WO2023210401A1 - 皮膚のリンパ管に基づき肌状態を決定する方法 - Google Patents

皮膚のリンパ管に基づき肌状態を決定する方法 Download PDF

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エンフトール ガントゥムル
恭子 井上
健太朗 加治屋
信之 三川
新介 秋田
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    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for determining skin condition using the relationship between the structure and/or form of skin lymph vessels and skin condition, a method for predicting skin lymph vessel structure, and a method for screening skin condition improving drugs.
  • a circulatory system consisting of a vascular system and a lymphatic system runs throughout the living body.
  • Blood vessels are responsible for maintaining body temperature and supplying nutrients and oxygen to tissues throughout the body, while lymphatic vessels are responsible for transporting immune cells and collecting excess tissue fluid and foreign substances.
  • the lymphatic system is composed of lymph capillaries present in peripheral areas, collecting lymph vessels formed by aggregation of lymph capillaries, and lymph nodes located throughout the body. The collecting lymph vessels eventually converge into the thoracic duct or right lymph trunk, which connects to the veins.
  • Lymphatic capillaries have closed, blind ends and are composed of a single layer of squamous epithelial cells.
  • lymph capillaries Compared to capillaries, lymph capillaries have looser connections between endothelial cells and larger intercellular spaces, and can collect large proteins and foreign substances that cannot be collected in blood vessels. When the function of lymph vessels is inhibited for some reason, tissue fluid accumulates in peripheral tissues, causing swelling and edema.
  • Lymphedema is a disease in which swelling occurs due to local lymph fluid increase and/or poor collection. Lymph that seeps into the tissues is collected by the lymph vessels, but it is not collected and accumulates in the limbs, causing swelling. Lymphedema has many causes, but it often occurs after cancer surgery or radiation therapy. When lymphedema occurs, it worsens its appearance and impairs motor function. In addition, due to poor lymph flow, inflammation that occurs at the wound site can spread to the entire limb, resulting in cellulitis. It has also been reported that abnormal proliferation of keratinocytes and condensation of dermal collagen occur in affected areas with lymphedema (Non-Patent Document 1: Emerg Infect Dis. 2004 Nov; 10(11): 1938-1946).
  • Non-Patent Document 2 Surg Radiol Anat 13 (3):221-226. doi:10.1007/ BF01627990. It has been reported that administration of estrogen improves or prevents swelling and lymphedema (Patent Document 1: Japanese Patent Application Laid-Open No. 2013-071913).
  • the purpose of the present invention is to elucidate the relationship between skin lymph vessels and lymphedema, as well as the relationship between skin lymph vessels and the skin, by clarifying the characteristics of skin lymph vessels that cause lymphedema. , thereby providing a method for evaluating lymphedema and further skin conditions.
  • the present inventors focused on the structure and morphology of lymphatic vessels in the skin of patients with lymphedema, and performed three-dimensional visualization and analysis of the structure of lymphatic vessels in the skin extracted from patients with lymphedema. It has been found that the structure and morphology of lymph vessels in the skin change depending on the severity (types 1 to 4) of skin cancer, and the properties of the lymph vessels change accordingly. Furthermore, when we three-dimensionally visualized and analyzed the lymphatic structure of the skin in healthy people of different ages, we found that the morphology of lymphatic vessels changes with age.
  • the invention therefore relates to: [1] A method for determining a skin condition, or a method for determining or providing a cosmetic treatment, based on parameters related to the structure and/or morphology of lymphatic vessels in the skin. [2] The method according to item 1, wherein the parameter regarding the morphology of lymph vessels in the skin is determined by at least one selected from the group consisting of volume, number of branches, and diameter of lymph vessels. [3] The method according to item 2, wherein when the parameter related to the morphology of lymph vessels in the skin is the diameter of lymph vessels, it is determined that the skin condition is worsening due to a change in the diameter of lymph vessels.
  • the screening method according to item 12 comprising: [14] The method according to item 13, wherein the skin is cultured skin containing lymphatic structure. [15] A step of culturing lymphatic endothelial cells in a medium containing a candidate drug; A step of measuring VE-cadherin expression in lymphatic endothelial cells after culture; Comparing the expression level of VE-cadherin with a control; The screening method according to item 12, comprising the step of selecting a candidate drug as a skin condition improving drug based on changes in VE-cadherin expression. [16] A drug for improving skin condition, including an agent for increasing the diameter of skin lymph vessels.
  • the present invention it is possible to determine the skin condition, especially lymphedema, based on the structure and/or morphology of lymph vessels in the skin.
  • FIG. 1A shows three-dimensional images of lymph vessels in normal skin (normal) and skin of lymphedema patients (types 1 to 4).
  • FIG. 1B shows the results of measuring the volume of lymph vessels from a three-dimensional image of lymph vessels.
  • FIG. 1C shows the results of measuring the diameter of a lymphatic vessel from a three-dimensional image of the lymphatic vessel.
  • FIG. 1D shows the results of measuring the number of branches of lymph vessels from a three-dimensional image of lymph vessels.
  • FIG. 2 shows the results of fluorescence staining and photographing of VE-cadherin in normal skin (normal) and skin of lymphedema patients (type 2, type 4).
  • FIG. 1A shows three-dimensional images of lymph vessels in normal skin (normal) and skin of lymphedema patients (types 1 to 4).
  • FIG. 1B shows the results of measuring the volume of lymph vessels from a three-dimensional image of lymph vessels.
  • FIG. 1C shows the results of measuring the diameter of a lymphatic vessel from a three-dimensional
  • FIG. 3A shows three-dimensional images of lymph vessels in the cheek skin of a person in their 20s and the cheek skin of a person in their 60s.
  • FIG. 3B shows the results of measuring the volume of lymph vessels from three-dimensional images of lymph vessels in young people (26 to 45 years old) and middle-aged people (46 to 67 years old).
  • FIG. 3C shows the results of measuring the diameter of lymph vessels from three-dimensional images of lymph vessels in young people (26 to 45 years old) and middle-aged people (46 to 67 years old).
  • Figure 3D shows the results of measuring the number of lymphatic vessel branches from three-dimensional images of lymphatic vessels in young people (26 to 45 years old) and middle-aged people (46 to 67 years old).
  • Figure 4 shows the intensity of R-CHP measured in stained photographs obtained by R-CHP/Hoechst staining on normal skin (normal) and skin of lymphedema patients (type 1 + type 2, type 3 + type 4). The results are shown below.
  • the present invention relates to a method for determining skin condition based on parameters related to the structure and/or morphology of skin lymph vessels.
  • Skin lymph vessels can be observed by performing known observation techniques on the skin.
  • Techniques for observing lymph vessels include scintigraphy, indocyanine green fluorescence angiography (ICG), redundant skin staining, optical coherence tomography, and optical ultrasound imaging.
  • Microscopic lymph vessels that exist in the dermis of the skin are particularly called lymph capillaries, and can be observed using these techniques.
  • lymphedema Although scintigraphy is an established method for diagnosing lymphedema and is capable of visualizing lymph fluid and its flow in living organisms, the use of isotopes as contrast media places a heavy burden on patients.
  • the ICG contrast method has also been established as a method for diagnosing lymphedema, and lymph fluid and its flow can be visualized by subcutaneously injecting indocyanine green.
  • these methods for labeling lymph fluid can visualize relatively large collecting lymph vessels and determine the transport capacity of lymph vessels, the lymph fluid exudates into the tissue, making it possible to visualize relatively large collecting lymph vessels. There is a problem in that the background of lymphatic capillaries in the peripheral region becomes high.
