WO2023001931A1 - Method for acquiring a two-dimensional image of a biological sample with targeted scanning - Google Patents

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WO2023001931A1
WO2023001931A1 PCT/EP2022/070427 EP2022070427W WO2023001931A1 WO 2023001931 A1 WO2023001931 A1 WO 2023001931A1 EP 2022070427 W EP2022070427 W EP 2022070427W WO 2023001931 A1 WO2023001931 A1 WO 2023001931A1
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WO
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voxels
presumptive
probed
scanning
image acquisition
Prior art date
Application number
PCT/EP2022/070427
Other languages
French (fr)
Inventor
Loïc LE GOFF
Hervé RIGNEAULT
Frédéric Etienne Jean GALLAND
Original Assignee
Centre National De La Recherche Scientifique
Université D'aix-Marseille
Ecole Centrale De Marseille
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Publication date
Application filed by Centre National De La Recherche Scientifique, Université D'aix-Marseille, Ecole Centrale De Marseille filed Critical Centre National De La Recherche Scientifique
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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B21/00—Microscopes
    • G02B21/0004—Microscopes specially adapted for specific applications
    • G02B21/002—Scanning microscopes
    • G02B21/0024—Confocal scanning microscopes (CSOMs) or confocal "macroscopes"; Accessories which are not restricted to use with CSOMs, e.g. sample holders
    • G02B21/0052—Optical details of the image generation
    • G02B21/0076—Optical details of the image generation arrangements using fluorescence or luminescence

Definitions

  • the invention relates to the field of imaging intended for the observation of biological samples, and more particularly to a method two-dimensional image scanning of a biological sample composed of a plurality of cells.
  • a traditional microscope scans the entire volume (cuboid) encompassing the structure of interest.
  • this phenomenon is in particular qualified as phototoxicity.
  • adaptive illumination Another method to try to limit the illumination undergone by the cells, called adaptive illumination, consists in controlling the acquisition instrument to modulate the light intensity and maintain a constant signal-to-noise ratio in the captured image. This is achieved in particular by means of labeling of the cell membranes. Nevertheless, this approach tends to illuminate more the center of the cells, necessarily darker than their outline, which is not an area of interest for the observer, who seeks on the contrary to study the cell outline.
  • the object of the invention is therefore to provide a method for acquiring biological samples which overcomes these drawbacks, that is to say by limiting as much as possible the light exposure of the sample both spatially and temporally, while providing a good quality image.
  • the invention takes advantage of the fact that certain biological samples, such as cellular tissues, are organized in space and that the user has prior information on the said organization.
  • biological samples such as cellular tissues
  • epithelial biological tissues are organized in monolayers, that is to say that the marking of cell junctions is organized in a mesh (cell contours) distributed over a surface.
  • the invention proposes to provide a method which illuminates a volume restricted to the object of interest, such as an epithelial surface.
  • the subject of the invention is a method for acquiring a three-dimensional image of a biological sample by scanning microscopy, said sample being located in a reference volume defined by a plurality of voxels, characterized in that it comprises the following steps: a) pre-scanning of the voxels of the reference volume, during which only a subset of the voxels of the reference volume, called the initial set of probed voxels, is illuminated, b) calculation, by interpolation digital of the initial set of probed voxels, of a presumptive geometric structure of the biological sample, c) determination of a set of voxels corresponding to the presumptive geometric structure, said set of presumptive voxels, d) selection, from of the set of presumptive voxels, of a set of voxels to be illuminated, said set of voxels to be probed, and e) scanning of the reference volume, during which only the set of voxels to
  • a presumptive geometric structure of the sample is calculated from a pre-scan illuminating a small number of voxels, and the voxels to be illuminated are determined from this calculation, it is possible to deduce therefrom voxels to be probed which have a strong chance of corresponding to a zone of interest of the reference volume in which the sample is located.
  • a high resolution image can be obtained without having to illuminate all or a large part of the sample, and therefore significantly reducing the phototoxicity of the acquisition.
  • an epithelial biological tissue it is possible to obtain an image of comparable quality to a traditional acquisition by only illuminating less than 10% of the reference volume in which the sample is located. .
  • the voxels of the set of voxels to be probed is chosen randomly from the set of presumptive voxels. Alternatively, they are distributed at the outer or inner border, that is to say that 30% of the voxels closest to the outer surface of the presumptive geometric structure are selected.
  • the calculation of the presumptive geometric structure and/or the selection of the set of voxels to be probed can in particular be based on the knowledge of the user on the organization in the space of the sample. In this way, the entire reference volume is not systematically probed, which limits the illumination of the reference volume.
  • a step of collecting information on the spatial organization of the biological sample is carried out before the pre-scanning step.
  • the collection of information may consist in automatically selecting data on the spatial organization of the biological sample, for example according to its nature, which may be entered by the user or according to prior observations.
  • the user can inform manually, by data entry or by selection in said database, the nature of the sample and/or its organization in space.
  • the calculation of the presumptive geometric structure S P and/or the selection of the set of voxels to be probed is preferably done using the information collected on the organization in space of the sample.
  • the biological sample is an epithelial cell, it will be possible to use for the calculation the fact that the presumptive geometric structure will be a shell-shaped surface.
  • steps b), c), d) and e) are repeated until voluntary interruption by an operator or until it is determined that the set of illuminated voxels includes the set of presumptive voxels.
  • the size of the voxels of the presumptive voxels and to be probed corresponds to the size of the voxels of the initial set of probed voxels.
  • the presumptive geometric structure is at least one surface.
  • the set of voxels to be probed is a fraction of the set of presumptive voxels. The method thus concentrates the acquisition at a presumptive volume closer to the real structure of interest. According to a particular embodiment of the invention, the set of voxels to be probed corresponds exactly to the set of presumptive voxels. The method thus performs the acquisition more rapidly.
  • the presumptive geometric structure is constructed from at least one surface. This makes it possible to improve the speed of the observation process.
  • the digital interpolation is a polynomial interpolation, a piecewise polynomial interpolation, an interpolation by splines, an estimation based on the nearest neighbors, a Bayesian inference, or an estimation using networks of convolution.
  • Such choices of digital interpolation make it possible to reduce the necessary computing power and therefore to limit the response time of the acquisition device implementing the method according to the invention, and are suitable for most geometric structures representative of biological samples.
  • step c) of determining the set of presumptive voxels comprises the following sub-steps: - selection of a thickness for the presumptive surface, and - determination of the voxels corresponding to the volume defined by the presumptive surface and the selected thickness.
  • step a) consists in scanning all the voxels of the reference volume and illuminating only the initial set of probed voxels.
  • step a) consists in scanning and illuminating only the initial set of probed voxels.
  • the voxels of the initial set of voxels are distributed randomly in the reference volume.
  • the sub-volume of the reference volume represents between 0.01% and 0 .2% of the voxels of the reference volume, preferably between 0.05% and 0.1% of the voxels of the reference volume.
  • the invention also relates to a device for acquiring a three-dimensional image of a biological sample by scanning microscopy, characterized in that it is configured to implement the method according to any one of the preceding claims.
  • the scanning of the samples is carried out by a confocal microscope using a linear or non-linear excitation contrast, for which the scanner can use a laser scan with a galvanometric or acousto-optic mirror, or an illumination array microscope.
  • the image acquisition device comprises an illumination system comprising at least one laser, a matrix of micro-mirrors and an optical relay.
  • Figure 2 is a schematic perspective view of a reference volume in which there is an epithelial tissue.
  • Figure 3 is a schematic diagram representing the method according to the invention.
  • Figure 4 is a schematic perspective view of sets of voxels detected as bright following the pre-scan contained in the reference volume of Figure 2 acquired by the image acquisition method according to the invention.
  • Figure 5 is a schematic sectional view, showing the actual structure of interest, a set of voxels illuminated during the pre-scan and a presumptive surface calculated during the calculation step of the method according to the invention;
  • Figure 6 is a view similar to Figure 4, further comprising the presumptive area calculated during the calculation step of the method.
  • FIG. 7 is a view similar to Figure 5 representing a new presumptive surface calculated during a second iteration of the method according to the invention.
  • FIG. 1 shows an example of a device 10 for acquiring a three-dimensional image of a biological sample by scanning microscopy according to a particular embodiment of the invention.
  • the acquisition device 10 comprises a microscope, to which is added an illumination matrix such as a matrix of micro-mirrors (“Digital Micromirror Device” in English terminology), hereinafter designated by DMD 14, placed in a plane conjugate to the focal plane, that is to say the sample plane of the objective 12 of the microscope using one or more optical relays 16, for example composed of a plurality of lenses 17 and mirrors 18, reflecting or semi-reflecting.
  • DMD 14 Upstream of the DMD is a laser 19, preferably colimated and widened to cover the surface of the DMD.
  • the assembly composed of the laser 19, the DMD 14 and the relay 16 constitutes a targeted illumination system 20.
  • the image acquisition device 10 further comprises a detection device 21, for example a camera 22 connected to a computer 24.
  • the detection device 21, in association with the illumination system 20, makes it possible to acquire a arbitrary number of discrete voxels, or voxels, in a reference volume V in which is placed a biological sample B, which is here an epithelial cell tissue, schematically illustrated in Figure 2.
  • the biological sample comprises a structure of real interest S R of sample B, which is here the outer surface of the sample, shown in Figures 5 and 7.
