A strain at various concentrations in coexistence. In addition to the 8107 GFP strain and the #3-8A strain, photographs of microdroplets cultured with soil bacteria are also shown.
  • A is a plot of a microdroplet in which only the 8107 GFP strain was cultured
  • B is a plot of a microdroplet in which the 8107 GFP strain, soil bacteria, and #3-8A strain were simultaneously encapsulated and cultured at 0.1 cells/droplet.
  • C is an enlarged view of the part surrounded by the frame of the plot of B.
  • D is a photograph of a colony of 8107 GFP strain, #3-8A strain, fraction a and fraction b, seeded and cultured on an mGAM plate evenly coated with 8107 GFP strain, differential interference contrast observation (DIC) under a fluorescence microscope. and a photograph ( ⁇ 400) obtained by fluorescence observation (Fluo).
  • DIC differential interference contrast observation
  • ⁇ 400 obtained by fluorescence observation
  • As the medium water and KingB medium were used. In the figure, the part surrounded by a circle with a white line indicates the position of a droplet where fluorescence could not be observed after culturing.
  • the first embodiment of the present invention is a method for screening useful microorganisms.
  • the method of the present embodiment is a method for screening useful microorganisms, which comprises inoculating a suspension containing microorganisms into a culture system containing a selection medium and culturing the microorganisms, the method comprising: is characterized in that the concentration is equivalent to 2 cells/culture system or more.
  • the method of this embodiment involves inoculating a suspension containing candidate useful microorganisms into a culture system at a high concentration without performing limiting dilution, thereby cultivating an empty culture in which no candidate microorganisms are present.
  • the number of systems can be reduced, which allows for more efficient screening.
  • microorganism refers to all microorganisms that are invisible to the naked eye, and includes bacteria, fungi, protists, viruses, and the like.
  • the microorganism is preferably a bacterium.
  • useful microorganisms refer to having useful properties such as producing physiologically active substances such as antibiotics, antagonizing pathogenic bacteria, decomposing harmful substances, and mediating useful chemical reactions. Refers to microorganisms.
  • microorganisms live on the body surface and inside of animals and plants (e.g., intestines), in the general environment such as soil and air, in activated sludge, and in water bodies such as lakes, rivers, and oceans. It may also be a microorganism.
  • animals and plants e.g., intestines
  • activated sludge e.g., activated sludge
  • water bodies e.g., lakes, rivers, and oceans.
  • soil microorganisms especially soil bacteria, can be used.
  • microorganisms preferably four or more, eight or more, ten or more, twenty or more, or fifty or more microorganisms are inoculated per culture system, thereby improving the symbiotic system and growth.
  • slow microorganisms can be cultured and propagated in a relatively short period of time.
  • the upper limit of the seeding concentration of microorganisms depends on the type and size of the culture system, but when using micro droplets as described below as a culture system, for example, 200 or less, 150 or less, 100 or less per culture system. , 50 or less, 30 or less, or 20 or less.
  • selective medium refers to a medium in which useful microorganisms with desired characteristics can be grown and the growth can be confirmed.
  • the term “selective medium” is usually used to refer to a screening medium that grows only microorganisms with specific characteristics and kills other microorganisms.
  • the term “selective medium” also includes “selective medium,” but it does not necessarily need to be a medium that kills other microorganisms. It encompasses a broader range of media.
  • microorganisms that compete with pathogenic bacteria or microorganisms that kill pathogenic bacteria it is possible to coexist candidate microorganisms in a medium containing pathogenic bacteria that expresses green fluorescent protein (GFP), thereby creating a culture system that does not emit fluorescence.
  • GFP green fluorescent protein
  • the culture system in which decomposing microorganisms exist can be identified.
  • the selection medium in this specification may be a medium in which only useful microorganisms having desired characteristics can grow, and a label is emitted by the growth of the useful microorganism, or a label disappears by the growth of the useful microorganism. It may also be a medium.
  • the selection medium is a medium containing pathogenic bacteria
  • the desired useful microorganism is a microorganism that is antagonistic to the pathogenic bacteria.
  • a GFP gene is incorporated into a pathogenic bacterium, and the pathogenic bacterium is inoculated so that at least one bacterium is distributed in each culture system.
  • a microbial suspension is inoculated into each culture system and cultured in coexistence with pathogenic bacteria and microorganisms.
  • the microorganism suspension contains antagonistic microorganisms, the growth of pathogenic bacteria is suppressed, so that GFP fluorescence is not detected. It is possible to obtain antagonistic microorganisms as useful microorganisms from culture systems in which growth inhibition of such pathogenic microorganisms has been confirmed.
  • the basal medium for preparing the selection medium known media such as LB medium, malt extract medium, potato dextrose medium, R2A medium, yeast nitrogen medium, PGC medium, tryptic soy medium, GAM medium, mGAM medium, KingB medium, etc. Any medium may be used, and the medium most suitable for the growth of the desired useful microorganisms can be appropriately selected.
  • the pathogen especially the Ralstonia solanacearum that has incorporated GFP
  • mGAM can be used (see Examples below).
  • the bacterial wilt fungus can be said to be a pathogenic bacterium that is in great need of control because it infects and damages more than 200 species of plants in addition to crops belonging to the Solanaceae family, such as tomatoes and potatoes.
  • Solanaceae family such as tomatoes and potatoes.
  • no means have been found to stably suppress its occurrence, so it can be said that antagonistic microorganisms are highly useful.
  • the basal medium when screening for bacteria that decompose a harmful substance as a carbon source, can be an inorganic medium containing only the harmful substance as a carbon source.
  • the concentration of the microorganism suspension for seeding the culture system corresponds to 2 or more, preferably 4 or more, 8 or more, 10 or more, 10 or more, 20 or more or 50 or more per culture system.
  • the number of microorganisms per volume added to one culture system is 2 or more, preferably 4 or more, 8 or more, 10 or more, 10 or more, 20 or more, or 50 or more. Needs adjustment.
  • the microorganism concentration here can be determined by any of the known methods, such as counting the number of microorganisms in a suspension under a microscope, or calculating from the turbidity of the microorganism suspension (usually absorbance at 600 nm). It can be determined using
  • Figure 1 shows the Poisson distribution of the number of microorganisms inoculated into the culture system when the microorganism concentration in the microorganism suspension is equivalent to 1, 4, and 8 microorganisms per culture system.
  • the Poisson distribution here is a theoretical calculation of the distribution of the number of microorganisms that can actually be inoculated into each culture system when a microorganism suspension of the same concentration is inoculated into a large number of culture systems at the same time. Poisson distribution is calculated based on the following formula (I).
  • X is a random variable
  • ⁇ is an expected value
  • the concentration of the microbial suspension seeded in the culture system it is necessary to increase the concentration of the microbial suspension seeded in the culture system to suppress the generation of an empty culture system. If it is too high, desired useful microorganisms may not be able to be efficiently cultured due to the influence of many other microorganisms.
  • the upper limit of the optimal concentration of the microorganism suspension varies depending on the nature and size of the culture system, but for example, when the culture system uses droplets with a diameter of 30 ⁇ m, the maximum concentration is 200 or less per culture system, and 150 droplets per culture system.
