WO2023182856A1 - 로-키나제 억제제를 포함하는 켈로이드 등 피부 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 그의 용도 - Google Patents

로-키나제 억제제를 포함하는 켈로이드 등 피부 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 그의 용도 Download PDF

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keloid
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kinase
kinase inhibitor
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최민하
박준호
강명희
김지영
민세리
양희웅
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서울대학교산학협력단
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Definitions

  • It relates to a pharmaceutical composition for treating skin fibrotic disease containing a rho-kinase inhibitor and a method of treating skin fibrotic disease using the same.
  • Keloids are a serious disease that has a very irregular surface and border, is hard, and thick, and does not get smaller even after 6-18 months after the injury. Rather, it goes beyond the damaged area and even invades normal skin. Keloids not only cause serious pain to the patient due to their appearance, but also cause significant disruption to social life by accompanied by symptoms such as burning, pain, itching, and functional impairment.
  • keloid treatment methods include pressure therapy, steroid injections, surgical resection, and radiation therapy, but they show a very high recurrence rate of more than 50% after treatment, and there is no fundamental treatment to date, leading to unmet clinical demand ( Unmet needs are very high.
  • Keloids are treated with external pressure therapy, steroid injections, surgical resection, and radiation therapy, but they have a very high recurrence rate after treatment, and there is no fundamental treatment to date, so there is a very high clinical unmet need. It is an incurable disease.
  • Target genes for keloid treatment have been reported continuously, but most of the research results have not led to the development of new drugs and are limited to the publication of papers, leaving a lack of practical results. This is also because the target discovery pipeline for keloid treatment cannot replicate the environment of keloids in the human body.
  • the present inventors used the Cell Stretching System in the verification process to confirm that a Rho Kinase inhibitor targeting keloids in situations involving mechanical physical force can be used as a preventive or therapeutic agent for keloids, and completed the present invention.
  • the present invention targeted Rho Associated Coiled-Coil Containing Protein Kinase (Rho Kinase), which is known to be overexpressed in situations involving mechanical force (physical stress), by using a previously unused Cell Stretching System in the verification process.
  • Rho Kinase Rho Associated Coiled-Coil Containing Protein Kinase
  • the present invention was completed by more actively reflecting the signaling system for various physical stresses inside and outside the cell, identifying the fundamental cause of suppression, and completing the present invention. .
  • the purpose of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating skin fibrotic disease containing a rho-kinase inhibitor as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating skin fibrotic disease, comprising administering the pharmaceutical composition to an individual in need thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for topical skin application containing a rho-kinase inhibitor for preventing or improving skin fibrotic disease.
  • Rho-Kinase Rho-Kinase induced by mechanical force.
  • Rho-Kinase inhibitors can be useful in the treatment of skin fibrotic diseases such as keloids, hypertrophic scars, and scars.
  • the present inventors have confirmed that the Rho-kinase inhibitor, Y-27632, effectively blocks the proliferation and production of keloid fibroblasts in the presence of mechanical stress.
  • Rho-kinase in the present invention, it was confirmed that when a certain mechanical stress is applied to primary cultured keloid fibroblasts, the expression and activity of Rho-kinase increases, resulting in excessive production of collagen, a typical characteristic of keloids.
  • Rho-kinase including Y-27632, blocks excessive collagen production in keloid fibroblasts by inhibiting the activity of Rho-kinase and associated downstream mechanisms even under mechanical stress. This will be a strategy that can not only prevent and treat keloid disease, but also greatly reduce the probability of recurrence.
  • Rho-Kinase and cofilin, Rho-Kinase and Myosin light chain (MLC), and factors involved in the collagen synthesis pathway
  • MLC Myosin light chain
  • the present inventors stabilized fibroblasts obtained through primary culture from tissues collected from keloid patients, secured the cell number, and then banked them for subsequent experiments.
  • a stretching device (STB-1400; Strex Inc., Janpan) was used to apply mechanical force to the banked primary cultured fibroblasts. More specifically, to apply mechanical stress, the container with the cells attached was mounted on a stretching device, and various conditions such as degree, frequency, and time of stress were applied to establish the optimal conditions closest to the physiological activity in the body.
  • Y-27632 a Rho-kinase inhibitor
  • Y-27632 and mechanical stress changed the expression of factors involved in the collagen synthesis pathway, the interaction between Rho-kinase and Cofilin, Rho-kinase and Myosin light chain (MLC), respectively.
  • MLC Myosin light chain
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating skin fibrotic disease comprising a rho-kinase inhibitor as an active ingredient.
  • Rho-kinase refers to a kinase belonging to the AGC (PKA/PKG/PKC) family of serine-threonine kinases.
  • Rho-associated protein kinase also referred to as ROCK refers to Rho-kinase, and ROCK consists of ROCK1 and ROCK2.
  • the present invention uses a previously unused Cell Stretching System in the verification process to target and inhibit Rho-Kinase, which is overexpressed in situations involving mechanical physical force (physical stress), thereby reducing physical stress such as mechanical force and mechanical friction. It blocks excessive collagen production in keloid fibroblasts by inhibiting Rho-Kinase induced by stimulation.
  • the Rho-kinase inhibitor refers to a substance that targets and inhibits Rho-kinase overexpressed by mechanical stimulation.
  • Rho-kinase inhibitor refers to an agent that reduces the expression or activity of Rho-kinase in cells, for example, by acting directly on Rho-kinase or indirectly on the upstream regulator of Rho-kinase. It may refer to an agent that reduces the expression level of Rho-kinase or its activity by reducing the expression of Rho-kinase at the transcriptional level, increasing the degradation of expressed Rho-kinase, or interfering with its activity. .
  • the Rho-kinase activity inhibitor may be an antibody that specifically binds to Rho-kinase protein or a fragment thereof, an antigen-binding fragment thereof, a peptide, a protein, or a combination thereof.
  • the Rho-kinase inhibitor is not particularly limited as long as it is a substance with Rho-kinase inhibitory activity, but in the present invention, the Rho-kinase inhibitor is Y-27632 (C 14 H 21 N 3 O), Y-27632 2HCl , Thiaxovivn (C 15 H 13 N 5 OS), Fasudil (HA-1077) (C 14 H 17 N 3 O 2 S), Fasudil (HA-1077) HCL, GSK429286A (C 21 H 16 F 4 N 4 O 2 ), RKI-1447 (C 16 H 14 N 4 O 2 S), H-1152 dihydrochloride (C 16 H 23 Cl 2 N 3 O 2 S), Azaindole 1 (TC-S 7001) (C 16 H 23 Cl 2 N 3 O 2 S), Hydroxyfasudil (HA-1100) (C 14 H 17 N 3 O 3 S), Hydroxyfasudil (HA-1100) HCL, Y-39983 (C 16 H 16 N
  • the Rho-kinase inhibitor may be Y-27632 or Y-27632 2HCl.
  • the treatment effect of skin fibrotic disease through Rho-kinase inhibition was confirmed using Y-27632.
  • the Rho-kinase inhibitor can target and inhibit Rho-kinase overexpressed by mechanical stimulation.
  • the Rho-kinase inhibitor can inhibit F-actin formation.
  • the rho-kinase inhibitor inhibits the expression of one or more proteins selected from the group consisting of VEGF, SMA, vimentin, collagen type I, and collagen type III. can do.
  • the rho-kinase inhibitor exhibits one or more characteristics selected from the following characteristics. (a) Inhibition of proliferation of keloid fibroblasts; (b) inhibition of migration of keloid fibroblasts; and (c) reduction in size and hardness of keloid tissue.
  • the rho-kinase inhibitor may be in the form of a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Said salts include the usual acid addition salts used in the pharmaceutical field, for example in the field of diseases associated with cell aging, for example salts derived from inorganic acids such as hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, sulfamic acid, phosphoric acid or nitric acid and acetic acid.
  • salts derived from organic acids such as loacetic acid.
  • the salts also include common metal salt forms, for example salts derived from metals such as lithium, sodium, potassium, magnesium, or calcium.
  • the acid addition salt or metal salt can be prepared according to conventional methods.
  • the rho-kinase inhibitor may also be in the form of its stereoisomer.
  • the stereoisomers include all stereoisomers such as enantiomers and diastereomers.
  • the compound may be in stereoisomerically pure form or a mixture of one or more stereoisomers, for example a racemic mixture. Separation of specific stereoisomers can be performed by any of the conventional methods known in the art.
  • skin fibrotic disease refers to the development of scars or fibrous tissue due to excessive proliferation of epithelial cells or fibrous connective tissue.
  • a wound occurs, it is healed through the processes of hemostasis, inflammation, proliferation, and remodeling, but if the skin wound is severe or repeated, the wound healing process is dysregulated, which causes Excessive fibrous connective tissue is formed around damaged skin tissue, which can cause skin fibrotic disease.
  • the skin fibrotic disease may be a concept encompassing fibrosis of any skin tissue and epithelial cells, scars, and fibrosis of epithelial cells of the skin and scalp.
  • the scar may refer to fibrous tissue that replaces normal tissue destroyed by injury or disease. Damage to the outer layer of the skin heals by rebuilding the tissue, in which case scar formation may be minimal. However, if the thick layer of tissue beneath the skin is damaged, reconstruction becomes more complicated. The body accumulates collagen fibers (a protein produced naturally by the body), which usually results in a noticeable scar.
  • the skin fibrotic disease includes keloid, stretch mark keloid, hypertrophic scar, hypertrophic scar, atrophic scar, scleroderma, and connective tissue. It may be a connective tissue disease or a connective tissue disease.
  • prevention includes all acts of suppressing or delaying skin fibrotic disease by administering the pharmaceutical composition according to one aspect to an individual.
  • treatment refers to all actions that improve or benefit symptoms of skin fibrotic disease by administering a pharmaceutical composition according to one aspect to an individual.
  • the pharmaceutical composition can be administered to mammals, including humans, through various routes.
  • the administration method may be any commonly used method, for example, oral, dermal, intravenous, intramuscular, subcutaneous, etc.
  • the pharmaceutical composition may further include an appropriate carrier, excipient, or diluent commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • the composition includes tablets, pills, powders, granules, capsules, suspensions, oral solutions, emulsions, syrups, sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, transdermal absorbents, gels, lotions, It may have any one dosage form selected from the group consisting of ointments, creams, patches, cataplasms, pastes, sprays, dermal emulsions, dermal suspensions, transdermal delivery patches, drug-containing bandages, and suppositories, and may be administered orally or It may be in various parenteral dosage forms, but is not limited thereto.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc. These solid preparations contain one or more compounds and at least one excipient, such as starch, calcium carbonate, sucrose, or lactose ( It is prepared by mixing lactose, gelatin, etc. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, oral solutions, emulsions, and syrups.
