WO2023145530A1 - 癌治療剤 - Google Patents

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WO2023145530A1
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cancer
therapeutic agent
braf
enc
tre
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裕也 吉田
雅信 高橋
千加史 石岡
桜 谷口
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国立大学法人東北大学
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Definitions

  • the present invention relates to a therapeutic agent for cancer containing a component that enhances the effect of a growth inhibitor.
  • Cancers such as colon cancer, lung cancer, breast cancer, and prostate cancer are cancers that have seen a marked increase in the number of cases in recent years, and their effective treatment is a continuous goal in basic research and the medical field. Genetic and chromosomal instability is recognized in many of these carcinogenic mechanisms of cancer. Among these, BRAF gene mutation has been reported in thyroid cancer, malignant melanoma, colon cancer, ovarian cancer, prostate cancer, and the like.
  • RAF family kinases including BRAF, function as important regulators of the MEK-ERK MAP kinase signaling pathway downstream of RAS. This pathway contributes to cell cycle, cell proliferation, differentiation, angiogenesis, apoptosis, migration and metastasis.
  • BRAF V600E mutations in cancers described above are activating mutations V600E that cause a single amino acid substitution in the kinase site.
  • BRAF V600E mutation is found in thyroid cancer (59%), malignant melanoma (50%), colon cancer (10%), lung cancer (6%), etc.
  • BRAF V600E mutant colon cancer is known to have a poor prognosis compared to wild-type and RAS mutant colon cancer.
  • molecular targeted drugs such as bevacizumab, a monoclonal antibody against vascular endothelial growth factor (VEGF), and cetuximab and panitumumab, monoclonal antibodies against epidermal growth factor receptor (EGFR), have been used. things are known.
  • VEGF vascular endothelial growth factor
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • Patent Document 1 discloses a pharmaceutical composition combining a BRAF inhibitor and a MEK inhibitor. This technology is intended to be used in said pharmaceutical composition for the treatment, suppression, severity reduction, risk reduction or inhibition of metastasis to BRAF-mutant cancers, especially melanoma.
  • the inventors have focused on the inhibitory effects of BRAF inhibitors and MEK inhibitors on proliferation, and are conducting research on means to enhance these therapeutic effects.
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and an object of the present invention is to contain a component that exhibits a synergistic effect with a BRAF inhibitor, exhibit a strong antitumor effect, and provide a BRAF inhibitor, an anti-EGFR antibody, and a MEK inhibitor.
  • An object of the present invention is to provide a cancer therapeutic agent that exhibits an enhancing effect on therapeutic effects even on drug-resistant cells and that is particularly effective in the treatment of genetically mutated cancers.
  • a cancer therapeutic agent according to the first aspect of the present invention comprises a compound acting on a retinoid receptor and a BRAF inhibitor.
  • a therapeutic agent for cancer according to the second aspect of the present invention is a therapeutic agent for cancer to be used in combination with a BRAF inhibitor and includes a compound acting on a retinoid receptor.
  • the compound acting on the retinoid receptor may be a retinoid compound or a derivative thereof.
  • the compound acting on the retinoid receptor may be tretinoin, tamibarotene or bexarotene.
  • the BRAF inhibitor may be dabrafenib or encorafenib.
  • the cancer therapeutic agent according to the first aspect of the present invention may further contain a MEK inhibitor.
  • the MEK inhibitor may be trametinib or binimetinib.
  • the cancer therapeutic agent according to the first aspect of the present invention may further contain a compound that acts on epidermal growth factor or epidermal growth factor receptor.
  • the compound acting on epidermal growth factor or epidermal growth factor receptor may be bevacizumab, cetuximab or panitumumab.
  • the cancer therapeutic agent according to the first or second aspect of the present invention may be a therapeutic agent for BRAF mutant cancer.
  • the therapeutic agent for cancer according to the first or second aspect of the present invention may be a therapeutic agent for colon cancer.
  • the cancer therapeutic agent of the above aspect contains a component that exhibits a synergistic effect with a BRAF inhibitor, exhibits a strong antitumor effect, and treats cells that are resistant to BRAF inhibitors, anti-EGFR antibodies, and MEK inhibitors. It is possible to provide a cancer therapeutic agent that exhibits an enhancing effect and is particularly effective in the treatment of gene-mutant cancers.
  • FIG. 1 is a graph showing the enhancement of inhibitory effects of tretinoin (TRE or ATRA), dabrafenib (DAB) and trametinib (TRA) in this example.
  • FIG. 2 is a graph showing enhancement of inhibitors by ATRA in various colon cancer cell lines in this example.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of using the RKO cell line for the effects of compounds acting on various retinoid receptors in this example.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of using HT29 cell line for the effects of compounds acting on various retinoid receptors in this Example.
  • FIG. 5 is a graph showing the results of using CO115 cell line for the effects of compounds acting on various retinoid receptors in this example.
  • FIG. 6 is a graph showing the enhancing effect of inhibitors by ATRA on encorafenib/cetuximab-resistant strains in this example.
  • FIG. 7 is a graph showing changes in tumor volume by ATRA in vivo in this example.
  • FIG. 8 is a graph showing the results of using various colorectal cancer cell lines regarding the effects of retinol in this example.
  • FIG. 9 is a graph showing the results of using various colorectal cancer cell lines for the effect of tamibarotene in this example.
  • FIG. 10 is a graph showing the results of using various colorectal cancer cell lines regarding the effects of bexarotene in this example.
  • FIG. 11 is a graph showing the results of the Annexin V-propidium iodide (PI) assay using the RKO cell line in this example.
  • FIG. 12 is a graph showing the results of the Annexin V-PI assay using the HT29 cell line in this example.
  • FIG. 13 shows images and graphs showing the analysis results of changes in expression of p-MEK using Western blot in this example.
  • FIG. 14 is an image showing the analysis results of expression changes of p-ERK and ERK using Western blot in this example.
  • FIG. 15 shows images and graphs showing the analysis results of p-AKT using Western blot in this example.
  • FIG. 16 shows images and graphs showing the analysis results of changes in PARP expression using Western blot in this example.
  • FIG. 17 is an image showing the analysis results of changes in expression of proteins related to the Bcl-2 family using Western blot in this Example.
  • FIG. 18 is a graph quantifying the signal intensity of each band in FIG.
  • FIG. 19 is an image showing the analysis results of endogenous RAR ⁇ and RXR ⁇ protein expression using Western blot in each BRAF mutant colon cancer cell line in this example.
  • FIG. 20 is images and graphs showing the analysis results of the expression of RAR ⁇ and RXR ⁇ using Western blot in the RKO cell line under RAR ⁇ or RXR ⁇ knockdown in this example.
  • FIG. 21 is a graph showing the results of examining the growth inhibitory effect of the combination of ATRA, encorafenib, and binimetinib, or the combination of bexarotene, encorafenib, and binimetinib in the RKO cell line under RAR ⁇ or RXR ⁇ knockdown in this example.
  • FIG. 22 shows images and graphs showing the analysis results of RXR ⁇ expression by Western blot in HT29 cell lines under RXR ⁇ knockdown in this example.
  • Figure 23 shows the combination of TRE, encorafenib (ENC), and binimetinib (BIN) or bexarotene (BEX), encorafenib (ENC), and binimetinib (BIN) in HT29 cell lines under RXRa knockdown in this example. It is a graph showing the results of examination of the growth inhibitory effect of the combined use.
  • FIG. 24 shows images and graphs showing the results of expression analysis of cleaved PARP by combined use of TRE with ENC, BIN and cetuximab (CET) in RKO cell lines under RAR ⁇ or RXR ⁇ knockdown in this example.
  • FIG. 25 is a graph showing the results of examination of the antitumor effect of the combination of TRE and ENC, BIN and CET, or ENC and CET in a subcutaneous tumor-implanted mouse model in this example.
  • FIG. 26 shows an image of immunohistochemical staining with an anti-Ki-67 antibody (magnification: 400 times) in the mouse model of subcutaneous tumor implantation in this example. Note that the scale bar is 100 ⁇ m.
  • FIG. 27 is a graph showing the Ki-67 positive sub-fraction (%) calculated using the stained image of FIG.
  • the cancer therapeutic agent of this embodiment contains a compound acting on a retinoid receptor and a BRAF inhibitor.
  • Retinoid compounds broadly refer to vitamin A-derived compounds, vitamin A derivatives, or vitamin A-like compounds. More specific examples include retinoic acid or derivatives thereof.
  • Compounds acting on retinoid receptors include retinol, tretinoin (ATRA (all-trans-retinoic acid)), isotretinoin (13-cis-retinoic acid), and alitretinoin (9-cis-retinoic acid) as first-generation retinoids. etc.
  • Second-generation retinoids include etretinate and acitretin.
  • Third-generation retinoids include adapalene, bexarotene, tazarotene, and tamibarotene.
  • Fourth-generation retinoids include triphalotene.
  • First and second generation retinoids can bind to several retinoid receptors due to their flexibility obtained by alternating single and double bonds.
  • adapalene is a selective RAR agonist
  • bexarotene is a selective RXR agonist
  • tamibarotene is a RAR/RXR agonist, with high RAR A selectivity.
  • Triphalotene is a selective RAR ⁇ agonist.
  • retinol, ATRA, tamibarotene or bexarotene is more preferably used as the compound acting on the retinoid receptor, and ATRA, tamibarotene or bexarotene is further preferably used.
  • retinoid receptors can enhance the effects of BRAF inhibitors. That is, a compound that acts on retinoid receptors can also be said to be an antitumor effect enhancer of a BRAF inhibitor.
  • a compound that acts on retinoid receptors can be said to be an antitumor effect enhancer of BRAF inhibitors and MEK inhibitors.
  • the cancer therapeutic agent of this embodiment contains a BRAF inhibitor.
  • a therapeutic agent for cancer containing a BRAF inhibitor means that in addition to the form in which the BRAF inhibitor is contained in the same formulation, it is provided in the form in which other components and the component containing the BRAF inhibitor are individually accommodated and used in combination. Including cases where it is a cancer therapeutic agent.
  • BRAF refers to the gene that expresses the B-Raf protein.
  • BRAF inhibitors broadly include components that inhibit the expression of B-Raf protein, and more specifically components that are known to inhibit the BRAF gene. Conventionally known BRAF inhibitors can be used, but those used as components of cancer therapy are preferred.
  • the cancer therapeutic agent of the present embodiment it is more preferable to use Dabrafenib or Encorafenib as the BRAF inhibitor.
  • ATRA and dabrafenib As a combination of the compound acting on the retinoid receptor and the BRAF inhibitor, it is more preferable to use ATRA and dabrafenib, ATRA and encorafenib, tamibarotene and dabrafenib, tamibarotene and encorafenib, bexarotene and dabrafenib, or bexarotene and encorafenib.
  • the cancer therapeutic agent of this embodiment can further contain other ingredients depending on the type of cancer, in addition to the compound acting on the retinoid receptor and the BRAF inhibitor.
  • the cancer therapeutic agent of this embodiment preferably further contains a MEK inhibitor.
  • MEK refers to the kinase enzyme MEK1 or MEK2 of mitogen-activated protein kinase, which is a kinase enzyme that phosphorylates mitogen-activated protein kinase.
  • MEK inhibitors broadly include components that inhibit the expression of MEK proteins (enzymes), and more specifically, components that are known to inhibit the MEK gene. As MEK inhibitors, conventionally known ones can be used, but those used as ingredients for cancer treatment are preferable.
  • trametinib or binimetinib as the MEK inhibitor.
  • ATRA encorafenib, and binimetinib, tamibarotene, encorafenib, and binimetinib, or bexarotene, encorafenib, and binimetinib.
  • ATRA, dabrafenib and trametinib, tamibarotene, dabrafenib and trametinib, or bexarotene, dabrafenib and trametinib are more preferably used.
  • MEK inhibitors are known to be effective when used in combination with conventional BRAF inhibitors in the treatment of cancer. Furthermore, the compound acting on the retinoid receptor of the present embodiment enhances the effects of MEK inhibitors in addition to BRAF inhibitors. Therefore, in cancer therapeutic agents, a further synergistic effect can be obtained by using a compound acting on retinoid receptors, a BRAF inhibitor and a MEK inhibitor in combination.
  • the cancer therapeutic agent of the present embodiment may contain other ingredients known to be used in combination with BRAF inhibitors or MEK inhibitors in cancer treatment.
  • it may contain compounds that act on epidermal growth factor (EGF) or epidermal growth factor receptor (EGFR).
  • EGF epidermal growth factor
  • EGFR epidermal growth factor receptor
  • Antibodies against VEGF and antibodies against EGFR may be used as such compounds. More specifically, bevacizumab, cetuximab, panitumumab, and the like may be included.
  • ATRA and encorafenib and cetuximab, tamibarotene and encorafenib and cetuximab, or bexarotene and encorafenib and cetuximab can be used.
  • ATRA dabrafenib and panitumumab
  • tamibarotene dabrafenib and panitumumab
  • bexarotene dabrafenib and panitumumab
  • Combinations of the compounds acting on retinoid receptors, BRAF inhibitors, MEK inhibitors, and compounds acting on EGF or EGFR include ATRA, encorafenib, binimetinib, and cetuximab, tamibarotene, encorafenib, binimetinib, and cetuximab, or bexarotene. and encorafenib, binimetinib, and cetuximab are preferred.
  • ATRA dabrafenib, trametinib and cetuximab, tamibarotene, dabrafenib, trametinib and cetuximab, or bexarotene, dabrafenib, trametinib and cetuximab are preferably used.
  • the therapeutic agent for cancer according to the present embodiment can be widely used for pharmaceuticals, pharmaceutical compositions, anticancer agents, anticancer compositions, therapeutic agents for cancer, and the like. These cancer therapeutic agents and the like can be used for cancer treatment, prevention, and accompanying treatment.
  • the cancer therapeutic agent of the present embodiment can be suitably used for the treatment of mutated cancer, that is, cancer caused by gene mutation.
  • the cancer therapeutic agent of the present embodiment can be suitably used for treatment of BRAF mutant cancer.
  • BRAF-mutated cancers it can be used for BRAF V600E-mutated cancer, and particularly for BRAF V600E-mutated colorectal cancer.
  • BRAF V600E mutant cancer refers to those showing a positive reaction in the BRAF V600 mutation test.
  • cancer therapeutic agent of the present embodiment can also be used to treat various cancers.
  • "Cancer” in this embodiment refers to a physiological condition characterized mainly by unregulated cell proliferation, and broadly refers to malignant tumors (cancer), also referred to as “cancerous” or “malignant.” Cancers include carcinoma, lymphoma, leukemia, blastoma and sarcoma.
  • cancer More specific examples of cancer include squamous cell carcinoma, myeloma, small cell lung cancer, non-small cell lung cancer, glioma, Hodgkin's lymphoma, non-Hodgkin's lymphoma, acute myelogenous leukemia, multiple myeloma, gastrointestinal ) cancer, kidney cancer, ovarian cancer, liver cancer, lymphoblastic leukemia, lymphocytic leukemia, colorectal cancer, endometrial cancer, kidney cancer, prostate cancer, thyroid cancer, melanoma, chondrosarcoma, neuroblastoma , pancreatic cancer, glioblastoma multiforme, cervical cancer, brain cancer, gastric cancer, bladder cancer, hepatoma, breast cancer, colon cancer and head and neck cancer.
  • the therapeutic agent for cancer of the present embodiment can be used, for example, for gastrointestinal cancer, lung cancer, and the like. Moreover, among these, it can be used particularly preferably for the treatment of colon cancer.
  • Treatment of cancer broadly includes amelioration of symptoms such as reduction of cancer cell number, reduction of tumor size, reduction of cancer cell infiltration rate into peripheral organs, tumor metastasis, or reduction of tumor growth rate. .
  • the therapeutic agent for cancer of this embodiment is a method of treating cancer as described above, specifically, a method of treating, suppressing, reducing the severity of, reducing the risk of, inhibiting, or metastasizing cancer as described above. can be used for
  • the cancer therapeutic agent of this embodiment can be used for the production of other drugs or compositions used for the treatment of cancer as described above.
  • the cancer therapeutic agent of this embodiment contains a component that exhibits a synergistic effect with a BRAF inhibitor, and exhibits a strong antitumor effect. Specifically, an effect of enhancing the growth inhibitory effect of the BRAF inhibitor by 20% or more is observed. These effects have been confirmed to inhibit growth in multiple BRAF mutant colon cancer cell lines.
  • reaction mechanisms are expected to involve the effects of compounds that act on retinoid receptors on RXR, RAR, RFR, etc. Therefore, compounds that are selective agonists of RXR, RAR, RFR, etc. may be effective.
  • the cancer therapeutic agent of this embodiment also exerts a synergistic effect on the effects of MEK inhibitors. That is, by further including a MEK inhibitor, a higher cancer therapeutic effect can be obtained.
  • the inventors have found that compounds that act on retinoid receptors enhance the effects of BRAF inhibitors.
  • the present inventors have found that a synergistic effect that further enhances the effect is exhibited by using these compounds acting on retinoid receptors in combination with a BRAF inhibitor and a MEK inhibitor.
  • the inventors focused on the possibility of obtaining a higher cancer therapeutic effect by using a compound that can further enhance the effects of BRAF inhibitors and MEK inhibitors in cancer therapeutic agents. Then, the inventors searched for a component capable of enhancing the effect of these inhibitors, and performed screening, thereby obtaining the configuration of the present embodiment.
  • the cancer therapeutic agent of the present embodiment exhibits a therapeutic effect-enhancing effect even on cells resistant to BRAF inhibitors, compounds acting on EGF or EGFR, preferably anti-EGFR antibodies and MEK inhibitors.
  • the cancer therapeutic agent of the present embodiment is particularly effective for treatment of gene mutation cancer.
  • the dosage of the compound that acts on the retinoid receptor can be the conventionally clinically used dosage.
  • the dose of the compound acting on the retinoid receptor is 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, or 1/6 of the dose conventionally clinically used. , 1/7, 1/8, or even 1/9, the enhancement effect can be exhibited.
  • the doses of the BRAF inhibitor, MEK inhibitor, and compound that acts on EGF or EGFR can also be used at conventionally clinically used doses.
  • the therapeutic effect of these drugs is enhanced, so that the dose used conventionally clinically is reduced to 1/2, 1/3, or 1/2. It can be reduced to about 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, or 1/9.
  • the dose of the above drug can be increased. may be reduced. By reducing the dose, the toxicity of these drugs can be suppressed, and the burden on the patients to whom they are administered can be reduced.
  • Cancer therapeutic agents in embodiments other than the foregoing embodiment are cancer therapeutic agents for use in combination with BRAF inhibitors, including compounds that act on retinoid receptors.
  • the cancer therapeutic agent of this embodiment contains at least a compound that acts on retinoid receptors.
  • the cancer therapeutic agent of this embodiment is used in combination with a BRAF inhibitor.
  • the combined use of a cancer therapeutic agent and a BRAF inhibitor broadly includes aspects in which a cancer therapeutic agent and a BRAF inhibitor are used in combination.
  • it includes an aspect in which the cancer therapeutic agent of this embodiment and the BRAF inhibitor are administered simultaneously.
