WO2023063564A1 - Pcaf 억제제를 포함하는 혈관 석회화 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 - Google Patents

Pcaf 억제제를 포함하는 혈관 석회화 예방 또는 치료용 약제학적 조성물 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular calcification comprising a pCAF inhibitor, and more particularly, to a pCAF protein activity inhibitor or a pCAF protein-encoding gene expression inhibitor for treatment or diagnosis of vascular calcification, And it relates to a screening method for a substance for inhibiting vascular calcification.
  • Vascular calcification refers to the deposition of minerals such as calcium phosphate in bones and soft tissues. Calcification in soft tissues such as blood vessels, kidneys, brain, heart, lungs, etc. is referred to as ectopic calcification, and exhibits the characteristics of pathological diseases, unlike normal calcified areas such as bones and teeth.
  • Extensive vascular calcification including coronary arteries, is commonly observed in patients with chronic kidney disease.
  • Traditional risk factors such as hypertension, diabetes, dyslipidemia, aging, and smoking affect the occurrence of vascular calcification, and it is largely classified into two types: atherosclerotic calcification and medial artery calcification. .
  • vascular calcification occurs in the vascular smooth muscle cells constituting the medial artery.
  • drugs such as phosphate binders, active vitamin D analogs, and calcium analogs have been developed and used to control vascular calcification, but their therapeutic effects are insignificant, and vascular calcification is still present in patients with chronic kidney disease. appearing frequently.
  • Vascular calcification is associated with cardiovascular disease, and cardiovascular disease is currently one of the diseases with a very high mortality rate. Therefore, for more effective treatment of vascular calcification, it is necessary to find a new mechanism involved in the occurrence of vascular calcification.
  • pCAF P300/CBP-associated fatcor
  • lysine acetyltransferase 2B is involved in acetylation of histone and non-histone proteins, and activates and promotes gene and protein expression.
  • histone acetyltransferase is excessively activated to overacetylate histones and target proteins, it is known to be involved in inducing not only cancer but also degenerative brain diseases such as Alzheimer's and epilepsy, chronic renal failure, and various other diseases.
  • pCAF acts as a transcription factor involved in atherosclerosis and restenosis after stenting in vascular tissue, but there is no report on the mechanism of vascular calcification and the possibility of preventing and treating vascular calcification using it.
  • the inventors of the present invention found a new role of pCAF (P300/CBP-associated fatcor) acting in the process of inducing vascular calcification, and determined that a pCAF inhibitor using the pCAF inhibitor could be used as a preventive and therapeutic agent for vascular calcification, and completed the present invention.
  • pCAF P300/CBP-associated fatcor
  • an object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular calcification, comprising a pCAF protein activity inhibitor or a pCAF protein-encoding gene expression inhibitor.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for diagnosing vascular calcification comprising an agent capable of measuring the activity level of the pCAF protein or the expression level of a gene encoding the pCAF protein.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for diagnosing vascular calcification including an agent capable of measuring the activity level of the pCAF protein or the expression level of a gene encoding the pCAF protein.
  • Another object of the present invention is to determine that the incidence of vascular calcification in the test subject is high when at least one of the activity of the pCAF protein and the expression of a gene encoding the pCAF protein in a sample isolated from the test subject is increased compared to a normal subject. It is an object of the present invention to provide an information providing method for diagnosing vascular calcification including a judgment step of determining.
  • Another object of the present invention relates to a screening method for a substance for inhibiting vascular calcification comprising the following steps:
  • Another object of the present invention relates to the use of an inhibitor of pCAF protein activity or expression of a gene encoding the pCAF protein to prevent or treat vascular calcification.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular calcification containing a pCAF inhibitor, and the pCAF inhibitor according to the present invention can be used as a preventive and therapeutic agent for vascular calcification.
  • the present inventors confirmed that the pattern of vascular calcification changes according to the activation and inhibition of the pCAF protein, and based on this, vascular calcification can be prevented or treated by inhibiting the activity of the pCAF protein or the expression of a gene encoding the pCAF protein. found
  • One aspect of the present invention is a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular calcification comprising a pCAF protein activity inhibitor or a pCAF protein-encoding gene expression inhibitor.
  • the pCAF protein activity inhibitor is at least one selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics, aptamers, antibodies, and natural products that specifically bind to the pCAF protein, preventing vascular calcification or It may be a pharmaceutical composition for treatment.
