WO2023089268A1 - Scores genotypiques mitochondriaux : marqueurs pronostiques dans un cancer chimiosensible - Google Patents

Scores genotypiques mitochondriaux : marqueurs pronostiques dans un cancer chimiosensible Download PDF

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WO2023089268A1
WO2023089268A1 PCT/FR2022/052098 FR2022052098W WO2023089268A1 WO 2023089268 A1 WO2023089268 A1 WO 2023089268A1 FR 2022052098 W FR2022052098 W FR 2022052098W WO 2023089268 A1 WO2023089268 A1 WO 2023089268A1
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WO
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genes
mutation
cytb
cox3
absence
Prior art date
Application number
PCT/FR2022/052098
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Inventor
Julie MONDET
Pascal MOSSUZ
Baptiste LAC
Original Assignee
Universite Grenoble Alpes
Centre Hospitalier Universitaire Grenoble Alpes (Hôpital Nord)
Centre National De La Recherche Scientifique
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • MITOCHONDRIAL GENOTYPIC SCORES PROGNOSTIC MARKERS IN CHEMO-SENSITIVE CANCER
  • the present invention relates to a prognostic risk score for a chemosensitive cancer, in particular acute myeloid leukemia (AML), based on somatic genetic abnormalities affecting certain genes of the mitochondrial genome.
  • AML acute myeloid leukemia
  • references in parentheses [ ] refer to the list of references presented at the end of the text.
  • AMLs Acute myeloid leukemias
  • leukemia cells stuck at an early stage of differentiation, accumulating in the bone marrow and eventually in other organs.
  • Prognostic factors currently used in practice are based on age, circulating white blood cell count, the 2017 European LeukemiaNet (ELN) prognostic classification (Dohner et al., 2017) [1],
  • ENN European LeukemiaNet
  • the 2017 ELN classification is based on cytogenetic and/or molecular alterations and defines three statuses respectively: favorable, intermediate and unfavorable.
  • Mitochondria are cellular organelles of bacterial origin present in all eukaryotic cells (except red blood cells). They play an essential role in the regulation of cellular metabolism, in the energy supply (Krebs cycle, p-oxidation of fatty acids, etc.), but also in calcium homeostasis, the generation of species reactive oxygen (ROS) and in the triggering of apoptosis phenomena. Somatic mutations of isocitrate dehydrogenases (IDH1, IDH2), mitochondrial enzymes present on the nuclear genome, cause deregulation of the Krebs cycle with the accumulation of a neometabolite, 2-hydroxyglutarate, which contributes to leukemogenesis.
  • IDH1 isocitrate dehydrogenases
  • oxidative phosphorylation activation In AML, the level of oxidative phosphorylation activation (OXPHOS) is directly correlated with the resistance of leukemic cells (Farge et al, 2017) [4], In addition, transfers of mitochondria between stromal cells and cells leukemic cells have been described as responsible for the resistance of leukemic cells to chemotherapy. In a prospective study (DRCI LAM38RC1 3-209), it was shown that a dysregulation of the production of reactive oxygen species (ROS) by the mitochondria of leukemic cells was associated with a poor prognosis (reduced survival overall) independently of the usual prognostic factors for AML (age, GB/I, ELN 2017, transplant) (Mondet et al, 2019) [5]. Thus, several tracks converge on the role of the mitochondria in the chemoresistance of AML.
  • ROS reactive oxygen species
  • a companion test is a diagnostic test that makes it possible to select, according to their status for a predictive marker identified by this test, only the patients in whom the treatment is likely to provide a benefit among those diagnosed for a given disease.
  • Venetoclax is an inhibitor of the anti-apoptotic protein BCL-2, a protein located in the mitochondrial membrane. Venetoclax binds directly to the BH3 domain binding groove of BCL-2, displacing pro-apoptotic proteins containing the BH3 motif such as BIM, to initiate Mitochondrial Outer Membrane Permeabilization (MOMP), caspase activation and apoptosis.
  • This treatment currently has authorization to be used in chronic lymphocytic leukemia, lymphomas and recently in the indication Acute myeloid leukemia in “unfit” patients, ie not able to tolerate standard chemotherapy.
  • the response to treatment with venetoclax is related to the state of the mitochondria. But no link with mutations in the mitochondrial genome has currently been described.
  • the technique used by Sanger-type sequencing has a sensitivity threshold of 20% (see material and methods of the publication, [14]) which underestimates the detection of variants in the cohort of patients (16% of variants in the COX1 and COX2 genes versus about 30-35% by a high-throughput sequencing technique taking into account a heteroplasmy threshold >2%).
  • the high-throughput sequencing study did not take haplogroups into account in the selection of variants.
  • the mitochondrial genome comprises 16 kB including 37 genes coding for 13 proteins involved in the respiratory chain as well as 22 tRNAs and 2 rRNAs.
  • the inventors are the very first to have demonstrated a score based on combinations of presence and absence of mutations of certain genes of the mitochondrial genome as prognostic markers of acute myeloid leukemia (AML).
  • AML acute myeloid leukemia
  • Mitoscore a score, hereinafter referred to as Mitoscore, to predict the response to a chemotherapy treatment and the survival of patients suffering from AML.
  • Mitoscore is based on mitochondrial genome sequencing technology (for example by NGS technology or other).
  • the Mitoscore based in particular on molecular abnormalities of the ND1, ND2, ND3, ND4, ND5, CYTB, ATP6, ATP8, COX1, COX2, COX3, 12S genes (otherwise called MT-ND1, MT-ND2, MT-ND3, MT -ND4, MT-ND5, MT-CYB, MT-ATP6, MT-ATP8, MT-CO1, MT-CO2, MT-CO3, MT-RNR1, respectively; see Table 1 below for official gene nomenclature mitochondrial cells used in the prognostic scores of the invention) stratifies, on diagnosis, patients suffering from AML into 3 respective prognosis groups: favorable, intermediate, unfavorable, in terms of overall survival on the basis of combinations of variants of the genes above.
  • the Mitoscore allows an improved prognostic stratification compared to the European LeukemiaNet 2017 (ELN 2017) prognostic score currently used for patients with AML, in order to distinguish good from bad responders and to adapt therapeutic management.
  • the Mitoscore allows also improved prognostic stratification compared to the recently published European LeukemiaNet 2022 (ELN 2022) prognostic score.
  • the Mitoscore is valid independently of the usual prognostic factors (age, white blood cell count, ELN, transplant), and can be combined with the EuroLeukemiaNet 2017 (ELN 2017) or EuroLeukemiaNet 2022 (ELN 2022) prognostic score - generically referred to as the ELN prognostic score - in the form a score, hereinafter referred to as Mitoscore+.
  • Mitoscore improves prognostic stratification of patients with AML at diagnosis. Moreover, the Mitoscore carried out by the sequencing of the mitochondrial genome (16 kb) turns out to be simpler than the classification of the ELN requiring both the culturing of leukemic cells for the production of a karyotype and sequencing of the molecular anomalies, for example by NGS technique (panel of around 100 kb, different depending on the centre). In addition, the karyotype requires a large number of leukemia cells not always obtained in poor marrow. Mitoscore therefore saves time, reduces costs, facilitates reproducibility (no culturing, no difficulties in interpretation), and requires a smaller quantity of biological material.
  • the present invention therefore relates to an in vitro method for establishing a Mitoscore survival prognosis in a patient suffering from a chemosensitive cancer, said method comprising the following steps:
  • chemosensitive cancer within the meaning of the present invention, a pathology that can be treated by chemotherapy (eg anthracyclines, antimetabolics, alkaloids or topoisomerase inhibitors, alone or in combination with other treatments) chosen for example from the group consisting by acute myeloid leukemia (AML), sarcomas, testicular cancer (of germ cells in general), choriocarcinomas, hemopathies, gynecological cancers such as ovarian cancer, and breast cancer, lung cancers, neuroblastomas, malignant brain tumors, digestive cancers, pancreatic cancers, bladder cancers, prostate cancers, thyroid cancers, liver cancers, ENT cancers.
  • AML acute myeloid leukemia
  • sarcomas testicular cancer (of germ cells in general)
  • choriocarcinomas hemopathies
  • gynecological cancers such as ovarian cancer, and breast cancer
  • lung cancers neuroblastomas
  • biological reference sample within the meaning of the present invention means a biological sample from a healthy subject, for example a DNA sample of marrow, blood, tissue.
  • reference sequence within the meaning of the present invention means a reference mitochondrial DNA sequence, for example the rCRS sequence (revised Cambridge Reference Sequence NC_012920.1) or a sequence present in the Mitomap/Mitomaster databases , gnomAD.
  • reference haplogroup/haplotype means the variations in composition with respect to the reference sequence (CRS or rCRS) defining a haplogroup or haplotype according to the classification of Richards and Macaulay of 1998, which can be determined by several tools (MitoTool, HaploFind, PhyloTree mt, Mitomap,).
  • the present invention also relates to an in vitro method for establishing a Mitoscore+ survival prognosis in a patient suffering from a chemosensitive cancer showing no mutation in the genes “ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, COX1, COX2, COX3 , 12S" or "ND2, ND5, ATP6, CYTB, ND4, ND1, COX3, 12S” (ie patients of the subgroups called Mitonaif A and Mitonaif B, respectively), said method comprising the method for establishing a Mitoscore survival prognosis as defined above and the determination of the ELN prognostic score, in said patient.
  • Mitonaif A or Mitonaif B of the "intermediate" Mitoscore the ELN stratification was applied to determine the Mitoscore+ which made it possible to reclassify these patients with AML into 3 prognostic groups in terms of overall survival.
  • the present invention also relates to an in vitro method for establishing a Mitoscore B/A survival prognosis in a patient suffering from a chemosensitive cancer, in particular acute myeloid leukemia (AML), according to the present invention, where:
  • the indication of a favorable survival prognosis corresponds either to the presence of at least one mutation in one of the ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 genes, and the absence of mutations in the following genes ND1/ COX3/12S, i.e. "the absence of mutations in the ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ND1/COX3/12S genes and the presence of at least one mutation in one of the "ND3, ATP8" genes and the absence of mutations in the “COX1, COX2” genes”;
  • the indication of an unfavorable survival prognosis corresponds either to the presence of at least one mutation in one of the ND1/COX3/12S genes, and the absence of mutation in the following genes ND2/ND5/ATP6/ CYTB/ND4, or the absence of mutations in the ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ND1/COX3/12S genes and the presence of at least one mutation in one of the "COX1, COX2" genes and the absence of mutations in one of the “ND3, ATP8” genes;
  • the indication of an intermediate survival prognosis corresponds either to the presence of at least one mutation in one of the ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 genes and at least one mutation in one of the genes ND1/COX3/12S or the absence of mutations in the ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ND1/COX3/12S genes and the presence of at least one mutation in one of the “COX1, COX2” genes and the presence of at least one mutation in one of the “ND3, ATP8” genes, or the absence of mutations in the ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ND1/COX3/12S/COX1/COX2/ ND3/ATP8 (patients called Mitonaifs B/A, i.e. approximately 25% of patients in AML).
  • the present invention also relates to an in vitro method for establishing a Mitoscore B/A+ survival prognosis in a patient suffering from cancer.
  • chemosensitive, in particular acute myeloid leukemia (AML) according to the present invention, where:
  • the indication of a favorable survival prognosis corresponds either to the presence of at least one mutation in one of the ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 genes, and the absence of mutation in the following genes ND1/ COX3/12S, i.e. "the absence of mutations in the ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ND1/COX3/12S genes and the presence of at least one mutation in one of the "ND3, ATP8" genes and the absence of mutations in the “COX1, COX2” genes or in Mitonaifs B/A patients classified as favorable with the ELN classification;
  • the indication of an unfavorable survival prognosis corresponds either to the presence of at least one mutation in one of the ND1/COX3/12S genes, and the absence of mutation in the following genes ND2/ND5/ATP6/ CYTB/ND4, or the absence of mutations in the ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ND1/COX3/12S genes and the presence of at least one mutation in one of the "COX1, COX2" genes and the absence of mutations in the “ND3, ATP8” genes, i.e. in Mitonaifs B/A patients classified unfavorably with the ELN classification;
  • the indication of an intermediate survival prognosis corresponds either to the presence of at least one mutation in one of the ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 genes and at least one mutation in one of the genes ND1/COX3/12S or the absence of mutations in the ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ND1/COX3/12S genes and the presence of at least one mutation in one of the “COX1, COX2” genes and the presence of at least one mutation in one of the “ND3, ATP8” genes, i.e. in Mitonaifs B/A patients classified as intermediate with the ELN classification.
