WO2023094753A1 - Method for detecting skatole in an aqueous solution - Google Patents

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WO2023094753A1
WO2023094753A1 PCT/FR2022/052134 FR2022052134W WO2023094753A1 WO 2023094753 A1 WO2023094753 A1 WO 2023094753A1 FR 2022052134 W FR2022052134 W FR 2022052134W WO 2023094753 A1 WO2023094753 A1 WO 2023094753A1
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WO
WIPO (PCT)
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skatole
aqueous solution
fat
organic solvent
aprotic organic
Prior art date
Application number
PCT/FR2022/052134
Other languages
French (fr)
Inventor
Emmanuel Scorsone
Matthieu Hamel
Samuel Stewart
Original Assignee
Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/66—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light electrically excited, e.g. electroluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/02—Food
    • G01N33/12—Meat; fish

Definitions

  • the invention relates to the field of the food industry and, in particular, to the field of the production and distribution of pork.
  • the invention relates to a method for detecting the presence of skatole, or 3-methylindole (3-MIH), in an aqueous solution and, in particular, in plasma or blood serum and, if the latter is present, to determine the content and this, with a very high sensitivity and a very high specificity vis-à-vis the other compounds likely to be also present in this solution.
  • 3-methylindole 3-methylindole
  • skatole together with androsterone, is responsible for an odor that is both strong and unpleasant, called "boar odor", which is given off during the cooking of the meat of whole male pigs
  • the invention can, in the first place , be implemented to identify, before they are taken to slaughter, whole male pigs whose meat carries boar taint.
  • boar taint for example by genetic selection or by modification of breeding conditions (feed, housing conditions, composition of groups of animals in terms of age, sex, etc.).
  • Boar taint results mainly from an accumulation of skatole and androsterone and, to a lesser extent, indole in the fatty tissues of whole, ie uncastrated, male pigs.
  • PCT international application WO-A-2021/009438 hereinafter reference [1] has proposed a method for detecting and assaying the skatole present in a sample of pig adipose tissue with a very high high sensitivity - since this method has a detection limit of the order of 20 nmol/L of sample - and very high specificity with respect to other indole compounds likely to also be present in this adipose tissue.
  • This method consists in preparing an organic extract of the adipose tissue sample and in subjecting this sample to an electrochemiluminescence reaction.
  • the concentration of skatole in the blood is proportional to its concentration in the adipose tissue, it is, however, much lower than the latter.
  • the threshold for rejection of pork by the consumer being set at approximately 0.2 pg of skatole per gram of adipose tissue, this means in analytical terms that:
  • the detection limit in the case of detection of skatole in an organic extract of adipose tissue, the detection limit must be at most 1.5 pmol per liter of organic extract, while
  • the detection limit of skatole must be at most 100 nmol per liter of sample, which cannot be obtained with most of the analytical methods that have been proposed to date to detect skatole whether in adipose tissue samples or blood samples (immunoassays, colorimetry, thermal desorption laser diode coupled to tandem mass spectrometry (LDTD-MS/MS), etc.).
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the inventors have set themselves the goal of providing a method which makes it possible to detect the presence of skatole in a blood sample - and, more generally, in an aqueous medium - with, on the one hand, a very high sensitivity (at least equivalent to that obtained with HPLC) and, on the other hand, high specificity so that this method leads to extremely reliable results.
  • the invention aims precisely to provide such a method.
  • the subject of the invention is therefore a method for detecting the presence of skatole in an aqueous solution, which comprises the steps consisting in: a) preparing an organic extract from the aqueous solution, by: i) mixing the aqueous solution with a fatty substance and then separating the aqueous solution from the fatty substance, whereby, if skatole is present in the aqueous solution, it is extracted by the fatty substance; ii) mixing the fat obtained at the end of i) with an aprotic organic solvent then separating the fat from the aprotic organic solvent, whereby, if skatole is present in the fat, it is extracted by the solvent aprotic organic; and iii) addition of a bottom salt to the aprotic organic solvent obtained at the end of ii); b) subjecting the organic extract prepared in step a) to an electrochemiluminescence (ECL) reaction; and c) measuring the luminescence intensity during step b) and, if
  • an organic extract suitable for being subjected to an ECL reaction is prepared from an aqueous solution by carrying out two successive liquid-liquid extractions, namely: a first extraction which aims to transfer the skatole likely to be present in the aqueous solution to a fat, then a second extraction which aims to transfer the skatole likely to have been extracted by the fat to an aprotic organic solvent.
  • the fat used in sub-step i) can in particular be:
  • a saturated fatty acid such as capric acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid or stearic acid, or unsaturated such as oleic acid, linoleic acid, myristoleic acid , palmitoleic acid, linolenic acid or arachidonic acid, these fatty acids being commercially available, for example from Sigma-Aldrich, at purity levels typically greater than 95%,
  • a fat of animal origin such as butter, pork fat (or lard), beef or mutton fat (or tallow), goose or duck fat, fish oil, or even
  • rapeseed oil such as rapeseed oil, sunflower oil, soybean oil, coconut oil, palm oil, linseed oil, olive oil or corn germ oil.
  • the fat on the one hand, has the lowest possible water content and, on the other hand, is liquid at room temperature (20 ° C-25 ° C) so as to avoid having to heat it to liquefy it before mixing it with the aqueous solution.
  • a vegetable oil rapeseed oil being particularly suitable. If a fat containing water - which is the case, for example, with butter
  • - is used, then it is preferably dehydrated beforehand, for example by heating to a temperature below 100° C. with drawing under vacuum.
  • the aqueous solution is mixed with the fatty substance in an aqueous solution/fatty substance volume ratio of less than 1, this ratio typically being between 0.1 and 0.5 and, better still , between 0.2 and 0.3.
  • the aqueous solution is then separated from the fat by centrifugation.
  • aprotic when it is applied to an organic solvent, is taken in its usual meaning, namely that it designates an organic solvent whose molecule is free of atom of acidic hydrogen, that is, bonded to a heteroatom such as a nitrogen, oxygen or sulfur atom.
  • the aprotic organic solvent used in sub-step ii) is advantageously a polar aprotic solvent, that is to say having a non-zero dipole moment, such as acetonitrile, dimethyl sulfoxide, carbonate of propylene or ⁇ -butyrolactone, preference being given to acetonitrile.
  • the fat obtained at the end of sub-step i) is mixed with the aprotic organic solvent in a fat/organic solvent volume ratio of less than 1, this ratio typically being between 0.1 and 0, 5 and, even better, between 0.2 and 0.3.
  • the fat is then separated from the aprotic organic solvent by centrifugation, optionally after having maintained, for example for 1 hour, the fat/organic solvent mixture at a temperature lower than or equal to 4° C. but higher than the temperature solidification of the organic solvent so as to freeze the fat without the organic solvent solidifying.
  • the bottom salt which is added to the organic solvent obtained at the end of sub-step ii), can be chosen from a large number of salts, it being understood that it must be, on the one hand, soluble in the organic solvent aprotic, and on the other hand, chemically and electrochemically inert so as not to disturb the ECL reaction nor to induce an undesirable reaction with the skatole.
  • this salt may in particular be a tetrafluoroborate, a hexaflurorophosphate or a tetraalkylammonium perchlorate whose alkyl group comprises from 1 to 6 carbon atoms, such as tetrabutylammonium tetrafluoroborate or tetrabutylammonium hexafluorophosphate, this type of salt having, in fact, a remarkable stability in an organic medium.
  • the bottom salt is added to the organic solvent in an amount such that its concentration in the organic extract is typically between 0.01 mol/L and 1 mol/L, preferably between 0.05 mol/L and 0.5 mol/L, and, even better, equal to 0.1 mol/L.
  • the organic extract prepared in step a) it is preferable for the organic extract prepared in step a) to be anhydrous, that is to say that it comprises at most 1% by weight of water.
  • a drying agent such as a hygroscopic salt which is not soluble in the aprotic organic solvent of the sodium or magnesium sulphate type. anhydrous, or a molecular sieve (for example, 3 or 4 angstroms) to eliminate any traces of water likely to have been extracted by the fat in sub-step i) then by the aprotic organic solvent in sub-step -step ii).
  • this drying agent is then removed before proceeding to step b).
  • the ECL reaction is preferably carried out in an electrochemical cell, the terms "electrochemical cell” here designating the assembly formed by a bowl-type container or the like, in which the organic extract is placed.
  • electrochemical cell designating the assembly formed by a bowl-type container or the like, in which the organic extract is placed.
  • electrodes for the ECL reaction, and at least two electrodes, namely a working electrode and a counter electrode.
  • the application to the working electrode of a cathodic potential then of an anodic potential can be carried out according to various electrochemical protocols and, in particular, by:
  • this container is desirable for this container to be made of a material which is resistant to organic solvents, to saline environments and, if a strong base is used, to alkaline environments.
  • this container should be made of a material that is optically transparent in the range of luminescence emission wavelengths or that it should have at least one wall made of a material exhibiting such transparency if the detection of the photons emitted is carried out by an optical detector located opposite one of its walls.
  • the choice of the electrodes of the electrolytic cell is not critical either.
  • the working electrode can be made of any electrode material allowing the formation of such ions such as carbon (graphite, glassy carbon, doped diamond, for example boron or nitrogen, etc.), a noble metal (gold, platinum, palladium, iridium, etc.) or an alloy of noble metals.
  • the counter-electrode can be made of a different electrode material or of the same electrode material as that which constitutes the working electrode.
  • the working electrode and the counter-electrode be made of diamond doped, in particular with boron, because this material is highly conductive, has a very high stability, a natural resilience fouling due to the high atomic density of diamond.
  • This resilience to fouling is particularly interesting given that the organic extract can comprise a certain number of compounds derived from pig adipose tissue, including fatty acids, which can quickly foul the surface of the electrodes.
  • this type of electrode can easily be cleaned electrochemically, for example by the method described in US Pat. No. 9,121,107 B2, reference [3] below.
  • this type of electrode has a large potential window which makes it possible to apply high potentials without electrolysing the solvent present in the organic extract.
  • a reference electrode may in particular be a saturated calomel electrode (SCE) or a silver chloride electrode (Ag/AgCl), possibly with a double junction, as traditionally used in electrochemistry.
  • SCE saturated calomel electrode
  • Ag/AgCl silver chloride electrode
  • the electrochemical cell i.e. container and electrodes
  • the electrochemical cell is made of low-cost materials (plastic container, carbon paste electrodes, etc.) so as to be disposable, which allows, on the one hand, to overcome the problems of fouling of the electrodes and, on the other hand, to ensure traceability of the samples of adipose tissue analyzed, for example by referencing each electrochemical cell with respect to a pig carcass.
  • the optical detector can be a photomultiplier coupled to a photocathode in bialkali, super-bialkali or ultra-bialkali, an avalanche photodiode, a photomultiplier with silicon photocathode, a spectrometer and , in particular, a spectrofluorimeter, a detector with a CCD sensor (from “Charged Coupled Device”), a detector with a CMOS sensor (from “Complementary Metal-Oxide-Semiconductor”), etc.
  • the threshold value used in step c) is preferably at least equal to 150% of the mean value of the intensity of the luminescence corresponding to the background noise of the optical detector.
  • the method of the invention also makes it possible, if skatole is present in the organic extract prepared in step a), to determine its concentration.