  • a skin sample can be fluorescently labeled specifically in lymph vessels by using an anti-podoplanin antibody as a primary antibody and a fluorescently labeled secondary antibody. By making it transparent using a transparentizing reagent, observation using a light sheet microscope becomes possible (Patent Document 3: International Publication No. 2018/030520).
  • Optical coherence tomography is a method that uses coherent near-infrared broadband light to image a vertical cross section of the measurement target as a backscattered intensity distribution, and obtains a three-dimensional image of the microstructure of the skin.
  • Non-patent document 3 Sci Rep. 2016 Feb 19;6:21122. doi: 10.1038/srep21122.
  • Photo-ultrasonic imaging uses an ultrasonic sensor to receive ultrasonic waves emitted by tissues that have absorbed pulsed light emitted from a laser, and can obtain three-dimensional images in real time by performing parallel signal processing on the received signals.
  • Non-patent document 4 F1000Res. 2018; 7: 1813. doi: 10.12688/f1000research.16743.2
  • Lymph vessels in the dermis can be analyzed in terms of volume, diameter, and number of branches.
  • the volume of lymph vessels relates to the proportion of lymph vessels in the dermis to a unit volume.
  • the diameter of a lymphatic vessel can be expressed as the average diameter calculated by calculating the diameter over the entire length of a lymphatic vessel in the dermis.
  • the number of branches of a lymphatic vessel can be expressed as the number of branches included in a unit volume.
  • the volume, diameter, and number of branches can be appropriately determined for a three-dimensionally constructed lymphatic vessel by computer processing.
  • Imaris3D/4D image analysis software Zeiss
  • Zeiss Imaris3D/4D image analysis software
  • Parameters related to the morphology of lymphatic vessels in the skin can be determined by at least one selected from the group consisting of volume, diameter, and number of branches of lymphatic vessels.
  • the volume, diameter, and number of branches may each be used as parameters related to the morphology.
  • a new parameter may be derived by combining at least two parameters among volume, number of branches, and diameter.
  • the diameter threshold can be set to, for example, 40 ⁇ m or 35 ⁇ m, and lymphedema can be determined when the diameter is lower than the threshold.
  • the volume threshold can be set to, for example, 2.5% or 2.0%, and lymphedema can be determined when the volume is lower than the threshold.
  • lymphedema can also be determined by further taking into account the number of branches of lymphatic vessels in the skin. As an example, if the diameter and/or volume of cutaneous lymph vessels decreases while the number of branches of cutaneous lymph vessels increases, this indicates that the cutaneous lymph vessels have become thinner and have more branches. This shows that lymphedema can be determined in its early stages.
  • a decrease in the diameter and/or volume of the skin lymph vessels, as well as a decrease in the number of branches of the skin lymph vessels, indicates that the lymph vessels have degenerated, leading to lymphedema and further skin conditions.
  • Deterioration ie, advanced lymphedema, can be determined.
  • lymphedema increases the thickness of the epidermis, including the stratum corneum (Non-Patent Document 1). Further, as lymphedema worsens, collagen production increases and degeneration occurs in the dermis ( Figure 4). Then, worsening of lymphedema is also associated with worsening of skin condition. Thereby, the skin condition can also be determined by determining the severity of lymphedema. Therefore, the skin condition can be determined based on parameters related to the structure and/or morphology of skin lymph vessels. More specifically, changes in the volume, diameter, or number of branches of skin lymph vessels can be associated with deterioration of skin condition. It can be determined that the skin condition is worsening if the volume and/or diameter decreases. Furthermore, the skin condition can also be determined by further taking into account the number of branches of lymphatic vessels in the skin.
  • the morphology of skin lymph vessels also changes depending on age (Figure 3A). There is a tendency for the volume of lymph vessels to decrease with age (Figure 3B). Furthermore, in young people, the diameter of lymph vessels in the skin is large and the number of branches is small, while in middle-aged and elderly people, the diameter of lymph vessels is small and the number of branches is large (FIGS. 3C and D). Since skin conditions worsen with age, lymphatic vessel morphology has been shown to be related to skin conditions even in normal skin. Therefore, the morphology of lymph vessels in the skin is not only an indicator of the degree of deterioration of the pathological condition of lymphedema, but also an indicator of the deterioration of normal skin.
  • the diameter threshold can be set to, for example, 35 ⁇ m or 30 m, and if the diameter is lower than the threshold, it can be determined that the skin condition is worsening.
  • the volume threshold can be set as appropriate, and for example, 2.5% or 2.0% can be used. If it is lower than such a threshold, it can be determined that the skin condition is deteriorating.
  • the skin condition can also be determined by further taking into account the number of branches of lymphatic vessels in the skin. As an example, if the diameter and/or volume of cutaneous lymph vessels decreases while the number of branches of cutaneous lymph vessels increases, this indicates that the cutaneous lymph vessels have become thinner and have more branches. Shows and allows you to determine your skin condition. Determination of skin condition is done for cosmetic purposes.
  • Cosmetic treatments can be provided to maintain the health of the lymphatic vessels when it is determined that the lymphatic vessels have become narrower, have decreased volume, and/or have an increased number of branches.
  • Such cosmetic treatments may include skin massage and presentation of appropriate cosmetics such as skin condition improving agents.
  • another aspect of the invention also relates to a method for determining or providing a cosmetic treatment based on parameters relating to the structure and/or morphology of lymphatic vessels in the skin.
  • the skin condition improving agent provided is preferably a skin condition improving agent screened by the screening method of the present invention.
  • VE-cadherin in the cutaneous lymph vessels can be mentioned as a parameter related to the structure of the cutaneous lymph vessels.
  • the expression level of VE-cadherin in skin lymph vessels increases ( Figure 2). Therefore, the expression level of VE-cadherin in the lymphatic vessels of the skin can be correlated with the severity of lymphedema.
  • the expression level of VE-cadherin can be observed by staining a skin sample and using a fluorescence microscope using an anti-VE-cadherin antibody and a fluorescently labeled secondary antibody.
  • VE-cadherin is present in both lymph vessels and blood vessels, so in order to distinguish between lymph vessels and blood vessels, co-staining with podoplanin, which is specifically expressed in lymph vessels, may be performed, or it may be possible to distinguish between lymph vessels and blood vessels based on the structure of the vessels. It may also be distinguished from lymph vessels.
  • the measurement may be performed by isolating lymph vessels from a skin sample and measuring the protein amount or mRNA amount of the isolated lymph vessels. The amount of protein or mRNA can be measured based on conventional methods, such as Western blotting or quantitative PCR. It has been shown that as lymphedema worsens, the expression level of VE-cadherin in skin lymph vessels increases.
  • VE-cadherin is a protein with a molecular weight of about 140 kDa, also called cadherin-5 or CD144, and belongs to the cadherin superfamily. VE-cadherin is specific to endothelial cells, is expressed in lymphatic endothelial cells and vascular endothelial cells, and is present in cell membranes (Patent Document 2: International Publication No. 2019/097958). VE-cadherin molecules are known to be involved in the permeability of vascular and lymphatic endothelium. Without intending to be limited by theory, increased expression of VE-cadherin may increase adhesion between lymphatic endothelial cells and inhibit lymph fluid collection.
