WO2023008927A1 - 유기물, 무기물 또는 이들의 염으로 이루어진 무정형 나노 분자 회합체 및 그의 제조방법 - Google Patents

유기물, 무기물 또는 이들의 염으로 이루어진 무정형 나노 분자 회합체 및 그의 제조방법 Download PDF

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김경희
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Definitions

  • the present invention relates to an amorphous nano-molecular assembly composed of organic/inorganic materials or salts thereof, and more particularly, an amorphous nanoparticle having excellent solubility and permeability to lipid membranes, prepared by applying shear stress to organic/inorganic materials or salts thereof. It is about molecular associations.
  • active ingredients in the form of organic/inorganic substances or salts thereof to a target location in the human body, it is known that the following two conditions must be satisfied.
  • solubility of the active ingredient in water must be secured. Since all fluids in the human body are water-based solutions or dispersions, solubility in water or dispersion phase in water must be sufficiently secured in order for a drug to be delivered to move in the body.
  • the permeability of the active ingredient to the hydrophobic membrane must be secured. Since cells in the human body are surrounded by a hydrophobic membrane like a phospholipid membrane, in order to pass through it, the surface properties of drug molecules or drug structures must be hydrophobic, or the size is very small enough to penetrate the cell membrane. should be
  • this drug encapsulation method has limitations in that the encapsulation process is complicated, the yield of encapsulation may be low, and the surfactant or polymer component surrounding the drug must be removed or passed through in order for the drug to be released. In addition, since most of the surfaces of cells or tissues that require permeation are composed of lipophilic phospholipid components, absorption of the drug is not efficient when the drug is hydrophilic.
  • polarity is applied to drug molecules to induce polar interactions with water molecules, or molecules that are very friendly to water, such as PEG, are covalently bonded or ionic bonded (complex) to a part of the molecular structure. ) method can be used.
  • top-down process such as high pressure homogenization, milling, and a piston-gap homogenizer
  • bottom-up process such as precipitation or self-assembly
  • the top-down method is a technology for manufacturing micrometer-sized particles by reducing the size of particles through methods such as grinding. It has its downsides.
  • the bottom-up method is a technology that grows nanometer-sized structures at the atomic or molecular level, in contrast to the top-down method. This technology is presented as a way to overcome the limitations of the top-down method. However, at the current technology level, it is still difficult to obtain direct results from the economic advantages of atomic or molecular technology.
  • Patent Document 1 Republic of Korea Patent Publication No. 10-2011-0053775 (2011.05.24), nano powder dispersion device using focused ultrasound and dispersion method using the same
  • the present inventors dissolved drug molecules, which are pharmacologically active ingredients, in a solvent, and then brought the molecules very close to each other, so that the polar groups in the molecules behave as if they were a single entity. Confirmed.
  • small particles at the molecular level can be prepared in a bottom-up method rather than a top-down method, but can be prepared in an amorphous rather than crystalline nano-sized drug structure.
  • an object of the present invention is to prepare a molecular assembly of a new structure using polar interactions or hydrogen bonds of molecules without changing the chemical structure of the molecule of a pharmacologically active ingredient, so that the surface of the molecular assembly is hydrophobic (hydrophobic). ) to provide a pharmacologically active ingredient molecular association with increased permeability to a phospholipid membrane.
  • the present invention is manufactured using a new method rather than the conventional top-down method, despite the advantage of reaching the highest saturation solubility of the existing amorphous drug nanoparticle. It is expected to bring innovation to the field of nanomedicine, ultimately nanotechnology, by improving the shelf-life maintenance period and problems caused by too fast dissolution rate of amorphous nanoparticle particle size. In conclusion, the present invention will be a new innovative technology in the field of amorphous nanomedicine and nanotechnology below 50 nm.
  • the present invention is a molecular association in which organic or inorganic substances are physically bonded, and when the molecular association is formed as a composition containing water, the molecular association in the composition has an aggregated structure.
  • the average particle diameter of the molecular assembly is 50 nm or less, and an amorphous nano-molecular assembly is provided.
  • the present invention is a molecular association in which salts of organic or inorganic substances are physically bonded, and when the molecular association is formed in a composition containing water, the molecular association in the composition has an aggregated structure, An amorphous nanomolecular aggregate having an average particle diameter of 50 nm or less is provided.
  • the present invention is organic, inorganic or salts thereof; And water; after putting the composition comprising a shear stress into the device,
  • a method for preparing a nanomolecular assembly by applying shear stress to the composition to prepare a molecular assembly in which organic substances, inorganic substances or salts thereof are physically bonded.
  • the present invention by preparing a molecular assembly of a new structure utilizing polar interactions or hydrogen bonds, without the hassle of changing the molecular structure of organic, inorganic substances or salts thereof such as pharmacologically active ingredients,
  • By making the surface hydrophobic not only can the permeability to the phospholipid membrane be increased, but the original molecular and chemical properties themselves are the same, so the initially intended drug effect can be displayed as it is, and the manufacturing method is simple. This has the advantage of reducing manufacturing costs.
  • the molecular association of the present invention can be used in various pharmaceutical compositions.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an apparatus for preparing a molecular association of pharmacologically active ingredients according to an embodiment of the present invention.
  • Figure 2 is a schematic diagram of an apparatus for preparing a molecular association of pharmacologically active ingredients according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a graph showing the results of measuring NOESY, a two-dimensional NOE (Nuclear Overhauser Effect) spectrum, for a pharmacologically active ingredient according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 4 is a graph showing the results of measuring NOESY, a two-dimensional NOE spectrum, for molecular associations of pharmacologically active ingredients according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 6 shows a comparison of FT-IR spectra according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 11 shows a comparison of FT-IR spectra according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 13 is a TEM photograph of a molecular assembly according to another embodiment of the present invention.
  • FIG. 14 is a graph showing XRD measurement results of molecular associations according to another embodiment of the present invention.
  • 15 is a graph showing XRD measurement results of molecular assemblages according to another embodiment of the present invention.
  • 16 is a graph showing DSC measurement results of molecular associations according to another embodiment of the present invention.
  • 17 is a TEM photograph of a molecular assembly according to another embodiment of the present invention.
  • 19 is a TEM photograph of a molecular assembly according to another embodiment of the present invention.
  • 20 is a 3D hologram photograph of the phospholipid membrane penetration performance of the molecular assembly according to another embodiment of the present invention.
  • 21 is a schematic diagram of a Wuxing chamber in which the corneal penetration performance of molecular assemblages according to another embodiment of the present invention is measured.
  • small particles at the molecular level are manufactured by a bottom-up method rather than a top-down method, but have a structure of an amorphous nano-sized drug rather than a crystalline form, and can be obtained without changing the chemical structure of organic substances, inorganic substances or salts thereof.
  • the surface of the molecular assembly has a hydrophobic (hydrophobic), increasing the permeability to the phospholipid membrane, organic matter, inorganic material or their Molecular associations of salts are presented.
  • a solution containing organic, inorganic, or salts thereof is introduced into the device, and then a solution containing organic, inorganic, or salts thereof is introduced into the device. It is characterized in that by applying shear stress to prepare a molecular assembly of organic substances, inorganic substances or salts thereof.
  • Methods for preparing drugs in nanometer size include top-down technologies such as high pressure homogenization, milling, and piston-gap homogenizer, and precipitation ) or bottom-up technology such as self-assembly.
  • the top-down manufacturing technology is a technology for producing micrometer-sized particles by reducing the particle size through methods such as grinding, and has disadvantages such as increased cost, risk of contamination, and product damage due to repeated grinding. have them
  • the bottom-up manufacturing technology such as precipitation has the advantage of having a low cost and simple manufacturing process through crystal growth, but only crystalline products can be manufactured, and excessive growth of crystals and their aggregation are caused by surfactants and There was a problem of adding the same separate compound.
  • the present inventors dissolved drug molecules in the form of organic, inorganic, or salts thereof in a solvent, and then brought the molecules very close to each other, so that the polar groups in the molecules interacted to form molecular associations. and confirmed the phenomenon that they behave like a single entity.
  • the present invention is intended to manufacture small particles at the molecular level in a bottom-up method rather than a top-down method, but in a non-crystalline, non-crystalline, nano-sized drug structure.
  • a solution containing an organic substance, an inorganic substance, or a salt thereof is introduced into an apparatus, and then a shear stress is applied to a solution containing an organic substance, an inorganic substance, or a salt thereof to form a molecular assembly of organic substances, inorganic substances, or salts thereof.
  • a device for manufacturing is provided.
  • the apparatus for preparing molecular associations of organic substances, inorganic substances or salts thereof is capable of preparing molecular associations of organic substances, inorganic substances or salts thereof according to the present invention by applying shear stress to a solution containing organic substances, inorganic substances or salts thereof.
  • shear stress using a roll mill process or a ball mill process.
  • the solvent for preparing the oil phase is oil derived from grain extracts such as castor oil, MCT oil, soybean oil, peanut oil, etc., or oil derived from herbal extracts such as ginseng, camellia, green tea, angelica, etc. showing pharmacological effects. Any one or more of them may be used, but are not necessarily limited thereto.
  • the organic, inorganic, or salt thereof may be used as a pharmacologically active ingredient, which may be used without particular limitation as long as it is a pharmaceutically useful substance or a substance having a medical effect.
  • a pharmacologically active ingredient for example, cyclosporine A, paclitaxel, docetaxel, deckercin, meloxicam, itraconazole, celecoxib, capecitabine, travo, frost, isoflavones, diclofenac sodium, tyrosine kinase inhibitors sunitinib, pazopanib, Axitinib, regorafenib, trametinib, ginsenoside Rg1, tachlorimus, alendronate, latanoprost, bimatoprost, atorvastatin calcium, rosuvastatin calcium, entecavir, amphotericin B, omega 3 , various cholic acids, such as deoxy
  • FIG. 1 a schematic diagram for explaining a device for preparing a molecular association of organic, inorganic or salts thereof according to an embodiment of the present invention is shown in FIG. 1.
  • an apparatus for producing a molecular association of organic, inorganic, or salts thereof includes a plurality of devices to apply shear stress to a solution containing organic, inorganic, or salts thereof.
  • a roll of can be provided.
  • the plurality of rolls may be two rolls facing each other, and may further include one or several rolls in addition to this.
  • a solution containing the organic, inorganic, or salt thereof (indicated as PTX Sol. in FIG. 1 as an example) is put between two facing rolls (roll A and roll B in FIG. 1) in the device. can do.
  • the two rolls facing each other are rotated for the solution containing the organic, inorganic, or salt thereof introduced between the two rolls, the organic, inorganic, or salt contained in the solution containing the organic, inorganic, or salt thereof is rotated.
  • shear stress to the salt By applying shear stress to the salt, a molecular association of organic, inorganic, or salts thereof according to the present invention can be prepared.
  • the distance between the two facing rolls may be set to 0.5 to 1000 ⁇ m.
  • the gap between the two facing rolls may be set to, for example, 0.5 ⁇ m or more, 1 ⁇ m or more, 2 ⁇ m or more, 3 ⁇ m or more, 4 ⁇ m or more, 5 ⁇ m or more, 10 ⁇ m or more, 1000 ⁇ m or less, 900 ⁇ m or less, 800 ⁇ m or less, 700 ⁇ m or less, 600 ⁇ m or less, 500 ⁇ m or less, 400 ⁇ m or less, 300 ⁇ m or less, 200 ⁇ m or less, 100 ⁇ m or less, preferably set to 10 to 100 ⁇ m can If the gap between the two facing rolls is less than 0.5 ⁇ m, the discharge amount between the rolls is too small, resulting in a problem of production speed, and if it is greater than 1000 ⁇ m, the shear stress or compressive stress is
  • the two facing rolls are different from each other. It can be rotated at speed. At this time, the rotational speed of any one of the two facing rolls is 50 to 250 rpm, and the rotational speed of the other may be 200 to 500 rpm. Alternatively, the rotation speed of each of the two facing rolls may be rotated at a ratio of 1:1.5 to 1:5.
  • the rotation direction of the two facing rolls may be set to a co-current direction having the same rotation direction, and the rotation directions are mutually It can also be set to other counter-current directions.
  • the apparatus for producing a molecular assembly according to an embodiment of the present invention may repeatedly apply shear stress or compressive stress to the contents discharged once several times.
  • a solution containing an organic substance, an inorganic substance, or a salt thereof is introduced into the device in a first direction, and another solution is introduced in a second direction facing the first side, and then a shear stress is applied.
  • An apparatus for producing a molecular association is provided.
  • An apparatus for producing the molecular assembly of the present invention may also be used without particular limitation as long as it can produce the molecular assembly of the present invention by applying shear stress to a solution containing an organic material, an inorganic material or a salt thereof, but preferably a roll Applying shear stress using a mill process or a ball mill process can be used.
  • the pharmacologically active ingredients may be the same as those mentioned above.
  • the water-soluble compound is citric acid, carbonic acid, lactic acid, acetic acid, phosphoric acid, ascorbic acid, malic acid ), Tartaric acid, Glutaric acid, Succinic acid, Maleic acid, Fumaric acid, Malonic acid, HCl, H 2 SO 4 , NaH 2 PO 4 , NaHCO 3 , KHCO 3 , Na 2 CO 3 , K 2 CO 3 , Na 3 PO 4 , K 3 PO 4 , NaH 2 PO 4 , NH 4 OH, sodium acetate (NaOAc), KOH, Any one or more selected from the group consisting of NaOH and Ca(OH) 2 may be used.
  • FIG. 2 a schematic diagram for explaining a device for producing a molecular assembly according to an embodiment of the present invention is shown in FIG. 2 .
  • the apparatus for producing a molecular assembly may include a plurality of rolls to apply shear stress to a solution containing an organic material, an inorganic material, or a salt thereof.
  • the plurality of rolls may be two facing rolls (roll A, roll B), or may include one or several additional rolls (roll C) as shown in FIG. 2 .
  • a solution containing the organic matter, inorganic matter or salt thereof (indicated as PTX Sol. in FIG. Marked as Sucrose Sol.) may be introduced to the side of the second roll facing the first roll.
  • the distance between the two facing rolls may be set to 0.5 to 1000 ⁇ m.
  • the gap between the two facing rolls may be set to, for example, 0.5 ⁇ m or more, 1 ⁇ m or more, 2 ⁇ m or more, 3 ⁇ m or more, 4 ⁇ m or more, 5 ⁇ m or more, 1000 ⁇ m or less, 900 ⁇ m or less, It may be set to 800 ⁇ m or less, 700 ⁇ m or less, 600 ⁇ m or less, or 500 ⁇ m or less, preferably 5 to 500 ⁇ m.
  • the gap between the two facing rolls is less than 0.5 ⁇ m, the discharge amount between the rolls is too small, resulting in a problem of production speed, and if it is greater than 1000 ⁇ m, the shear stress or compressive stress is too small, so the formation of particles is not easy. .
  • the two facing rolls may be rotated at different speeds.
  • the rotational speed of any one of the two facing rolls is 50 to 150 rpm, and the rotational speed of the other may be 200 to 500 rpm.
  • the rotation speed of each of the two facing rolls may be rotated at a ratio of 1:1.5 to 1:5.
  • the rotation direction of the two facing rolls may be set to a co-current direction having the same rotation direction, and the rotation directions are mutually It can also be set to other counter-current directions.
  • the apparatus for producing a molecular assembly according to an embodiment of the present invention may repeatedly apply shear stress or compressive stress to the contents discharged once several times.
  • the apparatus for preparing the molecular assembly may further include a third roll for applying shear stress to the solutions passing between the first and second rolls.
  • the third roll may apply shear stress between the second roll and the gap between the facing second roll and the third roll may be set to 0.5 to 1000 ⁇ m.
  • the gap between the two facing rolls may be set to, for example, 0.5 ⁇ m or more, 1 ⁇ m or more, 2 ⁇ m or more, 3 ⁇ m or more, 4 ⁇ m or more, 5 ⁇ m or more, 1000 ⁇ m or less, 900 ⁇ m or less, It may be set to 800 ⁇ m or less, 700 ⁇ m or less, 600 ⁇ m or less, or 500 ⁇ m or less, preferably 5 to 500 ⁇ m.
  • the distance between the second and third rolls is less than 0.5 ⁇ m, the amount of discharge between the rolls is too small, resulting in a problem in production speed, and if it is greater than 1000 ⁇ m, the shear stress or compressive stress is too small, so the formation of particles is not easy.
