WO2023106273A1 - ウイルス増殖抑制剤 - Google Patents

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WO2023106273A1
WO2023106273A1 PCT/JP2022/044812 JP2022044812W WO2023106273A1 WO 2023106273 A1 WO2023106273 A1 WO 2023106273A1 JP 2022044812 W JP2022044812 W JP 2022044812W WO 2023106273 A1 WO2023106273 A1 WO 2023106273A1
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acid
virus
bile
agonist
sars
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PCT/JP2022/044812
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真嗣 福田
猛志 一戸
拓 中原
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慶應義塾
国立大学法人 東京大学
メタジェンセラピューティクス株式会社
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Definitions

  • the present invention relates to providing a composition having antiviral activity, which contains a bile acid receptor agonist.
  • viruses such as influenza virus and novel coronavirus (SARS-CoV-2 virus) infect host organisms, they enter cells from the mucosal surfaces of tissues in the oral cavity, respiratory system, digestive system, and urinary system, establish an infection.
  • Influenza and SARS-CoV-2 viruses are known to infect through the mucous membranes of the respiratory tract.
  • macosal immunity protects the body from pathogens such as viruses, and “systemic immunity” works to eliminate foreign substances when pathogens invade the body. to combat pathogen infections.
  • the intestinal flora has a great effect on this "mucosal immunity”.
  • Intestinal bacteria are thought to affect the development and function of immunity in vivo. It has been suggested that the intestinal bacteria themselves and the substances metabolized by the intestinal bacteria are deeply involved in "natural immunity" against viruses and bacteria.
  • mice whose intestinal flora had been imbalanced by taking antibiotics for a long period of time were nasally infected with a non-lethal dose of the influenza virus, and immune responses to the influenza virus were induced 2 weeks after infection.
  • Virus-specific blood IgG antibody titers, nasal wash IgA antibody titers, splenic virus-specific CD4T and CD8 T cell responses, and lung CTL numbers are known to decrease (non Patent document 1).
  • the objective of the present invention is to develop a composition with antiviral activity by utilizing the effect of intestinal bacteria on immunity and the effect on infection with viruses including influenza virus and SARS-CoV-2 virus.
  • [1] A composition having antiviral activity, containing a bile acid receptor agonist
  • [2] The composition of [1], wherein the virus is an enveloped virus
  • [3] The composition according to [2], wherein the virus is influenza virus or coronavirus
  • [4] The composition according to any one of [1] to [3], wherein the bile acid receptor is selected from the group consisting of TGR5, PPAR ⁇ , FXR, and PXR
  • [5] The composition of any one of [1] to [3], wherein the bile acid receptor agonist is a bile acid or derivative thereof, TGR5 agonist, PPAR ⁇ agonist, FXR agonist, or PXR agonist
  • composition of the present invention By inoculating an animal with the composition of the present invention, it is possible to reduce the titer of the virus even when infected with the virus, and as a result, it can be used to prevent aggravation of symptoms.
  • active ingredients some substances that can be used as active ingredients are known as food ingredients, and can also be used as food compositions having antiviral activity.
  • FIG. 1 shows reduced resistance to influenza virus and reduced survival in mice on a low-fiber diet and on antibiotics.
  • Figure 2 shows that the ratio of neutrophils in the alveoli, which is an indicator of viral infection, increases after infection with influenza virus when a low-fiber diet and antibiotics are given (Fig. 2 (a) -1) (a-2)), an increase in CXCL1 produced in the blood by macrophages, neutrophils, and epithelial cells, which are indicators of inflammatory response (Fig. 2 (b-1) (b-2)) It is a figure which shows.
  • Fig. 3-1 shows that the titer of influenza virus infected to mice decreases in a concentration-dependent manner when deoxycholic acid, a bile acid, is applied (Fig.
  • FIG. 3 shows that the application of deoxycholic acid or ursodeoxycholic acid, which are bile acids, to mice improves their resistance to influenza virus and improves their survival rate (Fig. 3).
  • (b-1) shows that ursodeoxycholic acid, which are bile acids, to mice improves their resistance to influenza virus and improves their survival rate (Fig. 3).
  • (b-1) shows that ursodeoxycholic acid, which are bile acids, to mice improves their resistance to influenza virus and improves their survival rate (Fig. 3).
  • FIG. 4 is a diagram showing that expression of influenza virus genes in cells after influenza virus infection is reduced in cells to which various bile acids are applied.
  • Figure 5 shows decreased influenza virus titer (a) and increased resistance to influenza virus and improved survival (b) when bile acid receptor agonists were applied. It is a diagram.
  • FIG. 6 shows that in cells to which a bile acid receptor agonist is applied, expression of influenza virus genes in the cells after influenza virus infection
  • FIG. 7 shows decreased resistance to SARS-CoV2 virus and reduced viability in Syrian hamsters when given antibiotics.
  • FIG. 8 shows that the titer of SARS-CoV2 virus infecting Syrian hamsters is reduced when the bile acid deoxycholic acid is applied.
  • FIG. 9 is a diagram showing that when cholic acid, a bile acid, is applied to Syrian hamsters, their resistance to the SARS-CoV2 virus is improved and their survival rate is improved.
  • FIG. 10 is a diagram showing that expression of SARS-CoV2 virus genes in cells after infection with SARS-CoV2 virus is reduced in cells to which various bile acids are applied.
  • FIG. 11 shows that SARS-CoV2 virus titers are reduced when bile acid receptor agonists are applied.
  • FIG. 12 is a diagram showing that the expression of SARS-CoV2 virus genes in cells after SARS-CoV2 virus infection is reduced when a bile acid receptor agonist is applied.
  • the administration of antibiotics and the application of a low-fiber diet are thought to disrupt the balance of intestinal bacteria, and it was thought that the disruption of the intestinal balance caused a decline in resistance to viral infections.
  • the present inventors also speculated that an imbalance of intestinal bacteria caused abnormalities in bile acid metabolism in the intestine, and when bile acids (primary bile acids or secondary bile acids) were applied to cells, It was clarified that the titer of viral infection in cells decreased, and that administration of bile acids to animals increased resistance to viral infection and decreased the lethality rate.
  • bile acids primary bile acids or secondary bile acids
  • the inventors of the present invention found that animals given bile acid receptor agonists greatly enhanced their resistance to viral infection, and completed the present invention. Specifically, the inventors of the present invention have shown that the above-mentioned problems can be solved by providing a composition with antiviral activity comprising a bile acid receptor agonist.
  • composition of the present invention can be provided as a pharmaceutical composition, but among the active ingredients described later, ingredients that can be used as foods (for example, primary bile acids produced in vivo, bacteria in the intestinal tract, secondary bile acid produced by the action of (2) as an active ingredient, it can also be provided as a food composition.
  • ingredients that can be used as foods for example, primary bile acids produced in vivo, bacteria in the intestinal tract, secondary bile acid produced by the action of (2) as an active ingredient, it can also be provided as a food composition.
  • the target virus in the present invention is preferably an enveloped virus for which the antiviral activity of the composition has been confirmed in the present invention.
  • enveloped viruses include influenza virus, respiratory syncytial virus, parainfluenza virus, coronavirus, herpes simplex virus, varicella-zoster virus, measles virus, rubella virus coronavirus, influenza virus, herpes virus, and rubella virus.
  • the composition of the present invention can be used as a composition having antiviral activity against infections with any of these viruses.
  • influenza viruses and coronaviruses are preferred in the present invention.
  • the antiviral activity means inhibition of viral attachment to cells, inhibition of viral entry into cells, reduction of viral protein production in virus-infected cells, Inhibiting any of the viral replication cycles in infected cells, reducing the infectious titer of viruses produced from infected cells, and making virus-infected animal individuals resistant to viruses and that animal individuals infected with the virus do not die even if infected with the virus.
  • a bile acid receptor agonist used as an active ingredient in the present invention refers to a substance that binds to a bile acid receptor expressed on the cell surface and sends an activation signal to the cell.
  • Substances known as bile acid receptors in the art include TGR5, PPAR ⁇ , FXR, and PXR. good too.
  • Bile acids synthesized in the liver are secreted into the intestine via the bile duct. Most bile acids are reabsorbed in the lower ileum of the small intestine and returned to the liver via the portal vein. Bile acids are recycled by this "enterohepatic circulation”. Bile acid receptors are receptors for cells involved in this "enterohepatic circulation”.
