WO2023111452A1 - Dispositif de séquençage d'une sequence de nucleotides présentant une sensibilité augmentée et une fiabilité améliorée - Google Patents

Dispositif de séquençage d'une sequence de nucleotides présentant une sensibilité augmentée et une fiabilité améliorée Download PDF

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WO2023111452A1
WO2023111452A1 PCT/FR2022/052345 FR2022052345W WO2023111452A1 WO 2023111452 A1 WO2023111452 A1 WO 2023111452A1 FR 2022052345 W FR2022052345 W FR 2022052345W WO 2023111452 A1 WO2023111452 A1 WO 2023111452A1
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WO
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probe
recognition
adapter
strand
frequency
Prior art date
Application number
PCT/FR2022/052345
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Thomas ALAVA
Jean-Pierre Aime
Sébastien Hentz
Cédric B-HURTH
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives
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Publication date
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6825—Nucleic acid detection involving sensors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation

Definitions

  • the present invention relates to a device for detecting at least one nucleotide sequence and to a detection system comprising a large number of such devices.
  • a sequencing device or sequencer aims to determine the exact composition of a sequence of nucleic bases or nucleo-bases on a strand of DNA or RNA analyzed. This determination can be made by identifying the sequence by interaction with a probe formed by a strand. This interaction results in a hybridization reaction between the analyzed strand and the probe strand. The analyzed strand binds with greater ease to a probe whose sequence corresponds exactly to the complementary sequence of the analyzed strand, and with less ease to a probe whose sequence is different from its complementary sequence.
  • the methods of the state of the art present a lack of sensitivity by causing a large number of false positives, i.e. causing the pairing of two strands when they are not complementary by their sequences.
  • One method to reduce the number of false positives is to reduce the length of the strands analyzed, but this reduction has the effect of increasing the time and the cost of the analysis of the total sequence.
  • Another method consists in increasing the number of sensors equipped with the same recognition probe in order to carry out the same analysis, statistically making it possible to reduce the number of false positives. This method requires a large sample volume
  • the present invention relates to a device for detecting nucleic bases or nucleo-bases.
  • a detection or sequencing device comprising at least one fixed part and one part configured to be vibrated relative to the fixed part, an oligonucleotide probe mechanically connecting the fixed part and the mobile part, means for vibrating the mobile part and means for measuring the frequency of vibration of the mobile part before and after hybridization of the strand analyzed on the probe.
  • the level of hybridization between the probe and the analyzed strand causes the stiffness of the probe and analyzed strand assembly to vary, which has an influence on the mechanical resonance frequency of the vibrating part. This level of hybridization is thus detected.
  • the mechanical stiffness of a set composed of an analyzed strand and a sequence of nucleotides is measured, this stiffness being characteristic of the level of pairing of the analyzed strand and of the sequence, which makes it possible to deduce the structure of the strand in case of complete pairing.
  • the mobile part is a resonant optomechanical ring.
  • the device can be integrated into a fluidic channel in which a fluid comprising the analyzed strands circulates so as to come into contact with the probe.
  • a system comprising a large number of devices for detecting nucleic bases or nucleo-bases or for sequencing making it possible, for example, to analyze a complete genome in a single measurement.
  • the present invention relates to a device for detecting and/or sequencing at least one strand of nucleotides comprising a support, at least one moving part relative to the support, means for vibrating the moving part at a given frequency, means for measuring the vibration frequency of the moving part, a recognition probe mechanically connecting the support and the moving part, the recognition probe comprising at least one nucleotide sequence.
  • the means for vibrating the mobile part are configured to vibrate the mobile part at its resonant frequency.
  • the means for measuring the frequency of vibration are opto-mechanical means.
  • the means for measuring the vibration frequency comprise at least one waveguide optically coupled with the moving part, a light source for injecting light into the waveguide and a processing unit light coming out of the waveguide.
  • the mobile part can be in the form of a disc, a ring, a racetrack or an ellipse suspended by at least one foot.
  • the device may comprise several identical probes connecting the mobile part to the support.
  • the support may comprise a first adapter precursor and a first adapter, one end of which is fixed to the first adapter precursor and the other end comprises a sequence of nucleotides hybridized with one end of the recognition probe, and in which the part mobile comprises a second adapter precursor and a second adapter comprising a probe, one end of which is fixed to the second adapter precursor and the other end comprises a sequence of nucleotides hybridized with one end of the recognition probe.
  • the present invention also relates to an assembly comprising the device as defined previously as well as a fluidic channel ensuring the bringing into contact of a liquid containing the said analyzed strand and of the recognition probe.
  • the present invention also relates to a system comprising a plurality of sequencing devices as defined previously.
  • the devices are divided into groups, each group comprising recognition probes having the same nucleotide structure.
  • the recognition probes are chosen so that in a single measurement a complete genome is analyzed.
  • the present invention also relates to a method for detecting nucleic bases or nucleo-bases or for sequencing at least one nucleotide sequence comprising:
  • the moving part is vibrated at its resonant frequency.
  • the mobile part can be vibrated with an amplitude of the order of 0.1 nm.
  • the mobile part is vibrated at a frequency between 100 MHz and 1 GHz.
  • Figure 1 is a side view of an embodiment of a device according to the invention.
  • Figure 2 is a view of the device of figure 1 in a state in which an analyzed strand is hybridized on the probe
  • Figure 3B is a detail view of the device of Figure 1,
  • Figure 3A is a detail view of the device of Figure 1 without attachment probe
  • Figure 4 is a detail view of a variant of the device of Figure 1
  • Figure 5 is a schematic representation of the device of Figure 1 integrated into a fluidic channel
  • Figure 6 is a representation of a device as implemented according to one embodiment and implementing opto-mechanical detection means
  • Figure 7 is a top view of a system comprising a network of detection devices
  • Figures 8A-8B, 9A-9B, 10A-10B serve to illustrate the operation of an example of a device for detecting nucleic bases or nucleo-bases of a DNA or RNA strand and more particularly for detecting the level of hybridization between a recognition probe and this strand.
  • Figure 1 one can see an embodiment of a detection device.
  • the invention applies to the determination of DNA fragments and RNA fragments, and can find application in the sequencing of genomes.
  • DNA or RNA sequencing consists in determining the sequence order of nucleotides for a given DNA fragment or a given RNA fragment respectively.
  • FIGs 1, 2 and 3A and 3B one can see an example of a device comprising at least one fixed part 2, two in the example shown, for example secured to a support 3 and a part 4, designated part mobile, intended to be mobile relative to the fixed part 2 in the plane of the device.
  • the fixed part 2 is arranged close to the mobile part 4.
  • the distance between the edge of the fixed part 2 and the facing edge of the mobile part 4 is for example between 100 nm and 200 nm. This distance is chosen so as to avoid any contact between the moving part and the fixed part under normal conditions of oscillation of the moving part.
  • the plane of the device or of the sensor is the plane parallel to the support 3, generally formed by a substrate implemented in micro-electromechanics.
  • the mobile part comprises a platform 6 suspended by a foot 8.
  • the dimensions of the foot and of the platform 6 are such that the platform 6 can oscillate substantially in the plane.
  • the device is a resonant device and comprises excitation means 10 for vibrating the mobile part 4 in the plane.
  • the excitation means are of the electrostatic type and comprise an electrode 10.1 on the fixed part and an electrode 10.2 on the mobile part formed directly by the foot.
  • the application of a potential difference between the electrodes generates electrostatic forces between the foot and the fixed part causing the platform to vibrate.
  • the implementation of excitation means at the foot makes it possible to limit the size.
  • optical excitation means In particular, radiation or thermo-optic forces are used. In both cases, it is a question of using a laser with a wavelength in an optical peak, but whose power is modulated at the frequency of interest, in this case that of the mechanical resonance of the device.
  • This laser can be the same as that used for optical reading, or another laser, for example which is superimposed on the first.
  • the device also includes means (not shown) for measuring the vibration frequency of the moving part.
  • the moving part then forms a mechanical resonator.
  • These means comprise for example one or more capacitive, piezo-resistive, opto-mechanical, acoustic wave transducers of the bulk acoustic wave type BAW (“Bulk Acoustic Wave” in Anglo-Saxon terminology) or of the surface acoustic wave type. SAW (“Surface Acoustic Wave” in Anglo-Saxon terminology).
  • the moving part 4 can be a beam embedded at one end and vibrated by electrostatic means and whose frequency is measured by piezoresistive gauges.