  • S R structure of interest S R
  • S R structure of interest S R
  • its structure of interest S R is generally organized in a shell.
  • the image acquisition device 10 is capable of implementing an image acquisition method according to the invention represented schematically in FIG. 3.
  • the collection of information may consist in automatically selecting the data on the organization in space of the biological sample, for example according to its nature, which can be filled in by the user or according to prior observations.
  • the user can inform manually, by data entry or by selection in said database, the nature of the sample and/or its organization in space.
  • a pre-scan 100 of the voxels of the reference volume V is performed.
  • the voxels thus acquired are at the resolution limit of the microscope 12.
  • the initial set of probed voxels ⁇ Pré-scanning is illuminated by the illumination system 20.
  • the subset of the voxels of the reference volume V represents between 0.01% and 0.2% of the voxels of the reference volume V, preferably between 0.05% and 0, 1% of the voxels of the reference volume V.
  • the subset of the voxels of the reference volume V represents 0.1% of the voxels of the reference volume V.
  • the voxels of the initial set of probed voxels ⁇ Pre-scanning can be randomly distributed in the reference volume encompassing the sample B, as seen in particular in FIGS. 4 and 5.
  • a first estimate of the structure of interest of the sample is calculated, by digital interpolation of the initial set of probed voxels ⁇ Pré-scanning , or first presumptive geometric structure S P , shown in Figure 5.
  • the numerical interpolation can be polynomial interpolation, piecewise polynomial interpolation, spline interpolation, near-neighbor estimation, Bayesian interference, or a estimation using convolution networks
  • Numerical interpolation can be limited to only certain voxels of the initial set of probed voxels ⁇ Pre-scan . For example, one can perform a geometric analysis of the bright and non-bright voxels of ⁇ Pre-scan and select, among the bright voxels of ⁇ Pre-scan , those which are most likely to correspond to the actual structure of interest SR of sample B. These voxels are shown in Figure 4 being thicker.
  • This selection is preferably made from known information on the sample B, and in particular the spatial organization of the sample, preferably as collected during the information collection step 90.
  • the sample B For example, for an epithelial tissue such as that represented in the figures, it is known that its structure of interest S R is generally organized in a shell.
  • the digital interpolation chosen here is a polynomial interpolation, which makes it possible to reduce the necessary computing power and therefore to limit the response time of the image acquisition device 10, and is suitable for most geometric structures representative of biological samples B.
  • this type of digital interpolation is only one example among other possible types of interpolation, but it is here adapted to the shell shape of the surface of interest SR.
  • the first presumptive geometric structure S P contains the real structure of interest SR of the sample B, as can be seen in FIG. 5.
  • the first presumptive structure S P is therefore a “coarse” representation of the structure real interest SR, which will be refined if necessary during the process.
  • the calculation of the presumptive geometric structure S P is preferably done from known information on the sample B, and in particular the organization in space of the sample, preferably as collected during the information collection step 90.
  • the presumptive geometric structure S P will be constructed from a surface which will be converted into a shell by choosing a certain thickness for this surface, knowing that the structures of interest of the epithelial tissues are generally organized in a shell. Then, during a third step 300, a set of voxels corresponding to the presumptive geometric structure S P is determined, called a set of presumptive voxels ⁇ Presumptive .
  • the step 300 of determining the presumptive voxels ⁇ Presumptive comprises a sub-step 310 of selecting a thickness when the presumptive geometric structure S P is a surface.
  • the user can here choose a thickness which seems to him to be a good compromise between calculation time and precision of the image to be acquired.
  • this selection sub-step 310 the user can take advantage of his knowledge of the sample B, such as the prior information he has of the thickness he wishes to image.
  • a next sub-step 320 of the step for determining the set of presumptive voxels ⁇ Presumptive is then performed, during which voxels corresponding to the volume defined by the presumptive surface S P and the selected thickness are determined.
  • the size of the presumptive voxels ⁇ Presumptive corresponds to the size of the voxels of the initial set of probed voxels ⁇ Pre-scan .
  • a set of voxels to be illuminated called a set of voxels to be probed ⁇ Probe, is selected during a fourth step 400 . This set is represented in FIG. 7.
  • the size of the voxels to be probed ⁇ Probe corresponds to the size of the voxels of the initial set of voxels probed ⁇ Pre-scanning .
  • the set of voxels to be probed ⁇ Probe is selected not randomly, but so as to be able to refine the estimation of the real structure of interest SR. Then, during a scanning step 500, the reference volume V is scanned by illuminating only the set of voxels to be probed ⁇ Probe .
  • a decision step 600 it is possible to implement the method iteratively, so as to repeat the steps of scanning 100, of calculating 200 of a presumptive structure, the step 300 of determining voxels of this structure, selecting new 400 voxels to illuminate voxels and scanning 500 of the volume illuminating only the set of voxels to be probed ⁇ Probe .
  • the set of voxels to be probed ⁇ Probe represents a small proportion of the reference volume V, analogously to pre-scanning, with the difference that the voxels of ⁇ Probe are not distributed randomly: they are distributed so as to interrogate the structure of interest optimally.
  • the new illuminated (probed) voxels added are chosen on the basis of the information previously obtained during the previous iterations as well as in the processing of this information during the successive estimations of the structure of interest, that is- that is, the presumptive geometric structures. These are refined with each iteration and gradually converge towards the real structure.
  • the decision step 600 makes it possible to exit the iterative loop, here for example by two output channels 700, 800.
  • the first output channel 700 comes from a decision by the user to exit the iterative loop and scan the entirety of the most recent presumptive geometric structure S P in order to establish a high resolution image thereof.
  • the set of voxels to be probed ⁇ Probe corresponds exactly to the set of presumptive voxels ⁇ Presumptive .
  • the user can make a compromise between time of acquisition and precision sought according to his experience or his needs. Indeed, exiting the iterative loop during one of the first iterations is faster. Conversely, exiting the loop following several iterations is slower but makes it possible to scan a presumptive geometric structure S P whose overlap with the real structure of interest is greater.
  • a particular case of this manual output is to output from the first estimation of the structure of interest.
  • Another exit channel 800 is a so-called “automatic” exit. Indeed, over the iterations, while the space of probed voxels grows and the presumptive geometric structure converges towards the real structure, it is possible that the real structure SR is included in the volume already probed (illuminated). In this case the iterative process stops, because it no longer requires the illumination of new voxels. It then becomes unnecessary to scan the presumptive geometric structure S P by scanning to obtain a high resolution image since all the voxels to be scanned have already been processed by the image acquisition method.
  • the principle presented is adaptable to any type of microscope based on a point illumination of the sample in order to generate the light signal.
  • the light voxel(s) are scanned in the sample, generally shot by shot.
  • the image acquisition method adapts to microscopes such as the confocal microscope using linear or non-linear excitation contrast, for which the scanner can use laser scanning using galvanometric, resonant, or polygonal, non-linear microscopes (fluorescence, coherent Raman, SHG) with galvanometric, resonant or polygonal mirrors, microscopes using acousto-optical scanners, illumination matrix microscopes (“programmable array microscope” in English terminology ).
  • the invention is not limited to the embodiments shown and other embodiments will be apparent to those skilled in the art. It is in particular possible to provide for the application of the acquisition method according to the invention to biological samples other than the cellular tissues mentioned in the present description, and to use alternative microscopy techniques.

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Abstract

The invention relates to a method for acquiring a three-dimensional image of a biological sample by scanning microscopy. The sample is located in a reference volume (V) defined by a plurality of voxels. The method comprises the following steps: a) pre-scanning the voxels of the reference volume (V), during which only a subset of the voxels of the reference volume (V), referred to as the initial set of probed voxels (Ωpre-scan), is illuminated; b) calculating, by numerical interpolation of the initial set of probed voxels, a presumptive geometrical structure of the biological sample; c) determining a set of voxels corresponding to the presumptive geometrical structure, referred to as the set of presumptive voxels (Ωpresumptive); d) selecting, from the set of presumptive voxels, a set of voxels to be illuminated (Ωprobe), referred to as the set of voxels to be probed; and e) scanning the reference volume (V), during which only the set of voxels to be probed (Ωp robe) is illuminated.