  • the compound may be L-moses.
  • Garcinol and Isothiazolones are substances that act as histone acetylase p300 and pCAF inhibitors, and Compound 1, Compound 2 and Compound 3 have been reported as pCAF inhibitors, but act as non-selective pCAF inhibitors.
  • L-moses is the only pCAF-selective protein activity inhibitor reported so far.
  • the expression inhibitor of the gene encoding the pCAF protein is at least one selected from the group consisting of antisense nucleotides, siRNA (small interfering RNA) and shRNA (short hairpin RNA) that complementarily bind to the mRNA of the gene. it could be
  • the siRNA may be a siRNA pair consisting of a nucleotide pair represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2, but is not limited thereto.
  • compositions for diagnosing vascular calcification comprising an agent capable of measuring the activity level of pCAF protein or the expression level of a gene encoding the pCAF protein.
  • the agent capable of measuring the activity level of the pCAF protein is one or more selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics, aptamers, antibodies, and natural products that specifically bind to the pCAF protein.
  • the agent capable of measuring the expression level of the gene encoding the pCAF protein may be at least one selected from the group consisting of primers and probes that complementarily bind to the mRNA of the gene.
  • kits for diagnosing vascular calcification including an agent capable of measuring the activity level of pCAF protein or the expression level of a gene encoding the pCAF protein.
  • the agent capable of measuring the activity level of the pCAF protein is one or more selected from the group consisting of compounds, peptides, peptide mimetics, aptamers, antibodies, and natural products that specifically bind to the pCAF protein.
  • the agent capable of measuring the expression level of the gene encoding the pCAF protein may be at least one selected from the group consisting of primers and probes that complementarily bind to the mRNA of the gene.
  • Another aspect of the present invention is that when the activity of the pCAF protein and the expression of the gene encoding the pCAF protein increase in a sample isolated from the test subject compared to a normal subject, the incidence of vascular calcification in the test subject is high. It is an information providing method for diagnosing vascular calcification including a judgment step of determining.
  • Another aspect of the present invention is a screening method for a substance for inhibiting vascular calcification comprising the following steps:
  • the cells may be vascular smooth muscle cells.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a pCAF inhibitor for preventing or treating vascular calcification, and the inhibitor of the activity of the pCAF protein and the expression of a gene encoding the pCAF protein can be used as a preventive or therapeutic agent for vascular calcification.
  • FIG. 1 is a Western blot photograph confirming the pCAF expression level in a vascular calcification model according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a graph of calcium assay results by overexpression of pCAF in a vascular calcification model according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph of calcium analysis results by treatment of pCAF siRNA in a vascular calcification model according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a photograph of Alizarin red S staining showing the degree of vascular calcification by treatment with pCAF siRNA in a vascular calcification model according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 5 is a graph showing pCAF activity by L-moses treatment in a vascular calcification model prepared by treatment with high-concentration inorganic phosphoric acid according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 is a graph of calcium analysis results by L-moses treatment in a vascular calcification model prepared by treatment with high-concentration inorganic phosphoric acid according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 7 is a photograph of alizarin red S staining showing the degree of vascular calcification by L-moses treatment in a vascular calcification model prepared by treatment with high-concentration inorganic phosphoric acid according to an embodiment of the present invention.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular calcification comprising a pCAF protein activity inhibitor or a pCAF protein-encoding gene expression inhibitor.
  • % used to indicate the concentration of a particular substance is (weight/weight)% for solids/solids, (weight/volume)% for solids/liquids, and liquid/liquid is (volume/volume) %.
  • Example 1 Fabrication of vascular calcification model
  • the isolated vascular smooth muscle cells were cultured using Dulbecco's modified Eagle's medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) as a normal medium as a control.
  • FBS fetal bovine serum
  • vascular smooth muscle cells were treated with 2 to 5 mM Inorganic Phosphorus (Pi) for 2 to 6 days in the same general medium and cultured. Both the experimental group and the control group replaced the medium every 2 days to prevent vascular calcification. model was built.
  • vascular smooth muscle cells using typsin-EDTA After harvesting vascular smooth muscle cells using typsin-EDTA from a vascular calcification model in which the vascular smooth muscle cells isolated in Example 1 were treated with 2 mM inorganic phosphoric acid for 3 or 6 days, 1% NP-40 buffer (150 mM NaCl , 1% NP-40, 50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, protease inhibitor) was added and reacted for 30 minutes by sonication. After centrifugation at 13,000 rpm for 15 minutes, the supernatant was recovered, and protein was quantified using a kit (BCA protein assay kit).
