WO2023209262A1 - Material para recubrimiento pulpar y regeneración ósea - Google Patents

Material para recubrimiento pulpar y regeneración ósea Download PDF

Info

Publication number
WO2023209262A1
WO2023209262A1 PCT/ES2023/070274 ES2023070274W WO2023209262A1 WO 2023209262 A1 WO2023209262 A1 WO 2023209262A1 ES 2023070274 W ES2023070274 W ES 2023070274W WO 2023209262 A1 WO2023209262 A1 WO 2023209262A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
mch
calcium phosphate
membrane
pulp
eggshell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Ceased
Application number
PCT/ES2023/070274
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jaime GÓMEZ MORALES
Raquel FERNÁNDEZ PENAS
Cristóbal VERDUGO ESCAMILLA
Pedro Domingo ÁLVAREZ LLORET
Adriana Carolina TORRES MANSILLA
Juan Antonio Marchal Corrales
Elena LÓPEZ RUIZ
Ana Voltes Martínez
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad de Granada
Universidad de Oviedo
Servicio Andaluz de Salud
Universidad de Jaen
Original Assignee
Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Universidad de Granada
Universidad de Oviedo
Servicio Andaluz de Salud
Universidad de Jaen
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC, Universidad de Granada, Universidad de Oviedo, Servicio Andaluz de Salud, Universidad de Jaen filed Critical Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC
Publication of WO2023209262A1 publication Critical patent/WO2023209262A1/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Ceased legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/56—Materials from animals other than mammals
    • A61K35/57—Birds; Materials from birds, e.g. eggs, feathers, egg white, egg yolk or endothelium corneum gigeriae galli
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K6/00—Preparations for dentistry
    • A61K6/20—Protective coatings for natural or artificial teeth, e.g. sealings, dye coatings or varnish
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K6/00—Preparations for dentistry
    • A61K6/50—Preparations specially adapted for dental root treatment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K6/00—Preparations for dentistry
    • A61K6/50—Preparations specially adapted for dental root treatment
    • A61K6/54—Filling; Sealing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K6/00—Preparations for dentistry
    • A61K6/60—Preparations for dentistry comprising organic or organo-metallic additives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K6/00—Preparations for dentistry
    • A61K6/70—Preparations for dentistry comprising inorganic additives
    • A61K6/71—Fillers
    • A61K6/74—Fillers comprising phosphorus-containing compounds
    • A61K6/75—Apatite