  • the second roll and the third roll may be rotated at different speeds.
  • the rotational speed of any one of the second roll and the third roll may be 200 to 500 rpm, and the rotational speed of the other may be 600 to 1200 rpm.
  • the rotation speed of the second roll and the third roll may be rotated at a ratio of 1:1.5 to 1:5.
  • the device for producing the molecular association is not limited to the above method, and any device capable of applying shear stress to organic materials, inorganic materials, or salts thereof can be freely deformed.
  • the present inventors dissolved drug molecules in the form of organic, inorganic, or salts thereof in a solvent and brought the molecules very close to each other to form molecular associations by interacting with the polar groups in the molecules, making them look like a single entity. The behavioral phenomenon was confirmed.
  • the nanomolecular assembly produced by the apparatus mentioned in this specification has the following characteristics.
  • the nanomolecular assembly according to the present invention applies shear stress to a solution containing an organic material, an inorganic material, or a salt thereof, which is a precursor of the molecular assembly, so that the distance between the molecules of the organic material, inorganic material, or salt thereof is very close.
  • the molecular assembly As the molecular assembly is prepared, it has the characteristics of being amorphous while having a nanoparticle size. That is, by applying shear stress between molecules of the same structure, they become a nano-sized amorphous molecular assembly physically bonded to each other.
  • the molecular assemblage and the precursor of the molecular assemblage, an organic substance, an inorganic substance, or a salt thereof measured by chromatography are the same, and spectroscopy of the molecular assemblage and the pharmacologically active ingredient as a precursor of the molecular assemblage
  • the measured values by (Spectroscopy) have different characteristics.
  • determining the structure of a material include methods through various instrumental analyzes such as elemental analysis, FT-IR, NMR, UV spectroscopy, X-ray, and differential scanning calorimeter (DSC).
  • NMR and FT-IR are the analytical methods that best show the chemical structure, that is, the atoms constituting the molecule and their connections.
  • X-ray or DSC is a method widely used to investigate secondary structures such as crystal structures formed by molecules, such as crystal structures.
  • the microstructure is analyzed using a scanning electron microscope or a transmission electron microscope.
  • NMR can determine the electronic environment of an atomic nucleus determined by the electronic structure of a molecule.
  • the result of the present invention relates to a method for preparing a certain compound and its physical structure, and NMR provides very useful information as a method of finding out that there is no chemical change in the process of forming a physical structure.
  • a compound and its physical structure basically have similar NMR spectra.
  • NOE Nuclear Overhauser Effect
  • two-dimensional NOESY spectrum two-dimensional NOESY spectrum.
  • the distance between molecules of the molecular assembly may be 10 ⁇ or less.
  • the distance between molecules means measuring the average distance of these molecules based on the molecules constituting the molecular association, and can be measured, for example, using NOE of NMR.
  • NOE Nuclear Overhauser Effect
  • NOE Nuclear Overhauser Effect
  • FIGS. 3 and 4 NOESY, a two-dimensional NOE spectrum for NaDC molecules and molecular associations thereof, is shown, respectively. Parts marked with * and ** in FIGS. 3 and 4 indicate the same positions. It can be seen that off-diagonal peaks do not appear in the regions marked with *,** in the NaDC molecule itself in Figure 3, whereas off-diagonal peaks appear in the regions marked with *,** in the molecular association of NaDC in Figure 4. . This indicates that the distance between the two nuclei was far from each other in pure NaDC, but the distance between the two nuclei became closer as the molecular association was formed. Through this, it can be seen that when the molecular association is formed, the distance between the molecules becomes very close. In general, since it is known that the distance required for two hydrogens to exhibit NOE is physically about 6 ⁇ (Angstrom), the distance between molecules forming the molecular association of the present invention is also within the range of about 6 ⁇ (Angstrom). can
  • the reason why peaks that do not appear far from the molecules themselves appear in the nanomolecular aggregates provided in the present invention is due to the change in the physical position of molecules of organic, inorganic or salts thereof bound to the nanomolecular aggregates. That is, it means that the distance between molecules in the molecular association is very close.
  • the peak position in the NMR spectrum means a frequency that rotates according to the magnitude of a magnetic field applied to an atomic nucleus in a molecule composed of atomic bonds.
  • the magnitude of the magnetic field applied to the nucleus varies depending on the nature of the surrounding functional groups pushing and pulling electrons. As a result, as the strength of the magnetic field applied to the nucleus increases, it moves to a higher frequency. If the intensity of is weakened, the rotation frequency of the nucleus is reduced in a lower direction.
  • the density of the electron cloud of the atomic nucleus changes depending on the distance between the molecules with strong interactions.
  • the magnitude of the magnetic field is locally changed by the ring current, so that the number of revolutions of the nucleus is changed.
  • the molecular assembly prepared according to the present invention is physically bonded by the interaction between molecules even without a separate binder or additive, and may be substantially composed of organic or inorganic materials.
  • Structures of strongly polar molecules can interact such as hydrogen bonds, polar interactions, or pi-pi stacking, and these interactions cause changes in the position and intensity of peaks in the FT-IR spectrum. do. Therefore, even in the same molecular combination, the position and intensity of peaks may change depending on the surrounding environment. That is, if the FT-IR spectrum is the same, it can be seen that it is the same molecule. In particular, between 400 cm -1 and 700 cm -1 is called a fingerprint zone, and if peaks are the same between this zone, they are regarded as the same compound.
  • the present invention it is an object of the present invention to form a compound into a structure of a molecular association, which is a physical association.
  • a molecular association which is a physical association
  • the distance between molecules in the association exists very close to within about 10 ⁇ or within 5 ⁇ .
  • bonds in molecules are excited by infrared rays
  • compound bonds in molecular associations undergo molecular motion of stretching or bending. It has been found that the molecular associations of the present invention are accompanied by various changes, such as disappearance, change in peak position or decrease or increase in intensity of peaks.
  • the nanomolecular assembly prepared according to the present invention and the organic or inorganic material that is the precursor of the nanomolecular assembly have the same chemical structure as described above.
  • the measured value by the chromatography may be a result value measured by HPLC (high-performance liquid chromatography), and the organic or inorganic material and its molecular association, which are the results provided by the present invention, have peaks at almost the same position, and about 10 It is observed to have a retention time within % (i.e. ⁇ 5%).
  • peaks appearing within 10% of the time can be determined as the same material.
  • the nanomolecular assembly and the organic or inorganic material that is the precursor of the nanomolecular assembly have different physical structures, in the NMR spectrum, most of the peaks of the two target materials are similar, or some may be changed, , in the FT-IR image, various types of changes such as generation and disappearance of peaks and changes in peak intensity may appear.
  • the nanomolecular aggregate and the organic or inorganic material that is a precursor of the nanomolecular aggregate have the same chemical structure, the values measured by chromatography may be the same.
  • the NMR measurement of the nanomolecular aggregate and organic or inorganic substances that are precursors of the nanomolecular aggregate is not particularly limited, but can be measured using, for example, a Bruker 400 MHz Avance.
  • the FT-IR measurement of the nanomolecular aggregate and the organic or inorganic material that is the precursor of the nanomolecular aggregate is not particularly limited, but can be measured using, for example, Bruker Alpha 2 ATR.
  • Another molecular association derived from a drug molecule according to the present invention is obtained by applying shear stress to a solution containing an organic or inorganic salt as a precursor of the nanomolecular association to physically bind the organic or inorganic salt. It is characterized by producing a structured nanomolecular assembly.
  • the molecular assembly prepared in this way is a molecular assembly in which a pharmacologically active ingredient and a water-soluble compound are combined, and a molecular assembly in which an organic or inorganic salt, which is a precursor of the nanomolecular assembly, and a salt of the organic or inorganic substance are combined.
  • the values measured by chromatography are the same, and the measured values by spectroscopy of the organic or inorganic salt, which is a precursor of the nanomolecular association, and the molecular association to which the organic or inorganic salt are bonded are different. can be characterized.
  • the values measured by chromatography and the values measured by spectroscopy are the same as those mentioned above.
  • binder or additive are physically bonded by intermolecular interactions, and may be substantially composed of organic or inorganic salts.
  • the organic or inorganic salt may be used as a pharmacologically active ingredient, and the above-mentioned organic or inorganic salt may be used.
  • the NMR spectrum shows two target substances. Most of the peaks are similar, some of them can be changed, and various types of changes such as generation and disappearance of peaks and changes in peak intensity can appear in the FT-IR image.
  • the resultant value measured by FT-IR of the organic or inorganic salt, which is a precursor of the nanomolecular association, and the molecular association to which the organic or inorganic salt is bonded one or more peaks are generated or disappeared If it is, it can be determined that it is different, and specifically, the result value measured by FT-IR of the organic or inorganic salt, which is a precursor of the nanomolecular association, and the molecular association to which the organic or inorganic salt is bonded can be compared. When one or more peaks differ by 5 cm -1 or more, it can be determined that they are different.
  • the organic or inorganic salt, which is the precursor of the nanomolecular association, and the molecular association to which the organic or inorganic salt are bonded have the same chemical structure, values measured by chromatography may be the same. Specifically, if the result value measured by HPLC of the organic or inorganic salt, which is the precursor of the nanomolecular assembly, and the molecular assembly to which the organic or inorganic salt is bonded has a retention time of less than 10%, it is judged to be the same. can do.
  • the nanomolecular aggregate according to the present invention has a very small particle size and may have an average particle diameter of 50 nm or less, preferably 30 nm or less, more preferably 20 nm or less, and very preferably 15 nm or less. It may be nm or less, and most preferably 10 nm or less or 5 nm or less.
  • the average particle diameter can be measured through a diffraction experiment, preferably using Small Angle Neutron Scattering (SANS). Also, images can be measured using Transmission Electron Microscopy. When the average particle diameter of the nanomolecular aggregate exceeds 50 nm, there are problems in dispersibility, transparency and transmittance.
  • the lower limit of the average particle diameter of the nanomolecular aggregate is not particularly limited, but may be about 1 nm or more.
  • NaDC sodium Deoxycholate, Xian Lipa Biotech, China
  • 19.8 mg was dissolved in 10 mL of water to prepare a NaDC aqueous solution with a concentration of about 0.2%.
  • the prepared NaDC solution was introduced between rolls A and B at an input rate of 50 ml/min.
  • the rotation speed of the roll A was adjusted to 100 rpm
  • the rotation speed of the roll B was adjusted to 300 rpm
  • the distance between the rolls A and B was set to 10 ⁇ m.
  • NaDC powder was obtained through the same process as in Example 1, except that the roll process for making the NaDC aqueous solution and preparing the molecular assembly thereof was not performed.
  • Sunitinib-malate (SUNITINIB MALATE, TEVA) was dissolved in 100 mL of ethanol to prepare a Sunitinib solution with a concentration of about 0.5%.
  • molecular associations were prepared by introducing them into a roll device. At this time, the introduction rate of each solution was 50 ml/min.
  • the rotation speed of the roll A was adjusted to 100 rpm
  • the rotation speed of the roll B was adjusted to 300 rpm
  • the distance between the rolls A and B was set to 10 ⁇ m.
  • the aqueous solution recovered through the roll mill was frozen at -50 ° C and operated for 48 hours at 0.1 bar, -70 ° C temperature and pressure through a lyophilizer to remove water to obtain "Sunitinib/Maleate Molecular Association" was obtained in powder form.
  • Sunitinib maleate powder was obtained through the same process as in Example 2, except that the roll process of making an aqueous solution of Sunitinib maleate and preparing its molecular association was not performed.
  • Samples were prepared in the same manner as in Example 2, except that the distance between the rolls A and B was set to 90 ⁇ m.
  • Samples were prepared in the same manner as in Example 2, except that niclosamide was used instead of Sunitinib-malate (SUNITINIB MALATE, TEVA) and the distance between rolls A and B was set to 90 ⁇ m.
  • niclosamide was used instead of Sunitinib-malate (SUNITINIB MALATE, TEVA) and the distance between rolls A and B was set to 90 ⁇ m.
  • Samples were prepared in the same manner as in Example 2, except that the distance between the rolls A and B was set to 110 ⁇ m.
  • Samples were prepared in the same manner as in Example 4, except that the distance between the rolls A and B was set to 110 ⁇ m.
  • DCF-DA (2',7'-Dichlorofluorescin diacetate, Sigma-Aldrich) was dissolved in 10 mL of water to prepare a NaDC aqueous solution with a concentration of about 0.2%.
  • the prepared DCF-DA solution was introduced between rolls A and B at an input rate of 50 ml/min.
  • the rotation speed of the roll A was adjusted to 100 rpm
  • the rotation speed of the roll B was adjusted to 300 rpm
  • the distance between the rolls A and B was set to 10 ⁇ m.
  • DCF-DA powder was obtained through the same process as in Example 5, except that the roll process of making an aqueous solution of DCF-DA and preparing a molecular assembly thereof was not performed.
  • a molecular assembly was prepared in the same manner as in Example 1, except that cyclosporine A was used instead of NaDC.
  • An API was obtained in the same process as in Example 6, except that the roll process of making cyclosporine A in an aqueous solution and preparing its molecular association was not performed.
  • NMR Nuclear Magnetic Resonance; Bruker 400 MHz Avance
  • FT-IR Fullier-transform infrared spectroscopy
  • FIG. 5 shows the H-NMR spectrum of NaDC (pure compound, Comparative Example 1), a pharmacologically active ingredient that is a precursor of the molecular association of the present invention, and the bottom of FIG.
  • T2 spin-spin relaxation time
  • Example 6 shows the FT-IR spectra of the two materials. Comparing the spectrum of pure NaDC (Comparative Example 1), shown in blue, with the spectrum of the molecular association of Example 1 prepared by the production method of the present invention, shown in red, a characteristic new peak can be found. .
  • the four peaks appearing at 600 cm -1 705 cm -1 , 820 cm -1 , and 1150 cm -1 mean that a new molecular motion mode was created in addition to the existing stretching and bending motions as molecular associations were formed.
  • spectroscopy such as NMR or FT-IR for the nanomolecular assembly prepared by the production method of the present invention and the pharmacologically active ingredient that is a precursor of the nanomolecular assembly
  • the result values measured by (Spectroscopy) analysis were different from each other, and it was determined that the difference in these result values was due to the difference in physical structure of both materials. Specifically, when comparing result values measured by NMR, it is judged to be different if the peak position changes, and when comparing result values measured by FT-IR, it is judged to be different when one or more peaks are created or disappeared. At this time, it was found that the difference in the resulting values was caused by the difference in the physical structure of the two materials.
  • the nanomolecular aggregate prepared by the production method of the present invention and the pharmacologically active ingredient, which is a precursor of the nanomolecular aggregate were analyzed by chromatography (spectroscopy) such as HPLC.
  • chromatography spectroscopy
  • the result values measured by the analysis were identical to each other, and it was determined that these results were due to the same chemical structure of both materials.
  • the molecular assemblage prepared by the production method of the present invention has new characteristics of having the same chemical structure as the pharmacologically active substance that is the precursor of the molecular assemblage but different physical structures of the molecules.
  • the H-NMR spectrum of the salt of Sunitinib/Maleate and the H-NMR spectrum of the molecular association prepared in the present invention are shown in FIG. 8 .
  • the spectrum shown above is the H-NMR of the salt-forming mixture of Sunitinib and Maleate
  • the H-NMR spectrum shown below is the molecular association of the physically bonded two compounds prepared through the present invention.
  • This is the H-NMR spectrum.
  • the areas where changes occur are marked with * and **, and as molecular associations are formed, the distance between the molecules becomes very close, and these close molecules cause changes in the environment of each other's nucleus, and this causes the NMR peak It is evidence that the change is close enough to be observed.
  • FIG. 9 the FT-IR spectrum of the salt of Sunitinib/Maleate and the FT-IR spectrum of the molecular association prepared in the present invention are shown in FIG. 9 .
  • a change much more severe than that of the NMR spectrum is observed. This is because, as described above, the mode of stretching and bending of molecules is not only different in the excited energy of the motion mode due to the formation of molecular associations, but also the creation and disappearance of peaks, the movement of positions and their intensity due to constraints. can know
  • spectroscopy such as NMR or FT-IR for the nanomolecular assembly prepared by the production method of the present invention and the pharmacologically active ingredient that is a precursor of the nanomolecular assembly
  • the result values measured by (Spectroscopy) analysis were different from each other, and it was determined that the difference in these result values was due to the difference in physical structure of both materials.