  • the present invention also relates to an in vitro method for establishing a Mitoscore A/B survival prognosis in a patient suffering from a chemosensitive cancer, in particular acute myeloid leukemia, according to the present invention, where:
  • the indication of a favorable survival prognosis corresponds either to the presence of at least one mutation in one of the ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4 genes and the absence of mutation in the COX1, COX2 genes, COX3, 12S, or the absence of mutations in the COX1, COX2, COX3, 12S, ND2, ND3 genes, ATP8, CYTB, ND4 but the presence of at least one mutation in one of the ATP6, ND5 genes and the absence of mutations in the ND1 gene;
  • the indication of an unfavorable survival prognosis corresponds either to the presence of at least one mutation in one of the COX1, COX2, COX3, 12S genes and the absence of mutations in the ND2, ND3, ATP8 genes, CYTB, ND4, or the absence of mutations in the COX1, COX2, COX3, 12S, ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4 genes but the presence of at least one mutation in the ND1 gene and the absence of mutations in one of the ATP6 genes, ND5;
  • the indication of an intermediate survival prognosis corresponds either to the presence of at least one mutation in one of the ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4 genes and at least one mutation in one of the COX1 genes , COX2, COX3, 12S, or the absence of mutations in the ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, COX1, COX2, COX3, 12S genes, and the presence of at least one mutation in one of the ND5 genes /ATP6 and the presence of at least one mutation in the ND1 gene or the absence of mutations in the ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, COX1, COX2, COX3, 12S, ND5, ATP6, ND1 genes (patients called Mitonaifs A/B i.e. about 25% of patients in AML).
  • the present invention also relates to an in vitro method for establishing a Mitoscore A/B+ survival prognosis in a patient suffering from a chemosensitive cancer, in particular acute myeloid leukemia, according to the present invention, where:
  • the indication of a favorable survival prognosis corresponds either to the presence of at least one mutation in one of the ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4 genes and the absence of mutations in the COX1, COX2 genes, COX3, 12S, or the absence of mutations in the COX1, COX2, COX3, 12S, ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4 genes but the presence of at least one mutation in one of the ATP6, ND5 and the absence of mutations in the ND1 gene either in Mitonaifs A/B patients classified as favorable with the ELN classification;
  • the indication of an unfavorable survival prognosis corresponds either to the presence of at least one mutation in one of the COX1, COX2, COX3, 12S genes and the absence of mutations in the ND2, ND3, ATP8 genes, CYTB, ND4, or the absence of mutations in the COX1, COX2, COX3, 12S, ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4 genes but the presence of at least one mutation in the ND1 gene and the absence of mutations in one of the ATP6, ND5 genes or in Mitonaifs A/B patients classified as unfavorable with the ELN classification;
  • the indication of an intermediate survival prognosis corresponds either to the presence of at least one mutation in one of the ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4 genes and at least one mutation in one of the COX1 genes , COX2, COX3, 12S, or the absence of mutations in the ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, COX1, COX2, COX3, 12S genes, and the presence of at least one mutation in one of the ND5 genes /ATP6 and the presence of at least one mutation in the ND1 gene or Mitonaifs A/B patients classified as intermediate with the ELN classification.
  • the detection steps are carried out by high-throughput sequencing (NGS) of the mitochondrial genome.
  • NGS high-throughput sequencing
  • a further subject of the present invention is an in vitro method for predicting or evaluating the efficacy and/or the benefit of a treatment for a chemosensitive cancer, in particular an acute myeloid leukemia (AML), in a patient suffering from said cancer comprising the following steps:
  • chemosensitive cancer within the meaning of the present invention means a pathology that can be treated by chemotherapy (e.g. anthracyclines, antimetabolics, alkaloids or topoisomerase inhibitors, alone or in combination with other treatments) chosen for example from the group consisting of by acute myeloid leukemia (AML), sarcomas, cancer of the testicles (of germ cells in general), choriocarcinomas, hemopathies, gynecological cancer such as ovarian cancer, and breast cancer, lung cancer , neuroblastomas, malignant brain tumors, digestive cancers, pancreatic cancers, bladder cancers, prostate cancers, thyroid cancers, liver cancers, cancers of the ENT sphere.
  • chemotherapy e.g. anthracyclines, antimetabolics, alkaloids or topoisomerase inhibitors, alone or in combination with other treatments
  • AML acute myeloid leukemia
  • sarcomas cancer of the testicles (of germ cells in general)
  • identical survival prognosis before and after treatment within the meaning of the present invention means a favorable, intermediate or unfavorable survival prognosis before treatment which remains, respectively, a favorable, intermediate or unfavorable survival prognosis after treatment.
  • better survival prognosis after treatment than before treatment within the meaning of the present invention, for example, an intermediate or unfavorable survival prognosis before treatment which becomes, respectively, a favorable or intermediate survival prognosis after treatment.
  • the treatment of a chemosensitive cancer comprises the administration of venetoclax optionally in combination with another molecule (e.g. azacytidine).
  • venetoclax optionally in combination with another molecule (e.g. azacytidine).
  • a computer program has been created for the implementation of the above methods. This analyzes the variants from the source data of the sequencer used, filters them according to the quality criteria and the location of the variants in the coding zones, the rate of heteroplasmy and the silent mutations. THE program then applies the Mitoscores of the invention (Mitoscore/Mitoscore+/Mitoscore B/Mitoscore B+, Mitoscore B/A, Mitoscore B/A+, Mitoscore A/B, Mitoscore A/B+).
  • the present invention therefore also relates to a computer program comprising instructions, which when executed by a computer, lead it to implement the methods described above.
  • Mitoscores is carried out thanks to said computer program developed to analyze the sequences of the mitochondrial genome.
  • the present invention also relates to a computer-readable data medium comprising instructions which, when executed by a computer, lead the latter to implement a method as described above.
  • said data carrier is non-transitory.
  • the present invention also relates to a method making it possible to select, according to their status for a predictive marker identified by this test, only the patients in whom the treatment is likely to provide a benefit among those diagnosed for a given disease and thus to predict the addition of molecules/drugs targeting the mitochondria in chemosensitive cancers, in particular in acute myeloid leukaemia.
  • patients in the unfavorable or intermediate group of Mitoscores with mutations in the 12S gene can be treated with the MOTS-c peptide in order to improve the response to the standard treatment
  • patients in the unfavorable or intermediate group of Mitoscores with mutations in the COX1, COX2 or COX3 genes can be treated with quercetin or with a drug acting on complex IV in order to improve the response to treatment
  • patients in the intermediate or unfavorable Mitoscore group may benefit from therapies targeting complexes I or III of the respiratory chain (e.g. Olaparib, Mubritinib, trimetazidine dihydrochloride, etc.) in addition to the standard treatment.
  • therapies targeting complexes I or III of the respiratory chain e.g. Olaparib, Mubritinib, trimetazidine dihydrochloride, etc.
  • the present invention therefore relates to the use of a method according to the present invention to establish a Mitoscore in a patient suffering from a chemosensitive cancer as a companion test, in particular a companion test to the addition of molecules targeting the mitochondria.
  • Figure 1 represents the technical workflow carried out for the application of Mitoscore and Mitoscore+, defining in particular the criteria used for the selection of the variants.
  • Figure 2 represents the Kaplan-Meier survival curves (log-rank test p ⁇ 0.05) representing the overall survival as a function of time in patients with AML according to (A) the Mitoscore or (B) the Mitoscore+.
  • Figure 3 represents the Hazard Ratio (HR) (95% CI) of the risk of death according to Mitoscore and Mitoscore+ calculated according to the Cox model in univariate (UV) or multivariate (MV) analysis.
  • the covariates used in the MV analysis are age at diagnosis, white blood cell (WBC) count in G/l, ELN 2017 classification and/or bone marrow transplant.
  • Figure 4 shows the Kaplan-Meier survival curves (log-rank test p ⁇ 0.05) representing the overall survival as a function of time in patients with AML according to (A) the Mitoscore B containing the ND2/ND5/ CYTB /ND4/ATP6/ ND1/CO3/12S or (B) the Mitoscore B+ containing the ND2/ND5/CYTB /ND4/ATP6/ ND1/CO3/12S genes associated with ELN 2017 in patients Mitonaives for the genes previously cited.
  • Figure 5 represents the Hazard Ratio (HR) (95% CI) of the risk of death according to Mitoscore B and Mitoscore B+ calculated according to the Cox model in univariate (UV) or multivariate (MV) analysis.
  • the covariates used in the MV analysis are age at diagnosis, white blood cell (WBC) count in G/l, ELN 2017 classification and/or bone marrow transplant.
  • Figure 6 is a block diagram representing a computer for implementing a prognosis establishment method according to the invention.
  • Figure 7 shows the Kaplan-Meier survival curves (log-rank test p ⁇ 0.05) representing the overall survival as a function of time in patients with AML according to (A) the Mitoscore B/A or (B) the Mitoscore B/A+ associated with ELN 2017 in Mitonaifs B/A patients.
  • Figure 8 shows the Kaplan-Meier survival curves (log-rank test p ⁇ 0.05) representing the overall survival as a function of time in patients with AML according to (A) the Mitoscore A/B or (B) the Mitoscore A/B+ associated with ELN 2017 in Mitonaives A/B patients.
  • EXAMPLE 1 ELABORATION OF MITOCHONDRIAL GENOTYPIC SCORES IN THE CONTEXT OF THE PROGNOSIS OF ACUTE MYELOID LEUKEMIA (AML)
  • the inventors have sequenced the entire mitochondrial genome using high-throughput sequencing technology of the mitochondrial genome (NGS) of patients with AML. From this sequencing, a score called Mitoscore was defined which made it possible to predict patient survival. The value of Mitoscore was confirmed in multivariate analysis independently of the usual prognostic factors for AML (/.e. age, number of circulating white blood cells (WBC), cytogenetic and molecular abnormalities, transplant). In addition, the Mitoscore was functionally characterized by comparison with ROS emission data with and without mitochondrial complex inhibitors (antimycin A, Rotenone).
  • Sequencing of the mitochondrial genome was carried out on an S5 automaton (Ion Torrent) after PCR amplification of the mitochondrial genome (2 fragments of 8 kDa).
  • the mitochondrial genome can be produced with other technologies for the synthesis of libraries, for example PCR amplification of the mitochondrial genome with more than 2 fragments or recovery of the sequencing product by capture.
  • sequencing on an Illumina technology-type sequencer can also be performed.
  • Variant analysis was performed using Mitomaster. Variants affecting non-coding regions (e.g. D-loop%), heteroplasmy rates strictly below 2% and silent mutations were eliminated.
  • the Mitomaster site has defined a mitochondrial haplogroup.
  • This prognostic classification based on the “Mitoscore” is independent of the usual prognostic factors for AML (age, GB/I, ELN 2017, bone marrow transplant).
  • the Mitoscore was functionally characterized by comparing to ROS emission data.
  • leukemia cells from patients in the “unfavorable” Mitoscore subgroup emitted significantly less ROS under antimycin/rotenone stimulation (targeting ROS mitochondrial) than those of the “favorable” and “intermediate” Mitoscore with the COX1/COX2/COX3/12S and ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4 mutations.
  • complexes I and III of the respiratory chain are the main sources of emission of reactive oxygen species.
  • the genes involved in the "favorable" Mitoscore affect subunits of complexes I (ND2/ND3/ND4/ND5) and III (CYTB) as well as ATP synthase (ATP8/ATP6).
  • the ROS data therefore support the hypothesis of the functioning of the "favorable” Mitoscore where the mutations affect the emission of ROS, in particular under conditions of stimulation such as induced by chemotherapy.
  • the strong emission of ROS triggers the apoptosis threshold and leads to cell death of leukemia cells.