  • the mobile part 4 can be a vibrating plate in a Lamé or breathing mode.
  • the mobile part is excited at a resonance frequency allowing maximum amplification of the input signal and maximum sensitivity of the response of the device to a disturbance (modification of the environment).
  • the resonator is preferably chosen so as to have reduced viscous damping.
  • the device is intended to be placed in a fluidic channel in which a liquid containing the analyzed strand(s) flows.
  • FIG. 3B an enlarged view of the device of FIG. 1 can be seen.
  • FIG. 3A represents the device before the attachment of an SR recognition probe.
  • the device comprises an SR recognition probe intended to hybridize with the analyzed strand.
  • the recognition probe is for example an oligonucleotide probe.
  • the probe may for example comprise between a hundred and several thousand nucleotides.
  • the device also comprises nucleotide sequences 12, 14, one fixed by one end to the fixed part 2 and the other fixed by one end to the mobile part 4.
  • the two free ends of the nucleotide sequences 12, 14 are intended to cling to the ends of the SR recognition probe by hybridization and allow the SR recognition probe to mechanically connect the fixed part 2 and the mobile part 4.
  • Sequences 12, 14 are designated “adapters” and comprise the sequences complementary to the ends of the recognition probe, which allows the hybridization of the two ends of the recognition probe on the adapters.
  • the recognition probe SR comprises a succession of free nucleotides designated “useful zone” and intended to cooperate by hybridization with the analyzed strand.
  • the fixed part comprises on its upper face a layer 16 enabling the attachment of the adapter 12 and the upper face of the mobile part comprises a layer 18 enabling the attachment of the adapter 14.
  • the layers 16, 18 are said to be "adapter precursors" and comprise for example silane or a thin metallic layer.
  • a DNA-thiol adapter on a gold tie layer can be provided.
  • One or more thiols, polyethylene glycol PEG, epoxy can also be used for the adapter precursor.
  • biotin and streptavidin There is also a strong affinity between biotin and streptavidin, so one of these two elements can correspond to a precursor adapter while the other can be provided at one end of the adapter 12, 14 thus making it possible to "attach" the adapter to the fixed or mobile part.
  • the upper face of the fixed part and of the mobile part have different functionalizations in order to be selective with respect to the adapter precursors.
  • the functionalization is for example obtained by forming a film 17 on the upper face of the fixed part and a film 19 of different material on the upper face of the mobile part.
  • the films 17, 19 can for example be made of a polymer material or a metallic material such as gold.
  • the films 17, 19 have a thickness of the order of 100 nm.
  • the functionalized zones are located at the most mechanically sensitive places, i.e. which have the greatest displacement, for example the edge of the mobile part and/or opposite the fixed part.
  • the adapters are therefore chosen according to the recognition probe to be placed between the fixed part and the mobile part and therefore according to the strand analyzed.
  • the device comprises several fixed parts and several recognition probes connecting the fixed parts to the mobile part, the probes comprising the same nucleotide sequences.
  • the fixed parts can be in one piece and for example formed of a ring around the mobile part.
  • FIG 5 one can see a schematic representation of an assembly comprising the device of Figures 1 and 2 integrated in a fluid channel C, for example formed by cooperation between a cover 21 and the support 3 of the device.
  • the circulation of the liquid containing the strands to be analyzed is in open circuit or in continuous circuit.
  • the channel is connected to a reservoir containing the liquid and the strands to be analyzed and to a zone for collecting the liquid after circulation in the channel.
  • a circulation pump may be provided.
  • the liquid is for example injected into the channel by a syringe and a pump ensures the recirculation of the liquid in the channel. Closed-loop operation allows products to be recycled and several measurements to be made. Provision can be made to reset the sensors by implementing thermal melting of the paired DNA strands. Provision can also be made to accumulate measurement data without carrying out intermediate heating between the consecutive measurement cycles by causing the fluid to circulate several times over the device(s).
  • the mobile part 4 connected to the fixed part 2 by the “adapter-recognition probe-adapter” assembly is vibrated by the excitation means.
  • the amplitude of the vibration on the order of an interatomic distance about 0.1 nm (1 Angstrom).
  • the "adapter - recognition probe - adapter” assembly has a certain stiffness and dissipates a certain amount of energy.
  • the mobile part oscillates in the plane at a given frequency typically between 100 kHz and 1 GHz, preferably between 1 MHz and one or more tens of MHz resulting from the excitation means, the stiffness of the "adapter - probe recognition-adaptor” and its dissipation.
  • a liquid containing the analyzed DNA or RNA strand circulates on the sequencer device. This comes into contact with at least the part of the SR recognition probe not hybridized with the adapters.
  • the strand analyzed hybridizes more or less completely with the attachment probe (FIG. 2).
  • the higher the level of hybridization the more the stiffness of the "adapter - recognition probe - adapter" and analyzed strand assembly increases and the more the probe-strand assembly couples the fixed part to the mobile part, which has the effect to modify the oscillation frequency of the moving part.
  • the measuring means measure this vibration frequency which has varied with respect to its vibration frequency before the hybridization of the analyzed strand.
  • the frequency can vary from one to several hundred Hertz.
  • the big one Measurement sensitivity, to the nearest nucleotide, SNP for "single-nucleotide polymorphism", ie polymorphism of a single nucleotide
  • SNP single-nucleotide polymorphism
  • the device therefore has high reliability, high sensitivity and high detection speed.
  • the measurement of the dissipated energy is a rich source of information on the hybridization process.
  • the vibration frequency of the mobile part does not vary or does not vary significantly, in particular less than 0.001% variation which corresponds for example to less than 300 Hz variation for an initial resonance frequency of 30 MHz.
  • the high sensitivity of the detection means makes it possible to detect the level of hybridization between the strand and the recognition probe.
  • This device provides high detection reliability.
  • sequencer device allows the analysis of long sequences of nucleotides, which makes it possible to reduce the analysis time. For example, provision is made on the order of 5*10 6 base pairs to analyze a bacterium.
  • the fact of mechanically stressing the hybridized strand makes it possible to verify the hybridization. If the strand is partially hybridized, the hybridization will be less resistant to axial mechanical stress. The axial stress then significantly reduces the risk of false positives.
  • the hybridization level detection method can then take place according to the following steps:
  • the sequence of the strand analyzed is then known.
  • the liquid circulates.
  • the circulation rate of the liquid is preferably limited, for example to a flow rate of the order of one or more ml/min.
  • the hybridization can last on the order of several minutes, for example 5 minutes.
  • the detection means are opto-mechanical means.
  • the device comprises an optical resonator 4, at least one waveguide 20 optically coupled with the resonator, the waveguide being supported by the substrate, a light source SL and means T for processing the light wave emerging from the waveguide.
  • the support, the waveguide, the opto-mechanical resonator forms a sensor structure.
  • the waveguide 20 comprises an input end 20.1 of a light wave connected to a light source via a coupling network 22.1 not shown in the figure, and an output end 20.2 connected to means processing of the light wave leaving the waveguide via a coupling network 20.2.
  • the resonator 4 is arranged close to a side of the waveguide 20 so as to be optically coupled thereto.
  • the waveguide 20 is in the evanescent field of the resonator, so that the light wave coming from the source SL is injected into the optical resonator and the light wave having circulated in the resonator is collected by the guide. wave.
  • the wave circulating in the resonator is symbolized by an arrow.
  • the width of the space between the flank of the waveguide and the lateral edge of the resonator is for example between 10 nm and 50 nm.
  • the optomechanical resonator 4 has the form of a disc suspended from a foot 24 fixed to one face of the disc facing the substrate. The disc extends in a plane of the sensor.
  • the resonator has two end faces 4.1, 4.2 substantially parallel to the plane of the sensor and a side face 6.3 (FIG. 6).
  • the foot has a small diameter compared to the dimensions of the disc in the plane of the sensor, more particularly a small diameter compared to the diameter of the disc, preferably the foot has a diameter at least 10 times smaller than the diameter of the disc .
  • the diameter of the foot is ten times smaller than the smallest dimension of the resonator in the plane of the sensor, thus the foot interferes little or not with the radial vibration of the resonator.
  • the resonator is suspended by in-plane springs or by radially extending nano-sized beams compressed and tensioned by the vibration of the disc.
  • the springs or the beams are then sized to have a lower axial stiffness than that of the resonator.
  • any other shape of resonator may be suitable, for example seen from above the resonator may have the shape of a ring, ellipse or racetrack (“racetrack” in Anglo-Saxon terminology).