  • result values measured by NMR if the peak position changes, it is determined that the result values measured by spectroscopic analysis are different from each other, and when comparing result values measured by FT-IR, When one or more peaks are created or disappeared, it can be determined that the result values measured by spectroscopic analysis are different from each other.
  • FT-IR When one or more peaks are created or disappeared, it can be determined that the result values measured by spectroscopic analysis are different from each other.
  • the nanomolecular aggregate prepared by the production method of the present invention and the pharmacologically active ingredient, which is a precursor of the nanomolecular aggregate were analyzed by chromatography such as HPLC.
  • the result values measured by the analysis were identical to each other, and it was determined that these results were due to the same chemical structure of both materials.
  • Comparative Example 3 and Comparative Example 1 show almost similar spectral results according to FT-IR, and when the distance between the two roll mills is adjusted to exceed 100 ⁇ m, the molecular assembly according to the present invention It was found that it was not manufactured. Conversely, in the case of Example 3, as the distance between the two roll mills was adjusted to 100 ⁇ m or less, it was found that a new structure having a different physical structure, that is, the molecular assembly according to the present invention was prepared.
  • Comparative Example 4 and Comparative Example 1 also showed almost similar spectral results according to FT-IR, so that the distance between the two roll mills exceeded 100 ⁇ m regardless of the type of pharmacologically active ingredient. It was found that when it was, the molecular association according to the present invention could not be produced. Conversely, in the case of Example 4, as the distance between the two roll mills was adjusted to 100 ⁇ m or less, it was found that a new structure having a different physical structure, that is, the molecular assembly according to the present invention was prepared.
  • the molecular assembly according to the present invention is not produced, and when it is adjusted to 100 ⁇ m or less, the present invention It was found that the molecular association according to was prepared.
  • the molecular aggregate of niclosamaide prepared in Example 4 was photographed by TEM (FEI's Tecnai G2 Spirit Twin) and shown in FIG. 13.
  • the eccentricity measured using the transmission electron microscope image had an average value of about 0.85, and the distribution existed between 0.48 and 1.0.
  • the minimum and maximum sizes were about 2.5 nm and 7.7 nm, respectively, and the average size was about 4.8 nm.
  • Example 2 After the powder form of "Sunitinib/Maleate molecular association" prepared in Example 2 was prepared as a 0.05% aqueous solution, the changes in pH, particle size, content% and concentration were measured under the following conditions for 6 months, It is shown in Table 2 below.
  • a 0.5 mL sample was taken and analyzed once. Using a 1 mL pipette, 0.5 mL of sample was put so that the pH meter sensor was completely covered, and the pH was measured.
  • the average particle size of the molecular aggregate prepared in Example 2 was 2.2 nm, and the PDI was 1. In addition, it was found that the stability was maintained by seeing that the pH, content and particle size were maintained for 6 months.
  • Example 6 of the present invention prepared using cyclosporine A and cyclosporine A itself of Comparative Example 6 are compared and shown in FIG. 14 .
  • the API cyclosporine A itself of Comparative Example 6 before the process Unlike existing as a crystal form (sharp peak on the left), the molecular assembly of Example 6 of the present invention after the process changes to an amorphous form as the physical structure changes (amorphous on the left). peak) can be seen.
  • the peak may change as the size of the internal lattice changes, but this also only changes from the existing crystal form to another crystal form, as in the present invention. It does not change to an amorphous form.
  • Example 2 of the present invention prepared using sunitinib/malate salt as API and Comparative Example 2 are compared and shown in FIG. 15.
  • Example 6 of the present invention prepared using cyclosporine A as API and Comparative Example 6, which is cyclosporine A itself, are shown in FIG. 16 .
  • the solvent the solvent used in the present invention is water or ethanol
  • the DSC measurement result DATA shown in FIG. 16, such a peak does not appear at all.
  • the difference between the measured value by spectroscopy of the molecular assembly of the present application and the pharmacologically active ingredient, which is a precursor of the nanomolecular assembly, is due to a change in physical structure, not a change caused by sorbation.
  • the molecular association of the present application is a molecular association structure of API
  • a TEM photograph was taken of the molecular association of Example 2 prepared using First
  • a TEM photograph of the molecular association of Example 6 prepared using cyclosporine A as API was taken and shown in FIG. 17 .
  • the molecular structure according to the present invention is a structure in which several APIs are physically bonded. there is.
  • Example 2 prepared using sunitinib/malate salt was taken and shown in FIG. 18 .
  • the molecular assembly according to the present invention has a structure in which several APIs are physically bonded.
  • the structure in which the API is physically bonded could not be confirmed at all.
  • the structure according to the present invention is a molecular association structure in which a plurality of APIs are physically bonded.
  • DCF-DA molecular assembly in powder form prepared in Example 5 was compared with the DCF-DA itself in Comparative Example 5.
  • Suspended cells (MV-4-11 human macrophage) were grown in dishes to fill up to 50%.
  • DCF-DA of Comparative Example 5 was dissolved in ethanol, and the DCF-DA molecular assembly of Example 5 was treated with the same concentration of 0.005% in distilled water on cells for 30 minutes, and then PBS (phosphate buffer solution) was used as a buffer solution. The cells were washed with water to remove extracellular DCF-DA and to stop the entry by diffusion.
  • PBS phosphate buffer solution
  • a corneal permeation test was performed on the Sunitinib-malate molecular association in the form of powder prepared in Example 2 and the Sunitinib-malate itself in Comparative Example 2.
  • the corneal permeation experiment is already published paper "Lee et. al , "Modulating the Transport Characteristics of Bruch's Membrane With Steroidal Glycosides and its Relevance to Age-Related Macular Degeneration (AMD). Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2015 , 56 , 8403., 2015".
  • the cell for permeation experiment was self-manufactured as shown in FIG. It is composed of a donor chamber to administer the drug, a receiver chamber, and a membrane through which the drug permeates.
  • the drug is injected into the donor chamber of the wuxing chamber, and the corneal part of the pig eye is 8mm thick.
  • the membrane After removing other tissues attached to the cornea, the membrane is fixed in place, and the solution that permeates the membrane is received in the receiving chamber. At this time, the temperature at which diffusion occurs is set to 37 ° C, which is close to human body temperature. After a certain amount of time passed, the concentration of the solution in each supply chamber and the receiving chamber was measured, and the physical properties of diffusion of each sample could be identified. The concentration of each sample after 18 hours was shown in the table below 1. The concentration was measured using a UV/VIS spectrum (Thermo, Evolution201 UV/Vis) and a peak height of 420 nm.

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Abstract

본 발명은 유/무기물 또는 이들의 염으로 이루어진 무정형 나노 분자 회합체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유/무기물 또는 이들의 염에 전단응력을 가하여 제조하여, 용해도 및 지질막에 대한 투과도가 뛰어난 무정형 나노 분자 회합체에 관한 것이다.

Description

유기물, 무기물 또는 이들의 염으로 이루어진 무정형 나노 분자 회합체 및 그의 제조방법
본 발명은 유/무기물 또는 이들의 염으로 이루어진 무정형 나노 분자 회합체에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 유/무기물 또는 이들의 염에 전단응력을 가하여 제조하여, 용해도 및 지질막에 대한 투과도가 뛰어난 무정형 나노 분자 회합체에 관한 것이다.
일반적으로 유/무기물 또는 이들의 염의 형태를 가지고 있는 약리학적 활성 성분, 소위 유효성분이라 하는 약물을 인체 내의 목표 위치로 효과적으로 전달하기 위해서는, 다음과 같은 2가지의 조건을 만족해야 하는 것으로 알려져 있다.
먼저, 물에 대한 유효성분의 용해도(Aqueous solubility)가 확보되어야 한다. 인체 내의 유체(fluid)는 모두 물을 기반으로 한 용액 또는 분산액이므로, 전달하고자 하는 약물이 체내에서 이동하기 위해서는 물에 대한 용해도나 물에서의 분산상이 충분히 확보되어야 한다.
또한, 소수성(hydrophobic) 막에 대한 유효성분의 투과도(Permeability)가 확보되어야 한다. 인체 내의 세포들은 인지질막과 같이 소수성(hydrophobic) 막으로 둘러 쌓여 있기 때문에, 이를 통과하기 위해서는 약물 분자나 약물의 구조체의 표면성질이 소수성(hydrophobic)을 가지거나, 세포막을 뚫을 수 있을 정도로 매우 작은 사이즈로 되어 있어야 한다.
이러한 약물이 분자상태로 세포막을 투과하기 위한 기존의 방법으로는, 제3의 물질인 계면활성제/고분자 구조체를 활용한 미립구에 에멀전(emulsion)이나 현탁액(suspension)의 형태로 약물을 가두는 봉입 방법이 많이 이용되어 왔다.
그러나, 이러한 약물의 봉입 방법은 봉입 공정이 까다롭다는 제한이 있고, 봉입의 수율이 낮을 수 있으며, 약물이 방출되기 위해서 약물을 둘러싼 계면활성제나 고분자 성분이 제거되거나 이를 통과하여야 하는 문제점이 있다. 또한, 투과가 필요한 세포나 조직의 표면이 대부분 친유성인 인지질 성분 등으로 구성되어 있기 때문에 약물이 친수성일 경우에는 약물의 흡수가 효율적이지 못하다는 문제점이 있다.
이러한 약물의 봉입 방법의 문제점을 해결하기 위하여, 많은 연구자들은 분자 자체의 구조체를 활용하기 보다는, 앞서 언급한 바와 같이 제3의 물질을 활용하여 물리 화학적 결합을 활용하였다.
약물 분자를 물에 분산 또는 용해시키기 위해서, 약물 분자에 극성을 가지게 하여 물 분자와의 극성 상호작용을 유도하거나, 분자의 구조 일부에 PEG 등과 같이 물과 매우 친한 분자를 공유결합 또는 이온 결합(complex)하는 방법 등을 활용할 수 있다.
그러나 이러한 방법은 약물의 분자 구조를 변경시켜야 하는 번거로움이 있고, 이러한 분자의 제조공정에 따른 가격 상승의 문제가 있으며, 또한 변경된 분자구조는 원래 분자와 구조 자체가 다르기 때문에 체내에서 흡수된 이후 원래의 분자 상태로 돌아가야만 처음 의도한 약물의 효과를 나타낼 수 있었다. 따라서, 약물의 분자들이 화학 구조적인 변화 없이, 복수의 응집된 상태를 유지하지 못하기 때문에, 약물이 원래 가지고 있는 효능을 유지하지 못하는 한계도 있었다. 또한, 80 nm의 크기를 가지는 피부 틈새를 침투하는 것이 종래와 같이 수백 나노미터에 이르는 크기의 약물 구조로는 어려웠다.
따라서, 이러한 약물을 제조하기 위한 다양한 방법이 연구되었다. 특히, 약물을 나노미터 사이즈로 제조하기 위한 방법으로는 고압 균질화(high pressure homogenization), 분쇄(milling) 및 피스톤-갭 호모게나이저(piston-gap homogenizer) 등의 top-down 방식(하향식 공정)의 기술과, 침전(precipitation)이나 자가-조립(self-assembly) 등의 bottom-up 방식(상향식 공정)의 기술이 있었다.
top-down 방식(하향식 공정)은 분쇄 등의 방법을 통하여 입자의 크기를 감소시켜 마이크로미터 사이즈의 입자를 제조하는 기술로, 비용 증가, 오염의 위험, 및 반복된 분쇄에 기인한 제품 손상과 같은 단점들을 갖는다. 반면, bottom-up 방식(상향식 공정)은 top-down 방식과는 정반대로 원자나 분자단위에서 나노미터 크기의 구조물로 성장시키는 기술로 벌크(bulk)상태에서 나노미터 크기로 크기를 줄여 나가는 기존의 top-down 방식의 한계성을 극복하기 위한 방안으로 제시된 기술이다. 그러나, 현재의 기술 수준에서는 원자나 분자단위에서의 기술이 갖는 경제적인 이점은 아직 직접적인 결과를 얻기 힘들다. 또한, 기존 방법인 결정 성장을 통하여 저비용 및 간단한 제조 공정을 가지는 장점이 있으나, 결정형의 제품만을 제조할 수 있으며, 결정의 과다 성장 및 이들의 응집화는 계면활성제와 같은 별도의 화합물을 첨가해야 하는 문제점이 있었다.
(특허문헌 1) 대한민국 공개특허 제10-2011-0053775호 (2011.05.24), 집속 초음파를 이용한 나노 분말 분산장치 및 이를 이용한 분산방법
이에 본 발명자들은 전술한 문제점을 해결하기 위해 약리학적 활성 성분인 약물 분자들을 용매에 녹인 후, 분자들을 서로 매우 가깝게 접근시키면, 분자 내에 있는 극성기(polar group)들이 마치 한 개의 개체처럼 거동하는 현상을 확인하였다.
또한, 분자의 접근에 의해서 극성 그룹끼리 상호작용을 할 경우에는 약물 분자들이 전체적으로 소수성(hydrophobic)을 가지게 되지만, 이러한 약물 분자들이 결합된 구조체의 사이즈가 작아지게 되면서, 표면장력이 작아지게 되기 때문에 분산도를 높일 수 있는 것을 확인하였다.
이를 통하여, 분자 수준의 작은 입자를 top-down 방식이 아닌 bottom-up 방식으로 제조하면서도 결정형이 아닌 무정형의 나노 사이즈의 약물의 구조로 제조할 수 있음을 확인하였다.
이를 통하여, 분체의 공극을 활용한 분자 구조체의 제조나, 유연한 롤을 활용한 분자의 접근 등과 같이 분자간의 거리를 근접시키는 다양한 방법을 통하여 새로운 특성을 가지는 분자들이 결합된 구조체를 만들 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 약리학적 활성 성분 분자의 화학적 구조를 변경하지 않고서도, 분자들의 극성 상호작용 또는 수소결합을 활용한 새로운 구조의 분자 회합체를 제조함으로써, 분자 회합체의 표면이 소수성(hydrophobic)을 가지도록 하여, 인지질 막에 대한 투과도를 증가시킨 약리학적 활성 성분 분자 회합체를 제공하는 것이다.
따라서, 본 발명은 기존의 top-down 방식이 아닌 새로운 방식을 이용하여 제조된 것으로, 기존의 무정형 약물 나노 파티클(Amorphous drug nanoparticle)이 가지는 높은 포화 용해도(highest saturation solubility)에 도달 가능한 장점이 있음에도 불구하고, shelf-life 유지기간에 대한 문제점과 무정형의 나노파티클 입자사이즈가 가지는 너무 빠른 dissolution rate으로 인한 문제점을 개선하여 나노메디신 즉, 궁극적으로는 나노테크놀로지 분야에 혁신을 가져다줄 것으로 전망된다. 결론적으로, 본 발명은 50 nm이하의 무정형 나노메디신 및 나노테크놀로지 분야의 새로운 혁신 기술이 될 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 유기물 또는 무기물이 물리적으로 결합된 분자 회합체로서, 상기 분자 회합체에 물을 포함하는 조성물로 형성되는 경우, 상기 조성물 중에서 상기 분자 회합체는 응집된 구조를 가지고, 상기 분자 회합체의 평균 입경은 50nm 이하인, 무정형(amorphous)의 나노 분자 회합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 유기물 또는 무기물의 염이 물리적으로 결합된 분자 회합체로서, 상기 분자 회합체에 물을 포함하는 조성물로 형성되는 경우, 상기 조성물 중에서 상기 분자 회합체는 응집된 구조를 가지고, 상기 분자 회합체의 평균 입경은 50nm 이하인, 무정형(amorphous)의 나노 분자 회합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 유기물, 무기물 또는 이들의 염; 및 물;을 포함하는 조성물을 전단응력을 가할 수 있는 장치 내에 투입한 후,
상기 조성물에 전단응력을 가하여, 유기물, 무기물 또는 이들의 염들이 물리적으로 결합된 분자 회합체를 제조하는, 나노 분자 회합체를 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명은, 약리학적 활성 성분과 같은 유기물, 무기물 또는 이들의 염의 분자 구조를 변경해야 하는 번거로움 없이, 극성 상호작용 또는 수소결합을 활용한 새로운 구조의 분자 회합체를 제조함으로써, 분자 회합체의 표면이 소수성(hydrophobic)을 가지도록 하여, 인지질 막에 대한 투과도를 증가시킬 수 있을 뿐만 아니라, 원래 분자와 화학적 특성 자체가 동일하기 때문에 처음 의도한 약물의 효과를 그대로 나타낼 수 있으며, 제조방법이 간단하여 제조비용을 절약할 수 있다는 장점이 있다.