Description

Description Titre de l’invention : Procédé d’acquisition d’image en deux dimensions d’un échantillon biologique à balayage ciblé L’invention concerne le domaine de l’imagerie destinée à l’observations d’échantillons biologiques, et plus particulièrement un procédé de balayage d’image en deux dimensions d’un échantillon biologique composés d’une pluralité de cellules. Lors de l’observation par microscopie d’échantillons biologiques, notamment par microscopie optique à fluorescence, un microscope traditionnel balaye tout le volume (cuboïde) englobant la structure d’intérêt. Ceci présente toutefois un inconvénient majeur, car les fluorophores ont des effets délétères sur les cellules de l’échantillon, dont les processus biologiques peuvent être compromis par une trop longue exposition : ce phénomène est notamment qualifié de phototoxicité. Il est donc désirable, afin d’éviter leur dégradation, de limiter autant que possible l’exposition des échantillons, tant au niveau spatial que temporel. Dans l’art antérieur, il est connu, pour tenter de limiter les effets de la phototoxicité, d’accélérer la vitesse d’imagerie en remplaçant des miroirs galvanométriques de balayage laser par des systèmes résonnants ou par des déflecteurs acousto-optiques. Toutefois ces approches ne permettent pas d’obtenir une qualité d’image aussi bonne que celles obtenues par balayage classique. De plus, elles ne résolvent pas entièrement le problème de la phototoxicité, car la même quantité de lumière incidente est délivrée à l’échantillon in fine, mais seulement plus rapidement. Une autre méthode pour tenter de limiter l’illumination subie par les cellules, dite d’illumination adaptative, consiste à contrôler l’instrument d’acquisition pour moduler l’intensité lumineuse et maintenir un rapport signal sur bruit constant dans l’image capturée. Ceci est notamment réalisé à l’aide d’un marquage des membranes cellulaires. Néanmoins, cette approche a tendance à illuminer davantage le centre des cellules, nécessairement plus sombre que leur contour, qui n’est pas une zone d’intérêt pour l’observateur, qui cherche au contraire à étudier le contour cellulaire. L'invention a donc pour but de fournir un procédé d’acquisition d’échantillons biologiques qui surmonte ces inconvénients, c’est-à-dire en limitant autant que possible l'exposition lumineuse de l’échantillon tant au niveau spatial que temporel, tout en fournissant une image de bonne qualité. Pour ce faire, l’invention tire parti du fait que certains échantillons biologiques, tels que les tissus cellulaires, sont organisés dans l’espace et que l’utilisateur possède une information préalable sur ladite organisation. Ainsi, par exemple, les tissus biologiques épithéliaux sont organisés en monocouches, c’est-à-dire que le marquage des jonctions cellulaires s’organise en un maillage (des contours cellulaires) réparti sur une surface. L’invention se propose de fournir une méthode qui illumine un volume restreint à l’objet d’intérêt, telle qu’une surface épithéliale. A cet effet l’invention a pour objet un procédé d’acquisition d’image en trois dimensions d’un échantillon biologique par microscopie à balayage, ledit échantillon étant situé dans un volume de référence défini par une pluralité de voxels, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes : a) pré-balayage des voxels du volume de référence, au cours duquel seul un sous- ensemble des voxels du volume de référence, dit ensemble initial de voxels sondés, est illuminé, b) calcul, par interpolation numérique de l’ensemble initial de voxels sondés, d’une structure géométrique présomptive de l’échantillon biologique, c) détermination d’un ensemble de voxels correspondant à la structure géométrique présomptive, dit ensemble de voxels présomptifs, d) sélection, à partir de l’ensemble de voxels présomptifs, d’un ensemble de voxels à illuminer, dit ensemble de voxels à sonder, et e) balayage du volume de référence, au cours duquel seul l’ensemble de voxels à sonder est illuminé. Grâce au fait que l’on calcule, à partir d’un pré-balayage illuminant un faible nombre de voxels, une structure géométrique présomptive de l’échantillon, et que l’on en détermine les voxels à illuminer à partir de ce calcul, on peut en déduire des voxels à sonder qui ont de fortes chances de correspondre à une zone d’intérêt du volume de référence dans lequel se trouve l’échantillon. Ainsi, l’on peut obtenir une image à haute résolution sans avoir à illuminer l’ensemble ou une grande partie de l’échantillon, et donc en réduisant significativement la phototoxicité de l’acquisition. Par exemple, grâce à l’invention, pour un tissu biologique épithélial, il est possible d’obtenir une image de qualité comparable à une acquisition traditionnelle en n’illuminant que moins de 10% du volume de référence dans lequel se trouve l’échantillon. Par exemple, les voxels de l’ensemble de voxels à sonder est choisi aléatoirement parmi l’ensemble de voxels présomptifs. De manière alternative, ils sont répartis en bordure externe ou interne, c’est-à-dire que l’on sélectionne 30% des voxels les plus proches de la surface extérieure de la structure géométrique présomptive. Le calcul de la structure géométrique présomptive et/ou la sélection de l’ensemble de voxels à sonder peut notamment s’appuyer sur les connaissances de l’utilisateur sur l’organisation dans l’espace de l’échantillon. De cette manière, on ne sonde pas de façon systématique tout le volume de référence, ce qui limite l’illumination du volume de référence. Ainsi, de préférence, on effectue, avant l’étape de pré-balayage, une étape de collecte d’informations sur l’organisation dans l’espace de l’échantillon biologique. La collecte d’informations peut consister à sélectionner de manière automatique les données sur l’organisation dans l’espace de l’échantillon biologique, par exemple en fonction de sa nature, qui peut être renseignée par l’utilisateur ou selon des observations préalables. De manière alternative ou complémentaire, l’utilisateur pourra renseigner de manière manuelle, par entrée de données ou par sélection dans ladite base de données, la nature de l’échantillon et/ou son organisation dans l’espace. Dans une variante il est également possible de sélectionner de manière arbitraire, ou par défaut, un certain type d’organisation dans l’espace. Par exemple, on pourra collecter l’information selon laquelle les tissus biologiques épithéliaux sont organisés en monocouches, c’est-à-dire que le marquage des jonctions cellulaires s’organise en un maillage (des contours cellulaires) répartis sur une surface, comme une coque. Pour les échantillons biologiques tels que les organoïdes, on pourra collecter l’information selon laquelle les tissus cellulaires sont répartis sur une structure sphérique, ou encore sur une structure ovoïde pour les organoïdes d’embryons. Naturellement il ne s’agit que d’exemples et toute autre structure géométrique pourra être envisagée. De préférence, le calcul de la structure géométrique présomptive SP et/ou la sélection de l’ensemble de voxels à sonder se fait de préférence à l’aide des informations collectées sur l’organisation dans l’espace de l’échantillon. Par exemple, si l’échantillon biologique est une cellule épithéliale, on pourra utiliser pour le calcul le fait que la structure géométrique présomptive sera une surface en forme de coque. Pour les échantillons biologiques tels que les organoïdes, on pourra choisir une structure sphérique, ou encore une structure ovoïde pour les organoïdes d’embryons. Naturellement il ne s’agit que d’exemples et toute autre structure géométrique pourra être envisagée. De préférence, on réitère les étapes b), c), d) et e) jusqu’à interruption volontaire par un opérateur ou jusqu’à détermination que l’ensemble des voxels illuminés inclut l’ensemble de voxels présomptifs. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, la taille des voxels des voxels présomptifs et à sonder correspond à la taille des voxels de l’ensemble initial de voxels sondés. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, la structure géométrique présomptive est au moins une surface. Une telle structure géométrique est particulièrement adaptée à la configuration géométrique réelle de certains échantillon biologiques, tels que les tissus épithéliaux. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, l’ensemble des voxels à sonder est une fraction de l’ensemble des voxels présomptifs. Le procédé concentre ainsi l’acquisition à un volume présomptif plus proche de la structure d’intérêt réelle. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, l’ensemble des voxels à sonder correspond exactement à l’ensemble des voxels présomptif. Le procédé effectue ainsi l’acquisition de façon plus rapide. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, la structure géométrique présomptive est construite à partir d’au moins une surface. Ceci permet d’améliorer la rapidité du procédé d’observation. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, l'interpolation numérique est une interpolation polynomiale, une interpolation polynomiale par morceaux, une interpolation par splines, une estimation basée sur les proches voisins, une inférence bayésienne, ou une estimation utilisant des réseaux de convolution. De tels choix d’interpolation numérique permettent de réduire la puissance de calcul nécessaire et donc de limiter le temps de réponse du dispositif d’acquisition mettant en œuvre le procédé selon l’invention, et sont adaptés à la plupart des structures géométriques représentatives d’échantillons biologiques. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, l’étape c) de détermination de l’ensemble de voxels présomptifs comporte les sous-étapes suivantes : - sélection d’une épaisseur pour la surface présomptive, et - détermination des voxels correspondant au volume défini par la surface présomptive et l’épaisseur sélectionnée. Ceci est une façon pour l’utilisateur de tirer parti de sa connaissance de l’échantillon observé, et notamment de son épaisseur potentielle. En outre, ceci permet à l’utilisateur de contrôler l’illumination de l’échantillon et d’affiner la surface présomptive, et en particulier d’effectuer un compromis entre les deux. Selon une variante de l’invention, l’étape a) consiste à balayer tous les voxels du volume de référence et n’illuminer que l’ensemble initial de voxels sondés. Cette variante est bien adaptée aux cas d’utilisation d’un microscope à miroirs résonants, à miroirs galvanométriques, et à miroirs polygonaux. En revanche, elle nécessite la connaissance de la position de balayage en temps réel afin de moduler, également en temps réel, l’illumination pour éclairer les voxels voulus. Selon une autre variante de l’invention, l’étape a) consiste à ne balayer et illuminer que l’ensemble initial de voxels sondés. L’avantage de cette variante est que l’acquisition d’image sera plus rapide du fait qu’un volume restreint est balayé, en plus de générer une illumination réduite. En contrepartie, dans le cas d’utilisation d’un microscope à miroirs galvanométriques, il doit être fait attention à ce que les sauts ne soient pas trop fréquents ou soient faits suffisamment lentement pour ne pas entraîner les miroirs dans un régime instable. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, les voxels de l’ensemble initial de voxels sont répartis aléatoirement dans le volume de référence. Afin de limiter autant que possible l’illumination de l’échantillon tout en permettant le calcul d’une structure géométrique présomptive proche de la structure réelle de l’échantillon, le sous-volume du volume de référence représente entre 0,01% et 0,2% des voxels du volume de référence, de préférence entre 0,05% et 0,1% des voxels du volume de référence. L’invention concerne également un dispositif d’acquisition d’image en trois dimensions d’un échantillon biologique par microscopie à balayage, caractérisé en ce qu’il est configuré pour mettre en œuvre le procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention, le balayage des échantillons est réalisé par un microscope confocal utilisant un contraste d’excitation linéaire ou non-linéaire, pour lequel le scanner peut utiliser un balayage laser à miroir galvanométrique ou acousto-optique, ou un microscope à matrice d’illumination. De préférence, le dispositif d’acquisition d’image comprend un système d’illumination comprenant au moins un laser, une matrice de micro-miroirs et un relais optique. Brève description des figures L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre donnée uniquement à titre d'exemple et faite en se référant aux dessins annexés dans lesquels : [Fig.1] la figure 1 est une vue schématique d’un dispositif d’acquisition d’image selon un mode de réalisation particulier de l’invention. [Fig. 2] la figure 2 est une vue schématique en perspective d’un volume de référence dans lequel se trouve un tissu épithélial. [Fig.3] la figure 3 est un diagramme schématique représentant le procédé selon l’invention. [Fig.4] la figure 4 est une vue schématique en perspective d’ensembles de voxels détectés comme brillants à la suite du pré-balayage contenus dans le volume de référence de la figure 2 acquis par le procédé d’acquisition d’image selon l’invention. [Fig.5] la figure 5 est une vue schématique en coupe, représentant la structure d’intérêt réelle, un ensemble de voxels illuminés lors du pré-balayage et une surface présomptive calculée au cours de l’étape de calcul du procédé selon l’invention ; [Fig.6] la figure 6 est vue similaire à la figure 4, comprenant en outre la surface présomptive calculée au cours de l’étape de calcul du procédé. [Fig.7] la figure 7 est vue similaire à la figure 5 représentant une nouvelle surface présomptive calculée lors d’une deuxième itération du procédé selon l’invention. Description détaillée On a représenté à la figure 1 un exemple d’un dispositif d’acquisition 10 d’image en trois dimensions d’un échantillon biologique par microscopie à balayage selon un mode de réalisation particulier de l’invention. Le dispositif d’acquisition 10 comprend un microscope, auquel est adjoint une matrice d’illumination tel qu’une matrice de micro-miroirs (« Digital Micromirror Device » en terminologie anglo-saxonne), ci-après désignée par DMD 14, placée dans un plan conjugué au plan focal, c’est-à-dire le plan de l’échantillon de l’objectif 12 du microscope à l’aide d’un ou plusieurs relais optiques 16, par exemple composé d’une pluralité de lentilles 17 et de miroirs 18, réfléchissants ou semi-réfléchissants. En amont du DMD se trouve un laser 19, de préférence colimaté et élargi pour couvrir la surface du DMD. L’ensemble composé par le laser 19, le DMD 14 et le relais 16 constitue un système d’illumination ciblée 20. Afin d’obtenir une illumination en trois dimensions, il est possible soit de déplacer l’objectif suivant l’axe optique du microscope, soit d’utiliser une lentille électro- accordable pour déplacer le plan de focalisation de l’illumination et de la détection conjointement, soit encore d’utiliser un système de téléfocalisation à deux objectifs. Dans l’exemple illustré sur les figures, la technique consistant à déplacer l’objectif est utilisée, s’agissant de la plus simple. Le dispositif d’acquisition d’image 10 comprend en outre un dispositif de détection 21, par exemple une caméra 22 reliée à un ordinateur 24. Le dispositif de détection 21, en association avec le système d’illumination 20, permet d’acquérir un nombre arbitraire de voxels discrets, ou voxels, dans un volume de référence V dans lequel est placé un échantillon biologique B, qui est ici un tissu cellulaire épithélial, illustrés de manière schématique à la figure 2. L’échantillon biologique comprend une structure d’intérêt SR réelle de l’échantillon B, qui est ici la surface externe de l’échantillon, représenté aux figures 5 et 7. Dans l’exemple qui va être décrit, c’est à cette structure d’intérêt SR que l’on souhaite autant que possible limiter l’illumination de l’échantillon B. Par exemple, pour un tissu épithélial tel que celui représenté sur les figures, l’on sait que sa structure d’intérêt SR est en général organisée en coque. Le dispositif d’acquisition d’image 10 est apte à mettre en œuvre un procédé d’acquisition d’image selon l’invention représenté de façon schématique à la figure 3. De préférence, on effectue, une étape préalable de collecte d’informations 90 sur l’organisation dans l’espace de l’échantillon biologique B. La collecte d’informations peut consister à sélectionner de manière automatique les données sur l’organisation dans l’espace de l’échantillon biologique, par exemple en fonction de sa nature, qui peut être renseignée par l’utilisateur ou selon des observations préalables. De manière alternative ou complémentaire, l’utilisateur pourra renseigner de manière manuelle, par entrée de données ou par sélection dans ladite base de données, la nature de l’échantillon et/ou son organisation dans l’espace. Dans une variante il est également possible de sélectionner de manière arbitraire, ou par défaut, un certain type d’organisation dans l’espace. Par exemple, on pourra collecter l’information selon laquelle les tissus biologiques épithéliaux sont organisés en monocouches, c’est-à-dire que le marquage des jonctions cellulaires s’organise en un maillage (des contours cellulaires) répartis sur une surface, comme une coque. Pour les échantillons biologiques tels que les organoïdes, on pourra collecter l’information selon laquelle les tissus cellulaires sont répartis sur une structure sphérique, ou encore sur une structure ovoïde pour les organoïdes d’embryons. Naturellement il ne s’agit que d’exemples et toute autre structure géométrique pourra être envisagée. Comme illustré à la figure 3, on effectue un pré-balayage 100 des voxels du volume de référence V est effectué. De préférence, les voxels ainsi acquis sont à la limite de résolution du microscope 12. Au cours de cette étape, seul un sous-ensemble des voxels du volume de référence V, dit ensemble initial de voxels sondés ΩPré-balayage, est illuminé par le système d’illumination 20. De préférence, le sous-ensemble des voxels du volume de référence V représente entre 0,01% et 0,2% des voxels du volume de référence V, de préférence entre 0,05% et 0,1% des voxels du volume de référence V. Dans le mode de réalisation illustré sur les figures, le sous-ensemble des voxels du volume de référence V représente 0,1% des voxels du volume de référence V. Ainsi on illumine une très faible fraction de l’échantillon biologique B. En pratique, concernant les microscopes à balayage utilisant un scanner (miroir galvanométrique, miroir résonant, miroir polygonal, scanner acousto-optique), deux possibilités s’offrent pour contrôler spatialement l’illumination : soit balayer tous les voxels du volume de référence V et n’illuminer que l’ensemble initial de voxels sondés ΩPré-balayage, soit ne balayer et illuminer que l’ensemble initial de voxels sondés ΩPré-balayage. Dans le premier cas, on peut par exemple laisser le dispositif d’acquisition 10 balayer tout le volume de référence V façon systématique, mais en modulant le système d’illumination 20 de façon à contrôler quels voxels dans l’espace seront illuminés. Cette modalité est adaptée aux miroirs résonants, aux miroirs galvanométriques, et aux miroirs polygonaux. Elle nécessite la connaissance de la position de balayage en temps réel afin de moduler, aussi en temps réel, l’illumination pour éclairer les voxels voulus. Dans le second cas, on peut faire en sorte que le dispositif d’acquisition 10 saute d’un voxel à l’autre rapidement, c’est-à-dire sans balayer les voxels au moment du saut : ceci est possible avec les scanner acousto-optiques, et avec les miroirs galvanométriques. Lorsque le dispositif d’acquisition 10 est utilisé de telle sorte, le bénéfice est que l’imagerie sera plus rapide du fait qu’un volume restreint est balayé, en plus de générer une illumination réduite. Cependant, dans le cas des miroirs galvanométriques, il faut faire attention à ce que les sauts ne soient pas trop fréquents ou soient faits suffisamment lentement pour ne pas entraîner les miroirs dans un régime instable. Quelle que soit la technique utilisée, lors de cette étape de pré-balayage 100, les voxels de l’ensemble initial de voxels sondés ΩPré-balayage peuvent être répartis aléatoirement dans le volume de référence englobant l’échantillon B, comme on le voit notamment aux figures 4 et 5. Au cours d’une seconde étape de calcul 200, on calcule, par interpolation numérique de l’ensemble initial des voxels sondés ΩPré-balayage, une première estimation de la structure d’intérêt de l’échantillon, ou première structure géométrique présomptive SP, représentée à la figures 5. L’interpolation numérique peut être une interpolation polynomiale, une interpolation polynomiale par morceaux, une interpolation par splines, une estimation basée sur les proches voisins, une interférence bayésienne, ou une estimation utilisant des réseaux de convolution L’interpolation numérique peut être limitée à certains voxels seulement de l’ensemble initial de voxels sondés ΩPré-balayage. Par exemple, on peut réaliser une analyse géométrique des voxels brillants et non brillants de ΩPré-balayage et sélectionner, parmi les voxels brillants de ΩPré-balayage, ceux qui ont le plus de chances de correspondre à la structure d’intérêt réelle SR de l’échantillon B. Ces voxels sont représentés à la figure 4 en étant plus épais. Cette sélection se fait de préférence à partir d’informations connues sur l’échantillon B, et notamment l’organisation dans l’espace de l’échantillon, de préférence telles que collectées au cours de l’étape de collecte d’informations 90. Par exemple, pour un tissu épithélial tel que celui représenté sur les figures, l’on sait que sa structure d’intérêt SR est en général organisée en coque. L’interpolation numérique choisie est ici une interpolation polynomiale, qui permet de réduire la puissance de calcul nécessaire et donc de limiter le temps de réponse du dispositif d’acquisition d’image 10, et est adapté à la plupart des structures géométriques représentatives d’échantillons biologiques B. Comme indiqué plus haut, ce type d’interpolation numérique n’est qu’un exemple parmi d’autres types d’interpolation possibles, mais il est ici adapté à la forme en coque de la surface d’intérêt SR. De préférence, la première structure géométrique présomptive SP contient la structure d’intérêt réelle SR de l’échantillon B, comme on peut le voir à la figure 5. La première structure présomptive SP est donc une représentation « grossière » de la structure d’intérêt réelle SR, qui sera affinée si besoin au cours du procédé. En outre, le calcul de la structure géométrique présomptive