  • Mitoscore subgroup fewer ROS are emitted. Indeed, complex IV of the respiratory chain encoded by the COX1/COX2/COX3 genes is not a site for the emission of superoxide ions. In addition, the Mitochondrial-derived peptide MOTS-c encoded by the 12S gene plays a role in metabolic adaptation to stress.
  • Mitoscore+ was also functionally characterized in the same way as Mitoscore.
  • Mitonaif patients whose leukemia cells are able to produce more ROS in the presence of antimycin/rotenone and DPI (diphenyleneiodonium) show significantly better overall survival compared to patients whose leukemia cells produce less ROS.
  • the Mitoscore made it possible to stratify the 64 patients with AML into 3 prognostic groups in terms of overall survival based on the following combinations of variants:
  • a “favorable” Mitoscore corresponds to the presence of at least one mutation in one of the ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4 genes or at least one mutation in one of the ND2/ND3/ATP8/CYTB genes , and the absence of mutations in the following genes COX1/COX2/COX3/12S.
  • Mitoscore corresponds to the presence of at least one mutation in one of the COX1/COX2/COX3/12S genes, and the absence of mutations in the following genes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4.
  • An “intermediate” Mitoscore corresponds to:
  • the Mitoscore B also made it possible to stratify the 64 patients with AML into 3 prognostic groups in terms of overall survival on the basis of the following combinations of variants:
  • a "favorable” Mitoscore also corresponds to the presence of at least one mutation in one of the ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 genes, and the absence of mutations in the following genes ND1/COX3/12S.
  • An “unfavorable” Mitoscore also corresponds to the presence of at least one mutation in one of the ND1/COX3/12S genes, and the absence of mutations in the following genes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4.
  • a “favorable” Mitoscore+ corresponds to: - either the presence of at least one mutation in one of the ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4 genes or of at least one mutation in one of the ND2/ND3/ATP8/CYTB genes, and the absence of mutations in the following genes COX1/COX2/COX3/12S; - or to Mitonaifs A patients classified as “favourable” according to the ELN score.
  • a “favorable” Mitosscore B+ corresponds to:
  • the Mitoscore B/A also made it possible to stratify the 64 patients with AML into 3 prognostic groups in terms of overall survival based on the following combinations of variants:
  • Mitosscore B/A corresponds to:
  • Mitosscore B/A corresponds to:
  • the Mitoscore A/B allowed the 64 patients with AML to be stratified into 3 prognostic groups in terms of overall survival based on the following combinations of variants:
  • a “favorable” Mitoscore A/B corresponds to: - either the presence of at least one mutation in the ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4 genes, and the absence of a variant in the COX1/COX2/COX3/12S genes; or the absence of a variant in the COX1/COX2/COX3/12S/ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4/ND1 genes, and the presence of at least one mutation in the ATP6/ND5 genes.
  • Mitoscore A/B corresponds to:
  • the Mitoscore B/A+ also stratified the 64 AML patients into 3 prognostic groups in terms of overall survival based on the following variant combinations:
  • Mitosscore B/A+ corresponds to:
  • An “unfavorable” Mitosscore B/A+ corresponds to: - either the presence of at least one variant in the ND1/COX3/12S genes, and the absence of a variant in the ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 genes; either the absence of a variant in the ND1/COX3/12S/ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ATP8/ND3 genes, and the presence of at least one variant in the COX1/COX2 genes; or the absence of a variant in the ND1/COX3/12S/ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/COX1/COX2/ATP8/ND3 genes, and unfavorable ELN.
  • the Mitoscore A/B+ made it possible to stratify the 64 patients with AML into 3 prognostic groups in terms of overall survival on the basis of the following combinations of variants:
  • Mitosscore A/B+ corresponds to:
  • ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4 either the absence of a variant in the COX1/COX2/COX3/12S/ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4/ATP6/ND5 genes, and the presence of at least one variant in the ND1 gene; or the absence of a variant in the COX1/COX2/COX3/12S/ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4/ATP6/ND5/ND1 genes, and unfavorable ELN.
  • the different Mitoscores according to the invention can thus show their effectiveness in predicting the response to treatments for a chemosensitive cancer, for example using venetoclax.
  • they make it possible to define the sensitivity to a treatment (e.g. to venetoclax) in the indication acute myeloid leukemia as well as in the other indications using the treatment.
  • the Mitoscores according to the invention can make it possible to modify the management in combination with chemotherapy by using drugs capable of: • target the communication between the mitochondria and the nucleus of the leukemia cell by administering the MOTS-c peptide in intermediate or unfavorable patients with a mutation in the 12S gene
  • target complex IV of the mitochondria with, for example, quercetin or other drugs in intermediate or unfavorable patients with a mutation in one of the COX1, COX2, COX3 genes
  • target complexes I and III of the mitochondrial respiratory chain in intermediate or unfavorable patients via the administration of drugs targeting the mitochondria, for example olaparib, mubritinib, trimetazidine dihydrochloride, myxothiazol, etc.
  • Mitoscores of the invention can serve as a companion test to improve patient care and define possible indications for the addition of complementary therapies/products targeting the mitochondria.
  • a computer program has been created for the implementation of the above scores in order to be able to evaluate the effectiveness of a therapeutic treatment, for example with venetoclax, vis-à-vis a chemosensitive cancer, in particular a LAM.
  • Said program analyzes the variants from the source data of the sequencer used, filters them according to the quality criteria and the location of the variants in the coding zones, the rate of heteroplasmy and silent mutations.
  • the program then applies the Mitoscores (Mitoscore / Mitoscore+, Mitoscore B / Mitoscore B+, Mitoscore B/A, Mitoscore B/A+, Mitoscore A/B, Mitoscore A/B+).
  • FIG. 6 is a block diagram of a device 600 configured to implement the steps of a method for establishing a survival prognosis in a patient suffering from a chemosensitive cancer, as described above.
  • the device comprises a processor 601, a volatile memory 602, a non-volatile memory 603, the latter comprising instructions 604 which, when executed by the processor 601, lead the device 600 to implement the steps mentioned above. above to establish a survival prognosis in a patient with a chemosensitive cancer.
  • the different components are connected by a bus communication 605.
  • the device may comprise other components or interfaces 606 to other components, depending on the implementation, in particular a user interface.
  • Processor 601 may take any suitable form - one or more microprocessors, one or more microcontrollers, or a combination thereof.
  • Volatile memory 602 is used for temporary storage of data.
  • Nonvolatile memory 603 may include a hard disk, static memory, or other form of long-term storage.
  • Non-volatile memory stores implementation instructions, it can also store an operating system and/or applications.
  • the device 600 is for example a computer in which is loaded or downloaded a computer program which includes the instructions 604.
  • the different Mitoscores according to the invention can thus show their effectiveness in order to predict the response to treatments using venetoclax. For example, they make it possible to define the sensitivity to venetoclax in the indication Acute myeloid leukemia as well as in the other indications using the treatment.

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Abstract

La présente invention concerne un score de risque pronostique d'un cancer chimiosensible, en particulier d'une leucémie aiguë myéloïde (LAM), basé sur des anomalies génétiques somatiques touchant certains gènes du génome mitochondrial.

Description

SCORES GENOTYPIQUES MITOCHONDRIAUX : MARQUEURS PRONOSTIQUES DANS UN CANCER CHIMIOSENSIBLE
DESCRIPTION
Domaine technique de l’invention
La présente invention concerne un score de risque pronostique d’un cancer chimiosensible, en particulier d’une leucémie aiguë myéloïde (LAM), basé sur des anomalies génétiques somatiques touchant certains gènes du génome mitochondrial.
Dans la description ci-dessous, les références entre parenthèses [ ] renvoient à la liste des références présentée à la fin du texte.
Etat de la technique
Les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) sont des proliférations malignes incontrôlées de progéniteurs myéloïdes immatures appelés cellules leucémiques bloqués à un stade précoce de différenciation, s’accumulant dans la moelle osseuse et éventuellement dans d’autres organes. Malgré les progrès thérapeutiques, leur pronostic est très péjoratif avec une guérison chez 35 à 40% des patients adultes âgés de moins de 60 ans et chez 5 à 15% des patients âgés de plus de 60 ans. Les facteurs pronostiques actuellement utilisés en pratique sont basés sur l’âge, le taux de globules blancs circulants, la classification pronostique de l’European LeukemiaNet (ELN) 2017 (Dohner et al., 2017) [1], La classification ELN 2017 est basée sur des altérations cytogénétiques et/ou moléculaires et définit trois statuts respectivement : favorable, intermédiaire et défavorable. Toutefois, cette classification pronostique reste à améliorer. Par exemple, dans le groupe favorable, le taux de survie à 5 ans n’est que de 64% chez les patients de moins de 60 ans (35% chez les plus de 60 ans) [2], Il existe une mise à jour récente de la classification de pronostique de l’European LeukemiaNet : l’ELN 2022 (Dohner et al., 2022) [3],
Les mitochondries sont des organites cellulaires d’origine bactérienne présentes dans toutes les cellules eucaryotes (sauf les globules rouges). Elles jouent un rôle essentiel dans la régulation du métabolisme cellulaire, dans l’approvisionnement énergétique (cycle de Krebs, p-oxydation des acides gras, etc...), mais également dans l’homéostasie du calcium, la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et dans le déclenchement des phénomènes d’apoptose. Les mutations somatiques des isocitrate déshydrogénases (IDH1 , IDH2), enzymes mitochondriales présentes sur le génome nucléaire, entraînent des dérégulations du cycle de Krebs avec l’accumulation d’un néométabolite, le 2- hydroxyglutarate, qui contribue à la leucémogenèse.
Dans les LAM, le niveau d’activation de la phosphorylation oxydative (OXPHOS) est directement corrélé à la résistance des cellules leucémiques (Farge et al, 2017) [4], De plus, des transferts de mitochondries entre les cellules stromales et les cellules leucémiques ont été décrits comme responsables à la résistance des cellules leucémiques à la chimiothérapie. Dans une étude prospective (DRCI LAM38RC1 3-209), il a été montré qu’une dérégulation de la production des espèces réactives de l’oxygène (ROS) par les mitochondries des cellules leucémiques était associée à un pronostic péjoratif (diminution de la survie globale) indépendamment des facteurs pronostiques habituels des LAM (âge, GB/I, ELN 2017, greffe) (Mondet et al, 2019) [5]. Ainsi plusieurs pistes convergent sur le rôle de la mitochondrie dans la chimiorésistance des LAM.
Plusieurs publications suggèrent même l’utilisation de drogues ciblant la mitochondrie dans les LAM ou dans d’autres cancers afin de limiter l’acquisition de résistances aux chimiothérapies et d’augmenter la sensibilité à celles-ci (Bosc et al., 2021 ; Neuzil et al., 2013) [6, 7], Cependant, actuellement, il n’existe pas de tests compagnons spécifiques pour ces nouvelles stratégies thérapeutiques qui n’apportent un bénéfice que chez certains patients. On appelle test compagnon un test diagnostique permettant de sélectionner, en fonction de leur statut pour un marqueur prédictif identifié par ce test, uniquement les patients chez lesquels le traitement est susceptible d’apporter un bénéfice parmi ceux diagnostiqués pour une maladie donnée.
Le vénétoclax est un inhibiteur de la protéine anti-apoptotique BCL-2, protéine localisée au niveau de la membrane mitochondriale. Le vénétoclax se lie directement au sillon de liaison du domaine BH3 de BCL-2, en déplaçant les protéines pro-apoptotiques contenant le motif BH3 telles que BIM, pour initier la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe (MOMP, Mitochondrial Outer Membrane Permeabilization), l’activation des caspases et l’apoptose. Ce traitement a actuellement l’autorisation d’être utilisé dans la leucémie lymphoïde chronique, les lymphomes et récemment dans l’indication Leucémie aigue myéloïde chez les patients « unfit » c’est-à-dire non aptes à tolérer une chimiothérapie standard. La réponse au traitement par le vénétoclax est en lien avec l’état de la mitochondrie. Mais aucun lien avec les mutations du génome mitochondrial n’a actuellement été décrit.
