WO2023145833A1 - 変異型ｍａｄ７タンパク質 - Google Patents

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WO2023145833A1
WO2023145833A1 PCT/JP2023/002475 JP2023002475W WO2023145833A1 WO 2023145833 A1 WO2023145833 A1 WO 2023145833A1 JP 2023002475 W JP2023002475 W JP 2023002475W WO 2023145833 A1 WO2023145833 A1 WO 2023145833A1
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acid sequence
seq
mutant
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俊矢 穂積
耕一 西村
憶良 増田
悟 高寺
梨沙 貝沼
裕紀子 山下
俊 沢津橋
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株式会社セツロテック
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    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]

Definitions

  • the present invention relates to mutant MAD7 proteins and the like.
  • ZFNs Zinc-Finger Nucleases
  • TALENs Transcription Activator-Like Effector Nucleases
  • CRISPR/Cas system Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat-Associated System
  • the Cas9 protein is widely used, but the use of new Cas proteins such as the MAD7 protein is also spreading. Also, attempts to introduce various mutations have been made in order to improve the activity of the MAD7 protein (Patent Document 1).
  • An object of the present invention is to provide a mutant MAD7 protein with higher target site cleavage activity.
  • the present inventors have found that the amino acid sequence A shown in SEQ ID NO: 1 contains an amino acid sequence B obtained by mutation, and the amino acid sequence B is K169 in the amino acid sequence A. and a mutant MAD7 protein containing an amino acid substitution mutation of D529, it was found that the above problems could be solved.
  • the present inventor has completed the present invention as a result of further research based on this finding. That is, the present invention includes the following aspects.
  • MAD7 protein SEQ ID NO: 1
  • Item 1 A mutant MAD7 protein comprising an amino acid sequence B obtained by mutating the amino acid sequence A shown in SEQ ID NO: 1, and wherein said amino acid sequence B comprises amino acid substitution mutations of K169 and D529 in said amino acid sequence A.
  • Item 2 The mutant MAD7 protein according to Item 1, wherein the amino acid sequence B comprises the following amino acid sequence (a1), (a2), or (a3): (a1) an amino acid sequence containing amino acid substitution mutations of K169 and D529 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; (a2) an amino acid sequence having deletion, insertion, substitution and/or addition of one or several amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and containing the amino acid substitution mutation of (a1); (a3) An amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and containing the amino acid substitution mutation of (a1).
  • amino acid sequence B comprises the following amino acid sequence (a1), (a2), or (a3): (a1) an amino acid sequence containing amino acid substitution mutations of K169 and D529 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; (a2) an amino acid sequence having deletion, insertion, substitution and/or addition of one or several amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • Item 3 The mutant MAD7 protein according to Item 1 or 2, wherein in the amino acid substitution mutation, the amino acid after mutation of K169 is a basic amino acid other than lysine, and the amino acid after mutation of D529 is a basic amino acid.
  • Item 4 The mutant MAD7 protein according to any one of Items 1 to 3, wherein in the amino acid substitution mutation, the amino acid after mutation of K169 is arginine, and the amino acid after mutation of D529 is arginine.
  • Item 5 The mutant MAD7 protein according to any one of Items 1 to 4, wherein the amino acid sequence B contains an amino acid substitution mutation of Y1086 in the amino acid sequence A.
  • Item 6 The mutant MAD7 protein according to Item 5, wherein in the amino acid substitution mutation, the amino acid after mutation of Y1086 is an aromatic amino acid other than tyrosine.
  • Item 7 The mutant MAD7 protein according to Item 5 or 6, wherein in the amino acid substitution mutation, the amino acid after mutation of Y1086 is phenylalanine.
  • Item 8 The variant according to any one of Items 1 to 7, wherein the amino acid sequence B contains an amino acid substitution mutation of at least one amino acid selected from the group consisting of K970 and E1227 in the amino acid sequence A. MAD7 protein.
  • Item 9 The mutant MAD7 protein according to Item 8, wherein in the amino acid substitution mutation, the amino acid after mutation of K970 is a hydrophilic neutral amino acid and/or the amino acid after mutation of E1227 is a basic amino acid.
  • Item 10 The mutant MAD7 protein according to Item 8 or 9, wherein in the amino acid substitution mutation, the amino acid after mutation of K970 is asparagine and/or the amino acid after mutation of E1227 is lysine.
  • Item 11 Items 1 to 10, wherein the amino acid sequence B contains an amino acid substitution mutation of at least one amino acid selected from the group consisting of M961, K1098, F1198, Q1230, I1231, and N1250 in the amino acid sequence A. Mutant MAD7 protein according to any one of the paragraphs.
  • Item 12 The amino acid sequence B is C892, Y907, I922, Y966, S1000, T1014, K1040, L1056, I1065, K1067, T1083, F1163, D1200, K1236, D1238, F1241, S1242, and K1247 in the amino acid sequence A.
  • the mutant MAD7 protein according to any one of items 1 to 11, comprising an amino acid substitution mutation of at least one amino acid selected from the group consisting of:
  • Item 13 The mutant MAD7 protein according to any one of Items 1 to 12, wherein the amino acid sequence B comprises the following amino acid sequence (b1), (b2), or (b3): (b1) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2; (b2) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, one or several amino acids are deleted, inserted, substituted, and/or added, and the 169th and 529th amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are conserved amino acid sequence; (b3) An amino acid sequence having 70% or more identity to the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 and in which the 169th and 529th amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO:2 are conserved.
  • Item 14 The mutant MAD7 protein according to Item 13, wherein in (b2) or (b3), the 1086th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is further conserved.
  • Item 15 The mutant MAD7 protein according to Item 13 or 14, wherein in (b2) or (b3), the 970th and/or 1227th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is further conserved.
  • Item 16 The mutant MAD7 protein according to any one of Items 1 to 12, wherein the amino acid sequence B comprises the following amino acid sequence (c1), (c2), or (c3): (c1) the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3; (c2) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, one or several amino acids are deleted, inserted, substituted, and/or added, and the 169th and 529th amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 are conserved amino acid sequence; (c3) an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:3 and in which the 169th and 529th amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO:3 are conserved;
  • Item 17 The mutant MAD7 protein according to Item 13 or 14, wherein in (c2) or (c3), the 1086th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is conserved.
  • Item 18 The mutant MAD7 protein according to Item 16 or 17, wherein in (c2) or (c3), the 970th and/or 1227th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is further conserved.
  • Item 19 The mutant MAD7 protein according to any one of Items 1 to 18, comprising the amino acid sequence B and a nuclear localization signal sequence.
  • Item 20 comprising a first split fragment and a second split fragment of the mutant MAD7 protein of any one of Items 1 to 18, A combination of polypeptides, wherein the first split fragment and the second split fragment are polypeptides each comprising an amino acid sequence selected from the group consisting of (1) to (10) and (11) below: (1) First split fragment: amino acid sequence corresponding to the 1st to 182nd amino acid sequences of SEQ ID NO: 1, second split fragment: amino acid sequence corresponding to the 183rd to 1263rd amino acid sequences of SEQ ID NO: 1; (2) First split fragment: amino acid sequence corresponding to the 1st to 273rd amino acid sequences of SEQ ID NO: 1, second split fragment: amino acid sequence corresponding to the 274th to 1263rd amino acid sequences of SEQ ID NO: 1; (3) First split fragment: amino acid sequence corresponding to amino acid sequence 1 to 292 of SEQ ID NO: 1, second split fragment: amino acid sequence corresponding to amino acid sequence 293 to 1263 of SEQ ID NO: 1;
  • Item 21 A polynucleotide comprising a coding sequence for the mutant MAD7 protein of any one of Items 1 to 19 and/or the polypeptide of Item 20.
  • Item 22 A vector comprising the polynucleotide according to Item 21.
  • Item 23 The mutant MAD7 protein of any one of Items 1 to 19, the combination of the polypeptides of Item 20, the polynucleotide of Item 21, and/or the vector of Item 22, and a target and a guide RNA for the site.
  • Item 24 The mutant MAD7 protein of any one of Items 1 to 19, the combination of the polypeptides of Item 20, the polynucleotide of Item 21, and/or the vector of Item 22, cell.
  • Item 25 The mutant MAD7 protein according to any one of Items 1 to 19, the combination of the polypeptides according to Item 20, the polynucleotide according to Item 21, and/or the vector according to Item 22 are added to cells. or genome editing methods, including introduction into non-human organisms.
  • Item 26 The genome editing method according to Item 25, further comprising introducing a guide RNA for the target site into the cell or non-human organism.
  • Item 27 A method for producing a cell or organism in which a target site is genome-edited, The mutant MAD7 protein according to any one of items 1 to 19, the combination of the polypeptides according to item 20, the polynucleotide according to item 21, and/or the vector according to item 22, and the vector according to item 22, and the target site A method of production comprising introducing a guide RNA into a cell or non-human organism.
  • Item 28 Cells or organisms obtained by the production method of Item 27.
  • Item 29 The mutant MAD7 protein of any one of Items 1 to 19, the combination of the polypeptides of Item 20, the polynucleotide of Item 21, the vector of Item 22, and/or Item 24
  • Item 30 The mutant MAD7 protein of any one of Items 1 to 19, the combination of the polypeptides of Item 20, the polynucleotide of Item 21, the vector of Item 22, and/or Item 24 A composition for genome editing for agriculture, comprising the cell according to .
  • Item 31 The mutant MAD7 protein of any one of Items 1 to 19, the combination of the polypeptides of Item 20, the polynucleotide of Item 21, the vector of Item 22, and/or Item 24 A composition for medical genome editing, comprising the cell according to .
  • Item 32 The mutant MAD7 protein of any one of Items 1 to 19, the combination of the polypeptides of Item 20, the polynucleotide of Item 21, the vector of Item 22, and/or Item 24 A composition for genome editing for animal husbandry, comprising the cells according to .
  • Item 33 The mutant MAD7 protein of any one of Items 1 to 19, the combination of the polypeptides of Item 20, the polynucleotide of Item 21, the vector of Item 22, and/or Item 24 A composition for genome editing for marine products, comprising the cell according to .
  • Item 34 The mutant MAD7 protein of any one of Items 1 to 19, the combination of the polypeptides of Item 20, the polynucleotide of Item 21, the vector of Item 22, and/or Item 24 A composition for industrial genome editing, comprising the cell according to .
  • the present invention it is possible to provide a mutant MAD7 protein with higher target site cleavage activity. In addition, this allows genome editing to be performed with higher efficiency than when using the wild-type MAD7 protein.
  • FIG. 1 Schematic diagram showing domains and mutation sites of ST7, ST8-1, and ST8-2.
  • 1 shows the amino acid sequence of ST7.
  • 1 shows the amino acid sequence of ST8-1.
  • 1 shows the amino acid sequence of ST8-2.
  • the results of EGxxFP assay in Test Example 2 are shown.
  • the vertical axis indicates the relative value of the EGFP value normalized by the RFP value (the higher the value, the higher the cleavage activity).
  • the horizontal axis indicates the MAD7 expression vector used. See Figure 1 for ST7, ST8-1, and ST8-2.
  • the adopted PAM sequence is shown above the graph.
  • the results of EGxxFP assay in Test Example 2 are shown. Description of the figure is the same as that of FIG.
  • the results of EGxxFP assay in Test Example 2 are shown.
  • the results of EGxxFP assay in Test Example 2 are shown. Description of the figure is the same as that of FIG. The results of EGxxFP assay in Test Example 2 are shown. Description of the figure is the same as that of FIG. The results of EGxxFP assay in Test Example 2 are shown. Description of the figure is the same as that of FIG. The results of EGxxFP assay in Test Example 2 are shown. Description of the figure is the same as that of FIG. The results of EGxxFP assay in Test Example 2 are shown. Description of the figure is the same as that of FIG. The results of EGxxFP assay in Test Example 2 are shown. Description of the figure is the same as that of FIG. The results of EGxxFP assay in Test Example 2 are shown. Description of the figure is the same as that of FIG. The results of EGxxFP assay in Test Example 2 are shown. Description of the figure is the same as that of FIG.
  • the mutation sites relative to SEQ ID NO: 1 in the mutant MAD7 protein encoded by the MAD7 expression vector are shown.
  • the results of EGxxFP assay in Test Example 2 are shown. Description of the figure is the same as that of FIG.
  • the results of EGxxFP assay in Test Example 2 are shown. Description of the figure is the same as that of FIG.
  • the results of EGxxFP assay in Test Example 2 are shown. Description of the figure is the same as that of FIG.
  • the results of EGxxFP assay in Test Example 2 are shown. Description of the figure is the same as that of FIG.
  • the results of EGxxFP assay in Test Example 2 are shown. Description of the figure is the same as that of FIG.
  • the results of EGxxFP assay in Test Example 2 are shown. Description of the figure is the same as that of FIG.
  • the results of EGxxFP assay in Test Example 2 are shown. Description of the figure is the same as that of FIG.
  • the results of the In vitro assay of Test Example 4 are shown.
  • the vertical axis indicates cleavage activity.
  • the abscissa indicates the protein to be measured for activity and the measurement temperature.
  • the adopted PAM sequences and reaction times are shown above the graph.
  • the results of the In vitro assay of Test Example 4 are shown. Description of the figure is the same as that of FIG.
  • the results of the In vitro assay of Test Example 4 are shown. Description of the figure is the same as that of FIG.
  • the results of the In vitro assay of Test Example 4 are shown. Description of the figure is the same as that of FIG. 4 shows the analysis results of mutation introduction efficiency using mouse fertilized eggs of Test Example 5.
  • FIG. The vertical axis indicates the efficiency of mutation introduction, and the horizontal axis indicates the protein introduced into the mouse fertilized egg.
  • identity refers to the extent to which two or more comparable amino acid sequences match each other. Therefore, the higher the identity or similarity between two amino acid sequences, the higher the identity or similarity between those sequences.
  • the level of amino acid sequence identity is determined, for example, using the sequence analysis tool FASTA, using default parameters. or Algorithm BLAST by Karlin and Altschul (Karlin S, Altschul SF. "Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes" Proc Natl Acad Sci USA.
  • conservative substitution means that an amino acid residue is replaced with an amino acid residue having a similar side chain.
  • substitutions between amino acid residues having basic side chains such as lysine, arginine, and histidine correspond to conservative substitutions.