SP se fait de préférence à partir d’informations connues sur l’échantillon B, et notamment l’organisation dans l’espace de l’échantillon, de préférence telles que collectées au cours de l’étape de collecte d’informations 90. Par exemple, pour un tissu épithélial tel que celui représenté sur les figures, la structure géométrique présomptive SP sera construite à partir d’une surface qui sera convertie en une coque en choisissant une certaine épaisseur pour cette surface, sachant que les structures d’intérêt des tissus épithéliaux sont en général organisées en coque. Ensuite, au cours d’une troisième étape 300, on détermine un ensemble de voxels correspondant à la structure géométrique présomptive SP, dit ensemble de voxels présomptifs ΩPrésomptif. Selon un mode de réalisation particulier de l’invention qui correspond à celui illustré sur les figures, l’étape de détermination 300 des voxels présomptifs ΩPrésomptif comporte une sous-étape de sélection 310 d’une épaisseur lorsque la structure géométrique présomptive SP est une surface. L’utilisateur peut ici choisir une épaisseur qui lui semble être un bon compromis entre temps de calcul et précision de l’image à acquérir. Au cours de cette sous-étape de sélection 310, l’utilisateur peut mettre à profit sa connaissance de l’échantillon B, comme l’information préalable qu’il a de l’épaisseur qu’il souhaite imager. Selon ce mode de réalisation, on effectue ensuite une sous-étape suivante 320 de l’étape de détermination de l’ensemble de voxels présomptifs ΩPrésomptif , au cours de laquelle on détermine des voxels correspondant au volume défini par la surface présomptive SP et l’épaisseur sélectionnée. De préférence, la taille des voxels présomptifs ΩPrésomptif correspond à la taille des voxels de l’ensemble initial de voxels sondés ΩPré-balayage. A partir de l’ensemble de voxels présomptifs ΩPrésomptif déterminé au cours de l’étape 300, on sélectionne, au cours d’une quatrième étape 400, un ensemble de voxels à illuminer, dit ensemble de voxels à sonder ΩSonde. Cet ensemble est représenté à la figure 7. De préférence, la taille des voxels à sonder ΩSonde correspond à la taille des voxels de l’ensemble initial de voxels sondés ΩPré-balayage. L’ensemble de voxels à sonder ΩSonde est sélectionné non pas de façon aléatoire, mais de sorte à pouvoir affiner l’estimation de la structure d’intérêt réelle SR. Ensuite, au cours d’une étape de balayage 500, on balaye le volume de référence V en n’illuminant que l’ensemble de voxels à sonder ΩSonde. Puis, au cours d’une étape de décision 600, il est possible de mettre en œuvre le procédé de façon itérative, de sorte à répéter les étapes de balayage 100, de calcul 200 d’une structure présomptive, l’étape 300 de détermination des voxels de cette structure, de sélection de nouveaux voxels 400 à illuminer des voxels et de balayage 500 du volume en n’illuminant que l’ensemble de voxels à sonder ΩSonde. Lors de ces itérations, ce n’est pas l’ensemble initial de voxels sondés ΩPré-balayage qui est balayé, mais l’ensemble de voxels à sonder ΩSonde établi lors de l’itération précédente. L’ensemble de voxels à sonder ΩSonde représente une faible proportion du volume de référence V, de façon analogue au pré-balayage, à la différence que les voxels de ΩSonde ne sont pas répartis aléatoirement : ils sont répartis de façon à interroger la structure d’intérêt de façon optimale. A chaque fois, les nouveaux voxels illuminés (sondés) ajoutés sont choisis sur la base de l’information préalablement obtenue lors des itérations précédentes ainsi que dans le traitement de cette information lors des estimations successives de la structure d’intérêt, c’est-à-dire les structures géométriques présomptives. Celles-ci s’affinent à chaque itération et convergent progressivement vers la structure réelle. L’étape de décision 600 permet de sortir de la boucle itérative, ici par exemple par deux voies de sortie 700, 800. La première voie de sortie 700 provient d’une décision de l’utilisateur de sortir de la boucle itérative et balayer l’intégralité de la structure géométrique présomptive SP la plus récente afin d’établir une image haute résolution de celle-ci. Dans ce cas, l’ensemble des voxels à sonder ΩSonde correspond exactement à l’ensemble des voxels présomptifs ΩPrésomptif. En cela l’utilisateur peut effectuer un compromis entre temps d’acquisition et précision recherchée selon son expérience ou ses besoins. En effet, sortir de la boucle itérative lors d’une des premières itérations est plus rapide. A l’inverse, sortir de boucle à la suite de plusieurs itérations est plus lent mais permet de balayer une structure géométrique présomptive SP dont le recouvrement avec la structure d’intérêt réelle est plus grand. Un cas particulier de cette sortie manuelle est de sortir dès la première estimation de la structure d’intérêt. Une autre voie de sortie 800 est une sortie dite « automatique ». En effet, au fil des itérations, alors que l’espace des voxels sondés grandit et que la structure géométrique présomptive converge vers la structure réelle, il se peut que la structure réelle SR soit incluse dans le volume déjà sondé (illuminé). Dans ce cas le processus itératif s’arrête, car il ne nécessite plus l’illumination de nouveaux voxels. Il devient alors inutile de scanner la structure géométrique présomptive SP par balayage pour obtenir une image haute résolution puisque tous les voxels à balayer ont déjà été traités par le procédé d’acquisition d’image. Le principe présenté est adaptable à tout type de microscope reposant sur une illumination ponctuelle de l’échantillon dans le but de générer le signal lumineux. Le ou les voxels lumineux sont balayés dans l’échantillon, généralement plan par plan. Ainsi, le procédé d’acquisition d’image s’adapte à des microscopes tels que le microscope confocal utilisant un contraste d’excitation linéaire ou non-linéaire, pour lequel le scanner peut utiliser un balayage laser utilisant des miroirs galvanométriques, résonants, ou polygonaux, les microscopes non-linéaires (fluorescence, Raman cohérent, SHG) à miroir galvanométriques, résonants ou polygonaux, les microscopes utilisant des scanners acousto-optiques, les microscopes à matrice d’illumination (« programmable array microscope » en terminologie anglo-saxonne). L'invention n'est pas limitée aux modes de réalisation présentés et d'autres modes de réalisation apparaîtront clairement à l'homme du métier. Il est notamment possible de prévoir l’application du procédé d’acquisition selon l’invention à d’autres échantillons biologiques que les tissus cellulaires évoquées dans la présente description, et d’utiliser des techniques de microscopie alternatives. Description Title of the invention: Two-dimensional image acquisition method of a biological sample with targeted scanning The invention relates to the field of imaging intended for the observation of biological samples, and more particularly to a method two-dimensional image scanning of a biological sample composed of a plurality of cells. During the observation by microscopy of biological samples, in particular by optical fluorescence microscopy, a traditional microscope scans the entire volume (cuboid) encompassing the structure of interest. However, this has a major drawback, because the fluorophores have deleterious effects on the cells of the sample, the biological processes of which can be compromised by too long an exposure: this phenomenon is in particular qualified as phototoxicity. It is therefore desirable, in order to avoid their degradation, to limit the exposure of the samples as much as possible, both spatially and temporally. In the prior art, it is known, in an attempt to limit the effects of phototoxicity, to accelerate the imaging speed by replacing galvanometric laser scanning mirrors by resonant systems or by acousto-optic deflectors. However, these approaches do not make it possible to obtain an image quality as good as those obtained by conventional scanning. Moreover, they do not entirely solve the problem of phototoxicity, because the same quantity of incident light is delivered to the sample in fine, but only more quickly. Another method to try to limit the illumination undergone by the cells, called adaptive illumination, consists in controlling the acquisition instrument to modulate the light intensity and maintain a constant signal-to-noise ratio in the captured image. This is achieved in particular by means of labeling of the cell membranes. Nevertheless, this approach tends to illuminate more the center of the cells, necessarily darker than their outline, which is not an area of interest for the observer, who seeks on the contrary to study the cell outline. The object of the invention is therefore to provide a method for acquiring biological samples which overcomes these drawbacks, that is to say by limiting as much as possible the light exposure of the sample both spatially and temporally, while providing a good quality image. To do this, the invention takes advantage of the fact that certain biological samples, such as cellular tissues, are organized in space and that the user has prior information on the said organization. Thus, for example, epithelial biological tissues are organized in monolayers, that is to say that the marking of cell junctions is organized in a mesh (cell contours) distributed over a surface. The invention proposes to provide a method which illuminates a volume restricted to the object of interest, such as an epithelial surface. To this end, the subject of the invention is a method for acquiring a three-dimensional image of a biological sample by scanning microscopy, said sample being located in a reference volume defined by a plurality of voxels, characterized in that it comprises the following steps: a) pre-scanning of the voxels of the reference volume, during which only a subset of the voxels of the reference volume, called the initial set of probed voxels, is illuminated, b) calculation, by interpolation digital of the initial set of probed voxels, of a presumptive geometric structure of the biological sample, c) determination of a set of voxels corresponding to the presumptive geometric structure, said set of presumptive voxels, d) selection, from of the set of presumptive voxels, of a set of voxels to be illuminated, said set of voxels to be probed, and e) scanning of the reference volume, during which only the set of voxels to be probed is illuminated. Thanks to the fact that a presumptive geometric structure of the sample is calculated from a pre-scan illuminating a small number of voxels, and the voxels to be illuminated are determined from this calculation, it is possible to deduce therefrom voxels to be probed which have a strong chance of corresponding to a zone of interest of the reference volume in which the sample is located. Thus, a high resolution image can be obtained without having to illuminate all or a large part of the sample, and therefore significantly reducing the phototoxicity of the acquisition. For example, thanks to the invention, for an epithelial biological tissue, it is possible to obtain an image of comparable quality to a traditional acquisition by only illuminating less than 10% of the reference volume in which the sample is located. . For example, the voxels of the set of voxels to be probed is chosen randomly from the set of presumptive voxels. Alternatively, they