En effet, concernant le génome mitochondrial, peu d’études ont analysé l’impact des mutations du génome mitochondrial comme marqueur pronostique dans les LAM. Les mutations ND4, codant pour une sous-unité du complexe I, ont été analysées chez 452 patients via une approche de séquençage ciblé (différent de la technologie de séquençage haut-débit) dans les LAM et sont associées à une survie globale augmentée dans une analyse univariée (Damm et al., 2012) [8]. Cependant, l’analyse multivariée ne confirme pas de manière significative ce résultat (p=0.089). L’article conclut même qu’il faudrait confirmer ce résultat avec d’autres études. Une autre étude a étudié l’impact pronostique des mutations ND4 chez 121 patients atteints de LAM (Chun et al., 2014) [9]. Cependant l’étude ne montre aucune différence en termes de survie globale ni de survie sans rechute. L’impact pronostique de ND4 n’est donc pas une donnée certaine pour l’homme du métier.
Les mutations touchant les gènes COX1 et COX2 ont été analysées par séquençage haut débit (Silkjaer et al., 2013) [13] et par séquençage Sanger dans les leucémies aigues myéloides (Silkjaer et al., 2013) [14], Dans l’étude par séquençage haut débit, les mutations COX1 et COX2 sont associées à une survie globale diminuée dans une analyse univariée. Cependant, l’analyse multivariée ne confirme pas de manière significative ce résultat [13]. Dans l’étude faisant suite par séquençage Sanger, dans le groupe global de 165 patients atteints traités par chimiothérapie à visée curative, il n'y a pas eu d'impact pronostique de la présence de variations COX1 ou COX2 [14], L’impact pronostique des mutations COX1 et COX2 n’est donc pas une donnée certaine pour l’homme du métier. De plus, la technique utilisée par séquençage de type Sanger présente un seuil de sensibilité de 20 % (cf matériel et méthodes de la publication, [14]) ce qui sous-estime la détection des variants dans la cohorte de patients (16% des variants dans les gènes COX1 et COX2 versus environ 30-35% par une technique de séquençage haut- débit prenant en compte un seuil de hétéroplasmie >2%). Pour finir, l’étude par séquençage haut débit n’a pas pris en compte les haplogroupes dans la sélection des variants. Toutefois, le génome mitochondrial comprend 16 kB dont 37 gènes codant pour 13 protéines impliquées dans la chaîne respiratoire ainsi que 22 ARNt et 2 ARNr. Une autre étude issue de données publiques de génétiques somatiques tirées du site cbioportal (https://www.cbioportal.org/) a analysé l’impact des mutations sur la leucémie aiguë myéloïde (Wu et al., 2018) [10]. Toutefois, plusieurs biais existent dans cette étude. L’un d’eux est lié à l’utilisation d’une analyse bioinformatique dédiée à l’ADN génomique, non spécifique de l’ADN mitochondrial. Dans cette étude, seulement 8% des patients atteints de LAM présentent des mutations présentes sur les gènes (ND1 , ND2, ND3, ND4, ND4L, ND5, ND6, CYB, COX1 , COX2, COX3, ATP6, ATP8). L’erreur d’analyse des données génétiques conduit à une sous-estimation du nombre de variants faussant les résultats finaux. A titre comparatif dans l’étude ciblant uniquement le gène ND4 (Damm et al., 2012) [8], la fréquence des mutations était de 6,4% (29/452). L’ADN mitochondrial possédant son propre code génétique, utiliser une analyse bioinformatique commune entre les mutations génomiques nucléaires et les mutations mitochondriales est à l’origine d’erreurs d’interprétation des variants obtenus (Caudron-Herger et Diederichs, 2018) [11]. Le même biais d’analyse existe dans d’autres pathologies (e.g. site cbioportal en date du 08/10/2021 , étude Diffuse Large B cell Lymphoma, Duke 2017, 0% présente des mutations des gènes ND1 , ND2, ND3, ND4, ND4L vs 35% dans l’étude de Zeng et al., 2018) [12]).
Hormis les études de Damm et al. et de Chun et al. analysant uniquement le gène ND4, de Silkjaer et al. . analysant les gènes COX1 et COX2 [13-14], et de WU et al. utilisant une analyse bioinformatique inappropriée, aucune étude n’a montré l’apport des mutations du mitogénome dans la stratification des patients atteints de LAM.
Par conséquent, l’étude du génome mitochondrial et l’identification d’éventuels nouveaux marqueurs pronostiques des LAM reste un challenge, afin de mieux classer les patients atteints de LAM en termes de survie globale, et ainsi adapter leur prise en charge thérapeutique en fonction de leur pronostic de survie.
Description de l’invention
Les Inventeurs sont les tous premiers à avoir mis en évidence un score basé sur des combinaisons de présence et d’absence de mutations de certains gènes du génome mitochondrial comme marqueurs pronostiques de la leucémie aiguë myéloïde (LAM).
Les Inventeurs ont ainsi mis au point un score, ci-après dénommé Mitoscore, pour prédire la réponse à un traitement de chimiothérapie et la survie des patients atteints de LAM. Le Mitoscore est basé sur une technologie de séquençage du génome mitochondrial (par exemple par technologie NGS ou autre). Le Mitoscore basé en particulier sur des anomalies moléculaires des gènes ND1 , ND2, ND3, ND4, ND5, CYTB, ATP6, ATP8, COX1 , COX2, COX3, 12S (autrement nommés MT-ND1 , MT-ND2, MT-ND3, MT-ND4, MT-ND5, MT-CYB, MT-ATP6, MT-ATP8, MT-CO1 , MT-CO2, MT-CO3, MT-RNR1 , respectivement ; cf. tableau 1 ci-dessous indiquant la nomenclature officielle des gènes mitochondriaux utilisés dans les scores pronostiques de l’invention) stratifie au diagnostic les patients atteints de LAM en 3 groupes de pronostic respectif: favorable, intermédiaire, défavorable, en termes de survie globale sur la base de combinaisons de variants des gènes ci- dessus.
Tableau 1
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Le Mitoscore permet une stratification pronostique amé iorée par rapport au score pronostique European LeukemiaNet 2017 (ELN 2017) actuellement utilisé pour les patients souffrant de LAM, afin de distinguer les bons des mauvais répondeurs et d’adapter la prise en charge thérapeutique. Le Mitoscore permet également une stratification pronostique améliorée par rapport au score pronostique récemment publié European LeukemiaNet 2022 (ELN 2022). Le Mitoscore est valable indépendamment des facteurs pronostiques habituels (âge, nombre de globules blancs, ELN, greffe), et peut être combiné au pronostique EuroLeukemiaNet 2017 (ELN 2017) ou EuroLeukemiaNet 2022 (ELN 2022) - appelés génériquement score pronostique ELN - sous forme d’un score, ci-après dénommé Mitoscore+.
Le Mitoscore améliore la stratification pronostique des patients atteints de LAM au diagnostic. De plus, le Mitoscore réalisé par le séquençage du génome mitochondrial (16 kb) s’avère plus simple que la classification de l’ELN nécessitant à la fois la mise en culture de cellules leucémiques pour la réalisation d’un caryotype et un séquençage des anomalies moléculaires par exemple par technique NGS (panel d’environ 100 kb, différent selon les centres). De plus, le caryotype nécessite un nombre important de cellules leucémiques pas toujours obtenu dans les moelles pauvres. Le Mitoscore permet donc un gain de temps, des coûts amoindris, une reproductibilité plus facile (pas de mise en culture, pas de difficultés d’interprétation), et nécessite une quantité de matériel biologique plus faible.
La présente invention a donc pour objet un procédé in vitro pour établir un pronostic de survie Mitoscore chez un patient atteint d’un cancer chimiosensible, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
- détection dans un échantillon biologique dudit patient, de la présence et/ou l’absence d’au moins une mutation sur l’un des neuf gènes du génome mitochondrial suivants : ND1 , ND2, ND3, ND4, ND5, CYTB, ATP8, ATP6, COX1 , COX2, COX3 et 12S ;
- comparaison des résultats de détection par rapport à un échantillon biologique de référence ou une séquence de référence ou un haplogroupe/haplotype de référence ;
- établissement du pronostic de survie dudit patient.
On entend par « cancer chimiosensible » au sens de la présente invention, une pathologie pouvant être traité par chimiothérapie (e.g. anthracyclines, antimétaboliques, alcaloïdes ou inhibiteurs de topoisomérase, seuls ou en association avec d’autres traitements) choisie par exemple dans le groupe constitué par les leucémies aiguës myéloïdes (LAM), les sarcomes, le cancer des testicules (des cellules germinales en général), les choriocarcinomes, les hémopathies, le cancer gynécologiques tels que le cancer des ovaires, et le cancer du sein, les cancers du poumon, les neuroblastomes, les tumeurs cérébrales malignes, les cancers digestifs, les cancers du pancréas, les cancers de la vessie, les cancers de la prostate, les cancers de la thyroïde, les cancers du foie, les cancers de la sphère ORL. De préférence, il s’agit d’une leucémie aiguë myéloïde (LAM).
On entend par « échantillon biologique de référence » au sens de la présente invention, un échantillon biologique d’un sujet sain, par exemple un échantillon d’ADN de moelle, de sang, de tissu.
On entend par « séquence de référence » au sens de la présente invention, une séquence d’ADN mitochondrial de référence, par exemple la séquence rCRS (revised Cambridge Reference Sequence NC_012920.1 ) ou une séquence présente sur les bases de données Mitomap/Mitomaster, gnomAD.
On entend par « haplogroupe/haplotype de référence » selon la présente invention, les variations de composition par rapport à la séquence de référence (CRS ou rCRS) définissant un haplogroupe ou haplotype selon la classification de Richards et Macaulay de 1998, pouvant être déterminé par plusieurs outils (MitoTool, HaploFind, PhyloTree mt, Mitomap,...).
Selon un mode de réalisation particulier du procédé in vitro pour établir un pronostic de survie Mitoscore chez un patient atteint d’un cancer chimiosensible selon la présente invention :
- la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4 et l’absence de mutation dans les gènes COX1 , COX2, COX3, 12S, est l’indication d’un pronostic de survie favorable ;
- la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1 , COX2, COX3, 12S et l’absence de mutation dans les gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, est l’indication d’un pronostic de survie défavorable ; et
- soit l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, COX1 , COX2, COX3, 12S (patients appelés « Mitonaïf A », correspondant à environ 30% des patients atteints de LAM), soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4 et d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1 , COX2, COX3, 12S, est l’indication d’un pronostic de survie intermédiaire. Selon un mode de réalisation particulier du procédé in vitro pour établir un pronostic de survie Mitoscore chez un patient atteint d’un cancer chimiosensible selon la présente invention :
- la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, et l’absence de mutation dans les gènes COX1 , COX2, COX3, 12S, est l’indication d’un pronostic de survie favorable ;
- la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1 , COX2, COX3, 12S et l’absence de mutation dans les gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, est l’indication d’un pronostic de survie défavorable ; et
- soit l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, COX1 , COX2, COX3, 12S (patients appelés « Mitonaïf A », correspondant à environ 30% des patients atteints de LAM), soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4 et d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1 , COX2, COX, 12S, est l’indication d’un pronostic de survie intermédiaire.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé in vitro pour établir un pronostic de survie Mitoscore B chez un patient atteint d’un cancer chimiosensible selon la présente invention :
- la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4, et l’absence de mutation dans les gènes suivants ND1/COX3/12S, est l’indication d’un pronostic de survie favorable ;
- la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND1/COX3/12S, et l’absence de mutation dans les gènes suivants ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4, est l’indication d’un pronostic de survie défavorable ; et
- soit l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ ND1/COX3/12S (patients appelés « Mitonaïf B », correspondant à environ 40% des patients atteints de LAM), soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 et d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND1/COX3/12S (patients appelés « intermédiaire muté »), est l’indication d’un pronostic de survie intermédiaire.