Definitions

  • the present invention relates to a material comprising a membrane extracted from eggshell covered by a layer of calcium phosphate.
  • the invention also refers to the procedure for obtaining said material and its use as a pulp covering or regenerator of bone tissue.
  • the dental pulp is the only vital tissue of the tooth that can be exposed to the oral environment by different clinical dental actions, such as the removal of a deep carious lesion, or in prosthodontic preparation procedures (see “AAE Position Statement on Vital Pulp Therapy” Journal of Endodontics 2021, 47, 1340-1344; Duncan, H.F., et al. European Society of Endodontology position statement: Management of deep caries and the exposed pulp. International Endodontic Journal 2019, 52, 923-934; Duncan, H.F., n.d. “Present status and future directions — Vital pulp treatment and pulp preservation strategies” International Endodontic Journal n/a; and Nicholson, J., Czarnecka, B.
  • the mineral base of these silicate materials differs in composition with respect to the mineral phases present at the dentin level, mainly calcium phosphates, reducing their compatibility and chemical stability at the tissue level.
  • bone tissue regeneration is a clinical procedure that can use membranes in combination with a bone graft (either allograft or xenograft) (Urban, LA. and Monje, A. "Guided Bone Regeneration in Alveolar Bone Reconstruction.” Oral and Maxillofacial Surgery Clinics of North America 2019, 31, 331 — 338).
  • the membranes act as barriers that prevent the migration of unwanted cells to the graft, in addition to providing stability and preventing the collapse of the soft tissues in the defect that is to be repaired. Therefore, the materials must be biocompatible and must present good mechanical properties that allow their manipulation, exhibit osteoinductive capabilities (for example, induce differentiation of osteogenic cells) and osteoconductive (for example, providing scaffolding for osteogenic cells).
  • the membranes must be characterized as has been done previously in the study of other biomaterials to determine if they are optimal for use in regenerative bone therapies (Modi et al. “Effect of calcium glucoheptonate on proliferation and osteogenesis of osteoblast-like cells in vitro.” PloS one, 2019, 14(9)).
  • these membranes used for tissue regeneration within dental activities consist of synthetic polymers composed of polyglycolic acid (PGA) and polylactic acid (PLA) as well as biological polymers such as collagen, among others (Agarwal, A. and Gupta, N. D.
  • osteoinductive material useful in dental processes of pulp capping and bone tissue regeneration.
  • the present invention refers to a process for obtaining a material that comprises a stage (i) of controlled mineralization of an organic membrane with an inorganic coating by means of the vapor diffusion crystallization method.
  • the invention refers to the procedure defined above, where controlled mineralization takes place only in the outer layer of the organic membrane.
  • the invention refers to the procedure defined above, where the organic membrane is a membrane extracted from eggshell.
  • the internal layer of the organic membrane is protected from the mineralization process, so that the membrane acquires osteoinductive (external layer) and barrier (internal layer) properties.
  • This material is preferably obtained by interaction of a membrane extracted from eggshell with a layer of calcium phosphate through controlled mineralization of said inorganic coating.
  • the controlled mineralization process using the vapor diffusion crystallization technique generates the precipitation of the inorganic coating on the surface of the organic support.
  • This procedure is carried out in a crystallization device (crystallization mushroom) by diffusion of CO 2 and NH 3 vapors over microvolumes of aqueous solution rich in calcium and phosphate ions, kinetically controlling the heterogeneous nucleation of calcium phosphate on the surface of the membrane. .
  • Another aspect of the present invention refers to the material obtained by the procedure defined above, where said material comprises a membrane extracted from eggshell where the fibers that compose it are covered by a layer of calcium phosphate.
  • Another aspect of the present invention refers to a material that comprises a membrane extracted from eggshell where the fibers that compose it are covered by a layer of calcium phosphate.
  • the invention refers to the material defined above, which is also completely covered by a second layer of calcium phosphate.
  • the invention refers to the material defined above, where the Calcium phosphate corresponds to the crystalline phase of carbonated hydroxyapatite.
  • the invention relates to the material defined above, where the calcium phosphate is doped with one or more anions, and preferably where the calcium phosphate is doped with one or more anions selected from F, Cl_ , HPO 4 2- , CO 3 2- , SO 4 2- , SeO 3 2- , SeO 4 2- , SI0 4 4- , citrate and acetate.
  • the invention relates to the material defined above, where the calcium phosphate is doped with one or more metal ions, preferably where the metal ions are alkali, alkaline earth, transition metals, or lanthanides and more preferably where the metal ions are selected of L ⁇ + , Na + , K + , Mg + , Sr 2+ , Co 2+ , Mn 2+ , Ag + , Cu 2+ , Zn 2+ , T ⁇ 4+ , Gd 3+ , Eu 3+ and /o Tb 3+ .
  • the invention relates to the material defined above, where the calcium phosphate layer contains one or more organic molecules, and preferably where the organic molecules are selected from L-Aspartic acid, L-glutamic acid and mixtures thereof.
  • the material of the invention has mechanical, morphological and compositional properties that enable its clinical management in dental activity in direct and indirect pulp capping processes and in bone tissue regeneration.
  • Another aspect of the invention refers to the use of the material defined above for dental processes of pulp capping and bone tissue regeneration.
  • the material of the invention allows covering accidental exposure of the pulp and at the same time has optimal compatibility with dentinal tissue, therefore, it is useful in both direct and indirect pulp capping processes.
  • the invention relates to the use of the material defined above, where the pulp capping is direct or indirect.
  • the material of the invention acts as a boundary barrier in various clinical procedures, protecting the pulp tissue from the irritating byproducts of the polymerization of restorative composites.
  • This material provides a considerable advantage with respect to those described in the state of the art by presenting a composition compatible with mineralized tissues by adding an inorganic component (calcium phosphate layer) whose characteristics can be modulated for optimal application in dental tissues.
  • composition and protein structure of the eggshell membrane on the outer surface of the material of the invention acts as a support for the guided regeneration of bone tissue, effectively isolating the bone graft and promoting mineral development thanks to its composition. highly biocompatible chemistry. In this way, a support is built that mimics bone tissue in different aspects, such as its organic and inorganic duality and the presence of mineral phases with characteristics similar to biological apatite.
  • the material of the invention is biocompatible and has the ability to induce the differentiation of stem cells, being useful in guided bone regeneration procedures as it is stable and has osteoinductive and osteoconductive capacity.
  • the material of the invention may comprise cells, preferably human cells.
  • the cells of the invention may further comprise cells that may be present in pulp or bone tissue. Examples of cell types that may be present in pulp or bone tissue include osteocytes, osteoblasts, immune system cells (neutrophils, basophils, lymphocytes (including B lymphocytes, T lymphocytes, and T regulatory or T reg lymphocytes), eosinophils. monocytes, macrophages, NK cells (Natural Killer), (Abreu-Correa et al. “Pulp dentin complex.
  • mesenchymal stem cells that can be isolated from tissues or organs of a subject, such as, for example and not limited to, bone marrow, placenta, umbilical cord blood, Wharton's jelly, adipose tissue, amniotic membrane, and dental tissues .
  • another object of the present invention refers to the material defined above for use as a medicine or for the manufacture of a medicine.
  • Another aspect of the invention relates to the material defined above for use in the treatment of bone tissue conditions by pulp capping, and preferably through direct or indirect pulp capping.
  • direct pulp capping refers to a procedure that is part of vital pulp therapy that preserves the vitality of the dental pulp that has been exposed by traumatic actions such as the effect of caries or during dental procedures and consists of aseptically isolating the working field and position a biomaterial directly in the exposed pulp, before permanent restoration of the tooth, to promote pulp regeneration and the generation of reparative dentin.
  • directly pulp capping refers to a procedure that consists of preserving a dentinal barrier over the dental pulp after the removal of an extensive lesion of, for example, cavities. A material is applied to said barrier that maintains or promotes the vitality of all or part of the pulp.
  • the terms "doped with one or more anions”, “doped with one or more metal ions” or “contains one or more organic molecules”, independently mean the possibility that the calcium phosphate to which the invention of being doped or containing one or more, preferably 1, 2, 3 or 4 anions, metal ions or organic molecules, more preferably by 1, 2 or 3 anions, metal ions or organic molecules, and even more preferably by 1 or 2 anions, metal ions or organic molecules. If present, said anions, metal ions or organic molecules may be the same or different.
  • Fig. 1 Shows Scanning Electron Microscopy (SEM) images of (a,b) eggshell membrane (ECM) prior to the mineralization process (the arrows point to the nipples with granular aggregate morphology) and (ch) membrane of eggshell mineralized with calcium phosphate (MCH-Min) by the vapor diffusion crystallization method at different times: (cd) 1 day of mineralization; (ef) 7 days of mineralization; (gh) 15 days of mineralization.
  • SEM Scanning Electron Microscopy
  • Fig. 2 Shows the identification by X-ray diffraction of the mineral phase formed in the shell membrane (MCH-Min) using the vapor diffusion crystallization method.
  • the X-ray diffraction pattern of the precipitate obtained by vapor diffusion crystallization (upper curve) corresponds to the reference
  • Fig. 3 Analysis of the eggshell membrane by Infrared spectroscopy, (a) Infrared spectrum of the unmineralized membrane (MCH). (b) Infrared spectrum of mineralized eggshell membrane (MCH-Min) by vapor diffusion crystallization method.
  • Fig. 4 Analysis of eggshell membrane by Raman spectroscopy, (a) Raman spectrum of unmineralized eggshell membrane (MCH), (b) Raman spectrum of mineralized eggshell membrane (MCH). -Min) by the vapor diffusion crystallization method; (c) Enlarged image of the V1PO4 Raman band where assignments of vibrational modes associated with the calcium phosphate layer and the membrane are indicated.
  • Fig. 5 Shows the scanning electron microscope (SEM) image of a mineralized and non-mineralized zone of a membrane where elemental composition analyzes have been carried out using energy dispersive X-rays (EDS).
  • SEM scanning electron microscope
  • Fig. 7 Shows the morphology and cell adhesion of MSCs on MCH and MCH-Min after one day of cell culture. Scanning electron microscopy (SEM) images of MSCs on MCH and MCH-Min. The MSCs present a stretched morphology, with better adhesion and proliferation in the MCH-Min groups compared to the MCH group. The white arrows indicate the MSCs adhered to the material under study. Scale bar: 10pm. 2KX magnification.
  • Fig. 8 Shows the in vitro biological evaluation of MCH and MCH-Min. Immunofluorescence analysis for the detection of osteopontin after 21 days of cell culture. Representative confocal microscopy images of the presence of osteopontin in MCH and MCH-Min. Comparison between samples cultured using Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) and samples cultured using osteogenic differentiation cell culture medium. Scale bar: 100pm.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Fig. 9. Shows the in vitro biological evaluation of MCH and MCH-Min. Immunofluorescence analysis for the detection of collagen I after 21 days of cell culture. Representative confocal microscopy images of the presence of collagen I in MCH and MCH-Min. Comparison between samples cultured using Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) and samples cultured using osteogenic differentiation cell culture medium. Scale bar: 100pm.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • MCH eggshell membrane
  • MCH-Min T7 eggshell membrane mineralized with calcium phosphate by vapor diffusion crystallization method at 7 days
  • MCH-Min T 15 eggshell membrane mineralized with calcium phosphate by the method of crystallization by vapor diffusion at 15 days
  • MO Mesenchymal stem cells differentiated into Osteoblasts
  • MSC Mesenchymal Stem Cell
  • OPN Osteopontin
  • ST No treatment.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Example 1 Procedure for obtaining and chemical and structural characterization of the material object of the invention
  • ECMs Eggshell membranes
  • Example 2 Procedure for obtaining and auimic and structural characterization of the material object of the invention doped with ions and bioactive molecules.
  • the method is similar to that described in Example 1, but varying the initial composition of the microdroplets depending on the active dopant ion or molecule, mixing the solutions as follows: a) F: 20 microliters of 40 mM Ca(CH 3 COO) solution ) 2 +10mM NaF mixed with 20 microliters of 30 mM solution of (NH 4 ) 2 HPC>4.
  • M 2+ Mn 2+ , Co 2+ : 20 microliters of 40 mM Ca(CH 3 COO) 2 solution +10mM MCI 2 .nH 2 O mixed with 20 microliters of 30 mM solution of (NH 4 ) 2 HPC >4 with a final (Ca+M 2+ )/P ratio of 5:3;
  • M 3+ Eu 3+ , Tb 3+ : 20 microliters of solution of composition 40 mM Ca(CH 3 COO) 2 + 10mM MCh nH 2 O mixed with 20 microliters of 30 mM solution of (NH 4 ) 2 HPC >4 with a final (Ca+M 3+ )/P ratio of 5:3.
  • the images obtained by scanning electron microscope ( Figure 1) show the MCH on its active side ( Figures 1 a and 1 b) and after the MCH-Min mineralization process at different times ( Figures 1 ch).
  • the membrane has a structure of intertwined fibers covered by small granular aggregates of organic material (called “nipples”). After the controlled mineralization process using the vapor diffusion crystallization method, the membrane presents a precipitate composed of calcium phosphate mineral phases covering the cross-linked fibers.
  • the mineral identification of the precipitate (Min) formed on the fibers of the shell membrane (MCH-Min) corresponds to calcium phosphate, a crystalline phase identified by X-ray diffraction as carbonated hydroxyapatite ( Figures 2; reference sheets; ICDD: 00- 019-0272, COD: 969003552).
  • This mineral phase is mostly present in mineralized tissues of biological origin, such as bones and teeth.
  • the chemical characterization at the molecular level of the mineral precipitate formed in the membrane was carried out using complementary spectroscopic techniques, specifically through infrared (Figure 3) and Raman ( Figure 4) spectroscopies.
  • the unmineralized eggshell membrane (MCH) is composed mainly of amide-type protein bands, as well as bands related to different types of lipids and polysaccades ( Figure 3a and 4a).
  • the analysis of the spectra shows a mineral phase where bands related to vibrational modes of molecular groups of crystalline phosphates (Figure 3b and 4b) associated with apatite (vi,v 4 of PO 4 3 ) are observed. and a small band at 875 cm -1 associated with carbonate ( Figure 3b), characteristics of carbonated apatite as identified by X-ray diffraction.
  • compositional analyses obtained by X-ray spectroscopy (EDS) coupled to the scanning electron microscope (Table 1) show the relative composition of the chemical elements present in the MCH-Min (mineralized zone, Figure 5a) in comparison with the surface of non-mineralized membrane ( Figure 5b).
  • the results show how the controlled process of mineralization through crystallization by vapor diffusion generates a precipitate that covers the surface of the membrane whose Relative concentrations of the elements calcium and phosphorus (molar ratio of approximately 1.65) are associated with the stoichiometric relationship present in apatite.
  • compositional analyzes obtained by the presence of the dopant ion in the composition of the calcium phosphate layer.
  • Fluorine L-Glu and L-Asp there is a significant increase in the concentration of Oxygen.
  • Example 3 Cell proliferation test of MSCs seeded on the surface of the material object of the invention
  • Osteogenic differentiation was evaluated using immunofluorescence techniques.
  • MCH and MCH-Min seeded with MSCs were fixed after 21 days in cell culture with 4% PFA in PBS for 20 minutes at room temperature.
  • samples were treated with a primary antibody against osteopontin (Santa Cruz Biotechnology, 1:200), and type I collagen (Abeam, 1:200).
  • the sections were then incubated with secondary antibodies conjugated to AlexaFluor 488 or 594 (ThermoFisher, 1:500) and stained with DAPI. Images were obtained with a Leica TCS-SP5 microscope and analyzed with Image J software.
  • the quantification of COL I shows a significant difference p ⁇ 0.05 between MCH-MIN T7 cultured using osteogenic differentiation medium and MCH-MIN T15 cultured using standard supplemented medium (DMEM) with respect to controls, and p ⁇ 0.005 between MCH-MIN T7 (DMEM) and MCH-MIN T15 cultured with osteogenic differentiation medium with respect to the controls of MSCs seeded without the material under study in monolayer ( Figure 1 1).