  • BCA protein assay kit BCA protein assay kit
  • Example 3 Confirmation of the degree of vascular calcification by controlling the expression level of pCAF
  • pCAF overexpression vector To overexpress pCAF in vascular smooth muscle cells, a pCAF overexpression vector was purchased from Edgene (addgene #8941) and used. Specifically, the pCI-Flag pCAF vector, which is a pCAF overexpression vector, was prepared by inserting the coding region sequence of the human pCAF gene and the Flag tag sequence into the pCI vector (Promega) by genetic recombination.
  • transfection was performed with the pCI-Flag pCAF overexpression vector using lipofectamine LTX (ThermoFisher). The next day, the medium containing 10% FBS was replaced, and the experimental group was treated with 4 mM inorganic phosphoric acid for 3 days, and the medium was changed once every 2 days.
  • siRNA oligomer (si-pCAF) targeting pCAF to suppress expression of pCAF and a control pCAF non-specific scramble oligomer were prepared and purchased from Bioneer. Since siRNA was tested in vascular smooth muscle cells extracted from rats, it was designed as a double strand targeting the rat (Rattus Norvegicus) pCAF gene.
  • sequence number designation order One pCAF siRNA sense 5'-GGGUAUCGAACUUGUGUUA-3' 2 pCAF siRNA antisense 5'-UAACACAAGUUCGAUACCC-3'
  • vascular smooth muscle cells scramble oligomer, pCAF siRNA, and lipofectamine RNAiMAX (ThermoFisher) reagent were used to knock down pCAF at each concentration (50 and 100 nM), and the next day, medium containing 10% fetal bovine serum After replacement, 4 mM inorganic phosphoric acid was treated for 3 days.
  • the amount of calcium stored in the cells was checked in the same manner as in Example 3-1.
  • vascular smooth muscle cells in which pCAF was knocked down using Lipofectamine RNAiMAX reagent and 50 and 100 nM pCAF siRNA, respectively, were treated with 4 mM inorganic phosphate for 3 days. After removing the medium, the cells were rinsed once with PBS, and then added with 10% formalin and fixed at room temperature for 1 hour, then the formalin was removed, rinsed three times with PBS, and the cells were slightly dried. Then, 40 mM alizarin red S (pH 4.2) dye was added and reacted for 20 minutes. After staining, the cells were washed with tertiary distilled water to remove non-specifically stained cells.
  • vascular calcification increased by treatment with high-concentration inorganic phosphoric acid was blocked by treatment with pCAF siRNA.
  • Example 1 The vascular smooth muscle cells isolated in Example 1 were treated with 5 mM inorganic phosphoric acid for 2 days and then treated with 10 nM L-moses (TOCRIS), a pCAF activity inhibitor, for 24 hours, and then 700 ⁇ l of 1% NP-40 buffer was added and sonicated. and reacted on ice for 30 min. After centrifugation at 13,000 rpm for 15 minutes, the supernatant was collected, and the amount of protein was quantified using a kit (BCA protein assay kit). Of these, 1 mg was taken and immunized with pCAF antibody in a refrigerated state overnight. A sedimentation reaction was performed.
  • TOCRIS 10 nM L-moses
  • A/G beads were added and reacted in a refrigerated state for 1 hour, washed three times with 1% NP-40 buffer, and then pCAF activity was measured using a kit (Histone Acetyltransferase Activity Assay kit).
  • Vascular smooth muscle cells were prepared in the same manner as in Example 4-1, but L-moses were treated with 10 and 30 nM, respectively, to confirm changes in calcium accumulation.
  • Vascular smooth muscle cells were prepared in the same manner as in Example 4-1, but L-moses were treated with 10, 30, and 100 nM, respectively, to confirm changes in calcium accumulation.
  • vascular calcification increased by treatment with high-concentration inorganic phosphoric acid was reduced in a concentration-dependent manner by treatment with L-moses, an inhibitor of pCAF activity.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating vascular calcification comprising a pCAF inhibitor, and more particularly, to a pCAF protein activity inhibitor or a pCAF protein-encoding gene expression inhibitor for treatment or diagnosis of vascular calcification, And it relates to a screening method for a substance for inhibiting vascular calcification.