  • amino acid residues with acidic side chains such as aspartic acid and glutamic acid
  • amino acid residues with uncharged polar side chains such as glycine, asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine and cysteine
  • Amino acid residues with non-polar side chains such as proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • amino acid residues with ⁇ -branched side chains such as threonine, valine, isoleucine
  • aromatic side chains such as tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine. Substitutions between amino acid residues are also conservative substitutions.
  • nucleotides such as DNA and RNA may be subjected to known chemical modifications as exemplified below.
  • Substitution of phosphate residues of each nucleotide with chemically modified phosphate residues such as phosphorothioate (PS), methylphosphonate, and phosphorodithioate to prevent degradation by hydrolases such as nucleases. can be done.
  • the hydroxyl group at the 2nd position of the sugar (ribose) of each ribonucleotide is replaced by -OR (R is, for example, CH3 (2'-O-Me), CH2CH2OCH3 (2'-O-MOE), CH2CH2NHC(NH)NH2 , CH2CONHCH3, CH2CH2CN, etc.).
  • R is, for example, CH3 (2'-O-Me), CH2CH2OCH3 (2'-O-MOE), CH2CH2NHC(NH)NH2 , CH2CONHCH3, CH2CH2CN, etc.
  • the base moiety pyrimidine, purine
  • phosphate moiety or hydroxyl moiety has been modified with biotin, an amino group, a lower alkylamine group, an acetyl group, or the like.
  • BNA LNA
  • the conformation of the sugar portion is fixed to the N-type by bridging the 2' oxygen and 4' carbon of the sugar portion of the nucleotide, can also be preferably used.
  • amino acid mutation is specifically amino acid deletion, substitution, insertion, or addition.
  • the position of an amino acid in an amino acid sequence may be indicated by the amino acid number counted from the amino acid one-letter notation + N-terminal amino acid.
  • “K169” indicates lysine, which is the 169th amino acid from the N-terminus.
  • an amino acid substitution mutation may be indicated by the amino acid one-letter code before mutation + the amino acid number counted from the N-terminal amino acid + the amino acid one-letter code after mutation.
  • “K169R” indicates a substitution mutation of lysine, which is the 169th amino acid from the N-terminus, to arginine.
  • the mutant MAD7 protein contains an amino acid sequence B obtained by mutating the amino acid sequence A shown in SEQ ID NO: 1, and the amino acid sequence B is amino acids K169 and D529 in the amino acid sequence A. It relates to mutant MAD7 proteins containing substitution mutations (herein also referred to as "mutant MAD7 proteins of the present invention"). This will be explained below.
  • the amino acid sequence A is the amino acid sequence of the MAD7 protein.
  • the MAD7 protein is a Cas12a protein derived from Eubacterium rectale.
  • the MAD7 protein can be used in a CRISPR/Cas system, for example, it can bind to a target site of genomic DNA in a complex with a guide RNA and cleave the target site.
  • the amino acid sequence B is an amino acid sequence obtained by mutating the amino acid sequence A, and includes amino acid substitution mutations of K169 and D529 in the amino acid sequence A as mutations.
  • the amino acid sequence B can synergistically improve the cleavage activity for the target site by combining the amino acid substitution mutations of K169 and D529.
  • the amino acid after mutation of K169 is preferably a basic amino acid other than lysine.
  • the basic amino acid include arginine and histidine, and particularly preferably arginine.
  • the amino acid after mutation of D529 is preferably a basic amino acid.
  • the basic amino acid include arginine, lysine, histidine and the like, and arginine is particularly preferred.
  • amino acid sequence B include the following amino acid sequence (a). (a1) an amino acid sequence containing amino acid substitution mutations of K169 and D529 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; (a2) an amino acid sequence having deletion, insertion, substitution and/or addition of one or several amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and containing the amino acid substitution mutation of (a1); (a3) An amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and containing the amino acid substitution mutation of (a1).
  • amino acid sequence (a2) “one or several” may be, for example, a range in which the protein containing the amino acid sequence (a2) is an amino acid sequence that has cleavage activity against the target site.
  • the “target site-cleavage activity” is, for example, the cleavage activity in the state of forming a complex with a guide RNA that can be targeted to the target site (the same applies hereinafter).
  • the “identity” may be, for example, a range in which the protein containing the amino acid sequence (a3) is an amino acid sequence that has cleavage activity against the target site.
  • the “identity” of (a3) is, for example, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% with respect to the amino acid sequence of (a1) 97% or more, 98% or more, 99% or more.
  • amino acid sequences (a2) and (a3) preserve the amino acid substitution mutations in the amino acid sequence (a1), that is, the amino acid sequence A.
  • the amino acid sequences of (a2) and (a3) may contain amino acid substitution mutations other than K169 and D529 in the amino acid sequence A described below.
  • the amino acid sequence B preferably contains, as mutations, an amino acid substitution mutation of Y1086 in the amino acid sequence A in addition to the combination of amino acid substitution mutations of K169 and D529.
  • the amino acid sequence B can synergistically improve the cleavage activity for the target site.
  • the amino acid after mutation of Y1086 is preferably an aromatic amino acid other than tyrosine.
  • aromatic amino acid include phenylalanine and tryptophan, and particularly preferably phenylalanine.
  • the amino acid sequence B has, as mutations, a combination of amino acid substitution mutations of K169 and D529 (in particular, a combination of amino acid substitution mutations of K169, D529, and Y1086), K970 and It preferably contains at least one amino acid substitution mutation selected from the group consisting of E1227.
  • the amino acid sequence B can synergistically improve the cleavage activity for the target site.
  • the amino acid after mutation of K970 is preferably a hydrophilic neutral amino acid.
  • hydrophilic neutral amino acids include asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine, and the like, with asparagine being particularly preferred.
  • the amino acid after mutation of E1227 is preferably a basic amino acid.
  • the basic amino acid include lysine, arginine, histidine and the like, and particularly preferably lysine.
  • the amino acid sequence B has, in addition to a combination of amino acid substitution mutations of K169 and D529, at least one selected from the group consisting of M961, K1098, F1198, Q1230, I1231, and N1250 in amino acid sequence A. It is preferred to include amino acid substitution mutations of amino acids.
  • the amino acid sequence B can improve the cleavage activity for the target site by further combining the amino acid substitution mutations.
  • the amino acid after mutation of M961 is preferably a hydrophobic amino acid other than methionine.
  • hydrophobic amino acids include leucine, isoleucine, valine, glycine, alanine, proline, tryptophan, phenylalanine and the like, preferably leucine, isoleucine, valine and the like, and particularly preferably leucine. .
  • the amino acid after mutation of K1098 is preferably a hydrophilic neutral amino acid.
  • hydrophilic neutral amino acids include asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine, and the like, with asparagine being particularly preferred.
  • the amino acid after mutation of F1198 is preferably an aromatic amino acid other than phenylalanine.
  • aromatic amino acids include tyrosine and tryptophan, and particularly preferably tyrosine.
  • the amino acid after mutation of Q1230 is preferably a basic amino acid.
  • the basic amino acid include arginine, lysine, histidine and the like, and arginine is particularly preferred.
  • the amino acid after mutation of I1231 is preferably a hydrophobic amino acid other than isoleucine.
  • hydrophobic amino acids include valine, leucine, glycine, alanine, proline, tryptophan, phenylalanine, methionine and the like, and particularly preferably valine.
  • the amino acid after mutation of N1250 is preferably a hydrophilic neutral amino acid other than asparagine.
  • hydrophilic neutral amino acids include serine, glutamine, threonine, tyrosine, cysteine, etc. Serine is particularly preferred.
  • the amino acid sequence B can contain other amino acid mutations (eg, substitutions, conservative substitutions) as long as the cleavage activity for the target site is not significantly impaired.
  • the number of other amino acid mutations is, for example, 1-50, 1-20, 1-10, or 1-5.
  • the other amino acid mutations include, for example, C892, Y907, I922, Y966, S1000, T1014, K1040, L1056, I1065, K1067, T1083, F1163, D1200, K1236, D1238, F1241, S1242, and at least one amino acid substitution mutation selected from the group consisting of K1247.
  • the amino acid sequence B can be an amino acid sequence of a split protein fragment of a mutant MAD7 protein (amino acid sequence B') obtained by introducing amino acid substitution mutations of K169 and D529 into the amino acid sequence A.
  • the split-type protein fragment is a fragment obtained by cleaving the original protein sequence at one or more locations (for example, 2 to 3, preferably 2), and restores the original activity by reassociating with each other. It is possible.
  • the division site can be determined based on known information (eg, Cas9 protein division technology). For example, it can be determined as follows. 1. Obtain a three-dimensional structure from the amino acid sequence B' by homology modeling. 2. Choose one cleavage site for each domain-spanning region. At this time, a plurality of model structures are compared, and candidates considered to have no structural problems are preferentially selected. 3. Select sites that are considered splittable as a result.
  • known information eg, Cas9 protein division technology. For example, it can be determined as follows. 1. Obtain a three-dimensional structure from the amino acid sequence B' by homology modeling. 2. Choose one cleavage site for each domain-spanning region. At this time, a plurality of model structures are compared, and candidates considered to have no structural problems are preferentially selected. 3. Select sites that are considered splittable as a result.
  • the amino acid sequence B is preferably the amino acid sequence B1 shown in SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3, or 80% or more (preferably 85% or more, more preferably 90% or more, still more preferably 95% of the amino acid sequence B1) above, more preferably 97% or more, particularly preferably 99% or more, and less than 100%).
  • Amino acid sequence B1 (amino acid sequence of mutant MAD7 protein (ST8-1s), SEQ ID NO: 2) MNNGTNNFQNFIGISSLQKTLRNALIPTETTQQFIVKNGIIKEDELRGENRQILKDIMDDYYRGFISETLSSIDDIDWTSLFEKMEIQLKNGDNKDTLIKEQTEYRKAIHKKFANDDRFKNMFSAKLISDILPEFVIHNNNYSASEKEEKTQVIKLFSRFATSFKDYFRNRANCFSADDISSSSCHRIVNDNAEIFFSNALVYRRIVKSLSNDDINKISGDMK DSLKEMSLEEIYSYEKYGEFITQEGISFYNDICGKVNSFMNLYCQKNKENKNLYKLQKLHKQILCIADTSYEVPYKFESDEEVYQSVNGFLDNISSKHIVERLRKIGDNYNGYNLDKIYIVSKFYESVSQKTYRDWETINTALEIHY
  • Amino acid sequence B1 (amino acid sequence of mutant MAD7 protein (ST8-2s), SEQ ID NO: 3) MNNGTNNFQNFIGISSLQKTLRNALIPTETTQQFIVKNGIIKEDELRGENRQILKDIMDDYYRGFISETLSSIDDIDWTSLFEKMEIQLKNGDNKDTLIKEQTEYRKAIHKKFANDDRFKNMFSAKLISDILPEFVIHNNNYSASEKEEKTQVIKLFSRFATSFKDYFRNRANCFSADDISSSSCHRIVNDNAEIFFSNALVYRRIVKSLSNDDINKISGDMK DSLKEMSLEEIYSYEKYGEFITQEGISFYNDICGKVNSFMNLYCQKNKENKNLYKLQKLHKQILCIADTSYEVPYKFESDEEVYQSVNGFLDNISSKHIVERLRKIGDNYNGYNLDKIYIVSKFYESVSQKTYRDWETINTALEI
  • Amino acid sequence B may be the amino acid sequence of (b) below.
  • amino acid sequence of (b2) “one or several” may be, for example, a range in which the protein containing the amino acid sequence of (b2) is an amino acid sequence that has cleavage activity against the target site.
  • the "identity” may be, for example, a range in which the protein containing the amino acid sequence (b3) is an amino acid sequence that has cleavage activity against the target site.
  • the “identity” of (b3) is, for example, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more to the amino acid sequence of (b1). 97% or more, 98% or more, 99% or more.
  • the 1086th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is further conserved.
  • the protein containing the amino acid sequence (b2) or (b3) can synergistically improve the cleavage activity for the target site due to the conservation of the 1086th amino acid.
  • the 970th and/or 1227th amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 are conserved.
  • the protein containing the amino acid sequence (b2) or (b3) can synergistically improve the cleavage activity for the target site due to the conservation of the 970th and/or 1227th amino acids.
  • Amino acid sequence B may be the amino acid sequence of (c) below.
  • (c3) an amino acid sequence having 70% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO:3 and in which the 169th and 529th amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO:3 are conserved;
  • amino acid sequence of (c2) “one or several” may be, for example, a range in which the protein containing the amino acid sequence of (c2) has an amino acid sequence that has cleavage activity against the target site.
  • the "identity” may be, for example, a range in which the protein containing the amino acid sequence (c3) is an amino acid sequence that has cleavage activity against the target site.
  • the “identity” of (c3) is, for example, 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more to the amino acid sequence of (c1). 97% or more, 98% or more, 99% or more.
  • the 1086th amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is further conserved.
  • the protein containing the amino acid sequence (c2) or (c3) can synergistically improve the cleavage activity for the target site due to the conservation of the 1086th amino acid.
  • (c2) or (c3) above it is preferable that the 970th and/or 1227th amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 are conserved.
  • the protein containing the amino acid sequence (c2) or (c3) can synergistically improve the cleavage activity for the target site due to the conservation of the 970th and/or 1227th amino acids.
  • Mutant MAD7 proteins of the present invention may contain amino acid sequences other than amino acid sequence B, such as nuclear localization signal sequences, protein tags, fluorescent proteins, luminescent proteins, as long as the target site cleavage activity is not significantly impaired.
  • a protein or peptide such as a signal sequence such as a protease recognition sequence (TEV protease recognition sequence, etc.) may be added.
  • the protein tag include biotin, His tag, FLAG tag, Halo tag, MBP tag, HA tag, Myc tag, V5 tag, PA tag and the like.
  • the mutant MAD7 protein of the present invention preferably contains amino acid sequence B and a nuclear localization signal sequence.
  • the nuclear localization signal sequence include SV40 nuclear localization signal sequence, nucleoplasmin nuclear localization signal and the like.
  • the nuclear localization signal sequence is preferably arranged at the C-terminal side of the amino acid sequence B.
  • the mutant MAD7 protein of the present invention may be chemically modified as long as the target site cleavage activity is not significantly impaired.
  • the mutant MAD7 protein of the present invention may have a carboxyl group (--COOH), carboxylate ( --COO- ), amide (--CONH 2 ) or ester (--COOR) at the C-terminus.