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Oral & Maxillofacial Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)

Abstract

La presente invención se refiere a un material que comprende una membrana extraída de cáscara de huevo recubierta por una capa de fosfato cálcico. La invención también se refiere al procedimiento de obtención de dicho material y a su uso como recubrimiento pulpar o regenerador del tejido óseo.

Description

MATERIAL PARA RECUBRIMIENTO PULPAR Y REGENERACIÓN ÓSEA
La presente invención se refiere a un material que comprende una membrana extraída de cáscara de huevo recubierta por una capa de fosfato cálcico. La invención también se refiere al procedimiento de obtención de dicho material y a su uso como recubrimiento pulpar o regenerador del tejido óseo.
ESTADO DE LA TÉCNICA
La pulpa dental es el único tejido vital del diente que puede quedar expuesto al medio oral por diferentes actuaciones clínicas odontológicas, como la remoción de una lesión de caries profunda, o en procedimientos de preparación prostodóntica (ver "AAE Position Statement on Vital Pulp Therapy” Journal of Endodontics 2021 , 47, 1340-1344; Duncan, H.F., et al. European Society of Endodontology position statement: Management of deep caries and the exposed pulp. International Endodontic Journal 2019, 52, 923-934; Duncan, H.F., n.d. “Present status and future directions — Vital pulp treatment and pulp preservation strategies” International Endodontic Journal n/a; and Nicholson, J., Czarnecka, B. “Materials for pulp capping, in: Materials for the Direct Restoration of Teeth”. Elsevier, 2016, pp. 177-196). Sin embargo, mediante una estrategia adecuada es posible controlar la exposición pulpar, protegiendo y aislando la pulpa con materiales biocompatibles que permitan un sellado biológico, reduciendo con ello el riesgo de infección y daños posteriores al diente.
En la actualidad los materiales empleados para el recubrimiento pulpar en la actividad clínica odontológica están basados en compuestos a base de hidróxido de calcio (producto comercial), silicatos de calcio (marcas comerciales: Biodentina (Septodont, Francia), MTA (Dentsply, Alemania), BioMTA (Cerkamed, Poland), y resinas compuestas. Sin embargo, estos materiales presentan diferentes limitaciones en su aplicación odontológica. Estudios recientes (ver Manaspon et al., "Human dental pulp stem cell responses to different dental pulp capping materials". BMC Oral Health 2021 , 21 , 209; Pahrokh, M. et al. "Mineral Thoxide Aggregate: A Comprehensive Literature Review — Part III: Clinical Applications, Drawbacks, and Mechanism of Action." Journal of Endodontics 2010, 36, 400-413; y Torabinejad, et al. "Mineral thoxide aggregate and other bioactive endodontic cements: an updated overview - part II: other clinical applications and complications." International Endodontic Journal 2010, 51 , 284-317) han confirmado la alta toxicidad celular de los materiales con base en hidróxido de calcio y, por lo tanto, con resultados clínicos impredecibles e ineficaces.
Por otra parte, se han desarrollado materiales a base de silicato de calcio que, aunque presentan buenas capacidades reparadoras e inductivas (i.e. , diferenciación de células pulpares) aún ofrecen desafíos debido a la presencia de elementos tóxicos dentro de su composición, la posible decoloración dental, su difícil manipulación, el largo tiempo de fraguado, el elevado coste del material, la ausencia de un disolvente conocido para este material y la dificultad de eliminación tras el fotocurado (polimerización) (Cervino et al., "Mineral Trioxide Aggregate Applications in Endodontics: A Review" Eur J Dent 2020, 14, 683-691 ; Komabayashi et al., "Current status of direct pulp-capping materials for permanent teeth." Dental Materials Journal 2016, 35, 1-12; Manaspon et al., 2021 ; Parirokh and Torabinejad, 2010; Torabinejad et al., 2018). Además, la base mineral de estos materiales silicatados difiere en cuanto a composición con respecto a las fases minerales presentes a nivel dentinal, principalmente fosfatos de calcio, reduciendo su compatibilidad y estabilidad química a nivel tisular. (De Menezes Oliveira et al., "Microstructure and mineral composition of dental enamel of permanent and deciduous teeth." Microscopy Research and Technique 2010, 73, 572-577; and Pasteris et al., Bone and Tooth Mineralization: Why Apatite? Elements 2008, 4, 97-104).
Finalmente, los productos con base polimérica o resinas presentan notables inconvenientes debido a la generación de subproductos irritantes durante la polimerización provocando en último término la inflamación del tejido pulpar (Krifka et al., "Oxidative stress and cytotoxicity generated by dental composites in human pulp cells." Clin Oral Invest 2012, 16, 215-224; Schneider et al., "Effects of dental composite resin monomers on dental pulp cells." Dental Materials Journal 2019, 38, 579-583).
Por otro lado, la regeneración del tejido óseo es un procedimiento clínico que puede emplear membranas en combinación con un injerto óseo (ya sea aloinjerto o xenoinjerto) (Urban, LA. and Monje, A. "Guided Bone Regeneration in Alveolar Bone Reconstruction." Oral and Maxillofacial Surgery Clinics of North America 2019, 31 , 331 — 338). Las membranas actúan como barreras que previenen la migración de células no deseadas al injerto, además de proveer estabilidad y evitar el colapso de los tejidos blandos en el defecto que se desea reparar. Por tanto, los materiales han de ser biocompatibles y han de presentar buenas propiedades mecánicas que permitan su manipulación, exhiban capacidades osteoinductivas (por ejemplo, inducir la diferenciación de las células osteogénicas) y osteoconductivas (por ejemplo, proveer andamiaje para las células osteogénicas). Para comprobar esto, las membranas deben ser caracterizadas como se ha hecho previamente en el estudio de otros biomateriales para determinar si son óptimas para su uso en terapias óseas regenerativas (Modi et al. “Effect of calcium glucoheptonate on proliferation and osteogenesis of osteoblast-like cells in vitro.” PloS one, 2019, 14(9)).
En la actualidad estas membranas empleadas para la regeneración tisular dentro de la actividad odontológica, consisten en polímeros sintéticos compuestos por ácido poliglicólico (PGA) y ácido poliláctico (PLA) así como polímeros biológicos como el colágeno entre otros (Agarwal, A. and Gupta, N. D. "Comparative evaluation of decalcified freeze-dried bone allograft use alone and in combination with polylactic acid, polyglycolic acid membrane in the treatment of noncontained human periodontal infrabony defects." Quintessence Int 2012, 43, 761-768; Elgali et al., "Guided bone regeneration: materials and biological mechanisms revisited." European Journal of Oral Sciences 2017, 125, 315-337; Sun et al., "Poly(Lactic-co-Glycolic Acid): Applications and Future Prospects for Periodontal Tissue Regeneration." Polymers (Basel) 2017, 9, E189; Young-Kyun Kim, D. D. S. "Guided bone regeneration." Journal of the Korean Association of Oral and Maxillofacial Surgeons 2020, 46, 361-366). Sin embargo, estos materiales presentan un alto coste económico debido, entre otros factores, a su necesario preprocesamiento y adicionalmente ciertas desventajas, como la carencia de propiedades osteoconductivas, la posible reacción inflamatoria frente a un compuesto sintético y la baja estabilidad del colágeno.
Por tanto, sería deseable disponer de un material osteoinductor útil en procesos odontológicos de recubrimiento pulpar y de regeneración del tejido óseo.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de un material que comprende una etapa (i) de mineralización controlada de una membrana orgánica con un recubrimiento inorgánico mediante el método de cristalización por difusión de vapor.
En otra realización la invención se refiere al procedimiento definido anteriormente, donde la mineralización controlada se lleva a cabo sólo en la capa externa de la membrana orgánica.
En otra realización la invención se refiere al procedimiento definido anteriormente, donde la membrana orgánica es una membrana extraída de cáscara de huevo.
Así, con el procedimiento descrito en la presente invención la capa interna de la membrana orgánica queda protegida del proceso de mineralización, de manera que la membrana adquiere propiedades osteoinductoras (capa externa) y de barrera (capa interna).