이러한 장점으로 인하여, 본 발명의 분자 회합체는 다양한 의약용 조성물에 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 약리학적 활성 성분의 분자 회합체를 제조하는 장치의 모식도이다.
도 2은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 약리학적 활성 성분의 분자 회합체를 제조하는 장치의 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 약리학적 활성 성분에 대하여 2차원 NOE(Nuclear Overhauser Effect) 스펙트럼인 NOESY를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 약리학적 활성 성분의 분자 회합체에 대하여 2차원 NOE 스펙트럼인 NOESY를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 NMR 스펙트럼을 비교하여 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 FT-IR 스펙트럼을 비교하여 나타낸 것이다.
도 7a 내지 도 7c는 본 발명의 일 실시예에 따른 HPLC 측정 결과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 NMR 스펙트럼을 비교하여 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 FT-IR 스펙트럼을 비교하여 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 HPLC 측정 결과를 비교하여 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 FT-IR 스펙트럼을 비교하여 나타낸 것이다.
도 12은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 FT-IR 스펙트럼을 비교하여 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 분자 회합체를 촬영한 TEM 사진이다.
도 14는 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 분자 회합체의 XRD 측정결과를 나타낸 그래프이다.
도 15는 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 분자 회합체의 XRD 측정결과를 나타낸 그래프이다.
도 16은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 분자 회합체의 DSC 측정결과를 나타낸 그래프이다.
도 17은 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 분자 회합체를 촬영한 TEM 사진이다.
도 18은 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 분자 회합체를 촬영한 TEM 사진이다.
도 19는 본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 분자 회합체를 촬영한 TEM 사진이다.
도 20은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 분자 회합체의 인지질막 투과 성능을 촬영한 3D 홀로그램 사진이다.
도 21은 본 발명의 다른 일 실시예에 따른 분자 회합체의 각막 투과 성능을 측정한 우싱 챔버의 모식도이다.
본 발명에서는 분자 수준의 작은 입자를 top-down 방식이 아닌 bottom-up 방식으로 제조하면서도 결정형이 아닌 무정형의 나노 사이즈의 약물의 구조를 가지며, 유기물, 무기물 또는 이들의 염의 화학적 구조를 변경하지 않고서도, 극성 상호작용 또는 수소결합을 활용한 새로운 구조의 분자 회합체를 제조함으로써, 분자 회합체의 표면이 소수성(hydrophobic)을 가지도록 하여, 인지질 막에 대한 투과도를 증가시킨, 유기물, 무기물 또는 이들의 염의 분자 회합체를 제시한다.
이하 보다 자세히 설명한다.
유기물, 무기물 또는 이들의 염의 분자 회합체를 제조하는 장치
본 명세서에서 언급하는 유기물, 무기물 또는 이들의 염의 분자 회합체를 제조하는 장치는, 유기물, 무기물 또는 이들의 염이 포함된 용액을 장치 내에 투입한 후, 유기물, 무기물 또는 이들의 염이 포함된 용액에 전단응력을 가하여 유기물, 무기물 또는 이들의 염의 분자 회합체를 제조하는 것을 특징으로 한다.
약물을 나노미터 사이즈로 제조하기 위한 방법으로는 고압 균질화(high pressure homogenization), 분쇄(milling) 및 피스톤-갭 호모게나이저(piston-gap homogenizer) 등의 top-down 방식의 기술과, 침전(precipitation)이나 자가-조립(self-assembly) 등의 bottom-up 방식의 기술이 있었다.
top-down 방식의 제조 기술은 분쇄 등의 방법을 통하여 입자의 크기를 감소시켜 마이크로미터 사이즈의 입자를 제조하는 기술로, 비용 증가, 오염의 위험, 및 반복된 분쇄에 기인한 제품 손상과 같은 단점들을 갖는다.
반면, 침전과 같은 bottom-up 방식의 제조 기술은 결정 성장을 통하여 저비용 및 간단한 제조 공정을 가지는 장점이 있으나, 결정형의 제품만을 제조할 수 있으며, 결정의 과다 성장 및 이들의 응집화는 계면활성제와 같은 별도의 화합물을 첨가해야 하는 문제점이 있었다.
또한, 유기물, 무기물 또는 이들의 염 형태인 약리학적 활성 성분을 인체 내의 타겟으로 잘 전달하기 위해서는, 유기물, 무기물 또는 이들의 염의 물에 대한 용해도(Aqueous solubility)와 소수성(hydrophobic) 막에 대한 투과도(Permeability)가 확보되어야 한다. 이러한 약물이 분자상태로 세포막을 투과하기 위한 기존의 방법으로는, 약물에 극성을 가지게 하여 물 분자와의 극성 상호작용을 유도하거나, 분자의 구조 일부에 PEG 등과 같이 물과 매우 친한 분자를 공유결합 또는 이온 결합(complex)하는 방법 등이 많이 이용되어 왔다.
그러나 이러한 방법은 약물의 분자 구조를 변경시켜야 하는 번거로움이 있고, 또한 변경된 분자구조는 원래 분자와 구조 자체가 다르기 때문에 체내에서 흡수된 이후 원래의 분자 상태로 돌아가야만 처음 의도한 약물의 효과를 나타낼 수 있다는 한계가 있었다.
본 발명자들은 전술한 문제점을 해결하기 위해 유기물, 무기물 또는 이들의 염 형태인 약물 분자들을 용매에 녹인 후, 분자들을 서로 매우 가깝게 접근시키면, 분자 내에 있는 극성기(polar group)들이 상호 작용하여 분자 회합체를 이루고 이들이 한 개의 개체처럼 거동하는 현상을 확인하였다.
이를 통하여, 분자의 접근에 의해서 극성 그룹끼리 상호작용을 할 경우에는 전체적으로 소수성(hydrophobic)을 가지게 되지만, 이러한 약물 분자들이 결합된 구조체의 사이즈가 작아지게 되면서, 표면장력이 작아지게 되기 때문에 분산도를 높일 수 있는 것을 확인하였다.
분체의 공극을 활용한 분자 구조체의 제조나, 유연한 롤을 활용한 분자의 접근 등과 같이 분자간의 거리를 근접시키는 다양한 방법을 통하여 새로운 특성을 가지는 분자들이 결합된 분자 회합체를 만들 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은, 분자 수준의 작은 입자를 top-down 방식이 아닌 bottom-up 방식으로 제조하면서도 결정형이 아닌 무정형의 나노 사이즈의 약물의 구조로 제조하기 위한 것이다.
먼저, 본 발명은 유기물, 무기물 또는 이들의 염이 포함된 용액을 장치 내에 투입한 후, 유기물, 무기물 또는 이들의 염이 포함된 용액에 전단응력을 가하여 유기물, 무기물 또는 이들의 염의 분자 회합체를 제조하는 장치를 제공한다. 유기물, 무기물 또는 이들의 염의 분자 회합체를 제조하는 장치는 유기물, 무기물 또는 이들의 염이 포함된 용액에 전단응력을 가하여 본 발명의 유기물, 무기물 또는 이들의 염의 분자 회합체를 제조할 수 있는 것이라면 특별한 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 롤 밀 공정 또는 볼 밀 공정을 사용하여 전단응력을 가하는 것을 사용할 수 있다.
상기 유기물, 무기물 또는 이들의 염이 포함된 용액을 제조할 때에는, 오일상으로 제조할 수도 있다. 이 때 오일상으로 제조하기 위한 용매로는 Castor oil, MCT oil, 콩기름, 땅콩기름 등과 같이 곡류 추출물로부터 유래된 오일이나, 약리 효능을 나타내는 인삼, 동백, 녹차, 당귀 등의 약초 추출물로부터 유래된 오일 중 어느 하나 이상을 사용할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 유기물, 무기물 또는 이들의 염은 약리학적 활성 성분으로 사용될 수 있으며, 이는 약학적으로 유용한 물질이나 의학적 효과를 지니는 물질이라면 특별한 제한 없이 사용될 수 있다. 일례로 사이클로 스포린A, 파클리탁셀, 도세탁셀, 데커신, 멜록시캄, 이트라코나졸, 셀레콕시브, 카페시타빈, 트라보, 프로스트, 이소플라본, 디클로페낙나트륨, 타이로신 키나아제 저해제인 수니티닙, 파조파닙, 액시티닙, 레고라페닙, 트라메티닙, 진세노사이드 Rg1, 타클로리무스, 알렌드로네이트, 라타노프로스트, 비마토프로스트, 아토바스타틴 칼슘, 로슈바스타틴 칼슘, 엔테카비어, 암포테리신B, 오메가 3, 데옥시콜린산, 우루소데옥시콜린산 등의 다양한 콜린산류나 이의 소듐 또는 포타슘염; 불소로 치환되거나 수소로 존재하는 프레디메솔론 등의 스테로이드류; 유칼립투스유, 라벤더유, 레몬유, 산달우드유, 로즈마리유, 카모마일유, 신나몬유, 오렌지유 등의 향 오일; 알파비사보롤, 비타민A(레티놀), 비타민E, 토코페릴 아세테이트, 비타민D, 비타민F 또는 이들의 유도체; 등을 사용하거나 이들의 조합을 사용할 수 있다.
이렇게 전단응력을 가하는 장치의 한 구체적인 실시예로서, 본 발명의 일 실시예에 따른 유기물, 무기물 또는 이들의 염의 분자 회합체를 제조하는 장치를 설명하기 위한 개략도를 도 1에 나타냈다.
도 1에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 유기물, 무기물 또는 이들의 염의 분자 회합체를 제조하는 장치는 유기물, 무기물 또는 이들의 염이 포함된 용액에 전단응력을 가할 수 있도록 복수의 롤을 구비할 수 있다. 이 때 복수의 롤은 마주보는 2개의 롤일 수도 있고, 이에 추가하여 한 개 또는 수 개의 롤을 더 포함할 수도 있다.
구체적으로, 상기 유기물, 무기물 또는 이들의 염이 포함된 용액(도 1에 일 예로 PTX Sol.로 표시함)을 장치 내의 마주보는 2개의 롤(도 1의 경우 롤 A와 롤 B) 사이에 투입할 수 있다. 이렇게 2개의 롤 사이에 투입된 유기물, 무기물 또는 이들의 염이 포함된 용액에 대하여, 마주보는 2개의 롤을 회전함에 따라, 유기물, 무기물 또는 이들의 염이 포함된 용액 내에 포함된 유기물, 무기물 또는 이들의 염에 전단응력이 가해져, 본 발명에 따른 유기물, 무기물 또는 이들의 염의 분자 회합체가 제조될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 유기물, 무기물 또는 이들의 염의 분자 회합체를 제조하는 장치에서, 상기 마주보는 2개의 롤 사이의 간격은 0.5 내지 1000 ㎛로 설정될 수 있다. 상기 마주보는 2개의 롤 사이의 간격은 예를 들어 0.5㎛ 이상, 1㎛ 이상, 2㎛ 이상, 3㎛ 이상, 4㎛ 이상, 5㎛ 이상, 10㎛ 이상으로 설정될 수 있으며, 1000㎛ 이하, 900㎛ 이하, 800㎛ 이하, 700㎛ 이하, 600㎛ 이하, 500㎛ 이하, 400㎛ 이하, 300㎛ 이하, 200㎛ 이하, 100㎛ 이하로 설정될 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 100 ㎛으로 설정할 수 있다. 상기 마주보는 2개의 롤 사이의 간격이 0.5㎛ 보다 작으면 롤 사이의 토출량이 너무 작아서 생산속도의 문제가 있고 1000㎛ 보다 크면 전단응력이나 압축응력이 너무 적어서 입자의 형성이 용이하지 않은 문제가 있다.
상기와 같이 롤 사이에 용액을 통과시키는 경우, 분자 간에 과도한 힘이 가해져서 top-down 방식의 분쇄가 일어나는 것이 아니라, bottom-up 방식으로 각 분자들 간에 응집된 입자 구조가 만들어지는 것이다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 분자 회합체를 제조하는 장치는, 용액 내에 포함된 유기물, 무기물 또는 이들의 염에 전단응력을 더욱 효율적으로 전달시키기 위하여, 상기 마주보는 2개의 롤이 서로 다른 속도로 회전되도록 할 수 있다. 이 때, 상기 마주보는 2개의 롤 중 어느 하나의 회전속도는 50 내지 250 rpm이고, 다른 하나의 회전속도는 200 내지 500 rpm인 것을 사용할 수 있다. 또는 마주보는 2개의 롤 각각의 회전속도가 1:1.5 내지 1:5의 비율이 되도록 회전시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 분자 회합체를 제조하는 장치에 있어서, 상기 마주보는 2개의 롤의 회전방향이 서로 같은 회전방향을 갖는 co-current 방향으로 설정될 수도 있고, 회전방향이 서로 다른 counter-current 방향으로 설정될 수도 있다.
또한 본 발명의 일 실시예에 따른 분자 회합체를 제조하는 장치는 1회 토출된 내용물을 수 회 반복하여 전단응력이나 압축응력을 반복하여 인가할 수 있다.
또한, 본 발명은 유기물, 무기물 또는 이들의 염이 포함된 용액을 장치 내 제1측 방향으로 투입하고, 다른 용액을 상기 제1측과 마주보는 제2측 방향으로 투입한 후, 전단응력을 가하여 분자 회합체를 제조하는 장치를 제공한다. 본 발명의 분자 회합체를 제조하는 장치 역시 유기물, 무기물 또는 이들의 염이 포함된 용액에 전단응력을 가하여 본 발명의 분자 회합체를 제조할 수 있는 것이라면 특별한 제한 없이 사용할 수 있으나, 바람직하게는 롤 밀 공정 또는 볼 밀 공정을 사용하여 전단응력을 가하는 것을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약리학적 활성 성분은 앞서 언급한 것과 동일한 것을 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 수용성 화합물은 구연산(Citric acid), 탄산(Carbonic acid), 젖산(Lactic acid), 초산 (Acetic acid), 인산 (Phosphoric acid), 아스코르브산(Ascorbic acid), 말산(Malic acid), 타타르산(Tartaric acid), 글루타릭산(Glutaric acid), 숙신산(Succinic acid), 말레산(Maleic acid), 푸마릭산(Fumaric acid), 말론산(Malonic acid), HCl, H2SO4, NaH2PO4, NaHCO3, KHCO3, Na2CO3, K2CO3, Na3PO4, K3PO4, NaH2PO4, NH4OH, 아세트산염나트륨(NaOAc), KOH, NaOH 및 Ca(OH)2로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.
이렇게 전단응력을 가하는 장치의 한 구체적인 실시예로서, 본 발명의 일 실시예에 따른 분자 회합체를 제조하는 장치를 설명하기 위한 개략도를 도 2에 나타냈다.
도 2에 도시된 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 분자 회합체를 제조하는 장치는 유기물, 무기물 또는 이들의 염이 포함된 용액에 전단응력을 가할 수 있도록 복수의 롤을 구비할 수 있다. 이 때 복수의 롤은 마주보는 2개의 롤(롤 A, 롤 B)일 수도 있고, 도 2와 같이 한 개 또는 수 개의 롤을 더 추가(롤 C)하여 포함할 수도 있다.
구체적으로, 상기 유기물, 무기물 또는 이들의 염이 포함된 용액(도 2에 일 예로 PTX Sol.로 표시함)을 제1롤 측에 투입하고, 상기 수용성 화합물이 포함된 용액(도 2에 일 예로 Sucrose Sol.로 표시함)을 상기 제1롤과 마주보는 제2롤 측에 투입할 수 있다.
이렇게 2개의 롤의 서로 다른 측 방향으로 각각 투입된 유기물, 무기물 또는 이들의 염이 포함된 용액과 수용성 화합물이 포함된 용액에 대하여, 마주보는 2개의 롤이 회전함에 따라서, 이들 용액 내에 포함된 유기물, 무기물 또는 이들의 염과 수용성 화합물에 전단응력이 가해져, 본 발명에 따른 유기물, 무기물 또는 이들의 염의 분자 회합체를 제조할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따른 분자 회합체를 제조하는 장치에 있어서, 상기 마주보는 2개의 롤 사이의 간격은 0.5 내지 1000 ㎛로 설정될 수 있다. 상기 마주보는 2개의 롤 사이의 간격은 예를 들어 0.5㎛ 이상, 1㎛ 이상, 2㎛ 이상, 3㎛ 이상, 4㎛ 이상, 5㎛ 이상으로 설정될 수 있으며, 1000㎛ 이하, 900㎛ 이하, 800㎛ 이하, 700㎛ 이하, 600㎛ 이하, 500㎛ 이하로 설정될 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 500 ㎛으로 설정할 수 있다.