  • ком ⁇ онентs such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included.
  • Preparations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, and injectable ester such as ethyl oleate.
  • injectable ester such as ethyl oleate.
  • As a base for suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao, laurel, glycerogelatin, etc. can be used.
  • the administered dose of the pharmaceutical composition may vary depending on the individual's age, weight, gender, dosage form, health condition, and disease degree, and may be administered once a day to several times at regular time intervals according to the judgment of a doctor or pharmacist. It may also be administered in divided circuits.
  • the daily dosage may be 0.1 to 500 mg/kg based on the active ingredient content.
  • the above dosage is an example of an average case, and the dosage may be higher or lower depending on the size and number of lesions, differences in personal compliance, etc.
  • the present invention provides a method for preventing or treating skin fibrotic disease, comprising administering the pharmaceutical composition to an individual in need thereof.
  • the pharmaceutical composition in the present invention, the pharmaceutical composition, skin fibrotic disease, prevention, treatment, etc. are as described above.
  • the method includes administering the pharmaceutical composition in a pharmaceutically effective amount into a subject suspected of having skin fibrotic disease.
  • the entity may refer to all mammals including dogs, cows, horses, rabbits, mice, rats, chickens, or humans.
  • the pharmaceutical composition can be administered parenterally, subcutaneously, intraperitoneally, intrapulmonaryly, and intranasally.
  • Parenteral administration may include intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, or subcutaneous administration.
  • the method of administration of the pharmaceutical composition may be intravenous injection, subcutaneous injection, intradermal injection, intramuscular injection, and drip injection.
  • the dosage of the pharmaceutical composition varies depending on the individual's condition and weight, degree of disease, drug form, administration route and period, but can be appropriately selected by a person skilled in the art.
  • the Rho-kinase inhibitor has the effect of significantly reducing the proliferation and mobility of cells in which skin fibrotic disease has progressed, and therefore, a pharmaceutical composition containing the Rho-kinase inhibitor as an active ingredient is used in subjects suspected of having skin fibrotic disease. By administering it, skin fibrotic disease can be treated by preventing the occurrence or progression of skin fibrotic disease.
  • the present invention provides a composition for topical skin application for preventing or improving skin fibrotic disease, including a rho-kinase inhibitor.
  • the rho-kinase inhibitor, prevention, skin fibrotic disease, etc. are as described above.
  • improvement includes all actions that improve symptoms of skin fibrotic disease or provide benefits by applying the external skin composition to an individual.
  • skin external agents are a concept that generally encompasses compositions used for external use, and include cosmetic compositions containing various cosmetics such as basic cosmetics, makeup cosmetics, hair cosmetics, and shaving cosmetics, and various pharmaceuticals and quasi-drugs such as ointments. It can mean that it is broadly applicable.
  • the skin external preparation composition includes, in addition to the active ingredient, ingredients that are usually mixed in external preparations depending on the intended use and the properties of the external preparation composition, specifically moisturizers, ultraviolet absorbers, vitamins, animal and vegetable extracts, digestive agents, whitening agents, vasodilators, It may be additionally formulated with astringents, refreshing agents, hormones, etc.
  • the formulation of the composition for external use for skin may take an appropriate form depending on the intended use and the nature of the composition, specifically, aqueous solution, solubilization, emulsification, emulsion, gel, paste, ointment, and aerosol. , it may be a water-oil two-layer system, or a water-oil-powder three-layer system, and the formulation and form of the external preparation of the present invention are not limited by the above formulation.
  • the skin external preparation may additionally include a mechanism necessary to penetrate or transfer the active ingredient into skin tissue.
  • the composition containing a Rho-kinase inhibitor as an active ingredient according to the present invention targets Rho-kinase overexpressed by mechanical stimulation, thereby controlling the proliferation and migration of keloid fibroblasts, the expression of skin fibrosis markers, and the size and hardness of keloid tissue. By reducing the number of skin fibrotic diseases, it can be effectively used in the treatment or prevention of skin fibrotic diseases.
  • Figure 1 shows the expression of ROCK1 in keloid tissue and fibroblasts.
  • FIG. 2 shows that mechanical stress induces ROCK1 expression and F-actin rearrangement in keloid fibroblasts.
  • a Different stretching intensities (0-20%) were applied to normal fibroblasts (NF) and keloid-derived fibroblasts (KF) induced cell reorientation in response to stretching stimulation.
  • B cell proliferation in a stretching intensity-dependent manner was examined by CCK-8 assay. Cells were subjected to various stretch intensities of 0-20% (C) and incubation times of 0-24 hours (D) and then examined by Western blotting. Relative levels of ROCK1 were calculated using GADPH as a control.
  • Figure 3 shows the effect of Y-27632 on F-actin cytoskeleton rearrangement in keloid fibroblasts.
  • A is the cell viability according to increasing doses of Y-27632 in keloid fibroblasts for 24 hours.
  • B F-actin expression was determined by immunofluorescence in keloid fibroblasts treated with increasing doses of Y-27632 for 24 hours.
  • Figure 4 shows that suppressed ROCK1 induced F-actin rearrangement in keloid fibroblasts through the Rho/ROCK1 conversion pathway.
  • A is the kinase activity of ROCK1 in keloid fibroblasts with or without mechanical stretching with or without Y-27632.
  • B Immunocytochemical analysis of F-actin in keloid fibroblasts with or without mechanical stretching with or without Y-27632.
  • C Western blot analysis of p-MLC and MLC, or p-cofilin and cofilin, in keloid fibroblasts with or without mechanical stretching with or without Y-27632.
  • D is quantification of relative proteins pMLC/MLC and pCofilin/Cofilin from Western blotting results (C).
  • E Western blotting analysis of p-MLC and MLC, or p-cofilin and cofilin, in keloid fibroblasts under treatment of siNC and siROCK1 with or without mechanical stretch.
  • Figure 5 shows that inhibiting ROCK1 attenuates skin fibrosis and cell migration in keloid fibroblasts.
  • A shows the results of qRT-PCR analysis of the mRNA levels of pro-fibrotic genes, COL1A1, COL3A1, FN, a-SMA, CTGF, and PCNA.
  • Figure 6 shows cyclic stretch-activated ROCK1-triggered YAP and MRTF nuclear translocation.
  • A Western blotting analysis of nuclear translocation of YAP and MRTF in subcellular fractions of keloid fibroblasts with or without mechanical stretching with or without Y-27632.
  • Figure 7 is histological and immunohistochemical images of nodules formed by human keloid fibroblasts in SCID mice 7 days after Y-27632 treatment.
  • A Isolated nodules from mice treated with DMSO or Y-27632.
  • B Representative H&E staining, MT staining, and immunohistochemistry for VEGF, ⁇ -SMA, vimentin, MMP2, MMP9, COL I, and COL III in nodule tissue.
  • Original magnification: 200x, scale bar 100 ⁇ m.
  • ICH-GCP Guideline for Good Clinical Practice
  • the dermis and epidermis were separated, chopped into 1 mm thick pieces, and digested in 3 mg/ml collagenase type I (Thermo Fisher, MA, USA) to obtain a single cell suspension.
  • Cells were cultured in a humidified incubator in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM; Biowest, Nuaill ⁇ , France) containing 10% fetal bovine serum (FBS; Biowest, France) and 1% Antibiotic/Antimycotic Solution (Welgene Inc., Korea). did. 5% CO 2 at 37°C. Cells from passages 4 to 8 were used in the experiments.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle medium
  • FBS fetal bovine serum
  • Antibiotic/Antimycotic Solution Welgene Inc., Korea
  • ROCK1 kinase activity was assayed with the ROCK activity assay kit (Cell Biolabs, CA, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • the ROCK Activity Assay kit is an enzyme immunoassay designed to detect the phosphorylation level of myosin phosphatase target subunit1 at Thr696 by ROCK. Briefly, keloid fibroblasts (1.2 x 10 cells/collagen-coated silicone chamber) were seeded to reach 80% confluence overnight and cultured under static and kidney culture conditions for an additional 24 h with the ROCK1 inhibitor Y-27632 (10 ⁇ M). It was processed in . Cells were harvested, trypsinized, and washed twice with PBS.
  • lysis buffer Cells were lysed in lysis buffer (Cell Signaling Technology, MA, USA) for 30 min, and then samples were centrifuged at 15,000 rpm for 15 min at 4°C to collect protein lysates. Protein concentration was determined using the Pierce BCA Quantification Protein Kit (Thermo Fisher Scientific, MA, USA). 35 ⁇ g lysate protein was loaded/well for kinase analysis. The kinase reaction was activated by adding reaction solution (10mM DTT, 2mM ATP) in a shaking incubator at 30°C for 1 hour with slight shaking. After three washing steps with the washing solution provided in the kit, the reactive solution was decanted. Anti-phospho-MYPT1 (Thr696) was added to each well and incubated at 4°C overnight.
  • This membrane was incubated with ROCK1 (sc-17794, Santa Cruz, CA, USA), phosho COFILIN (#3313, Cell Signaling, MA, USA), COFILIN (#66057-1-Ig, Proteintech, IL, USA), and phosho MLC (# 3671, Cell Signaling, MA, USA), MLC (#ALX-BC-1150-S, Enzo Life Sciences, Inc., NY, USA) and GAPDH (sc-47724, Santa Cruz, CA, USA) primary antibodies; Incubate with secondary antibody (Enzo Life Sciences, Inc., NY, USA) coupled to horseradish peroxidase. GAPDH was used as a loading control for Western blotting analysis.
  • the PCR step consisted of an initial denaturation step at 94 °C for 5 min; 94 °C for 1 min (denaturation), 55 °C for 1 min (annealing), and 72 °C for 2 min (extension); and a final extension step at 72 °C for 7 min.
  • mRNA expression of ROCK1, skin fibrotic markers Collagen Type I Alpha 1 Chain (COL1A1), Collagen Type III Alpha 1 Chain (COL3A1), Alpha-smooth muscle actin (SMA), Fibronectin (FN), and connective tissue growth factor (CTGF) ) and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) were evaluated. Relative expression was calculated using the 2- ⁇ Ct method.
  • Nuclear/cytoplasmic extracts were separated separately using NE-Per Nuclear and Cytoplamic Extractons Reagents (#78833, Thermo Scientific, MA, USA) according to the manufacturer's instructions.
  • Subcellular fractionation lysis included YAP (#5157, Cell Signaling, MA, USA), GADPH (sc-47724, Santa Cruz, CA, USA) and Lamin B (#12586, Cell Signaling, MA) as internal markers for cytoplasmic and nuclear fractions. , USA) and MRTF (sc-47724, Santa Cruz, CA, USA), respectively, were analyzed by western blotting analysis. Quantification was performed with Image J software.