  • the number is preferably 100 or less, 50 or less, 30 or less, or 20 or less.
  • most culture systems are seeded with multiple microorganisms, but usually, by culturing in a selective medium, the desired useful microorganisms proliferate, but other microorganisms do not proliferate or die. do.
  • useful microorganisms can be isolated by subculturing this culture solution about 2 to 5 times using a selective medium.
  • the useful microorganisms isolated here may be a single species or two or more species. In particular, in the case of microorganisms that construct a symbiotic system, they are separated as two or more types.
  • the isolated useful microorganism After confirming that the isolated useful microorganism has the desired characteristics, it is subjected to known microorganism identification methods such as 16S ribosomal RNA gene sequencing, genome sequencing, morphological observation, FISH, proteome analysis, MALDI-TOF/MS. etc. can be used for identification. Furthermore, the isolated useful microorganisms can be cultured in a basal medium and then lyophilized or stored as a -80°C glycerol stock.
  • any known culture system such as an agar plate, a microwell plate, or a microdroplet can be used, but it is preferable to use a liquid medium culture system that is also suitable for culturing a symbiotic system.
  • the culture system is preferably in the form of microdroplets because high-throughput processing is possible.
  • Culture using microdroplets is a technique also called microdroplet method.
  • Microdroplets as a culture system containing microorganisms can be prepared using, for example, the apparatuses described in Patent Documents 2 and 3.
  • an emulsion generating device On-chip (registered trademark) Droplet Generator (On-chip Biotechnologies Co., Ltd.) can be used. According to the On-chip Droplet Generator, it is possible to create several thousand microdroplets per minute.
  • microdroplets After the microdroplets are prepared and subjected to a culture process, they are subjected to flow cytometry and a cell sorter. Microdroplets in which desired useful microorganisms may be present can be analyzed by their fluorescence intensity, etc., automatically sorted, and collected. As such devices, for example, the On-chip Sort system (On-chip Biotechnologies Co., Ltd.) and the On-chip Droplet Selector (On-chip Biotechnologies Co., Ltd.) can be used. By using such a system, it is possible to analyze and collect a large amount of microdroplets in a short period of time.
  • On-chip Sort system On-chip Biotechnologies Co., Ltd.
  • On-chip Droplet Selector On-chip Biotechnologies Co., Ltd.
  • the microdroplet is not particularly limited, it can be prepared using the principle of the microdroplet preparation mechanism shown in FIG. 2, for example.
  • the microbial suspension is supplied to the microchannel (M) as a liquid mixture mixed with a selection medium.
  • the mixed liquid passes through the microchannel, it comes into contact with oil that flows in from both directions (left and right in the figure) perpendicular to the direction of passage (downward in the figure) at a constant pressure, and then immediately moves to the oil phase.
  • the oil for example, fluorinated oil can be used.
  • the size of the microdroplet can be adjusted by controlling the pressure of the liquid mixture supplied to the microchannel and the oil flowing into it.
  • the average diameter of the microdroplets is not particularly limited, but is preferably 5 ⁇ m or more, more preferably 10 ⁇ m or more, even more preferably 15 ⁇ m or more, even more preferably 20 ⁇ m or more, even more preferably 25 ⁇ m or more, preferably 200 ⁇ m or less, and 150 ⁇ m or less. is more preferably 120 ⁇ m or less, further preferably 100 ⁇ m or less, even more preferably 85 ⁇ m or less, even more preferably 60 ⁇ m or less, even more preferably 50 ⁇ m or less, even more preferably 40 ⁇ m or less, and even more preferably 35 ⁇ m or less.
  • microdroplet method when screening soil microorganisms, it is preferable to use the microdroplet method.
  • the microdroplet method since more than 99% of soil microorganisms are difficult to cultivate, it took a great deal of time and effort to obtain useful microorganisms.
  • the microdroplet method it is possible to study a large number of tests and a variety of culture conditions in a short period of time, making it possible to widely culture uncultured soil microorganisms.
  • microbial culture especially soil microorganisms
  • useful microorganisms such as antagonistic microorganisms of pathogenic bacteria. can. If new useful microorganisms can be isolated from various soils, it will be possible to select useful microorganisms that are likely to colonize each area, and it will be possible to use them as extremely useful microbial materials.
  • the second embodiment of the present invention is a method for producing a population of microorganisms.
  • the method of the present embodiment includes inoculating and culturing a suspension containing microorganisms in a culture system containing a selective medium, wherein the concentration of microorganisms in the suspension is 2 or more per culture system. It is characterized by having a concentration corresponding to .
  • the method of the present embodiment is a method for obtaining a microbial population having desired characteristics, including useful microorganisms having desired characteristics, preferably consisting of useful microorganisms.
  • the conditions such as the preparation method of the suspension to be seeded in the culture system, the seeding conditions, the medium used, the type of culture system, the method for isolating useful microorganisms, the storage method, etc., shall be changed unless there is any particular contradiction.
  • the conditions are the same as those described in "1. Screening method for useful microorganisms.”
  • the microorganism population obtained by the method of this embodiment may contain a single type of useful microorganism, or may contain two or more types of useful microorganisms.
  • the microorganism population preferably consists of only useful microorganisms, but may contain other microorganisms as long as they do not inhibit the desired characteristics or growth/survival of the useful microorganisms.
  • the third embodiment of the present invention is a microbial population.
  • the microorganism population of this embodiment is characterized in that it is obtained by inoculating and culturing a suspension containing a concentration of two or more microorganisms per culture system into a culture system containing a selective medium. do.
  • the microbial population of this embodiment may be a population of useful microorganisms screened by the method of the first embodiment, and/or may be a microbial population obtained by the method of the second embodiment. good.
  • various conditions such as the method for preparing a suspension to be seeded in a culture system, seeding conditions, the medium used, the type of culture system, the method for isolating useful microorganisms, and the storage method, etc.
  • the conditions are the same as those described in "1. Screening method for useful microorganisms" unless otherwise noted.
  • the microorganism population obtained by the method of this embodiment may contain a single type of useful microorganism, or may contain two or more types of useful microorganisms.
  • the microorganism population preferably consists of only useful microorganisms, but may contain other microorganisms as long as they do not inhibit the desired characteristics or growth/survival of the useful microorganisms.
  • the microbial population of this embodiment is preferably stored as a glycerol stock or freeze-dried at -80°C until use.
  • microorganisms are generated by suspending the stock in a medium, and then cultured under conditions (medium, scale, time, etc.) depending on the purpose.
  • the culture solution of the antagonistic microorganisms is sprayed on the soil where the plants are being grown, or added to the hydroponic cultivation medium, and the seeds of the plants are grown. It can be added to the plant growing environment by coating or other methods.
  • a culture solution of the degrading microorganisms can be added to and mixed with the contaminated soil.
  • Example 1 Screening for antagonistic microorganisms of bacterial wilt from soil microorganisms (1) Model pathogenic bacteria A platform for screening antagonistic microorganisms for bacterial pathogens was constructed. Soil microorganisms isolated from soil on the premises of the RIKEN BioResource Research Center (BRC) were used as a screening source. As a model pathogen, Ralstonia solanacearum, a soil pathogen, was used. The transformation method for bacterial wilt has been established, it is easy to handle in the laboratory, and antagonistic microorganisms are already available, so it was selected as a suitable pathogen for the model.