  • TGR5 is a bile acid receptor expressed on the surface of the cell membrane of L cells present in the human gastrointestinal tract. It is a receptor classified as a G protein-coupled receptor, and when it detects bile acid on the cell surface, it increases the concentration of intracellular cAMP. It is known that when TGR5 is activated, it acts to suppress the function of macrophages in the vicinity and at the same time regulates the energy consumption of the body, exhibiting anti-obesity and anti-diabetic effects.
  • PPAR ⁇ is a bile acid nuclear receptor that is distributed in the liver, kidney, heart, and skeletal muscle, and is particularly abundant in the liver. PPAR ⁇ forms a heterodimer with the retinoid X receptor (RXR) in the nucleus and regulates gene transcription upon ligand binding. It is activated by using isolated fatty acids as physiological ligands (signaling substances) and plays an important role in fatty acid metabolism.
  • RXR retinoid X receptor
  • the farnesoid X receptor is a nuclear receptor that is highly expressed in the liver, small intestine, kidney, and adrenal glands. It binds to the FXR responsive element (FXRE) of target genes and has the function of promoting or suppressing transcription.
  • FXRE FXR responsive element
  • Bile acid biosynthetic intermediates also exhibit potent effects as physiological ligands for FXR. These tissues are sites where cholesterol is metabolized and degraded into bile acids or steroid hormones and excreted from the body, and it has been clarified that FXR functions to maintain bile acid/cholesterol homeostasis.
  • the pregnane X receptor is a nuclear receptor that is expressed in tissues such as the liver and intestinal tract, and is involved in inducing the expression of important proteins that regulate pharmacokinetics, such as CYP3A and P-glycoprotein.
  • PXR Upon ligand binding to PXR, PXR, upon activation, forms a dimer with the retinoid X receptor (RXR), which translocates into the nucleus to function as a transcription factor. Activation of PXR has been reported to produce anti-inflammatory effects.
  • a bile acid receptor agonist in the present invention refers to a substance that binds to the bile acid receptor described above and sends an activation signal to cells.
  • bile acid receptor agonists that can be used in the present invention can include bile acids or derivatives thereof, TGR5 agonists, PPAR ⁇ agonists, FXR agonists, or PXR agonists.
  • Bile acids that can be used as bile acid receptor agonists in the present invention include primary bile acids that are biosynthesized in the liver of animals and part of the primary bile acids that are metabolized by intestinal bacteria in the intestinal tract. There are also secondary bile acids that are produced as metabolites by endobacteria.
  • Examples of primary bile acids include cholic acid, chenodeoxycholic acid, hyocholic acid, myuricholic acid, and 5 ⁇ -cyprinol.
  • secondary bile acids examples include deoxycholic acid, lithocholic acid, hyodeoxycholic acid, and ursodeoxycholic acid.
  • conjugated bile acids in which these secondary bile acids are present in combination with glycine and taurine that is, glycodeoxycholic acid, which is the glycine-conjugated form of deoxycholic acid, and taurodeoxycholic acid, which is the taurine-conjugated form of deoxycholic acid, lytocol
  • TGR5 agonists that can be used in the present invention include CCDC (HY-14229), INT-777, Hyodeoxycholic acid, TC-G 1005, INT-767, having the following chemical structures, which is not limited to
  • PPAR ⁇ agonists that can be used in the present invention include, but are not limited to, fenofibrate and pemafibrate having the following chemical structures.
  • FXR agonists that can be used in the present invention include GW4064, Colforsin (Forskolin, HL 362), Turofexorate Isopropyl (XL335), Chenodeoxycholic Acid, T0901317, Sevelamer HCl, Lithocholic acid, Nidufexor (LMB- 763), fexaramine, LY2562175, Obeticholic Acid, Vonafexor (EYP001), Guggulsterone E&Z, Tropifexor (LJN452), Cilofexor, but not limited to these.
  • PXR agonists that can be used in the present invention include, but are not limited to, SR-12813 and rifampicin, which have the following chemical structures.
  • the present invention can provide methods of preventing, treating, or speeding recovery from viral infection comprising administering a bile acid receptor agonist.
  • the bile acid receptor agonists used here have already been mentioned above.
  • This method can be used effectively against infections with enveloped viruses, especially influenza viruses and coronaviruses.
  • the method of administering the bile acid receptor agonist can be appropriately determined according to each of a method for preventing viral infection, a method for treating viral infection, and a method for hastening recovery from viral infection.
  • Viral infection can be prevented by daily and continuous administration of bile acid receptor agonists to animals, including humans.
  • Viral infection can be treated or recovery from viral infection can be hastened by administration until virus is no longer detectable in the sample.
  • Example 1 Changes in Influenza Virus Resistance by Diet or Administration of Antibiotics
  • low-fiber diets or administration of antibiotics caused changes in resistance to influenza viruses in mice.
  • Control group was given water along with a normal diet (CMF, Oriental Yeast Co., Ltd.), a group was given a low-fiber diet (LF group), and a group was given an 8-drug mixed antibiotic along with a normal diet.
  • CMF normal diet
  • LF group low-fiber diet
  • 8-drug mixed antibiotic along with a normal diet.
  • 7 to 10 female C57BL/6 (wild-type) mice were assigned to each group and maintained under SPF conditions with ad libitum food and water access and a 12 h light/dark cycle for 4 weeks. bottom.
  • mice in the antibiotic-treated group received ampicillin (1 g/L; Nacalai Tesque), vancomycin (500 mg/L; Duchefa Biochemie), neomycin sulfate (1 g/L; Nacalai Tesque), Metronidazole (1 g/L; Nacalai Tesque), gentamicin (10 mg/L; Nacalai Tesque), penicillin (100 U/ml; Nacalai Tesque), streptomycin (100 U/ml; Nacalai Tesque), and amphotericin B (0.25 mg /L (Nacalai Tesque) was allowed to drink freely for 4 weeks.
  • influenza A virus (A/PR8 strain, provided by the National Institute of Infectious Diseases). Virus infection was performed by injecting mice intranasally with 30 ⁇ L of virus suspension (1,000 pfu influenza virus in PBS) under complete anesthesia by intraperitoneal injection of sodium pentobarbital (infected day 0).
  • mice were bred for 14 days under the same conditions as before virus infection, and the results of confirming survival and death are shown in Figure 1. As shown by these results, all animals survived the normal diet (100% survival rate), whereas the LF group given the low-fiber diet and the Abx treated with antibiotics In all groups, some individuals died 7 or 8 days after virus infection, and the survival rate decreased to 20% or less after 14 days.
  • Mouse lungs 1-7 days after virus infection were perfused with 10 ml PBS through the right ventricle before tissue acquisition. After mincing, the cells were incubated in HBSS containing 2.5 mM Hepes and 1.3 mM EDTA at 37°C for 30 minutes, and the cells were further treated with 5% FBS, 1 mM CaCl 2 , 1 mM MgCl 2 , 2.5 mM Hepes. , and 0.5 mg/ml collagenase D (Roche) and incubated at 37°C for 60 min. A turbid solution was prepared.
  • CXCL1 a type of chemokine whose production in the blood is induced by macrophages, neutrophils, and epithelial cells activated by inflammatory mediators.
  • CXCL1 in 100 ⁇ l serum was measured using the Mouse CXCL1 ELISA Kit (#KE10019).
  • Figures 2 (a-1) and (a-2) show the percentage of neutrophils in lung cells in each experimental group. In these figures, the ratio of neutrophils was higher in the LF group and the Abx group than in the control group, suggesting that the inflammatory response due to virus infection was enhanced.
  • Example 2 Changes in Influenza Virus Resistance by Application of Bile Acids
  • Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells (National Institute of Biomedical Innovation, Health and Nutrition JCRB cell bank) were treated with bile acid. Influenza virus was added, and the titer of influenza virus was measured 24 hours later. Viral titers were quantified by standard plaque assays using Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells.
  • influenza virus titers when 0.125 mM deoxycholate was added to the medium was measured 24 hours post-infection, or 48 hours post-infection, using standard plaques using Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells. Quantified by assay. As a result, in the group to which deoxycholic acid was not added (only DMSO was added), the virus titer increased over time, whereas in the group to which deoxycholic acid was added, the virus titer increased over time. Viral titer did not increase (Fig. 3(a-2)).
  • influenza A virus (A/PR8 strain, provided by the National Institute of Infectious Diseases). Virus infection was performed by injecting mice intranasally with 30 ⁇ L of virus suspension (1,000 pfu influenza virus in PBS) under complete anesthesia by intraperitoneal injection of sodium pentobarbital (infected day 0).