  • the method advantageously further comprises a quantification of the skatole present in the organic extract by comparison of the maximum intensity of luminescence measured during step c ) with a calibration curve, this quantification being carried out during step c) or after step c).
  • the aqueous solution is preferably male pig blood plasma or serum and, in particular, male pig blood plasma.
  • plasma is the liquid part of blood which is obtained by centrifugation of this blood in a tube in the presence of an anticoagulant and, therefore, without coagulation
  • serum is the liquid part of blood which is obtained by leaving the blood clot in a tube in the absence of any anticoagulant.
  • serum is stripped of coagulation factors and fibrinogen.
  • the method of the invention makes it possible to detect the presence of skatole in an aqueous solution with great sensitivity since a detection limit of around 37 nmol of skatole per liter of aqueous solution could be obtained.
  • skatole is highly specific since other indole compounds present in the fatty tissues of pigs such as indole and their precursor , tryptophan, are hardly detected with this method.
  • Figure 1 illustrates the chronoamperogram obtained by subjecting, to an ECL reaction by potential jump, a synthetic solution comprising 1 p.mol/L of skatole and 0.1 mol/L of tetrabutylammonium hexafluorophosphate (TBAHFP) in the acetonitrile; in this figure, the ordinate axis corresponds to the intensity, denoted I and expressed in microamperes (piA), of the current measured at the working electrode while the abscissa axis corresponds to time, denoted t and expressed in seconds (s).
  • piA microamperes
  • FIG. 2 illustrates the luminescence signal measured simultaneously with the recording of the chronoamperogram shown in FIG. 1; in this figure, the ordinate axis corresponds to the number of shots emitted, denoted Ne and expressed in arbitrary units (ua), while the abscissa axis corresponds to time, denoted t and expressed in seconds (s).
  • Figure 3 illustrates the maximum intensity of the luminescence signal obtained by subjecting, to an ECL reaction by potential jump, three synthetic solutions comprising respectively 1 pg/L of skatole, 1 pg/L of tryptophan and 1 pg/L of indole, as well as 0.1 mol/L of TBAHFP in acetonitrile;
  • the ordinate axis corresponds to the maximum number of shots emitted, denoted Ne and expressed in arbitrary units (au), while the letters S, T and I on the abscissa axis designate respectively the skatole, the tryptophan and indole.
  • Figure 4 illustrates a calibration curve established by subjecting, to an ECL reaction by potential jump, seven organic extracts having been obtained from one and the same plasma originating from a male pig not contaminated with skatole but to which was added 0 nmol/L to 1 pmol/L of skatole of commercial origin as well as 0.1 mol/L of TBAHFP; in this figure, the ordinate axis corresponds to the maximum number of shots emitted, denoted Ne and expressed in arbitrary units (a.u.), while the abscissa axis corresponds to the concentration of skatole, denoted [C] and expressed in nmol /L, in organic extracts.
  • FIG. 5 illustrates the results of a test aimed at comparing the ECL assay of skatole in organic extracts having been obtained from the plasma of 24 male pigs with the HPLC assay of skatole in the adipose tissue of these same pigs;
  • the ordinate axis corresponds to the skatole concentration found by ECL, denoted [C]ECL and expressed in ng/g
  • the abscissa axis corresponds to the skatole concentration found by HPLC, denoted [ C]HPLC and expressed in ng/g
  • the concentrations symbolized by triangles correspond to concentrations above the rejection threshold set at 0.2 pg of skatole/g of adipose tissue
  • the concentrations symbolized by circles correspond to concentrations below this threshold.
  • the organic extracts are prepared by following, for each extract, the following operating protocol.
  • 1 mL of blood plasma previously obtained by subjecting whole pig blood to standard centrifugation in the presence of an anticoagulant (EDTA), is introduced into a first 15 mL tube, together with 4 mL of rapeseed oil.
  • EDTA anticoagulant
  • the tube After closing, the tube is subjected to stirring (with a vortex) for 10 minutes then to centrifugation for 5 minutes at 4000 rpm, whereby an oily phase and an aqueous phase are obtained.
  • the tube After closing, the tube is subjected to agitation (with a vortex) for 10 minutes. The tube is then placed in a freezer for 1 hour to freeze the oily phase and then it is subjected to centrifugation for 5 minutes at 4000 rpm, whereby an oily phase and an acetonitrile phase are obtained.
  • the tube is inverted several times to ensure total absorption of these traces of water by the sodium sulphate which, unlike TBAHFP, does not dissolve in acetonitrile.
  • Synthetic solutions are prepared by dissolving, with stirring, either skatole or tryptophan or indole in acetonitrile, then adding to the resulting solutions TBAHFP to give them a background salt concentration of 0.1 mol/ I.
  • the ECL reactions are carried out by means of an electrochemical cell with a capacity of 10 mL, of parallelepiped shape, fitted with an optical glass window.
  • Two electrodes in the form of boron-doped diamond sections on a silicon substrate and serving respectively as working electrode and counter-electrode are positioned on the two opposite walls of this cell which have the largest surface but staggered relative to each other so that these electrodes are arranged parallel to each other but without facing each other.
  • the working electrode measures 10 x 10 mm while the counter electrode measures 15 x 15 mm. Electrical contact is ensured via the silicon substrate constituting the rear face of these electrodes by means of a copper strip.
  • the cell is further provided with a platinum wire serving as a pseudo-reference electrode.
  • electrochemical and ECL measurements are performed using an AutolabTM PGSTAT128N potentiostat/galvanostat (Autolab) or PDM03-9107-USB photodetector module (ET-Enterprises ).
  • ECL measurements are performed using a portable PalmSens4TM potentiostat (PalmSens) and a FluoromaxTM 4P spectrofluorimeter (Horiba Jobin Yvon) which allows real-time monitoring of the evolution of luminescence thanks to integrated software.
  • PalmSens4TM potentiostat PanSens
  • FluoromaxTM 4P spectrofluorimeter Horiba Jobin Yvon
  • the electrodes are carefully cleaned by electrochemical activation by immersing them in a solution comprising 0.1 mol/L of TBAHFP in acetonitrile and by applying 0.5 second pulses of 2 mA and -2mA for 200 cycles.
  • the ECL reaction which is favored in the context of the invention comprises the application of a cathodic potential to the working electrode of the electrochemical cell to induce the formation of superoxide ions, followed by the application of an anodic potential to this same electrode to induce the oxidation of the conjugate base of the skatole if the latter is present in the organic extract.
  • this be achieved by a potential jump, that is to say by applying a constant negative potential to the working electrode, for a time sufficient to saturate the surface of this electrode with ions. superoxides, then by applying a constant positive potential to it, also for a time sufficient to saturate the surface of the working electrode with oxidized skatole.
  • the measurement of the luminescence emitted is launched from the start of the application of the negative potential to the working electrode.
  • the chronoamperogram obtained under these conditions for a synthetic solution comprising 1 pmol/L of skatole is illustrated in figure 1 while the luminescence signal measured simultaneously with the recording of the chronoamperogram is illustrated in figure 2.
  • an intense peak of luminescence is observed when jumping from negative potential to positive potential. This peak can be linked to the presence of skatole in the standard solution and its amplitude can itself be linked to the amount of skatole present in said solution.
  • 3 synthetic solutions comprising respectively 1 pg/L of skatole, 1 pg/L of tryptophan and 1 pg/L of indole, are each subjected to an ECL reaction by potential jump.
  • the maximum intensities of the luminescence signals emitted during these reactions are illustrated in FIG. 3 in the form of a bar diagram, the rod denoted S corresponds to skatole, the rod denoted T corresponding to tryptophan and the rod denoted I corresponding to the indole.
  • a very high luminescence signal is obtained for skatole while a very weak luminescence signal is obtained for tryptophan and indole, the maximum intensity of this signal being respectively 200 times and 170 times weaker than that of the luminescence signal obtained for skatole.
  • a calibration test is carried out by subjecting 7 organic extracts - 6 of which comprise skatole to variable concentrations and 1 is free of skatole (“control” extract) - to an ECL reaction by potential jump.
  • This detection limit is 37 nmol of skatole/litre of blood plasma, i.e.
  • the concentrations thus obtained are compared with those previously obtained by assaying by HPLC the concentration of skatole in the adipose tissue of these 24 pigs.
  • the method of the invention is therefore perfectly suited to the detection of boar taint in live male pigs.

Abstract

The invention relates to a method for detecting the presence of skatole in an aqueous solution, comprising the steps of: a) preparing an organic extract from the aqueous solution, by: i) mixing the aqueous solution with a fat and then separating the aqueous solution from the fat; ii) mixing the fat obtained at the end of i) with an aprotic organic solvent and then separating the fat from the aprotic organic solvent; and iii) adding a background salt to the aprotic organic solvent obtained at the end of ii); b) subjecting the organic extract prepared in step a) to an electrochemiluminescence reaction; and c) measuring the luminescence intensity during step b) and, if the measured luminescence intensity exceeds a predetermined threshold value, inferring the presence of skatole in the aqueous solution. Applications: identification prior to slaughter of entire male pigs having meat with boar taint; a research tool, in particular for studying the factors that influence skatole production in the adipose tissue of entire male pigs in order to develop methods for preventing or reducing boar taint.

Description

PROCÉDÉ DE DÉTECTION DU SCATOL DANS UNE SOLUTION AQUEUSE METHOD FOR DETECTING SCATOL IN AN AQUEOUS SOLUTION
Description Description
Domaine technique Technical area
L'invention relève du domaine de l'agroalimentaire et, en particulier, du domaine de la production et de la distribution de la viande de porc. The invention relates to the field of the food industry and, in particular, to the field of the production and distribution of pork.
Plus spécifiquement, l'invention se rapporte à un procédé permettant de détecter la présence de scatol, ou 3-méthylindole (3-MIH), dans une solution aqueuse et, notamment, dans du plasma ou du sérum sanguin et, si celui-ci est présent, d'en déterminer la teneur et ce, avec une très grande sensibilité et une très grande spécificité vis-à-vis des autres composés susceptibles d'être également présents dans cette solution. More specifically, the invention relates to a method for detecting the presence of skatole, or 3-methylindole (3-MIH), in an aqueous solution and, in particular, in plasma or blood serum and, if the latter is present, to determine the content and this, with a very high sensitivity and a very high specificity vis-à-vis the other compounds likely to be also present in this solution.
Le scatol étant, avec l'androstérone, responsable d'une odeur à la fois forte et désagréable, dite « odeur de verrat », qui est dégagée pendant la cuisson de la viande de porcs mâles entiers, l'invention peut, en premier lieu, être mise en oeuvre pour identifier, avant qu'ils ne soient conduits à l'abattage, les porcs mâles entiers dont la viande est porteuse de l'odeur de verrat. Since skatole, together with androsterone, is responsible for an odor that is both strong and unpleasant, called "boar odor", which is given off during the cooking of the meat of whole male pigs, the invention can, in the first place , be implemented to identify, before they are taken to slaughter, whole male pigs whose meat carries boar taint.
Elle peut également être mise en oeuvre comme outil de recherche, notamment pour étudier les facteurs influençant la production de scatol et son accumulation dans les tissus adipeux des porcs mâles entiers en vue de développer des méthodes permettant de réduire le nombre de porcs susceptibles de développer l'odeur de verrat, par exemple par sélection génétique ou par modification des conditions d'élevage (alimentation, conditions de stabulation, composition des groupes d'animaux en termes d'âge, de sexe, etc.). It can also be used as a research tool, in particular to study the factors influencing the production of skatole and its accumulation in the fatty tissues of whole male pigs with a view to developing methods to reduce the number of pigs susceptible to developing scatol. boar taint, for example by genetic selection or by modification of breeding conditions (feed, housing conditions, composition of groups of animals in terms of age, sex, etc.).