  • the resonator in the form of a ring, ellipse or hippodrome, the latter is suspended from the substrate, for example by means of a foot located in the center of the resonator, and beams extending between the inner edge of the resonator and the foot.
  • the resonator can be made of any material capable of confining an electromagnetic wave, such as GaAS, Ge or Si.
  • the latter is particularly advantageous for manufacture according to microelectronic techniques offering a high level of integration on a substrate.
  • the functionalization layer is formed for example on the face 4.2 of the resonator opposite to that 4.1 facing the substrate.
  • the excitation means are for example electrostatic means (not shown) or optical means.
  • the wavelength of the light wave to be injected into the resonator is chosen close to the optical resonance of the resonator, ie on the edge of the optical resonance peak.
  • the light resonating inside the optical resonator is then very sensitive to the mechanical deformation of the mechanical resonator, in particular when the optical and mechanical resonator are combined.
  • the light wave at the chosen wavelength is injected into the waveguide by the light source, by optical coupling the light wave is injected into the optomechanical resonator 4.
  • the mass of the resonator hardly varies during hybridization, consequently when the stiffness of the resonator increases, its frequency increases.
  • the measurement of the variation in the vibration frequency makes it possible to determine whether the hybridization was complete or not, and if the hybridization was complete, to determine the identity of the strand analyzed. Indeed, the optomechanical resonator is sensitive enough to distinguish between perfect or near-perfect matching.
  • the measurement of the variation in the vibration frequency can be combined with a measurement of the variations in the optical properties of the resonator, making it possible to acquire additional information.
  • the optomechanical resonator has for example a vibration frequency between 100 MHz and 1 GHz with amplitude oscillations of the order of a few picometers.
  • the fact of working at high frequencies makes it possible to increase the sensitivity of detection and the precision of the data collected, in particular by a level of temporal sampling never achieved until now.
  • the optomechanical resonator as described above also offers the advantage of offering very good performance in a liquid medium.
  • a system is produced comprising a large number of detection devices D (FIG. 7).
  • detection devices D For example, it is possible to provide between 9 and of the order of 10,000 resonators. An even higher number of resonators can be provided, the limit being able to be defined according to the manufacturing cost.
  • Each device or each group of devices can be provided with different recognition probes.
  • Each detector delivers its own signal which is processed by a processing unit. Only some of the devices are shown schematically.
  • the system comprises for example a fluidic channel common to all the devices or several parallel fluidic channels, each supplying a column of devices.
  • the channel or channels are formed for example in a cap (not shown).
  • optomechanical means facilitates such integration thanks to multiplexing techniques very well mastered in the field of optics.
  • microelectronic manufacturing techniques allows the integration of a very large number of devices.
  • the recognition probe equipping each device is known since it depends on the adapters fixed to the fixed part and the mobile part which are themselves determined by the functionalization of each of the parts.
  • the analyzed strand detectable by each device is therefore known.
  • the method described above applies to a sequencing system, however such a system makes it possible to detect several different strands.
  • the liquid then contains fragments of genomes, for example a genome of several thousand bases. This is injected into the channel or channels of the system and after a step of potential hybridization of the strands on the appropriate recognition probes, the vibration frequencies of the various resonators are measured. The frequencies can be measured continuously, making it possible to follow the hybridization process.
  • the detection device and the detection system are reusable; after a sequencing cycle, they can be rinsed to remove the strands hybridized on the SR recognition probes.
  • rinsing solution a buffer solution (“buffer” according to the Anglo-Saxon terminology) without DNA, for example of the tris-acetate type, tris-EDTA, PBS (“Phosphate Buffered Saline”), HEPES (N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N'-(2-ethanesulfonic acid) with the addition of a surfactant, typically in small quantities, i.e. around 0.1% or less.
  • the surfactant can be SDS ("Sodium dodecyl sulfate") or TWEEN (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate).
  • the rinsing solution is circulated to unhook the DNA strands hybridized on the recognition probe.
  • the circulation should not be done in circuit
  • This example is only given by way of illustration, the person skilled in the art will know how to adapt the components of the rinsing solution according to the nature of the DNA strands and other reagents used.
  • the resonators can be vibrated at different frequencies, for example they can have different mechanical resonance frequencies.
  • a sequencing system comprising groups of 200 devices provided with the same recognition probe comprising 150 pairs of nucleotides.
  • the sequencing system comprises 4,104 optomechanical detectors/cm 2 , i.e. approximately 200 groups of 200 devices having the same recognition probe and therefore capable to detect 200 domains of different sequences.
  • This system then makes it possible to analyze a complete viral genome of 30 kb, ie 30,000 bases or nucleotides, in a single series of measurements.
  • each device measures 40 ⁇ m on a side, which makes it possible to produce sequencing systems having a density of devices of 62.5 ⁇ 10 3 cm 2 .
  • the detection device and the detection system can advantageously be made at least in part by microelectronics techniques.
  • the mobile part(s) and the fixed part(s) and optionally the waveguide(s) are made by depositing layers on a substrate and lithography and etching.
  • the electrical tracks are also produced by deposition and etching.
  • the polymer layers as well as the adapter precursors are for example deposited and localized by lithography and etching.
  • the cover is for example made of glass and is structured to form with the substrate the fluidic channel or channels.
  • the cover is attached to the substrate and is for example glued thereto.
  • a liquid containing the adapters is injected into the channel or channels.
  • the liquid is a physiological liquid.
  • the adapters then attach to the adapter precursors.
  • the liquid is at rest or in circulation generating a shear force on the fixed and mobile parts.
  • the physiological liquid containing the recognition probes is injected into the channel or channels.
  • the probes attach at one end to an adapter on the fixed part and at the other end on the mobile.
  • the liquid is at rest or in circulation generating a shear force on the fixed and mobile parts.
  • the detection device and the detection system have the advantage of using mastered materials and techniques. They have good robustness.
  • sequencing devices allow many applications, such as parallel processing and profiling of coding sequences, gene selection and localization, parallel processing of multiple mutations, selection and localization of viral variants.
  • a device for detecting nucleic bases or nucleobases of a DNA or RNA strand as described above makes it possible to detect a level of hybridization between a recognition probe and a given sequence of nucleotides. The more the recognition probe and the sequence are complementary, the greater the level of hybridization.
  • the device illustrated in FIG. 8A uses an example of an arrangement described above in connection with FIG. 6.
  • the genetic probe SR is attached on the one hand to a fixed part 2 and on the other hand to a mobile part 4, for example in the form of a disc, and in particular a surface 4.2 of this disc.
  • the addition of the SR probe to the resonant disc 4 causes an increase in the vibrating mass and, as illustrated in FIG. 8B (schematically giving an evolution curve Co of the resonant frequency of the disc 4 as a function of the time) a decrease in the resonance frequency (PI portion on the Co curve).
  • Such an arrangement is likely to induce a lower resonant frequency shift down compared to a conventional arrangement where the genetic probe SR would be attached entirely to the mobile part 4.
  • FIGS. 9A-9B serve to illustrate when a BPC “partially complementary” DNA strand binds to the SR probe because this BPC strand has one or more common bases with a targeted region of the SR probe.
  • a perfectly complementary BIC DNA strand hybridizes to the SR probe because it contains the exact complementary sequence to the sequence targeted by the SR probe.
  • the first effect (portion P3a of the resonance frequency curve C2) resides in an addition of mass translated by a reduction in the resonance frequency linked to the joining of the complementary strand with the SR probe on a few bases, thus coupling the mass of the BIC strand to that of the SR probe and the mobile part 4. The more the attachment of the complementary nucleo-bases progresses, the more a double-stranded DNA double helix tends to form.
  • the resonance frequency shift thus translates the level of hybridization. It is possible to calibrate the system by measuring the C2 curve with the BIC strand. In this way, during subsequent measurements, it is possible to immediately recognize whether a fully BIC-compatible strand or a partially BPC-compatible strand is detected.
  • a detection device and a detection system as described previously apply to the sequencing of at least one strand of nucleotides.

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Abstract

Dispositif de séquençage d'au moins un brin de nucléotides comportant un support (3), au moins une partie mobile (4) par rapport au support (3), des moyens de mise en vibration de la partie mobile (4) à une fréquence donnée, des moyens de mesure de la fréquence de vibration de la partie mobile (4), une sonde de reconnaissance (SR) reliant mécaniquement le support et la partie mobile (4), la sonde de reconnaissance (SR) comportant au moins une séquence de nucléotides.