  • BRC RIKEN BioResource Research Center
  • the GFP-labeled strain of bacterial wilt (8107 GFP strain) was provided by the National Agriculture and Food Research Organization (A. Furusawa, et al., J. Phytopathol., Vol. 167, No. 6). , pp. 338-343 (2019)).
  • Candidate and test media include LB medium (Nacalai Tesque, #20068-75), malt extract medium (Malt:BD, #211320), potato dextrose medium (PD:BD, #254920), and R2A medium (Fuji Film, #211320).
  • yeast nitrogen medium YNB:BD, #239210
  • PGC medium Bactase (trademark) peptone 10.0g
  • yeast extract 1.0g yeast extract 1.0g
  • casamino acid 1.0g glucose 5.0g
  • tryptic soy medium TPS: Sigma-Aldrich, #22092-500G
  • GAM medium Nissui Pharmaceutical, #5422
  • mGAM medium Nissui Pharmaceutical, #5433
  • the concentration of the medium was 1-fold dilution and 10-fold dilution, respectively.
  • the 8107 GFP strain was used as the bacterial wilt GFP-labeled strain, and preculture was performed on a PGC medium plate at 25° C. for 2 days.
  • the bacterial cells were scraped from the plate and suspended in sterilized water, the bacterial cell concentration was adjusted to 8 cells/culture system (droplets), mixed with a medium, and sealed into microdroplets. The diameter of the droplet was 30 ⁇ m. Culture in the microdroplets was carried out at 25°C for 3 days. As a result, it was found that the fluorescence intensity and growth rate of the 8107 GFP strain differed depending on the medium, and that bacterial wilt bacteria grew better in higher medium concentrations (Figure 3).
  • the amount of fluorescence of the microdroplets of the 8107 GFP strain be sufficiently high and clearly different from the amount of fluorescence from the medium itself. Therefore, PGC medium, TPS medium, and mGAM medium were selected as mediums that showed a large difference in FIG. 3 and allowed the 8107 GFP strain to grow efficiently. Although the GAM medium seems to satisfy the above conditions, it was not used in this example because the growth of the 8107 GFP strain varied from droplet to droplet and was unstable.
  • micro droplets containing 8 cells/droplet of 8107 GFP strain and 20 cells/droplet of BRC soil bacteria were grown.
  • the cells were prepared and cultured at 25°C for 3 days.
  • the microdroplets after culture were subjected to On-chip Sort (On-chip Technologies, Inc.), and the size and fluorescence amount of each microdroplet was examined.
  • the diameter of the microdroplets was 30 ⁇ m, and the amount of fluorescence of the microdroplets of the 8107 GFP strain was found to be sufficiently different from the background fluorescence of the medium and the amount of fluorescence when only soil microorganisms were encapsulated.
  • mGAM medium and TPS medium were selected (Fig. 4). Since the fluorescence S/N ratio of the 8107 GFP strain was higher and clearly detected in the mGAM medium than in the TPS medium, it was decided to use the mGAM medium in subsequent experiments.
  • FIG. 6A shows a plot of a microdroplet in which only 8107GFP was cultured
  • FIG. 6B shows a plot of a microdroplet in which 8107GFP, soil bacteria, and #3-8A strain were simultaneously encapsulated and cultured at 0.1 particles/droplet
  • FIG. 6C is an enlarged view of the portion surrounded by a frame in the plot of B.
  • FIG. 6D shows colony photographs, DIC micrographs, and fluorescence micrographs of the 8107 GFP strain, #3-8A strain, fraction a, and fraction b on an mGAM plate. As shown in the figure, on the mGAM plate, the 8107 GFP strain formed colonies but did not show a halo effect, but the #3-8A strain did show a halo effect.
  • fractions a and b fraction a did not show a halo effect, and fraction b showed a halo effect.
  • the behavior of fractions a and b was similar to that of the 8107 GFP strain and #3-8A strain, respectively.
  • the above results indicate that it is possible to separate the 8107GFP strain and the #3-8A strain based on the amount of fluorescence, and this means that even when isolating unknown antagonistic microorganisms, microdroplets can be separated based on the amount of fluorescence. It was shown that it could be separated from pathogenic bacteria by sorting.
  • the TWR114 strain and the TCR112 strain were each encapsulated in microdroplets at 8 cells/droplet at the same time as the 8107 GFP strain, and cultured at 25° C. for 3 days.
  • the culture was carried out under the same conditions as described in (4) above, except that the TWR114 strain or the TCR112 strain was used instead of the #3-8A strain.
  • the amount of fluorescence was lower in both microdroplets containing TWR114 strain and 8107GFP strain, and microdroplets co-encapsulating TCR112 strain and 8107GFP strain, compared to microdroplets containing only 8107GFP strain. (Figure 7). This indicates that by using the platform of the present invention, antagonistic microorganisms having antagonistic effects other than antibiotic-producing bacteria can also be obtained.
  • Example 2 Screening for Pseudomonas fluorescens antagonistic microorganisms from soil microorganisms
  • Construction of a Pseudomonas fluorescens antagonistic microorganism screening system In the same manner as in Example 1, a bacterial antagonistic microorganism screening platform was constructed.
  • Pseudomonas fluorescens a species closely related to Pseudomonas aeruginosa, which is a type of human opportunistic pathogenic bacteria, was used.
  • P. It is known that C.
  • fluorescens produces pyoverdin (also known as fluorescin), which is a fluorescent yellow-green pigment, and emits fluorescence upon UV irradiation. Also, P. It is known that culturing the same bacterium in KingB medium is suitable for pigment production of S. fluorescens.
  • Figure 8 shows bright field micrographs (BF) and fluorescence micrographs (Fluo) of microdroplets under each condition.
  • BF bright field micrographs
  • Fluo fluorescence micrographs
  • FIG. 9 shows bright field micrographs (BF) and fluorescence micrographs (Fluo) of microdroplets under each condition.
  • the part surrounded by a circle with a white line indicates the position of a droplet where fluorescence could not be observed after culturing.
  • an overall decrease in the fluorescence intensity of the droplets was observed, but there were some droplets whose fluorescence intensity decreased even more significantly (possibly due to the presence of antagonistic microorganisms). This indicates that it can be used as a screening system for antagonistic microorganisms.