  • mice were bred for 14 days under the same conditions as before virus infection, and the results of confirming survival and death are shown in Figures 3 (b-1), (b-2) and (B-3).
  • the survival rate was improved in the group supplemented with cholesterol, a raw material for bile acid, and deoxycholic acid, a bile acid, was improved.
  • Example 3 Intracellular Changes in Influenza Virus by Application of Bile Acids
  • Example 4 Changes in Influenza Virus Resistance by Application of Bile Acid Receptor Agonists
  • mice Female C57BL/6 (wild-type) mice were divided into two groups of 25 and 73 mice and allowed ad libitum access to a low-fiber diet and drinking water under SPF conditions and a 12 h light/dark cycle for 4 weeks. bred. A group of 73 rats added 100 ⁇ M of the TGR5 agonist HY-14229 to their drinking water (100 ⁇ M TGR5 group), and another group (25 rats) did not (water group).
  • influenza A virus (A/PR8 strain, provided by the National Institute of Infectious Diseases). Virus infection was performed by injecting mice intranasally with 30 ⁇ L of virus suspension (1,000 pfu influenza virus in PBS) under complete anesthesia by intraperitoneal injection of sodium pentobarbital (infected day 0).
  • mice were bred for 14 days under the same conditions as before virus infection, and the results of confirming survival and death are shown in Figure 5 (b). As shown by these results, the survival rate was improved in the group to which the TRG5 agonist was added as compared with the group to which only water was given (water group).
  • Example 5 Changes in Cells against Influenza Virus by Application of Bile Acid Receptor Agonist Check if there are any changes.
  • FXR agonist GW4064 and TGR5 agonist HY-14229 which are bile acid receptor agonists, in influenza-infected cells.
  • MOI 0.01
  • GW4064 or HY-14229 dissolved in DMSO was added to 0.1 ⁇ M, 1 ⁇ M, 10 ⁇ M or 100 ⁇ M Madin-Darby It was added into the culture medium of canine kidney (MDCK) cells and incubated for 24 hours. Addition of 10 ⁇ M or 100 ⁇ M GW4064 resulted in cell death and was excluded from the experiment.
  • tubulin and influenza virus proteins were analyzed by Western blotting.
  • cholate, deoxycholate, taurocholate, taurodeoxycholate, and ursodeoxycholate all reduced SARS-Cov-2 nucleocapsid expression at 11 hours after virus infection.
  • the expression level was greatly reduced when deoxycholic acid and ursodeoxycholic acid were applied (Fig. 10).
  • Example 6 Changes in SARS-CoV-2 virus resistance by application of antibiotics
  • the application of antibiotics caused changes in resistance to the SARS-CoV-2 virus in Syrian hamsters. .
  • Control group given water with a normal diet (CMF, Oriental Yeast Co., Ltd.), a group (Abx) given a 7-drug mixed antibiotic (see Example 1 above) with a normal diet , Allocating 5 to 6 1-month-old female Syrian hamsters (Japan SLC Inc.) to each, allowing them to eat and drink ad libitum under SPF conditions, with a 12-hour light/dark cycle for 4 weeks. bred.
  • group (Abx) given antibiotics the free drinking water containing antibiotics was administered in the same manner as in Example 1.
  • SARS-CoV-2/UT-NCGM02/Human/2020/Tokyo (provided by Professor Yoshihiro Kawaoka, Institute of Medical Science, University of Tokyo) was infected intranasally. Viral infection was performed by intranasally applying 2 ⁇ 10 6 pfu of SARS-CoV-2 to Syrian hamsters under complete anesthesia with an intraperitoneal injection of pentobarbital sodium (day of infection). 0).
  • Fig. 7 shows the results of confirming survival and death after breeding these Syrian hamsters under the same conditions as before virus infection for 14 days. As shown by this result, all animals survived when given a normal diet (survival rate 100%), whereas the Abx group treated with antibiotics died 3 days after virus infection. The survival rate decreased to less than 20% after 14 days.
  • Example 7 Changes in SARS-CoV-2 virus resistance by application of bile acid
  • SARS-CoV-2 virus SARS-CoV-2/UT-NCGM02/Human/2020/Tokyo (provided by Professor Yoshihiro Kawaoka, Institute of Medical Science, University of Tokyo) ⁇ 10 7 pfu/ml of virus solution
  • secondary Deoxycholic acid in DMSO
  • DMSO secondary Deoxycholic acid
  • Viral titers were quantified by standard plaque assays using Madin-Darby canine kidney (MDCK) cells.
  • the SARS-CoV-2 virus titer decreased from the addition of 1.25 mM deoxycholate, and the SARS-CoV-2 virus titer decreased significantly when 2.5 mM deoxycholate was added. decreased (Fig. 8).
  • SARS-CoV-2 virus virulent mutant (British type), QK002 mutant (strain B.1.1.7) (provided by the National Institute of Infectious Diseases) was infected through the intranasal route. Viral infection was performed by intranasally applying 2 ⁇ 10 6 pfu of SARS-CoV-2 to Syrian hamsters under complete anesthesia with an intraperitoneal injection of pentobarbital sodium (day of infection). 0).
  • Fig. 9 shows the results of confirming survival and death after breeding these Syrian hamsters under the same conditions as before virus infection for 14 days. As shown by these results, the survival rate was improved in the group to which cholic acid was added (CA (0.5 mM) group) compared to the group to which only water was given (Control group).
  • Example 8 Changes in Cells to SARS-CoV-2 Virus by Application of Bile Acids It was confirmed what kind of change there was in the growth of
  • Cholic acid (CA) dissolved in DMSO (Nacalai Tesque Co., Ltd.), deoxycholic acid (DCA) (Nacalai Tesque Co., Ltd.), taurocholic acid (TCA) (Nacalai Tesque Co., Ltd.), taurodeoxycholic acid (TDCA) (Nacalai Tesque, Inc.) or ursodeoxycholic acid (UDCA) (Chemodex) was added to 0.125 mM in the culture medium of VeroE6/TMPRSS2 cells, and at that time, the cells were infected with SARS-CoV. -2 virus QK002 mutant strain (strain B.1.1.7) (provided by National Institute of Infectious Diseases) was infected with MOI 0.01, and cells were collected after 11 hours and 14 hours.
  • nucleocapsid expression levels of cholic acid, deoxycholic acid, taurocholic acid, taurodeoxycholic acid, and ursodeoxycholic acid decreased, but deoxycholic acid and ursodeoxycholic acid decreased.
  • the expression level of nucleocapsids was greatly reduced when acid was added (Fig. 10). This trend was almost the same at 14 hours after virus infection (Fig. 10).
  • Example 9 Change in SARS-CoV-2 virus resistance by application of bile acid receptor agonist
  • application of a bile acid receptor agonist changed resistance to SARS-CoV-2 virus in Syrian hamsters I checked if there is
  • Example 10 Changes in Cells against SARS-Cov-2 Virus by Application of Bile Acid Receptor Agonists We determined what changes there were to the growth of the SARS-Cov-2 virus.
  • FXR agonist GW4064 and TGR5 agonist HY-14229 which are bile acid receptor agonists, in cells infected with the SARS-CoV-2 virus.
  • GW4064 or HY-14229 dissolved in DMSO was added to the culture medium of VeroE6/TMPRSS2 cells at 10 ⁇ M or 100 ⁇ M.
  • the cell lysate was collected and the expression levels of tubulin and SARS-CoV-2 nucleocapsid were analyzed by Western blotting.
  • both GW4064 and HY-14229 at 100 ⁇ M decreased the expression level of the SARS-Cov-2 nucleocapsid at 24 hours after virus infection (Fig. 12).
  • composition of the present invention By inoculating animals with the composition of the present invention, it is possible to reduce the titer of the virus even when infected with the virus, and as a result, it can be used to prevent aggravation of symptoms.
  • active ingredients some substances that can be used as active ingredients are known as food ingredients, and can also be used as food compositions having antiviral activity.