Description

DESCRIPTION
Titre : DISPOSITIF DE SÉQUENÇAGE D'UNE SEQUENCE DE NUCLEOTIDES PRÉSENTANT UNE SENSIBILITÉ AUGMENTÉE ET UNE FIABILITÉ AMÉLIORÉE
DOMAINE TECHNIQUE ET ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE
La présente invention se rapporte à un dispositif de détection d'au moins une séquence de nucléotides et à un système de détection comportant un grand nombre de tels dispositifs.
Un dispositif de séquençage ou séquenceur a pour objectif de déterminer la composition exacte d'une séquence de bases nucléiques ou nucléo-bases sur un brin d'ADN ou d'ARN analysé. Cette détermination peut être réalisée en identifiant la séquence par interaction avec une sonde formée par un brin. Cette interaction se traduit par une réaction d'hybridation entre le brin analysé et le brin sonde. Le brin analysé se lie avec une plus grande facilité à une sonde dont la séquence correspond exactement à la séquence complémentaire du brin analysé, et avec moins de facilité à une sonde dont la séquence est différente de sa séquence complémentaire.
Les méthodes de l'état de la technique présentent un manque de sensibilité en provoquant un grand nombre de faux positifs, i.e. provoquent l'appariement de deux brins alors qu'ils ne sont pas complémentaires par leurs séquences.
Une méthode pour réduire le nombre de faux positifs est de réduire la longueur des brins analysés, or cette réduction a pour effet d'augmenter la durée et le coût de l'analyse de la séquence totale.
Une autre méthode consiste à augmenter le nombre de capteurs munis de la même sonde de reconnaissance afin de réaliser la même analyse, permettant statistiquement de réduire le nombre de faux positifs. Cette méthode requiert un volume d'échantillon important
Par ailleurs il existe une forte demande pour fournir des dispositifs de séquençage d'ADN. En particulier, des méthodes rapides et avec des taux d'erreurs réduits. EXPOSÉ DE L'INVENTION
C'est par conséquent un but de la présente invention d'offrir un dispositif de détection pour le séquençage d'au moins un fragment d'ADN ou d'ARN, plus sensible et plus fiable que les dispositifs de l'état de la technique.
Plus généralement, la présente invention concerne un dispositif de détection de bases nucléiques ou nucléo-bases.
Le but énoncé ci-dessus peut être atteint par un dispositif, de détection ou de séquençage, comportant au moins une partie fixe et une partie configurée pour être mise en vibration par rapport à la partie fixe, une sonde oligonucléotide reliant mécaniquement la partie fixe et la partie mobile, des moyens pour mettre en vibration la partie mobile et des moyens pour mesurer la fréquence de vibration de la partie mobile avant et après hybridation du brin analysé sur la sonde.
Le niveau d'hybridation entre la sonde et le brin analysé fait varier la raideur de l'ensemble sonde et brin analysé, ce qui a une influence sur la fréquence mécanique de résonance de la partie vibrante. On détecte ainsi ce niveau d'hybridation.
En fonction de la variation de la fréquence de résonance mécanique, il peut être déterminé si l'hybridation est totale, partielle ou nulle et ainsi en déduire la séquence exacte de nucléobases du brin analysé.
En d'autres termes, on mesure la raideur mécanique d'un ensemble composé d'un brin analysé et d'une séquence de nucléotides, cette raideur étant caractéristique du niveau d'appariement du brin analysé et de la séquence, ce qui permet d'en déduire la structure du brin en cas d'appariement complet.
Avantageusement la partie mobile est un anneau optomécanique résonant.
Le dispositif peut être intégré dans un canal fluidique dans lequel un fluide comportant les brins analysés circule de sorte à entrer en contact avec la sonde.
De manière préférée, on réalise un système comportant un grand nombre de dispositifs de détection de bases nucléiques ou nucléo-bases ou de séquençage permettant par exemple d'analyser un génome complet en une seule mesure.
Selon un aspect, la présente invention concerne un dispositif de détection et/ou de séquençage d'au moins un brin de nucléotides comportant un support, au moins une partie mobile par rapport au support, des moyens de mise en vibration de la partie mobile à une fréquence donnée, des moyens de mesure de la fréquence de vibration de la partie mobile, une sonde de reconnaissance reliant mécaniquement le support et la partie mobile, la sonde de reconnaissance comportant au moins une séquence de nucléotides.
Avantageusement, les moyens de mise en vibration de la partie mobile sont configurés pour mettre en vibration la partie mobile à sa fréquence de résonance.
Selon une possibilité de mise en œuvre, les moyens de mesure de la fréquence de vibration sont des moyens opto-mécaniques.
Selon un mode de réalisation, les moyens de mesure de la fréquence de vibration comportent au moins un guide d'onde couplé optiquement avec la partie mobile, une source de lumière pour injecter de la lumière dans le guide d'onde et une unité de traitement de la lumière sortant du guide d'onde.
Avantageusement, la partie mobile peut être sous forme d'un disque, d'un anneau, d'un hippodrome ou une ellipse suspendu(e) par au moins un pied.
Selon une possibilité de mise en œuvre, le dispositif peut comporter plusieurs sondes identiques reliant la partie mobile au support.
Le support peut comporter un premier précurseur d'adaptateur et un premier adaptateur dont une extrémité est fixée au premier précurseur d'adaptateur et l'autre extrémité comporte une séquence de nucléotides hybridée avec une extrémité de la sonde de reconnaissance, et dans lequel la partie mobile comporte un deuxième précurseur d'adaptateur et un deuxième adaptateur comprenant une sonde dont une extrémité est fixée au deuxième précurseur d'adaptateur et l'autre extrémité comporte une séquence de nucléotides hybridée avec une extrémité de la sonde de reconnaissance.
La présente invention concerne également un ensemble comportant le dispositif tel que défini précédemment ainsi qu'un canal fluidique assurant la mise en contact d'un liquide contenant ledit brin analysé et de la sonde de reconnaissance.
La présente invention concerne également un système comportant une pluralité de dispositifs de séquençage tels que définis précédemment. Avantageusement, les dispositifs sont répartis en groupe, chaque groupe comportant des sondes de reconnaissance ayant la même structure de nucléotides.
Avantageusement, les sondes de reconnaissance sont choisies de sorte qu'en une seule mesure un génome complet est analysé.
Pour cela, on prévoit typiquement des centaines de milliers de capteurs en parallèles et/ou plusieurs cycles de mesures.
La présente invention concerne également un procédé de détection de bases nucléiques ou nucléo-bases ou de séquençage d'au moins une séquence de nucléotides comportant :
- la mise en contact d'un liquide contenant ladite séquence avec un dispositif résonant comportant une sonde de reconnaissance reliant une partie fixe et une partie mobile du dispositif résonant,
- la mise en vibration de la partie mobile,
- la mesure de la variation de la fréquence de vibration de la partie mobile du à l'hybridation entre la sonde de reconnaissance et la séquence de nucléotides. Avantageusement, la partie mobile est mise en vibration à sa fréquence de résonance. Typiquement, la partie mobile peut être mise en vibration avec une amplitude de l'ordre de 0,1 nm.
Selon un mode de réalisation, la partie mobile est mise en vibration à une fréquence comprise entre 100 MHz et 1 GHz.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
La présente invention sera mieux comprise sur la base de la description qui va suivre et des dessins en annexe sur lesquels :
Figure 1 est une vue de côté d'un exemple de réalisation d'un dispositif suivant l'invention,
Figure 2 est une vue du dispositif de la figure 1 dans un état dans lequel un brin analysé est hybridé sur la sonde,
Figure 3B est une vue de détail du dispositif de la figure 1,
Figure 3A est une vue de détail du dispositif de la figure 1 sans sonde d'accrochage, Figure 4 est une vue de détail d'une variante du dispositif de la figure 1, Figure 5 est une représentation schématique du dispositif de la figure 1 intégré dans un canal fluidique,
Figure 6 est une représentation d'un dispositif tel que mis en œuvre suivant un mode de réalisation et mettant en œuvre des moyens de détection opto-mécaniques, Figure 7 est une vue de dessus d'un système comprenant un réseau de dispositifs de détection,
Figure 8A-8B, 9A-9B, 10A-10B servent à illustrer le fonctionnement d'un exemple de dispositif de détection de bases nucléiques ou nucléo-bases d'un brin d'ADN ou d'ARN et plus particulièrement à une détection du niveau d'hybridation entre une sonde de reconnaissance et ce brin.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS
Sur la figure 1, on peut voir un exemple de réalisation d'un dispositif de détection. L'invention s'applique à la détermination de fragments d'ADN et de fragments d'ARN, et peut trouver application dans le séquençage de génomes.