Este material se obtiene preferentemente por interacción de membrana extraída de cáscara de huevo con una capa de fosfato cálcico mediante mineralización controlada de dicho recubrimiento inorgánico.
El proceso controlado de mineralización mediante la técnica de cristalización por difusión de vapor genera la precipitación del recubrimiento inorgánico sobre la superficie del soporte orgánico. Dicho procedimiento se realiza en un dispositivo de cristalización (seta de cristalización) por difusión de vapores de CO2 y NH3 sobre microvolúmenes de solución acuosa rica en iones calcio y fosfato, controlando cinéticamente la nucleación heterogénea del fosfato cálcico sobre la superficie de la membrana.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al material obtenido por el procedimiento definido anteriormente, donde dicho material comprende una membrana extraída de cáscara de huevo donde las fibras que la componen están recubiertas por una capa de fosfato cálcico.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un material que comprende una membrana extraída de cáscara de huevo donde las fibras que la componen están recubiertas por una capa de fosfato cálcico.
En otra realización la invención se refiere al material definido anteriormente, que además está recubierto en su totalidad por una segunda capa de fosfato de calcio.
En otra realización la invención se refiere al material definido anteriormente, donde el fosfato cálcico corresponde a la fase cristalina de hidroxiapatito carbonatado.
En otra realización la invención se refiere al material definido anteriormente, donde el fosfato cálcico está dopado con uno o más aniones, y preferiblemente donde el fosfato cálcico está dopado con uno o más aniones seleccionados de F, Cl_, HPO4 2-, CO3 2- , SO4 2- , SeO3 2- , SeO4 2-, S¡04 4-, citrato y acetato.
En otra realización la invención se refiere al material definido anteriormente, donde el fosfato cálcico está dopado con uno o más iones metálicos, preferiblemente donde los iones metálicos son alcalinos, alcalinotérreos, metales de transición, o lantánidos y más preferiblemente donde los iones metálicos se seleccionan de L¡+, Na+, K+, Mg+, Sr2+, Co2+, Mn2+, Ag+, Cu2+, Zn2+, T¡4+, Gd3+, Eu3+ y/o Tb3+.
En otra realización la invención se refiere al material definido anteriormente, donde la capa de fosfato cálcico contiene una o más moléculas orgánicas, y preferentemente donde las moléculas orgánicas se seleccionan de ácido L-Aspártico, ácido L-glutámico y mezclas de los mismos.
El material de la invención presenta propiedades mecánicas, morfológicas y composicionales que posibilitan su manejo clínico en la actividad odontológica en procesos de recubrimiento pulpar directo e indirecto y en regeneración del tejido óseo.
Así, otro aspecto de la invención se refiere al uso del material definido anteriormente para procesos odontológicos de recubrimiento pulpar y de regeneración de tejido óseo.
El material de la invención permite cubrir una exposición accidental de la pulpa y a su vez tiene una óptima compatibilidad con el tejido dentinal, por tanto, resulta útil en procesos de recubrimiento pulpar tanto directo como indirecto.
Por tanto, en otra realización, la invención se refiere al uso del material definido anteriormente, donde el recubrimiento pulpar es directo o indirecto.
Además, el material de la invención actúa como barrera límite en diversos procedimientos clínicos protegiendo al tejido pulpar de los subproductos irritantes de la polimerización de los composites de restauración. Este material aporta una ventaja considerable con respecto a los descritos en el estado de la técnica por presentar una composición compatible con tejidos mineralizados añadiendo un componente inorgánico (capa de fosfato cálcico) cuyas características pueden modularse para una óptima aplicación en los tejidos dentales.
La particular composición y estructura proteica de la membrana de la cáscara de huevo en la superficie exterior del material de la invención actúa como soporte para la regeneración guiada del tejido óseo, aislando de forma efectiva el injerto óseo y favoreciendo el desarrollo mineral gracias a su composición química altamente biocompatible. De esta manera se construye un soporte que mimetiza al tejido óseo en diferentes aspectos, como su dualidad orgánica e inorgánica y la presencia de fases minerales con características semejantes al apatito biológico.
Por tanto, el material de la invención es biocompatible y tiene la capacidad de inducir la diferenciación de células madre resultando útil en los procedimientos de regeneración ósea guiada al ser estable y presentar capacidad osteoinductiva y osteoconductiva. Además, el material de la invención puede comprender células, preferiblemente células humanas. Las células de la invención además pueden comprender células que pueden estar presentes en el tejido pulpar u óseo. Ejemplos de tipos de células que pueden estar presentes en el tejido pulpar u óseo, incluyen, osteocitos, osteoblastos, células del sistema inmune (neutrófilos, basófilos, linfocitos (incluyendo linfocitos B, linfocitos T y linfocitos T reguladores o T reg), eosinóf ¡los, monocitos, macrófagos, células NK (por sus siglas en inglés, Natural Killer), (Abreu-Correa et al. “Complejo dentino pulpar. Estructura y diagnóstico.” Revista de Medicina Isla de la Juventud 2013, 12(1 ), 82-99) células madre mesenquimales que pueden aislarse de tejidos u órganos de un sujeto, como por ejemplo y sin limitarse a, médula ósea, placenta, sangre del cordón umbilical, de gelatina de Wharton, tejido adiposo, membrana amniótica, y tejidos dentales.
A la vista de estas propiedades y aplicaciones, otro objeto de la presente invención se refiere al material definido anteriormente para su uso como medicamento o para la fabricación de un medicamento.
Otro aspecto de la invención se refiere al material definido anteriormente para su uso en el tratamiento de afecciones del tejido óseo mediante recubrimiento pulpar, y preferiblemente mediante recubrimiento pulpar directo o indirecto.
El término “recubrimiento pulpar directo” se refiere a un procedimiento que forma parte de la terapia pulpar vital que preserva la vitalidad de la pulpa dental que ha sido expuesta por acciones traumáticas tales como el efecto de caries o durante procedimientos odontológicos y consiste en aislar asépticamente el campo de trabajo y posicionar un biomaterial directamente en la pulpa expuesta, antes de la restauración permanente del diente, para promover la regeneración pulpar y la generación de dentina reparativa.
El término “recubrimiento pulpar indirecto” se refiere a un procedimiento que consiste en la preservación de una barrera dentinal sobre la pulpa dental tras la remoción de una lesión extensa de, por ejemplo, caries. Sobre dicha barrera se aplica un material que mantiene o promueve la vitalidad de toda o de parte de la pulpa.
A lo largo de la invención los términos “dopado con uno o más aniones”, “dopado con uno o más iones metálicos” o “contiene una o más moléculas orgánicas”, independientemente significa la posibilidad de que el fosfato cálcico al que se refiere la invención de estar dopado o de que contenga uno o más, preferiblemente 1 , 2, 3 ó 4 aniones, iones metálicos o moléculas orgánicas, más preferiblemente por 1 , 2 ó 3 aniones, iones metálicos o moléculas orgánicas, y aún más preferiblemente por 1 ó 2 aniones, iones metálicos o moléculas orgánicas. Si están presentes, dichos aniones, iones metálicos o moléculas orgánicas pueden ser ¡guales o diferentes.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus vahantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Fig. 1. Muestra imágenes de Microscopía Electrónica de Barrido (MEB) de (a,b) membrana de la cáscara de huevo (MCH) anterior al proceso de mineralización (las flechas señalan las mamilas con morfología en agregados granulares) y (c-h) membrana de la cáscara de huevo mineralizada con fosfato de calcio (MCH-Min) mediante el método de cristalización por difusión de vapor en diferentes tiempos: (c-d) 1 día de mineralización; (e-f) 7 días de mineralización; (g-h) 15 días de mineralización.