are distributed at the outer or inner border, that is to say that 30% of the voxels closest to the outer surface of the presumptive geometric structure are selected. The calculation of the presumptive geometric structure and/or the selection of the set of voxels to be probed can in particular be based on the knowledge of the user on the organization in the space of the sample. In this way, the entire reference volume is not systematically probed, which limits the illumination of the reference volume. Thus, preferably, a step of collecting information on the spatial organization of the biological sample is carried out before the pre-scanning step. The collection of information may consist in automatically selecting data on the spatial organization of the biological sample, for example according to its nature, which may be entered by the user or according to prior observations. Alternatively or additionally, the user can inform manually, by data entry or by selection in said database, the nature of the sample and/or its organization in space. In a variant, it is also possible to select arbitrarily, or by default, a certain type of organization in space. For example, we can collect the information according to which the epithelial biological tissues are organized in monolayers, that is to say that the marking of the cellular junctions is organized in a mesh (cell outlines) distributed over a surface, as a shell. For biological samples such as organoids, it will be possible to collect the information according to which the cellular tissues are distributed on a spherical structure, or even on an ovoid structure for the organoids of embryos. Naturally, these are only examples and any other geometric structure may be envisaged. Preferably, the calculation of the presumptive geometric structure S P and/or the selection of the set of voxels to be probed is preferably done using the information collected on the organization in space of the sample. For example, if the biological sample is an epithelial cell, it will be possible to use for the calculation the fact that the presumptive geometric structure will be a shell-shaped surface. For biological samples such as organoids, a spherical structure can be chosen, or even an ovoid structure for embryo organoids. Naturally, these are only examples and any other geometric structure may be envisaged. Preferably, steps b), c), d) and e) are repeated until voluntary interruption by an operator or until it is determined that the set of illuminated voxels includes the set of presumptive voxels. According to a particular embodiment of the invention, the size of the voxels of the presumptive voxels and to be probed corresponds to the size of the voxels of the initial set of probed voxels. According to a particular embodiment of the invention, the presumptive geometric structure is at least one surface. Such a geometric structure is particularly suited to the actual geometric configuration of certain biological samples, such as epithelial tissues. According to a particular embodiment of the invention, the set of voxels to be probed is a fraction of the set of presumptive voxels. The method thus concentrates the acquisition at a presumptive volume closer to the real structure of interest. According to a particular embodiment of the invention, the set of voxels to be probed corresponds exactly to the set of presumptive voxels. The method thus performs the acquisition more rapidly. According to a particular embodiment of the invention, the presumptive geometric structure is constructed from at least one surface. This makes it possible to improve the speed of the observation process. According to a particular embodiment of the invention, the digital interpolation is a polynomial interpolation, a piecewise polynomial interpolation, an interpolation by splines, an estimation based on the nearest neighbors, a Bayesian inference, or an estimation using networks of convolution. Such choices of digital interpolation make it possible to reduce the necessary computing power and therefore to limit the response time of the acquisition device implementing the method according to the invention, and are suitable for most geometric structures representative of biological samples. According to a particular embodiment of the invention, step c) of determining the set of presumptive voxels comprises the following sub-steps: - selection of a thickness for the presumptive surface, and - determination of the voxels corresponding to the volume defined by the presumptive surface and the selected thickness. This is a way for the user to take advantage of his knowledge of the sample observed, and in particular of its potential thickness. Furthermore, this allows the user to control the illumination of the sample and to refine the presumptive surface, and in particular to make a compromise between the two. According to a variant of the invention, step a) consists in scanning all the voxels of the reference volume and illuminating only the initial set of probed voxels. This variant is well suited to the cases of use of a microscope with resonant mirrors, with galvanometric mirrors, and with polygonal mirrors. On the other hand, it requires knowledge of the scanning position in real time in order to modulate, also in real time, the illumination to illuminate the desired voxels. According to another variant of the invention, step a) consists in scanning and illuminating only the initial set of probed voxels. The advantage of this variant is that the image acquisition will be faster due to the fact that a restricted volume is scanned, in addition to generate reduced illumination. On the other hand, in the case of using a microscope with galvanometric mirrors, care must be taken that the jumps are not too frequent or are made slowly enough not to drag the mirrors into an unstable state. According to a particular embodiment of the invention, the voxels of the initial set of voxels are distributed randomly in the reference volume. In order to limit as much as possible the illumination of the sample while allowing the calculation of a presumptive geometric structure close to the real structure of the sample, the sub-volume of the reference volume represents between 0.01% and 0 .2% of the voxels of the reference volume, preferably between 0.05% and 0.1% of the voxels of the reference volume. The invention also relates to a device for acquiring a three-dimensional image of a biological sample by scanning microscopy, characterized in that it is configured to implement the method according to any one of the preceding claims. According to a particular embodiment of the invention, the scanning of the samples is carried out by a confocal microscope using a linear or non-linear excitation contrast, for which the scanner can use a laser scan with a galvanometric or acousto-optic mirror, or an illumination array microscope. Preferably, the image acquisition device comprises an illumination system comprising at least one laser, a matrix of micro-mirrors and an optical relay. Brief description of the figures The invention will be better understood on reading the following description given solely by way of example and made with reference to the accompanying drawings in which: [Fig.1] Figure 1 is a schematic view of an image acquisition device according to a particular embodiment of the invention. [Fig. 2] Figure 2 is a schematic perspective view of a reference volume in which there is an epithelial tissue. [Fig.3] Figure 3 is a schematic diagram representing the method according to the invention. [Fig.4] Figure 4 is a schematic perspective view of sets of voxels detected as bright following the pre-scan contained in the reference volume of Figure 2 acquired by the image acquisition method according to the invention. [Fig.5] Figure 5 is a schematic sectional view, showing the actual structure of interest, a set of voxels illuminated during the pre-scan and a presumptive surface calculated during the calculation step of the method according to the invention; [Fig.6] Figure 6 is a view similar to Figure 4, further comprising the presumptive area calculated during the calculation step of the method. [Fig.7] Figure 7 is a view similar to Figure 5 representing a new presumptive surface calculated during a second iteration of the method according to the invention. DETAILED DESCRIPTION FIG. 1 shows an example of a device 10 for acquiring a three-dimensional image of a biological sample by scanning microscopy according to a particular embodiment of the invention. The acquisition device 10 comprises a microscope, to which is added an illumination matrix such as a matrix of micro-mirrors (“Digital Micromirror Device” in English terminology), hereinafter designated by DMD 14, placed in a plane conjugate to the focal plane, that is to say the sample plane of the objective 12 of the microscope using one or more optical relays 16, for example composed of a plurality of lenses 17 and mirrors 18, reflecting or semi-reflecting. Upstream of the DMD is a laser 19, preferably colimated and widened to cover the surface of the DMD. The assembly composed of the laser 19, the DMD 14 and the relay 16 constitutes a targeted illumination system 20. In order to obtain three-dimensional illumination, it is possible either to move the objective along the optical axis of the microscope, either to use an electro-tunable lens to move the focal plane of illumination and detection together, or even to use a two-lens telefocusing system. In the example illustrated in the figures, the technique consisting in moving the lens is used, being the simplest. The image acquisition device 10 further comprises a detection device 21, for example a camera 22 connected to a computer 24. The detection device 21, in association with the illumination system 20, makes it possible to acquire a arbitrary number of discrete voxels, or voxels, in a reference volume V in which is placed a biological sample B, which is here an epithelial cell tissue, schematically illustrated in Figure 2. The biological sample comprises a structure of real interest S R of sample B, which is here the outer surface of the sample, shown in Figures 5 and 7. In the example which will be described, it is at this structure of interest S R that the 'we wish limit the illumination of sample B as much as possible. For example, for an epithelial tissue such as that represented in the figures, it is known that its structure of interest S R is generally organized in a shell. The image acquisition device 10 is capable of implementing an image acquisition method according to the invention represented schematically in FIG. 3. Preferably, a preliminary step of collecting information 90 on the organization in space of the biological sample B. The collection of information may consist in automatically selecting the data on the organization in space of the biological sample, for example according to its nature, which can be filled in by the user or according to prior observations. Alternatively or additionally, the user can inform manually, by data entry or by selection in said database, the nature of the sample and/or its organization in space. In a variant, it is also possible to select arbitrarily, or by default, a certain type of organization in space. For example, we can collect the information according to which the epithelial