État de la technique antérieure State of the prior art
L'odeur de verrat découle principalement d'une accumulation du scatol et de l'androstérone et, dans une moindre mesure, de l'indole dans les tissus adipeux des porcs mâles entiers, c'est-à-dire non castrés. Boar taint results mainly from an accumulation of skatole and androsterone and, to a lesser extent, indole in the fatty tissues of whole, ie uncastrated, male pigs.
Cette odeur, qui se dégage pendant la cuisson de la viande de porc, est généralement considérée comme nauséabonde par les consommateurs. This smell, which is released during the cooking of pork, is generally considered foul by consumers.
Historiquement, pour prévenir l'odeur de verrat, les porcelets mâles étaient castrés avant qu'ils n'atteignent une maturité sexuelle. Toutefois, depuis une quinzaine d'années, des raisons éthiques, de bien-être animal mais également économiques amènent de plus en plus d'éleveurs à ne plus castrer les porcelets mâles et ce, d'autant plus que seuls 5 % à 10 % des adultes développent l'odeur de verrat. Historically, to prevent boar taint, male piglets were castrated before they reached sexual maturity. However, for the past fifteen years, ethical, animal welfare and also economic reasons have led more and more breeders to no longer castrate male piglets, especially since only 5% to 10% adults develop boar taint.
On connaît un certain nombre de procédés permettant d'identifier, sur les chaînes d'abattage, les carcasses de porcs mâles dont la viande est porteuse de l'odeur de verrat. Ces procédés ont tous en commun d'utiliser le tissu adipeux comme source des échantillons soumis à la détection. A certain number of methods are known which make it possible to identify, on the slaughter lines, the carcasses of male pigs whose meat carries boar taint. These methods all have in common that they use adipose tissue as the source of the samples subjected to detection.
En particulier, il a été proposé dans la demande internationale PCT WO-A-2021/ 009438, ci-après référence [1], un procédé permettant de détecter et de doser le scatol présent dans un échantillon de tissu adipeux de porc avec une très grande sensibilité - puisque ce procédé présente une limite de détection de l'ordre de 20 nmol/L d'échantillon - et une très grande spécificité vis-à-vis des autres composés indoliques susceptibles d'être également présents dans ce tissu adipeux. Ce procédé consiste à préparer un extrait organique de l'échantillon de tissu adipeux et à soumettre cet échantillon à une réaction d'électrochimioluminescence. In particular, PCT international application WO-A-2021/009438, hereinafter reference [1], has proposed a method for detecting and assaying the skatole present in a sample of pig adipose tissue with a very high high sensitivity - since this method has a detection limit of the order of 20 nmol/L of sample - and very high specificity with respect to other indole compounds likely to also be present in this adipose tissue. This method consists in preparing an organic extract of the adipose tissue sample and in subjecting this sample to an electrochemiluminescence reaction.
Si la détection du scatol sur les chaînes d'abattage présente un indéniable intérêt puisqu'elle permet d'effectuer un tri entre les carcasses qui peuvent être destinées à la découpe et la vente de viande de porc (parce qu'elles sont exemptes d'odeur de verrat) et celles qui doivent être orientées vers une chaîne de transformation de cette viande (parce qu'elles ont l'odeur de verrat), il serait toutefois souhaitable de pouvoir identifier, avant que les porcs ne soient amenés à l'abattage, ceux dont la viande présente l'odeur de verrat. If the detection of skatole on the slaughter lines has an undeniable interest since it makes it possible to carry out a sorting between the carcasses which can be intended for the cutting and the sale of pork meat (because they are exempt from boar taint) and those which must be sent to a processing line for this meat (because they have boar taint), it would however be desirable to be able to identify, before the pigs are brought to slaughter , those whose meat has the smell of boar.
En effet, compte-tenu de la cadence d'abattage à laquelle sont soumis les abattoirs, il se trouve que le temps qui sépare l'abattage des porcs et l'expédition des carcasses vers les ateliers de découpe et les transformateurs est très court, ce qui laisse très peu de temps pour effectuer les analyses nécessaires à la détection de l'odeur de verrat. Indeed, given the rate of slaughter to which the slaughterhouses are subjected, it turns out that the time between the slaughter of the pigs and the shipment of the carcasses to the cutting plants and the processors is very short, which leaves very little time to carry out the analyzes necessary for the detection of boar taint.
Une solution à ce problème serait donc d'effectuer ces analyses chez les porcs mâles vivants dans les jours qui précèdent leur abattage. Toutefois, comme il est inenvisageable de réaliser de telles analyses sur des échantillons de tissu adipeux pour des raisons de bien-être animal, il conviendrait de pouvoir les réaliser sur des échantillons sanguins dont le prélèvement est aisé et quasi indolore. One solution to this problem would therefore be to carry out these analyzes in live male pigs in the days preceding their slaughter. However, since it is unthinkable to carry out such analyzes on samples of adipose tissue for reasons of animal welfare, it would be appropriate to be able to carry them out on blood samples, the collection of which is easy and almost painless.
L'une des difficultés que pose le développement d'un procédé de détection du scatol dans des échantillons sanguins est la limite de détection très basse que doit présenter ce procédé. One of the difficulties posed by the development of a method for detecting skatole in blood samples is the very low detection limit that this method must have.
En effet, bien que, chez le porc, la concentration du scatol dans le sang soit proportionnelle à sa concentration dans le tissu adipeux, elle est, toutefois, beaucoup plus faible que cette dernière. Indeed, although, in pigs, the concentration of skatole in the blood is proportional to its concentration in the adipose tissue, it is, however, much lower than the latter.
Ainsi, le seuil de rejet d'une viande de porc par le consommateur étant fixé à environ 0,2 pg de scatol par gramme de tissu adipeux, cela signifie en termes analytiques que : Thus, the threshold for rejection of pork by the consumer being set at approximately 0.2 pg of skatole per gram of adipose tissue, this means in analytical terms that:
- dans le cas d'une détection du scatol dans un extrait organique de tissu adipeux, la limite de détection doit être au plus de 1,5 pmol par litre d'extrait organique, tandis que - in the case of detection of skatole in an organic extract of adipose tissue, the detection limit must be at most 1.5 pmol per liter of organic extract, while
- dans le cas d'une détection du scatol dans un échantillon sanguin, la limite de détection du scatol doit être au plus de 100 nmol par litre d'échantillon, ce qui ne peut pas être obtenu avec la plupart des procédés analytiques ayant été proposés à ce jour pour détecter le scatol que ce soit dans des échantillons de tissu adipeux ou des échantillons sanguins (immunoessais, colorimétrie, diode laser à désorption thermique couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LDTD-MS/MS), etc.). - in the case of detection of skatole in a blood sample, the detection limit of skatole must be at most 100 nmol per liter of sample, which cannot be obtained with most of the analytical methods that have been proposed to date to detect skatole whether in adipose tissue samples or blood samples (immunoassays, colorimetry, thermal desorption laser diode coupled to tandem mass spectrometry (LDTD-MS/MS), etc.).
Actuellement, la technique la plus couramment utilisée pour détecter le scatol dans des échantillons sanguins est la chromatographie liquide à haute performance (HPLC). Cette technique consiste à faire circuler l'échantillon sanguin, après traitement et dilution, dans une colonne contenant une phase stationnaire permettant de séparer les unes des autres les espèces présentes dans cet échantillon et à les détecter au moyen d'un détecteur. Pour le scatol, le détecteur est soit un spectromètre de masse, qui a l'avantage d'être très sélectif, soit un détecteur UV (en raison du cycle aromatique que comprend le scatol). Si cette technique possède la sensibilité requise pour la détection du scatol dans un échantillon sanguin, elle présente les inconvénients de nécessiter des temps d'analyse longs, des opérateurs hautement qualifiés, un appareillage et des consommables onéreux et un niveau de maintenance élevé. Elle est d'ailleurs essentiellement utilisée à des fins de recherche. Currently, the most commonly used technique for detecting skatole in blood samples is high performance liquid chromatography (HPLC). This technique consists of circulating the blood sample, after treatment and dilution, in a column containing a stationary phase making it possible to separate the species present in this sample from each other and to detect them by means of a detector. For skatole, the detector is either a mass spectrometer, which has the advantage of being very selective, or a UV detector (due to the aromatic ring that skatole includes). Although this technique has the sensitivity required for the detection of skatole in a blood sample, it has the disadvantages of requiring long analysis times, highly qualified operators, expensive equipment and consumables and a high level of maintenance. It is mainly used for research purposes.
Compte-tenu de ce qui précède, les inventeurs se sont fixé pour but de fournir un procédé qui permette de détecter la présence de scatol dans un échantillon sanguin - et, plus généralement, dans un milieu aqueux - avec, d'une part, une très grande sensibilité (au moins équivalente avec celle obtenue avec l'HPLC) et, d'autre part, une haute spécificité de sorte à ce que ce procédé conduise à des résultats extrêmement fiables. In view of the foregoing, the inventors have set themselves the goal of providing a method which makes it possible to detect the presence of skatole in a blood sample - and, more generally, in an aqueous medium - with, on the one hand, a very high sensitivity (at least equivalent to that obtained with HPLC) and, on the other hand, high specificity so that this method leads to extremely reliable results.
Ils se sont, de plus, fixé pour but que ce procédé soit simple à mettre en œuvre et qu'il permette d'analyser des séries d'échantillons sanguins à une cadence compatible avec les contraintes des acteurs (éleveurs et abatteurs) de la filière porcine. They have, moreover, set themselves the goal that this process be simple to implement and that it allow the analysis of series of blood samples at a rate compatible with the constraints of the actors (breeders and slaughterers) of the sector. pig.
Ils se sont en outre fixé pour but que la mise en œuvre de ce procédé ne nécessite pas un appareillage complexe et coûteux. They have also set themselves the goal that the implementation of this method does not require complex and expensive equipment.
L'invention vise justement à fournir un tel procédé. The invention aims precisely to provide such a method.
Exposé de l'invention Disclosure of Invention
L'invention a donc pour objet un procédé pour détecter la présence de scatol dans une solution aqueuse, qui comprend les étapes consistant à : a) préparer un extrait organique à partir de la solution aqueuse, par : i) mélange de la solution aqueuse avec une matière grasse puis séparation de la solution aqueuse de la matière grasse, moyennant quoi, si du scatol est présent dans la solution aqueuse, il est extrait par la matière grasse ; ii) mélange de la matière grasse obtenue à l'issue de i) avec un solvant organique aprotique puis séparation de la matière grasse du solvant organique aprotique, moyennant quoi, si du scatol est présent dans la matière grasse, il est extrait par le solvant organique aprotique ; et iii) ajout d'un sel de fond au solvant organique aprotique obtenu à l'issue de ii) ; b) soumettre l'extrait organique préparé à l'étape a) à une réaction d'électrochimioluminescence (ECL) ; et c) mesurer l'intensité de la luminescence pendant l'étape b) et, si l'intensité de luminescence mesurée dépasse une valeur seuil prédéterminée, déduire la présence de scatol dans la solution aqueuse. The subject of the invention is therefore a method for detecting the presence of skatole in an aqueous solution, which comprises the steps consisting in: a) preparing an organic extract from the aqueous solution, by: i) mixing the aqueous solution with a fatty substance and then separating the aqueous solution from the fatty substance, whereby, if skatole is present in the aqueous solution, it is extracted by the fatty substance; ii) mixing the fat obtained at the end of i) with an aprotic organic solvent then separating the fat from the aprotic organic solvent, whereby, if skatole is present in the fat, it is extracted by the solvent aprotic organic; and iii) addition of a bottom salt to the aprotic organic solvent obtained at the end of ii); b) subjecting the organic extract prepared in step a) to an electrochemiluminescence (ECL) reaction; and c) measuring the luminescence intensity during step b) and, if the measured luminescence intensity exceeds a predetermined threshold value, deducing the presence of skatole in the aqueous solution.