Fig. 2. Muestra la identificación mediante difracción de rayos X de la fase mineral formada en la membrana de la cáscara (MCH-Min) mediante el método de cristalización por difusión de vapor. El diagrama de difracción de rayos X del precipitado obtenido mediante cristalización por difusión de vapor (curva superior) corresponde al patrón de difracción de rayos X de referencia del hidroxiapatito carbonatado (curva inferior) (Crystallographic Open Database, referencia COD: 969003552).
Fig. 3. Análisis de la membrana de la cáscara de huevo por espectroscopia Infrarroja, (a) Espectro de Infrarrojos de la membrana sin mineralizar (MCH). (b) Espectro de Infrarrojos de la membrana de cáscara de huevo mineralizada (MCH-Min) mediante el método de cristalización por difusión de vapor.
Fig. 4. Análisis de la membrana de la cáscara de huevo por espectroscopia Raman, (a) Espectro Raman de la membrana de cáscara de huevo sin mineralizar (MCH), (b) Espectro Raman de la membrana de cáscara de huevo mineralizada (MCH-Min) mediante el método de cristalización por difusión de vapor; (c) Imagen ampliada de la banda V1PO4 Raman donde aparecen indicadas asignaciones de modos vibracionales asociados a la capa de fosfato cálcico y a la membrana.
Fig. 5. Muestra la imagen del microscopio electrónico de barrido (MEB) de una zona mineralizada y otra no mineralizada de una membrana donde se han hecho los análisis de composición elemental mediante energía dispersiva de rayos X (EDS).
Fig. 6. Muestra la biocompatibilidad in vitro de las MCH y MCH-Min. Tasa de proliferación de las células madre mesenquimales (MSC) cultivadas en las MCH y MCH- Min hasta 21 días. Los datos representan la media ± desviación estándar de la diferencia significativa entre grupos con respecto a las MSCs cultivadas en el día 0 (n=3). (*) p<0.05; (**) p<0,01 ; (***) p<0,005. (RFU: Unidades de fluorescencia relativa). Abreviaturas -> MCH-Min T7: membrana de la cáscara de huevo mineralizada con fosfato de calcio mediante el método de cristalización por difusión de vapor a 7 días; MCH-Min T15: membrana de la cáscara de huevo mineralizada con fosfato de calcio mediante el método de cristalización por difusión de vapor a 15 días
Fig. 7. Muestra la morfología y adhesión celular de MSCs sobre MCH y MCH-Min tras un día de cultivo celular. Imágenes de microscopía electrónica de barrido (SEM) de MSCs sobre MCH y MCH-Min. Las MSCs presentan una morfología estirada, con mejor adherencia y proliferación en los grupos MCH-Min con respecto al grupo MCH. Las flechas blancas señalan las MSCs adheridas al material objeto de estudio. Barra de escala: 10pm. Magnificación de 2 KX.
Fig. 8. Muestra la evaluación biológica in vitro de las MCH y MCH-Min. Análisis de inmunofluorescencia para la detección de osteopontina tras 21 días de cultivo celular. Imágenes de microscopía confocal representativas de la presencia de osteopontina en MCH y MCH-Min. Comparación entre muestras cultivadas usando Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) y muestras cultivadas utilizando medio de cultivo celular de diferenciación osteogénica. Barra de escala: 100pm.
Fig. 9. Muestra la evaluación biológica in vitro de las MCH y MCH-Min. Análisis de inmunofluorescencia para la detección de colágeno I tras 21 días de cultivo celular. Imágenes de microscopía confocal representativas de la presencia de colágeno I en MCH y MCH-Min. Comparación entre muestras cultivadas usando Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) y muestras cultivadas utilizando medio de cultivo celular de diferenciación osteogénica. Barra de escala: 100pm.
Fig. 10. Muestra en valores cuantitativos la intensidad de mareaje de osteopontina de las MSCs cultivadas en MCH y MCH-Min. Los datos representan la media ± D.S. de la diferencia significativa entre grupos con respecto a las MSCs cultivadas en el día 0 (n=4). Comparación entre muestras cultivadas usando Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) y muestras cultivadas utilizando medio de cultivo celular de diferenciación osteogénica. La cuantificación de OPN muestra diferencia significativa p<0,005 entre todos los grupos con respecto a los controles de MSC en monocapa. Barra de escala: 100pm. (*) p<0.05; (**) p<0,01 ; (***) p<0,005. Abreviaturas -> DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle Medium; MCH: membrana de la cáscara de huevo; MCH-Min T7: membrana de la cáscara de huevo mineralizada con fosfato de calcio mediante el método de cristalización por difusión de vapor a 7 días; MCH-Min T 15: membrana de la cáscara de huevo mineralizada con fosfato de calcio mediante el método de cristalización por difusión de vapor a 15 días; M-O:Células madre mesenquimales diferenciadas a Osteoblastos; MSC: Célula Madre Mesenquimal; OPN: Osteopontina; ST: Sin tratamiento.
Fig. 11. Muestra en valores cuantitativos la intensidad de mareaje de colágeno I de las MSCs cultivadas en MCH y MCH-Min. Los datos representan la media ± D.S. de la diferencia significativa entre grupos con respecto a las MSCs cultivadas en el día 0 (n=4). Comparación entre muestras cultivadas usando Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) y muestras cultivadas utilizando medio de cultivo celular de diferenciación osteogénica. La cuantificación de COL I muestra diferencia significativa p<0,05 entre MCH-MIN T7 cultivadas usando medio de diferenciación osteogénica y MCH-MIN T15 cultivadas usando medio estándar suplementado (DMEM) con respecto a los controles, y p<0,005 entre MCH-MIN T7 DMEM y MCH-MIN T 15 cultivadas usando medio de diferenciación osteogénica con respecto a los controles de MSC en monocapa. Barra de escala: 100pm. (*) p<0.05; (**) p<0,01 ; (***) p<0,005. Abreviaturas -> Col I: Colágeno tipo I; DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium; MCH: membrana de la cáscara de huevo; MCH-Min T7: membrana de la cáscara de huevo mineralizada con fosfato de calcio mediante el método de cristalización por difusión de vapor a 7 días; MCH-Min T15: membrana de la cáscara de huevo mineralizada con fosfato de calcio mediante el método de cristalización por difusión de vapor a 15 días; M-O: Células madre mesenquimales diferenciadas a Osteoblastos; MSC: Célula Madre Mesenquimal; ST: Sin tratamiento.
EJEMPLOS
A continuación, se ¡lustrará la invención mediante una descripción del proceso de obtención y unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
Ejemplo 1 : Procedimiento de obtención v caracterización química v estructural del material objeto de la invención
Las membranas de cáscara de huevo (MCH) se obtuvieron cuidadosamente mediante separación manual de la cáscara de huevo con ayuda de unas pinzas. A continuación, se lavaron con agua desionizada y se seccionaron en piezas circulares de 0 8 mm utilizando un punzón de biopsia. Estas piezas se colocaron en la cámara superior de la “seta de cristalización” con la superficie activa (el lado que se encontraba en contacto con la cáscara, que muestra las mamilas de la figura 1 ) hacia arriba con objeto de proteger la cara interna de la mineralización. Posteriormente, se deposita sobre ellas microgotas formadas al mezclar 20 microlitros de disolución 50 mM Ca(CH3COO)2 con 20 microlitros de disolución 30 mM de (NH4)2HPC>4, con una relación final Ca/P de 5:3 cada una. En la cámara inferior de la seta se añadieron 3 mL de disolución de 40 mM NH4HCO3. Una vez tapada y sellada la seta con grasa de alto vacío de silicona, el NH4HCO3 se descompone en gases CO2 y NH3, que difunden hasta la cámara superior a través de un agujero de 6 mm de diámetro, y de ahí difunden sobre las gotas, elevando el pH y favoreciendo la precipitación del fosfato cálcico
Figure imgf000012_0001
sobre las piezas circulares de membrana (MCH). Los experimentos de cristalización se realizaron durante 1 , 7, 15 y 21 días a temperatura ambiente y presión atmosférica. Al terminar los experimentos, se abrió el dispositivo y las membranas mineralizadas (MCH-Min) se lavaron con agua desionizada, se secaron al aire durante dos días y almacenaron para su posterior caracterización.
Ejemplo 2. Procedimiento de obtención v caracterización auímica v estructural del material objeto de la invención dopado con iones v moléculas bioactivas