On entend par pronostic de survie « favorable », « intermédiaire » ou « défavorable » au sens de la présente invention, la graduation des hypothèses faites sur l’évolution de la pathologie sur la base des variants mitochondriaux (/.e. en termes de chances de survie, de risques de complications et/ou de décès). La présente invention a encore pour objet un procédé in vitro pour établir un pronostic de survie Mitoscore+ chez un patient atteint d’un cancer chimiosensible ne présentant aucune mutation dans les gènes « ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, COX1 , COX2, COX3, 12S » ou « ND2, ND5, ATP6, CYTB, ND4, ND1 , COX3, 12S » (i.e. patients des sous-groupes appelés Mitonaïf A et Mitonaïf B, respectivement), ledit procédé comprenant le procédé pour établir un pronostic de survie Mitoscore tel que défini ci-dessus et la détermination du score pronostique ELN, chez ledit patient. Dans les sous-groupes de patients appelés Mitonaïf A ou Mitonaïf B du Mitoscore « intermédiaire », la stratification de l’ELN a été appliquée pour déterminer le Mitoscore+ qui a permis de reclasser ces patients atteints de LAM en 3 groupes de pronostic en termes de survie globale.
Selon un mode de réalisation particulier d’un procédé in vitro pour établir un pronostic de survie Mitoscore+ chez un patient atteint d’un cancer chimiosensible selon la présente invention :
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4 et l’absence de mutation dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, COX1 , COX2, COX3, 12S et un classement « favorable » selon le score ELN, est l’indication d’un pronostic de survie favorable ;
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1 /COX2/COX3/12S et l’absence de mutation dans les gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, COX1 , COX2, COX3, 12S et un classement « défavorable » selon le score ELN, est l’indication d’un pronostic de survie défavorable ;
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4 et d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1/COX2/COX3/12S, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, COX1 , COX2, COX3, 12S et un classement « intermédiaire » selon le score ELN, est l’indication d’un pronostic de survie intermédiaire. Selon un mode de réalisation particulier d’un procédé in vitro pour établir un pronostic de survie Mitoscore+ chez un patient atteint d’un cancer chimiosensible selon la présente invention :
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB et l’absence de mutation dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, COX1 , COX2, COX3, 12S et un classement « favorable » selon le score ELN, est l’indication d’un pronostic de survie favorable ;
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1 /COX2/COX3/12S et l’absence de mutation dans les gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, COX1 , COX2, COX3, 12S et un classement « défavorable » selon le score ELN, est l’indication d’un pronostic de survie défavorable ;
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4 et d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1/COX2/COX3/12S, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, COX1 , COX2, COX3, 12S et un classement « intermédiaire » selon le score ELN, est l’indication d’un pronostic de survie intermédiaire.
Selon un mode de réalisation particulier d’un procédé in vitro pour établir un pronostic de survie Mitoscore B+ chez un patient atteint d’un cancer chimiosensible selon la présente invention :
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 et l’absence de mutation dans les gènes suivants ND1/COX3/12S, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND5, ATP6, CYTB, ND4, ND1 , COX3, 12S et un classement « favorable » selon le score ELN , est l’indication d’un pronostic de survie favorable ;
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND1/COX3/12S et l’absence de mutation dans les gènes suivants ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND5, ATP6, CYTB, ND4, ND1 , COX3, 12S et un classement « défavorable » selon le score ELN, est l’indication d’un pronostic de survie défavorable ; - soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 et d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND1/COX3/12S, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND5, ATP6, CYTB, ND4, ND1 , COX3, 12S et un classement « intermédiaire » selon le score ELN, est l’indication d’un pronostic de survie intermédiaire.
La présente invention a encore pour objet un procédé in vitro pour établir un pronostic de survie Mitoscore B/A chez un patient atteint d’un cancer chimiosensible, en particulier une leucémie aiguë myéloïde (LAM), selon la présente invention, où :
- l’indication d’un pronostic de survie favorable correspond soit à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4, et l’absence de mutations dans les gènes suivants ND1/COX3/12S, soit « l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ND1/ COX3/12S et la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes « ND3, ATP8 » et l’absence de mutations dans les gènes « COX1 , COX2 » » ;
- l’indication d’un pronostic de survie défavorable correspond soit à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND1/COX3/12S, et l’absence de mutation dans les gènes suivants ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4, soit à l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ ND1/COX3/12S et la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes « COX1 , COX2 » et l’absence de mutations dans l’un des gènes « ND3, ATP8 » ;
- l’indication d’un pronostic de survie intermédiaire correspond soit à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 et d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND1/COX3/12S soit à l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ND1/COX3/12S et la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes « COX1 , COX2 » et la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes « ND3, ATP8 »soit à l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ND1/COX3/12S/COX1/COX2/ ND3/ATP8 (patients appelés Mitonaifs B/A soit environ 25% des patients dans la LAM).
La présente invention a encore pour objet un procédé in vitro pour établir un pronostic de survie Mitoscore B/A+ chez un patient atteint d’un cancer chimiosensible, en particulier une leucémie aiguë myéloïde (LAM), selon la présente invention, où :
- l’indication d’un pronostic de survie favorable correspond soit à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4, et l’absence de mutation dans les gènes suivants ND1/COX3/12S, soit « l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ND1/ COX3/12S et la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes « ND3, ATP8 » et l’absence de mutations dans les gènes « COX1 , COX2 » » soit aux patients Mitonaifs B/A classés favorable avec la classification de l’ELN ;
- l’indication d’un pronostic de survie défavorable correspond soit à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND1/COX3/12S, et l’absence de mutation dans les gènes suivants ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4, soit à l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ND1/COX3/12S et la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes « COX1 , COX2 » et l’absence de mutations dans les gènes « ND3, ATP8 » soit aux patients Mitonaifs B/A classés défavorable avec la classification de l’ELN ;
- l’indication d’un pronostic de survie intermédiaire correspond soit à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 et d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND1/COX3/12S soit à l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ND1/COX3/12S et la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes « COX1 , COX2 » et la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes « ND3, ATP8 » soit aux patients Mitonaifs B/A classés intermédiaire avec la classification de l’ELN.
La présente invention a encore pour objet un procédé in vitro pour établir un pronostic de survie Mitoscore A/B chez un patient atteint d’un cancer chimiosensible, en particulier une leucémie aiguë myéloïde, selon la présente invention, où :
- l’indication d’un pronostic de survie favorable correspond soit à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4 et l’absence de mutation dans les gènes COX1 , COX2, COX3, 12S, soit à l’absence de mutations dans les gènes COX1 , COX2, COX3, 12S, ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4 mais la présence d’un moins une mutation dans l’un des gènes ATP6, ND5 et l’absence de mutations dans le gène ND1 ;
- l’indication d’un pronostic de survie défavorable correspond soit à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1 , COX2, COX3, 12S et l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, soit à l’absence de mutations dans les gènes COX1 , COX2, COX3, 12S, ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4 mais la présence d’un moins une mutation dans le gène ND1 et l’absence de mutations dans l’un des gènes ATP6, ND5 ;
- l’indication d’un pronostic de survie intermédiaire correspond soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4 et d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1 , COX2, COX3, 12S, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, COX1 , COX2, COX3, 12S, et la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND5/ATP6 et la présence d’au moins une mutation dans le gène ND1 soit l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, COX1 , COX2, COX3, 12S, ND5, ATP6, ND1 (patients appelés Mitonaifs A/B soit environ 25% des patients dans la LAM).
La présente invention a encore pour objet un procédé in vitro pour établir un pronostic de survie Mitoscore A/B+ chez un patient atteint d’un cancer chimiosensible, en particulier une leucémie aiguë myéloïde, selon la présente invention, où :
- l’indication d’un pronostic de survie favorable correspond soit à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4 et l’absence de mutations dans les gènes COX1 , COX2, COX3, 12S, soit à l’absence de mutations dans les gènes COX1 , COX2, COX3, 12S, ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4 mais la présence d’un moins une mutation dans l’un des gènes ATP6, ND5 et l’absence de mutations dans le gène ND1 soit aux patients Mitonaifs A/B classés favorable avec la classification de l’ELN ;
- l’indication d’un pronostic de survie défavorable correspond soit à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1 , COX2, COX3, 12S et l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, soit à l’absence de mutations dans les gènes COX1 , COX2, COX3, 12S, ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4 mais la présence d’un moins une mutation dans le gène ND1 et l’absence de mutations dans l’un des gènes ATP6, ND5 soit aux patients Mitonaifs A/B classés défavorable avec la classification de l’ELN ;
- l’indication d’un pronostic de survie intermédiaire correspond soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4 et d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1 , COX2, COX3, 12S, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, COX1 , COX2, COX3, 12S, et la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND5/ATP6 et la présence d’au moins une mutation dans le gène ND1 ou les patients Mitonaifs A/B classés intermédiaire avec la classification de l’ELN.
On entend par pronostic de survie « favorable », « intermédiaire » ou « défavorable » au sens de la présente invention, la graduation des hypothèses faites sur l’évolution de la pathologie sur la base des variants mitochondriaux (i.e. en termes de chances de survie, de risques de complications et/ou de décès).
Selon un mode de réalisation particulier d’un procédé selon la présente invention, les étapes de détection sont réalisées par séquençage haut débit (NGS) du génome mitochondrial.
La présente invention a encore pour objet, un procédé in vitro pour prévoir ou évaluer l’efficacité et/ou le bénéfice d’un traitement d’un cancer chimiosensible, en particulier d’une leucémie aiguë myéloïde (LAM), chez un patient atteint dudit cancer comprenant les étapes suivantes :
- détermination d’un pronostic de survie Mitoscore, Mitoscore+, Mitoscore B, Mitoscore B+, Mitoscore A/B, Mitoscore A/B+, Mitoscore B/A ou Mitoscore B/A+ selon un procédé selon la présente invention à partir d’un échantillon biologique dudit patient avant traitement ;
- détermination d’un pronostic de survie Mitoscore, Mitoscore+, Mitoscore B, Mitoscore B+, Mitoscore A/B, Mitoscore A/B+, Mitoscore B/A ou Mitoscore B/A+ selon un procédé selon la présente invention à partir d’un échantillon biologique dudit patient après traitement ;
- comparaison des pronostics de survie Mitoscore, Mitoscore+, Mitoscore B, Mitoscore B+, Mitoscore A/B, Mitoscore A/B+, Mitoscore B/A ou Mitoscore B/A+ avant et après traitement ;
- détermination soit d’une résistance au traitement lorsque le pronostic de survie dudit patient après traitement est identique ou plus mauvais que le pronostic de survie dudit patient avant traitement, soit d’une sensibilité au traitement lorsque le pronostic de survie dudit patient après traitement est meilleur que le pronostic de survie dudit patient avant traitement.
On entend par « cancer chimiosensible » au sens de la présente invention, une pathologie pouvant être traité par chimiothérapie (e.g. anthracyclines, antimétaboliques, alcaloïdes ou inhibiteurs de topoisomérase, seuls ou en association avec d’autres traitements) choisie par exemple dans le groupe constitué par les leucémies aiguës myéloïdes (LAM), les sarcomes, le cancer des testicules (des cellules germinales en général), les choriocarcinomes, les hémopathies, le cancer gynécologiques tels que le cancer des ovaires, et le cancer du sein, les cancers du poumon, les neuroblastomes, les tumeurs cérébrales malignes, les cancers digestifs, les cancers du pancréas, les cancers de la vessie, les cancers de la prostate, les cancers de la thyroïde, les cancers du foie, les cancers de la sphère ORL.
On entend par “pronostic de survie identique avant et après traitement” au sens de la présente invention, un pronostic de survie favorable, intermédiaire ou défavorable avant traitement qui demeure, respectivement, un pronostic de survie favorable, intermédiaire ou défavorable après traitement.
On entend par “pronostic de survie plus mauvais après traitement qu’avant traitement” au sens de la présente invention, par exemple, un pronostic de survie favorable ou intermédiaire avant traitement qui devient, respectivement, un pronostic intermédiaire ou défavorable après traitement.
On entend par « meilleur pronostic de survie après traitement qu’avant traitement » au sens de la présente invention, par exemple, un pronostic de survie intermédiaire ou défavorable avant traitement qui devient, respectivement, un pronostic de survie favorable ou intermédiaire après traitement.
Selon un mode de réalisation particulier du procédé de la présente invention, le traitement d’un cancer chimiosensible, en particulier d’une leucémie aiguë myéloïde, comprend l’administration de vénétoclax éventuellement en association avec une autre molécule (e.g. azacytidine).