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Abstract

効率よく有用微生物を取得可能な、有用微生物のスクリーニング方法を提供する。　微生物を含む懸濁液を、選択用培地を含む培養系に播種して培養することを含む、有用微生物のスクリーニング方法において、前記懸濁液中の微生物の濃度を１培養系あたり２個以上に相当する濃度とする。

Description

有用微生物のスクリーニング方法
　本発明は、所望の特性を有する微生物を効率よくスクリーニングするための方法、及び該方法により得られる微生物に関する。
　現在、拮抗微生物などの有用微生物をスクリーニングする方法としては、主に限界希釈法が利用されている。限界希釈法は、微生物のスクリーニング源を１０の３～９乗まで希釈して寒天プレートや培地を含む９６穴又は３８６穴マイクロウェルプレート等へ播種することで、物理的な距離により個々の微生物を分離・培養する方法である。分離した個々の微生物を一定期間の間培養した後に、コロニー形成の確認か、培地の濁度測定により、増殖が確認された微生物を手作業でピックアップして、所望の特性を有する単離株を取得することができる。このような限界希釈法の一連の作業では、膨大な量の培養用培地、培養用インキュベーター等を要すること、また、手作業であることから多大な人的労力を要することが、有用微生物の活用（例えば、もの作り）において大きな制限要因となっている。
　非特許文献１には、水相の表面が二重膜でコーティングされた微小水相液滴のエマルジョンを用いて、有用微生物の候補微生物を各液滴に封入し、これを液滴内で培養して所望の特性を有する微生物を選択する、有用微生物のスクリーニング方法が開示されている。このような微小液滴を用いる培養方法は、マイクロドロップレット法と称され、従来の寒天プレートやマイクロウェルプレートを使用する方法に代わるハイスループット法として利用されている。この方法で用いる微小液滴（マイクロドロップ）は、例えば、特許文献１に記載の方法・装置を用いて調製することができる。また、培養前後のマイクロドロップは、例えば、特許文献２及び３に記載の方法・装置を用いて解析することができる。
国際公開第２００２／０６８１０４号 特開２０１０－１８１３４９号公報 国際公開第２０１１／０８６９９０号
S. S. Terekhov, et al., PNAS, 2018 vol. 115, No. 38, pp. 9551-9556
　マイクロドロップレット法による微生物スクリーニング法は、従来の寒天プレートを用いるスクリーニング法と同様に、微小液滴の調製に際して、１つの微小液滴中の微生物数が０～１となるまで微生物懸濁液を希釈する、限界希釈工程を備えることを特徴とする。そのため、調製した微小液滴には、微生物が封入されない、空の微小液滴が多数生じ得る。そのため、微小液滴の解析に際して、有用微生物の特性を選抜するための蛍光波長と、これと異なる空マイクロドロップレットを排除するための波長の２波長以上の蛍光の照射が必要となることがあり、この場合、マイクロドロップレット法のハイスループットを十分に活用できていなかった。
　また、例えば、土壌微生物を候補微生物とする場合、その一部には共生系により生存、生育する微生物が含まれ得るところ、このような微生物は単独では微小液滴内で生育できないことから、有用微生物として選択することが不可能であった。
　本発明は、効率よく有用微生物を取得可能な、有用微生物のスクリーニング方法を提供することを目的とする。また、本発明は、該方法により取得された有用微生物を提供することを目的とする。
　本発明は、以下を提供する。
（１）微生物を含む懸濁液を、選択用培地を含む培養系に播種して培養することを含む、有用微生物のスクリーニング方法であって、
　前記懸濁液中の微生物の濃度が、１培養系あたり２個以上に相当する濃度である、方法。
（２）前記培養系が微小液滴である、（１）に記載の方法。
（３）前記濃度が、１培養系あたり４個以上、８個以上、１０個以上、２０個以上又は５０個以上に相当する濃度である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記濃度が、１培養系あたり２００個以下、１５０個以下、１００個以下又は５０個以下に相当する濃度である、（３）に記載の方法。
（５）前記微生物が土壌微生物である、（１）～（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記選択用培地が病原菌を含む培地であって、前記有用微生物が前記病原菌の拮抗微生物である、（１）～（５）のいずれかに記載の方法。
（７）微生物を含む懸濁液を、選択用培地を含む培養系に播種して培養することを含む、微生物集団の製造方法であって、
　前記懸濁液中の微生物の濃度が、１培養系あたり２個以上に相当する濃度である、方法。
（８）１培養系あたり２個以上に相当する濃度の微生物を含む懸濁液を、選択用培地を含む培養系に播種して培養することで得られる、１種又は２種以上の微生物を含む、微生物集団。
（９）２種以上の微生物を含む、（８）に記載の微生物集団。
　本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2022-074332号の開示内容を包含する。
　本発明によれば、効率よく有用微生物を取得可能な、有用微生物のスクリーニング方法を提供することが可能である。また、本発明によれば、該方法により取得された有用微生物を含む微生物集団を提供することが可能である。
培養系に播種する微生物懸濁液の濃度を、１培養系あたり１個、４個及び８個に相当する濃度としたときの、培養系に播種される微生物数のポアソン分布である。 マイクロドロップレット法における微小液滴形成の原理を示す概要図である。 各種培地を用いて青枯病菌８１０７ＧＦＰ株をマイクロドロップレット法で培養した結果を示す蛍光顕微鏡写真（×４００）である。 ＰＧＣ培地、ｍＧＡＭ培地、ＴＰＳ培地を使用して、培地のみ、土壌細菌、８１０７ＧＦＰ株をそれぞれマイクロドロップレット法で培養した結果を示す蛍光顕微鏡写真と、微小液滴の大きさとＧＦＰ蛍光強度のプロット図である。 青枯病菌８１０７ＧＦＰ株と、各濃度のＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属＃３－８Ａ株を共存させて培養した結果を示す蛍光顕微鏡写真である。８１０７ＧＦＰ株、＃３－８Ａ株に加えて、土壌細菌を加えて培養した微小液滴の写真も併せて示す。 Ａは、８１０７ＧＦＰ株のみを培養した微小液滴、Ｂは８１０７ＧＦＰ株、土壌細菌及び０．１個／液滴の＃３－８Ａ株を同時封入して培養した微小液滴のプロット図を示す。Ｃは、Ｂのプロット図の枠で囲まれた部分の拡大図である。 Ｄは、８１０７ＧＦＰ株、＃３－８Ａ株、画分ａ及び画分ｂを、８１０７ＧＦＰ株を一様に塗布したｍＧＡＭプレート上に播種・培養したコロニー写真、蛍光顕微鏡下で微分干渉観察（ＤＩＣ）及び蛍光観察（Ｆｌｕｏ）した写真（×４００）である。 Ｍｉｔｓｕａｒｉａ属ＴＷＲ１１４株、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ属ＴＣＲ１１２株をそれぞれ８１０７ＧＦＰ株と同時に微小液滴に封入して培養した結果を示す、蛍光顕微鏡写真（×４００）である。 Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓを０個、１２個、１６個／培養系となるように封入し、２５℃で３日間培養した微小液滴を観察した、明視野顕微鏡写真（×４００）及び蛍光顕微鏡写真（×４００）である。 Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓを０個、１６個／培養系、ＢＲＣ土壌細菌を０個、１０個、２０個／液滴となるように封入し、２５℃で３日間培養した微小液滴を観察した、明視野顕微鏡写真（×４００）及び蛍光顕微鏡写真（×４００）である。媒体は、水、ＫｉｎｇＢ培地をそれぞれ使用した。図中、白線の丸で囲んだ部分は、培養後に蛍光が観察できなかった液滴の位置を示す。