Le séquençage de l'ADN ou de l'ARN consiste à déterminer l'ordre d'enchaînement des nucléotides pour un fragment d'ADN donné ou d'un fragment d'ARN donné respectivement.
Sur les figures 1, 2 et 3A et 3B, on peut voir un exemple d'un dispositif comportant au moins une partie fixe 2, deux dans l'exemple représenté, par exemple solidaire d'un support 3 et une partie 4, désignée partie mobile, destinée à être mobile par rapport à la partie fixe 2 dans le plan du dispositif. La partie fixe 2 est disposée à proximité de la partie mobile 4. La distance entre le bord de la partie fixe 2 et le bord en regard de la partie mobile 4 est par exemple comprise entre 100 nm et 200 nm. Cette distance est choisie de sorte à éviter tout contact entre la partie mobile et la partie fixe dans des conditions normales d'oscillation de la partie mobile.
Le plan du dispositif ou du capteur est le plan parallèle au support 3, généralement formé par un substrat mis en œuvre en micro-électromécanique.
Dans l'exemple représenté la partie mobile comporte une plateforme 6 suspendue par un pied 8. Les dimensions du pied et de la plateforme 6 sont telles que la plateforme 6 peut osciller sensiblement dans le plan. Le dispositif est un dispositif résonant et comporte des moyens d'excitation 10 pour mettre en vibration la partie mobile 4 dans le plan. Dans l'exemple représenté de manière schématique sur la figure 1, les moyens d'excitation sont de type électrostatique et comportent une électrode 10.1 sur la partie fixe et une électrode 10.2 sur la partie mobile formée par le pied directement. L'application d'une différence de potentiels entre les électrodes génère des forces électrostatiques entre le pied et la partie fixe mettant en vibration la plateforme. La mise en œuvre de moyens d'excitation au niveau du pied permet de limiter l'encombrement.
En variante, il est également possible d'utiliser des moyens d'excitation optiques. On utilise en particulier des forces de radiation ou thermo-optiques. Dans les deux cas, il s'agit d'utiliser un laser de longueur d'onde dans un pic optique, mais dont la puissance est modulée à la fréquence d'intérêt, en l'occurrence celle de la résonance mécanique du dispositif. Ce laser peut être le même que celui utilisé pour la lecture optique, ou un autre laser, par exemple que l'on vient superposer au premier.
Le dispositif comporte également des moyens de mesure (non représentés) de la fréquence de vibration de la partie mobile. La partie mobile forme alors un résonateur mécanique. Ces moyens comportent par exemple un ou plusieurs transducteurs capacitifs, piézo-résistifs, opto-mécaniques, à ondes acoustiques de type à onde acoustique de volume BAW (« Bulk Acoustic Wave » en terminologie anglo-saxonne) ou de type à onde acoustique de surface SAW (« Surface Acoustic Wave » en terminologie anglo-saxonne).
La partie mobile 4 peut être une poutre encastrée par une extrémité et mise en vibration par des moyens électrostatiques et dont la fréquence est mesurée par des jauges piézorésistives.
Selon un autre exemple, la partie mobile 4 peut être une plaque vibrante dans un mode de Lamé ou de respiration.
Un exemple de détection opto-mécanique sera décrit en détail.
De préférence la partie mobile est excitée à une fréquence de résonance permettant une amplification maximale du signal d'entrée et un maximum de sensibilité de la réponse du dispositif à une perturbation (modification de l'environnement). Le résonateur est choisi de préférence de sorte à présenter un amortissement visqueux réduit. En effet, le dispositif est destiné à être disposé dans un canal fluidique dans lequel s'écoule un liquide contenant le ou les brins analysés.
Sur la figure 3B, on peut voir une vue agrandie du dispositif de la figure 1. La figure 3A représente le dispositif avant la fixation d'une sonde de reconnaissance SR.
Le dispositif comporte une sonde de reconnaissance SR destinée à s'hybrider avec le brin analysé. La sonde de reconnaissance est par exemple une sonde oligonucléotide. La sonde peut comporter par exemple entre une centaine et plusieurs milliers de nucléotides.
Le dispositif comporte également des séquences de nucléotides 12, 14 l'une fixée par une extrémité à la partie fixe 2 et l'autre fixée par une extrémité à la partie mobile 4. Les deux extrémités libres des séquences de nucléotides 12, 14 sont destinées à s'accrocher aux extrémités de la sonde de reconnaissance SR par hybridation et permettre à la sonde de reconnaissance SR de relier mécaniquement la partie fixe 2 et la partie mobile 4.
Les séquences 12, 14 sont désignés « adaptateurs » et comportent les séquences complémentaires aux extrémités de la sonde de reconnaissance, ce qui permet l'hybridation des deux extrémités de la sonde de reconnaissance sur les adaptateurs. Une fois accrochés aux adaptateurs 12, 14 la sonde de reconnaissance SR comporte une succession de nucléotides libres désignée « zone utile » et destinée à coopérer par hybridation avec le brin analysé.
La partie fixe comporte sur sa face supérieure une couche 16 permettant l'accroche de l'adaptateur 12 et la face supérieure de la partie mobile comporte une couche 18 permettant l'accroche de l'adaptateur 14. Les couches 16, 18 sont dites des « précurseurs d'adaptateur » et comportent par exemple du silane ou une fine couche métallique. Un adaptateur ADN-thiol sur une couche d'accroche en or peut être prévu. Un ou plusieurs thiols, du polyéthylène glycol PEG, de l'époxyde peuvent être également utilisés pour le précurseur d'adaptateur. Il existe par ailleurs une forte affinité entre la biotine et la streptavidine, ainsi, l'un de ces deux éléments peut correspondre à un précurseur d'adaptateur tandis que l'autre peut être prévu à une extrémité de l'adaptateur 12, 14 permettant ainsi « d'attacher » l'adaptateur sur la partie fixe ou mobile.
De préférence, préalablement au dépôt des précurseurs d'adaptateur, la face supérieure de la partie fixe et de la partie mobile présentent des fonctionnalisations différentes pour être sélectives par rapport aux précurseurs d'adaptateur. La fonctionnalisation est par exemple obtenue par formation d'un film 17, sur la face supérieure de la partie fixe et d'un film 19 en matériau différent sur la face supérieure de la partie mobile. Les films 17, 19 peuvent être par exemple en matériau polymère ou en matériau métallique tel que de l'or. Un exemple de réalisation particulier prévoit :
- un film 17 en SiÛ2, et une couche 16 en PLL-g-PEG ou silane
- un film 19 en or avec une couche 18 à base de thiol.
Typiquement, les films 17, 19 ont une épaisseur de l'ordre de 100 nm.
De manière préférée, les zones fonctionnalisées sont situées aux endroits les plus sensibles mécaniquement, i.e. qui présentent le déplacement le plus important, par exemple le bord de la partie mobile et/ou en vis-à-vis de la partie fixe.
Les adaptateurs sont donc choisis en fonction de la sonde de reconnaissance à disposer entre la partie fixe et la partie mobile et donc en fonction du brin analysé.
Avantageusement, le dispositif comporte plusieurs parties fixes et plusieurs sondes de reconnaissance reliant les parties fixes à la partie mobile, les sondes comportant les mêmes séquences de nucléotides. Les parties fixes peuvent être d'un seul tenant et par exemple formées d'un anneau autour de la partie mobile. En augmentant le nombre de sondes de reconnaissance, on augmente la probabilité d'accroche du ou des brins analysés, ce qui augmente la sensibilité du dispositif.
Sur la figure 5, on peut voir une représentation schématique d'un ensemble comportant le dispositif des figures 1 et 2 intégré dans un canal fluidique C, par exemple formé par coopération entre un capot 21 et le support 3 du dispositif. La circulation du liquide contenant les brins à analyser est en circuit ouvert ou en circuit continu. En circuit ouvert, le canal est connecté à un réservoir contenant le liquide et les brins à analyser et à une zone de collecte du liquide après circulation dans le canal. Une pompe de circulation peut être prévue. En circuit fermé, le liquide est par exemple injecté dans le canal par une seringue et une pompe assure la recirculation du liquide dans le canal. Le fonctionnement en boucle fermée permet de recycler les produits et de réaliser plusieurs mesures. On peut prévoir de réinitialiser les capteurs en mettant en œuvre une fonte thermique des brins ADN appariés. On peut également prévoir d'accumuler des données de mesure sans effectuer de chauffage intermédiaire entre les cycles consécutifs de mesure en faisant circuler plusieurs fois le fluide sur le ou les dispositifs.