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Abstract

본 발명은 pCAF 억제제를 포함하는 혈관 석회화 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 상기 pCAF 단백질의 활성, 및 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제제는 혈관 석회화 예방 및 치료제로써 활용할 수 있다.

Description

PCAF 억제제를 포함하는 혈관 석회화 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
본 특허출원은 2021년 10월 12일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2021-0135117호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 pCAF 억제제를 포함하는 혈관 석회화 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 pCAF 단백질 활성 억제제 또는 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제제를 이용한 혈관 석회화의 치료, 또는 진단 방법, 및 혈관 석회화 억제용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
혈관 석회화는 뼈와 연조직에 인산 칼슘과 같은 무기질이 침착되는 현상을 말한다. 혈관, 신장, 뇌, 심장, 폐 등 연조직에서의 석회화는 비정상부위 석회화 (ectopic calcification)라 하고, 뼈나 치아와 같은 정상적으로 석회화되는 부위와는 다르게 병적인 질환의 특징을 나타낸다.
관상동맥을 포함한 광범위한 혈관 석회화는 만성신장병 환자에서 흔히 관찰된다. 전통적인 위험 요인인 고혈압, 당뇨, 이상지질혈증, 고령화, 그리고 흡연 등이 혈관석회화 발생에 영향을 미치며, 크게는 죽상경화성 석회화(atherosclerotic calcification) 및 내측동맥 석회화(medial artery calcification)의 두 종류로 분류된다.
만성신장병 환자의 경우 신장 기능 저하로 인하여 칼슘-인 결합체 농도가 상승되어 있다. 이러한 현상이 지속될 경우 내측동맥을 구성하는 혈관 평활근 세포에 혈관 석회화가 발생하게 된다. 혈관 석회화를 조절하기 위해 인산염 결합제(phosphate binder), 활성 비타민 D 유사체(active vitamin D analog), 칼슘 유사체(calcimimetics) 등 여러 약제들이 개발되어 사용되고 있지만 치료 효과는 미비하며 만성신장병 환자에게서 혈관 석회화는 여전히 흔하게 나타나고 있다.
이러한 혈관 석회화의 발병기전에는 여러 요소들이 영향을 미칠 수 있다. 혈관 석회화는 심혈관질환과 연관되어 있으며, 심혈관 질환은 현재 사망률이 매우 높은 질환 중 하나이다. 따라서 보다 더 효과적인 혈관석회화 치료를 위해서는 혈관 석회화 발생에 관여하는 새로운 기전을 찾을 필요가 있다.
pCAF(P300/CBP-associated fatcor)는 라이신 아세틸트랜스퍼라이제 2B로 알려져 있으며, 히스톤 및 비히스톤 단백질의 아세틸화에 관여하고 있으며, 유전자 및 단백질 발현을 활성화 및 촉진시킨다. 그러나 히스톤 아세틸트랜스퍼라아제가 과도하게 활성화되어 히스톤 및 표적단백질을 과아세틸화시키게 되면, 암 유발 뿐 아니라 알츠하이머, 간질과 같은 퇴행성 뇌질환, 만성 신부전 및 다양한 질환 유발에 관여한다고 알려져 있다.
한편, 혈관 조직에서 pCAF가 죽상경화증과 스텐트 시술 후 재발협착증에 관여하는 전사인자로 작용한다는 보고가 있었으나, 혈관 석회화 기전 및 이를 이용한 혈관 석회화 예방 및 치료 가능성에 대해 보고된 바는 없다.
이에 본 발명자들은 혈관 석회화 유발 과정에 작용하는 pCAF(P300/CBP-associated fatcor)의 새로운 역할을 찾고 이를 이용한 pCAF 억제제를 통해 혈관 석회화 예방 및 치료제로써 활용할 수 있을 것으로 판단하여 본 발명을 완성하게 되었다.
이에, 본 발명의 목적은 pCAF 단백질의 활성 억제제 또는 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제제를 포함하는 혈관 석회화 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 pCAF 단백질의 활성 수준 또는 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 혈관 석회화 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 pCAF 단백질의 활성 수준 또는 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 혈관 석회화 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 시험 개체로부터 분리된 시료에서 pCAF 단백질의 활성, 및 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 중 1종 이상의 수치가 정상 개체 대비 증가하는 경우, 시험 개체의 혈관 석회화 발병도가 높을 것으로 판단하는 것인 판단 단계를 포함하는 혈관 석회화의 진단을 위한 정보 제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 다음 단계를 포함하는 혈관 석회화 억제용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다:
혈관 석회화가 유도된 분리된 세포에 후보 물질을 접촉시키는 접촉 단계; 및
상기 세포에서 후보 물질을 접촉시키지 않은 대조군 세포에 대비하여 pCAF 단백질의 활성, 및 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 중 1종 이상의 수치가 감소하는 경우, 상기 후보 물질을 혈관 석회화 억제용 물질로 판단하는 판단 단계.