  • R in the ester includes, for example, C 1-6 alkyl groups such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl and n-butyl; C 3-8 cycloalkyl groups such as cyclopentyl and cyclohexyl; C 6-12 aryl groups such as , ⁇ -naphthyl; phenyl-C 1-2 alkyl groups such as benzyl, phenethyl; C 7- such as ⁇ -naphthyl-C 1-2 alkyl groups such as ⁇ -naphthylmethyl 14 Aralkyl group; pivaloyloxymethyl group and the like are used.
  • C 1-6 alkyl groups such as methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl and n-butyl
  • C 3-8 cycloalkyl groups such as cyclopentyl and cyclohexyl
  • carboxyl groups (or carboxylates) other than the C-terminus may be amidated or esterified.
  • ester in this case, for example, the above-mentioned C-terminal ester or the like is used.
  • the amino group of the amino acid residue at the N-terminus is protected by a protecting group (for example, a formyl group, a C1-6 acyl group such as a C1-6 alkanoyl group such as an acetyl group, etc.).
  • a protecting group for example, a formyl group, a C1-6 acyl group such as a C1-6 alkanoyl group such as an acetyl group, etc.
  • Protected ones, pyroglutamated N-terminal glutamine residues that can be cleaved in vivo, substituents on side chains of amino acids in molecules e.g., -OH, -SH, amino groups , an imidazole group, an indole group, a guanidino group, etc.
  • an appropriate protecting group for example, a C1-6 acyl group such as a formyl group, a C1-6 alkanoyl group such as an acetyl group, etc.
  • Composite proteins such as so-called glycoproteins to which sugar chains are bound are also included.
  • the mutant MAD7 protein of the present invention may be in the form of a salt with an acid or base.
  • the salt is not particularly limited, and both acid salts and basic salts can be employed.
  • the acid salts include, for example, inorganic acid salts such as hydrochloride, hydrobromide, sulfate, nitrate, and phosphate; acetate, propionate, tartrate, fumarate, maleate, malic acid Salts, organic acid salts such as citrate, methanesulfonate and paratoluenesulfonate; amino acid salts such as aspartate and glutamate;
  • Examples of the basic salt include alkali metal salts such as sodium salts and potassium salts; alkaline earth metal salts such as calcium salts and magnesium salts;
  • the mutant MAD7 protein of the present invention may be in the form of a solvate.
  • the solvent is not particularly limited, and examples thereof include water, ethanol, glycerol, acetic acid and the like.
  • the target site cleavage activity of the mutant MAD7 protein of the present invention can be measured by the method described in the Examples.
  • the target site cleavage activity of the mutant MAD7 protein of the present invention is, for example, preferably 150% or more, more preferably 150% or more, relative to 100% target site cleavage activity of the MAD7 protein consisting of the amino acid sequence A shown in SEQ ID NO: 1. is 200% or more, more preferably 300% or more, and even more preferably 400% or more. Within this range, the activity is preferably 500% or higher, more preferably 600% or higher, even more preferably 700% or higher, even more preferably 800% or higher, particularly preferably 900% or higher, and particularly preferably 1000% or higher. is.
  • the target site cleavage activity of the mutant MAD7 protein of the present invention is, for example, 1000% or less, 900% or less, or 800% of the target site cleavage activity of the MAD7 protein consisting of the amino acid sequence A shown in SEQ ID NO: 1. 700% or less, 600% or less, 500% or less, 400% or less, 300% or less, 200% or less, or 150% or less.
  • the range of target site cleavage activity of the mutant MAD7 protein of the present invention is, for example, any combination of the upper and lower limits described above.
  • the mutant MAD7 protein of the present invention can be easily produced according to known genetic engineering techniques.
  • the mutant MAD7 protein of the present invention can be produced using, for example, PCR, restriction enzyme cleavage, DNA ligation technology, in vitro transcription/translation technology, recombinant protein production technology, and the like.
  • polynucleotides comprising a coding sequence of the mutant MAD7 protein of the present invention. It relates to a cell (herein sometimes referred to as “the cell of the present invention”) containing at least one selected from the group consisting of the polynucleotide of the present invention and the mutant MAD7 protein of the present invention.
  • the coding sequence of the mutant MAD7 protein of the present invention is not particularly limited as long as it is a polynucleotide consisting of a base sequence encoding the mutant MAD7 protein of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention comprises an expression cassette of the mutant MAD7 protein of the present invention.
  • the expression cassette of the mutant MAD7 protein of the present invention is not particularly limited as long as it is a polynucleotide capable of expressing the mutant MAD7 protein of the present invention in cells.
  • a typical example of an expression cassette for a mutant MAD7 protein of the invention includes a promoter and a polynucleotide comprising a coding sequence for a mutant MAD7 protein of the invention placed under the control of the promoter.
  • the promoter contained in the expression cassette of the mutant MAD7 protein of the present invention is not particularly limited and can be appropriately selected according to the target cell.
  • various pol II promoters can be used.
  • the pol II promoter include, but are not limited to, CMV promoter, EF1 promoter, SV40 promoter, MSCV promoter and the like.
  • Other examples of the promoter include tryptophan promoters such as trc and tac, lac promoter, T7 promoter, T5 promoter, T3 promoter, SP6 promoter, arabinose-inducible promoter, cold shock promoter, tetracycline-inducible promoter, and the like.
  • the polynucleotide of the present invention may optionally contain other elements (e.g., multiple cloning site (MCS), drug resistance gene, replication origin, enhancer sequence, repressor sequence, insulator sequence, reporter protein (e.g., fluorescent protein). etc.) coding sequences, drug resistance gene coding sequences, guide RNA expression cassettes, etc.).
  • MCS multiple cloning site
  • drug resistance gene e.g., replication origin, enhancer sequence, repressor sequence, insulator sequence, reporter protein (e.g., fluorescent protein).
  • reporter protein e.g., fluorescent protein
  • the polynucleotide of the present invention can be in the form of a vector.
  • a suitable vector is selected depending on the purpose of use (cloning, expression of protein) and in consideration of the type of host cell.
  • E. coli host vectors include M13 phage or variants thereof, ⁇ phage or variants thereof, pBR322 or variants thereof (pB325, pAT153, pUC8, etc.), and yeast hosts include pYepSec1, pMFa, pYES2. , pPIC3.5K and the like, pAc, pVL and the like for insect cell hosts, and pcDNA, pCDM8, pMT2PC and the like for mammalian cell hosts.
  • the cell of the present invention is not particularly limited as long as it contains at least one selected from the group consisting of the polynucleotide of the present invention and the mutant MAD7 protein of the present invention.
  • the cells include Escherichia coli K12 and other Escherichia coli, Bacillus subtilis MI114 and other Bacillus bacteria, Saccharomyces cerevisiae AH22 and other yeasts, Spodoptera frugiperda-derived Sf cell lines or Trichoplusia ni-derived HighFive cell lines, and olfactory nerve cells.
  • insect cells animal cells such as COS7 cells, and the like.
  • the animal cells are preferably mammal-derived cultured cells, specifically COS7 cells, CHO cells, HEK293 cells, HEK293FT cells, Hela cells, PC12 cells, N1E-115 cells, SH-SY5Y cells and the like. mentioned.
  • the mutant MAD7 protein of the present invention is expressed from the polynucleotide of the present invention.
  • Genome editing method comprising introducing at least one selected from the group consisting of the mutant MAD7 protein of the present invention and the polynucleotide of the present invention into a cell or non-human organism. relating to the method.
  • Cells and organisms targeted for genome editing are not particularly limited as long as they are cells and organisms that can be genome-edited by the CRISPR/Cas system.
  • the target cells for genome editing include cells derived from various tissues or having various properties, such as blood cells, hematopoietic stem cells/progenitor cells, gametes (sperm, eggs), fertilized eggs, fibroblasts, epithelial cells, vascular endothelial cells, nerve cells, hepatocytes, keratinocytes, muscle cells, epidermal cells, endocrine cells, ES cells, iPS cells, tissue stem cells, cancer cells and the like.
  • Examples of the genome editing target organism include mammals such as humans, monkeys, mice, rats, dogs, cats, and rabbits; reptiles such as snakes and lizards; amphibians such as Xenopus; Chordates such as sea squirts; Arthropods such as fruit flies and silkworms; Animals such as: Arabidopsis thaliana, rice, wheat, plants such as tobacco; Examples thereof include bacteria such as fungi and blue-green algae.
  • the introduction method is not particularly limited, and can be appropriately selected according to the type of target cell or organism and the type of material (nucleic acid, protein, etc.).
  • Examples of the introduction method include microinjection, electroporation, DEAE-dextran treatment, lipofection, nanoparticle-mediated transfection, virus-mediated nucleic acid delivery, and the like.
  • materials necessary for genome editing such as guide RNA expression cassettes and donor DNA, can be introduced.
  • genome-edited cells or organisms can be obtained by collecting the target cell or target organism.
  • a genome-editing composition comprising at least one selected from the group consisting of the mutant MAD7 protein of the present invention, the polynucleotide of the present invention, and the cell of the present invention (In this specification, it may also be referred to as the “composition for genome editing of the present invention”). This will be explained below.
  • the genome editing composition of the present invention is not particularly limited as long as it contains at least one selected from the group consisting of the mutant MAD7 protein of the present invention, the polynucleotide of the present invention, and the cell of the present invention. or may contain other components as necessary. Examples of other components include, but are not limited to, bases, carriers, solvents, dispersants, emulsifiers, buffers, stabilizers, excipients, binders, disintegrants, lubricants, Thickeners, moisturizing agents, coloring agents, fragrances, chelating agents and the like are included.
  • the genome-editing composition may optionally contain a polynucleotide containing a guide RNA expression cassette. It may also contain a donor polynucleotide, if desired.
  • composition for genome editing of the present invention can also be in the form of a kit.
  • other materials, reagents, instruments, and the like necessary for carrying out the genome editing method of the present invention such as nucleic acid introduction reagents and buffers, may be included as necessary.
  • the genome-editing kit may contain a polynucleotide containing a guide RNA expression cassette, and if necessary, a donor It may contain a polynucleotide.
  • the composition for genome editing of the present invention can be used for various purposes.
  • the composition for genome editing of the present invention can be used, for example, for experimental, agricultural, medical, livestock, fisheries, and industrial purposes.
  • the term “experimental” refers to those used for testing and research, not for practical purposes such as agriculture or medical treatment.
  • the agricultural use includes, for example, the use of genome-edited products as agricultural products.
  • the medical use includes, for example, cases in which genome editing is used to improve or treat conditions or diseases of organisms.
  • the term “for livestock farming” includes, for example, the case where the genome-edited products are used as livestock animals.
  • the term “for aquaculture” includes, for example, the case where the genome-edited product is used as an aquatic animal.
  • the industrial use includes, for example, the use of genome-edited products as industrial raw materials (organisms that produce materials such as fibers, microorganisms for fermentation such as alcoholic beverages, etc.).
  • Test example 1-1 Preparation of MAD7 expression vector A protein (ST7, SEQ ID NO: 8) obtained by adding NLS (SEQ ID NO: 4), GS linker, and 3 ⁇ HA tag (SEQ ID NO: 5) to the C-terminus of MAD7 protein (SEQ ID NO: 1) 1 and 2) coding sequence, NLS (SEQ ID NO: 4) at the C-terminus of the mutant MAD7 protein (ST8-1s, SEQ ID NO: 2: a sequence obtained by introducing K169R, D529R, K970N, and Y1086F into SEQ ID NO: 1) , a GS linker, and a coding sequence of a protein (ST8-1, SEQ ID NO: 9: FIGS.
  • NLS SEQ ID NO: 4
  • 3 ⁇ HA tag SEQ ID NO: 5
  • the coding sequence for the added protein was inserted downstream of the CMV promoter of the expression vector to obtain the MAD7 expression vector.
  • Test Example 1-2 Preparation of crRNA Expression Vector A vector having a scaffold-crRNA-terminator sequence inserted downstream of the U6 promoter was prepared.
  • Test Example 1-3 Preparation of RFP expression vector A vector was prepared in which a red fluorescent protein (RFP) was inserted downstream of the EF-1 ⁇ promoter.
  • RFP red fluorescent protein
  • Test Example 1-4 Preparation of vector for EGxxFP assay detection A vector was prepared in which the EGFP amino group terminal region, the base sequence to be cleaved including the PAM sequence, and the EGFP carboxyl group terminal region were inserted downstream of the CAG promoter in this order. The vector is designed so that when it is cleaved by genome editing, the EGFP sequence is repaired and green fluorescence is observed.
  • Test example 2 EGxxFP assay Using each MAD7 expression vector (Test Example 1), the cleavage activity of the mutant MAD7 protein for the target site was measured. Specifically, it was carried out as follows. (1) HEK293T cells were seeded on a 24-well plate and cultured for 1.5 to 2 days at 37°C in a CO 2 incubator. The medium used was DMEM (High Glucose) (Sigma-Aldrich), 10% FBS (CAPRICORN), and 1x penicillin-streptomycin mixed solution (Nacalai Techs). (2) The following liquid mixture was prepared.
  • DMEM High Glucose
  • FBS CAPRICORN
  • penicillin-streptomycin mixed solution Nacalai Techs
  • Solution A Opti-MEM (Gibco) 600 ⁇ l, 2 ng/2 nl RFP expression vector 0.6 ⁇ l, 2 ng/2 nl crRNA expression vector 1.2 ⁇ l, 2 ng/2 nl EGxxFP assay detection vector 3 ⁇ l
  • B solution Opti-MEM 600 ⁇ l, Turbofect (Thermo Fisher Scientific) 24 ⁇ l (3) 75 ⁇ l of solution A was dispensed into each tube and mixed with 0.75 ⁇ l of 0.4 ng/nl ST7 or ST8 expression vector. (4) 75 ⁇ l of solution B was added to the solution prepared in (3), mixed well, and allowed to stand at room temperature for 20 minutes. (5) The medium in the 24 well plate was replaced with new medium.
  • a sample containing no MAD7 expression vector was used as a negative control, and the value of the negative control was subtracted from the value of each sample.
  • the value of ST7 was set to 1, and the values of other samples were relative values of ST7.
  • the number of individuals for each data is 3, and the error range is indicated by the standard error. The results are shown in Figures 5-25.