Ainsi, selon l'invention, on prépare un extrait organique propre à être soumis à une réaction d'ECL à partir d'une solution aqueuse en effectuant deux extractions liquide- liquide successives, à savoir : une première extraction qui vise à transférer le scatol susceptible d'être présent dans la solution aqueuse vers une matière grasse, puis une deuxième extraction qui vise à transférer le scatol susceptible d'avoir été extrait par la matière grasse vers un solvant organique aprotique. Thus, according to the invention, an organic extract suitable for being subjected to an ECL reaction is prepared from an aqueous solution by carrying out two successive liquid-liquid extractions, namely: a first extraction which aims to transfer the skatole likely to be present in the aqueous solution to a fat, then a second extraction which aims to transfer the skatole likely to have been extracted by the fat to an aprotic organic solvent.
Conformément à l'invention, la matière grasse utilisée à la sous-étape i) peut notamment être : In accordance with the invention, the fat used in sub-step i) can in particular be:
- un acide gras saturé tel que l'acide caprique, l'acide laurique, l'acide myristique, l'acide palmitique ou l'acide stéarique, ou insaturé tel que l'acide oléique, l'acide linoléique, l'acide myristoléique, l'acide palmitoléique, l'acide linolénique ou l'acide arachidonique, ces acides gras étant disponibles commercialement, par exemple auprès de la société Sigma-Aldrich, à des taux de pureté typiquement supérieurs à 95 %, - a saturated fatty acid such as capric acid, lauric acid, myristic acid, palmitic acid or stearic acid, or unsaturated such as oleic acid, linoleic acid, myristoleic acid , palmitoleic acid, linolenic acid or arachidonic acid, these fatty acids being commercially available, for example from Sigma-Aldrich, at purity levels typically greater than 95%,
- une matière grasse d'origine animale telle que le beurre, la graisse de porc (ou saindoux), la graisse de bœuf ou de mouton (ou suif), la graisse d'oie ou de canard, une huile de poisson, ou encore - a fat of animal origin such as butter, pork fat (or lard), beef or mutton fat (or tallow), goose or duck fat, fish oil, or even
- une huile végétale telle que l'huile de colza, l'huile de tournesol, l'huile de soja, l'huile de coprah, l'huile de palme, l'huile de lin, l'huile d'olive ou l'huile de germe de maïs. - a vegetable oil such as rapeseed oil, sunflower oil, soybean oil, coconut oil, palm oil, linseed oil, olive oil or corn germ oil.
Pour des simplicités de mise en œuvre du procédé, on préfère que la matière grasse, d'une part, ait une teneur en eau la plus faible possible et, d'autre part, soit liquide à température ambiante (20°C-25°C) de sorte à éviter d'avoir à la chauffer pour la liquéfier avant de la mélanger à la solution aqueuse. For ease of implementation of the process, it is preferred that the fat, on the one hand, has the lowest possible water content and, on the other hand, is liquid at room temperature (20 ° C-25 ° C) so as to avoid having to heat it to liquefy it before mixing it with the aqueous solution.
Aussi préfère-t-on utiliser une huile végétale, l'huile de colza convenant particulièrement bien. Si une matière grasse contenant de l'eau - ce qui est le cas, par exemple, du beurreIt is therefore preferred to use a vegetable oil, rapeseed oil being particularly suitable. If a fat containing water - which is the case, for example, with butter
- est utilisée, alors, elle est, de préférence, préalablement déshydratée, par exemple par chauffage à une température inférieure à 100 °C avec un tirage sous vide. - is used, then it is preferably dehydrated beforehand, for example by heating to a temperature below 100° C. with drawing under vacuum.
De préférence, à la sous-étape ii), la solution aqueuse est mélangée avec la matière grasse dans un rapport volumique solution aqueuse/matière grasse inférieur à 1, ce rapport étant typiquement compris entre 0,1 et 0,5 et, mieux encore, entre 0,2 et 0,3. Preferably, in sub-step ii), the aqueous solution is mixed with the fatty substance in an aqueous solution/fatty substance volume ratio of less than 1, this ratio typically being between 0.1 and 0.5 and, better still , between 0.2 and 0.3.
De préférence également, la solution aqueuse est ensuite séparée de la matière grasse par centrifugation. Also preferably, the aqueous solution is then separated from the fat by centrifugation.
Dans ce qui précède et ce qui suit, le terme « aprotique », lorsqu'il est appliqué à un solvant organique, est pris dans son acception habituelle, à savoir qu'il désigne un solvant organique dont la molécule est exempte d'atome d'hydrogène acide, c'est-à-dire lié à un hétéroatome comme un atome d'azote, d'oxygène ou de soufre. In what precedes and what follows, the term “aprotic”, when it is applied to an organic solvent, is taken in its usual meaning, namely that it designates an organic solvent whose molecule is free of atom of acidic hydrogen, that is, bonded to a heteroatom such as a nitrogen, oxygen or sulfur atom.
Conformément à l'invention, le solvant organique aprotique utilisé à la sous-étape ii) est avantageusement un solvant aprotique polaire, c'est-à-dire présentant un moment dipolaire non nul, comme l'acétonitrile, le diméthylsulfoxyde, le carbonate de propylène ou la y-butyrolactone, préférence étant donnée à l'acétonitrile. In accordance with the invention, the aprotic organic solvent used in sub-step ii) is advantageously a polar aprotic solvent, that is to say having a non-zero dipole moment, such as acetonitrile, dimethyl sulfoxide, carbonate of propylene or γ-butyrolactone, preference being given to acetonitrile.
De préférence, la matière grasse obtenue à l'issue de la sous-étape i) est mélangée avec le solvant organique aprotique dans un rapport volumique matière grasse/solvant organique inférieur à 1, ce rapport étant typiquement compris entre 0,1 et 0,5 et, mieux encore, entre 0,2 et 0,3. Preferably, the fat obtained at the end of sub-step i) is mixed with the aprotic organic solvent in a fat/organic solvent volume ratio of less than 1, this ratio typically being between 0.1 and 0, 5 and, even better, between 0.2 and 0.3.
De préférence également, la matière grasse est ensuite séparée du solvant organique aprotique par centrifugation, éventuellement après avoir maintenu, par exemple pendant 1 heure, le mélange matière grasse/solvant organique à une température inférieure ou égale à 4°C mais supérieure à la température de solidification du solvant organique de sorte à figer la matière grasse sans que le solvant organique ne solidifie. Also preferably, the fat is then separated from the aprotic organic solvent by centrifugation, optionally after having maintained, for example for 1 hour, the fat/organic solvent mixture at a temperature lower than or equal to 4° C. but higher than the temperature solidification of the organic solvent so as to freeze the fat without the organic solvent solidifying.
Le sel de fond, qui est ajouté au solvant organique obtenu à l'issue de la sous- étape ii), peut être choisi parmi de très nombreux sels étant entendu qu'il doit être, d'une part, soluble dans le solvant organique aprotique, et d'autre part, chimiquement et électrochimiquement inerte de sorte à ne pas perturber la réaction d'ECL ni induire une réaction indésirable avec le scatol. Comme bien connu des électrochimistes, ce sel peut notamment être un tétrafluoroborate, un hexaflurorophosphate ou un perchlorate de tétraalkylammonium dont le groupe alkyle comprend de 1 à 6 atomes de carbone, tel que le tétrafluoroborate de tétrabutylammonium ou l'hexafluorophosphate de tétrabutylammonium, ce type de sel présentant, en effet, une stabilité remarquable en milieu organique. The bottom salt, which is added to the organic solvent obtained at the end of sub-step ii), can be chosen from a large number of salts, it being understood that it must be, on the one hand, soluble in the organic solvent aprotic, and on the other hand, chemically and electrochemically inert so as not to disturb the ECL reaction nor to induce an undesirable reaction with the skatole. As well known to electrochemists, this salt may in particular be a tetrafluoroborate, a hexaflurorophosphate or a tetraalkylammonium perchlorate whose alkyl group comprises from 1 to 6 carbon atoms, such as tetrabutylammonium tetrafluoroborate or tetrabutylammonium hexafluorophosphate, this type of salt having, in fact, a remarkable stability in an organic medium.
Par ailleurs, le sel de fond est ajouté au solvant organique en une quantité telle que sa concentration dans l'extrait organique soit typiquement comprise entre 0,01 mol/L et 1 mol/L, de préférence entre 0,05 mol/L et 0,5 mol/L, et, mieux encore, égale à 0,1 mol/L. Furthermore, the bottom salt is added to the organic solvent in an amount such that its concentration in the organic extract is typically between 0.01 mol/L and 1 mol/L, preferably between 0.05 mol/L and 0.5 mol/L, and, even better, equal to 0.1 mol/L.
Conformément à l'invention, il est préférable que l'extrait organique préparé à l'étape a) soit anhydre, c'est-à-dire qu'il comprenne au plus 1 % massique d'eau. In accordance with the invention, it is preferable for the organic extract prepared in step a) to be anhydrous, that is to say that it comprises at most 1% by weight of water.
Aussi est-il possible d'ajouter de plus au solvant organique obtenu à l'issue de la sous-étape ii) un agent de séchage tel qu'un sel hygroscopique non soluble dans le solvant organique aprotique du type sulfate de sodium ou de magnésium anhydre, ou un tamis moléculaire (par exemple, de 3 ou 4 angstroms) pour éliminer les éventuelles traces d'eau susceptibles d'avoir été extraites par la matière grasse à la sous-étape i) puis par le solvant organique aprotique à la sous-étape ii). Also, it is possible to further add to the organic solvent obtained at the end of sub-step ii) a drying agent such as a hygroscopic salt which is not soluble in the aprotic organic solvent of the sodium or magnesium sulphate type. anhydrous, or a molecular sieve (for example, 3 or 4 angstroms) to eliminate any traces of water likely to have been extracted by the fat in sub-step i) then by the aprotic organic solvent in sub-step -step ii).
Si tel est le cas, cet agent de séchage est ensuite éliminé avant de procéder à l'étape b). If this is the case, this drying agent is then removed before proceeding to step b).
Comme connu en soi, la réaction d'ECL est, de préférence, réalisée dans une cellule électrochimique, les termes « cellule électrochimique » désignant ici l'ensemble formé par un contenant de type cuvette ou analogue, dans lequel est placé l'extrait organique pour la réaction d'ECL, et au moins deux électrodes, à savoir une électrode de travail et une contre-électrode. As known per se, the ECL reaction is preferably carried out in an electrochemical cell, the terms "electrochemical cell" here designating the assembly formed by a bowl-type container or the like, in which the organic extract is placed. for the ECL reaction, and at least two electrodes, namely a working electrode and a counter electrode.