  • the phrase "administered and used at the same time" includes the case where they are administered in the same formulation, such as a combination formulation, and also includes the case where they are administered in different formulations and administered at the same time.
  • using together also includes the case of using sequentially not simultaneously. Sequential use refers to the sequential use of the cancer therapeutic agent and the other ingredients.
  • the administration frequency and dose of the cancer therapeutic agent and other components may be the same or different.
  • the mode of administration may be oral administration, injection, or the like.
  • each may be taken orally on consecutive days, and in that case, the administration time may be at approximately the same time on the same day or at a different time. More specifically, for example, a compound acting on a retinoid receptor and a BRAF inhibitor are administered orally every day, and a compound acting on EGF or EGFR, preferably an anti-EGFR antibody, is administered intravenously once a week or every other week. may be administered at
  • the same components as in the above embodiments can be used.
  • cancer therapeutic agent of this embodiment may be used in combination with the above embodiment and a MEK inhibitor, a compound acting on EGF or EGFR, preferably an anti-EGFR antibody.
  • cancer therapeutic agent of this embodiment may contain other components of the above-described embodiments, and may be used in combination.
  • Still other embodiments than those described above include cancer therapeutics that combine a BRAF inhibitor and a retinoid receptor. Still yet other embodiments include a method of ameliorating symptoms of cancer using a combination of a BRAF inhibitor and a retinoid receptor, or a method of treatment or prevention using a combination of a BRAF inhibitor and a retinoid receptor.
  • a cancer therapeutic agent of still another embodiment is a cancer therapeutic agent for combined use with a compound that acts on a retinoid receptor, and includes a BRAF inhibitor.
  • a therapeutic agent for cancer of still another embodiment is a therapeutic agent for cancer to be used in combination with a compound that acts on a retinoid receptor, and includes a MEK inhibitor.
  • examples of other embodiments of the present invention include the following. a) A method of ameliorating symptoms of cancer in a subject, comprising administering to the subject a compound that acts on a retinoid receptor and a BRAF inhibitor. b) A method of ameliorating symptoms of cancer in a subject comprising administering to the subject a compound that acts on a retinoid receptor and a BRAF inhibitor, wherein the subject has a BRAF-mutant cancer. c) A method of ameliorating symptoms of cancer in a subject comprising administering to the subject a compound that acts on a retinoid receptor and a BRAF inhibitor, wherein the subject is suffering from colon cancer.
  • a method of treating or preventing cancer in a subject comprising administering to the subject a compound that acts on a retinoid receptor and a BRAF inhibitor.
  • e) A method of inhibiting cancer progression in a subject comprising administering to the subject a compound that acts on a retinoid receptor and a BRAF inhibitor.
  • g) Compounds acting on retinoid receptors for use in combination with BRAF inhibitors to ameliorate symptoms of BRAF-mutant cancers.
  • a pharmaceutical composition comprising a compound acting on a retinoid receptor for use in treating or preventing cancer in combination with BRAF inhibitors.
  • j Compounds acting on retinoid receptors for use in combination with BRAF inhibitors to inhibit cancer progression.
  • a pharmaceutical composition comprising a compound acting on a retinoid receptor for use in combination with a BRAF inhibitor to ameliorate symptoms of cancer.
  • a pharmaceutical composition comprising a compound acting on a retinoid receptor for use in combination with a BRAF inhibitor to ameliorate symptoms of BRAF-mutated cancer.
  • a pharmaceutical composition comprising a compound acting on a retinoid receptor for use in combination with a BRAF inhibitor to ameliorate symptoms of colorectal cancer.
  • a pharmaceutical composition comprising a compound acting on a retinoid receptor for use in treating or preventing cancer in combination with a BRAF inhibitor.
  • q Use of a compound acting on retinoid receptors for the manufacture of a pharmaceutical composition that, in combination with a BRAF inhibitor, ameliorate symptoms of BRAF-mutated cancer.
  • r Use of a compound acting on retinoid receptors for the manufacture of a pharmaceutical composition for ameliorating symptoms of colorectal cancer in combination with a BRAF inhibitor.
  • s Use of compounds acting on retinoid receptors for the manufacture of pharmaceutical compositions for treating or preventing cancer in combination with BRAF inhibitors.
  • t Use of a compound acting on a retinoid receptor for producing a pharmaceutical composition for inhibiting cancer progression in combination with a BRAF inhibitor.
  • a cancer therapeutic agent kit comprising a BRAF inhibitor and a compound acting on a retinoid receptor.
  • v A cancer therapeutic agent kit comprising a BRAF inhibitor, a compound acting on a retinoid receptor, and a MEK inhibitor.
  • w A cancer treatment kit comprising a BRAF inhibitor, a compound acting on retinoid receptors, and a MEK inhibitor or a compound acting on EGF or EGFR.
  • Dabrafenib (catalog # D-5699) from LC Laboratories (Woburn, MA, USA), Trametinib (catalog # 16292), ATRA (all-trans Retinoic Acid) (catalog # 11017) from Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA ) was purchased from
  • Encorafenib (catalog # 16994, HY-15605), Binimetinib (catalog # 16996, HY-15202) are Cayman Chemical (Ann Arbor, MI, USA), MedChemoExpress (Monmouth Ju nction, NJ, USA).
  • Bexarotene (catalog # HY-14171) was purchased from MedChemoExpress (Monmouth Junction, NJ, USA).
  • Cetuximab (Erbitax) was purchased from Merck Serono (Tokyo, Japan).
  • WiDR cells those distributed from the JCRB Cell Bank (Osaka, Japan), National Institute of Biomedical Innovation, Health and Nutrition were used.
  • RKO, WiDR, HT29, CO115 cells were cultured in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (Sigma-Aldrich Inc. St. Lois, MO, USA) containing 10% fetal bovine serum (FBS). C. and 5% CO 2 concentration conditions were used.
  • Dulbecco's Modified Eagle's Medium Sigma-Aldrich Inc. St. Lois, MO, USA
  • FBS fetal bovine serum
  • Test Example 1 Search for compounds that enhance sensitivity to BRAF inhibitors and MEK inhibitors
  • Test method A SCAD Inhibitor Kit 4 containing 80 compounds was used to screen compounds that might enhance the anti-tumor effects of BRAF inhibitors, MEK inhibitors in RKO cells.
  • the SCADS Inhibitor Kit was provided by the Molecular Profiling Committee of the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology's Grant-in-Aid for Scientific Research "Advanced Animal Model Support (AdAMS)”.
  • RKO cells were seeded on a 96-well plate at a cell number of 2.7 ⁇ 10 3 cells/well, and after 24 hours, SCADS Inhibitor Kit 4 ver2.3 was administered to 500 nM.
  • Two similarly treated plates were prepared, and 50 nM of the BRAF inhibitor Dabrafenib and 5 nM of the MEK inhibitor Trametinib were administered to one of the plates. After incubation at 37° C. for 72 hours after drug administration, cell viability was measured by MTT assay (described below). Cell viability was evaluated for RKO cells that received only DMSO.
  • MTT Thiazolyl blue tetrazolium bromide
  • DAB+TRA indicates the value of dabrafenib (DAB) 50 nM and trametinib (TRA) 5 nM in combination.
  • the arrow indicates ATRA, and the survival rate is 101% with ATRA alone, and 26% with DAB+TRA and ATRA in combination.
  • the viability in this combination is significantly lower than 48% in the case of DAB+TRA alone (solvent DMSO alone), that is, the effect of reducing and suppressing viability is high. Therefore, ATRA was recognized as a compound exhibiting a synergistic effect especially when used in combination with DAB+TRA.
  • Fig. 2 shows the survival rate of RKO, (b) WiDR, (c) HT29, (d) CO115, and (e) 8505C colon cancer cell lines.
  • the horizontal axis shows the component concentrations of encorafenib and binimetinib in the range of 0 to 10 ⁇ M, and the vertical axis shows the cell viability when ATRA of 0, 1.0 or 10 ⁇ M (each bar graph) is administered.
  • encorafenib and binimetinib were used at equal molar concentrations.
  • the IC50 (0% inhibitory concentration) is RKO (BRAF V600E mutant colon cancer cell line)
  • ATRA 1 uM: 7.5 HT29 (BRAF V600E mutant colon cancer cell line)
  • ATRA 1 uM: 0.32 WiDR (BRAF V600E mutant colon cancer cell line)
  • ATRA 1uM: 3.6 CO115 (BRAF V600E mutant colon cancer cell line)
  • ATRA was shown to increase the cell growth inhibitory effect of encorafenib and binimetinib in any colon cancer cell line.
  • Test Example 3 Verification of cell growth inhibitory effect by each retinoid compound
  • Compounds that act on retinoid receptors other than ATRA tretinoin
  • retinoids retinol, tamibarotene, and bexarotene were used as compounds acting on retinoid receptors.
  • cell lines the above-mentioned RKO, HT29, and CO115 cell lines were used.
  • BRAF inhibitor and MEK inhibitor to be used in combination as in Test Example 2, a component (EB) in which equal amounts of encorafenib and binimetinib were mixed was used.
  • EB component in which equal amounts of encorafenib and binimetinib were mixed was used.
  • Fig. 3 shows the results using the RKO cell line.
  • retinol (0 ⁇ M or 30 ⁇ M) in FIG. 3(a)
  • tamibarotene (0 ⁇ M or 10 ⁇ M) in FIG. 3(b)
  • bexarotene (0 ⁇ M or 10 ⁇ M) in FIG.
  • FIG. 3(a) shows cell viability.
  • retinol, tamibarotene, and bexarotene all caused a greater decrease in cell viability when the retinoid was added to the EBs, indicating inhibition of EB cell proliferation. The effect of enhancing the action of was shown.
  • Fig. 4 shows the results using the HT29 cell line.
  • retinol (0 ⁇ M or 1 ⁇ M) in FIG. 4 (a) tamibarotene (0 ⁇ M or 1 ⁇ M) in FIG. 4 (b), and bexarotene (0 ⁇ M or 1 ⁇ M) in FIG. , indicated cell viability.
  • retinol, tamibarotene, and bexarotene caused a greater decrease in cell viability and inhibition of EB cell proliferation when the retinoid was added to the EB. The effect of enhancing the action of was shown.
  • Fig. 5 shows the results using the CO115 cell line.
  • Fig. 5(a) shows cell viability using retinol (0 ⁇ M or 30 ⁇ M)
  • Fig. 5(b) shows tamibarotene (0 ⁇ M or 30 ⁇ M)
  • EB is 0 ⁇ M or 0.1 ⁇ M.
  • both retinol and tamibarotene caused a greater decrease in cell viability when the retinoid was added to the EB, indicating that the cell proliferation of the EB was inhibited. was shown to be effective in enhancing
  • Test Example 4 Verification of effects in encorafenib / cetuximab-resistant strains
  • An encorafenib/cetuximab-resistant strain was prepared, and the enhancing effect of the inhibitor by ATRA was examined for the resistant strain.
  • the above-mentioned RKO cells were seeded on a 15 mm dish, and the BRAF inhibitor Encorafenib, the anti-EGFR antibody drug Cetuximab, and the BRAF inhibitor Encorafenib, the MEK inhibitor Binimetinib, and the anti-EGFR antibody drug Cetuximab were administered. Groups were prepared.
  • Encorafenib 10 nM, Binimetinib 10 nM, and Cetuximab were started at 1 ⁇ g/ml, respectively, and the drug was gradually increased while considering the growth rate and administration period to obtain resistant strains.
  • the survival rate of the susceptible strain (S) decreased according to the encorafenib dose of 0-10 ⁇ M, even if ATRA was not administered (0 ⁇ M). In the ATRA-administered group (1 ⁇ M), the survival rate was further decreased, and the survival rate was around 0.1.
  • Resistant strains (R) acquired encorafenib resistance when ATRA was not administered (0 ⁇ M), so the decrease in survival rate was small with respect to the dose of encorafenib, and even with encorafenib 10 ⁇ M, the survival rate was 0.7 to 0. 0.8 survival rate.
  • the IC50 (50% inhibitory concentration) for each cell line is Sensitive strain ATRA 0 ⁇ M: 1.23 ATRA 1 ⁇ M: 0.0046 Resistant strain ATRA 0 ⁇ M: >10 ATRA 1 ⁇ M: 1.58 Met.
  • the Xenograft mouse model was prepared as follows.
  • mice Female nude mice (BALB/c-nu) were purchased from Charles River Laboratories Japan (Yokohama, Japan) and bred in a specific pathogen-free environment.
  • the above cultured HT29 cells were collected with trypsin and suspended in a mixed solution of culture medium and Corning Matrigel basement membrane matrix (Corning, NY, USA) at 1 ⁇ 10 7 cells/ml.
  • mice were randomly grouped into control group, all-trans Retinoic Acid (ATRA) administration group, Encorafenib/Cetuximab administration group, ATRA/Encorafenib/Cetuximab administration group.
  • ATRA all-trans Retinoic Acid
  • Encorafenib was given orally at a dose of 10 mg/kg and ATRA at a dose of 10 mg/kg daily for 21 days.
  • An oral probe for mice was used for oral administration. Cetuximab was administered intraperitoneally twice weekly at a dose of 20 mg/kg. Each solvent was used as a control.
  • Animal experiments were approved by the Tohoku University Institutional Animal Care and Use Committee and were performed in accordance with the Tohoku University Institutional Guidelines.
  • Fig. 7(a) shows the average tumor volume
  • Fig. 7(b) shows the average body weight.
  • the significant difference in FIG. 7(a) was p ⁇ 0.05 by One-way ANOVA and Tukey-Kramer test.
  • the tumor volume increased day by day in the group administered DMSO (control solvent) and ATRA only, indicating tumor cell proliferation.
  • the increase in tumor size was suppressed more than in the above group, and as is conventionally known, Encorafenib/Cetuximab has an inhibitory effect on proliferation.
  • ATRA/Encorafenib/Cetuximab administration group ATRA/encore/cet volume. This indicates that the administration of ATRA causes a synergistic effect with Encorafenib/Cetuximab, and the inhibitory effect on proliferation is more pronounced as the tumor size decreases. As shown in FIG. 7(b), there was no significant difference in body weight among the administration groups, and ATRA caused no significant side effects.
  • Test Example 6 Verification of cell growth inhibitory effect by each retinoid compound 2
  • the effect of suppressing cell proliferation that is, the effect of enhancing the effect of suppressing cell proliferation of BRAF inhibitors and MEK inhibitors
  • the cell lines used were the RKO, HT29, CO115, WiDR, COLO205, and LIM2405 colon cancer cell lines described above.
  • a component (EB) in which equal amounts of encorafenib and binimetinib were mixed was used as in Test Example 2.
  • FIG. 8 shows the results using retinol.
  • RKO cell line in FIG. 8(a) shows the results using retinol.
  • HT29 cell line in FIG. 8(b) shows the results using retinol.
  • HT29 cell line in FIG. 8(b) shows the results using retinol.
  • CO115 cell line in FIG. 8(c) shows the results using the WiDR cell line in FIG. 8(d), COLO205 cell line in FIG. 8(e),
  • FIG. 8(f) shows the results using the LIM2405 cell line.
  • the cell viability decreased in an EB concentration-dependent manner in all of the RKO, HT29, CO115, WiDR, COLO205, and LIM2405 cell lines.
  • the cell viability is greatly reduced, and the decrease in cell viability is dependent on the concentration of retinol, and the effect of enhancing the effect of EB to suppress cell growth. It has been shown.
  • FIG. 9 shows the results using Tamibarotene.
  • RKO cell line in FIG. 9(a) shows the results using the HT29 cell line in FIG. 8(b), CO115 cell line in FIG. 9(c), WiDR cell line in FIG. 9(d), COLO205 cell line in FIG. 9(f) shows the results using the LIM2405 cell line.
  • the cell viability decreased in an EB concentration-dependent manner in all of the RKO, HT29, CO115, WiDR, COLO205, and LIM2405 cell lines.
  • the cell viability is greatly reduced, and the decrease in cell viability is dependent on the concentration of tamibarotene, and the effect of enhancing the effect of EB to suppress cell proliferation. It has been shown.
  • FIG. 10 shows the results using bexarotene.
  • RKO cell line in FIG. 10(a) shows the results using HT29 cell line in FIG. 10(b), CO115 cell line in FIG. 10(c), WiDR cell line in FIG. 10(d), COLO205 cell line in FIG.
  • FIG. 10(f) shows the results using the LIM2405 cell line.
  • the cell viability is greatly reduced, and the decrease in cell viability is dependent on the concentration of bexarotene, and the effect of enhancing the effect of EB to suppress cell proliferation. It has been shown.
  • the RKO cell line and the HT29 cell line were seeded on a 6-well plate at cell numbers of 7.5 ⁇ 10 4 cells/well and 8.0 ⁇ 10 4 cells/well, respectively. After culturing for 24 hours, each cell line was administered with DMSO, TRE, ENC+BIN or TRE+ENC+BIN, respectively.
  • Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit Nakalai Tesque
  • Apoptotic cells were detected using CytoFLEX LX.
  • the percentage of Annexin V-positive cells was calculated as the percentage of apoptotic cells. The above was performed 3 times as an independent experiment. Student's t test was used for the significance test.
  • FIG. 11 shows the results of the Annexin V-PI assay in the RKO cell line.
  • FIG. 11(a) shows dot plots of propidium iodide (PI) against Annexin V in DMSO, TRE, ENC+BIN, and TRE+ENC+BIN.
  • FIG. 11(b) shows the percentage of apoptotic cells in DMSO, TRE, ENC+BIN, and TRE+ENC+BIN.
  • DMSO and TRE did not significantly change the percentage of apoptotic cells.
  • TRE+ENC+BIN significantly increased the percentage of apoptotic cells compared to ENC+BIN.
  • FIG. 12 shows the results of the Annexin V-PI assay in the HT29 cell line.
  • FIG. 12(a) shows dot plots of PI against Annexin V in DMSO, TRE, ENC+BIN, and TRE+ENC+BIN.
  • FIG. 12(b) shows the percentage of apoptotic cells in DMSO, TRE, ENC+BIN, and TRE+ENC+BIN.
  • DMSO and TRE did not significantly change the percentage of apoptotic cells.
  • TRE+ENC+BIN significantly increased the percentage of apoptotic cells compared to ENC+BIN.
  • the RKO cell line and HT29 cell line were seeded in a 6-well plate at a cell number of 5.0 ⁇ 10 4 cells/well and 1.2 ⁇ 10 5 cells/well, respectively. After culturing for 24 hours, each cell line was administered with DMSO, TRE, ENC+BIN or TRE+ENC+BIN, respectively. Both cell lines were administered with 0.1 v/v% DMSO, 1 ⁇ M TRE, 10 nM ENC, and 10 nM BIN. Twenty-four hours after drug administration, the cells were collected, and total RNA was extracted using RNeasy Mini Kit (QIAGEN Inc.). The amount of total RNA was measured using a NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (Thermo Fisher Scientific Inc.).
  • RNA 100 ng of extracted total RNA was amplified using Low Input Quick Amp Labeling Kit, one-color (Agilent Technologies) and labeled with Cyanine3.
  • the quantity and quality of cRNA were measured using an Agilent Bioanalyzer (Agilent Technologies) and a NanoDrop One ND-ONE-W (Thermo Fisher Scientific Inc.).