biological tissues are organized in monolayers, that is to say that the marking of the cellular junctions is organized in a mesh (cell outlines) distributed over a surface, as a shell. For biological samples such as organoids, it will be possible to collect the information according to which the cellular tissues are distributed on a spherical structure, or even on an ovoid structure for the organoids of embryos. Naturally, these are only examples and any other geometric structure may be envisaged. As illustrated in FIG. 3, a pre-scan 100 of the voxels of the reference volume V is performed. Preferably, the voxels thus acquired are at the resolution limit of the microscope 12. During this step, only a subset of the voxels of the reference volume V, referred to as the initial set of probed voxels Ω Pré-scanning , is illuminated by the illumination system 20. Preferably, the subset of the voxels of the reference volume V represents between 0.01% and 0.2% of the voxels of the reference volume V, preferably between 0.05% and 0, 1% of the voxels of the reference volume V. In the embodiment illustrated in the figures, the subset of the voxels of the reference volume V represents 0.1% of the voxels of the reference volume V. Thus a very small fraction of the biological sample B. In practice, concerning scanning microscopes using a scanner (galvanometric mirror, resonant mirror, polygonal mirror, acousto-optic scanner), two possibilities are available for spatially controlling the illumination: either scanning all them voxels of the reference volume V and illuminate only the initial set of probed voxels Ω Pre-scan , or scan and illuminate only the initial set of probed voxels Ω Pre-scan . In the first case, it is possible for example to let the acquisition device 10 scan the entire reference volume V systematically, but by modulating the illumination system 20 so as to control which voxels in space will be illuminated. This modality is suitable for resonant mirrors, galvanometric mirrors, and polygonal mirrors. It requires knowledge of the scanning position in real time in order to modulate, also in real time, the illumination to illuminate the desired voxels. In the second case, it is possible to ensure that the acquisition device 10 jumps from one voxel to another quickly, that is to say without scanning the voxels at the time of the jump: this is possible with the scanners acousto-optics, and with galvanometric mirrors. When the acquisition device 10 is used in this way, the benefit is that the imaging will be faster because a restricted volume is scanned, in addition to generating reduced illumination. However, in the case of galvanometric mirrors, care must be taken that the jumps are not too frequent or are made slowly enough not to lead the mirrors into an unstable regime. Whatever the technique used, during this pre-scanning step 100, the voxels of the initial set of probed voxels Ω Pre-scanning can be randomly distributed in the reference volume encompassing the sample B, as seen in particular in FIGS. 4 and 5. During a second calculation step 200, a first estimate of the structure of interest of the sample is calculated, by digital interpolation of the initial set of probed voxels Ω Pré-scanning , or first presumptive geometric structure S P , shown in Figure 5. The numerical interpolation can be polynomial interpolation, piecewise polynomial interpolation, spline interpolation, near-neighbor estimation, Bayesian interference, or a estimation using convolution networks Numerical interpolation can be limited to only certain voxels of the initial set of probed voxels Ω Pre-scan . For example, one can perform a geometric analysis of the bright and non-bright voxels of Ω Pre-scan and select, among the bright voxels of Ω Pre-scan , those which are most likely to correspond to the actual structure of interest SR of sample B. These voxels are shown in Figure 4 being thicker. This selection is preferably made from known information on the sample B, and in particular the spatial organization of the sample, preferably as collected during the information collection step 90. For example, for an epithelial tissue such as that represented in the figures, it is known that its structure of interest S R is generally organized in a shell. The digital interpolation chosen here is a polynomial interpolation, which makes it possible to reduce the necessary computing power and therefore to limit the response time of the image acquisition device 10, and is suitable for most geometric structures representative of biological samples B. As indicated above, this type of digital interpolation is only one example among other possible types of interpolation, but it is here adapted to the shell shape of the surface of interest SR. Preferably, the first presumptive geometric structure S P contains the real structure of interest SR of the sample B, as can be seen in FIG. 5. The first presumptive structure S P is therefore a “coarse” representation of the structure real interest SR, which will be refined if necessary during the process. In addition, the calculation of the presumptive geometric structure S P is preferably done from known information on the sample B, and in particular the organization in space of the sample, preferably as collected during the information collection step 90. For example, for an epithelial tissue such as that shown in the figures, the presumptive geometric structure S P will be constructed from a surface which will be converted into a shell by choosing a certain thickness for this surface, knowing that the structures of interest of the epithelial tissues are generally organized in a shell. Then, during a third step 300, a set of voxels corresponding to the presumptive geometric structure S P is determined, called a set of presumptive voxels Ω Presumptive . According to a particular embodiment of the invention which corresponds to that illustrated in the figures, the step 300 of determining the presumptive voxels Ω Presumptive comprises a sub-step 310 of selecting a thickness when the presumptive geometric structure S P is a surface. The user can here choose a thickness which seems to him to be a good compromise between calculation time and precision of the image to be acquired. During this selection sub-step 310, the user can take advantage of his knowledge of the sample B, such as the prior information he has of the thickness he wishes to image. According to this embodiment, a next sub-step 320 of the step for determining the set of presumptive voxels Ω Presumptive is then performed, during which voxels corresponding to the volume defined by the presumptive surface S P and the selected thickness are determined. Preferably, the size of the presumptive voxels Ω Presumptive corresponds to the size of the voxels of the initial set of probed voxels Ω Pre-scan . From the set of presumptive voxels Ω Presumptive determined during step 300, a set of voxels to be illuminated, called a set of voxels to be probed Ω Probe, is selected during a fourth step 400 . This set is represented in FIG. 7. Preferably, the size of the voxels to be probed Ω Probe corresponds to the size of the voxels of the initial set of voxels probed Ω Pre-scanning . The set of voxels to be probed Ω Probe is selected not randomly, but so as to be able to refine the estimation of the real structure of interest SR. Then, during a scanning step 500, the reference volume V is scanned by illuminating only the set of voxels to be probed Ω Probe . Then, during a decision step 600, it is possible to implement the method iteratively, so as to repeat the steps of scanning 100, of calculating 200 of a presumptive structure, the step 300 of determining voxels of this structure, selecting new 400 voxels to illuminate voxels and scanning 500 of the volume illuminating only the set of voxels to be probed Ω Probe . During these iterations, it is not the initial set of probed voxels Ω Pre-scan that is scanned, but the set of voxels to be probed Ω Probe established during the previous iteration. The set of voxels to be probed Ω Probe represents a small proportion of the reference volume V, analogously to pre-scanning, with the difference that the voxels of Ω Probe are not distributed randomly: they are distributed so as to interrogate the structure of interest optimally. Each time, the new illuminated (probed) voxels added are chosen on the basis of the information previously obtained during the previous iterations as well as in the processing of this information during the successive estimations of the structure of interest, that is- that is, the presumptive geometric structures. These are refined with each iteration and gradually converge towards the real structure. The decision step 600 makes it possible to exit the iterative loop, here for example by two output channels 700, 800. The first output channel 700 comes from a decision by the user to exit the iterative loop and scan the entirety of the most recent presumptive geometric structure S P in order to establish a high resolution image thereof. In this case, the set of voxels to be probed Ω Probe corresponds exactly to the set of presumptive voxels Ω Presumptive . In this the user can make a compromise between time of acquisition and precision sought according to his experience or his needs. Indeed, exiting the iterative loop during one of the first iterations is faster. Conversely, exiting the loop following several iterations is slower but makes it possible to scan a presumptive geometric structure S P whose overlap with the real structure of interest is greater. A particular case of this manual output is to output from the first estimation of the structure of interest. Another exit channel 800 is a so-called “automatic” exit. Indeed, over the iterations, while the space of probed voxels grows and the presumptive geometric structure converges towards the real structure, it is possible that the real structure SR is included in the volume already probed (illuminated). In this case the iterative process stops, because it no longer requires the illumination of new voxels. It then becomes unnecessary to scan the presumptive geometric structure S P by scanning to obtain a high resolution image since all the voxels to be scanned have already been processed by the image acquisition method. The principle presented is adaptable to any type of microscope based on a point illumination of the sample in order to generate the light signal. The light voxel(s) are scanned in the sample, generally shot by shot. Thus, the image acquisition method adapts to microscopes such as the confocal microscope using linear or non-linear excitation contrast, for which the scanner can use laser scanning using galvanometric, resonant, or polygonal, non-linear microscopes (fluorescence, coherent Raman, SHG) with galvanometric, resonant or polygonal mirrors, microscopes using acousto-optical scanners, illumination matrix microscopes (“programmable array microscope” in English terminology ). The invention is not limited to the embodiments shown and other embodiments will be apparent to those skilled in the art. It is in particular possible to provide for the application of the acquisition method according to the invention to biological samples other than the cellular tissues mentioned in the present description, and to use alternative microscopy techniques.