  • Test example 3 Preparation of mutant MAD7 protein MAD7 and mutant MAD7 protein were purified using the E. coli protein expression system pET system. Specifically, it was carried out as follows. (1) RosettaTM (DE3) Competent cells (Sigma-Aldrich) were transformed with a pET expression vector containing the coding sequence of MAD7 or mutant MAD7 (Test Example 1) and cultured on LB agar medium containing kanamycin sulfate. bottom. After incubation at 37° C. for 1 day, the formation of E. coli colonies was confirmed. (2) One colony was selected from the formed colonies and cultured (preculture) in 10 ml of LB liquid medium containing kanamycin sulfate at 37° C.
  • coli pellet was treated with lysozyme and sonicated, centrifuged at 4° C., 70000 ⁇ g for 30 minutes, and the soluble fraction was recovered. (7) The soluble fraction was separated and purified by column chromatography using NGCTM Chromatography System (Bio-Rad). (8) The separated and purified MAD7 and mutant MAD7 were confirmed by CBB staining (Wako) after electrophoresis on SDS-PAGE.
  • Test example 4 in vitro assays (1) By CBB staining, the quantitative ratio of MAD7 protein (Test Example 3) and ST8.2 protein (Test Example 3) was calculated. (2) 10 ⁇ l of MAD7 protein solution and 10 ⁇ l of ST8.2 protein solution at the same concentration, 2 ⁇ l of NEBuffer 3.1, crRNA [sequence: /AlTR1/rUrArArUrUrCrUrArCrUrCrUrUrGrUrArGrArUrUrGrUrCrArCrCrCrCrUrGrUrCrCrCrCrUrG (SEQ ID NO: 6)/AlTR2/] ( 100 ng/ ⁇ l) 3 ⁇ l with sterile water Mixed and left at 25° C.
  • Test example 5 Mouse fertilized egg Analysis of mutagenesis efficiency (1) MAD7 or ST8.2 at the same concentration in mouse fertilized egg and crRNA designed at mouse Rosa26 locus 7) to GEEP It was inserted by the method (Japanese Patent Application Laid-Open No. 2017-184639). (2) Electroporated fertilized eggs were cultured in a CO 2 incubator at 37° C. until E3.5-4.5, and fertilized eggs developed into morula or blastocyst were collected individually. (3) DNA was extracted from the collected fertilized eggs. (4) PCR was performed using primers that detect the target sequence of crRNA designed at the Rosa26 locus. (5) DNA sequence analysis was performed using Miseq reagent nano kit v2.

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Abstract

標的部位に対する切断活性がより高い変異型ＭＡＤ７タンパク質を提供する。 配列番号１に示されるアミノ酸配列Ａが変異してなるアミノ酸配列Ｂを含み、且つ前記アミノ酸配列Ｂが、前記アミノ酸配列ＡにおけるK169及びD529のアミノ酸置換変異を含む、変異型ＭＡＤ７タンパク質。

Description

変異型ＭＡＤ７タンパク質
　本発明は、変異型ＭＡＤ７タンパク質等に関する。
　遺伝子改変動物は、現在、医学及び生物学を含む様々な研究分野において、生物の基本的メカニズムの解明のために、あるいは、ヒトの疾患のモデルとして、使用されている。迅速な遺伝子改変動物の作製手段として、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ（Zinc-Finger Nucleases））、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（Transcription Activator-Like Effector Nucleases））、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系（群生性等間隔短回文反復関連システム（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat-Associated System））等の人工制限酵素を利用する系が、注目を集めている。これらの新しい技術はゲノム編集と呼ばれ、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）や人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を利用せずに、幅広い生物のゲノムを改変することを可能にした。
　Ｃａｓタンパク質としては、Ｃａｓ９タンパク質が汎用されているが、ＭＡＤ７タンパク質等の新たなＣａｓタンパク質の使用も広がっている。また、ＭＡＤ７タンパク質の活性を向上させるべく、各種変異を導入する試みも行われている（特許文献１）。
国際公開第２０２０／０８６４７５号
　本発明は、標的部位に対する切断活性がより高い変異型ＭＡＤ７タンパク質を提供することを課題とする。
　本発明者は、上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、配列番号１に示されるアミノ酸配列Ａが変異してなるアミノ酸配列Ｂを含み、且つ前記アミノ酸配列Ｂが、前記アミノ酸配列ＡにおけるK169及びD529のアミノ酸置換変異を含む、変異型ＭＡＤ７タンパク質、であれば、上記課題を解決できることを見出した。本発明者は、この知見に基づいてさらに研究を進めた結果、本発明を完成させた。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
ＭＡＤ７タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１）
MNNGTNNFQNFIGISSLQKTLRNALIPTETTQQFIVKNGIIKEDELRGENRQILKDIMDDYYRGFISETLSSIDDIDWTSLFEKMEIQLKNGDNKDTLIKEQTEYRKAIHKKFANDDRFKNMFSAKLISDILPEFVIHNNNYSASEKEEKTQVIKLFSRFATSFKDYFKNRANCFSADDISSSSCHRIVNDNAEIFFSNALVYRRIVKSLSNDDINKISGDMKDSLKEMSLEEIYSYEKYGEFITQEGISFYNDICGKVNSFMNLYCQKNKENKNLYKLQKLHKQILCIADTSYEVPYKFESDEEVYQSVNGFLDNISSKHIVERLRKIGDNYNGYNLDKIYIVSKFYESVSQKTYRDWETINTALEIHYNNILPGNGKSKADKVKKAVKNDLQKSITEINELVSNYKLCSDDNIKAETYIHEISHILNNFEAQELKYNPEIHLVESELKASELKNVLDVIMNAFHWCSVFMTEELVDKDNNFYAELEEIYDEIYPVISLYNLVRNYVTQKPYSTKKIKLNFGIPTLADGWSKSKEYSNNAIILMRDNLYYLGIFNAKNKPDKKIIEGNTSENKGDYKKMIYNLLPGPNKMIPKVFLSSKTGVETYKPSAYILEGYKQNKHIKSSKDFDITFCHDLIDYFKNCIAIHPEWKNFGFDFSDTSTYEDISGFYREVELQGYKIDWTYISEKDIDLLQEKGQLYLFQIYNKDFSKKSTGNDNLHTMYLKNLFSEENLKDIVLKLNGEAEIFFRKSSIKNPIIHKKGSILVNRTYEAEEKDQFGNIQIVRKNIPENIYQELYKYFNDKSDKELSDEAAKLKNVVGHHEAATNIVKDYRYTYDKYFLHMPITINFKANKTGFINDRILQYIAKEKDLHVIGIDRGERNLIYVSVIDTCGNIVEQKSFNIVNGYDYQIKLKQQEGARQIARKEWKEIGKIKEIKEGYLSLVIHEISKMVIKYNAIIAMEDLSYGFKKGRFKVERQVYQKFETMLINKLNYLVFKDISITENGGLLKGYQLTYIPDKLKNVGHQCGCIFYVPAAYTSKIDPTTGFVNIFKFKDLTVDAKREFIKKFDSIRYDSEKNLFCFTFDYNNFITQNTVMSKSSWSVYTYGVRIKRRFVNGRFSNESDTIDITKDMEKTLEMTDINWRDGHDLRQDIIDYEIVQHIFEIFRLTVQMRNSLSELEDRDYDRLISPVLNENNIFYDSAKAGDALPKDADANGAYCIALKGLYEIKQITENWKEDGKFSRDKLKISNKDWFDFIQNKRYL
　項１：配列番号１に示されるアミノ酸配列Ａが変異してなるアミノ酸配列Ｂを含み、且つ前記アミノ酸配列Ｂが、前記アミノ酸配列ＡにおけるK169及びD529のアミノ酸置換変異を含む、変異型ＭＡＤ７タンパク質。
　項２：前記アミノ酸配列Ｂは、下記（ａ１）、（ａ２）、又は（ａ３）のアミノ酸配列を含む、項１に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質：
（ａ１）配列番号１のアミノ酸配列において、K169及びD529のアミノ酸置換変異を含むアミノ酸配列；
（ａ２）配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、及び／又は、付加を有し、且つ前記（ａ１）のアミノ酸置換変異を含むアミノ酸配列；
（ａ３）配列番号１のアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有し、且つ前記（ａ１）のアミノ酸置換変異を含むアミノ酸配列。
　項３：前記アミノ酸置換変異において、K169の変異後のアミノ酸がリシン以外の塩基性アミノ酸であり、D529の変異後のアミノ酸が塩基性アミノ酸である、項１又は２に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
　項４：前記アミノ酸置換変異において、K169の変異後のアミノ酸がアルギニンであり、且つD529の変異後のアミノ酸がアルギニンである、項１～３のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
　項５：前記アミノ酸配列Ｂが、前記アミノ酸配列ＡにおけるY1086のアミノ酸置換変異を含む、項１～４のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
　項６：前記アミノ酸置換変異において、Y1086の変異後のアミノ酸がチロシン以外の芳香族アミノ酸である、項５に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
　項７：前記アミノ酸置換変異において、Y1086の変異後のアミノ酸がフェニルアラニンである、項５又は６に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
　項８：前記アミノ酸配列Ｂが、前記アミノ酸配列ＡにおけるK970及びE1227からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸のアミノ酸置換変異を含む、項１～７のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
　項９：前記アミノ酸置換変異において、K970の変異後のアミノ酸が親水性中性アミノ酸であり、且つ／或いはE1227の変異後のアミノ酸が塩基性アミノ酸である、項８に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
　項１０：前記アミノ酸置換変異において、K970の変異後のアミノ酸がアスパラギンであり、且つ／或いはE1227の変異後のアミノ酸がリシンである、項８又は９に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
　項１１：前記アミノ酸配列Ｂが、前記アミノ酸配列ＡにおけるM961、K1098、F1198、Q1230、I1231、及びN1250からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸のアミノ酸置換変異を含む、項１～１０のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
　項１２：前記アミノ酸配列Ｂが、前記アミノ酸配列ＡにおけるC892、Y907、I922、Y966、S1000、T1014、K1040、L1056、I1065、K1067、T1083、F1163、D1200、K1236、D1238、F1241、S1242、及びK1247からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸のアミノ酸置換変異を含む、項１～１１のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
　項１３：前記アミノ酸配列Ｂは、下記（ｂ１）、（ｂ２）、又は（ｂ３）のアミノ酸配列を含む、項１～１２のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質：
（ｂ１）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ２）配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、及び／又は付加され、且つ配列番号２のアミノ酸配列における１６９番目及び５２９番目のアミノ酸が保存されたアミノ酸配列；
（ｂ３）配列番号２のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有し、且つ配列番号２のアミノ酸配列における１６９番目及び５２９番目のアミノ酸が保存されたアミノ酸配列。
　項１４：前記（ｂ２）又は（ｂ３）において、さらに、配列番号２のアミノ酸配列における１０８６番目のアミノ酸が保存されている、項１３に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
　項１５：前記（ｂ２）又は（ｂ３）において、さらに、配列番号２のアミノ酸配列における９７０番目及び／又は１２２７番目のアミノ酸が保存されている、項１３又は１４に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
　項１６：前記アミノ酸配列Ｂは、下記（ｃ１）、（ｃ２）、又は（ｃ３）のアミノ酸配列を含む、項１～１２のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質：
（ｃ１）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｃ２）配列番号３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、及び／又は付加され、且つ配列番号３のアミノ酸配列における１６９番目及び５２９番目のアミノ酸が保存されたアミノ酸配列；
（ｃ３）配列番号３のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有し、且つ配列番号３のアミノ酸配列における１６９番目及び５２９番目のアミノ酸が保存されたアミノ酸配列。
　項１７：前記（ｃ２）、又は（ｃ３）において、さらに、配列番号３のアミノ酸配列における１０８６番目のアミノ酸が保存されている、項１３又は１４に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
　項１８：前記（ｃ２）、又は（ｃ３）において、さらに、配列番号３のアミノ酸配列における９７０番目及び／又は１２２７番目のアミノ酸が保存されている、項１６又は１７に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
　項１９：前記アミノ酸配列Ｂ及び核局在化シグナル配列を含む、項１～１８のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
　項２０：項１から１８のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質の第１の分割断片と、第２の分割断片とを含み、
前記第１の分割断片及び前記第２の分割断片は、それぞれ、下記（１）～（１０）及び（１１）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、ポリペプチドの組合せ：