El método es similar al descrito en el Ejemplo 1 , pero vahando la composición inicial de las microgotas dependiendo del ion o molécula activa dopante, mezclando las disoluciones de la siguiente manera: a) F: 20 microlitros de disolución 40 mM Ca(CH3COO)2 +10mM NaF mezcladas con 20 microlitros de disolución 30 mM de (NH4)2HPC>4. b) M2+= Mn2+, Co2+: 20 microlitros de disolución 40 mM Ca(CH3COO)2 +10mM MCI2.nH2O mezcladas con 20 microlitros de disolución 30 mM de (NH4)2HPC>4 con una relación final (Ca+M2+)/P de 5:3; c) M3+= Eu3+ , Tb3+: 20 microlitros de disolución de composición 40 mM Ca(CH3COO)2 + 10mM MCh nH2O mezclados con 20 microlitros de disolución 30 mM de (NH4)2HPC>4 con una relación final (Ca+M3+)/P de 5:3. d) Moléculas bioactivas = ácido L-aspártico, ácido L-Glutámico: 15 microlitros de disolución 50 mM Ca(CH3COO)2 + 15 microlitros de disolución 30 mM (NH4)2HPC>4 (Ca/P = 5/3) +10 microlitros de molécula bioactiva de concentración 20 mM. Las imágenes obtenidas mediante microscopio electrónico de barrido (Figura 1 ) muestran la MCH por su lado activo (Figuras 1 a y 1 b) y después del proceso de mineralización MCH-Min a vahos tiempos (Figuras 1 c-h). La membrana posee una estructura de fibras entrecruzadas cubierta por pequeños agregados granulares de material orgánico (denominados “mamilas”). Tras el proceso de mineralización controlada mediante el método de cristalización por difusión de vapor, la membrana presenta un precipitado compuesto por fases minerales de fosfato cálcico recubriendo las fibras entrecruzadas.
La identificación mineral del precipitado (Min) formado sobre las fibras de la membrana de la cáscara (MCH-Min) corresponde a fosfato cálcico, fase cristalina identificada mediante difracción de rayos X como hidroxiapatito carbonatado (Figuras 2; fichas referencia; ICDD: 00-019-0272, COD: 969003552). Esta fase mineral se encuentra mayohtahamente presente en tejidos mineralizados de origen biológico, tales como huesos y dientes.
La caracterización química a nivel molecular del precipitado mineral formado en la membrana se realizó empleando técnicas espectroscópicas complementarias, específicamente mediante espectroscopias de infrarrojo (Figura 3) y Raman (Figura 4). La membrana de la cáscara de huevo sin mineralizar (MCH) está compuesta principalmente por bandas proteicas de tipo amida, así como por bandas relacionadas con distintos tipos de lípidos y polisacáhdos (Figura 3a y 4a). Posteriormente al proceso de mineralización controlada, el análisis de los espectros muestra una fase mineral donde se observan bandas relacionadas con modos vibracionales de grupos moleculares de fosfatos cristalinos (Figura 3b y 4b) asociados con apatito (vi,v4 de PO4 3), y una pequeña banda a 875 cm-1 asociada a carbonato (Figura 3b), características del apatito carbonatado tal y como se identificó mediante difracción de rayos X.
Los análisis composicionales, obtenidos por espectroscopia de rayos X (EDS) acoplada al microscopio electrónico de barrido (Tabla 1 ) muestran la composición relativa de los elementos químicos presentes en la MCH-Min (zona mineralizada, Figura 5a) en comparación con la superficie de membrana no mineralizada (Figura 5b). Los resultados muestran como el proceso controlado de mineralización mediante cristalización por difusión de vapor genera un precipitado que recubre la superficie de la membrana cuyas concentraciones relativas de los elementos calcio y fósforo (razón molar de aproximadamente 1 ,65) están asociadas a la relación estequiométrica presente en apatito.
Tabla 1 . Análisis EDS de la MCH-Min en la zona mineralizada y no mineralizada
Figure imgf000014_0001
Los análisis composicionales obtenidos por espectroscopia de rayos X (EDS) de MCH- Min dopados con iones o conteniendo moléculas bioactivas siguiendo el ejemplo 2, se muestran en la Tabla 2. En ellos se puede observar un aumento en la concentración de oxígeno, así como la presencia del ion dopante en la composición de la capa de fosfato cálcico. En los experimentos usando Flúor, L-Glu y L-Asp hay un aumento significativo de la concentración de Oxígeno.
Tabla 2. Análisis EDS de la MCH-Min dopada con iones y moléculas bioactivas
Figure imgf000014_0002
Ejemplo 3: Ensayo de proliferación celular de las MSCs sembradas en la superficie del material objeto de la invención
La proliferación celular se determinó mediante el ensayo colorimétrico AlamarBIue (Thermo Fisher Scientific) siguiendo las instrucciones del fabricante. Éste reveló una tendencia a mantener la proliferación celular a lo largo del cultivo en algunas condiciones y a aumentarla en otras (Figura 6). En el grupo MCH, se observa una ligera reducción no significativa de la proliferación celular a lo largo de los días. Sin embargo, la tasa de proliferación en MCH-Min T7 aumentó desde el día 1 hasta el día 10 de cultivo, con un leve descenso no significativo en el día 21. Por otra parte, el biomaterial condicionado de la forma MCH-Min T15 mostró un aumento significativo de la tasa de proliferación después de 21 días. Ambas condiciones de estudio, MCH-Min T7 y MCH-Min T15, mostraron un aumento significativo en la proliferación celular en el tiempo con respecto al grupo MCH. En esencia, estos resultados indican que el nuevo biomaterial consistente en membranas de huevo mineralizadas proporcionó un entorno favorable a las células, apoyando una buena proliferación celular en diferentes procesos de mineralización.
Figure imgf000015_0001
de adhesión celular mediante imaaen obtenida
Figure imgf000015_0003
ía electrónica de barrido
Figure imgf000015_0002
La morfología y adherencia celular se examinaron mediante microscopía electrónica de barrido (SEM). Para ello, MCH y MCH-Min se fijaron en glutaraldehído frío al 2,5%. Tras vahos lavados con PBS, las muestras se deshidrataron utilizando una serie graduada de etanol (30-100%) y se secaron mediante un secador de punto crítico Emscope CPD 750. Las muestras se fijaron a una seta de aluminio y se recubrieron con una aleación de oro y paladio, utilizando un Sputter Coater 108 Auto. Las imágenes de las muestras se obtuvieron utilizando un SEM Quanta 400 (PEI), a un aumento de 2KX.
Las imágenes obtenidas mediante SEM (Figura 7) muestran que las MSCs presentan mejor adherencia y una mayor capacidad de proliferación en los grupos MCH-Min con respecto al grupo MCH. Las flechas blancas señalan las MSCs adheridas al material objeto de estudio. Magnificación de 2 KX.
5: Evaluación de la diferenciación osteoqénica de células madre
Figure imgf000015_0004
sobre el material objeto de la invención
La diferenciación osteogénica se evaluó mediante técnicas de inmunofluorescencia. Las MCH y MCH-Min sembradas con MSCs se fijaron tras 21 días en cultivo celular con PFA al 4% en PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Para el análisis por inmunofluorescencia, las muestras se trataron con un anticuerpo primario contra la osteopontina (Santa Cruz Biotechnology, 1 :200), y colágeno tipo I (Abeam, 1 :200). A continuación, las secciones se incubaron con anticuerpos secundarios conjugados con AlexaFluor 488 o 594 (ThermoFisher, 1 :500) y se tiñeron con DAPI. Las imágenes se obtuvieron con un microscopio Leica TCS-SP5 y se analizaron con el software Image J. La tinción de inmunofluorescencia reveló la presencia de osteopontina y colágeno I tras 21 días de cultivo (Figuras 8 y 9), lo que indica que la mineralización de la membrana del huevo promovió la diferenciación osteogénica de las MSC. La intensidad de mareaje de la osteopontina (OPN) y el colágeno I (COL I) presente en las MSCs sembradas sobre MCH y MCH-Min también fue evaluada, mostrando un aumento significativo de la presencia de estas proteínas. La cuantificación de OPN muestra diferencia significativa p<0,005 entre todos los grupos con respecto al control de MSCs sembradas sin el material objeto de estudio en monocapa (Figura 10). La cuantificación de COL I muestra diferencia significativa p<0,05 entre MCH-MIN T7 cultivadas usando medio de diferenciación osteogénica y MCH-MIN T15 cultivadas usando medio estándar suplementado (DMEM) con respecto a los controles, y p<0,005 entre MCH-MIN T7 (DMEM) y MCH-MIN T15 cultivadas con medio de diferenciación osteogénica con respecto a los controles de MSCs sembradas sin el material objeto de estudio en monocapa (Figura 1 1 ).