본 발명의 또 다른 목적은 pCAF 단백질 활성 또는 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제제의 혈관 석회화 예방 또는 치료 용도에 관한 것이다.
본 발명은 pCAF 억제제를 포함하는 혈관 석회화 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명에 따른 pCAF 억제제는 혈관 석회화 예방 및 치료제로써 활용할 수 있다.
본 발명자들은 pCAF 단백질의 활성화 및 억제에 따라 혈관 석회화를 나타내는 양상이 변화하는 것을 확인하였고, 이에 근거하여 pCAF 단백질의 활성 또는 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제함으로써 혈관 석회화를 예방 또는 치료할 수 있음을 발견하였다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명의 일 양태는 pCAF 단백질의 활성 억제제 또는 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제제를 포함하는 혈관 석회화 예방 또는 치료용 약제학적 조성물이다.
본 발명에 있어서 상기 pCAF 단백질의 활성 억제제는 pCAF 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 혈관 석회화 예방 또는 치료용 약제학적 조성물인 것일 수 있다.
상기 화합물은 L-moses인 것일 수 있다. 가르시놀(Galcinol)과 이소시아졸론(Isothiazolones)은 히스톤 아세틸라아제 p300와 pCAF 억제제로 작용하는 물질이며 Compound 1, Compound 2와 Compound 3는 pCAF 억제제로 보고되었으나, 비선택적 pCAF 억제제로 작용한다. 현재까지 보고된 pCAF 선택적 단백질 활성 억제제로는 L-moses가 유일하게 적용 가능하다.
본 발명에 있어서 상기 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제제는 상기 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA(small interfering RNA) 및 shRNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
상기 siRNA는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 쌍으로 이루어진 siRNA 쌍인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태는 pCAF 단백질의 활성 수준 또는 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 혈관 석회화 진단용 조성물이다.
본 발명에 있어서 상기 pCAF 단백질의 활성 수준을 측정할 수 있는 제제는 pCAF 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 프라이머 및 프로브로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 pCAF 단백질의 활성 수준 또는 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 혈관 석회화 진단용 키트이다.
본 발명에 있어서 상기 pCAF 단백질의 활성 수준을 측정할 수 있는 제제는 pCAF 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명에 있어서 상기 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 프라이머 및 프로브로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 시험 개체로부터 분리된 시료에서 pCAF 단백질의 활성, 및 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 중 1종 이상의 수치가 정상 개체 대비 증가하는 경우, 시험 개체의 혈관 석회화 발병도가 높을 것으로 판단하는 것인 판단 단계를 포함하는 혈관 석회화의 진단을 위한 정보 제공 방법이다.
본 발명의 또 다른 양태는 다음 단계를 포함하는 혈관 석회화 억제용 물질의 스크리닝 방법이다:
혈관 석회화가 유도된 분리된 세포에 후보 물질을 접촉시키는 접촉 단계; 및
상기 세포에서 후보 물질을 접촉시키지 않은 대조군 세포에 대비하여 pCAF 단백질의 활성, 및 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 중 1종 이상의 수치가 감소하는 경우, 상기 후보 물질을 혈관 석회화 억제용 물질로 판단하는 판단 단계.
본 발명에 있어서 상기 세포는 혈관 평활근 세포인 것일 수 있다.