Conformément à l'invention, on préfère : In accordance with the invention, it is preferred:
- que la réaction d'ECL soit initiée par l'application d'un potentiel cathodique à une électrode de travail, qui est plongée dans l'extrait organique, de sorte à induire la formation d'ions superoxydes par réduction du dioxygène dissous dans cet extrait, puis la formation de la base conjuguée du scatol et de radicaux hydro peroxydes, et - que l'application d'un potentiel cathodique soit suivie de l'application d'un potentiel anodique de sorte à oxyder la base conjuguée du scatol qui, une fois oxydée, va réagir avec les radicaux hydroperoxydes pour conduire à la formation de /V-(2-acétyl- phényl)formamide à l'état excité, lequel, par désexcitation (ou, autrement dit, par retour à son état fondamental), émet une luminescence mesurable. - that the ECL reaction is initiated by the application of a cathodic potential to a working electrode, which is immersed in the organic extract, so as to induce the formation of superoxide ions by reduction of the dioxygen dissolved in this extract, then the formation of the conjugate base of skatole and hydro peroxide radicals, and - that the application of a cathodic potential is followed by the application of an anodic potential so as to oxidize the conjugate base of the skatole which, once oxidized, will react with the hydroperoxide radicals to lead to the formation of /V -(2-acetyl-phenyl)formamide in the excited state, which, on de-excitation (or, in other words, on returning to its ground state), emits a measurable luminescence.
Pour des détails sur ce processus, le lecteur est invité à se référer à la référence [1] ainsi qu'à l'article publié par T. Okajima et T. Ohsaka dans Journal of Electroanalytical Chemistry 2002, 523, 34-39, ci-après référence [2]. For details on this process, the reader is invited to refer to reference [1] as well as to the article published by T. Okajima and T. Ohsaka in Journal of Electroanalytical Chemistry 2002, 523, 34-39, ci - after reference [2].
L'application à l'électrode de travail d'un potentiel cathodique puis d'un potentiel anodique peut être réalisée selon différents protocoles électrochimiques et, notamment, par : The application to the working electrode of a cathodic potential then of an anodic potential can be carried out according to various electrochemical protocols and, in particular, by:
- un balayage en potentiel, auquel cas on applique à l'électrode de travail un balayage vers les potentiels négatifs puis un balayage vers les potentiels positifs ; - a potential scan, in which case a scan is applied to the working electrode towards the negative potentials then a scan towards the positive potentials;
- un saut de potentiel, auquel cas on applique à l'électrode de travail un potentiel négatif constant, pendant une durée suffisante pour saturer la surface de cette électrode en ions superoxydes, puis un potentiel positif constant, également pendant une durée suffisante pour saturer la surface de l'électrode de travail en scatol oxydé ; ou- a potential jump, in which case a constant negative potential is applied to the working electrode, for a sufficient time to saturate the surface of this electrode with superoxide ions, then a constant positive potential, also for a sufficient time to saturate the working electrode surface in oxidized skatole; Or
- par une série d'impulsions de potentiel alternativement cathodique et anodique. - by a series of alternately cathodic and anodic potential pulses.
Toutefois, dans le cadre de l'invention, on préfère que l'application à l'électrode de travail d'un potentiel cathodique puis d'un potentiel anodique soit réalisée par saut de potentiel car il s'agit du protocole électrochimique qui permet de réaliser la réaction d'ECL le plus rapidement. However, in the context of the invention, it is preferred that the application to the working electrode of a cathodic potential then of an anodic potential be carried out by potential jump because this is the electrochemical protocol which makes it possible to perform the ECL reaction as quickly as possible.
À titre d'exemple, pour une cellule électrochimique munie d'une électrode de travail et d'une contre-électrode en diamant dopé au bore ainsi que d'une électrode de pseudo-référence en platine, d'excellents résultats ont été obtenus en appliquant à l'électrode de travail un potentiel négatif constant inférieur à -1,5 V (versus Pt), par exemple de -1,8 V (versus Pt), pendant de 10 secondes à 60 secondes, puis un potentiel positif constant supérieur à 0,5 V (versus Pt), par exemple de +0,8 V (versus Pt), pendant de 1 à 15 secondes. Le choix du contenant de la cellule électrochimique n'est pas critique en soi.By way of example, for an electrochemical cell equipped with a working electrode and a boron-doped diamond counter-electrode as well as a platinum pseudo-reference electrode, excellent results have been obtained in applying to the working electrode a constant negative potential lower than -1.5 V (versus Pt), for example -1.8 V (versus Pt), for from 10 seconds to 60 seconds, then a higher constant positive potential at 0.5 V (versus Pt), for example +0.8 V (versus Pt), for 1 to 15 seconds. The choice of the container for the electrochemical cell is not critical in itself.
Toutefois, il est souhaitable que ce contenant soit en un matériau résistant aux solvants organiques, aux milieux salins et, si une base forte est utilisée, aux milieux alcalins. However, it is desirable for this container to be made of a material which is resistant to organic solvents, to saline environments and, if a strong base is used, to alkaline environments.
Par ailleurs, il convient que ce contenant soit en un matériau optiquement transparent dans la gamme des longueurs d'onde d'émission de la luminescence ou qu'il présente au moins une paroi en un matériau présentant une telle transparence si la détection des photons émis est réalisée par un détecteur optique situé en vis-à-vis de l'une de ses parois. Furthermore, this container should be made of a material that is optically transparent in the range of luminescence emission wavelengths or that it should have at least one wall made of a material exhibiting such transparency if the detection of the photons emitted is carried out by an optical detector located opposite one of its walls.
Le choix des électrodes de la cellule électrolytique n'est pas critique non plus.The choice of the electrodes of the electrolytic cell is not critical either.
Si la réaction d'ECL est basée sur la formation d'ions superoxydes, alors l'électrode de travail peut être constituée de tout matériau d'électrode permettant la formation de tels ions comme du carbone (graphite, carbone vitreux, diamant dopé, parexemple au bore ou à l'azote, etc.), un métal noble (or, platine, palladium, iridium, etc.) ou un alliage de métaux nobles. If the ECL reaction is based on the formation of superoxide ions, then the working electrode can be made of any electrode material allowing the formation of such ions such as carbon (graphite, glassy carbon, doped diamond, for example boron or nitrogen, etc.), a noble metal (gold, platinum, palladium, iridium, etc.) or an alloy of noble metals.
La contre-électrode peut être constituée d'un matériau d'électrode différent ou du même matériau d'électrode que celui qui constitue l'électrode de travail. The counter-electrode can be made of a different electrode material or of the same electrode material as that which constitutes the working electrode.
Dans le cadre de l'invention, on préfère que l'électrode de travail et la contre- électrode soient en diamant dopé, notamment au bore, en raison de ce que ce matériau est hautement conducteur, présente une très grande stabilité, une résilience naturelle à l'encrassement due à la forte densité atomique du diamant. Cette résilience à l'encrassement est particulièrement intéressante compte-tenu que l'extrait organique peut comprendre un certain nombre de composés issus du tissu adipeux de porc, dont des acides gras, qui peuvent encrasser rapidement la surface des électrodes. De plus, en cas d'encrassement, ce type d'électrode peut être aisément décrassé par voie électrochimique, par exemple par le procédé décrit dans le brevet US 9,121,107 B2, ci-après référence [3]. Enfin, ce type d'électrode présente une grande fenêtre de potentiel qui permet d'appliquer des potentiels élevés sans venir électrolyser le solvant présent dans l'extrait organique. In the context of the invention, it is preferred that the working electrode and the counter-electrode be made of diamond doped, in particular with boron, because this material is highly conductive, has a very high stability, a natural resilience fouling due to the high atomic density of diamond. This resilience to fouling is particularly interesting given that the organic extract can comprise a certain number of compounds derived from pig adipose tissue, including fatty acids, which can quickly foul the surface of the electrodes. Moreover, in the event of fouling, this type of electrode can easily be cleaned electrochemically, for example by the method described in US Pat. No. 9,121,107 B2, reference [3] below. Finally, this type of electrode has a large potential window which makes it possible to apply high potentials without electrolysing the solvent present in the organic extract.
Si une électrode de référence est utilisée, alors celle-ci peut notamment être une électrode au calomel saturé (ECS) ou une électrode au chlorure d'argent (Ag/AgCI), éventuellement à double jonction, telles que traditionnellement utilisées en électrochimie. Toutefois, dans le cadre de l'invention, on préfère utiliser une électrode de pseudoréférence en un métal noble tel que le platine parce que ce type d'électrode peut également être aisément décrassé, par exemple par passage à la flamme. If a reference electrode is used, then this may in particular be a saturated calomel electrode (SCE) or a silver chloride electrode (Ag/AgCl), possibly with a double junction, as traditionally used in electrochemistry. However, in the context of the invention, it is preferred to use a pseudo-reference electrode made of a noble metal such as platinum because this type of electrode can also be easily cleaned, for example by passing it over a flame.
Avantageusement, la cellule électrochimique (i.e. contenant et électrodes) est réalisée dans des matériaux à bas coûts (contenant en plastique, électrodes à pâte de carbone, etc.) de sorte à être à usage unique, ce qui permet, d'une part, de s'affranchir des problèmes d'encrassement des électrodes et, d'autre part, d'assurer une traçabilité des échantillons de tissus adipeux analysés, par exemple en référençant chaque cellule électrochimique par rapport à une carcasse de porc. Advantageously, the electrochemical cell (i.e. container and electrodes) is made of low-cost materials (plastic container, carbon paste electrodes, etc.) so as to be disposable, which allows, on the one hand, to overcome the problems of fouling of the electrodes and, on the other hand, to ensure traceability of the samples of adipose tissue analyzed, for example by referencing each electrochemical cell with respect to a pig carcass.
Quant au détecteur optique, il peut s'agir d'un photomultiplicateur couplé à une photocathode en bialkali, super-bialkali ou ultra-bialkali, d'une photodiode à avalanche, d'un photomultiplicateur à photocathode en silicium, d'un spectromètre et, notamment, un spectrofluorimètre, d'un détecteur à capteur CCD (de « Charged Coupled Device »), d'un détecteur à capteur CMOS (de « Complementary Metal-Oxide-Semiconductor »), etc. As for the optical detector, it can be a photomultiplier coupled to a photocathode in bialkali, super-bialkali or ultra-bialkali, an avalanche photodiode, a photomultiplier with silicon photocathode, a spectrometer and , in particular, a spectrofluorimeter, a detector with a CCD sensor (from “Charged Coupled Device”), a detector with a CMOS sensor (from “Complementary Metal-Oxide-Semiconductor”), etc.
Conformément à l'invention, la valeur seuil utilisée à l'étape c) est, de préférence, au moins égale à 150 % de la valeur moyenne de l'intensité de la luminescence correspondant au bruit de fond du détecteur optique. In accordance with the invention, the threshold value used in step c) is preferably at least equal to 150% of the mean value of the intensity of the luminescence corresponding to the background noise of the optical detector.
Comme précédemment indiqué, le procédé de l'invention permet aussi, si du scatol est présent dans l'extrait organique préparé à l'étape a), d'en déterminer la concentration. As previously indicated, the method of the invention also makes it possible, if skatole is present in the organic extract prepared in step a), to determine its concentration.