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Abstract

本発明は、腸内細菌の免疫に対する作用およびインフルエンザウイルスやSARS-CoV-2ウイルスを含むウイルスに対する感染に対する作用を利用して、抗ウイルス活性を有する組成物を開発することを課題とする。　本発明の発明者らは、鋭意研究を進めた結果、胆汁酸受容体アゴニストを摂取させた動物が、ウイルスの感染に対する抵抗性を大きく増進させることを見出し、本発明を完成させるに至った。具体的には、本発明の発明者らは、胆汁酸受容体アゴニストを含む、抗ウイルス活性を有する組成物を提供することにより、上述した課題を解決することができることを示した。

Description

ウイルス増殖抑制剤
　本発明は、胆汁酸受容体アゴニストを含む、抗ウイルス活性を有する組成物を提供することに関する。
　インフルエンザウイルスや新型コロナウイルス（SARS-CoV-2ウイルス）などのウイルスは、宿主生物に感染する際に、口腔や呼吸器、消化器系や泌尿器系の組織の粘膜面から細胞内に侵入し、感染を成立させる。インフルエンザウイルスやSARS-CoV-2ウイルスは、気道の粘膜から感染することが知られている。
　このようなウイルスの感染に対して、ウイルスなどの病原体を体内に侵入させないように体を守る「粘膜免疫」と病原体が体内に侵入してしまったときに異物を排除するように働く「全身免疫」により、病原体の感染に対処する。この「粘膜免疫」に対して、腸内細菌叢は大きな作用を有している。
　腸内細菌は、生体において免疫の発達と機能に影響を与えると考えられている。腸内細菌そのものや、腸内細菌により代謝された物質が、ウイルスや細菌など対する「自然免疫」に深くかかわっていることが示唆されている。
　インフルエンザウイルスに関して、抗生物質を長期間飲ませて腸内細菌叢のバランスを崩したマウスに、非致死量のインフルエンザウイルスを経鼻的に感染させて、感染2週間後のインフルエンザウイルスに対する免疫応答を解析すると、ウイルス特異的な血液中のIgG抗体価、鼻腔洗浄液中のIgA抗体価、脾臓のウイルス特異的なCD4T、CD8T細胞応答、肺のCTLの数が低下することが知られている（非特許文献1）。
　また、SARS-CoV-2による新型コロナウイルス感染症（COVID-19）において、その重症度の違いに関して、COVID-19の患者の免疫状態に、腸内細菌が重大な影響を与えている可能性が示唆され、SARS-CoV-2の感染と栄養、胃腸機能の評価に関心がもたれている。また、SARS-CoV-2ウイルス感染者の60％以上が下痢、悪心、嘔吐などの胃腸症状を示し、このグループの患者が重症度の高い傾向にあることが明らかになっていることから、ヒトの腸内細菌叢の組成を解析することにより、COVID-19の重症度を予測できる可能性があることも示唆されている（非特許文献2）。
　このように、ウイルスの感染と腸内細菌叢との間の関連性が示唆されているものの、現状においては、その関連性が解明されていない。
Ichinohe T, et al., Proc Natl Acad Sci U S A 108: 5354-5359, 2011 https://www.medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.22.20076091v1
　本発明は、腸内細菌の免疫に対する作用およびインフルエンザウイルスやSARS-CoV-2ウイルスを含むウイルスに対する感染に対する作用を利用して、抗ウイルス活性を有する組成物を開発することを課題とする。
　本発明の発明者らは、鋭意研究を進めた結果、胆汁酸受容体アゴニストを摂取させた動物が、ウイルスの感染に対する抵抗性を大きく増進させることを見出し、本発明を完成させるに至った。具体的には、本発明の発明者らは、胆汁酸受容体アゴニストを含む、抗ウイルス活性を有する組成物を提供することにより、上述した課題を解決することができることを示した。
　より具体的には、本件出願は、前述した課題を解決するため、以下の態様を提供する：
［1］：　胆汁酸受容体アゴニストを含む、抗ウイルス活性を有する組成物；
［2］：　ウイルスが、エンベロープ型ウイルスである、［1］に記載の組成物；
［3］：　ウイルスが、インフルエンザウイルス、コロナウイルスである、［2］に記載の組成物；
［4］：　胆汁酸受容体が、TGR5、PPARα、FXR、PXRからなる群から選択される、［1］～［3］のいずれかに記載の組成物；
［5］：　胆汁酸受容体アゴニストが、胆汁酸またはその誘導体、TGR5アゴニスト、PPARαアゴニスト、FXRアゴニスト、またはPXRアゴニストである、［1］～［3］のいずれかに記載の組成物；
［6］：　胆汁酸受容体アゴニストが、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸、ケノデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、ヒオコール酸、グリコヒオコール酸、タウロヒオコール酸、ミュリコール酸、グリコミュリコール酸、タウロミュリコール酸5α-シプリノール、デオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、リトコール酸、グリコリトコール酸、タウロリトコール酸、ヒオデオキシコール酸、グリコヒオデオキシコール酸、タウロヒオデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、グリコウルソデオキシコール酸、タウロウルソデオキシコール酸、CCDC（HY-14229）、INT-777、Hyodeoxycholic acid、TC-G 1005、INT-767、フェノフィブラート、ペマフィブラート、GW4064、Colforsin (Forskolin, HL 362)、Turofexorate Isopropyl (XL335)、Chenodeoxycholic Acid、T0901317、Sevelamer HCl、Lithocholic acid、Nidufexor (LMB-763)、fexaramine、LY2562175、Obeticholic Acid、Vonafexor (EYP001)、Guggulsterone E&Z、Tropifexor (LJN452）、Cilofexor、SR-12813、リファンピシン、からなる群から選択される、［5］に記載の組成物。
　本発明の組成物は、動物に接種させることにより、ウイルスに感染した場合でもウイルスの力価を下げることができ、結果的に症状の悪化を防止するために使用することができる。また、有効成分として使用することができる物質には食品成分として知られているものもあり、抗ウイルス活性を有する食品組成物として使用することもできる。
図1は、低繊維食を与えた場合および抗生物質を与えた場合のマウスにおいて、インフルエンザウイルスへの抵抗性が低下し、生存率が低下することを示す図である。 図2は、低繊維食を与えた場合および抗生物質を与えた場合に、インフルエンザウイルスに感染させると、ウイルス感染の指標である肺胞中の好中球比率が上昇すること（図2（a-1）（a-2））、炎症反応の指標であるマクロファージ、好中球、上皮細胞から血液中に産生されるCXCL1が上昇すること（図2（b-1）（b-2））を示す図である。 図3-1は、胆汁酸であるデオキシコール酸を適用した場合に、濃度依存的に、マウスに感染させたインフルエンザウイルスの力価が低下することを示す図である（図3（a-1）（a-2））。 図3-2は、胆汁酸であるデオキシコール酸あるいはウルソデオキシコール酸をマウスに適用した場合に、インフルエンザウイルスに対する抵抗性が向上し、生存率が改善されることを示す図である（図3（b-1）（b-2）（b-3））。 図4は、種々の胆汁酸を適用した細胞において、インフルエンザウイルス感染後の細胞内におけるインフルエンザウイルスの遺伝子の発現が低下することを示す図である。 図5は、胆汁酸受容体アゴニストを適用した場合に、インフルエンザウイルスの力価が低下すること（a）、そしてインフルエンザウイルスに対する抵抗性が向上し、生存率が改善されること（b）を示す図である。 図6は、胆汁酸受容体アゴニストを適用した細胞において、インフルエンザウイルス感染後の細胞内におけるインフルエンザウイルスの遺伝子の発現が低下することを示す図である。 図7は、抗生物質を与えた場合のシリアンハムスターにおいて、SARS-CoV2ウイルスへの抵抗性が低下し、生存率が低下することを示す図である。 図8は、胆汁酸であるデオキシコール酸を適用した場合に、シリアンハムスターに感染させたSARS-CoV2ウイルスの力価が低下することを示す図である。 図9は、胆汁酸であるコール酸をシリアンハムスターに適用した場合に、SARS-CoV2ウイルスに対する抵抗性が向上し、生存率が改善されることを示す図である。 図10は、種々の胆汁酸を適用した細胞において、SARS-CoV2ウイルス感染後の細胞内におけるSARS-CoV2ウイルスの遺伝子の発現が低下することを示す図である。 図11は、胆汁酸受容体アゴニストを適用した場合に、SARS-CoV2ウイルスの力価が低下することを示す図である。 図12は、胆汁酸受容体アゴニストを適用した場合に、SARS-CoV2ウイルス感染後の細胞内におけるSARS-CoV2ウイルスの遺伝子の発現が低下することを示す図である。