Le fonctionnement de ce dispositif va maintenant être décrit.
La partie mobile 4 reliée à la partie fixe 2 par l'ensemble « adaptateur - sonde de reconnaissance - adaptateur » est mise en vibration par les moyens d'excitation. L'amplitude de la vibration de l'ordre d'une distance interatomique, environ 0,1 nm (1 Angstrom). L'ensemble « adaptateur - sonde de reconnaissance - adaptateur » présente une certaine raideur et dissipe une certaine quantité d'énergie. La partie mobile oscille dans le plan à une fréquence donnée typiquement entre une 100 kHz et 1 GHz, préférentiellement entre 1 MHz et une ou plusieurs dizaines de MHz qui résulte des moyens d'excitation, de la raideur de l'ensemble « adaptateur - sonde de reconnaissance - adaptateur » et de sa dissipation.
Un liquide contenant le brin ADN ou ARN analysé circule sur le dispositif séquenceur. Celui-ci entre en contact avec au moins la partie de la sonde de reconnaissance SR non hybridée avec les adaptateurs. Le brin analysé s'hybride de manière plus ou moins complète avec la sonde d'accrochage (figure 2). Plus le niveau d'hybridation est élevé, plus la raideur de l'ensemble « adaptateur - sonde de reconnaissance - adaptateur » et brin analysé augmente et plus l'ensemble sonde-brin couple la partie fixe à la partie mobile ce qui a pour effet de modifier la fréquence d'oscillation de la partie mobile. Les moyens de mesure mesurent cette fréquence de vibration qui a varié par rapport à sa fréquence de vibration avant l'hybridation du brin analysé. La fréquence peut varier d'une à plusieurs centaines de Hertz.
En effet, lorsque le brin analysé s'hybride avec la sonde de reconnaissance, les deux brins se contractent et l'ensemble ainsi formé présente une raideur longitudinale déterminée et connue, plus grande que celle de la sonde de reconnaissance seule. La grande sensibilité de mesure, au nucléotide près, SNP (pour « single-nucleotide polymorphism », i.e. polymorphisme d'un seul nucléotide), peut être proposée dans la mise en œuvre d'une compétition cinétique de type déplacement de brins. Le dispositif présente donc une grande fiabilité, une grande sensibilité et une vitesse de détection élevée.
La mesure de l'énergie dissipée est une source d'information riche sur le processus d'hybridation.
Dans le cas où aucune hybridation n'a lieu entre le brin analysé et la sonde d'accrochage, la fréquence de vibration de la partie mobile ne varie pas ou pas significativement, en particulier moins de 0.001% de variation ce qui correspond par exemple à moins de 300 Hz de variation pour une fréquence de résonnance initiale de 30MHz.
La grande sensibilité des moyens de détection permet de détecter le niveau d'hybridation entre le brin et la sonde de reconnaissance. Le fait que le dispositif permette de détecter et mesurer les états intermédiaires d'hybridation (hybridation partielle), permet néanmoins d'obtenir des informations sélectives sur les différentes séquences.
Ce dispositif permet une grande fiabilité de détection.
En outre, le dispositif séquenceur permet l'analyse de longues séquences des nucléotides, ce qui permet de réduire le temps d'analyse. Par exemple, on prévoit de l'ordre de 5*106 paires de bases pour analyser une bactérie.
De manière avantageuse, le fait de solliciter mécaniquement le brin hybridé permet de vérifier l'hybridation. Si le brin est partiellement hybridé, l'hybridation sera moins résistante à une sollicitation mécanique axiale. La sollicitation axiale permet alors de réduire sensiblement le risque de faux positifs.
Le procédé de détection de niveau d'hybridation peut alors se dérouler selon les étapes suivantes :
- Mise en vibration du résonateur à une fréquence donnée, de préférence sa fréquence de résonance mécanique,
- Circulation d'une solution contenant le brin à analyser sur le dispositif,
- Mesure de la fréquence de vibration du résonateur,
- Détection d'une hybridation parfaite, partielle ou d'aucune hybridation.
- S'il y a hybridation parfaite, la séquence du brin analysé est alors connue. De préférence, lors de l'hybridation le liquide circule.
La vitesse de circulation du liquide est de préférence limitée, par exemple à un débit de l'ordre de un ou plusieurs ml/min. L'hybridation peut durer de l'ordre de plusieurs minutes, par exemple 5 minutes.
On peut jouer sur la vitesse de flux, la répétition de mesures avec les cycles, effectuer des paliers. La circulation de liquide est arrêtée et la mesure s'effectue par accumulation des données avec une probabilité d'accrochage contrôlée par la diffusion des cibles [Note : une option supplémentaire qui permet différents types de mesure sans la perturbation du flux].
Sur la figure 6, on peut voir un exemple de réalisation dans lequel les moyens de détection sont des moyens opto-mécaniques.
Le dispositif comporte un résonateur optique 4, au moins un guide d'onde 20 couplé optiquement avec le résonateur, le guide d'onde étant supporté par le substrat, une source lumineuse SL et des moyens de traitement T de l'onde lumineuse sortant du guide d'onde. Le support, le guide d'onde, le résonateur opto-mécanique forme une structure de capteur.
Le guide d'onde 20 comporte une extrémité d'entrée 20.1 d'une onde lumineuse connectée à une source lumineuse par l'intermédiaire d'un réseau de couplage 22.1 non représenté sur la figure, et une extrémité de sortie 20.2 connectée à des moyens de traitement de l'onde lumineuse sortant du guide d'onde par l'intermédiaire d'un réseau de couplage 20.2.
Le résonateur 4 est disposé à proximité d'un flanc du guide d'onde 20 de sorte à être couplé optiquement à celui-ci. Le guide d'onde 20 est dans le champ évanescent du résonateur, de sorte que l'onde lumineuse provenant de la source SL soit injectée dans le résonateur optique et que l'onde lumineuse ayant circulé dans le résonateur soit collectée par le guide d'onde. L'onde circulant dans le résonateur est symbolisée par une flèche.
La largeur de l'espace entre le flanc du guide d'onde et le bord latéral du résonateur est par exemple comprise entre 10 nm et 50 nm. Dans l'exemple représenté le résonateur optomécanique 4 a la forme d'un disque suspendu à un pied 24 fixé à une face du disque en regard du substrat. Le disque s'étend dans un plan du capteur. Le résonateur comporte deux faces d'extrémité 4.1, 4.2 sensiblement parallèles au plan du capteur et une face latérale 6.3 (figure 6).
De préférence le pied présente un diamètre faible par rapport aux dimensions du disque dans le plan du capteur, plus particulièrement un diamètre faible par rapport au diamètre du disque, de préférence le pied présente un diamètre au moins 10 fois plus petit que le diamètre du disque.
Plus généralement, le diamètre du pied est dix fois plus petit que la plus petite dimension du résonateur dans le plan du capteur, ainsi le pied gêne peu ou pas la vibration radiale du résonateur.
En variante, le résonateur est suspendu par des ressorts dans le plan ou par des poutres de taille nanométriques s'étendant radialement et comprimées et tendues par la vibration du disque. Les ressorts ou les poutres sont alors dimensionnés pour présenter une raideur axiale plus faible que celle du résonateur.
Toute autre forme de résonateur peut convenir, par exemple vue de dessus le résonateur peut avoir une forme d'anneau, d'ellipse ou hippodrome (« racetrack » en terminologie anglo-saxonne). Dans le cas d'un résonateur en forme d'anneau, d'ellipse ou hippodrome, celui-ci est suspendu au substrat par exemple au moyen d'un pied situé au centre du résonateur, et de poutres s'étendant entre le bord intérieur du résonateur et le pied.
Le résonateur peut être réalisé en tout matériau capable de confiner une onde électromagnétique, tel que le GaAS, le Ge ou le Si. Ce dernier est particulièrement intéressant pour une fabrication selon les techniques microélectroniques offrant un niveau élevé d'intégration sur un substrat.
La couche de fonctionnalisation est formée par exemple sur la face 4.2 du résonateur opposée à celle 4.1 en regard du substrat.
Les moyens d'excitation sont par exemple des moyens électrostatiques (non représentés) ou des moyens optiques.