  • Keloid tissue was obtained from the abdomen, ears, and back from a total of 5 patients between the ages of 20 and 80 with keloid scars, and the keloids were collected after separating fibroblast cells for analysis.
  • ROCK1 ROCK1 expression in human keloid and normal skin tissues. Immunohistochemical staining showed increased expression of ROCK1 in human keloid tissue compared with normal skin tissue ( Figure 1A). As shown in Figure 1A, activated ROCK1 was easily detected in the dermal layer of keloid skin tissue, where fibroblast cells are mainly located. The expression of ROCK1 was examined in primary fibroblasts derived from normal and keloid tissues. Altered mRNA expression levels of ROCK1 in keloid-derived and human normal fibroblasts were quantified by quantitative reverse transcription PCR (RT-qPCR).
  • RT-qPCR quantitative reverse transcription PCR
  • the present invention used a cyclic stretching machine capable of controlling stretch deformation on fibroblasts to observe changes in cell morphology and proliferation after cyclic stretching.
  • a stretch gradient (5-20%) was applied to fibroblast cells for 24 hours and the effect of mechanical stretch on the cells was evaluated.
  • Figure 2A keloid fibroblasts aligned and reorganized parallel and perpendicular to the direction of elongation, whereas normal fibroblasts displayed an unoriented arrangement regardless of the cyclic elongation gradient. Additionally, keloid fibroblasts in the kidney state tend to grow thicker than normal fibroblasts.
  • ROCK1 expression was measured in fibroblasts subjected to cyclic stretch through Western blotting analysis.
  • fibroblasts were exposed to a series of gradients (5–20%) of cyclic stretch, ROCK1 expression was upregulated at increased stretch amplitude, as expected ( Figure 2C).
  • intense cyclic stretch (20%) impaired ROCK1 expression, consistent with a decrease in relative cell viability, which negatively affects fibroblast function and makes 20% cyclic stretch unsuitable for further studies.
  • the main components of the cytoskeletal network are F-actin fibers. Therefore, we investigated changes in F-actin in fibroblasts in response to periodic stress. Fibroblast cells stained with Phalloidin Alexa-488 were observed in static and stretch cultures and analyzed after 24 hours of culture. Figure 2E showed immunofluorescence images of F-actin fibers in normal and keloid fibroblasts under non-stretched stimulation (0%) and stretched stimulation (5% and 10%). Fiber fluorescence stained in unstretched fibroblasts showed no significant change between all treated conditions, indicating the insensitivity of cyclic stretch bearing F-actin synthesis to normal fibroblasts.
  • Y-27632 was used to confirm the effect of ROCK1 on keloids. No inhibitory effect of Y-27632 on keloid fibroblast proliferation was observed regardless of treatment dose (Figure 3A). However, in keloid fibroblasts, F-actin fiber formation is tightly regulated by Y-27632 treatment in a dose-dependent manner. A dramatic disruption of F-actin cytoskeletal structure was observed at 25 and 50 ⁇ M Y-27632, indicating an effective inhibitory effect of Y-27632 on ROCK1-mediated keloids in terms of actin depolymerization. The effective therapeutic dose of Y-27632 against keloid fibroblasts was optimized at 10 ⁇ M ( Figure 3B).
  • keloid fibroblasts were grown in 4 cells containing non-elongated fibroblasts, elongated fibroblasts, non-elongated fibroblasts pretreated with Y-27632, and elongated fibroblasts. were assigned to groups.
  • Rho/ROCK1 Rho/ROCK1 pathway for building the internal cytoskeletal network.
  • Dysregulation of the Rho/ROCK1 pathway may result in perturbation of F-actin formation, contributing to the framework of abnormal scarring and skin fibrotic diseases.
  • Keloids are characterized by excessive proliferation and migration of keloid fibroblasts beyond the location of the original lesion. Accordingly, prevention of keloid hypermobility has been proposed as a key factor in curing keloid formation and recurrence.
  • the migratory activity of keloid fibroblasts was further analyzed using a transwell migration assay. As observed in Figure 5B, migration of keloid fibroblasts was significantly promoted under mechanical force and partially inhibited in response to Y-27632.
  • YAP Yes-associated protein
  • MRTF Myocardin-related transcription factor
  • Keloid xenograft SCID mice were evaluated for inhibition of keloid nodule progression.
  • the average volume of keloid nodules treated with Y-27632 was 17.21 ⁇ 13.49 MM 3
  • the control group treated with 2% DMSO group was 21.27 ⁇ 13.98 MM 3 .
  • keloid nodule weight was significantly reduced in the Y-27632 treatment group compared to the control group.
  • the average weight of keloid nodules for the Y-27632 treated group and untreated control group was 4.56 ⁇ 3.50 Mg and 7.61 ⁇ 3.16 Mg, respectively (Figure 7A).
  • Keloid areas showed reduced inflammatory cells in the group treated with Y-27632 compared to the control group.
  • MT staining showed higher deposition of collagen bundles in the control group compared to the Y-27632 treated group.
  • the protein expression of VEGF, SMA, vimentin, collagen type I, and collagen type III in the Y-27632-treated group was significantly decreased (Figure 7B).

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Abstract

본 발명은 로-키나제 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물, 피부 외용제 조성물 및 이를 이용한 피부 섬유화 질환의 예방 또는 치료방법에 관한 것이다.

Description

로-키나제 억제제를 포함하는 켈로이드 등 피부 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 그의 용도
로-키나제 억제제를 포함하는 피부 섬유화 질환 치료용 약학적 조성물 및 이를 이용한 피부 섬유화 질환 치료방법에 관한 것이다.
켈로이드는 표면과 경계가 매우 불규칙하고, 딱딱하고, 두껍고, 다친 지 6-18개월이 지나도 작아지지 않으며 오히려 손상된 범위를 넘어 정상 피부까지 침범할 정도로 심각한 질환이다. 켈로이드는 환자에게 외양상 심각한 고통을 줄 뿐만 아니라, 작열감, 통증, 가려움증, 기능장애와 같은 증상을 동반하여 사회생활에 막대한 지장을 준다.
켈로이드에 대한 세계적 관심은 외모에 대한 관심 증가, 흉터 치료에 대한 관심 증대 및 COVID-19 영향으로 인한 라이프 스타일 변화 등에 의해 폭발적으로 증가하였다. 종래의 켈로이드 치료 방법은 압력 요법, 스테로이드 주사법, 외과적 절제술, 방사선 요법 등으로 시행되고 있으나, 치료 후 50% 이상의 매우 높은 재발률을 보이고, 현재까지 근본적으로 치료할 수 있는 치료법이 없어 임상적 미충족 수요(Unmet Needs)가 매우 높은 상황이다.
켈로이드는 외부 압력요법, 스테로이드 주사법, 외과적 절제술, 방사선 요법 등으로 치료되고 있으나, 치료 후 매우 높은 재발률을 보이고, 현재까지 근본적으로 치료할 수 있는 치료법이 없어 임상적 미충족 수요(Unmet Needs)가 매우 높은 난치성 질환이다. 켈로이드 치료를 위한 타겟 유전자들이 줄곧 보고되어지고 있으나, 연구성과가 대부분 신약개발로 이어지지 못하고 논문발표로 국한되어 실용화 성과 창출이 미흡한 상태이다. 이는 켈로이드 치료용 타겟 발굴 파이프라인이 켈로이드의 인체 내 환경을 모사하지 못하기 때문이기도 한다.
한편, 현재까지 발견된 켈로이드 조절 인자들이 어떠한 작용기전에 의해 켈로이드를 유발하는지에 대해서는 많은 부분들이 알려져 있지 않다.
본 발명자들은 Cell Stretching System을 검증 과정에 이용하여 기계적 물리력이 관여하는 상황에서 켈로이드를 타겟팅하는 Rho Kinase 억제제가 켈로이드에 대한 예방 또는 치료제로서 사용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 기존에 사용하지 않았던 Cell Stretching System을 검증 과정에 이용함으로써 기계적 물리력(물리적 스트레스)이 관여하는 상황에서 과발현된다고 알려진 Rho Associated Coiled-Coil Containing Protein Kinase (Rho Kinase)를 표적하였다. 이로써 염증억제를 위한 스테로이드 또는 세포분열억제를 위한 항암제 등의 기존 켈로이드 치료제와 비교하여 보다 적극적으로 세포 내외의 다양한 물리적 스트레스에 대한 신호전달 체계를 반영하고 근본적인 억제 원인을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은　로-키나제 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은　상기 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 섬유화 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은　로-키나제 억제제를 포함하는 피부 섬유화 질환의 예방 또는 개선용 피부 외용제 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명자들은 켈로이드 형성 및 증식이 유전자의 발현 변화에 의한 직접적인 결과 외에도 유전적 변화는 물론 생체의 물리적 환경에 의해 보다 심층적으로 조절되는 것에 착안하여, 기계적 물리력에 의해 유발되는 로-키나제(Rho-Kinase)를 켈로이드 치료의 타겟으로 설정하고, 로-키나제 억제제가 켈로이드, 비후성 반흔, 흉터 등 피부 섬유화 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 또한, 본 발명자들은 기계적 스트레스가 존재 하에서 로-키나제 억제제, Y-27632가 효과적으로 켈로이드 섬유아세포의 증식 및 생성을 차단함을 확인한 바 있다.
본 발명에서는 일차배양된 켈로이드 섬유아세포에 일정한 기계적 스트레스가 가해지면 로-키나제의 발현 및 활성이 증가하고 결과적으로 켈로이드의 대표적인 특징인 콜라겐의 과다 생성이 유발됨을 확인하였다. Y-27632를 포함한 로-키나제는 기계적 스트레스 상황에서도 로-키나제 및 연관된 하위 기전의 활성을 억제함으로써 켈로이드 섬유아세포에서의 콜라겐 과다 생성을 차단시킨다. 이는 켈로이드 질환의 예방 및 치료는 물론이고, 재발 확률을 크게 낮출 수 있는 전략이 될 것이다.