  • Another aspect of the present invention may relate to a method of predicting the lymphatic structure of the skin from the skin condition based on the relationship between parameters based on the structure and/or morphology of the lymphatic vessels of the skin and the skin condition.
  • the lymphatic structure of the skin can be predicted, and thereby the progression of swelling and edema can be predicted.
  • the present invention also relates to a method for screening skin condition improving drugs using parameters related to the morphology of skin lymph vessels as an index. More specifically, the screening method of the present invention includes the following steps: adding a candidate drug to the skin; a step of photographing the morphology of lymph vessels in the skin after addition; calculating parameters regarding the morphology of lymph vessels based on the captured images; a step of comparing parameters regarding the morphology of lymph vessels in the skin before addition of the candidate drug or in a control drug addition group; and a step of selecting the candidate drug as a skin condition improving drug based on the change in the parameter. including.
  • candidate drugs can be screened as skin condition improving agents.
  • the volume, number of branches, and/or diameter of lymph vessels can be used as parameters regarding the morphology of lymph vessels in the skin.
  • the candidate agent may be repeatedly added to the skin over a period of time during which changes in parameters related to lymphatic vessel morphology occur.
  • the control drug added group may differ only in that no candidate drug is added.
  • the skin used in the screening method of the present invention may be cultured skin containing lymphatic structure, cultured tissue of surplus skin, animal skin, or skin of a living human body.
  • the invention also relates to a method for screening skin condition improving drugs based on VE-cadherin expression in skin lymphatic cells. More specifically, the screening method of the present invention is as follows: adding a candidate drug to the skin; measuring VE-cadherin expression in skin lymphatic cells after addition; a step of comparing the expression of VE-cadherin in the skin lymph vessels before addition of the candidate drug or a control drug addition group; and a step of selecting the candidate drug as a skin condition improving drug based on the change in VE-cadherin expression. including.
  • candidate drugs capable of suppressing VE-cadherin expression in skin lymph vessels can be screened as skin condition improving agents.
  • the control drug added group may differ only in that no candidate drug is added.
  • the skin used in the screening method of the present invention may be cultured skin containing lymphatic structure, cultured tissue of surplus skin, or animal skin.
  • the screening method may be performed on cultures of lymphatic cells. Specifically: culturing lymphatic vessel cells in a medium containing a candidate drug; measuring VE-cadherin expression in lymphatic cells after culture; The method includes a step of comparing the expression level of VE-cadherin with a control, and a step of selecting a candidate drug as a skin condition improving drug based on the change in VE-cadherin expression.
  • the lymphatic cells may be cultured alone or in combination with other cells, and the control may be a group that differs only in the absence of the candidate agent or the candidate agent. It may be a group before drug addition. For example, it may be cultured as a skin culture.
  • Candidate drugs capable of suppressing VE-cadherin expression in lymphatic cells can be screened as skin condition improving agents. Lymphatic cells are especially lymphatic endothelial cells.
  • any drug included in any library can be used.
  • a known cosmetic material library or pharmaceutical library may be used.
  • These libraries may be compound libraries or extract libraries.
  • the skin condition improving agent refers to a drug that can improve the general properties of the skin, particularly the skin conditions related to lymphedema or swelling.
  • the skin condition improving agent may be incorporated into cosmetics, pharmaceuticals, or quasi-drugs, or may be incorporated into foods, such as nutritional supplements such as supplements.
  • improving the expression of VE-cadherin and the function of lymphatic vessels in the skin can improve skin conditions, particularly swelling or lymphedema. Therefore, the skin condition improving agent can also be referred to as an agent for treating, preventing or improving swelling or lymphedema, and can also be referred to as an agent for increasing the diameter and/or volume of lymph vessels.
  • the skin condition improving agent can be administered by any route such as transdermally, mucosally, orally, subcutaneously, or intramuscularly, but transdermal administration is preferred from the viewpoint of acting on the lymphatic vessels directly under the skin.
  • Example 1 Analysis of lymph vessels in skin samples from lymphedema patients Surgical surplus skin and normal lower branches of lower limb lymphedema patients whose severity of lymphedema (types 1 to 4) was determined using lymphoscintigraphy Skin samples were provided by Chiba University Hospital. Informed consent was obtained from each patient for the use of excess skin in experiments.
  • the excess skin tissue of the lower limbs was heat treated (60°C, 1 minute) to peel off the epidermis and fixed overnight with 4% paraformaldehyde (PFA)/physiological saline (PBS). PFA-fixed skin tissue was permeabilized overnight with 2% Triton-X100/PBS, and then blocked overnight with 5% donkey serum/PBS. Thereafter, it was incubated for 3 days with anti-podoplanin antibody (Dako Cytomation, #M3619)/5% donkey serum/PBS as the primary antibody, washed with PBS, and Alexa647-labeled anti-mouse (H+L) antibody (Invitrogen)/as the secondary antibody.
  • PFA paraformaldehyde
  • PBS physiological saline
  • Heat treatment 60°C, 1 minute was applied to the excess skin tissue of the lower limbs to peel off the epidermis, which was fixed overnight in 4% paraformaldehyde (PFA)/physiological saline (PBS).
  • PFA paraformaldehyde
  • PBS physiological saline
  • the PFA-fixed skin tissue was defatted using CUBIC-L (Wako) at 37°C for one week, and then blocked overnight with 5% donkey serum/PBS. Thereafter, it was incubated for 3 days with anti-VE-cadherin antibody (Cell signaling, #2500)/5% donkey serum/PBS as the primary antibody, washed, and Alexa568-labeled anti-rabbit (H+L) antibody (Invitrogen) as the secondary antibody.
  • Cell signaling #2500
  • H+L Alexa568-labeled anti-rabbit
  • Example 2 Age-related changes in lymph vessels in healthy subjects Excess cheek skin of women in their 20s to 60s was treated with Obio, LLC. Obtained from. The excess skin tissue on the cheek was heat treated (60° C., 1 minute) to peel off the epidermis and fixed overnight with 4% paraformaldehyde (PFA)/physiological saline (PBS). PFA-fixed skin tissue was permeabilized overnight with 2% Triton-X100/PBS, and then blocked overnight with 5% donkey serum/PBS.
  • PFA paraformaldehyde
  • PBS physiological saline
  • the cells were incubated for 3 days with anti-podoplanin antibody (Dako Cytomation, #M3619)/5% donkey serum/PBS as the primary antibody, washed with PBS, and Alexa647-labeled anti-mouse (H+L) antibody (Invitrogen)/as the secondary antibody. Incubated overnight with 5% donkey serum/PBS.
  • the immunostained skin tissue was immersed in a clearing reagent: Rapiclear 1.52 (SunJin Lab Co.) to make it transparent.
  • the sample thus obtained was observed under a fluorescence microscope using LSM880 (ZEISS), and a three-dimensional image of the skin lymph vessels was obtained (FIG. 3A).
  • the diameter and number of branches of lymph vessels were determined using Imaris3D/4D image analysis software (ZEISS) (FIGS. 3B and 3C).
  • ZEISS Imaris3D/4D image analysis software
  • the morphology of lymphatic vessels in the skin also changed with age (Fig. 3A).
  • Fig. 3B There was a tendency for the volume of lymph vessels to decrease with age (Fig. 3B).
  • the diameter of lymph vessels was large and the number of branches was small, while in middle-aged and elderly people, the diameter of lymph vessels was small and the number of branches was large (Fig. 3C and D).