（１）第１の分割断片：配列番号１の１～１８２番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列、第２の分割断片：配列番号１の１８３～１２６３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列；
（２）第１の分割断片：配列番号１の１～２７３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列、第２の分割断片：配列番号１の２７４～１２６３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列；
（３）第１の分割断片：配列番号１の１～２９２番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列、第２の分割断片：配列番号１の２９３～１２６３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列；
（４）第１の分割断片：配列番号１の１～３７７番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列、第２の分割断片：配列番号１の３７８～１２６３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列；
（５）第１の分割断片：配列番号１の１～５１１番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列、第２の分割断片：配列番号１の５１２～１２６３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列；
（６）第１の分割断片：配列番号１の１～５３８番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列、第２の分割断片：配列番号１の５３９～１２６３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列；
（７）第１の分割断片：配列番号１の１～５６７番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列、第２の分割断片：配列番号１の５６８～１２６３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列；
（８）第１の分割断片：配列番号１の１～７５５番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列、第２の分割断片：配列番号１の７５６～１２６３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列；
（９）第１の分割断片：配列番号１の１～８３２番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列、第２の分割断片：配列番号１の８３３～１２６３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列；
（１０）第１の分割断片：配列番号１の１～８５４番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列、第２の分割断片：配列番号１の８５５～１２６３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列；
（１１）第１の分割断片：配列番号１の１～４９番目及び５１２～１２６３のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列を有し、且つ配列番号１の５１３番目に対応するアミノ酸ＹがＳに置換されている、第２の分割断片：配列番号１の５０～５１１番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列。
　項２１：項１～１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、及び／又は項２０のポリペプチドのコード配列を含む、ポリヌクレオチド。
　項２２：項２１に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
　項２３：項１から１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、項２０に記載のポリペプチドの組合せ、項２１に記載のポリヌクレオチド、及び／又は項２２に記載のベクターと、標的部位に対するガイドＲＮＡとを含む、組成物。
　項２４：項１～１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、項２０に記載のポリペプチドの組合せ、項２１に記載のポリヌクレオチド、及び／又は項２２に記載のベクターを含む、細胞。
　項２５：項１～１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、項２０に記載のポリペプチドの組合せ、項２１に記載のポリヌクレオチド、及び／又は項２２に記載のベクターを、細胞又は非ヒト生物に導入することを含む、ゲノム編集方法。
　項２６：さらに、標的部位に対するガイドＲＮＡを、前記細胞又は非ヒト生物に導入することを含む、項２５に記載のゲノム編集方法。
　項２７：標的部位がゲノム編集された細胞又は生物の製造方法であって、
項１～１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、項２０に記載のポリペプチドの組合せ、項２１に記載のポリヌクレオチド、及び／又は項２２に記載のベクターと、前記標的部位に対するガイドＲＮＡを、細胞又は非ヒト生物に導入することを含む、製造方法。
　項２８：項２７の製造方法で得られた、細胞又は生物。
　項２９：項１～１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、項２０に記載のポリペプチドの組合せ、項２１に記載のポリヌクレオチド、項２２に記載のベクター、及び／又は項２４に記載の細胞を含む、実験用ゲノム編集用組成物。
　項３０：項１～１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、項２０に記載のポリペプチドの組合せ、項２１に記載のポリヌクレオチド、項２２に記載のベクター、及び／又は項２４に記載の細胞を含む、農業用ゲノム編集用組成物。
　項３１：項１～１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、項２０に記載のポリペプチドの組合せ、項２１に記載のポリヌクレオチド、項２２に記載のベクター、及び／又は項２４に記載の細胞を含む、医療用ゲノム編集用組成物。
　項３２：項１～１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、項２０に記載のポリペプチドの組合せ、項２１に記載のポリヌクレオチド、項２２に記載のベクター、及び／又は項２４に記載の細胞を含む、畜産用ゲノム編集用組成物。
　項３３：項１～１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、項２０に記載のポリペプチドの組合せ、項２１に記載のポリヌクレオチド、項２２に記載のベクター、及び／又は項２４に記載の細胞を含む、水産用ゲノム編集用組成物。
　項３４：項１～１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、項２０に記載のポリペプチドの組合せ、項２１に記載のポリヌクレオチド、項２２に記載のベクター、及び／又は項２４に記載の細胞を含む、工業用ゲノム編集用組成物。
　本発明によれば、標的部位に対する切断活性がより高い変異型ＭＡＤ７タンパク質を提供することができる。また、これにより、野生型ＭＡＤ７タンパク質を使用する場合よりも高い効率でゲノム編集を行うことができる。
ST7、ST8-1、及びST8-2のドメイン及び変異部位を示す模式図である。 ST7のアミノ酸配列を示す。 ST8-1のアミノ酸配列を示す。 ST8-2のアミノ酸配列を示す。 試験例２のEGxxFP assayの結果を示す。縦軸はEGFPの値をRFPの値で標準化した値の相対値（当該値が高い程、切断活性が高いことを表す）を示す。横軸に、使用したＭＡＤ７発現ベクターを示す。ST7、ST8-1、ST8-2は図１を参照。グラフ上方に採用したPAM配列を示す。 試験例２のEGxxFP assayの結果を示す。図の説明は図５と同様である。 試験例２のEGxxFP assayの結果を示す。図の説明は図５と同様である。 試験例２のEGxxFP assayの結果を示す。図の説明は図５と同様である。 試験例２のEGxxFP assayの結果を示す。図の説明は図５と同様である。 試験例２のEGxxFP assayの結果を示す。図の説明は図５と同様である。 試験例２のEGxxFP assayの結果を示す。図の説明は図５と同様である。 試験例２のEGxxFP assayの結果を示す。図の説明は図５と同様である。 試験例２のEGxxFP assayの結果を示す。図の説明は図５と同様である。 試験例２のEGxxFP assayの結果を示す。図の説明は図５と同様である。 試験例２のEGxxFP assayの結果を示す。図の説明は図５と同様である。 試験例２のEGxxFP assayの結果を示す。図の説明は図５と同様である。 試験例２のEGxxFP assayの結果を示す。図の説明は図５と同様である。 試験例２のEGxxFP assayの結果を示す。図の説明は図５と同様である。 試験例２のEGxxFP assayの結果を示す。図の説明は図５と同様である。横軸中、ST7以外は、ＭＡＤ７発現ベクターがコードする変異型ＭＡＤ７タンパク質における配列番号１に対する変異部位を示す。 試験例２のEGxxFP assayの結果を示す。図の説明は図１９と同様である。 試験例２のEGxxFP assayの結果を示す。図の説明は図１９と同様である。 試験例２のEGxxFP assayの結果を示す。図の説明は図１９と同様である。 試験例２のEGxxFP assayの結果を示す。図の説明は図１９と同様である。 試験例２のEGxxFP assayの結果を示す。図の説明は図１９と同様である。 試験例２のEGxxFP assayの結果を示す。図の説明は図１９と同様である。 試験例４のIn vitro assayの結果を示す。縦軸は切断活性を示す。横軸に活性測定対象のタンパク質と測定温度を示す。グラフ上方に採用したPAM配列と反応時間を示す。 試験例４のIn vitro assayの結果を示す。図の説明は図２６と同様である。 試験例４のIn vitro assayの結果を示す。図の説明は図２６と同様である。 試験例４のIn vitro assayの結果を示す。図の説明は図２６と同様である。 試験例５のマウス受精卵を用いた変異導入効率の解析結果を示す。縦軸は変異導入効率を示し、横軸に、マウス受精卵に導入したタンパク質を示す。
　１．定義等
　本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
　本明細書において、アミノ酸配列の「同一性」とは、２以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある２つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるＦＡＳＴＡを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（Karlin S， Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264－2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high－scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873－7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（ＮＣＢＩ）のウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の「同一性」も上記に準じて定義される。
　本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；トレオニン、バリン、イソロイシンといったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
　本明細書において、ＤＮＡ、ＲＮＡなどのヌクレオチドには、次に例示するように、公知の化学修飾が施されていてもよい。ヌクレアーゼなどの加水分解酵素による分解を防ぐために、各ヌクレオチドのリン酸残基（ホスフェート）を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換することができる。また、各リボヌクレオチドの糖（リボース）の2位の水酸基を、-OR（Rは、例えば、CH3（2´-O-Me）、CH2CH2OCH3（2´-O-MOE）、CH2CH2NHC(NH)NH2、CH2CONHCH3、CH2CH2CN等を示す）に置換してもよい。さらに、塩基部分（ピリミジン、プリン）に化学修飾を施してもよく、例えば、ピリミジン塩基の5位へのメチル基やカチオン性官能基の導入、あるいは2位のカルボニル基のチオカルボニルへの置換などが挙げられる。さらには、リン酸部分やヒドロキシル部分が、例えば、ビオチン、アミノ基、低級アルキルアミン基、アセチル基等で修飾されたものなどを挙げることができるが、これに限定されない。また、ヌクレオチドの糖部の2´酸素と4´炭素を架橋することにより、糖部のコンフォーメーションをＮ型に固定したものであるＢＮＡ（ＬＮＡ）等もまた、好ましく用いられ得る。
　本明細書において、アミノ酸の変異は、具体的には、アミノ酸の欠失、置換、挿入、又は付加である。
　本明細書において、アミノ酸配列中のアミノ酸の位置は、アミノ酸一文字表記＋Ｎ末端アミノ酸から数えた場合のアミノ酸番号で示すことがある。例えば、「K169」は、Ｎ末端から169番目のアミノ酸であるリシンを示す。また、アミノ酸置換変異は、変異前のアミノ酸一文字表記＋Ｎ末端アミノ酸から数えた場合のアミノ酸番号＋変異後のアミノ酸一文字表記で示すことがある。例えば、「K169R」は、Ｎ末端から169番目のアミノ酸であるリシンのアルギニンへの置換変異を示す。
　２．変異型ＭＡＤ７タンパク質
　本発明は、その一態様において、配列番号１に示されるアミノ酸配列Ａが変異してなるアミノ酸配列Ｂを含み、且つ前記アミノ酸配列Ｂが、前記アミノ酸配列ＡにおけるK169及びD529のアミノ酸置換変異を含む、変異型ＭＡＤ７タンパク質（本明細書において、「本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質」と示すこともある。）に関する。以下に、これについて説明する。
　前記アミノ酸配列Ａ（配列番号１）は、ＭＡＤ７タンパク質のアミノ酸配列である。前記ＭＡＤ７タンパク質は、Eubacterium rectale由来のＣａｓ１２ａタンパク質である。前記ＭＡＤ７タンパク質は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムにおいて用いることができ、例えば、ガイドＲＮＡと複合体を形成した状態でゲノムＤＮＡの標的部位に結合し、該標的部位を切断することができる。
　前記アミノ酸配列Ｂは、前記アミノ酸配列Ａが変異してなるアミノ酸配列であって、変異として、前記アミノ酸配列ＡにおけるK169及びD529のアミノ酸置換変異を含む。前記アミノ酸配列Ｂは、K169及びD529のアミノ酸置換変異の組合せにより、標的部位に対する切断活性を相乗的に向上させることができる。
　K169の変異後のアミノ酸は、リシン以外の塩基性アミノ酸であることが好ましい。前記塩基性アミノ酸としては、例えば、アルギニン、ヒスチジン等が挙げられ、特に好ましくは、アルギニンが挙げられる。
　D529の変異後のアミノ酸は、塩基性アミノ酸であることが好ましい。前記塩基性アミノ酸としては、例えば、アルギニン、リシン、ヒスチジン等が挙げられ、特に好ましくは、アルギニンが挙げられる。
　具体例として、前記アミノ酸配列Ｂとしては、例えば、下記（ａ）のアミノ酸配列が挙げられる。
（ａ１）配列番号１のアミノ酸配列において、K169及びD529のアミノ酸置換変異を含むアミノ酸配列；
（ａ２）配列番号１のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、及び／又は、付加を有し、且つ前記（ａ１）のアミノ酸置換変異を含むアミノ酸配列；
（ａ３）配列番号１のアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有し、且つ前記（ａ１）のアミノ酸置換変異を含むアミノ酸配列。
　（ａ２）のアミノ酸配列において、「１若しくは数個」は、例えば、（ａ２）のアミノ酸配列を含むタンパク質が、標的部位に対する切断活性を有するアミノ酸配列である範囲であればよい。前記（ａ２）の「１若しくは数個」は、配列番号１のアミノ酸配列において、例えば、１～３７８個、１～３１５個、１～２５２個、１～１８９個、１～１２６個、１～６３個、１～５０個、１～３７個、１～２５個、１～１２個、１～６個、１～３個、１又は２個、１個である。「標的部位に対する切断活性」は、例えば、標的部位に標的化可能なガイドＲＮＡと複合体を形成した状態での切断活性である（以下、同様）。
　前記（ａ３）のアミノ酸配列において、「同一性」は、例えば、前記（ａ３）のアミノ酸配列を含むタンパク質が、標的部位に対する切断活性を有するアミノ酸配列である範囲であればよい。前記（ａ３）の「同一性」は、前記（ａ１）のアミノ酸配列に対して、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
　（ａ２）及び（ａ３）のアミノ酸配列は、前記（ａ１）のアミノ酸配列、すなわち、前記アミノ酸配列Ａにおけるアミノ酸置換変異が保存されているということもできる。（ａ２）及び（ａ３）のアミノ酸配列は、前記アミノ酸配列ＡにおけるK169及びD529以外の後述のアミノ酸置換変異を含んでもよい。
　前記アミノ酸配列Ｂは、変異として、K169及びD529のアミノ酸置換変異の組合せに加えてさらに、前記アミノ酸配列ＡにおけるY1086のアミノ酸置換変異を含むことが好ましい。前記アミノ酸配列Ｂは、Y1086のアミノ酸置換変異をさらに組み合わせることにより、標的部位に対する切断活性を相乗的に向上させることができる。