본 발명은 pCAF 억제제를 포함하는 혈관 석회화 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 상기 pCAF 단백질의 활성, 및 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제제는 혈관 석회화 예방 및 치료제로써 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 혈관 석회화 모델에서 pCAF 발현량을 확인한 웨스턴 블랏 사진이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 혈관 석회화 모델에서 pCAF의 과발현에 의한 칼슘 분석(assay) 결과 그래프이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 혈관 석회화 모델에서 pCAF siRNA의 처리에 의한 칼슘 분석 결과 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 혈관 석회화 모델에서 pCAF siRNA의 처리에 의한 혈관 석회화 정도를 나타낸 알리자린 레드(Alizarin red) S 염색 사진이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 고농도 무기인산 처리에 의해 제조된 혈관 석회화 모델에서 L-moses 처리에 의한 pCAF 활성을 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 고농도 무기인산 처리에 의해 제조된 혈관 석회화 모델에서 L-moses 처리에 의한 칼슘 분석 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 고농도 무기인산 처리에 의해 제조된 혈관 석회화 모델에서 L-moses 처리에 의한 혈관 석회화 정도를 나타낸 알리자린 레드 S 염색 사진이다.
pCAF 단백질의 활성 억제제 또는 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제제를 포함하는 혈관 석회화 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량)%, 고체/액체는 (중량/부피)%, 그리고 액체/액체는 (부피/부피)%이다.
실시예 1: 혈관 석회화 모델의 제작
8~9주령 랫트(Sprague Dawley)를 2,2,2-트리브로모에탄올(tribromoethanol)을 이용한 마취제로 안락사시킨 뒤 대동맥을 분리하였으며, 내피세포를 제거한 뒤에 콜라게네이즈(collagenase)를 포함하는 배양액(Ham's F12)에 넣고 혈관 평활근 세포를 분리하였다.
10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함한 둘베코수정이글배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium)를 일반배지로 사용하여 분리한 혈관 평활근 세포를 대조군으로 배양하였다. 실험군으로는 동일한 일반배지에서 혈관 평활근 세포에 2 내지 5 mM 무기인산(Inorganic Phosphorus; Pi)을 2 내지 6일간 처리하며 배양하였으며, 실험군과 대조군 모두 2일에 1회 간격으로 배지를 교체하여 혈관 석회화 모델을 구축하였다.
실시예 2: 혈관 석회화 모델에서의 pCAF 단백질 발현량의 확인
상기 실시예 1에서 분리된 혈관 평활근 세포에 2 mM 무기인산을 3일 또는 6일간 처리한 혈관 석회화 모델로부터 typsin-EDTA를 이용하여 혈관 평활근 세포를 수획한 뒤에 1% NP-40 완충액(150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 10 mM NaF, 1 mM Na3VO4, 1 mM EDTA, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, protease inhibitor)을 넣고 소니케이션하여 30분간 반응시켰다. 13,000 rpm으로 15분간 원심분리한 뒤에 상층액을 회수하여, 키트(BCA protein assay kit)를 이용하여 단백질을 정량하였다.
상기 단백질 30 ug을 취하여 SDS-PAGE에 전기영동한 뒤에 폴리비닐아덴 플루오라이드(Polyvinylidene fluoride, PVDF membrane)으로 옮겨 검출 대상 단백질에 특이적인 1차 항체(α-pCAF(1:1000, Cell signaling), α-b-Actin(1:1000, Santa cruz))를 넣고 하루 동안 냉장 상태에서 반응시켰다. 이후 2차 항체(anti-mouse IgG or anti-rabbit IgG, horseradish peroxidase(HRP)-linked antibody, 1:5000, Cell signaling)로 1시간 동안 상온에서 반응시키고 1xTBST 완충액으로 3회 이상 세척(washing)한 후 기질(Western Chemiluminescent HRP substrate)을 이용하여 대상 단백질 검출양을 확인하였다.
도 1에서 확인할 수 있듯이, 무기인산을 처리하지 않은(day 0) 대조군 대비 무기인산을 처리하여 제작된 혈관 석회화 모델(day 3, 6)에서 pCAF(P300/CBP-associated factor)의 발현량이 유의적으로 증가하였다.
실시예 3: pCAF의 발현량 조절에 의한 혈관 석회화 정도의 확인
3-1. pCAF의 과발현에 따른 칼슘 축적도의 확인
혈관 평활근 세포에 pCAF를 과발현 시키기 위해 pCAF 과발현 벡터를 에드진(addgene #8941)에서 구입하여 사용하였다. 구체적으로, pCI 벡터(Promega)에 인간 pCAF 유전자의 코딩 부위 서열과 Flag 태그 서열을 유전자 재조합 방법으로 삽입하여 pCAF 과발현 벡터인 pCI-Flag pCAF 벡터가 제조되었다.