　本発明者らは、抗生物質を投与した動物や、低繊維食を与えた動物が、ウイルス感染に対する抵抗性を大きく低下させ、致死率が上昇することを見出した。抗生物質の投与や、低繊維食の適用は、腸内細菌のバランスを崩すと考えられており、腸内バランスの崩れが、ウイルス感染に対する抵抗性の低下を引き起こしたと考えられた。
　本発明者らはまた、腸内細菌のバランスの崩れにより、腸内における胆汁酸の代謝に異常が生じたと推測し、胆汁酸（一次胆汁酸または二次胆汁酸）を細胞に適用したところ、細胞におけるウイルスの感染力価が低下すること、胆汁酸を動物に投与したところウイルス感染に対する抵抗性が上昇し致死率が低下することを明らかにした。
　さらには、胆汁酸が細胞内にシグナルを送ることでこれらの作用を発揮していると想定し、胆汁酸受容体アゴニストを細胞に適用したところ、細胞におけるウイルスの感染力価が低下すること、胆汁酸受容体アゴニストを動物に投与したところウイルス感染に対する抵抗性が上昇し致死率が低下することを明らかにした。
　本発明の発明者らは、これらの知見に基づき、胆汁酸受容体アゴニストを摂取させた動物が、ウイルスの感染に対する抵抗性を大きく増進させることを見出し、本発明を完成させるに至った。具体的には、本発明の発明者らは、胆汁酸受容体アゴニストを含む、抗ウイルス活性を有する組成物を提供することにより、上述した課題を解決することができることを示した。
　本発明の組成物は、医薬組成物として提供することもできるが、後述する有効成分のうち食品として使用することができる成分（例えば、生体内で産生される一次胆汁酸や、腸管内で細菌の作用により産生される二次胆汁酸）を有効成分とする場合には、食品組成物として提供することもできる。
＜治療対象＞
　ここで、本発明において対象となるウイルスは、本発明において組成物の抗ウイルス活性が確認されたエンベロープ型ウイルスであることが好ましい。エンベロープ型ウイルスとしては、インフルエンザウイルス、RSウイルス、パラインフルエンザウイルス、コロナウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘－帯状疱疹ウイルス、麻しんウイルス、風しんウイルスコロナウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、風疹ウイルスなどが知られている。本発明の組成物は、これらのいずれのウイルスに対する感染に対しても、抗ウイルス活性を有する組成物として使用することができる。これらのウイルスのうち、本発明において、ウイルスは、インフルエンザウイルス、コロナウイルスであることが好ましい。
　本発明において、抗ウイルス活性という場合、細胞に対するウイルスの付着を阻害すること、細胞内へのウイルスの侵入を阻害すること、ウイルスが感染した細胞内におけるウイルスタンパク質の産生を低下させること、ウイルスが感染した細胞内におけるウイルス複製サイクルのいずれかを阻害すること、ウイルスが感染した細胞から産生されるウイルスの感染力価を低下させること、ウイルスに感染した動物個体がウイルスに対して抵抗性を有すること、ウイルスに感染した動物個体がウイルス感染しても致死しないこと、などを挙げることができる。
＜有効成分＞
　本発明において、有効成分として使用する胆汁酸受容体アゴニストは、細胞表面上に発現される胆汁酸受容体と結合して、細胞に対して活性化シグナルを送る物質のことをいう。当該技術分野において胆汁酸受容体として知られる物質としては、TGR5、PPARα、FXR、PXRが知られており、本発明においては、これらのいずれの胆汁酸受容体から細胞内にシグナルが送られてもよい。
　当該技術分野において、胆汁酸受容体という場合、TGR5、PPARα、ファルネソイドX受容体（FXR）、プレグナンX受容体（PXR）が知られている。肝臓で合成された胆汁酸は、胆管を経て腸管に分泌される。大部分の胆汁酸は小腸下部の回腸で再吸収され、門脈を経て肝臓に戻る。胆汁酸はこの「腸肝循環」によりリサイクルされている。胆汁酸受容体は、この「腸肝循環」に関与する細胞の受容体である。
　ここで、TGR5とは、ヒトの消化管内に存在するL細胞の細胞膜の表面に発現している胆汁酸受容体である。Gタンパク質共役受容体に分類される受容体であり、細胞表面で胆汁酸を検知すると、細胞内のcAMPの濃度を上昇させる。TGR5が活性化すると、付近にいるマクロファージの機能を抑制する方向に作用すると同時に、生体のエネルギー消費を調整され、抗肥満・抗糖尿病効果を示すことが知られている。
　PPARαは、肝臓、腎臓、心臓、骨格筋に分布し、特に肝臓中に多く存在する、胆汁酸の核内受容体である。PPARαは、核内でレチノイドX受容体（RXR）とヘテロ二量体を形成し、リガンドとの結合を引き金として遺伝子の転写を制御する。離脂肪酸などを生理的なリガンド（情報伝達物質）として活性化され、脂肪酸代謝に重要な役割を担っている。
　ファルネソイドX受容体（FXR）は、肝臓、小腸、腎臓、副腎において高レベルで発現している核内受容体であり、核内でレチノイドX受容体（RXR）とヘテロ二量体を形成し、標的遺伝子のFXR応答領域（FXR responsive element、FXRE）に結合し、転写を促進・あるいは抑制する働きを有するものである。胆汁酸生合成中間体も、FXRの生理的リガンドとして強力な作用を示す。これらの組織は、コレステロールが胆汁酸あるいはステロイドホルモンに代謝・分解され、体外に排出される場であり、FXRは胆汁酸／コレステロールホメオスタシス維持に機能していることが明らかになっている。
　プレグナンX受容体（PXR）は、肝臓や腸管などの組織において発現し、CYP3AやP-糖タンパク質など薬物動態を規定する重要なタンパク質の発現誘導に関わる核内受容体である。リガンドがPXRに結合すると、PXRは活性化されると、レチノイドX受容体（RXR）と二量体を形成し、二量体は核内へと移行して転写因子として機能する。PXRが活性化されると、炎症軽減作用が生じることが報告されている。
　本発明における胆汁酸受容体アゴニストは、上述した胆汁酸受容体と結合して、細胞に対して活性化シグナルを送る物質のことをいう。例えば、本発明において使用することができる胆汁酸受容体アゴニストとしては、胆汁酸またはその誘導体、TGR5アゴニスト、PPARαアゴニスト、FXRアゴニスト、またはPXRアゴニストを挙げることができる。
　本発明における胆汁酸受容体アゴニストとして使用することができる胆汁酸は、動物の肝臓で生合成される一次胆汁酸と、一次胆汁酸の一部が腸管で腸内細菌によって代謝を受け、その腸内細菌による代謝物として産生される二次胆汁酸とが存在する。
　一次胆汁酸の例としては、コール酸、ケノデオキシコール酸、ヒオコール酸、ミュリコール酸、5α-シプリノール、が含まれる。ここで、これらの一次胆汁酸がグリシンやタウリンと結び付いて存在する抱合型胆汁酸、すなわち、コール酸のグリシン抱合型であるグリココール酸およびタウリン抱合型であるタウロコール酸、ケノデオキシコール酸のグリシン抱合型であるグリコケノデオキシコール酸およびタウリン抱合型であるタウロケノデオキシコール酸、ヒオコール酸のグリシン抱合型であるグリコヒオコール酸およびタウリン抱合型であるタウロヒオコール酸、ミュリコール酸のグリシン抱合型であるグリコミュリコール酸およびタウリン抱合型であるタウロミュリコール酸も一次胆汁酸に含まれる。本発明においては、これらの一次胆汁酸の誘導体化合物もまた、使用することができる。
　二次胆汁酸の例としては、デオキシコール酸、リトコール酸、ヒオデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、が含まれる。ここで、これらの二次胆汁酸がグリシンやタウリンと結び付いて存在する抱合型胆汁酸、すなわち、デオキシコール酸のグリシン抱合型であるグリコデオキシコール酸およびタウリン抱合型であるタウロデオキシコール酸、リトコール酸のグリシン抱合型であるグリコリトコール酸およびタウリン抱合型であるタウロリトコール酸、ヒオデオキシコール酸のグリシン抱合型であるグリコヒオデオキシコール酸およびタウリン抱合型であるタウロヒオデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸のグリシン抱合型であるグリコウルソデオキシコール酸およびタウリン抱合型であるタウロウルソデオキシコール酸も二次胆汁酸に含まれる。本発明においては、これらの二次胆汁酸の誘導体化合物もまた、使用することができる。
　本発明において使用することができるTGR5アゴニストとしては、以下の化学構造を有するCCDC（HY-14229）、INT-777、Hyodeoxycholic acid、TC-G 1005、INT-767、を挙げることができるが、これらには限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  
　本発明において使用することができるPPARαアゴニストとしては、以下の化学構造を有するフェノフィブラート、ペマフィブラート、を挙げることができるが、これらには限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