  • Example 3 Degeneration of collagen in skin samples derived from lymphedema patients Surgical surplus skin of lower limb lymphedema patients whose lymphedema severity (types 1 to 4) was determined using lymphoscintigraphy, and as a control. Normal lower limb skin samples were provided by Chiba University Hospital. Informed consent was obtained from each patient for the use of excess skin in experiments.
  • the skin samples were frozen and frozen sections with a thickness of 50 ⁇ m were obtained.
  • the frozen sections were stained for denatured collagen using R-CHP (3Helix Inc.) according to the protocol. Denatured collagen was quantified using the image analysis software Fiji on the stained images (FIG. 4). Exacerbation of lymphedema increased denatured collagen production in the dermis.

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Abstract

皮膚のリンパ管とリンパ浮腫との関係、さらには皮膚のリンパ管と皮膚との関係を解明することを目的とし、それによりリンパ浮腫、さらには肌状態の評価方法を提供することを目的とする。皮膚のリンパ管の構造及び/又は形態に関するパラメータが、皮膚のリンパ浮腫さらには肌状態と関係することを見出し、皮膚のリンパ管の構造及び/又は形態に基づき肌状態を評価する方法を提供する。

Description

皮膚のリンパ管に基づき肌状態を決定する方法
　本発明は、皮膚のリンパ管の構造及び/又は形態と肌状態との関連を利用した肌状態の決定方法、皮膚のリンパ管構造を予測する方法、及び肌状態改善薬のスクリーニング方法に関する。
　生体には血管系及びリンパ系からなる循環系が張り巡らされている。血管は体温の維持や、全身の組織に対する栄養や酸素の供給を担っている一方で、リンパ管は免疫細胞の輸送、過剰な組織液や異物の回収を担っている。リンパ系は、抹消部位に存在する毛細リンパ管と、毛細リンパ管が集合して形成する集合リンパ管、及び体内のところどころに存在するリンパ節から構成されている。集合リンパ管は、最終的に胸管又は右リンパ本幹にまとまり、静脈に繋がっている。毛細リンパ管は、先端が閉じられた盲端であり、単層扁平上皮細胞から構成される。毛細リンパ管は、毛細血管と比較して、内皮細胞間の接合が緩く、細胞間隙が大きく、血管では回収できない大きなタンパク質や異物なども回収することができる。リンパ管の機能が何らかの理由で阻害されて、組織液が抹消組織において溜まることで、むくみや浮腫が生じる。
　リンパ浮腫は、局所におけるリンパ液の増大及び／又は回収不良に起因してむくみが生じる疾患である。組織に滲出したリンパ液はリンパ管に回収されるが、回収されずに四肢にたまることで、むくみが生じる。リンパ浮腫の原因はさまざまであるが、癌の手術や放射線治療後に生じることが多い。リンパ浮腫が生じると、その外観が悪化するとともに、運動機能が障害される。また、リンパ液の流れが悪いことに起因して、傷口に生じた炎症が四肢全体に広がり、蜂窩織炎を生じうる。またリンパ浮腫を生じた患部において、ケラチノサイトの異常増殖、真皮コラーゲンの凝縮が生じることが報告されている（非特許文献１：Emerg Infect Dis. 2004 Nov; 10(11): 1938-1946）。
　癌手術後に発症するリンパ浮腫は患者のＱＯＬを著しく下げる一方、その詳細な生理的な知見は少なく、その治療法としては、マッサージによるリンパドレナージや、弾性包袋、着衣等による圧迫や、運動などが挙げられる。また、閉経後の女性においてリンパ循環が減少することが報告されており、むくみの原因の一つとなっている（非特許文献２：Surg Radiol Anat 13 (3):221-226. doi:10.1007/BF01627990）。そしてエストロゲンの投与により、むくみやリンパ浮腫を改善又は予防することが報告されている（特許文献１：特開２０１３－０７１９１３号）
特開２０１３－０７１９１３号公報 国際公開第２０１９／０９７９５８号 国際公開第２０１８／０３０５２０号
Emerg Infect Dis. 2004 Nov; 10(11): 1938-1946 Surg Radiol Anat 13 (3):221-226. doi:10.1007/BF01627990 Sci Rep. 2016 Feb 19;6:21122. doi: 10.1038/srep21122 F1000Res. 2018; 7: 1813. doi: 10.12688/f1000research.16743.2
　本発明は、リンパ浮腫を引き起こす皮膚のリンパ管の特性を明らかにすることで、皮膚のリンパ管とリンパ浮腫との関係、さらには皮膚のリンパ管と皮膚との関係を解明することを目的とし、それによりリンパ浮腫、さらには肌状態の評価方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、リンパ浮腫の患者における皮膚のリンパ管の構造及び形態に着目し、リンパ浮腫患者から摘出した皮膚のリンパ管の構造を３次元的に可視化し解析を行ったところ、リンパ浮腫の重症度（１型～４型）に応じて、皮膚のリンパ管の構造及び形態が変化し、それによりリンパ管の性質が変化するという点を見出した。また、年齢の異なる健常人においても皮膚のリンパ管構造を３次元的に可視化し解析したところ、加齢に伴いリンパ管の形態が変化することを見出した。
　そこで本発明は以下に関する：
［１]　皮膚のリンパ管の構造及び/又は形態に関するパラメータに基づき、肌状態を決定する方法、又は美容処置を決定もしくは提供する方法。
［２]　前記皮膚のリンパ管の形態に関するパラメータが、リンパ管の体積、分岐数及び直径からなる群から選ばれる少なくとも１により決定される、項目１に記載の方法。
［３]　前記皮膚のリンパ管の形態に関するパラメータが、リンパ管の直径である場合に、リンパ管直径の変化により、肌状態が悪化していると決定する、項目２に記載の方法。
［４]　前記皮膚のリンパ管の形態に関するパラメータが、さらにリンパ管の分岐数も考慮し、肌状態が悪化していると決定する、項目３に記載の方法。
［５]　前記皮膚のリンパ管の形態が、光干渉断層装置又は光超音波イメージングにより測定される、項目１～４のいずれか一項に記載の方法。
［６]　前記皮膚のリンパ管の構造に関するパラメータが、皮膚のリンパ管におけるＶＥ－カドヘリンの発現量により決定される、項目１～５のいずれか一項に記載の方法。
［７]　皮膚のリンパ管における前記ＶＥ－カドヘリンの発現の増加により、肌状態が悪化していると決定する、項目６に記載の方法。