24-웰(well) 플레이트에 세포를 접종(seeding)한 후 리포펙타민 LTX (lipofectamine LTX, ThermoFisher)를 사용하여 상기 pCI-Flag pCAF 과발현 벡터로 트랜스펙션(transfection)을 수행하였다. 다음날 10% FBS에 포함된 배지로 교체하였고 실험군에는 4 mM 무기인산을 3일간 처리하였으며 2일에 한번 배지를 교체하였다.
세포의 칼슘 축적량을 확인하기 위해 이에 0.6 N HCl을 처리하여 24시간 동안 냉장상태에서 반응시킨 뒤, 키트(QuantiChrom Calcium Assay Kit)를 사용하여 칼슘 축적량을 측정하였고 pCAF 단백질의 발현량은 키트(BCA protein assay kit)를 사용하여 측정하였다. 칼슘 축적량(mg/mg protein)은 pCAF 단백질 발현량이 각각 0, 50, 100, 및 200 ng인 경우를 기준으로 보정하였다.
Pi - + + + +
pCAF - - 50 ng 100 ng 200 ng
칼슘 축적량 0.016 0.141 0.093 0.396 1.289
표 1 및 도 2에서 확인할 수 있듯이, 혈관 평활근 세포에 무기인산 처리에 의해 증가된 칼슘 축적은 pCAF 과발현 양을 증가시킬수록 칼슘의 축적량이 증가하였다.
3-2. pCAF의 발현 억제에 의한 칼슘 축적도의 확인
pCAF의 발현을 억제하기 위한 pCAF를 표적으로 하는 siRNA 올리고머(si-pCAF)와 대조군인 pCAF 비 특이적인 스크램블(scramble) 올리고머는 바이오니아에서 제작 및 구입하였다. siRNA는 랫트에서 추출한 혈관 평활근 세포에서 실험하였으므로 랫트(Rattus Norvegicus)의 pCAF 유전자를 타겟으로 하여 이중 가닥으로 디자인하였다.
서열번호 명칭 서열
1 pCAF siRNA sense 5'-GGGUAUCGAACUUGUGUUA-3'
2 pCAF siRNA antisense 5'-UAACACAAGUUCGAUACCC-3'
혈관 평활근 세포에서 스크램블 올리고머, pCAF siRNA, 및 리포펙타민 RNAiMAX(ThermoFisher) 시약을 이용하여 pCAF를 각각 농도별(50 및 100 nM)로 넉다운(knockdown) 시킨 뒤, 다음 날 10% 소태아혈청 포함한 배지로 교체한 후, 4 mM 무기인산을 3일 동안 처리하였다.
세포의 칼슘 축적량 확인은 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 수행하였다.
Pi - + + +
Si-pCAF - - 50 nM 100 nM
칼슘 축적량 0.003 0.018 0.011 0.0105
표 3 및 도 3에서 확인할 수 있듯이, 무기인산 처리에 의해 증가된 칼슘 축적량은 스크램블 대비 pCAF siRNA를 처리한 경우에서 칼슘의 축적량이 농도별로 차단되었다.
3-3. pCAF의 발현 억제에 의한 혈관 석회화 정도의 확인
pCAF의 발현 억제가 혈관 석회화에 미치는 영향을 알리자린 레드(Alizarin red) S 염색으로 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 3-2의 방법에 따라 각각 리포펙타민 RNAiMAX 시약 및 pCAF siRNA 50 및 100 nM를 이용하여 pCAF를 넉다운시킨 혈관 평활근 세포에 4 mM 무기인산을 3일간 처리하였다. 배지를 제거한 세포를 PBS로 한번 헹군 뒤 10% 포르말린을 넣고 상온에서 1시간 동안 고정시킨 후 포르말린을 제거하고 PBS로 세 번 헹구고 세포를 살짝 건조시켰다. 이후 40 mM 알리자린 레드 S(pH 4.2) 염색약을 넣고 20분간 반응시켰다. 염색 후 비특이적으로 세포에 염색된 염료를 제거하기 위해 3차 증류수로 세척하였다.
도 4에서 확인할 수 있듯이, 고농도 무기인산 처리에 의해 증가된 혈관 석회화가 pCAF siRNA의 처리에 의하여 차단되었다.