　本発明において使用することができるFXRアゴニストとしては、以下の化学構造を有するGW4064、Colforsin (Forskolin, HL 362)、Turofexorate Isopropyl (XL335)、Chenodeoxycholic Acid、T0901317、Sevelamer HCl、Lithocholic acid、Nidufexor (LMB-763)、fexaramine、LY2562175、Obeticholic Acid、Vonafexor (EYP001)、Guggulsterone E&Z、Tropifexor (LJN452)、Cilofexorを挙げることができるが、これらには限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
  
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
　本発明において使用することができるPXRアゴニストとしては、以下の化学構造を有するSR-12813、リファンピシンを挙げることができるが、これらには限定されない。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　本発明の抗ウイルス活性を有する組成物を使用することにより、ウイルス感染を予防し、ウイルス感染を治療し、またはウイルス感染からの回復を早めることができる。すなわち、本発明は、胆汁酸受容体アゴニストを投与することを含む、ウイルス感染を予防する方法、ウイルス感染を治療する方法、またはウイルス感染からの回復を早める方法を提供することができる。ここで使用する胆汁酸受容体アゴニストは、すでに上述した通りである。
　この方法では、エンベロープ型ウイルス、その中でも特にインフルエンザウイルスや、コロナウイルスに対する感染に対して有効に使用することができる。
　本発明において、胆汁酸受容体アゴニストの投与の方法は、ウイルス感染を予防する方法、ウイルス感染を治療する方法、またはウイルス感染からの回復を早める方法のそれぞれにより適宜決定することができ、例えば、ヒトを含む動物に対して胆汁酸受容体アゴニストを日常的に継続的に投与することによりウイルス感染を予防することができ、ヒトを含む動物のウイルスに対する感染が明らかになった場合には、生体試料中からウイルスが検出できなくなるまで投与することによりウイルス感染を治療しまたはウイルス感染からの回復を早めることができる。
　以下、実施例を挙げて本発明を具体的に示す。下記に示す実施例はいかなる方法によっても本発明を限定するものではない。
　実施例1：食餌または抗生物質の投与によるインフルエンザウイルス抵抗性の変化
　本実施例において、低繊維食または抗生物質の投与により、マウスにおいてインフルエンザウイルスに対する抵抗性に変化があるかを確認した。
　実験は、通常の食餌（CMF、オリエンタル酵母工業）とともに水を与える対照群（Control群）に対して、低繊維食を与える群（LF群）および通常の食餌とともに8剤混合抗生物質を与える群（Abx）について、それぞれメスのマウスC57BL/6（野生型）を7～10匹ずつ割り当て、SPF条件下、食餌自由摂食、自由飲水を可能にし、12時間の明／暗サイクルで4週間飼育した。
　抗生物質を与える群（Abx）のマウスには、飲水中にアンピシリン（1 g/L；Nacalai Tesque）、バンコマイシン（500 mg/L；Duchefa Biochemie）、硫酸ネオマイシン（1 g/L；Nacalai Tesque）、メトロニダゾール（1 g/L；Nacalai Tesque）、ゲンタマイシン（10 mg/L；Nacalai Tesque）、ペニシリン（100 U/ml；Nacalai Tesque）、ストレプトマイシン（100 U/ml；Nacalai Tesque）、およびアムホテリシンB（0.25 mg/L；Nacalai Tesque）を含む水を自由飲水可能な条件下で4週間飼育した。
　その後、インフルエンザAウイルス（A/PR8株、国立感染症研究所より供与）を経鼻的に感染させた。ウイルスの感染は、マウスを、ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射による完全麻酔下で、30μLのウイルス懸濁液（PBS中の1,000 pfuのインフルエンザウイルス）を経鼻投与することにより行った（感染させた日をDay 0とする）。
　これらのマウスを、ウイルス感染前と同一の条件下で14日間飼育し、生存および死亡を確認した結果を図1に示す。この結果からも示されるように、通常の食餌を与えた場合には全匹生存していた（生存率100％）のに対して、低繊維食を与えたLF群および抗生物質を投与したAbx群のいずれにおいても、ウイルス感染7日後あるいは8日後から死亡する個体があらわれ、14日経過後には生存率は20％以下まで低下した。
　ウイルス感染後1～7日後のマウスの肺を、右心室を通して10 mlのPBSで灌流してから組織を取得した。これを細切したのち、2.5 mMのHepesおよび1.3 mMのEDTAを含むHBSS中で37℃で30分間インキュベートし、細胞をさらに、5％FBS、1 mM CaCl2、1 mM MgCl2、2.5 mM Hepes、および0.5 mg/mlコラゲナーゼD（Roche）を含むRPMIに再懸濁して37℃で60分間インキュベートし、RBC溶解後に、得られた細胞を70μmセルストレーナー（BD）でろ過し、単一細胞懸濁液を調製した。
　次に、細胞を、好中球特異的なeFluor450標識抗-Ly6G抗体およびAPC標識抗-Ly6C抗体とともにインキュベートした。フローサイトメトリー分析は、FACSVerseフローサイトメーター（BD Biosciences）を使用して行った。解析にはFlowJo software（Tree Star, Inc.）を使用した。
　また、炎症メディエーターによって活性化されたマクロファージや好中球、上皮細胞がから血液中への産生が誘導されるケモカインの一種であるCXCL1を測定した。100μl の血清中のCXCL1は、Mouse CXCL1 ELISA Kit（#KE10019）を用いて測定した。
　各実験群の肺細胞中の好中球の割合を図2（a-1）および（a-2）に示す。これらの図において、LF群およびAbx群においては、Control群と比較して、好中球の割合が高くなり、すなわち、ウイルス感染による炎症反応が亢進していることが示唆された。
　各実験群の血清中のCXCL1量（pg/ml）を図2（b-1）および（b-2）に示す。これらの図において、LF群およびAbx群においては、Control群と比較して、血清中のCXCL1量が高くなり、すなわち、ウイルス感染の結果、体内で炎症反応がControl群より強く発生していることが示唆された。
　実施例2：胆汁酸の適用によるインフルエンザウイルス抵抗性の変化
　本実施例において、胆汁酸の適用により、マウスにおいてインフルエンザウイルスに対する抵抗性に変化があるかを確認した。
　まず、インフルエンザウイルスの力価が、胆汁酸の添加により変化するかどうかを確認した。インフルエンザAウイルス（A/PR8株、国立感染症研究所より供与）MOI＝0.01に、胆汁酸として、DMSO中に溶解したデオキシコール酸（ナカライテスク株式会社）を0 mM、0.3 mM、0.6 mM、1.25 mM、2.5 mMとなるように処理し、洗浄後にMadin-Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞（国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所JCRB細胞バンク）の培養液中に胆汁酸処置をしたインフルエンザウイルスを添加し、24時間経過後のインフルエンザウイルスの力価を測定した。ウイルス力価は、Madin-Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞を使用した標準的なプラークアッセイによって定量化した。
　その結果、0.6 mM、1.25 mM、2.5 mMのデオキシコール酸を添加した場合に、濃度依存的にインフルエンザウイルスの力価が低下することが示された（図3（a-1））。
　次に、0.125mMのデオキシコール酸を培地に添加した場合のインフルエンザウイルス力価の変化を感染後24時間、または48時間経過後に、Madin-Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞を使用した標準的なプラークアッセイによって定量化した。その結果、デオキシコール酸を添加していない群（DMSOのみ添加）では、時間の経過とともにウイルス力価が上昇しているのに対して、デオキシコール酸を添加した群では、時間の経過によってもウイルス力価が上昇しなかった（図3（a-2））。
　次に、マウスにインフルエンザウイルスを感染させた場合に、胆汁酸が生存率に影響を与えるかを調べた。実験は、低繊維食を与える群（LF（水）群）、低繊維食＋2％コレステロールを与える群（LF（w/ 2％コレステロール）群）（コレステロールは胆汁酸の原料となる物質である）、低繊維食＋0.5 mMデオキシコール酸を与える群（LF（w/ 0.5 mM DCA）群）、0.5 mMウルソデオキシコール酸を添加する群（LF（w/ 0.5 mM UDCA)群）について、それぞれメスのマウスC57BL/6（野生型）を16～22匹ずつ割り当て、SPF条件下、食餌自由摂食、自由飲水を可能にし、12時間の明／暗サイクルで4週間飼育した。