Claims

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento de obtención de un material que comprende una etapa (i) de mineralización controlada de una membrana orgánica con un recubrimiento inorgánico mediante cristalización por difusión de vapor.
2. El procedimiento según la reivindicación 1 , donde la mineralización controlada se lleva a cabo sólo en la capa externa de la membrana orgánica.
3. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, donde la membrana orgánica es una membrana extraída de cáscara de huevo.
4. Material obtenido por el procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende una membrana extraída de cáscara de huevo donde las fibras que la componen están recubiertas por una capa de fosfato cálcico.
5. El material según la reivindicación 4, que además está recubierto en su totalidad por una segunda capa de fosfato de calcio.
6. El material según cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5, donde el fosfato cálcico corresponde a la fase cristalina de hidroxiapatito carbonatado.
7. El material según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, donde el fosfato cálcico está dopado con uno o más aniones.
8. El material según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, donde el fosfato cálcico está dopado con uno o más iones metálicos.
9. El material según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, donde la capa de fosfato cálcico contiene una o más moléculas orgánicas.
10. El material según cualesquiera de las reivindicaciones 4 a 9, para su uso en procesos odontológicos de recubrimiento pulpar y de regeneración de tejido óseo.
11 . El material para el uso según la reivindicación 10, donde el recubrimiento pulpar es directo o indirecto.
PCT/ES2023/070274 2022-04-28 2023-04-28 Material para recubrimiento pulpar y regeneración ósea Ceased WO2023209262A1 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
ES202230390A ES2955740A1 (es) 2022-04-28 2022-04-28 Material para recubrimiento pulpar y regeneracion osea
ESP202230390 2022-04-28