Ainsi, si la présence de scatol a été déduite à l'étape c), le procédé comprend avantageusement de plus une quantification du scatol présent dans l'extrait organique par comparaison de l'intensité maximale de luminescence mesurée au cours de l'étape c) avec une courbe d'étalonnage, cette quantification étant réalisée au cours de l'étape c) ou postérieurement à l'étape c). Thus, if the presence of skatole was deduced in step c), the method advantageously further comprises a quantification of the skatole present in the organic extract by comparison of the maximum intensity of luminescence measured during step c ) with a calibration curve, this quantification being carried out during step c) or after step c).
Conformément à l'invention, la solution aqueuse est, de préférence, du plasma ou du sérum de sang de porc mâle et, en particulier, du plasma de sang de porc mâle. According to the invention, the aqueous solution is preferably male pig blood plasma or serum and, in particular, male pig blood plasma.
À cet égard, on rappelle que le plasma est la partie liquide du sang qui est obtenue par centrifugation de ce sang dans un tube en présence d'un anticoagulant et, donc, sans coagulation, tandis que le sérum est la partie liquide du sang qui est obtenue en laissant le sang coaguler dans un tube en l'absence de tout anticoagulant. Ainsi, contrairement au plasma, le sérum est débarrassé des facteurs de coagulation et du fibrinogène. In this respect, it should be recalled that plasma is the liquid part of blood which is obtained by centrifugation of this blood in a tube in the presence of an anticoagulant and, therefore, without coagulation, while serum is the liquid part of blood which is obtained by leaving the blood clot in a tube in the absence of any anticoagulant. Thus, unlike plasma, serum is stripped of coagulation factors and fibrinogen.
Comme mis en évidence par les expérimentations rapportées ci-après, le procédé de l'invention permet de détecter la présence de scatol dans une solution aqueuse avec une grande sensibilité puisqu'une limite de détection autour de 37 nmol de scatol par litre de solution aqueuse a pu être obtenue. As demonstrated by the experiments reported below, the method of the invention makes it possible to detect the presence of skatole in an aqueous solution with great sensitivity since a detection limit of around 37 nmol of skatole per liter of aqueous solution could be obtained.
Par ailleurs, comme également mis en évidence par les expérimentations rapportées ci-après, la détection du scatol par le procédé de l'invention est hautement spécifique puisque d'autres composés indoliques présents dans les tissus adipeux de porcs comme l'indole et leur précurseur, le tryptophane, ne sont quasiment pas détectés avec ce procédé. Moreover, as also demonstrated by the experiments reported below, the detection of skatole by the method of the invention is highly specific since other indole compounds present in the fatty tissues of pigs such as indole and their precursor , tryptophan, are hardly detected with this method.
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention ressortiront du complément de description qui suit, qui se rapporte à des expérimentations ayant permis de valider le procédé de l'invention et qui est donné en référence aux figures annexées. Other characteristics and advantages of the invention will become apparent from the additional description which follows, which relates to experiments which made it possible to validate the method of the invention and which is given with reference to the appended figures.
Il va de soi toutefois que ce complément de description n'est donné qu'à titre d'illustration de l'objet de l'invention et ne doit en aucun cas être interprété comme une limitation de cet objet. It goes without saying, however, that this additional description is only given by way of illustration of the subject of the invention and should in no way be interpreted as a limitation of this subject.
Brève description des figures Brief description of figures
La figure 1 illustre le chronoampérogramme obtenu en soumettant, à une réaction d'ECL par saut de potentiel, une solution synthétique comprenant 1 p.mol/L de scatol et 0,1 mol/L d'hexafluorophosphate de tétrabutylammonium (TBAHFP) dans l'acétonitrile ; sur cette figure, l'axe des ordonnées correspond à l'intensité, notée I et exprimée en microampères (piA), du courant mesuré à l'électrode de travail tandis que l'axe des abscisses correspond au temps, noté t et exprimé en secondes (s). Figure 1 illustrates the chronoamperogram obtained by subjecting, to an ECL reaction by potential jump, a synthetic solution comprising 1 p.mol/L of skatole and 0.1 mol/L of tetrabutylammonium hexafluorophosphate (TBAHFP) in the acetonitrile; in this figure, the ordinate axis corresponds to the intensity, denoted I and expressed in microamperes (piA), of the current measured at the working electrode while the abscissa axis corresponds to time, denoted t and expressed in seconds (s).
La figure 2 illustre le signal de luminescence mesuré simultanément à l'enregistrement du chronoampérogramme montré sur la figure 1 ; sur cette figure, l'axe des ordonnées correspond au nombre de coups émis, noté Ne et exprimé en unités arbitraires (u.a.), tandis que l'axe des abscisses correspond au temps, noté t et exprimé en secondes (s). La figure 3 illustre l'intensité maximale du signal de luminescence obtenu en soumettant, à une réaction d'ECL par saut de potentiel, trois solutions synthétiques comprenant respectivement 1 pg/L de scatol, 1 pg/L de tryptophane et 1 pg/L d'indole, ainsi que 0,1 mol/L de TBAHFP dans l'acétonitrile ; sur cette figure, l'axe des ordonnées correspond au nombre maximal de coups émis, noté Ne et exprimé en unités arbitraires (u.a.), tandis que les lettres S, T et I portées sur l'axe des abscisses désignent respectivement le scatol, le tryptophane et l'indole. FIG. 2 illustrates the luminescence signal measured simultaneously with the recording of the chronoamperogram shown in FIG. 1; in this figure, the ordinate axis corresponds to the number of shots emitted, denoted Ne and expressed in arbitrary units (ua), while the abscissa axis corresponds to time, denoted t and expressed in seconds (s). Figure 3 illustrates the maximum intensity of the luminescence signal obtained by subjecting, to an ECL reaction by potential jump, three synthetic solutions comprising respectively 1 pg/L of skatole, 1 pg/L of tryptophan and 1 pg/L of indole, as well as 0.1 mol/L of TBAHFP in acetonitrile; in this figure, the ordinate axis corresponds to the maximum number of shots emitted, denoted Ne and expressed in arbitrary units (au), while the letters S, T and I on the abscissa axis designate respectively the skatole, the tryptophan and indole.
La figure 4 illustre une courbe d'étalonnage établie en soumettant, à une réaction d'ECL par saut de potentiel, sept extraits organiques ayant été obtenus à partir d'un seul et même plasma provenant d'un porc mâle non contaminé par du scatol mais auxquels a été ajouté de 0 nmol/L à 1 pmol/L de scatol d'origine commerciale ainsi que 0,1 mol/L de TBAHFP ; sur cette figure, l'axe des ordonnées correspond au nombre maximal de coups émis, noté Ne et exprimé en unités arbitraires (u.a.), tandis que l'axe des abscisses correspond à la concentration du scatol, notée [C] et exprimée en nmol/L, dans les extraits organiques. Figure 4 illustrates a calibration curve established by subjecting, to an ECL reaction by potential jump, seven organic extracts having been obtained from one and the same plasma originating from a male pig not contaminated with skatole but to which was added 0 nmol/L to 1 pmol/L of skatole of commercial origin as well as 0.1 mol/L of TBAHFP; in this figure, the ordinate axis corresponds to the maximum number of shots emitted, denoted Ne and expressed in arbitrary units (a.u.), while the abscissa axis corresponds to the concentration of skatole, denoted [C] and expressed in nmol /L, in organic extracts.
La figure 5 illustre les résultats d'un test visant à comparer le dosage par ECL du scatol dans des extraits organiques ayant été obtenus à partir du plasma de 24 porcs mâles avec le dosage par HPLC du scatol dans le tissu adipeux de ces mêmes porcs ; sur cette figure, l'axe des ordonnées correspond à la concentration de scatol trouvée par ECL, notée [C]ECL et exprimée en ng/g, tandis que l'axe des abscisses correspond à la concentration de scatol trouvée par HPLC, notée [C]HPLC et exprimée en ng/g ; les concentrations symbolisées par des triangles correspondent aux concentrations supérieures au seuil de rejet fixé à 0,2 pg de scatol/g de tissu adipeux, tandis que les concentrations symbolisées par des cercles correspondent aux concentrations inférieures à ce seuil. FIG. 5 illustrates the results of a test aimed at comparing the ECL assay of skatole in organic extracts having been obtained from the plasma of 24 male pigs with the HPLC assay of skatole in the adipose tissue of these same pigs; in this figure, the ordinate axis corresponds to the skatole concentration found by ECL, denoted [C]ECL and expressed in ng/g, while the abscissa axis corresponds to the skatole concentration found by HPLC, denoted [ C]HPLC and expressed in ng/g; the concentrations symbolized by triangles correspond to concentrations above the rejection threshold set at 0.2 pg of skatole/g of adipose tissue, while the concentrations symbolized by circles correspond to concentrations below this threshold.
Exposé détaillé de modes de réalisation particuliers Detailed description of particular embodiments
Les expérimentations qui sont décrites ci-après sont réalisées en utilisant : The experiments which are described below are carried out using:
- soit des extraits organiques préalablement obtenus à partir de plasmas sanguins de porcs conformément à l'invention ; - or organic extracts previously obtained from blood plasma of pigs in accordance with the invention;
- soit des solutions, dites ci-après « solutions synthétiques », qui comprennent du scatol, du tryptophane ou de l'indole, tous trois d'origine commerciale (Sigma-Aldrich). I - Préparation des extraits organiques et des solutions synthétiques - or solutions, referred to below as “synthetic solutions”, which comprise skatole, tryptophan or indole, all three of commercial origin (Sigma-Aldrich). I - Preparation of organic extracts and synthetic solutions
1.1 - Extraits organiques : 1.1 - Organic extracts:
Les extraits organiques sont préparés en suivant, pour chaque extrait, le protocole opératoire suivant. The organic extracts are prepared by following, for each extract, the following operating protocol.
1 mL de plasma sanguin, préalablement obtenu en soumettant du sang total de porcs à une centrifugation standard en présence d'un anticoagulant (EDTA), est introduit dans un premier tube de 15 mL, conjointement avec 4 mL d'huile de colza. 1 mL of blood plasma, previously obtained by subjecting whole pig blood to standard centrifugation in the presence of an anticoagulant (EDTA), is introduced into a first 15 mL tube, together with 4 mL of rapeseed oil.
Après fermeture, le tube est soumis à une agitation (au vortex) pendant 10 minutes puis à une centrifugation pendant 5 minutes à 4 000 rpm, moyennant quoi sont obtenues une phase huileuse et une phase aqueuse. After closing, the tube is subjected to stirring (with a vortex) for 10 minutes then to centrifugation for 5 minutes at 4000 rpm, whereby an oily phase and an aqueous phase are obtained.
Après ouverture du tube, 2 mL de la phase huileuse surnageante sont prélevés et introduits dans un deuxième tube de 15 mL, conjointement avec 8 mL d'acétonitrile. After opening the tube, 2 mL of the supernatant oily phase are removed and introduced into a second 15 mL tube, together with 8 mL of acetonitrile.