Un programme informatique a été créé pour la mise en œuvre des procédés ci-dessus. Celui-ci analyse les variants à partir des données sources du séquenceur utilisé, les filtre en fonction des critères de qualité et de la localisation des variants dans les zones codantes, du taux d’hétéroplasmie et les mutations silencieuses. Le programme applique par la suite les Mitoscores de l’invention (Mitoscore / Mitoscore+ / Mitoscore B/ Mitoscore B+, Mitoscore B/A, Mitoscore B/A+, Mitoscore A/B, Mitoscore A/B+).
La présente invention a done encore pour objet un programme d’ordinateur comportant des instructions, qui lorsqu’elles sont exécutées par un ordinateur, conduisent celui-ci à mettre en œuvre les procédés décrits ci-dessus.
Ainsi la mise en œuvre des Mitoscores est réalisée grâce audit programme d’ordinateur développé pour analyser les séquences du génome mitochondrial.
La présente invention a également pour objet un support de données lisible par un ordinateur comportant des instructions qui lorsqu’elles sont exécutées par un ordinateur, conduisent celui-ci à mettre en œuvre un procédé tel que décrit ci- dessus. Dans un mode de réalisation, ledit support de données est non-transitoire.
La présente invention a encore pour objet, un procédé permettant de sélectionner, en fonction de leur statut pour un marqueur prédictif identifié par ce test, uniquement les patients chez lesquels le traitement est susceptible d’apporter un bénéfice parmi ceux diagnostiqués pour une maladie donnée et ainsi de prévoir l’addition de molécules/drogues ciblant la mitochondrie dans les cancers chimiosensibles, en particulier dans la leucémie aiguë myéloïde. Par exemple : les patients du groupe défavorable ou intermédiaire des Mitoscores présentant des mutations du gène 12S peuvent être traités par le peptide MOTS-c afin d’améliorer la réponse au traitement de référence ; les patients du groupe défavorable ou intermédiaire des Mitoscores présentant des mutations des gènes COX1 , COX2 ou COX3 peuvent être traités par quercétine ou par une drogue agissant sur le complexe IV afin d’améliorer la réponse au traitement ; les patients du groupe intermédiaire ou défavorable des Mitoscores peuvent bénéficier de thérapies ciblant les complexes I ou III de la chaîne respiratoire (e.g. Olaparib, Mubritinib, dichlorhydrate de trimétazidine, etc) en adjonction au traitement de référence.
La présente invention a donc pour objet l’utilisation d’un procédé selon la présente invention pour établir un Mitoscore chez un patient atteint d’un cancer chimiosensible comme test compagnon, en particulier un test compagnon à l’adjonction de molécules ciblant la mitochondrie.
BREVE DESCRIPTION DES FIGURES La Figure 1 représente le workflow technique réalisé pour l’application du Mitoscore et du Mitoscore+, définissant notamment les critères retenus pour la sélection des variants.
La Figure 2 représente les courbes de survie Kaplan-Meier (test log-rank p<0,05) représentant la survie globale en fonction du temps chez les patients atteints de LAM selon (A) le Mitoscore ou (B) le Mitoscore+.
La Figure 3 représente le Hazard Ratio (HR) (IC 95%) du risque de décès en fonction du Mitoscore et du Mitoscore+ calculé selon le modèle Cox en analyse univariée (UV) ou multivariée (MV). Les covariables utilisées dans l’analyse MV sont l’âge au diagnostic, le nombre de globules blancs (GB) en G/l, la classification ELN 2017 et/ou la greffe de moelle osseuse.
La Figure 4 représente les courbes de survie Kaplan-Meier (test log-rank p<0,05) représentant la survie globale en fonction du temps chez les patients atteints de LAM selon (A) le Mitoscore B contenant les gènes ND2/ND5/CYTB /ND4/ATP6/ ND1/CO3/12S ou (B) le Mitoscore B+ contenant les gènes ND2/ND5/CYTB /ND4/ATP6/ ND1/CO3/12S associé à l’ELN 2017 chez les patients Mitonaïfs pour les gènes préalablement cités.
La Figure 5 représente le Hazard Ratio (HR) (IC 95%) du risque de décès en fonction du Mitoscore B et du Mitoscore B+ calculé selon le modèle Cox en analyse univariée (UV) ou multivariée (MV). Les covariables utilisées dans l’analyse MV sont l’âge au diagnostic, le nombre de globules blancs (GB) en G/l, la classification ELN 2017 et/ou la greffe de moelle osseuse.
La Figure 6 est un schéma bloc représentant un ordinateur pour la mise en œuvre d’un procédé d’établissement de pronostic selon l’invention.
La Figure 7 représente les courbes de survie Kaplan-Meier (test log-rank p<0,05) représentant la survie globale en fonction du temps chez les patients atteints de LAM selon (A) le Mitoscore B/A ou (B) le Mitoscore B/A+ associé à l’ELN 2017 chez les patients Mitonaïfs B/A.
La Figure 8 représente les courbes de survie Kaplan-Meier (test log-rank p<0,05) représentant la survie globale en fonction du temps chez les patients atteints de LAM selon (A) le Mitoscore A/B ou (B) le Mitoscore A/B+ associé à l’ELN 2017 chez les patients Mitonaïfs A/B.
EXEMPLES EXEMPLE 1 : ELABORATION DE SCORES GENOTYPIQUES MITOCHONDRIAUX DANS LE CADRE DU PRONOSTIC DE LA LEUCEMIE AIGUE MYELOÏDE (LAM)
Résumé : les Inventeurs ont séquencé l’intégralité du génome mitochondrial par technologie de séquençage haut débit du génome mitochondrial (NGS) de patients atteints de LAM. A partir de ce séquençage, un score dénommé Mitoscore, a été défini qui a permis de prédire la survie des patients. L’intérêt du Mitoscore a été confirmé en analyse multivariée indépendamment des facteurs pronostics habituels des LAM (/.e. âge, nombre de globules blancs (GB) circulants, anomalies cytogénétiques et moléculaires, greffe). Par ailleurs, le Mitoscore a été caractérisé fonctionnellement par comparaison aux données d’émission de ROS avec et sans inhibiteurs de complexes mitochondriaux (antimycine A, Roténone).
Définition des variants retenus :
Le séquençage du génome mitochondrial a été effectué sur automate S5 (Ion Torrent) après une amplification par PCR du génome mitochondrial (2 fragments de 8 kDa). Le génome mitochondrial peut être réalisé avec d’autres technologies pour la synthèse des librairies, par exemple amplification par PCR du génome mitochondrial avec plus de 2 fragments ou récupération du produit de séquençage par capture. De plus, le séquençage sur séquenceur type technologie Illumina peut également être réalisé. L’analyse des variants a été réalisée via Mitomaster. Les variants touchant les régions non codantes (e.g. D-loop...), les taux d’hétéroplasmie strictement inférieurs à 2% et les mutations silencieuses ont été éliminées. Le site Mitomaster a défini un haplogroupe mitochondrial. Les variants présentant une fréquence dans l’haplogroupe <0,5% ou s’ils étaient décrits dans les cancers, ont été retenus. Les éventuelles erreurs de séquençage ont été vérifiées sur IGV ou ont été filtrées automatiquement par un programme bioinformatique. Pour les haplogroupes dont l’effectif est <100, la fréquence du variant a été vérifié dans gnomAD v3 et retenus si <0,5% ou si décrits dans les cancers (figure 1 ).
Elaboration des Mitoscores :
A partir des courbes de survie réalisées de manière individuelle par gène du génome mitochondrial chez les 64 patients de l’étude ayant reçu une chimiothérapie d’induction, certains gènes ont été déterminés comme étant de “bon pronostic” (ND2/ND3/ND4/ATP8/CYTB/ND5/ATP6) ou de “mauvais pronostic” (COX1/COX2/COX3/12S/ND1 ).
Malgré une bonne séparation des courbes de survie, aucune différence significative n’a été observée dans l’analyse univariée de ces gènes pris individuellement.
Par conséquent, les “Mitoscores” ont été créés, stratifiant les patients en 3 groupes de pronostique respectif favorable, intermédiaire, défavorable (figure 2A / figure 4A).
Cette classification pronostique basée sur le « Mitoscore » est indépendante des facteurs pronostiques habituels des LAM (âge, GB/I, ELN 2017, greffe de moelle osseuse).
Cependant, 30% des patients ne possédant aucune mutation dans l’ensemble des gènes du Mitoscore, i.e. patients du sous-groupe appelé Mitonaïf A, nécessitent une reclassification. Par conséquent, le Mitoscore+ a été créé en combinant la classification pronostique de l’ELN 2017 au Mitoscore chez les patients Mitonaïfs (figure 2B). Ceci permet une réduction de l’utilisation de la classification pronostique de l’ELN 2017 de l’ordre de 70%. 40% des patients ne possédant aucune mutation dans l’ensemble des gènes du Mitoscore B, i.e. patients du sous-groupe appelé Mitonaïf B, nécessitent une reclassification. Par conséquent, le Mitoscore B+ a été créé en combinant la classification pronostique de l’ELN 2017 au Mitoscore chez les patients Mitonaïfs (figure 4B). Ceci permet une réduction de l’utilisation de la classification pronostique de l’ELN 2017 de l’ordre de 60%.
L’intérêt du Mitoscore et du Mitoscore+ a été confirmé avec un modèle de Cox en analyse univariée (UV) indépendamment des facteurs pronostics habituels des LAM et en analyse multivariée (MV) (figure 3). Les covariables utilisées dans l’analyse MV ont été : l’âge, le nombre de globules blancs (GB) circulants en G/l, la classification ELN 2017, et/ou une greffe de moelle osseuse. De même, les mitoscore B/B+ sont significatifs en analyse multivariée (Figure 5).
De plus, le Mitoscore a été caractérisé fonctionnellement en comparant aux données d’émission de ROS. De manière intéressante, les cellules leucémiques des patients du sous-groupe Mitoscore « défavorable » émettent significativement moins de ROS en condition de stimulation par antimycine/roténone (ciblant les ROS mitochondriaux) que ceux du Mitoscore « favorable » et « intermédiaire » avec les mutations COX1 /COX2/COX3/12S et ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4.
Au sein des mitochondries, les complexes I et III de la chaîne respiratoire sont les principales sources d’émission d’espèces réactives de l’oxygène. Les gènes impliqués dans le Mitoscore « favorable » touchent des sous-unités des complexes I (ND2/ND3/ND4/ND5) et III (CYTB) ainsi que l’ATP synthase (ATP8/ATP6). Les données ROS confortent donc l’hypothèse de fonctionnement du Mitoscore « favorable » où les mutations affectent l’émission des ROS notamment en condition de stimulation telle qu’induite par la chimiothérapie. Ainsi la forte émission de ROS déclenche le seuil d’apoptose et entraine la mort cellulaire des cellules leucémiques.
Dans le sous-groupe Mitoscore « défavorable », moins de ROS sont émis. En effet, le complexe IV de la chaîne respiratoire codé par les gènes COX1 /COX2/COX3 n’est pas un site d’émission d’ions superoxide. Par ailleurs, le Mitochondrial-derived peptide MOTS-c codé par le gène 12S joue un rôle dans l’adaptation métabolique au stress.
Le Mitoscore+ a également été caractérisé fonctionnellement de la même façon que pour le Mitoscore. Dans le sous-groupe de patients appelé Mitonaïf, les patients dont les cellules leucémiques sont capables de produire plus de ROS en présence d’antimycine/roténone et de DPI (diphénylèneiodonium) présentent significativement une meilleure survie globale par rapport aux patients dont les cellules leucémiques produisent moins de ROS.
Définition des Mitoscore et Mitoscore B :
Le Mitoscore a permis de stratifier les 64 patients atteints de LAM en 3 groupes de pronostic en termes de survie globale sur la base des combinaisons de variants suivants :
Un Mitoscore « favorable » correspond à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4 ou d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB, et l’absence de mutations dans les gènes suivants COX1/COX2/COX3/12S.