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023209262A1 true WO2023209262A1 (es) 2023-11-02

Family

ID=88517977

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/ES2023/070274 Ceased WO2023209262A1 (es) 2022-04-28 2023-04-28 Material para recubrimiento pulpar y regeneración ósea

Country Status (2)

Country Link
ES (1) ES2955740A1 (es)
WO (1) WO2023209262A1 (es)

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MAHDAVI SHAHRIAR, AMIRSADEGHI ARMIN, JAFARI ARMAN, NIKNEZHAD SEYYED VAHID, BENCHERIF SIDI A.: "Avian Egg: A Multifaceted Biomaterial for Tissue Engineering", INDUSTRIAL & ENGINEERING CHEMISTRY RESEARCH, AMERICAN CHEMICAL SOCIETY, vol. 60, no. 48, 8 December 2021 (2021-12-08), pages 17348 - 17364, XP093107009, ISSN: 0888-5885, DOI: 10.1021/acs.iecr.1c03085 *
NAFI’ISAH D, BUDI C E, ROSYIDA N F, ALHASYIMI A A: "Development of eggshell membrane as an alternative for black triangle reconstruction following orthodontic tooth movement", JOURNAL OF PHYSICS: CONFERENCE SERIES, INSTITUTE OF PHYSICS PUBLISHING, GB, vol. 1170, 1 March 2019 (2019-03-01), GB , pages 012077, XP093107012, ISSN: 1742-6588, DOI: 10.1088/1742-6596/1170/1/012077 *
OCHOA I.: "Sintesis and caracterizacion of polvos of hidroxiapatita carbonatada tipo b con diferentes contenidos of carbonato", REVISTA COLOMBIANA OF MATERIALS, no. 17, 1 January 2021 (2021-01-01), pages 22 - 32, XP093107031, ISSN: 2256-1013 *
SALAH MOHAMED, KATAIA MOHAMED M., KATAIA ENGY M., EL DIN ENAS ALAA, ESSA MONA E.: "Evaluation of eggshell powder as an experimental direct pulp capping material", FUTURE DENTAL JOURNAL, vol. 4, no. 2, 1 December 2018 (2018-12-01), pages 160 - 164, XP093107018, ISSN: 2314-7180, DOI: 10.1016/j.fdj.2018.05.008 *
ZHANG, Y. ; LIU, Y. ; JI, X. ; BANKS, C.E. ; SONG, J.: "Flower-like agglomerates of hydroxyapatite crystals formed on an egg-shell membrane", COLLOIDS AND SURFACES B: BIOINTERFACES, ELSEVIER AMSTERDAM, NL, vol. 82, no. 2, 1 February 2011 (2011-02-01), NL , pages 490 - 496, XP027524946, ISSN: 0927-7765 *
ZHITONG ZHAO: "Effect of Doping Ions and Organic Molecules on the Precipitation and Biological Interactions of Nanostructured Calcium Phosphates", PHD THESIS MATERIALS SCIENCE AND ENGINEERING DOCTORAL PROGRAM, 1 October 2015 (2015-10-01), XP093107022, Retrieved from the Internet <URL:https://upcommons.upc.edu/bitstream/handle/2117/95999/TZZ1de1.pdf?sequence=1&isAllowed=y> [retrieved on 20231129] *

Also Published As

Publication number Publication date
ES2955740A1 (es) 2023-12-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Watson et al. Present and future of glass-ionomers and calcium-silicate cements as bioactive materials in dentistry: Biophotonics-based interfacial analyses in health and disease
Pepla et al. Nano-hydroxyapatite and its applications in preventive, restorative and regenerative dentistry: a review of literature
Osorio et al. Bioactivity of zinc-doped dental adhesives
Juárez Broon et al. Healing of root perforations treated with Mineral Trioxide Aggregate (MTA) and Portland cement
Dascălu et al. Synthesis and characterization of biocompatible polymer-ceramic film structures as favorable interface in guided bone regeneration
Ohayon Maxillary sinus floor augmentation using biphasic calcium phosphate: a histologic and histomorphometric study.
Imura et al. Application of hydroxyapatite nanoparticle-assembled powder using basic fibroblast growth factor as a pulp-capping agent
Donath et al. A histologic evaluation of a mandibular cross section one year after augmentation with hydroxyapatite particles
ES2929118T3 (es) Hidrogeles de fosfato de magnesio
Sheikh et al. Achieving enhanced bone regeneration using monetite granules with bone anabolic drug conjugates (C3 and C6) in rat mandibular defects
Um et al. Histological comparison of autogenous and allogenic demineralized dentin matrix loaded with recombinant human bone morphogenetic protein-2 for alveolar bone repair: a preliminary report
Kim et al. Development of cell-laden photopolymerized constructs with bioactive amorphous calcium magnesium phosphate for bone tissue regeneration via 3D bioprinting
EP3849566B1 (en) Dental and medical compositions having a multiple source of metallic ions
Danesh et al. Biocompatibility and mineralization activity of fresh or set white mineral trioxide aggregate, biomimetic carbonated apatite, and synthetic hydroxyapatite
El-Ghannam et al. Enhancement of bone regeneration and graft material resorption using surface-modified bioactive glass in cortical and human maxillary cystic bone defects.
Dorozhkin et al. Precipitation of carbonateapatite from a revised simulated body fluid in the presence of glucose
WO2023209262A1 (es) Material para recubrimiento pulpar y regeneración ósea
Sousa et al. A clinical report of bone regeneration in maxillofacial surgery using Bonelike® synthetic bone graft
Sokolowski et al. Phycogenic bone substitutes for sinus floor augmentation: Histomorphometric comparison of hydroxyapatite and biphasic calcium phosphate in a randomised clinical pilot study.
JPH10243996A (ja) 硬組織石灰化促進用生体材料
Kocak Smart pH and Thermosensitive Injectable Hydrogels: Chitosan–Hydroxyapatite–Heparin Based Functionalised Biomaterials for Bone Regeneration
Komlev et al. Bioactivity and effect of bone formation for octacalcium phosphate ceramics
RU2477120C2 (ru) Способ получения цемента брушитного типа для замещения костных дефектов
Felice et al. Magnesium-substituted hydroxyapatite grafting using the vertical inlay technique.
Taha et al. Evaluation of osseous healing in induced mandibular defects grafted with biphasic calcium phosphate doped with silver and zirconium nanoparticles: An experimental study in dogs

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 23795700

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 23795700

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1