Après fermeture, le tube est soumis à une agitation (au vortex) pendant 10 minutes. Le tube est ensuite placé dans un congélateur pendant 1 heure pour figer la phase huileuse puis il est soumis à une centrifugation pendant 5 minutes à 4 000 rpm, moyennant quoi sont obtenues une phase huileuse et une phase d'acétonitrile. After closing, the tube is subjected to agitation (with a vortex) for 10 minutes. The tube is then placed in a freezer for 1 hour to freeze the oily phase and then it is subjected to centrifugation for 5 minutes at 4000 rpm, whereby an oily phase and an acetonitrile phase are obtained.
Le passage du tube au congélateur permet de garantir qu'une bonne séparation des phases huileuse et d'acétonitrile sera obtenue lors de la centrifugation à laquelle est ensuite soumis ce tube. Placing the tube in the freezer makes it possible to guarantee that a good separation of the oily and acetonitrile phases will be obtained during the centrifugation to which this tube is then subjected.
8 mL de la phase d'acétonitrile surnageante sont prélevés et introduits dans un troisième tube de 15 mL, conjointement avec 309,9 mg de TBAHFP en tant que sel de fond, et 900 mg de sulfate de sodium en tant qu'agent desséchant pour éliminer les éventuelles traces d'eau susceptibles d'avoir été extraites par l'huile de colza puis par l'acétonitrile. 8 mL of the supernatant acetonitrile phase is removed and introduced into a third 15 mL tube, together with 309.9 mg of TBAHFP as the bottom salt, and 900 mg of sodium sulphate as a drying agent for eliminate any traces of water likely to have been extracted by the rapeseed oil then by the acetonitrile.
Le tube est retourné plusieurs fois pour garantir une totale absorption de ces traces d'eau par le sulfate de sodium qui, contrairement au TBAHFP, ne se dissout pas dans l'acétonitrile. The tube is inverted several times to ensure total absorption of these traces of water by the sodium sulphate which, unlike TBAHFP, does not dissolve in acetonitrile.
Puis, les 8 mL de la phase acétonitrile surnageante sont prélevés. Then, the 8 mL of the supernatant acetonitrile phase are removed.
1.2 - Solutions synthétiques : Les solutions synthétiques sont préparées en dissolvant, sous agitation, soit du scatol soit du tryptophane soit de l'indole dans l'acétonitrile, puis en ajoutant aux solutions résultantes du TBAHFP pour leur conférer une concentration en sel de fond de 0,1 mol/L. 1.2 - Synthetic solutions: Synthetic solutions are prepared by dissolving, with stirring, either skatole or tryptophan or indole in acetonitrile, then adding to the resulting solutions TBAHFP to give them a background salt concentration of 0.1 mol/ I.
Il - Détection du scatol Il - Detection of skatole
11.1 - Appareillage expérimental : 11.1 - Experimental apparatus:
Les réactions d'ECL sont réalisées au moyen d'une cellule électrochimique de 10 mL de contenance, de forme parallélépipédique, munie d'une fenêtre en verre optique. The ECL reactions are carried out by means of an electrochemical cell with a capacity of 10 mL, of parallelepiped shape, fitted with an optical glass window.
Deux électrodes se présentant sous la forme de sections en diamant dopé au bore sur un substrat de silicium et servant respectivement d'électrode de travail et de contre- électrode sont positionnées sur les deux parois opposées de cette cellule qui présentent la plus grande surface mais de manière décalée l'une par rapport à l'autre en sorte que ces électrodes sont disposées parallèlement l'une à l'autre mais sans se faire face. Two electrodes in the form of boron-doped diamond sections on a silicon substrate and serving respectively as working electrode and counter-electrode are positioned on the two opposite walls of this cell which have the largest surface but staggered relative to each other so that these electrodes are arranged parallel to each other but without facing each other.
L'électrode de travail mesure 10 x 10 mm tandis que la contre-électrode mesure 15 x 15 mm. Le contact électrique est assuré via le substrat en silicium constituant la face arrière de ces électrodes au moyen d'une bande de cuivre. The working electrode measures 10 x 10 mm while the counter electrode measures 15 x 15 mm. Electrical contact is ensured via the silicon substrate constituting the rear face of these electrodes by means of a copper strip.
La cellule est, de plus, munie d'un fil de platine servant d'électrode de pseudoréférence. The cell is further provided with a platinum wire serving as a pseudo-reference electrode.
Pour les mesures de l'émission lumineuse totale, des mesures électrochimiques et d'ECL sont effectuées à l'aide d'un potentiostat/galvanostat Autolab™ PGSTAT128N (Autolab) ou d'un module photodétecteur PDM03-9107-USB (ET-Enterprises). For total light emission measurements, electrochemical and ECL measurements are performed using an Autolab™ PGSTAT128N potentiostat/galvanostat (Autolab) or PDM03-9107-USB photodetector module (ET-Enterprises ).
Pour l'obtention des données spectrales, les mesures d'ECL sont effectuées à l'aide d'un potentiostat portable PalmSens4™ (PalmSens) et d'un spectrofluorimètre Fluoromax™ 4P (Horiba Jobin Yvon) qui permet de suivre en temps réel l'évolution de la luminescence grâce à un logiciel intégré. To obtain spectral data, ECL measurements are performed using a portable PalmSens4™ potentiostat (PalmSens) and a Fluoromax™ 4P spectrofluorimeter (Horiba Jobin Yvon) which allows real-time monitoring of the evolution of luminescence thanks to integrated software.
Au début de chaque session de mesures, les électrodes sont soigneusement nettoyées par activation électrochimique en les immergeant dans une solution comprenant 0,1 mol/L de TBAHFP dans de l'acétonitrile et en appliquant des impulsions de 0,5 seconde de 2 mA et -2 mA pendant 200 cycles. At the beginning of each measurement session, the electrodes are carefully cleaned by electrochemical activation by immersing them in a solution comprising 0.1 mol/L of TBAHFP in acetonitrile and by applying 0.5 second pulses of 2 mA and -2mA for 200 cycles.
Pendant les réactions d'ECL, la cellule électrochimique est placée dans le noir absolu pour limiter le bruit de fond du photodétecteur ou du spectrofluorimètre. 11.2 - Protocole expérimental : During ECL reactions, the electrochemical cell is placed in absolute darkness to limit background noise from the photodetector or spectrofluorimeter. 11.2 - Experimental protocol:
Comme précédemment indiqué, la réaction d'ECL qui est privilégiée dans le cadre de l'invention comprend l'application d'un potentiel cathodique à l'électrode de travail de la cellule électrochimique pour induire la formation d'ions superoxydes, suivie de l'application d'un potentiel anodique à cette même électrode pour induire l'oxydation de la base conjuguée du scatol si celui-ci est présent dans l'extrait organique. As previously indicated, the ECL reaction which is favored in the context of the invention comprises the application of a cathodic potential to the working electrode of the electrochemical cell to induce the formation of superoxide ions, followed by the application of an anodic potential to this same electrode to induce the oxidation of the conjugate base of the skatole if the latter is present in the organic extract.
Comme également précédemment indiqué, on préfère que ceci soit réalisé par un saut de potentiel, c'est-à-dire en appliquant à l'électrode de travail un potentiel négatif constant, pendant une durée suffisante pour saturer la surface de cette électrode en ions superoxydes, puis en lui appliquant un potentiel positif constant, également pendant une durée suffisante pour saturer la surface de l'électrode de travail en scatol oxydé. As also previously indicated, it is preferred that this be achieved by a potential jump, that is to say by applying a constant negative potential to the working electrode, for a time sufficient to saturate the surface of this electrode with ions. superoxides, then by applying a constant positive potential to it, also for a time sufficient to saturate the surface of the working electrode with oxidized skatole.
C'est donc ce type de protocole qui est retenu pour toutes les expérimentations décrites ci-après. It is therefore this type of protocol which is retained for all the experiments described below.
En l'espèce, ces expérimentations sont réalisées en appliquant à l'électrode de travail un potentiel négatif constant de -1,8 V (versus Pt) pendant 40 secondes puis un potentiel positif constant de +0,8 V (versus Pt) pendant 5 secondes. In this case, these experiments are carried out by applying to the working electrode a constant negative potential of -1.8 V (versus Pt) for 40 seconds then a constant positive potential of +0.8 V (versus Pt) for 5 seconds.
La mesure de la luminescence émise est lancée dès le début de l'application du potentiel négatif à l'électrode de travail. The measurement of the luminescence emitted is launched from the start of the application of the negative potential to the working electrode.
À titre d'exemple, le chronoampérogramme obtenu dans ces conditions pour une solution synthétique comprenant 1 pmol/L de scatol est illustré sur la figure 1 tandis que le signal de luminescence mesuré simultanément à l'enregistrement du chronoampérogramme est illustré sur la figure 2. By way of example, the chronoamperogram obtained under these conditions for a synthetic solution comprising 1 pmol/L of skatole is illustrated in figure 1 while the luminescence signal measured simultaneously with the recording of the chronoamperogram is illustrated in figure 2.
Comme le montre la figure 2, un pic intense de luminescence est observé lors du saut du potentiel négatif au potentiel positif. Ce pic peut être relié à la présence de scatol dans la solution standard et son amplitude peut, elle, être reliée à la quantité de scatol présent dans ladite solution. As shown in Figure 2, an intense peak of luminescence is observed when jumping from negative potential to positive potential. This peak can be linked to the presence of skatole in the standard solution and its amplitude can itself be linked to the amount of skatole present in said solution.
11.3 - Spécificité de la détection du scatol par ECL : 11.3 - Specificity of the detection of skatole by ECL:
Afin de vérifier la spécificité de la détection du scatol par ECL, 3 solutions synthétiques comprenant respectivement 1 pg/L de scatol, 1 pg/L de tryptophane et 1 pg/L d'indole, sont soumises chacune à une réaction d'ECL par saut de potentiel. Les intensités maximales des signaux de luminescence émis au cours de ces réactions sont illustrées sur la figure 3 sous forme d'un diagramme en bâtonnets, le bâtonnet noté S correspond au scatol, le bâtonnet noté T correspondant au tryptophane et le bâtonnet noté I correspondant à l'indole. In order to verify the specificity of the detection of skatole by ECL, 3 synthetic solutions comprising respectively 1 pg/L of skatole, 1 pg/L of tryptophan and 1 pg/L of indole, are each subjected to an ECL reaction by potential jump. The maximum intensities of the luminescence signals emitted during these reactions are illustrated in FIG. 3 in the form of a bar diagram, the rod denoted S corresponds to skatole, the rod denoted T corresponding to tryptophan and the rod denoted I corresponding to the indole.
Comme le montre cette figure, un signal de luminescence très élevé est obtenu pour le scatol alors qu'un signal de luminescence très faible est obtenu pour le tryptophane et l'indole, l'intensité maximale de ce signal étant respectivement 200 fois et 170 fois plus faible que celle du signal de luminescence obtenu pour le scatol. As shown in this figure, a very high luminescence signal is obtained for skatole while a very weak luminescence signal is obtained for tryptophan and indole, the maximum intensity of this signal being respectively 200 times and 170 times weaker than that of the luminescence signal obtained for skatole.
11.4 - Test d'étalonnage : 11.4 - Calibration test:
Afin de vérifier qu'il est possible de doser de manière fiable par ECL le scatol présent dans des extraits organiques obtenus à partir de plasmas sanguins de porcs, un test d'étalonnage est réalisé en soumettant 7 extraits organiques - dont 6 comprennent du scatol à des concentrations variables et 1 est exempt de scatol (extrait « témoin ») - à une réaction d'ECL par saut de potentiel. In order to verify that it is possible to reliably assay by ECL the skatole present in organic extracts obtained from the blood plasmas of pigs, a calibration test is carried out by subjecting 7 organic extracts - 6 of which comprise skatole to variable concentrations and 1 is free of skatole (“control” extract) - to an ECL reaction by potential jump.