１．有用微生物のスクリーニング方法
　本発明の第１の実施形態は、有用微生物のスクリーニング方法である。本実施形態の方法は、微生物を含む懸濁液を、選択用培地を含む培養系に播種して培養することを含む、有用微生物のスクリーニング方法であって、前記懸濁液中の微生物の濃度が、２個／培養系以上に相当する濃度であることを特徴とする。
　本実施形態の方法は、有用微生物の候補微生物を含む懸濁液を、限界希釈を行うことなく、高濃度の状態で培養系に播種することで、候補微生物が１つも入らない、空の培養系の数を減じることができ、これにより、より効率的なスクリーニングを行うことを可能とする。
　本明細書において「微生物」の用語は、肉眼で視認できない微小な生物全般を指し、細菌、真菌、原生生物、ウイルス等をいずれも包含する。本実施形態において、微生物は、好適には細菌である。また、本明細書において「有用微生物」とは、抗生物質等の生理活性物質を産生する、病原菌と拮抗する、有害物質を分解する、有用な化学反応を媒介する等の、有用な特性を有する微生物を指す。このような微生物の由来は特に限定されず、動植物の体表面及び体内（例えば腸内）、土壌・空気中などの一般環境、活性汚泥、湖沼、河川及び海洋などの水域等のいずれに生息する微生物であってもよい。例えば、土壌微生物、特に土壌細菌を使用することができる。
　１ｇの土壌中には微生物が約１万種１０億個以上存在し、病原菌等に対する拮抗微生物の宝庫と言われている。しかし、土壌微生物の９９％以上は難培養性であり、有用な拮抗微生物の単離は容易ではなかった。例えば、土壌微生物の一部には、単一種では生育できず、他種の微生物と共生系を構築するものが存在する。このような土壌微生物の場合、限界希釈により単一微生物の状態としてしまうと、その後の培養で生育させることができない。また、単一種で生育できる微生物であっても、増殖速度が遅く、単一微生物の状態から増殖が確認できるまでに非常に時間のかかるものも存在する。本実施形態の方法は、１培養系あたりに２個以上、好ましくは、４個以上、８個以上、１０個以上、２０個以上又は５０個以上の微生物を播種することで、共生系や増殖速度の遅い微生物についても、比較的短期間で培養して増殖させることが可能となる。微生物の播種濃度の上限は、培養系の種類や大きさにもよるが、後述の微小液滴を培養系とする場合は、例えば、１培養系あたり２００個以下、１５０個以下、１００個以下、５０個以下、３０個以下、又は２０個以下とすることができる。
　本明細書における「選択用培地」とは、所望の特性を有する有用微生物を増殖させ、かつ、その増殖を確認することができる培地を指す。当分野において、通常、「選択培地」の用語は、特定の特性を有する微生物だけを生育させ、他の微生物を死滅されるためのスクリーニング用の培地であり、微生物の抗生物質耐性、栄養要求性等に基づいて設計される培地を指すが、本明細書における「選択用培地」の用語は、「選択培地」も包含するが、必ずしも他の微生物を死滅させる培地であることを要しないため、より広義の培地を包含する。例えば、病原菌と拮抗する微生物や病原菌を殺傷する微生物を取得するためには、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現する病原菌を含む培地を用いて候補微生物を共存させることで、蛍光を発しない培養系を有用微生物が存在する培養系として特定することができる。また、例えば、有害物質の分解微生物を取得するためには、有害物質を培地に含有させ、かつ、有害物質の分解時に蛍光を発する、又は蛍光が消失するように設計することで、蛍光の有無より分解微生物が存在する培養系を特定することができる。あるいは、微生物変換によって有用物質が生成される際に、蛍光を発する、又は蛍光が消失するように設計することで、蛍光の有無より有用な化学反応を媒介する微生物が存在する培養系を特定することができる。このように、本明細書における選択用培地は、所望の特性を有する有用微生物のみが生育できる培地であってもよく、有用微生物の増殖により標識を発する、または有用微生物の増殖により標識が消失する培地であってもよい。
　本実施形態の方法の一態様において、選択用培地は、病原菌を含む培地であり、所望の有用微生物は、病原菌との拮抗微生物である。この態様では、例えば、病原菌にＧＦＰ遺伝子を組み込み、これを各培養系に少なくとも１菌体が分布するように播種する。この各培養系に微生物懸濁液を播種して、病原菌と微生物と共存させて培養する。微生物懸濁液に拮抗微生物が含まれる場合、病原菌の増殖が抑えられるため、ＧＦＰの蛍光が検出されない。このような病原菌の増殖抑制が確認された培養系から、有用微生物としての拮抗微生物を取得することが可能である。
　選択用培地を調製するための基礎培地としては、ＬＢ培地、麦芽エキス培地、ポテトデキストロース培地、Ｒ２Ａ培地、酵母ニトロゲン培地、ＰＧＣ培地、トリプティックソイ培地、ＧＡＭ培地、ｍＧＡＭ培地、ＫｉｎｇＢ培地等の公知の培地のいずれを使用してもよく、所望の有用微生物の生育に最も適した培地を適宜選択することができる。例えば、病原菌として青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）を使用して、その拮抗微生物をスクリーニングする場合は、拮抗微生物の不存在下で該病原菌(特に、ＧＦＰを組み込んだ青枯病菌)が良好に増殖する培地を選択することを要する。このような培地としては、例えば、ｍＧＡＭを使用することができる（後述の実施例を参照のこと）。青枯病菌は、トマト、ジャガイモなどナス科の作物の他に２００余種もの植物に感染し被害が発生することから防除の必要性の非常に高い病原菌であるといえる。しかし、現在のところ、その発生を安定的に抑える手段は見出されていないことから、その拮抗微生物の有用性は高いといえる。
　あるいは、例えば、有害物質を炭素源として分解する菌をスクリーニングする場合は、基礎培地は、該有害物質のみを炭素源として含む無機培地とすることができる。
　培養系に播種するための微生物懸濁液の濃度は、１培養系あたり２個以上、好ましくは４個以上、８個以上、１０個以上、１０個以上、２０個以上又は５０個以上に相当する濃度、すなわち、１培養系に加えられる容量あたりの微生物数が２個以上、好ましくは４個以上、８個以上、１０個以上、１０個以上、２０個以上又は５０個以上となるように調整することを要する。ここでいう微生物濃度は、懸濁液中の微生物数を検鏡下でカウントする方法、微生物懸濁液の濁度（通常は６００ｎｍの吸光度）から算出する方法等、公知の方法のいずれかを用いて決定することができる。