　Y1086の変異後のアミノ酸は、チロシン以外の芳香族アミノ酸であることが好ましい。前記芳香族アミノ酸としては、例えば、フェニルアラニン、トリプトファン等が挙げられ、特に好ましくは、フェニルアラニンが挙げられる。
　前記アミノ酸配列Ｂは、変異として、K169及びD529のアミノ酸置換変異の組合せに加えてさらに（特に、K169、D529、及びY1086のアミノ酸置換変異の組合せに加えてさらに）、前記アミノ酸配列ＡにおけるK970及びE1227からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸のアミノ酸置換変異を含むことが好ましい。前記アミノ酸配列Ｂは、当該アミノ酸置換変異をさらに組み合わせることにより、標的部位に対する切断活性を相乗的に向上させることができる。
　K970の変異後のアミノ酸は、親水性中性アミノ酸であることが好ましい。前記親水性中性アミノ酸としては、例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン等が挙げられ、特に好ましくは、アスパラギンが挙げられる。
　E1227の変異後のアミノ酸は、塩基性アミノ酸であることが好ましい。前記塩基性アミノ酸としては、例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン等が挙げられ、特に好ましくは、リシンが挙げられる。
　前記アミノ酸配列Ｂは、変異として、K169及びD529のアミノ酸置換変異の組合せに加えてさらに、アミノ酸配列ＡにおけるM961、K1098、F1198、Q1230、I1231、及びN1250からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸のアミノ酸置換変異を含むことが好ましい。前記アミノ酸配列Ｂは、当該アミノ酸置換変異をさらに組み合わせることにより、標的部位に対する切断活性の向上を図ることができる。
　M961の変異後のアミノ酸は、メチオニン以外の疎水性アミノ酸であることが好ましい。前記疎水性アミノ酸としては、例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン等が挙げられ、好ましくは、ロイシン、イソロイシン、バリン等が挙げられ、特に好ましくは、ロイシンが挙げられる。
　K1098の変異後のアミノ酸は、親水性中性アミノ酸であることが好ましい。前記親水性中性アミノ酸としては、例えば、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン等が挙げられ、特に好ましくは、アスパラギンが挙げられる。
　F1198の変異後のアミノ酸は、フェニルアラニン以外の芳香族アミノ酸であることが好ましい。前記芳香族アミノ酸としては、例えば、チロシン、トリプトファン等が挙げられ、特に好ましくは、チロシンが挙げられる。
　Q1230の変異後のアミノ酸は、塩基性アミノ酸であることが好ましい。前記塩基性アミノ酸としては、例えば、アルギニン、リシン、ヒスチジン等が挙げられ、特に好ましくは、アルギニンが挙げられる。
　I1231の変異後のアミノ酸は、イソロイシン以外の疎水性アミノ酸であることが好ましい。前記疎水性アミノ酸としては、例えば、バリン、ロイシン、グリシン、アラニン、プロリン、トリプトファン、フェニルアラニン、メチオニン等が挙げられ、特に好ましくは、バリンが挙げられる。
　N1250の変異後のアミノ酸は、アスパラギン以外の親水性中性アミノ酸であることが好ましい。前記親水性中性アミノ酸としては、例えば、セリン、グルタミン、トレオニン、チロシン、システイン等が挙げられ、特に好ましくは、セリンが挙げられる。
　前記アミノ酸配列Ｂは、標的部位に対する切断活性が著しく損なわれない限りにおいて、他のアミノ酸変異（例えば、置換、保存的置換）を含むことができる。前記他のアミノ酸変異の数は、例えば、１～５０個、１～２０個、１～１０個、又は１～５個である。前記アミノ酸配列Ｂにおいて、前記他のアミノ酸変異としては、例えば、C892、Y907、I922、Y966、S1000、T1014、K1040、L1056、I1065、K1067、T1083、F1163、D1200、K1236、D1238、F1241、S1242、及びK1247からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸のアミノ酸置換変異が挙げられる。より具体的には、例えば、C892Y、Y907H、I922L、Y966F、S1000G、T1014A、K1040T、L1056M、I1065V、K1067N、T1083A、F1163V、D1200N、K1236R、D1238G、F1241L、S1242R、K1247R等が挙げられる。
　前記アミノ酸配列Ｂは、前記アミノ酸配列ＡにK169及びD529のアミノ酸置換変異が導入されてなる変異型ＭＡＤ７タンパク質（アミノ酸配列Ｂ´）の分割型タンパク質断片のアミノ酸配列であることができる。前記分割型タンパク質断片とは、元のタンパク質配列の１カ所又は複数カ所（例えば、２～３、好ましくは２）で切断してなる断片であり、互いに再会合することにより元の活性を回復することができるものである。
　分割部位については、公知の情報（例えば、Ｃａｓ９タンパク質の分割技術）に基づいて決定することができる。例えば、以下のようにして決定することができる。
１. アミノ酸配列Ｂ´からhomology modelingにより立体構造を得る。２. ドメインをまたぐ領域毎に１箇所を切断サイトとして選ぶ。この際、複数のモデル構造を比較し、構造上不都合のないと考えられる候補を優先的に選択する。３. 結果的にｓｐｌｉｔ可能と考えられるサイトを選択する。
　もし、１箇所切断で良好な結果が得られない場合、複数箇所での切断と、それらの再接続に基づくｓｐｌｉｔタンパク質の設計に取り組むべきと考えられる。そのような設計パターンは複数考えられるが、例えば、配列をＡ／Ｂ／Ｃの３領域に分割した後ＡとＣを再接続し、実質的にＡＣ＋Ｂの２分割としたものである。
　具体的には、例えば、以下の１１種の分割部位及び２２種の分割断片（head及びtail）が挙げられる。表中の数字は、配列番号１中のアミノ酸番号である。
　前記アミノ酸配列Ｂとしては、好ましくは配列番号２又は配列番号３に示されるアミノ酸配列Ｂ１、又はアミノ酸配列Ｂ１と８０％以上（好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、よりさらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上、また１００％未満）の同一性を有するアミノ酸配列Ｂ２が挙げられる。
アミノ酸配列Ｂ１（変異型ＭＡＤ７タンパク質（ST8-1s）のアミノ酸配列、配列番号２）
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アミノ酸配列Ｂ１（変異型ＭＡＤ７タンパク質（ST8-2s）のアミノ酸配列、配列番号３）
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　アミノ酸配列Ｂは、下記（ｂ）のアミノ酸配列であってもよい。
（ｂ）下記（ｂ１）、（ｂ２）、又は（ｂ３）のアミノ酸配列：
（ｂ１）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｂ２）配列番号２のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、及び／又は付加され、且つ配列番号２のアミノ酸配列における１６９番目及び５２９番目のアミノ酸が保存されたアミノ酸配列；
（ｂ３）配列番号２のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有し、且つ配列番号２のアミノ酸配列における１６９番目及び５２９番目のアミノ酸が保存されたアミノ酸配列。
　前記（ｂ２）のアミノ酸配列において、「１若しくは数個」は、例えば、前記（ｂ２）のアミノ酸配列を含むタンパク質が、標的部位に対する切断活性を有するアミノ酸配列である範囲であればよい。前記（ｂ２）の「１若しくは数個」は、配列番号２のアミノ酸配列において、例えば、１～３７８個、１～３１５個、１～２５２個、１～１８９個、１～１２６個、１～６３個、１～５０個、１～３７個、１～２５個、１～１２個、１～６個、１～３個、１又は２個、１個である。
　前記（ｂ３）のアミノ酸配列において、「同一性」は、例えば、前記（ｂ３）のアミノ酸配列を含むタンパク質が、標的部位に対する切断活性を有するアミノ酸配列である範囲であればよい。前記（ｂ３）の「同一性」は、前記（ｂ１）のアミノ酸配列に対して、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
　前記（ｂ２）又は（ｂ３）において、さらに、配列番号２のアミノ酸配列における１０８６番目のアミノ酸が保存されていることが好ましい。前記（ｂ２）又は（ｂ３）のアミノ酸配列を含むタンパク質は、１０８６番目のアミノ酸が保存されていることにより、標的部位に対する切断活性を相乗的に向上させることができる。
　前記（ｂ２）又は（ｂ３）において、さらに、配列番号２のアミノ酸配列における９７０番目及び／又は１２２７番目のアミノ酸が保存されていることが好ましい。前記（ｂ２）又は（ｂ３）のアミノ酸配列を含むタンパク質は、９７０番目及び／又は１２２７番目のアミノ酸が保存されていることにより、標的部位に対する切断活性を相乗的に向上させることができる。
　アミノ酸配列Ｂは、下記（ｃ）のアミノ酸配列であってもよい。
（ｃ）下記（ｃ１）、（ｃ２）、又は（ｃ３）のアミノ酸配列：
（ｃ１）配列番号３のアミノ酸配列；
（ｃ２）配列番号３のアミノ酸配列において、１若しくは数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、及び／又は付加され、且つ配列番号３のアミノ酸配列における１６９番目及び５２９番目のアミノ酸が保存されたアミノ酸配列；
（ｃ３）配列番号３のアミノ酸配列に対して、７０％以上の同一性を有し、且つ配列番号３のアミノ酸配列における１６９番目及び５２９番目のアミノ酸が保存されたアミノ酸配列。
　前記（ｃ２）のアミノ酸配列において、「１若しくは数個」は、例えば、前記（ｃ２）のアミノ酸配列を含むタンパク質が、標的部位に対する切断活性を有するアミノ酸配列である範囲であればよい。前記（ｃ２）の「１若しくは数個」は、配列番号３のアミノ酸配列において、例えば、１～３７８個、１～３１５個、１～２５２個、１～１８９個、１～１２６個、１～６３個、１～５０個、１～３７個、１～２５個、１～１２個、１～６個、１～３個、１又は２個、１個である。
　前記（ｃ３）のアミノ酸配列において、「同一性」は、例えば、前記（ｃ３）のアミノ酸配列を含むタンパク質が、標的部位に対する切断活性を有するアミノ酸配列である範囲であればよい。前記（ｃ３）の「同一性」は、前記（ｃ１）のアミノ酸配列に対して、例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上である。
　前記（ｃ２）又は（ｃ３）において、さらに、配列番号３のアミノ酸配列における１０８６番目のアミノ酸が保存されていることが好ましい。前記（ｃ２）又は（ｃ３）のアミノ酸配列を含むタンパク質は、１０８６番目のアミノ酸が保存されていることにより、標的部位に対する切断活性を相乗的に向上させることができる。
　前記（ｃ２）又は（ｃ３）において、さらに、配列番号３のアミノ酸配列における９７０番目及び／又は１２２７番目のアミノ酸が保存されていることが好ましい。前記（ｃ２）又は（ｃ３）のアミノ酸配列を含むタンパク質は、９７０番目及び／又は１２２７番目のアミノ酸が保存されていることにより、標的部位に対する切断活性を相乗的に向上させることができる。
　本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質は、標的部位に対する切断活性が著しく損なわれない限りにおいて、アミノ酸配列Ｂ以外の他のアミノ酸配列、例えば、核局在化シグナル配列、タンパク質タグ、蛍光タンパク質、発光タンパク質、プロテアーゼ認識配列（TEVプロテアーゼ認識配列等）等のシグナル配列等のタンパク質又はペプチドが付加されたものであってもよい。前記タンパク質タグとしては、例えば、ビオチン、Hisタグ、FLAGタグ、Haloタグ、MBPタグ、HAタグ、Mycタグ、V5タグ、PAタグ等が挙げられる。
　本発明の好ましい一態様において、本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質は、アミノ酸配列Ｂ及び核局在化シグナル配列を含むことが好ましい。前記核局在化シグナル配列としては、例えば、SV40核局在化シグナル配列、ヌクレオプラスミン核局在化シグナル等が挙げられる。本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質が前記核局在化シグナル配列を含む場合、アミノ酸配列ＢのＣ末端側に前記核局在化シグナル配列が配置されていることが好ましい。
　本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質は、標的部位に対する切断活性が著しく損なわれない限りにおいて、化学修飾されたものであってもよい。
　本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質は、C末端がカルボキシル基（－COOH）、カルボキシレート（－COO－）、アミド（－CONH2）又はエステル（－COOR）の何れであってもよい。
　ここでエステルにおけるRとしては、例えば、メチル、エチル、n－プロピル、イソプロピル、n－ブチルなどのC1－6アルキル基；例えば、シクロペンチル、シクロヘキシルなどのC3－8シクロアルキル基；例えば、フェニル、α－ナフチルなどのC6－12アリール基；例えば、ベンジル、フェネチルなどのフェニル－C1－2アルキル基；α－ナフチルメチルなどのα－ナフチル－C1－2アルキル基などのC7－14アラルキル基；ピバロイルオキシメチル基などが用いられる。
　本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質は、Ｃ末端以外のカルボキシル基（又はカルボキシレート）が、アミド化又はエステル化されていてもよい。この場合のエステルとしては、例えば、上記Ｃ末端のエステルなどが用いられる。
　さらに、本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質には、Ｎ末端のアミノ酸残基のアミノ基が保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイルなどのC1－6アシル基など）で保護されているもの、生体内で切断されて生成し得るN末端のグルタミン残基がピログルタミン酸化したもの、分子内のアミノ酸の側鎖上の置換基（例えば、－OH、－SH、アミノ基、イミダゾール基、インドール基、グアニジノ基など）が適当な保護基（例えば、ホルミル基、アセチル基などのC1－6アルカノイル基などのC1－6アシル基など）で保護されているもの、あるいは糖鎖が結合した、いわゆる糖蛋白質などの複合蛋白質なども包含される。
　本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質は、酸又は塩基との塩の形態であってもよい。前記塩は、特に限定されず、酸性塩、塩基性塩のいずれも採用することができる。前記酸性塩は、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、硝酸塩、リン酸塩等の無機酸塩；酢酸塩、プロピオン酸塩、酒石酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、パラトルエンスルホン酸塩等の有機酸塩；アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩等のアミノ酸塩等が挙げられる。また、前記塩基性塩は、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩等が挙げられる。
　本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質は、溶媒和物の形態であってもよい。前記溶媒は、特に限定されず、例えば、水、エタノール、グリセロール、酢酸等が挙げられる。
　本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質の標的部位に対する切断活性は、実施例に記載の方法で測定することができる。本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質の標的部位に対する切断活性は、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列ＡからなるＭＡＤ７タンパク質の標的部位に対する切断活性100％に対して、好ましくは150％以上、より好ましくは200％以上、さらに好ましくは300％以上、よりさらに好ましくは400％以上である。当該範囲の中でも、上記活性は、好ましくは500％以上、より好ましくは600％以上、さら好ましくは700％以上、よりさらに好ましくは800％以上、とりわけ好ましくは900％以上、特に好ましくは1000％以上である。本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質の標的部位に対する切断活性は、例えば、配列番号１に示されるアミノ酸配列ＡからなるＭＡＤ７タンパク質の標的部位に対する切断活性に対して、1000％以下、900％以下、800％以下、700％以下、600％以下、500％以下、400％以下、300％以下、200％以下、又は150％以下である。本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質の標的部位に対する切断活性の範囲は、例えば、上述の上限値及び下限値の任意の組合せである。
　本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質は、公知の遺伝子工学的手法に従って容易に製造することができる。本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質は、例えば、ＰＣＲ、制限酵素切断、ＤＮＡ連結技術、in vitro転写・翻訳技術、リコンビナントタンパク質作製技術等を利用して製造することができる。
　３．ポリヌクレオチド、細胞
　本発明は、その一態様において、本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質のコード配列を含む、ポリヌクレオチド（本明細書において、「本発明のポリヌクレオチド」と示すこともある。）、本発明のポリヌクレオチド、及び本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質からなる群より選択される少なくとも１種を含む、細胞（本明細書において、「本発明の細胞」と示すこともある。）に関する。以下に、これらについて説明する。