Tous les extraits organiques ont été préparés à partir d'un seul et même plasma provenant d'un porc non contaminé par du scatol. Puis 6 d'entre eux ont été additionnés de scatol d'origine commerciale à hauteur de 25 nmol/L, 50 nmol/L, 100 nmol/L, 250 nmol/L, 500 nmol/L et 1 p.mol/L. All organic extracts were prepared from one and the same plasma from a pig not contaminated with skatole. Then 6 of them were added with skatole of commercial origin up to 25 nmol/L, 50 nmol/L, 100 nmol/L, 250 nmol/L, 500 nmol/L and 1 p.mol/L.
L'évolution de l'intensité maximale de luminescence obtenue en fonction de la concentration du scatol dans les extraits organiques est illustrée sur la figure 4. The evolution of the maximum luminescence intensity obtained as a function of the concentration of skatole in the organic extracts is illustrated in figure 4.
Cette figure montre une relation quasi linéaire (R2 = 0,9948) entre l'intensité maximale de luminescence et la concentration du scatol. Une courbe d'étalonnage est ainsi obtenue. This figure shows an almost linear relationship (R 2 = 0.9948) between the maximum intensity of luminescence and the concentration of the skatole. A calibration curve is thus obtained.
Compte-tenu qu'une partie du scatol initialement présent dans un plasma est perdu lors de la préparation d'un extrait organique à partir de ce plasma, il est possible de calculer la limite de détection du scatol en utilisant [Blanc + 3*Déviation Standard (Blanc)]. Given that part of the skatole initially present in a plasma is lost during the preparation of an organic extract from this plasma, it is possible to calculate the detection limit of skatole using [Blank + 3*Deviation Standard (White)].
Cette limite de détection est de 37 nmol de scatol/litre de plasma sanguin, soitThis detection limit is 37 nmol of skatole/litre of blood plasma, i.e.
4,84 ng de scatol/g de plasma sanguin. 4.84 ng skatole/g blood plasma.
11.5 - Analyse de plasmas sanguins : Afin de vérifier que le dosage du scatol par le procédé de l'invention est bien corrélé à celui qui serait obtenu si le scatol était dosé dans du tissu adipeux de porc, on soumet des extraits organiques préparés à partir du plasma de 24 porcs mâles entiers à une réaction d'ECL par saut de potentiel et on détermine la concentration du scatol dans ces extraits au moyen d'une courbe d'étalonnage du type de celle montrée sur la figure 4. 11.5 - Blood plasma analysis: In order to verify that the dosage of skatole by the method of the invention is indeed correlated with that which would be obtained if the skatole were measured in pig adipose tissue, organic extracts prepared from the plasma of 24 whole male pigs are submitted to an ECL reaction by potential jump and the concentration of the skatole in these extracts is determined by means of a calibration curve of the type shown in FIG.
Les concentrations ainsi obtenues sont comparées à celles préalablement obtenues en dosant par HPLC la concentration du scatol dans le tissu adipeux de ces 24 porcs. The concentrations thus obtained are compared with those previously obtained by assaying by HPLC the concentration of skatole in the adipose tissue of these 24 pigs.
Les résultats sont illustrés sur la figure 5 qui représente la concentration de scatol trouvée par ECL en fonction de la concentration de scatol trouvée par HPLC. The results are shown in Figure 5 which plots the concentration of skatole found by ECL as a function of the concentration of skatole found by HPLC.
Cette figure montre qu'il existe une corrélation quasi parfaite (R2 = 0,9222) entre les concentrations du scatol obtenues à partir de plasma sanguin par le procédé de l'invention et les concentrations du scatol obtenues par HPLC à partir de tissu adipeux. This figure shows that there is an almost perfect correlation (R 2 = 0.9222) between the concentrations of skatole obtained from blood plasma by the method of the invention and the concentrations of skatole obtained by HPLC from adipose tissue .
Elle montre également que le procédé selon l'invention permet de détecter des concentrations plasmatiques de scatol qui correspondent à des concentrations de scatol dans le tissu adipeux bien inférieures au seuil de rejet de 0,2 pg de scatol/g de tissu adipeux (concentrations symbolisées par des cercles). It also shows that the method according to the invention makes it possible to detect plasma concentrations of skatole which correspond to concentrations of skatole in the adipose tissue well below the rejection threshold of 0.2 pg of skatole/g of adipose tissue (concentrations symbolized by circles).
Le procédé de l'invention est donc parfaitement adapté à la détection de l'odeur de verrat chez les porcs mâles vivants. The method of the invention is therefore perfectly suited to the detection of boar taint in live male pigs.
Références citées Cited references
[1] WO-A-2021/ 009438 [1] WO-A-2021/009438
[2] T. Okajima et T. Ohsaka, Journal of Electroanalytical Chemistry 2002, 523, 34-39 [2] T. Okajima and T. Ohsaka, Journal of Electroanalytical Chemistry 2002, 523, 34-39
[3] US 9,121,107 B2 [3] US 9,121,107 B2

Claims

Revendications Claims
1. Procédé pour détecter la présence de scatol dans une solution aqueuse, qui comprend les étapes consistant à : a) préparer un extrait organique à partir de la solution aqueuse, par : i) mélange de la solution aqueuse avec une matière grasse puis séparation de la solution aqueuse de la matière grasse, moyennant quoi, si du scatol est présent dans la solution aqueuse, il est extrait par la matière grasse ; ii) mélange de la matière grasse obtenue à l'issue de i) avec un solvant organique aprotique puis séparation de la matière grasse du solvant organique aprotique, moyennant quoi, si du scatol est présent dans la matière grasse, il est extrait par le solvant organique aprotique ; et iii) ajout d'un sel de fond au solvant organique aprotique obtenu à l'issue de ii) ; b) soumettre l'extrait organique préparé à l'étape a) à une réaction d'électrochimioluminescence ; et c) mesurer l'intensité de la luminescence pendant l'étape b) et, si l'intensité de luminescence mesurée dépasse une valeur seuil prédéterminée, déduire la présence de scatol dans la solution aqueuse. 1. Process for detecting the presence of skatole in an aqueous solution, which comprises the steps consisting in: a) preparing an organic extract from the aqueous solution, by: i) mixing the aqueous solution with a fatty substance then separating the aqueous solution of the fat, whereby, if skatole is present in the aqueous solution, it is extracted by the fat; ii) mixing the fat obtained at the end of i) with an aprotic organic solvent then separating the fat from the aprotic organic solvent, whereby, if skatole is present in the fat, it is extracted by the solvent aprotic organic; and iii) addition of a bottom salt to the aprotic organic solvent obtained at the end of ii); b) subjecting the organic extract prepared in step a) to an electrochemiluminescence reaction; and c) measuring the luminescence intensity during step b) and, if the measured luminescence intensity exceeds a predetermined threshold value, deducing the presence of skatole in the aqueous solution.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel la matière grasse est un acide gras saturé ou insaturé, une matière grasse d'origine animale ou une huile végétale. 2. Process according to claim 1, in which the fat is a saturated or unsaturated fatty acid, a fat of animal origin or a vegetable oil.
3. Procédé selon la revendication 2, dans lequel la matière grasse est une huile végétale, de préférence l'huile de colza. 3. Method according to claim 2, in which the fat is a vegetable oil, preferably rapeseed oil.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, dans lequel la solution aqueuse est mélangée avec la matière grasse dans un rapport volumique solution aqueuse/matière grasse inférieur à 1, de préférence compris entre 0,1 et 0,5. 4. Process according to any one of claims 1 to 3, in which the aqueous solution is mixed with the fatty substance in an aqueous solution/fatty substance volume ratio of less than 1, preferably between 0.1 and 0.5.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel le solvant organique aprotique est l'acétonitrile, le diméthylsulfoxyde, le carbonate de propylène ou la y-butyrolactone, de préférence l'acétonitrile. 5. Process according to any one of claims 1 to 4, in which the aprotic organic solvent is acetonitrile, dimethyl sulphoxide, propylene carbonate or γ-butyrolactone, preferably acetonitrile.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans lequel la matière grasse obtenue à l'issue de i) est mélangée avec le solvant organique aprotique dans un rapport volumique matière grasse/solvant organique aprotique inférieur à 1, de préférence compris entre 0,1 et 0,5. 6. Process according to any one of claims 1 to 5, in which the fat obtained at the end of i) is mixed with the aprotic organic solvent in a fat/aprotic organic solvent volume ratio of less than 1, preferably between 0.1 and 0.5.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans lequel le sel de fond est un tétrafluoroborate, un hexaflurorophosphate ou un perchlorate de tétraalkylammonium dont le groupe alkyle comprend de 1 à 6 atomes de carbone, de préférence le tétrafluoroborate de tétrabutylammonium ou l'hexafluorophosphate de tétrabutylammonium. 7. Method according to any one of claims 1 to 6, in which the bottom salt is a tetrafluoroborate, a hexaflurorophosphate or a tetraalkylammonium perchlorate whose alkyl group comprises from 1 to 6 carbon atoms, preferably tetrabutylammonium tetrafluoroborate or tetrabutylammonium hexafluorophosphate.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, dans lequel l'extrait organique comprend de 0,01 mol/L à 1 mol/L, de préférence de 0,05 mol/L à 0,5 mol/L de sel de fond. 8. Method according to any one of claims 1 to 7, in which the organic extract comprises from 0.01 mol/L to 1 mol/L, preferably from 0.05 mol/L to 0.5 mol/L of bottom salt.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel l'étape b) est réalisée dans une cellule électrochimique comprenant au moins une électrode de travail et une contre-électrode, et la réaction d'électrochimioluminescence comprend l'application à l'électrode de travail d'un potentiel cathodique suivi d'un potentiel anodique. 9. Method according to any one of claims 1 to 8, in which step b) is carried out in an electrochemical cell comprising at least one working electrode and one counter-electrode, and the electrochemiluminescence reaction comprises the application at the working electrode of a cathodic potential followed by an anodic potential.
10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel l'application à l'électrode de travail d'un potentiel cathodique suivi d'un potentiel anodique est réalisée par saut de potentiel. 10. Method according to claim 9, in which the application to the working electrode of a cathodic potential followed by an anodic potential is carried out by potential jump.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans lequel, la présence de scatol ayant été déduite à l'étape c), on réalise de plus une quantification du scatol présent dans l'extrait organique par comparaison de l'intensité maximale de luminescence mesurée au cours de l'étape c) avec une courbe d'étalonnage, la quantification étant réalisée au cours de l'étape c) ou postérieurement à l'étape c). 11. Method according to any one of claims 1 to 10, in which, the presence of skatole having been deduced in step c), a quantification of the skatole present in the organic extract is also carried out by comparison of the maximum luminescence intensity measured during step c) with a calibration curve, the quantification being carried out during step c) or after step c).
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 11, dans lequel la solution aqueuse est du plasma ou du sérum de sang de porc mâle, de préférence du plasma de sang de porc mâle. 12. Method according to any one of claims 1 to 11, in which the aqueous solution is male porcine blood plasma or serum, preferably male porcine blood plasma.
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