　その後、インフルエンザAウイルス（A/PR8株、国立感染症研究所より供与）を経鼻的に感染させた。ウイルスの感染は、マウスを、ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射による完全麻酔下で、30μLのウイルス懸濁液（PBS中の1,000 pfuのインフルエンザウイルス）を経鼻投与することにより行った（感染させた日をDay 0とする）。
　これらのマウスを、ウイルス感染前と同一の条件下で14日間飼育し、生存および死亡を確認した結果を図3（b-1）、（b-2）および（B-3）に示す。この結果からも示されるように、低繊維食を与えたLF（水）群と比較して、胆汁酸の原料であるコレステロールを添加した群では生存率が改善し、胆汁酸であるデオキシコール酸（二次胆汁酸）またはウルソデオキシコール酸（二次胆汁酸）を添加した群では生存率がさらに改善された。
　実施例3：胆汁酸の適用によるインフルエンザウイルスに対する細胞内での変化
　本実施例において、胆汁酸の適用により、インフルエンザウイルスに感染した細胞内でインフルエンザウイルスの増殖に対してどのような変化があるかを確認した。
　インフルエンザAウイルス（A/PR8株、国立感染症研究所より供与）MOI＝0.01を感染させると同時に、胆汁酸として、DMSOに溶解したコール酸（CA）（ナカライテスク株式会社）、デオキシコール酸（DCA）（ナカライテスク株式会社）、タウロコール酸（TCA）（ナカライテスク株式会社）、タウロデオキシコール酸（TDCA）（ナカライテスク株式会社）、またはウルソデオキシコール酸（UDCA）（Chemodex）を0.125 mMとなるように、Madin-Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞の培養液中に添加した。ウイルス感染から9または24時間経過後に、細胞を回収した。
　各時間ごとの細胞抽出液を回収し、ウェスタンブロット法を用いて、チューブリンおよびインフルエンザウイルスタンパク質（NS1、M2）の発現量を解析した。この結果、ウイルス感染9時間後の時点で、デオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、およびウルソデオキシコール酸においてNS1、M2ともに発現量が低下し、デオキシコール酸およびウルソデオキシコール酸において特に、NS1、M2の発現量が低下した。この傾向は、ウイルス感染24時間後の時点でもほぼ同様であった（図4）。すなわち、二次胆汁酸が細胞内でのインフルエンザウィルス翻訳を抑制することが示唆された。
　実施例4：胆汁酸受容体アゴニストの適用によるインフルエンザウイルス抵抗性の変化
　本実施例において、胆汁酸受容体アゴニストの適用により、マウスにおいてインフルエンザウイルスに対する抵抗性に変化があるかを確認した。
　まず、インフルエンザウイルスの力価が、胆汁酸受容体アゴニストの添加により変化するかどうかを確認した。インフルエンザAウイルス（A/PR8株、国立感染症研究所より供与）MOI＝0.01を感染させたあと、胆汁酸受容体アゴニストとして、DMSO中に溶解したFXRアゴニストのGW4064（セレック）、TGR5アゴニストのHY-14229（ナミキ商事）を1μMとなるように、Madin-Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞（国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所JCRB細胞バンク）の培養液中に添加し、24時間経過後のインフルエンザウイルスの力価を測定した。ウイルス力価は、Madin-Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞を使用した標準的なプラークアッセイによって定量化した。
　その結果、TGR5アゴニストのHY-14229を添加した場合に、インフルエンザウイルスの力価が低下することが示された（図5（a））。
　次に、マウスにインフルエンザウイルスを感染させた場合に、胆汁酸受容体アゴニストが生存率に影響を与えるかを調べた。実験は、本実施例においてインフルエンザウイルスの力価を低下させることが示されたTGR5アゴニストのHY-14229についてのみ行った。
　メスのマウスC57BL/6（野生型）を25匹と73匹の2群に分け、SPF条件下、低繊維食を自由摂食、自由飲水を可能にし、12時間の明／暗サイクルで4週間飼育した。73匹の群は飲水にTGR5アゴニストのHY-14229を100μM添加し（100μM TGR5群）、もう一群（25匹）には添加しなかった（水群）。
　その後、インフルエンザAウイルス（A/PR8株、国立感染症研究所より供与）を経鼻的に感染させた。ウイルスの感染は、マウスを、ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射による完全麻酔下で、30μLのウイルス懸濁液（PBS中の1,000 pfuのインフルエンザウイルス）を経鼻投与することにより行った（感染させた日をDay 0とする）。
　これらのマウスを、ウイルス感染前と同一の条件下で14日間飼育し、生存および死亡を確認した結果を図5（b）に示す。この結果からも示されるように、水のみを与えた群（水群）と比較して、TRG5アゴニストを添加した群では生存率が改善された。
　実施例5：胆汁酸受容体アゴニストの適用によるインフルエンザウイルスに対する細胞内での変化
　本実施例において、胆汁酸受容体アゴニストの適用により、インフルエンザウイルスに感染した細胞内でインフルエンザウイルスの増殖に対してどのような変化があるかを確認した。
　胆汁酸受容体アゴニストであるFXRアゴニストのGW4064およびTGR5アゴニストのHY-14229の、インフルエンザに感染した細胞内での作用を調べた。インフルエンザAウイルス（A/PR8株、国立感染症研究）MOI＝0.01で感染させたあと、DMSOに溶解したGW4064またはHY-14229を、0.1μM、1μM、10μMまたは100μMとなるように、Madin-Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞の培養液中に添加し、24時間インキュベートした。なお、10μMまたは100μMのGW4064を添加した場合、細胞が死んだため、実験から除外した。
　ウイルス感染24時間経過後に、細胞ライセートを回収し、ウェスタンブロット法により、チューブリンおよりインフルエンザウイルスタンパク質（NS1、M2）の発現量を解析した。
　この結果、ウイルス感染11時間後の時点で、コール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸のすべてにおいてSARS-Cov-2のヌクレオカプシドの発現量が低下したが、中でもデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸を適用した場合の発現量が大きく低下した（図10）。
　実施例6：抗生物質の適用によるSARS-CoV-2ウイルス抵抗性の変化
　本実施例において、抗生物質の適用により、シリアンハムスターにおいてSARS-CoV-2ウイルスに対する抵抗性に変化があるかを確認した。
　実験は、通常の食餌（CMF、オリエンタル酵母工業）とともに水を与える対照群（Control群）に対して、通常の食餌とともに7剤混合抗生物質（上記実施例1参照）を与える群（Abx）について、それぞれ生後1か月のメスのシリアンハムスター（Japan SLC Inc.）を5～6匹ずつ割り当て、SPF条件下、食餌自由摂食、自由飲水を可能にし、12時間の明／暗サイクルで4週間飼育した。抗生物質を与える群（Abx）には、実施例1と同様に自由飲水中に抗生物質を含有させて、投与した
　その後、SARS-CoV-2/UT-NCGM02/Human/2020/Tokyo（東京大学医科学研究所河岡義裕教授より供与）を、鼻腔内経路から感染させた。ウイルスの感染は、シリアンハムスターを、ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射による完全麻酔下で、2×106 pfuのSARS-CoV-2を鼻腔内に適用することにより行った（感染させた日をDay 0とする）。
　SARS-CoV-2を使用したすべての実験は、研究所のバイオセーフティ操作手順に従って、東京大学の強化バイオセーフティレベル3（BSL-3）封じ込め研究施設で実施した。
　これらのシリアンハムスターを、ウイルス感染前と同一の条件下で14日間飼育し、生存および死亡を確認した結果を図7に示す。この結果からも示されるように、通常の食餌を与えた場合には全匹生存していた（生存率100％）のに対して、抗生物質を投与したAbx群において、ウイルス感染3日後から死亡する個体があらわれ、14日経過後には生存率は20％以下まで低下した。
　実施例7：胆汁酸の適用によるSARS-CoV-2ウイルス抵抗性の変化
　本実施例において、胆汁酸の適用により、シリアンハムスターにおいてSARS-CoV-2ウイルスに対する抵抗性に変化があるかを確認した。