  • the labeled RNA was hybridized to Sure Print G3 Human GE Microarray 8*60K Ver3.0 (Agilent Technologies) by rotating at 65° C. for 17 hours. After washing, the microarrays were scanned with an Agilent DNA microarray scanner G2505C (Agilent Technologies).
  • the genes of the RKO cell line that were significantly changed by TRE, TRE + ENC + BIN and could be analyzed were 790 genes and 1,222 genes, respectively. Pathway analysis using these variable genes enriched 3 signaling pathways for TRE and 14 signaling pathways for TRE+ENC+BIN (see Tables 1 and 3 below). Furthermore, in order to focus on molecular signaling pathways in tumors, we limited the signaling pathways belonging to the Environmental Information Processing and Cellular Processes in the KEGG category, and identified 3 signaling pathways for TRE and 6 signaling pathways for TRE + ENC + BIN.
  • genes that are changed by TRE + ENC + BIN are included in a group of genes belonging to signal transduction pathways involved in cell proliferation, such as the JAK-STAT signal transduction pathway and the PI3K-Akt signal transduction pathway, which were not observed in TRE.
  • the genes of the HT29 cell line that were significantly changed by TRE and TRE + ENC + BIN and could be analyzed were 1,274 genes and 1,619 genes, respectively. Pathway analysis using these variable genes revealed that 12 signaling pathways were enriched for TRE and 31 for TRE+ENC+BIN (see Tables 2 and 4 above). The analysis was performed in the same manner as the RKO cell line, and finally 3 signaling pathways were identified for TRE and 9 signaling pathways for TRE + ENC + BIN. Genes that are changed by TRE + ENC + BIN are included in a group of genes belonging to molecular signaling pathways involved in cell proliferation, such as JAK-STAT signaling pathway, Ras signaling pathway and PI3K-Akt signaling pathway, which were not observed in TRE. It was shown that
  • the RKO cell line was seeded in a 6-well plate at a cell number of 5.0 ⁇ 10 4 cells/well. After culturing for 24 hours, DMSO, TRE, ENC+BIN or TRE+ENC+BIN were administered respectively. They were administered so that DMSO 0.1 v/v%, TRE 10 ⁇ M, ENC 10 nM, and BIN 10 nM, respectively. Cells were harvested 48 hours after drug administration. Separation was performed by centrifugation, cell pellets were made and frozen at -80°C. The experimental steps after protein extraction were carried out by Kinex TM Antibody Microarray Contract Service (Cosmo Bio Co., Ltd.) for contract analysis.
  • Kinex TM Antibody Microarray Contract Service Cosmo Bio Co., Ltd.
  • the antibody array KAM-2000 (Kinexus Bioinformatics) used in this study covers 875 phosphorylation site-specific antibodies and 451 pan-specific antibodies.
  • % CFC % Change From Control value
  • % CFC ⁇ -45 % CFC ⁇ -45 recommended by Kinexus Bioinformatics was used as a criterion for significant difference.
  • the proteins and phosphorylated proteins specifically altered by this TRE + ENC + BIN belong to signaling pathways involved in tumor growth, such as MAPK signaling pathway, PI3K-Akt signaling pathway, FoxO signaling pathway and ErbB signaling pathway. showed that
  • Table 6 shows the types and dilution ratios of the primary antibodies used for Western blot.
  • Radioimmunoprecipitation assay buffer composition: 50 mM Tris-HCL, pH 8.0, 150 mM sodium chloride , 0.5 w/v% sodium deoxycholate, 0.1 w/ v% Sodium Dodecyl Sulfate, 1.0 w/v% NP-40 substrate
  • the extracted protein was quantified by the bicinchoninic acid method.
  • a 5 ⁇ g protein sample was separated by polyacrylamide electrophoresis, transferred to a polyvinylidene difluoride membrane (PVDF membrane, Merck Millipore Ltd.), and blocked with an Odyssey Blocking Buffer (Licor Inc.) for 1 hour at room temperature.
  • the PVDF membrane after transfer was immersed in a primary antibody solution and cultured at room temperature for 2 hours or at 4° C. overnight. After primary antibody reaction, the cells were washed three times with Tris Buffered Saline with Tween 20 (TBS-T) for 5 minutes at room temperature, immersed in secondary antibody and incubated at room temperature for 1 hour.
  • Secondary antibodies are Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody Alexa Fluor 680 (Thermo Fisher Scientific Inc.) and Goat anti-Mouse IgG (H+L) Hi Ghly Cross-Adsorbed Secondary Antibody Alexa Fluor 680 (Thermo Fisher Scientific Inc.
  • TRE enhances the ability of ENC+BIN to induce apoptosis. Since one of the mechanisms of apoptosis induction by TRE is the regulation of the Bcl-2 family, expression levels of the Bcl-2 family proteins Bcl-2, Mcl-1, Bcl-xL, BAX and BAK in addition to PARP was analyzed.
  • TRE induces DNA damage and tumor growth suppression by single agent or combination therapy with cytotoxic anticancer drugs. It has also been reported that DNA damage and the Bcl-2 family interact with each other. Based on these previous reports, we also analyzed the expression level of p-H2AX, which reflects DNA damage that is thought to be involved in TRE-mediated Bcl-2 family-mediated apoptosis.
  • FIG. 13 shows the analysis results of p-MEK expression changes related to the MAPK signaling pathway using Western blot.
  • FIG. 13(a) shows the Western blot band using the RKO cell line
  • FIG. 13(b) shows the Western blot band using the HT29 cell line
  • FIG. 13(c) shows the band of FIG. 13(a).
  • a graph quantifying the signal intensity is shown in FIG. 13(d), which is a graph quantifying the signal intensity of the bands in FIG. 13(b).
  • Fig. 14 shows the analysis results of expression changes of p-ERK and t-ERK related to the MAPK signaling pathway using Western blot.
  • FIG. 15 shows the analysis results of changes in p-AKT expression associated with the PI3K-Akt signaling pathway using Western blot.
  • FIG. 15(a) shows the Western blot band using the RKO cell line
  • FIG. 15(b) shows the Western blot band using the HT29 cell line
  • FIG. 15(c) shows the band of FIG. 15(a).
  • a graph quantifying the signal intensity is shown in FIG. 15(d), which is a graph quantifying the signal intensity of the bands in FIG. 15(b).
  • FIG. 16 shows the analysis results of changes in PARP expression related to the mechanism of apoptosis induction using Western blot.
  • FIG. 16(a) shows the Western blot band using the RKO cell line
  • FIG. 16(b) shows the Western blot band using the HT29 cell line
  • FIG. 16(c) shows the band of FIG. 16(a).
  • a graph quantifying the signal intensity is shown in FIG. 16(d), which is a graph quantifying the signal intensity of the band in FIG. 16(b).
  • FIG. 17 shows the analysis results of expression changes of proteins related to the Bcl-2 family using Western blot.
  • FIG. 17(a) shows the results using the RKO cell line
  • FIG. 17(b) shows the results using the HT29 cell line.
  • FIG. 18 shows a graph quantifying the signal intensity of each protein band in FIG. Figure 18 (a), Figure 18 (b), Figure 18 (e), Figure 18 (f), Figure 18 (i) are the results using the RKO cell line
  • Figure 18 (c), Figure 18 (d) Figure 18(g), FIG. 18(h), FIG. 18(j), and FIG. 18(k) are the results using the HT29 cell line.
  • the combination of TRE and ENC+BIN enhanced the expression of cleaved PARP, BAK and p-H2AX in RKO and HT29 cell lines compared to ENC+BIN. This result indicates that the enhanced apoptosis-inducing ability contributes to the molecular biological mechanism that enhances cell growth suppression by the combination of TRE and ENC+BIN, and supports the results of the Annexin V-PI assay.
  • the combination of TRE and ENC + BIN enhanced the expression of BAK, which is an effector of the Bcl-2 family, and p-H2AX, which is a marker of DNA damage, compared to ENC + BIN. suggested to be involved.
  • RAR ⁇ and RXR ⁇ are TRE receptors that are associated with the cytostatic effect of TRE. It was hypothesized that the mechanism by which compounds acting on retinoid receptors, including TRE, enhance the cytostatic effect of ENC+BIN is via RAR ⁇ or RXR ⁇ .
  • Western blot analysis was performed in the same manner as in Test Example 10. .
  • Fig. 19 shows the results of Western blot analysis of endogenous RAR ⁇ and RXR ⁇ protein expression in each BRAF mutant colon cancer cell line.
  • endogenous RAR ⁇ was observed in the RKO cell line, it was at a level that was hardly observed in other cell lines.
  • the expression of endogenous RXR ⁇ was higher in WiDR cell line, HT29 cell line, LIM2405 cell line, RKO cell line, COLO205 cell line and CO115 cell line in that order.
  • Test Example 12 Verification of cell growth inhibitory effect by combined use of a compound acting on retinoid receptors under the control of RAR ⁇ or RXR ⁇ expression, a BRAF inhibitor, and a MEK inhibitor
  • RAR ⁇ by siRNA
  • the MTT assay was performed using the RKO cell line and the HT29 cell line in which the expression of RXR ⁇ was suppressed.
  • siGENOME siRNA Reagents Horizon Discovery Ltd.
  • siGENOME Human RARA siRNA SMARTpool catalog #M-003437-02-0005
  • siGENOME Human RXRA siRNA SMA siGENOME Human RXRA siRNA SMA
  • RTpool catalog#M- 003443-02-0005
  • siGENOME Non-Targeting siRNA Pool catalog #D-001206-13-05
  • RAR ⁇ and RXR ⁇ are endogenously expressed in RKO cells, and only RXR ⁇ is endogenously expressed in other BRAF-mutant colon cancer cells, TRE and selective RXR, which act on both RAR ⁇ and RXR ⁇ among retinoids, are endogenously expressed.
  • BEX an agonist
  • siRNA-induced changes in RAR ⁇ and RXR ⁇ protein expression in the RKO cell line were analyzed using Western blot in the same manner as in Test Example 10.
  • DMSO in si-NC-introduced cells was set to 1 and evaluated as a relative value.
  • FIG. 20 shows the analysis results of RAR ⁇ and RXR ⁇ expression by Western blot in RKO cell lines under RAR ⁇ or RXR ⁇ knockdown.
  • FIG. 20(a) shows Western blot bands in the RKO cell line under RAR ⁇ knockdown.
  • FIG. 20(b) shows a graph quantifying the bands in FIG. 20(a).
  • FIG. 20(c) shows Western blot bands in the RKO cell line under RXR ⁇ knockdown.
  • FIG. 20(d) shows a graph quantifying the bands in FIG. 20(c).
  • si-RAR ⁇ reduced RAR ⁇ expression by 39 ⁇ 6% and si-RXR ⁇ reduced RXR ⁇ expression by 87 ⁇ 2.3% compared to the control si-NC.
  • DMSO 0.1 v/v%, TRE 10 ⁇ M, ENC 10 nM + BIN 10 nM, TRE 10 ⁇ M + ENC 10 nM + BIN 10 nM, BEX 10 ⁇ M, BEX 10 ⁇ M + ENC 10 nM + BIN 10 nM were administered to the RKO cell line introduced with each siRNA or si-NC, and after administration 72 hours was evaluated for cell viability.
  • FIG. 21 shows the results of examining the growth inhibitory effect of TRE + ENC + BIN or BEX + ENC + BIN in RKO cell lines under RAR ⁇ or RXR ⁇ knockdown.
  • FIG. 21(d) shows the results of BEX+ENC+BIN in the RKO cell line under RXR ⁇ knockdown.
  • FIG. 22 shows the analysis results of RXR ⁇ expression by Western blot in HT29 cell lines under RXR ⁇ knockdown.
  • FIG. 22(a) shows Western blot bands in the HT29 cell line under RXR ⁇ knockdown.
  • FIG. 22(b) shows a graph quantifying the bands in FIG. 22(a).
  • si-RXR ⁇ reduced the expression of RXR ⁇ by 60 ⁇ 5%.
  • DMSO 0.1 v/v%, TRE 10 ⁇ M, ENC 10 nM + BIN 10 nM, TRE 10 ⁇ M + ENC 10 nM + BIN 10 nM, BEX 10 ⁇ M, BEX 10 ⁇ M + ENC 10 nM + BIN 10 nM were administered to the HT29 cell line introduced with si-RXR ⁇ or si-NC. and 72 days after administration Time to assess cell viability.
  • FIG. 23 shows the results of examining the growth inhibitory effect of TRE + ENC + BIN or BEX + ENC + BIN in RKO cell lines under RXR ⁇ knockdown.
  • FIG. 23(a) shows the results of TRE+ENC+BIN under RXR ⁇ knockdown
  • FIG. 23(b) shows the results of BEX+ENC+BIN under RXR ⁇ knockdown.
  • FIG. 24 shows the results of expression analysis of cleaved PARP by TRE + ENC + BIN + CET in RKO cell lines under RAR ⁇ or RXR ⁇ knockdown.
  • FIG. 24(a) shows Western blot bands in the RKO cell line under RAR ⁇ or RXR ⁇ knockdown.
  • FIG. 24(b) shows a graph quantifying the bands in FIG. 24(a).
  • TRE enhanced the expression levels of cleaved PARP by ENC+BIN and ENC+BIN+CET about 13-fold and about 11-fold, respectively.
  • RAR ⁇ was suppressed
  • the effect of TRE on enhancing the expression level of cleaved PARP by ENC+BIN and ENC+BIN+CET was attenuated to about 8-fold and about 3-fold, respectively.
  • RXR ⁇ was suppressed, it was attenuated about 1.5 times and about 2 times.
  • Test Example 13 Verification of anti-tumor effect by combination of compound acting on retinoid receptor, BRAF inhibitor, MEK inhibitor, and anti-EGFR antibody in subcutaneous tumor transplant mouse model
  • mice Female nude mice (BALB/c-nu) were purchased from The Jackson Laboratory Japan and housed in a specific pathogen-free environment.
  • the cultured HT29 cell line was recovered with trypsin, and suspended by mixing a culture medium and Corning Matrigel basement membrane matrix (Corning) at a volume ratio of 1:1 so as to obtain 1 ⁇ 10 7 cells/mL.
  • 0.1 mL of cell suspension was subcutaneously implanted into the left flank region of each mouse.
  • mice were randomly assigned to the vehicle group, TRE alone group, ENC + CET group, TRE and ENC + CET triple combination (TRE + ENC + CET) group, ENC + BIN + CET group, or TRE and ENC + BIN + CET four drugs. They were grouped into a combination (TRE+ENC+BIN+CET) group. TRE, ENC and BIN were dissolved in corn oil (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries) and subjected to ultrasonic treatment using Bioruptor UCW-310 (Sonic Bio Co., Ltd.) to prepare a chemical solution.
  • a dose of ENC 5 mg/kg, BIN 1.75 mg/kg, TRE 10 mg/kg was administered by oral gavage once daily for 28 days.
  • FIG. 25 shows the results of examination of the antitumor effect of combined use of TRE and ENC+BIN+CET or ENC+CET in subcutaneous tumor transplant mouse models.
  • FIG. 25(a) shows changes in tumor volume (mm 3 ) over time
  • FIG. 25(b) shows changes over time in body weight (g).
  • the tumor volume in the vehicle group was 1339 mm 3 ⁇ 231 mm 3
  • the tumor volume in the TRE alone group was 1156 mm 3 ⁇ 283 mm 3
  • the tumor volumes of the ENC + BIN + CET group and the ENC + CET group were 854 mm 3 ⁇ 425 mm 3 and 543 mm 3 ⁇ 88 mm 3 respectively
  • the tumor volumes of the TRE + ENC + BIN + CET group and the TRE + ENC + CET group were 389 mm 3 ⁇ 196 mm 3 and 255 mm 3 respectively. ⁇ 111 mm 3 , with significant reductions of 54% and 53%, respectively.
  • mice in the treatment group was measured as shown in Fig. 25(b).
  • the body weights of the vehicle group and the TRE alone group, the ENC+CET group and the TRE+ENC+CET group, and the ENC+BIN+CET group and the TRE+ENC+BIN+CET group on day 28 of treatment were compared. As a result, there was no significant difference in body weight of mice with or without TRE.
  • Ki-67 labeling index was calculated using resected tumors at the end of treatment in order to evaluate the effect of the combination of TRE and ENC + BIN + CET or ENC + CET on in vivo tumor growth.
  • tumors were excised from 4 to 6 mice randomly selected from each treatment group.
  • Excised tumors were fixed with 10 v/v % neutral formalin.
  • a paraffin-embedded tissue section was prepared from the fixed tumor at the Tohoku University Experimental Animal Pathology Platform, and immunostained with a rabbit anti-Ki-67 antibody (Cell Signaling Technology, dilution ratio 1:800).
  • the stained sample was observed with an optical microscope at a magnification of 400. Five fields were selected in the center of the tumor without tumor necrosis, and a total of 500 or more cells were counted in each group.
  • the Ki-67 labeling index was calculated as the number of Ki-67 positive cells/total number of cells.
  • FIG. 26 shows an image of immunohistochemical staining with an anti-Ki-67 antibody (magnification: 400x) in a mouse model of subcutaneous tumor transplantation. Note that the scale bar in FIG. 26 is 100 ⁇ m.
  • FIG. 27 shows the Ki-67 positive fraction (%) calculated using the stained image of FIG.
  • Ki-67 labeling index of the TRE+ENC+CET group and the TRE+ENC+BIN+CET group decreased significantly compared to the ENC+CET group and the ENC+BIN+CET group, respectively.
  • the cancer therapeutic agent of the present invention contains a component that exhibits a synergistic effect with a BRAF inhibitor, exhibits a strong antitumor effect, and treats cells that are resistant to BRAF inhibitors, anti-EGFR antibodies, and MEK inhibitors. It is possible to provide a cancer therapeutic agent that exhibits an enhancing effect and is particularly effective in the treatment of gene-mutant cancers.