Le fonctionnement du capteur va maintenant être décrit. De préférence, on choisit la longueur d'onde de l'onde lumineuse à injecter dans le résonateur proche de la résonance optique du résonateur, i.e. à flanc du pic de résonance optique. La lumière résonant à l'intérieur du résonateur optique est alors très sensible à la déformation mécanique du résonateur mécanique, en particulier lorsque le résonateur optique et mécanique sont confondus.
L'onde lumineuse à la longueur d'onde choisie est injectée dans le guide d'onde par la source lumineuse, par couplage optique l'onde lumineuse est injectée dans le résonateur optomécanique 4.
Lorsque d'un brin analysé s'hybride sur la sonde de reconnaissance, en fonction du niveau d'hybridation la raideur de la liaison entre le résonateur et la partie fixe est modifiée et l'énergie dissipée également, ce qui a un effet sur la fréquence de vibration du résonateur, qui en général augmente.
En effet, la fréquence mécanique
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La masse du résonateur ne varie quasiment pas lors de l'hybridation, par conséquent lorsque la raideur du résonateur augmente, sa fréquence augmente.
La mesure de la variation de la fréquence de vibration, permet de déterminer si l'hybridation a été totale ou non, et si l'hybridation a été totale, de déterminer l'identité du brin analysé. En effet le résonateur optomécanique est suffisamment sensible pour distinguer entre un appariement parfait ou quasi-parfait.
En variante, la mesure de variation de la fréquence de vibration peut être combinée à une mesure des variations des propriétés optiques du résonateur permettant d'acquérir des informations complémentaires.
Le résonateur optomécanique a par exemple une fréquence de vibration entre 100 MHz et 1 GHz avec des oscillations d'amplitude de l'ordre de quelques picomètres. Le fait de travailler à hautes fréquences permet d'augmenter la sensibilité de détection et la précision des données recueillies en particulier par un niveau d'échantillonnage temporel jamais atteint jusqu'à présent. Le résonateur optomécanique tel que décrit ci-dessus offre en outre l'avantage d'offrir de très bonnes performances en milieu liquide.
De manière préférée, on réalise un système comprenant un grand nombre de dispositifs de détection D (figure 7). Par exemple, on peut prévoir entre 9 et de l'ordre de 10000 résonateurs. Un nombre encore plus élevé de résonateurs peut être prévu, la limite pouvant être définie en fonction du cout de fabrication.
Chaque dispositif ou chaque groupe de dispositifs peut être muni de sondes de reconnaissance différentes. Chaque détecteur délivre son propre signal qui est traité par une unité de traitement. Seule une partie des dispositifs est schématisée.
Le système comporte par exemple un canal fluidique commun à tous les dispositifs ou plusieurs canaux fluidiques parallèles, chacun alimentant une colonne de dispositifs. Le canal ou les canaux sont formés par exemple dans un capot (non représenté).
La mise en œuvre de moyens optomécaniques facilite une telle intégration grâce aux techniques de multiplexage très bien maîtrisée dans le domaine de l'optique.
En outre, la mise en œuvre de techniques de fabrication microélectronique permet l'intégration d'un très grand nombre de dispositifs.
La sonde de reconnaissance équipant chaque dispositif est connue puisqu'elle dépend des adaptateurs fixés sur la partie fixe et la partie mobile qui sont eux-mêmes déterminés par la fonctionnalisation de chacune des parties. Le brin analysé détectable par chaque dispositif est donc connu.
En localisant spatialement les sondes et donc les réponses données par chacun des dispositifs, il est possible de réaliser des mesures redondantes exploitables, et d'obtenir des taux d'erreurs faibles.
Le procédé décrit ci-dessus s'applique à un système de séquençage, cependant un tel système permet de détecter plusieurs brins différents. Le liquide contient alors des fragments de génomes par exemple un génome de plusieurs milliers de bases. Celui-ci est injecté dans le canal ou les canaux du système et après une étape d'hybridation potentielle des brins sur les sondes de reconnaissance adéquates, les fréquences de vibration des différents résonateurs sont mesurées. Les fréquences peuvent être mesurées en continu, permettant de suivre le processus d'hybridation.
Le dispositif de détection et le système de détection sont réutilisables ; après un cycle de séquençage, ils peuvent être rincés pour retirer les brins hybridés sur les sondes de reconnaissance SR.
Un exemple de procédé de rinçage utilise comme solution de rinçage une solution tampon (« buffer » selon la terminologie anglo-saxonne) sans ADN, par exemple de type tris-acétate, tris-EDTA, PBS (« Phosphate Buffered Saline »), HEPES (N-(2- Hydroxyethyl)piperazine-N'-(2-ethanesulfonic acid) avec l'ajout d'un surfactant, typiquement en faible quantité, i.e. de l'ordre de 0.1% ou inférieure. Le surfactant peut être du SDS (« Sodium dodecyl sulfate ») ou du TWEEN (Polyethylene glycol sorbitan monolaurate). On fait circuler la solution de rinçage pour décrocher les brins d'ADN hybridés sur la sonde de reconnaissance. De préférence, la circulation ne doit pas se faire en circuit fermé. Cet exemple est uniquement donné à titre illustratif, l'Homme du Métier saura adapter les composants de la solution de rinçage en fonction de la nature des brins d'ADN et autres réactifs utilisés.
Il peut également être envisagé de remplacer les sondes de reconnaissance, celles-ci peuvent être retirées et remplacées par d'autres sondes pour modifier l'application du dispositif ou du système.
En faisant monter la température dans une gamme comprise par exemple entre 50 et 80°C, on peut obtenir un décrochage des sondes des accroches et les accroches deviennent libres pour mettre des nouvelles sondes.
Il est à noter que les résonateurs peuvent être mis en vibration à des fréquences différentes, par exemple ils peuvent avoir des fréquences de résonance mécanique différentes.
A titre d'exemple, en utilisant des sondes de reconnaissance de dimension linéaire de 50 micromètres, pour un système de séquençage comportant des groupes de 200 dispositifs munis de la même sonde de reconnaissance comprenant 150 paires de nucléotides. Le système de séquençage comprend 4 104 détecteurs optomécaniques/ cm2, i.e. environ 200 groupes de 200 dispositifs ayant la même sonde de reconnaissance et donc capables de détecter 200 domaines de séquences différentes. Ce système permet alors d'analyser un génome complet viral de 30 kb, i.e. 30000 bases ou nucléotides, en une seule série de mesure.
Dans un autre exemple, chaque dispositif mesure 40 pm de côté, ce qui permet de réaliser des systèmes de séquençage ayant une densité de dispositifs de 62,5xl03 cm2. Comme cela a déjà été mentionné ci-dessus, le dispositif de détection et le système de détection peuvent avantageusement être réalisés au moins en partie par des techniques de la microélectronique.
La ou les parties mobiles et la ou les parties fixes et éventuellement ou les guides d'onde sont réalisés par dépôt de couches sur un substrat et lithographie et gravure. Les pistes électriques sont également réalisées par dépôt et gravure.
Les couches polymères ainsi que les précurseurs d'adaptateur sont par exemple déposés et localisés par lithographie et gravure.
Le capot est par exemple en verre et est structuré pour former avec le substrat le canal ou les canaux fluidiques.
Le capot est rapporté sur le substrat et est par exemple collé à celui-ci. Lors d'une étape suivante, un liquide contenant les adaptateurs est injecté dans le canal ou les canaux. Le liquide est un liquide physiologique. Les adaptateurs se fixent alors sur les précurseurs d'adaptateur. Pendant la phase d'accrochage, le liquide est au repos ou en circulation générant un effort de cisaillement sur les parties fixes et mobiles.
Typiquement, si l'on ne met pas en œuvre de circulation une sédimentation et une mauvaise lecture, avec un risque de faux positifs est susceptible de survenir. Toutefois, si l'on met en œuvre une circulation de liquide trop rapide, une mauvaise accroche entraînant un risque de faux négatifs est susceptible de survenir. L'Homme du métier saura adapter la vitesse de circulation de liquide. Par exemple, on peut prévoir une vitesse entre 1 nl/min et plusieurs mL/min.
Lors d'une étape suivante, le liquide physiologique contenant les sondes de reconnaissance est injecté dans le canal ou les canaux. Les sondes se fixent par une extrémité à un adaptateur sur la partie fixe et par une autre extrémité sur la partie mobile. Pendant la phase d'accrochage des sondes, le liquide est au repos ou en circulation générant un effort de cisaillement sur les parties fixes et mobiles.