　本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質のコード配列は、本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質をコードする塩基配列からなるポリヌクレオチドである限り、特に制限されない。
　本発明のポリヌクレオチドは、その一態様において、本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質の発現カセットを含む。
　本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質の発現カセットは、細胞内で本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質を発現可能なポリヌクレオチドである限り、特に制限されない。本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質の発現カセットの典型例としては、プロモーター、及びそのプロモーターの制御下に配置された本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質のコード配列を含むポリヌクレオチドが挙げられる。
　本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質の発現カセットに含まれるプロモーターとしては、特に制限されず、対象細胞に応じて適宜選択することができる。前記プロモーターとしては、例えば、pol II系プロモーターを各種使用することができる。前記pol II系プロモーターとしては、特に制限されないが、例えば、CMVプロモーター、EF1プロモーター、SV40プロモーター、MSCVプロモーター等が挙げられる。その他にも、前記プロモーターとして、例えば、trcやtac等のトリプトファンプロモーター、lacプロモーター、T7プロモーター、T5プロモーター、T3プロモーター、SP6プロモーター、アラビノース誘導プロモーター、コールドショックプロモーター、テトラサイクリン誘導性プロモーター等が挙げられる。
　本発明のポリヌクレオチドは、必要に応じて、他のエレメント（例えば、マルチクローニングサイト（ＭＣＳ）、薬剤耐性遺伝子、複製起点、エンハンサー配列、リプレッサー配列、インスレーター配列、レポータータンパク質（例えば、蛍光タンパク質等）コード配列、薬剤耐性遺伝子コード配列、ガイドＲＮＡ発現カセットなどが挙げられる。）を含んでいてもよい。
　本発明のポリヌクレオチドは、ベクターの形態であることができる。使用目的（クローニング、タンパク質の発現）に応じて、また宿主細胞の種類を考慮して適当なベクターが選択される。大腸菌を宿主とするベクターとしてはＭ１３ファージ又はその改変体、λファージ又はその改変体、pBR322又はその改変体（pB325、pAT153、pUC8など）等、酵母を宿主とするベクターとしてはpYepSec1、pMFa、pYES2、pPIC3.5K等、昆虫細胞を宿主とするベクターとしてはpAc、pVL等、哺乳類細胞を宿主とするベクターとしてはpcDNA、pCDM8、pMT2PC等を例示することができる。
　本発明の細胞は、本発明のポリヌクレオチド、及び本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質からなる群より選択される少なくとも１種を含む限り、特に制限されない。前記細胞としては、例えば、Escherichia coli K12等の大腸菌、Bacillus subtilis MI114等のバチルス属細菌、Saccharomyces cerevisiae AH22等の酵母、Spodoptera frugiperda 由来の Sf細胞系若しくはTrichoplusia ni由来のHighFive細胞系、嗅神経細胞等の昆虫細胞、COS7細胞等の動物細胞等が挙げられる。前記動物細胞としては、好ましくは、哺乳動物由来の培養細胞、具体的には、COS7細胞、CHO細胞、HEK293細胞、HEK293FT細胞、Hela細胞、PC12細胞、N1E-115細胞、SH-SY5Y細胞等が挙げられる。
　本発明の細胞が本発明のポリヌクレオチドを含む場合は、その一態様において、本発明のポリヌクレオチドから本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質を発現している。
　４．ゲノム編集方法
　本発明は、その一態様において本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質、及び本発明のポリヌクレオチドからなる群より選択される少なくとも１種を細胞又は非ヒト生物に導入することを含む、ゲノム編集方法、に関する。
　ゲノム編集対象細胞及び生物は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムによりゲノム編集可能な細胞及び生物である限り、特に制限されない。前記ゲノム編集対象細胞としては、各種組織由来又は各種性質の細胞、例えば、血液細胞、造血幹細胞・前駆細胞、配偶子（精子、卵子）、受精卵、線維芽細胞、上皮細胞、血管内皮細胞、神経細胞、肝細胞、ケラチン生成細胞、筋細胞、表皮細胞、内分泌細胞、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、組織幹細胞、がん細胞等が挙げられる。前記ゲノム編集対象生物としては、例えば、ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギ等の哺乳類動物；ヘビ、トカゲ等の爬虫類；アフリカツメガエル等の両生類動物；ゼブラフィッシュ、メダカ、トラフグ等の魚類動物；ホヤ等の脊索動物；ショウジョウバエ、カイコ等の節足動物；等の動物：シロイヌナズナ、イネ、コムギ、タバコ等の植物：ワカメ、ノリ等の藻類：酵母、アカパンカビ等の菌類：大腸菌、枯草菌、藍藻等の細菌等が挙げられる。
　導入方法は、特に制限されず、対象細胞又は生物の種類、材料の種類（核酸であるのか、タンパク質であるのか等）に応じて、適宜選択することができる。前記導入方法としては、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、DEAE-デキストラン処理、リポフェクション、ナノ粒子媒介性トランスフェクション、ウイルス媒介性核酸送達等が挙げられる。
　必要に応じて、ガイドＲＮＡの発現カセット、ドナーＤＮＡ等、ゲノム編集に必要な材料を導入することができる。
　導入してから、一定時間経過後に、対象細胞又は対象生物内でゲノム編集が起こるので、前記対象細胞又は前記対象生物を回収することにより、ゲノム編集された細胞又は生物を得ることができる。
　５．ゲノム編集用組成物
　本発明は、その一態様において、本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質、本発明のポリヌクレオチド、及び本発明の細胞からなる群より選択される少なくとも１種を含む、ゲノム編集用組成物（本明細書において、「本発明のゲノム編集用組成物」と示すこともある。）、に関する。以下に、これについて説明する。
　本発明のゲノム編集用組成物は、本発明の変異型ＭＡＤ７タンパク質、本発明のポリヌクレオチド、及び本発明の細胞からなる群より選択される少なくとも１種を含む限り、特に制限されず、これのみであってもよいし、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。前記他の成分としては、特に限定されるものではないが、例えば、基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。前記ゲノム編集用組成物は、必要に応じて、ガイドRNA発現カセットを含むポリヌクレオチドを含んでいてもよい。また、必要に応じて、ドナーポリヌクレオチドを含んでいてもよい。
　本発明のゲノム編集用組成物はキットの形態であることもできる。この場合、必要に応じて核酸導入試薬、緩衝液等、本発明の前記ゲノム編集方法の実施に必要な他の材料、試薬、器具等を適宜含んでいてもよい。本発明の前記ゲノム編集方法の実施に必要な他の材料としては、ゲノム編集用キットは、必要に応じて、ガイドRNA発現カセットを含むポリヌクレオチドを含んでいてもよく、必要に応じて、ドナーポリヌクレオチドを含んでいてもよい。
　本発明のゲノム編集用組成物は、各種用途に用いることができる。本発明のゲノム編集用組成物は、例えば、実験用、農業用、医療用、畜産用、水産用、工業用とすることができる。前記実験用は、試験・研究のために用いられるものであり、農業や医療等の実用目的ではないことである。前記農業用とは、例えば、ゲノム編集産物が農産物として利用される場合を包含する。前記医療用とは、例えば、ゲノム編集が生物の状態又は疾患の改善又は治療等に利用される場合を包含する。前記畜産用とは、例えば、ゲノム編集産物が畜産動物として利用される場合を包含する。前記水産用とは、例えば、ゲノム編集産物が水産動物として利用される場合を包含する。前記工業用とは、例えば、ゲノム編集産物が工業原料（線維等の素材の産生生物、酒類等の発酵用微生物）として利用される場合を包含する。
　以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
　試験例１．発現ベクターの調製 　試験例１－１．ＭＡＤ７発現ベクターの調製
　ＭＡＤ７タンパク質（配列番号１）のＣ末端にNLS（配列番号４）、ＧＳリンカー、及び3×HAタグ（配列番号５）を付加してなるタンパク質（ST7、配列番号８：図１及び２）のコード配列、変異型ＭＡＤ７タンパク質（ST8-1s、配列番号２：配列番号１にK169R、D529R、K970N、及びY1086Fが導入されてなる配列）のC末端にNLS（配列番号４）、ＧＳリンカー、及び3×HAタグ（配列番号５）を付加してなるタンパク質（ST8-1、配列番号９：図１及び３）のコード配列、変異型ＭＡＤ７タンパク質（ST8-2s、配列番号３：配列番号１にK169R、D529R、Y1086F、及びE1227Kが導入されてなる配列）のＣ末端にNLS（配列番号4）、ＧＳリンカー、及び3×HAタグ（配列番号５）を付加してなるタンパク質（ST8-2、配列番号１０：図１及び４）のコード配列を、発現ベクターのCMVプロモーターの下流に挿入し、ＭＡＤ７発現ベクターを得た。
ＮＬＳのアミノ酸配列（配列番号４）
KRPAATKKAGQAKKKK
３×ＨＡタグのアミノ酸配列（配列番号５）
YPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA
ＳＴ７のアミノ酸配列（配列番号８）
MNNGTNNFQNFIGISSLQKTLRNALIPTETTQQFIVKNGIIKEDELRGENRQILKDIMDDYYRGFISETLSSIDDIDWTSLFEKMEIQLKNGDNKDTLIKEQTEYRKAIHKKFANDDRFKNMFSAKLISDILPEFVIHNNNYSASEKEEKTQVIKLFSRFATSFKDYFKNRANCFSADDISSSSCHRIVNDNAEIFFSNALVYRRIVKSLSNDDINKISGDMKDSLKEMSLEEIYSYEKYGEFITQEGISFYNDICGKVNSFMNLYCQKNKENKNLYKLQKLHKQILCIADTSYEVPYKFESDEEVYQSVNGFLDNISSKHIVERLRKIGDNYNGYNLDKIYIVSKFYESVSQKTYRDWETINTALEIHYNNILPGNGKSKADKVKKAVKNDLQKSITEINELVSNYKLCSDDNIKAETYIHEISHILNNFEAQELKYNPEIHLVESELKASELKNVLDVIMNAFHWCSVFMTEELVDKDNNFYAELEEIYDEIYPVISLYNLVRNYVTQKPYSTKKIKLNFGIPTLADGWSKSKEYSNNAIILMRDNLYYLGIFNAKNKPDKKIIEGNTSENKGDYKKMIYNLLPGPNKMIPKVFLSSKTGVETYKPSAYILEGYKQNKHIKSSKDFDITFCHDLIDYFKNCIAIHPEWKNFGFDFSDTSTYEDISGFYREVELQGYKIDWTYISEKDIDLLQEKGQLYLFQIYNKDFSKKSTGNDNLHTMYLKNLFSEENLKDIVLKLNGEAEIFFRKSSIKNPIIHKKGSILVNRTYEAEEKDQFGNIQIVRKNIPENIYQELYKYFNDKSDKELSDEAAKLKNVVGHHEAATNIVKDYRYTYDKYFLHMPITINFKANKTGFINDRILQYIAKEKDLHVIGIDRGERNLIYVSVIDTCGNIVEQKSFNIVNGYDYQIKLKQQEGARQIARKEWKEIGKIKEIKEGYLSLVIHEISKMVIKYNAIIAMEDLSYGFKKGRFKVERQVYQKFETMLINKLNYLVFKDISITENGGLLKGYQLTYIPDKLKNVGHQCGCIFYVPAAYTSKIDPTTGFVNIFKFKDLTVDAKREFIKKFDSIRYDSEKNLFCFTFDYNNFITQNTVMSKSSWSVYTYGVRIKRRFVNGRFSNESDTIDITKDMEKTLEMTDINWRDGHDLRQDIIDYEIVQHIFEIFRLTVQMRNSLSELEDRDYDRLISPVLNENNIFYDSAKAGDALPKDADANGAYCIALKGLYEIKQITENWKEDGKFSRDKLKISNKDWFDFIQNKRYLKRPAATKKAGQAKKKKGSYPYDVPDYAYPYDVPDYAYPYDVPDYA
ＳＴ８－１のアミノ酸配列（配列番号９）
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ＳＴ８－２のアミノ酸配列（配列番号１０）
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　また、配列番号１に各種変異（変異部位については、データを示す図中に示す。）が導入されてなる配列のＣ末端にNLS（配列番号４）及び3×HAタグ（配列番号５）を付加してなるタンパク質のコード配列を、発現ベクターのCMVプロモーターの下流に挿入し、ＭＡＤ７発現ベクターを得た。
　試験例１－２．crRNA発現ベクターの調製
　U6 promoterの下流にscaffold-crRNA-terminator配列が挿入されたベクターを調製した。
　試験例１－３．RFP発現ベクターの調製
　EF-1α promoterの下流に赤色蛍光タンパク質（RFP）が挿入されたベクターを調製した。
　試験例１－４．EGxxFP assay検出用ベクターの調製
　CAG promoterの下流にEGFP アミノ基末端領域、PAM配列を含む切断される塩基配列、EGFP カルボキシル基末端領域の順番で挿入されたベクターを調製した。当該ベクターは、ゲノム編集により切断されるとEGFP配列の修復が起こり、緑色蛍光が観察されるようにデザインされている。
　試験例２．EGxxFP assay
　各ＭＡＤ７発現ベクター（試験例１）を用いて、変異型ＭＡＤ７タンパク質の標的部位に対する切断活性を測定した。具体的には以下のようにして行った。
（１）HEK293T細胞を24 well plateに撒き、1.5日間から2日間、37℃でCO2インキュベーター内にて培養した。培地はDMEM (High Glucose)（Sigma-Aldrich）、10%FBS（CAPRICORN）、1xペニシリンーストレプトマイシン混合溶液（ナカライテクス）を使用した。
（２）以下の混合液を作製した。
Ａ液：Opti-MEM（Gibco）600μl、2ng/ 2nl RFP発現ベクター 0.6μl、2 ng/ 2nl crRNA発現ベクター1.2μl、2ng/ 2nl EGxxFP assay検出用ベクター3μl
Ｂ液：Opti-MEM 600μl、Turbofect（Thermo Fisher Scientific） 24μl
（３）Ａ液を各チューブ75μlずつ分注し、0.4 ng/nl ST7又はST8発現ベクターを0.75μl混合した。
（４）(３)で作製した液にＢ液75μlを加え、よく混合させ、室温で20分静置した。
（５）24 well plateの培地を新しい培地に交換した。
（６）24well plateの各wellに（４）で作製した液50μlを加えて、軽くゆすった。
（７）1.5日から2日間培養した後、トリプシン処理により細胞を回収し、Passive Lysis 5x Buffer（Promega）の希釈液を加えて激しく撹拌し、細胞を破壊した。
（８）12000 rpm、5分で遠心し、上清を回収した。各サンプルの上清50μlを96 well plateの2 wellに加え、上清に含まれるEGFPとRFPの蛍光強度をプレートリーダー(CYTATION3 imaging reader (BioTek))で検出した。
（９）EGFPの値をRFPの値で標準化した。ＭＡＤ７発現ベクターを含まないサンプルをネガティブコントロールとし、各サンプルの値から、ネガティブコントロールの値を引いた。ST7の値を１とし、それ以外のサンプルの値はST7の相対値を示した。各データは個体数３で、誤差範囲は標準誤差で示した。結果を図５～２５に示す。
　試験例３．変異型ＭＡＤ７タンパク質の作製
　大腸菌タンパク質発現系ｐＥＴシステムを用いてＭＡＤ７ならびに、変異型ＭＡＤ７タンパク質の精製を行った。具体的には以下のようにして行った。
（１）ＭＡＤ７若しくは変異型ＭＡＤ７のコード配列（試験例１）を含むｐＥＴ発現ベクターをRosettaTM (DE3) Competent cells(Sigma-Aldrich)に形質転換し、カナマイシン硫酸塩を含んだＬＢ寒天培地上で培養した。３７℃で１日間インキュベートさせ、大腸菌コロニーの形成を確認した。
（２）形成したコロニーから１つのコロニーを選出し、カナマイシン硫酸塩を含んだＬＢ液体培地10mlで37℃ 180rpm 6時間培養した(preculture)。
（３）バッフル付三角フラスコ１０個にそれぞれprecultureしたＬＢ培養液 1mlと100mlのカナマイシン硫酸塩を含んだＬＢ液体培地を入れ、37℃、180rpm、8時間の条件で、インキュベートした。
（４）氷上で15分静置した後、最終濃度0.5mMになるようにＩＰＴＧ（Merk）を添加し、25℃、130rpm、6時間インキュベートした。
（５）4℃、3000g、10分の条件で、遠心し上清を除去、さらに大腸菌ペレットをＰＢＳで洗浄した。
（６）大腸菌ペレットをリゾチーム処理ならびに超音波処理し、4℃、70000xg、30分の条件で、遠心した後、可溶性画分を回収した。
（７）可溶性画分をNGCTM クロマトグラフィーシステム(Bio-Rad)を使用したカラムクロマトグラフィーで分離・精製を行った。