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Abstract

癌治療剤は、レチノイド受容体に作用する化合物と、ＢＲＡＦ阻害剤とを含む。癌治療剤は、ＢＲＡＦ阻害剤と併用するための癌治療剤であって、レチノイド受容体に作用する化合物を含む。前記レチノイド受容体に作用する化合物が、レチノイド化合物又はその誘導体であってもよい。前記レチノイド受容体に作用する化合物が、ＡＴＲＡ、タミバロテン又はベキサロテンであってもよい。前記ＢＲＡＦ阻害剤が、ダブラフェニブ又はエンコラフェニブであってもよい。前記癌治療剤は、ＭＥＫ阻害剤をさらに含んでもよい。前記癌治療剤は、ＥＦＧ又はＥＧＦ受容体に作用する化合物をさらに含んでもよい。

Description

癌治療剤
　本発明は、増殖阻害剤の効果を増強する成分を含む癌治療剤に関する。
　本願は、２０２２年１月２７日に、日本に出願された特願２０２２－０１１０６４号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　大腸癌、肺癌、乳癌及び前立腺癌等の癌は、近年、罹患数の増加が顕著な癌であり、その有効な治療は基礎研究から医療分野にわたって継続的な目標である。これらの癌の発癌メカニズムのうち、遺伝子、染色体不安定性が多くに認められる。このうち、ＢＲＡＦ遺伝子変異は、甲状腺癌、悪性黒色腫、大腸癌、卵巣癌、及び前立腺癌等で報告されている。
　ＢＲＡＦを含むＲＡＦファミリーキナーゼは、ＲＡＳの下流でＭＥＫ－ＥＲＫ　ＭＡＰキナーゼシグナル伝達経路の重要な調節因子として機能する。この伝達経路は細胞周期、細胞増殖、分化、血管新生、アポトーシス、遊走及び転移などに寄与する。
　前記した癌におけるＢＲＡＦ遺伝子変異のうちの８０％以上は、キナーゼ部位の１アミノ酸置換を生ずる活性型変異Ｖ６００Ｅである。ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ変異は甲状腺癌（５９％）、悪性黒色腫（５０％）、大腸癌（１０％）、肺癌（６％）等で認められる。ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ変異型大腸癌は、野生型やＲＡＳ変異型大腸癌と比較して予後不良であることが知られている。
　遺伝子変異を伴う癌に対する薬物療法としては、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に対するモノクローナル抗体であるベバシズマブや、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に対するモノクローナル抗体のセツキシマブやパニツムマブなどの分子標的治療薬を用いたものが知られている。
　ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ変異型大腸癌に対する治療としては、二次治療としての標準治療（ＦＯＬＦＩＲＩ　ｏｒ　ＣＰＴ－１１、セツキシマブ）を使用する治療が知られている。また、ＢＥＡＣＯＮ　ＩＩＩ試験で、エンコラフェニブ、ビニメチニブ、セツキシマブを併用することで全生存期間の延長を示した例がある。ダブラフェニブがＢＲＡＦ阻害剤、ビニメチニブ及びトラメチニブが上記経路のＭＥＫ阻害剤として知られている。
　特許文献１は、ＢＲＡＦ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を組み合わせた薬学的組成物を開示している。この技術は、前記薬学的組成物において、ＢＲＡＦ変異癌、特に黒色腫に対する転移の処置、抑制、重症度を低減する、危険度を低減するもしくは阻害する処置に用いようとするものである。
　前述したように、ＢＲＡＦ変異癌については各種阻害剤及びその併用による薬物治療の技術が開発されているものの、依然として予後不良であり、さらなる有効な治療手段が求められている。特に、大腸癌においてはさらなる治療効果が強く求められている。
　これらの治療手段として、発明者らは、ＢＲＡＦ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤による増殖の抑制効果に注目し、これらの治療効果を増強する手段について研究を進めている。
日本国特表２０１６－５１０７４８号公報
　本発明は上記のような事情を鑑みてなされたものであり、その目的は、ＢＲＡＦ阻害剤と相乗効果を示す成分を含み、強い抗腫瘍効果を示し、ＢＲＡＦ阻害剤、抗ＥＧＦＲ抗体及びＭＥＫ阻害剤に抵抗性の細胞に対しても治療効果の増強効果を示し、遺伝子の変異癌に対する治療に特に有効な癌治療剤を提供することにある。
　上記課題を解決するため、本発明は以下の態様を有する。
　本発明の第１態様に係る癌治療剤は、レチノイド受容体に作用する化合物と、ＢＲＡＦ阻害剤とを含む。
　本発明の第２態様に係る癌治療剤は、ＢＲＡＦ阻害剤と併用するための癌治療剤であって、レチノイド受容体に作用する化合物を含む。
　前記レチノイド受容体に作用する化合物が、レチノイド化合物又はその誘導体であってもよい。
　前記レチノイド受容体に作用する化合物が、トレチノイン、タミバロテン又はベキサロテンであってもよい。
　前記ＢＲＡＦ阻害剤が、ダブラフェニブ又はエンコラフェニブであってもよい。
　本発明の第１態様に係る癌治療剤は、ＭＥＫ阻害剤をさらに含んでもよい。
　前記ＭＥＫ阻害剤が、トラメチニブ又はビニメチニブであってもよい。
　本発明の第１態様に係る癌治療剤は、上皮成長因子又は上皮成長因子受容体に作用する化合物をさらに含んでもよい。
　前記上皮成長因子又は上皮成長因子受容体に作用する化合物が、ベバシズマブ、セツキシマブ又はパニツムマブであってもよい。
　本発明の第１又は第２態様に係る癌治療剤は、ＢＲＡＦ変異癌の治療剤であってもよい。
　本発明の第１又は第２態様に係る癌治療剤は、大腸癌の治療剤であってもよい。
　上記態様の癌治療剤によれば、ＢＲＡＦ阻害剤と相乗効果を示す成分を含み、強い抗腫瘍効果を示し、ＢＲＡＦ阻害剤、抗ＥＧＦＲ抗体及びＭＥＫ阻害剤に抵抗性の細胞に対しても治療効果の増強効果を示し、遺伝子の変異癌に対する治療に特に有効な癌治療剤を提供することができる。
図１は、本実施例におけるトレチノイン（ＴＲＥ、又はＡＴＲＡ）とダブラフェニブ（ＤＡＢ）とトラメチニブ（ＴＲＡ）の阻害効果の増強を示すグラフである。 図２は、本実施例における各種の大腸癌細胞株でのＡＴＲＡによる阻害剤の増強について示すグラフである。 図３は、本実施例における各種のレチノイド受容体に作用する化合物の効果についてＲＫＯ細胞株を用いた結果を示すグラフである。 図４は、本実施例における各種のレチノイド受容体に作用する化合物の効果についてＨＴ２９細胞株を用いた結果を示すグラフである。 図５は、本実施例における各種のレチノイド受容体に作用する化合物の効果についてＣＯ１１５細胞株を用いた結果を示すグラフである。 図６は、本実施例におけるエンコラフェニブ／セツキシマブ耐性株に対するＡＴＲＡによる阻害剤の増強効果を示すグラフである。 図７は、本実施例におけるｉｎ　ｖｉｖｏでのＡＴＲＡによる腫瘍体積の変化について示すグラフである。 図８は、本実施例におけるレチノールの効果について各種の大腸癌細胞株を用いた結果を示すグラフである。 図９は、本実施例におけるタミバロテンの効果について各種の大腸癌細胞株を用いた結果を示すグラフである。 図１０は、本実施例におけるベキサロテンの効果について各種の大腸癌細胞株を用いた結果を示すグラフである。 図１１は、本実施例におけるＲＫＯ細胞株を用いたＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖ－ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）アッセイの結果を示すグラフである。 図１２は、本実施例におけるＨＴ２９細胞株を用いたＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖ－ＰＩアッセイの結果を示すグラフである。 図１３は、本実施例におけるＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔを用いたｐ－ＭＥＫの発現変化の解析結果を示す画像及びグラフである。 図１４は、本実施例におけるＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔを用いたｐ－ＥＲＫ及びＥＲＫの発現変化の解析結果を示す画像である。 図１５は、本実施例におけるＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔを用いたｐ－ＡＫＴの解析結果を示す画像及びグラフである。 図１６は、本実施例におけるＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔを用いたＰＡＲＰの発現変化の解析結果を示す画像及びグラフである。 図１７は、本実施例におけるＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔを用いたＢｃｌ－２ファミリーに関連するタンパク質の発現変化の解析結果を示す画像である。 図１８は、図１７の各バンドのシグナル強度を定量化したグラフである。 図１９は、本実施例における各ＢＲＡＦ変異型大腸癌細胞株でのＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔを用いた内因性のＲＡＲα及びＲＸＲαのタンパク質発現の解析結果を示す画像である。 図２０は、本実施例におけるＲＡＲα又はＲＸＲαノックダウン下のＲＫＯ細胞株でのＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔを用いたＲＡＲα及びＲＸＲαの発現の解析結果を示す画像及びグラフである。 図２１は、本実施例におけるＲＡＲα又はＲＸＲαノックダウン下のＲＫＯ細胞株でのＡＴＲＡ、エンコラフェニブ、及びビニメチニブの併用、又は、ベキサロテン、エンコラフェニブ、及びビニメチニブの併用による増殖抑制効果の検討結果を示すグラフである。 図２２は、本実施例におけるＲＸＲαノックダウン下のＨＴ２９細胞株でのＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔによるＲＸＲαの発現の解析結果を示す画像及びグラフである。 図２３は、本実施例におけるＲＸＲαノックダウン下のＨＴ２９細胞株でのＴＲＥ、エンコラフェニブ（ＥＮＣ）、及びビニメチニブ（ＢＩＮ）の併用、又は、ベキサロテン（ＢＥＸ）、エンコラフェニブ（ＥＮＣ）、及びビニメチニブ（ＢＩＮ）の併用による増殖抑制効果の検討結果を示すグラフである。 図２４は、本実施例におけるＲＡＲα又はＲＸＲαノックダウン下のＲＫＯ細胞株でのＴＲＥとＥＮＣ、ＢＩＮ及びセツキシマブ（ＣＥＴ）の併用によるｃｌｅａｖｅｄ　ＰＡＲＰの発現解析の結果を示す画像及びグラフである。 図２５は、本実施例における腫瘍皮下移植マウスモデルでのＴＲＥとＥＮＣ、ＢＩＮ及びＣＥＴ、又は、ＥＮＣ及びＣＥＴの併用による抗腫瘍効果の検討結果を示すグラフである。 図２６は、本実施例における腫瘍皮下移植マウスモデルでの抗Ｋｉ－６７抗体による免疫組織化学染色像（倍率：４００倍）を示した。なお、スケールバーは１００μｍである。 図２７は、図２６の染色像を用いて算出されたＫｉ－６７陽性細割合（％）を示すグラフである。
　以下、本発明に係る癌治療剤について、実施形態を示して説明する。ただし、本発明は以下の実施形態に限定されるものではない。
　（癌治療剤）
　本実施形態の癌治療剤は、レチノイド受容体に作用する化合物と、ＢＲＡＦ阻害剤とを含む。
　（レチノイド受容体に作用する化合物）
　前記レチノイド受容体に作用する化合物としては、レチノイド化合物又はその誘導体が挙げられる。レチノイド化合物は、ビタミンＡ由来化合物、ビタミンＡ誘導体、又はビタミンＡ類似化合物を広く指す。さらに具体的には、レチノイン酸又はその誘導体が挙げられる。
　レチノイド受容体に作用する化合物としては、第１世代レチノイドとしてレチノール、トレチノイン（ＡＴＲＡ（全トランスレチノイン酸））、イソトレチノイン（１３－シス－レチノイン酸）、及びアリトレチノイン（９－シス－レチノイン酸）等が挙げられる。
　第２世代レチノイドとしてエトレチナート、及びアシトレチン等が挙げられる。
　第３世代レチノイドとしてアダパレン、ベキサロテン、タザロテン、及びタミバロテン等が挙げられる。
　第４世代レチノイドとしてトリファロテン等が挙げられる。
　第１世代及び第２世代のレチノイドは、単一結合と二重結合が交互に現れることで柔軟性が得られるため、いくつかのレチノイド受容体と結合することができる。
　上述のレチノイドのうち、アダパレンは選択的ＲＡＲアゴニスト、ベキサロテンは選択的ＲＸＲアゴニスト、タミバロテンはＲＡＲ／ＲＸＲのアゴニストで、ＲＡＲ　Ａの選択性が高い。トリファロテンは選択的ＲＡＲγアゴニストである。
　本実施形態では、前記レチノイド受容体に作用する化合物としては、これらのうちレチノール、ＡＴＲＡ、タミバロテン又はベキサロテンを用いることがより好ましく、ＡＴＲＡ、タミバロテン又はベキサロテンを用いることがさらに好ましい。
　これらのレチノイド受容体に作用する化合物は、ＢＲＡＦ阻害剤の効果を増強することができる。すなわち、レチノイド受容体に作用する化合物は、ＢＲＡＦ阻害剤の抗腫瘍効果増強剤ということもできる。また、これらのレチノイド受容体に作用する化合物をＢＲＡＦ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤と併用することで、さらに効果が増強される相乗効果を発揮する。すなわち、レチノイド受容体に作用する化合物は、ＢＲＡＦ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤の抗腫瘍効果増強剤ということもできる。
　（阻害剤）
　本実施形態の癌治療剤は、ＢＲＡＦ阻害剤を含む。癌治療剤がＢＲＡＦ阻害剤を含むとは、同製剤中にＢＲＡＦ阻害剤が含まれる形態の他、他の成分とＢＲＡＦ阻害剤を含む成分とが個別に収納され、併用する形態で提供される癌治療剤となっている場合を含む。
　ＢＲＡＦとは、Ｂ－Ｒａｆタンパク質を発現させる遺伝子を指す。ＢＲＡＦ阻害剤とは、広くはＢ－Ｒａｆタンパク質の発現を阻害する成分を広く含み、より具体的には、ＢＲＡＦ遺伝子を阻害することが知られている成分である。ＢＲＡＦ阻害剤としては、従来知られたものを用いることができるが、癌治療の成分として用いられているものが好ましい。
　本実施形態の癌治療剤では、ＢＲＡＦ阻害剤としては、ダブラフェニブ（Ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ）又はエンコラフェニブ（Ｅｎｃｏｒａｆｅｎｉｂ）を用いることがより好ましい。
　上述のレチノイド受容体に作用する化合物とＢＲＡＦ阻害剤との組み合わせとしては、ＡＴＲＡとダブラフェニブ、ＡＴＲＡとエンコラフェニブ、タミバロテンとダブラフェニブ、タミバロテンとエンコラフェニブ、ベキサロテンとダブラフェニブ、又は、ベキサロテンとエンコラフェニブを用いることがさらに好ましい。
　本実施形態の癌治療剤は、レチノイド受容体に作用する化合物とＢＲＡＦ阻害剤に加えて、癌種に応じて、更に他の成分を含むことができる。
　本実施形態の癌治療剤は、ＭＥＫ阻害剤をさらに含むことが好ましい。ＭＥＫとは、マイトジェン活性化プロテインキナーゼのキナーゼ酵素ＭＥＫ１又はＭＥＫ２を指し、マイトジェン活性化プロテインキナーゼをリン酸化するキナーゼ酵素である。ＭＥＫ阻害剤とは、広くはＭＥＫタンパク質（酵素）の発現を阻害する成分を広く含み、より具体的には、ＭＥＫ遺伝子を阻害することが知られている成分である。ＭＥＫ阻害剤としては、従来知られたものを用いることができるが、癌治療の成分として用いられているものが好ましい。
　本実施形態の癌治療剤では、ＭＥＫ阻害剤としては、トラメチニブ（Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ）又はビニメチニブ（Ｂｉｎｉｍｅｔｉｎｉｂ）を用いることがより好ましい。
　上述のレチノイド受容体に作用する化合物、ＢＲＡＦ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤との組み合わせとしては、ＡＴＲＡとエンコラフェニブとビニメチニブ、タミバロテンとエンコラフェニブとビニメチニブ、又は、ベキサロテンとエンコラフェニブとビニメチニブを用いることがさらに好ましい。或いは、ＡＴＲＡとダブラフェニブとトラメチニブ、タミバロテンとダブラフェニブとトラメチニブ、又は、ベキサロテンとダブラフェニブとトラメチニブを用いることがさらに好ましい。
　ＭＥＫ阻害剤は、癌の処置において従来ＢＲＡＦ阻害剤と併用することが有効であることが知られている。さらに、本実施形態のレチノイド受容体に作用する化合物は、ＢＲＡＦ阻害剤に加えて、ＭＥＫ阻害剤による効果も増強する。したがって、癌治療剤において、レチノイド受容体に作用する化合物、ＢＲＡＦ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤を併用することで、さらなる相乗効果が得られる。
　本実施形態の癌治療剤は、癌の処置において、ＢＲＡＦ阻害剤又はＭＥＫ阻害剤と併用されるものとして知られる他の成分を含んでいてもよい。
　例えば、上皮成長因子（ＥＧＦ）又は上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）に作用する化合物を含んでいてもよい。このような化合物としては、ＶＥＧＦに対する抗体やＥＧＦＲに対する抗体を用いてもよい。さらに具体的には、ベバシズマブ、セツキシマブやパニツムマブ等を含んでいてもよい。
　上述のレチノイド受容体に作用する化合物、ＢＲＡＦ阻害剤及びＥＧＦ又はＥＧＦＲに作用する化合物との組み合わせとしては、ＡＴＲＡとエンコラフェニブとセツキシマブ、タミバロテンとエンコラフェニブとセツキシマブ、又は、ベキサロテンとエンコラフェニブとセツキシマブを用いることが好ましい。或いは、ＡＴＲＡとダブラフェニブとセツキシマブ、タミバロテンとダブラフェニブとセツキシマブ、又は、ベキサロテンとダブラフェニブとセツキシマブを用いることが好ましい。或いは、ＡＴＲＡとダブラフェニブとパニツムマブ、タミバロテンとダブラフェニブとパニツムマブ、又は、ベキサロテンとダブラフェニブとパニツムマブを用いることが好ましい。
　上述のレチノイド受容体に作用する化合物、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＥＧＦ又はＥＧＦＲに作用する化合物との組み合わせとしては、ＡＴＲＡとエンコラフェニブとビニメチニブとセツキシマブ、タミバロテンとエンコラフェニブとビニメチニブとセツキシマブ、又は、ベキサロテンとエンコラフェニブとビニメチニブとセツキシマブを用いることが好ましい。或いは、ＡＴＲＡとダブラフェニブとトラメチニブとセツキシマブ、タミバロテンとダブラフェニブとトラメチニブとセツキシマブ、又は、ベキサロテンとダブラフェニブとトラメチニブとセツキシマブを用いることが好ましい。
　（癌治療剤の用途）
　本実施形態の癌治療剤は、医薬、医薬組成物、抗癌剤、抗癌用組成物、癌の治療薬等に広く用いることができる。これらの癌治療剤等は、癌の治療、予防やそれに伴う処置に用いることができる。
　本実施形態の癌治療剤は、変異癌、すなわち遺伝子の変異による癌の治療に好適に用いることができる。
　本実施形態の癌治療剤は、これらの変異癌のうち、ＢＲＡＦ変異癌の治療に好適に用いることができる。ＢＲＡＦ変異癌のうち、ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ変異癌に用いることができ、特にＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ変異型大腸癌に用いることができる。ここで、ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ変異癌とは、ＢＲＡＦ　Ｖ６００変異検査での陽性反応を示すものなどを指す。