　図１は、微生物懸濁液の微生物濃度を、１培養系あたり１個、４個及び８個に相当するとしたときの、培養系に播種される微生物数のポアソン分布である。ここでいうポアソン分布は、多数の培養系に同濃度の微生物懸濁液を同時に播種したときに、実際に個々の培養系に播種され得る微生物数の分布を理論的に算出したものである。ポワソン分布は、下記式（Ｉ）に基づいて算出される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　上記式中、Ｘは確率変数、λは期待値、Ｐ（Ｘ＝ｋ）はＸがｋになる確率を示す。期待値λは、微生物懸濁液の濃度から算出される１培養系あたりの微生物の数があてはまる。図１に示す通り、期待値λが１の時に、微生物の数がゼロとなる培養系、すなわち空の培養系が多数生じる。一方、期待値λが多くなるほど空の培養系が少なくなり、λ＝８の場合、空の培養系はほぼゼロになることが分かる。
　以上の通り、本実施形態の方法においては、培養系に播種する微生物懸濁液の濃度を高くして空の培養系の生成を抑制することを要するが、一方、微生物懸濁液の濃度が高すぎれば、所望の有用微生物が他の多数の微生物の影響により、効率よく培養できなくなる可能性もある。微生物懸濁液の至適濃度の上限は、その培養系の性状・大きさによって異なるが、例えば、直径３０μｍの液滴を培養系とする場合は、１培養系あたり、２００個以下、１５０個以下、１００個以下、５０個以下、３０個以下又は２０個以下とすることが好ましい。
　本実施形態の方法において、ほとんどの培養系には複数の微生物が播種されるが、通常は、選択用培地による培養により、目的の有用微生物は増殖するが、他の微生物は増殖しないか、死滅する。さらに、この培養液について、選択用培地を用いて２～５回程度の継代培養を行うことで、有用微生物を分離することが可能である。ここで分離される有用微生物は、単一種であってもよく、２種以上であってもよい。特に、共生系を構築する微生物の場合、２種以上として分離される。
　分離された有用微生物は、所望の特性を有することを確認した後、公知の微生物同定方法、例えば、１６ＳリボゾーマルＲＮＡ遺伝子の配列決定、ゲノムシーケンス、形態観察、ＦＩＳＨ、プロテオーム解析、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ等を用いて同定することができる。また、分離された有用微生物は、基礎培地で培養された後、凍結乾燥又は－８０℃グリセロールストックとして保存することができる。
　前記培養系は、寒天プレート、マイクロウェルプレート、微小液滴など、公知の培養系をいずれも使用することができるが、共生系の培養にも適した液体培地の培養系とすることが好ましい。さらに、培養系は、ハイスループット処理が可能であることから、微小液滴とすることが好ましい。微小液滴を用いる培養は、マイクロドロップレット法とも称される技術である。微生物を封入した培養系としての微小液滴は、例えば、特許文献２及び３に記載の装置を用いて調製することができる。市販の装置としては、例えば、エマルジョン生成装置Ｏｎ－ｃｈｉｐ（登録商標）Ｄｒｏｐｌｅｔ　Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ（株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ）を使用可能である。Ｏｎ－ｃｈｉｐ　Ｄｒｏｐｌｅｔ　Ｇｅｎｅｒａｔｏｒによれば、１分間に数千個の微小液滴を作成することも可能である。
　微小液滴は、調製され、培養工程を経た後、フローサイトメトリー及びセルソーターに供される。所望の有用微生物が存在し得る微小液滴を、その蛍光強度等をして解析し、自動的にソーティングし、回収することができる。このような装置としては、例えば、Ｏｎ－ｃｈｉｐ　Ｓｏｒｔシステム（株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ）及びＯｎ－ｃｈｉｐ　Ｄｒｏｐｌｅｔ　Ｓｅｌｅｃｔｏｒ（株式会社オンチップ・バイオテクノロジーズ）を使用することができる。このようなシステムを使用することで、短時間に大量の微小液滴について解析・回収を行うことが可能である。
　微小液滴は、特に限定されないが、例えば、図２に示す微小液滴調製機構の原理で調製することができる。図２に示す微小液滴機構において、微生物懸濁液は、選択用培地と混合した混合液として、マイクロチャネル（Ｍ）に供される。混合液は、マイクロチャネル通過時に、通過方向（図中では下方向）に対して垂直の両方向（図中では左右方向）から一定の圧力で流入するオイルと接触した後、直ちに油相に移動する。これにより、微生物を含む選択用培地を内包する微小液滴が調製される。オイルとしては、例えば、フッ化オイルを使用することができる。
　微小液滴の大きさは、マイクロチャネルに供する混合液及び流入するオイルの圧力を制御することにより調整することができる。微小液滴の直径の平均は、特に限定されないが、５μｍ以上が好ましく、１０μｍ以上がより好ましく、１５μｍ以上がさらに好ましく、２０μｍ以上がさらに好ましく、２５μｍ以上がさらに好ましく、２００μｍ以下が好ましく、１５０μｍ以下がより好ましく、１２０μｍ以下がさらに好ましく、１００μｍ以下がさらに好ましく、８５μｍ以下がさらに好ましく、６０μｍ以下がさらに好ましく、５０μｍ以下がさらに好ましく、４０μｍ以下がさらに好ましく、３５μｍ以下がさらに好ましい。
　特に、土壌微生物のスクリーニングに際しては、マイクロドロップレット法を用いることが好ましい。上記した通り、土壌微生物の９９％以上は難培養性であるため、有用微生物を取得するために多大な時間と労力を要した。マイクロドロップレット法によれば、非常に多くの試験数と多様な培養条件を短期間に検討することが可能であり、これにより、未培養の土壌微生物を広く培養することが可能となる。このように、最新のマイクロ工学技術を微生物培養、特に土壌微生物に応用することで、全く未知の微生物の培養および病原菌の拮抗微生物等の有用微生物の高効率な単離・同定を実現することができる。様々な土壌から新規の有用微生物を単離することができれば、土地ごとに定着しやすい有用微生物を選択することが可能になり、非常に有用な微生物資材とすることができる。
２．微生物集団の製造方法
　本発明の第２の実施形態は、微生物集団の製造方法である。本実施形態の方法は、微生物を含む懸濁液を、選択用培地を含む培養系に播種して培養することを含み、前記懸濁液中の微生物の濃度が、１培養系あたり２個以上に相当する濃度である、ことを特徴とする。本実施形態の方法は、所望の特性を有する有用微生物を含む、好ましくは有用微生物からなる、所望の特性を有する微生物集団を取得するための方法である。
　本実施形態の方法において、培養系に播種する懸濁液の調製方法、播種条件、使用する培地、培養系の種類、有用微生物の分離方法、保存方法等の各条件は、特に矛盾のない限り、「１．有用微生物のスクリーニング方法」のに記載の条件と同様である。
　本実施形態の方法で得られる微生物集団は、単一種の有用微生物を含んでいてもよく、また、２種以上の有用微生物を含んでいてもよい。微生物集団は、有用微生物のみからなることが好ましいが、有用微生物の所望の特性や生育・生存を阻害しない限り、他の微生物を含んでいてもよい。
３．微生物集団
　本発明の第３の実施形態は、微生物集団である。本実施形態の微生物集団は、１培養系あたり２個以上に相当する濃度の微生物を含む懸濁液を、選択用培地を含む培養系に播種して培養することで得られる、ことを特徴とする。本実施形態の微生物集団は、第１の実施形態の方法でスクリーニングされた有用微生物の集団であってもよく、及び／又は、第２の実施形態の方法で取得された微生物集団であってもよい。