Il est à noter que les dispositions relatives de deux dispositifs voisins sont telles qu'il n'y pas de risque qu'une sonde se fixe sur une partie mobile d'un dispositif et sur une partie fixe d'une partie fixe d'un autre dispositif.
Le dispositif de détection et le système de détection présentent l'avantage d'utiliser des matériaux et techniques maîtrisées. Ils présentent une bonne robustesse.
En outre, l'association d'un grand nombre de dispositifs de séquençage permet de nombreuses applications, tels que le traitement en parallèle et le profilage de séquences codantes, la sélection et la localisation de gènes, le traitement en parallèle de mutations multiples, la sélection et la localisation de variants viraux.
Un dispositif de détection tel que décrit précédemment de bases nucléiques ou nucléo- bases d'un brin d'ADN ou d'ARN permet de détecter un niveau d'hybridation entre une sonde de reconnaissance et une séquence donnée de nucléotides. Plus la sonde de reconnaissance et la séquence sont complémentaires, plus le niveau d'hybridation est important.
Le dispositif illustré sur la figure 8A reprend un exemple d'agencement décrit précédemment en liaison avec la figure 6. La sonde génétique SR est rattachée d'une part à une partie fixe 2 et d'autre part à une partie mobile 4, par exemple sous forme d'un disque, et en particulier une surface 4.2 de ce disque. L'ajout de la sonde SR sur le disque résonant 4 provoque une augmentation de la masse en vibration et, comme illustré sur la figure 8B (donnant de manière schématique une courbe d'évolution Co de la fréquence de résonance du disque 4 en fonction du temps) une diminution de la fréquence de résonance (portion PI sur la courbe Co). Un tel agencement est susceptible d'induire un décalage vers le bas de la fréquence de résonance moindre par rapport à un agencement conventionnel où la sonde génétique SR serait attachée entièrement sur la partie mobile 4.
En effet, avec un agencement tel que proposé où la sonde SR est rattachée d'une part au disque 4 et d'autre part à la partie fixe 2, la masse de la sonde SR est plus faiblement couplée avec le mouvement vibratoire du disque 4 sur sa partie proche de la partie fixe 2. Les figures 9A-9B servent à illustrer lorsqu'un brin d'ADN dit « partiellement complémentaire » BPC vient se lier à la sonde SR car ce brin BPC comporte une ou plusieurs bases communes avec une région ciblée de la sonde SR.
L'ajout de la masse du brin partiellement complémentaire BPC au système vibratoire constitué par le disque 4 et la sonde SR résulte en un décalage vers le bas de la fréquence de résonance (portion P2 de la courbe de fréquence de résonance, le décalage étant égal à Afmismatch) lié à un effet de masse pur. Il n'y a pas de force supplémentaire exercée par la sonde SR sur la partie mobile 4 autre que la masse dans ce cas, consécutive à l'accroche de ce brin partiellement complémentaire BPC.
Dans l'exemple illustré sur les figures 10A-10B, un brin d'ADN parfaitement complémentaire BIC s'hybride à la sonde SR car il comporte la séquence complémentaire exacte à la séquence ciblée par la sonde SR. Le premier effet (portion P3a de la courbe C2 de fréquence de résonance) réside en un ajout de masse traduit par une diminution de la fréquence de résonance lié à la solidarisation du brin complémentaire avec la sonde SR sur quelques bases, couplant ainsi la masse du brin BIC à celle de la sonde SR et la partie mobile 4. Plus l'accroche des nucléo-bases complémentaires progresse, plus une double hélice d'ADN double brin a tendance à se constituer. La constitution d'une double hélice, éventuellement parfaite, liée à la complémentarité, éventuellement parfaite, des deux séquences, va générer une force de tension exercée par cette double hélice sur la partie mobile 4 via l'accroche de la sonde SR sur la surface 4.2. Cette force supplémentaire de tension apporte une plus grande raideur au système formé par le brin BIC reconnu - la sonde SR - la partie mobile 4 ce qui se traduit par une ré-augmentation de la fréquence de résonance dans ce cas (portion P3b). Enfin, à mesure que la double hélice entre le brin reconnu et la sonde SR est réalisée, le couplage mécanique entre la masse des deux brins respectivement reconnu et celui de la sonde SR augmente et le mouvement vibratoire de la partie mobile 4 diminue ce qui résulte en fin d'expérience en une diminution de la fréquence de résonance (décalage final de la fréquence de résonance Afcomplementary) de plus grande intensité que pour le décalage Afmismatch de l'exemple précèdent avec un brin partiellement complémentaire. Le décalage de fréquence de résonance traduit ainsi le niveau d'hybridation. Il est possible de faire un étalonnage du système en mesurant la courbe C2 avec le brin BIC. De cette manière, lors des mesures suivantes, il est possible de reconnaître imméditement si l'on détecte un brin entièrement compatible BIC ou un brin partiellement compatible BPC. Un dispositif de détection et un système de détection tels que décrits précédemment s'appliquent au séquençage d'au moins un brin de nucléotides.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif de détection d'au moins un brin de nucléotides comportant un support (3), au moins une partie mobile (4) par rapport au support (3), des moyens de mise en vibration de la partie mobile (4) à une fréquence donnée, des moyens de mesure de la fréquence de vibration de la partie mobile (4), une sonde de reconnaissance (SR) reliant mécaniquement une partie fixe (2) solidaire du support et la partie mobile (4), la sonde de reconnaissance (SR) comportant au moins une séquence de nucléotides.
2. Dispositif selon la revendication 1, dans lequel les moyens de mise en vibration de la partie mobile sont configurés pour mettre en vibration la partie mobile à sa fréquence de résonance.
3. Dispositif selon l'une des revendications 1 ou 2, dans lequel les moyens de mesure de la fréquence de vibration sont des moyens opto-mécaniques.
4. Dispositif selon la revendication 3, dans lequel les moyens de mesure de la fréquence de vibration comportent au moins un guide d'onde couplé optiquement avec la partie mobile, une source de lumière pour injecter de la lumière dans le guide d'onde et une unité de traitement de la lumière sortant du guide d'onde.
5. Dispositif selon la revendication 4, dans lequel la partie mobile est un disque, un anneau, un hippodrome ou une ellipse suspendu(e) par au moins un pied.
6. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 5, comportant plusieurs sondes identiques reliant la partie mobile au support.
7. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 6, dans lequel la partie fixe comporte un premier précurseur d'adaptateur et un premier adaptateur dont une extrémité est fixée au premier précurseur d'adaptateur et l'autre extrémité comporte une séquence de nucléotides hybridée avec une extrémité de la sonde de reconnaissance, et dans lequel la partie mobile comporte un deuxième précurseur d'adaptateur et un deuxième adaptateur comprenant une sonde dont une extrémité est fixée au deuxième précurseur d'adaptateur et l'autre extrémité comporte une séquence de nucléotides hybridée avec une extrémité de la sonde de reconnaissance.
8. Dispositif selon l'une des revendications 1 à 7, dans lequel les moyens de mise en vibration de la partie mobile (4) à une fréquence donnée sont de type électrostatique comportent une électrode sur la partie fixe et une électrode sur la partie mobile.
9. Ensemble comportant le dispositif selon l'une des revendications précédentes et un canal fluidique assurant la mise en contact d'un liquide contenant ledit brin analysé et de la sonde de reconnaissance.
10. Système comportant une pluralité de dispositifs selon l'une des revendications 1 à 8.
11. Système selon la revendication 10, dans lequel les dispositifs sont répartis en groupe, chaque groupe comportant des sondes de reconnaissance ayant la même structure de nucléotides.
12. Système selon la revendication 11, dans lequel les sondes de reconnaissance sont choisies de sorte qu'en une seule mesure un génome complet est analysé.
13. Procédé de détection pour le séquençage d'au moins une séquence de nucléotides comportant :
- la mise en contact d'un liquide contenant ladite séquence avec un dispositif résonant comportant une sonde de reconnaissance reliant une partie fixe et une partie mobile du dispositif résonant,
- la mise en vibration de la partie mobile, - la mesure de la variation de la fréquence de vibration de la partie mobile due à l'hybridation entre la sonde de reconnaissance et la séquence de nucléotides.
14. Procédé selon la revendication précédente, dans lequel la partie mobile est mise en vibration à sa fréquence de résonance.
15. Procédé selon l'une des revendications 13 ou 14, dans lequel la partie mobile est mise en vibration avec une amplitude de l'ordre de 0,1 nm et/ou dans lequel la partie mobile est mise en vibration à une fréquence comprise entre 100 MHz et 1 GHz.
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