　本実施形態の癌治療剤はまた、癌としては、各種の癌の治療に用いることができる。本実施形態での「癌」は、主に無秩序な細胞増殖を特徴とする生理学的状態を指し、悪性腫瘍（がん）を広く指し、「癌性」又は「悪性」ともいう。癌としては、癌腫、リンパ腫、白血病、芽細胞腫及び肉腫が挙げられる。癌のより具体的な例には、扁平上皮癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、胃腸（管）癌、腎臓癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽球性白血病、リンパ性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、黒色腫、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、多形膠芽腫、子宮頸癌、脳癌、胃癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌及び頭頸部癌等が挙げられる。このうち、本実施形態の癌治療剤は、例えば、消化器の癌、又は肺癌等に用いることができる。また、このうち、大腸癌の治療に特に好適に用いることができる。
　癌の治療とは、例えば癌細胞数の減少、腫瘍サイズの減少、末梢器官へのがん細胞浸潤速度の低下、腫瘍の転移、又は腫瘍の増殖速度の低下等の症状の改善が広く含まれる。
　本実施形態の癌治療剤は、上述の癌の治療方法、具体的には上述の癌の処置、抑制、重症度の低減、危険度の低減、阻害、又は癌の転移に対するこれらの処置の方法に用いることができる。
　本実施形態の癌治療剤は、上述の癌の治療に用いる他の薬剤又は組成物の製造のための使用に用いることができる。
　（癌治療剤の効果）
　本実施形態の癌治療剤は、ＢＲＡＦ阻害剤と相乗効果を示す成分を含み、強い抗腫瘍効果を示す。具体的には、ＢＲＡＦ阻害剤による増殖抑制の効果を２０％以上増強する効果がみられる。これらの効果は、ＢＲＡＦ変異型大腸癌細胞株の複数の株において、増殖抑制の効果が確認されたものである。
　これらの反応機序については、レチノイド受容体に作用する化合物における、ＲＸＲ、ＲＡＲ、ＲＦＲ等に作用する効果が関わっていると予測される。したがって、ＲＸＲ、ＲＡＲ、ＲＦＲ等の選択的なアゴニストである化合物は有効である可能性がある。
　本実施形態の癌治療剤は、ＭＥＫ阻害剤の効果に対しても相乗効果を発揮する。すなわち、さらにＭＥＫ阻害剤を含むことで、さらに高い癌治療効果を奏する。
　発明者らは、レチノイド受容体に作用する化合物が、ＢＲＡＦ阻害剤の効果を増強することを見出した。また、これらのレチノイド受容体に作用する化合物をＢＲＡＦ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤と併用することで、さらに効果が増強される相乗効果を発揮することを見出した。
　すなわち、発明者らは、癌治療剤においてＢＲＡＦ阻害剤やＭＥＫ阻害剤の効果をより増強することができる化合物を併用することで、より高い癌治療効果を得られる可能性に着目した。そして、これらの阻害剤の効果を増強させることのできる成分を求めてスクリーニングを行い、本実施形態の構成を得るに至った。
　レチノイド受容体に作用する化合物は、従来は主に皮膚科領域で用いられ、腫瘍領域で注目されることはなかった。また、ＢＲＡＦ阻害剤との相乗効果、及び、ＭＥＫ阻害剤などのその他の癌処置に用いられる成分との相乗効果は知られていなかった。
　本実施形態の癌治療剤は、ＢＲＡＦ阻害剤、ＥＧＦ又はＥＧＦＲに作用する化合物、好ましくは抗ＥＧＦＲ抗体及びＭＥＫ阻害剤に抵抗性を有する細胞に対しても、治療効果の増強効果を示す。
　すなわち、ＢＲＡＦ阻害剤、ＥＧＦ又はＥＧＦＲに作用する化合物、好ましくは抗ＥＧＦＲ抗体、ＭＥＫ阻害剤、又はその他の成分に対して耐性を獲得した細胞組織に対しても有効である可能性がある。また、これらの成分の治療剤による治療効果が出なくなった患者に対して、治療効果を発揮することができる可能性がある。
　これらの効果から、本実施形態の癌治療剤は、遺伝子の変異癌に対する治療に特に有効である。
　本実施形態の癌治療剤において、レチノイド受容体に作用する化合物の投与量については、従来から臨床上使用されている投与量で用いることができる。或いは、本実施形態の癌治療剤において、レチノイド受容体に作用する化合物は、従来から臨床上使用されている投与量の１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、又は１／９程度であっても、上記増強効果を発揮することができる。
　また、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及びＥＧＦ又はＥＧＦＲに作用する化合物の投与量についても、従来から臨床上使用されている投与量で用いることができる。或いは、レチノイド受容体に作用する化合物と併用することで、これら薬剤による治療効果が増強されることから、従来から臨床上使用されている投与量よりも使用量の１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、又は１／９程度まで低減することが可能である。また、レチノイド受容体に作用する化合物と併用して、上記薬剤を従来から臨床上使用されている投与量による投薬を行うことで、ある程度治療効果がみられた場合に、上記薬剤の投与量を低減してもよい。投与量を低減することにより、これら薬剤による毒性を抑え、投与される患者への負担を低減することができる。
　（ＢＲＡＦ阻害剤と併用するための癌治療剤）
　前述の実施形態とは他の実施形態における癌治療剤は、ＢＲＡＦ阻害剤と併用するための癌治療剤であって、レチノイド受容体に作用する化合物を含む。
　本実施形態の癌治療剤は、少なくともレチノイド受容体に作用する化合物を含む。本実施形態の癌治療剤は、ＢＲＡＦ阻害剤と併用する用途で用いられる。
　ここで癌治療剤とＢＲＡＦ阻害剤とを併用するとは、癌治療剤とＢＲＡＦ阻害剤とを組み合わせて使用する態様を広く含む。例えば本実施形態の癌治療剤とＢＲＡＦ阻害剤が同時に投与されて用いられる態様を含む。同時に投与されて用いられるとは、同一の製剤とされた場合、例えば合剤とされて投与される場合を含み、別の製剤とされ、同時に投与される場合も含む。また、併用するとは、同時でなく逐次に使用する場合も含む。逐次に使用するとは、癌治療剤と他の成分を連続して使用することを指す。癌治療剤と他の成分の投与回数や投与量は、同じであっても、異なっていてもよい。投与の形態は、内服でも、注射等でもよい。
　投与する際は、例えば、それぞれを連日内服してもよく、その場合、投与の時間は同日のほぼ同時でも、別の時間であってもよい。さらに具体的には、例えば、レチノイド受容体に作用する化合物とＢＲＡＦ阻害剤とは連日内服し、ＥＧＦ又はＥＧＦＲに作用する化合物、好ましくは抗ＥＧＦＲ抗体については静脈注射により週１回か、又は隔週で投与してもよい。
　ＢＲＡＦ阻害剤としては、前述の実施形態と同様の成分を用いることができる。
　また、本実施形態の癌治療剤は、前述の実施形態とＭＥＫ阻害剤、ＥＧＦ又はＥＧＦＲに作用する化合物、好ましくは抗ＥＧＦＲ抗体と併用してもよい。
　また、本実施形態の癌治療剤は、前述の実施形態のその他の成分が含まれていてもよく、併用してもよい。
　（その他の形態）
　前述の実施形態とはさらに他の実施形態は、ＢＲＡＦ阻害剤とレチノイド受容体とを併用する癌治療剤を含む。またさらに他の実施形態は、ＢＲＡＦ阻害剤とレチノイド受容体とを併用する癌の症状の改善の方法、又は、ＢＲＡＦ阻害剤とレチノイド受容体とを併用する治療若しくは予防の方法を含む。
　またさらに他の実施形態の癌治療剤は、レチノイド受容体に作用する化合物と併用するための癌治療剤であって、ＢＲＡＦ阻害剤を含む。またさらに他の実施形態の癌治療剤は、レチノイド受容体に作用する化合物と併用するための癌治療剤であって、ＭＥＫ阻害剤を含む。
　また、本発明の実施の他の形態の例としては、以下が挙げられる。
　ａ）対象における癌の症状を改善する方法であって、対象にレチノイド受容体に作用する化合物と、ＢＲＡＦ阻害剤とを投与する方法。
　ｂ）対象における癌の症状を改善する方法であって、対象にレチノイド受容体に作用する化合物と、ＢＲＡＦ阻害剤とを投与することを含み、対象がＢＲＡＦ変異癌に罹患している、方法。
　ｃ）対象における癌の症状を改善する方法であって、対象にレチノイド受容体に作用する化合物と、ＢＲＡＦ阻害剤とを投与することを含み、対象が大腸癌に罹患している、方法。
　ｄ）対象における癌の治療又は予防方法であって、対象にレチノイド受容体に作用する化合物と、ＢＲＡＦ阻害剤とを投与することを含む、方法。
　ｅ）対象における癌の進行抑制方法であって、対象にレチノイド受容体に作用する化合物と、ＢＲＡＦ阻害剤とを投与することを含む、方法。
　ｆ）ＢＲＡＦ阻害剤と併用し癌の症状の改善に使用するための、レチノイド受容体に作用する化合物。
　ｇ）ＢＲＡＦ阻害剤と併用しＢＲＡＦ変異癌の症状の改善に使用するための、レチノイド受容体に作用する化合物。
　ｈ）ＢＲＡＦ阻害剤と併用し大腸癌の症状の改善に使用するための、レチノイド受容体に作用する化合物。
　ｉ）ＢＲＡＦ阻害剤と併用し癌の治療又は予防に使用するための、レチノイド受容体に作用する化合物。
　ｊ）ＢＲＡＦ阻害剤と併用し癌の進行抑制に使用するための、レチノイド受容体に作用する化合物。
　ｋ）ＢＲＡＦ阻害剤と併用し癌の症状の改善に使用するための、レチノイド受容体に作用する化合物を含む医薬組成物。
　ｌ）ＢＲＡＦ阻害剤と併用しＢＲＡＦ変異癌の症状の改善に使用するための、レチノイド受容体に作用する化合物を含む医薬組成物。
　ｍ）ＢＲＡＦ阻害剤と併用し大腸癌の症状の改善に使用するための、レチノイド受容体に作用する化合物を含む医薬組成物。
　ｎ）ＢＲＡＦ阻害剤と併用し癌の治療又は予防に使用するための、レチノイド受容体に作用する化合物を含む医薬組成物。
　о）ＢＲＡＦ阻害剤と併用し癌の進行抑制に使用するための、レチノイド受容体に作用する化合物を含む医薬組成物。
　ｐ）ＢＲＡＦ阻害剤と併用し癌の症状を改善する医薬組成物を製造するための、レチノイド受容体に作用する化合物の使用。
　ｑ）ＢＲＡＦ阻害剤と併用しＢＲＡＦ変異癌の症状を改善する医薬組成物を製造するための、レチノイド受容体に作用する化合物の使用。
　ｒ）ＢＲＡＦ阻害剤と併用し大腸癌の症状を改善する医薬組成物を製造するための、レチノイド受容体に作用する化合物する化合物の使用。
　ｓ）ＢＲＡＦ阻害剤と併用し癌を治療又は予防する医薬組成物を製造するための、レチノイド受容体に作用する化合物の使用。
　ｔ）ＢＲＡＦ阻害剤と併用し癌を進行抑制する医薬組成物を製造するための、レチノイド受容体に作用する化合物の使用。
　ｕ）ＢＲＡＦ阻害剤と、レチノイド受容体に作用する化合物と、を備える、癌治療剤キット。
　ｖ）ＢＲＡＦ阻害剤と、レチノイド受容体に作用する化合物と、ＭＥＫ阻害剤と、を備える、癌治療剤キット。
　ｗ）ＢＲＡＦ阻害剤と、レチノイド受容体に作用する化合物と、ＭＥＫ阻害剤、又は、ＥＧＦ若しくはＥＧＦＲに作用する化合物と、を備える、癌治療剤キット。
　以下、実施例及び比較例により、本発明の効果をより明らかなものとする。なお、本発明は、以下の実施例のみに限定されるものではなく、その要旨を変更しない範囲で適宜変更して実施できるものである。
　（使用した薬剤）
　Ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ（ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｄ－５６９９）はＬＣ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　（Ｗｏｂｕｒｎ，　ＭＡ，　ＵＳＡ）より、Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ（ｃａｔａｌｏｇ　＃　１６２９２）、ＡＴＲＡ（ａｌｌ－ｔｒａｎｓ　Ｒｅｔｉｎｏｉｃ　Ａｃｉｄ）（ｃａｔａｌｏｇ　＃　１１０１７）はＣａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　（Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ，　ＭＩ，　ＵＳＡ）より購入した。
　Ｅｎｃｏｒａｆｅｎｉｂ（ｃａｔａｌｏｇ　＃　１６９９４、ＨＹ－１５６０５）、Ｂｉｎｉｍｅｔｉｎｉｂ（ｃａｔａｌｏｇ　＃　１６９９６、ＨＹ－１５２０２）はＣａｙｍａｎ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　（Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ，　ＭＩ，　ＵＳＡ）、ＭｅｄＣｈｅｍｏＥｘｐｒｅｓｓ（Ｍｏｎｍｏｕｔｈ　Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，　ＮＪ，　ＵＳＡ）より購入した。
　Ｒｅｔｉｎｏｌ（ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｓ５５９２）、Ｔａｍｉｂａｒｏｔｅｎｅ（ｃａｔａｌｏｇ　＃　Ｓ４２６０）はＳｅｌｌｅｃｋ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　（Ｈｏｕｓｔｏｎ，　ＴＸ，　ＵＳＡ）より購入した。
　Ｂｅｘａｒｏｔｅｎｅ（ｃａｔａｌｏｇ　＃　ＨＹ－１４１７１）はＭｅｄＣｈｅｍｏＥｘｐｒｅｓｓ（Ｍｏｎｍｏｕｔｈ　Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，　ＮＪ，　ＵＳＡ）より購入した。
　Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ（Ｅｒｂｉｔａｘ）はＭｅｒｃｋ　Ｓｅｒｏｎｏ（Ｔｏｋｙｏ，　Ｊａｐａｎ）より購入した。
　（大腸癌細胞株）
　後述の試験において使用した４種類の大腸癌細胞株については、Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，　ＶＡ，　ＵＳＡ）より２０１５年にＲＫＯ細胞を購入した。
　ＷｉＤＲ細胞については国立研究開発法人　医薬基盤・健康・栄養研究所　ＪＣＲＢ細胞バンク（Ｏｓａｋａ，　Ｊａｐａｎ）より分譲されたものを使用した。
　ＨＴ２９、ＣＯ１１５、ＬＩＭ２４０５、ＣＯＬＯ２０５についてはＪｏｈｎ　Ｍ．　Ｍａｒｉａｄａｓｏｎ博士（Ｌｕｄｗｉｇ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｆｏｒ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，　Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ，　Ｖｉｃ，　Ａｕｓｔｒａｌｉａ）より譲り受けたものを使用した。
　ＲＫＯ細胞、ＷｉＤＲ細胞、ＨＴ２９細胞、ＣＯ１１５細胞は１０％　ｆｅｔａｌ　ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ（ウシ胎児血清、ＦＢＳ）を含むＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ　Ｉｎｃ．　Ｓｔ．Ｌｏｉｓ，　ＭＯ，　ＵＳＡ）で３７℃、５％　ＣＯ２濃度の条件下で培養したものを使用した。
　（試験例１：ＢＲＡＦ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤の感受性を増強させる化合物の探索）
　（試験方法）
　８０の化合物を含むＳＣＡＤ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｋｉｔ４を使用して、ＲＫＯ細胞におけるＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤の抗腫瘍効果を高める可能性のある化合物をスクリーニングした。
　ＳＣＡＤＳ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｋｉｔは、文部科学省の革新的分野の科学研究費補助金「先端動物モデル支援（ＡｄＡＭＳ）」の分子プロファイリング委員会から提供されたものを用いた。
　ＲＫＯ細胞を２．７×１０３個／ｗｅｌｌの細胞数で９６－ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播き、２４時間後にＳＣＡＤＳ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｋｉｔ　４　ｖｅｒ２．３を５００ｎＭになるよう投与した。同様に処理したｐｌａｔｅを２枚準備し、そのうちの１枚のｐｌａｔｅにはＢＲＡＦ阻害剤Ｄａｂｒａｆｅｎｉｂ　５０ｎＭ及びＭＥＫ阻害剤Ｔｒａｍｅｔｉｎｉｂ　５ｎＭを投与した。薬剤投与から３７℃で７２時間インキュベートした後、ＭＴＴアッセイ（後述）で細胞生存率を測定した。ＤＭＳＯのみが投与されたＲＫＯ細胞を対象として細胞生存率を評価した。
　ＭＴＴ（Ｔｈｉａｚｏｌｙｌ　ｂｌｕｅ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｂｒｏｍｉｄｅ）アッセイは以下のように行った。
　ＲＫＯ細胞を１．５×１０３個／ｗｅｌｌの細胞数、ＣＯ１１５細胞を２．５×１０３個／ｗｅｌｌ、ＨＴ２９細胞、ＷｉＤＲ細胞を６×１０３個／ｗｅｌｌで９６－ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播いた。細胞密度が４０－６０％となるまで約２４時間インキュベートした後、薬剤を投与した。３７℃で７２時間インキュベートした後、ＭＴＴアッセイをＣｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８　（Ｄｏｊｉｎｄｏ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，　Ｋｕｍａｍｏｔｏ，　Ｊａｐａｎ）を用いて行った。Ｃｅｌｌ　Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｋｉｔ－８溶液を各ｗｅｌｌに１０μｌずつ添加し、５％　ＣＯ２、３７℃の培養器で１２０分呈色反応を行った後、マイクロプレートリーダーＳｐｅｃｔｒａＭａｘ　Ｍ２ｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｄｅｖｉｃｅｓ，　Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，　ＣＡ，　ＵＳＡ）で４５０ｎｍの吸光度を測定し評価した。０．１％　ＤＭＳＯが投与された細胞をコントロールとして用いた。以上を独立した実験として３回以上行った。
　相乗効果についてはＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｅｘを用いて評価した。Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　Ｉｎｄｅｘの計算には、ＣｏｍｐｕＳｙｎ　ｓｏｆｔｗａｒｅ　（ＣｏｍｂｏＳｙｎ　Ｉｎｃ、ＮＪ、ＵＳＡ）を使用した。以前の報告に基づいて、ＣＩ＜０．７を相乗効果、ＣＩ　０．７－１．０をわずかな相乗効果／相加効果、ＣＩ＞　１．０を拮抗作用と定義した。
　（試験結果）
　標準阻害剤キット０．５μＭで７２時間処理の場合の相乗効果評価の結果を図１に示した。ＤＡＢ＋ＴＲＡはダブラフェニブ（ＤＡＢ）５０ｎＭ及びトラメチニブ（ＴＲＡ）５ｎＭを併用した値を示す。矢印がＡＴＲＡを示し、ＡＴＲＡ単剤では１０１％、ＤＡＢ＋ＴＲＡとＡＴＲＡを併用した場合は２６％の生存率となっている。この併用した場合の生存率は、ＤＡＢ＋ＴＲＡのみ（溶媒であるＤＭＳＯのみ）の場合の４８％よりも顕著に低く、すなわち生存率の低下効果、抑制効果が高い。このため、ＡＴＲＡが特にＤＡＢ＋ＴＲＡと併用した場合に相乗効果を示す化合物と認められた。
　ＡＴＲＡ単独では増殖抑制が２０％未満であり、ＤＡＢ＋ＴＲＡ＋ＡＴＲＡ併用ではＤＡＢ＋ＴＲＡによる増殖抑制より２０％以上の抑制効果を認めた。したがって、ＡＴＲＡはＤＡＢ及びＴＲＡと相乗効果を示し、これらの成分による抑制効果を増強する成分であることが示された。
　（試験例２：各大腸癌細胞株におけるＡＴＲＡの効果）
　各種の大腸癌細胞株において、細胞の生存率に対するＢＲＡＦ阻害剤（エンコラフェニブ）及びＭＥＫ阻害剤（ビニメチニブ）の阻害効果と、ＡＴＲＡによる増強について調べた。図２（ａ）にＲＫＯ、（ｂ）にＷｉＤＲ、（ｃ）にＨＴ２９、（ｄ）にＣＯ１１５、（ｅ）に８５０５Ｃの各大腸癌細胞株について各生存率を示した。横軸は、エンコラフェニブ及びビニメチニブの成分濃度を０～１０μＭの範囲で示し、縦軸には０、１．０又は１０μＭ（各棒グラフ）のＡＴＲＡを投与した場合の細胞生存率を示した。図に示すように、エンコラフェニブ及びビニメチニブはモル濃度で等量となるよう用いた。
　各細胞株について、ＩＣ５０（５０％阻害濃度）は、