Un Mitoscore « défavorable » correspond à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1/COX2/COX3/12S, et l’absence de mutations dans les gènes suivants ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4. Un Mitoscore « intermédiaire » correspond :
- soit à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4, et d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1/COX2/COX3/12S. Il s’agit du sous-groupe de patients appelé « intermédiaire muté » ; soit à l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4/COX1/COX2/COX3/12S. Il s’agit du sous-groupe de patients appelé « Mitonaïf A », correspondant à environ 30% des patients atteints de LAM. Tableau 2
Figure imgf000023_0001
Le Mitoscore B a également permis de stratifier les 64 patients atteints de LAM en 3 groupes de pronostic en termes de survie globale sur la base des combinaisons de variants suivants : Un Mitoscore « favorable » correspond également à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4, et l’absence de mutations dans les gènes suivants ND1/COX3/12S. Un Mitoscore « défavorable » correspond également à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND1/COX3/12S, et l’absence de mutations dans les gènes suivants ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4.
Un Mitoscore « intermédiaire » correspond également à :
- soit à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4, et d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND1/COX3/12S. Il s’agit du sous-groupe de patients appelé « intermédiaire muté » ;
- soit à l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ ND1/COX3/12S. Il s’agit du sous-groupe de patients appelé « Mitonaïf B », correspondant à environ 40% des patients atteints de LAM.
Tableau 3
Figure imgf000024_0001
Définition des Mitoscore+ et Mitoscore B+ :
Dans le sous-groupe de patients appelé Mitonaïf A du Mitoscore « intermédiaire », la stratification de l’ELN a été appliquée pour déterminer le Mitoscore+ qui a permis de reclasser ces 30% de patients atteints de LAM en 3 groupes de pronostic en termes de survie globale sur la base des combinaisons de variants suivants :
Un Mitoscore+ « favorable » correspond : - soit à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4 ou d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB, et l’absence de mutations dans les gènes suivants COX1/COX2/COX3/12S ; - soit aux patient Mitonaïfs A classés « favorable » selon le score ELN.
Un Mitoscore+ « défavorable » correspond :
- soit à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1/COX2/COX3/12S, et l’absence de mutations dans les gènes suivants ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4 ; - soit aux patients Mitonaïfs A classés « défavorable » selon le score ELN.
Le Mitoscore+ « intermédiaire » correspond :
- soit à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4, et d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1/COX2/COX3/12S ; - soit aux patients Mitonaïfs A classés « intermédiaire » selon le score ELN.
Tableau 4
Figure imgf000025_0001
Dans le sous-groupe de patients appelé Mitonaïf B du Mitoscore « intermédiaire », la stratification de l’ELN a également été appliquée pour déterminer le Mitoscore B+ qui a permis de reclasser ces 40% de patients atteints de LAM en 3 groupes de pronostic en termes de survie globale sur la base des combinaisons de variants suivants :
Un Mitoscore B+ « favorable » correspond :
- soit à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4, et l’absence de mutations dans les gènes suivants ND1/COX3/12S;
- soit aux patient Mitonaïfs B classés « favorable » selon le score ELN.
Un Mitoscore B+ « défavorable » correspond :
- soit à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND1/COX3/12S, et l’absence de mutations dans les gènes suivants N D2/N D5/ATP6/CYTB/N D4 ;
- soit aux patients Mitonaïfs B classés « défavorable » selon le score ELN.
Un Mitoscore B+ « intermédiaire » correspond :
- soit à la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4, et d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND1/COX3/12S;
- soit aux patients Mitonaïfs B classés « intermédiaire » selon le score ELN.
Tableau 5
Figure imgf000026_0001
Figure imgf000027_0001
Définition du Mitoscore B/A :
Le Mitoscore B/A a également permis de stratifier les 64 patients atteints de LAM en 3 groupes de pronostic en termes de survie globale sur la base des combinaisons de variants suivants :
Un Mitoscore B/A « favorable » correspond :
- soit à la présence d’au moins une mutation dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4, et l’absence de variant dans les gènes ND1/COX3/12S ; soit à l’absence de variant dans les gènes ND1/COX3/12S/ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/COX1/COX2, et la présence d’au moins une mutation dans les gènes ATP8/ND3.
Un Mitoscore B/A « défavorable » correspond :
- soit à la présence d’au moins une mutation dans les gènes ND1/COX3/12S, et l’absence de variant dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 ; soit à l’absence de variant dans les gènes ND1/COX3/12S/ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 /ATP8 /ND3, et la présence d’au moins une mutation dans les gènes COX1/COX2.
Un Mitoscore B/A « intermédiaire » correspond :
- soit à la présence d’au moins une mutation dans les gènes ND1/COX3/12S, et la présence d’au moins une mutation dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 ; soit à l’absence de variant dans les gènes ND1/COX3/12S/ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4, et la présence d’au moins une mutation dans les gènes COX1 ou COX2, et la présence d’au moins une mutation dans les gènes ATP8 et ND3 ; soit à l’absence de variant dans les gènes ND1 /COX3/12S/ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/COX1 /COX2/ATP8/ND3. Tableau 6
Figure imgf000028_0001
Définition du Mitoscore A/B :
Le Mitoscore A/B a permis de stratifier les 64 patients atteints de LAM en 3 groupes de pronostic en termes de survie globale sur la base des combinaisons de variants suivants :
Un Mitoscore A/B« favorable » correspond : - soit à la présence d’au moins une mutation dans les gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4, et l’absence de variant dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S ; soit à l’absence de variant dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S/ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4/ND1 , et la présence d’au moins une mutation dans les gènes ATP6/ND5.
Un Mitoscore A/B « défavorable » correspond :
- soit à la présence d’au moins une mutation dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S, et l’absence de variant dans les gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4 ; soit à l’absence de variant dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S/ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4/ATP6/ND5, et la présence d’au moins une mutation dans le gène ND1 .
Un Mitoscore A/B« intermédiaire » correspond :
- soit à la présence d’au moins une mutation dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S, et la présence d’au moins une mutation dans les gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4 ; soit à l’absence de variant dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S/ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4, et la présence d’au moins une mutation dans les gènes ATP6/ND5 et d’au moins une mutation dans le gène ND1 ; soit à l’absence de variant dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S/ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4/ATP6/ND5/ND1 .
Tableau 7
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0001
Définition du Mitoscore B/A +:
Le Mitoscore B/A + a également permis de stratifier les 64 patients atteints de LAM en 3 groupes de pronostic en termes de survie globale sur la base des combinaisons de variants suivants :
Un Mitoscore B/A+ « favorable » correspond :
- soit à la présence d’au moins un variant dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4, et l’absence de variant dans les gènes ND1/COX3/12S ; - soit à l’absence de variant dans les gènes ND1/COX3/12S/ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/COX1/COX2, et la présence d’au moins un variant dans les gènes ATP8/ND3 ; soit à l’absence de variant dans les gènes ND1/COX3/12S/ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/COX1/COX2/ATP8/ND3, et ELN favorable.
Un Mitoscore B/A+ « défavorable » correspond : - soit à la présence d’au moins un variant dans les gènes ND1/COX3/12S, et l’absence de variant dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 ; soit à l’absence de variant dans les gènes ND1/COX3/12S/ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 /ATP8 / ND3, et la présence d’au moins un variant dans les gènes COX1/COX2 ; soit à l’absence de variant dans les gènes ND1/COX3/12S/ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/COX1/COX2/ATP8/ND3, et ELN défavorable.
Un Mitoscore B/A+ « intermédiaire » correspond :
- soit à la présence d’au moins un variant dans les gènes ND1/COX3/12S, et la présence d’au moins un variant dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 ; soit à l’absence de variant dans les gènes ND1/COX3/12S/ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4, et la présence d’au moins un variant retenu dans les gènes COX1/COX2 et présence d’au moins un variant dans les gènes ATP8/ ND3 ; soit l’absence de variant dans les gènes ND1/COX3/12S/ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/COX1/COX2/ATP8/ND3, et ELN intermédiaire.
Tableau 8
Figure imgf000031_0001
Figure imgf000032_0001
Définition du Mitoscore A/B+ :
Le Mitoscore A/B+ a permis de stratifier les 64 patients atteints de LAM en 3 groupes de pronostic en termes de survie globale sur la base des combinaisons de variants suivants :
Un Mitoscore A/B+« favorable » correspond :
- soit à la présence d’au moins un variant dans les gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4, et l’absence de variant dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S ; - soit à l’absence de variant dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S/ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4/ND1 , et la présence d’au moins un variant dans les gènes ATP6/ND5 ; soit à l’absence de variant dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S/ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4/ATP6/ND5/ND1 , et ELN favorable.
Un Mitoscore A/B+ « défavorable » correspond :
- soit à la présence d’au moins un variant dans les gènes
COX1/COX2/COX3/12S, et l’absence de variant dans les gènes
ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4 ; soit à l’absence de variant dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S/ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4/ATP6/ND5, et la présence d’au moins un variant dans le gène ND1 ; soit à l’absence de variant dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S/ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4/ATP6/ND5/ND1 , et ELN défavorable.
Un Mitoscore A/B+« intermédiaire » correspond :
- soit à la présence d’au moins un variant dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S, et la présence d’au moins un variant dans les gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4 ; soit à l’absence de variant dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S/ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4, et la présence d’au moins un variant dans les gènes ATP6/ND5 et d’au moins un variant dans le gène ND1 ; soit à l’absence de variant dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S/ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4/ATP6/ND5/ND1 , et ELN intermédiaire.
Tableau 9
Figure imgf000033_0001
Figure imgf000034_0001
Les différents Mitoscores selon l’invention peuvent ainsi montrer leur efficacité afin de prédire la réponse aux traitements d’un cancer chimiosensible, par exemple utilisant le vénétoclax. Ainsi, ils permettent de définir la sensibilité à un traitement (e.g. au vénétoclax) dans l’indication leucémie aigue myéloide ainsi que dans les autres indications utilisant le traitement.
Définition des Mitoscores comme test compagnon :
Chez les patients intermédiaires et défavorables avec les Mitoscores, les Mitoscores selon l’invention peuvent permettre de modifier la prise en charge en combinaison avec la chimiothérapie en utilisant des drogues capables de : • cibler la communication entre les mitochondries et le noyau de la cellule leucémique en administrant le peptide MOTS-c chez les patients intermédiaires ou défavorables présentant une mutation dans le gène 12S
• cibler le complexe IV de la mitochondrie avec par exemple de la quercétine ou d’autres drogues chez les patients intermédiaires ou défavorables présentant une mutation dans l’un des gènes COX1 , COX2, COX3
• cibler les complexes I et III de la chaine respiratoire mitochondriale chez les patients intermédiaires ou défavorables via l’administration de drogues ciblant la mitochondrie par exemple l’olaparib, le mubritinib, le trimétazidine dichlorhydrate, le myxothiazol...
Ainsi les Mitoscores de l’invention peuvent servir de test compagnon pour améliorer la prise en charge des patients et définir d’éventuelles indications d’adjonction de thérapies / produits complémentaires ciblant la mitochondrie.
PROGRAMME INFORMATIQUE POUR LA MISE EN ŒUVRE DES SCORES GENOTYPIQUES MITOCHONDRIAUX
Un programme informatique a été créé pour la mise en œuvre des scores ci- dessus afin de pouvoir évaluer l’efficacité d’un traitement thérapeutique, par exemple au vénétoclax, vis-à-vis d’un cancer chimiosensible, en particulier d’une LAM. Ledit programme analyse les variants à partir des données sources du séquenceur utilisé, les filtre en fonction des critères de qualité et de la localisation des variants dans les zones codantes, du taux d’hétéroplasmie et des mutations silencieuses. Le programme applique par la suite les Mitoscores (Mitoscore / Mitoscore+, Mitoscore B / Mitoscore B+, Mitoscore B/A, Mitoscore B/A+, Mitoscore A/B, Mitoscore A/B+).
La figure 6 est un diagramme blocs d’un dispositif 600 configuré pour mettre en œuvre les étapes d’un procédé pour établir un pronostic de survie chez un patient atteint d’un cancer chimiosensible, tel que décrit ci-dessus. Le dispositif comprend un processeur 601 , une mémoire volatile 602, une mémoire non-volatile 603, cette dernière comportant des instructions 604 qui, lorsqu’elles sont exécutées par le processeur 601 , conduisent le dispositif 600 à mettre en œuvre les étapes mentionnées ci-dessus pour établir un pronostic de survie chez un patient atteint d’un cancer chimiosensible. Les différentes composantes sont reliées par un bus de communication 605. Le dispositif peut comporter d’autres composantes ou des interfaces 606 vers d’autres composantes, selon l’implémentation, notamment une interface utilisateur. Le processeur 601 peut prendre une forme adaptée quelconque - un ou plusieurs microprocesseurs, un ou plusieurs microcontrôleurs, ou une combinaison de ceux-ci. La mémoire volatile 602 est utilisée pour un stockage temporaire de données. La mémoire non-volatile 603 peut comprendre un disque dur, une mémoire statique ou une autre forme de stockage longue durée. La mémoire non-volatile stocke les instructions de mise en œuvre, elle peut également stocker un système d’exploitation et/ou des applications. Le dispositif 600 est par exemple un ordinateur dans lequel est chargé ou téléchargé un programme d’ordinateur qui comporte les instructions 604.