또한, 본 발명에서는 로-키나제(Rho-Kinase)와 코필린(cofilin), 로-키나제(Rho-Kinase)와 미오신 경쇄(Myosin light chain; MLC)의 상호작용 및 콜라겐(Collagen) 합성 경로 관여 인자의 발현 변화를 통해 로-키나제 억제제의 켈로이드의 예방 또는 치료 효과를 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명자들은 켈로이드 환자의 수집된 조직에서 일차 배양을 통해 얻어진 섬유아세포 (fibroblast)는 안정화를 통해 세포수를 확보한 후, 후속 실험을 위해 뱅킹하였다. 뱅킹된 일차배양 섬유아세포에 기계적 물리력을 가하기 위해서 Stretching device (STB-1400; Strex Inc., Janpan)를 이용하였다. 보다 구체적으로, 기계적 스트레스를 주기위해 세포가 붙어 있는 용기를 Stretching device에 장착한 후, 스트레스의 정도, 빈도, 시간 등의 조건을 다양하게 적용함으로써 체내 생리활성에 가장 가까운 최적의 조건을 확립하였다. 한편, 기계적 스트레스에 의해 활성되는 로-키나제를 타겟팅하기 위해 로-키나제 억제제인 Y-27632를 사용하여 일차배양 섬유아세포를 이용, 기계적 스트레스가 있는 상황과 기계적 스트레스가 없는 상황에서 Y-27632의 켈로이드 형성 억제 효과를 확인하였다. 구체적으로는 로-키나제와 코필린(Cofilin), 로-키나제와 미오신 경쇄(Myosin light chain; MLC)의 상호작용 및 콜라겐(Collagen) 합성 경로 관여 인자들의 발현 변화를 Y-27632 와 기계적 스트레스가 각각 또는 동시에 가해진 환경에서 대조군과 비교하여 테스트하였다.
본 발명은 로-키나제 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 로-키나제　(Rho-kinase)는 세린-트레오닌 키나제의 AGC (PKA/PKG/PKC) 패밀리에 속하는 키나제를 의미한다. 본 발명에서 로-연관 단백질 키나제(Rho-associated protein kinase: ROCK라고도 한다)는 로-키나제　(Rho-kinase)를 의미하며, ROCK는 ROCK1 및 ROCK2로 구성된다.
본 발명은 기존에 사용하지 않았던 Cell Stretching System을 검증 과정에 이용함으로써 기계적 물리력(물리적 스트레스)이 관여하는 상황에서 과발현되는 로-키나제(Rho-Kinase)를 표적하여 억제함으로서 기계적 물리력, 기계적 마찰 등 물리적 자극에 의해 유발된 로-키나제(Rho-Kinase)를 억제하여 켈로이드 섬유아세포에서의 콜라겐 과다 생성을 차단시킨다. 이로써 염증억제를 위한 스테로이드 또는 세포분열억제를 위한 항암제 등의 기존 켈로이드 치료제와 비교하여 보다 적극적으로 세포 내외의 다양한 물리적 스트레스에 대한 신호전달 체계를 반영하였다. 따라서, 본 발명에서 상기 로-키나제 억제제는 기계적 자극에 의하여 과발현되는 로-키나제를 표적하여 억제하는 물질을 의미한다.
본 발명에서 로-키나제 억제제는 세포 내에서 로-키나제의 발현 또는 활성을 감소시키는 제제를 의미하는 것으로, 예를 들어, 로-키나제에 직접적으로 작용하거나 또는 로-키나제의 상위 조절자에 간접적으로 작용하여 로-키나제의 발현을 전사 수준에서 감소시키거나, 발현된 로-키나제의 분해를 증가시키거나, 그 활성을 방해함으로써 로-키나제의 발현 수준 또는 그 활성을 감소시키는 제제를 의미할 수 있다.
본 발명에서 상기 로-키나제 활성 저해제는 로-키나제 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편, 펩티드, 단백질 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명에서 상기 로-키나제 억제제는 로-키나제 저해 활성을 가진 물질이라면, 특별히 제한되지 않으나, 본 발명에서 상기　로-키나제 억제제는 Y-27632 (C14H21N3O), Y-27632 2HCl, Thiaxovivn (C15H13N5OS), Fasudil (HA-1077) (C14H17N3O2S), Fasudil (HA-1077) HCL, GSK429286A (C21H16F4N4O2), RKI-1447 (C16H14N4O2S), H-1152 dihydrochloride (C16H23Cl2N3O2S), Azaindole 1 (TC-S 7001) (C16H23Cl2N3O2S), Hydroxyfasudil (HA-1100) (C14H17N3O3S), Hydroxyfasudil (HA-1100) HCL, Y-39983 (C16H16N4O), Y-39983 HCl, Netarsudil (AR-13324) (C28H27N3O3), Netarsudil (AR-13324) 2HCl, GSK269962A (C29H30N8O5), GSK269962A HCl, Ripasudil (K-115) hydrochloride dihydrate (C15H18FN3O2S.HCl.2H2O), Belumosudil (KD025) (C26H24N6O2), 또는 AT 13148 (C17H16ClN3O)일 수 있다. 바람직하게, 상기 로-키나제 억제제는 Y-27632 또는 Y-27632 2HCl일 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 상기 Y-27632을 이용하여 로-키나제 저해를 통한 피부 섬유화 질환의 치료 효과를 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 로-키나제 억제제는 기계적 자극에 의하여 과발현되는 로-키나제를 표적하여 억제할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 로-키나제 억제제는 F-액틴 형성을 억제할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 로-키나제 억제제는 VEGF, SMA, vimentin, 콜라겐 I형(collagen type I), 콜라겐 III형(collagen type III)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 발현을 억제할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 로-키나제 억제제는 하기와 같은 특성으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 나타낸다. (a) 켈로이드 섬유아세포의 증식 억제; (b) 켈로이드 섬유아세포의 이동 억제; 및 (c) 켈로이드 조직의 크기 및 경도 감소.
본 발명에서 상기　로-키나제 억제제는 그의 약제학적으로 허용가능한 염의 형태일 수 있다. 상기 염은 약학 분야, 예를 들면 세포의 노화와 연관된 질환 분야에서 사용되는 통상의 산 부가염, 예를 들면 염산, 브롬산, 황산, 설팜산, 인산 또는 질산과 같은 무기산으로부터 유도된 염 및 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 스테아르산, 시트르산, 말레산, 말론산, 메탄술폰산, 타르타르산, 말산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 2-아세톡시벤조산, 푸마르산, 톨루엔술폰산, 옥살산 또는 트리플루오로아세트산과 같은 유기산으로부터 유도된 염을 포함한다. 또한, 상기 염은 통상의 금속 염 형태, 예를 들면 리튬, 소듐, 칼륨, 마그네슘, 또는 칼슘과 같은 금속으로부터 유도된 염을 포함한다. 상기 산 부가염 또는 금속염은 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다.
본 발명에서 상기　로-키나제 억제제는 또한 그의 입체이성질체의 형태일 수 있다. 상기 입체이성질체는 거울상 이성질체 (enantiomer) 및 부분입체이성질체 (diastereomer)와 같은 모든 입체이성질체를 포함한다. 상기 화합물은 입체이성질체의 순수 형태 (stereoisomerically pure form) 또는 하나 이상의 입체이성질체의 혼합물, 예를 들면 라세미 혼합물일 수 있다. 특정 입체이성질체의 분리는 당해 분야에 공지된 통상의 방법 중 하나에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에서 피부 섬유화 질환은 상피 세포 또는 섬유성 결합 조직(fibrous connective tissue)의 과도한 증식으로 인한 흉터 내지는 섬유성 조직의 발달의 초래를 의미한다. 한편, 상처가 발생되면 지혈(hemostasis), 염증(inflammation), 증식(proliferation) 및 리모델링(remodeling)의 프로세스를 거쳐 치유되나, 피부 상처가 심하거나 반복될 경우 상처 치료 프로세스에 조절장애가 발생되고, 이는 손상된 피부 조직 주위로 과도한 섬유성 결합 조직(fibrous connective tissue)을 형성하여 피부 섬유화 질환을 유발할 수 있다.
본 발명에서 상기 피부 섬유화 질환은 임의의 피부 조직 및 상피 세포의 섬유증, 흉터(scar), 피부 및 두피의 상피 세포의 섬유증 등을 포괄하는 개념일 수 있다.
본 발명에서 상기 흉터는 상해 또는 질환에 의해 파괴된 정상 조직을 대체하는 섬유 조직을 의미할 수 있다. 피부 외층의 손상은 조직을 재구축함으로써 치유되며, 이러한 경우, 흉터 형성은 미미할 수 있다. 그러나, 피부 아래의 조직의 두꺼운 층이 손상되는 경우, 재구축은 더욱 복잡해진다. 신체는 콜라겐 섬유 (신체에 의해 자연적으로 생성되는 단백질)를 축적하고, 이는 일반적으로 뚜렷한 흉터를 발생시킨다.
본 발명에서 상기 피부 섬유화 질환은 켈로이드(keloid), 스트레칭 마크(stretch marks)켈로이드(keloid), 비후성반흔, 과증식성 흉터(hypertrophic scar), 위축성 흉터(atrophic scar), 피부경화증(Scleroderma), 결합조직 질환(connective tissue disease) 또는 결합조직 질환(connective tissue disease)일 수 있다.
본 발명에서 예방은 일 양상에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여하여 피부 섬유화 질환을 억제시키거나 지연시키는 모든 행위를 포함한다. 본 발명에서 치료는 일 양상에 따른 약학적 조성물을 개체에 투여하여 피부 섬유화 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 상기 약학적 조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예를 들어, 경구, 피부, 정맥, 근육, 피하 등의 경로로 투여될 수 있다.
본 발명에서 상기 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 바람직하게 상기 조성물은 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제, 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제, 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 경피흡수제, 겔제, 로션제, 연고제, 크림제, 첩부제, 카타플라스마제, 페이스트제, 스프레이, 피부 유화액, 피부 현탁액, 경피 전달성 패치, 약물 함유 붕대 및 좌제로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 제형을 가질 수 있으며, 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propyleneglycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 61(tween 61), 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 약학적 조성물의 투여 용량은 개체의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다. 예컨대, 유효성분 함량을 기준으로 1일 투여량이 0.1 내지 500 ㎎/kg, 일 수 있다. 상기한 투여량은 평균적인 경우를 예시한 것으로서, 병변의 크기, 개수, 개인적인 순응도 차이 등에 따라 그 투여량이 높거나 낮을 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 피부 섬유화 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에서 상기 약학적 조성물, 피부 섬유화 질환, 예방, 치료 등에 대해서는 상기한 바와 같다.
본 발명에서 상기　방법은 상기 약학적 조성물을　약학적 유효량으로 피부 섬유화 질환이 의심되는 개체 내에 투여하는 단계를 포함한다. 상기 개체는 개, 소, 말, 토끼, 마우스, 래트, 닭 또는 인간을 포함한 포유류 전체를 의미하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기　약학적 조성물은 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있다. 비 경구 투여에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함될 수 있다. 예를 들어, 상기 약학적 조성물의 투여방식은 정맥 주사, 피하주사, 피내주사제, 근육주사 및 점적 주사 등이 될 수 있다. 상기　약학적 조성물의 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명에서 상기 로-키나제 억제제는 피부 섬유화 질환이 진행된 세포의 증식 및 이동성을 유의적으로 감소시키는 효과를 나타내므로, 상기 로-키나제 억제제를 유효성분을 포함하는　약학적 조성물을 피부 섬유화 질환 의심 개체에 투여하여, 피부 섬유화 질환의 발생 또는 진행을 막아 피부 섬유화 질환을　치료할 수 있다.