ＲＫＯ　（ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ変異型大腸癌細胞株）
　ＡＴＲＡ　０ｕＭ：１０３
　ＡＴＲＡ　１ｕＭ：７．５
ＨＴ２９　（ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ変異型大腸癌細胞株）
　ＡＴＲＡ　０ｕＭ：１４．５
　ＡＴＲＡ　１ｕＭ：０．３２
ＷｉＤＲ　（ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ変異型大腸癌細胞株）
　ＡＴＲＡ　０ｕＭ：１９．１
　ＡＴＲＡ　１ｕＭ：３．６
ＣＯ１１５　（ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ変異型大腸癌細胞株）
　ＡＴＲＡ　０ｕＭ：１４．３
　ＡＴＲＡ　１０ｕＭ：４．４
８５０５Ｃ　（ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ変異型甲状腺癌細胞株）
　ＡＴＲＡ　０ｕＭ：３９８
　ＡＴＲＡ　１０ｕＭ：２２．８
　であった。
　各図に示すように、いずれの細胞株においても、エンコラフェニブ及びビニメチニブの濃度が高くなるほど細胞生存率が低下し、癌細胞の増殖が抑制されているが、いずれもＡＴＲＡの濃度が高い方がより細胞生存率が低下している。したがって、ＡＴＲＡはいずれの大腸癌細胞株においても、エンコラフェニブ及びビニメチニブの細胞増殖阻害効果を増大させることが示された。
　これらの結果より、ＢＲＡＦ　Ｖ６００Ｅ変異型大腸癌細胞株ＲＫＯ、ＨＴ２９、ＷｉＤＲ、ＣＯ１１５において、ＡＴＲＡ、エンコラフェニブ及びビニメチニブの併用療法は、相乗効果を示す可能性が示唆された。
　（試験例３：各レチノイド化合物による細胞増殖抑制効果の検証）
　ＡＴＲＡ（トレチノイン）以外のレチノイド受容体に作用する化合物について、細胞増殖の抑制効果、すなわちＢＲＡＦ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤の細胞増殖の抑制の作用を増強する効果について調べた。レチノイド受容体に作用する化合物としてはレチノイドのうち、レチノール、タミバロテン、ベキサロテンを用いた。細胞株としては上述のＲＫＯ、ＨＴ２９、ＣＯ１１５の細胞株を用いた。併用するＢＲＡＦ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤としては試験例２と同様、エンコラフェニブ及びビニメチニブを等量で混合した成分（ＥＢ）を用いた。
　図３にＲＫＯ細胞株を用いた結果を示した。図３（ａ）にレチノール（０μＭ又は３０μＭ）、図３（ｂ）にタミバロテン（０μＭ又は１０μＭ）、図３（ｃ）にベキサロテン（０μＭ又は１０μＭ）を用いて、ＥＢが０μＭ又は０．１μＭにおける、細胞生存率を示した。これらの図が示すように、ＲＫＯ細胞株において、レチノール、タミバロテン、ベキサロテンのいずれのレチノイドによっても、ＥＢにさらにレチノイドを加えた場合の方が細胞生存率が大きく減少し、ＥＢの細胞増殖の抑制の作用を増強する効果が示された。
　図４にＨＴ２９細胞株を用いた結果を示した。図４（ａ）にレチノール（０μＭ又は１μＭ）、図４（ｂ）にタミバロテン（０μＭ又は１μＭ）、図３（ｃ）にベキサロテン（０μＭ又は１μＭ）を用いて、ＥＢが０μＭ又は０．０１μＭにおける、細胞生存率を示した。これらの図が示すように、ＨＴ２９細胞株において、レチノール、タミバロテン、ベキサロテンのいずれのレチノイドによっても、ＥＢにさらにレチノイドを加えた場合の方が細胞生存率が大きく減少し、ＥＢの細胞増殖の抑制の作用を増強する効果が示された。
　図５にＣＯ１１５細胞株を用いた結果を示した。図５（ａ）にレチノール（０μＭ又は３０μＭ）、図５（ｂ）にタミバロテン（０μＭ又は３０μＭ）を用いて、ＥＢが０μＭ又は０．１μＭにおける、細胞生存率を示した。これらの図が示すように、ＣＯ１１５細胞株において、レチノール、タミバロテンのいずれのレチノイドによっても、ＥＢにさらにレチノイドを加えた場合の方が細胞生存率が大きく減少し、ＥＢの細胞増殖の抑制の作用を増強する効果が示された。
　（試験例４：エンコラフェニブ／セツキシマブ耐性株における効果の検証）
　エンコラフェニブ／セツキシマブ耐性株を作成し、その耐性株について、ＡＴＲＡによる阻害剤の増強効果を調べた。
　耐性株の作成については、上述のＲＫＯ細胞を１５ｍｍディシュに播き、ＢＲＡＦ阻害剤Ｅｎｃｏｒａｆｅｎｉｂ、抗ＥＧＦＲ抗体薬Ｃｅｔｕｘｉｍａｂを投与する群及びＢＲＡＦ阻害剤Ｅｎｃｏｒａｆｅｎｉｂ、ＭＥＫ阻害剤Ｂｉｎｉｍｅｔｉｎｉｂ、抗ＥＧＦＲ抗体薬Ｃｅｔｕｘｉｍａｂを投与する群を準備した。
　ＲＫＯ細胞ではそれぞれＥｎｃｏｒａｆｅｎｉｂ　１０ｎＭ、Ｂｉｎｉｍｅｔｉｎｉｂ　１０ｎＭ、Ｃｅｔｕｘｉｍａｂは１μｇ／ｍｌから開始し、増殖速度や投与期間を考慮しつつ、薬剤を漸増して、耐性株を得た。
　この耐性株（図中のＲ）とコントロールとして感受性株（図中のＳ）を用い、トレチノイン（ＡＴＲＡ）を０μＭ又は１μＭ投与した効果を比較した結果を図６に示す。縦軸に生存率（比）、横軸にエンコラフェニブの投与量を示した。
　図の結果からは、感受性株（Ｓ）はＡＴＲＡを投与しない（０μＭ）ものでも、エンコラフェニブ投与量０～１０μＭにしたがって生存率が低下している。ＡＴＲＡを投与したもの（１μＭ）ではより低下し、生存率は０．１前後となっている。
　耐性株（Ｒ）は、ＡＴＲＡを投与していない（０μＭ）ものは、エンコラフェニブ耐性を獲得しているので、エンコラフェニブの投与量に対して生存率の低下が少なく、エンコラフェニブ１０μｍでも０．７～０．８の生存率を示している。
　しかしながら、耐性株（Ｒ）にＡＴＲＡを投与した（１μＭ）ものは、感受性株にＡＴＲＡを投与しないものと同程度（生存率０．３前後）まで生存率が低下している。この結果から、ＡＴＲＡはエンコラフェニブ耐性を獲得した細胞株に対しても、エンコラフェニブによる阻害すなわち細胞増殖抑制効果を付与することができることが示された。
　また、各細胞株についてＩＣ５０（５０％阻害濃度）は、
感受性株
　ＡＴＲＡ　０μＭ：１．２３
　ＡＴＲＡ　１μＭ：０．００４６
耐性株
　ＡＴＲＡ　０μＭ：＞１０
　ＡＴＲＡ　１μＭ：１．５８ 
　であった。
　これらの結果から、ＢＲＡＦ変異型大腸癌細胞株のＢＲＡＦ阻害剤に抵抗性となった細胞株（二次性）でも、ＡＴＲＡはＢＲＡＦ阻害剤＋抗ＥＧＦＲ抗体＋－ＭＥＫ阻害剤の効果増強を示すことが明らかとなった。
　（試験例５：ＰＤＸモデルにおける効果の検証）
　Ｉｎ　Ｖｉｖｏ試験として、本実施形態の癌治療剤をマウスに投与し、腫瘍サイズ（体積）の変化により抗腫瘍効果を検証した。
　Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ　ｍｏｕｓｅ　ｍｏｄｅｌは以下のように準備した。
　メスのヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ）は、Ｃｈａｒｌｅｓ　Ｒｉｖｅｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｊａｐａｎ（Ｙｏｋｏｈａｍａ、Ｊａｐａｎ）から購入し、特定病原体除去環境で飼育した。
　培養された上述のＨＴ２９細胞をトリプシンで回収し、１×１０７個／ｍｌとなるよう、培養培地とＣｏｒｎｉｎｇマトリゲル基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）の混合溶液に懸濁した。
　０．１ｍＬの細胞懸濁液を各マウスの左側腹部領域に皮下移植した。腫瘍体積が１５０～２００ｍｍ３に達した時点で、マウスをランダムにコントロール群、ａｌｌ－ｔｒａｎｓ　Ｒｅｔｉｎｏｉｃ　Ａｃｉｄ（ＡＴＲＡ）投与群、Ｅｎｃｏｒａｆｅｎｉｂ／Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ投与群、ＡＴＲＡ／Ｅｎｃｏｒａｆｅｎｉｂ／Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ投与群に群分けした。Ｅｎｃｏｒａｆｅｎｉｂは１０ｍｇ／ｋｇ、ＡＴＲＡは１０ｍｇ／ｋｇの用量で２１日間毎日経口投与をされた。経口投与にはマウス用経口ゾンデを用いた。Ｃｅｔｕｘｉｍａｂは２０ｍｇ／ｋｇの用量で週に２回腹腔内投与された。コントロールには各溶媒を用いた。治療開始後より腫瘍サイズ及び体重を３日毎に測定し、計算式（腫瘍体積（ｍｍ３）＝１／２×長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ））を用いて体積を推定した。動物実験は東北大学の施設動物管理使用委員会によって承認され、東北大学の施設ガイドラインに従って実施された。
　結果を図７に示す。図７（ａ）に平均の腫瘍体積、図７（ｂ）に平均の体重を示した。図７（ａ）の有意差はＯｎｅ－ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ、Ｔｕｋｅｙ－Ｋｒａｍｅｒ　ｔｅｓｔでｐ＜０．０５とした。
　図７（ａ）に示すように、腫瘍体積は、ＤＭＳＯ（コントロール溶媒）及びＡＴＲＡのみ投与した群では、体積（腫瘍サイズ）は日によって増加しており、腫瘍細胞の増殖が起こっている。Ｅｎｃｏｒａｆｅｎｉｂ／Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ投与群（ｅｎｃｏ／ｃｅｔ体積）では前記群よりは腫瘍サイズの増加が抑えられ、従来知られているようにＥｎｃｏｒａｆｅｎｉｂ／Ｃｅｔｕｘｉｍａｂの増殖の抑制効果が起こっている。
　これに対して、ＡＴＲＡ／Ｅｎｃｏｒａｆｅｎｉｂ／Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ投与群（ＡＴＲＡ／ｅｎｃｏｒｅ／ｃｅｔ体積）では腫瘍サイズの減少がみられる。これはＡＴＲＡの投与によって、Ｅｎｃｏｒａｆｅｎｉｂ／Ｃｅｔｕｘｉｍａｂと相乗効果を起こし、増殖の抑制効果が、腫瘍サイズが減少するほどに顕著であることを示している。図７（ｂ）に示すように、各投与群において体重に関してはいずれも大きな差はなく、ＡＴＲＡにより顕著な副作用等は生じていない。
　この結果により、本実施形態のＡＴＲＡとエンコラフェニブ、セツキシマブを併用した成分はＩｎ　Ｖｉｖｏでも顕著に腫瘍サイズの減少の効果を持ち、癌治療剤として有効であることが明らかとなった。
　（試験例６：各レチノイド化合物による細胞増殖抑制効果の検証２）
　ＡＴＲＡ以外のレチノイド受容体に作用する化合物を用いて、細胞増殖の抑制効果、すなわちＢＲＡＦ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤の細胞増殖の抑制の作用を増強する効果について、試験例３よりも細かく濃度をふってより詳細に検証した。レチノイド受容体に作用する化合物としてはレチノイドのうち、レチノール、タミバロテン、ベキサロテンを用いた。細胞株としては上述のＲＫＯ、ＨＴ２９、ＣＯ１１５、ＷｉＤＲ、ＣＯＬＯ２０５、及びＬＩＭ２４０５の大腸癌細胞株を用いた。併用するＢＲＡＦ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤としては試験例２と同様、エンコラフェニブ及びビニメチニブを等量で混合した成分（ＥＢ）を用いた。
　図８にレチノールを用いた結果を示した。図８（ａ）にＲＫＯ細胞株、図８（ｂ）にＨＴ２９細胞株、図８（ｃ）にＣＯ１１５細胞株、図８（ｄ）にＷｉＤＲ細胞株、図８（ｅ）にＣＯＬＯ２０５細胞株、図８（ｆ）にＬＩＭ２４０５細胞株を用いた結果を示した。
　これらの図が示すように、ＲＫＯ、ＨＴ２９、ＣＯ１１５、ＷｉＤＲ、ＣＯＬＯ２０５、及びＬＩＭ２４０５のいずれの細胞株においても、ＥＢの濃度依存的に細胞生存率が減少していた。また、ＥＢにさらにレチノールを加えた場合の方が、細胞生存率が大きく減少し、且つ、細胞生存率の減少はレチノールの濃度依存的であり、ＥＢの細胞増殖の抑制の作用を増強する効果が示された。
　図９にタミバロテンを用いた結果を示した。図９（ａ）にＲＫＯ細胞株、図８（ｂ）にＨＴ２９細胞株、図９（ｃ）にＣＯ１１５細胞株、図９（ｄ）にＷｉＤＲ細胞株、図９（ｅ）にＣＯＬＯ２０５細胞株、図９（ｆ）にＬＩＭ２４０５細胞株を用いた結果を示した。
　これらの図が示すように、ＲＫＯ、ＨＴ２９、ＣＯ１１５、ＷｉＤＲ、ＣＯＬＯ２０５、及びＬＩＭ２４０５のいずれの細胞株においても、ＥＢの濃度依存的に細胞生存率が減少していた。また、ＥＢにさらにタミバロテンを加えた場合の方が、細胞生存率が大きく減少し、且つ、細胞生存率の減少はタミバロテンの濃度依存的であり、ＥＢの細胞増殖の抑制の作用を増強する効果が示された。
　図１０にベキサロテンを用いた結果を示した。図１０（ａ）にＲＫＯ細胞株、図１０（ｂ）にＨＴ２９細胞株、図１０（ｃ）にＣＯ１１５細胞株、図１０（ｄ）にＷｉＤＲ細胞株、図１０（ｅ）にＣＯＬＯ２０５細胞株、図１０（ｆ）にＬＩＭ２４０５細胞株を用いた結果を示した。
　これらの図が示すように、ＲＫＯ、ＨＴ２９、ＣＯ１１５、ＷｉＤＲ、ＣＯＬＯ２０５、及びＬＩＭ２４０５のいずれの細胞株においても、ＥＢの濃度依存的に細胞生存率が減少していた。また、ＥＢにさらにベキサロテンを加えた場合の方が、細胞生存率が大きく減少し、且つ、細胞生存率の減少はベキサロテンの濃度依存的であり、ＥＢの細胞増殖の抑制の作用を増強する効果が示された。
　以上の結果から、レチノール、タミバロテン、ベキサロテンは、複数のＢＲＡＦ変異型大腸癌細胞株において、ＥＢによる細胞増殖抑制を相乗的に増強することが示された。
　（試験例７：レチノイド受容体に作用する化合物、ＢＲＡＦ阻害剤、及びＭＥＫ阻害剤の併用のアポトーシスへの影響の検証）
　レチノイド受容体に作用する化合物、ＢＲＡＦ阻害剤、及びＭＥＫ阻害剤の併用によるＢＲＡＦ変異型大腸癌細胞のアポトーシス誘導への影響を検証した。
　ＲＫＯ細胞株及びＨＴ２９細胞株をそれぞれ７．５×１０４個／ｗｅｌｌ、８．０×１０４個／ｗｅｌｌの細胞数で６－ｗｅｌｌプレートに播種した。２４時間培養した後、各細胞株にＤＭＳＯ、ＴＲＥ、ＥＮＣ＋ＢＩＮ又はＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮをそれぞれ投与した。ＲＫＯ細胞株にはＤＭＳＯ　０．１ｖ／ｖ％、ＴＲＥ　１０μＭ、ＥＮＣ　１００ｎＭ、ＢＩＮ　１００ｎＭとなるよう、ＨＴ２９細胞株にはＤＭＳＯ　０．１ｖ／ｖ％、ＴＲＥ　１０μＭ、ＥＮＣ　１０ｎＭ、ＢＩＮ　１０ｎＭとなるよう投与し、３７℃で７２時間培養した。その後、細胞を回収しＰＢＳで洗浄を行い、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ－ＦＩＴＣ　Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｎａｋａｌａｉ　Ｔｅｓｑｕｅ）を用いてＡｎｎｅｘｉｎ　ＶとＰＩで細胞を染色した。ＣｙｔｏＦＬＥＸ　ＬＸを用いてアポトーシス細胞を検出した。Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖが陽性の細胞割合をアポトーシス細胞割合として計算した。以上を独立した実験として３回行った。有意差検定にはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ　ｔｅｓｔを使用した。
　図１１にＲＫＯ細胞株におけるＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖ－ＰＩアッセイの結果を示した。図１１（ａ）にＤＭＳＯ、ＴＲＥ、ＥＮＣ＋ＢＩＮ、及びＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮにおけるＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖに対するヨウ化プロピジウム（ＰＩ）のドットプロットを示した。図１１（ｂ）にＤＭＳＯ、ＴＲＥ、ＥＮＣ＋ＢＩＮ、及びＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮにおけるアポトーシス細胞割合（％）を示した。
　ＲＫＯ細胞株において、ＤＭＳＯとＴＲＥではアポトーシス細胞割合に有意な変化を認めなかった。一方で、ＥＮＣ＋ＢＩＮと比較してＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮはアポトーシス細胞割合を有意に増加させた。
　図１２にＨＴ２９細胞株におけるＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖ－ＰＩアッセイの結果を示した。図１２（ａ）にＤＭＳＯ、ＴＲＥ、ＥＮＣ＋ＢＩＮ、及びＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮにおけるＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖに対するＰＩのドットプロットを示した。図１２（ｂ）にＤＭＳＯ、ＴＲＥ、ＥＮＣ＋ＢＩＮ、及びＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮにおけるアポトーシス細胞割合（％）を示した。
　ＨＴ２９細胞株において、ＤＭＳＯとＴＲＥではアポトーシス細胞割合に有意な変化を認めなかった。一方で、ＥＮＣ＋ＢＩＮと比較してＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮはアポトーシス細胞割合を有意に増加させた。
　以上の結果から、ＴＲＥはＥＮＣ＋ＢＩＮと併用することによってアポトーシス誘導能を増強することを示した。
　（試験例８：レチノイド受容体に作用する化合物単独、並びに、レチノイド受容体に作用する化合物、ＢＲＡＦ阻害剤、及びＭＥＫ阻害剤の併用によって変化する遺伝子発現の解析）
　レチノイド受容体に作用する化合物単独と、レチノイド受容体に作用する化合物、ＢＲＡＦ阻害剤、及びＭＥＫ阻害剤の併用によって変化する遺伝子発現の違いを明らかにするために、ｍＲＮＡマイクロアレイを用いて網羅的な遺伝子発現解析を行った。
　ＲＫＯ細胞株及びＨＴ２９細胞株をそれぞれ５．０×１０４個／ｗｅｌｌ、１．２×１０５個／ｗｅｌｌの細胞数で６－ｗｅｌｌプレートに播種した。２４時間培養した後、各細胞株にＤＭＳＯ、ＴＲＥ、ＥＮＣ＋ＢＩＮ又はＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮをそれぞれ投与した。両細胞株にはＤＭＳＯ　０．１ｖ／ｖ％、ＴＲＥ　１μＭ、ＥＮＣ　１０ｎＭ、ＢＩＮ　１０ｎＭとなるよう投与した。薬剤投与から２４時間後に細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ　Ｉｎｃ．）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出した。ｔｏｔａｌ　ＲＮＡの量をＮａｎｏＤｒｏｐ　ＮＤ－１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．）を使用して測定した。Ｌｏｗ　Ｉｎｐｕｔ　Ｑｕｉｃｋ　Ａｍｐ　Ｌａｂｅｌｉｎｇ　Ｋｉｔ、ｏｎｅ－ｃｏｌｏｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して抽出された１００ｎｇのｔｏｔａｌ　ＲＮＡを増幅し、Ｃｙａｎｉｎｅ３でラベル化した。ｃＲＮＡの量と質をＡｇｉｌｅｎｔ　Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とＮａｎｏＤｒｏｐ　Ｏｎｅ　ＮＤ－ＯＮＥ－Ｗ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．）を使用して測定した。ラベル化されたＲＮＡをＳｕｒｅ　Ｐｒｉｎｔ　Ｇ３　Ｈｕｍａｎ　ＧＥマイクロアレイ８＊６０Ｋ　Ｖｅｒ３．０（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に６５℃で１７時間回転させてハイブリダイズした。洗浄後、Ａｇｉｌｅｎｔ　ＤＮＡマイクロアレイスキャナーＧ２５０５Ｃ（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でマイクロアレイをスキャンした。Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｆｅａｔｕｒｅ　Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎソフトウェアバージョン１０．７を使用して、スキャンされた蛍光強度を定量化した。Ｇｅｎｅ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｖｅｒ．１４．５（Ａｇｉｌｅｎｔ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、発現分析を行った。７５パーセンタイルシフトで正規化を行った。Ｓｕｒｅ　Ｐｒｉｎｔ　Ｇ３　Ｈｕｍａｎ　ＧＥマイクロアレイ８＊６０Ｋ　Ｖｅｒ３．０には合計５０，５９９個のプローブがある。本試験では、遺伝子発現変化の有意差を特定するために、倍率変化２倍以上の変化を有意差ありの基準とした。