상기 마주보는 2개의 롤 사이의 간격이 0.5㎛ 보다 작으면 롤 사이의 토출량이 너무 작아서 생산속도의 문제가 있고 1000㎛ 보다 크면 전단응력이나 압축응력이 너무 적어서 입자의 형성이 용이하지 않은 문제가 있다.
또한, 용액 내에 포함된 유기물, 무기물 또는 이들의 염에 전단응력을 더욱 효율적으로 전달하기 위하여, 상기 마주보는 2개의 롤은 서로 다른 속도로 회전하도록 할 수 있다. 이 때, 상기 마주보는 2개의 롤 중 어느 하나의 회전속도는 50 내지 150 rpm이고, 다른 하나의 회전속도는 200 내지 500 rpm인 것을 사용할 수 있다. 또는 마주보는 2개의 롤 각각의 회전속도가 1:1.5 내지 1:5의 비율이 되도록 회전시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 분자 회합체를 제조하는 장치에 있어서, 상기 마주보는 2개의 롤의 회전방향이 서로 같은 회전방향을 갖는 co-current 방향으로 설정될 수도 있고, 회전방향이 서로 다른 counter-current 방향으로 설정될 수도 있다.
또한 본 발명의 일 실시예에 따른 분자 회합체를 제조하는 장치는 1회 토출된 내용물을 수 회 반복하여 전단응력이나 압축응력을 반복하여 인가할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 분자 회합체를 제조하는 장치는 상기 제1롤과 제2롤 사이를 통과하는 용액들에 다시 전단응력을 가하는 제3롤을 추가로 구비할 수 있다. 상기 제3롤은 상기 제2롤과의 사이에서 전단응력을 가할 수 있으며, 상기 마주보는 제2롤과 제3롤 사이의 간격은 0.5 내지 1000 ㎛로 설정될 수 있다. 상기 마주보는 2개의 롤 사이의 간격은 예를 들어 0.5㎛ 이상, 1㎛ 이상, 2㎛ 이상, 3㎛ 이상, 4㎛ 이상, 5㎛ 이상으로 설정될 수 있으며, 1000㎛ 이하, 900㎛ 이하, 800㎛ 이하, 700㎛ 이하, 600㎛ 이하, 500㎛ 이하로 설정될 수 있으며, 바람직하게는 5 내지 500 ㎛으로 설정할 수 있다. 상기 제2롤과 제3롤 사이의 간격이 0.5㎛ 보다 작으면 롤 사이의 토출량이 너무 작아서 생산속도의 문제가 있고 1000㎛ 보다 크면 전단응력이나 압축응력이 너무 적어서 입자의 형성이 용이하지 않은 문제가 있다.
또한, 전단응력을 더욱 효율적으로 전달하기 위하여, 상기 제2롤과 제3롤은 서로 다른 속도로 회전하도록 할 수 있다. 이 때, 상기 제2롤과 제3롤 중 어느 하나의 회전속도는 200 내지 500 rpm이고, 다른 하나의 회전속도는 600 내지 1200 rpm인 것을 사용할 수 있다. 또는 제2롤과 제3롤의 회전속도가 1:1.5 내지 1:5의 비율이 되도록 회전시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 분자 회합체를 제조하는 장치는 상기 방법에 제한되는 것이 아니며, 유기물, 무기물 또는 이들의 염에 전단응력을 가할 수 있는 장치라면 자유롭게 변형 가능함은 물론이다.
유기물, 무기물 또는 이들의 염의 분자 회합체
본 발명자들은 유기물, 무기물 또는 이들의 염 형태인 약물 분자들을 용매에 녹인 후, 분자들을 서로 매우 가깝게 접근시키면, 분자 내에 있는 극성기(polar group)들이 상호 작용하여 분자 회합체를 이루고 이들이 한 개의 개체처럼 거동하는 현상을 확인하였다.
이를 통하여, 분자의 접근에 의해서 극성 그룹끼리 상호작용을 할 경우에는 전체적으로 소수성(hydrophobic)을 가지게 되지만, 이러한 약물 분자들이 결합된 분자 회합체의 사이즈가 작아지게 되면서, 표면장력이 작아지게 되기 때문에 분산도를 높일 수 있는 것을 확인하였다.
분체의 공극을 활용한 분자 회합체의 제조나, 유연한 롤을 활용한 분자의 접근 등과 같이 분자간의 거리를 근접시키는 다양한 방법을 통하여 새로운 특성을 가지는 분자들이 결합된 분자 회합체를 만들 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 명세서에서 언급하는 장치에 의하여 제조되는 나노 분자 회합체는 다음과 같은 특징을 가진다.
먼저, 본 발명에 따른 나노 분자 회합체는, 상기 분자 회합체의 전구체인 유기물, 무기물 또는 이들의 염이 포함된 용액에 전단응력을 가하여 유기물, 무기물 또는 이들의 염의 분자간의 거리가 매우 가깝게 접근시켜 분자 회합체를 제조함에 따라서, 나노 입자 사이즈를 가지면서도 무정형(amorphous)의 특징을 가지게 된다. 즉, 동일한 구조의 분자들 사이에 전단응력을 가하여, 이들끼리 물리적으로 결합되어 있는 나노 사이즈의 무정형 분자 회합체가 되는 것이다.
또한 상기 분자 회합체와, 상기 분자 회합체의 전구체인 유기물, 무기물 또는 이들의 염의 크로마토그래피에 의한 측정값이 동일하고, 상기 분자 회합체와, 상기 분자 회합체의 전구체인 약리학적 활성 성분의 분광학(Spectroscopy)에 의한 측정값이 상이한 특징을 가지게 된다.
물질의 구조를 알 수 있는 일반적인 방법으로는 원소 분석, FT-IR, NMR, UV spectroscopy, X-ray, DSC(differential scanning calorimeter) 등의 다양한 기기분석을 통한 방법들이 있다. 이중에서도 화학적 구조, 즉 분자를 구성하는 원자와 이의 연결을 가장 잘 보여주는 분석방법으로는 NMR과 FT-IR이 있다. 보통 X-ray나 DSC는 결정구조와 같이 분자들이 형성하는 결정구조와 같이 이차구조를 조사하기 위해서 많이 사용하는 방법이다. 이외에도 주사 전자현미경이나 투고 전자현미경 등을 활용하여 미세구조를 분석하기도 한다.
언급한 방법 중에서, NMR은 분자의 전자 구조에 의해 결정되는 원자핵의 전자 환경을 알 수 있다. 본 발명의 결과물은 어떤 화합물과 이의 물리적 구조체를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 물리적 구조체가 형성되는 과정에서 화학적 변이가 없다는 것을 알아보는 방법으로서 NMR은 매우 유용한 정보를 제공한다. 화학적 결합의 생성이나 소멸이 없다면, 기본적으로 화합물과 그의 물리적 구조체는 유사한 NMR spectra를 지니게 된다. 물론 얼마나 가까운 거리에서 화합물끼리 분자 회합체를 형성하는지를 알기 위해서 NOE(Nuclear Overhauser Effect)나 이차원의 NOESY spectrum을 통해 통상 0.5 nm거리에 위치한 화합물 분자간 거리를 대략적으로 측정해보았다.
또한, 본 발명에 따른 나노 분자 회합체의 일 실시예에 따르면, 상기 분자 회합체는 분자간의 거리가 10Å 이하일 수 있다. 상기 분자간의 거리는 분자 회합체를 이루고 있는 분자를 기준으로 이들 분자들의 평균 거리를 측정하는 것을 의미하며, 예를 들어 NMR의 NOE를 이용하여 측정할 수 있다. 한 개의 수소를 펄스를 이용하여 여기하면, 가까운 거리에 있는 수소의 intensity가 증가하는 현상을 NOE(Nuclear Overhauser Effect)라고 하며, 이는 수소 핵간 거리의 여섯 제곱에 반비례한다. 따라서 분자내의 수소라 하더라도 거리가 멀면, NOE에 의한 피크세기의 증가에 기여하지 않는다. 그런데 분자가 매우 근접하게 되면, 분자내 수소의 거리보다 분자간 수소의 거리가 가까워지면, NOE가 발견되고, 이는 분자간의 거리가 매우 가까워짐을 의미한다. 일반적으로 1nm보다 가까운 거리에 있을 때 NOE가 관찰되는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서도 NaDC(sodium Deoxycholate) 화합물과 본 발명에서 얻어진 분자 회합체에 대해서 이차원 NOESY NMR을 통해서 분자간의 거리가 매우 가까워서 옹스트롬(10-10 m) 정도의 스케일로 모여 있음을 확인한 바 있다.
도 3 및 도 4에서 NaDC 분자와 이의 분자 회합체에 대한 2차원 NOE 스페트럼인 NOESY를 각각 표시하였다. 도 3 및 도 4에서 *,**로 표시된 부분은 동일한 위치를 나타낸다. 도 3의 NaDC 분자 자체에서 *,**로 표시된 영역에서는 off-diagonal 피크가 나타나지 않는 반면 도 4의 NaDC의 분자 회합체에서는 *,** 로 표시된 영역에 off-diagonal 피크가 나타남을 알 수 있다. 이는 순수한 NaDC에서는 2개의 핵의 거리가 서로 멀었지만, 분자 회합체가 만들어지면서 2개의 핵의 거리가 가까워짐을 나타낸다. 이를 통하여, 분자 회합체가 형성될 때 분자간의 거리가 매우 가까워진다는 것을 알 수 있다. 일반적으로 두 수소가 NOE를 나타내기 위해서 필요한 거리는 물리적으로 대략 6 Å(옹스트롬) 정도라고 알려져 있으므로, 본 발명의 분자 회합체를 형성하는 분자간 거리 역시 대략 6 Å(옹스트롬) 정도의 범위 안에 있음을 알 수 있다.
요약하면 분자 자체에서는 멀리 있어서 나타나지 않던 피크가 본 발명에서 제공하는 나노 분자 회합체에서 나타나는 이유는, 나노 분자 회합체에 결합된 유기물, 무기물 또는 이들의 염의 분자들의 물리적 위치가 변경되는 것에 기인한다. 즉, 분자 회합체 내의 분자 간의 거리가 매우 가깝다는 것을 의미하는 것이다.
NMR의 스펙트럼에서의 피크 위치는 상술한 바와 같이 원자의 결합으로 이루어진 분자 내에서 원자핵에 인가되는 자기장의 크기에 따라서 회전운동하는 주파수를 의미한다. 원자핵에 인가되는 자기장의 크기는 주변의 작용기가 전자를 밀고 당기는 성질에 따라서 달라지고, 결과적으로 핵에 인가되는 자기장의 세기가 커지면 높은 주파수로 이동하고, 반대로 핵 주변에 전자가 많아서 핵이 느끼는 자기장의 세기를 약하게 만들면, 핵의 회전운동 주파수가 낮은 방향으로 줄어든다. 분자들의 회합체가 물리적으로 형성되면, 상호작용이 강한 분자간의 거리에 의해서 원자핵의 전자 구름의 밀도가 달라지게 된다. 또 다른 방식으로는 자기장 하에서 링 전류가 형성되는 페닐링(C6H5-) 근처에 있는 핵은 링전류에 의해서 자기장의 크기가 국부적으로 변화되어 핵의 회전수가 변화되게 된다. 또한 C=O와 같이 이중결합에 의해 전자밀도가 높은 경우에도 주변의 핵이 C=O과의 상대적 위치에 따라서 자기장의 세기가 달라지기 때문에 피크의 위치가 up field나 down field로 이동할 수 있다.
본 발명에 의하여 제조되는 분자 회합체의 경우, 별도의 바인더나 첨가물이 없더라도 분자간의 상호 작용에 의하여 물리적으로 결합이 되며, 실질적으로 유기물 또는 무기물로 이루어질 수 있다.
이러한 점을 통하여 판단해보면, 본 발명에 의하여 제조되는 분자 회합체와, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 유기물 또는 무기물의 NMR로 측정된 결과값을 비교할 때, NMR 스펙트럼의 피크 위치가 일부 변화하게 되며, 이는 상기 나노 분자 회합체와, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 유기물 또는 무기물 사이의 화학적 구조의 변화는 없지만 물리적 구조의 변화가 생김에 따른 것이라는 것을 알 수 있다. 구체적으로, 상기 나노 분자 회합체와, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 유기물 또는 무기물의 NMR로 측정된 결과값을 비교할 때, 1HNMR 기준으로 peak의 이동이 0.005ppm 이상인 경우, 상이한 것으로 판단할 수도 있다.
한편, FT-IR의 경우에는 분자를 구성하는 결합을 구성하는 전자의 밀도가 편재화 되어서, 분자가 운동할 때 쌍극자 모멘트의 변화가 일어나는 경우에 피크의 변화가 잘 나타나는 것으로 알려져 있으며, 스펙트럼의 피크들은 여러가지의 신축(stretching)과 굽힘(bending)과 같은 분자 운동에 의해서 여기되는 것으로 알려져 있다. 분자의 결합이 극성을 띄는 것은 이원자(heteroatom)에 의해서 형성된 경우 피크의 변화가 많이 나타난다. 예를 들어 탄소와 산소 사이에 일차결합인 에테르 결합(C-O)이나 이차결합인 카보닐 결합(C=O) 등은 적외선 레이저에 의해서 신축밴드가 나타난다. 또한 탄소와 수소의 경우에도 서로 다른 분자의 결합이기 때문에 신축 밴드가 나타난다. 스트레칭의 경우에는 두개의 질량이 용수철로 연결된 모델로 설명할 수 있으며, 용수철이 운동을 여기하는 에너지가 적외선에 의해 공급되면, 스펙트럼에서 피크가 나타나게 된다.
여러 개의 탄소가 서로 연결된 경우에도 벤젠과 같이 여섯 개의 원자가 결합되어 있는 경우에는 in-plane 바이브레이션, out of plane 바이브레이션과 같은 다양한 굽힘 피크가 나타나게 된다. 특히 굽힘 운동의 경우에는 다양한 종류의 분자 운동이 FT-IR spectrum에 의해서 관찰 가능하다. 예를 들면 좌우로 운동하는 rocking, 가위처럼 운동하는 scissoring, 평면의 앞뒤로 흔들리는 wagging, 마치 꼬임이 일어나는 것을 반복하는 twisting/torsion 등이 일어난다.
강한 극성을 띄는 분자의 구조들은 수소결합, 극성 상호작용 또는 파이-파이 스택킹(stacking)과 같은 상호작용을 할 수 있고, 이러한 상호 작용이 FT-IR 스펙트럼에서 피크의 위치와 세기에 변화를 야기한다. 그래서 동일한 분자 결합도 주변환경에 의해서 피크의 위치와 세기에 변화가 생기는 경우가 있다. 즉 FT-IR spectrum이 동일하면 동일한 분자임을 알 수 있다. 특히 400 cm-1 ~ 700 cm-1 사이를 지문영역(fingerprint zone)이라고 하며, 이 영역 사이에서 피크가 동일하면 동일한 화합물로 간주한다.
본 발명에서는 화합물을 물리적 회합체인 분자 회합체의 구조로 형성하는 것을 그 목적으로 한다. 이와 같이 화합물을 물리적 회합체인 분자 회합체로 형성할 때, 회합체 내의 분자간 거리는 약 10Å 이내 또는 5Å 이내로 매우 가깝게 존재한다. 분자 내의 결합이 적외선에 의해서 여기가 될 때 분자 회합체 내의 화합물 결합이 신축이나 굽힘의 분자운동을 되고, 이때 화합물과 매우 가까운 거리내에 존재하는 화합물로 인해서 원래의 화합물 스펙트럼에서 나타나지 않던 피크가 나타나기도 하고, 소멸되기도 하며, 피크의 위치가 변하거나 피크의 세기가 줄어들거나 늘어나는 등의 여러가지 변화가 수반되는 경우가 본 발명의 분자 회합체에서 나타난다는 것을 알게 되었다.