또한, 본 발명은 로-키나제 억제제를 포함하는 피부 섬유화 질환의 예방 또는 개선용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 로-키나제 억제제, 예방, 피부 섬유화 질환 등에 대해서는 상기한 바와 같다.
본 발명에서 개선은 상기 피부 외용제 조성물을 개체에 적용하여 피부 섬유화 질환의 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 포함한다.
본 발명에서 피부　외용제는 일반적으로 외용에 사용하는 조성물 전반을 포괄하는 개념으로, 기초 화장료, 메이크업 화장료, 모발용 화장료, 면도용 화장료 등 각종 화장료를 포함하는 화장료 조성물이나 연고제 등의 다양한 의약품 내지 의약외품 등으로 폭넓게 적용 가능한 것을 의미할 수 있다.
본 발명에서 상기 피부　외용제 조성물은 유효성분 외에 사용용도 및　외용제　조성물의 성질에 따라 통상　외용제에 배합되고 있는 성분, 구체적으로 보습제, 자외선 흡수제, 비타민류, 동식 물 추출성분, 소화제, 미백제, 혈관확장제, 수렴제, 청량제, 호르몬제 등을 추가로 배합한 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 피부　외용제 조성물의 제형은 사용용도 및　외용제　조성물의 성질에 따라 적절한 형태를 취할 수 있으며, 구체적으로 수용액계, 가용화계, 유화계, 유액계, 겔계, 페이스트계, 연고계, 에어졸계, 물-기름 2층계, 물-기름-분말 3층계일 수 있으며, 상기 제형에 의해 본 발명의　외용제의 제형 및 형태가 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기　피부　외용제는 유효성분을　피부 조직으로 침투 또는 이행시키기 위해서 필요한 기제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 로-키나제 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물은 기계적 자극에 의하여 과발현되는 로-키나제를 표적하여 켈로이드 섬유아세포의 증식 및 이동, 피부 섬유화 마커의 발현, 켈로이드 조직의 크기 및 경도를 유의적으로 감소시킴으로써, 피부 섬유화 질환의 치료 또는 예방에 효과적으로 사용될 수 있다.
도 1은 켈로이드 조직과 섬유아세포에서 ROCK1의 발현을 나타낸 것이다. A는 인간 정상 피부 및 켈로이드에서 ROCK1 발현의 IHC 분석(축적 막대 = 200 μm)결과이다. B는 정상 섬유아세포(n=3) 및 켈로이드 섬유아세포(n=8)에서 ROCK1의 상대적인 mRNA 발현은 qRT-PCR에 의해 검출되었다. 모든 실험은 세 번 수행되었다. 결과는 SD와 함께 평균으로 표시되었다. 스튜던트 t 테스트는 모든 분석에 사용된다. *P < 0.05.
도 2는 기계적 스트레스가 켈로이드 섬유아세포에서 ROCK1 발현 및 F-액틴 재배열을 유도하는 것을 나타낸 것이다. A는 신장 자극에 반응하여 정상 섬유아세포(NF) 및 켈로이드 유래 섬유아세포(KF) 유도된 세포 재배향에 상이한 신장 강도(0-20%)를 적용하였다. B는 신축 강도 의존적 방식의 세포 증식을 CCK-8 검정으로 조사하였다. 세포를 다양한 스트레치 강도 0-20%(C) 및 인큐베이션 시간 0-24시간(D)에 적용한 후 웨스턴 블로팅을 검사하였다. ROCK1의 상대 수준은 GADPH를 대조군으로 사용하여 계산되었다. E는 기계적 자극은 F-액틴 중합을 변화시켰다. 공초점 이미지는 F-액틴(녹색)에 대한 항체의 면역염색을 보여주었다. 축척 막대 = 20μm. 형광 강도의 정량화를 나타내었다. 실험은 세 번 수행되었다. 결과는 SD와 함께 평균으로 표시된다. 스튜던트 t 테스트는 모든 분석에 사용된다. *P < 0.05.
도 3은 켈로이드 섬유아세포에서 F-액틴 세포골격 재배열에 대한 Y-27632의 효과를 나타낸 것이다. A는 24시간 동안 켈로이드 섬유아세포에서 Y-27632의 용량 증가에 따른 세포 생존력이다. B는 F-액틴의 발현은 Y-27632의 투여량을 증가시키면서 24시간 동안 처리된 켈로이드 섬유아세포에서 면역형광에 의해 결정된 것이다. 면역형광법 공초점 현미경(Immunofluorescence confocal microscopy) 실험은 F-액틴(녹색)과 vinculin(주황색)에 대한 항체로 수행되었다. 축척 막대 = 50μm. 형광 강도의 정량화를 나타내었다. 실험은 세 번 수행되었다. 스튜던트 t 테스트는 모든 분석에 사용된다. *P < 0.05.
도 4는 억제된 ROCK1이 Rho/ROCK1 변환 경로를 통해 켈로이드 섬유아세포에서 F-액틴 재배열을 유도한 것을 나타낸 것이다. A는 Y-27632 유무에 관계없이 기계적 스트레칭을 받거나 받지 않은 켈로이드 섬유 아세포에서 ROCK1의 키나제 활성이다. B는 Y-27632 유무에 관계없이 기계적 스트레칭을 받거나 받지 않은 켈로이드 섬유아세포에서 F-액틴의 면역세포화학 분석이다. C는 Y-27632를 사용하거나 사용하지 않고 기계적 스트레칭을 받거나 받지 않은 켈로이드 섬유아세포에서 p-MLC 및 MLC, 또는 p-cofilin 및 cofilin의 웨스턴 블로팅 분석이다. D는 웨스턴 블로팅 결과로부터 상대 단백질 pMLC/MLC 및 pCofilin/Cofilin의 정량화(C)이다. E는 기계적 신장이 있거나 없는 siNC 및 siROCK1의 처리 하에 켈로이드 섬유아세포에서 p-MLC 및 MLC, 또는 p-cofilin 및 cofilin의 웨스턴 블로팅 분석이다. F는 웨스턴 블로팅 결과로부터 상대 단백질 pMLC/MLC 및 pCofilin/Cofilin의 정량화(E)이다. 축척 막대 = 50μm. 결과는 SD(n=5)의 평균으로 표현되었다. 실험은 세 번 수행되었다. 스튜던트 t 테스트는 모든 분석에 사용된다. *P < 0.05.
도 5는 억제 ROCK1은 켈로이드 섬유아세포에서 피부 섬유화 및 세포 이동을 약화시키는 것을 나타낸 것이다. A는 pro-fibrotic gene, COL1A1, COL3A1, FN, a-SMA, CTGF 및 PCNA의 mRNA 수준을 qRT-PCR로 분석 결과이다. Y-27632(B) 또는 siROCK1(E)에 의해 억제된 기계 활성화 켈로이드 섬유아세포의 이동 활동이다. Y-27632(C) 및 siROCK1(F)을 사용한 켈로이드 섬유아세포의 억제된 이동 활동의 정량화이다. 축척 막대 = 200μm. 결과는 SD(n=5)의 평균으로 표현되었다. 스튜던트 t 테스트는 모든 분석에 사용된다. *P < 0.05.
도 6은 순환 스트레치 활성화 ROCK1 트리거 YAP 및 MRTF 핵 전위를 나타낸 것이다. A는 YAP 및 MRTF의 핵 전좌는 Y-27632 유무에 관계없이 기계적 신장을 받았거나 받지 않은 켈로이드 섬유아세포의 세포하 분획에서 웨스턴 블로팅 분석이다. B는 MRTF 및 YAP의 세포질 및 핵 발현 수준의 정량 분석이다. 결과는 SD(n=5)의 평균으로 표현되었다. 스튜던트 t 테스트는 모든 분석에 사용된다. *P < 0.05.
도 7은 Y-27632 처리 7일 후 SCID 마우스에서 인간 켈로이드 섬유아세포에 의해 형성된 결절의 조직학적 및 면역조직화학적 이미지이다. A는 DMSO 또는 Y-27632를 처리한 마우스로부터 결절을 분리이다. B는 결절 조직에서 대표적인 H&E 염색, MT 염색 및 VEGF, α-SMA, vimentin, MMP2, MMP9, COL I, COL III에 대한 면역조직화학이다. 원배율: 200 배, 축적 막대 = 100μm.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 실험 재료 및 방법
1.1 윤리 승인
헬싱키 선언(Helsinki Declaration and Integrated Addendum to ICH: Guideline for Good Clinical Practice(ICH-GCP))의 규정에 따라 보라매병원 임상심사위원회로부터 윤리적 승인을 받았다(승인번호 26-2017-20). 윤리위원회의 지침에 따라 사전 동의하에 수술을 받는 환자로부터 인간의 정상 및 켈로이드 조직을 수집하였다.
1.2 인간 정상 및 켈로이드 및 섬유아세포의 1차 배양
1차 정상 및 켈로이드 섬유아세포 배양은 기존 방법으로 확립되었다(Choi, M.-H., et al., Scientific reports, 2021. 11(1): p. 1-10.). 간략하게, 서울대학교 보라매병원에서 수술적 절제를 시행한 5명의 환자로부터 인체 피부 및 켈로이드 조직을 채취하였다. 시료는 1% 항생제-항진균제 용액(A/A; Welgene, Gyeongsangbuk-do, Korea)을 함유한 Dulbecco의 인산완충식염수로 3번 헹구고 3mm 두께로 절단하였다. 이어서, 조직을 37℃에서 4시간 동안 5 mg/ml 디스파제 용액(Roche, Basel, Switzerland)에 두었다. 진피와 표피를 분리하고 1mm 두께로 잘게 썬 다음 3mg/ml 콜라게나제 I형(Thermo Fisher, MA, USA)에서 소화하여 단일 세포 현탁액을 얻었다. 세포는 10% 우태아혈청(FBS; Biowest, France)과 1% Antibiotic/Antimycotic Solution(Welgene Inc., Korea)이 함유된 둘베코수정이글배지(DMEM; Biowest, Nuaillι, France)에서 가습 배양기에서 배양하였다. 37 ℃에서 5% CO2. 계대 4에서 8까지의 세포를 실험에 사용하였다.