　本実施形態の微生物集団を取得するための方法について、培養系に播種する懸濁液の調製方法、播種条件、使用する培地、培養系の種類、有用微生物の分離方法、保存方法等の各条件は、特に矛盾のない限り、「１．有用微生物のスクリーニング方法」のに記載の条件と同様である。
　本実施形態の方法で得られる微生物集団は、単一種の有用微生物を含んでいてもよく、また、２種以上の有用微生物を含んでいてもよい。微生物集団は、有用微生物のみからなることが好ましいが、有用微生物の所望の特性や生育・生存を阻害しない限り、他の微生物を含んでいてもよい。
　本実施形態の微生物集団は、使用時までは凍結乾燥又は－８０℃保存のグリセロールストックとして保存されることが好ましい。使用時には、培地でストックを懸濁して微生物を起こした後に、目的に応じた条件（培地、スケール、時間等）で培養を行う。例えば、植物の病原菌の拮抗微生物を用いて病原菌の防除を行う場合は、拮抗微生物の培養液を、植物を育成している土壌に散布する、又は水耕栽培培地に添加する、植物の種子をコーティングする、等の手法で植物の育成環境に付加することができる。有害物質分解微生物を用いて土壌汚染の浄化を行う場合は、分解微生物の培養液を汚染された土壌に添加混合することができる。
　以下、本発明のより詳細な理解のために、実施例を挙げて本発明を説明するが、以下の記載は、本発明の範囲を実施例に記載の範囲に限定することを意図するものではない。
　実施例１　土壌微生物からの青枯病菌拮抗微生物のスクリーニング
（１）モデル病原菌
　病原菌の拮抗微生物スクリーニングプラットフォームを構築した。理化学研究所バイオリソース研究センター（ＢＲＣ）敷地内の土壌から分離した土壌微生物をスクリーニング源として使用した。モデル病原菌としては、土壌病原菌である青枯病菌（Ｒａｌｓｔｏｎｉａ　ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ）を用いた。青枯病菌の形質転換法は確立されており、実験室での取り扱いが容易なこと、すでに拮抗微生物が資材化されていることから、モデルに適した病原菌として採用した。青枯病菌のＧＦＰ標識株（８１０７ＧＦＰ株）は、国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構より譲渡された（A. Furusawa, et al., J. Phytopathol., Vol. 167, No. 6, pp. 338-343 (2019)を参照のこと）。
（２）生育培地の検討
　まず、スクリーニングに適した生育培地の選別を行った。候補培地として、検討培地としてＬＢ培地（ナカライテスク、＃２００６８－７５）、麦芽エキス培地（Ｍａｌｔ：ＢＤ、＃２１１３２０）、ポテトデキストロース培地（ＰＤ：ＢＤ、＃２５４９２０）、Ｒ２Ａ培地（富士フィルム、＃３９５－０１６８１）、酵母ニトロゲン培地（ＹＮＢ：ＢＤ、＃２３９２１０）、ＰＧＣ培地（Ｂａｃｔｏ（商標）ペプトン　１０．０ｇ、酵母エキス　１．０ｇ、カザミノ酸　１．０ｇ、グルコース　５．０ｇ）、トリプティックソイ培地（ＴＰＳ：Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、＃２２０９２－５００Ｇ）、ＧＡＭ培地（日水製薬、＃５４２２）、ｍＧＡＭ培地（日水製薬、＃５４３３）を用いた。培地の濃度は、それぞれ１倍希釈、１０倍希釈とした。青枯病菌ＧＦＰ標識株には８１０７ＧＦＰ株を用いて、前培養はＰＧＣ培地プレートで、２５℃、２日間行った。その後、菌体をプレートから掻きとって滅菌水に懸濁し、８細胞／培養系（液滴）になるように菌体濃度を調整し、培地と混合してマイクロドロップレットへ封入した。ドロップレットの直径は３０μｍで作成した。マイクロドロップレット内での培養は、２５℃、３日間行った。その結果、８１０７ＧＦＰ株の蛍光強度および増殖度が培地ごとに異なっており、青枯病菌は培地濃度が高い方が生育が良いことがわかった（図３）。
　蛍光量による選抜には、８１０７ＧＦＰ株のマイクロドロップレットの蛍光量が十分に高く、培地そのものからの蛍光量とはっきりとした差が出るものが望ましい。そこで、図３において差が大きく、かつ８１０７ＧＦＰ株が効率よく増殖する培地として、ＰＧＣ培地、ＴＰＳ培地、ｍＧＡＭ培地を選抜した。ＧＡＭ培地は上記条件を満たしているように見えるが、８１０７ＧＦＰ株の増殖が液滴ごとに異なり不安定であったため、本実施例では採用しなかった。
（３）土壌細菌を用いた生育培地の選定
　ＰＧＣ培地、ＴＰＳ培地、ｍＧＡＭ培地を用いて、８細胞／液滴の８１０７ＧＦＰ株、２０個／液滴のＢＲＣ土壌細菌を、それぞれ含む微小液滴を作成し、２５℃、３日間培養した。培養後の微小液滴をＯｎ－ｃｈｉｐ　Ｓｏｒｔ（株式会社オンチップ・テクノロジーズ）に供して、それぞれの微小液滴の大きさと蛍光量を調べた。その結果、微小液滴の直径は３０μｍであり、８１０７ＧＦＰ株の微小液滴の蛍光量が、培地のバックグラウンドの蛍光量および土壌微生物のみ封入した場合の蛍光量と十分な差があるような培地として、ｍＧＡＭ培地とＴＰＳ培地を選抜した（図４）。ＴＰＳ培地よりもｍＧＡＭ培地の方が８１０７ＧＦＰ株の蛍光のＳ／Ｎ比が高く明確に検出できたため、以降の実験ではｍＧＡＭ培地を用いることにした。
（４）モデル拮抗微生物を用いたスクリーニング系構築
　青枯病菌のモデル拮抗微生物を用いて実験系の構築を行った。モデル拮抗微生物は、ＢＲＣ土壌から分離したＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ属＃３－８Ａ株を用いた。＃３－８Ａ株は、青枯病菌を塗布したｍＧＡＭプレート上で、顕著なハロー形成能を持つことが確認された細菌である。そこで、８個／液滴の８１０７ＧＦＰ株と、０、０．１、０．５、１．０、５．０個／液滴の＃３－８Ａ株とをそれぞれｍＧＡＭ培地の微小液滴に同時封入し、２５℃で３日間培養した。併せて、８１０７ＧＦＰ株と＃３－８Ａ株に加えて、１０個／液滴のＢＲＣ土壌細菌を同時封入した液滴についても同様に培養した。その結果、＃３－８Ａ株の存在する微小液滴では、８１０７ＧＦＰ株由来の蛍光が、共存させた＃３－８Ａ株の濃度に依存して低くなることが確認された（図５）。
　培養後の各条件の微小液滴について、Ｏｎ－ｃｈｉｐ　Ｓｏｒｔによる解析を行った（図６）。図６Ａは、８１０７ＧＦＰのみを培養した微小液滴、図６Ｂは８１０７ＧＦＰ、土壌細菌及び０．１個／液滴の＃３－８Ａ株を同時封入して培養した微小液滴のプロット図を示す。図６Ｃは、Ｂのプロット図のうち、枠で囲まれた部分の拡大図である。ＡとＢのプロット図を対比して、Ｃの枠で囲まれたａの部分が８１０７ＧＦＰ株、ｂの部分が＃３－８Ａ株が多く含まれる微小液滴のプロットを示すと推測した。そこで、ａ、ｂのそれぞれに相当する集団についてソーティングを行い、微小液滴中の微生物を、それぞれ、青枯病菌（ここでは８１０７ＧＦＰ株）を塗布したｍＧＡＭプレート上に播種した。併せて、８１０７ＧＦＰ株、＃３－８Ａ株についてもそれぞれ同様にｍＧＡＭプレート上に播種した。図６Ｄに、８１０７ＧＦＰ株、＃３－８Ａ株、画分ａ及び画分ｂの、ｍＧＡＭプレート上でのコロニー写真、ＤＩＣ顕微鏡写真及び蛍光顕微鏡写真を示す。図に示した通り、ｍＧＡＭプレート上で、８１０７ＧＦＰ株はコロニーを形成するもののハロー効果を示さなかったが、＃３－８Ａ株はハロー効果を示した。一方、画分ａ、ｂについて、画分ａはハロー効果を示さず、画分ｂはハロー効果を示した。画分ａ、ｂの挙動は、それぞれ８１０７ＧＦＰ株、＃３－８Ａ株と同様であった。以上の結果から、蛍光量に基づいて８１０７ＧＦＰ株と＃３－８Ａ株を分離できることが示され、これにより、未知の拮抗微生物の単離を行う場合においても、同様に微小液滴を蛍光量でソーティングすることにより、病原菌と分離可能であることが示された。