Claims

Revendications [Revendication 1] Procédé d’acquisition d’image en trois dimensions d’un échantillon biologique par microscopie à balayage, ledit échantillon étant situé dans un volume de référence défini par une pluralité de voxels, caractérisé en ce qu’il comprend les étapes suivantes : a) pré-balayage (100) des voxels du volume de référence (V), au cours duquel seul un sous-ensemble des voxels du volume de référence (V), dit ensemble initial de voxels sondés (ΩPré-balayage), est illuminé, b) calcul (200), par interpolation numérique de l’ensemble initial de voxels sondés (ΩPré-balayage), d’une structure géométrique présomptive (SP) de l’échantillon biologique (B), c) détermination (300) d’un ensemble de voxels correspondant à la structure géométrique présomptive (SP), dit ensemble de voxels présomptifs (ΩPrésomptif), d) sélection (400), à partir de l’ensemble de voxels présomptifs (ΩPrésomptif), d’un ensemble de voxels à illuminer (Ωsonde), dit ensemble de voxels à sonder, et e) balayage (500) du volume de référence (V), au cours duquel seul l’ensemble de voxels à sonder (ΩSonde) est illuminé. [Revendication 2] Procédé d’acquisition d’image selon la revendication 1, dans lequel on effectue, avant l’étape de pré-balayage, une étape de collecte d’informations (90) sur l’organisation dans l’espace de l’échantillon biologique (B), le calcul de la structure géométrique présomptive (SP) et/ou la sélection de l’ensemble de voxels à sonder (ΩSonde), étant de préférence effectué à l’aide des informations collectées sur l’organisation dans l’espace de l’échantillon biologique (B). [Revendication 3] Procédé d’acquisition d’image selon la revendication 1 ou 2, dans lequel on réitère les étapes b), c) et d) et e) (100, 200, 300, 400, 500) jusqu’à interruption volontaire (600) par un opérateur ou jusqu’à détermination (700) que l’ensemble de voxels illuminés sur l’ensemble des itérations inclut l’ensemble de voxels présomptifs (ΩPrésomptif). [Revendication 4] Procédé d’acquisition d’image selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la taille des voxels des voxels présomptifs (ΩPrésomptif) et à sonder (ΩSonde) correspond à la taille des voxels de l’ensemble initial de voxels sondés (ΩPré-balayage). [Revendication 5] Procédé d’acquisition d’image selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’ensemble des voxels à sonder (ΩSonde) correspond exactement à l’ensemble des voxels présomptifs (ΩPrésomptif). [Revendication 6] Procédé d’acquisition d’image selon l’une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l’ensemble des voxels à sonder (ΩSonde) est une fraction de l’ensemble des voxels présomptifs (ΩPrésomptif). [Revendication 7] Procédé d’acquisition d’image selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la structure géométrique présomptive (SP) est construite à partir d’au moins une surface. [Revendication 8] Procédé d’acquisition d’image selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'interpolation numérique est une interpolation polynomiale, une interpolation polynomiale par morceaux, une interpolation par splines, une estimation basée sur les proches voisins, une interférence bayésienne, ou une estimation utilisant des réseaux de convolution. [Revendication 9] Procédé d’acquisition d’image selon l’une quelconque des revendications 7 ou 8, dans lequel l’étape c) de détermination (300) de l’ensemble de voxels présomptifs comporte les sous-étapes suivantes : - sélection (310) d’une épaisseur pour la surface présomptive (SP), et - détermination (320) des voxels correspondant au volume défini par la surface présomptive (SP) et l’épaisseur sélectionnée. [Revendication 10] Procédé d’acquisition d’image selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l’étape a) (100) consiste à balayer tous les voxels du volume de référence (V) et n’illuminer que l’ensemble initial de voxels sondés (ΩPré-balayage). [Revendication 11] Procédé d’acquisition d’image selon l’une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel l’étape a) (100) consiste à ne balayer et illuminer que l’ensemble initial de voxels sondés (ΩPré- balayage). [Revendication 12] Procédé d’acquisition d’image selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel les voxels de l’ensemble initial de voxels sondés (ΩPré-balayage) sont répartis aléatoirement dans le volume de référence (V). [Revendication 13] Procédé d’acquisition d’image selon l’une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le sous-ensemble des voxels du volume de référence (V) représente entre 0,01% et 0,2% des voxels du volume de référence (V), de préférence entre 0,05% et 0,1% des voxels du volume de référence (V). [Revendication 14] Dispositif d’acquisition d’image en trois dimensions d’un échantillon biologique par microscopie à balayage, caractérisé en ce qu’il est configuré pour mettre en œuvre le procédé selon l’une quelconque des revendications précédentes. [Revendication 15] Dispositif d’acquisition d’image selon la revendication 14, dans lequel le balayage des échantillons est réalisé par un microscope confocal utilisant un contraste d’excitation linéaire ou non-linéaire, pour lequel le scanner peut utiliser un balayage laser à miroir galvanométrique ou acousto-optique, ou un microscope à matrice d’illumination. [Revendication 16] Dispositif d’acquisition d’image selon la revendication 15, comprenant un système d’illumination (20) comprenant au moins un laser, une matrice de micro-miroirs et un relais optique. Claims [Claim 1] Method for acquiring a three-dimensional image of a biological sample by scanning microscopy, said sample being located in a reference volume defined by a plurality of voxels, characterized in that it comprises the steps following steps: a) pre-scanning (100) of the voxels of the reference volume (V), during which only a subset of the voxels of the reference volume (V), called the initial set of voxels probed (Ω Pre-scanning ) , is illuminated, b) calculation (200), by digital interpolation of the initial set of probed voxels (Ω Pre-scanning ), of a presumptive geometric structure ( SP ) of the biological sample (B), c) determination (300) of a set of voxels corresponding to the presumptive geometric structure (S P ), said set of presumptive voxels (Ω Presumptive ), d) selection (400), from the set of presumptive voxels (Ω Presumptive ), of a set of voxels to illuminate (Ω probe ), said set of voxels to probe er, and e) scanning (500) of the reference volume (V), during which only the set of voxels to be probed (Ω Probe ) is illuminated. [Claim 2] Image acquisition method according to claim 1, in which, before the pre-scanning step, a step of collecting information (90) on the spatial organization of the biological sample (B), the calculation of the presumptive geometric structure (S P ) and/or the selection of the set of voxels to be probed (Ω Probe ), being preferably carried out using the information collected on the spatial organization of the biological sample (B). [Claim 3] Image acquisition method according to claim 1 or 2, in which steps b), c) and d) and e) (100, 200, 300, 400, 500) are repeated until interrupted voluntary (600) by an operator or until it is determined (700) that the set of illuminated voxels over the set of iterations includes the set of presumptive voxels (Ω Presumptive ). [Claim 4] Image acquisition method according to any one of the preceding claims, in which the size of the voxels of the presumptive voxels (Ω Presumptive ) and to be probed (Ω Probe ) corresponds to the size of the voxels of the set initial of probed voxels (Ω Pre-scan ). [Claim 5] Image acquisition method according to any one of the preceding claims, in which the set of voxels to be probed (Ω Probe ) corresponds exactly to the set of presumptive voxels (Ω Presumptive ). [Claim 6] Image acquisition method according to any one of Claims 1 to 4, in which the set of voxels to be probed (Ω Probe ) is a fraction of the set of presumptive voxels (Ω Presumptive ). [Claim 7] Image acquisition method according to any one of the preceding claims, in which the presumptive geometric structure (S P ) is constructed from at least one surface. [Claim 8] An image acquisition method according to any preceding claim, wherein the digital interpolation is polynomial interpolation, piecewise polynomial interpolation, spline interpolation, near neighbor estimation, Bayesian interference, or estimation using convolution networks. [Claim 9] Image acquisition method according to any one of Claims 7 or 8, in which the step c) of determining (300) the set of presumptive voxels comprises the following sub-steps: - selection (310) of a thickness for the presumptive surface (S P ), and - determination (320) of the voxels corresponding to the volume defined by the presumptive surface (S P ) and the selected thickness. [Claim 10] Image acquisition method according to any one of the preceding claims, in which step a) (100) consists in scanning all the voxels of the reference volume (V) and illuminating only the initial set of probed voxels (Ω Pre-scan ). [Claim 11] Image acquisition method according to any one of claims 1 to 9, in which step a) (100) consists in not scan and illuminate only the initial set of probed voxels ( ΩPre -scan). [Claim 12] Image acquisition method according to any one of the preceding claims, in which the voxels of the initial set of probed voxels (Ω Pre-scan ) are randomly distributed in the reference volume (V). [Claim 13] Image acquisition method according to any one of the preceding claims, in which the subset of the voxels of the reference volume (V) represents between 0.01% and 0.2% of the voxels of the volume volume (V), preferably between 0.05% and 0.1% of the voxels of the reference volume (V). [Claim 14] Device for acquiring a three-dimensional image of a biological sample by scanning microscopy, characterized in that it is configured to implement the method according to any one of the preceding claims. [Claim 15] Image acquisition device according to claim 14, in which the scanning of the samples is carried out by a confocal microscope using a linear or non-linear excitation contrast, for which the scanner can use a laser scanning at galvanometric or acousto-optic mirror, or an illumination array microscope. [Claim 16] Image acquisition device according to claim 15, comprising an illumination system (20) comprising at least one laser, an array of micro-mirrors and an optical relay.
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