［８]　皮膚のリンパ管の形態に関するパラメータを指標とした、肌状態改善薬のスクリーニング方法。
［９]　候補薬剤を皮膚に添加する工程、
　添加後の皮膚のリンパ管の形態を撮影する工程、
　撮影された画像に基づき皮膚のリンパ管の形態に関するパラメータを計算する工程、
　候補薬剤添加前又は対照薬剤添加群の皮膚における皮膚のリンパ管形態に関するパラメータと比較する工程、そして
　パラメータの変化に基づき、候補薬剤を肌状態改善薬として選択する工程、
　を含む項目８に記載のスクリーニング方法。
［１０]　前記皮膚のリンパ管の形態に関するパラメータが、リンパ管の体積、分岐数及び直径からなる群から選ばれる少なくとも１により決定される、項目９に記載の方法。
［１１]　前記皮膚が、リンパ管構造を含む培養皮膚である、項目９又は１０に記載の方法。
［１２]　リンパ管内皮細胞のＶＥ－カドヘリン発現量を指標とした、肌状態改善薬のスクリーニング方法。
[１３]　候補薬剤を皮膚に添加する工程、
　添加後の皮膚のリンパ管内皮細胞におけるＶＥ－カドヘリン発現を測定する工程、
　候補薬剤添加前又は対照薬剤添加群の皮膚のリンパ管内皮細胞におけるＶＥ－カドヘリン発現と比較する工程、そして
　ＶＥ－カドヘリン発現量の変化に基づき、候補薬剤を肌状態改善薬として選択する工程、
　を含む、項目１２に記載のスクリーニング方法。
[１４]　前記皮膚が、リンパ管構造を含む培養皮膚である、項目１３に記載の方法。
[１５]　候補薬剤を含む培地中でリンパ管内皮細胞を培養する工程
　培養後のリンパ管内皮細胞におけるＶＥ－カドヘリン発現を測定する工程、
　対照におけるＶＥ－カドヘリン発現量と比較する工程、
　ＶＥ－カドヘリン発現変化に基づき、候補薬剤を肌状態改善薬として選択する工程
　を含む、項目１２に記載のスクリーニング方法。
[１６]　皮膚のリンパ管の直径の増大剤を含む、肌状態改善用薬剤。
　本発明によると、皮膚のリンパ管の構造及び/又は形態に基づいて肌状態、特にリンパ浮腫を決定することが可能になる。
図１Ａは、正常皮膚（正常）とリンパ浮腫患者の皮膚（１型～４型）において、リンパ管を撮影した３次元画像を示す。図１Ｂは、リンパ管の３次元画像からリンパ管の体積を計測した結果を示す。図１Ｃは、リンパ管の３次元画像からリンパ管の直径を計測した結果を示す。図１Ｄはリンパ管の３次元画像からリンパ管の分岐数を計測した結果を示す。 図２は、正常皮膚（正常）と、リンパ浮腫患者の皮膚（２型、４型）において、ＶＥ－カドヘリンを蛍光染色して撮影した結果を示す。 図３Ａは、２０代の頬皮膚と６０代の頬皮膚において、リンパ管を撮影した３次元画像を示す。図３Ｂは、若年層（２６～４５歳）と中高年層（４６歳～６７歳）のリンパ管の３次元画像からリンパ管の体積を計測した結果を示す。図３Ｃは、若年層（２６～４５歳）と中高年層（４６歳～６７歳）のリンパ管の３次元画像からリンパ管の直径を計測した結果を示す。図３Ｄは若年層（２６～４５歳）と中高年層（４６歳～６７歳）のリンパ管の３次元画像からリンパ管の分岐数を計測した結果を示す。 図４は、正常皮膚（正常）とリンパ浮腫患者の皮膚（１型＋２型、３型＋４型）において、Ｒ－ＣＨＰ／ヘキスト染色をして得た染色写真において、Ｒ－ＣＨＰの強度を測定して比較した結果を示す。
　本発明は、皮膚のリンパ管の構造及び/又は形態に関するパラメータに基づき、肌状態を決定する方法に関する。
　皮膚のリンパ管は、皮膚に対し既知の観察手法を行うことで観察することができる。リンパ管を観察する手法としては、シンチグラフィー、インドシアニングリーン蛍光造影法（ＩＣＧ）、余剰皮膚染色、光干渉断層法及び光超音波イメージングが挙げられる。皮膚の真皮に存在する微細なリンパ管を特に毛細リンパ管といい、これらの手法により観察することができる。
　シンチグラフィーは、リンパ浮腫診断法として確立しており生体におけるリンパ液及びその流れを可視化することができるものの、造影剤としてアイソトープを使用する点で患者への負担が大きかった。ＩＣＧ造影法についても、リンパ浮腫診断法として確立されており、インドシアニングリーンを皮下に注射することで、リンパ液及びその流れを可視化することができる。リンパ液を標識するこれらの手法は、比較的大きな集合リンパ管を可視化することが可能であり、リンパ管の輸送能を決定することができるものの、組織中にリンパ液が滲出していることから、組織抹消部における毛細リンパ管についてはバックグランドが高くなるという課題がある。一方、余剰皮膚を染色して蛍光顕微鏡を用いて観察することで、より小さい構造の皮膚に存在する毛細リンパ管の３次元構造を構築することが可能になった。皮膚の染色は、リンパ管特異的に発現するタンパク質を標的とすることができる。このようなタンパク質としては、ポドプラニンなどが挙げられる。一例として、皮膚試料について、抗ポドプラニン抗体を一次抗体として用い、蛍光標識二次抗体を用いることで、リンパ管特異的に蛍光標識することができる。透明化試薬を用いて透明化することで、ライトシート顕微鏡による観察が可能になる（特許文献３：国際公開第２０１８／０３０５２０号）。
　光干渉断層法（ＯＣＴ）は、コヒーレンスな近赤外広帯域光を利用して，測定対象の垂直断層を後方散乱強度分布として画像化する手法であり、皮膚の微細構造の３次元画像を取得することができる（非特許文献３：Sci Rep. 2016 Feb 19;6:21122. doi: 10.1038/srep21122）。光超音波イメージングは、レーザーから照射されたパルス光を吸収した組織が発する超音波を超音波センサにより受信し、受信した信号を並列信号処理することでリアルタイムに３次元画像を取得することができる（非特許文献４：F1000Res. 2018; 7: 1813. doi: 10.12688/f1000research.16743.2）
　リンパ管観察手法により可視化され、３次元構築された真皮のリンパ管、特に毛細リンパ管について、体積、直径及び分岐数により解析することができる。リンパ管の体積は、単位体積に占める真皮のリンパ管の割合に関する。リンパ管の直径は、真皮のリンパ管の全長に渡って直径を計算し、その平均直径として表すことができる。リンパ管の分岐数は、単位体積に含まれる分岐数として表すことができる。体積、直径及び分岐数は、３次元構築されたリンパ管について、コンピュータ処理により適宜決定することができる。一例として、Ｉｍａｒｉｓ３Ｄ／４Ｄ画像解析ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を用いることで、３次元構築されたリンパ管の体積、直径及び分岐数を決定することができる。
　皮膚のリンパ管の形態に関するパラメータは、リンパ管の体積、直径、及び分岐数からなる群から選ばれる少なくとも１により決定されうる。体積、直径、及び分岐数をそれぞれそのまま形態に関するパラメータとしてもよい。さらに、体積、分岐数及び直径のうちの少なくとも２つのパラメータを組み合わせて、新たなパラメータを導いてもよい。