즉, 상기 FT-IR로 측정된 결과값을 기준으로 1개 이상의 피크가 생성 또는 소멸되는 경우, 상이한 것으로 판단할 수 있다.
본 발명에 의하여 제조되는 상기 나노 분자 회합체와, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 유기물 또는 무기물의 FT-IR로 측정된 결과값을 비교할 때, FT-IR 스펙트럼의 1개 이상의 피크가 생성 또는 소멸되며, 이는 상기 나노 분자 회합체와, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 유기물 또는 무기물 사이의 화학적 구조의 변화는 없지만 물리적 구조의 변화가 생김에 따른 것이라는 것을 알 수 있다. 또한, 상기 나노 분자 회합체와, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 유기물 또는 무기물의 FT-IR로 측정된 결과값을 비교할 때, 한 개 이상의 피크의 위치가 5 cm-1 이상 달라지는 경우, 상이한 것으로 판단할 수 있다. 즉, 화합물을 분자 회합체로 전환하는 것은 물리적 작용에 따른 것이지, 새로운 화학결합이 만들어지거나 화학결합이 사라지는 것은 아니라는 말이다. 따라서 이러한 스펙트럼의 변화가 본 발명에서 종래에 없던 새로운 구조의 분자 회합체가 만들어졌다는 점을 잘 설명할 수 있다.
다만, 본 발명에 의하여 제조되는 상기 나노 분자 회합체와, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 유기물 또는 무기물은 화학적 구조는 앞서 언급한 바와 같이 동일하다. 이는 상기 나노 분자 회합체와, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 유기물 또는 무기물에 대하여 크로마토그래피에 의한 분석을 진행하고, 이 측정값이 동일하다는 것을 통하여 알 수 있다. 상기 크로마토그래피에 의한 측정값은 HPLC(high-performance liquid chromatography)로 측정된 결과값일 수 있으며, 본 발명에서 제공하는 결과물인 유기물 또는 무기물과 이의 분자 회합체는 거의 동일한 위치에서 피크가 나타나며, 대략 10%(즉, ±5%) 이내의 retention time을 지니는 것으로 관찰된다. 일반적으로 동일한 칼럼과 이동상 및 고정상을 지니는 경우에는 10% 이내의 시간에서 나타나는 피크는 동일한 물질로 판단할 수 있다.
이와 같이, 상기 나노 분자 회합체와, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 유기물 또는 무기물은 물리적 구조가 상이하기 때문에, NMR 스펙트럼에서는 두 개의 목적물질이 대개의 피크가 유사하거나, 일부는 변경될 수 있고, FT-IR상에서는 피크의 생성 및 소멸 그리고 피크의 세기의 변화와 같이 다양한 형태의 변화가 나타날 수 있다. 또한, 상기 나노 분자 회합체와, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 유기물 또는 무기물은 화학적 구조가 동일하기 때문에, 크로마토그래피에 의한 측정값이 동일할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 나노 분자 회합체와 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 유기물 또는 무기물의 NMR 측정은 특별한 제한은 없으나, 일례로 Bruker 400 MHz Avance를 사용하여 측정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 나노 분자 회합체와 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 유기물 또는 무기물의 FT-IR 측정은 특별한 제한은 없으나, 일례로 Bruker Alpha 2 ATR을 사용하여 측정할 수 있다.
다음으로, 본 발명에 따른 약물 분자 유래의 또 다른 분자 회합체는, 상기 나노 분자 회합체의 전구체로서 유기물 또는 무기물의 염이 포함된 용액에 전단응력을 가하여 유기물 또는 무기물의 염이 물리적으로 결합된 구조의 나노 분자 회합체를 제조하는 것을 특징으로 한다.
이렇게 제조된 분자 회합체는, 약리학적 활성 성분 및 수용성 화합물이 결합된 분자 회합체로서, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 유기물 또는 무기물의 염과, 상기 유기물 또는 무기물의 염이 결합된 분자 회합체의 크로마토그래피에 의한 측정값이 동일하고, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 유기물 또는 무기물의 염과, 상기 유기물 또는 무기물의 염이 결합된 분자 회합체의 분광학(Spectroscopy)에 의한 측정값이 상이한 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 나노 분자 회합체에 있어서, 크로마토그래피에 의한 측정값과 분광학에 의한 측정값은 앞서 언급한 내용과 동일하다.
마찬가지로, 별도의 바인더나 첨가물이 없더라도 분자간의 상호 작용에 의하여 물리적으로 결합이 되며, 실질적으로 유기물 또는 무기물의 염으로 이루어질 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유기물 또는 무기물의 염은 약리학적 활성 성분으로 사용되는 것을 사용할 수 있으며, 앞서 언급한 유기물 또는 무기물들의 염을 사용할 수 있다.
앞서 살펴본 바와 같이, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 유기물 또는 무기물의 염과, 상기 유기물 또는 무기물의 염이 물리적으로 결합된 분자 회합체는 물리적 구조가 상이하기 때문에, NMR 스펙트럼에서는 두 개의 목적물질이 대개의 피크가 유사하고, 일부는 변경될 수 있고, FT-IR상에서는 피크의 생성 및 소멸 그리고 피크의 세기의 변화와 같이 다양한 형태이 변화가 나타날 수 있게 된다.
예를 들어, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 유기물 또는 무기물의 염과, 상기 유기물 또는 무기물의 염이 결합된 분자 회합체의 NMR로 측정된 결과값을 비교할 때, 피크 위치가 변화하는 경우 상이한 것으로 판단할 수 있으며, 구체적으로 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 유기물 또는 무기물의 염과, 상기 유기물 또는 무기물의 염이 결합된 분자 회합체의 NMR로 측정된 결과값을 비교할 때, 1HNMR 기준으로 peak의 이동이 0.005ppm 이상인 경우, 상이한 것으로 판단할 수 있다.
또한, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 유기물 또는 무기물의 염과, 상기 유기물 또는 무기물의 염이 결합된 분자 회합체의 FT-IR로 측정된 결과값을 비교할 때, 1개 이상의 피크가 생성 또는 소멸되는 경우, 상이한 것으로 판단할 수 있으며, 구체적으로 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 유기물 또는 무기물의 염과, 상기 유기물 또는 무기물의 염이 결합된 분자 회합체의 FT-IR로 측정된 결과값을 비교할 때, 한 개 이상의 피크가 5 cm-1 이상 달라지는 경우, 상이한 것으로 판단할 수 있다.
또한, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 유기물 또는 무기물의 염과, 상기 유기물 또는 무기물의 염이 결합된 분자 회합체는 화학적 구조가 동일하기 때문에, 크로마토그래피에 의한 측정값은 동일할 수 있다. 구체적으로, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 유기물 또는 무기물의 염과, 상기 유기물 또는 무기물의 염이 결합된 분자 회합체의 HPLC로 측정된 결과값이 10% 이내의 retention time을 가지는 경우 동일한 것으로 판단할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 나노 분자 회합체는 입자 사이즈가 매우 작아서 50nm 이하의 평균 입경을 가질 수 있으며, 바람직하게는 30 nm 이하일 수 있으며, 더 바람직하게는 20 nm 이하일 수 있으며, 매우 바람직하게는 15 nm 이하일 수 있으며, 가장 바람직하게는 10nm 이하이거나 5nm 이하일 수 있다. 상기 평균 입경은 회절실험을 통하여 측정할 수 있으며, 바람직하게는 Small Angle Neutron Scattering (SANS)를 사용하여 측정할 수 있다. 또한 Transmission Electron Microscopy를 이용하여 image를 측정할 수도 있다. 상기 나노 분자 회합체의 평균 입경이 50 nm를 초과하게 되면 분산성이 떨어지고, 투명도와 투과도가 떨어지는 문제가 있다. 또한, 상기 나노 분자 회합체의 평균 입경의 하한치는 특별한 제한은 없으나 약 1nm 이상인 것을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 통하여 본 발명의 제조방법을 보다 상세히 설명한다. 본 발명은 이들 실시예에 국한되는 것이 아님은 당연하다 할 것이다.
실시예
사용 장비
3 roll mill
Figure PCTKR2022011132-appb-img-000001
제조
[실시예 1]
NaDC(Sodium Deoxycholate, 중국 시안 리파 바이오텍사) 19.8 mg을 물 10 mL에 녹여서 약 0.2% 농도의 NaDC 수용액을 제조하였다. 도 1와 같이, 롤 A, 롤 B의 2개의 롤로 구성된 롤 밀을 준비한 후, 롤 A와 롤 B 사이에 50 ml/min의 투입속도로 상기 제조된 NaDC 용액을 투입하였다. 상기 롤 A의 회전속도는 100rpm, 롤 B의 회전속도는 300rpm로 조절하였고, 상기 롤 A와 롤 B의 간격을 10㎛로 설정하였다.
수득한 수용액을 -50℃에서 얼린 후 동결건조기를 통해 0.1 bar, -70℃의 온도, 압력에서 48시간동안 운전하여 물을 제거하였다. 수득한 시료는 흰색의 분말이었다.
[비교예 1]
NaDC 수용액을 만들고, 이의 분자 회합체를 제조하는 롤 공정을 진행하지 않은 것을 제외하고, 나머지는 실시예 1과 동일한 공정을 통해서 NaDC 분말을 수득하였다.
[실시예 2]
Sunitinib-malate(SUNITINIB MALATE, TEVA) 500mg을 에탄올 100 mL에 녹여서 약 0.5% 농도의 Sunitinib 용액을 제조하였다. 도 1와 같이 롤 장치에 투입하여 분자 회합체를 제조하였다, 이 때 각 용액의 투입 속도는 50 ml/min이었다. 상기 롤 A의 회전속도는 100rpm, 롤 B의 회전속도는 300rpm로 조절하였고, 상기 롤 A와 롤 B의 간격을 10 ㎛으로 설정하였다.
이 후, 롤 밀을 통해 회수된 수용액을 -50℃에서 얼린 후 동결건조기를 통해 0.1 bar, -70℃의 온도, 압력에서 48시간 동안 운전하여 물을 제거하여 "Sunitinib/Maleate의 분자 회합체"를 파우더 형태로 얻었다.
[비교예 2]
Sunitinib maleate를 수용액을 만들고, 이의 분자 회합체를 제조하는 롤 공정을 진행하지 않은 것을 제외하고, 나머지는 실시예 2와 동일한 공정을 통해서 Sunitinib maleate 분말을 수득하였다.
[실시예 3]
상기 롤 A와 롤 B의 간격을 90㎛로 설정한 것을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 시료를 제조하였다.
[실시예 4]
Sunitinib-malate(SUNITINIB MALATE, TEVA) 대신 niclosamide를 사용하고, 상기 롤 A와 롤 B의 간격을 90㎛로 설정한 것을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 시료를 제조하였다.
[비교예 3]
상기 롤 A와 롤 B의 간격을 110㎛로 설정한 것을 제외하고, 실시예 2와 동일한 방법으로 시료를 제조하였다.
[비교예 4]
상기 롤 A와 롤 B의 간격을 110㎛로 설정한 것을 제외하고, 실시예 4와 동일한 방법으로 시료를 제조하였다.
[실시예 5]
DCF-DA (2',7'-Dichlorofluorescin diacetate, 시그마 알드리치사) 19.8 mg을 물 10 mL에 녹여서 약 0.2% 농도의 NaDC 수용액을 제조하였다. 도 1과 같이, 롤 A, 롤 B의 2개의 롤로 구성된 롤 밀을 준비한 후, 롤 A와 롤 B 사이에 50 ml/min의 투입속도로 상기 제조된 DCF-DA 용액을 투입하였다. 상기 롤 A의 회전속도는 100rpm, 롤 B의 회전속도는 300rpm로 조절하였고, 상기 롤 A와 롤 B의 간격을 10㎛로 설정하였다.
수득한 수용액을 -50℃에서 얼린 후 동결건조기를 통해 0.1 bar, -70℃의 온도, 압력에서 48시간 동안 운전하여 물을 제거하였다. 수득한 시료는 노랑색을 띄는 형광색 분말이었다.
[비교예 5]
DCF-DA를 수용액을 만들고, 이의 분자 회합체를 제조하는 롤 공정을 진행하지 않은 것을 제외하고, 나머지는 실시예 5와 동일한 공정을 통해서 DCF-DA 분말을 수득하였다.
[실시예 6]
NaDC 대신 사이클로 스포린 A를 사용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 분자 회합체를 제조하였다.
[비교예 6]
사이클로 스포린 A를 수용액으로 만들고, 이의 분자 회합체를 제조하는 롤 공정을 진행하지 않은 것을 제외하고, 나머지는 실시예 6과 동일한 공정으로 API를 수득하였다.
실험예 1: 실시예 1 및 비교예 1의 화학적/물리적 구조 비교
실시예 1에서 제조한 파우더 형태의 NaDC 분자 회합체와 비교예 1의 NaDC 자체에 대해, NMR(Nuclear Magnetic Resonance; Bruker 400MHz Avance) 및 FT-IR (Fourier-transform infrared spectroscopy; Bruker Alpha 2 ATR)을 이용하여 스펙트럼을 측정하였으며, NMR에 따른 스펙트럼 결과를 도 5에, FT-IR에 따른 스펙트럼 결과를 도 6에 나타내었다.
도 5에서 나타난 바와 같이 NaDC의 두 개의 스펙트럼을 볼 수 있다. 도 5의 상단의 스펙트럼은 본 발명 분자 회합체의 전구체인 약리학적 활성 성분인 NaDC(순수한 화합물, 비교예 1)의 H-NMR 스펙트럼을 나타냈고, 도 5의 하단에는 NaDC를 본 발명의 제조방법에 의하여 제조한 분자 회합체에 대한 H-NMR 스펙트럼을 나타냈다. 도 5의 상단과 하단을 비교하면, 도 5의 상단의 경우에는 피크가 매우 날카롭고, 좋은 분해능을 나타낸 반면 도 5의 하단에 나타난 스펙트럼에서는 피크가 뭉툭하고 겹침 현상이 발견된다. 이 차이는 본 발명의 제조방법에 의하여 제조한 분자 회합체의 구조가 형성되면서 실질적인 분자운동이 일어나는 분자량이 달라지고, T2(spin-spin relaxation time)가 짧아지기 때문이다.
도 6에서 상기 두 물질의 FT-IR 스펙트럼을 나타냈다. 파란색으로 표시한 순수한 NaDC (비교예 1)의 스펙트럼과, 붉은색으로 표현한 본 발명의 제조방법에 의하여 제조한 실시예 1의 분자 회합체의 스펙트럼을 비교하면, 특징적으로 새로운 피크를 발견할 수 있다. 600cm-1 705cm-1, 820cm-1, 1150cm-1에서 나타난 네 개의 피크는 분자 회합체가 형성되면서 기존의 신축 굽힘 운동 이외에 새로운 분자운동 mode가 생겼음을 의미한다.
상기 도 5와 도 6의 스펙트럼 결과를 통하여, 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 상기 나노 분자 회합체와, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 약리학적 활성 성분에 대하여 NMR 또는 FT-IR 등의 분광학(Spectroscopy)적 분석으로 측정된 결과값이 서로 상이하며, 이러한 결과값의 차이는, 양 물질의 물리적인 구조가 상이함에 기인하는 것으로 판단하였다. 구체적으로 NMR로 측정된 결과값을 비교하는 경우에는 피크 위치가 변화하는 경우 상이한 것으로 판단하고, FT-IR로 측정된 결과값을 비교하는 경우에는 1개 이상의 피크가 생성 또는 소멸되는 경우 상이한 것으로 판단할 수 있었으며, 이 때 결과값이 서로 상이한 것은 두 물질의 물리적 구조가 상이함에 따라 발생하는 것임을 알 수 있었다.
뿐만 아니라, 실시예 1에서 제조한 파우더 형태의 NaDC의 분자 회합체와 비교예 1의 NaDC에 대하여 HPLC(Waters사의 e2695)측정을 진행하였으며, 그 결과를 도 7 (a)에 기재하였다. 도 7 (a)의 붉은색 타원으로 나타낸 주된 피크와 같이, 구조체를 제조하기 전의 API(비교예)와 전단응력이 가해져 새롭게 제조된 분자 회합체의 크로마토그래피 특성이 동일하며, 이를 통해 동일한 피크를 가지는 동일한 물질이라는 것이 확인할 수 있습니다. 따라서, 도 7 (a)에서 볼 수 있듯이 HPLC의 측정 결과, 실시예 1에서 제조한 파우더 형태의 NaDC의 분자 회합체와 비교예 1의 NaDC는 동일한 결과값을 가지는 것을 알 수 있었다.