（８）分離・精製したＭＡＤ７ならびに変異型ＭＡＤ７は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥで電気泳動した後、ＣＢＢ染色（Wako）で確認した。
　試験例４．In vitro assay
（１）ＣＢＢ染色により、ＭＡＤ７タンパク質（試験例３）とST8.2タンパク質（試験例３）の量比を算出した。
（２）同濃度のＭＡＤ７タンパク質溶液10μlとST8.2タンパク質溶液10μl、NEBuffer 3.1 2μl、crRNA [配列: /AlTR1/rUrArArUrUrUrCrUrArCrUrCrUrUrGrUrArGrArUrUrGrUrCrArCrCrArArUrCrCrUrGrUrCrCrCrUrArG（配列番号6）/AlTR2/](100 ng/μl) 3μl、滅菌水を混合し、25℃で10分静置した。
（３）500ngになるように、基質ＤＮＡを加え、反応液量を20μlにした。
（４）37℃、30℃、25℃の条件で、１時間と２４時間反応させた。
（５）4μl 10 x loading bufferを加えた。
（６）２％アガロースゲルで10μlの反応溶液を泳動した。
（７）ゲル撮影装置で撮影し、ImageJで切断されていない切断用ＤＮＡ量を測定した。
（８）100x(（コントロールの基質ＤＮＡ量－切断されていない基質ＤＮＡ量）／コントロールの基質ＤＮＡ量)の計算式で、切断活性を算出した。結果を図２６～２９に示す。
　試験例５．マウス受精卵　変異導入効率の解析
（１）マウス受精卵に同濃度のＭＡＤ７又はST8.2とマウスRosa26遺伝子座に設計したcrRNA[配列: /AlTR1/rUrArArUrUrUrCrUrArCrUrCrUrUrGrUrArGrArUrCrArCrCrUrGrUrUrCrArArUrUrCrCrCrCrUrGrCrA/AlTR2/]（配列番号７）をＧＥＥＰ法（特開2017-184639号公報）により挿入した。
（２）エレクトロポレーションを行った受精卵を、37℃の条件で、CO2インキュベーターでE3.5-4.5まで培養し、桑実胚又は胚盤胞に発生した受精卵を個別に回収した。
（３）回収した受精卵よりＤＮＡを抽出した。
（４）Rosa26遺伝子座に設計したｃｒＲＮＡの標的配列を検出するプライマーを用いてＰＣＲを行った。
（５）Miseq reagent nano kit v2を用いてＤＮＡシーケンス解析を行った。
（６）Rosa26遺伝子座において、ゲノムＤＮＡの切断に起因する変異を確認した。
（７）100×（Rosa26遺伝子座においてゲノムＤＮＡの切断に起因する変異が検出された検体数／全検体数）の計算式で、切断効率を算出した。結果を図３０に示す。
　以上、実施形態を参照して本発明を説明したが、本発明は、上記実施形態に限定されるものではない。本発明の構成や詳細には、本発明のスコープ内で当業者が理解しうる様々な変更をできる。
　この出願は、２０２２年１月２８日に出願された日本出願特願２０２２－１００９１４を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

Claims (34)

  1. 配列番号１に示されるアミノ酸配列Ａが変異してなるアミノ酸配列Ｂを含み、且つ前記アミノ酸配列Ｂが、前記アミノ酸配列ＡにおけるK169及びD529のアミノ酸置換変異を含む、変異型ＭＡＤ７タンパク質。
  2. 前記アミノ酸配列Ｂは、下記（ａ１）、（ａ２）、又は（ａ３）のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質：
    （ａ１）配列番号１のアミノ酸配列において、K169及びD529のアミノ酸置換変異を含むアミノ酸配列；
    （ａ２）配列番号１のアミノ酸配列において、１～１２６個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、及び／又は、付加を有し、且つ前記（ａ１）のアミノ酸置換変異を含むアミノ酸配列；
    （ａ３）配列番号１のアミノ酸配列において、配列番号１のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有し、且つ前記（ａ１）のアミノ酸置換変異を含むアミノ酸配列。
  3. 前記アミノ酸置換変異において、K169の変異後のアミノ酸がリシン以外の塩基性アミノ酸であり、D529の変異後のアミノ酸が塩基性アミノ酸である、請求項１又は２に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
  4. 前記アミノ酸置換変異において、K169の変異後のアミノ酸がアルギニンであり、且つD529の変異後のアミノ酸がアルギニンである、請求項１～３のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
  5. 前記アミノ酸配列Ｂが、前記アミノ酸配列ＡにおけるY1086のアミノ酸置換変異を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
  6. 前記アミノ酸置換変異において、Y1086の変異後のアミノ酸がチロシン以外の芳香族アミノ酸である、請求項５に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
  7. 前記アミノ酸置換変異において、Y1086の変異後のアミノ酸がフェニルアラニンである、請求項５又は６に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
  8. 前記アミノ酸配列Ｂが、前記アミノ酸配列ＡにおけるK970及びE1227からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸のアミノ酸置換変異を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
  9. 前記アミノ酸置換変異において、K970の変異後のアミノ酸が親水性中性アミノ酸であり、且つ／或いはE1227の変異後のアミノ酸が塩基性アミノ酸である、請求項８に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
  10. 前記アミノ酸置換変異において、K970の変異後のアミノ酸がアスパラギンであり、且つ／或いはE1227の変異後のアミノ酸がリシンである、請求項８又は９に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
  11. 前記アミノ酸配列Ｂが、前記アミノ酸配列ＡにおけるM961、K1098、F1198、Q1230、I1231、及びN1250からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸のアミノ酸置換変異を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
  12. 前記アミノ酸配列Ｂが、前記アミノ酸配列ＡにおけるC892、Y907、I922、Y966、S1000、T1014、K1040、L1056、I1065、K1067、T1083、F1163、D1200、K1236、D1238、F1241、S1242、及びK1247からなる群より選択される少なくとも１種のアミノ酸のアミノ酸置換変異を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
  13. 前記アミノ酸配列Ｂは、下記（ｂ１）、（ｂ２）、又は（ｂ３）のアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質：
    （ｂ１）配列番号２のアミノ酸配列；
    （ｂ２）配列番号２のアミノ酸配列において、１～１２６個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、及び／又は付加され、且つ配列番号２のアミノ酸配列における１６９番目及び５２９番目のアミノ酸が保存されたアミノ酸配列；
    （ｂ３）配列番号２のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有し、且つ配列番号２のアミノ酸配列における１６９番目及び５２９番目のアミノ酸が保存されたアミノ酸配列。
  14. 前記（ｂ２）又は（ｂ３）において、さらに、配列番号２のアミノ酸配列における１０８６番目のアミノ酸が保存されている、請求項１３に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
  15. 前記（ｂ２）又は（ｂ３）において、さらに、配列番号２のアミノ酸配列における９７０番目及び／又は１２２７番目のアミノ酸が保存されている、請求項１３又は１４に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
  16. 前記アミノ酸配列Ｂは、下記（ｃ１）、（ｃ２）、又は（ｃ３）のアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質：
    （ｃ１）配列番号３のアミノ酸配列；
    （ｃ２）配列番号３のアミノ酸配列において、１～１２６個のアミノ酸が欠失、挿入、置換、及び／又は付加され、且つ配列番号３のアミノ酸配列における１６９番目及び５２９番目のアミノ酸が保存されたアミノ酸配列；
    （ｃ３）配列番号３のアミノ酸配列に対して、９０％以上の同一性を有し、且つ配列番号３のアミノ酸配列における１６９番目及び５２９番目のアミノ酸が保存されたアミノ酸配列。
  17. 前記（ｃ２）、又は（ｃ３）において、さらに、配列番号３のアミノ酸配列における１０８６番目のアミノ酸が保存されている、請求項１３又は１４に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
  18. 前記（ｃ２）、又は（ｃ３）において、さらに、配列番号３のアミノ酸配列における９７０番目及び／又は１２２７番目のアミノ酸が保存されている、請求項１６又は１７に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
  19. 前記アミノ酸配列Ｂ及び核局在化シグナル配列を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質。
  20. 請求項１から１８のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質の第１の分割断片と、第２の分割断片とを含み、
    前記第１の分割断片及び前記第２の分割断片は、それぞれ、下記（１）～（１０）及び（１１）からなる群から選択されるアミノ酸配列からなるポリペプチドである、ポリペプチドの組合せ：
    （１）第１の分割断片：配列番号１の１～１８２番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列、第２の分割断片：配列番号１の１８３～１２６３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列；
    （２）第１の分割断片：配列番号１の１～２７３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列、第２の分割断片：配列番号１の２７４～１２６３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列；
    （３）第１の分割断片：配列番号１の１～２９２番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列、第２の分割断片：配列番号１の２９３～１２６３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列；
    （４）第１の分割断片：配列番号１の１～３７７番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列、第２の分割断片：配列番号１の３７８～１２６３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列；
    （５）第１の分割断片：配列番号１の１～５１１番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列、第２の分割断片：配列番号１の５１２～１２６３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列；
    （６）第１の分割断片：配列番号１の１～５３８番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列、第２の分割断片：配列番号１の５３９～１２６３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列；
    （７）第１の分割断片：配列番号１の１～５６７番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列、第２の分割断片：配列番号１の５６８～１２６３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列；
    （８）第１の分割断片：配列番号１の１～７５５番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列、第２の分割断片：配列番号１の７５６～１２６３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列；
    （９）第１の分割断片：配列番号１の１～８３２番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列、第２の分割断片：配列番号１の８３３～１２６３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列；
    （１０）第１の分割断片：配列番号１の１～８５４番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列、第２の分割断片：配列番号１の８５５～１２６３番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列；
    （１１）第１の分割断片：配列番号１の１～４９番目及び５１２～１２６３のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列を有し、且つ配列番号１の５１３番目に対応するアミノ酸ＹがＳに置換されている、第２の分割断片：配列番号１の５０～５１１番目のアミノ酸配列と対応するアミノ酸配列。
  21. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、及び／又は請求項２０のポリペプチドのコード配列を含む、ポリヌクレオチド。
  22. 請求項２１に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
  23. 請求項１から１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、請求項２０に記載のポリペプチドの組合せ、請求項２１に記載のポリヌクレオチド、及び／又は請求項２２に記載のベクターと、標的部位に対するガイドＲＮＡとを含む、組成物。
  24. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、請求項２０に記載のポリペプチドの組合せ、請求項２１に記載のポリヌクレオチド、及び／又は請求項２２に記載のベクターを含む、細胞。
  25. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、請求項２０に記載のポリペプチドの組合せ、請求項２１に記載のポリヌクレオチド、及び／又は請求項２２に記載のベクターを、細胞又は非ヒト生物に導入することを含む、ゲノム編集方法。
  26. さらに、標的部位に対するガイドＲＮＡを、前記細胞又は非ヒト生物に導入することを含む、請求項２５に記載のゲノム編集方法。
  27. 標的部位がゲノム編集された細胞又は生物の製造方法であって、
    請求項１～１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、請求項２０に記載のポリペプチドの組合せ、請求項２１に記載のポリヌクレオチド、及び／又は請求項２２に記載のベクターと、前記標的部位に対するガイドＲＮＡを、細胞又は非ヒト生物に導入することを含む、製造方法。
  28. 請求項２７の製造方法で得られた、細胞又は生物。
  29. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、請求項２０に記載のポリペプチドの組合せ、請求項２１に記載のポリヌクレオチド、請求項２２に記載のベクター、及び／又は請求項２４に記載の細胞を含む、実験用ゲノム編集用組成物。
  30. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、請求項２０に記載のポリペプチドの組合せ、請求項２１に記載のポリヌクレオチド、請求項２２に記載のベクター、及び／又は請求項２４に記載の細胞を含む、農業用ゲノム編集用組成物。
  31. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、請求項２０に記載のポリペプチドの組合せ、請求項２１に記載のポリヌクレオチド、請求項２２に記載のベクター、及び／又は請求項２４に記載の細胞を含む、医療用ゲノム編集用組成物。
  32. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、請求項２０に記載のポリペプチドの組合せ、請求項２１に記載のポリヌクレオチド、請求項２２に記載のベクター、及び／又は請求項２４に記載の細胞を含む、畜産用ゲノム編集用組成物。
  33. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、請求項２０に記載のポリペプチドの組合せ、請求項２１に記載のポリヌクレオチド、請求項２２に記載のベクター、及び／又は請求項２４に記載の細胞を含む、水産用ゲノム編集用組成物。
  34. 請求項１～１９のいずれか一項に記載の変異型ＭＡＤ７タンパク質、請求項２０に記載のポリペプチドの組合せ、請求項２１に記載のポリヌクレオチド、請求項２２に記載のベクター、及び／又は請求項２４に記載の細胞を含む、工業用ゲノム編集用組成物。

     
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