　リンパ浮腫が悪化するに伴い、皮膚のリンパ管の直径および体積が減少する（図１Ａ、Ｂ、Ｃ）。したがって、皮膚のリンパ管の直径と、リンパ浮腫の重症度とを関連付けることができる。また、早期のリンパ浮腫（１型および２型）では分岐数が増大し、次いで進行リンパ浮腫（３型および４型）ではリンパ管が縮退するとともに分岐数が減少する（図１Ａ、Ｄ）。したがって、皮膚のリンパ管の形態に関するパラメータ、例えば体積、直径又は分岐数の変化をリンパ浮腫の重症度と関連付けることができ、さらにはリンパ管の形態に関するパラメータについてリンパ浮腫の重症度と関連付けた閾値を設定することもできる。一例として、直径の閾値について、例えば４０μｍ又は３５μｍを設定することができ、斯かる閾値よりも低い場合にリンパ浮腫であると決定することができる。一例として、体積の閾値について、例えば２．５％又は２．０％を設定することができ、斯かる閾値よりも低い場合にリンパ浮腫であると決定することができる。さらに、皮膚のリンパ管の分岐数をさらに考慮に入れてリンパ浮腫を決定することもできる。一例として、皮膚のリンパ管の直径及び/又は体積が減少した一方、皮膚のリンパ管の分岐数が増大している場合、皮膚のリンパ管はより分岐数の多い細い状態となっていることを示しており、早期のリンパ浮腫であることを決定することができる。一方、皮膚のリンパ管の直径及び/又は体積が減少し、さらに皮膚のリンパ管の分岐数が減少した場合には、リンパ管が縮退したことを示しており、リンパ浮腫及び肌状態の更なる悪化、すなわち進行リンパ浮腫を判定することができる。
　リンパ浮腫と肌状態との関係も知られており、リンパ浮腫により角層を含む表皮の厚さが増大することが知られている（非特許文献１）。また、リンパ浮腫の悪化により、真皮においてコラーゲン産生が増大し、かつ変性する（図４）。そうすると、リンパ浮腫の悪化は肌状態の悪化とも関連する。これにより、リンパ浮腫の重症度を判定することにより、肌状態を決定することもできる。したがって、皮膚のリンパ管の構造及び／又は形態に関するパラメータに基づき、肌状態を決定することができる。より具体的に、皮膚のリンパ管の体積、直径又は分岐数の変化を肌状態の悪化と関連付けることができる。体積及び／又は直径が減少した場合に、肌状態が悪化していると決定することができる。さらに、皮膚のリンパ管の分岐数をさらに考慮に入れて肌状態を決定することもできる。
　皮膚のリンパ管の形態は、年齢に応じても変化する（図３Ａ）。加齢に伴いリンパ管の体積は減少する傾向が見られる（図３Ｂ）。また、若年層では、皮膚のリンパ管の直径は大きく、かつ分岐数は少ない一方、中高年層ではリンパ管の直径は小さくなり、分岐数が多くなる（図３Ｃ及びＤ）。加齢により肌状態は悪化することから、正常皮膚でもリンパ管形態は肌状態と関連することが示されている。したがって、皮膚のリンパ管の形態は、リンパ浮腫という病的状態の悪化度の指標となるのみではなく、正常皮膚の悪化の指標となる。一例として、直径の閾値について、例えば３５μｍ又は３０ｍを設定することができ、斯かる閾値よりも低い場合に肌状態が悪化していると決定することができる。体積の閾値について、適宜設定することができ、一例として、２．５％、又は２．０％を使用することができる。斯かる閾値よりも低い場合に肌状態が悪化していると決定することができる。さらに、皮膚のリンパ管の分岐数をさらに考慮に入れて肌状態を決定することもできる。一例として、皮膚のリンパ管の直径及び/又は体積が減少した一方、皮膚のリンパ管の分岐数が増大している場合、皮膚のリンパ管はより分岐数の多い細い状態となっていることを示しており、肌状態の閣下を決定することができる。肌状態の決定は、美容目的で行われる。リンパ管が細く、体積が少なくなり、及び／又は分岐数が増大していることが判定された場合に、リンパ管の健康状態を維持するための美容処置を提供することができる。かかる美容処置としては、皮膚のマッサージや、肌状態改善剤などの適切な化粧料の提示などが行われうる。したがって、本発明の別の態様では、皮膚のリンパ管の構造及び/又は形態に関するパラメータに基づき美容処置を決定又は提供する方法にも関する。提供される肌状態改善剤は、本発明におけるスクリーニング方法によりスクリーニングされた肌状態改善剤が好ましい。
　皮膚のリンパ管の構造に関するパラメータとして、皮膚のリンパ管におけるＶＥ－カドヘリンの発現が挙げられる。リンパ浮腫が悪化するに伴い、皮膚のリンパ管におけるＶＥカドヘリンの発現量が増大する（図２）。したがって、皮膚のリンパ管におけるＶＥカドヘリンの発現量と、リンパ浮腫の重症度とを関連付けることができる。ＶＥ－カドヘリンの発現量は、皮膚試料を染色して、抗ＶＥ－カドヘリン抗体と蛍光標識二次抗体を用いた蛍光顕微鏡を用いて観察することができる。ＶＥ－カドヘリンはリンパ管と血管の両方に存在するため、リンパ管と血管とを区別するために、さらにリンパ管特異的に発現するポドプラニンと共染色してもよいし、管の構造から血管とリンパ管とを識別してもよい。さらに別の態様では、皮膚試料からリンパ管を単離し、単離されたリンパ管についてタンパク質量又はｍＲＮＡ量を計測することにより行われてもよい。タンパク質量又はｍＲＮＡ量は、常法に基づいて測定することができるが、一例としてウエスタンブロッティング又は定量的ＰＣＲなどが行われうる。リンパ浮腫が悪化するほど、皮膚のリンパ管におけるＶＥ－カドヘリンの発現量が高まることが示された。これにより、皮膚のリンパ管におけるＶＥ－カドヘリンの発現量と、リンパ浮腫の重症度を関連付けることができ、ＶＥ－カドヘリンの発現量が増加するほど、リンパ浮腫は悪化する。リンパ浮腫とリンパ管の構造との関連が示されているので、リンパ管の形態に関するパラメータと同様に、リンパ管の構造に関するパラメータも、リンパ浮腫という病的状態の悪化度の指標となるのみではなく、正常皮膚の悪化の指標となる。
　ＶＥカドヘリンは、カドヘリン５又はＣＤ１４４とも呼ばれる分子量約１４０ｋＤａのタンパク質であり、カドヘリンスーパーファミリーに属するタンパク質である。ＶＥ-カドヘリンは、内皮細胞に特異的であり、リンパ管内皮細胞及び血管内皮細胞において発現し、細胞膜に存在する（特許文献２：国際公開第２０１９／０９７９５８号）。ＶＥ-カドヘリン分子は、血管内皮やリンパ管内皮の透過性に関与することが知られている。理論に限定されることを意図するものではないが、ＶＥカドヘリンの発現が増加することで、リンパ管内皮細胞同士の接着性が高まり、リンパ液の回収が阻害されうる。
　本発明の別の態様では、皮膚のリンパ管の構造及び/又は形態に基づくパラメータと、肌状態との関連から、肌状態から皮膚のリンパ管構造を予測する方法に関していてもよい。表皮状態及び/又は真皮コラーゲンの変性に基づく肌状態を決定することにより、皮膚のリンパ管構造を予測し、それによりむくみや浮腫の進行を予測することができる。
　本発明の別の態様では、本発明は皮膚のリンパ管の形態に関するパラメータを指標とした肌状態改善薬のスクリーニング方法にも関する。より具体的には本発明のスクリーニング方法は以下の工程：
　候補薬剤を皮膚に添加する工程、
　添加後の皮膚のリンパ管の形態を撮影する工程、
　撮影された画像に基づきリンパ管の形態に関するパラメータを計算する工程、
　候補薬剤添加前又は対照薬剤添加群の皮膚のリンパ管の形態に関するパラメータと比較する工程、そして
　パラメータの変化に基づき、候補薬剤を肌状態改善薬として選択する工程、
　を含む。この方法を行うことにより、候補薬剤を肌状態改善剤としてスクリーニングすることができる。皮膚のリンパ管の形態に関するパラメータは、リンパ管の体積、分岐数及び／又は直径を使用することができる。リンパ管の形態に関するパラメータの変化が生じる期間にわたり、繰り返し候補薬剤を皮膚に添加する工程を行ってもよい。対照薬剤添加群は、候補薬剤が添加されない点でのみ異なっていてもよい。本発明のスクリーニング方法において用いられる皮膚は、リンパ管構造を含む培養皮膚、余剰皮膚の培養組織であってもよいし、動物の皮膚であってもよく、ヒトの生体の皮膚であってもよい
　本発明のさらに別の態様では、本発明は、皮膚のリンパ管細胞のＶＥ－カドヘリン発現に基づく、肌状態改善薬のスクリーニング方法にも関する。より具体的には本発明のスクリーニング方法は以下：
　候補薬剤を皮膚に添加する工程、
　添加後の皮膚のリンパ管細胞におけるＶＥ－カドヘリン発現を測定する工程、