Les différents Mitoscores selon l’invention peuvent ainsi montrer leur efficacité afin de prédire la réponse aux traitements utilisant le vénétoclax. Par exemple, ils permettent de définir la sensibilité au vénétoclax dans l’indication Leucémie aigue myéloide ainsi que dans les autres indications utilisant le traitement.
Liste des références
1 . Dohner et al., Blood, 129(4) :424-447, 2017
2. Herold et al, Leukemia., 34(12):3161 -3172, 2020 3. Dohner et al., Blood, 140(12) : 1345-1377, 2022
4. Farge et al., Cancer discov., 7(7) :716-735, 2017
5. Mondet et al, Hematologica, 104(9):e393-e397, 2019
6. Bosc et al., Nat. Cancer., 2(11 ) : 1204-1223, 2021
7. Neuzil et al., Mitochondrion, 13(3) : 199-208, 2013 8. Damm et al., Leukemia, 26 : 289-295, 2012
9. Chun et al., Chin. J. Hematol., 35(8) : 708-712, 2014
10. Wu et al., Scientific reports, 8 : 13301 , 2018
11 . Caudron-Herger et Diederichs, Biology, 15 : 62-69, 2018
12. Zeng et al., Scientific reports, 8 : 3623, 2018 13. Silkjaer et al., Eur. J. Haematol., 90(5): 385-396, 2013
14. Silkjaer et al., Eur. J. Haematol., 91(4): 295-303, 2013

Claims

36 REVENDICATIONS
1 . Procédé in vitro pour établir un pronostic de survie chez un patient atteint d’un cancer chimiosensible, ledit procédé comprenant les étapes suivantes :
- détection dans un échantillon biologique dudit patient, de la présence et/ou l’absence d’au moins une mutation sur l’un des neuf gènes du génome mitochondrial suivants : ND1 , ND2, ND3, ND4, ND5, CYTB, ATP8, ATP6, COX1 , COX2, COX3 et 12S ;
- comparaison des résultats de détection par rapport à un échantillon biologique de référence ou une séquence de référence ou un haplogroupe/haplotype de référence ;
- établissement du pronostic de survie dudit patient.
2. Procédé selon la revendication 1 , où :
- la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4 et l’absence de mutations dans les gènes COX1 , COX2, COX3, 12S, est l’indication d’un pronostic de survie favorable ;
- la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1 , COX2, COX3, 12S et l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, est l’indication d’un pronostic de survie défavorable ; et
- soit l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, COX1 , COX2, COX3, 12S (patients Mitonaïf A), soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4 et d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1 , COX2, COX, 12S, est l’indication d’un pronostic de survie intermédiaire.
3. Procédé selon la revendication 1 , où : la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4, et l’absence de mutations dans les gènes suivants ND1/COX3/12S, est l’indication d’un pronostic de survie favorable ;
- la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND1/COX3/12S, et l’absence de mutations dans les gènes suivants ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4, est l’indication d’un pronostic de survie défavorable ; et 37
- soit l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ ND1/COX3/12S (patients Mitonaïf B), soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 et d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND1/COX3/12S, est l’indication d’un pronostic de survie intermédiaire.
4. Procédé selon l’une quelconque des revendications 2 ou 3, où le procédé comprend en outre la détermination du score pronostique ELN dans le sous-groupe de patients Mitonaif A ou Mitonaif B.
5. Procédé selon la revendication 4, où :
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4 et l’absence de mutations dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, COX1 , COX2, COX3, 12S et un classement « favorable » selon le score ELN, est l’indication d’un pronostic de survie favorable ;
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1 /COX2/COX3/12S et l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, COX1 , COX2, COX3, 12S et un classement « défavorable » selon le score ELN, est l’indication d’un pronostic de survie défavorable ;
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4 et d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1/COX2/COX3/12S, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND3, ATP8, CYTB, ND4, COX1 , COX2, COX3, 12S et un classement « intermédiaire » selon le score ELN, est l’indication d’un pronostic de survie intermédiaire.
6. Procédé selon la revendication 4, où :
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 et l’absence de mutations dans les gènes suivants ND1/COX3/12S, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND5, ATP6, CYTB, ND4, ND1 , COX3, 12S et un classement « favorable » selon le score ELN, est l’indication d’un pronostic de survie favorable ; - soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND1/COX3/12S et l’absence de mutations dans les gènes suivants ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND5, ATP6, CYTB, ND4, ND1 , COX3, 12S et un classement « défavorable » selon le score ELN, est l’indication d’un pronostic de survie défavorable ;
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 et d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND1/COX3/12S, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2, ND5, ATP6, CYTB, ND4, ND1 , COX3, 12S et un classement « intermédiaire » selon le score ELN, est l’indication d’un pronostic de survie intermédiaire.
7. Procédé selon la revendication 1 , où :
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 et l’absence de mutations dans les gènes ND1/COX3/12S, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ND1/COX3/12S et la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND3/ATP8 et l’absence de mutations dans les gènes COX1/COX2, est l’indication d’un pronostic de survie favorable ;
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND1/COX3/12S et l’absence de mutations dans les gènes suivants ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ ND1/COX3/12S et la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1/COX2 et l’absence de mutations dans les gènes ND3/ATP8, est l’indication d’un pronostic de survie défavorable ;
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes
ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 et d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND1/COX3/12S, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ND1/COX3/12S et la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1/COX2 et la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND3/ATP8, soit l’absence de mutations dans les gènes N D2/N D5/ATP6/CYTB/N D4/N D 1 /COX3/12S/COX1 /COX2/N D3/ATP8 (patients
Mitonaïfs B/A), est l’indication d’un pronostic de survie intermédiaire.
8. Procédé selon la revendication 1 , où : - soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4 et l’absence de mutations dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S, soit l’absence de mutations dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S/ND2/ND3/ATP8/ CYTB/ND4 mais la présence d’un moins une mutation dans l’un des gènes ATP6/ND5 et l’absence de mutations dans le gène ND1 , est l’indication d’un pronostic de survie favorable ;
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1 /COX2/COX3/12S et l’absence de mutation dans les gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4, soit l’absence de mutations dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S/ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4 mais la présence d’un moins une mutation dans le gène ND1 et l’absence de mutations dans les gènes ATP6/ND5, est l’indication d’un pronostic de survie défavorable ;
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND3/ATP8/
CYTB/ND4 et d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1/COX2/COX3/12S, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4/COX1/COX2/COX3/12S et la présence d’au moins une mutation dans les gènes ND5/ATP6 et la présence d’au moins une mutation dans le gène ND1 , soit l’absence de mutations dans les gènes N D2/N D3/ATP8/CYTB/N D4/COX1 /COX2/COX3/12S/N D5/ATP6/N D 1 (patients
Mitonaifs A/B), est l’indication d’un pronostic de survie intermédiaire.
9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, où le procédé comprend en outre la détermination du score pronostique ELN dans le sous-groupe de patients Mitonaïfs B/A ou Mitonaïfs A/B.
10. Procédé selon la revendication 9, où:
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4, et l’absence de mutations dans les gènes ND1/COX3/12S, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ND1/COX3/12S et la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND3/ATP8 et l’absence de mutations dans les gènes COX1/COX2 soit les patients Mitonaifs B/A classés favorable avec la classification de l’ELN, est l’indication d’un pronostic de survie favorable ; - soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND1/COX3/12S, et l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ND1/COX3/12S et la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1/COX2 et l’absence de mutations dans les gènes ND3/ATP8 soit les patients Mitonaifs B/A classés défavorable avec la classification de l’ELN, est l’indication d’un pronostic de survie défavorable ;
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4 et d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND1/COX3/12S soit l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND5/ATP6/CYTB/ND4/ND1/COX3/12S et la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1/COX2 et la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND3/ATP8 soit les Mitonaïfs B/A classés intermédiaire avec la classification de l’ELN, est l’indication d’un pronostic intermédiaire.
11 . Procédé selon la revendication 9, où:
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ ND4 et l’absence de mutations dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S, soit l’absence de mutations dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S/ND2/ND3/ATP8/ CYTB/ND4 mais la présence d’un moins une mutation dans l’un des gènes ATP6/ND5 et l’absence de mutations dans le gène ND1 soit les patients Mitonaifs A/B classés favorable avec la classification de l’ELN, est l’indication d’un pronostic de survie favorable ; soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1 /COX2/COX3/12S et l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4, soit l’absence de mutations dans les gènes COX1/COX2/COX3/12S/ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4 mais la présence d’un moins une mutation dans le gène ND1 et l’absence de mutations dans les gènes ATP6/ND5 soit les patients Mitonaifs A/B classés défavorable avec la classification de l’ELN, est l’indication d’un pronostic de survie défavorable ;
- soit la présence d’au moins une mutation dans l’un des gènes ND2/ND3/ATP8/ CYTB/ND4 et d’au moins une mutation dans l’un des gènes COX1/COX2/COX3/12S, soit l’absence de mutations dans les gènes ND2/ND3/ATP8/CYTB/ND4/COX1/COX2/COX3/12S, et la présence d’au moins 41 une mutation des gènes ND5/ATP6 et la présence d’au moins une mutation dans le gène ND1 soit les patients Mitonaifs A/B classés intermédiaire avec la classification de l’ELN, est l’indication d’un pronostic de survie intermédiaire.
12. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 11 , où les étapes de détection sont réalisées par séquençage haut débit du génome mitochondrial.
13. Procédé in vitro pour prévoir ou évaluer l’efficacité et/ou le bénéfice d’un traitement d’un cancer chimiosensible chez un patient atteint dudit cancer comprenant les étapes suivantes :
- détermination d’un pronostic de survie selon un procédé tel que défini selon l’une quelconque des revendications 1 à 12 à partir d’un échantillon biologique dudit patient avant traitement ;
- détermination d’un pronostic de survie selon un procédé tel que défini selon l’une quelconque des revendications 1 à 12 à partir d’un échantillon biologique dudit patient après traitement ;
- comparaison des pronostics de survie avant et après traitement ;
- détermination soit d’une résistance au traitement lorsque le pronostic de survie dudit patient après traitement est identique ou plus mauvais que le pronostic de survie dudit patient avant traitement, soit d’une sensibilité au traitement lorsque le pronostic de survie dudit patient après traitement est meilleur que le pronostic de survie dudit patient avant traitement.
14. Procédé selon la revendication 13, où le traitement d’un cancer chimiosensible est un traitement au vénétoclax.
15. Procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 14, où le cancer chimiosensible est choisi dans le groupe constitué des leucémies aiguës myéloïdes (LAM), les sarcomes, le cancer des testicules, les choriocarcinomes, les hémopathies, les cancers gynécologiques, les cancers du poumon, les neuroblastomes, les tumeurs cérébrales malignes, les cancers digestifs, les cancers du pancréas, les cancers de la vessie, les cancers de la prostate, les cancers de la thyroïde, les cancers du foie, les cancers de la sphère ORL. 42
16. Programme d’ordinateur comportant des instructions, qui lorsque le programme est exécuté par un ordinateur, conduisent celui-ci à mettre en œuvre un procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 15.
17. Support de données lisible par un ordinateur comportant des instructions, qui lorsqu’elles sont exécutées par un ordinateur, conduisent celui-ci à mettre en œuvre un procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 15.
18. Utilisation d’un procédé selon l’une quelconque des revendications 1 à 15, comme test compagnon.
PCT/FR2022/052098 2021-11-16 2022-11-16 Scores genotypiques mitochondriaux : marqueurs pronostiques dans un cancer chimiosensible WO2023089268A1 (fr)

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