실시예 4: pCAF 활성 억제제에 따른 혈관 석회화 정도의 확인
4-1. pCAF 활성 억제제에 따른 pCAF 활성 억제 효과 확인
실시예 1에서 분리된 혈관 평활근 세포에 5 mM 무기인산을 2일간 처리한 후 pCAF 활성 억제제인 10 nM L-moses(TOCRIS)를 24시간 처리한 뒤에 1% NP-40 완충액 700 μl를 넣고 소니케이션하였으며, 30분간 얼음위에서 반응시켰다. 13,000 rpm에서 15분간 원심분리 후 상층액을 회수한 다음 키트(BCA protein assay kit)를 사용하여 단백질량을 정량하였고 이 중 1 mg를 취해서 pCAF 항체를 이용해 냉장상태에서 오버나이트(overnight) 조건으로 면역침강반응을 수행하였다. A/G bead를 넣고 1시간 동안 냉장상태에서 반응시킨 뒤에 1% NP-40 완충액으로 세 번 세척한 뒤에 키트(Histone Acetyltransferase Activity Assay kit)를 이용하여 pCAF 활성도를 측정하였다.
Pi - + +
L-moses - - +
pCAF 활성 0.042 0.101 0.041
표 4 및 도 5에서 확인할 수 있듯이, 고농도 무기인산 처리에 의해 증가된 pCAF 활성이 L-moses 처리에 의해 억제되었다.
4-2. pCAF 활성 억제제에 따른 칼슘 축적도의 감소 확인
혈관 평활근 세포를 상기 실시예 4-1과 동일하게 준비하되, L-moses는 각각 10 및 30 nM 처리하여 칼슘 축적도의 변화를 확인하였다.
Pi - + + +
L-moses - - 10 nM 30 nM
칼슘 축적량 0.015 0.033 0.022 0.019
표 5 및 도 6에서 확인할 수 있듯이, 고농도 무기인산 처리에 의해 축적된 칼슘 축적량이 pCAF 활성 억제제인 L-moses 처리에 의해 농도 의존적으로 감소되었다.
4-3. pCAF 활성 억제제에 따른 혈관 석회화 정도의 확인
혈관 평활근 세포를 상기 실시예 4-1과 동일하게 준비하되, L-moses는 각각 10, 30 및 100 nM 처리하여 칼슘 축적도의 변화를 확인하였다.
도 7에서 확인할 수 있듯이, 고농도 무기인산 처리에 의해 증가된 혈관 석회화가 pCAF 활성 억제제인 L-moses 처리에 의해 농도 의존적으로 감소되었다.
본 발명은 pCAF 억제제를 포함하는 혈관 석회화 예방 또는 치료용 약제학적 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 pCAF 단백질 활성 억제제 또는 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제제를 이용한 혈관 석회화의 치료, 또는 진단 방법, 및 혈관 석회화 억제용 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Claims (11)

  1. pCAF 단백질의 활성 억제제 또는 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제제를 포함하는 혈관 석회화 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 pCAF 단백질의 활성 억제제는 pCAF 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 혈관 석회화 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 화합물은 L-moses인 것인, 혈관 석회화 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 억제제는 상기 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, siRNA(small interfering RNA) 및 shRNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 혈관 석회화 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  5. 제4항에 있어서, 상기 siRNA는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 뉴클레오티드 쌍으로 이루어진 siRNA 쌍인 것인, 혈관 석회화 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
  6. pCAF 단백질의 활성 수준 또는 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 혈관 석회화 진단용 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 pCAF 단백질의 활성 수준을 측정할 수 있는 제제는 pCAF 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 혈관 석회화 진단용 조성물.
  8. 제6항에 있어서, 상기 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 프라이머 및 프로브로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것인, 혈관 석회화 진단용 조성물.
  9. pCAF 단백질의 활성 수준 또는 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 혈관 석회화 진단용 키트.
  10. 시험 개체로부터 분리된 시료에서 pCAF 단백질의 활성, 및 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 중 1종 이상의 수치가 정상 개체 대비 증가하는 경우, 시험 개체의 혈관 석회화 발병도가 높을 것으로 판단하는 것인 판단 단계를 포함하는 혈관 석회화의 진단을 위한 정보 제공 방법.
  11. 다음 단계를 포함하는 혈관 석회화 억제용 물질의 스크리닝 방법:
    혈관 석회화가 유도된 분리된 세포에 후보 물질을 접촉시키는 접촉 단계; 및
    상기 세포에서 후보 물질을 접촉시키지 않은 대조군 세포에 대비하여 pCAF 단백질의 활성, 및 pCAF 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 중 1종 이상의 수치가 감소하는 경우, 상기 후보 물질을 혈관 석회화 억제용 물질로 판단하는 판단 단계.
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