1.3 기계적 스트레칭 장치
기계적 스트레칭 장치 (STB-1400; Strex Inc., Osaka, Japan)를 사용하여 기계적 스트레칭을 켈로이드 섬유아세포에 적용하였다. 간략하게, 켈로이드 섬유아세포를 20 μg/ml 쥐 꼬리 I형 콜라겐(C7661, Sigma Aldrich)으로 미리 코팅된 strex stretch chamber(STB-CH-10 Strex Inc., Osaka, Japan)에 1.2 X 105 세포의 밀도로 시딩하였다. 밤새 인큐베이션을 위한 부착을 허용한 후, strex 스트레치 챔버를 스트레치 장치로 이동하고 후크에 장착하였다. 유연한 실리콘 챔버는 24시간 동안 10주기/분(0.166Hz)의 주파수에서 길이가 0-20% 장력의 스트레칭에 노출되었다. 이 스트레칭 장력은 정상적인 건강한 성인 상태의 호흡 속도를 모방한다. 대조군의 세포는 인큐베이터에서 동일한 유형의 챔버에서 배양되었다.
1.4 세포 증식 검정 CCK8
정상 및 켈로이드 섬유아세포의 증식에 대한 스트레치 자극의 영향을 CCK-8 분석으로 평가하였다. 간략하게, 제조업체의 지침(Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan)에 따라 CCK-8 시약을 첨가하여 24시간 동안 일련의 신장 변형(0-20%)을 섬유아세포에 적용하였다. 증식 속도를 평가하기 위한 광학 밀도는 SpectraMax Plus 384 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)에서 450 nm에서 판독되었다. 실험은 3회 수행되었으며 데이터는 평균 ±SD로 표시된다.
1.5 로-키나제(Rho-kinase) 활성 검정
ROCK1 키나제 활성은 제조사의 지침에 따라 ROCK 활성 분석 키트(Cell Biolabs, CA, USA)로 분석되었다. ROCK Activity Assay 키트는 ROCK에 의해 Thr696에서 myosin phosphatase target subunit1의 인산화 수준을 검출하기 위해 설계된 효소 면역분석법이다. 간략하게, 켈로이드 섬유아세포(1.2 x 105개 세포/콜라겐 코팅 실리콘 챔버)를 접종하여 밤새 80% 합류도에 도달하고 ROCK1 억제제 Y-27632(10 μM)로 추가 24시간 동안 정적 배양 및 신장 배양 조건에서 처리하였다. 세포를 수확하고 트립신화한 후 PBS를 2회 세척하였다. 세포를 용해 완충액(Cell Signaling Technology, MA, USA)에서 30분 동안 용해시킨 다음 샘플을 4℃에서 15분 동안 15,000rpm에서 원심분리하여 단백질 용해물을 수집하였다. Pierce BCA Quantification Protein Kit(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)를 사용하여 단백질 농도를 결정하였다. 35μg 용해물 단백질을 키나제 분석을 위해 로딩/웰하였다. 키나제 반응은 30℃ 진탕 배양기에서 1시간 동안 약간 진동하면서 반응 용액(10mM DTT, 2mM ATP)을 첨가하여 활성화되었다. 키트 제공 세척액으로 3회 세척 단계를 거친 후 반응성 용액을 경사분리하였다. anti- phospho-MYPT1(Thr696)을 각 웰에 첨가하고 밤새 4℃에서 배양하였다. 세척 후, HRP로 표지된 두 번째 항체를 실온에서 1시간 동안 적당히 진탕하면서 각 웰에 첨가하였다. 반응 혼합물을 세척하고 ELISA 플레이트를 100μl 기질 용액과 함께 실온에서 추가로 15분 동안 인큐베이션하였다. HRP 기반 반응은 정지 용액으로 종료되었다. 흡광도는 SpectraMax Plus 384 마이크로플레이트 판독기(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)로 450nm에서 읽었다.
1.6 웨스턴 블로팅 분석
전세포 추출물을 얻기 위해 포스파타제 억제제와 프로테아제 억제제가 포함된 Pierce Cell Lysis Buffer(Thermo Fisher, MA, USA)로 세포를 용해하였다. 단백질 추출물(30μg)을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)로 분석하고 polyvinylidene difluoride 막으로 옮겼다. 이 막을 ROCK1(sc-17794, Santa Cruz, CA, USA), phosho COFILIN(#3313, Cell Signaling, MA, USA), COFILIN(#66057-1-Ig, Proteintech, IL, USA), phosho MLC(#3671, Cell Signaling, MA, USA), MLC(#ALX-BC-1150-S, Enzo Life Sciences, Inc., NY, USA) 및 GAPDH(sc-47724, Santa Cruz, CA, USA) 1차 항체, 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase)에 결합된 2차 항체(Enzo Life Sciences, Inc., NY, USA)와 함께 배양한다. GAPDH는 웨스턴 블로팅 분석을 위한 로딩 컨트롤로 사용되었다.
1.7 실시간 정량적 역전사 중합효소연쇄반응(Real-Time qRT-PCR)
총 RNA는 TRIzol 시약(Thermo Fisher Scientific, MA, USA)을 사용하여 추출하였다. RNA(1000ng)는 oligo(dT) 무작위 프라이머(Integrated DNA Technologies, IA, US) 및 AccuPower RT PreMix(Bioneer, South Korea)를 사용하여 다음 절차에 따라 cDNA 합성을 거쳤다: 42 ℃에서 60분 및 95 ℃ 5분 동안 qRT-PCR은 StepOnePlus 실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, CA, USA)에서 PowerUp SYBR 그린 마스터 믹스로 수행되었다. 실시간 PCR에 사용되는 프라이머 서열은 표 1에 나열되어 있다. 각 유전자의 mRNA 수준은 GAPDH의 mRNA 수준으로 정규화되었다. PCR 단계는 94 ℃에서 5 분 동안 초기 변성 단계로 구성되었다; 94 ℃에서 1 분 동안 (변성), 1 분 동안 55 ℃(어닐링) 및 2 분 동안 72 ℃(연장); 및 72 ℃에서 7 분 동안 최종 연장 단계. ROCK1의 mRNA 발현, 피부 섬유성 마커인 Collagen Type I Alpha 1 Chain (COL1A1), Collagen Type III Alpha 1 Chain (COL3A1), Alpha-smooth muscle actin (SMA), Fibronectin (FN), connective tissue growth factor (CTGF) 및 증식세포 핵항원(proliferating cell nuclear antigen; PCNA)을 평가하였다. 상대 발현은 2-△△Ct 방법을 사용하여 계산하였다.
명칭 Forward (5'-3') Reverse (5'-3')
COL1A1 CACCAATCACCTGCGGTACAGAA
(서열번호 1)		 CAGATCACGTCATCGCACAAC
(서열번호 2)
COL1A3 CCCACTATTATTTTGGCACAACAG
(서열번호 3)		 AACGGATCCTGAGTCACAGACA
(서열번호 4)
Fibronectin (FN1) CGGTGGCTGTCAGTCAAAG
(서열번호 5)		 AAACCTCGGCTTCCTCCATAA
(서열번호 6)
SMA GCCAAGCACTGTCAGGAATC
(서열번호 7)		 TTGTCACACACCAAGGCAGT
(서열번호 8)
CTGF (CCN2) AGACCTGTGCCTGCCATT
(서열번호 9)		 TGTCTCCGTACATCTTCCTG
(서열번호 10)
PCNA AGTAAAGATGCCTTCTGGTGAA
(서열번호 11)		 TCCATTTCCAAGTTCTCCACT
(서열번호 12)
ROCK1 CCAAAGCTCGTTTAACTGACAA
(서열번호 13)		 GAGCTTCTCTTTCTTCTTTCAGC
(서열번호 14)
GAPDH CACCCACTCCTCCACCTTTG
(서열번호 15)		 CCACCACCCTGTTGCTGTAG
(서열번호 16)
1.8 면역형광
세포를 차가운 PBS로 두 번 세척하고 4%(w/v) 파라포름알데히드로 4℃에서 밤새 고정하였다. Permeabilization 단계는 0.1% Triton X-100/PBS로 30분 동안 수행한 후 PBS로 세척하였다. 세포를 실온에서 30분 동안 완충액(1% BSA/PBS)에 노출시키고 1% BSA/0.1% Triton X-100/PBS에 1시간 동안 Alexa Fluor 488-컨쥬게이션된 팔로이딘(#A12379, Invitrogen, USA)에 노출시켰다. 실온에서. 3회 세척 단계 후, 세포를 DAPI 장착 배지로 장착하고 커버 슬립으로 밀봉하고 공초점 레이저 스캐닝 현미경(LSM 900; Carl Zeiss, NY, USA)을 사용하여 검사하였다.
1.9 마이그레이션 분석
Transwell 8.0 μM 기공 크기 폴리카보네이트 멤브레인(# 3422, Corning Inc., ME, USA)을 사용한 이동 분석용. 켈로이드 섬유아세포를 가습 인큐베이터(37℃에서 5% CO2)에서 밤새 부착하기 위해 strex 스트레치 챔버에 사전 코팅된 콜라겐 I형에 1.2 x 105 세포의 밀도로 시딩한 후 추가로 24시간 동안 스트레칭 처리에 노출시켰다. 10 μm Y-27632의 부재. 대조군으로서 정적 세포는 스트레치 자극 없이 동일한 조건 하에서 strex 스트레치 챔버에서 배양되었다. 그 후, 켈로이드 세포를 수확하고 계수하고, 2 x 104 세포를 1% FBS가 포함된 150 μL 배지에 재현탁하고 삽입물의 상부 구획으로 재도입하였다. 하부 구획은 화학 유인 물질로서 2% FBS가 포함된 500 μL의 배지로 채워졌다. 세포는 24시간 동안 37℃에서 이동하도록 허용되었다. 세포를 4% PFA에 고정하고, PBS 중 0.1% Triton X-100으로 10분 동안 투과시키고, 실온에서 10분 동안 헤마톡실린으로 염색하였다. PBS로 세척한 후, 상부 삽입물에서 이동하지 않은 세포를 면봉으로 제거하였다. 폴리카보네이트 멤브레인을 삽입물에서 제거하고 슬라이드에 장착하였다. 이동한 세포의 필드를 도립 현미경(Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Germany)으로 캡처하였다. 마이그레이션 영역은 각 이미지에서 추출한 자주색 영역으로 평가하고 마이그레이션된 영역의 백분율로 Image J 소프트웨어로 분석하였다.
1.10 스트레칭 중인 YAP 및 MRTF의 핵 전좌(Nuclear translocation)
핵/세포질 추출물은 제조사의 지시에 따라 NE-Per Nuclear 및 Cytoplamic Extractons Reagents(#78833, Thermo Scientific, MA, USA)를 사용하여 별도로 분리하였다. Subcellular fractionation lysis는 YAP(#5157, Cell Signaling, MA, USA), 세포질 및 핵 분획에 대한 내부 마커로서 GADPH(sc-47724, Santa Cruz, CA, USA) 및 Lamin B(#12586, Cell Signaling, MA, USA)를 포함하는 MRTF(sc-47724, Santa Cruz, CA, USA), 각각을 western blotting analysis로 분석하였다. Image J 소프트웨어로 정량화를 수행하였다.