（５）他の拮抗微生物を用いたスクリーニング系検証
　青枯病菌に対して、＃３－８Ａ株とは異なる原理で拮抗する微生物として、Ｍｉｔｓｕａｒｉａ属ＴＷＲ１１４株およびＲａｌｓｔｏｎｉａ属ＴＣＲ１１２株を使用した。これらの拮抗微生物は、岐阜大学より譲渡を受けた。これらの拮抗微生物は、抗生物質が一部関与するものの、栄養分の競合や抗菌酵素を介した拮抗作用、植物内部で増殖し病原菌の増殖を抑制するなど、他のメカニズムが重要な役割を担うことが知られる（M. Malek, et al., Appl. Soil Ecol., Vol. 128, pp. 71-80 (2018), M. Malek, et al., J. Gen. Plant Pathol. Vol. 85, pp. 142-154 (2019)を参照のこと）。各１個、８個／液滴のＴＷＲ１１４株、ＴＣＲ１１２株を、８個／液滴の８１０７ＧＦＰ株と同時に微小液滴に封入し、２５℃で３日間培養した。培養は、＃３－８Ａ株に代えてＴＷＲ１１４株又はＴＣＲ１１２株を使用した以外は、上記（４）に記載の条件と同様の条件で行った。その結果、ＴＷＲ１１４株と８１０７ＧＦＰ株とを同時封入した微小液滴、ＴＣＲ１１２株と８１０７ＧＦＰ株と同時封入した微小液滴の両方において、８１０７ＧＦＰ株のみを含む微小液滴と比して蛍光量が低下していた（図７）。このことから、本発明のプラットフォームを用いることで、抗生物質産生菌以外の拮抗作用を持つ拮抗微生物も得られることが示された。
　実施例２　土壌微生物からのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ拮抗微生物のスクリーニング
（１）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの拮抗微生物スクリーニング系の構築
　実施例１と同様に、細菌の拮抗微生物スクリーニングプラットフォームを構築した。モデル細菌としては、ヒトの日和見病原細菌の一種である緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）の近縁種の蛍光菌Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓを使用した。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓは蛍光黄緑色色素であるｐｙｏｖｅｒｄｉｎ（別名ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ）を産生し、ＵＶ照射により蛍光を発することが知られている。また、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの色素産生には、同細菌のＫｉｎｇＢ培地での培養が適することが知られている。
　Ｋｉｎｇ　Ｂ培地に懸濁したＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓを、菌体数が０個、１２個、１６個／培養系（液滴）となるように微小液滴に封入し、２５℃で３日間培養した後、明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡での観察を行った。
　図８に、各条件下の微小液滴の明視野顕微鏡写真（ＢＦ）及び蛍光顕微鏡写真（Ｆｌｕｏ）を示す。微小液滴への菌体封入数が１２個／液滴の場合は、菌の増殖が見られない液滴が散見されたが、１６個／液滴の場合は、観察した全ての液滴で菌の増殖が見られた。以後、１６個／液滴の条件で試験を行った。
（２）土壌サンプルからのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ拮抗微生物のスクリーニング
　Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓを含む水、ＫｉｎｇＢ培地のそれぞれに、さらにＢＲＣ土壌細菌を加えた液滴をそれぞれ調製した。Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの封入数は、０個（対照）、１６個／液滴とし、ＢＲＣ土壌細菌の封入数は、０個（対照）、１０個、２０個／液滴とした。封入した液滴を、２５℃で３日間培養した後、明視野顕微鏡及び蛍光顕微鏡での観察を行った。
　図９に、各条件下の微小液滴の明視野顕微鏡写真（ＢＦ）及び蛍光顕微鏡写真（Ｆｌｕｏ）を示す。図中、白線の丸で囲んだ部分は、培養後に蛍光が観察できなかった液滴の位置を示す。土壌微生物を入れることで、全体的に液滴の蛍光強度の低下が見られたが、中には、さらに顕著に蛍光強度が低下した液滴（拮抗微生物が存在するとみられる）が散見されたことから、拮抗微生物のスクリーニング系として使用可能であることが示された。液滴あたりの土壌微生物数を多くすれば、顕著に蛍光強度が低下する液滴が多く発生するが、一方で、全体の蛍光強度が下がり、拮抗微生物を含む液滴の選別が困難になることが予測された。液滴あたりの土壌微生物数は、２０個／液滴程度が適していることが示された。
　水を使用した場合と比較して、ＫｉｎｇＢ培地を使用した場合に、顕著に蛍光強度が低下する液滴が多く見られたことから、ＫｉｎｇＢ培地を使用することで、より多くの拮抗微生物候補が得られることが示された。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (9)

  1. 　微生物を含む懸濁液を、選択用培地を含む培養系に播種して培養することを含む、有用微生物のスクリーニング方法であって、
    　前記懸濁液中の微生物の濃度が、１培養系あたり２個以上に相当する濃度である、方法。
  2. 　前記培養系が微小液滴である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記濃度が、１培養系あたり４個以上、８個以上、１０個以上、２０個以上又は５０個以上に相当する濃度である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記濃度が、１培養系あたり２００個以下、１５０個以下、１００個以下又は５０個以下に相当する濃度である、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記微生物が土壌微生物である、請求項１又は２に記載の方法。
  6. 　前記選択用培地が病原菌を含む培地であって、前記有用微生物が前記病原菌の拮抗微生物である、請求項１又は２に記載の方法。
  7. 　微生物を含む懸濁液を、選択用培地を含む培養系に播種して培養することを含む、微生物集団の製造方法であって、
    　前記懸濁液中の微生物の濃度が、１培養系あたり２個以上に相当する濃度である、方法。
  8. 　１培養系あたり２個以上に相当する濃度の微生物を含む懸濁液を、選択用培地を含む培養系に播種して培養することで得られる、１種又は２種以上の微生物を含む、微生物集団。
  9. 　２種以上の微生物を含む、請求項８に記載の微生物集団。
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