　まず、SARS-CoV-2ウイルスの力価が、胆汁酸の添加により変化するかどうかを確認した。SARS-CoV-2ウイルス（SARS-CoV-2/UT-NCGM02/Human/2020/Tokyo（東京大学医科学研究所河岡義裕教授より供与）～107 pfu/mlのウイルス液に対して、二次胆汁酸としてのデオキシコール酸（DMSO中）を最終濃度が0 mM、0.3 mM、0.6 mM、1.25 mM、2.5 mMとなるように添加した。37℃で60分間インキュベートしたのち、SARS-CoV-2ウイルスの力価をMadin-Darbyイヌ腎臓（MDCK）細胞を使用した標準的なプラークアッセイによって定量化した。
　その結果、1.25 mMのデオキシコール酸を添加した場合からSARS-CoV-2ウイルスの力価が低下し、2.5 mMのデオキシコール酸を添加した場合に大幅にSARS-CoV-2ウイルスの力価が低下することが示された（図8）。
　次に、シリアンハムスターにSARS-CoV-2ウイルスを感染させた場合に、胆汁酸が生存率に影響を与えるかを調べた。生後1か月のメスのシリアンハムスター（Japan SLC Inc.）を5～6匹ずつの2群に分け、1群は飲水に胆汁酸のコール酸（ナカライテスク株式会社）を0.5 mM添加し（CA（0.5 mM）群）、もう一群には添加せず（Control群）、SPF条件下、実施例6の食餌と同じものの食餌自由摂食、自由飲水を可能にし、12時間の明／暗サイクルで4週間飼育した。
　その後、SARS-CoV-2ウイルス強毒変異株（イギリス型）であるQK002変異株（系統B.1.1.7）（国立感染症研究所より供与）を、鼻腔内経路から感染させた。ウイルスの感染は、シリアンハムスターを、ペントバルビタールナトリウムの腹腔内注射による完全麻酔下で、2×106 pfuのSARS-CoV-2を鼻腔内に適用することにより行った（感染させた日をDay 0とする）。
　これらのシリアンハムスターを、ウイルス感染前と同一の条件下で14日間飼育し、生存および死亡を確認した結果を図9に示す。この結果からも示されるように、水のみを与えた群（Control群）と比較して、コール酸を添加した群（CA（0.5 mM）群）では生存率が改善された。
　実施例8：胆汁酸の適用によるSARS-CoV-2ウイルスに対する細胞内での変化
　本実施例において、胆汁酸の適用により、SARS-CoV-2ウイルスに感染した細胞内でSARS-CoV-2ウイルスの増殖に対してどのような変化があるかを確認した。
　胆汁酸として、DMSOに溶解したコール酸（CA）（ナカライテスク株式会社）、デオキシコール酸（DCA）（ナカライテスク株式会社）、タウロコール酸（TCA）（ナカライテスク株式会社）、タウロデオキシコール酸（TDCA）（ナカライテスク株式会社）、またはウルソデオキシコール酸（UDCA）（Chemodex）を0.125 mMとなるように、VeroE6/TMPRSS2細胞の培養液中に添加し、そのタイミングで、この細胞をSARS-CoV-2ウイルスQK002変異株（系統B.1.1.7）（国立感染症研究所より供与）MOI＝0.01に感染させ、11時間経過後および14時間経過後に、細胞を回収した。
　ウイルス感染11時間後、14時間後に、細胞ライセートを回収し、ウェスタンブロット法により、チューブリン、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドの発現量を解析した。
　この結果、ウイルス感染11時間後の時点で、コール酸、デオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸のそれぞれにおいてヌクレオカプシドの発現量が低下したが、デオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸を添加する場合に、ヌクレオカプシドの発現量が大きく低下した（図10）。この傾向は、ウイルス感染14時間後の時点でもほぼ同様であった（図10）。
　実施例9：胆汁酸受容体アゴニストの適用によるSARS-CoV-2ウイルス抵抗性の変化
　本実施例において、胆汁酸受容体アゴニストの適用により、シリアンハムスターにおいてSARS-CoV-2ウイルスに対する抵抗性に変化があるかを確認した。
　SARS-CoV-2ウイルスの力価が、胆汁酸受容体アゴニストの添加により変化するかどうかを確認した。SARS-CoV-2ウイルス（SARS-CoV-2/UT-NCGM02/Human/2020/Tokyo（東京大学医科学研究所河岡義裕教授より供与）を感染させたあと、胆汁酸受容体アゴニストとして、DMSO中に溶解したFXRアゴニストのGW4064（セレック）、TGR5アゴニストのHY-14229（ナミキ商事）、およびネガティブコントロールである抗インフルエンザ薬であるアマンタジン（シグマアルドリッチ）を100μMとなるように、VeroE6/TMPRSS2細胞（国立研究開発法人医薬基盤・健康・栄養研究所JCRB細胞バンク）の培養液中に添加した。48時間経過後のSARS-CoV-2ウイルスの力価を測定した。ウイルス力価は、VeroE6/TMPRSS2細胞を使用した標準的なプラークアッセイによって定量化した。
　その結果、FXRアゴニストのGW4064およびTGR5アゴニストのHY-14229を添加した場合に、SARS-CoV-2ウイルスの力価が低下し、これらのうちFXRアゴニストのGW4064を添加した場合にSARS-CoV-2ウイルスの力価が大きく低下することが示された（図11）。
　実施例10：胆汁酸受容体アゴニストの適用によるSARS-Cov-2ウイルスに対する細胞内での変化
　本実施例において、胆汁酸受容体アゴニストの適用により、SARS-Cov-2ウイルスに感染した細胞内でSARS-Cov-2ウイルスの増殖に対してどのような変化があるかを確認した。
　胆汁酸受容体アゴニストであるFXRアゴニストのGW4064およびTGR5アゴニストのHY-14229の、SARS-CoV-2ウイルスに感染した細胞内での作用を調べた。DMSOに溶解したGW4064またはHY-14229を、10μMまたは100μMとなるように、VeroE6/TMPRSS2細胞の培養液中に添加し、そのタイミングで、この細胞をSARS-CoV-2ウイルス（SARS-CoV-2/UT-NCGM02/Human/2020/Tokyo（東京大学医科学研究所河岡義裕教授より供与）MOI＝0.01に感染させ、24時間経過後に、細胞を回収した。
　ウイルス感染24時間後に、細胞ライセートを回収し、ウェスタンブロット法により、チューブリン、SARS-CoV-2ヌクレオカプシドの発現量を解析した。
　この結果、ウイルス感染24時間後の時点で、100μMのGW4064およびHY-14229の両方において、SARS-Cov-2のヌクレオカプシドの発現量が低下した（図12）。
　本発明の組成物は、動物に接種させることにより、ウイルスに感染した場合でもウイルスの力価を下げることができ、結果的に症状の悪化を防止するために使用することができる。また、有効成分として使用することができる物質には食品成分として知られているものもあり、抗ウイルス活性を有する食品組成物として使用することもできる。

 

Claims (6)

  1. 　胆汁酸受容体アゴニストを含む、抗ウイルス活性を有する組成物。
  2. 　ウイルスが、エンベロープ型ウイルスである、請求項1に記載の組成物。
  3. 　ウイルスが、インフルエンザウイルス、コロナウイルスである、請求項2に記載の組成物。
  4. 　胆汁酸受容体が、TGR5、PPARα、FXR、PXRからなる群から選択される、請求項1～3のいずれか1項に記載の組成物。
  5. 　胆汁酸受容体アゴニストが、胆汁酸またはその誘導体、TGR5アゴニスト、PPARαアゴニスト、FXRアゴニスト、またはPXRアゴニストである、請求項1～3のいずれか1項に記載の組成物。
  6. 　胆汁酸受容体アゴニストが、コール酸、グリココール酸、タウロコール酸、ケノデオキシコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、ヒオコール酸、グリコヒオコール酸、タウロヒオコール酸、ミュリコール酸、グリコミュリコール酸、タウロミュリコール酸5α-シプリノール、デオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、リトコール酸、グリコリトコール酸、タウロリトコール酸、ヒオデオキシコール酸、グリコヒオデオキシコール酸、タウロヒオデオキシコール酸、ウルソデオキシコール酸、グリコウルソデオキシコール酸、タウロウルソデオキシコール酸、CCDC（HY-14229）、INT-777、Hyodeoxycholic acid、TC-G 1005、INT-767、フェノフィブラート、ペマフィブラート、GW4064、Colforsin (Forskolin, HL 362)、Turofexorate Isopropyl (XL335)、Chenodeoxycholic Acid、T0901317、Sevelamer HCl、Lithocholic acid、Nidufexor (LMB-763)、fexaramine、LY2562175、Obeticholic Acid、Vonafexor (EYP001)、Guggulsterone E&Z、Tropifexor (LJN452）、Cilofexor、SR-12813、リファンピシン、からなる群から選択される、請求項5に記載の組成物。
     

     
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