　次いで、有意な遺伝子発現の変化に対するＰａｔｈｗａｙ解析には、ＤＡＶＩＤ（ｔｈｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ　ｆｏｒ　Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ、Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）というバイオインフォマティクス・ソフトウェア（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）を用いて行った。修正フィッシャー正確確率検定でｐ≦０．０５かつ遺伝子数が１０個以上含まれるＫｙｏｔｏ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）ｐａｔｈｗａｙを抽出した。さらに腫瘍内の分子シグナル伝達経路に変化があるかどうかを調べるため、ＫＥＧＧカテゴリー３のＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇとカテゴリー４のＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓに属する分子シグナル伝達経路を抽出した。
　ＴＲＥ、ＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮによって有意に変化し、解析可能であったＲＫＯ細胞株の遺伝子はそれぞれ７９０遺伝子、１，２２２遺伝子であった。これらの変動遺伝子を用いてＰａｔｈｗａｙ解析を行ったところ、ＴＲＥでは３個の、ＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮでは１４個のシグナル伝達経路が濃縮された（以下の表１及び表３参照）。さらに腫瘍内の分子シグナル伝達経路に着目するために、ＫＥＧＧ　ｃａｔｅｇｏｒｙにおけるＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇとＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓに属するシグナル伝達経路に限定し、ＴＲＥでは３個の、ＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮでは６個のシグナル伝達経路を同定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　ＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮによって変化する遺伝子は、ＴＲＥでは認められなかったようなＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路及びＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達経路等の細胞増殖に関与するシグナル伝達経路に属する遺伝子群に含まれることを示した。
　ＴＲＥ、ＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮによって有意に変化し、解析可能であったＨＴ２９細胞株の遺伝子はそれぞれ１，２７４遺伝子、１，６１９遺伝子であった。これらの変動遺伝子を用いてＰａｔｈｗａｙ解析を行ったところ、ＴＲＥでは１２個、ＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮでは３１個のシグナル伝達経路がエンリッチされた（上記表２及び表４参照）。ＲＫＯ細胞株の解析と同様に行い、最終的にＴＲＥでは３個、ＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮでは９個のシグナル伝達経路を同定した。ＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮによって変化する遺伝子は、ＴＲＥでは認められなかったようなＪＡＫ－ＳＴＡＴシグナル伝達経路、Ｒａｓシグナル伝達経路及びＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達経路等の細胞増殖に関与する分子シグナル伝達経路に属する遺伝子群に含まれることを示した。
　（試験例９：レチノイド受容体に作用する化合物、ＢＲＡＦ阻害剤、及びＭＥＫ阻害剤の併用によって変化するタンパク質発現の解析）
　レチノイド受容体に作用する化合物、ＢＲＡＦ阻害剤、及びＭＥＫ阻害剤の併用が特異的なタンパク質又はリン酸化タンパク質発現に及ぼす影響を明らかにするために、抗体マイクロアレイを用いて、網羅的な遺伝子発現解析を行った。
　ＲＫＯ細胞株を５．０×１０４個／ｗｅｌｌの細胞数となるよう６－ｗｅｌｌ　ｐｌａｔｅに播種した。２４時間培養した後、ＤＭＳＯ、ＴＲＥ、ＥＮＣ＋ＢＩＮ又はＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮをそれぞれ投与した。それぞれＤＭＳＯ　０．１ｖ／ｖ％、ＴＲＥ　１０μＭ、ＥＮＣ　１０ｎＭ、ＢＩＮ　１０ｎＭとなるよう投与した。薬剤投与から４８時間後に細胞を回収した。遠心操作によって分離し、細胞ペレットを作成し、－８０℃で凍結した。タンパク質抽出以降の実験工程はＫｉｎｅｘＴＭ抗体マイクロアレイ受託サービス（コスモ・バイオ株式会社）の受託解析にて行った。本試験で使用された抗体アレイＫＡＭ－２０００（Ｋｉｎｅｘｕｓ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）は８７５個のリン酸化部位特異的抗体と４５１個の汎特異的抗体が対象となっている。本試験ではタンパク質又はリン酸化タンパク質発現変化の有意差を特定するために、Ｋｉｎｅｘｕｓ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ社が推奨する％Ｃｈａｎｇｅ　Ｆｒｏｍ　Ｃｏｎｔｒｏｌ値（％ＣＦＣ）≧４５、％ＣＦＣ≦－４５の変化を有意差ありの基準とした。
　次いで、タンパク質又はリン酸化タンパク質発現の変化に対するＰａｔｈｗａｙ解析には、ＤＡＶＩＤ（ｔｈｅ　Ｄａｔａｂａｓｅ　ｆｏｒ　Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ、Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ）というバイオインフォマティクス・ソフトウェア（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）を用いて行った。修正フィッシャー正確確率検定でｐ≦０．０５かつタンパク質又はリン酸化タンパク質数が１０個以上含まれるＫｙｏｔｏ　Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｓ　ａｎｄ　Ｇｅｎｏｍｅｓ（ＫＥＧＧ）ｐａｔｈｗａｙを抽出した。さらに腫瘍内の分子シグナル伝達経路に変化があるかどうかを調べるため、ＫＥＧＧカテゴリー３のＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇとカテゴリー４のＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓに属する分子シグナル伝達経路を抽出した。
　ＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮで特異的に変動したタンパク質及びリン酸化タンパク質を抽出するために、ＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮで変動したタンパク質からＴＲＥ、ＥＮＣ＋ＢＩＮで変動したタンパク質及びリン酸化タンパク質を除外した。その結果、解析可能なタンパク質は１０６個であった。これらのタンパク質及びリン酸化タンパク質を用いてＰａｔｈｗａｙ解析を行うと、３０個のシグナル伝達経路がエンリッチされた。腫瘍内の分子シグナル伝達経路に着目するために、ＫＥＧＧ　ｃａｔｅｇｏｒｙにおけるＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇとＣｅｌｌｕｌａｒ　Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓに属するシグナル伝達経路に限定し、９個のシグナル伝達経路を同定した（以下の表５参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　このＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮによって特異的に変動したタンパク質及びリン酸化タンパク質は、ＭＡＰＫシグナル伝達経路、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達経路、ＦｏｘＯシグナル伝達経路及びＥｒｂＢシグナル伝達経路等、腫瘍増殖に関与するシグナル伝達経路に属していることを示した。
　（試験例１０：レチノイド受容体に作用する化合物、ＢＲＡＦ阻害剤、及びＭＥＫ阻害剤の併用によるタンパク質発現の変化）
　レチノイド受容体に作用する化合物、ＢＲＡＦ阻害剤、及びＭＥＫ阻害剤の併用による細胞増殖抑制効果の増強に関わる分子生物学的機序を明らかにするために、レチノイド受容体に作用する化合物、ＢＲＡＦ阻害剤、及びＭＥＫ阻害剤の併用によるタンパク質の発現変化を確認した。
　Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔに使用した一次抗体の種類、希釈倍率については以下の表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　回収した細胞にＨａｌｔ　Ｐｒｏｔｅａｓｅ　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　Ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．）を添加したＲａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ　ａｓｓａｙ　ｂｕｆｆｅｒ（組成：５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｃｈｌｏｒｉｄｅ、０．５ｗ／ｖ％　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１ｗ／ｖ％　Ｓｏｄｉｕｍ　Ｄｏｄｅｃｙｌ　Ｓｕｌｆａｔｅ、１．０ｗ／ｖ％　ＮＰ－４０　ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）を加えて溶解し、タンパク質を抽出した。抽出したタンパク質をビシンコニン酸法により定量した。５μｇの蛋白質サンプルをポリアクリルアミド電気泳動で分離し、Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ　ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ　ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＰＶＤＦ膜、Ｍｅｒｃｋ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｌｔｄ．）に転写した後、Ｏｄｙｓｓｅｙ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｃｏｒ　Ｉｎｃ．）にて１時間室温でブロッキングした。その後、一次抗体液に転写後のＰＶＤＦ膜を浸し、室温で２時間又は４℃で一晩培養した。一次抗体反応後、Ｔｒｉｓ　Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ　ｗｉｔｈ　Ｔｗｅｅｎ　２０（ＴＢＳ－Ｔ）で室温にて５分の洗浄を３回行い、二次抗体に浸して室温で１時間培養した。二次抗体はＧｏａｔ　ａｎｔｉ－Ｒａｂｂｉｔ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｈｉｇｈｌｙ　Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ　Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６８０（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．）とＧｏａｔ　ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）Ｈｉｇｈｌｙ　Ｃｒｏｓｓ－Ａｄｓｏｒｂｅｄ　Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ　Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒ６８０（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．）を希釈倍率１：１０００で用いた。その後ＴＢＳ－Ｔで５分間の洗浄を３回行い、Ｏｄｙｓｓｅｙ　Ｉｎｆｒａｒｅｄ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｃｏｒ　Ｉｎｃ．）を用いてシグナルの測定を行った。解析用ソフトＩｍａｇｅＪ　ｖｅｒｓｉｏｎ　１．５３ａ（Ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ、ａｖａｉｌａｂｌｅ　ａｔ：http://imagej.nih.gov/ij/）によるｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙを用いて、検出したバンドを定量化し、内在コントロールβ－Ａｃｔｉｎ、α－ｔｕｂｕｌｉｎ又はＧＡＰＤＨで補正した。以上を独立した実験として３回以上行った。有意差検定にはＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ　ｔ　ｔｅｓｔを使用した。
　ｍＲＮＡマイクロアレイ及び抗体アレイの結果を踏まえて、ＭＡＰＫシグナル伝達経路に関連するｐ－ＥＲＫ、ｔ－ＥＲＫ及びｐ－ＭＥＫ、ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達経路に関連するｐ－ＡＫＴの発現レベルを解析した。また前述のＡｎｎｅｘｉｎ　Ｖ－ＰＩアッセイの結果から、ＴＲＥはＥＮＣ＋ＢＩＮによるアポトーシス誘導能を増強する。ＴＲＥによるアポトーシス誘導の機序の一つとしてＢｃｌ－２ファミリーの制御があることから、ＰＡＲＰに加えＢｃｌ－２ファミリータンパク質であるＢｃｌ－２、Ｍｃｌ－１、Ｂｃｌ－ｘＬ、ＢＡＸ及びＢＡＫの発現レベルを解析した。さらに、ＴＲＥは単剤又は細胞障害性抗がん薬との併用療法によってＤＮＡ損傷を誘導し、腫瘍増殖抑制を誘導する。またＤＮＡ損傷とＢｃｌ－２ファミリーが相互に影響することが報告されている。これらの過去の報告からＴＲＥによるＢｃｌ－２ファミリーを介したアポトーシスと関与すると考えられるＤＮＡ損傷を反映するｐ－Ｈ２ＡＸの発現レベルについても解析した。
　図１３にＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔを用いたＭＡＰＫシグナル伝達経路に関連するｐ－ＭＥＫの発現変化の解析結果を示した。図１３（ａ）にＲＫＯ細胞株を用いたＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔのバンドを、図１３（ｂ）にＨＴ２９細胞株を用いたＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔのバンドを、図１３（ｃ）に図１３（ａ）のバンドのシグナル強度を定量化したグラフを、図１３（ｄ）に図１３（ｂ）のバンドのシグナル強度を定量化したグラフを示した。
　図１４にＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔを用いたＭＡＰＫシグナル伝達経路に関連するｐ－ＥＲＫ、及びｔ－ＥＲＫの発現変化の解析結果を示した。
　ＴＲＥとＥＮＣ＋ＢＩＮの併用はＥＮＣ＋ＢＩＮと比較して、ＲＫＯ細胞株及びＨＴ２９細胞株におけるｐ－ＭＥＫの発現を有意に低下させた（図１３（ａ）及び図１３（ｂ））。しかし、その下流であるｐ－ＥＲＫの発現には有意な差は認めなかった（図１４）。この結果は、ＴＲＥとＥＮＣ＋ＢＩＮの併用による細胞増殖抑制を増強する機序にはＭＡＰＫシグナル伝達経路を直接介することが主ではないことを示唆した。
　図１５にＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔを用いたＰＩ３Ｋ－Ａｋｔシグナル伝達経路に関連するｐ－ＡＫＴの発現変化の解析結果を示した。図１５（ａ）にＲＫＯ細胞株を用いたＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔのバンドを、図１５（ｂ）にＨＴ２９細胞株を用いたＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔのバンドを、図１５（ｃ）に図１５（ａ）のバンドのシグナル強度を定量化したグラフを、図１５（ｄ）に図１５（ｂ）のバンドのシグナル強度を定量化したグラフを示した。
　ＴＲＥとＥＮＣ＋ＢＩＮの併用はＥＮＣ＋ＢＩＮと比較してＲＫＯ細胞株におけるｐ－ＡＫＴの発現を有意に低下させたものの、ＨＴ２９細胞株では同様の傾向は認めなかった。
　図１６にＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔを用いたアポトーシス誘導の機序に関連するＰＡＲＰの発現変化の解析結果を示した。図１６（ａ）にＲＫＯ細胞株を用いたＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔのバンドを、図１６（ｂ）にＨＴ２９細胞株を用いたＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔのバンドを、図１６（ｃ）に図１６（ａ）のバンドのシグナル強度を定量化したグラフを、図１６（ｄ）に図１６（ｂ）のバンドのシグナル強度を定量化したグラフを示した。
　図１７にＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔを用いたＢｃｌ－２ファミリーに関連するタンパク質の発現変化の解析結果を示した。図１７（ａ）にＲＫＯ細胞株、図１７（ｂ）にＨＴ２９細胞株を用いた結果を示した。図１８に、図１７の各タンパク質のバンドのシグナル強度を定量化したグラフを示した。図１８（ａ）、図１８（ｂ）、図１８（ｅ）、図１８（ｆ）、図１８（ｉ）はＲＫＯ細胞株を用いた結果であり、図１８（ｃ）、図１８（ｄ）、図１８（ｇ）、図１８（ｈ）、図１８（ｊ）、図１８（ｋ）はＨＴ２９細胞株を用いた結果である。
　ＴＲＥとＥＮＣ＋ＢＩＮの併用は、ＥＮＣ＋ＢＩＮと比較してＲＫＯ細胞株とＨＴ２９細胞株におけるｃｌｅａｖｅｄ　ＰＡＲＰ、ＢＡＫ及びｐ－Ｈ２ＡＸの発現を増強した。この結果はＴＲＥとＥＮＣ＋ＢＩＮの併用による細胞増殖抑制を増強する分子生物学的機序にアポトーシス誘導能の増強が寄与していることを示し、Ａｎｎｅｘｉｎ　Ｖ－ＰＩアッセイの結果を裏付けるものであった。またＴＲＥとＥＮＣ＋ＢＩＮの併用がＥＮＣ＋ＢＩＮと比較してＢｃｌ－２ファミリーのエフェクターであるＢＡＫ及びＤＮＡ損傷のマーカーであるｐ－Ｈ２ＡＸの発現を増強したことは、その機序にＢｃｌ－２ファミリーやＤＮＡ損傷が関与することを示唆した。
　（試験例１１：レチノイド受容体に作用する化合物による細胞増殖抑制の増強効果と内因性のＲＡＲα及びＲＸＲαのタンパク質発現との関連性の検証）