1.11 동물 실험 절차
서울대학교 보라매병원 동물실험실적위원회로부터 동물실험 승인(승인번호: 2019-0031)을 받았다. 수컷 NOD.CB17-Prkdc scid/J(SCID) 마우스(생후 5주, 체중: 22.58 ± 0.91g)를 Charles River Japan(Yokohama, Japan)에서 구입하였다. 모든 동물 실험 절차는 서울특별시보라매병원 동물실험연구위원회 가이드라인에 따라 수행되었다.
1.12 켈로이드 동물 모델
모든 실험은 무균 상태에서 수행되었다. isoflurane을 이용한 마취 하에 SCID 마우스 7마리의 등쪽 털을 제거하고 중간선을 표시한 후 1ml 주사기(Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)에 26게이지 바늘을 사용하였다. 이 세포들은 서울대학교 보라매병원에서 켈로이드 절제 수술을 받은 7명의 환자에게서 얻은 것이다. 세포는 마우스 등의 가장 눈에 띄는 부위의 왼쪽과 오른쪽에서 약 1cm 떨어져서 주입되었다. 마우스의 등에 결절이 형성된 후 왼쪽 결절에는 2% dimethyl sulfoxide(DMSO; control)를, 오른쪽 결절에는 Y-27632(20 mg/kg)를 주입하였다. 결절은 캘리퍼스로 2~3일마다 측정하고 결절 부피는 다음 방정식을 사용하여 계산하였다. 결절 부피 = 1/2 Х A Х B2, 여기서 A = 길이(밀리미터), B = 폭(밀리미터). 켈로이드 섬유아세포 주사 후 14일째에 결절을 채취하기 위해 집게와 칼날을 이용하여 주위 피부를 조심스럽게 분리하고 결절만을 채취하여 무게를 쟀다.
1.13 생체내 조직학적 분석
초기 세포 주입 14일 후 결절을 수확한 다음 4℃에서 24시간 동안 4% 파라포름알데히드에 고정하고 최소 4시간 동안 물로 세척한 다음 마지막으로 파라핀에 포매하였다. 제조사의 지침에 따라 파라핀 절편(두께 4μm)을 헤마톡실린 및 에오신(H&E, ab245880, Abcam, Cambridge, UK) 및 MT(TRM-2, ScyTek, Logan, Utah, USA) 염색으로 염색하였다. H&E 염색 절편의 세포질(400 Х 확대)과 MT 염색 절편의 콜라겐 밀도(400 Х 확대)를 Olympus BX53 현미경(Olympus Corporation, Shinjuku, Japan)을 사용하여 각 절에 대해 확인하였다. 3개의 미세한 필드(오른쪽, 중앙 및 왼쪽)의 스크린샷을 획득하였다. 단위 면적(0.1mm2)당 염증 세포의 수는 Olympus cellSens 표준 이미징 소프트웨어를 사용하여 계산되었다. 콜라겐의 광학밀도는 아비딘-비오틴 복합법에 의한 ImageJ Immunohistochemical staining을 이용하여 측정하였다. 간단히 말해서, 파라포름알데히드(4%) 고정 시편을 파라핀 포매하고 4μm 두께로 절단하였다. 절편을 56℃에서 1시간 동안 건조시킨 다음 자일렌으로 탈파라핀 및 재수화 단계를 수행하였다. 그런 다음 절편을 37 ° C에서 30 분 동안 트립신 효소 항원 검색 용액 (ab970, Abcam, Cambridge, UK)과 함께 배양하였다. 일차 항체와 함께 4℃에서 하룻밤 배양을 수행하였다. 0.025% Triton-100을 포함하는 Tris-완충 식염수로 3회 세척한 후, 두 번째 항체를 실온에서 30분 동안 섹션별로 적용하였다. Olympus BX53 현미경으로 3개 필드(오른쪽, 중앙 및 왼쪽)에서 이미지를 촬영하고 Image J 소프트웨어로 분석하였다.
1.14 통계 분석
체외 실험 결과는 최소 3회 독립적인 실험의 평균값 ± 표준 편차로 보고된다. 생체 내 실험의 경우 모든 값은 평균의 평균 ± 표준 오차로 보고된다. 두 그룹 간의 비교는 스튜던트 t 테스트를 사용하여 수행되었다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
실시예 2. 실험 결과
2.1 켈로이드 조직 수집
켈로이드 흉터가 있는 20세 내지 80세 사이의 총 5명의 환자로부터 복부, 귀, 등에서 켈로이드를 조직을 확보하고, 분석을 위해 섬유모세포 세포를 분리한 후 켈로이드를 수집하였다.
2.2 켈로이드 조직 및 섬유아세포에서 ROCK1의 과발현
켈로이드 형성에 ROCK1이 관여하는지 확인하기 위해 인간 켈로이드 및 정상 피부 조직에서의 ROCK1 발현을 먼저 분석하였다. 면역 조직 화학 염색은 정상 피부 조직과 비교하여 인간 켈로이드 조직에서 ROCK1의 발현 증가를 보여주었다 (도 1A). 도 1A와 같이, 활성화된 ROCK1은 섬유아세포 세포가 주로 위치하는 켈로이드 피부 조직의 진피층에서 쉽게 검출되었다. 정상 및 켈로이드 조직에서 파생된 기본 섬유아세포에서 ROCK1의 발현을 조사하였다. 켈로이드 유래 및 인간 정상 섬유아세포에서 ROCK1의 변경된 mRNA 발현 수준은 정량적 역전사 PCR(RT-qPCR)에 의해 정량화되었다. 면역 조직 화학 분석과 일치하여 켈로이드 유래 섬유아세포의 ROCK1 수준은 정상 섬유아세포에 비해 눈에 띄게 상향 조절되었다 (도 1B). 종합하면, 이러한 결과는 켈로이드에서 ROCK1의 과발현을 확인했으며, ROCK1이 켈로이드 치료 요법에서 유망한 치료 표적임을 시사한다.
2.3 기계적 스트레스에 의한 켈로이드 섬유아세포에서 ROCK 발현 및 F-액틴 재배열 유도
켈로이드 섬유아세포 진행에 대한 기계적인 스트레스의 영향을 확인하기 위해, 본 발명에서는 순환 스트레칭 후 세포 형태 및 증식의 변화를 관찰하기 위해 섬유아세포에 스트레치 변형을 조절할 수 있는 순환 스트레칭 기계를 사용하였다. 24시간 동안 섬유아세포 세포에 스트레치 구배(5-20%)를 적용하고 세포에 대한 기계적 스트레치 효과를 평가하였다. 도 2A에서 관찰한 바와 같이, 켈로이드 섬유아세포는 신장 방향에 대해 평행하고 수직으로 정렬 및 재조직화되는 반면, 정상 섬유아세포는 순환 신장 구배에 관계없이 무방향성 배열을 나타냈다. 또한 신장 상태의 켈로이드 섬유아세포는 정상 섬유아세포에 비해 밀도가 두껍게 자라는 경향이 있다. 또한, 적용 스트레치의 5% 진폭에서의 증식률은 더 낮거나 더 높은 주기적 스트레치 진폭에 의해 유도된 증식률과 비교하여 두 가지 유형의 섬유아세포에서 가장 중요한 세포 증식을 나타냈다(도 2B). 흥미롭게도, 신장된 진폭(20%)은 정상 섬유아세포(~50%)와 켈로이드 섬유아세포(~90%)에서 증식 능력의 현저한 감소를 유도하였다. 이러한 결과는 켈로이드 섬유아세포의 과증식이 기계적 스트레스 크기와 밀접한 관련이 있지만 급성 기계적 힘이 생존율을 방해할 수 있음을 나타낸다.
그 후, 웨스턴 블로팅 분석을 통해 cyclic stretch를 받은 섬유아세포에서 ROCK1 발현을 측정하였다. 섬유모세포가 순환 신장의 일련의 구배(5-20%)에 노출되었을 때, 예상대로 증가된 신장 진폭에서 ROCK1 발현이 상향 조절되었다(도 2C). 그러나 강렬한 순환 스트레치(20%)는 ROCK1 발현을 손상시켰는데, 이는 섬유아세포 기능에 부정적인 영향을 미치고 추가 연구에 적합하지 않은 20% 순환 스트레치를 언급하는 상대적인 세포 생존 능력의 감소와 일치한다. ROCK1 발현을 시간 의존적 방식(0-24시간)으로 조사하기 위해 섬유아세포에 5% 및 10%의 스트레스 변형만을 사용하였다. 결과는 가장 상향 조절된 ROCK1이 켈로이드 및 정상 섬유아세포 모두에서 5% 스트레치에 노출된 지 24시간 후에 검출되었음을 시사한다(도 2D).
세포골격 네트워크의 주요 구성 요소는 F-액틴 섬유이다. 따라서 주기적인 스트레스에 대한 반응으로 섬유아세포에서 F-액틴의 변화를 조사하였다. Static 및 stretch culture에서 Phalloidin Alexa-488로 염색된 섬유아세포 세포를 관찰하고 24시간 배양 후 분석하였다. 도 2E는 신장되지 않은 자극(0%) 및 신장된 자극(5% 및 10%) 하에서 정상 및 켈로이드 섬유아세포의 F-액틴 섬유의 면역형광 이미지를 보여주었다. 스트레칭되지 않은 섬유아세포에서 염색된 섬유 형광은 모든 처리된 조건 사이에서 유의미하지 않은 변화를 나타냈으며, 이는 정상적인 섬유아세포에 대한 순환 스트레치 베어링 F-액틴 합성의 무감각성을 나타낸다. 상대적으로, 신장된 섬유아세포에서 상승된 형광 신호가 상당히 검출되었으며, 이는 신장 유도된 F-액틴 스트레스 섬유 중합의 증거를 나타낸다. 또한, 5% 스트레치에서 풍부한 F-액틴 섬유의 내부 공간은 10% 스트레치에 비해 더 넓은 경향이 있다. 이러한 결과는 앞서 언급한 ROCK1 발현의 웨스턴 블로팅과 함께 24시간 동안 5% 스트레치 조건에 대한 켈로이드 섬유모세포의 가장 기계적 민감성을 나타냄을 알 수 있다.
2.4 켈로이드 섬유아세포에서 F-액틴 세포골격 재배열에 대한 Y-27632의 효과
ROCK1에 대한 켈로이드에 대한 효과를 확인하기 위해 Y-27632를 사용하였다. 켈로이드 섬유아세포 증식에 대한 Y-27632의 억제 효과는 치료 용량에 관계없이 관찰되지 않았다(도 3A). 그러나 켈로이드 섬유아세포에서 F-액틴 섬유 형성은 Y-27632 치료의 용량 의존 방식에 의해 엄격하게 조절된다. 25 및 50 μM Y-27632에서 F-액틴 세포골격 구조의 극적인 붕괴가 관찰되었으며, 이는 액틴 해중합 측면에서 ROCK1 매개 켈로이드에 대한 Y-27632의 효과적인 억제 효과를 나타낸다. 10 μM에서 켈로이드 섬유아세포에 대한 Y-27632의 효과적인 치료 용량을 최적화하였다(도 3B).