마찬가지로, 본원의 실시예 4에서 제조한 niclosamide를 API로 사용하여 분자 회합체를 만든 경우에도, 분자 회합체를 제조하기 전의 API와 전단응력이 가해져 새롭게 제조된 분자 회합체의 크로마토그래피 특성이 동일하다는 것을 확인하기 위하여, 앞선 실험예와 동일하게 HPLC를 사용하여 측정하였으며, 그 결과 도 7 (b)의 그래프에서 보다시피 동일한 피크를 나타내는 것을 알 수 있었다.
또한, 본원의 실시예 2에서 제조한 Sunitinib/Maleate의 분자 회합체와 비교예 2에서 제조한 Sunitinib와 Maleate의 염의 경우에도, 분자 회합체를 제조하기 전의 API와 전단응력이 가해져 새롭게 제조된 분자 회합체의 크로마토그래피 특성이 동일하다는 것을 확인하기 위하여, 앞선 실험예와 동일하게 HPLC를 사용하여 측정하였으며, 그 결과 도 7 (c)의 그래프에서 보다시피 동일한 피크를 나타내는 것을 알 수 있었다.
따라서, 상기 도 7의 결과를 통하여, 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 상기 나노 분자 회합체와, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 약리학적 활성 성분에 대하여 HPLC 등의 크로마토그래피(Spectroscopy) 등의 분석으로 측정된 결과값이 서로 동일하며, 이러한 결과는, 양 물질의 화학적 구조가 동일함에 기인하는 것으로 판단하였다.
또한, 도 5에서 나타낸 2개의 스펙트럼을 살펴보면, 피크의 날카로운 분해능의 입장에서는 변화가 관찰되었지만, 피크의 위치는 거의 동일하다. 이는 순수한 NaDC와 이를 본 발명의 제조방법으로 새롭게 제조한 분자 회합체를 비교하면, 새로운 화학결합이 형성되거나 화학결합이 제거되지 않고, 이 역시 화학적 구조가 동일함을 의미한다.
이를 통하여, 본 발명의 제조방법에 의하여 제조한 분자 회합체는, 이 분자 회합체의 전구체인 약리학적 활성물질의 화학적 구조는 동일하지만 분자의 물리적 구조가 상이한 새로운 특성을 가진다는 것을 알 수 있다.
실험예 2: 실시예 2 및 비교예 2의 화학적/물리적 구조 비교
실시예 2에서 제조한 Sunitinib/Maleate 분자 회합체와 비교예 2에서 제조한 Sunitinib와 Maleate의 염에 대해, NMR 및 FT-IR을 이용하여 스펙트럼을 측정하였으며, NMR에 따른 스펙트럼 결과를 도 8에, FT-IR에 따른 스펙트럼 결과를 도 9에 나타냈다.
먼저, Sunitinib/Maleate의 염의 H-NMR 스펙트럼과 본 발명에서 만든 분자 회합체의 H-NMR 스펙트럼 결과를 도 8에 나타냈다. 도 8에서, 위에 표시한 스펙트럼이 Sunitinib와 Maleate의 염 생성 혼합물에 대한 H-NMR이고, 아래쪽에 표시한 H-NMR 스펙트럼이 본 발명을 통해 제조한 두개의 화합물이 물리적으로 결합된 분자 회합체의 H-NMR 스펙트럼이다. 변화가 일어난 부분 *, **로 표시하였고, 이에 대해서 분자 회합체가 형성되면서 분자들의 거리가 매우 가까워지고, 이 근접되어 있는 분자들은 서로의 핵의 환경에 변화를 야기하고, 이로 인해서 NMR 피크의 변화가 관찰될 만큼 가까운 거리에 있다는 증거가 된다.
다음으로, Sunitinib/Maleate의 염의 FT-IR 스펙트럼과 본 발명에서 만든 분자 회합체의 FT-IR 스펙트럼 결과를 도 9에 나타냈다. 도 9에서 관찰된 바와 같이 NMR 스펙트럼의 변화보다 훨씬 심한 변화가 관찰됨을 알 수 있다. 이는 위에서 설명한 바와 같이 분자의 신축 및 굽힘의 모드가 분자의 분자 회합체가 형성됨으로써 그 운동모드의 여기되는 에너지가 달라질 뿐만 아니라, 제약을 받아서 피크가 생성 및 소멸 그리고 위치의 이동 및 그 세기가 달라짐을 알 수 있다. 1300 ~ 1700 cm-1에서 나타나는 피크는 분자 구조에서 나타나는 C=O의 신축운동을 나타낸다. 도 9에 나타난 화학구조에서 알 수 있듯이 두 분자의 혼합물에는 4개의 서로 다른 카보닐 그룹이 존재하고, 이는 서로 다른 위치에 존재한다. 그러나 이 두개의 혼합물을 이용하여 제조한 분자 회합체에 대해서는 이 날카로운 4개의 peak가 뚱뚱해지고(broad), 갈라지는 현상이 나타나며, 피크의 세기도 크게 변화된다. 이는 여러 개의 카보닐 그룹이 서로 상호작용을 통해 다양한 환경을 만들어내고 있음을 의미한다. 또한 900 cm-1, 500 cm-1 근처에서 새로운 피크가 나타남을 확인할 수 있으며, 3000~3500 cm-1의 영역에서 나타난다고 알려진 OH, NH의 신축운동 피크를 관찰해보면, 전반적으로 피크가 뚱뚱해지고, 피크의 위치를 정의하기 어려울 만큼 피크의 위치가 달라짐을 관찰할 수 있다. 이는 두개의 분자가 가까워지면서, 수소결합이 강화되어 그 결합의 강도에 따라서 다양한 피크가 나타나게 되어 결과적으로 뚱뚱한 피크의 세기가 분자 혼합물에 비해서 증가됨을 알 수 있다.
상기 도 8과 도 9의 스펙트럼 결과를 통하여, 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 상기 나노 분자 회합체와, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 약리학적 활성 성분에 대하여 NMR 또는 FT-IR 등의 분광학(Spectroscopy)적 분석으로 측정된 결과값이 서로 상이하며, 이러한 결과값의 차이는, 양 물질의 물리적인 구조가 상이함에 기인하는 것으로 판단하였다. 구체적으로 NMR로 측정된 결과값을 비교하는 경우에는 피크 위치가 변화하는 경우 분광학(Spectroscopy)적 분석으로 측정된 결과값이 서로 상이한 것으로 판단하고, FT-IR로 측정된 결과값을 비교하는 경우에는 1개 이상의 피크가 생성 또는 소멸되는 경우 분광학(Spectroscopy)적 분석으로 측정된 결과값이 서로 상이한 것으로 판단할 수 있었으며, 이 때 결과값이 서로 상이한 것은 두 물질의 물리적 구조가 상이함에 따라 발생하는 것임을 알 수 있었다.
또한, 상기 도 10의 결과를 통하여, 본 발명의 제조방법에 의하여 제조된 상기 나노 분자 회합체와, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 약리학적 활성 성분에 대하여 HPLC 등의 크로마토그래피(chromatography) 등의 분석으로 측정된 결과값이 서로 동일하며, 이러한 결과는, 양 물질의 화학적 구조가 동일함에 기인하는 것으로 판단하였다.
실험예 3: 실시예 3 및 비교예 3의 화학적/물리적 구조 비교
실시예 3에서 제조한 파우더와 비교예 3에서 제조한 파우더에 대해, FT-IR (Fourier-transform infrared spectroscopy; Bruker Alpha 2 ATR)을 이용하여 스펙트럼을 측정하였으며, 이를 이미 측정하였던, 본 발명의 제조방법으로 제조하지 않은 원래의 전구체인 비교예 1의 스펙트럼 결과와 비교하였다.
먼저, 실시예 3과 비교예 3 및 비교예 1의 FT-IR에 따른 스펙트럼 결과를 비교한 것을 도 11에 나타내고, 실시예 4와 비교예 4 및 비교예 1의 FT-IR에 따른 스펙트럼 결과를 비교한 것을 도 12에 나타내었다.
도 11에 나타난 바와 같이 비교예 3과 비교예 1은 거의 유사한 FT-IR에 따른 스펙트럼 결과를 나타내어, 2개의 롤 밀의 간격이 100㎛를 초과하여 조절되는 경우에는, 본 발명에 따른 분자 회합체가 제조되지 않는 것을 알 수 있었다. 반대로 실시예 3의 경우, 2개의 롤 밀의 간격이 100㎛ 이하로 조절됨에 따라서, 물리적인 구조가 상이한 새로운 구조체, 즉 본 발명에 따른 분자 회합체가 제조되는 것을 알 수 있었다.
다음으로, 도 12에 나타난 바와 같이 비교예 4와 비교예 1 역시 거의 유사한 FT-IR에 따른 스펙트럼 결과를 나타내어, 약리학적 활성 성분의 종류와 상관없이 2개의 롤 밀의 간격이 100㎛를 초과하여 조절되는 경우에는, 본 발명에 따른 분자 회합체가 제조되지 않는 것을 알 수 있었다. 반대로 실시예 4의 경우, 2개의 롤 밀의 간격이 100㎛ 이하로 조절됨에 따라서, 물리적인 구조가 상이한 새로운 구조체, 즉 본 발명에 따른 분자 회합체가 제조되는 것을 알 수 있었다.
따라서, 약리학적 활성 성분의 종류와 상관없이 2개의 롤 밀의 간격이 100㎛를 초과하여 조절되는 경우에는, 본 발명에 따른 분자 회합체가 제조되지 않고, 100㎛ 이하로 조절되는 경우에는, 본 발명에 따른 분자 회합체가 제조되는 것을 알 수 있었다.
또한, 실시예 4에서 제조된 niclosamaide의 분자 회합체를 TEM(FEI 사 Tecnai G2 Spirit Twin)으로 촬영하여 도 13에 나타내었다. 투과 전자현미경 이미지를 이용하여 측정한 이심율은 0.85 정도의 평균값을 지녔고, 그 분포는 0.48~1.0 사이에 존재하고 있었다. 또한 크기는 최소값과 최대값이 각각 약 2.5 nm, 7.7 nm였고, 평균 크기는 약 4.8 nm이었다.
실험예 4: 실시예 2의 분자 회합체의 안정성 시험 및 입자 사이즈 확인
실시예 2에서 제조한 파우더 형태의 "Sunitinib/Maleate의 분자 회합체"를 0.05% 수용액으로 제조한 후, 6개월 동안 pH, 입자 사이즈, 함량% 및 농도의 변화를 다음과 같은 조건으로 측정하여, 하기 표 2에 나타냈다.
pH 측정방법
샘플을 0.5 mL 취하여 1회 분석하였다. 1 mL pipette을 사용하여, pH meter 측정센서가 완전히 덮이도록 0.5 mL의 샘플을 넣고, pH를 측정하였다.
입자사이즈 측정방법(particle size by zetasizer)
샘플을 1 mL 취한다. 샘플을 cuvette cell에 기포가 생기지 않게 조심스럽게 담는다. 동일한 샘플로 총 10회 반복 분석을 진행하였다. (기본 세팅 값이 1회 측정 시 10회 반복 분석) 처리되어 나온 데이터 중에 Size distribution by Volume 부분을 사용하였고, Size 및 PDI값은 10개의 평균값으로 처리하였다.
Zetasizer 측정조건
Temperature 25 ℃ Duration Used 25 S
Count rate 202.5 Kcps Measurement (set) 4.65
Cell Description Disposable sizing cuvette Attenuator 10
함량 측정조건 Preparation of standard solution for calibration curve
Mobile phase인 20 mM Ammonium acetate와 Acetonitrile을 준비하였다. Mobile phase로 약 30분 동안 HPLC 내부를 흘려주었다. 수니티닙 시료를 Vehicle에 녹여 0.005%, 0.01%, 0.03%, 0.05%, 0.1% Standard Solution을 만들었다. Standard Solution을 이용하여 HPLC 조건에서 area 값을 측정하였다. 측정된 area 값을 y축으로, 알고 있는 농도는 x축으로 설정하여 Calibration curve를 만들었다. Calibration curve가 완성되면, y축에 대한 수식을 구하였다.
Concentration by HPLCS
샘플을 1 mL 취하여 LC vial에 담는다. Mobile phase로 약 30분 동안 HPLC 내부를 흘려주었다. 10 μl injection하여 HPLC Area를 측정하였다. 작성된 Calibration curve를 이용하여 농도를 계산하였다.
구분 적합
기준 		Sample#: SUT2111JY130
0주차 1주차 2주차 4주차 2개월 5 개월 6개월
pH - 6.20 6.18 6.23 6.22 6.15 6.20 6.20
입자사이즈 - 2.23 nm
± 0.53
(PDI 0.52)		 2.65 nm
± 0.71
(PDI 0.29)		 2.18 nm
± 0.41
(PDI 0.70)		 2.46 nm
± 0.16
(PDI 0.71)		 3.14 nm
± 0.73
(PDI 0.20)		 2.86 nm
± 1.52
(PDI 0.19)		 3.26 nm
± 0.78
(PDI 0.14)
함량 (%) 95.0 ~ 115.0 % 109.52 108.45 109.90 110.78 110.75 110.84 110.08
상기 표 2와 같이, 실시예 2에서 제조된 분자 회합체의 입자사이즈는 평균 2.2 nm이었고, PDI는 1 이었다. 또한, 6개월간 pH, 함량 및 입자크기가 유지되는 것을 보아, 안정성이 유지되는 것을 알 수 있었다.
실험예 5: 실시예와 비교예들의 XRD 구조 비교
사이클로 스포린A를 사용하여 제조된 본 발명 실시예 6의 분자 회합체와 비교예 6의 사이클로 스포린A 자체의 XRD 측정결과를 비교하여 도 14에 나타내었다. 상기 그래프의 비교를 통하여 알 수 있듯이, 시편을 잡는 홀더(SUS 재질)에 의하여 나타나는 피크(그래프의 오른쪽에 동일하게 나타나는 피크들)를 제외하면, 공정 전인 비교예 6의 API(사이클로 스포린A) 자체는 크리스탈(crystal) 폼으로 존재(좌측의 날카로운 피크)하고 있는 것과 달리, 공정 후인 본 발명의 실시예 6의 분자 회합체는 물리적인 구조가 바뀜에 따라서 무정형(amorphous) 폼으로 변화(좌측의 무정형 피크)한 것을 알 수 있다.
본원의 분자 회합체와 같이 무정형이 아닌 결정형 구조의 경우, 그 내부의 레티스의 사이즈가 바뀜에 따라서 피크가 변화할 수는 있겠지만 이 역시 기존의 크리스탈 폼에서 다른 크리스탈 폼으로 바뀔 뿐이지, 본 발명과 같이 무정형(amorphous) 폼으로 변화하지는 않는다.
따라서, 도 14를 통하여, 본 발명의 분자 회합체는 솔베이트 형태로 변한 것이 아니라 물리적인 구조 자체가 무정형(amorphous) 폼으로 변화한 것을 알 수 있다.
마찬가지로 API로 수니티닙/말레이트 염을 사용하여 제조된 본 발명의 실시예 2의 분자 회합체와 비교예 2의 XRD 측정결과를 비교하여 도 15에 도시하였다.
앞서 살펴본 사이클로 스포린A와 마찬가지로 공정 전인 비교예 2의 API(수니티닙/말레이트 염) 자체는 크리스탈(crystal) 폼으로 존재하고 있는 것과 달리, 공정 후인 본 발명의 실시예 2의 분자 회합체는 물리적인 구조가 바뀜에 따라서 아몰포스(amorphous) 폼으로 변화한 것을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 분자 회합체가 솔베이트 형태로 변한 것이 아니라 물리적인 구조 자체가 아몰포스(amorphous) 폼으로 변화한 것을 알 수 있다.
실험예 6: 실시예와 비교예들의 DSC 측정 실험 비교
본원의 출원인은, 본원의 분자 회합체가 결정화(솔베이트) 된 것이 아니라는 것을 명확하게 입증하기 위하여, 아래와 같은 DSC 측정 실험을 하였다.