　ＴＲＥによる細胞増殖抑制効果と関連するＴＲＥの受容体にＲＡＲαやＲＸＲαがある。ＴＲＥをはじめとしたレチノイド受容体に作用する化合物がＥＮＣ＋ＢＩＮの細胞増殖抑制効果を増強させる機序に、ＲＡＲα又はＲＸＲαを介した機序があると仮説を立てた。まず、内因性のＲＡＲα又はＲＸＲαのタンパク質発現の程度とＴＲＥがＥＮＣ＋ＢＩＮの細胞増殖抑制を増強する効果との関係を評価するために、試験例１０と同様の方法により、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔを用いて解析した。
　図１９に各ＢＲＡＦ変異型大腸癌細胞株における内因性のＲＡＲα及びＲＸＲαのタンパク質発現をＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔにより解析した結果を示した。
　内因性のＲＡＲαの発現はＲＫＯ細胞株では認めたものの、他の細胞株ではほとんど認められないレベルであった。内因性のＲＸＲαの発現はＷｉＤＲ細胞株、ＨＴ２９細胞株、ＬＩＭ２４０５細胞株、ＲＫＯ細胞株、ＣＯＬＯ２０５細胞株、ＣＯ１１５細胞株の順で高かった。
　これらの結果から、ＴＲＥがＥＮＣ＋ＢＩＮの細胞増殖抑制を増強する効果と内因性のＲＡＲαとＲＸＲαのタンパク質発現レベルの間に明らかな相関は認められなかった。
　（試験例１２：ＲＡＲα又はＲＸＲαの発現制御下でのレチノイド受容体に作用する化合物、ＢＲＡＦ阻害剤、及びＭＥＫ阻害剤の併用による細胞増殖抑制効果の検証）
　次に、レチノイド受容体に作用する化合物によるＢＲＡＦ阻害剤、及びＭＥＫ阻害剤の細胞増殖抑制を増強する効果が、ＲＡＲα又はＲＸＲαの発現変化に影響を受けるかを明らかにするために、ｓｉＲＮＡによってＲＡＲα又はＲＸＲαの発現を抑制させたＲＫＯ細胞株とＨＴ２９細胞株を用いてＭＴＴアッセイを行った。
　具体的には、ｓｉＲＮＡによる発現抑制に、ｓｉＧＥＮＯＭＥ　ｓｉＲＮＡ　Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｈｏｒｉｚｏｎ　Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　Ｌｔｄ．）のうち、ｓｉＧＥＮＯＭＥ　Ｈｕｍａｎ　ＲＡＲＡ　ｓｉＲＮＡ　ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（ｃａｔａｌｏｇ＃Ｍ－００３４３７－０２－０００５）、ｓｉＧＥＮＯＭＥ　Ｈｕｍａｎ　ＲＸＲＡ　ｓｉＲＮＡ　ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（ｃａｔａｌｏｇ＃Ｍ－００３４４３－０２－０００５）及びｓｉＧＥＮＯＭＥ　Ｎｏｎ－Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ　ｓｉＲＮＡ　Ｐｏｏｌ（ｃａｔａｌｏｇ＃Ｄ－００１２０６－１３－０５）を使用した。ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ　２０００　Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｉｎｃ．）を使用し、ｓｉＲＮＡの終濃度が２５ｎＭとなる条件でトランスフェクションを行った。
　ＲＫＯ細胞ではＲＡＲαとＲＸＲαの両方が、その他のＢＲＡＦ変異型大腸癌細胞ではＲＸＲαのみが内因性に発現している点を考慮し、レチノイドのうちＲＡＲαとＲＸＲαの両方に作用するＴＲＥと選択的ＲＸＲアゴニストであるＢＥＸを使用した。
　まず、ｓｉＲＮＡによるＲＫＯ細胞株のＲＡＲαとＲＸＲαのタンパク質発現変化を試験例１０と同様の方法により、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔを用いて解析した。ｓｉＲＮＡを用いたＲＡＲα、ＲＸＲαの発現を抑制されたＲＫＯ細胞におけるＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ解析では、ｓｉ－ＮＣ導入細胞におけるＤＭＳＯを１とした相対値で評価した。
　図２０にＲＡＲα又はＲＸＲαノックダウン下のＲＫＯ細胞株におけるＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔによるＲＡＲα及びＲＸＲαの発現の解析結果を示した。図２０（ａ）にＲＡＲαノックダウン下のＲＫＯ細胞株におけるＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔのバンドを示した。図２０（ｂ）に図２０（ａ）のバンドを定量化したグラフを示した。図２０（ｃ）にＲＸＲαノックダウン下のＲＫＯ細胞株におけるＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔのバンドを示した。図２０（ｄ）に図２０（ｃ）のバンドを定量化したグラフを示した。
　コントロールであるｓｉ－ＮＣと比較して、ｓｉ－ＲＡＲαによってＲＡＲαの発現が３９±６％減少し、ｓｉ－ＲＸＲαによってＲＸＲαの発現が８７±２．３％減少することを確認した。
　次いで、各ｓｉＲＮＡ又はｓｉ－ＮＣを導入したＲＫＯ細胞株にＤＭＳＯ　０．１ｖ／ｖ％、ＴＲＥ　１０μＭ、ＥＮＣ　１０ｎＭ＋ＢＩＮ　１０ｎＭ、ＴＲＥ　１０μＭ＋ＥＮＣ　１０ｎＭ＋ＢＩＮ　１０ｎＭ、ＢＥＸ　１０μＭ、ＢＥＸ　１０μＭ＋ＥＮＣ　１０ｎＭ＋ＢＩＮ　１０ｎＭを投与し、投与後７２時間で細胞生存率を評価した。
　図２１にＲＡＲα又はＲＸＲαノックダウン下のＲＫＯ細胞株におけるＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮ又はＢＥＸ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮによる増殖抑制効果の検討結果を示した。図２１（ａ）にＲＡＲαノックダウン下のＲＫＯ細胞株におけるＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮ、図２１（ｂ）にＲＸＲαノックダウン下のＲＫＯ細胞株におけるＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮ、図２１（ｃ）にＲＡＲαノックダウン下のＲＫＯ細胞株におけるＢＥＸ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮ、図２１（ｄ）にＲＸＲαノックダウン下のＲＫＯ細胞株におけるＢＥＸ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮの結果を示した。
　ＲＡＲαの抑制はＴＲＥ、ＢＥＸを用いた試験でそれぞれ１９±６％、２１±４％細胞増殖を抑制させた。一方で、選択的ＲＸＲアゴニストであるＢＥＸを使用した場合には、ＲＸＲα抑制のみがＢＥＸ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮによる細胞増殖抑制効果を減弱させた。
　次いで、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔにおけるＨＴ２９細胞株の内因性ＲＡＲαのタンパク質発現レベルは低く、ノックダウン効率の評価が困難であった。そのため、ＨＴ２９細胞ではＲＸＲαの抑制のみ、上記ＲＫＯ細胞株と同様の方法を用いて評価した。
　図２２にＲＸＲαノックダウン下のＨＴ２９細胞株におけるＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔによるＲＸＲαの発現の解析結果を示した。図２２（ａ）にＲＸＲαノックダウン下のＨＴ２９細胞株におけるＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔのバンドを示した。図２２（ｂ）に図２２（ａ）のバンドを定量化したグラフを示した。
　コントロールであるｓｉ－ＮＣと比較して、ｓｉ－ＲＸＲαによってＲＸＲαの発現が６０±５％減少することを確認した。
　次いで、ｓｉ－ＲＸＲα又はｓｉ－ＮＣを導入したＨＴ２９細胞株にＤＭＳＯ　０．１ｖ／ｖ％、ＴＲＥ　１０μＭ、ＥＮＣ　１０ｎＭ＋ＢＩＮ　１０ｎＭ、ＴＲＥ　１０μＭ＋ＥＮＣ　１０ｎＭ＋ＢＩＮ　１０ｎＭ、ＢＥＸ　１０μＭ、ＢＥＸ　１０μＭ＋ＥＮＣ　１０ｎＭ＋ＢＩＮ　１０ｎＭを投与し、投与後72時間で細胞生存率を評価した。
　図２３にＲＸＲαノックダウン下のＲＫＯ細胞株におけるＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮ又はＢＥＸ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮによる増殖抑制効果の検討結果を示した。図２３（ａ）にＲＸＲαノックダウン下におけるＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮ、図２３（ｂ）にＲＸＲαノックダウン下におけるＢＥＸ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮの結果を示した。
　ＲＸＲα抑制はＲＫＯ細胞株と同様に、ＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮ又はＢＥＸ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮの細胞増殖抑制効果を減弱させた。
　これらの結果から、レチノイドがＥＮＣ＋ＢＩＮの細胞増殖抑制を増強する効果は部分的にＲＡＲα又はＲＸＲαを介することを示した。
　さらに次に、ＲＡＲα又はＲＸＲαの抑制がＴＲＥとＥＮＣ＋ＢＩＮ又はＥＮＣ＋ＢＩＮ＋ＣＥＴの併用によるアポトーシスに影響を与えるかを明らかにするために、ｃｌｅａｖｅｄ　ＰＡＲＰの発現レベルを試験例１０と同様の方法により、Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔを用いて解析した。
　図２４にＲＡＲα又はＲＸＲαノックダウン下のＲＫＯ細胞株におけるＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮ＋ＣＥＴによるｃｌｅａｖｅｄ　ＰＡＲＰの発現解析の結果を示した。図２４（ａ）に、ＲＡＲα又はＲＸＲαノックダウン下のＲＫＯ細胞株におけるＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔのバンドを示した。図２４（ｂ）に図２４（ａ）のバンドを定量化したグラフを示した。
　ｓｉ－ＮＣを導入した細胞では、ＴＲＥはそれぞれＥＮＣ＋ＢＩＮ及びＥＮＣ＋ＢＩＮ＋ＣＥＴによるｃｌｅａｖｅｄ　ＰＡＲＰの発現レベルを約１３倍、約１１倍に増強した。ＲＡＲαを抑制すると、ＴＲＥがＥＮＣ＋ＢＩＮ及びＥＮＣ＋ＢＩＮ＋ＣＥＴによるｃｌｅａｖｅｄ　ＰＡＲＰの発現レベルを増強する効果はそれぞれ約８倍、約３倍と減弱した。また、ＲＸＲαを抑制すると約１．５倍、約２倍に減弱した。これらの結果は、ｓｉＲＮＡを用いたＭＴＴアッセイの結果と一致する結果と考えられた。
　以上の結果から、ＴＲＥをはじめとしたレチノイド受容体に作用する化合物がＥＮＣ＋ＢＩＮ及びＥＮＣ＋ＢＩＮ＋ＣＥＴによる細胞増殖抑制を増強する分子生物学的機構には、部分的にＲＡＲα又はＲＸＲαを介したアポトーシス誘導能の増強が存在することを示した。
　（試験例１３：腫瘍皮下移植マウスモデルにおけるレチノイド受容体に作用する化合物、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及び抗ＥＧＦＲ抗体の併用による抗腫瘍効果の検証）
　レチノイド受容体に作用する化合物とＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及び抗ＥＧＦＲ抗体、又は、ＢＲＡＦ阻害剤、及び抗ＥＧＦＲ抗体の併用によるｉｎ　ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果と毒性をＨＴ２９細胞株の皮下移植マウスモデルで評価した。
　メスのヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃ－ｎｕ）をＴｈｅ　Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｊａｐａｎから購入し、特定病原体除去環境で飼育した。培養したＨＴ２９細胞株をトリプシンで回収し、１×１０７個／ｍＬとなるよう培養培地とＣｏｒｎｉｎｇマトリゲル基底膜マトリックス（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を容量比１：１で混合し、懸濁した。０．１ｍＬの細胞懸濁液を各マウスの左側腹部領域に皮下移植した。腫瘍体積が１５０～２００ｍｍ３に達した時点で、マウスをランダムにｖｅｈｉｃｌｅ群、ＴＲＥ単独群、ＥＮＣ＋ＣＥＴ群、ＴＲＥとＥＮＣ＋ＣＥＴの３剤併用（ＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＣＥＴ）群、ＥＮＣ＋ＢＩＮ＋ＣＥＴ群、又は、ＴＲＥとＥＮＣ＋ＢＩＮ＋ＣＥＴの４剤併用（ＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮ＋ＣＥＴ）群に群分けした。ＴＲＥ、ＥＮＣ及びＢＩＮをＣｏｒｎ　ｏｉｌ（富士フィルム和光純薬）に溶解し、さらにＢｉｏｒｕｐｔｏｒ　ＵＣＷ－３１０（ソニック・バイオ株式会社）を用いて超音波処理を行い、薬液を作成した。ＥＮＣ　５ｍｇ／ｋｇ、ＢＩＮ　１．７５ｍｇ／ｋｇ、ＴＲＥ　１０ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回２８日間強制経口投与を行った。ＣＥＴ　２０ｍｇ／ｋｇの用量で週２回腹腔内投与を行った。コントロールには各溶媒を用いた。腫瘍サイズ及び体重を治療開始から３日毎に測定した。腫瘍体積を計算式「腫瘍体積（ｍｍ３）＝１／２×長径（ｍｍ）×短径（ｍｍ）」で推定した。動物実験は東北大学の施設動物管理使用委員会によって承認され、東北大学の施設ガイドラインに従って実施した。
　図２５に腫瘍皮下移植マウスモデルにおけるＴＲＥとＥＮＣ＋ＢＩＮ＋ＣＥＴ又はＥＮＣ＋ＣＥＴの併用による抗腫瘍効果の検討結果を示した。図２５（ａ）に腫瘍体積（ｍｍ３）の経時変化、図２５（ｂ）に体重（ｇ）の経時変化を示した。
　治療開始２８日時点のｖｅｈｉｃｌｅ群の腫瘍体積は１３３９ｍｍ３±２３１ｍｍ３であったのに対して、ＴＲＥ単独群の腫瘍体積は１１５６ｍｍ３±２８３ｍｍ３であり、有意な縮小を認めなかった。一方で、ＥＮＣ＋ＢＩＮ＋ＣＥＴ群、ＥＮＣ＋ＣＥＴ群の腫瘍体積はそれぞれ８５４ｍｍ３±４２５ｍｍ３、５４３ｍｍ３±８８ｍｍ３であったのに対して、ＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮ＋ＣＥＴ群、ＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＣＥＴ群の腫瘍体積はそれぞれ３８９ｍｍ３±１９６ｍｍ３、255ｍｍ３±１１１ｍｍ３であり、それぞれ５４％、５３％の有意な縮小を認めた。
　この結果から、ＴＲＥはＥＮＣ＋ＢＩＮ＋ＣＥＴ又はＥＮＣ＋ＣＥＴによるｉｎ　ｖｉｖｏでの抗腫瘍効果を増強することを示した。
　ＴＲＥによる毒性を評価するために、図２５（ｂ）に示すように治療群のマウスの体重を測定した。治療２８日時点におけるｖｅｈｉｃｌｅ群とＴＲＥ単独群、ＥＮＣ＋ＣＥＴ群とＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＣＥＴ群、ＥＮＣ＋ＢＩＮ＋ＣＥＴ群とＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮ＋ＣＥＴ群の体重をそれぞれ比較した。その結果、ＴＲＥの有無によってマウスの体重は有意な差を認めなかった。
　続いて、ＴＲＥとＥＮＣ＋ＢＩＮ＋ＣＥＴ又はＥＮＣ＋ＣＥＴとの併用によるｉｎ　ｖｉｖｏでの腫瘍増殖への影響を評価するために、治療終了時点での切除腫瘍を用いてＫｉ－６７　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｉｎｄｅｘを算出した。
　具体的には、各治療群から無作為に選択された４～６匹のマウスから腫瘍を摘出した。摘出腫瘍を１０ｖ／ｖ％中性ホルマリンで固定した。東北大学実験動物病理プラットフォームに依頼し、固定した腫瘍からパラフィン包埋組織切片を作成し、ウサギ抗Ｋｉ－６７抗体（Ｃｅｌｌ　Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、希釈倍率１：８００）による免疫染色を行った。染色されたサンプルを光学顕微鏡４００倍で観察を行った。腫瘍壊死をきたしていない腫瘍中心部の５つの視野を選択し、各群で計５００個以上の細胞をカウントした。Ｋｉ－６７　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｉｎｄｅｘはＫｉ－６７陽性細胞数／全体の細胞数として計算された。
　図２６に腫瘍皮下移植マウスモデルにおける抗Ｋｉ－６７抗体による免疫組織化学染色像（倍率：４００倍）を示した。なお、図２６において、スケールバーは１００μｍである。図２７に図２６の染色像を用いて算出されたＫｉ－６７陽性細割合（％）を示した。
　ｖｅｈｉｃｌｅ群とＴＲＥ単独群のＫｉ－６７　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｉｎｄｅｘは有意な差を認めなかった。一方で、ＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＣＥＴ群、ＴＲＥ＋ＥＮＣ＋ＢＩＮ＋ＣＥＴ群のＫｉ－６７　ｌａｂｅｌｉｎｇ　ｉｎｄｅｘはそれぞれＥＮＣ＋ＣＥＴ群、ＥＮＣ＋ＢＩＮ＋ＣＥＴ群と比較して有意に低下した。
　これらの結果から、ＴＲＥはＥＮＣ＋ＣＥＴ又はＥＮＣ＋ＢＩＮ＋ＣＥＴへの上乗せにより抗腫瘍効果を相乗的に増強すること、またこれらの治療は良好な忍容性を示すことをｉｎ　ｖｉｖｏモデルで示した。
　以上の結果から、ＴＲＥ、ＲＥＴ、ＴＡＭ、ＢＥＸ等のレチノイド受容体に作用する化合物は、ＢＲＡＦ阻害剤及びＭＥＫ阻害剤によって、ＲＡＲαやＲＸＲαを介してアポトーシス誘導能を増強し、ＢＲＡＦ変異型大腸癌細胞の増殖抑制効果を相乗的に増強させる化合物であることを発見した。さらに、ＴＲＥ等のレチノイド受容体に作用する化合物は、ｉｎ　ｖｉｖｏモデルにおいてもＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、及び抗ＥＧＦＲ抗体による抗腫瘍効果を増強することを初めて明らかにした。本試験は、ＴＲＥをはじめとしたレチノイド受容体に作用する化合物がＢＲＡＦ変異型大腸癌における有望な新規治療薬となる可能性を示した。
　本発明の癌治療剤によれば、ＢＲＡＦ阻害剤と相乗効果を示す成分を含み、強い抗腫瘍効果を示し、ＢＲＡＦ阻害剤、抗ＥＧＦＲ抗体及びＭＥＫ阻害剤に抵抗性の細胞に対しても治療効果の増強効果を示し、遺伝子の変異癌に対する治療に特に有効な癌治療剤を提供することができる。

Claims (11)

  1. 　レチノイド受容体に作用する化合物と、ＢＲＡＦ阻害剤とを含む、癌治療剤。
  2. 　ＢＲＡＦ阻害剤と併用するための癌治療剤であって、レチノイド受容体に作用する化合物を含む、癌治療剤。
  3. 　前記レチノイド受容体に作用する化合物が、レチノイド化合物又はその誘導体である、請求項１又は２に記載の癌治療剤。
  4. 　前記レチノイド受容体に作用する化合物が、トレチノイン、タミバロテン又はベキサロテンである、請求項１又は２に記載の癌治療剤。
  5. 　前記ＢＲＡＦ阻害剤が、ダブラフェニブ又はエンコラフェニブである、請求項１又は２に記載の癌治療剤。
  6. 　ＭＥＫ阻害剤をさらに含む、請求項１に記載の癌治療剤。
  7. 　前記ＭＥＫ阻害剤が、トラメチニブ又はビニメチニブである、請求項６に記載の癌治療剤。
  8. 　上皮成長因子又は上皮成長因子受容体に作用する化合物をさらに含む、請求項１又は６に記載の癌治療剤。
  9. 　前記上皮成長因子又は上皮成長因子受容体に作用する化合物が、ベバシズマブ、セツキシマブ又はパニツムマブである、請求項８に記載の癌治療剤。
  10. 　ＢＲＡＦ変異癌の治療剤である、請求項１又は２に記載の癌治療剤。
  11. 　大腸癌の治療剤である、請求項１又は２に記載の癌治療剤。
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