　候補薬剤添加前又は対照薬剤添加群の皮膚のリンパ管におけるＶＥ－カドヘリン発現と比較する工程、そして
　ＶＥ－カドヘリン発現変化に基づき、候補薬剤を肌状態改善薬として選択する工程、
　を含む。この方法を行うことにより、皮膚のリンパ管において、ＶＥ－カドヘリン発現を抑制可能な候補薬剤を肌状態改善剤としてスクリーニングすることができる。対照薬剤添加群は、候補薬剤が添加されない点でのみ異なっていてもよい。本発明のスクリーニング方法において用いられる皮膚は、リンパ管構造を含む培養皮膚、余剰皮膚の培養組織であってもよいし、動物の皮膚であってもよい。
　さらに別の態様では、リンパ管細胞の培養物に対してスクリーニング方法が行われてもよい。
　具体的には、以下の：
　候補薬剤を含む培地中でリンパ管細胞を培養する工程、
　培養後のリンパ管細胞におけるＶＥ－カドヘリン発現を測定する工程、
　対照におけるＶＥ－カドヘリン発現量と比較する工程、及び
　ＶＥ－カドヘリン発現変化に基づき、候補薬剤を肌状態改善薬として選択する工程
　を含む。リンパ管細胞は、リンパ管細胞単独で培養されてもよいし、他の細胞と合わせて培養されてもよく、対照は、候補薬剤が添加されない点でのみ異なっている群であるか、又は候補薬剤添加前の群であってもよい。例えば皮膚培養物として培養されてもよい。リンパ管細胞においてＶＥ－カドヘリン発現を抑制可能な候補薬剤を肌状態改善剤としてスクリーニングすることができる。リンパ管細胞は、特にリンパ管内皮細胞である。
　スクリーニング方法に使用される候補薬剤は、任意のライブラリーに含まれる薬剤を用いることができる。一例として、公知の化粧品素材ライブラリー、医薬品ライブラリーが用いられてもよい。これらのライブラリーは化合物ライブラリーであってもよいし、エキスライブラリーであってもよい。
　本発明において肌状態改善剤とは、肌の一般的性状、特にリンパ浮腫又はむくみに関する肌状態を改善することができる薬剤をいう。肌状態改善剤は、化粧料、医薬品、又は医薬部外品に配合されてもよいし、食品、例えばサプリメントなどの栄養補助食品に配合されてもよい。理論に限定されることを意図するものではないが、ＶＥ－カドヘリンの発現や皮膚のリンパ管の機能を改善することで、肌状態、特にむくみ又はリンパ浮腫を改善することができる。したがって、肌状態改善剤は、むくみ又はリンパ浮腫の治療、予防又は改善剤ともいうことができ、またリンパ管の直径及び/又は体積の増大剤ともいうことができる。肌状態改善剤は、経皮、径粘膜、経口、皮下、筋中など任意の投与経路で投与することができるが、皮膚直下のリンパ管に作用させる観点から、経皮投与が好ましい。
　本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。
　以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。
実施例１：リンパ浮腫患者由来の皮膚試料におけるリンパ管の解析
　リンパシンチグラフィを用いてリンパ浮腫の重症度(１型～４型)を判定された下肢リンパ浮腫患者の手術余剰皮膚及び正常の下枝皮膚試料を千葉大学医学部附属病院より提供を受けた。余剰皮膚を実験に使用することについては各患者からインフォームドコンセントを取得した。
　下肢の余剰皮膚組織に熱処理（６０℃，１分）を加えて、表皮を剥離し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／生理食塩水（ＰＢＳ）にて一晩固定した。ＰＦＡ固定済皮膚組織に対し、２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００／ＰＢＳで膜透過処理を１晩行い、次いで５％ロバ血清／ＰＢＳで一晩ブロッキングした。その後、一次抗体として抗ポドプラニンン抗体（Ｄａｋｏ　Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，　＃Ｍ３６１９）／５％ロバ血清／ＰＢＳで３日間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてＡｌｅｘａ６４７標識抗マウス（Ｈ＋Ｌ)抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）／５％ロバ血清／ＰＢＳで一晩インキュベートした。免疫染色した皮膚組織を、透明化試薬：Ｒａｐｉｃｌｅａｒ　１．５２（ＳｕｎＪｉｎ　Ｌａｂ　Ｃｏ．）に浸漬し透明化した。こうして得られた試料を、ＬＳＭ８８０（ＺＥＩＳＳ）を使用して蛍光顕微鏡観察を行い、皮膚のリンパ管について３次元画像を取得した（図１Ａ）。３次元画像から、リンパ管の体積、直径及び分岐数について、Ｉｍａｒｉｓ３Ｄ／４Ｄ画像解析ソフトウェア（Ｚｅｉｓｓ）を用いて決定した（図１Ｂ～図１Ｄ）。リンパ浮腫が悪化するに伴い、皮膚のリンパ管の直径および体積が減少した（図１Ａ、Ｂ、Ｃ）。早期のリンパ浮腫（１型および２型）では分岐数が増大し、次いで進行リンパ浮腫（３型および４型）では分岐数が減少した
　下肢の余剰皮膚組織に熱処理（６０℃，１分）を加えて、表皮を剥離し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／生理食塩水（ＰＢＳ）にて一晩固定した。ＰＦＡ固定済皮膚組織に対し、ＣＵＢＩＣ－Ｌ（ｗａｋｏ）を使用して一週間３７℃で脱脂した後、５％ロバ血清／ＰＢＳで一晩ブロッキングした。その後、一次抗体として抗ＶＥ－カドへリン抗体　（Ｃｅｌｌ　ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，　＃２５００）／５％ロバ血清／ＰＢＳで３日間インキュベートした後、洗浄し、２次抗体としてＡｌｅｘａ５６８標識抗ウサギ（Ｈ＋Ｌ）抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）／５％ロバ血清／ＰＢＳで一晩インキュベートした。免疫染色した皮膚組織は、透明化試薬に浸漬することにより透明化した。透明化試薬は、ＣＵＢＩＣ－Ｒ＋（ｗａｋｏ）を使用した。こうして得られた試料を、ＬＳＭ８８０（ＺＥＩＳＳ）を使用して蛍光顕微鏡観察を行った（図２）。リンパ浮腫が悪化するに伴い、皮膚のリンパ管におけるＶＥカドヘリンの発現量が増大した。
実施例２：健常人におけるリンパ管の加齢変化
　２０代～６０代女性の頬余剰皮膚をＯｂｉｏ，　ＬＬＣ．より入手した。
　頬の余剰皮膚組織に熱処理（６０℃，１分）を加えて、表皮を剥離し、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）／生理食塩水（ＰＢＳ）にて一晩固定した。ＰＦＡ固定済皮膚組織に対し、２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００／ＰＢＳで膜透過処理を１晩行い、次いで５％ロバ血清／ＰＢＳで一晩ブロッキングした。その後、一次抗体として抗ポドプラニンン抗体（Ｄａｋｏ　Ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ，　＃Ｍ３６１９）／５％ロバ血清／ＰＢＳで３日間インキュベートした後、ＰＢＳで洗浄し、２次抗体としてＡｌｅｘａ６４７標識抗マウス（Ｈ＋Ｌ)抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）/５％ロバ血清／ＰＢＳで一晩インキュベートした。免疫染色した皮膚組織を、透明化試薬：Ｒａｐｉｃｌｅａｒ　１．５２（ＳｕｎＪｉｎ　Ｌａｂ　Ｃｏ．）に浸漬し透明化した。こうして得られた試料を、ＬＳＭ８８０（ZEISS）を使用して蛍光顕微鏡観察を行い、皮膚のリンパ管について３次元画像を取得した（図３Ａ）。３次元画像から、リンパ管の直径及び分岐数について、Ｉｍａｒｉｓ３Ｄ／４Ｄ画像解析ソフトウェア（ＺＥＩＳＳ）を用いて決定した（図３Ｂ及び図３Ｃ）。皮膚のリンパ管の形態は、年齢に応じても変化した（図３Ａ）。加齢に伴いリンパ管の体積は減少する傾向が見られた（図３Ｂ）。また、若年層では、リンパ管の直径は大きく、かつ分岐数は少ない一方、中高年層ではリンパ管の直径は小さくなり、分岐数が多くなった（図３Ｃ及びＤ）。