구체적으로, API로 사이클로 스포린A를 사용하여 제조된 본 발명의 실시예 6의 분자 회합체와 사이클로 스포린A 자체인 비교예 6의 DSC 측정결과를 비교하여 도 16에 나타냈다. 만약 본 발명의 공정을 거친 분자 회합체가 솔베이트라면, DSC 그래프 상에 솔벤트(본 발명에서 사용하는 솔벤트는 물 또는 에탄올)가 끓는점(물은 100℃, 에탄올은 60 ℃정도)근처에서 날라가는 피크가 나타나야 하는데, 도 16에 나타난 DSC 측정결과 DATA에서는 이와 같은 픽이 전혀 나타나지 않고 있다. 따라서, 본원의 분자 회합체와, 상기 나노 분자 회합체의 전구체인 약리학적 활성 성분의 분광학(Spectroscopy)에 의한 측정값이 상이한 것은 솔베이트화에 의하여 생기는 변화가 아니라 물리적인 구조의 변화에 따른 것임을 명확하게 알 수 있다.
실험예 7: 실시예의 입자 사진 확인
본원의 출원인은, 본원의 분자 회합체가 API의 분자 회합체인 구조라는 점을 확인하기 위하여, API로 사이클로 스포린A를 사용하여 제조한 실시예 6의 분자 회합체와 수니티닙/말레이트 염을 사용하여 제조한 실시예 2의 분자 회합체의 TEM 사진을 촬영하였다. 먼저, API로 사이클로 스포린A를 사용하여 제조한 실시예 6의 분자 회합체의 TEM 사진을 촬영하여 도 17에 나타내었다. 사이클로 스포린A 자체는 물에 잘 녹지 않아, TEM으로 확인할 수 없는 것과 달리, 도 D의 TEM 사진에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 분자 구조체는 여러 개의 API가 물리적으로 결합되어 있는 구조라는 것을 확인할 수 있다.
마찬가지로 수니티닙/말레이트 염을 사용하여 제조한 실시예 2의 분자 회합체의 TEM 사진을 촬영하여 도 18에 나타내었다.
상기 도 18의 TEM 사진에서 확인할 수 있듯이, 본 발명에 따른 분자 회합체는 여러 개의 API가 물리적으로 결합되어 있는 구조라는 것을 확인할 수 있다. 이와 달리, 도 19의 TEM 사진에서와 같이, 수니티닙/말레이트 염 자체인 비교예 2를 물에 녹인 것을 TEM 사진으로 촬영한 결과를 살펴보면, API가 물리적으로 결합되어 있는 구조를 전혀 확인할 수 없었다.
따라서, 본 발명에 따른 구조체는 복수의 API가 물리적으로 결합된 분자 회합체 구조라는 것을 명확하게 알 수 있다.
실험예 8: 실시예 5 및 비교예 5의 세포 투과 성능 비교
실시예 5에서 제조한 파우더 형태의 DCF-DA 분자 회합체와 비교예 5의 DCF-DA 자체에 대해, 세포 투과 성능을 비교하였다. 부유세포 (MV-4-11 human macrophage)을 디쉬에 50% 정도 채워지게 키웠다. 비교예 5의 DCF-DA를 에탄올에 용해하고, 실시예 5의 DCF-DA 분자 회합체를 증류수에 각각 0.005%의 동일한 농도로 30분간 세포에 처리한 후 PBS(phosphate buffer solution) 버퍼 용액을 이용하여 세포를 수세하여, 세포 외 DCF-DA를 제거하고 확산에 의한 투입을 정지시켰다. 30분 추가 배양으로 세포를 안정화시킨 후, 0.03% 과산화수소(H2O2)를 처리하여 세포내 형광을 띄는 DCF를 3차원 현미경(Tomocube사의 HT-2H)을 이용하여 3D 홀로그램과 형광으로 촬영하여 도 20에 나타냈다. 실험 결과, 도 20의 A 및 B에 나타낸 비교예 5의 DCF-DA 처리구에 비하여, 도 20의 C 및 D에 나타낸 실시예 5의 DCF-DA 분자 회합체의 처리구에서 훨씬 강한 형광을 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명에 따라 제조된 분자 회합체의 인지질막 투과성이 훨씬 높다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 9: 실시예 2 및 비교예 2의 각막 투과 성능 비교
실시예 2에서 제조한 파우더 형태의 Sunitinib-malate 분자 회합체와 비교예 2의 Sunitinib-malate 자체에 대해, 각막 투과 실험을 수행하였다.
상기 각막 투과 실험은 이미 공개되어 있는 논문인 "Lee　et. al, "Modulating the Transport Characteristics of Bruch's Membrane With Steroidal Glycosides and its Relevance to Age-Related Macular Degeneration (AMD) .　Invest.　Ophthalmol. Vis. Sci.　 2015,　56, 8403., 2015"의 내용을 참조하여 진행하였다. 투과실험을 위한 셀은 도 21에 나타난 바와 같이 우싱 챔버(ussing chamber)를 자체 제작하였고, 우싱 챔버는 크게 세부분으로 구성되는데, 약물을 투여하는 공급 챔버(donor chamber), 수용 챔버(receiver chamber) 그리고 약물이 투과할 멤브레인 막으로 구성된다. 기본적으로 약물을 우싱 챔버의 공급 챔버에 약물을 투입하고, 돼지 눈의 각막 부위를 8mm 크기의 원형으로 체취하고, 각막에 붙어있는 다른 조직들을 제거한 후, 멤브레인 위치에 고정하고, 막을 투과한 용액을 수용 챔버에서 받게 되며, 이때 확산이 일어나는 온도를 사람의 체온에 가까운 37℃에 맞춘 항온 챔버에 넣어서 보관하였다. 일정한 시간이 흐르면, 각 공급 챔버와 수용 챔버 내에서의 용액 농도를 측정하여, 각 시료의 diffusion에 대한 물성을 파악할 수 있었다. 각각의 시료에 대한 18시간 후에 농도를 하기 표 1에 표시하였다. 농도는 UV/VIS spectrum(Thermo사, Evolution201 UV/Vis)을 활용하였고, 420nm의 peak높이를 이용하여 농도를 측정하였다.
Initial drug load (μg) Drug in corneal tissue
(μg, Mean±SD)		 Drug in receiver
(μg, Mean±SD)		 Transport percentage*
(%, Mean±SD)
비교예 2 540 65.7 ± 7.5 8.8 ± 5.8 1.6 ± 1.1
실시예 2 490 70.2 ± 10.7 27.8 ± 2.9 5.7 ± 0.6***
상기 표 3과 같이, 투과된 양을 백분율로 표시하면 약리활성 물질의 분자 회합체의 투과도가 약리활성 물질의 투과도와 비교할 때 대략 4배 정도의 우수한 투과도를 보임을 알 수 있다. 따라서, 앞선 실시예 4의 DCF-DA의 세포 투과 실험에서 관찰되었듯이, 본 발명에 따른 분자 회합체의 세포에 대한 투과가 약리활성물질 자체보다는 매우 우수함을 알 수 있었다.

Claims (26)

  1. 유기물 또는 무기물이 물리적으로 결합된 분자 회합체로서,
    상기 분자 회합체에 물을 포함하는 조성물로 형성되는 경우, 상기 조성물 중에서 상기 분자 회합체는 응집된 구조를 가지고,
    상기 분자 회합체의 평균 입경은 50nm 이하인,
    무정형(amorphous)의 나노 분자 회합체.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 유기물 또는 무기물 자체와 상기 분자 회합체 자체의 HPLC(high-performance liquid chromatography) 결과값이 동일하고,
    상기 유기물 또는 무기물 자체와 상기 분자 회합체 자체의 NMR 또는 FT-IR의 방법으로 측정된 결과값이 상이한 것을 특징으로 하는 나노 분자 회합체.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 유기물 또는 무기물 자체와 상기 분자 회합체 자체의 HPLC로 측정된 결과값이 10% 이내의 retention time을 가지는 경우 동일한 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 나노 분자 회합체.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 유기물 또는 무기물 자체와 상기 분자 회합체 자체의 NMR로 측정된 결과값을 비교할 때, 피크 위치가 변화하는 경우 상이한 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 나노 분자 회합체.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 유기물 또는 무기물 자체와 상기 분자 회합체 자체의 NMR로 측정된 결과값을 비교할 때, 1HNMR 기준으로 peak의 이동이 0.005ppm 이상인 경우, 상이한 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 나노 분자 회합체.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 유기물 또는 무기물 자체와 상기 분자 회합체 자체의 FT-IR로 측정된 결과값을 비교할 때, 1개 이상의 피크가 생성 또는 소멸되는 경우, 상이한 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 나노 분자 회합체.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 유기물 또는 무기물 자체와 상기 분자 회합체 자체의 FT-IR로 측정된 결과값을 비교할 때, 한 개 이상의 피크 위치가 5cm-1 이상 달라지는 경우, 상이한 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 나노 분자 회합체.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 유기물 또는 무기물은 스포린A, 파클리탁셀, 도세탁셀, 데커신, 멜록시캄, 이트라코나졸, 셀레콕시브, 카페시타빈, 트라보, 프로스트, 이소플라본, 디클로페낙나트륨, 수니티닙, 파조파닙, 액시티닙, 레고라페닙, 트라메티닙, 진세노사이드 Rg1, 타클로리무스, 알렌드로네이트, 라타노프로스트, 비마토프로스트, 아토바스타틴 칼슘, 로슈바스타틴 칼슘, 엔테카비어, 암포테리신B, 오메가 3, 데옥시콜린산, 우루소데옥시콜린산, 데옥시콜린산의 소듐 또는 포타슘염, 우루소데옥시콜린산의 소듐 또는 포타슘염, 프레디메솔론, 유칼립투스유, 라벤더유, 레몬유, 산달우드유, 로즈마리유, 카모마일유, 신나몬유, 오렌지유, 알파비사보롤, 비타민A(레티놀), 비타민E, 토코페릴 아세테이트 및 비타민D, 비타민F 또는 이들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 약리학적 활성 성분인 것을 특징으로 하는 나노 분자 회합체.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 분자 회합체는 분자간의 거리가 10Å 이하인 것을 특징으로 하는 나노 분자 회합체.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 분자 회합체는 유기물 또는 무기물로 이루어진 것을 특징으로 하는 나노 분자 회합체.
  11. 유기물 또는 무기물의 염이 물리적으로 결합된 분자 회합체로서,
    상기 분자 회합체에 물을 포함하는 조성물로 형성되는 경우, 상기 조성물 중에서 상기 분자 회합체는 응집된 구조를 가지고,
    상기 분자 회합체의 평균 입경은 50nm 이하인,
    무정형(amorphous)의 나노 분자 회합체.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 유기물 또는 무기물의 염 자체와 상기 분자 회합체 자체의 HPLC(high-performance liquid chromatography) 결과값이 동일하고,
    상기 유기물 또는 무기물의 염 자체와 상기 분자 회합체 자체의 NMR 또는 FT-IR의 방법으로 측정된 결과값이 상이한 것을 특징으로 하는 나노 분자 회합체.
  13. 제11항에 있어서,
    상기 유기물 또는 무기물의 염 자체와 상기 분자 회합체 자체의 HPLC로 측정된 결과값이 10% 이내의 retention time을 가지는 경우 동일한 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 나노 분자 회합체.
  14. 제11항에 있어서,
    상기 유기물 또는 무기물의 염 자체와 상기 분자 회합체 자체의 NMR로 측정된 결과값을 비교할 때, 피크 위치가 변화하는 경우 상이한 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 나노 분자 회합체.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 유기물 또는 무기물의 염 자체와 상기 분자 회합체 자체의 NMR로 측정된 결과값을 비교할 때, 1HNMR 기준으로 peak의 이동이 0.005ppm 이상인 경우, 상이한 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 나노 분자 회합체.
  16. 제11항에 있어서,
    상기 유기물 또는 무기물의 염 자체와 상기 분자 회합체 자체의 FT-IR로 측정된 결과값을 비교할 때, 1개 이상의 피크가 생성 또는 소멸되는 경우, 상이한 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 나노 분자 회합체.
  17. 제11항에 있어서,
    상기 유기물 또는 무기물의 염 자체와 상기 분자 회합체 자체의 FT-IR로 측정된 결과값을 비교할 때, 한 개 이상의 피크 위치가 5cm-1 이상 달라지는 경우, 상이한 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 나노 분자 회합체.
  18. 제11항에 있어서,
    상기 유기물 또는 무기물의 염은 스포린A, 파클리탁셀, 도세탁셀, 데커신, 멜록시캄, 이트라코나졸, 셀레콕시브, 카페시타빈, 트라보, 프로스트, 이소플라본, 디클로페낙나트륨, 수니티닙, 파조파닙, 액시티닙, 레고라페닙, 트라메티닙, 진세노사이드 Rg1, 타클로리무스, 알렌드로네이트, 라타노프로스트, 비마토프로스트, 아토바스타틴 칼슘, 로슈바스타틴 칼슘, 엔테카비어, 암포테리신B, 오메가 3, 데옥시콜린산, 우루소데옥시콜린산, 데옥시콜린산의 소듐 또는 포타슘염, 우루소데옥시콜린산의 소듐 또는 포타슘염, 프레디메솔론, 유칼립투스유, 라벤더유, 레몬유, 산달우드유, 로즈마리유, 카모마일유, 신나몬유, 오렌지유, 알파비사보롤, 비타민A(레티놀), 비타민E, 토코페릴 아세테이트 및 비타민D, 비타민F 또는 이들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유기물 또는 무기물의 염인 약리학적 활성 성분인 것을 특징으로 하는 나노 분자 회합체.
  19. 제11항에 있어서,
    상기 분자 회합체는 분자간의 거리가 10Å 이하인 것을 특징으로 하는 나노 분자 회합체.
  20. 제11항에 있어서,
    상기 분자 회합체는 유기물 또는 무기물의 염으로 이루어진 것을 특징으로 하는 나노 분자 회합체.
  21. 유기물, 무기물 또는 이들의 염; 및 물;을 포함하는 조성물을 전단응력을 가할 수 있는 장치 내에 투입한 후,
    상기 조성물에 전단응력을 가하여, 유기물, 무기물 또는 이들의 염들이 물리적으로 결합된 분자 회합체를 제조하는, 제1항 또는 제10항의 나노 분자 회합체를 제조하는 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 장치는 유기물, 무기물 또는 이들의 염이 포함된 용액에 전단응력을 가할 수 있도록 복수의 롤을 구비하고,
    상기 유기물, 무기물 또는 이들의 염이 포함된 용액을 장치 내의 마주보는 2개의 롤 사이에 투입한 후,
    상기 유기물, 무기물 또는 이들의 염이 포함된 용액에 전단응력을 가하는 것을 특징으로 하는, 나노 분자 회합체를 제조하는 방법.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 마주보는 2개의 롤 사이의 간격은 0.5 내지 1000㎛인 것을 특징으로 하는, 나노 분자 회합체를 제조하는 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 마주보는 2개의 롤은 서로 다른 속도로 회전하는 것을 특징으로 하는, 나노 분자 회합체를 제조하는 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 마주보는 2개의 롤 중 어느 하나의 회전속도는 50 내지 250rpm이고, 다른 하나의 회전속도는 200 내지 500rpm인 것을 특징으로 하는, 나노 분자 회합체를 제조하는 방법.
  26. 제21항에 있어서,
    상기 유기물, 무기물은 스포린A, 파클리탁셀, 도세탁셀, 데커신, 멜록시캄, 이트라코나졸, 셀레콕시브, 카페시타빈, 트라보, 프로스트, 이소플라본, 디클로페낙나트륨, 수니티닙, 파조파닙, 액시티닙, 레고라페닙, 트라메티닙, 진세노사이드 Rg1, 타클로리무스, 알렌드로네이트, 라타노프로스트, 비마토프로스트, 아토바스타틴 칼슘, 로슈바스타틴 칼슘, 엔테카비어, 암포테리신B, 오메가 3, 데옥시콜린산, 우루소데옥시콜린산, 데옥시콜린산의 소듐 또는 포타슘염, 우루소데옥시콜린산의 소듐 또는 포타슘염, 프레디메솔론, 유칼립투스유, 라벤더유, 레몬유, 산달우드유, 로즈마리유, 카모마일유, 신나몬유, 오렌지유, 알파비사보롤, 비타민A(레티놀), 비타민E, 토코페릴 아세테이트 및 비타민D, 비타민F 또는 이들의 유도체로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 약리학적 활성 성분인 것을 특징으로 하는, 나노 분자 회합체를 제조하는 방법.
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