2.5 신장-자극된 켈로이드 섬유아세포의 ROCK1 활성에 대한 Y-27632의 억제 효과
ROCK1을 억제하는 Y-27632의 효과적인 투여량을 확인한 후, 켈로이드 섬유아세포를 신장되지 않은 섬유아세포, 신장된 섬유아세포, Y-27632로 전처리된 신장되지 않은 섬유아세포 및 신장된 섬유아세포를 포함하는 4개의 그룹에 할당하였다. 여기서 ROCK1 활동에 대한 스트레치(신장) 자극 플랫폼에 대한 Y-27632의 영향을 분석하려고 하였다.
결과는 Y-27632 치료가 반대로 ROCK1 활성화를 억제하는 반면 켈로이드 섬유아세포에서 지속적으로 신장된 자극이 향상된 ROCK1 활성을 유도한다는 것을 보여주었다. Y-27632로 치료하고 신장 자극을 받은 켈로이드 섬유아세포는 Y-27632 단독으로 치료한 것(10.8%)과 비교하여 ROCK1(26%)의 활성 감소 비율이 가장 컸다. 이는 켈로이드의 병인과 관련된 ROCK1 활성 억제에 대한 기계적 및 화학적 효과의 시너지 효과를 나타낸다(도 4A).
2.6 Y-27632의 Rho/ROCK1 경로를 통해 켈로이드 섬유모세포에서 기계적 스트레스 유도 F-액틴 재배열 억제 효과
기계적인 힘에 반응하여 G-액틴이 중합되어 F-액틴을 형성하고 과도한 힘이 가해지면 F-액틴이 과중합되는 경향이 있으며 이는 도 4B에서 명확하게 나타난다. 대조적으로, 섬유아세포가 Y-27632에 노출되었을 때 세포 F-액틴 네트워크는 현저하게 파괴되었다. 결과는 ROCK1 활동에 의존하는 F- 액틴 네트워크의 섭동에 대한 우리의 가설을 확인한다.
코필린과 미오신 경쇄(MLC)의 ROCK1 유도 인산화의 역할을 설명하기 위해 차례로 액틴 중합과 세포 수축성을 촉진하기 위해 ROCK1 억제제 Y-27632의 도움을 받거나 받지 않고 확장 활성화 ROCK1 조건에 반응하여 코필린 및 MLC 인산화 정도를 순차적으로 조사하였다. 인산화된 코필린 및 미오신 경쇄의 실질적으로 증가된 함량은 세가지 다른 처리와 비교하여 신장 자극 하의 섬유아세포에서 검출되었다(도 4C). ROCK1 억제제 Y-27632에 의한 ROCK1 활성의 고갈은 인산화 단백질의 발현에서 가장 큰 감소를 보였다.
종합하면, 결과는 내부 세포골격 네트워크를 구축하기 위한 ROCK1 매개 Rho/ROCK1 경로의 중요한 역할을 나타낸다. Rho/ROCK1 경로의 조절 장애는 F-액틴 형성의 교란을 초래하여 비정상적인 흉터 및 피부 섬유증 질환의 틀에 기여할 수 있다.
2.7 ROCK1 억제에 의한 섬유성 유전자의 하향조절을 유도 효과
켈로이드 섬유아세포는 일반적으로 높은 수준의 섬유증 마커를 발현하므로, 섬유화 유전자 발현의 조절을 통해 켈로이드의 병인을 이해하면 켈로이드 흉터의 치유에 기여할 수 있다. 이를 통해 기계적 유발 켈로이드에 대한 Y-27632의 억제 효과를 조사하고자 하였다.
섬유성 매개체의 상향 조절을 통한 섬유형성-보유 켈로이드에 대한 ROCK1의 관여는 mRNA 수준에서 COL1A1, COL3A1, Fibronectin, α-SMA, CTGF 및 PCNA의 발현을 평가함으로써 확인되었다. 주기적 기계적 자극은 모든 섬유증 마커를 크게 향상시켰다. 예상대로 Y-27632 치료는 섬유화 유전자의 mRNA 수준 감소를 통해 섬유화 과정을 약화시키는 경향이 있다. 관찰된 결과는 Y-27632가 스트레칭 장치에 의해 시뮬레이션된 생물학적 기계적 환경에서 켈로이드 진행을 방지하는 치료 효과를 보여준다 (도 5A).
2.8 켈로이드 섬유모세포의 스트레치에 의한 이동 촉진 및 Y-27632에 의한 억제
켈로이드는 원래 병변의 위치를 넘어 켈로이드 섬유모세포의 과도한 증식 및 이동을 특징으로 한다. 이에 따라 켈로이드 과이동의 예방이 켈로이드 형성 및 재발을 치유하는 핵심 인자로 제안되었다. transwell 이동 분석을 사용하여 켈로이드 섬유아세포의 이동 활동을 추가로 분석하였다. 도 5B에서 관찰된 바와 같이, 켈로이드 섬유모세포의 이동은 기계적인 힘 하에서 현저하게 촉진되었고 Y-27632에 반응하여 부분적으로 억제되었다.
2.9 기계적 활성화된 ROCK의 YAP 및 NRTF 핵 전좌(nucleus translocation)를 통해 켈로이드 섬유아세포 활성화 유도
Rho/ROCK1 신호 전달 경로를 통한 스트레치 자극에 적응하기 위해 YAP(Yes-associated protein) 및 MRTF(Myocardin-related transcription factor)의 세포 내 분포를 조사하였다.
예상대로 정적 배양 섬유아세포와 비교하여 신장된 섬유아세포의 핵에서 현저하게 향상된 YAP 및 MRTF 함량이 검출된 반면, Y-27632의 처리는 세포질에서 YAP 및 MRTF의 높은 축적으로 확인된 이러한 기계 민감성 전사 인자 단백질의 핵 수입을 억제함으로써 이러한 영향을 역전시키는 것을 확인하였다(도 6).
2.10 결절 형성의 환자 유래 켈로이드 이종 이식 SCID 마우스 모델에서 Y-27632의 억제 효과
켈로이드 결절(nodule) 진행을 억제에 대하여 켈로이드 이종 이식 SCID 마우스에서 평가하였다. 켈로이드 결절 적출시 Y-27632로 처리된 켈로이드 결절의 평균 부피는 17.21±13.49 MM3 인 반면, 2% DMSO 그룹으로 처리된 대조군은 21.27±13.98 MM3이었다. 또한, 켈로이드 결절 무게는 대조군과 비교하여 Y-27632 처리 그룹에서 유의하게 감소되었다. Y-27632 처리된 그룹의 평균 중량 켈로이드 결절과 처리되지 않은 대조군의 경우 각각 4.56±3.50 Mg 및 7.61±3.16 Mg였다(도 7A).
켈로이드 부분은 대조군과 비교하여 Y-27632로 처리된 그룹에서 감소된 염증 세포를 나타냈다. MT 염색은 Y-27632 처리군과 비교하여 대조군에서 콜라겐 다발의 더 높은 증착을 보여 주었다. DMSO 처리 그룹과 비교하여 Y-27632 처리 그룹의 VEGF, SMA, vimentin, 콜라겐 I형(collagen type I), 콜라겐 III형(collagen type III)의 단백질 발현이 현저히 감소하였다(도 7B).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (11)

  1. 로-키나제 억제제를 유효성분으로 포함하는 피부 섬유화 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 로-키나제 억제제는 로-키나제 단백질 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 이의 항원 결합 단편, 펩티드, 단백질, 또는 이들의 조합인 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 로-키나제 억제제는 Y-27632, Y-27632 2HCl, Thiaxovivn, Fasudil (HA-1077), Fasudil (HA-1077) HCL, GSK429286A, RKI-1447, H-1152 dihydrochloride, Azaindole 1 (TC-S 7001), Hydroxyfasudil (HA-1100), Hydroxyfasudil (HA-1100) HCL, Y-39983, Y-39983 HCl, Netarsudil (AR-13324), Netarsudil (AR-13324) 2HCl, GSK269962A, GSK269962A HCl, Ripasudil (K-115) hydrochloride dihydrate, Belumosudil (KD025), 또는 AT 13148 인 것인 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서,
    로-키나제 억제제는 기계적 자극에 의하여 과발현되는 로-키나제를 표적하여 억제하는 것인 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    로-키나제 억제제는 F-액틴 형성을 억제하는 것인 약학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    로-키나제 억제제는 VEGF, SMA, vimentin, 콜라겐 I형(collagen type I), 콜라겐 III형(collagen type III)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 단백질의 발현을 억제하는 것인 약학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 피부 섬유화 질환은 켈로이드(keloid), 스트레칭 마크(stretch marks)켈로이드(keloid), 비후성반흔, 과증식성 흉터(hypertrophic scar), 위축성 흉터(atrophic scar), 피부경화증(Scleroderma), 결합조직 질환(connective tissue disease) 또는 결합조직 질환(connective tissue disease)인 것인 약학적 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 로-키나제 억제제는 하기와 같은 특성으로부터 선택되는 어느 하나 이상을 나타내는 것인 약학적 조성물:
    (a) 켈로이드 섬유아세포의 증식 억제;
    (b) 켈로이드 섬유아세포의 이동 억제; 및
    (c) 켈로이드 조직의 크기 및 경도 감소.
  9. 로-키나제 억제제를 포함하는 피부 섬유화 질환의 예방 또는 개선용 피부 외용제 조성물.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 로-키나제 억제제는 Y-27632 2HCl, Thiaxovivn, Fasudil (HA-1077) HCL, GSK429286A, RKI-1447, H-1152 dihydrochloride, Azaindole 1 (TC-S 7001), Hydroxyfasudil (HA-1100) HCL, Y-39983 HCl, Netarsudil (AR-13324) 2HCl, GSK269962A HCl, Ripasudil (K-115) hydrochloride dihydrate, Belumosudil (KD025), 또는 AT 13148 인 것인 피부 외용제 조성물.
  11. 제9항에 있어서,
    상기 피부 섬유화 질환은 켈로이드(keloid), 스트레칭 마크(stretch marks)켈로이드(keloid), 비후성반흔, 과증식성 흉터(hypertrophic scar), 위축성 흉터(atrophic scar), 피부경화증(Scleroderma), 결합조직 질환(connective tissue disease) 또는 결합조직 질환(connective tissue disease)인 것인 피부 외용제 조성물.
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