実施例３：リンパ浮腫患者由来の皮膚試料におけるコラーゲンの変性
　リンパシンチグラフィを用いてリンパ浮腫の重症度(１型～４型)を判定された下肢リンパ浮腫患者の手術余剰皮膚、及び対照として、正常の下肢皮膚試料を千葉大学医学部附属病院より提供を受けた。余剰皮膚を実験に使用することについては各患者からインフォームドコンセントを取得した。
　皮膚試料を凍結し、５０μｍの厚さの凍結切片を取得した。凍結切片をＲ－ＣＨＰ（３Ｈｅｌｉｘ　Ｉｎｃ．）をプロトコルに従い用いて変性コラーゲンを染色した。染色画像について画像解析ソフトＦｉｊｉを使用して変性コラーゲンを定量した（図４）。リンパ浮腫の悪化により、真皮において変性コラーゲン産生が増大した。

Claims (16)

  1. 　皮膚のリンパ管の構造及び/又は形態に関するパラメータに基づき、肌状態を決定する方法。
  2. 　前記皮膚のリンパ管の形態に関するパラメータが、リンパ管の体積、分岐数及び直径からなる群から選ばれる少なくとも１により決定される、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記皮膚のリンパ管の形態に関するパラメータが、リンパ管の直径である場合に、リンパ管直径の変化により、肌状態が悪化していると決定する、請求項２に記載の方法。
  4. 　前記皮膚のリンパ管の形態に関するパラメータが、さらにリンパ管の分岐数も考慮し、肌状態が悪化していると決定する、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記皮膚のリンパ管の形態が、光干渉断層装置又は光超音波イメージングにより測定される、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記皮膚のリンパ管の構造に関するパラメータが、皮膚のリンパ管におけるＶＥ－カドヘリンの発現量により決定される、請求項１に記載の方法。
  7. 　皮膚のリンパ管における前記ＶＥ－カドヘリンの発現の増加により、肌状態が悪化していると決定する、請求項６に記載の方法。
  8. 　皮膚のリンパ管の形態に関するパラメータを指標とした、肌状態改善薬のスクリーニング方法。
  9. 　候補薬剤を皮膚に添加する工程、
    　添加後の皮膚のリンパ管の形態を撮影する工程、
    　撮影された画像に基づき皮膚のリンパ管の形態に関するパラメータを計算する工程、
    　候補薬剤添加前又は対照薬剤添加群の皮膚における皮膚のリンパ管形態に関するパラメータと比較する工程、そして
    　パラメータの変化に基づき、候補薬剤を肌状態改善薬として選択する工程、
    　を含む請求項８に記載のスクリーニング方法。
  10. 　前記皮膚のリンパ管の形態に関するパラメータが、リンパ管の分岐数及び直径からなる群から選ばれる少なくとも１により決定される、請求項９に記載の方法。
  11. 　前記皮膚が、リンパ管構造を含む培養皮膚である、請求項９又は１０に記載の方法。
  12. 　リンパ管内皮細胞のＶＥ－カドヘリン発現量を指標とした、肌状態改善薬のスクリーニング方法。
  13. 　候補薬剤を皮膚に添加する工程、
    　添加後の皮膚のリンパ管内皮細胞におけるＶＥ－カドヘリン発現を測定する工程、
    　候補薬剤添加前又は対照薬剤添加群の皮膚のリンパ管内皮細胞におけるＶＥ－カドヘリン発現と比較する工程、そして
    　ＶＥ－カドヘリン発現量の変化に基づき、候補薬剤を肌状態改善薬として選択する工程、
    　を含む、請求項１２に記載のスクリーニング方法。
  14. 　前記皮膚が、リンパ管構造を含む培養皮膚である、請求項１３に記載の方法。
  15. 　候補薬剤を含む培地中でリンパ管内皮細胞を培養する工程
    　培養後のリンパ管内皮細胞におけるＶＥ－カドヘリン発現を測定する工程、
    　対照におけるＶＥ－カドヘリン発現量と比較する工程、
    　ＶＥ－カドヘリン発現変化に基づき、候補薬剤を肌状態改善薬として選択する工程
    　を含む、請求項１２に記載のスクリーニング方法。
  16. 　皮膚のリンパ管の直径の増大剤を含む、肌状態改善用薬剤。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080051644A1 (en) * 2006-02-17 2008-02-28 Raymond Tabibiazar Lymphedema associated genes and model
JP2019063049A (ja) * 2017-09-29 2019-04-25 株式会社 資生堂 皮膚の血管網を可視化する装置、方法およびプログラム
JP2022500020A (ja) * 2018-09-07 2022-01-04 ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィアThe Children’S Hospital Of Philadelphia リンパ系疾患の診断および治療のための組成物および方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080051644A1 (en) * 2006-02-17 2008-02-28 Raymond Tabibiazar Lymphedema associated genes and model
JP2019063049A (ja) * 2017-09-29 2019-04-25 株式会社 資生堂 皮膚の血管網を可視化する装置、方法およびプログラム
JP2022500020A (ja) * 2018-09-07 2022-01-04 ザ・チルドレンズ・ホスピタル・オブ・フィラデルフィアThe Children’S Hospital Of Philadelphia リンパ系疾患の診断および治療のための組成物および方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"New points of view have also been applied to beauty foods. Rooibos extract has been confirmed to improve the adhesion function of lymphatic endothelial cells. Contributes to improving skin elasticity and improving skin roughness", POLA ORBIS HOLDINGS NEWS RELEASE, 24 August 2015 (2015-08-24), pages 1 - 2, XP009549938, Retrieved from the Internet <URL:http://www.pola-rm.co.jp/pdf/release_20150824.pdf> *

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